JP3032085B2 - プロテインｃを含有し血栓溶解活性を有する非経口投与が可能な薬剤 - Google Patents

プロテインｃを含有し血栓溶解活性を有する非経口投与が可能な薬剤

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、血栓溶解活性を有し、
プロテインＣまたは活性化プロテインＣに対する抗体な
らびにトロンビン活性を含有しない活性化されたプロテ
インＣを含有する非経口投与が可能な薬剤に関する。
【０００２】これらの薬剤はプロテインＣ欠乏症の治療
に適用できると共に、血栓溶解剤として、線維素(フィ
ブリン)溶解剤として、ならびに抗凝固剤として適用で
きる。
【０００３】
【従来の技術とその課題】プロテインＣはビタミンＫ依
存性の糖タンパク質であり、この糖タンパク質は肝臓で
合成され、血漿中で不活性酵素原(チモーゲン)として４
μg／mlの濃度で循環する。プロテインＣは血管壁の表
面(内皮)上のトロンビン-トロンボモジュリン複合体に
よって活性なセリンプロテアーゼ(活性化プロテインＣ)
に変換される。活性化プロテインＣがプロフィブリン溶
解特性を有することは知られている。またこれは因子Ｘ
aが誘導するプロトロンビン活性化(トロンビン生成)の
補因子である因子Ｖa、ならびに因子IＸaが誘導する因
子Ｘ活性化の補因子である因子ＶIIIaの両方をタンパク
加水分解的に分解するので、これは抗凝固効果をも有す
る。
【０００４】プロテインＣの生体内での活性化は、トロ
ンビンの生成における負のフィードバック反応を構成す
る。最適な生物活性を発揮するためには補因子(プロテ
インＳ)が必要である。
【０００５】ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１２０２８およびＥ
Ｐ-Ａ-０２８７０２８には、プロテインＣを活性化する
方法ならびにアフィニティークロマトグラフィー精製法
が記述されている。ＥＰ-Ａ-０２８７０２８によれば、
プロテインＣとトロンビン／トロンボモジュリンとの反
応は抗トロンビンIIIの添加によって停止する。
【０００６】アフィニティークロマトグラフィーを用い
て非滅菌モノクローナル抗体で精製したプロテインＣ調
製物を投与する場合、病原体が伝染する危険がある。さ
らに、微量のトロンビン、微量のネズミ・タンパク質あ
るいは血清アミロイドＰなどの不純物が、活性化プロテ
インＣを含有する調製物の投与に際して不利な効果を有
するかもしれない。
【０００７】プロテインＣ調製物のウイルス安全性を増
大させるために、既にウイルス不活化された出発物質か
ら、ウイルス不活化モノクローナル抗体でのアフィニテ
ィークロマトグラフィー精製によってプロテインＣを単
離することが、“Advances inApplied Biotechnology Se
ries",第11巻,“Protein C and Related Anticoagulant
s"(Bruley D.F.およびDrohan W.N.共編；Gulf Publishi
ng Company,Houston,London,Paris,Zurich,Tokyo),83-8
9頁(1990)に提案されている。次いで、その調製物をさ
らにウイルス不活化処理にかけることができる。
【０００８】ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７５２４から、イ
オン交換体(セファデックスＱ５０)へのプロテインＣの
吸着によって血清アミロイドＰを除去できることが知ら
れている。
【０００９】さらにヘパリン-セファロースへのトロン
ビンの選択的吸着によって、活性化プロテインＣから微
量のトロンビンを除去することができる(Thromb.Res.5
9,27-35(1990))。しかしこの方法にはウイルス不活化の
ための操作、あるいは血清アミロイドＰを除去するため
の操作が含まれていない。
【００１０】ＥＰ-Ａ-０３１８２０１には、活性化プロ
テインＣを単独で、あるいは血栓溶解的に活性な物質と
組み合わせて使用することによって、動脈血栓症または
血栓閉塞状態を防止し得ることが述べられている。活性
化プロテインＣの抗血栓症活性は実施例によって立証さ
れている。
【００１１】本発明の目的は、特に高純度の活性化プロ
テインＣを含有する、最初に限定した種類の薬剤を提供
することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明の薬剤は血清アミ
ロイドＰおよび感染性物質を含有しないことを特徴とす
る。
【００１３】本発明の薬剤はいかなる副反応も示さず、
血栓溶解療法は線維素原(フィブリノーゲン)の低下また
は出血を誘発しない。
【００１４】本発明の薬剤は、特にLys-プラスミノーゲ
ンまたはウロキナーゼと組み合わせると、驚くほど良い
血栓溶解活性を有し、したがって血栓症を防止する能力
が高いことがわかった。
【００１５】本発明は、活性化プロテインＣの投与が血
栓溶解的に活性な酵素プラスミンの生物内での遊離に関
与し、したがって生体内での血栓溶解活性を増大させる
という発見に基づいている。したがって、本発明の薬剤
は血栓溶解剤としての使用に適している。さらに、その
血栓溶解活性が適用した投与量の関数であり、したがっ
て、使用する活性化プロテインＣがトロンビン活性およ
