CZ355899A3 - Imunotolerantní farmaceutické přípravky prothrombinového komplexu, způsob jejich výroby a jejich použití - Google Patents

Abstract

Řešení se týká imnnotolerantního farmaceutického přípravku prothrombinového komplexu, obsahujícího faktoryII, IX, Xa případně VII, kletý vykazuje obsah antigenu faktoruVID méně než 0,1, způsobu výroby tohoto přípravku, který zahrnuje kroky poskytnutí plasmy nebo frakce písmy obsahující faktory Π, IX, X apřípadněVII, uvedení plasmy nebo frakce plasmy v kontakt s nosnýmmateriálem, případně v přítomnosti detergentu, takže se oddělí faktor VIII a případně fosfolipidjy od faktorů Π, IX, Aa případně VII, čištění plasmy nebo frakce plasmy, a získání frakce obsahující fatory Π, IX, Xa případně VR Dále se týká použití uvedeného přípravku k výrobě léčiva.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutického přípravku k ošetřování poruch srážlivosti krve, obzvláště pacientů s inhibici faktoru VIII. Vynález se dále týká způsobu výroby takových přípravků a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Srážení krve je vyvoláno řadou po sobě následujících reakcí různých proteinů případně enzymů. Nedostatkem faktorů srážlivosti krve se zabrání tvorbě fibrinu z fibrinogenu a tím uzavření rány; následkem je krvácení. K takovému případu dochází při hemofilii A. Ta je nejrozšířenějším onemocněním krvácívosti a je vyvolána nedostatkem faktoru VIII. K substitučnímu ošetření hemofilie A se používají preparáty, které obsahují faktor VIII. Ošetření těmito preparáty vede ve většině případů k rychlému zastavení krvácení.

Existují však také pacienti, u nichž se vyskytuje nejenom nedostatek faktoru VIII, nýbrž se vyvinula i tlumicí látka (inhibitor), působící proti faktoru VIII. Další skupina pacientů vykazuje inhibitory faktoru VIII, aniž by však trpěla hemofilii A. Podle disponibilního množství inhibitoru faktoru VIII se inhibuje účinek přivedeného faktoru VIII jeho neutralizací.

• · • · Λ · · · · · · • · · · · ········ • · · · · · · ·· ··· ··· ··· ·· ··

Κ ošetření pacientů s inhibicí faktoru VIII se nyní nabízejí přípravky na bázi frakcí plasmy, které obsahují směs faktorů srážlivosti. Tyto frakce plasmy mohou příkladně obsahovat faktory prothrombinového komplexu (faktor II, VII,

IX a X). Přípravek podporující srážlivost krve s aktivitou faktor VIII-Inhibitor-Bypass (FEIBA^ TIM 4, firma IMUNO AG) se získá příkladně podle AT-B 0 368 883 zpracováním kryozbytku. Tento přípravek obsahuje rovněž faktory srážení II, VII, IX a X.

Účinek preparátu FEIBA je na základě tohoto komplexního složení mnohostranný. Mariani a spol. (Thrombosis Res. 31, 475-488 (1983)) uvádí jako princip účinnosti faktor VII v jeho aktivované podobě. Bylo zjištěno, že po infuzi přípravku FEIBA se objeví zvýšený obsah faktoru Vila v plasmě hemofyliků.

Úlohu faktoru Vila v koncentrátech prothrombinových komplexů s Faktor VIII-Bypassing-Aktivity diskutuje rovněž Teitel (Thrombosis and Haemostasis 66 (5) 559-564 (1991)). Zároveň se pojednává také princip účinku faktoru Xa v preprátech tohoto druhu. Zkoumané koncentráty prothrombinového komplexu obsahovaly faktor Vila, vyjádřeno poměrem aktivity faktoru VII k antigenu faktoru VII 2,1 a 2,5.

Terapeutický přípravek obsahující prothrombin vyrobený podle EP 0 044 343-B1 je vhodný k ošetření inhibitorů faktorů srážení a obsahuje jeden aktivovaný prothrombinový komplex, u kterého jsou faktory částečně aktivovány. Podíl faktoru Vila činí 8-80 jednotek/ml. Koncentrace faktoru IX je v oblasti 15 až 112 jednotek/ml. Obdobně činí obsah faktoru Vila, vztaženo na faktor IX, 0,07 - 5,3 E faktor VIIa/E faktor IX. Vinazzer (Thromb. Res. 26, 21-29 (1982)) ukazuje rozdíly přípravku AUTOPLEX, který se vyrobí podle EP 0 044 343 a FEIBA. Jak je uvedeno, vyznačuje se AUTOPLEX vyšším obsahem thrombinu (faktor Ila), měřeno v jednotkách NIH, ve srovnání s FEIBA (viz tabulka 1, strana 24).

Ale také vysoce čisté přípravky faktoru Vila se navrhují k terapii inhibovaných stavů faktorů srážení (příkladně EP 0 082 182-B1 a Hedner a spol. (Haemostasis 19, 335-343 (1989).

Výhodou přípravků faktoru Vila je nepřítomnost faktoru VIII. Obsah faktoru VIII v přípravcích prothrombinových komplexů nebo v aktivovaných přípravcích prothrombinových komplexů jako příkladně FEIBA způsobuje totiž u pacientů s funkční inhibicí faktoru VIII, že tyto inhibující protilátky jsou opětovným podáním faktoru VIII boostovány, čímž se stav inhibované hemofilie přechodně dokonce zhorší.

Bylo ovšem zjištěno, že k efektivnímu zastavení krvácení při hemofilii inhibicí faktoru VIII se přípravky faktoru Vila v jejich účinku podřizují přípravkům faktorů prothrombinového komplexu (Turecek P. a spol., Thrombosis & Haemostasis, 1997, str. 222).

Úkolem předloženého vynálezu proto je dát k dispozici přípravek, který má efektivnost případně účinnost přípravků faktorů prothrombinového komplexu, aniž by však vykazoval nežádoucí imunologické vedlejší reakce přípravků takového druhu.

