JP3032085B2 - プロテインcを含有し血栓溶解活性を有する非経口投与が可能な薬剤 - Google Patents

プロテインcを含有し血栓溶解活性を有する非経口投与が可能な薬剤

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、血栓溶解活性を有し、
プロテインCまたは活性化プロテインCに対する抗体な
らびにトロンビン活性を含有しない活性化されたプロテ
インCを含有する非経口投与が可能な薬剤に関する。
【0002】これらの薬剤はプロテインC欠乏症の治療
に適用できると共に、血栓溶解剤として、線維素(フィ
ブリン)溶解剤として、ならびに抗凝固剤として適用で
きる。
【0003】
【従来の技術とその課題】プロテインCはビタミンK依
存性の糖タンパク質であり、この糖タンパク質は肝臓で
合成され、血漿中で不活性酵素原(チモーゲン)として4
μg/mlの濃度で循環する。プロテインCは血管壁の表
面(内皮)上のトロンビン-トロンボモジュリン複合体に
よって活性なセリンプロテアーゼ(活性化プロテインC)
に変換される。活性化プロテインCがプロフィブリン溶
解特性を有することは知られている。またこれは因子X
aが誘導するプロトロンビン活性化(トロンビン生成)の
補因子である因子Va、ならびに因子IXaが誘導する因
子X活性化の補因子である因子VIIIaの両方をタンパク
加水分解的に分解するので、これは抗凝固効果をも有す
る。
【0004】プロテインCの生体内での活性化は、トロ
ンビンの生成における負のフィードバック反応を構成す
る。最適な生物活性を発揮するためには補因子(プロテ
インS)が必要である。
【0005】PCT公開WO90/12028およびE
P-A-0287028には、プロテインCを活性化する
方法ならびにアフィニティークロマトグラフィー精製法
が記述されている。EP-A-0287028によれば、
プロテインCとトロンビン/トロンボモジュリンとの反
応は抗トロンビンIIIの添加によって停止する。
【0006】アフィニティークロマトグラフィーを用い
て非滅菌モノクローナル抗体で精製したプロテインC調
製物を投与する場合、病原体が伝染する危険がある。さ
らに、微量のトロンビン、微量のネズミ・タンパク質あ
るいは血清アミロイドPなどの不純物が、活性化プロテ
インCを含有する調製物の投与に際して不利な効果を有
するかもしれない。
【0007】プロテインC調製物のウイルス安全性を増
大させるために、既にウイルス不活化された出発物質か
ら、ウイルス不活化モノクローナル抗体でのアフィニテ
ィークロマトグラフィー精製によってプロテインCを単
離することが、“Advances inApplied Biotechnology Se
ries",第11巻,“Protein C and Related Anticoagulant
s"(Bruley D.F.およびDrohan W.N.共編;Gulf Publishi
ng Company,Houston,London,Paris,Zurich,Tokyo),83-8
9頁(1990)に提案されている。次いで、その調製物をさ
らにウイルス不活化処理にかけることができる。
【0008】PCT公開WO90/07524から、イ
オン交換体(セファデックスQ50)へのプロテインCの
吸着によって血清アミロイドPを除去できることが知ら
れている。
【0009】さらにヘパリン-セファロースへのトロン
ビンの選択的吸着によって、活性化プロテインCから微
量のトロンビンを除去することができる(Thromb.Res.5
9,27-35(1990))。しかしこの方法にはウイルス不活化の
ための操作、あるいは血清アミロイドPを除去するため
の操作が含まれていない。
【0010】EP-A-0318201には、活性化プロ
テインCを単独で、あるいは血栓溶解的に活性な物質と
組み合わせて使用することによって、動脈血栓症または
血栓閉塞状態を防止し得ることが述べられている。活性
化プロテインCの抗血栓症活性は実施例によって立証さ
れている。
【0011】本発明の目的は、特に高純度の活性化プロ
テインCを含有する、最初に限定した種類の薬剤を提供
することにある。
【0012】
【課題を解決するための手段】本発明の薬剤は血清アミ
ロイドPおよび感染性物質を含有しないことを特徴とす
る。
【0013】本発明の薬剤はいかなる副反応も示さず、
血栓溶解療法は線維素原(フィブリノーゲン)の低下また
は出血を誘発しない。
【0014】本発明の薬剤は、特にLys-プラスミノーゲ
ンまたはウロキナーゼと組み合わせると、驚くほど良い
血栓溶解活性を有し、したがって血栓症を防止する能力
が高いことがわかった。
【0015】本発明は、活性化プロテインCの投与が血
栓溶解的に活性な酵素プラスミンの生物内での遊離に関
与し、したがって生体内での血栓溶解活性を増大させる
という発見に基づいている。したがって、本発明の薬剤
は血栓溶解剤としての使用に適している。さらに、その
血栓溶解活性が適用した投与量の関数であり、したがっ