び血清アミロイドＰを含有しなければ、その至適活性を
示すこともわかった。
【００１６】また本発明は、上述の薬剤を得る方法であ
って、次の手段： ・抗プロテインＣ抗体(任意に、感染性物質に対して不
活化したもの)によるアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いてプロテインＣを精製する； ・精製したプロテインＣをトロンビンで活性化した後、
トロンビンを阻害する; ・イオン交換体を用いてクロマトグラフィー的に、活性
化プロテインＣから血清アミロイドＰおよび抗体を除去
する； ・非経口投与が可能な薬剤に加工する； の組み合わせを特徴とする方法に関する。
【００１７】本発明の方法の好ましい態様は、感染性物
質を不活化するために少なくとも２つの手段を採用する
ことを特徴とする。
【００１８】本発明の薬剤は、特に純粋な形態の活性化
プロテインＣを含有する。抗トロンビンIII-ヘパリン複
合体の形態でトロンビン１単位当たり０.０１〜０.１Ｉ
Ｕ抗トロンビンIIIを用いて、トロンビンを阻害し、次
いでその反応混合物からトロンビンを除去することが最
善の方法である。抗トロンビンIII-ヘパリン複合体はト
ロンビンに対して、抗トロンビンIII単独よりもかなり高
い親和性を有し、それゆえに活性化プロテインＣからの
トロンビンの分離がより容易に実行できる。
【００１９】微量のトロンビンを含有しないことに加え
て、ネズミ・タンパク質(抗体類)および血清アミロイド
Ｐもイオン交換体でのクロマトグラフィー精製を用いて
本発明の薬剤から除去されており、さらに本発明の薬剤
はウイルス不活化処理をいくつか組み合わせることによ
って、ウイルス安全(ウイルス感染の危険がない)である
と見なし得る。酵素原を得るために、既にウイルスを不
活化した出発物質(プロトロンビン複合体)をウイルス不
活化モノクローナル抗体でのアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いて精製することができる。トロンビンに
よる活性化の後、活性化プロテインＣを再度ウイルス不
活化処理に付す。既知の不活化法(例えば、ＥＰ-Ａ-０
１５９３１１、ＥＰ-Ａ-００５００６１、ＥＰ-Ａ-０１
３１７４０)を用いてヒト病原性微生物を不活化するこ
とができる。
【００２０】トロンビンの阻害は抗トロンビンIII-ヘパ
リン複合体の添加によって達成することが有利である。
【００２１】以下に、活性化プロテインＣを含有する医
薬組成物の製造、ならびに動物モデル中で観測したその
血栓溶解活性について、より詳細に記述する。
【００２２】
【実施例】実施例１ ：プロテインＣの製造 市販のプロトロンビン複合体濃縮物から得た粗プロテイ
ンＣ画分から、純粋なプロテインＣを回収した。精製
は、モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマ
トグラフィーによって達成した。モノクローナル抗プロ
テインＣ抗体を次のように製造した。
【００２３】ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、２週間間隔で腹腔
内注射することによりヒトプロテインＣ １００μgで免
疫化した。６週間後、ヒトプロテインＣをさらに５０μ
g注射し、その３日後に融合を実行した。骨髄腫細胞株
(Ｐ３-Ｘ-６３-ＡＧ８-６５３、１.５ｘ１０7細胞)を
１.７ｘ１０8のマウス脾臓細胞と混合し、Kohlerおよび
Milesteinの改良法に従って、ＰＥＧ１５００を用いて
融合した(Kohler G.,Milestein C.,Nature 256(1975),4
95-497)。
【００２４】ＥＬＩＳＡを用いて検定した陽性クローン
を２回サブクローニングした。プリスタン(Pristan)処
理の２週間後、ＢＡＬＢ／Ｃマウス１匹あたり５ｘ１０
6ハイブリドーマ細胞を注射することによって、腹水産
生を達成した。
【００２５】硫酸アンモニウム沈殿後、ＱＡＥ-セファ
デックスでクロマトグラフィーを行い、さらにセファデ
ックスＧ２００でクロマトグラフィーを行うことによっ
て、腹水から免疫グロブリンを精製した。ネズミ・ウイ
ルスの伝染の危険性を減じるために、固定化に先立って
抗体をさらにウイルス不活化操作に付した。このように
して得たモノクローナル・プロテインＣ抗体をＣＮＢｒ
-活性化セファロース４Ｂ(ファルマシア)に結合させ
た。アフィニティークロマトグラフィーによるプロテイ
ンＣの精製には次の緩衝液を使用した。 吸着緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ、２mM ＥＤＴＡ、０.２
５M ＮａＣｌ、５mM ベンズアミジン； 洗浄緩衝液：２０mM Ｔｒｉｓ、１M ＮａＣｌ、２mM ベ
ンズアミジン、２mM ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４； 溶出緩衝液：３M ＮａＳＣＮ、２０mM Ｔｒｉｓ、１M
ＮａＣｌ、０.５mM ベンズアミジン、２mM ＥＤＴＡ。
【００２６】詳細：プロトロンビン複合体濃縮物を吸着
緩衝液に溶解した(モノクローナル抗体カラム２０mlに
ついて約１０gのプロトロンビン複合体濃縮物を使用し
た)。次いで、溶解したプロトロンビン複合体濃縮物を
濾過し、２００００r.p.m.で１５分間遠心分離し、０.