Podstata vynálezu

Výše uvedený úkol je vyřešen tak, že podle předloženého vynálezu je dán k dispozici imunotolerantni farmaceutický přípravek prothrombinového komplexu, obsahující faktory II, IX, X a případně VII s minimálním obsahem antigenu faktoru VIII .

Obsah antigenu faktoru VIII přípravku podle vynálezu činí s výhodou méně než 10 %, obzvláště méně než 5 %. Obsah faktoru VIII je s výhodou menší než 0,1 faktor VIII :

C antigen/E FEIBA. Při zvláště výhodné formě provedení leží obsah antigenu faktoru VIII dokonce pod 0,03/E FEIBA, ještě výhodněji pod 0,02/E FEIBA a nejvýhodněji pod hranicí prokazatelnosti.

Zjištění, že obzvláště při dalším čištění faktorů prothrombinového komplexu z plasmy nebo frakce plasmy může být obsah faktoru VIII a případně také obsah fosfolipidů redukován takovým způsobem, zatímco aktivita faktorů prothrombinového komplexu zůstává dalekosáhle zachována, je třeba považovat za překvapivé.

Obzvláště obsahuje farmaceutický přípravek podle vynálezu nejméně faktory IXa, Xa a Vila a vykazuje aktivitu FEIB, zkracuje tedy dobu srážení plasmy deficitní faktorem VIII s funkčním inhibitorem (k tomu viz příkladně AT-B 350 726).

Přípravek podle vynálezu se může vyrábět z plasmy nebo že z frakce plasmy. Frakce plasmy se může vyrobit z plasmy, obzvláště plasmy humánního původu, chromatografickým zpracováním, srážením nebo centrifugací, nebo se použije zbytek po • · · · φ φ kryoprecipitaci .

Frakce plasmy obsahuje faktory závislé na vitaminu K jako faktory prothrombinového komplexu, ale s výhodou jsou obsaženy také proteiny S, C a/nebo Z.

Při jedné obzvláště výhodné formě provedení neobsahuje přípravek fosfolipidy. S výhodou činí horní hranice obsažených fosfolipidů 0,1 nmol/E FEIBA (ke stanovení viz příklady).

Na základě nepřítomnosti fosfolipidů se může zmírnit případně zamezit tvorbě nežádoucích protilátek proti faktoru Vlil.

Podle předloženého vynálezu je dán k dispozici také způsob výroby tohoto přípravku. Tento způsob zahrnuje následuj ící kroky :

a) poskytnutí plasmy nebo frakce plasmy obsahující faktory

II, IX, X a případně VII,

b) uvedeni plasmy nebo frakce plasmy v kontakt s nosným materiálem, případně v přítomnosti detergentu, takže se oddělí faktor VIII a případně fosfolipidy od faktorů II, IX, X a případně VII,

c) čištění plasmy nebo frakce plasmy, a

d) získání frakce obsahující faktory II, IX, X a případně VII .

Při výhodné variantě se kroky b) a c), případně b), c) a d) provádějí jako jeden procesní krok.

V případě použité frakce plasmy se s výhodou jedná • · · o plasmu s nejméně intermediární čistotou.

Jako přípravek s intermediární čistotou se rozumí taková frakce plasmy, která je analogická definici intermediární čistoty preparátů faktoru VIII (k tomu viz příkladně Vood Clive (ed.), Factor VIII : Purity and prophylaxis, Royal Society of Medicine).

Doprovodné proteiny, které se neodstranily chromatografickým čištěním, mohou tak být v preparátu intermediární čistoty ještě obsaženy.

Jako výchozí preparáty se mohou použít také obvyklé, na trh dodávané přípravky faktorů prothrombinového komplexu, jako příkladně FEIBA S-TIM 4, IMUNO nebo aktivovaný prothrombinový komplex.

Jako odpovídající čisticí procesy se použijí metody známé podle stavu techniky, s výhodou se provádí chromatograf ické zpracování, srážení nebo centrifugace. Jako frakce plasmy se může použít také zbytek po kryoprecipitaci.

Nosným materiálem je materiál vhodný pro chromatografii, filtraci a/nebo nanofiltraci. V případě filtrace se jedná obzvláště o afinitní nebo membránovou filtraci.

Pokud se použije předčištěný materiál, příkladně materiál předčištěný pomocí iontoměniče, může se readsorpce provést za změněných podmínek na jiném nosném materiálu, s výhodou na stejném nosném materiálu, jaký se použil pro předčištění.

V jedné výhodné formě provedení je nosný materiál specifickým nosným materiálem pro faktor VIII, obzvláště matrice vhodná pro afinitní chromatografii. Obzvláště výhodně se použije matrice obsahující vVF.

Na nosný materiál takového druhu se s výhodou adsorbuje faktor VIII a případně fosfolipid, zatímco faktory II, IX, X a případně VII se neváží.

Nosný materiál může být ale také nespecifický nosný materiál pro faktor VIII, příkladně slabý aniontoměnič, příkladně DEAE-, TMAE- nebo další aniontoměniče dostatečné známé podle stavu techniky.

Podle zvolených podmínek se na nosném materiálu adsorbuje buďto faktor VIII a případně fosfolipidy, zatímco faktory II, IX, X a případně VII se neváží nebo naopak.

Při další výhodné formě provedení vykazuje nosný materiál vyšší afinitu pro prothrombinový komplex než pro faktor VIII. Tak se příkladně adsorbují faktory II, IX, X a případně VII, zatímco faktor VIII a případně fosfolipidy se eluuj í.

Faktor VIII se může také cíleně inaktivovat a příkladně se potom nevázat v této inaktivované formě na nosný materiál. Takové inaktivace faktoru VIII se může příkladně dosáhnout disociací za použití za použití příkladně chelatotvorných látek, odbouráním, obzvláště proteolytickým odbouráním, příkladně serinproteázami jako thrombin nebo aktivovaný protein C, vazbou afinitních partnerů, jako protilátek nebo peptidů.

Všechny popsané varianty způsobu se mohou provádět také • · · v přítomnosti detergentu, obzvláště neionického detergentu.