て、使用する活性化プロテインCがトロンビン活性およ
び血清アミロイドPを含有しなければ、その至適活性を
示すこともわかった。
【0016】また本発明は、上述の薬剤を得る方法であ
って、次の手段: ・抗プロテインC抗体(任意に、感染性物質に対して不
活化したもの)によるアフィニティークロマトグラフィ
ーを用いてプロテインCを精製する; ・精製したプロテインCをトロンビンで活性化した後、
トロンビンを阻害する; ・イオン交換体を用いてクロマトグラフィー的に、活性
化プロテインCから血清アミロイドPおよび抗体を除去
する; ・非経口投与が可能な薬剤に加工する; の組み合わせを特徴とする方法に関する。
【0017】本発明の方法の好ましい態様は、感染性物
質を不活化するために少なくとも2つの手段を採用する
ことを特徴とする。
【0018】本発明の薬剤は、特に純粋な形態の活性化
プロテインCを含有する。抗トロンビンIII-ヘパリン複
合体の形態でトロンビン1単位当たり0.01〜0.1I
U抗トロンビンIIIを用いて、トロンビンを阻害し、次
いでその反応混合物からトロンビンを除去することが最
善の方法である。抗トロンビンIII-ヘパリン複合体はト
ロンビンに対して、抗トロンビンIII単独よりもかなり高
い親和性を有し、それゆえに活性化プロテインCからの
トロンビンの分離がより容易に実行できる。
【0019】微量のトロンビンを含有しないことに加え
て、ネズミ・タンパク質(抗体類)および血清アミロイド
Pもイオン交換体でのクロマトグラフィー精製を用いて
本発明の薬剤から除去されており、さらに本発明の薬剤
はウイルス不活化処理をいくつか組み合わせることによ
って、ウイルス安全(ウイルス感染の危険がない)である
と見なし得る。酵素原を得るために、既にウイルスを不
活化した出発物質(プロトロンビン複合体)をウイルス不
活化モノクローナル抗体でのアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いて精製することができる。トロンビンに
よる活性化の後、活性化プロテインCを再度ウイルス不
活化処理に付す。既知の不活化法(例えば、EP-A-0
159311、EP-A-0050061、EP-A-01
31740)を用いてヒト病原性微生物を不活化するこ
とができる。
【0020】トロンビンの阻害は抗トロンビンIII-ヘパ
リン複合体の添加によって達成することが有利である。
【0021】以下に、活性化プロテインCを含有する医
薬組成物の製造、ならびに動物モデル中で観測したその
血栓溶解活性について、より詳細に記述する。
【0022】
【実施例】実施例1プロテインCの製造 市販のプロトロンビン複合体濃縮物から得た粗プロテイ
ンC画分から、純粋なプロテインCを回収した。精製
は、モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマ
トグラフィーによって達成した。モノクローナル抗プロ
テインC抗体を次のように製造した。
【0023】BALB/Cマウスを、2週間間隔で腹腔
内注射することによりヒトプロテインC 100μgで免
疫化した。6週間後、ヒトプロテインCをさらに50μ
g注射し、その3日後に融合を実行した。骨髄腫細胞株
(P3-X-63-AG8-653、1.5x107細胞)を
1.7x108のマウス脾臓細胞と混合し、Kohlerおよび
Milesteinの改良法に従って、PEG1500を用いて
融合した(Kohler G.,Milestein C.,Nature 256(1975),4
95-497)。
【0024】ELISAを用いて検定した陽性クローン
を2回サブクローニングした。プリスタン(Pristan)処
理の2週間後、BALB/Cマウス1匹あたり5x10
6ハイブリドーマ細胞を注射することによって、腹水産
生を達成した。
【0025】硫酸アンモニウム沈殿後、QAE-セファ
デックスでクロマトグラフィーを行い、さらにセファデ
ックスG200でクロマトグラフィーを行うことによっ
て、腹水から免疫グロブリンを精製した。ネズミ・ウイ
ルスの伝染の危険性を減じるために、固定化に先立って
抗体をさらにウイルス不活化操作に付した。このように
して得たモノクローナル・プロテインC抗体をCNBr
-活性化セファロース4B(ファルマシア)に結合させ
た。アフィニティークロマトグラフィーによるプロテイ
ンCの精製には次の緩衝液を使用した。 吸着緩衝液:20mM Tris、2mM EDTA、0.2
5M NaCl、5mM ベンズアミジン; 洗浄緩衝液:20mM Tris、1M NaCl、2mM ベ
ンズアミジン、2mM EDTA、pH7.4; 溶出緩衝液:3M NaSCN、20mM Tris、1M
NaCl、0.5mM ベンズアミジン、2mM EDTA。
【0026】詳細:プロトロンビン複合体濃縮物を吸着
緩衝液に溶解した(モノクローナル抗体カラム20mlに
ついて約10gのプロトロンビン複合体濃縮物を使用し
た)。次いで、溶解したプロトロンビン複合体濃縮物を
濾過し、20000r.p.m.で15分間遠心分離し、0.
