CZ2000982A3 - Farmaceutický preparát obsahující jednotlivé faktory, závislé na vitaminu K a jeho použití - Google Patents

Abstract

Řešení se týká farmaceutického separovaného preparátu prothrombinového komplexu, který obsahuje nejméně dva vysoce čistéjednotlivé krevní faktory závislé na vitaminu K jako účinné látky.

Description

Farmaceutický preparát obsahující jednotlivé na vitaminu K a jeho použití faktory závislé

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutického preparátu obsahujícího jednotlivé faktory závislé na vitaminu K.

Dosavadní stav techniky

Proteiny závisející na vitaminu K se vyznačují tím, že pro svou biosyntézu zásadním způsobem vyžadují vitamin K.

Tak příkladně prothrobmin (faktor II), který se tvoří za účinku antagonistů vitaminu K, neváže na rozdíl od normálního prothrombinu Ca . Normální prothrombin obsahuje na N-konci gWHťZ-karboxyglutamát, tedy druhou karboxylovou skupinu na glutamátovém zbytku. Během biogeneze funkčního prothrombinu se totiž karboxyluje v aminofunkční koncové oblasti proteinu prvních deset glutamátových zbytků enzymového systému závislého na vitaminu K na gama-karboxyglutamát. Tato gízmíz-karboxyglutamátová skupina je velmi silným chelátorem pro ionty vápníku. Přes tyto vázané Ca ionty se prothrombin váže na fosfolipidové membrány, které pocházejí z buněčných membrán, příkladně z krevních destiček, aby tak vznikla správná topologie k iniciaci krevní srážlivosti.

Nejenom prothrombin obsahuje g-ama-karboxyglutamátové zbytky, nýbrž i faktory srážlivosti VII, IX a X se karboxylují na specifických glutamátových zbytcích, aby tak vytvořily vysokou afinitu vůči iontům vápníku. Ale také další proteiny podílející se na kaskádě srážlivosti, jako •0 ·· 0 ·· 00 00 000 0 · 0 0

0 000 0 00 0 0 000 0000000 00 · protein C, protein S a protein Z potřebují ke své biosyntéze vitamin K.

Jednotlivé faktory závislé na vitaminu K, obzvláště faktory II, VII, IX a X vykazují podobné fyzikálně chemické vlastnosti, jako příkladně podobnou molekulovou hmotnost, pl s, elektroforetlckou mobilitu a tak dále, a získávají se proto zpravidla společně jako prothrombinový komplex (jiné označení : faktor IX-komplex nebo PPSB-komplex). S ohledem na podobnou charakteristiku proteinů je obtížné, preparativně vyrobit jednotlivé faktory. Výroba preparátů prothrombinového komplexu za současné izolace všech obsažených faktorů má proto podle stavu techniky vždy přednost před výrobou koncentrátů krevních faktorů při výrobě farmaceutických preparátů (viz Brummelhuis v Methods of Plasma Protein Fractionation, ed. Curling, 1980, Academie Press, strany 117-128). Rovněž se ale také ukazuje, že faktory prothrombinového komplexu na základě jejich rozdílné stability případně poločasu účinnosti nemohou být nikdy získány za fyziologických poměrů (vždy 1 E proteinu), (viz Můller a spol., Krankenhauspharmazie 13 (11), (1992), strany

528-531; Kóhler a spol., Thrombosis Research 60 (1990), strany 63-70).

V EP-A 0 700 684 se popisuje koncentrát prothrombinového komplexu spolu s nejméně jednou další složkou podporující srážlivost krve jako obranný prostředek pro krevní antikoagulancia.

Vzniká riziko, že koncentráty prothrombinového komplexu na základě jejich čištění z komplexních směsí proteinů obsahují aktivované faktory krevní srážlivosti, které jsou většinou aktivními serinproteázami. Právě u pacientů by ale toto «toto ·· ·· «· »«· ···· ·· · · · · *··· to ·«· to to to to · to to to· to nemělo docházet ke koagulaci, protože vznik tromboz může být případně je fatální. Dokonce i když jsou v takovém preparátu přítomny i jen stopy těchto aktivovaných faktorů krevní srážlivosti, obzvláště thrombinu, dochází k proteolytické inaktivaci jednotlivých faktorů, která podle individuální stability jednotlivých faktorů může mít závažné důsledky. Obecně maj i koncentráty prothrombinových komplexů sklon k nestabilitě a jsou proto nevhodné pro delěí skladování.

K těmto odbourávacím reakcím, obzvláště pomocí thrombinu, dochází dokonce i v pevném stavu, to znamená, že ani dokonce vysušení případně lyofilizace preparátu nevede ke spolehlivé stabilitě při skladování.

Dále jsou koncentráty prothrombinového komplexu mimořádně nepružné z hlediska relativních poměrů obsažených jednotlivých faktorů. Neni prakticky možnost v průběhu čištění prothrombinového komplexu ovlivnit tyto relativní poměry, především je pak nevýhodou v případě, kdy se požaduje prothrombinový komplex obohacený určitými faktory.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu je proto připravit kombinované farmaceutické preparáty proteinů závislých na vitaminu K, které jsou z hlediska jejich složení přesně definované případně definovatelné, mají vysokou stabilitu, obzvláště při dlouhodobém skladováni a rovněž mají vysokou flexibilitu při změně složení.

Tetno úkol se podle vynálezu řeší farmaceuticky separovaným preparátem prothrombinového komplexu obsahuj ího jako účinné látky nejméně dva chromatograficky čištěné • 4 4 · · 4 · · ♦ 4

4 4 4 4 4 4 4444

44 4444 4 « 4 ·

4 4 44 4444444 · 4 4

444 44 4 4444

44444 4 · 4 44 44 jednotlivé faktory závislé na vitaminu K. Především má preparát podle vynálezu obsahovat vysoce čistý faktor IX v kombinaci s nejméně jedním dalším vysoce čistým jednotlivým faktorem závislým na vitaminu K.

Na rozdíl od stavu techniky, podle něhož se prothrombinový komplex vyrábí vždy jako čištěný prothrombinový komplex a nikoliv kombinací jednotlivých faktorů a kromě toho je v nej lepším případě k dispozici pouze v intermediární, tedy pouze ve střední čistotě, je dán předloženým vynálezem k dispozici preparát, který neobsahuje rušivé nečistoty, obzvláště nečistoty s thrombinovou aktivitou. Obzvláště se podle vynálezu jednotlivé kombinované faktory čistí chromatografickými čisticími procesy, jako je chromatografie na iontoměničích, hydrofobní chromatografie, afinitní chromatografie a/nebo molekulová vylučovací chromatografie z plasmy případně rekombinantních buněk. Tím může většina jednotlivých faktorů závislých na vitaminu K dosáhnout vždy specifické aktivity nejméně 50 % teoretické čistoty, s výhodou nejméně 70 %, obzvláště výhodně nejméně 90 %, až k teoretické čistotě jednotlivého faktoru. Podle toho je také výhodné používat faktory, které v podstatě neobsahují 5 %) produkty denaturace.

Při farmaceutické výrobě přípravků proteinů krevní srážlivosti se zpravidla rozlišují tři různé stupně čistoty : nízký, střední a vysoký.

• · » « • 0 0 0 » 0 0 0

I 9 0 ·

0 0

Tabulka 1

	Poločas stability in vivo	Teoretická čistota
Faktor II	60 hodin	0,1 E/mg
Faktor VII	2 - 2,5 hodin	2000 (1667-2500)
Faktor IX	18 - 24 hodin	250 (200-333)
Faktor X	40 hodin	118 (100-143)

Obzvláště při zjišťování aktivity faktoru II jsou na základě přítomnosti stop faktoru Ila vždy znovu získávány chybné výsledky, protože již stopy faktoru Ila stanovení koncentrace faktoru II natolik znepřesní, že mohou být zjištěny dokonce několikanásobně vyšší hodnoty, než by byly pro teoretickou čistotu. V případě faktoru VII jsou hodnoty oproti jiným faktorům o něci nižší protože faktor VII je velmi labilní protein, který mimořádně rychle konvertuje na faktor Vila. Proto se již přípravky faktoru VII, které obsahují více jak 10 % teoretické čistoty, považují za vysoce čisté.