S výhodou se jako detergent použije polyether nebo polysorbát, obzvláště se použije Tveen nebo Triton.

Pokud je přítomný detergent, při výhodné formě provedení se opět odstraní případně oddělí.

V další výhodné formě provedení se předpokládá krok k inaktivaci případně přítomných patogenů, obzvláště krok vybraný ze skupiny ošetření teplem, ošetření parou, ošetření rozpouštědlem a/nebo ošetření detergentem.

Přípravek podle vynálezu je tedy možné získat obecně výše popsanými způsoby. Vhodné jsou obzvláště k výrobě léčiv, která se hodí k ošetření pacientů s inhibici faktoru VIII (hemofilie A), obzvláště pro pacienty s titrem inhibice větším než 1 Bethesda E/ml plasmy, s výhodou větším než 5 Bethesda E/ml plasmy. Může se vyrobit také kombinací vysoce čistých jednotlivých faktorů II, IX a X a rovněž případně VII .

Protože biologický materiál, tedy materiál, který pochází z organismů případně tělesných kapalin nebo mikroorganismů může být kontaminován patogeny, jako příkladně infekčními molekulami nebo mikroorganismy a viry, případně pyrogeny, byly již dříve vyvinuty různé způsoby k inaktivaci případně snížení kontaminace patogenů případně pyrogenů.

Takové způsoby zahrnují fyzikální a/nebo chemické ošetření, jako příkladně různé filtrační metody (příkladně nano-, dia- nebo ultrafilatrace), ošetření teplem, zpracování kyselinou nebo louhy, ošetření detergenty a/nebo organickými rozpouštědly a rovněž ošetření UV-světlem nebo laserovým

999 999

999 9 světlem. Opakovaně byly podle stavu techniky navrhovány také kombinace těchto způsobů k inaktivaci případně snížení kontaminace patogenů.

Z EP 0 197 554 je příkladně znám způsob depyrogenace a inaktivace virů v biologickém nebo farmaceutickém produktu, který zahrnuje ošetření prostředkem k inaktivaci virů a depyrogenaci, jako příkladně amfifilní substanci a/nebo rozpouštědlo na pevné fázi, na které je produkt adsorbován. Po tomto ošetření se prostředek k inaktivaci virů a depyrogenaci oddělí od pevné fáze, adsorbovaný produkt se promyje a konečně se eluuje z pevné fáze.

Z EP 0 131 740 je známé ošetření přípravku obsahujícího protein v roztoku s organickým rozpouštědlem jako di- nebo trialkylfosfáty, případně v přítomnosti detergentu (ošetření rozpouštědlo/detergent), kterým se mohou proteinové přípravky získat aniž by obsahovaly lipidické viry.

Z AT-PS 402 151 je známé ošetření teplem, při kterém se k přípravku ve vodném roztoku před zahřátím přidá tenzid v koncentraci nejméně 1 % hmotnostní.

Další způsob k redukci případně supresi nežádoucích aktivit v biologických nebo farmaceutických produktech je známý z EP 0 083 999. Tento způsob je založen na prodlouženém kontaktu s roztokem nebo suspenzí amfifilu, který nepůsobí denaturačně. Depyrogenovaný produkt se k odstranění amfifilu zpracuje na iontoměniči.

Nevýhodou mnoha těchto způsobů známých podle stavu techniky je častý výskyt ztráty aktivity labilních proteinů, obsažených ve zpracovávaných přípravcích, příkladně krevních proteinů. Obzvláště při provádění chromatografického čištění dochází k inaktivaci proteinu v relativně vysoké míře. Odbourání proteinů může ale také vést k aktivaci. Tak je příkladně známo, že se faktor VII při chromatografickém čištění na základě autokatalytických procesů velmi snadno aktivuje na nežádoucí, velmi labilní faktor Vila.

Další nevýhoda spočívá ve vysoké časové a aparátové náročnosti mnoha způsobů, což silně snižuje jejich využitelnost a jejich použití v produkčním technickém měřítku je často nevhodné.

V rámci předloženého vynálezu se má proto využít způsob k účinné inaktivaci patogenů v biologickém materiálu, šetrný pro proteiny, obzvláště pro labilní krevní proteiny, který je možné snadno převést do provozně technického měřítka a může se provádět ekonomicky. Obzvláště se má způsobem inaktivace patogenů významně zabránit odbourání a možné aktivaci proteinů k tomu citlivých.

U tohoto způsobu inaktivace patogenů, obzvláště virů v biologickém materiálu se tento materiál inkubuje s chemickým prostředkem, přičemž inkubace se provádí v přítomnosti eluotropní soli odpovídající koncentraci chloridu sodného nejméně 200 mmol/1, s výhodou nejméně 300 mmol/1.

Inaktivace patogenů v roztoku přináší oproti ošetření adsorbentu některé výhody. Tak je příkladně schůdnost takových způsobů v homogenním, jednofázovém systému snadnější a validace inaktivace je lépe možná. Rovněž se zdá, že lepší přístupnost patogenů v relativně homogenní fázi zvyšuje účinnost tohoto procesního kroku.

Biologický materiál obsahuje s výhodou humánní protein a je to obzvláště plasma nebo frakce plasmy nebo pochází z buněčné kultury. S výhodou obsahuje biologický materiál krevní faktor, jako faktor XII, XI, VIII, V, protein závislý na Villebrandově faktoru nebo fibrinogenu, obzvláště na vitaminu K, jako faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C, protein S případně protein Z.

Proteiny se mohou vyskytovat jako jednotlivé faktory, s výhodou ve vyčištěné formě, nebo jako komplexní směsi.

Při jedné obzvláště výhodné formě provedení obsahuje biologický materiál nejméně jeden faktor prothrombinového komplexu a je obzvláště materiál obsahující frakci obsahující prothrombinový komplex nebo faktor VII, příkladně se vychází z odpovídajícího zbytku (kryozbytek) po kryoprecipitaci plasmy.