8μmフィルターを通して滅菌濾過した。溶解し滅菌濾
過したこのプロトロンビン複合体濃縮物を10ml/時間
の流量でカラムに添加した。次いで、このカラムを洗浄
緩衝液で洗浄することによりタンパク質を除去し、最後
に溶出緩衝液を5ml/時間の流量で流すことによって、
結合したプロテインCを溶出させ、その分画を集めた。
溶出したプロテインCを緩衝液(0.2mol/lTris、
0.15M グリシン、1mM EDTA、pH8.3)に対し
て透析した。プロテインC抗原濃縮物をLaurellが記述
した方法を用いて決定し、プロタック(Protac)活性化を
用いてプロテインC活性を決定した。
【0027】得られたプロテインC含有溶液を滅菌濾過
し、凍結乾燥し、80℃±5℃および1375±35mbar
で1時間蒸気処理することによってウイルスを不活化し
た。
【0028】実施例2活性化プロテインCの製造 精製したプロテインCの活性化を次のように行った:プ
ロテインC 10gを緩衝液(150mM NaCl、15mM
クエン酸ナトリウム、pH7.5)に6mg/mlの濃度
で溶解し、100mM NaClおよび10mM クエン
酸ナトリウム緩衝液に溶解したヒトウイルス不活化トロ
ンビン 14.4mgと共に37℃で3時間インキュベート
した。1200Uの抗トロンビンIII-ヘパリン複合体を
用いてこの反応を停止させた。
【0029】この後、Q-セファロースを用いて、活性
化プロテインCのさらなる精製を行った。この目的のた
めに、150mM NaClおよび15mM クエン酸ナトリ
ウム中で吸着を行い、1M NaCl溶液で溶出を実行し
た。
【0030】この溶出液を限外濾過し、滅菌濾過し、そ
れぞれ5mlの単位で滅菌的に充填し、凍結乾燥した。
【0031】5mlの体積に溶解する際、この調製物の組
成を次のようにした。
【表1】 タンパク質: 1.5mg/ml aPC(活性化プロテインC): 204U/ml(色素原
基質S2366(Kabi)のアミド加水分解に関して) NaCl: 150mM クエン酸ナトリウム: 15mM pH: 7.5
【0032】この調製物はプロテインCおよびトロンビ
ンに対する抗体を含有せず(免疫学的に決定した)、さら
に血清アミロイドPを含有しなかった(電気泳動的に決
定した)。
【0033】実施例3動物モデル ヒト活性化プロテインCの血栓溶解特性を、文献で知ら
れており、血栓溶解性物質を試験するための標準である
と考えられているモデルで評価した。D.Collenが198
3年に記述したモデルを、125I-フィブリノーゲンの代
わりに123I-フィブリノーゲンを用い、ガンマカメラ(E
lscint APEX 409AG,シングル・ピンホール・コリメータ
ー)を使用することによって改良した。
【0034】麻酔したウサギ・ハイプノルム(Hypnorm;
ジャンセン(Jansenn))の左頚静脈を露出させ、その顔面
枝中にカテーテルを固定した。約1.5cmの距離にわた
って頚静脈を圧搾した後、100μlの123I-フィブリ
ノーゲン-ウサギ血液混合物をカテーテルを通して添加
した。30分後、鉗子を除去した。aPCを大腿深静脈
を通して1時間注入した。ガンマカメラを123I-フィブ
リノーゲン血栓上の距離2cmに設置した。放射活性を2
時間測定し、連続的に記録した。その値を123I-フィブ
リノーゲンの減衰によって補正した。血栓溶解速度を血
栓中の放射活性の低下として表した。
【0035】それぞれの投与量群について4匹の動物を
用いた。1つの群は、ビタミン-K-依存性凝固因子の合
成を排除するために、クマリン(4-ヒドロキシクマリン
(シグマ)、5mg/kg i.v.9日間)で予備処置した。抗
凝固化動物中の血栓は正常な(即ち、非抗凝固化)ウサギ
の血液-フィブリノーゲン混合物によって形成させた。
【0036】aPCの注入は服量依存性の血栓溶解をも
たらした。即ち、80、150、200および500U
/kgはそれぞれ21、24、40および58%の血栓
溶解を誘発した。緩衝液で処理した動物は同じ2時間の
測定時間中に12%の溶解を示したに過ぎなかった。抗
凝固化動物は溶解耐性であり、400U/kgで18%よ
