SK4022000A3

SK4022000A3 - PHARMACEUTICAL SUBSTANCE CONTAINING VARIOUS VITAMIN K-DEPENDENTì (54) FACTORS

Info

Publication number: SK4022000A3
Application number: SK402-2000A
Authority: SK
Inventors: Yendra Linnau; Peter Turecek; Hans-Peter Schwarz
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-17
Publication date: 2000-09-12
Also published as: EP1015020A1; JP2001517636A; ATA159197A; AU743102B2; WO1999015196A1; CA2304396A1; HUP0003681A1; NO20001415D0; AT409334B; NO20001415L; AU9244998A; BR9812222A

Abstract

The invention relates to a pharmaceutical substance separated from a prothrombin complex, containing at least two different blood factors which are highly purified and vitamin k-dependent.

Description

Vynález sa týka farmaceutického preparátu obsahujúceho jednotlivé faktory závislé od vitamínu K.The present invention relates to a pharmaceutical composition comprising individual vitamin K dependent factors.

Doterajší stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Proteíny závislé od vitamínu K sa vyznačujú tým, že pre svoju biosyntézu zásadným spôsobom vyžadujú vitamín K. Tak napríklad protrombín (faktor II), ktorý sa tvorí za účinku antagonistov vitamínu K, neviaže, na rozdiel od normálneho protrombínu, Ca²⁺. Normálny protrombín obsahuje na N-konci gama-karboxyglutamát, teda druhú karboxylovú skupinu na glutamátovom zvyšku. Počas biogenézy funkčného protrombínu sa totiž karboxyluje v aminofunkčnej koncovej oblasti proteínu prvých desať glutamátových zvyškov enzýmového systému závislého od vitamínu K na gama - karboxyglutamát. Táto gama-karboxyglutamátová skupina je veľmi silný chelátor pre ióny vápnika. Cez tieto viazané Ca²⁺ ióny sa protrombín viaže na fosfolipidové membrány, ktoré pochádzajú z bunečných membrán, napríklad z krvných doštičiek, aby tak vznikla správna topológia na iniciáciu krvnej zrážanlivosti.Vitamin K-dependent proteins are characterized in that they essentially require vitamin K for their biosynthesis. For example, prothrombin (factor II), which is produced under the action of vitamin K antagonists, does not bind Ca ²⁺ , unlike normal prothrombin. Normal prothrombin contains a gamma-carboxyglutamate at the N-terminus, a second carboxyl group on the glutamate residue. Indeed, during the biogenesis of functional prothrombin, the first ten glutamate residues of the vitamin K-dependent enzyme system are carboxylated in the amino-functional terminal region of the protein to gamma-carboxyglutamate. This gamma-carboxyglutamate group is a very potent chelator for calcium ions. Through these bound Ca ²⁺ ions, prothrombin binds to phospholipid membranes that originate from cell membranes, such as platelets, to provide the correct topology for initiating blood clotting.

Nielen protrombín obsahuje gama-karboxyglutamátové zvyšky, ale i faktory zrážanlivosti VII, IX a X sa karboxylujú na špecifických glutamátových zvyškoch, aby tak vytvorili vysokú afinitu voči iónom vápnika. Ale tiež ďalšie proteíny podieľajúce sa na kaskáde zrážanlivosti, ako proteín C, proteín S a proteín Z potrebujú na svoju biosyntézu vitamín K.Not only prothrombin contains gamma-carboxyglutamate residues, but also clotting factors VII, IX and X are carboxylated at specific glutamate residues to create high affinity for calcium ions. But also other proteins involved in the clotting cascade, such as protein C, protein S and protein Z, need vitamin K for their biosynthesis.

Jednotlivé faktory závislé od vitamínu K, najmä faktory II, VII, IX a X vykazujú podobné fyzikálno - chemické vlastnosti, ako napríklad podobnú molekulovú hmotnosť, pľ s, elektroforetickú mobilitu a tak ďalej a získavajú sa preto spravidla spoločne ako protrombínový komplex (iné označenie: faktor IX•3Ť245/H komplex alebo PPSB-komplex). S ohľadom na podobnú charakteristiku proteínov je ťažké preparatívne vyrobiť jednotlivé faktory. Výroba preparátov protrombínového komplexu za súčasnej izolácie všetkých obsiahnutých faktorov má preto podľa stavu techniky vždy prednosť pred výrobou koncentrátov krvných faktorov pri výrobe farmaceutických preparátov (pozri Brummelhuis vMethods of Plasma Protein Fractionation, ed. Curling, 1980, Academic Press, str. 117 - 128). Rovnako sa ale tiež ukazuje, že faktory protrombínového komplexu na základe ich rozdielnej stability, prípadne polčasu účinnosti nemôžu byť nikdy získané za fyziologických pomerov (vždy 1 E proteínu), (pozri Míiller a spol., Krankenhauspharmazie, 13,11,1992, str. 528531; Kôhler a spol., Thrombosis Research 60,1990, str. 63 - 70).Individual vitamin K-dependent factors, in particular factors II, VII, IX and X exhibit similar physicochemical properties, such as similar molecular weight, p.s, s, electrophoretic mobility and so on, and are therefore generally obtained together as a prothrombin complex (other designation: Factor IX • 3445 (H complex or PPSB complex). Due to a similar characteristic of proteins, it is difficult to prepare individual factors preparatively. Accordingly, the production of prothrombin complex preparations while isolating all the factors involved has always prevailed in the prior art over the production of blood factor concentrates in the manufacture of pharmaceutical preparations (see Brummelhuis in Methods of Plasma Protein Fractionation, ed. Curling, 1980, Academic Press, pp. 117-128). . However, it is also shown that prothrombin complex factors, due to their different stability or half-life, can never be obtained at physiological ratios (1 E protein each), (see Miller et al., Krankenhauspharmazie, 13, 11, 1992, p. Kohler et al., Thrombosis Research 60, 1990, pp. 63-70).

V EP-A 0 700 684 sa popisuje koncentrát protrombínového komplexu spolu s najmenej jednou ďalšou zložkou podporujúcou zrážanlivosť krvi ako obranný prostriedok pre krvnú antikoaguláciu.EP-A 0 700 684 discloses a prothrombin complex concentrate together with at least one other blood-clotting promoting component as a defense agent for blood anticoagulation.

Vzniká riziko, že koncentráty protrombínového komplexu na základe ich čistenia z komplexných zmesí proteínov obsahujú aktivované faktory krvnej zrážanlivosti, ktoré sú väčšinou aktívnymi serínproteázami. Práve u pacientov by ale nemalo dochádzať ku koagulácii, pretože vznik trombóz môže byť, prípadne je osudový. Dokonca i keď sú v takom preparáte prítomné hoci len stopy týchto aktivovaných faktorov krvnej zrážanlivosti, najmä trombínu, dochádza k proteolytickej inaktivácii jednotlivých faktorov, ktorá podľa individuálnej stability jednotlivých faktorov môže mať závažné dôsledky. Všeobecne majú koncentráty protrombínových komplexov sklon k nestabilite a sú preto nevhodné na čiastkové skladovanie. K týmto odbúravacím reakciám, obzvlášť pomocou trombínu, dochádza dokonca i v pevnom stave, to znamená, že ani dokonca vysušenie, prípadne lyofilizácia preparátu nevedie k spoľahlivej stabilite pri skladovaní.There is a risk that prothrombin complex concentrates, based on their purification from complex protein mixtures, contain activated blood clotting factors, which are mostly active serine proteases. However, patients should not be coagulated, since thrombosis may be fatal. Even if only traces of these activated clotting factors, especially thrombin, are present in such a preparation, proteolytic inactivation of the individual factors occurs, which may have serious consequences depending on the individual stability of the individual factors. In general, prothrombin complex concentrates tend to be unstable and are therefore unsuitable for partial storage. These degradation reactions, especially with thrombin, occur even in the solid state, i.e. even drying or lyophilization of the preparation does not lead to reliable storage stability.

Ďalej sú koncentráty protrombínového komplexu mimoriadne nepružné z hľadiska relatívnych pomerov obsiahnutých jednotlivých faktorov. Nie je prakticky možnosť v priebehu čistenia protrombínového komplexu ovplyvniťFurthermore, the prothrombin complex concentrates are extremely inflexible in terms of the relative ratios of the individual factors involved. There is practically no possibility to influence during purification of the prothrombin complex

31245/H tieto relatívne pomery, predovšetkým je potom nevýhodné v prípade, kedy sa požaduje protrombínový komplex obohatený o určité faktory.31245 / H, these relative ratios, in particular, are disadvantageous when a prothrombin complex enriched with certain factors is required.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Úlohou predloženého vynálezu je preto pripraviť kombinované farmaceutické preparáty proteínov závislých od vitamínu K, ktoré sú z hľadiska ich zloženia presne definované, prípadne definovateľné, majú vysokú stabilitu, najmä pri dlhodobom skladovaní a rovnako majú vysokú flexibilitu pri zmene zloženia.SUMMARY OF THE INVENTION It is therefore an object of the present invention to provide combination pharmaceutical preparations of vitamin K-dependent proteins which are precisely defined or definable in terms of their composition, have high stability, especially during long-term storage, and also have high flexibility in composition change.

Táto úloha sa podľa vynálezu rieši farmaceutický separovaným preparátom protrombínového komplexu obsahujúceho ako účinné látky najmenej dva chromatograficky čistené jednotlivé faktory závislé od vitamínu K. Predovšetkým má preparát podľa vynálezu obsahovať vysoko čistý faktor IX v kombinácii s najmenej jedným ďalším vysoko čistým jednotlivým faktorom závislým od vitamínu K.This object is achieved according to the invention by a pharmaceutical separated preparation of prothrombin complex comprising as active substances at least two chromatographically purified individual vitamin K dependent factors. In particular, the preparation according to the invention is to contain highly pure factor IX in combination with at least one other highly pure individual vitamin K dependent factor. .

Na rozdiel od stavu techniky, podľa ktorého sa protrombínový komplex vyrába vždy ako čistý protrombínový komplex a nie kombináciou jednotlivých faktorov a okrem toho je v najlepšom prípade k dispozícii iba v intermediámej, teda iba v strednej čistote, je predloženým vynálezom daný k dispozícii preparát, ktorý obsahuje jednotlivé krvné faktory vo vysokočistej forme, očistený od rušivých nečistôt, najmä nečistôt strombínovou aktivitou. Obzvlášť sa podľa vynálezu jednotlivé kombinované faktory čistia chromatografickými čistiacimi procesmi, ako je chromatografia na iónomeničoch, hydrofóbna chromatografia, afinitná chromatografia a/alebo molekulová vylučovacia chromatografia z plazmy, prípadne rekombinantných buniek. Tým môže väčšina jednotlivých faktorov závislých od vitamínu K dosiahnuť vždy špecifické aktivity najmenej 50 % teoretickej čistoty, s výhodou najmenej 70 %, obzvlášť výhodne najmenej 90 %, až k teoretickej čistote jednotlivého faktoru. Podľa toho je tiež výhodné používať faktory, ktoré v podstate neobsahujú (< 5 %) produkty denaturácie.In contrast to the prior art, in which the prothrombin complex is always produced as a pure prothrombin complex and not by a combination of individual factors, and moreover, at best, it is only available in intermediate purity, i.e. only in moderate purity, it contains individual blood factors in a high purity form, cleansed of disturbing impurities, especially impurities by strombine activity. In particular, according to the invention, the individual combined factors are purified by chromatographic purification processes, such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography and / or molecular size exclusion chromatography from plasma or recombinant cells. Thus, most of the individual vitamin K-dependent factors can achieve specific activities of at least 50% of the theoretical purity, preferably of at least 70%, particularly preferably of at least 90%, up to the theoretical purity of the individual factor. Accordingly, it is also advantageous to use factors which are substantially free (<5%) of denaturation products.

31245/H31245 / H

Pri farmaceutickej výrobe prípravkov proteínu krvnej zrážanlivosti sa spravidla rozlišujú tri rôzne stupne čistoty: nízky, stredný a vysoký.In the pharmaceutical production of blood clotting protein preparations, three different degrees of purity are generally distinguished: low, medium and high.

Tabuľka 1Table 1

Polčas stability in vivo In vivo half-life Teoretická čistota Theoretical purity Faktor II Factor II 60 hodín 60 hours 0,1 E/mg 0.1 E / mg Faktor Vil Faktor Vil 2,0-2,5 hodiny 2.0-2.5 hours 2000 (1667-2500) 2000 (1667-2500) Faktor IX Factor IX 18-24 hodín 18-24 hours 250 (200 - 333) 250 (200 - 333) Faktor X Factor X 40 hodín 40 hours 118(100-143) 118 (100-143)

Najmä pri zisťovaní aktivity faktoru II sú na základe prítomnosti stôp faktoru Ha vždy znova získavané chybné výsledky, pretože už stopy faktoru Ha stanovenie koncentrácie faktoru II natoľko znepresnia, že sa môžu zistiť dokonca niekoľkonásobne vyššie hodnoty než platia pre teoretickú čistotu. V prípade faktora VII sú hodnoty oproti iným faktorom o niečo nižšie, pretože faktor Vil je veľmi labilný proteín, ktorý mimoriadne rýchlo konvertuje na faktor Vila. Preto sa už prípravky faktoru VII, ktoré obsahujú viac ako 10 % teoretickej čistoty, pokladajú za vysoko čisté.Particularly in the determination of factor II activity, erroneous results are always recovered due to the presence of Factor IIa traces, since the trace of Factor IIa already determines the concentration of Factor II so much that even several times higher values than the theoretical purity can be found. In the case of factor VII, the values are somewhat lower than other factors, since factor VIIa is a very labile protein that converts extremely quickly to factor VIIa. Therefore, factor VII preparations containing more than 10% of theoretical purity are already considered to be highly pure.

