WO2005033140A1 - 高純度血液凝固ｉｘ因子調製物およびその精製方法 - Google Patents

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Hisashi Yano
Minako Miyagawa
Mai Higashi
Yoichi Ogata
Takayoshi Hamamoto
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    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying blood coagulation factor IX (hereinafter, referred to as FIX) and a higher-purity FIX preparation obtained by the purification method.
  • FIX-containing fraction can be obtained by removing FIX-activating factor, particularly mannose-binding lectin-binding serine protease 1 (MASP-1), from the FIX-containing fraction, and the purification method of FIX. Higher purity FIX fractions and FIX preparations.
  • MASP-1 mannose-binding lectin-binding serine protease 1
  • FIX is a precursor of a serine protease and is a vitamin K-dependent blood coagulation factor having a ⁇ -carboxydaltamate (Gla) residue in the amino terminal region.
  • FIX is synthesized in the liver and is present in the blood in 3-5 gZml.
  • FIX can be physiologically activated by the active coagulation factor VII (hereinafter, FVIIa) -tissue factor (TF) complex or the active coagulation factor XI (hereinafter, FXIa).
  • FVIIa active coagulation factor VII
  • TF tissue factor
  • FXIa active coagulation factor XI
  • the activated coagulation blood coagulation factor IX (hereinafter, FIXa) generated by the activation codification further activates blood coagulation factor X (hereinafter, FX) to progress the blood coagulation.
  • Human FIX is a single-chain glycoprotein with a molecular weight of 57,000 and is composed of a domain sequence called a serine proteinase domain via an amino-terminal capilla Gla domain, a hinge region, two EGF-like domains, and an active peptide region. . There are 12 Gla residues in the Gla domain.
  • hemophilia B An abnormality based on FIX deficiency / deficiency is known as hemophilia B, which is a bleeding disorder. No curative therapy for hemophilia B at present The main treatment is hemostatic management of patients with FIX replacement therapy.
  • Non-Patent Document 4 See Non-Patent Document 5 and Non-Patent Document 6.
  • immunoaffinity chromatography using a monoclonal antibody against FIX was used to remove vitamin K-dependent coagulation factors other than FIX, and FIX preparations that specifically purified FIX would be used.
  • Non-patent literature l Michalski C. et al., Vox Sanguinis, 55, 4, 1988, p.202-210
  • Non-Patent Document 2 Kamiya Tadashi, Journal of the Japanese Society of Transfusion, Vol. 33, No. 5, 1987, p. 638-644
  • Non-patent Document 3 Junichi Yasuda, Blood Products, Modern Publishing, 1986, P.184-191
  • Non-Patent Document 4 Burnouf T. et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 49, 1-3, 2001, p.575-586
  • Non-Patent Document 5 Josic D. et al., Journal of Chromatography, 632, 1-2, 1993, p.l-10
  • Non-Patent Document 6 Burnouf T. et al., Vox Sanguinis, Vol. 57, No. 4, 1989, p. 225-232
  • Non-Patent Document 7 Watari Morikawa, Fundamentals and Clinical Practice, Vol. 24, No. 10, 1990, 713 -717 pages
  • Non-patent literature 8 Iga Y. et al., Proceedings of the bixth International Symposium on Hemophilia Treatment, Tokyo, Japan, 1990, p.107-116
  • Non-Patent Document 9 Akimoto Y. et al., Proceedings of the Sixth International Symposium on Hemophilia Treatment, Tokyo, Japan, 1990, p.117-130
  • the present inventors have purified human plasma power by a reported method using an anion exchanger (for example, see Morikawa Wataru, Basic and Clinical, Vol. 24, No. 10, 1990, pp. 713-717).
  • an anion exchanger for example, see Morikawa Wataru, Basic and Clinical, Vol. 24, No. 10, 1990, pp. 713-717.
  • a solution of a FIX sample (M fraction) purified by immunoaffinity chromatography using a monoclonal antibody against FIX was incubated with FIX. Had been found to be converted to FIXa.
  • the rate of FIXa formation increased when mixed with the anion exchanger gel.