Protože se preparát podle vynálezu obzvláště z hlediska jeho aktivity případně stupně čistoty skládá z velmi přesně definovaných jednotlivých faktorů, může se také vzájemný poměr jednotlivých faktorů optimálně nastavit. Přitom se mohou předem eliminovat problémy, které vyplývají v průběhu dalšího zpracování koncentrátů komplexu všech proteinů podle stavu techniky, příkladně ztrátou aktivity při inaktivaci virů, ale také procesy, ke kterým dochází během čisticího procesu, protože po spojení vysoce čistých jednotlivých faktorů v preparát podle vynálezu se již s výhodou nemusí proA A A vádět žádné další zpracovatelské operace.

Preparát podle vynálezu vykazuje tedy výhody standardizovatelnosti. Tím je zaručeno, že dané jednotlivé faktory jsou v preparátu obsaženy v daných koncentracích +/- 10 % odchylky.

Výhodné jednotlivé faktory se podle vynálezu vyberou ze skupiny sestávající z faktoru II, faktoru VII, faktoru IX, faktoru X, proteinu C, proteinu S a proteinu Z. Výhodné výrobní metody pro vysoce čisté preparáty těchto proteinů lze najít příkladně v EP 0 796 623 (faktory II a X), v A 594/97 (faktor VII), v EP 0 496 725 (faktor IX), EP 0 533209 (protein C) a v EP 0 406 216 (protein S).

V preparátu podle vynálezu se s výhodou spoj i nej méně faktory II, VII, IX a X, vycházející z vysoce čistých jednotlivých faktorů, přičemž se případně ještě mohou přimísit vysoce čisté jednotlivé faktory protein C, protein S a/nebo protein Z, aby bylo možno připravit pokud možno fyziologický prothrombinový komplex, to znamená prothrombinový komplex, který složením odpovídá fyziologickému - pouze bez rušivých doprovodných proteinů, které v průběhu čištění prothrombinového komplexu pronikají z plasmy, jako příkladně thrombin.

Jednotlivé faktory se mohou čistit z plasmy, obzvláště humání plasmy nebo se nohou vyrábět rekombinantně. Protože při výrobě rekombinantní DNA-technologií není nutné oddělení strukturálně a fyzikálně chemicky velmi podobných faktorů, sestaví se preparát podle vynálezu s výhodou z vysoce čistých rekombinantních jednotlivých faktorů. Faktor se může vyrobit také transgeně; může být derivátem, obzvláště pepti• ·· ·· · fefe fe* * · · · · · · · · · fe • ·· · · fe · · · β · • · · · fe fefe····· ·· · • fefe ·· · · · · · • ••fefe fefe · fefe ·· dem a/nebo fragmentem.

Jednotlivé faktory závislé na vitaminu K faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein S a protein C jsou klonovány a sekvencovány a jejich tvorba se příkladně popisuje ve Falkner a spol., Thrombosis and Haemostasis 68 (2) (1992), strany 119 až 124 pro proteiny, které jsou závislé na vitaminu K.

Podle vynálezu je možné snadno a v libovolných vzájemných poměrech upravit relativní poměry vysoce čistých jednotlivých faktorů, příkladně tak, aby tyto poměry odpovídaly přirozeným poměrům v krvi, tedy asi na jednotku jednoho faktoru je přítomna jednotka jiného faktoru. Výhodný preparát podle předloženého vynálezu proto obsahuje vysoce čisté faktory II, faktor VII, faktor IX a faktor X v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až

2) : (0,5 až 2) : (0,5 až 2). Pokud jsou v preparátu přítomny protein C, protein S a/nebo protein Z, potom také tyto jednotlivé faktory vykazují s výhodou relativní poměr 0,5 až 2.

Na druhé straně je podle vynálezu také možné sestavit jednotlivé faktory na základě jejich relativní stability, obzvláště s ohledem na jejich relativní poločas stability, to znamená, že se méně stabilního faktoru přidá více a stabilního faktoru přiměřeně méně. Přitom se může zároveň zohlednit předpokládaná doba použití případně účinku, to znamená čím delší je tato doba, tím významnější je i uplatnění těchto relativních poměrů.

Také rekombinantní proteiny s příkladně změněným poločasem stability se mohou přiměřeně standardizovat. Do standardizace faktorů mohou vstoupit i další hlediska, jako příkladně opětovné obnovení in-vivo (recovery).

Z tohoto hlediska výhodný preparát proto zahrnuje jednotlivé faktory, faktor II, faktor VII, faktor IX a faktor X v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 35) : (0,5 až 7) : (0,5 až 5), neboť poločas stability prothrombinu činí 60 hodin, faktoru VII 2 hodiny, faktoru IX 20 hodin a faktoru X 40 hodin. Výhodný preparát s těmito faktory proto obsahuje jednotlivé faktory, faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C a protein S v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 35) : (0,5 až 7) : (0,5 až 5) : (1 až

15) : (1 až 15) .

Protože faktor II je s odstupem nejstabilnější z těchto faktorů a proto i v jeho aktivované formě thrombinu nese největší riziko stability, je výhodný preparát, který neobsahuje žádný prothrombin. Faktor VII se většinou považuje za velmi nestabilní a proto se v preparátu podle vynálezu s výhodou předpokládá ve zvýšeném poměru, příkladně v 10-ti násobné koncentraci (vztaženo na mezinárodní jednotky). Obzvláště výhodný preparát proto obsahuje jednotlivý faktor VII a jednotlivý faktor II v poměru větším než 10 : 1.

S výhodou je navrženým preparátem k dispozici prothrombinový komplex nebo částečný prothrombinový komplex z vysoce čistých jednotlivých faktorů. V každém případě je výhodné, že jednotlivé faktory netvoří v preparátu žádné komplexy.

To je možné prokázat příkladně analytickou iontoměničovou chromatografií na Q-Sepharose (Pharmacia), při které se mohou jednotlivé faktory při eluci solným gradientem diskrétně eluovat. Opakem jsou komplexy, které jsou u prothrombinázy • ♦* 99 9 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 9 9

9 999 9 9999 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 nebo pro-prothrombinázy.

Prothrombináza je komplex enzymových substrátů, který se tvoří na povrchu fosfolipidů a umožňuje aktivaci prothrombinu. Prothrombináza podle definice sestává z faktoru II (prothrombin), aktivovaného faktoru X (faktor Xa), kofaktoru V případně Va, fosfolipidů a kalciových iontů. Tyto faktory jsou k dispozici in vivo jako transientní komplex k aktivaci prothrombinu a tvorbě thrombinu. Odpovídající pro-prothrombináza je definována jako komplex faktorů, které jsou k dispozici ke tvorbě prothrombinázy a jsou nejméně částečně modifikovány případně aktivovány. Pro-prothrombinázu je proto nutné chápat jako předstupeň prothrombinázy a jako komplex, ve kterém je jedna nebo několik komponent přítomna jako předstupeň, jako zymogen nebo jako proforma a který se tvoří na základě vzájemné afinity komponent.

V preparátu podle vynálezu je z důvodů stability výhodné zabránit každé přítonosti aktivovaných faktorů krevní srážlivosti. Výhodná forma provedení se proto vyznačuje tím, že preparát neobsahuje žádné aktivované krevní faktory, obzvláště žádný faktor Ha IXa, Xa a případně Vila.

Výhodné preparáty podle vynálezu obsahuj i méně než 0,1 E faktoru VIII : C nebo faktoru VIII : Ag/mg proteinu a/nebo méně než 0,1 E faktoru Ila/jednotku prothrombinu a/nebo méně než 0,1 E faktoru Xa/jednotku faktoru X.

