CZ2000982A3 - Farmaceutický preparát obsahující jednotlivé faktory, závislé na vitaminu K a jeho použití - Google Patents
Farmaceutický preparát obsahující jednotlivé faktory, závislé na vitaminu K a jeho použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2000982A3 CZ2000982A3 CZ2000982A CZ2000982A CZ2000982A3 CZ 2000982 A3 CZ2000982 A3 CZ 2000982A3 CZ 2000982 A CZ2000982 A CZ 2000982A CZ 2000982 A CZ2000982 A CZ 2000982A CZ 2000982 A3 CZ2000982 A3 CZ 2000982A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- factor
- preparation according
- protein
- factors
- preparation
- Prior art date
Links
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 title claims abstract description 16
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 16
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 title claims abstract description 16
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 title claims abstract description 16
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title description 11
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 93
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims abstract description 71
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 claims description 45
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 44
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 37
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims description 36
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims description 36
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 35
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 35
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 35
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims description 34
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims description 34
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims description 33
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims description 33
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 claims description 33
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims description 33
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims description 33
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims description 32
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 claims description 30
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 15
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 12
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 11
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 8
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 claims description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims description 7
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 claims description 6
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 claims description 6
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 6
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 5
- 108010025221 plasma protein Z Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 5
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 4
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 3
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 claims description 2
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 208000018592 inherited blood coagulation disease Diseases 0.000 claims description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims 2
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 claims 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 claims 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 claims 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims 1
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 72
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 32
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 12
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 12
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 11
- 229940024790 prothrombin complex concentrate Drugs 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 9
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 9
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 8
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 7
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N benzenecarboximidamide;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=[NH2+])C1=CC=CC=C1 LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 7
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 108091005605 Vitamin K-dependent proteins Proteins 0.000 description 6
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 5
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 4
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- -1 citrates Chemical class 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241001146702 Candidatus Entotheonella factor Species 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 101500025568 Homo sapiens Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- 101000577630 Homo sapiens Vitamin K-dependent protein S Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 2
- 238000010266 Sephadex chromatography Methods 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 102000052932 human PROS1 Human genes 0.000 description 2
- 229940100689 human protein c Drugs 0.000 description 2
- 229940099815 human protein s Drugs 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000001470 plasma protein fractionation Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 108010026668 snake venom protein C activator Proteins 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N tetratriacontaethylene glycol monomethyl ether Chemical compound COCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCOCCO VUYXVWGKCKTUMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 2
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 108010091326 Cryoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000777796 Homo sapiens Corneodesmosin Proteins 0.000 description 1
- 101000803709 Homo sapiens Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 101000882917 Penaeus paulensis Hemolymph clottable protein Proteins 0.000 description 1
- 241001054637 Pharnacia Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- SNIABFMMCKVXSY-UHFFFAOYSA-N benzoylazanium;chloride Chemical compound Cl.NC(=O)C1=CC=CC=C1 SNIABFMMCKVXSY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N chromate(2-) Chemical compound [O-][Cr]([O-])(=O)=O ZCDOYSPFYFSLEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000012538 diafiltration buffer Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000010200 folin Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940019333 vitamin k antagonists Drugs 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Řešení se týká farmaceutického separovaného preparátu
prothrombinového komplexu, který obsahuje nejméně dva
vysoce čistéjednotlivé krevní faktory závislé na vitaminu K
jako účinné látky.
Description
Farmaceutický preparát obsahující jednotlivé na vitaminu K a jeho použití faktory závislé
Oblast techniky
Vynález se týká farmaceutického preparátu obsahujícího jednotlivé faktory závislé na vitaminu K.
Dosavadní stav techniky
Proteiny závisející na vitaminu K se vyznačují tím, že pro svou biosyntézu zásadním způsobem vyžadují vitamin K.
Tak příkladně prothrobmin (faktor II), který se tvoří za účinku antagonistů vitaminu K, neváže na rozdíl od normálního prothrombinu Ca . Normální prothrombin obsahuje na N-konci gWHťZ-karboxyglutamát, tedy druhou karboxylovou skupinu na glutamátovém zbytku. Během biogeneze funkčního prothrombinu se totiž karboxyluje v aminofunkční koncové oblasti proteinu prvních deset glutamátových zbytků enzymového systému závislého na vitaminu K na gama-karboxyglutamát. Tato gízmíz-karboxyglutamátová skupina je velmi silným chelátorem pro ionty vápníku. Přes tyto vázané Ca ionty se prothrombin váže na fosfolipidové membrány, které pocházejí z buněčných membrán, příkladně z krevních destiček, aby tak vznikla správná topologie k iniciaci krevní srážlivosti.
Nejenom prothrombin obsahuje g-ama-karboxyglutamátové zbytky, nýbrž i faktory srážlivosti VII, IX a X se karboxylují na specifických glutamátových zbytcích, aby tak vytvořily vysokou afinitu vůči iontům vápníku. Ale také další proteiny podílející se na kaskádě srážlivosti, jako •0 ·· 0 ·· 00 00 000 0 · 0 0
0 000 0 00 0 0 000 0000000 00 · protein C, protein S a protein Z potřebují ke své biosyntéze vitamin K.
Jednotlivé faktory závislé na vitaminu K, obzvláště faktory II, VII, IX a X vykazují podobné fyzikálně chemické vlastnosti, jako příkladně podobnou molekulovou hmotnost, pl s, elektroforetlckou mobilitu a tak dále, a získávají se proto zpravidla společně jako prothrombinový komplex (jiné označení : faktor IX-komplex nebo PPSB-komplex). S ohledem na podobnou charakteristiku proteinů je obtížné, preparativně vyrobit jednotlivé faktory. Výroba preparátů prothrombinového komplexu za současné izolace všech obsažených faktorů má proto podle stavu techniky vždy přednost před výrobou koncentrátů krevních faktorů při výrobě farmaceutických preparátů (viz Brummelhuis v Methods of Plasma Protein Fractionation, ed. Curling, 1980, Academie Press, strany 117-128). Rovněž se ale také ukazuje, že faktory prothrombinového komplexu na základě jejich rozdílné stability případně poločasu účinnosti nemohou být nikdy získány za fyziologických poměrů (vždy 1 E proteinu), (viz Můller a spol., Krankenhauspharmazie 13 (11), (1992), strany
528-531; Kóhler a spol., Thrombosis Research 60 (1990), strany 63-70).
V EP-A 0 700 684 se popisuje koncentrát prothrombinového komplexu spolu s nejméně jednou další složkou podporující srážlivost krve jako obranný prostředek pro krevní antikoagulancia.
Vzniká riziko, že koncentráty prothrombinového komplexu na základě jejich čištění z komplexních směsí proteinů obsahují aktivované faktory krevní srážlivosti, které jsou většinou aktivními serinproteázami. Právě u pacientů by ale toto «toto ·· ·· «· »«· ···· ·· · · · · *··· to ·«· to to to to · to to to· to nemělo docházet ke koagulaci, protože vznik tromboz může být případně je fatální. Dokonce i když jsou v takovém preparátu přítomny i jen stopy těchto aktivovaných faktorů krevní srážlivosti, obzvláště thrombinu, dochází k proteolytické inaktivaci jednotlivých faktorů, která podle individuální stability jednotlivých faktorů může mít závažné důsledky. Obecně maj i koncentráty prothrombinových komplexů sklon k nestabilitě a jsou proto nevhodné pro delěí skladování.
K těmto odbourávacím reakcím, obzvláště pomocí thrombinu, dochází dokonce i v pevném stavu, to znamená, že ani dokonce vysušení případně lyofilizace preparátu nevede ke spolehlivé stabilitě při skladování.
Dále jsou koncentráty prothrombinového komplexu mimořádně nepružné z hlediska relativních poměrů obsažených jednotlivých faktorů. Neni prakticky možnost v průběhu čištění prothrombinového komplexu ovlivnit tyto relativní poměry, především je pak nevýhodou v případě, kdy se požaduje prothrombinový komplex obohacený určitými faktory.
Podstata vynálezu
Úkolem předloženého vynálezu je proto připravit kombinované farmaceutické preparáty proteinů závislých na vitaminu K, které jsou z hlediska jejich složení přesně definované případně definovatelné, mají vysokou stabilitu, obzvláště při dlouhodobém skladováni a rovněž mají vysokou flexibilitu při změně složení.
Tetno úkol se podle vynálezu řeší farmaceuticky separovaným preparátem prothrombinového komplexu obsahuj ího jako účinné látky nejméně dva chromatograficky čištěné • 4 4 · · 4 · · ♦ 4
4 4 4 4 4 4 4444
44 4444 4 « 4 ·
4 4 44 4444444 · 4 4
444 44 4 4444
44444 4 · 4 44 44 jednotlivé faktory závislé na vitaminu K. Především má preparát podle vynálezu obsahovat vysoce čistý faktor IX v kombinaci s nejméně jedním dalším vysoce čistým jednotlivým faktorem závislým na vitaminu K.