Přípravek podle vynálezu je s výhodou přípravek s aktivitou FEIB (Factor Eight Inhibitor Bypassing-Activity), tedy přípravek, který je vhodný k ošetření pacientů s inhibicí faktoru VIII.

Materiál pocházející z buněčné kultury je s výhodou materiál obsahující rekombinantně vyrobené krevní faktory, mezi nimi faktory vnitřního nebo vnějšího srážení, fibrinolyzy, trombolyzy nebo jejich inhibitorů, obzvláště krevních faktorů závislých na vitaminu K. Jako buňky přicházejí v úvahu běžné buňky pro expresi rekombinantních proteinů, s výhodou buňky savců, jako příkladně Věro-, CHO- nebo BHK-buňky. Odpovídající proteiny se mohou přímo ze surového buněnčného extraktu podrobit způsobu podle vynálezu k inaktivaci případně se vyskytujících patogenů, může se ale také jednat o předěištěnou buněčnou frakci.

• ··9 99 9 • · φ ·· · · · ·

Chemický prostředek je příkladně detergent (amfifil, tenzid), který je s výhodou obsažen v množství nejméně 1 %, výhodněji více jak 5 %, nejvýhodněji více jak 10 %; podle vynálezu se ale také mohou použít jiné chemické prostředky, obzvláště takové, u kterých je již příkladně znám virucidní, baktericidní nebo depyrogenaění účinek, případně směsi nejrůznějších chemických prostředků.

Výběr je však limitován tím, aby nebyla podstatně ovlivněna nativita biologického materiálu. Pro ekonomický způsob se volí chemikálie, která zachová biologickou aktivitu materiálu více jak 50 %, vztaženo na aktivitu před inkubací, s výhodou nejméně 70 %, obzvláště více jak 85 %. Zachování biologické aktivity znamená, že proteiny obsažené v biologickém materiálu mohou vykonávat jim přirozeně připsané funkce případně různé funkce. Tato biologická aktivita se potom může podle druhu proteinu zjišťovat a udávat, příkladně pomocí standardizovaného chromogeního testu nebo stanovením antigenů. Případně se chemický prostředek po inkubaci oddělí.

Jako detergent se obecně rozumí syntetická, organická substance aktivní na hraničních plochách.

S výhodou se pro způsob podle vynálezu použije neionický detergent. Neionické tenzidy jako polyether, obzvláště alkylfenolpolyglykolether jsou mezi jiným produkty ethoxylace mastných kyselin, amidů mastných kyselin, mastných aminů, mastných alkoholů, aminoxidů, esterů mastných kyselin polyalkoholů a esterů cukrů.

Takový tenzid nepůsobí na proteiny denaturačně a s vý• · «·' Φ φ · 9 · · • Φ φφ φφ φφφφ * · φ Φφφφ • · · φ φ «φφφφφ φ φ φ φ · «ΦΦ «♦· ΦΦΦ φφ (Ί hodou se vybere ze skupiny polysorbátů a tritonu. Jako polysorbát se příkladně používá Tveen^.

Pokud se detergenty použijí jako chemické prostředky, potom se tyto detergenty podle výhodné formy provedení vynálezu použijí bez přídavku dalších prostředků, obzvláště bez přídavku toxických organických látek nebo rozpouštědel, jako příkladně TNBP. Tím se minimalizuje riziko kontaminace .

Biologický materiál se způsobem podle vynálezu inkubuje chemickým prostředkem. Inkubace znamená uvést v kontakt biologický materiál s roztokem, suspenzí nebo emulzí chemického prostředku po dostatečně dlouhou dobu potřebnou k inaktivaci případně přítomných patogenů případně pyrogenů při určité teplotě. Uvedení v kontakt se může příkladně provést jednoduchým ponecháním směsi po definovanou dobu.

Inkubace se podle předloženého vynálezu provádí v přítomnosti eluotropní sole. Jako eluotropní sůl se dále rozumí sůl ve směsi s chemickým prostředkem nebo sůl v komplexním přípravku, s vlastností vyloužit adsorbované látky z pevných adsorbentů nebo adsorbentů napojených kapalinou nebo gelovitých adsorbentů a/nebo vytlačit. S výhodou se v případě eluotropních solí jedná o desorpční prostředek, jaký se používá pro chromatografické procesy. Adsorbovaná látka je podle toho dostatečně rozpustná v přítomnosti eluotropní soli, to znamená, že se s výhodou voli podmínky, za kterých nedochází ke srážení biologického materiálu.

Druh a koncentrace soli případně přípravku se obecně volí podle použitého adsorbentů. Eluční účinek soli závisí • · · příkladně na polaritě rozpouštědla, stoupá tedy příkladně v pořadí ethanol - aceton - methanol - voda. Adsorbent může být pevnou fází, obzvláště matrice vhodná pro iontoměničovou chromatografií. V přípravku obsahujícím eluotropní sůl mohou být obsaženy ještě další přísady, příkladně další soli.

S výhodou se v případě přípravků jedná o vodné přípravky s pH hodnotou v rozmezí mezi 6,0 až 8,0, výhodněji okolo 7,0.

Při výhodné formě provedení se jako eluotropní sůl použije chlorid sodný, ale i jiné soli alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, mezi nimi chlorid vápenatý. Jako eluotropní soli se mohou použít i tak zvané chaotropy, jako příkladně močovina, rhodanidy nebo guanidin. Koncentrace soli je nejméně s: 200 mmol/1, s výhodou 2: 300 mmol/1. Horní hranice použité koncentrace závisí obzvláště na rozpustnosti dané soli a pro chlorid sodný činí příkladně okolo 2 mol/1. Chaotropní látky, jako příkladně močovina, se mohou dokonce případně použít v koncentraci až do 8 mol/1.

Inkubace biologického materiálu chemickými prostředky se provádí po dobu dostatečně dlouhou k inaktivaci případně přítomných patogenů, s výhodou po dobu mezi 10 minut a 10 hodin, nejvýhodněji mezi 1 hodinou a 5 hodinami. Doba potřebná ke způsobu podle vynálezu se může zjistit pomoci modelových virů jako HIV, Sindbis-, FSME- nebo virů hepatitidy předběžným pokusem.