Aby bylo možné co nejdéle zachovat vynikající stabilitu preparátu podle vynálezu je výhodné, připravit preparát podle vynálezu v lyofilizované formě. Tím se umožní, aby bylo možné preparát podle vynálezu téměř neomezeně dlouho skladovat a přesto jako lyofilizát během krátké doby rekons10 • · to ·· to toto to· toto·· ··· · · to to • · · · · · · · · » · ·· ·«· ·····»· ·· · truovat na roztok připravený k použiti.

Podle další výhodné formy provedení obsahuje dále preparát podle vynálezu hořčíkové ionty. Tyto ionty působí kompetitivně s vápníkovými ionty a mohou vápníkové ionty především v úplných nebo částečných prothrombinových komplexech vytlačit. Tím se podchytí předčasná tvorba trombinu v roztoku preparátu podle vynálezu v ještě větší míře a preparát je natolik stabilizován, že ve vodném roztoku zůstává dokonce několik hodin stabilní.

Ukázalo se, že farmaceutický preparát podle předloženého vynálezu může být připraven k použití dokonce jako stabil- ní infusní roztok, především pokud je zaručeno, že neobsahuje žádné volné vápníkové ionty. Obsah volných vápníkových iontů je možné snadno stanovit známými koncentracemi iontů nebo jinými analytickými metodami. K tvorbě komplexů vápníkových iontů jsou příkladně vhodné farmaceuticky akceptovatelné chelatotvorné sloučeniny, příkladně EDTA a příbuzné sloučeniny jako citráty.

S výhodou obsahuje dále preparát podle vynálezu antithrombin III v množství, ve kterém byl dosud v koncentrátech prothrombinového komplexu používán jako stabilizační prostředek, případně společně s heparinem. Ačkoliv se toto opatření na základě vysokého stupně čistoty jednotlivých faktorů nezdá být bezpodmínečně nutné, může to být z farmaceutických důvodů nebo na základě požadavků lékopisu nebo jiných požadavků týkaj ících se koncentrátů prothrombinových komplexůpodle stavu techniky výhodné.

V dalši výhodné formě provedení proto preparát neobsahuje albumin a/nebo stabilizátory, jako obzvláště anti11 • 00 00 · ·· ··

0 0 · 0 0 0 0000 • ·· 0 0·0 · · 0 0 0 0 0 0 0 0 0000 0 0 0 0 0 000 00 0 0000 thrombin III a/nebo heparin. Obzvláště neobsahuje preparát podle vynálezu fosfolipidy.

Farmaceutický preparát podle vynálezu se podle výhodné formy provedení vynálezu ošetřuje k inaktivaci virů nebo jiných infekčních agencií. Toto ošetření k inaktivaci virů se s výhodou zaručuje dvěma vzájemně nezávislými procesy k inaktivaci nebo zneškodnění virů.

Tato inaktivace se s výhodou provádí tenzidy a/nebo tepelným ošetřením, příkladně tepelným zpracováním v pevném stavu, obzvláště ošetřením parou podle EP 0 159 311, EP 0 519 901 nebo EP 0 674 531.

Další zpracování k inaktivaci virů zahrnuje také ošetření chemickými nebo chemicko/fyzikálními metodami, příkladně pomocí chaotropních látek podle VO 94/13329, DE 44 34 538 nebo EP 0 131 740 (rozpouštědlo) nebo fotoinaktivací.

Nanofiltrace nebo nanofiltrace intenzifikovaná na protilátky viz PCT/AT 97/00075) představuje rovněž výhodný způsob ke zneškodnění virů v rámci předloženého vynálezu.

S výhodou obsahuje dále preparát podle vynálezu farmaceuticky akceptovatelné pufrující látky nebo stabilizátory, příkladně substance již uvedené v lékopise pro koncentráty prothrombinových komplexů.

Obzvláště výhodný způsob zaručení nepřítomnosti virů v produktech podle vynálezu spočívá v tom, že se sestaví z jednotlivých vysoce čistých faktorů závislých na vitaminu K, které jsou již předem inaktivovány a zbaveny případně vzniklých produktů denaturace a stabilizátorů, takže mohou

0 > «

00

být k dispozici jako virově inaktivní a přesto ve velmi přesně definovatelné formě z hlediska jejich aktivity.

Protože především při termických procesech inaktivace virů může částečně docházet k inaktivačnímu procesu prothrombinových faktorů, které po provedení tepelného zpracování preparátů prothrombinového komplexu mohou podle stability jednotlivých faktorů vést k rozdílným výtěžků a specifickým aktivitám, umožňuje forma provedení způsobu podle vynálezu upravit poměry jednotlivých faktorů ve směsi tak, aby i po provedeném tepelném zpracování byly faktory přítomny ve vzájemném požadovaném poměru. Pokud je příkladně známo, že tepelné zpracování prothrombinu není spojeno s žádnými ztrátami aktivity, zatímco faktor X a faktor IX, obsažené také v kombinovaném preparátu jsou vždy inaktivovány z 20 %, může se sestavit směsný, tepelně proti virům inaktivovaný komplex tak, že se faktory I, IX a X kombinují v poměru aktivit 1 : 1,25 : 1,25. Po takovémto nastavení poměrů se může provést inaktivace virů a bezprostředním výsledkem je preparát obsahuj ící tyto faktory v poměru 1:1:1.

Faktor X se s výhodou použije v jeho a-formě a/nebo βformě.

Předmětem předloženoho vynálezu je také diagnostický preparát, který se podle vynálezu skládá z vysoce čistých jednotlivých faktorů závislých na vitaminu K. Také pro diagnostické účely jsou zvláště výhodné přednosti jako definovatelnost, variabilita koncentračních poměrů a stabilita.

Farmaceutický preparát podle vynálezu se může samozřejmě používat pro všechny dosavadní indikace prothrombinového komplexu.

• · · • · * · • · · · • · · · · • · · ·· · · · · · ··· ·· ♦ · 9 ·· ··

Předmětem předloženého vynálezu je proto také použití preparátu podle vynálezu k výrobě přípravku k ošetření zděděné nebo získané poruchy krevní srážlivosti, k ošetření těžkých krvácení, k profylaxi krvácení, obzvláště při výsky tu dědičných poruch krevní srážlivosti, k substituční terapii a k ošetření hemofilie B.

Také při poruchách funkce jater se osvědčuje preparát podle vynálezu jako indikovaný.

Při podáváni pacientům se při dávkováni vychází z dosa vadního režimu dávkováni, při čemž je však přesná definovatelnost preparátu podle vynálezu výhodou.

Předložený vynález bude blíže vysvětlen následuj ícími příklady, aniž by se však na ně omezoval.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1