Na rozdíl od stavu techniky, podle něhož se prothrombinový komplex vyrábí vždy jako čištěný prothrombinový komplex a nikoliv kombinací jednotlivých faktorů a kromě toho je v nej lepším případě k dispozici pouze v intermediární, tedy pouze ve střední čistotě, je dán předloženým vynálezem k dispozici preparát, který neobsahuje rušivé nečistoty, obzvláště nečistoty s thrombinovou aktivitou. Obzvláště se podle vynálezu jednotlivé kombinované faktory čistí chromatografickými čisticími procesy, jako je chromatografie na iontoměničích, hydrofobní chromatografie, afinitní chromatografie a/nebo molekulová vylučovací chromatografie z plasmy případně rekombinantních buněk. Tím může většina jednotlivých faktorů závislých na vitaminu K dosáhnout vždy specifické aktivity nejméně 50 % teoretické čistoty, s výhodou nejméně 70 %, obzvláště výhodně nejméně 90 %, až k teoretické čistotě jednotlivého faktoru. Podle toho je také výhodné používat faktory, které v podstatě neobsahují 5 %) produkty denaturace.
Při farmaceutické výrobě přípravků proteinů krevní srážlivosti se zpravidla rozlišují tři různé stupně čistoty : nízký, střední a vysoký.
• · » « • 0 0 0 » 0 0 0
I 9 0 ·
0 0
Tabulka 1
| Poločas stability in vivo | Teoretická čistota | |
| Faktor II | 60 hodin | 0,1 E/mg |
| Faktor VII | 2 - 2,5 hodin | 2000 (1667-2500) |
| Faktor IX | 18 - 24 hodin | 250 (200-333) |
| Faktor X | 40 hodin | 118 (100-143) |
Obzvláště při zjišťování aktivity faktoru II jsou na základě přítomnosti stop faktoru Ila vždy znovu získávány chybné výsledky, protože již stopy faktoru Ila stanovení koncentrace faktoru II natolik znepřesní, že mohou být zjištěny dokonce několikanásobně vyšší hodnoty, než by byly pro teoretickou čistotu. V případě faktoru VII jsou hodnoty oproti jiným faktorům o něci nižší protože faktor VII je velmi labilní protein, který mimořádně rychle konvertuje na faktor Vila. Proto se již přípravky faktoru VII, které obsahují více jak 10 % teoretické čistoty, považují za vysoce čisté.
Protože se preparát podle vynálezu obzvláště z hlediska jeho aktivity případně stupně čistoty skládá z velmi přesně definovaných jednotlivých faktorů, může se také vzájemný poměr jednotlivých faktorů optimálně nastavit. Přitom se mohou předem eliminovat problémy, které vyplývají v průběhu dalšího zpracování koncentrátů komplexu všech proteinů podle stavu techniky, příkladně ztrátou aktivity při inaktivaci virů, ale také procesy, ke kterým dochází během čisticího procesu, protože po spojení vysoce čistých jednotlivých faktorů v preparát podle vynálezu se již s výhodou nemusí proA A A vádět žádné další zpracovatelské operace.
Preparát podle vynálezu vykazuje tedy výhody standardizovatelnosti. Tím je zaručeno, že dané jednotlivé faktory jsou v preparátu obsaženy v daných koncentracích +/- 10 % odchylky.
Výhodné jednotlivé faktory se podle vynálezu vyberou ze skupiny sestávající z faktoru II, faktoru VII, faktoru IX, faktoru X, proteinu C, proteinu S a proteinu Z. Výhodné výrobní metody pro vysoce čisté preparáty těchto proteinů lze najít příkladně v EP 0 796 623 (faktory II a X), v A 594/97 (faktor VII), v EP 0 496 725 (faktor IX), EP 0 533209 (protein C) a v EP 0 406 216 (protein S).
V preparátu podle vynálezu se s výhodou spoj i nej méně faktory II, VII, IX a X, vycházející z vysoce čistých jednotlivých faktorů, přičemž se případně ještě mohou přimísit vysoce čisté jednotlivé faktory protein C, protein S a/nebo protein Z, aby bylo možno připravit pokud možno fyziologický prothrombinový komplex, to znamená prothrombinový komplex, který složením odpovídá fyziologickému - pouze bez rušivých doprovodných proteinů, které v průběhu čištění prothrombinového komplexu pronikají z plasmy, jako příkladně thrombin.
Jednotlivé faktory se mohou čistit z plasmy, obzvláště humání plasmy nebo se nohou vyrábět rekombinantně. Protože při výrobě rekombinantní DNA-technologií není nutné oddělení strukturálně a fyzikálně chemicky velmi podobných faktorů, sestaví se preparát podle vynálezu s výhodou z vysoce čistých rekombinantních jednotlivých faktorů. Faktor se může vyrobit také transgeně; může být derivátem, obzvláště pepti• ·· ·· · fefe fe* * · · · · · · · · · fe • ·· · · fe · · · β · • · · · fe fefe····· ·· · • fefe ·· · · · · · • ••fefe fefe · fefe ·· dem a/nebo fragmentem.
Jednotlivé faktory závislé na vitaminu K faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein S a protein C jsou klonovány a sekvencovány a jejich tvorba se příkladně popisuje ve Falkner a spol., Thrombosis and Haemostasis 68 (2) (1992), strany 119 až 124 pro proteiny, které jsou závislé na vitaminu K.
Podle vynálezu je možné snadno a v libovolných vzájemných poměrech upravit relativní poměry vysoce čistých jednotlivých faktorů, příkladně tak, aby tyto poměry odpovídaly přirozeným poměrům v krvi, tedy asi na jednotku jednoho faktoru je přítomna jednotka jiného faktoru. Výhodný preparát podle předloženého vynálezu proto obsahuje vysoce čisté faktory II, faktor VII, faktor IX a faktor X v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až
2) : (0,5 až 2) : (0,5 až 2). Pokud jsou v preparátu přítomny protein C, protein S a/nebo protein Z, potom také tyto jednotlivé faktory vykazují s výhodou relativní poměr 0,5 až 2.
Na druhé straně je podle vynálezu také možné sestavit jednotlivé faktory na základě jejich relativní stability, obzvláště s ohledem na jejich relativní poločas stability, to znamená, že se méně stabilního faktoru přidá více a stabilního faktoru přiměřeně méně. Přitom se může zároveň zohlednit předpokládaná doba použití případně účinku, to znamená čím delší je tato doba, tím významnější je i uplatnění těchto relativních poměrů.
Také rekombinantní proteiny s příkladně změněným poločasem stability se mohou přiměřeně standardizovat. Do standardizace faktorů mohou vstoupit i další hlediska, jako příkladně opětovné obnovení in-vivo (recovery).
Z tohoto hlediska výhodný preparát proto zahrnuje jednotlivé faktory, faktor II, faktor VII, faktor IX a faktor X v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 35) : (0,5 až 7) : (0,5 až 5), neboť poločas stability prothrombinu činí 60 hodin, faktoru VII 2 hodiny, faktoru IX 20 hodin a faktoru X 40 hodin. Výhodný preparát s těmito faktory proto obsahuje jednotlivé faktory, faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C a protein S v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 35) : (0,5 až 7) : (0,5 až 5) : (1 až
15) : (1 až 15) .
Protože faktor II je s odstupem nejstabilnější z těchto faktorů a proto i v jeho aktivované formě thrombinu nese největší riziko stability, je výhodný preparát, který neobsahuje žádný prothrombin. Faktor VII se většinou považuje za velmi nestabilní a proto se v preparátu podle vynálezu s výhodou předpokládá ve zvýšeném poměru, příkladně v 10-ti násobné koncentraci (vztaženo na mezinárodní jednotky). Obzvláště výhodný preparát proto obsahuje jednotlivý faktor VII a jednotlivý faktor II v poměru větším než 10 : 1.
S výhodou je navrženým preparátem k dispozici prothrombinový komplex nebo částečný prothrombinový komplex z vysoce čistých jednotlivých faktorů. V každém případě je výhodné, že jednotlivé faktory netvoří v preparátu žádné komplexy.
To je možné prokázat příkladně analytickou iontoměničovou chromatografií na Q-Sepharose (Pharmacia), při které se mohou jednotlivé faktory při eluci solným gradientem diskrétně eluovat. Opakem jsou komplexy, které jsou u prothrombinázy • ♦* 99 9 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 9 9 9 9 9 9
9 999 9 9999 9 9 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 nebo pro-prothrombinázy.