Také volba teploty ovlivňuje použitou dobu. Při způsobu podle vynálezu se s výhodou inkubuje při teplotě místnosti, příkladně v rozmezí teplot mezi 15 a 45 °C, obzvláště mezi 20 a 30 °C.

• · • · · 9 ··

Při způsobu podle vynálezu se biologický materiál s výhodou adsorbuje na pevný nosič, vyčistí se a inkubace se provádí bezprostředně po elucí vyčištěného materiálu, přičemž eluát se ještě dále zpracovává, příkladně centrifugací, filtrací nebo jinými fyzikálními metodami.

Pevný nosič je s výhodou materiál vhodný pro chromatograf ii, obzvláště nosič vhodný pro iontoměničovou chromatografii, hydrofobní chromatografii nebo afinitní chromatografii. Příkladně se používají materiály jako Sepharose , Superdex , Sephadex , Spherodex , Toyopearl , nebo anorganické materiály jako hydroxylapatit.

Jako iontoměniče se mohou používat iontoměničové materiály, jako příkladně DEAE-Sephacel^, DEAE-Sephadex^,

DEAE-Sepharose^ CL6B, DEAE-Sepharose^ Fast Flow, QAE-SephaR R R dex , Q-Sepharose Fasl Flow, Q-Sepharose High Performance, n

DEAE-Tris-Acryl, DEAE-Spherodex , Q-Hyper-D (dodávaný firmou Sepracor), DEAE-Toyopearl^, QAE-Toyopearl^, Fractogel^ EMD-TMAE nebo jiné Fractogelové materiály.

Jako příklady hydrofobních chromatografických materiálů lze příkladně uvést Butyl-Sepharose , Octyl-Sepharose , Phenyl-Sepharose^, Fractogel^ TSK-butyl, t-Butyl-HIC Support nebo TSK-Gel Butyl Toyopearl^.

Biologický materiál se může přímo z komplexní směsi adsorbovat na nosič a čistit, inaktivačnímu kroku mohou ale předcházet nebo jemu následovat také další kroky k čištění materiálu, přičemž v rámci předloženého vynálezu je výhodné další chromatografické čištění.

Způsobem podle vynálezu se patogeny inaktivují. Jako patogeny se rozumí také produkty degradace příkladně virů, obzvláště také izolovaný genom nebo jeho fragmenty.

Patogeny mohou být patogeny obklopené lipidy, jako příkladně Hepatitis-B-Virus, nebo nelipidické patogeny, jako příkladně Hepatitis-A-Virus.

Způsoby inaktivace virů se dnes označují za účinné, jestliže po použití způsobu na vzorku biologického materiálu, který byl smíchán s vysokou dávkou testovaného viru, příkladně HI-viru nebo Sindbis-viru jako modelového viru pro viry Hepatitis nelze ve vzorku prokázat žádné viry a titr viru byl tak redukován pod hranici prokazatelnosti. Průkaz a kvantifikace nukleových kyselin se může příkladně provádět pomocí metody PCR, jak se popisuje v AT-PS 401 062 nebo přímou titrací.

Jako míra inaktivace je znám tak zvaný redukční faktor, který se po jediném přidání testovaného viru vypočítá z dekadického logaritmu kvocientů počátečního a konečného titru viru. Podle evropské směrnice EC III/8115/89-EN Komise evropského společenství je dále znám tak zvaný celkový redukční faktor. Vypočítá se ze součtu redukčních faktorů jednotlivých subsekvenčních inaktivačních opatření.

S výhodou se provádí také další nezávislý krok k inaktivaci případně redukci kontaminace patogeny . Zde přicházej i v úvahu všechny podle stavu techniky známé způsoby k minimalizaci infekčního rizika.

Obzvláště se jako další krok k inaktivaci případně redukci kontaminace provádí filtrace a/nebo ošetření teplem.

4 » 4 · 4 4 · · v*··· · · · 4 4 4 4 4 • •4 4 4 «444

4 4 4 4 4 4 444444

4 4 4 4 4 4

444 444 444 44 44

Jako filtrace se s výhodu provádí nanofiltrace. Výhodné ošetření teplem se provádí na pevném biologickém materiálu, příkladně na lyofilizátu s řízeným obsahem vody, příkladně obsahem vody mezi 5 a 8 % a teplotě mezi 50 a 80 °C, jak se popisuje v EP 0 159 311.

Při jedné výhodné formě provedeni se provádí dvoustupňové ošetření s detergentem jako chemickým prostředkem. Přitom se v prvním kroku použije detergent v množství nejméně 1 %, s výhodou nejméně 5 %, nejvýhodněji nejméně 10 %.

Ve druhém stupni se použije další detergent v množství nejméně 10 %, s výhodou nejméně 12 %, nejvýhodněji nejméně 14 %. Použitý detergent může být pro oba dva stupně stejný, mohou se ale také použít rozdílné detergenty. Zcela obecně lze kombinací kroků k inaktivaci virů silně redukovat případně vyloučit riziko virové infekce po podání příslušného preparátu.

Podle předloženého vynálezu se dává k dispozici také chromatograficky čištěný přípravek, obsahující autodynamicky aktivovatelný krevní faktor s podílem aktivovaného krevního faktoru méně než 50 %, vztaženo na obsah aktivovaného a neaktivovaného krevního faktoru, s výhodou méně než 40 %, výhodněji méně než 30 %, ještě výhodněji méně než 20 %, ještě více výhodněji méně než 10 %, nejvýhodněji méně než 1 %, a s obsahem detergentu.

Obzvláště se jedná o přípravek obsahující prothrombinový komplex s aktivitou faktoru Vila méně než 50 %, vztaženo na obsah aktivovaného a neaktivovaného faktoru VII, s výhodou méně než 10 % a nejvýhodněji méně než 1 %. Obsah detergentu v přípravku podle vynálezu přitom odpovídá farma18 • · · fr » · · · ·

Ο · · · · · frfr · · · · • frfr · · · · · · • fr · · · · fr ······ frfrfr frfr frfr • fr frfrfr frfr· frfrfr frfr frfr ceuticky přijatelnému množství, s výhodou mezi 1 % a hranicí prokazatelnosti detergentu.