Výroba preparátů jednotlivých faktorů

1.1. Výroba jednotlivých preparátů plasmatického faktoru X a plasmatického faktoru II

Lyofilizovaný přípravek faktorů prothrombinového komplexu, který obsahuje faktory II, IX, X a rovněž protein C a protein S se vyrobí metodou podle Brummelhuis, H.G.J., Preparation of the prothrombinkomplex v Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, J.M. ed. 117-128, Academie Press, New York (1980) a k inaktirvaci virů se tepelně ošet • •fe fefefe ··♦· • fe · fe ··· ···· • ·· ···· · · · · fe · ··· fefefefefe·· fefe * fefefe ♦· · ···· • fefe fefe fefe · fefe fefe ří podle EP 159 311. Lyofilizát (1000 E faktoru X/G, 1200 E faktoru II/g) se přiměřeným způsobem rozpustí v destilované vodě, takže roztok obsahuje 50 000 E faktoru X/l a pH se upraví na 7,0. Po přídavku 12 % (v/v) TVEEN^ 80 se míchá při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Následně se zředí 20 mM pufru Tris-HCl, pH 7,0, 1 : 5a proteinová frakce prothrombinového komplexu se adsorbuje na fosforečnan vápenatý (Ca-j ^()4)2) θ koncentraci 30 g (Ca-^PC^^) na 1 1 roztoku prothrombinového komplexu jednohodinovým mícháním při teplotě místnosti. Následně se pevná fáze oddělí centrifugací po dobu 20 minut při 5000 ot/min a sraženina se dvakrát promyje 20 mM pufru Tris-HCl, pH 7,0, obsahujícího 10 % síranu amonného, resuspenduje se a centrifuguje. Třetí promytí se provede analogicky 20 mM pufru Tris-HCl, pH 7,0, obsahujícího 150 mM NaCl. Eluce frakce prothrombinového komplexu se provádí 1 M roztokem fosforečnanu sodného, pH 7,0, přičemž se 25 ml tohoto roztoku na g fosforečnanu vápenatého míchá 1 hodinu při teplotě místnosti a následně se zbývající sraženina oddělí centrifugací jak je uvedeno výše. Zbytek se následně sráží síranem amonným s 366 g síranu amonného na 1 po dobu 15 hodin při teplotě 4 ’C za míchání. Sraženina obsahující frakci prothrombinového komlexu se oddělí centrifugací jak se popisuje výše. Sraženina se přidá do 25 mM trinatriumcitrátdihydrátového pufru, obsahujícího 100 mM NaCl, 1 mM benzamidlnhydrochloridu, pH 6,0 a přepufruje se na sloupci, plněném Sephadex G-25, při teplotě 4 °C při průtoku 1 cm/min proti 25 mM trinatriumcitrátdihydrátového pufru, obsahujícího 100 mM NaCl, 1 mM benzamidlnhydrochloridu, pH 6,0, aby se odstranil síran amonný. Přitom se v proudu eluátu měří UV-absorpce při 280 nm a elektrická vodivost.

Frakce obsahující proteiny se spojí a následně se podrobí iontoměničové chromatografií přes DEAE-Sepharose to* · • to ·· to *'to • to « to • ·· toto toto • · · • toto ·· • · to * to · · * • ······· toto to • to to «tototo rto to ·· ·*

FF^R, firma Pharmacia. Frakce se nanesou na sloupec (vnitřní průměr : výška gelového lože =1 : 1,3) s objemem gelu 8,2 1 0,55 g proteinu/l gelu, při lineárním průtoku 0,36 cm/min. Chromatografie se provádí při teplotě 22 °C. Před nanesením proteinu se sloupec ekvilibruje 25 mM trinatriumcitrátdihydrátového pufru, obsahujícího 100 mM NaCI, 1 mM benzamidinhydrochloridu, pH 6,0. Eluce proteinových frakcí se provádí v několika stupních pufrem 1 (25 mM trinatriumcitrátdihydrát, 1 mM benzamidinhydrochloridu, 245 mM NaCI, pH 6,0), pufrem 2 (25 mM trinatriumcitrátdihydrát, 1 mM benzamidinhydrochloridu, 270 mM NaCI, pH 6,0) a pufrem 3 (25 mM trinatriumcitrátdihydrát, 1 mM benzamidinhydrochloridu, 400 mM NaCI, pH 6,0). Eluce pufrem 1 se provede 2,4-násobným objemem sloupce, přitom se oddělí inertní proteiny. Eluce pufrem 2 se provádí 5,6-násobkem objemu sloupce, přičemž se zde shromažďují frakce, které se analyzují na obsah faktoru II, faktoru X, proteinu C a faktoru IX. Frakce obsahující faktor X, které neobsahují faktor II, IX a protein C se spojí. Tento preparát vysoce čistého faktoru X vykazuje specifickou aktivitu 60 E/mg proteinu.

Eluci pufrem 3 (1,9 objemu sloupce) se desorbuje faktor II, přičemž se opět shromáží frakce a zkoumají se na obsah faktorů X, faktoru IX a faktoru II. Frakce obsahující faktor II se pooluji. Jak faktor II, tak i pool obsahující faktor X se mohou případně podrobit přídavkem 1 M KSCN a inkubací při teplotě 22 °C po dobu několika hodin dodatečnému ošetření k inaktivaci patogenních nečistot.

Takto získaný pool faktoru II se přídavkem chloridu sodného nastaví na 1,9 M NaCI a hodnota pH se upraví na 7,0. Tento roztok se následně adsorbuje hydrofobní interakcí na • · • · • ·

« *·

9 V · · · · • 9 9 9 9 9 9 · · ·····«· ·· ·

9 9 9 9 9 9

9· 9 99 99

D gel Phenylsepharose High Performance firmy Pharmacia, přičemž se váží 3 g proteinu /1 gelu. Na sloupci s poměrem vnitřní průměr/výška gelového lože =1 : 1,9 se při lineárním průtoku 0,25 cm/min adsorbuje proteinová frakce a následně se promytím pufrem (25 mM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7,4) zbaví inertního proteinu. Gradientovou eluci s 11,5 objemy sloupce 3 M - 0,9 M NaCl za rovnoměrného odebírání frakcí se ze sloupce eluuje faktor II, přičemž se pooluje každá frakce obsahující aktivitu faktoru II, ale neobsahující faktor X a faktor IX. Sloučené frakce faktoru II se následně desetinásobně zkoncentruji ultra-/diafiltrací přes ultrafiltrační membránu s cut-off 30 kD a přepufruje proti pufru obsahujícímu 4 g trinatriumcitrátdihydrátu/l,8 g NaCl/1, pH 7,0. Tatko vyrobený preparát faktoru II vykazuje specifickou aktivitu 6,9 E/mg proteinu.

Stanovení aktivity faktoru II se provádí jednostupňovou metodou, založené na době tromboplastinu, za použití plasmy bez faktoru II proti mezinárodnímu standardu faktoru II za použití kombinace reagencií IMMUNO, Vídeň. Ostatní faktory krevní srážlivosti byly při analýze srážlivosti pouze ve stopách nebo nebyly vůbec prokazatelné (faktor VII < 0,00002 E/E faktoru II, faktor IX < 0,0002 E/E faktoru II, faktor X < 0,004 E/E faktoru II, protein C 0,003 E/E faktoru II a faktor VIII < 0,0002 E/E faktoru II.

Jako alternativní způsob výroby vysoce čistého faktoru II se používá také způsob, při kterém se z lyofilizovaného preparátu faktorů prothrombinového komplexu nejprve hydrofobni chromatografií oddělí faktor IX, následně se izoluje faktor II a ten se chromatografií na hydroxylapatitu čistí do vysokého stupně čistoty.

«· ·· · 9 9 • Φ · 9 · ··· • · φ 9 Φ · Φ ΦΦ * φ φ Φ ΦΦΦΦΦΦΦ ΦΦ

ΦΦΦΦΦ ΦΦ Φ

Přípravek faktorů prothrombinového komplexu se rozpustí stejně, jako se popisuje výše a s detergentem se inkubuje po dobu 1 hodiny při tepolotě místnosti. Následně se iontoměničovou chromatografií na DEAE- Sepharosa FF , firma Pharmacia, izoluji frakce obsahující faktor II, IX a X. Z nich se n

následně interakcí s Butyl-Toyopearl , firma Toso Haas, odstraní frakce obsahující faktor IX. Adsorpčni zbytek se násn ledně čistí na Phenylsepharose High Performance firmy Pharmacia další hydrofobni interakční chromatografií, při čemž se může adsorbovat asi 4 g proteinu/l gelu. Na sloupci s poměrem vnitřní průměr/výška gelového lože =1 : 1,9 se při lineárním průtoku 0,25 cm/min adsorbuje proteinová frakce, následně se promytím pufrem 20 mM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7,4) odstraní inertní protein a konečně se stupňovitou eluci izoluje frakce obsahující faktor II, která se při klesající vodivosti desorbuje z gelu při 1,9 M NaCl. Frakce obsahující faktor II se následně přímo adsorbuje na Ceramik-Hydroo xylapatit , firma Biorad. To se provede na sloupci s poměrem vnitřní průměr/výška gelového lože =1 : 4,8. Eluce se provádí při lineárním průtoku 3 cm/min. Eluci se solným gradientem se ze sloupce může desorbovat faktor II. Frakce obsahující faktor II se shromažďují a pomocí ultra-/diafiltrace přes pólysulfonovou membránu s cut-off 30 kD se zkoncentruji až do koncentrace faktoru II 50 - 100 E/ml. Takto vyrobený přípravek faktoru II vykazuje specifickou aktivitu nejméně 7 E/mg proteinu. Ostatní faktory krevní srážlivosti, obzvláště faktor IX a faktor VIII jsou přítomny jen ve stopách nebo nejsou vůbec prokazatelné. Volbou vhodného diafiltračniho pufru se přípravek faktoru II převededo farmaceuticky snášenlivoho pufru (příkladně 4 g trinatriumcitrátdihydrát/l, 8 g NaCl, pH 7,0).