Prothrombináza je komplex enzymových substrátů, který se tvoří na povrchu fosfolipidů a umožňuje aktivaci prothrombinu. Prothrombináza podle definice sestává z faktoru II (prothrombin), aktivovaného faktoru X (faktor Xa), kofaktoru V případně Va, fosfolipidů a kalciových iontů. Tyto faktory jsou k dispozici in vivo jako transientní komplex k aktivaci prothrombinu a tvorbě thrombinu. Odpovídající pro-prothrombináza je definována jako komplex faktorů, které jsou k dispozici ke tvorbě prothrombinázy a jsou nejméně částečně modifikovány případně aktivovány. Pro-prothrombinázu je proto nutné chápat jako předstupeň prothrombinázy a jako komplex, ve kterém je jedna nebo několik komponent přítomna jako předstupeň, jako zymogen nebo jako proforma a který se tvoří na základě vzájemné afinity komponent.
V preparátu podle vynálezu je z důvodů stability výhodné zabránit každé přítonosti aktivovaných faktorů krevní srážlivosti. Výhodná forma provedení se proto vyznačuje tím, že preparát neobsahuje žádné aktivované krevní faktory, obzvláště žádný faktor Ha IXa, Xa a případně Vila.
Výhodné preparáty podle vynálezu obsahuj i méně než 0,1 E faktoru VIII : C nebo faktoru VIII : Ag/mg proteinu a/nebo méně než 0,1 E faktoru Ila/jednotku prothrombinu a/nebo méně než 0,1 E faktoru Xa/jednotku faktoru X.
Aby bylo možné co nejdéle zachovat vynikající stabilitu preparátu podle vynálezu je výhodné, připravit preparát podle vynálezu v lyofilizované formě. Tím se umožní, aby bylo možné preparát podle vynálezu téměř neomezeně dlouho skladovat a přesto jako lyofilizát během krátké doby rekons10 • · to ·· to toto to· toto·· ··· · · to to • · · · · · · · · » · ·· ·«· ·····»· ·· · truovat na roztok připravený k použiti.
Podle další výhodné formy provedení obsahuje dále preparát podle vynálezu hořčíkové ionty. Tyto ionty působí kompetitivně s vápníkovými ionty a mohou vápníkové ionty především v úplných nebo částečných prothrombinových komplexech vytlačit. Tím se podchytí předčasná tvorba trombinu v roztoku preparátu podle vynálezu v ještě větší míře a preparát je natolik stabilizován, že ve vodném roztoku zůstává dokonce několik hodin stabilní.
Ukázalo se, že farmaceutický preparát podle předloženého vynálezu může být připraven k použití dokonce jako stabil- ní infusní roztok, především pokud je zaručeno, že neobsahuje žádné volné vápníkové ionty. Obsah volných vápníkových iontů je možné snadno stanovit známými koncentracemi iontů nebo jinými analytickými metodami. K tvorbě komplexů vápníkových iontů jsou příkladně vhodné farmaceuticky akceptovatelné chelatotvorné sloučeniny, příkladně EDTA a příbuzné sloučeniny jako citráty.
S výhodou obsahuje dále preparát podle vynálezu antithrombin III v množství, ve kterém byl dosud v koncentrátech prothrombinového komplexu používán jako stabilizační prostředek, případně společně s heparinem. Ačkoliv se toto opatření na základě vysokého stupně čistoty jednotlivých faktorů nezdá být bezpodmínečně nutné, může to být z farmaceutických důvodů nebo na základě požadavků lékopisu nebo jiných požadavků týkaj ících se koncentrátů prothrombinových komplexůpodle stavu techniky výhodné.
V dalši výhodné formě provedení proto preparát neobsahuje albumin a/nebo stabilizátory, jako obzvláště anti11 • 00 00 · ·· ··
0 0 · 0 0 0 0000 • ·· 0 0·0 · · 0 0 0 0 0 0 0 0 0000 0 0 0 0 0 000 00 0 0000 thrombin III a/nebo heparin. Obzvláště neobsahuje preparát podle vynálezu fosfolipidy.
Farmaceutický preparát podle vynálezu se podle výhodné formy provedení vynálezu ošetřuje k inaktivaci virů nebo jiných infekčních agencií. Toto ošetření k inaktivaci virů se s výhodou zaručuje dvěma vzájemně nezávislými procesy k inaktivaci nebo zneškodnění virů.
Tato inaktivace se s výhodou provádí tenzidy a/nebo tepelným ošetřením, příkladně tepelným zpracováním v pevném stavu, obzvláště ošetřením parou podle EP 0 159 311, EP 0 519 901 nebo EP 0 674 531.
Další zpracování k inaktivaci virů zahrnuje také ošetření chemickými nebo chemicko/fyzikálními metodami, příkladně pomocí chaotropních látek podle VO 94/13329, DE 44 34 538 nebo EP 0 131 740 (rozpouštědlo) nebo fotoinaktivací.
Nanofiltrace nebo nanofiltrace intenzifikovaná na protilátky viz PCT/AT 97/00075) představuje rovněž výhodný způsob ke zneškodnění virů v rámci předloženého vynálezu.
S výhodou obsahuje dále preparát podle vynálezu farmaceuticky akceptovatelné pufrující látky nebo stabilizátory, příkladně substance již uvedené v lékopise pro koncentráty prothrombinových komplexů.
Obzvláště výhodný způsob zaručení nepřítomnosti virů v produktech podle vynálezu spočívá v tom, že se sestaví z jednotlivých vysoce čistých faktorů závislých na vitaminu K, které jsou již předem inaktivovány a zbaveny případně vzniklých produktů denaturace a stabilizátorů, takže mohou
0 > «
00
být k dispozici jako virově inaktivní a přesto ve velmi přesně definovatelné formě z hlediska jejich aktivity.
Protože především při termických procesech inaktivace virů může částečně docházet k inaktivačnímu procesu prothrombinových faktorů, které po provedení tepelného zpracování preparátů prothrombinového komplexu mohou podle stability jednotlivých faktorů vést k rozdílným výtěžků a specifickým aktivitám, umožňuje forma provedení způsobu podle vynálezu upravit poměry jednotlivých faktorů ve směsi tak, aby i po provedeném tepelném zpracování byly faktory přítomny ve vzájemném požadovaném poměru. Pokud je příkladně známo, že tepelné zpracování prothrombinu není spojeno s žádnými ztrátami aktivity, zatímco faktor X a faktor IX, obsažené také v kombinovaném preparátu jsou vždy inaktivovány z 20 %, může se sestavit směsný, tepelně proti virům inaktivovaný komplex tak, že se faktory I, IX a X kombinují v poměru aktivit 1 : 1,25 : 1,25. Po takovémto nastavení poměrů se může provést inaktivace virů a bezprostředním výsledkem je preparát obsahuj ící tyto faktory v poměru 1:1:1.
Faktor X se s výhodou použije v jeho a-formě a/nebo βformě.
Předmětem předloženoho vynálezu je také diagnostický preparát, který se podle vynálezu skládá z vysoce čistých jednotlivých faktorů závislých na vitaminu K. Také pro diagnostické účely jsou zvláště výhodné přednosti jako definovatelnost, variabilita koncentračních poměrů a stabilita.
Farmaceutický preparát podle vynálezu se může samozřejmě používat pro všechny dosavadní indikace prothrombinového komplexu.
• · · • · * · • · · · • · · · · • · · ·· · · · · · ··· ·· ♦ · 9 ·· ··
Předmětem předloženého vynálezu je proto také použití preparátu podle vynálezu k výrobě přípravku k ošetření zděděné nebo získané poruchy krevní srážlivosti, k ošetření těžkých krvácení, k profylaxi krvácení, obzvláště při výsky tu dědičných poruch krevní srážlivosti, k substituční terapii a k ošetření hemofilie B.
Také při poruchách funkce jater se osvědčuje preparát podle vynálezu jako indikovaný.
Při podáváni pacientům se při dávkováni vychází z dosa vadního režimu dávkováni, při čemž je však přesná definovatelnost preparátu podle vynálezu výhodou.
Předložený vynález bude blíže vysvětlen následuj ícími příklady, aniž by se však na ně omezoval.