Jako autodynamicky aktivovatelný krevní faktor se podle předloženého vynálezu rozumí krevní faktor, který je aktivovatelný autokatalyticky, kontaktem na povrchu nebo pomocí procesu, jako příkladně chromatografického procesu. Obzvláště je takový krevní faktor vybrán ze skupiny faktor VII, faktor XII, faktor XI a prekallikrein.

V další výhodné formě provedení neobsahuje přípravek inhibitory serinproteázy, jako příkladně inhibitory thrombinu, případně kofaktory, jako příkladně heparin. Ve specielní formě provedení je nepřítomnost substancí tohoto druhu dána již během chromatografického procesu.

Proto se předložený vynález týká také odpovídajících přípravků, které se mohou získat způsobem podle vynálezu.

V přípravcích podle vynálezu mohou být obsaženy také další přísady, příkladně stabilizačně působící substance jako aminokyseliny.

Následujícími příklady má být předložený vynález ještě blíže vysvětlen, aniž by se však na tyto příklady omezoval.

··· φ · · · φ φ • · · φ · φ · φ φ φ φ φ φ • · · φ · φ φ

Φ· ··· Φ·· φφφ φφ φφ

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1

Stanovení faktoru VIII

Stanovení antigenu faktoru VIII ve FEIBA se provádí metodou podle Moritz B. a spol (Thromb. Haemost. 1997,

Suppl: 31). Při tomto stanovení se monoklonální protilátkou proti lehkému řetězci molekuly faktoru VIII jako Captureprotilátky a pomocí monoklonální protilátky jako detekční látky, rovněž proti lehkému řetězci molekuly faktoru VIII, avšak směrované proti jinému epitopu, prokáže selektivně faktor VIII vedle dalších proteinů plasmy ve FEIBA.

Příklad 2

Stanovení fosfolipidů

Organicky vázaný fosfát se extrahuje z lyofilizovaného prášku frakce FEIBA metodou podle Folch J. a spol. (J.Biol. Chem. 1957, 226:497-509) pomocí směsi rozpouštědel sestávající z chloroformu a methanolu v poměru 2 objemové díly chloroformu k jednomu objemovému dílu methanolu. Extrakt obsahující veškerý podíl fosfolipidů se následně převede do teflonové nádobky a organická rozpouštědla se odpaří v proudu dusíku. Po přídavku pufru (20 ml Tris HC1, 150 mM chloridu sodného, pH 7,4) a Oxisolvreagenz (firma Merck) se teflonová nádoba těsně uzavře a digeruje po dobu 5 hodin při teplotě 160 °C. Digerací uvolněný fosfát se kvantitativně stanoví fotometricky jako molybdenový komplex metodou podle Ames B.N. (Methods in Enzymology 1966, 8:115-118).

Příklad 3

Výroba afinitního nosiče vázajícího faktor VIII

Způsobem popsaným ve FEBS.Lett. 1994, 351:345-348 se vyrobí buněčný klon CHO-, který produkuje rekombinanty Villebrandova faktoru. Transfekcí s vektorem kódujícím pro humánní cDNA furin (van den Ouweland a spol., Nucleic Acid Res. 1990, 18:664) se buněčná linie uvede k Co-expresi humánního furinu. Stabilní buněčné klony tohoto druhu byly v provozním měřítku fermentovány v perfusních reaktorech na mikronosičích (Blůml a spol. v : Spier RE, Griffith JB, Berthold V, eds Animal cell technology. Oxford, London: Butterworth-Heinemann, 1994:267-269).

Čištění se provádí dvoustupňovým chromatografickým procesem podle Thromb.Haemost. 1995, 73:1160. Získá se frakce desorbovaná elucí kuchyňskou solí a přepufruje se gelovou filtrací přes Sephadex G25 (firma Pharmacia) v pufru obsahujícím 20 ml Tris HC1, 150 mM chloridu sodného, pH 7,5. Následně se přípravek zakoncentruje pomocí ultrakoncentrace přes membránu Amicon YM30 (cut-off : 30.000 D) na koncentraci proteinu 3 mg/ml. Koncentrace Villebrandova faktoru v tomto přípravku činí 60 E vVF-antígenu/mg proteinu.

Přípravek rekombinantního Villlebrandova faktoru se zředí pufrem, obsahujícím 20 ml Tris HC1, 150 mM chloridu sodného, pH 7,5, na 1,5 mg/ml. Předem aktivovaný gel, vhodný pro afinitní chromatografii (Actigel, ALD-Superflow, firma Sterogone) se excesivně promyje pufrem obsahujícím 20 ml Tris HC1, 150 mM chloridu sodného, pH 7,5. Jeden objemový díl promytého gelu se smíchá s 1,1 objemového dílu proteinového roztoku, který se má imobilizovat a následně se přidá

9 · · · ·· · · • · · · 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 · 999999 • · 9 9 9 9 9

999 999 999 99 99

0,15 objemového dílu roztoku 0,1 M kyanborhydridu (NaCNBHg) v 0,1 M fosfátovém pufru, pH 7,0. V tomto pufru se gel třepáním suspenduje a za pokračujícího třepání sé inkubuje po dobu 16 hodin při teplotě místnosti. Následně se gel promyje na sintrové nuči desetinásobným objemem pufru obsahujícím 20 ml Tris HCl, 150 mM chloridu sodného, pH 7,5 a pětinásobným objemem pufru, obsahujícím 20 ml Tris HCl, 2 M chloridu sodného, pH 7,5. Potom se ještě ekvilibruje pěti objemovými díly pufru 20 ml Tris HCl, 150 mM chloridu sodného, pH 7,5 a gel se převede na chromatografický sloupec s rozměry průměr k výšce gelového lože 1:4. Stanovením koncentrace proteinu v roztocích inkubačního zbytku roztoku Villebrandova faktoru a afinitního gelu, oddělených na sintrové nuči a rovněž promývacích roztoků bylo možné zjistit poměr navázání více jak 90 % použitého proteinu.