  • MASP mannose-binding lectin-binding serine protease
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above problems and found that purified MASP-1 activated FIX in a time-dependent manner and immobilized a monoclonal antibody against human MASP-1. It was found that when MASP-1 was removed using a gel, the degree of FIX activation was drastically reduced (approximately 95% of the activity was lost). It was confirmed that the subject was MASP-1, a kind of MASP. In this way, conventional FIX preparations that have been purified to high purity by affinity chromatography or immunoaffinity chromatography may still contain trace amounts of FIXa (0.1-1.0% based on FIX amount). However, it was found that FIX was activated during the purification process due to contamination with MASP-1.
  • the present invention is known to be a physiological activator of FIX so far, even in a very small amount in a highly purified conventional FIX preparation.
  • MASP which is a novel FIX activator different from FXIa and FVIIa
  • MASP-1 the FIX activator (MASP, especially MASP
  • the present invention relates to a method for purifying FIX, characterized by removing -1). ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it becomes possible to provide the highly safe FIX preparation in which FIXa which is still mixed in a trace amount in the highly purified FIX preparation is reduced as much as possible.
  • the present invention also relates to a purified FIX fraction having a MASP-1 content of 0.1 lng or less per FIX1 international unit, obtained by the purification method of the present invention.
  • the present invention also relates to a FIX preparation having a FIXa content of 0.1% or less based on FIX.
  • the FIX preparation further has a MASP-1 content of O.lng or less per FIX1 international unit. The invention's effect
  • the amount of FIXa present in a trace amount is significantly reduced as compared with conventional preparations, and the risk of thrombosis induction is reduced. It has become possible to provide a more safe preparation.
  • FIX is specifically eluted with low saline buffer.
  • the salt concentration during adsorption is preferably 1 M or more, and the elution is preferably 1 M or less during elution.
  • the ligand of the carrier used in the hydrophobic chromatography of the present invention is preferably a butyl group, a phenyl group or an octyl group, and the carrier is preferably Toyopearl (product name: Tosoichi Co., Ltd.). Can be selected.
  • the temperature in the hydrophobic chromatography of the present invention is preferably 1 ° C to 30 ° C, and the pH is preferably 5-8.
  • the cryo supernatant from which 3000 ml of human plasma has been removed from the cryoprecipitate is passed through 100 ml of anion exchanger (Q-Sepharose) equilibrated with 20 mM citrate buffer, and the adsorbed fraction is diluted with quinone containing 0.5 M sodium chloride. Elution with an acid buffer gave a FIX-containing fraction.
  • anion exchanger Q-Sepharose
  • Table 1 shows the MASP-1 content and FIXa content in the obtained FIX fraction compared with the results of the FIX fraction obtained by the conventional method without hydrophobic chromatography.
  • the introduction of hydrophobic chromatography reduced the MASP-1 content per international unit of FIX1 to less than O.lng, and the content of FIXa relative to FIX to less than 0.1%.