Příklady provedení vynálezu
Přiklad 1
Výroba preparátů jednotlivých faktorů
1.1. Výroba jednotlivých preparátů plasmatického faktoru X a plasmatického faktoru II
Lyofilizovaný přípravek faktorů prothrombinového komplexu, který obsahuje faktory II, IX, X a rovněž protein C a protein S se vyrobí metodou podle Brummelhuis, H.G.J., Preparation of the prothrombinkomplex v Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, J.M. ed. 117-128, Academie Press, New York (1980) a k inaktirvaci virů se tepelně ošet • •fe fefefe ··♦· • fe · fe ··· ···· • ·· ···· · · · · fe · ··· fefefefefe·· fefe * fefefe ♦· · ···· • fefe fefe fefe · fefe fefe ří podle EP 159 311. Lyofilizát (1000 E faktoru X/G, 1200 E faktoru II/g) se přiměřeným způsobem rozpustí v destilované vodě, takže roztok obsahuje 50 000 E faktoru X/l a pH se upraví na 7,0. Po přídavku 12 % (v/v) TVEEN^ 80 se míchá při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Následně se zředí 20 mM pufru Tris-HCl, pH 7,0, 1 : 5a proteinová frakce prothrombinového komplexu se adsorbuje na fosforečnan vápenatý (Ca-j ^()4)2) θ koncentraci 30 g (Ca-^PC^^) na 1 1 roztoku prothrombinového komplexu jednohodinovým mícháním při teplotě místnosti. Následně se pevná fáze oddělí centrifugací po dobu 20 minut při 5000 ot/min a sraženina se dvakrát promyje 20 mM pufru Tris-HCl, pH 7,0, obsahujícího 10 % síranu amonného, resuspenduje se a centrifuguje. Třetí promytí se provede analogicky 20 mM pufru Tris-HCl, pH 7,0, obsahujícího 150 mM NaCl. Eluce frakce prothrombinového komplexu se provádí 1 M roztokem fosforečnanu sodného, pH 7,0, přičemž se 25 ml tohoto roztoku na g fosforečnanu vápenatého míchá 1 hodinu při teplotě místnosti a následně se zbývající sraženina oddělí centrifugací jak je uvedeno výše. Zbytek se následně sráží síranem amonným s 366 g síranu amonného na 1 po dobu 15 hodin při teplotě 4 ’C za míchání. Sraženina obsahující frakci prothrombinového komlexu se oddělí centrifugací jak se popisuje výše. Sraženina se přidá do 25 mM trinatriumcitrátdihydrátového pufru, obsahujícího 100 mM NaCl, 1 mM benzamidlnhydrochloridu, pH 6,0 a přepufruje se na sloupci, plněném Sephadex G-25, při teplotě 4 °C při průtoku 1 cm/min proti 25 mM trinatriumcitrátdihydrátového pufru, obsahujícího 100 mM NaCl, 1 mM benzamidlnhydrochloridu, pH 6,0, aby se odstranil síran amonný. Přitom se v proudu eluátu měří UV-absorpce při 280 nm a elektrická vodivost.
Frakce obsahující proteiny se spojí a následně se podrobí iontoměničové chromatografií přes DEAE-Sepharose to* · • to ·· to *'to • to « to • ·· toto toto • · · • toto ·· • · to * to · · * • ······· toto to • to to «tototo rto to ·· ·*
FFR, firma Pharmacia. Frakce se nanesou na sloupec (vnitřní průměr : výška gelového lože =1 : 1,3) s objemem gelu 8,2 1 0,55 g proteinu/l gelu, při lineárním průtoku 0,36 cm/min. Chromatografie se provádí při teplotě 22 °C. Před nanesením proteinu se sloupec ekvilibruje 25 mM trinatriumcitrátdihydrátového pufru, obsahujícího 100 mM NaCI, 1 mM benzamidinhydrochloridu, pH 6,0. Eluce proteinových frakcí se provádí v několika stupních pufrem 1 (25 mM trinatriumcitrátdihydrát, 1 mM benzamidinhydrochloridu, 245 mM NaCI, pH 6,0), pufrem 2 (25 mM trinatriumcitrátdihydrát, 1 mM benzamidinhydrochloridu, 270 mM NaCI, pH 6,0) a pufrem 3 (25 mM trinatriumcitrátdihydrát, 1 mM benzamidinhydrochloridu, 400 mM NaCI, pH 6,0). Eluce pufrem 1 se provede 2,4-násobným objemem sloupce, přitom se oddělí inertní proteiny. Eluce pufrem 2 se provádí 5,6-násobkem objemu sloupce, přičemž se zde shromažďují frakce, které se analyzují na obsah faktoru II, faktoru X, proteinu C a faktoru IX. Frakce obsahující faktor X, které neobsahují faktor II, IX a protein C se spojí. Tento preparát vysoce čistého faktoru X vykazuje specifickou aktivitu 60 E/mg proteinu.
Eluci pufrem 3 (1,9 objemu sloupce) se desorbuje faktor II, přičemž se opět shromáží frakce a zkoumají se na obsah faktorů X, faktoru IX a faktoru II. Frakce obsahující faktor II se pooluji. Jak faktor II, tak i pool obsahující faktor X se mohou případně podrobit přídavkem 1 M KSCN a inkubací při teplotě 22 °C po dobu několika hodin dodatečnému ošetření k inaktivaci patogenních nečistot.
Takto získaný pool faktoru II se přídavkem chloridu sodného nastaví na 1,9 M NaCI a hodnota pH se upraví na 7,0. Tento roztok se následně adsorbuje hydrofobní interakcí na • · • · • ·
« *·
9 V · · · · • 9 9 9 9 9 9 · · ·····«· ·· ·
9 9 9 9 9 9
9· 9 99 99
D gel Phenylsepharose High Performance firmy Pharmacia, přičemž se váží 3 g proteinu /1 gelu. Na sloupci s poměrem vnitřní průměr/výška gelového lože =1 : 1,9 se při lineárním průtoku 0,25 cm/min adsorbuje proteinová frakce a následně se promytím pufrem (25 mM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7,4) zbaví inertního proteinu. Gradientovou eluci s 11,5 objemy sloupce 3 M - 0,9 M NaCl za rovnoměrného odebírání frakcí se ze sloupce eluuje faktor II, přičemž se pooluje každá frakce obsahující aktivitu faktoru II, ale neobsahující faktor X a faktor IX. Sloučené frakce faktoru II se následně desetinásobně zkoncentruji ultra-/diafiltrací přes ultrafiltrační membránu s cut-off 30 kD a přepufruje proti pufru obsahujícímu 4 g trinatriumcitrátdihydrátu/l,8 g NaCl/1, pH 7,0. Tatko vyrobený preparát faktoru II vykazuje specifickou aktivitu 6,9 E/mg proteinu.
Stanovení aktivity faktoru II se provádí jednostupňovou metodou, založené na době tromboplastinu, za použití plasmy bez faktoru II proti mezinárodnímu standardu faktoru II za použití kombinace reagencií IMMUNO, Vídeň. Ostatní faktory krevní srážlivosti byly při analýze srážlivosti pouze ve stopách nebo nebyly vůbec prokazatelné (faktor VII < 0,00002 E/E faktoru II, faktor IX < 0,0002 E/E faktoru II, faktor X < 0,004 E/E faktoru II, protein C 0,003 E/E faktoru II a faktor VIII < 0,0002 E/E faktoru II.
Jako alternativní způsob výroby vysoce čistého faktoru II se používá také způsob, při kterém se z lyofilizovaného preparátu faktorů prothrombinového komplexu nejprve hydrofobni chromatografií oddělí faktor IX, následně se izoluje faktor II a ten se chromatografií na hydroxylapatitu čistí do vysokého stupně čistoty.
«· ·· · 9 9 • Φ · 9 · ··· • · φ 9 Φ · Φ ΦΦ * φ φ Φ ΦΦΦΦΦΦΦ ΦΦ
ΦΦΦΦΦ ΦΦ Φ
Přípravek faktorů prothrombinového komplexu se rozpustí stejně, jako se popisuje výše a s detergentem se inkubuje po dobu 1 hodiny při tepolotě místnosti. Následně se iontoměničovou chromatografií na DEAE- Sepharosa FF , firma Pharmacia, izoluji frakce obsahující faktor II, IX a X. Z nich se n
následně interakcí s Butyl-Toyopearl , firma Toso Haas, odstraní frakce obsahující faktor IX. Adsorpčni zbytek se násn ledně čistí na Phenylsepharose High Performance firmy Pharmacia další hydrofobni interakční chromatografií, při čemž se může adsorbovat asi 4 g proteinu/l gelu. Na sloupci s poměrem vnitřní průměr/výška gelového lože =1 : 1,9 se při lineárním průtoku 0,25 cm/min adsorbuje proteinová frakce, následně se promytím pufrem 20 mM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7,4) odstraní inertní protein a konečně se stupňovitou eluci izoluje frakce obsahující faktor II, která se při klesající vodivosti desorbuje z gelu při 1,9 M NaCl. Frakce obsahující faktor II se následně přímo adsorbuje na Ceramik-Hydroo xylapatit , firma Biorad. To se provede na sloupci s poměrem vnitřní průměr/výška gelového lože =1 : 4,8. Eluce se provádí při lineárním průtoku 3 cm/min. Eluci se solným gradientem se ze sloupce může desorbovat faktor II. Frakce obsahující faktor II se shromažďují a pomocí ultra-/diafiltrace přes pólysulfonovou membránu s cut-off 30 kD se zkoncentruji až do koncentrace faktoru II 50 - 100 E/ml. Takto vyrobený přípravek faktoru II vykazuje specifickou aktivitu nejméně 7 E/mg proteinu. Ostatní faktory krevní srážlivosti, obzvláště faktor IX a faktor VIII jsou přítomny jen ve stopách nebo nejsou vůbec prokazatelné. Volbou vhodného diafiltračniho pufru se přípravek faktoru II převededo farmaceuticky snášenlivoho pufru (příkladně 4 g trinatriumcitrátdihydrát/l, 8 g NaCl, pH 7,0).