Příklad 4

Výroba prothrombinového komplexu neobsahujícího faktor VIII kontaktem s afinitním gelem (toho času podle názoru přihlašovatelky nej lepší cesta k provedení vynálezu)

Farmaceutický preparát FEIBA S-TIM4 IMMUNO (1000 jednotek) se rekonstituuje ve 20 ml destilované vody. Po úplném rozpuštění lyofilizovaného prášku obsahuje roztok koncentraci účinné látky 50 jednotek v ml. 10 ml tohoto roztoku se uvede v kontakt se 100 mg výše popsaného imobilizovaného Villebrandova faktoru a inkubuje se po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti za lehkého třepání. Následně se imobilizát odstraní filtrací přes sintrovou nuč. Roztok FEIBA obsažený ve filtrátu vykazuje aktivitu 49 jednotek FEIBA/ml. Vazbou faktoru VIII obsaženého v preparátu na imobilizovaný Villebrandův faktor byl antigen faktoru VIII v tomto • · · · « ·· · · · · • · přípravku pod hranicí prokazatelnosti.

Příklad 5

Výroba aktivovaného prothrombinového komplexu neobsahujícího faktor VIII readsorpcí na nespecifickém nosiči mg DEAE-Sephadex^ A-50 firmy Pharmacia se po dobu 15 minut při teplotě místnosti inkubuje k botnání s 1 ml roztoku 30 g/1 chloridu sodného ve vodě . Potom se gel oddělí centrifugací od nabotnaného zbytku. Následně se pětkrát provede promytí gelu vždy 1 ml pufru (9 g/1 Na2HPO₄ .

H2O, 7 g/1 NaCl, pH 7,0) a další dvě promytí pufrem (7 g/1 citrátu troj sodného . 2 H₂0, 7 g/1 NaCl) a rovněž resuspendace a centrifugace.

ml čerstvě zamražené lidské citrátové plasmy se roztaví při 0 až +4 °C a vzniklý kryoprecipitát se oddělí centrifugací při teplotě +2 °C. Vzniklý kryozbytek se

TD inkubuje promytým DEAE-Sephadex , přičemž se generuje FEIBA a spolu s faktory protrombinového komplexu a inertním proteinem se adsorbuje na gel. Potom se koadsorbovaný inertní protein odstraní z DEAE-gelu promytím pufrem (9 g/1

Na₂HP0₄ . 2 H₂0, 7 g/1 NaCl).

Gelový proteinový komplex vlhký pufrem se nyní suspenduje s 1,5 ml roztoku 150 mg/ml TVEEN^-80 a 30 mg/ml chloridu sodného po dobu 1 hodiny při teplotě 26 °C. Ošetřením roztokem vyššího iontového škrobu se protein společně s faktory protrombinového komplexu a případně přítomnými patogeny desorbuje. Následně se suspenze zředí přídavkem 6,5 ml vody a jednu hodinu se readsorbuje při teplotě místnosti, přičemž se frakce prothrombinového komplexu nově readsorbuje. Nyní • · · φ · • · φ φ · · « • · · φ φ «φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ · φ φφφ φ φ φ φ se zároveň readsorbuje na gel nepatrná část faktoru VIII obsažená v proteinové frakci. Gel/proteinový komplex se potom pětkrát promyje vždy 1 ml roztoku 7 g/1 chloridu sodného ve vodě do odstranění detergentu.

K elucí se gel zpracuje za míchání s 0,7 ml roztoku 30 g/1 chloridu sodného ve vodě. Eluát se potom dialyzuje proti destilované vodě, zamrazí se a lyofilizuje. Po rekonstituci lyofilizátu se stanoví aktivita FEIB podle AT-B 350 726.

Dále se stanoví obsah antigenu faktoru VIII. Jako kontrola slouží konvenčně vyrobený preparát FEIBA, jaký se popisuje v AT 350 726. Přípravek získaný popsaným způsobem vykazuje ve srovnání s kontrolou obsah faktoru VIII snížený o faktor 10.

Kontaktem s detergentem se inaktivuji také případně přítomné patogeny, obzvláště viry obklopené lipidy.

Příklad 6

Výroba aktivovaného prothrombinového komplexu neobsahujícího faktor VIII a neobsahující fosfolipidy readsorpcí na nespecifickém nosiči n

mg DEAE-Sephadex A-50 firmy Pharmacia se po dobu 15 minut při teplotě místnosti inkubuje k botnání s 1 ml roztoku 30 g/1 chloridu sodného ve vodě . Potom se gel oddělí centrifugací od nabotnaného zbytku. Následně se pětkrát provede promytí gelu vždy 1 ml pufru (9 g/1 Na₂HP0₄ .

H₂0, 7 g/1 NaCl, pH 7,0) a další dvě promytí pufrem (7 g/1 citrátu troj sodného . 2 H₂0, 7 g/1 NaCl) a rovněž re24 ·· · · · ·· ·· ···· · * ·· · · · · • · · · · ···· • · · · * · · ······ • · · · · · · «· ··· ··· «·· ·· ·· suspendace a centrifugace.

ml čerstvě zamražené lidské citrátové plasmy se roztaví při 0 až +4 °C a vzniklý kryoprecipitát se oddělí centrifugací při teplotě +2 °C. Vzniklý kryozbytek se inkubuje promytým DEAE-Sephadex^, přičemž se generuje FEIBA a spolu s faktory protrombinového komplexu, faktorem VIII, fosfolipidy a inertním proteinem se adsorbuje na gel. Potom se koadsorbovaný inertní protein odstraní z DEAE-gelu promytím pufrem (9 g/1 Na2HP04 . 2 H2O, 7 g/1 NaCl).