  • FIXa content content ratio of FIXa to FIX 0.1 to 1.0% 0.1% or less

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Abstract

　血液凝固IX因子含有画分から血液凝固IX因子活性化因子を除去することによって活性化血液凝固IX因子の生成を防ぐことを特徴とする血液凝固IX因子の精製方法、および当該精製方法によって得られたＦIXaの含有量の少ない安全性の高い血液凝固IX因子製剤を提供する。当該血液凝固IX因子活性化因子はマンノース結合レクチン結合性セリンプロテアーゼ−１（MASP-1）である。血液凝固IX因子活性化因子の除去は疎水クロマトグラフィーにより行うのが好ましい。

Description

明 細 書
高純度血液凝固 IX因子調製物およびその精製方法
技術分野
[0001] 本発明は、血液凝固 IX因子 (以下、 FIX)の精製方法および当該精製方法によって 得られたより高純度の FIX調製物に関する。詳細には、 FIX含有画分から FIX活性ィ匕 因子、特にマンノース結合レクチン結合性セリンプロテアーゼー 1 (MASP-1)を除去す ること〖こよる FIXの精製方法、および当該精製方法を経て得られるより高純度の FIX 精製画分および FIX製剤に関する。
背景技術
[0002] FIXはセリンプロテアーゼの前駆体であり、ァミノ末端領域に γ—カルボキシダルタミ ン酸 (Gla)残基を有するビタミン K依存性血液凝固因子である。 FIXは肝臓で合成さ れ、血中には 3— 5 gZml存在する。 FIXは、生理的には活性ィ匕血液凝固 VII因子（ 以下、 FVIIa)—組織因子 (TF)複合体、あるいは活性ィ匕血液凝固 XI因子（以下、 F XIa)により活性ィ匕されることが知られている。活性ィ匕により生成した活性ィ匕血液凝固 IX因子（以下、 FIXa)は、さらに血液凝固 X因子（以下、 FX)を活性化し血液凝固を 進行させる。ヒト FIXは分子量 57,000の一本鎖糖タンパク質で、ァミノ末端カゝら Glaドメ イン、ヒンジ領域、 2つの EGF様ドメイン、さらに活性ィ匕ペプチド領域を経てセリンプロ テアーゼドメインというドメイン配列により構成されている。 Glaドメインには 12個の Gla 残基が存在している。
[0003] FIXの欠乏/欠損に基づく異常症は、出血性疾患である血友病 Bとして知られてい る。血友病 Bに対する根治的療法は現在のところなぐ FIXの補充療法による患者の 止血管理が治療の主体である。
[0004] 1980年代には、クリオ上清やコーンのエタノール分画のフラクション I上清などを出 発原料として、陰イオン交換体を用いたクロマトグラフィーで分画して精製される血液 凝固 IX因子複合体製剤 (PCC製剤)が FIXの補充療法に使用されていた (例えば、非 特許文献 1、非特許文献 2、および非特許文献 3参照)。また、 FIXは、その他のビタミ ン K依存性の凝固因子 (プロトロンビン、 FVII、 FXなど）と物理ィ匕学的に性状が類似 しているために、それらとの分離が困難であった力 ァフィユティークロマトグラフィー 精製技術の発達により、高純度 FIXの精製が可能になった。例えば、 1980年代後半 には、へノリンをリガンドにした担体を用いたァフィユティークロマトグラフィーにより F IXを高度に精製した FIX製剤が臨床使用されるようになった (例えば、非特許文献 4、 非特許文献 5、および非特許文献 6参照)。さらに 1990年代になると、 FIXに対するモ ノクローナル抗体を用いたィムノアフィ-ティークロマトグラフィーで FIX以外のビタミン K依存性の凝固因子を除去し、 FIXを特異的に高度に精製した FIX製剤が使用され るようになってきた (例えば、非特許文献 7、非特許文献 8、および非特許文献 9参照
) o
[0005] 非特許文献 l : Michalski C.ら， Vox Sanguinis, 55卷， 4号， 1988年， p.202-210
非特許文献 2 :神谷忠，日本輸血学会誌, 33卷， 5号， 1987年， p.638 - 644
非特許文献 3 :安田純一,血液製剤,近代出版， 1986年， P.184— 191
非特干文献 4 : Burnouf T.ら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 49卷 , 1-3号， 2001年， p.575-586