• 4 • 0 • · 0 • 0 0 0 0 0 · 0··· 0 ·0 0000 0 00 0 • 0 00· 0000000 00 · 0 0 · 00 0 000·

0000« 0 * 9 * · ··

1.2. Získání plasmatického faktoru VII ml čerstvě zamražené lidské citrátové plasmy se nechá roztát při teplotě 0 - +4 °C a přitom vzniklý kryoprecipitát se oddělí centrifugací při +2 °C. Vzniklý kryozbytek se smíchá s 2 IE heparinu/ml. Potom se proteiny prothrombinového komplexu adsorbují pomocí DEAE Sephadex^R A firmy Pharmacia v koncentraci 0,5 mg/ml. Gel proteinového komplexu se oddělí od roztoku a promyje vždy pufrem 1 (4 g/1 trinatriumcitrátdihydrát, 0,7 g/1 NaCl, 9 g/1 Na^PO^ . 2 H₂0, 500 IE heparinu/1, pH 7,5) a následně pufrem 2 (4 g/1 trinatriumcitrátdihydrát/1, 7 g/1 NaCl, 500 IE heparinu/1, pH 7,5).

Tím se oddělí frakce prothrombinového komplexu obsahující faktor krevní srážlivosti prothrombin, nepatrné podílyfaktoru VII, faktoru IX a faktoru X. Většina faktoru krevní srážlivosti VII zbývající ve zbytku po adsorpci na DEAESephadex^R A50, firma Pharmacia se nyní získá adsorpci na oxidu hlinitém. K tomu se na litr zbytku po oddělení prothrombinového komplexu přidá 10 ml 2 %-ní suspenze aluminium-hydrogelu a míchá se po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Následně se centrifugací při 5000 ot/min po dobu 10 minut při teplotě 4 °C v Sorvall RC3B Rotor H6000A oddělí komplex protein-alumlniumhydroxid, zbytek se vyhodí a sraženina se suspenduj e s 3,5 % obj emu zbytku prothrombinového komplexu použitého k adsorpci v roztoku 4 g/1 trinatriumcitrátdihydrátu a 7 g/1 NaCl, pH 7,5 a míchá se po dobu 30 minut. Tím se desorbuje inertní protein z aluminiumhydroxidu. Faktor II zbylý na aluminiumhydroxidu se stejně jako se popisuje výše peletuje novou centrifugací. Zbytek se vyhodí a sraženina se dále použije k dalšímu zpracování. K desorpci proteinové frakce se komplex aluminiumhydroxid - faktor to ·« ··* ·· ·· • •toto 4, ♦ · φ · · · • ·· ···· ···· • · ·?· ·····♦· · · · • toto ·· · ···· • to · · · · · * »· < *

VII míchá po dobu 30 minut s 1 objemovým % zbytku prothrombinového komplexu použitého k adsorpci s 0,3 mol/1 fosfátového pufru, pH 8,6 (53,4 g Na₂HP0₄ . 2 H₂0/l se upraví roztokem 41,1 g NaH₂P0₄ . H₂0/l na pH 8,6), obsahujícím 1 % TVEEN^R-80. Následně se k inaktivaci patogenů přidá detergent TVEEN -80 na konečnou koncentraci 15 % a potom se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě 40 °C.

Po ochlazení roztoku na teplotu 22 °C se alikvot 20 ml n přepufruje sloupcovou chromatografií přes Sephadex G-50 (firma Pharmacia) proti roztoku 4 g/1 trinatriumcitrátdihydrátu, pH 7,4 a stejným roztokem se desetinásobně zředí. Veškerý roztok se následně nanese na sloupec plněný Heparinsepharose CL6B (firma Pharmacia) o průměru 16 mm a výšce 10 cm. Průtok činí 1 ml/min. Následně se eluuje solným gradientem 0,1 M NaCI v roztoku 4 g/1 trinatriumcitrátdihydrátu, pH 7,4 desetinásobným objemem sloupce. Proteinová frakce se kvantifikuje měřením UV-absorpce při 280 nm. Zároveň se frakce shromažďují a stanovuje se v nich faktor VII testem chromogeního faktoru VII (Immunochrom Faktor VII : 10, Immuno AG, Vídeň). Frakce eluovaného proteinu, které obsahují faktor VII, se spojí a čistí. Eluční objem frakcí faktoru VII činí 25 ml. V proteinové frakci se stanoví obsah proteinu metodou podle Bradforda, M.M. (Anal. Biochem. 72,

248-254, 1976) faktor VII stejně, jako se popisuje výše. Rovněž se kvantitativně stanoví faktor Vila metodou podle US 683 682. Z toho bylo možné zjistit, že eluovaná frakce faktoru VII vykazuje specifickou aktivitu 98 jednotek/ml proteinu, zatímco obsah faktoru Vila je menší než jedna jednotka/ml. Odpovídajícím způsobem je možné získat preparát vysoce čistého faktoru VII bez podstatné aktivace faktoru VII. Výtěžek při chromatografií činí více jak 50 %.

• 00

000 0000000

1.3. Plasmatický faktor IX

150 ml prothrombinového komplexu se předčistí pomocí dextransulfátu (Miletich a spol., Analytical Biochemistry 105, 304 (1980). 20 ml eluátu (912 I.E. faktoru IX, 160

I.E. faktoru X) se nanese na sloupec s 20 ml agarosového polymeru s oktylovými skupinami (0ctyl-Sepharose-CL-4B, firma Pharmacia, Švédsko) s průtokem 360 ml/hod. Sloupec se předem ekvilibruje 80 ml pufru A. Po promytí naplněného gelu 120 ml pufru A se eluuje frakce obsahující faktor IX 80 ml 250 mmolárního roztoku NaCl.

Výtěžek faktoru IX činí asi 54 % výchozí aktivity. Specifická aktivita činí 186 I.E. faktoru IX/mg proteinu. Faktor X je přítomen pouze ve stopách.

1.4. Získání plasmatického proteinu C

Vysoce čistý protein C se získá ze surové frakce proteinu C, která se vyrob! z komerčně dodávaného koncentrátu prothrombinového komplexu. Čištění se provádí afinitní chromatografii pomocí monoklonálních protilátek. Monoklonální anti-protein C-protilátky se vyrobí následovně :

BALB/C myši se imunizují 100 gg lidského proteinu C ve dvoutýdenních intervalech intraperitoneální injekcí. Po šesti týdnech se injikuje ještě jednou 50 gg lidského proteinu C a tři dny později se provede fuze. Myelomová buněčná linie (P3-X-63-AG8-653, 1,5 x 10^ buněk) se smísí s 1,7 x 10® slezinných buněk myši a provede se fuze modifikovanou metodou podle Kóhlera & Milsteina za použití PEG 1500 (Kóhler G., Milstein C., Nátuře 256, (1975), 495-497).