り高い溶解を示さなかった。これは、ビタミン-K-依存
性タンパク質(例えばプロテインS、プロテインZ、プ
ロトロンビン)がaPCの生体内での血栓溶解効果にと
って必要であることを立証している。
【0037】これらの結果を添付の図1にグラフ化して
表す。横座標は投与量(単位/kg)を表し、縦座標は血栓
溶解効果(溶解率(%))を表す。
【0038】aPCがaPCとt-PAの組み合わせよ
り静脈血栓の溶解に適していることが立証された。50
0単位aPC/kgおよび0.4mg t-PA/kgを投与し
たところ、約33%の溶解(aPCを単独で適用した場
合と比較して58%)しか観測できなかった。
【図面の簡単な説明】
【図1】 活性化プロテインCの生体内での血栓溶解活
性の投与量依存性を表す。横座標は投与量(単位/kg)を
表し、縦座標は血栓溶解効果(溶解率(%))を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12N 9/72 A61K 37/547 37/54 (72)発明者 アントン・フィラピィッチュ オーストリア、アー−2490エーベンフル ト、ハンス・クートリッヒガッセ5番 (72)発明者 ハンス・ペーター・シュヴァルツ オーストリア、アー−1180ヴィーン、シ ントレルガッセ32番 (56)参考文献 特表 昭60−501859(JP,A) 国際公開90/7524(WO,A1) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) CA(STN)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 非経口投与が可能な血栓溶解剤であっ
    て、プロテインCまたは活性化プロテインCに対する抗
    体ならびにトロンビン活性が混入していない活性化プロ
    テインCを含有し、血清アミロイドPおよび感染性物質
    を含有しない薬剤。
  2. 【請求項2】 ・精製プロテインCを得るために、抗プ
    ロテインC抗体によるアフィニティークロマトグラフィ
    ーを用いてプロテインCを精製すること; ・活性化プロテインCを得るために、該精製プロテイン
    Cをトロンビンで活性化し、次いで該トロンビンを阻害
    すること; ・血清アミロイドPおよび抗体を含有しないプロテイン
    Cを得るために、イオン交換体を用いてクロマトグラフ
    ィー的に該活性化プロテインCから血清アミロイドPお
    よび抗体を除去すること;および ・血清アミロイドPおよび抗体を含有しない該プロテイ
    ンCを加工することによって、非経口投与が可能な薬剤
    を得ること; の組み合わせからなる、非経口投与が可能な血栓溶解剤
    であって、プロテインCまたは活性化プロテインCに対
    する抗体ならびにトロンビン活性が混入していない活性
    化プロテインCを含有し、血清アミロイドPおよび感染
    性物質を含有しない薬剤の製造方法。
  3. 【請求項3】 さらに該抗プロテインC抗体を感染性物
    質に対して不活化することを含む請求項2の方法。
  4. 【請求項4】 感染性物質を不活化するために少なくと
    も2つの不活化法を適用する請求項3の方法。
  5. 【請求項5】 抗トロンビンIII-ヘパリン複合体を添加
    することによって該トロンビンを阻害する請求項2の方
    法。
  6. 【請求項6】 活性化プロテインCを活性成分とする静
    脈血栓溶解剤。
  7. 【請求項7】 Lys-プラスミノーゲンおよびウロキナー
    ゼの少なくとも1つならびに活性化プロテインCを活性
    成分とする静脈血栓溶解剤。
  8. 【請求項8】 患者に投与することにより患者の種々の
    血栓を溶解するための、有効量のプロテインCを含む請
    求項1に記載の薬剤。
  9. 【請求項9】 Lys-プラスミノーゲンおよびウロキナー
    ゼの少なくとも1つをさらに含む請求項8に記載の薬
    剤。
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