非特許文献 5 :Josic D.ら， Journal of Chromatography, 632卷， 1-2号， 1993年， p.l— 10
非特許文献 6 : Burnouf T.ら， Vox Sanguinis, 57卷， 4号， 1989年， p.225-232 非特許文献 7 :森河亘ら，基礎と臨床， 24卷， 10号， 1990年， 713-717頁
非特干文献 8 : Iga Y.ら, Proceedings of the bixth International Symposium on Hemophilia Treatment, Tokyo, Japan, 1990年, p.107— 116
非特許文献 9 : Akimoto Y.ら, Proceedings of the Sixth International Symposium on Hemophilia Treatment, Tokyo, Japan, 1990年, p.117— 130
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] し力し、ァフィ-ティークロマトグラフィーあるいはィムノアフィ-ティーク口マトグラフィ 一で高純度に精製された FIX製剤であっても、精製工程中に生成した微量の FIXa ( FIX量に対して 0.1— 1.0%)が含まれる。 FIXaとゥサギ鬱血試験（血栓傾向を検査す る生体内試験）のスコア一との間に正相関があるとの報告もある（例えば、 Gray E.ら， Thrombosis and Haemostasis, 73卷， 4号， 1995年， p.675— 679および Philippou H.ら， Thrombosis and Haemostasis, 76卷， 1号， 1996年， p.23— 28参照）。したがって、高純 度に精製された FIX調製物中になお微量に混在する FIXaを可能な限り低減させるこ とは、血栓誘発の危険性をさらに低減させ、 FIX製剤の安全性をより高めるものである 課題を解決するための手段
[0007] ここで、 FIX製剤中の FIXaを低減させる方策としては、ー且生成した FIXaを FIX製 剤の最終組成物となる以前の精製工程で除去することの他に、 FIXa生成の原因とな る FIX活性ィ匕因子を FIX製造工程中で予め除き、精製された FIX調製物中に FIXaが 混入されな ヽようにすると ヽぅ対応策も考えられた。
[0008] 本発明者らは、ヒト血漿力も陰イオン交換体を用いる既報告の方法 (例えば、森河 亘ら，基礎と臨床， 24卷， 10号， 1990年， 713-717頁参照）で精製分離したビタミン K 依存性凝固因子画分を出発原料として、 FIXに対するモノクローナル抗体を用いたィ ムノアフィ-ティークロマトグラフィーで精製した FIXサンプル (M画分）の溶液をイン キュベーシヨンすると FIXが活性ィ匕し、 FIXaに変換されることを見出していた。この F IXaの生成速度は、陰イオン交換体ゲルと混合すると増カロした。
[0009] この原因は、 FIXの生理的な活性化因子であるといわれている FXIaや FVIIaが微量 に混在しているためであろうと当初は推測された。し力し、 M画分サンプル中の FXIa と FVIIa含量を ELISAにて調べ、あら力じめ高純度に精製した FIXに M画分と同等量 の FXIaあるいは FVIIaを添カ卩し反応させ、それらによる FIX活性ィ匕能を調べた結果、 FXIaある!/、は FVIIaを添カ卩したサンプルよりも、 M画分サンプルの FIX活性化能が著 しく高いことが示された。この事実より、 FXIaおよび FVIIa以外の新規な FIX活性ィ匕プ 口テアーゼの存在が示唆された。
[0010] 一方、レクチン経路と呼ばれる第 3の補体活性ィ匕経路で働くセリンプロテアーゼの 一種にマンノース結合レクチン結合性セリンプロテアーゼ (MASP)がある（例えば、 Sato T.ら， International Immunology, 6卷， 4号， 1994年， p.665— 669 ;Endo Y.ら， Journal of Immunology, 161卷， 9号， 1998年， p.4924— 4930 ;および遠藤雄一ら，蛋 白質核酸酵素， 45卷， 5号， 2000年， p.671— 678参照）。この MASPには、 MASP-1、 MASP-2、 MASP-3、および sMAPの 4タイプがあることが知られている。しかしながら、 MASP力 血液凝固因子の活性ィ匕に関与することは従来知られていな力つた。