• 4 • 0 • · 0 • 0 0 0 0 0 · 0··· 0 ·0 0000 0 00 0 • 0 00· 0000000 00 · 0 0 · 00 0 000·
0000« 0 * 9 * · ··
1.2. Získání plasmatického faktoru VII ml čerstvě zamražené lidské citrátové plasmy se nechá roztát při teplotě 0 - +4 °C a přitom vzniklý kryoprecipitát se oddělí centrifugací při +2 °C. Vzniklý kryozbytek se smíchá s 2 IE heparinu/ml. Potom se proteiny prothrombinového komplexu adsorbují pomocí DEAE SephadexR A firmy Pharmacia v koncentraci 0,5 mg/ml. Gel proteinového komplexu se oddělí od roztoku a promyje vždy pufrem 1 (4 g/1 trinatriumcitrátdihydrát, 0,7 g/1 NaCl, 9 g/1 Na^PO^ . 2 H20, 500 IE heparinu/1, pH 7,5) a následně pufrem 2 (4 g/1 trinatriumcitrátdihydrát/1, 7 g/1 NaCl, 500 IE heparinu/1, pH 7,5).
Tím se oddělí frakce prothrombinového komplexu obsahující faktor krevní srážlivosti prothrombin, nepatrné podílyfaktoru VII, faktoru IX a faktoru X. Většina faktoru krevní srážlivosti VII zbývající ve zbytku po adsorpci na DEAESephadexR A50, firma Pharmacia se nyní získá adsorpci na oxidu hlinitém. K tomu se na litr zbytku po oddělení prothrombinového komplexu přidá 10 ml 2 %-ní suspenze aluminium-hydrogelu a míchá se po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Následně se centrifugací při 5000 ot/min po dobu 10 minut při teplotě 4 °C v Sorvall RC3B Rotor H6000A oddělí komplex protein-alumlniumhydroxid, zbytek se vyhodí a sraženina se suspenduj e s 3,5 % obj emu zbytku prothrombinového komplexu použitého k adsorpci v roztoku 4 g/1 trinatriumcitrátdihydrátu a 7 g/1 NaCl, pH 7,5 a míchá se po dobu 30 minut. Tím se desorbuje inertní protein z aluminiumhydroxidu. Faktor II zbylý na aluminiumhydroxidu se stejně jako se popisuje výše peletuje novou centrifugací. Zbytek se vyhodí a sraženina se dále použije k dalšímu zpracování. K desorpci proteinové frakce se komplex aluminiumhydroxid - faktor to ·« ··* ·· ·· • •toto 4, ♦ · φ · · · • ·· ···· ···· • · ·?· ·····♦· · · · • toto ·· · ···· • to · · · · · * »· < *
VII míchá po dobu 30 minut s 1 objemovým % zbytku prothrombinového komplexu použitého k adsorpci s 0,3 mol/1 fosfátového pufru, pH 8,6 (53,4 g Na2HP04 . 2 H20/l se upraví roztokem 41,1 g NaH2P04 . H20/l na pH 8,6), obsahujícím 1 % TVEENR-80. Následně se k inaktivaci patogenů přidá detergent TVEEN -80 na konečnou koncentraci 15 % a potom se míchá po dobu 1 hodiny při teplotě 40 °C.
Po ochlazení roztoku na teplotu 22 °C se alikvot 20 ml n přepufruje sloupcovou chromatografií přes Sephadex G-50 (firma Pharmacia) proti roztoku 4 g/1 trinatriumcitrátdihydrátu, pH 7,4 a stejným roztokem se desetinásobně zředí. Veškerý roztok se následně nanese na sloupec plněný Heparinsepharose CL6B (firma Pharmacia) o průměru 16 mm a výšce 10 cm. Průtok činí 1 ml/min. Následně se eluuje solným gradientem 0,1 M NaCI v roztoku 4 g/1 trinatriumcitrátdihydrátu, pH 7,4 desetinásobným objemem sloupce. Proteinová frakce se kvantifikuje měřením UV-absorpce při 280 nm. Zároveň se frakce shromažďují a stanovuje se v nich faktor VII testem chromogeního faktoru VII (Immunochrom Faktor VII : 10, Immuno AG, Vídeň). Frakce eluovaného proteinu, které obsahují faktor VII, se spojí a čistí. Eluční objem frakcí faktoru VII činí 25 ml. V proteinové frakci se stanoví obsah proteinu metodou podle Bradforda, M.M. (Anal. Biochem. 72,
248-254, 1976) faktor VII stejně, jako se popisuje výše. Rovněž se kvantitativně stanoví faktor Vila metodou podle US 683 682. Z toho bylo možné zjistit, že eluovaná frakce faktoru VII vykazuje specifickou aktivitu 98 jednotek/ml proteinu, zatímco obsah faktoru Vila je menší než jedna jednotka/ml. Odpovídajícím způsobem je možné získat preparát vysoce čistého faktoru VII bez podstatné aktivace faktoru VII. Výtěžek při chromatografií činí více jak 50 %.
• 00
000 0000000
1.3. Plasmatický faktor IX
150 ml prothrombinového komplexu se předčistí pomocí dextransulfátu (Miletich a spol., Analytical Biochemistry 105, 304 (1980). 20 ml eluátu (912 I.E. faktoru IX, 160
I.E. faktoru X) se nanese na sloupec s 20 ml agarosového polymeru s oktylovými skupinami (0ctyl-Sepharose-CL-4B, firma Pharmacia, Švédsko) s průtokem 360 ml/hod. Sloupec se předem ekvilibruje 80 ml pufru A. Po promytí naplněného gelu 120 ml pufru A se eluuje frakce obsahující faktor IX 80 ml 250 mmolárního roztoku NaCl.
Výtěžek faktoru IX činí asi 54 % výchozí aktivity. Specifická aktivita činí 186 I.E. faktoru IX/mg proteinu. Faktor X je přítomen pouze ve stopách.
1.4. Získání plasmatického proteinu C
Vysoce čistý protein C se získá ze surové frakce proteinu C, která se vyrob! z komerčně dodávaného koncentrátu prothrombinového komplexu. Čištění se provádí afinitní chromatografii pomocí monoklonálních protilátek. Monoklonální anti-protein C-protilátky se vyrobí následovně :
BALB/C myši se imunizují 100 gg lidského proteinu C ve dvoutýdenních intervalech intraperitoneální injekcí. Po šesti týdnech se injikuje ještě jednou 50 gg lidského proteinu C a tři dny později se provede fuze. Myelomová buněčná linie (P3-X-63-AG8-653, 1,5 x 10^ buněk) se smísí s 1,7 x 10® slezinných buněk myši a provede se fuze modifikovanou metodou podle Kóhlera & Milsteina za použití PEG 1500 (Kóhler G., Milstein C., Nátuře 256, (1975), 495-497).
» «* · · ♦ · · · · «· « 4 · · 4 · · · » • 4 4 4 · · ♦ · · · · • · · 4 « ·»···♦· 4 4 ·
4 4 4 4 4 · .· * ·
Pozitivní klony, testované pomocí ELISA, se dvakrát subklonují. Produkce ascites se provede injekcí 5 x 10^ hybridomních buněk pro každou myš BALB/C dva týdny po ošetření Přistáném.
Imunoglobulin se z ascitů čistí precipitací síranem amonným a následnou chromatografií pomocí QAE-Sephadexu a následně chromatografii na Sephadexu G200. Ke snížení rizika přenosu muriních virů se protilátka před imobilizací ještě podrobí kroku inaktivace virů. Takto získaná monoklonální protilátka proti proteinu C se napojí na CNBR-Sepharose 4B (Pharmacia). K čištění proteinu C pomocí afinitní chromát ografie se použijí následuje! pufry :
Jako adsorpční pufr :
mM Tris, 2 mM EDTA, 0,25 M NaCl a 5 mM benzamidinu;
Jako promývací pufr :
mM Tris, 1 M NaCl, 2 mM benzamidinu, 2 mM EDTA; pH hodnota činí 7,4;
Jako eluční pufr se použije :
M NaSCN, 20 mM Tris, 1 M NaCl, 0,5 mM benzamidinu, 2 mM EDTA.