» «* · · ♦ · · · · «· « 4 · · 4 · · · » • 4 4 4 · · ♦ · · · · • · · 4 « ·»···♦· 4 4 ·

4 4 4 4 4 · .· * ·

Pozitivní klony, testované pomocí ELISA, se dvakrát subklonují. Produkce ascites se provede injekcí 5 x 10^ hybridomních buněk pro každou myš BALB/C dva týdny po ošetření Přistáném.

Imunoglobulin se z ascitů čistí precipitací síranem amonným a následnou chromatografií pomocí QAE-Sephadexu a následně chromatografii na Sephadexu G200. Ke snížení rizika přenosu muriních virů se protilátka před imobilizací ještě podrobí kroku inaktivace virů. Takto získaná monoklonální protilátka proti proteinu C se napojí na CNBR-Sepharose 4B (Pharmacia). K čištění proteinu C pomocí afinitní chromát ografie se použijí následuje! pufry :

Jako adsorpční pufr :

mM Tris, 2 mM EDTA, 0,25 M NaCl a 5 mM benzamidinu;

Jako promývací pufr :

mM Tris, 1 M NaCl, 2 mM benzamidinu, 2 mM EDTA; pH hodnota činí 7,4;

Jako eluční pufr se použije :

M NaSCN, 20 mM Tris, 1 M NaCl, 0,5 mM benzamidinu, 2 mM EDTA.

Další vhodná monoklonální protilátka k čištění proteinu C se popisuje v US 5 336 610. Tato protilátka se váže na aktivační peptid proteinu C a je proto vhodná selektivně čistit zymogen proteinu C od aktivované formy.

V podrobnostech : koncentrát prothrombinového komplexu « · · · ♦ · * 4 · • •44 «44 494«

44 4444 »44»

4 «4» 4444404 «4 *

444 4 4 4 4···

44444 4» 4 ·· 4« se rozpustí v adsorpčním pufru, přičemž se použije asi 10 g koncentrátu prothrombinového komplexu na asi 20 ml sloupce monoklonální protilátky. Následně se rozpuštěný koncentrát prothrombinového komplexu filtruje, centrifuguje se při 20 000 οΐ/min po dobu 15 minut a pomocí 0,8 pm filtru se filtruje ke sterilaci. Filtrací sterilovaný a rozpuštěný koncentrát prothrombinového komplexu se nanese na sloupec s průtokem 10 ml/hod. Následně se sloupec promyje promývacím pufrem k odstranění proteinů a konečně se vázaný protein C eluuje elučním pufrem při průtoku 5 ml/hod a frakce se shromažďují. Eluovaný protein C se dialyzuje proti pufru (0,2 M Tris, 0,15 M glycinu a 1 mM EDTA, pH 8,3). Obsah proteinu C se stanoví podle antigenu pomocí metody dle Laurella a podle aktivity aktivací dle Protaca.

Získaný eluát proteinu C se dokončí na farmaceuticky aplikovatelný preparát následovně :

Eluát se nejprve podrobí ultrafiltraci a diafiltraci. Pro diafiltraci se použije pufr s pH hodnotou 7,4, který obsahuje 150 mM NaCI a 15 mM trinatriumcitrátu . 2 H2O. Získaný filtrát se vysuší vymražením a jednohodinovým ošetřením parou při teplotě 80 °C ± 5 °C a tlaku 137,5 kPa ± 3,5 kPa se inaktivuje proti virům.

Lyofilizovaný materiál inaktivovaný na viry se potom rozpustí ve sterilním isotoním roztoku NaCI a pomocí iontoměničové chromatografie na Q-Sepharose se odstraní případně přítomné protilátky případně serumamyloid P. Vyčištěný roztok se potom koncentruje ultrafiltraci a dialfiltraci. Nato se k získanému roztoku přidá 10 albuminu, 150 mM NaCI a 15 mM trinatriumcitrátu. Myší imunglobulin ani faktory II, VII, IX a X nebylo možné prokázat. Následně se roztok

• · · • 4 to 4 steriluje filtrací, plní se a lyofilizuje. Specifická aktivita činí 14 jednotek proteinu C/mg. Jako test aktivity se použije amidolytický test, přičemž protein C se aktivuje pomocí Protacu (firma Pentapharm).

1.5. Čištění plasmatického proteinu S

Lidský protein S se vyrobí jako koncentrát faktoru IX (prothrombinový komplex STIM-3 IMMUNO AG Vídeň) pomocí QAE-Sephadex a Blue Sepharose CL-6B-Chromatographie (Pharnacia) následujícím způsobem :

Lyofilizovaný koncentrát (100 g) se rozpustí ve 200 ml sterilní deionizované vody a dialyzuje se proti pufru, sestávajícímu z 0,01 M 2-(N-morfolinethansulfonové kyseliny), pH 6,0; 0,18 M NaCI, 10 mM EDTA, 2 mM benzamidinhydrochloridu a 0,02 % NaN^ (starovací pufr). Dialyzovaný materiál se potom nanese na sloupec QAE-Sephadexu (8 x 19 cm) a ekvilibruje se uvedeným pufrem. Jako promývací roztok se použije 1,5 1 pufru (startovací pufr).

Protein S se eluuje 110 ml/hod lineárním gradientem NaC1, sestávajícím z 1,2 1 startovacího pufru a 1,2 1 dalšího pufru, který se od prvního pufru liší přídavkem 0,5 M NaCI. Frakce S-proteinu se zkouší pomocí Fast Flow SDS Page (Pharmacia) a stanovením antigenu (Laurell) na obsah proteinu S a frakce, které obsahují protein S, se pooluji a nakonec se dialyzují proti pufru. Tento pufr obsahuje 50 mM tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCI, 2 mM EDTA, 1 mM benzamidinhydrochloridu a 0,02 % NaN^. Po dialyze se pool proteinu S nanese na sloupec Blue-Sepharose CL-6B (2,5 cm x 10,5 cm) a ekvilibruje se startovacím pufrem.

Promytí se provádí rychlostí 15 ml/hod 500 ml startovacího pufru. Protein S se tak eluuje ve void volume, zatímco prothrombin se adsorbuje na sloupci. Frakce s obsahem proteinu S se potom opět stanoví pomocí SDS-Page Fast Flow System (Pharmacia) a podle Laurella (Scand.J.Clin.Invest. (Suppl.) 29 (1977) 21 (Suppl. 124).

Takto vyrobený protein S má na redukované SDS-Page morfologii charakteristickou pro protein S, totiž dva blízké pásy (Doublett) s molekulovou hmotností asi 86 000 případně 76 000. Koncentrace proteinu se stanoví spektrofotometricky na základě extinkčních koeficientů 0,1 při 280 nm pro lidský protein S a potvrdí se metodou podle Lowry (Lowry 0., Rosegrough Ν., Farr AL., Randall R., Protein Measurement with the Folin phenol reagent, J.Biol.Chem. 193 (1951) 265).

Takto vyrobený předčištěný protein S se použije k výrobě ovčího antisera proti proteinu S, kdy se použijí čtyři imunisační injekce, přičemž prvními dvěma injekcemi se subkutánně aplikuje 100 gg proteinu S s adjuvans podle Freunda a při následném boostování se pracuje s nekompletním adjuvans. Po dalším boostování se antiserum testuje pomocí dvojité imunodifuze a vykazuje precipitaci s čištěným proteinem Sas normální plasmou.

IgG frakce ze 450 ml antisera se získá vysrážením alkoholem a následnou adsorpcí na Sephades A 50 v tris-HCl pufru, pH 6,8. Ze 450 ml antisera bylo ve zbytku 1,14 g antiproteinu S-IgG. IgG frakce se napojí na 450 ml Sepharose CL-4B, přičemž se použije 5,7 mg proteinu/ml Sepharose. Účinnost spojení činí 76 %. Sloupec pro antiprotein S se ekvilibruje glycinhydrochloridem, pH 3 a adsorpčním pufrem pH 7,5.