[0011] 本発明者らは、上記の諸問題に鑑み鋭意検討した結果、精製 MASP-1が時間依存 的に FIXを活性ィ匕すること、およびヒト MASP-1に対するモノクローナル抗体を固定ィ匕 したゲルを用いて M画分力ゝら MASP— 1を除去すると、 FIX活性化の程度が激減 (約 95%の活性ィ匕能が消失)することを見出し、これら事実力 FIX活性ィ匕プロテアーゼ の主体が MASPの一種である MASP-1であることを確認した。このようにして、了フィニ ティークロマトグラフィーあるいはィムノアフィ-ティークロマトグラフィーで高純度に精 製された従来の FIX製剤中になお微量の FIXa (FIX量に対して 0.1-1.0%)が含ま れる原因は、 MASP-1の混入による精製工程中での FIXの活性化にあることが判明し た。
[0012] すなわち、本発明は、高純度に精製された従来の FIX製剤中になお微量に混在し て!、る FIXaの原因力 これまで FIXの生理的な活性化因子であることが知られて!/、る FXIaや FVIIaとは異なる新規な FIX活性化因子である MASP、特に MASP-1によるもの であるとの上記知見に基づき、 FIX含有画分から当該 FIX活性化因子 (MASP、特に MASP-1)を除去することを特徴とする FIXの精製方法に関するものである。本発明に より、高純度に精製された FIX調製物中になお微量に混在する FIXaが可能な限り低 減された、さらに安全性の高い FIX製剤を提供することが可能となる。
[0013] また、本発明は、本発明による精製方法によって得られた、 FIX1国際単位当たりの MASP- 1含有量が 0. lng以下の FIX精製画分に関する。
[0014] また、本発明は、 FIXに対する FIXaの含有率が 0.1%以下の FIX製剤に関する。当 該 FIX製剤は、さらに FIX1国際単位当たりの MASP-1含有量が O.lng以下である。 発明の効果
[0015] 本発明により、血友病 B患者に対する補充療法剤として汎用されている FIX製剤に 関して、微量に存在する FIXaが従来の製剤よりも有意に低減し、血栓誘発の危険性 の少ないより安全性の高い製剤を提供することが可能となった。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 当該 FIX活性ィ匕因子の除去方法としては、「MASP-1に対するモノクローナル抗体 を固定化したゲルを用いて FIX画分力 MASP-1を除去する方法」、「セファロース担 体のカラムを通すことで FIX画分力 MASP-1を吸着除去する方法」、および「陰ィォ ン交換ゲル、疎水ゲル、キレートゲル、ベンズアミジン固定化ゲルを用いたクロマトグ ラフィ一により FIX画分力 MASP-1を除去する方法」などがある力 疎水クロマトダラ フィーを実施する方法は特に好ま U、態様である。
[0017] 本発明により MASP-1を除去するには疎水クロマトグラフィーを利用するのが好まし い。その場合、ィムノアフィ-ティーあるいはへノ リン様物質をリガンドとした担体で精 製した高純度 FIXの高食塩濃度溶液を疎水担体に展開して FIXを吸着させ、 MASP-1を素通りさせる。 FIXは低食塩濃度の緩衝液で特異的に溶出される。吸着の 際の食塩濃度は 1M以上が好ましぐ溶出時は 1M以下が好ましい。
[0018] 本発明の疎水クロマトグラフィーに用いる担体のリガンドは、ブチル基、フエ-ル基 あるいはォクチル基が好ましぐ担体はトヨパール (製品名：東ソ一 (株)）をはじめ種々 のものを選択可能である。
[0019] また、本発明の疎水クロマトグラフィーでの温度は 1°C一 30°Cが好ましぐ pHは 5— 8が好ましい。
[0020] このようにして FIX精製画分に混入した MASP-1を有効に除去することで、 FIX精製 画分に微量に混在する FIXaを可能な限り低減させ、血栓誘発の危険性をさらに低下 した安全性の高 、FIX製剤を提供することができる。
[0021] 以下、本発明の実施例を血液凝固 IX因子 (FIX)の調製例とともに示し、本発明をさ らに具体的に説明する力 本発明はこれに限定されるものではない。
実施例 1
[0022] 《1.血液凝固 IX因子 (FIX)の調製》
ヒト血漿 3000mlからクリオ沈殿を除去したクリオ上清を、 20mMクェン酸緩衝液で平 衡化した陰イオン交換体（Q- Sepharose) 100mlに通液し、吸着画分を 0.5Mの食塩を 含むクェン酸緩衝液で溶出し、 FIX含有画分を得た。