Další vhodná monoklonální protilátka k čištění proteinu C se popisuje v US 5 336 610. Tato protilátka se váže na aktivační peptid proteinu C a je proto vhodná selektivně čistit zymogen proteinu C od aktivované formy.
V podrobnostech : koncentrát prothrombinového komplexu « · · · ♦ · * 4 · • •44 «44 494«
44 4444 »44»
4 «4» 4444404 «4 *
444 4 4 4 4···
44444 4» 4 ·· 4« se rozpustí v adsorpčním pufru, přičemž se použije asi 10 g koncentrátu prothrombinového komplexu na asi 20 ml sloupce monoklonální protilátky. Následně se rozpuštěný koncentrát prothrombinového komplexu filtruje, centrifuguje se při 20 000 οΐ/min po dobu 15 minut a pomocí 0,8 pm filtru se filtruje ke sterilaci. Filtrací sterilovaný a rozpuštěný koncentrát prothrombinového komplexu se nanese na sloupec s průtokem 10 ml/hod. Následně se sloupec promyje promývacím pufrem k odstranění proteinů a konečně se vázaný protein C eluuje elučním pufrem při průtoku 5 ml/hod a frakce se shromažďují. Eluovaný protein C se dialyzuje proti pufru (0,2 M Tris, 0,15 M glycinu a 1 mM EDTA, pH 8,3). Obsah proteinu C se stanoví podle antigenu pomocí metody dle Laurella a podle aktivity aktivací dle Protaca.
Získaný eluát proteinu C se dokončí na farmaceuticky aplikovatelný preparát následovně :
Eluát se nejprve podrobí ultrafiltraci a diafiltraci. Pro diafiltraci se použije pufr s pH hodnotou 7,4, který obsahuje 150 mM NaCI a 15 mM trinatriumcitrátu . 2 H2O. Získaný filtrát se vysuší vymražením a jednohodinovým ošetřením parou při teplotě 80 °C ± 5 °C a tlaku 137,5 kPa ± 3,5 kPa se inaktivuje proti virům.
Lyofilizovaný materiál inaktivovaný na viry se potom rozpustí ve sterilním isotoním roztoku NaCI a pomocí iontoměničové chromatografie na Q-Sepharose se odstraní případně přítomné protilátky případně serumamyloid P. Vyčištěný roztok se potom koncentruje ultrafiltraci a dialfiltraci. Nato se k získanému roztoku přidá 10 albuminu, 150 mM NaCI a 15 mM trinatriumcitrátu. Myší imunglobulin ani faktory II, VII, IX a X nebylo možné prokázat. Následně se roztok
• · · • 4 to 4 steriluje filtrací, plní se a lyofilizuje. Specifická aktivita činí 14 jednotek proteinu C/mg. Jako test aktivity se použije amidolytický test, přičemž protein C se aktivuje pomocí Protacu (firma Pentapharm).
1.5. Čištění plasmatického proteinu S
Lidský protein S se vyrobí jako koncentrát faktoru IX (prothrombinový komplex STIM-3 IMMUNO AG Vídeň) pomocí QAE-Sephadex a Blue Sepharose CL-6B-Chromatographie (Pharnacia) následujícím způsobem :
Lyofilizovaný koncentrát (100 g) se rozpustí ve 200 ml sterilní deionizované vody a dialyzuje se proti pufru, sestávajícímu z 0,01 M 2-(N-morfolinethansulfonové kyseliny), pH 6,0; 0,18 M NaCI, 10 mM EDTA, 2 mM benzamidinhydrochloridu a 0,02 % NaN^ (starovací pufr). Dialyzovaný materiál se potom nanese na sloupec QAE-Sephadexu (8 x 19 cm) a ekvilibruje se uvedeným pufrem. Jako promývací roztok se použije 1,5 1 pufru (startovací pufr).
Protein S se eluuje 110 ml/hod lineárním gradientem NaC1, sestávajícím z 1,2 1 startovacího pufru a 1,2 1 dalšího pufru, který se od prvního pufru liší přídavkem 0,5 M NaCI. Frakce S-proteinu se zkouší pomocí Fast Flow SDS Page (Pharmacia) a stanovením antigenu (Laurell) na obsah proteinu S a frakce, které obsahují protein S, se pooluji a nakonec se dialyzují proti pufru. Tento pufr obsahuje 50 mM tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCI, 2 mM EDTA, 1 mM benzamidinhydrochloridu a 0,02 % NaN^. Po dialyze se pool proteinu S nanese na sloupec Blue-Sepharose CL-6B (2,5 cm x 10,5 cm) a ekvilibruje se startovacím pufrem.
Promytí se provádí rychlostí 15 ml/hod 500 ml startovacího pufru. Protein S se tak eluuje ve void volume, zatímco prothrombin se adsorbuje na sloupci. Frakce s obsahem proteinu S se potom opět stanoví pomocí SDS-Page Fast Flow System (Pharmacia) a podle Laurella (Scand.J.Clin.Invest. (Suppl.) 29 (1977) 21 (Suppl. 124).
Takto vyrobený protein S má na redukované SDS-Page morfologii charakteristickou pro protein S, totiž dva blízké pásy (Doublett) s molekulovou hmotností asi 86 000 případně 76 000. Koncentrace proteinu se stanoví spektrofotometricky na základě extinkčních koeficientů 0,1 při 280 nm pro lidský protein S a potvrdí se metodou podle Lowry (Lowry 0., Rosegrough Ν., Farr AL., Randall R., Protein Measurement with the Folin phenol reagent, J.Biol.Chem. 193 (1951) 265).
Takto vyrobený předčištěný protein S se použije k výrobě ovčího antisera proti proteinu S, kdy se použijí čtyři imunisační injekce, přičemž prvními dvěma injekcemi se subkutánně aplikuje 100 gg proteinu S s adjuvans podle Freunda a při následném boostování se pracuje s nekompletním adjuvans. Po dalším boostování se antiserum testuje pomocí dvojité imunodifuze a vykazuje precipitaci s čištěným proteinem Sas normální plasmou.
IgG frakce ze 450 ml antisera se získá vysrážením alkoholem a následnou adsorpcí na Sephades A 50 v tris-HCl pufru, pH 6,8. Ze 450 ml antisera bylo ve zbytku 1,14 g antiproteinu S-IgG. IgG frakce se napojí na 450 ml Sepharose CL-4B, přičemž se použije 5,7 mg proteinu/ml Sepharose. Účinnost spojení činí 76 %. Sloupec pro antiprotein S se ekvilibruje glycinhydrochloridem, pH 3 a adsorpčním pufrem pH 7,5.
« ·
Adsorpční pufr sestává z 20 mM TRIS, 2 mM EDTA, 0,25 M NaCI, 2 mM benzamidinu, 0,02 % TweenR 20 a 0,02 % NaN3, pH 7,4. Roztok promývacího pufru má následuj ící složky : 20 mM TRIS, 2 mM EDTA, 1,0 M NaCI, 0,5 mM benzamidinu, 0,01 % TweenR 20 a 0,02 % NaN^, pH 7,4.
Eluční pufr má stejné složení jako roztok promývacího p
pufru s tou změnou, že se použije 0,05 % Tween 20 a navíc 243,3 g NaSCN, pH 7,4 (3 M roztok rhodanidu).
Roztok dialyzačního pufru obsahuje 20 mM TRIS, 0,15 mM glycinu, 1 mM EDTA, 2 mM benzamidinu, pH 8,3.
K dalšímu čištění frakce proteinu S vyrobeného z koncentrátu prothrombinového komplexu se rozpustí 100 g frakce vil adsorpčníhp pufru a přes noc se dialyzuje proti roztoku adsorpčníhp pufru. Sloupec se po nanesení vzorku promyje asi 5 1 promývacího pufru až do nepřítomnosti proteinu, následně se provádí eluce se 3 M NaSCN v roztoku elučního pufru.
Eluát se okamžitě dialyzuje, dokud se nedosáhne obsahu SCN pod hranicí prokazatelnosti; eluát má koncentraci 500 gg/ml proteinu S. Neobsahuje C4-binding protein.
Monoklonální protilátka antiproteinu S se vyrobí následovně :
BALB/C myši se imunizují 100 gg vyrobeného proteinu S ve dvoutýdenních intervalech intraperitoneální injekcí.
Po šesti týdnech se injikuje ještě jednou 50 gg lidského proteinu S a tři dny později se provede fuze. Myelomová bu26 • ·· · «· ·· « 4 · · · ♦ 4 ···« • ·* «444 ·»·· · 4 4 4 444444· · 4 · něčná linie (P3-X-63-AG8-653, 1,5 x 10? buněk) se smísí s 1,7 x 10® slezinných buněk myši a provede se fuze modifikovanou metodou podle Kohlera & Milsteina za použiti PEG 1500 (Kóhler G., Milstein C., Nátuře 256, (1975), 495-497).