８μmフィルターを通して滅菌濾過した。溶解し滅菌濾
過したこのプロトロンビン複合体濃縮物を１０ml／時間
の流量でカラムに添加した。次いで、このカラムを洗浄
緩衝液で洗浄することによりタンパク質を除去し、最後
に溶出緩衝液を５ml／時間の流量で流すことによって、
結合したプロテインＣを溶出させ、その分画を集めた。
溶出したプロテインＣを緩衝液(０.２mol／lＴｒｉｓ、
０.１５M グリシン、１mM ＥＤＴＡ、ｐＨ８.３)に対し
て透析した。プロテインＣ抗原濃縮物をLaurellが記述
した方法を用いて決定し、プロタック(Protac)活性化を
用いてプロテインＣ活性を決定した。
【００２７】得られたプロテインＣ含有溶液を滅菌濾過
し、凍結乾燥し、８０℃±５℃および１３７５±３５mbar
で１時間蒸気処理することによってウイルスを不活化し
た。
【００２８】実施例２：活性化プロテインＣの製造 精製したプロテインＣの活性化を次のように行った：プ
ロテインＣ １０gを緩衝液(１５０mM ＮａＣｌ、１５mM
クエン酸ナトリウム、ｐＨ７.５)に６mg／ｍｌの濃度
で溶解し、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび１０mM クエン
酸ナトリウム緩衝液に溶解したヒトウイルス不活化トロ
ンビン １４.４mgと共に３７℃で３時間インキュベート
した。１２００Ｕの抗トロンビンIII-ヘパリン複合体を
用いてこの反応を停止させた。
【００２９】この後、Ｑ-セファロースを用いて、活性
化プロテインＣのさらなる精製を行った。この目的のた
めに、１５０mM ＮａＣｌおよび１５mM クエン酸ナトリ
ウム中で吸着を行い、１M ＮａＣｌ溶液で溶出を実行し
た。
【００３０】この溶出液を限外濾過し、滅菌濾過し、そ
れぞれ５mlの単位で滅菌的に充填し、凍結乾燥した。
【００３１】５mlの体積に溶解する際、この調製物の組
成を次のようにした。
【表１】 タンパク質： １.５mg／ml ａＰＣ(活性化プロテインＣ)： ２０４Ｕ／ml(色素原
基質Ｓ２３６６(Kabi)のアミド加水分解に関して) ＮａＣｌ： １５０mM クエン酸ナトリウム： １５mM ｐＨ： ７.５
【００３２】この調製物はプロテインＣおよびトロンビ
ンに対する抗体を含有せず(免疫学的に決定した)、さら
に血清アミロイドＰを含有しなかった(電気泳動的に決
定した)。
【００３３】実施例３：動物モデル ヒト活性化プロテインＣの血栓溶解特性を、文献で知ら
れており、血栓溶解性物質を試験するための標準である
と考えられているモデルで評価した。D.Collenが１９８
３年に記述したモデルを、125Ｉ-フィブリノーゲンの代
わりに123Ｉ-フィブリノーゲンを用い、ガンマカメラ(E
lscint APEX 409AG,シングル・ピンホール・コリメータ
ー)を使用することによって改良した。
【００３４】麻酔したウサギ・ハイプノルム(Hypnorm;
ジャンセン(Jansenn))の左頚静脈を露出させ、その顔面
枝中にカテーテルを固定した。約１.５cmの距離にわた
って頚静脈を圧搾した後、１００μlの123Ｉ-フィブリ
ノーゲン-ウサギ血液混合物をカテーテルを通して添加
した。３０分後、鉗子を除去した。ａＰＣを大腿深静脈
を通して１時間注入した。ガンマカメラを123Ｉ-フィブ
リノーゲン血栓上の距離２cmに設置した。放射活性を２
時間測定し、連続的に記録した。その値を123Ｉ-フィブ
リノーゲンの減衰によって補正した。血栓溶解速度を血
栓中の放射活性の低下として表した。
【００３５】それぞれの投与量群について４匹の動物を
用いた。１つの群は、ビタミン-Ｋ-依存性凝固因子の合
成を排除するために、クマリン(４-ヒドロキシクマリン
(シグマ)、５mg／kg ｉ.ｖ.９日間)で予備処置した。抗
凝固化動物中の血栓は正常な(即ち、非抗凝固化)ウサギ
の血液-フィブリノーゲン混合物によって形成させた。
【００３６】ａＰＣの注入は服量依存性の血栓溶解をも
たらした。即ち、８０、１５０、２００および５００Ｕ
／ｋｇはそれぞれ２１、２４、４０および５８％の血栓
溶解を誘発した。緩衝液で処理した動物は同じ２時間の
測定時間中に１２％の溶解を示したに過ぎなかった。抗