« ·

Adsorpční pufr sestává z 20 mM TRIS, 2 mM EDTA, 0,25 M NaCI, 2 mM benzamidinu, 0,02 % Tween^R 20 a 0,02 % NaN₃, pH 7,4. Roztok promývacího pufru má následuj ící složky : 20 mM TRIS, 2 mM EDTA, 1,0 M NaCI, 0,5 mM benzamidinu, 0,01 % Tween^R 20 a 0,02 % NaN^, pH 7,4.

Eluční pufr má stejné složení jako roztok promývacího p

pufru s tou změnou, že se použije 0,05 % Tween 20 a navíc 243,3 g NaSCN, pH 7,4 (3 M roztok rhodanidu).

Roztok dialyzačního pufru obsahuje 20 mM TRIS, 0,15 mM glycinu, 1 mM EDTA, 2 mM benzamidinu, pH 8,3.

K dalšímu čištění frakce proteinu S vyrobeného z koncentrátu prothrombinového komplexu se rozpustí 100 g frakce vil adsorpčníhp pufru a přes noc se dialyzuje proti roztoku adsorpčníhp pufru. Sloupec se po nanesení vzorku promyje asi 5 1 promývacího pufru až do nepřítomnosti proteinu, následně se provádí eluce se 3 M NaSCN v roztoku elučního pufru.

Eluát se okamžitě dialyzuje, dokud se nedosáhne obsahu SCN pod hranicí prokazatelnosti; eluát má koncentraci 500 gg/ml proteinu S. Neobsahuje C4-binding protein.

Monoklonální protilátka antiproteinu S se vyrobí následovně :

BALB/C myši se imunizují 100 gg vyrobeného proteinu S ve dvoutýdenních intervalech intraperitoneální injekcí.

Po šesti týdnech se injikuje ještě jednou 50 gg lidského proteinu S a tři dny později se provede fuze. Myelomová bu26 • ·· · «· ·· « 4 · · · ♦ 4 ···« • ·* «444 ·»·· · 4 4 4 444444· · 4 · něčná linie (P3-X-63-AG8-653, 1,5 x 10? buněk) se smísí s 1,7 x 10® slezinných buněk myši a provede se fuze modifikovanou metodou podle Kohlera & Milsteina za použiti PEG 1500 (Kóhler G., Milstein C., Nátuře 256, (1975), 495-497).

Pozitivní klony, testované pomocí ELISA, se dvakrát subklonují. Produkce ascites se provede injekcí 5 x 10^ hybrdidomních buněk pro každou myš BALB/C dva týdny po ošetření Přistáném.

Imunoglobulin se z ascitů čistí precipitací síranem amonným a následnou chromatografií pomocí QAE-Sephadexu a následně chromatografií na Sephadexu G200.

IgG frakce získaná z ascitů a předčištěná na Sepharose - protein A se napojí na Sepharose CL-4B. Čištění proteinu, který byl získán z koncentrátu prothrombinového komplexu pomocí afinitni chromatografie se provádí za podmínek popsaných pro protilátku polyklonálního proteinu S. Koncentrace proteinu S v eluátu činí 600pg/ml. Neobsahuje C4-binding protein.

Metodou polyklonální nebo monoklonální afinitní chromatografie vysoce vyčištěný přípravek proteinu S se podrobí SDS-Page (gradientový gel 8 až 12 %) a může se podle Coomasie zabarvení (Laemmli UK : Cleavage of structural proteins during the assenbly of the head of bacteriophage T4, Nátuře 227 (1970), 680) označit jako více než 95 % čistota.

Eluát se následně podrobí ultrafiltraci a diafiltraci. Pro diafiltraci se použije pufr s pH hodnotou 7,4, který obsahuje 150 mM NaCl a 15 mM trinatriumcitrátu . 2 H2O. Získaný filtrát se vysuší vymražením a jednohoti ·

Φ Φ • Φ Φ

Φ Φ Φ • Φ Φ

ΦΦΦ · Φ

Φ* ΦΦ dinovým ošetřením parou při teplotě 80 °C± 5 °Ca tlaku 137,5 kPa ± 3,5 kPa se inaktivuje proti virům (k odstraněni případně přítomné virové kontaminace polyklonálni nebo monoklonální protilátkou).

Lyofilizovaný materiál inaktivovaný na viry se potom rozpustí ve sterilním isotoním roztoku NaCl a pomocí iontoměničové chromatografie na Q-Sepharose se odstraní případně přítomné protilátky případně serumamyloid P. Vyčištěný roztok se potom koncentruje další ultrafiltrací a dialfUtrácí . Nato se k získanému roztoku přidá na 1 1 10 g albuminu, 150 mM NaCl a 15 mM trinatriumcitrátu. Hodnota pH čini

7,5. Obsahuje 3000 gg/ml proteinu S. Tento obsah proteinu S odpovídá 500-násobnému obohacení ve srovnání s plasmou. Myší imunoglobulin ani faktory II, VII, IX a X není možné prokázat. Nálsedně se roztok filtuje ke sterilaci, plní se a lyofylizuje.

Příklad 2

Farmaceutický přípravek vysoce čistých proteinů závislých na vitaminu K

Vysoce čisté jednotlivé faktory prothrombinu, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C a protein S se smíchají tak, aby vznikl roztok obsahující vždy 25 000 jednotek/l jednotlivých faktorů ve vodném roztoku 4 g Na^-citrátu . 2 H₂0 a 8 g NaCl. Roztok se steriluje filtrací přes nylonový filtr s poměrem zadržení 0,2 gm a následně se plní po 20 ml sterilovaných skleněných lahviček o plnicím objemu 50 ml. Následně se za sterilních podmínek vymrazí a lahvičky se potom sterilně uzavřou.

• tt tt «··· · · · ···· • 99 9999 9999

9 999 9999999 99 9

9 9 · 9 9 9 9 9 9 • 99 99 99 9 9 · 99

Příklad 3

Farmaceutický přípravek prothrombinového komplexu

Stejně jako se popisuje v předchozím příkladu se připraví vysoce čistý prothrombinový komplex, obsahující faktor VII, faktor IX a faktor X, avšak bez proteinu C a proteinu S a za sterilních podmínek se plní. Poodle mezinárodních doporučení se k roztoku před plněním přidá 10 000 mezinárodních jednotek heparinu/1.

Příklad 4

Farmaceutický přípravek proteinů závislých na vitaminu K k trvalé substituci a udržení konstantní hladiny plasmatu

Po substituci koncentrátem proteinů závislých na vitaminu K, u kterého se má pokud možno dosáhnout konstantní hladiny plasmatu faktorů prothrombinového komplexu, je na základě rozdílných poločasů stability jednotlivých faktorů nutné provést míru substituce těchto proteinů v poměru, který není ekvivalentní. Odpovídajícím způsobem se stejně jako je popsáno výše se připraví farmaceutický přípravek, který obsahuje prothrombin, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C a protein S v poměru 1:30:3:1,5:6:6.

Příklad 5

Farmaceutický přípravek parciálního prothrombinového komplexu

Pro rozdílné poločasy faktorů prothrombinového komplexu in vivo, obzvláště pro dlouhý poločas prothrombinu 2 až 5 •0 ·· · 00 00 0 0 0 0 · 0900

0000 0000 0 000 0000000 00 0 00 00 0 0000 dní ve srovnání s krátkým poločasem faktoru VII 4 až 7 hodin a faktoru IX pod 24 hodin, dochází při trvalé substituci přípravky prothrombinového komplexu, kde při nastavení normální koncentrace plasmatu 1 jednotka faktoru VII/ml, k poklesu koncentrace plasmatu po 24 hodinách j iž opět pod koncentraci nejméně 20 %, která je potřebná pro fungující hemostázu, zatímco příkladně hladina prothrombinového plasmatu je ještě přibližně normální, to znamená 1 jednotka/ml. Při nové substituci koncentrátem prothrombinového komplexu stejného složení jako při primární substituci nyní vyplývá, že koncentrace prothrombinové plasmy u pacienta je zvýšena nad normální oblast, aby bylo možné dosáhnout nové ekvivalentní koncentrace plasmy faktoru VII nebo faktoru IX. Zvýšení koncentrace prothrombinové plasmy nad normální oblast však znamená zvýšené riziko trombózy pro ošetřované pacienty, neboť Poort a spol. (Blood 88:3698-3703, 1996) zjistili, že i jen o 30 % zvýšená hladina plasmy prothrombinu je spojena s výrazně vyšším rizikem venozní trombózy. Tomuto problému se může zabránit, jestliže se pro sekundární substituce cíleně použijí kombinované přípravky prothrombinového komplexu.