[0023] 得られた FIX画分に、終濃度 50mMになるようにカルシウムを添カ卩し、カルシウム依 存性の抗 FIXモノクローナル抗体をリガンドとした担体（100ml)に通液し FIXを担体に 吸着させた。担体を洗浄し、 20mMの EDTA含有緩衝液で FIXを溶出し、高純度化し た FIXを得た。
[0024] 《2.疎水クロマトグラフィーによる MASP-1の除去および FIXの調製》
上記により調製された FIX溶液に終濃度 1.5Mになるように食塩を添加し、クロマトグ ラフィーアプライサンプルを調製した。次に、 25°Cにて、そのサンプルを、ヒスチジン 緩衝液 (pH6)で平衡化したブチルトヨパール 650C (製品名：東ソー (株)） 20mlに通液 し FIXを吸着させた。 1.1M食塩含有緩衝液で洗浄後、 0.5M食塩含有緩衝液で FIXを 溶出した。疎水クロマトグラフィー精製後の FIXは、森河らの方法 (森河亘ら，基礎と 臨床， 24卷， 10号， 1990年， 713— 717頁）に準じて、 Q- Sepharoseによりさらに高純度 に精製された。得られた FIX画分における MASP-1含量および FIXa含量を、疎水クロ マトグラフィーを実施しない従来法により得られる FIX画分の成績と比較したものを、 表 1に示した。疎水クロマトグラフィーを導入することにより、 FIX1国際単位当たりの MASP-1含量は O.lng以下まで低下し、それに伴い FIXに対する FIXaの含有率も 0.1% 以下まで低下した。
[0025] [表 1]
疎水ク ロマ 卜な し 疎水ク ロマ トあ り
MAS P- 1含量 （F I X 1国際単位当たり） 0 . 2〜 1 . 0 n g 0 . 1 n g以下
F I Xa含量 ： F I Xに対する F I Xaの含有率 0 . 1 〜 1 . 0 % 0 . 1 %以下

Claims

請求の範囲
[I] 血液凝固 IX因子含有画分力 血液凝固 IX因子活性ィ匕因子を除去することを特徴と する、血液凝固 IX因子の精製方法。
[2] 血液凝固 IX因子含有画分力 血液凝固 IX因子活性ィ匕因子を除去することによって 活性ィ匕血液凝固 IX因子の生成を防ぐことを特徴とする、請求項 1に記載の血液凝固 IX因子の精製方法。
[3] 当該血液凝固 IX因子活性ィ匕因子がマンノース結合レクチン結合性セリンプロテア ーゼ（以下、 MASP)である、請求項 1または 2に記載の血液凝固 IX因子の精製方法。
[4] 当該 MASPが MASP-1である、請求項 3に記載の血液凝固 IX因子の精製方法。
[5] 血液凝固 IX因子含有画分力 の血液凝固 IX因子活性ィ匕因子の除去を疎水クロマ トグラフィ一により行うことを特徴とする、請求項 1ないし 4のいずれかに記載の血液凝 固 IX因子の精製方法。
[6] 当該疎水クロマトグラフィーにおいて血液凝固 IX因子をクロマトグラフィー担体に吸 着させ、血液凝固 IX因子活性ィ匕因子を素通りさせることを特徴とする、請求項 5に記 載の血液凝固 IX因子の精製方法。
[7] 請求項 1ないし 6のいずれかに記載の精製方法により得られた、血液凝固 IX因子 1 国際単位当たりの MASP-1の含有量が O.lng以下である、血液凝固 IX因子の精製画 分。
[8] 血液凝固 IX因子に対する活性ィ匕血液凝固 IX因子の含有率が 0.1%以下であること を特徴とする、血液凝固 IX因子製剤。
[9] 血液凝固 IX因子 1国際単位当たりの MASP-1の含有量が O. lng以下であることを特 徴とする、請求項 8に記載の血液凝固 IX因子製剤。
[10] 血液凝固 IX因子の製造工程において、血液凝固 IX因子 1国際単位当たりの
MASP-1の含有量を 0. lng以下まで低減する精製方法を実施することで、最終産物 での血液凝固 IX因子に対する活性ィ匕血液凝固 IX因子の含有率を 0.1%以下とした、 血液凝固 IX因子製剤。
[II] 血液凝固 IX因子の製造工程において、疎水クロマトグラフィーによって血液凝固 IX 因子 1国際単位当たりの MASP-1の含有量を O.lng以下まで低減することで、最終産 物での血液凝固 IX因子に対する活性ィ匕血液凝固 IX因子の含有率を 0.1%以下とし た、請求項 10記載の血液凝固 IX因子製剤。
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