Gelový proteinový komplex vlhký pufrem se nyní suspenduje s 1,5 ml roztoku 1 mg/ml TVEEN^-80 a 30 mg/ml chloridu sodného po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, přičemž se deadsorbuje proteinová frakce a nespecificky adsorbované nečistoty. Následně se gel oddělí filtrací. Proteinový roztok se nyní dalším přídavkem TVEEN^-80 doplní na koncentraci detergentu 150 mg/ml a následně se inkubuje 1 hodinu za míchání. Následně se zředí přídavkem 6,5 ml vody a gel se readsorbuje na připravený čerstvě promytý DEAE-Sephadex^ A-50, přičemž se frakce prothrombinového komplexu nově readsorbují. Nyní se zároveň readsorbuje na gel nepatrná část faktoru VIII obsažená v proteinové frakci. Následně se pětkrát promyje vždy 1 ml roztoku 7 g/1 chloridu sodného ve vodě do odstranění detergentu. Přitom se odstraní také vázaný fosfolipid, který byl po kontaktu s amfifilem solubilizován.

K eluci se gel zpracuje za míchání s 0,7 ml roztoku 30 g/1 chloridu sodného ve vodě. Eluát se potom dialyzuje proti destilované vodě, zamrazí se a lyofilizuje. Po rekonstituci lyofilizátu se stanoví aktivita FEIB podle AT-B 350 726 .

φ φ φ φφφ φφφ

Dále se stanoví obsah antigenů faktoru VIII a fosfolipidu jak je popsáno. Jako kontrola slouží konvenčně vyrobený preparát FEIBA, který byl získán podle AT 350 726. Přípravek získaný popsaným způsobem vykazuje ve srovnání s kontrolou snížený obsah faktoru VIII a neobsahuje fosfolipidy. Výsledky analyzy jsou shrnuty v Tabulce 1.

Tabulka 1

Obsah faktoru VIII/fosfolipidu

	FEIBA	FVIIIC:Ag	FVIIIC:Ag	Fosfolipid
FEIBA
	U/ml	U/ml	u/u	nMFosfat/ U FEIBA
FEIBA (standard)	51	7,0	0,14	0,14
FEIBA (produkt podle vynálezu)	70	1,0	0,01	< 0,02

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Imunotolerantní farmaceutický přípravek prothrombinového komplexu, obsahující faktory II, IX, X a případně VII vyznačující se tím, že vykazuje obsah antigenu faktoru VIII méně než 0,1.
2. 2. Farmaceutický přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že je vyroben z plasmy nebo z frakce plasmy.
3. 3. Farmaceutický přípravek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že přípravek obsahuje nejméně jeden z faktorů IXa, Xa a Vila a vykazuje aktivitu FEIB.
4. 4. Farmaceutický přípravek podle některého z nároků 1 až 3,vyznačuj ící se tím, že neobsahuje fosfolipidy.
5. 5. Způsob výroby přípravku podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky :

   a) poskytnutí plasmy nebo frakce plasmy obsahující faktory II, IX, X a případně VII,

   b) uvedení plasmy nebo frakce plasmy v kontakt s nosným materiálem, případně v přítomnosti detergentu, takže se oddělí faktor VIII a případně fosfolipidy od faktorů II, IX, X a případně VII, ♦ · · ···

   c) čištění plasmy nebo frakce plasmy, a d) získání frakce obsahující faktory II, IX, X a případně VII . 6. Způsob podle nároku 5, v y značující se tím, že se kroky b) a c)

   provádějí jako jeden procesní krok.
6. 7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že nosný materiál je materiál vhodný pro chromatografii, filtraci a/nebo nanofiltraci.
7. 8. Způsob podle některého z nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že nosný materiál je specifickým nosným materiálem pro faktor VIII, obzvláště matrice vhodná pro afinitní chromatografii.
8. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že matrice je matrice obsahující vVF.
9. 10. Způsob podle některého z nároků 5 až 9, vyznačující se tím, že se faktor VIII a případně fosfolipid adsorbují na nosném materiálu.
10. 11. Způsob podle některého z nároků 5 až 7, vyznačující se tím, že nosný materiál vykazuje vyšší afinitu pro prothrombinový komplex než pro faktor VIII a obzvláště je slabým aniontoměničem.
11. 12.

    Způsob podle nároku 11,

    ΦΦ Φ φ φ φφ φφ • · · · ♦ φ φ · φ φ · φ φ · φ φ φ φ φ • · · φ φ φ φφφφφφ • φ φ φ φ φ

    Φ· φφφ φφφ φφφ φφ φφ vyznačující se tím, že se faktory II, IX, X a případně VII adsorbuj i, zatímco faktor VIII a případně fosfolipidy se eluuji.
12. 13. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že se faktory II, IX,

    X a případně VII neváží na nosný materiál.
13. 14. Způsob podle některého z nároků 5 až 13, vyznačující se tím, že detergent je neionický detergent, obzvláště polyether.
14. 15. Způsob podle některého z nároků 5 až 14, vyznačující se tím, že se detergent po kontaktu s plasmou nebo frakcí plasmy odstraní.
15. 16. Způsob podle některého z nároků 5 až 15, vyznačující se tím, že se frakce plasmy získá chromatografií, srážením nebo centrifugací, případně je zbytkem z kryoprecipitace.
16. 17. Způsob podle některého z nároků 5 až 15, vyznačující se tím, že frakce plasmy vykazuje nejméně intermediární čistotu.
17. 18. Způsob podle některého z nároků 5 až 17, vyznačující se tím, že se provede nejméně jeden krok k inaktivaci nebo omezení kontaminace viry nebo částmi virů, obzvláště vybraný ze skupiny ošetření teplem, ošetření parou, ošetření rozpouštědlem a/nebo ošetření detergentem a nanofiltrace.
18. 19.

    Přípravek podle nároku 1, získaný způsobem podle náro ·· ··· ··· • · · · · • · ··· ··· • · · ··· ·· ·· ku 5 .
19. 20. Použití přípravku podle nároku 1 k výrobě léčiva k ošetření pacientů s inhibici faktoru VIII , tedy s hemofilií A , obzvláště pacientů s titrem inhibitoru větším než 1 Bethesda E/ml plasmy, s výhodou větším než 5 Bethesda E/ml plasmy.