Takový přípravek se vyrobí následovně :

Stejně jako se popisuje v předcházejících příkladech, sestaví se koncentrát prothrombinového komplexu, sestávající z faktoru VII, IX a X v poměru 30 : 3 : 1,5, avšak bez prothrombinu a připraví se jako farmaceutická formulace. Dávky tohoto preparátu předpokládané k aplikaci obsahují vždy 500 mezinárodních jednotek faktorů krevní srážlivosti VII, IX a X v objemu pro rozpuštění 10 ml po rekonstituci lyofilyzovaného prášku.

> ·· ·· · ·· ·· • · * · 9 9 9 9 · · • ·« · · 9 · · · · • 9 9 9 9 9 9999 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9

99999 99 9 9 9 99

Příklad 6

Kontrola jakosti preparátu prothrombinového komlexu

Jednotlivé faktory krevní srážlivosti v konečné adjústa ci preparátu prothrombinového komlexu se zkouší jednostupňovým testem krevní srážlivosti za použití deficitní plasmy a reagencií krevní srážlivosti firmy IMUNO, Vídeň, na obsah prothrombinu, faktoru VII, faktoru IX, faktoru X, proteinu C a proteinu S.

Detaily použité metody lze čerpat z práce Muller, H:G: a Bonik K. (Krankenhauspharmazie 13:528-531, 1992).

Ke stanovení obsahu aktivovaných faktorů prothrombinového komplexu se použijí chromogenní substráty S-2238, S-2222, S-2444, S-2366 a S-2251 firmy Chromogenix. Stanovení se provádí za pufrovaných podmínek udaných výrobcem. Chromogenními substráty se stanoví vždy aktivované faktory thrombin, faktor Vila, faktor IXA, faktor Xa, aktivovaný protein C, které vůči použitým peptidovým substrátům vyvíjejí proteolytickou aktivitu. Po vyhodnocení fotometrické analýzy chromogenní přeměny substrátu bylo zjištěno, že pro všechny substráty leží obsah proteinů nebo vybraných faktorů prothrombinového komplexu ve dříve popsaných přípravcích, obsahujících vitamín K, vždy pod 10 mU/ml.

Claims (34)

1. Farmaceutický separovaný preparát prothrombinového komplexu, vyznačující se tím, že sestává nejméně ze dvou chromatograficky čištěných jednotlivých faktorů závislých na vitaminu K jako účinných látek.

2. Preparát podle nároku 1, vyznačující se tím, že jednotlivé faktory jsou vybrané ze skupiny faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C, protein S a protein Z.

3. Preparát podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň faktory II, VII, IX a X.

4. Preparát podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé faktory protein C a protein S.

5. Preparát podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že nejméně jeden z jednotlivých faktorů je rekombinantní faktor, transgeně vyrobený faktor, derivát, obzvláště peptid, a/nebo fragment.

6. Preparát podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé obsahové faktory v poměru, který v podstatě odpovídá poměru těchto faktorů v krvi.

7.

Preparát podle některého z nároků 1 až 6, • ·

Φ · ···· vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé faktory faktor II, faktor VII, faktor IX a faktor X v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 2) : (0,5 až 2) : (0,5 až 2).

8. Preparát podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé faktory faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C a protein S v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 2) : (0,5 až 2) : (0,5 až 2) (0,5 až 2) : (0,5 až 2).

9. Preparát podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že obsažené jednotlivé faktory jsou v poměru, který odpovídá relativnímu poločasu stability jednotlivých faktorů.

10. Preparát podle nároku 9, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé faktory faktor II, faktor VII, faktor IX a faktor X v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 35) : (0,5 až 7) : (0,5 až 5).

11. Preparát podle některého z nároků 9 nebo 10, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé faktory faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C a protein S v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (5 až 35) : (0,5 až 7) : (0,5 až 5) : (1 až 15) : (1 až 15).

12. Preparát podle nároku 1, 2, 4, 5, 6 nebo 9, vyznačující se tím, že obsahuje faktor VII a faktor II v poměru větším než 10 : 1.

· • · · · · · · · · · · • ·» · · · · · · · · • · ··· ······· · · * ··· ·· · to··· ····· ·· · ·· ··

13. Preparát podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že jednotlivé faktory v preparátu netvoří žádný komplex.

14. Preparát podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že obsahuje parciální prothrombinový komplex.

15. Preparát podle některého z nároků 1 až 14, vyznačujíc! se tím, že neobsahuj e žádný aktivovaný faktor krevní srážlivosti vybraný z Ila, IXa, Xa a případně Vila.

16. Preparát podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že obsahuje méně než 0,1 E faktoru VIII : C nebo faktoru VIII : Ag/mg proteinu.

17. Preparát podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že obsahuj e méně než 0,1 E faktoru Ila/E prothrombinu.

18. Preparát podle některého z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že obsahuj e méně než 0,1 E faktoru Xa/E faktoru X.

19. Preparát podle některého z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že se vyskytuje v lyofilizované formě.

20. Preparát podle některého z nároků 1 až 19, vyznačující se tím, že obsahuje hořčíkové ionty.

·· to • toto to · to to • toto* · to · · • · ······· ·· · • · · · · · · ·· · ·· ··

21. Preparát podle některého z nároků 1 až 20, vyznačující se tím, že neobsahuje žádné volné vápenaté ionty.

22. Preparát podle nároku 21, vyznačující se tím, že obsahuje chelátotvornou sloučeninu k tvorbě komplexu s volnými vápenatými ionty.

23. Preparát podle některého z nároků 1 až 22, vyznačujíc! se tím, že dále obsahuje antithrombin III ve stabilizujících množstvích, popřípadě společně s heparinem.

24. Preparát podle některého z nároků 1 až 23, vyznačující se tím, že na základě ošetření k inaktivaci virů nebo zneškodnění virů je prostý infekčních virů.

25. Preparát podle některého z nároků 1 až 24, vyznačující se tím, že nepřítomnost infekčních virů je zajištěna dvěma na sobě nezávislými způsoby k inaktivaci virů nebo zneškodnění virů.

26. Preparát podle některého z nároků 1 až 25, vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky přijatelné pufrovací látky nebo stabilizátory.

27. Preparát podle některého z nároků 1 až 26, vyznačující se tím, že sestává z vysoce čistých jednotlivých faktorů závislých na vitaminu K, které jsou virově inaktivovány.

9 99 99 9 99 99

99 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 999 9999999 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 99 99 9 9 9 99

28. Preparát podle některého z nároků 1 až 27, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivý faktor X v jeho α-formě a/nebo β-formě.

29. Diagnostický přípravek obsahující preparát podle některého nároků 1 až 28.

30. Použití preparátu podle některého z nároků 1 až 28 k výrobě přípravku k ošetření získané nebo zděděné poruchy krevní srážlivosti.

31. Použití preparátu podle některého z nároků 1 až 28 k výrobě přípravku k ošetření těžkých krvácení.

32. Použití preparátu podle některého z nároků 1 až 28 k výrobě přípravku k profylaxi krvácení, obzvláště při výskytu zděděných poruch krevní srážlivosti.

33. Použití preparátu podle některého z nároků 1 až 28 k výrobě přípravku k substituční terapii.

34. Použití preparátu podle některého z nároků 1 až 28 k výrobě přípravku k ošetření hemofilie B.