Pozitivní klony, testované pomocí ELISA, se dvakrát subklonují. Produkce ascites se provede injekcí 5 x 10^ hybrdidomních buněk pro každou myš BALB/C dva týdny po ošetření Přistáném.
Imunoglobulin se z ascitů čistí precipitací síranem amonným a následnou chromatografií pomocí QAE-Sephadexu a následně chromatografií na Sephadexu G200.
IgG frakce získaná z ascitů a předčištěná na Sepharose - protein A se napojí na Sepharose CL-4B. Čištění proteinu, který byl získán z koncentrátu prothrombinového komplexu pomocí afinitni chromatografie se provádí za podmínek popsaných pro protilátku polyklonálního proteinu S. Koncentrace proteinu S v eluátu činí 600pg/ml. Neobsahuje C4-binding protein.
Metodou polyklonální nebo monoklonální afinitní chromatografie vysoce vyčištěný přípravek proteinu S se podrobí SDS-Page (gradientový gel 8 až 12 %) a může se podle Coomasie zabarvení (Laemmli UK : Cleavage of structural proteins during the assenbly of the head of bacteriophage T4, Nátuře 227 (1970), 680) označit jako více než 95 % čistota.
Eluát se následně podrobí ultrafiltraci a diafiltraci. Pro diafiltraci se použije pufr s pH hodnotou 7,4, který obsahuje 150 mM NaCl a 15 mM trinatriumcitrátu . 2 H2O. Získaný filtrát se vysuší vymražením a jednohoti ·
Φ Φ • Φ Φ
Φ Φ Φ • Φ Φ
ΦΦΦ · Φ
Φ* ΦΦ dinovým ošetřením parou při teplotě 80 °C± 5 °Ca tlaku 137,5 kPa ± 3,5 kPa se inaktivuje proti virům (k odstraněni případně přítomné virové kontaminace polyklonálni nebo monoklonální protilátkou).
Lyofilizovaný materiál inaktivovaný na viry se potom rozpustí ve sterilním isotoním roztoku NaCl a pomocí iontoměničové chromatografie na Q-Sepharose se odstraní případně přítomné protilátky případně serumamyloid P. Vyčištěný roztok se potom koncentruje další ultrafiltrací a dialfUtrácí . Nato se k získanému roztoku přidá na 1 1 10 g albuminu, 150 mM NaCl a 15 mM trinatriumcitrátu. Hodnota pH čini
7,5. Obsahuje 3000 gg/ml proteinu S. Tento obsah proteinu S odpovídá 500-násobnému obohacení ve srovnání s plasmou. Myší imunoglobulin ani faktory II, VII, IX a X není možné prokázat. Nálsedně se roztok filtuje ke sterilaci, plní se a lyofylizuje.
Příklad 2
Farmaceutický přípravek vysoce čistých proteinů závislých na vitaminu K
Vysoce čisté jednotlivé faktory prothrombinu, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C a protein S se smíchají tak, aby vznikl roztok obsahující vždy 25 000 jednotek/l jednotlivých faktorů ve vodném roztoku 4 g Na^-citrátu . 2 H20 a 8 g NaCl. Roztok se steriluje filtrací přes nylonový filtr s poměrem zadržení 0,2 gm a následně se plní po 20 ml sterilovaných skleněných lahviček o plnicím objemu 50 ml. Následně se za sterilních podmínek vymrazí a lahvičky se potom sterilně uzavřou.
• tt tt «··· · · · ···· • 99 9999 9999
9 999 9999999 99 9
9 9 · 9 9 9 9 9 9 • 99 99 99 9 9 · 99
Příklad 3
Farmaceutický přípravek prothrombinového komplexu
Stejně jako se popisuje v předchozím příkladu se připraví vysoce čistý prothrombinový komplex, obsahující faktor VII, faktor IX a faktor X, avšak bez proteinu C a proteinu S a za sterilních podmínek se plní. Poodle mezinárodních doporučení se k roztoku před plněním přidá 10 000 mezinárodních jednotek heparinu/1.
Příklad 4
Farmaceutický přípravek proteinů závislých na vitaminu K k trvalé substituci a udržení konstantní hladiny plasmatu
Po substituci koncentrátem proteinů závislých na vitaminu K, u kterého se má pokud možno dosáhnout konstantní hladiny plasmatu faktorů prothrombinového komplexu, je na základě rozdílných poločasů stability jednotlivých faktorů nutné provést míru substituce těchto proteinů v poměru, který není ekvivalentní. Odpovídajícím způsobem se stejně jako je popsáno výše se připraví farmaceutický přípravek, který obsahuje prothrombin, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C a protein S v poměru 1:30:3:1,5:6:6.
Příklad 5
Farmaceutický přípravek parciálního prothrombinového komplexu
Pro rozdílné poločasy faktorů prothrombinového komplexu in vivo, obzvláště pro dlouhý poločas prothrombinu 2 až 5 •0 ·· · 00 00 0 0 0 0 · 0900
0000 0000 0 000 0000000 00 0 00 00 0 0000 dní ve srovnání s krátkým poločasem faktoru VII 4 až 7 hodin a faktoru IX pod 24 hodin, dochází při trvalé substituci přípravky prothrombinového komplexu, kde při nastavení normální koncentrace plasmatu 1 jednotka faktoru VII/ml, k poklesu koncentrace plasmatu po 24 hodinách j iž opět pod koncentraci nejméně 20 %, která je potřebná pro fungující hemostázu, zatímco příkladně hladina prothrombinového plasmatu je ještě přibližně normální, to znamená 1 jednotka/ml. Při nové substituci koncentrátem prothrombinového komplexu stejného složení jako při primární substituci nyní vyplývá, že koncentrace prothrombinové plasmy u pacienta je zvýšena nad normální oblast, aby bylo možné dosáhnout nové ekvivalentní koncentrace plasmy faktoru VII nebo faktoru IX. Zvýšení koncentrace prothrombinové plasmy nad normální oblast však znamená zvýšené riziko trombózy pro ošetřované pacienty, neboť Poort a spol. (Blood 88:3698-3703, 1996) zjistili, že i jen o 30 % zvýšená hladina plasmy prothrombinu je spojena s výrazně vyšším rizikem venozní trombózy. Tomuto problému se může zabránit, jestliže se pro sekundární substituce cíleně použijí kombinované přípravky prothrombinového komplexu.
Takový přípravek se vyrobí následovně :
Stejně jako se popisuje v předcházejících příkladech, sestaví se koncentrát prothrombinového komplexu, sestávající z faktoru VII, IX a X v poměru 30 : 3 : 1,5, avšak bez prothrombinu a připraví se jako farmaceutická formulace. Dávky tohoto preparátu předpokládané k aplikaci obsahují vždy 500 mezinárodních jednotek faktorů krevní srážlivosti VII, IX a X v objemu pro rozpuštění 10 ml po rekonstituci lyofilyzovaného prášku.
> ·· ·· · ·· ·· • · * · 9 9 9 9 · · • ·« · · 9 · · · · • 9 9 9 9 9 9999 9 9 99
9 9 9 9 9 9 9 9
99999 99 9 9 9 99
Příklad 6
Kontrola jakosti preparátu prothrombinového komlexu
Jednotlivé faktory krevní srážlivosti v konečné adjústa ci preparátu prothrombinového komlexu se zkouší jednostupňovým testem krevní srážlivosti za použití deficitní plasmy a reagencií krevní srážlivosti firmy IMUNO, Vídeň, na obsah prothrombinu, faktoru VII, faktoru IX, faktoru X, proteinu C a proteinu S.
Detaily použité metody lze čerpat z práce Muller, H:G: a Bonik K. (Krankenhauspharmazie 13:528-531, 1992).
Ke stanovení obsahu aktivovaných faktorů prothrombinového komplexu se použijí chromogenní substráty S-2238, S-2222, S-2444, S-2366 a S-2251 firmy Chromogenix. Stanovení se provádí za pufrovaných podmínek udaných výrobcem. Chromogenními substráty se stanoví vždy aktivované faktory thrombin, faktor Vila, faktor IXA, faktor Xa, aktivovaný protein C, které vůči použitým peptidovým substrátům vyvíjejí proteolytickou aktivitu. Po vyhodnocení fotometrické analýzy chromogenní přeměny substrátu bylo zjištěno, že pro všechny substráty leží obsah proteinů nebo vybraných faktorů prothrombinového komplexu ve dříve popsaných přípravcích, obsahujících vitamín K, vždy pod 10 mU/ml.