凝固化動物は溶解耐性であり、４００Ｕ／kgで１８％よ
り高い溶解を示さなかった。これは、ビタミン-Ｋ-依存
性タンパク質(例えばプロテインＳ、プロテインＺ、プ
ロトロンビン)がａＰＣの生体内での血栓溶解効果にと
って必要であることを立証している。
【００３７】これらの結果を添付の図１にグラフ化して
表す。横座標は投与量(単位／kg)を表し、縦座標は血栓
溶解効果(溶解率(％))を表す。
【００３８】ａＰＣがａＰＣとｔ-ＰＡの組み合わせよ
り静脈血栓の溶解に適していることが立証された。５０
０単位ａＰＣ／kgおよび０.４mg ｔ-ＰＡ／kgを投与し
たところ、約３３％の溶解(ａＰＣを単独で適用した場
合と比較して５８％)しか観測できなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 活性化プロテインＣの生体内での血栓溶解活
性の投与量依存性を表す。横座標は投与量(単位／kg)を
表し、縦座標は血栓溶解効果(溶解率(％))を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/72 Ａ６１Ｋ 37/547 37/54 (72)発明者 アントン・フィラピィッチュ オーストリア、アー−2490エーベンフル ト、ハンス・クートリッヒガッセ５番 (72)発明者 ハンス・ペーター・シュヴァルツ オーストリア、アー−1180ヴィーン、シ ントレルガッセ32番 (56)参考文献 特表 昭60−501859（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／7524（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 非経口投与が可能な血栓溶解剤であっ
    て、プロテインＣまたは活性化プロテインＣに対する抗
    体ならびにトロンビン活性が混入していない活性化プロ
    テインＣを含有し、血清アミロイドＰおよび感染性物質
    を含有しない薬剤。
  2. 【請求項２】 ・精製プロテインＣを得るために、抗プ
    ロテインＣ抗体によるアフィニティークロマトグラフィ
    ーを用いてプロテインＣを精製すること； ・活性化プロテインＣを得るために、該精製プロテイン
    Ｃをトロンビンで活性化し、次いで該トロンビンを阻害
    すること； ・血清アミロイドＰおよび抗体を含有しないプロテイン
    Ｃを得るために、イオン交換体を用いてクロマトグラフ
    ィー的に該活性化プロテインＣから血清アミロイドＰお
    よび抗体を除去すること；および ・血清アミロイドＰおよび抗体を含有しない該プロテイ
    ンＣを加工することによって、非経口投与が可能な薬剤
    を得ること； の組み合わせからなる、非経口投与が可能な血栓溶解剤
    であって、プロテインＣまたは活性化プロテインＣに対
    する抗体ならびにトロンビン活性が混入していない活性
    化プロテインＣを含有し、血清アミロイドＰおよび感染
    性物質を含有しない薬剤の製造方法。
  3. 【請求項３】 さらに該抗プロテインＣ抗体を感染性物
    質に対して不活化することを含む請求項２の方法。
  4. 【請求項４】 感染性物質を不活化するために少なくと
    も２つの不活化法を適用する請求項３の方法。
  5. 【請求項５】 抗トロンビンIII-ヘパリン複合体を添加
    することによって該トロンビンを阻害する請求項２の方
    法。
  6. 【請求項６】 活性化プロテインＣを活性成分とする静
    脈血栓溶解剤。
  7. 【請求項７】 Lys-プラスミノーゲンおよびウロキナー
    ゼの少なくとも１つならびに活性化プロテインＣを活性
    成分とする静脈血栓溶解剤。
  8. 【請求項８】 患者に投与することにより患者の種々の
    血栓を溶解するための、有効量のプロテインＣを含む請
    求項１に記載の薬剤。
  9. 【請求項９】 Lys-プラスミノーゲンおよびウロキナー
    ゼの少なくとも１つをさらに含む請求項８に記載の薬
    剤。
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