Pretože sa preparát podľa vynálezu obzvlášť z hľadiska jeho aktivity, prípadne stupňa čistoty skladá z veľmi presne definovaných jednotlivých faktorov, môže sa tiež vzájomný pomer jednotlivých faktorov optimálne nastaviť. Pritom sa môžu vopred eliminovať problémy, ktoré vyplývajú z priebehu ďalšieho spracovania koncentrátov komplexu všetkých proteínov podľa stavu techniky, napríklad stratou aktivity pri inaktivácii vírusov, ale tiež procesmi, ku ktorým dochádza počas čistiaceho procesu, pretože po spojení vysoko čistých jednotlivých faktorov do preparátu podľa vynálezu sa už s výhodou nemusia vykonávať žiadne ďalšie spracovateľské operácie.Since the preparation according to the invention, in particular in terms of its activity or degree of purity, consists of very precisely defined individual factors, the ratio of the individual factors can also be optimally adjusted. In this process, problems arising from the further processing of the complex concentrates of all the proteins of the prior art can be eliminated beforehand, for example by the loss of virus inactivation activity, but also by processes occurring during the purification process. advantageously, no further processing operations have to be carried out.

Preparát podľa vynálezu vykazuje teda výhody štandardizovateľnosti. Tým sa zaručí, že dané jednotlivé faktory sú v preparáte obsiahnuté v daných koncentráciách ±10% odchýlky.The preparation according to the invention thus has the advantages of standardizability. This ensures that the given individual factors are included in the preparation at the given concentrations ± 10% deviation.

31245/H31245 / H

Výhodné sa jednotlivé faktory podľa vynálezu vyberú zo skupiny pozostávajúcej z faktoru II, faktoru Vil, faktoru IX, faktoru X, proteínu C, proteínu S a proteínu Z. Výhodné výrobné metódy pre vysoko čisté preparáty týchto proteínov možno nájsť napríklad v EP 0 796 623 (faktory II a X), v A 594/97 (faktor Vil), v EP 0 496 725 (faktor IX), EP 0 533 209 (proteín C) a v EP 0 406 216 (proteín S).Preferably, the individual factors of the invention are selected from the group consisting of Factor II, Factor VII, Factor IX, Factor X, Protein C, Protein S and Protein Z. Suitable manufacturing methods for high purity preparations of these proteins can be found, for example, in EP 0 796 623 ( factors II and X), A 594/97 (Factor VII), EP 0 496 725 (Factor IX), EP 0 533 209 (Protein C) and EP 0 406 216 (Protein S).

V preparáte podľa vynálezu sa s výhodou spoja najmenej faktory II, Vil, IX a X, vychádzajúce z vysoko čistých jednotlivých faktorov, pričom sa prípadne ešte môžu primiešať vysoko čisté jednotlivé faktory proteín C, proteín S a/alebo proteín Z, aby bolo možné pripraviť pokiaľ možno fyziologický protrombínový komplex, to znamená protrombínový komplex, ktorý zložením zodpovedá fyziologickému - iba bez rušivých sprievodných proteínov, ktoré v priebehu čistenia protrombínového komplexu prenikajú z plazmy, ako napríklad trombín.Preferably, at least the factors II, VII, IX and X, based on the highly pure individual factors, are combined in the preparation according to the invention, whereby the highly pure individual factors protein C, protein S and / or protein Z may optionally be admixed. preferably a physiological prothrombin complex, that is, a prothrombin complex that is physiologically compositional-only free of interfering accompanying proteins that leak from plasma, such as thrombin, during purification of the prothrombin complex.

Jednotlivé faktory sa môžu čistiť z plazmy, najmä humánnej plazmy alebo sa môžu vyrábať rekombinantné. Pretože pri výrobe rekombinantnou DNA - technológiou nie je nutné oddelenie štrukturálne a fyzikálne chemicky veľmi podobných faktorov, zostaví sa preparát podľa vynálezu s výhodou z vysoko čistých rekombinantných jednotlivých faktorov. Faktor sa môže vyrobiť tiež transgénne; môže byť derivátom, najmä peptidom a/alebo fragmentom.Individual factors may be purified from plasma, particularly human plasma, or may be recombinantly produced. Since in the production by recombinant DNA technology it is not necessary to separate structurally and physically chemically very similar factors, the preparation according to the invention is preferably assembled from highly pure recombinant single factors. The factor can also be produced transgenically; it may be a derivative, in particular a peptide and / or a fragment.

Jednotlivé faktory závislé od vitamínu K faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, proteín S a proteín C sú klonované a sekvenované a ich tvorba sa napríklad popisuje vo Falkner a spol., Thrombosis and Haemostasis, 68, 2, 1992, str. 119 až 124 pre proteíny, ktoré sú závislé od vitamínu K.The individual vitamin K dependent factors Factor II, Factor VII, Factor IX, Factor X, Protein S and Protein C are cloned and sequenced, and their formation is described, for example, in Falkner et al., Thrombosis and Haemostasis, 68, 2, 1992, p. . 119 to 124 for vitamin K dependent proteins.

Podľa vynálezu je možné ľahko a v ľubovoľných vzájomných pomeroch upraviť relatívne pomery vysoko čistých jednotlivých faktorov, napríklad tak, aby tieto pomery zodpovedali prirodzeným pomerom v krvi, teda asi na jednotku jedného faktoru je prítomná jednotka iného faktoru. Výhodný preparát podľa predloženého vynálezu preto obsahuje vysoko čisté faktory II, faktor VII, faktor IX a faktor X v relatívnom pomere, vzťahujúc na medzinárodné jednotky (0,5 až 2): (0,5 až 2): (0,5 až 2): (0,5 až 2). Pokiaľ sú v preparáte prítomné proteín C,According to the invention, it is possible to adjust the relative ratios of the highly pure individual factors easily and in any relative ratio, for example to correspond to the natural blood ratios, that is to say a unit of another factor is present per unit of one factor. Therefore, a preferred preparation of the present invention comprises highly pure Factors II, Factor VII, Factor IX and Factor X in relative proportions based on International Units (0.5 to 2): (0.5 to 2): (0.5 to 2) ): (0.5 to 2). If protein C is present in the preparation,

31245/H proteín S a/alebo proteín Z, potom tiež tieto jednotlivé faktory vykazujú s výhodou relatívny pomer 0,5 až 2.31245 / H protein S and / or protein Z, then also these individual factors preferably have a relative ratio of 0.5 to 2.

Na druhej strane je podľa vynálezu tiež možné zostaviť jednotlivé faktory na základe ich relatívnej stability, najmä s ohľadom na ich relatívny polčas stability, to znamená, že sa menej stabilného faktoru pridá viac a stabilného faktoru primerane menej. Pritom sa môže zároveň zohľadniť predpokladaná doba použitia, prípadne účinku, to znamená, o čo je dlhšia táto doba, o to významnejšie je i uplatnenie týchto relatívnych pomerov.On the other hand, it is also possible according to the invention to assemble individual factors on the basis of their relative stability, in particular with regard to their relative half-life, i.e. a less stable factor is added more and a stable factor is appropriately less. At the same time, it is possible to take into account the anticipated period of use or effect, i.e. the longer this period, the more significant the application of these relative ratios.

Tiež rekombinantné proteíny s napríklad zmeneným polčasom stability sa môžu primerane štandardizovať. Do štandardizácie faktorov môžu vstúpiť i ďalšie hľadiská, ako je napríklad opätovné obnovenie in-vivo (recovery).Also, recombinant proteins with, for example, an altered half-life can be appropriately standardized. Other aspects, such as in-vivo recovery, may also come into standardization of factors.

Z tohto hľadiska výhodný preparát preto zahrňuje jednotlivé faktory, faktor II, faktor VII, faktor IX a faktor X v relatívnom pomere, vzťahujúc na medzinárodné jednotky (0,5 až 2) : (0,5 až 35) : (0,5 až 7) : (0,5 až 5), lebo polčas stability protrombínu je 60 hodín, faktoru VII 2 hodiny, faktoru IX 20 hodín a faktoru X 40 hodín. Výhodný preparát s týmito faktormi preto obsahuje jednotlivé faktory, faktor II, faktor VII, faktor IX, faktor X, proteín C a proteín S v relatívnom pomere, vzťahujúc na medzinárodné jednotky (0,5 až 2): (0,5 až 35): (0,5 až 7): (0,5 až 5): (1 až 15): (1 až 15).In this respect, the preferred formulation therefore comprises the individual factors, Factor II, Factor VII, Factor IX and Factor X in relative proportions, relative to the International Units (0.5 to 2): (0.5 to 35): (0.5 to 35) 7): (0.5 to 5) because the half-life of prothrombin is 60 hours, factor VII 2 hours, factor IX 20 hours and factor X 40 hours. A preferred preparation with these factors therefore comprises the individual factors, Factor II, Factor VII, Factor IX, Factor X, Protein C and Protein S in relative proportions, relative to the International Units (0.5 to 2): (0.5 to 35) : (0.5 to 7): (0.5 to 5): (1 to 15): (1 to 15).

Pretože faktor II je s odstupom najstabilnejší z týchto faktorov, a preto i v jeho aktivovanej forme trombínu nesie najväčšie riziko stability, je výhodný preparát, ktorý neobsahuje žiaden protrombín. Faktor VII sa väčšinou pokladá za veľmi nestabilný, a preto sa v preparáte podľa vynálezu s výhodou predpokladá vo zvýšenom pomere, napríklad v 10-násobnej koncentrácii (vzťahujúc na medzinárodné jednotky). Obzvlášť výhodný preparát preto obsahuje jednotlivý faktor VII a jednotlivý faktor II v pomere väčšom ako 10:1.Since factor II is at a distance the most stable of these factors, and therefore, even in its activated form, thrombin carries the greatest risk of stability, a formulation containing no prothrombin is preferred. Factor VII is generally considered to be very unstable, and is therefore preferably envisaged in the formulation of the invention in an increased ratio, for example at a 10-fold concentration (referring to international units). A particularly preferred formulation therefore comprises a single factor VII and a single factor II in a ratio greater than 10: 1.

S výhodou je navrhnutým preparátom k dispozícii protrombínový komplex alebo čiastočný protrombínový komplex z vysoko čistých jednotlivých faktorov. V každom prípade je výhodné, že jednotlivé faktory netvoria v preparáte žiadne komplexy. To je možné preukázať napríklad analytickouPreferably, a prothrombin complex or a partial prothrombin complex of highly pure individual factors is provided by the proposed preparation. In any case, it is preferred that the individual factors do not form any complexes in the formulation. This can be demonstrated, for example, by analytical methods

31245/H iónomeničovou chromatografiou na Q-Sepharose (Pharmacia), pri ktorej sa môžu jednotlivé faktory pri eluácii voľným gradientom diskrétne eluovať. Opakom sú komplexy, ktoré sú u protrombinázy alebo pro-protrombinázy.31245 / H ion exchange chromatography on Q-Sepharose (Pharmacia), in which individual factors can be discretely eluted by free gradient elution. The opposite is the complexes that are present in prothrombinase or pro-prothrombinase.

Protrombináza je komplex enzýmových substrátov, ktorý sa tvorí na povrchu fosfolipidov a umožňuje aktiváciu protrombinu. Protrombináza podľa definície pozostáva z faktoru II (protrombín), aktivovaného faktoru X (faktor Xa), kofaktoru V, prípadne Va, fosfolipidov a kalciových iónov. Tieto faktory sú k dispozícii in vivo ako transientný komplex na aktiváciu protrombinu a tvorbu trombínu. Zodpovedajúca pro- trombináza je definovaná ako komplex faktorov, ktoré sú k dispozícii na tvorbu protrombinázy a sú najmenej čiastočne modifikované, prípadne aktivované. Pro-protrombinázu je preto nutné chápať ako predstupeň protrombinázy a ako komplex, v ktorom je jeden alebo niekoľko komponentov prítomných ako predstupeň, ako zymogén alebo ako proforma a ktorý sa tvorí na základe vzájomnej afinity komponentov.Prothrombinase is a complex of enzyme substrates that forms on the surface of phospholipids and allows activation of prothrombin. By definition, prothrombinase consists of factor II (prothrombin), activated factor X (factor Xa), cofactor V or Va, respectively, phospholipids and calcium ions. These factors are available in vivo as a transient complex for prothrombin activation and thrombin formation. The corresponding prothrombinase is defined as a complex of factors available for the production of prothrombinase and at least partially modified or activated. Pro-prothrombinase is therefore to be understood as a precursor of prothrombinase and as a complex in which one or more of the components are present as a precursor, as a zymogen or as a pro-form and which are formed based on the mutual affinity of the components.

V preparáte podľa vynálezu je z dôvodov stability výhodné zabrániť každej prítomnosti aktivovaných faktorov krvnej zrážanlivosti. Výhodná forma vyhotovenia sa preto vyznačuje tým, že preparát neobsahuje žiadne aktivované krvné faktory, najmä žiaden faktor Ha, IXa, Xa a prípadne Vila.In the preparation of the invention, for reasons of stability, it is advantageous to avoid any presence of activated blood clotting factors. A preferred embodiment is therefore characterized in that the preparation contains no activated blood factors, in particular no factor Ha, IXa, Xa and optionally VIIa.

Výhodné preparáty podľa vynálezu obsahujú menej ako 0,1 E faktoru Vili : C alebo faktoru Vili : Ag/mg proteínu a/alebo menej ako 0,1 E faktoru lla/jednotka protrombinu a/alebo menej ako 0,1 E faktoru Xa/jednotka faktoru X.Preferred preparations of the invention comprise less than 0.1 E Factor VIII: C or Factor VIII: Ag / mg protein and / or less than 0.1 E Factor IIa / prothrombin unit and / or less than 0.1 E Factor Xa / unit Factor X.

Aby bolo možné čo najdlhšie zachovať vynikajúcu stabilitu preparátu podľa vynálezu, je výhodné pripraviť preparát podľa vynálezu v lyofilizovanej forme. Tým sa umožní, aby bolo možné preparát podľa vynálezu takmer neobmedzene dlho skladovať a napriek tomu ako lyofilizát v priebehu krátkej doby rekonštruovať na roztok pripravený na použitie.In order to maintain the excellent stability of the preparation according to the invention as long as possible, it is preferred to prepare the preparation according to the invention in lyophilized form. This allows the preparation according to the invention to be stored for almost indefinitely and yet to be reconstituted into a ready-to-use solution within a short time.

Podľa ďalšej výhodnej formy vyhotovenia obsahuje ďalej preparát podľa vynálezu horčíkové ióny. Tieto ióny pôsobia kompetitívne s vápnikovými iónmi a môžu vápnikové ióny predovšetkým v úplných alebo čiastočnýchAccording to a further preferred embodiment, the preparation according to the invention further comprises magnesium ions. These ions act competitively with calcium ions and can in particular be in total or partial calcium ions.

31245/H protrombínových komplexoch vytlačiť. Tým sa podchytí predčasná tvorba trombínu v roztoku preparátu podľa vynálezu v ešte väčšej miere a preparát je natoľko stabilizovaný, že vo vodnom roztoku zostáva dokonca niekoľko hodín stabilný.31245 / H prothrombin complexes printed. This prevents the premature formation of thrombin in the solution of the preparation according to the invention to an even greater extent and the preparation is so stabilized that it remains stable in the aqueous solution for several hours.

Ukázalo sa, že farmaceutický preparát podľa predloženého vynálezu môže byť pripravený na použitie dokonca ako stabilný infúzny roztok, predovšetkým ak sa zaručí, že neobsahuje žiadne voľné vápnikové ióny. Obsah voľných vápnikových iónov je možné ľahko stanoviť známymi koncentráciami iónov alebo inými analytickými metódami. Na tvorbu komplexov vápnikových iónov sú napríklad vhodné farmaceutický akceptovateľné chelatotvorné zlúčeniny, napríklad EDTA a príbuzné zlúčeniny ako citráty.It has been shown that the pharmaceutical preparation of the present invention can be ready for use even as a stable infusion solution, especially if it is guaranteed that it does not contain any free calcium ions. The free calcium ion content can be readily determined by known ionic concentrations or other analytical methods. For example, pharmaceutically acceptable chelating compounds such as EDTA and related compounds such as citrates are suitable for forming calcium ion complexes.

S výhodou obsahuje ďalej preparát podľa vynálezu antitrombín Iii v množstve, v ktorom bol doteraz v koncentrátoch protrombínového komplexu používaný ako stabilizačný prostriedok, prípadne spoločne s heparínom. Hoci sa toto opatrenie na základe vysokého stupňa čistoty jednotlivých faktorov nezdá byť bezpodmienečne nutné, môže to byť z farmaceutických dôvodov alebo na základe požiadaviek liekopisu alebo iných požiadaviek týkajúcich sa koncentrátov protrombínových komplexov podľa stavu techniky výhodné.Advantageously, the preparation according to the invention further comprises antithrombin III in an amount in which up to now it has been used as a stabilizing agent in the prothrombin complex concentrates, optionally together with heparin. Although this measure does not necessarily seem necessary due to the high degree of purity of the individual factors, this may be advantageous for pharmaceutical reasons or due to pharmacopoeial requirements or other requirements related to prior art prothrombin complex concentrates.

V ďalšej výhodnej forme vyhotovenia preto preparát neobsahuje albumín a/alebo stabilizátory, ako obzvlášť antitrombín III a/alebo heparín. Obzvlášť neobsahuje preparát podľa vynálezu fosfolipidy.Therefore, in a further preferred embodiment, the preparation does not comprise albumin and / or stabilizers, in particular antithrombin III and / or heparin. In particular, the preparation according to the invention does not contain phospholipids.

Farmaceutický preparát podľa vynálezu sa podľa výhodnej formy vyhotovenia vynálezu ošetruje na inaktiváciu vírusov alebo iných infekčných agencií. Toto ošetrenie na inaktiváciu vírusov sa s výhodou zaručuje dvoma navzájom nezávislými procesmi na inaktiváciu alebo zneškodnenie vírusov.According to a preferred embodiment of the invention, the pharmaceutical preparation according to the invention is treated for the inactivation of viruses or other infectious agents. This virus inactivation treatment is preferably guaranteed by two independent processes for virus inactivation or destruction.

Táto inaktivácia sa s výhodou vykonáva tenzidmi a/alebo tepelným ošetrením, napríklad tepelným spracovaním v pevnom stave, obzvlášť ošetrením parou podľa EP 0 159 311, EP 0 519 901 alebo EP 0 674 531.This inactivation is preferably carried out with surfactants and / or a heat treatment, for example a solid-state heat treatment, in particular a steam treatment according to EP 0 159 311, EP 0 519 901 or EP 0 674 531.

Ďalšie spracovanie na inaktiváciu vírusov zahrňuje tiež ošetrenie chemickými alebo chemicko/fyzikálnymi metódami, napríklad pomocouFurther processing for virus inactivation also includes treatment with chemical or chemical / physical methods, e.g.

31245/H chaotropných látok podľa WO 94/13329, DE 44 34 538 alebo EP 0 131 740 (rozpúšťadlo) alebo fotoinaktiváciou.31245 / H of chaotropic substances according to WO 94/13329, DE 44 34 538 or EP 0 131 740 (solvent) or photoinactivation.

Nanofiltrácia alebo nanofiltrácia intenzifikovaná na protilátky pozri PCT/AT 97/00075) predstavuje rovnako výhodný spôsob na zneškodnenie vírusov v rámci predloženého vynálezu.Nanofiltration or antibody-intensified nanofiltration (see PCT / AT 97/00075) is an equally advantageous method for the destruction of viruses within the scope of the present invention.

S výhodou obsahuje ďalej preparát podľa vynálezu farmaceutický akceptovateľné pufrujúce látky alebo stabilizátory, napríklad substancie už uvedené v liekopise pre koncentráty protrombínových komplexov.Preferably, the formulation according to the invention further comprises pharmaceutically acceptable buffering agents or stabilizers, for example substances already mentioned in the pharmacopoeia for prothrombin complex concentrates.

Obzvlášť výhodný spôsob zaručenia neprítomnosti vírusov v produktoch podľa vynálezu spočíva vtom, že sa zostaví z jednotlivých vysoko čistých faktorov závislých od vitamínu K, ktoré sú už vopred inaktivované a zbavené prípadne vzniknutých produktov denaturácie a stabilizátorov, takže môžu byť k dispozícii ako vírusovo inaktívne a napriek tomu vo veľmi presne definovanej forme z hľadiska ich aktivity.A particularly advantageous way of guaranteeing the absence of viruses in the products according to the invention is to consist of individual highly pure vitamin K-dependent factors which are already inactivated and free of any denaturation and stabilizer products formed, so that they can be available as virally inactive and despite in a very precisely defined form in terms of their activity.

Pretože predovšetkým pri termických procesoch inaktivácie vírusov môže čiastočne dochádzať k inaktivačnému procesu protrombínových faktorov, ktoré po vykonaní tepelného spracovania preparátov protrombínového komplexu môžu podľa stability jednotlivých faktorov viesť k rozdielnym výťažkom a špecifickým aktivitám, umožňuje forma uskutočnenia spôsobu podľa vynálezu upraviť pomery jednotlivých faktorov v zmesi tak, aby i po vykonanom tepelnom spracovaní boli faktory prítomné vo vzájomnom požadovanom pomere. Pokiaľ je napríklad známe, že tepelné spracovanie protrombínu nie je spojené so žiadnymi stratami aktivity, zatiaľ čo faktor X a faktor IX, obsiahnuté tiež v kombinovanom preparáte, sú vždy inaktivované z 20 %, môže sa zostaviť zmesný, tepelne voči vírusom inaktivovaný „komplex,, tak, že sa faktory I, IX a X kombinujú v pomere aktivít 1 : 1,25 : 1,25. Po takomto nastavení pomerov sa môže vykonať inaktivácia vírusov a bezprostredným výsledkom je preparát obsahujúci tieto faktory v pomere 1:1:1.Because, in particular, in thermal processes of virus inactivation, the inactivation process of prothrombin factors can occur in part, which after heat treatment of prothrombin complex preparations can lead to different yields and specific activities depending on the stability of the individual factors. so that, even after the heat treatment has been carried out, the factors are present in the desired ratio with each other. For example, if it is known that heat treatment of prothrombin is not associated with any loss of activity, while factor X and factor IX, also contained in the combination preparation, are always inactivated by 20%, a mixed, heat-inactivated "complex" , such that factors I, IX and X are combined in an activity ratio of 1: 1.25: 1.25. After such a ratio adjustment, virus inactivation can be performed and the immediate result is a preparation containing these factors in a ratio of 1: 1: 1.

Faktor X sa s výhodou použije v jeho alfa-forme a/alebo beta-forme.Factor X is preferably used in its alpha form and / or beta form.

31245/H31245 / H

Predmetom predloženého vynálezu je tiež diagnostický preparát, ktorý sa podľa vynálezu skladá z vysoko čistých jednotlivých faktorov závislých od vitamínu K. Tiež pre diagnostické účely sú obzvlášť výhodné prednosti ako definovateľnosť, variabilita koncentračných pomerov a stabilita.It is also an object of the present invention to provide a diagnostic composition which according to the invention consists of highly pure individual vitamin K-dependent factors. Also advantageous for diagnostic purposes are advantages such as definability, variability of concentration ratios and stability.

Farmaceutický preparát podľa vynálezu sa môže samozrejme používať pre všetky doterajšie indikácie protrombínového komplexu.Of course, the pharmaceutical composition of the invention may be used for all prior indications of the prothrombin complex.

Predmetom predloženého vynálezu je preto tiež použitie preparátu podľa vynálezu na výrobu prípravku na ošetrenie zdedenej alebo získanej poruchy krvnej zrážanlivosti, na ošetrenie ťažkých krvácaní, na profylaxiu krvácania, obzvlášť pri výskyte dedičných porúch krvnej zrážanlivosti, na substitučnú terapiu a na ošetrenie hemofílie B.Accordingly, the present invention also provides the use of a formulation of the invention for the manufacture of a composition for the treatment of inherited or acquired blood clotting disorder, for the treatment of severe bleeding, for prophylaxis of bleeding, particularly in the occurrence of hereditary blood clotting disorders, substitution therapy and haemophilia B.

Tiež pri poruchách funkcie pečene sa osvedčuje ako indikovaný preparát podľa vynálezu.It is also proven to be an indicated preparation according to the invention in liver function disorders.

Pri podávaní pacientom sa pri dávkovaní vychádza z doterajšieho režimu dávkovania, pričom je však presná definovateľnosť preparátu podľa vynálezu výhodou.For administration to patients, the dosage is based on the current dosage regimen, but the precise definability of the preparation of the invention is an advantage.

Predložený vynález bude bližšie vysvetlený nasledujúcimi príkladmi bez toho, aby sa na ne obmedzoval.The present invention will be further illustrated by the following examples without being limited thereto.

Príklady uskutočnenia vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Príklad 1Example 1

Výroba preparátov jednotlivých faktorovProduction of preparations of individual factors

1.1. Výroba jednotlivých preparátov plazmatického faktoru X a plazmatického faktoru II1.1. Production of individual preparations of plasma factor X and plasma factor II

Lyofilizovaný prípravok faktorov protrombínového komplexu, ktorý obsahuje faktory II, IX, X a rovnako proteín C a proteín S, sa vyrobí metódou podľa Brummelhuis, H.G.J., Preparation of the prothrombinkomplex v Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, J. M. ed., 117 - 128, Academic Press, New York (1980) a na inaktiváciu vírusov sa tepelne ošetrí podľa EP 159 311.A lyophilized prothrombin complex factor preparation containing Factors II, IX, X as well as protein C and protein S is prepared by the method of Brummelhuis, HGJ, Preparation of the prothrombin complex in Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, JM ed., 117-128. , Academic Press, New York (1980) and for virus inactivation are heat treated according to EP 159 311.

31245/H31245 / H

Lyofilizát (1000 E faktoru X/G, 1200 E faktoru ll/g) sa primeraným spôsobom rozpustí v destilovanej vode, takže roztok obsahuje 50 000 E faktoru X/1 a pH sa upraví na 7,0. Po prídavku 12 % (v/v) TWEEN® 80 sa mieša pri teplote miestnosti počas 1 hodiny. Následne sa zriedi 20 mM pufra Tris - HCI, pH 7,0 , 1:5a proteínová frakcia protrombínového komplexu sa adsorbuje na fosforečnan vápenatý (Ca3(PO₄)₂) s koncentráciou 30 g (Ca3(PO₄)₂) na 1 I roztoku protrombínového komplexu jednohodinovým miešaním pri teplote miestnosti. Následne sa pevná fáza oddelí centrifugáciou počas 20 minút pri 5 000 ot./min. a zrazenina sa dvakrát premyje 20 mM pufra Tris - HCI, pH 7,0, obsahujúceho 10 % síranu amónneho, resuspenduje sa a centrifuguje. Tretie premytie sa vykoná analogicky 20 mM pufra Tris - HCI, pH 7,0, obsahujúceho 150 mM NaCl. Eluácia frakcie protrombínového komplexu sa vykonáva 1 M roztokom fosforečnanu sodného, pH 7,0, pričom sa 25 ml tohto roztoku na g fosforečnanu vápenatého mieša 1 hodinu pri teplote miestnosti a následne sa zvyšná zrazenina oddelí centrifugáciou, ako je uvedené vyššie. Zvyšok sa následne zráža síranom amónnym s 366 g síranu amónneho na I počas 15 hodín pri teplote 4 °C za miešania. Zrazenina obsahujúca frakciu protrombínového komplexu sa oddelí centrifugáciou, ako sa popisuje vyššie. Zrazenina sa pridá do 25 mM trinátriumcitrátdihydrátového pufra, obsahujúceho 100 mM NaCl, 1 mM benzamidínhydrochloridu, pH 6,0 a prepufruje sa na stĺpci, plnenom Sephadex® G-25, pri teplote 4 °C pri prietoku 1 cm/min. proti 25 mM trinátriumcitrátdihydrátového pufra, obsahujúceho 100 mM NaCl, 1 mM benzamidínhydrochloridu, pH 6,0, aby sa odstránil síran amónny. Pritom sa v prúde eluátu meria UV-absorpcia pri 280 nm a elektrická vodivosť.The lyophilisate (1000 E factor X / G, 1200 E factor II / g) is appropriately dissolved in distilled water so that the solution contains 50,000 E factor X / 1 and the pH is adjusted to 7.0. After addition of 12% (v / v) TWEEN® 80, it is stirred at room temperature for 1 hour. Subsequently, it is diluted with 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0, 1: 5, and the protein fraction of the prothrombin complex is adsorbed onto calcium phosphate (Ca 3 (PO ₄ ) ₂ ) at a concentration of 30 g (Ca 3 (PO ₄ ) ₂ ) per 1 L. of prothrombin complex solution by stirring at room temperature for 1 hour. Subsequently, the solid phase is separated by centrifugation for 20 minutes at 5,000 rpm. and the precipitate is washed twice with 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0, containing 10% ammonium sulfate, resuspended and centrifuged. A third wash is performed analogously to 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0, containing 150 mM NaCl. The elution of the prothrombin complex fraction is carried out with 1 M sodium phosphate solution, pH 7.0, 25 ml of this solution per g of calcium phosphate is stirred for 1 hour at room temperature, and the remaining precipitate is separated by centrifugation as above. The residue was then precipitated with ammonium sulfate with 366 g of ammonium sulfate per I for 15 hours at 4 ° C with stirring. The precipitate containing the prothrombin complex fraction is collected by centrifugation as described above. The precipitate is added to 25 mM trisodium citrate dihydrate buffer containing 100 mM NaCl, 1 mM benzamidine hydrochloride, pH 6.0 and buffered on a column packed with Sephadex® G-25 at 4 ° C at a flow rate of 1 cm / min. against 25 mM trisodium citrate dihydrate buffer containing 100 mM NaCl, 1 mM benzamidine hydrochloride, pH 6.0 to remove ammonium sulfate. The UV absorption at 280 nm and the electrical conductivity are measured in the eluate stream.

Frakcie obsahujúce proteíny sa spoja a následne sa podrobia iónomeničovej chromatografii cez DEAE - Sepharose FF®, firma Pharmacia. Frakcie sa nanesú na stĺpec (vnútorný priemer: výška gólového lôžka = 1 : 1,3) s objemom gélu 8,2 I 0,55 g proteínu/l gélu, pri lineárnom prietoku 0,36 cm/min. Chromatografia sa vykonáva sa pri teplote 22 °C. Pred nanesením proteínu sa stĺpec ekvilibruje 25 mM trinátriumcitrátdihydrátového pufra, obsahujúceho 100 mM NaCl, 1 mM benzamidínhydrochloridu, pH 6,0. Eluácia proteínových frakcií sa vykonáva v niekoľkých stupňoch pufrom 1 (25 mM trinátriumcitrátdihydrát, 1The protein-containing fractions were pooled and then subjected to ion exchange chromatography through DEAE-Sepharose FF®, Pharmacia. The fractions are applied to a column (internal diameter: goal bed height = 1: 1.3) with a 8.2 L gel volume of 0.55 g protein / L gel, at a linear flow rate of 0.36 cm / min. Chromatography is performed at 22 ° C. Prior to protein loading, the column was equilibrated with 25 mM trisodium citrate dihydrate buffer containing 100 mM NaCl, 1 mM benzamidine hydrochloride, pH 6.0. Elution of protein fractions is performed in several steps with Buffer 1 (25 mM trisodium citrate dihydrate, 1

31245/H mM benzamidínhydrochloridu, 245 mM NaCl, pH 6,0), pufrom 2 (25 mM trinátriumcitrátdihydrát, 1 mM benzamidínhydrochloridu, 270 mM NaCl, pH 6,0) a pufrom 3 (25 mM trinátriumcitrátdihydrát, 1 mM benzamidínhydrochloridu, 400 mM NaCl, pH 6,0). Eluácia pufrom 1 sa vykoná 2,4-násobným objemom stĺpca, pritom sa oddelia inertné proteíny. Eluácia pufrom 2 sa vykonáva 5,6násobkom objemu stĺpca, pričom sa tu zhromažďujú frakcie, ktoré sa analyzujú na obsah faktoru II, faktoru X, proteínu C a faktoru IX. Frakcie obsahujúce faktor X, ktoré neobsahujú faktor II, IX a proteín C, sa spoja. Tento preparát vysoko čistého faktoru X vykazuje špecifickú aktivitu 60 E/mg proteínu.31245 / H mM benzamidine hydrochloride, 245 mM NaCl, pH 6.0), buffer 2 (25 mM trisodium citrate dihydrate, 1 mM benzamidine hydrochloride, 270 mM NaCl, pH 6.0) and buffer 3 (25 mM trisodium citrate dihydrate, 1 mM benzamidine hydrochloride, 400 mM NaCl, pH 6.0). Elution with buffer 1 is carried out with a 2.4-fold column volume while the inert proteins are separated. Elution with buffer 2 is performed at 5.6 times the column volume, collecting fractions which are analyzed for the content of factor II, factor X, protein C and factor IX. The fractions containing factor X, which do not contain factor II, IX and protein C, are pooled. This highly pure Factor X preparation exhibits a specific activity of 60 E / mg protein.

Eluáciou pufrom 3 (1,9 objemu stĺpca) sa desorbuje faktor II, pričom sa opäť zhromaždia frakcie a skúmajú sa na obsah faktoru X, faktoru IX a faktoru II. Frakcie obsahujúce faktor II sa poolujú. Ako faktor II, tak i pool obsahujúci faktor X sa môžu prípadne podrobiť prídavkom 1 M KSCN a inkubáciou pri teplote 22 °C počas niekoľkých hodín dodatočnému ošetreniu na inaktiváciu patogénnych nečistôt.Elution with Buffer 3 (1.9 column volume) desorbs Factor II, collecting fractions again and examining the contents of Factor X, Factor IX and Factor II. Fractions containing factor II were pooled. Optionally, both Factor II and the Factor X-containing pool may be subjected to the addition of 1 M KSCN and incubation at 22 ° C for several hours for additional treatment to inactivate pathogenic impurities.

Takto získaný pool faktor II sa prídavkom chloridu sodného nastaví na 1,9 M NaCl a hodnota pH sa upraví na 7,0. Tento roztok sa následne adsorbuje hydrofóbnou interakciou na gél Phenylsepharose High Performance® firmy Pharmacia, pričom sa vážia 3 g proteín/l gélu. Na stĺpci s pomerom vnútorný priemer/výška gélového lôžka = 1 : 1,9 sa pri lineárnom prietoku 0,25 cm/min. adsorbuje proteínová frakcia a následne sa premytím pufrom (25 mM Tris HCl, 3 M NaCl, pH 7,4) zbaví inertného proteínu. Gradientovou eluáciou s 11,5 objemami stĺpca 3 M - 0,9 M NaCl za rovnomerného odoberania frakcií sa zo stĺpca eluuje faktor II, pričom sa pooluje každá frakcia obsahujúca aktivitu faktoru II, ale neobsahujúca faktor X a faktor IX. Zlúčené frakcie faktoru II sa následne desaťnásobne skoncentrujú ultra-/diafiltráciou cez uitrafiltračnú membránu s cut-off 30 kD a prepufrujú proti pufru obsahujúcemu 4 g trinátriumcitrátdihydrátu/1,8 g NaCl/Ι, pH 7,0. Takto vyrobený preparát faktoru II vykazuje špecifickú aktivitu 6,9 E/mg proteínu.The Factor II pool thus obtained is adjusted to 1.9 M NaCl by addition of sodium chloride and the pH is adjusted to 7.0. This solution is then adsorbed by a hydrophobic interaction onto a Phenylsepharose High Performance® gel from Pharmacia, weighing 3 g of protein / 1 gel. On a column with an inner diameter / gel bed height ratio of 1: 1.9 at a linear flow rate of 0.25 cm / min. the protein fraction is adsorbed and subsequently washed free of the inert protein by washing with buffer (25 mM Tris HCl, 3 M NaCl, pH 7.4). Gradient elution with 11.5 column volumes of 3 M - 0.9 M NaCl with even fraction collection elutes factor II from the column, pooling each fraction containing factor II activity but not containing factor X and factor IX. The combined Factor II fractions are then concentrated 10-fold by ultra / diafiltration through a 30 kD cut-off membrane and buffered against a buffer containing 4 g trisodium citrate dihydrate / 1.8 g NaCl / Ι, pH 7.0. The factor II preparation thus produced exhibits a specific activity of 6.9 E / mg protein.

Stanovenie aktivity faktoru II sa vykonáva jednostupňovou metódou, založenou na dobe tromboplastínu, za použitia plazmy bez faktoru II protiDetermination of factor II activity is performed by a one-step method based on the time of thromboplastin using plasma without factor II against

31245/H medzinárodnému štandardu faktoru II za použitia kombinácie reagencií IMMUNO, Viedeň. Ostatné faktory krvnej zrážanlivosti boli pri analýze zrážanlivosti iba v stopách alebo neboli vôbec preukázateľné (faktor VII < 0,00002 E/E faktoru II, faktor IX < 0,0002 E/E faktoru II, faktor X < 0,004 E/E faktoru II, proteín C 0,003 E/E faktoru II a faktor VIII < 0,0002 E/E faktoru II.31245 / H International Factor II Standard using IMMUNO reagent combination, Vienna. The other blood clotting factors were only trace in the clotting analysis or were not detectable at all (factor VII <0.00002 E / E factor II, factor IX <0.0002 E / E factor II, factor X <0.004 E / E factor II, protein C 0.003 E / E factor II and factor VIII <0.0002 E / E factor II.

Ako alternatívny spôsob výroby vysoko čistého faktoru II sa používa tiež spôsob, pri ktorom sa z lyofilizovaného preparátu faktorov protrombínového komplexu najprv hydrofóbnou chromatografiou oddelí faktor IX, následne sa izoluje faktor II a ten sa chromatografiou na hydroxylapatite čistí do vysokého stupňa čistoty.As an alternative process for the production of high purity factor II, a process is also employed in which factor IX is first separated from the lyophilized prothrombin complex factor preparation by hydrophobic chromatography, then factor II is isolated and purified to a high degree of purity by hydroxylapatite chromatography.

Prípravok faktorov protrombínového komplexu sa rozpustí rovnako ako sa popisuje vyššie a s detergentom sa inkubuje počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Následne sa iónomeničovou chromatografiou na DEAE Sepharosa FF®, firma Pharmacia, izolujú frakcie obsahujúce faktor II, IX a X. Z nich sa následne interakciou s Butyl-Toyopearl®, firma Toso Haas, odstránia frakcie obsahujúce faktor IX. Adsorpčný zvyšok sa následne čistí na Phenylsepharose High Peformance® firmy Pharmacia ďalšou hydrofóbnou interakčnou chromatografiou, pričom sa môžu adsorbovať asi 4 g proteínu/l gélu. Na stĺpci s pomerom vnútorný priemer /výška gólového lôžka = 1 : 1,9 sa pri lineárnom prietoku 0,25 cm/min. adsorbuje proteínová frakcia, následne sa premytím pufrom 20 mM Tris - HCl, 3 M NaCI, pH 7,4) odstráni inertný proteín a konečne sa stupňovitou eluáciou izoluje frakcia obsahujúca faktor II, ktorá sa pri klesajúcej vodivosti desorbuje z gélu pri 1,9 M NaCI. Frakcia obsahujúca faktor II sa následne priamo adsorbuje na Ceramik - Hydroxylapatit®, firma Biorad. To sa vykoná na stĺpci s pomerom vnútorný priemer/výška gólového lôžka = 1 : 4,8. Eluácia sa vykonáva pri lineárnom prietoku 3 cm/min. Eluáciou so soľným gradientom sa zo stĺpca môže desorbovať faktor II. Frakcie obsahujúce faktor II sa zhromažďujú a pomocou ultra-/diafiltrácie cez polysulfónovú membránu s cut-off 30 kD sa skoncentrujú až do koncentrácie faktoru II 50-100 E/ml. Takto vyrobený prípravok faktoru II vykazuje špecifickú aktivitu najmenej 7 E/mg proteínu. Ostatné faktory krvnej zrážanlivosti, najmäThe prothrombin complex factor preparation is dissolved as described above and incubated with the detergent for 1 hour at room temperature. Fractions containing factor II, IX and X are then isolated by ion exchange chromatography on DEAE Sepharosa FF®, Pharmacia, and the factor IX-containing fractions are then removed by interaction with Butyl-Toyopearl®, Toso Haas. The adsorption residue is subsequently purified on Phenylsepharose High Peformance® from Pharmacia by further hydrophobic interaction chromatography, whereby about 4 g of protein / 1 gel can be adsorbed. On the column with the ratio of the inner diameter / height of the goal bed = 1: 1.9 at a linear flow rate of 0.25 cm / min. the protein fraction is adsorbed, then the inert protein is removed by washing with 20 mM Tris-HCl, 3 M NaCl, pH 7.4) and finally the step II-containing fraction is isolated by stepwise elution and is desorbed from the gel at 1.9 M as conductivity decreases NaCl. The fraction containing factor II is then directly adsorbed onto Ceramik-Hydroxylapatit®, Biorad. This is done on a column with a ratio of the inner diameter / height of the goal bed = 1: 4.8. Elution is performed at a linear flow rate of 3 cm / min. By elution with a salt gradient, factor II can be desorbed from the column. The fractions containing factor II are collected and concentrated to a factor II concentration of 50-100 E / ml by ultra- / diafiltration through a polysulfone membrane with a cut-off of 30 kD. The factor II preparation thus produced exhibits a specific activity of at least 7 E / mg protein. Other factors of blood coagulation, in particular

31245/H faktor IX a faktor VIII, sú prítomné len v stopách alebo nie sú vôbec preukázateľné. Voľbou vhodného diafiltračného pufra sa prípravok faktoru II prevedie do farmaceutický znášanlivého pufra (napríklad 4 g trinátriumcitrátdihydrát/l, 8 g NaCl, pH 7,0).31245 / H Factor IX and Factor VIII are present only in traces or are not detectable at all. By selecting a suitable diafiltration buffer, the Factor II preparation is converted into a pharmaceutically acceptable buffer (e.g., 4 g trisodium citrate dihydrate / 1.8 g NaCl, pH 7.0).

1.2. Získanie plazmatického faktoru VII ml čerstvo zamrazenej ľudskej citrátovej plazmy sa nechá roztopiť pri teplote 0 + 4 ’C a pritom vzniknutý kryoprecipitát sa oddelí centrífugáciou pri +2 °C. Vzniknutý „kryozvyšok„ sa zmieša s 2 IE heparínu/ml. Potom sa proteíny protrombínového komplexu adsorbujú pomocou DEAE Sephadex® A firmy Pharmacia v koncentrácii 0,5 mg/ml. Gél proteínového komplexu sa oddelí od roztoku a premyje vždy pufrom 1 (4 g/l trinátriumcitrátdihydrát, 0,7 g/l NaCl, 9 g/l Na2HPO₄ . 2 H₂O, 500 IE heparínu, pH 7,5) a následne pufrom 2 (4 g/l trinátriumcitrátdihydrát/l, 7 g/l NaCl, 500 IE heparínu/l, pH 7,5).1.2. Obtaining plasma factor VII ml of freshly frozen human citrate plasma is allowed to thaw at 0 + 4 ° C and the cryoprecipitate formed is separated by centrifugation at +2 ° C. The resulting "cryo residue" is mixed with 2 IU heparin / ml. The proteins of the prothrombin complex are then adsorbed with DEAE Sephadex® A from Pharmacia at a concentration of 0.5 mg / ml. The gel protein complex was separated from the solution and washed with each buffer 1 (4 g / L of trisodium citrate dehydrate, 0.7 g / l NaCl, 9 g / L Na 2 HPO _fourth 2H ₂ O, 500 IU of heparin, pH 7.5) followed by buffer 2 (4 g / l trisodium citrate dihydrate / 1.7 g / l NaCl, 500 IU heparin / l, pH 7.5).

Tým sa oddelí frakcia protrombínového komplexu obsahujúca faktor krvnej zrážanlivosti protrombín, nepatrné podiely faktoru VII, faktoru IX a faktoru X. Väčšina faktoru krvnej zrážanlivosti VII zostávajúca vo zvyšku po adsorpcii na DEAE - Sephadex® A50, firma Pharmacia, sa teraz získa adsorpciou na oxide hlinitom. Na to sa na liter zvyšku po oddelení protrombínového komplexu pridá 10 ml 2 %-nej suspenzie alumínium hydrogélu a mieša sa počas 30 minút pri teplote 4 °C. Následne sa centrífugáciou pri 5 000 ot/min. počas 10 minút pri teplote 4 °C v Sorvall RC3B Rotor H6000A oddelí komplex proteín - alumíniumhydroxid, zvyšok sa vyhodí a zrazenina sa suspenduje s 3,5 % obj. zvyšku protrombínového komplexu použitého na adsorpciu v roztoku 4 g/l trinátriumcitrátdihydrátu a 7 g/l NaCl, pHThis separates the fraction of prothrombin complex containing prothrombin blood clotting factor, small fractions of factor VII, factor IX and factor X. Most of the blood clotting factor VII remaining after adsorption on DEAE-Sephadex® A50, Pharmacia, is now obtained by adsorption on alumina . For this, 10 ml of a 2% aluminum hydrogel suspension are added per liter of prothrombin complex residue and stirred for 30 minutes at 4 ° C. Subsequently, centrifugation at 5,000 rpm. for 10 minutes at 4 ° C in Sorvall RC3B Rotor H6000A separates the protein-aluminum hydroxide complex, discard the residue and suspend the precipitate with 3.5% v / v. of the prothrombin complex used for adsorption in a solution of 4 g / l trisodium citrate dihydrate and 7 g / l NaCl, pH

7,5 a mieša sa počas 30 minút. Tým sa adsorbuje inertný proteín z alumíniumhydroxidu. Faktor II zostávajúci na alumíniumhydroxide sa rovnako ako sa popisuje vyššie, peletuje novou centrífugáciou. Zvyšok sa vyhodí a zrazenina sa ďalej použije na ďalšie spracovanie. Na desorpciu proteínovej frakcie sa komplex alumíniumhydroxid - faktor VII mieša počas 30 minút s 1 objemovým % zvyšku protrombínového komplexu použitého na adsorpciu s 0,3 mól/l fosfátového pufra, pH 8,6 (53,4 g Na2HPO₄.2 H₂O/I sa upraví roztokom7.5 and stirred for 30 minutes. This adsorbs an inert protein from aluminum hydroxide. The Factor II remaining on the aluminum hydroxide is pelleted by new centrifugation as described above. The residue was discarded and the precipitate was further used for further processing. For the desorption of the protein fraction is a complex of aluminum hydroxide - Factor VII stirred for 30 minutes with 1% by volume of the remainder of the prothrombin complex used for the adsorption with 0.3 mol / L phosphate buffer, pH 8.6 (53.4 g Na 2 HPO ₄ .2 H ₂ O Adjust the solution with I / L

31245/H31245 / H

41,1 g NaH₂PO₄. H₂O/I na pH 8,6), obsahujúcim 1 % TWEEN®-80. Následne sa kvôli inaktivácii patogénov pridá detergent TWEEN®-80 na konečnú koncentráciu 15 % a potom sa mieša počas 1 hodiny pri teplote 40 °C.41.1 g NaH ₂ PO ₄ . H ₂ O / l to pH 8.6) containing 1% TWEEN®-80. Subsequently, for the inactivation of pathogens, TWEEN®-80 detergent is added to a final concentration of 15% and then stirred for 1 hour at 40 ° C.

Po ochladení roztoku na teplotu 22 °C sa alikvót 20 ml prepufruje stĺpcovou chromatografiou cez Sephadex® G-50 (firma Pharmacia) proti roztoku 4 g/l trinátriumcitrátdihydrátu, pH 7,4 a rovnakým roztokom sa desaťnásobne zriedi. Všetok roztok sa následne nanesie na stĺpec plnený Heparín - Sepharose CL6B (firma Pharmacia) s priemerom 16 mm a výškou 10 cm. Prietok je 1 ml/min. Následne sa eluuje soľným gradientom 0,1 M NaCl v roztoku 4 g/l trinátriumcitrátdihydrátu, pH 7,4 desaťnásobným objemom stĺpca. Proteínová frakcia sa kvantifikuje meraním UV - absorpcie pri 280 nm. Zároveň sa frakcie zhromažďujú a stanovuje sa v nich faktor VII testom chromogénneho faktoru VII (Immunochrom Faktor VII : 10, Immuno AG, Viedeň). Frakcie eluovaného proteínu, ktoré obsahujú faktor VII, sa spoja a čistia. Eluačný objem frakcií faktoru VII je 25 ml. V proteínovej frakcii sa stanoví obsah proteínovou metódou podľa Bradforda, M. M: (Anál. Biochem. 72, 248 254,1976) faktor VII rovnako, ako sa popisuje vyššie. Rovnako sa kvantitatívne stanoví faktor Vila metódou podľa US 683 682. Z toho bolo možné zistiť, že eluovaná frakcia faktoru VII vykazuje špecifickú aktivitu 98 jednotiek/ml proteínu, zatiaľ čo obsah faktoru Vila je menší ako jedna jednotka/ml. Zodpovedajúcim spôsobom je možné získať preparát vysoko čistého faktoru VII bez podstatnej aktivácie faktoru VII. Výťažok pri chromatografii je viac ako 50 %.After cooling the solution to 22 ° C, an aliquot of 20 ml is buffered over Sephadex® G-50 (Pharmacia) against a 4 g / l solution of trisodium citrate dihydrate, pH 7.4, and diluted ten-fold with the same solution. The whole solution is then applied to a column packed with Heparin-Sepharose CL6B (Pharmacia) with a diameter of 16 mm and a height of 10 cm. The flow rate is 1 ml / min. Subsequently, it is eluted with a salt gradient of 0.1 M NaCl in a 4 g / l solution of trisodium citrate dihydrate, pH 7.4, by a ten-fold column volume. The protein fraction is quantified by measuring UV absorption at 280 nm. At the same time, the fractions were collected and assayed for factor VII by a chromogenic factor VII assay (Immunochrom Factor VII: 10, Immuno AG, Vienna). The eluted protein fractions containing Factor VII are pooled and purified. The elution volume of the Factor VII fractions is 25 ml. The protein fraction is determined by the protein method of Bradford, M. M: (Anal. Biochem. 72, 248, 254, 1976) factor VII as described above. The factor VIIa was also quantitatively determined by the method of US 683 682. From this, it was found that the eluted factor VII fraction showed a specific activity of 98 units / ml protein, while the factor VIIa content was less than one unit / ml. Accordingly, it is possible to obtain a highly pure Factor VII preparation without substantially activating Factor VII. The yield in chromatography is more than 50%.

1.3. Plazmatický faktor IX1.3 Plasma factor IX

150 ml protrombínového komplexu sa predčistí pomocou dextránsulfátu (Miletich a spol., Analytical Biochemistry 105, 304, 1980). 20 ml eluátu (912 I.E. faktoru IX, 160 I.E. faktoru X) sa nanesie na stĺpec s 20 ml agarózového polyméru s oktylovými skupinami (Octyl - Sepharose-CL-4B, firma Pharmacia, Švédsko) s prietokom 360 ml/hod. Stĺpec sa vopred ekvilibruje 80 ml pufra A. Po premytí naplneného gélu 120 ml pufra A sa eluuje frakcia obsahujúca faktor IX 80 ml 250 mmolárneho roztoku NaCl.150 ml of the prothrombin complex was pre-purified with dextran sulfate (Miletich et al., Analytical Biochemistry 105, 304, 1980). 20 ml of the eluate (912 I.E. factor IX, 160 I.E. factor X) was applied to a column of 20 ml agarose polymer with octyl groups (Octyl-Sepharose-CL-4B, Pharmacia, Sweden) at a flow rate of 360 ml / h. The column was pre-equilibrated with 80 ml of buffer A. After washing the filled gel with 120 ml of buffer A, the fraction containing factor IX was eluted with 80 ml of 250 mM NaCl solution.

31245/H31245 / H

Výťažok faktoru IX je asi 54 % východiskovej aktivity. Špecifická aktivita je 186 I.E. faktoru IX/mg proteínu. Faktor X je prítomný iba v stopách.The yield of factor IX is about 54% of the starting activity. The specific activity is 186 I.E. factor IX / mg protein. Factor X is present only in feet.

1.4. Získanie plazmatického proteínu C1.4. Obtaining plasma protein C

Vysoko čistý proteín C sa získa zo surovej frakcie proteínu C, ktorá sa vyrobí z komerčne dodávaného koncentrátu protrombínového komplexu. Čistenie sa vykonáva afinitnou chromatografiou pomocou monoklonálnych protilátok. Monoklonálne anti-proteín C-protilátky sa vyrobia nasledovne:High purity protein C is obtained from the crude protein C fraction, which is produced from a commercially available prothrombin complex concentrate. Purification is by affinity chromatography using monoclonal antibodies. Monoclonal anti-protein C-antibodies are produced as follows:

BALB/C myši sa imunizujú 100 gg ľudského proteínu C v dvojtýždenných intervaloch intraperitoneálnou injekciou. Po šiestich týždňoch sa injikuje ešte raz 50 gg ľudského proteínu C a tri neskôr sa vykoná fúzia. Myelómová bunečná línia (P3-X-63-AG8-653, 1,5 x 10⁷ buniek) sa zmieša s 1,7 x 10⁸slezinových buniek myši a vykoná sa fúzia modifikovanou metódou podľa Kôhiera a Milsteina za použitia PEG 1500 (Kohler, G., Milstein, C., Náture 256, 1975, 495-497).BALB / C mice are immunized with 100 gg of human protein C at biweekly intervals by intraperitoneal injection. After six weeks, 50 gg of human protein C is injected once more and fusion is carried out three times later. The myeloma cell line (P3-X-63-AG8-653, 1.5 x 10 ⁷ cells) is mixed with 1.7 x 10 ⁸ mouse spleen cells and fused using a modified Kohler and Milstein method using PEG 1500 (Kohler) , G., Milstein, C., Nature 256, 1975, 495-497).

Pozitívne klony, testované pomocou ELISA, sa dvakrát subklonujú. Produkcia ascites sa vykoná injekciou 5 x 10⁶ hybridómnych buniek pre každú myš BALB/C dva týždne po ošetrení Pristanom.Positive clones, tested by ELISA, are subcloned twice. Production of ascites is performed by injection of 5 x 10 ⁶ hybridoma cells for each BALB / C mouse two weeks after Pristan treatment.

Imunoglobulín sa zascitov čistí precipitáciou síranom amónnym a následnou chromatografiou pomocou QAE-Sephadexu a následne chromatografiou na Sephadexe G200. Kvôli zníženiu rizika prenosu murínnych vírusov sa protilátka pred imobilizáciou ešte podrobí kroku inaktivácie vírusov. Takto získaná monoklonálna protilátka proti proteínu C sa napojí na CNBR Sepharose 4B (Pharmacia). Na čistenie proteínu C pomocou afinitnej chromatografie sa použijú nasledujúce pufre:The immunoglobulin is purified by ammonium sulfate precipitation followed by QAE-Sephadex chromatography followed by Sephadex G200 chromatography. To reduce the risk of transmission of murine viruses, the antibody is further subjected to a virus inactivation step prior to immobilization. The thus obtained monoclonal antibody against protein C is coupled to CNBR Sepharose 4B (Pharmacia). The following buffers are used to purify protein C by affinity chromatography:

Ako adsorpčný pufor:As an adsorption buffer:

mM Tris, 2 mM EDTA, 0,25 M NaCl a 5 mM benzamidínu.mM Tris, 2 mM EDTA, 0.25 M NaCl and 5 mM benzamidine.

Ako premývací pufor:As a washing buffer:

mM Tris, 1 M NaCl, 2 mM benzamidínu, 2 mM EDTA, pH hodnota je 7,4.mM Tris, 1 M NaCl, 2 mM benzamidine, 2 mM EDTA, pH 7.4.

Ako eluačný pufor sa použije:The elution buffer used is:

31245/H31245 / H

M NaSCN, 20 mM Tris, 1 M NaCl, 0,5 mM benzamidínu, 2 m EDTA.M NaSCN, 20 mM Tris, 1 M NaCl, 0.5 mM benzamidine, 2 m EDTA.

Ďalšia vhodná monoklonálna protilátka na čistenie proteínu C sa popisuje v US 5 336 610. Táto protilátka sa viaže na aktivačný peptid proteínu C a je preto vhodná na selektívne čistenie zymogén proteínu C od aktivovanej formyAnother suitable monoclonal antibody for purifying protein C is disclosed in US 5,336,610. This antibody binds to an activating protein C protein and is therefore suitable for selectively purifying protein C zymogen from an activated form.

V detailoch: koncentrát protrombínového komplexu sa rozpustí vadsorpčnom pufre, pričom sa použije asi 10 g koncentrátu protrombínového komplexu na asi 20 ml stĺpca monoklonálnej protilátky. Následne sa rozpustený koncentrát protrombínového komplexu filtruje, centrifuguje sa pri 20 000 ot./min. počas 15 minút a pomocou 0,8 pm filtra sa filtruje k sterilizácii. Filtráciou sterilizovaný a rozpustený koncentrát protrombínového komplexu sa nanesie na stĺpec s prietokom 10 ml/hod. Následne sa stĺpec premyje premývacím pufrom kvôli odstráneniu proteínov a konečne sa viazaný protein C eluuje eluačným pufrom pri prietoku 5 ml/hod. a frakcie sa zhromažďujú. Eluovaný protein C sa dialyzuje proti pufru (0,2 M Tris, 0,15 M glycínu a 1 mM EDTA, pH 8,3). Obsah proteínu C sa stanoví podľa antigénu pomocou metódy podľa Laurella a podľa aktivity aktiváciou podľa Protaca.In detail: the prothrombin complex concentrate is dissolved in the adsorption buffer using about 10 g of the prothrombin complex concentrate per about 20 ml monoclonal antibody column. Subsequently, the dissolved prothrombin complex concentrate is filtered, centrifuged at 20,000 rpm. for 15 minutes and filtered through a 0.8 µm filter for sterilization. The filter-sterilized and dissolved prothrombin complex concentrate is applied to a column at a flow rate of 10 ml / h. Subsequently, the column is washed with wash buffer to remove proteins and finally bound protein C is eluted with elution buffer at a flow rate of 5 ml / h. and fractions are collected. Eluted protein C is dialyzed against buffer (0.2 M Tris, 0.15 M glycine and 1 mM EDTA, pH 8.3). Protein C content is determined by antigen using the Laurell method and by activity by Protac activation.

Získaný eluát proteínu C sa dokončí na farmaceutický aplikovateľný preparát nasledovne:The obtained protein C eluate is completed on a pharmaceutically applicable preparation as follows:

Eluát sa najprv podrobí ultrafiltrácii a diafiltrácii. Na diafiltráciu sa použije pufor s pH hodnotou 7,4, ktorý obsahuje 150 mM NaCl a 15 mM trinátriumcitrátu 2 H2O. Získaný filtrát sa vysuší vymrazením a jednohodinovým ošetrením parou, pri teplote 80 °C ± 5 °C a tlaku 137,5 kPa ±The eluate is first subjected to ultrafiltration and diafiltration. A pH 7.4 buffer containing 150 mM NaCl and 15 mM trisodium citrate 2 H2O is used for diafiltration. The filtrate obtained is freeze-dried and steam-treated for one hour at a temperature of 80 ° C ± 5 ° C and a pressure of 137.5 kPa ±

3,5 kPa sa inaktivuje proti vírusom.3.5 kPa is inactivated against viruses.

Lyofilizovaný materiál inaktivovaný na vírusy sa potom rozpustí v sterilnom izotónnom roztoku NaCl a pomocou ionomeničovej chromatografie na Q - Sepharose sa odstránia prípadne prítomné protilátky, prípadne sérumamyloid P. Vyčistený roztok sa potom koncentruje ultrafiltráciou a diafiltráciou. Nato sa k získanému roztoku pridá 10 albumínu, 150 mM NaCl a 15 mM trinátriumcitrátu. Myší imunoglobulín ani faktory II, VII, IX a X neboloThe lyophilized virus-inactivated material is then dissolved in sterile isotonic NaCl solution and any antibodies or serum amyloid P present are removed by ion exchange chromatography on Q-Sepharose. The purified solution is then concentrated by ultrafiltration and diafiltration. Then 10 albumin, 150 mM NaCl and 15 mM trisodium citrate are added to the solution obtained. There was no murine immunoglobulin, nor factors II, VII, IX and X

31245/H možné preukázať. Následne sa roztok sterilizuje filtráciou, plní sa a lyofilizuje. Špecifická aktivita je 14 jednotiek proteínu C/mg. Ako test aktivity sa použije amidolytický test, pričom proteín C sa aktivuje pomocou Protacu (firma Pentapharm).31245 / H can be demonstrated. Subsequently, the solution is sterilized by filtration, filled and lyophilized. The specific activity is 14 units of protein C / mg. As an activity assay, an amidolytic assay is used wherein protein C is activated by Protac (Pentapharm).

1.5. Čistenie plazmatického proteínu S1.5. Purification of plasma protein

Ľudský proteín S sa vyrobí ako koncentrát faktoru IX (protrombínový komplex STIM-3 IMMUNO AG Viedeň) pomocou QAE — Sephadex a Blue Sepharose CL-6B-Chromatographie (Pharmacia) nasledujúcim spôsobom.Human Protein S is produced as Factor IX concentrate (prothrombin complex STIM-3 IMMUNO AG Vienna) using QAE-Sephadex and Blue Sepharose CL-6B-Chromatography (Pharmacia) as follows.

Lyofilizovaný koncentrát (100 g) sa rozpustí v 200 ml sterilnej deionizovanej vody a dialyzuje sa proti pufru, pozostávajúcemu z 0,01 M 2-(Nmorfolín-etánsulfónovej kyseliny), pH 6,0; 0,18 M NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM benzamidín-hydrochloridu a 0,02 % NaN₃ (štartovací pufor). Dialyzovaný materiál sa potom nanesie na stĺpec QAE - Sephadexu (8 x 19 cm) a ekvilibruje sa uvedeným pufrom. Ako premývací roztok sa použije 1,5 I pufra (štartovací pufor).The lyophilized concentrate (100 g) was dissolved in 200 ml of sterile deionized water and dialyzed against a buffer consisting of 0.01 M 2- (N-morpholine-ethanesulfonic acid), pH 6.0; 0.18 M NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM benzamidine hydrochloride and 0.02% NaN ₃ (starter buffer). The dialyzed material was then loaded onto a QAE-Sephadex column (8 x 19 cm) and equilibrated with the indicated buffer. As a washing solution, 1.5 L of buffer (starter buffer) was used.

Proteín S sa eluuje 110 ml /hod. lineárnym gradientom NaCl, pozostávajúcim z 1,2 I štartovacieho pufra a 1,2 I ďalšieho pufra, ktorý sa od prvého pufra odlišuje prídavkom 0,5 M NaCl. Frakcia S-proteínu sa skúša pomocou Fast Flow SDS Page (Pharmacia) a stanovením antigénu (Laurell) na obsah proteínu S a frakcie, ktoré obsahujú proteín S, sa poolujú a nakoniec sa dialyzujú proti pufru. Tento pufor obsahuje 50 mM Tris - HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM benzamidín-hydrochloridu a 0,02 % NaN₃. Po dialýze sa pool proteínu S nanesie na stĺpec Blue - Sepharose CL-6B (2,5 cm x 10,5 cm) a ekvilibruje sa štartovacím pufrom.Protein S is eluted at 110 ml / h. a linear NaCl gradient consisting of 1.2 L of starting buffer and 1.2 L of another buffer which differs from the first buffer by the addition of 0.5 M NaCl. The S-protein fraction was assayed by Fast Flow SDS Page (Pharmacia) and assayed for antigen (Laurell) for protein S content and fractions containing protein S were pooled and finally dialyzed against buffer. This buffer contains 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM benzamidine hydrochloride and 0.02% NaN ₃ . After dialysis, the protein S pool was loaded onto a Blue-Sepharose CL-6B column (2.5 cm x 10.5 cm) and equilibrated with the start buffer.

Premytie sa vykonáva rýchlosťou 15 ml/hod. 500 ml štartovacieho pufra. Proteín S sa tak eluuje vo „void volume,,, zatiaľ čo protrombín sa adsorbuje na stĺpci. Frakcie s obsahom proteínu S sa potom opäť stanovia pomocou SDS Page Fast Flow Systém (Pharmacia) a podľa Laurella (Scand. J. Clin. Invest. (Suppl.), 29, 1977, 21, Suppl. 124).Washing is performed at a rate of 15 ml / h. 500 ml of starting buffer. Protein S is thus eluted in the void volume, while prothrombin is adsorbed on the column. Fractions containing protein S are then determined again by SDS Page Fast Flow System (Pharmacia) and according to Laurell (Scand. J. Clin. Invest. (Suppl.), 29, 1977, 21, Suppl. 124).

31245/H31245 / H

Takto vyrobený proteín S má na redukovanej SDS - Page morfológiu charakteristickú pre proteín S, totiž dva blízke pásy (Doublett) s molekulovou hmotnosťou asi 86 000, prípadne 76 000. Koncentrácia proteínu sa stanoví spektrofotometrícky na základe extinkčných koeficientov 0,1 pri 280 nm pre ľudský proteín S a potvrdí sa metódou podľa Lowry (Lowry, O., Rosegrough, N., Farr, AL., Randall, R., Proteín Measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193, 1951, 265).The protein S thus produced has, on a reduced SDS-Page morphology characteristic of protein S, namely two close bands (Doublett) with a molecular weight of about 86,000 or 76,000, respectively. The protein concentration is determined spectrophotometrically based on extinction coefficients of 0.1 at 280 nm for human protein S and confirmed by the Lowry method (Lowry, O., Rosegrough, N., Farr, AL., Randall, R., Protein Measurement with the Folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193, 1951, 265) ).

Takto vyrobený predčistený proteín S sa použije na výrobu ovčieho antiséra proti proteínu S, kedy sa použijú štyri imunizačné injekcie, pričom prvými dvoma injekciami sa subkutánne aplikuje 100 pg proteínu S s adjuvans podľa Freunda a pri následnom boostovaní sa pracuje s nekompletným adjuvans. Po ďalšom boostovaní sa antisérum testuje pomocou dvojitej imunodifúzie a vykazuje precipitáciu s čisteným proteínom S a s normálnou plazmou.The pre-purified Protein S thus produced is used to produce a sheep antiserum against Protein S using four immunization injections, with 100 µg of Freund adjuvanted Protein S subcutaneously administered for the first two injections followed by incomplete adjuvant boosting. After further boosting, the antiserum is assayed by double immunodiffusion and shows precipitation with purified protein S and normal plasma.

IgG frakcia zo 450 ml antiséra sa získa vyzrážaním alkoholom a následnou adsorbciou na Sephadex A50 v Tris - HCI pufre, pH 6,8. Zo 450 ml antiséra bolo vo zvyšku 1,14 g antiproteínu S-lgG. IgG frakcie sa napoja na 450 ml Sepharose CL-4B, pričom sa použije 5,7 mg proteínu/ml Sepharose. Účinnosť spojenia je 76 %. Stĺpec pre antiproteín S sa ekvilibruje glycínhydrochloridom, pH 3 a adsorpčným pufrom pH 7,5.The IgG fraction from 450 ml of antiserum is obtained by alcohol precipitation and subsequent adsorption on Sephadex A50 in Tris-HCl buffer, pH 6.8. Of the 450 ml of antiserum, 1.14 g of S-IgG was in the remainder. The IgG fraction was coupled to 450 ml Sepharose CL-4B using 5.7 mg protein / ml Sepharose. The connection efficiency is 76%. The antiprotein S column is equilibrated with glycine hydrochloride, pH 3 and adsorption buffer pH 7.5.

Adsorpčný pufor pozostáva z 20 mM Tris, 2 Mm EDTA, 0,25 M NaCl, 2 mM benzamidínu, 0,02 % Tween® 20 a 0,02 % NaN_3l pH 7,4. Roztok premývacieho pufra má nasledujúce zložky: 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 1,0 M NaCl, 0,5 mM benzamidínu, 0,01 % Tween® a 0,02 NaN₃, pH 7,4.The adsorption buffer consists of 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 0.25 M NaCl, 2 mM benzamidine, 0.02% Tween® 20 and 0.02% NaN _3l pH 7.4. The wash buffer solution has the following components: 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 1.0 M NaCl, 0.5 mM benzamidine, 0.01% Tween® and 0.02 NaN ₃ , pH 7.4.

Eluačný pufor má rovnaké zloženie ako roztok premývacieho pufra s tou zmenou, že sa použije 0,05 % Tween® 20 a navyše 243,3 g NaSCN, pH 7,4 (3 M roztok rhodanidu).The elution buffer has the same composition as the wash buffer solution except that 0.05% Tween ® 20 and 243.3 g NaSCN, pH 7.4 (3 M rhodanide solution) are used.

Roztok dialyzačného pufra obsahuje 20 mM Tris, 0,15 mM glycínu, 1 mM EDTA, 2 mM benzamidínu, pH 8,3.The dialysis buffer solution contains 20 mM Tris, 0.15 mM glycine, 1 mM EDTA, 2 mM benzamidine, pH 8.3.

31245/H31245 / H

Kvôli ďalšiemu čisteniu frakcie proteínu S vyrobeného z koncentrátu protrombínového komplexu sa rozpustí 100 g frakcie v 1 I adsorpčného pufra a cez noc sa dialyzuje proti roztoku adsorpčného pufra. Stĺpec sa po nanesení vzorky premyje asi 5 I premývacieho pufra až do neprítomnosti proteínu, následne sa vykonáva eluácia s 3 M NaSCN v roztoku eluačného pufra.For further purification of the protein S fraction made from the prothrombin complex concentrate, 100 g of fraction was dissolved in 1 L of adsorption buffer and dialyzed against the adsorption buffer solution overnight. After loading the sample, the column is washed with about 5 L of wash buffer until the absence of protein, followed by elution with 3 M NaSCN in the elution buffer solution.

Eluát sa okamžite dialyzuje, kým sa nedosiahne obsah SCN pod hranicou preukázateľnosti; eluát má koncentráciu 500 pg/ml proteínu S. Neobsahuje C4-binding proteín.The eluate is immediately dialyzed until the SCN content is below the limit of detection; the eluate has a concentration of 500 µg / ml protein S. It does not contain C4-binding protein.

Monoklonálna protilátka antiproteínu S sa vyrobí nasledovne:The monoclonal antibody of antiprotein S is produced as follows:

BALB/C myši sa imunizujú 100 pg vyrobeného proteínu S v dvojtýždenných intervaloch intraperitoneálnou injekciou. Po šiestich týždňoch sa injikuje ešte raz 50 pg ľudského proteínu S a tri dni neskôr sa vykoná fúzia. Myelómová bunečná línia (P3-X-63-AG8-653, 1,5 x 10⁷ buniek) sa zmieša s 1,7 x 10⁸ slezinových buniek myši a vykoná sa fúzia modifikovanou metódou podľa Kôhlera a Milsteina za použitia PEG 1500 (Kôhler, G., Milstein ,C„ Náture, 256, 1975, 495-497).BALB / C mice are immunized with 100 µg of produced Protein S at two-week intervals by intraperitoneal injection. After six weeks, 50 µg of human protein S is injected once more and fusion is performed three days later. The myeloma cell line (P3-X-63-AG8-653, 1.5 x 10 ⁷ cells) is mixed with 1.7 x 10 ⁸ mouse spleen cells and fused using a modified Kohler and Milstein method using PEG 1500 (Kohler , G., Milstein, (Nature, 256, 1975, 495-497).

Imunoglobulín sa z ascitov čistí precipitáciou síranom amónnym a následnou chromatografiou pomocou QAE - Sephadexu a následne chromatografiou na Sephadexe G200.Immunoglobulin is purified from ascites by ammonium sulfate precipitation followed by QAE-Sephadex chromatography followed by Sephadex G200 chromatography.

IgG frakcia získaná z ascitov a predčistená na Sepharose - protein A sa napojí na Sepharose CL-4B. Čistenie proteínu, ktorý sa získal z koncentrátu protrombínového komplexu pomocou afinitnej chromatografie, sa vykonáva za podmienok popísaných pre protilátku polyklonálneho proteínu S. Koncentrácia proteínu S v eluáte je 600 pg/ml. Neobsahuje C4 - binding proteín.The IgG fraction obtained from ascites and pre-purified on Sepharose-protein A is coupled to Sepharose CL-4B. Purification of the protein obtained from the prothrombin complex concentrate by affinity chromatography is performed under the conditions described for the polyclonal protein S antibody. The protein S concentration in the eluate is 600 pg / ml. It does not contain C4 - binding protein.

Metódou polyklonálnej alebo monoklonálnej afinitnej chromatografie vysoko vyčistený prípravok proteínu S sa podrobí SDS - Page (gradientový gél až 12 %) a môže sa podľa Coomasie zafarbenia (Laemmli UK: Cleavage ofUsing a polyclonal or monoclonal affinity chromatography method, a highly purified Protein S preparation is subjected to an SDS-Page (gradient gel up to 12%) and may be Coomasie stained (Laemmli UK: Cleavage of

31245/H structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Náture, 227,1970, 680) označiť ako viac než 95 % čistota.31245 / H structural proteins during the assembly of the bacteriophage head (T4, Nature, 227, 19070, 680) were reported to be > 95% pure.

Eluát sa následne podrobí ultrafiltrácii a diafiltrácii. Na diafiltráciu sa použije pufor s pH hodnotou 7,4, ktorý obsahuje 150 mM NaCl a 15 mM trinátriumcitrátu 2 H2O. Získaný filtrát sa vysuší vymrazením a jednohodinovým ošetrením parou pri teplote 80 °C ± 5 °C a tlaku 137,5 kPa ±The eluate is then subjected to ultrafiltration and diafiltration. A pH 7.4 buffer containing 150 mM NaCl and 15 mM trisodium citrate 2 H2O is used for diafiltration. The filtrate obtained is freeze-dried and steam-treated for one hour at 80 ° C ± 5 ° C and 137.5 kPa ±

3,5 kPa sa inaktivuje proti vírusom (kvôli odstráneniu prípadne prítomnej vírusovej kontaminácie polyklonálnou a monoklonálnou protilátkou).3.5 kPa is inactivated against viruses (to remove any polyclonal and monoclonal antibody contamination, if any).

Lyofilizovaný materiál inaktivovaný na vírusy sa potom rozpustí v sterilnom izotónnom roztoku NaCl a pomocou iónomeničovej chromatografie na Q - Sepharose sa odstránia prípadne prítomné protilátky, prípadne sérumamyloid P. Vyčistený roztok sa potom koncentruje ďalšou ultrafiltráciou a diafiltráciou. Nato sa k získanému roztoku pridá na 1 110 g albumínu, 150 mM NaCl a 15 mM trinátriumcitrátu. Hodnota pH je 7,5. Obsahuje 3 000 gg/ml proteínu S. Tento obsah proteínu S zodpovedá 500-násobnému obohateniu v porovnaní s plazmou. Myší imunoglobulín ani faktory II, VII, IX a X nie je možné preukázať. Následne sa roztok filtruje kvôli sterilizácii, plní sa a lyofilizuje.The lyophilized virus-inactivated material is then dissolved in sterile isotonic NaCl solution and any antibodies or serum amyloid P present are removed by ion exchange chromatography on Q-Sepharose. The purified solution is then concentrated by further ultrafiltration and diafiltration. Thereafter, 1110 g of albumin, 150 mM NaCl and 15 mM trisodium citrate are added to the obtained solution. The pH is 7.5. It contains 3000 gg / ml protein S. This protein S content corresponds to a 500-fold enrichment compared to plasma. Neither mouse immunoglobulin nor factors II, VII, IX and X can be detected. Subsequently, the solution is filtered for sterilization, filled and lyophilized.

Príklad 2Example 2

Farmaceutický prípravok vysoko čistých proteínov závislých od vitamínu KPharmaceutical preparation of highly pure vitamin K dependent proteins

Vysoko čisté jednotlivé faktory protrombínu, faktor VII, faktor IX, faktor X, proteín C a proteín S sa zmiešajú tak, aby vznikol roztok obsahujúci vždy 25 000 jednotiek/l jednotlivých faktorov vo vodnom roztoku 4 g Na₃-citrátu . 2 H₂O a 8 g NaCl. Roztok sa sterilizuje filtráciou cez nylonový filter s pomerom zadržania 0,2 μιτι a následne sa plní po 20 ml sterilizovaných sklenených fľaštičiek s plniacim objemom 50 ml. Následne sa za sterilných podmienok vymrazia a fľaštičky sa potom sterilné uzatvoria.The highly pure individual prothrombin factors, Factor VII, Factor IX, Factor X, Protein C and Protein S are mixed to form a solution containing 25,000 units / L of each factor in an aqueous solution of 4 g Na ₃ -citrate. 2 H ₂ O and 8 g NaCl. The solution is sterilized by filtration through a nylon filter with a retention rate of 0.2 μιτι and subsequently filled into 20 ml sterilized glass vials with a 50 ml filling volume. They are then frozen under sterile conditions and the vials are then sealed.

Príklad 3Example 3

Farmaceutický prípravok protrombínového komplexuPharmaceutical preparation of prothrombin complex

31245/H31245 / H

Rovnako ako sa popisuje v predchádzajúcom príklade, sa pripraví vysoko čistý protrombínový komplex, obsahujúci faktor VII, faktor IX a faktor X, avšak bez proteínu C a proteínu S a za sterilných podmienok sa plní. Podľa medzinárodných odporučení sa k roztoku pred plnením pridá 10 000 medzinárodných jednotiek heparínu/l.As described in the previous example, a high purity prothrombin complex containing Factor VII, Factor IX and Factor X is prepared, but without protein C and protein S and is filled under sterile conditions. According to international recommendations, 10,000 International Units of Heparin / L are added to the solution prior to filling.

Príklad 4Example 4

Farmaceutický prípravok proteínov závislých od vitamínu K na trvalú substitúciu a udržanie konštantnej hladiny plazmyPharmaceutical preparation of vitamin K dependent proteins for permanent substitution and maintenance of constant plasma levels

Po substitúcii koncentrátom proteínov závislých od vitamínu K, u ktorého sa má pokiaľ možno dosiahnuť konštantná hladina plazmy faktorov protrombínového komplexu, je na základe rozdielnych polčasov stability jednotlivých faktorov nutné vykonať mieru substitúcie týchto proteínov v pomere, ktorý nie je ekvivalentný. Zodpovedajúcim spôsobom sa rovnako ako je popísané vyššie pripraví farmaceutický prípravok, ktorý obsahuje protrombín, faktor VII, faktor IX, faktor X, proteín C a proteín S v pomere 1 : 30 : 3 :1,5 : 6 : 6.After substitution with vitamin K-dependent protein concentrate, which should preferably achieve a constant plasma level of prothrombin complex factors, it is necessary to perform a substitution rate of these proteins at a ratio that is not equivalent, due to different half-lives of the individual factors. Accordingly, a pharmaceutical composition comprising prothrombin, factor VII, factor IX, factor X, protein C and protein S in a ratio of 1: 30: 3: 1.5: 6: 6 is prepared as described above.

Príklad 5Example 5

Farmaceutický prípravok parciálneho protrombínového komplexuA pharmaceutical preparation of a partial prothrombin complex

Pre rozdielne polčasy faktorov protrombínového komplexu in vivo, najmä pre dlhý polčas protrombínu 2 až 5 dní v porovnaní s krátkym polčasom faktoru VII 4 až 7 hodín a faktoru IX pod 24 hodín, dochádza pri trvalej substitúcii prípravku protrombínového komplexu, kde pri nastavení normálnej koncentrácie plazmy 1 jednotka faktoru Vll/ml, k poklesu koncentrácie plazmy po 24 hodinách už opäť pod koncentráciu najmenej 20 %, ktorá je potrebná pre fungujúcu hemostázu, zatiaľ čo napríklad hladina protrombínovej plazmy je ešte približne normálna, to znamená 1 jednotka/ml. Pri novej substitúcii koncentrátom protrombínového komplexu rovnakého zloženia ako pri primárnej substitúcii teraz vyplýva, že koncentrácia protrombínovej plazmy pacienta je zvýšená nad normálnu oblasť, aby bolo možné dosiahnuť novú ekvivalentnú koncentráciu plazmy faktoru VII alebo faktoru IX. Zvýšenie koncentrácieBecause of the different half-lives of prothrombin complex factors in vivo, especially the long half-life of prothrombin 2 to 5 days compared to the short half-life of factor VII 4 to 7 hours and factor IX below 24 hours, the prothrombin complex preparation is permanently replaced. 1 unit of factor VIII / ml, to decrease the plasma concentration after 24 hours already below the concentration of at least 20% required for functioning hemostasis, while for example the level of prothrombin plasma is still approximately normal, i.e. 1 unit / ml. With a new substitution with a prothrombin complex concentrate of the same composition as the primary substitution, it now follows that the patient's prothrombin plasma concentration is increased above the normal range to achieve a new equivalent factor VII or factor IX plasma concentration. Increase in concentration

31245/H protrombínovej plazmy nad normálnu oblasť však znamená zvýšené riziko trombózy pre ošetrovaných pacientov, lebo Poort a spol. (Blood 88, 3698 3703, 1996) zistili, že i len o 30 % zvýšená hladina plazmy protrombínu je spojená s výrazne vyšším rizikom venóznej trombózy. Tomuto problému sa môže zabrániť, ak sa pre sekundárne substitúcie cielene použijú kombinované prípravky protrombínového komplexu.However, 31245 / H of prothrombin plasma above the normal area means an increased risk of thrombosis for the treated patients, since Poort et al. (Blood 88, 3698 3703, 1996) found that even a 30% increase in prothrombin plasma levels is associated with a significantly higher risk of venous thrombosis. This problem can be avoided if combination preparations of the prothrombin complex are specifically used for the secondary substitutions.

Takýto prípravok sa vyrobí nasledovne:Such a preparation is prepared as follows:

Rovnako ako sa popisuje v predchádzajúcich príkladoch, zostaví sa koncentrát protrombínového komplexu, pozostávajúci z faktoru VII, IX a X ί v pomere 30 : 3 : 1,5, avšak bez protrombínu a pripraví sa ako farmaceutická ·* formulácia. Dávky tohto preparátu predpokladané na aplikáciu obsahujú vždyAs described in the previous examples, a prothrombin complex concentrate consisting of factor VII, IX and X β in a ratio of 30: 3: 1.5, but without prothrombin, is assembled and prepared as a pharmaceutical formulation. The doses of this preparation contemplated for administration always contain

500 medzinárodných jednotiek faktorov krvnej zrážanlivosti VII, IX a X v objeme kvôli rozpusteniu 10 ml po rekonštitúcii lyofilizovaného prášku.500 International Units of Blood Clotting Factors VII, IX and X in volume to dissolve 10 ml after reconstitution of the lyophilized powder.

Príklad 6Example 6

Kontrola akosti preparátu protrombínového komplexuQuality control of prothrombin complex preparation

Jednotlivé faktory krvnej zrážanlivosti v konečnej adjustácii preparátu protrombínového komplexu sa skúšajú jednostupňovým testom krvnej zrážanlivosti za použitia deficitnej plazmy a reagenciou krvnej zrážanlivosti firmy IMMUNO Viedeň, na obsah protrombínu, faktoru VII, faktoru IX, faktoru X, ’· proteínu C a proteínu S.The individual clotting factors in the final adjustment of the prothrombin complex preparation are tested by a one-stage blood clotting assay using IMMUNO Vienna deficient plasma and blood clotting reagent for prothrombin, factor VII, factor IX, factor X, protein X, protein C and protein S levels.

Detaily použitej metódy možno čerpať z práce Muller, H. G. a Bonik, K. (Krankenhauspharmazie 13, 528-531,1992).Details of the method used can be found in Muller, H. G. and Bonik, K. (Krankenhauspharmazie 13, 528-531, 1992).

Na stanovenie obsahu aktivovaných faktorov protrombínového komplexu sa použijú chromogénne substráty S-2238, S-2222, S-2444, S-2366 a S-2251 firmy Chromogenix. Stanovenie sa vykonáva za pufrovaných podmienok udaných výrobcom. Chromogénnymi substrátmi sa stanovia vždy aktivované faktory trombín, faktor Vila, faktor IXA, faktor Xa, aktivovaný proteín C, ktoré voči použitým peptidovým substrátom vyvíjajú proteolytickú aktivitu. Po vyhodnotení fotometrickej analýzy chromogénnej premeny substrátu sa zistilo, že pre všetky substráty je obsah proteínov alebo vybraných faktorovChromogenix substrates S-2238, S-2222, S-2444, S-2366 and S-2251 from Chromogenix are used to determine the content of activated prothrombin complex factors. The determination is carried out under the buffered conditions given by the manufacturer. Activated thrombin factors, Factor VIIa, Factor IXA, Factor Xa, Activated Protein C, which exert proteolytic activity against the peptide substrates used, are determined by chromogenic substrates. After evaluating the photometric analysis of the chromogenic transformation of the substrate, it was found that for all substrates the content of proteins or selected factors

31245/H protrombínového komplexu v prv popísaných prípravkoch, obsahujúci vitamín K, vždy pod 10 mU/ml.31245 / H of prothrombin complex in the above-described preparations containing vitamin K, always below 10 mU / ml.

31245/H31245 / H

VaZ -ZffrtVaZ -Zffrt

Claims

Pharmaceutical separated preparation of prothrombin complex, characterized in that it comprises at least two chromatographically purified individual vitamin K-dependent factors as active ingredients.

The preparation according to claim 1, characterized in that the individual factors are selected from the group of factor II, factor VII, factor IX, factor X, protein C, protein S and protein Z.

Preparation according to claim 1 or 2, characterized in that it contains at least factors II, VII, IX and X.

Preparation according to one of Claims 1 to 3, characterized in that it contains individual factors protein C and protein S.

Preparation according to one of claims 1 to 4, characterized in that at least one of the individual factors is a recombinant factor, a transgenically produced factor, a derivative, in particular a peptide and / or a fragment.

A preparation according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it contains the individual content factors in a ratio which substantially corresponds to the ratio of these factors in the blood.

A preparation according to any one of claims 1 to 6, characterized in that it comprises individual factors II, II, factor IX and factor X relative to the international units (0,5 to 2): (0,5 to 2): (0.5 to 2): (0.5 to 2).

A preparation according to any one of claims 1 to 7, characterized in that it comprises individual factors II, factor VII, factor IX, factor X, protein C and protein S in relative proportions relative to international units (0.5 to 2). ): (0.5 to 2): (0.5 to 2): (0.5 to 2): (0.5 to 2): (0.5 to 2).

31245 / H

Preparation according to one of claims 1 to 5, characterized in that the individual factors contained are in a ratio corresponding to the relative half-life of the individual factors.

A preparation according to claim 9, characterized in that it comprises the individual factors II, II, IX and factor X in relative proportions relative to the international units (0.5 to 2): (5 to 35): (0) , 5 to 7): (0.5 to 5).

Preparation according to either of Claims 9 or 10, characterized in that it contains individual factors II, II, factor IX, factor X, protein C and protein S in relative proportions relative to the international units (0.5 to 2). ): (5 to 35): (0,5 to 7): (0,5 to 5): (1 to 15): (1 to 15).

A preparation according to claim 1, 2, 4, 5, 6 or 9, characterized in that it comprises factor VII and factor II in a ratio greater than 10: 1.

Preparation according to one of claims 1 to 12, characterized in that the individual factors in the preparation do not form any complex.

Preparation according to one of Claims 1 to 13, characterized in that it contains a partial prothrombin complex.

Preparation according to any one of claims 1 to 14, characterized in that it contains no activated blood clotting factor selected from IIIa, IXa, Xa and optionally VIIa.

A preparation according to any one of claims 1 to 15, characterized in that it contains less than 0.1 E factor VIII: C or factor VIII: Ag / mg protein.

A preparation according to any one of claims 1 to 16, characterized in that it contains less than 0.1 E of factor 11a / E prothrombin.

A preparation according to any one of claims 1 to 17, characterized in that it contains less than 0.1 E factor Xa / E factor X.

31245 / H

Preparation according to any one of claims 1 to 18, characterized in that it is present in lyophilized form.

Preparation according to one of claims 1 to 19, characterized in that it contains magnesium ions.

Preparation according to one of Claims 1 to 20, characterized in that it contains no free calcium ions.

22. A formulation according to claim 21 comprising a chelating compound for complexing with free calcium ions.

Preparation according to any one of claims 1 to 22, characterized in that it further comprises antithrombin III in stabilizing amounts, optionally together with heparin.

A preparation according to any one of claims 1 to 23, characterized in that it is free from infectious viruses as a result of treatment for virus inactivation or virus destruction.

Preparation according to one of claims 1 to 24, characterized in that the absence of infectious viruses is ensured by two independent methods for virus inactivation or virus destruction.

A formulation according to any one of claims 1 to 25, further comprising pharmaceutically acceptable buffer substances or stabilizers.

Preparation according to one of claims 1 to 26, characterized in that it consists of highly pure individual vitamin K-dependent factors which are virally inactivated.

Preparation according to any one of claims 1 to 27, characterized in that it contains the individual factor X in its α- and / or β-form.

A diagnostic composition comprising the composition of any one of claims 1 to 28.

Use of a preparation according to any one of claims 1 to 28 for the manufacture of a preparation for the treatment of acquired or inherited blood clotting disorder.

31245 / H

Use of a preparation according to any one of claims 1 to 28 for the manufacture of a preparation for the treatment of severe bleeding.

Use of a preparation according to any one of claims 1 to 28 for the manufacture of a preparation for the prophylaxis of bleeding, particularly in the presence of inherited blood clotting disorders.

Use of a formulation according to any one of claims 1 to 28 for the manufacture of a substitution therapy formulation.

Use of a preparation according to any one of claims 1 to 28 for the manufacture of a preparation for the treatment of haemophilia B.