Claims (34)
1. Farmaceutický separovaný preparát prothrombinového komplexu, vyznačující se tím, že sestává nejméně ze dvou chromatograficky čištěných jednotlivých faktorů závislých na vitaminu K jako účinných látek.
2. Preparát podle nároku 1, vyznačující se tím, že jednotlivé faktory jsou vybrané ze skupiny faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C, protein S a protein Z.
3. Preparát podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň faktory II, VII, IX a X.
4. Preparát podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé faktory protein C a protein S.
5. Preparát podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že nejméně jeden z jednotlivých faktorů je rekombinantní faktor, transgeně vyrobený faktor, derivát, obzvláště peptid, a/nebo fragment.
6. Preparát podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé obsahové faktory v poměru, který v podstatě odpovídá poměru těchto faktorů v krvi.
7.
Preparát podle některého z nároků 1 až 6, • ·
Φ · ···· vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé faktory faktor II, faktor VII, faktor IX a faktor X v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 2) : (0,5 až 2) : (0,5 až 2).
8. Preparát podle některého z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé faktory faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C a protein S v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 2) : (0,5 až 2) : (0,5 až 2) (0,5 až 2) : (0,5 až 2).
9. Preparát podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že obsažené jednotlivé faktory jsou v poměru, který odpovídá relativnímu poločasu stability jednotlivých faktorů.
10. Preparát podle nároku 9, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé faktory faktor II, faktor VII, faktor IX a faktor X v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 35) : (0,5 až 7) : (0,5 až 5).
11. Preparát podle některého z nároků 9 nebo 10, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivé faktory faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, protein C a protein S v relativním poměru, vztaženo na mezinárodní jednotky (0,5 až 2) : (5 až 35) : (0,5 až 7) : (0,5 až 5) : (1 až 15) : (1 až 15).
12. Preparát podle nároku 1, 2, 4, 5, 6 nebo 9, vyznačující se tím, že obsahuje faktor VII a faktor II v poměru větším než 10 : 1.
· • · · · · · · · · · · • ·» · · · · · · · · • · ··· ······· · · * ··· ·· · to··· ····· ·· · ·· ··
13. Preparát podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že jednotlivé faktory v preparátu netvoří žádný komplex.
14. Preparát podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že obsahuje parciální prothrombinový komplex.
15. Preparát podle některého z nároků 1 až 14, vyznačujíc! se tím, že neobsahuj e žádný aktivovaný faktor krevní srážlivosti vybraný z Ila, IXa, Xa a případně Vila.
16. Preparát podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že obsahuje méně než 0,1 E faktoru VIII : C nebo faktoru VIII : Ag/mg proteinu.
17. Preparát podle některého z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že obsahuj e méně než 0,1 E faktoru Ila/E prothrombinu.
18. Preparát podle některého z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že obsahuj e méně než 0,1 E faktoru Xa/E faktoru X.
19. Preparát podle některého z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že se vyskytuje v lyofilizované formě.
20. Preparát podle některého z nároků 1 až 19, vyznačující se tím, že obsahuje hořčíkové ionty.
·· to • toto to · to to • toto* · to · · • · ······· ·· · • · · · · · · ·· · ·· ··
21. Preparát podle některého z nároků 1 až 20, vyznačující se tím, že neobsahuje žádné volné vápenaté ionty.
22. Preparát podle nároku 21, vyznačující se tím, že obsahuje chelátotvornou sloučeninu k tvorbě komplexu s volnými vápenatými ionty.
23. Preparát podle některého z nároků 1 až 22, vyznačujíc! se tím, že dále obsahuje antithrombin III ve stabilizujících množstvích, popřípadě společně s heparinem.
24. Preparát podle některého z nároků 1 až 23, vyznačující se tím, že na základě ošetření k inaktivaci virů nebo zneškodnění virů je prostý infekčních virů.
25. Preparát podle některého z nároků 1 až 24, vyznačující se tím, že nepřítomnost infekčních virů je zajištěna dvěma na sobě nezávislými způsoby k inaktivaci virů nebo zneškodnění virů.
26. Preparát podle některého z nároků 1 až 25, vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky přijatelné pufrovací látky nebo stabilizátory.
27. Preparát podle některého z nároků 1 až 26, vyznačující se tím, že sestává z vysoce čistých jednotlivých faktorů závislých na vitaminu K, které jsou virově inaktivovány.
9 99 99 9 99 99
99 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 999 9999999 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 99 99 9 9 9 99
28. Preparát podle některého z nároků 1 až 27, vyznačující se tím, že obsahuje jednotlivý faktor X v jeho α-formě a/nebo β-formě.
29. Diagnostický přípravek obsahující preparát podle některého nároků 1 až 28.
30. Použití preparátu podle některého z nároků 1 až 28 k výrobě přípravku k ošetření získané nebo zděděné poruchy krevní srážlivosti.
31. Použití preparátu podle některého z nároků 1 až 28 k výrobě přípravku k ošetření těžkých krvácení.
32. Použití preparátu podle některého z nároků 1 až 28 k výrobě přípravku k profylaxi krvácení, obzvláště při výskytu zděděných poruch krevní srážlivosti.
33. Použití preparátu podle některého z nároků 1 až 28 k výrobě přípravku k substituční terapii.
34. Použití preparátu podle některého z nároků 1 až 28 k výrobě přípravku k ošetření hemofilie B.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000982A CZ2000982A3 (cs) | 1998-09-17 | 1998-09-17 | Farmaceutický preparát obsahující jednotlivé faktory, závislé na vitaminu K a jeho použití |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000982A CZ2000982A3 (cs) | 1998-09-17 | 1998-09-17 | Farmaceutický preparát obsahující jednotlivé faktory, závislé na vitaminu K a jeho použití |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2000982A3 true CZ2000982A3 (cs) | 2000-08-16 |
Family
ID=5469991
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2000982A CZ2000982A3 (cs) | 1998-09-17 | 1998-09-17 | Farmaceutický preparát obsahující jednotlivé faktory, závislé na vitaminu K a jeho použití |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2000982A3 (cs) |
-
1998
- 1998-09-17 CZ CZ2000982A patent/CZ2000982A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2287267C (en) | Improved methods for processing activated protein c | |
| US7767647B2 (en) | Method of the invention preparations of factor IXa | |
| US5866122A (en) | Pharmaceutical preparation for treating blood coagulation disorders | |
| Wesselschmidt et al. | Structural requirements for tissue factor pathway inhibitor interactions with factor Xa and heparin | |
| JP2533050B2 (ja) | 高純度活性因子ＶＩＩａの濃縮物の製造方法 | |
| US5219995A (en) | Plasma fraction purification | |
| JP2002518411A (ja) | 薬学的第ｖｉｉ因子調製物 | |
| JP3032085B2 (ja) | プロテインｃを含有し血栓溶解活性を有する非経口投与が可能な薬剤 | |
| US4404132A (en) | Blood coagulation promoting product | |
| JPS6254286B2 (cs) | ||
| US6358534B1 (en) | Immunotolerant prothrombin complex preparation | |
| SK4022000A3 (en) | PHARMACEUTICAL SUBSTANCE CONTAINING VARIOUS VITAMIN K-DEPENDENTì (54) FACTORS | |
| HUT72712A (en) | Purification of factor vii | |
| Michalski et al. | Large‐scale production and properties of a solvent‐detergent‐treated factor IX concentrate from human plasma | |
| RU2142806C1 (ru) | Способ очистки и хранения фактора ix, водный раствор очищенного фактора ix, композиция, содержащая фактор ix, способ лечения | |
| JP5261478B2 (ja) | 第Ｘ因子，活性化第Ｘ因子，不活性第Ｘ因子および不活性化第Ｘａ因子の調製方法、ならびに該因子を含む医薬組成物 | |
| JPH1059866A (ja) | 血液凝固第ｖｉｉ因子及び／もしくは活性化血液凝固第ｖｉｉ因子の製造方法 | |
| CN112423782B (zh) | FX活化方法及其在FXa组合物制备中的用途 | |
| FI94927B (fi) | Menetelmä S-proteiinipitoisen farmaseuttisen tuotteen valmistamiseksi | |
| US6403556B1 (en) | Pharmaceutical preparation containing protein C and a thrombolytically active substance | |
| CZ2000982A3 (cs) | Farmaceutický preparát obsahující jednotlivé faktory, závislé na vitaminu K a jeho použití | |
| Grancha et al. | Factor IX | |
| MXPA00002622A (es) | Preparado farmaceutico que contiene factores individuales dependientes de la vitamina k | |
| Rao et al. | Purification and characterization of rabbit factor IX and its existence as a two-chain factor IXα in circulating plasma | |
| CZ355899A3 (cs) | Imunotolerantní farmaceutické přípravky prothrombinového komplexu, způsob jejich výroby a jejich použití |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |