CN110612350A - 源自血液的谷氨酸-纤溶酶原的制备和使用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种分离Glu‑纤溶酶原的方法，所述方法对包括血浆或包含Glu‑纤溶酶原的血浆级分进行阴离子色谱交换。此外，本发明还涉及用本发明的方法获得的Glu‑纤溶酶原及其在治疗方面的用途。所述治疗用途是针对患有或有风险患有以下疾病的患者：器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)及其中两种或更多种的组合。

Description

源自血液的谷氨酸-纤溶酶原的制备和使用

本发明涉及一种分离Glu-纤溶酶原(谷氨酰胺纤溶酶原，Glu-plasminogen)的方法，所述方法包括将血浆或含Glu-纤溶酶原的血浆级分进行阴离子交换色谱。此外，本发明涉及可根据本发明的方法获得的Glu-纤溶酶原，及其在治疗器官衰竭，血栓形成，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)及其两种或更多种所述疾病的患者或有患所述疾病风险的人群。本发明的纤溶酶原也可以一般性地用于治疗患有获得性纤溶酶原缺陷的患者。这些患者可能会因此有出现器官衰竭的风险(例如，患者的肾脏，心脏，大脑，肝脏，肺，肌肉，排泄腺，内分泌腺，眼睛，骨骼等器官衰竭)。

器官衰竭是严重的威胁生命的病理状态。通常，多器官衰竭是由败血症，多发创伤和/或病毒疾病引起的，导致休克症状并引发组织因子的释放并最终产生凝血。多创伤性休克和手术可能导致组织损伤，恶性肿瘤转移释放，在败血症的情况下，白细胞增多。每种所述机制都可能启动组织因子的增强，并可能与血纤蛋白凝块的形成有关。如果纤维蛋白溶解不能平衡高凝倾向，则通常会导致多器官衰竭。Seitz等人报道了肾移植后纤维蛋白溶解受损和蛋白C增加。(Seitz R，Michalik R，Karges HE，Lange H，Egbring R.尸体肾脏移植后纤维蛋白溶解受损和蛋白C增加。《血栓研究》1986年5月1日；42(3)：277-88)。

患有多器官衰竭的患者可以使用多种不同的药物进行缓解以便尽快找到合适的治疗策略。

因败血症而导致多器官功能衰竭的患者通常接受抗生素治疗并预防血栓形成。在某些情况下，还可以通过器官特异性治疗来治疗患者，例如针对肾衰竭进行透析，对多器官缺陷进行手术(例如阑尾)，通气治疗以及针对具有全身血管作用的不同细菌和血管相关药物的抗感染治疗(儿茶酚胺，例如肾上腺素，去甲肾上腺素)，血流动力学稳定化和活化蛋白C(可选重组)和免疫球蛋白(例如IgG和IgM)。

这样的治疗具有严重的不良副作用。因此，已经考虑了通过天然蛋白酶抑制剂治疗血栓形成作用。当前关于血栓形成作用的护理标准不能通过使用天然蛋白酶抑制剂来改善纤维蛋白溶解。添加天然蛋白酶抑制剂，如抗凝血酶-III(主要抑制F.Xa和凝血酶)具有以下缺陷：现有的纤维蛋白凝块不受此类天然蛋白酶抑制剂的治疗影响。无法启动纤维蛋白溶解，导致多器官衰竭。

血栓形成的治疗通常是药物治疗。特殊情况下保留手术方式去除静脉血栓。为了防止血栓增大，寻求抗凝抑制作用。最初，使用肝素制剂或Xa因子抑制剂。当血块停止增长时，身体可以开始清除损伤。他分解了血块，试图再次使静脉畅通。这需要几周到几个月的时间-静脉系统受到的影响越大，时间越长。在凝块破裂和静脉再生中，物质被释放，这增加了血液的凝结性。在这段时间内，再次发生血栓形成的风险特别大。因此，通常避免使用其他抗凝药物。然后可以使用4-羟基香豆素(如苯丙香豆素，华法林或乙基双香豆素)约三至六个月。豆的使用通常需要定期进行血液检查并给予特别注意，因为该药物可防止血栓形成，但也会增加流血的意愿。最重要的是，由于抗凝疗法而导致的出血风险仍然是日常临床实践中尚未解决的问题。

通常在文献中描述了纤溶酶原的纯化方法(参见GB-A1305504)。

然而，该方法不能令人满意，特别是因为所获得的纤溶酶原不稳定，并且包含部分Lys-纤溶酶原。其他方法显示回收率相当差，并且无法清楚地区分Glu-纤溶酶，Glu-纤溶酶原和Lys-纤溶酶原(参见WO 2002/095019；US 5288489；Boi等人，Journal of MembraneScience，2015，475：71-79)。

两种抑制剂抗凝血酶III和肝素辅因子II可以平衡血液的凝结。形成的血纤蛋白凝块只能通过激活血纤蛋白溶解系统去除。纤溶系统的激活取决于纤溶酶的激活。人血浆包含多种激活形式的纤溶酶原，如Glu-纤溶酶原(天然)，Lys-纤溶酶原(略微活化)和纤溶酶。在健康个体中通过uPA，tPA激活天然Glu-纤溶酶原是一个关键机制(Stricker，RB；Wong，组织纤溶酶原激活剂对正常血小板和血栓性血小板的纤溶酶激活：对表面蛋白和血小板聚集的影响。《血液》1986，275–280页)。链激酶或尿激酶在治疗环境中用于在不同的血栓形成事件中实现溶栓作用(Kunamneni，A.；Durvasula，R:"链激酶-溶栓治疗药物：专利审查"。《心血管药物发现的最新进展》，2014，106–121页；Takada，Akakazu；Takada，Yumiko，"尿激酶激活Glu-纤溶酶原到Lys-纤溶酶的途径"，《血栓研究》1982，671-677页)。由于纤溶酶原(PLG)的活化导致纤溶酶开始，导致纤溶酶原(PLG)从纤溶酶裂解为纤溶酶[Wohl，R.C。在pH 7.4和37摄氏度下，不同激活剂对人纤溶酶原的激活动力学，《生物化学杂志》1980，S。2005–2013]。因此，已知三种不同的激活机制(Fredenburgh，J.C.；Nesheim，M.E.Lys-纤溶酶原是体外纤维蛋白溶解过程中激活Glu-纤溶酶原的重要中间体。《生物化学杂志》1992，26150–26156页)。纤溶酶原对内皮细胞和血纤蛋白凝块具有高结合亲和力。组织纤溶酶原激活物(tPA)的额外结合导致激活和纤溶酶形成。最后一种机制是通过纤溶酶原在细胞表面的结合来说明的，这种结合被tPA激活至纤溶酶(Stricker，R.B.；Wong，组织纤溶酶原激活物对正常和血栓性血小板的纤溶酶原的激活：对表面蛋白和血小板聚集的影响。《血液》1986，275-280页)。

激活的纤溶酶是纤溶系统中的关键酶。只要纤溶酶结合到血纤蛋白凝块基质上，它就不会被抑制剂α-2-抗纤溶酶(A2AP)抑制，但一旦被释放，纤溶酶会立即受到抑制。游离纤溶酶的半衰期非常短，仅为0.1秒。Glu-纤溶酶原和α-2-抗纤溶酶(A2AP)的半衰期则为50小时。相比之下，Lys78-纤溶酶原的半衰期仅为20小时(Fredenburgh，J.C.；Nesheim，M.E.："Lys-纤溶酶原是体外纤维蛋白溶解过程中激活Glu-纤溶酶原的重要中间体"。《生物化学杂志》1992，26150–26156页)。与胰蛋白酶相比，纤溶酶更选择性在赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧优先裂解。它将聚合的纤维蛋白转化为可溶性产物(Castellino，Francis J.；Ploplis，Victoria A.："纤溶酶原/纤溶酶系统的结构和功能"。《血栓形成和止血》，2005，647-654页。

中间分子Lys-纤溶酶原通常仅存在于人体内血纤蛋白凝块。Lys-纤溶酶原通常在从Glu-转化为Lys-纤溶酶原后直接转化为纤溶酶。因此，Lys-纤溶酶原是纤溶酶原的预活化形式，通常不会在人体中循环。

在人体中，可以测量到A2AP(α-2-抗纤溶酶)和PLG比例的变化，A2AP可减少70-80％而PLG可增加100％。人血清中的PLG浓度为约0.2g/L，纤溶酶原参考活性范围为0.75至1.60U/mL(Cederholm-Williams，S.："血浆和血清中纤溶酶原和抗纤溶酶的浓度"。《临床病理学杂志》1981，979–981页)。PLG的分子量为92kDa(Summaria，L.；Spitz，F.；L.Boreisha，I.G.；Robbins，K.C.："人Glu和Lys纤溶酶原和纤溶酶的亲和色谱形式的分离和表征"。《生物化学杂志》1976，3693-3699页)。在某些病理条件下，A2AP>PLG(平均比为1.26)会导致不可逆的病变。纤溶酶原的缺乏会导致血纤蛋白血块永久残留的危险，特别是在微脉管系统中。

如实施例部分所示，可以证明在疾病的不同状态下，患者呈现获得性纤溶酶原缺乏症。

在某些情况下，增加的α-2-抗纤溶酶浓度会抑制纤溶酶原的可选使用量。但是在其他情况下，α-2-抗纤溶酶的浓度对纤维蛋白溶解减少没有影响。这些患者已经用尽了大部分的纤溶酶原。由于缺乏产量，人体无法平衡由此产生的纤溶酶原的缺乏。凝血和纤溶系统之间的合理平衡转变为过度凝血。这也是为什么组织纤溶酶原激活剂的使用仅对30％的中风患者有所改善的原因。

概括起来，较早的研究表明，施用包含纤溶酶原的组合物通常可以改善患有血液中纤溶酶原的极低(总体)水平的患者的身体状况。纤溶酶原水平降低可能是由于该蛋白消耗量增加所致。例如，器官衰竭患者的血液中的纤溶酶原水平较低。对于具体原因不明的血浆纤溶酶原缺乏症，已经进行了Glu-纤溶酶原作为孤儿药(orphan drug status)的试验。

仅对遗传性纤溶酶原缺乏症，其达到了孤儿药的标准。有趣的是，这些患者在健康状态下没有高凝状态。对于这种适应症，纤溶酶原主要用于预防严重的、与全身粘膜上纤维沉积形成有关的临床症状，而与血栓形成事件无主要关联。

使用Glu-纤溶酶原作为治疗方法，多器官功能衰竭患者，包括因脑膜炎奈瑟氏菌引起的多发性皮肤坏死的患者，原则上可以得到康复，这说明其具有很高的生物药潜力。案例有从多发性皮肤坏死(沃特豪斯·弗里德里希森综合症)康复的4岁男孩(Egbring R，Seitz R，Blanke H，Leititis J，Kesper HJ，Burghard R，Fuchs G，LerchL："蛋白酶抑制剂复合物(抗凝血酶III-凝血酶，α-2-抗纤溶酶-纤溶酶和α-1-抗胰蛋白酶-弹性蛋白酶)在败血病，暴发性肝衰竭和心源性休克中的应用：

对DIC/F综合征的诊断和治疗控制具有重要意义"。贝林·米特研究所(BehringInst Mitt)，1986年2月；(79)：87-103)。脑膜炎奈瑟氏球菌患者的案例也说明通过Glu-纤溶酶原治疗得到的康复。

纤溶酶原治疗23天后，该患者得以幸存并不需接受重症监护。Wada等人(2002)也描述了弥散性血管内凝血(DIC)的缓解。(《重症监护杂志》，2014，2:15)。

令人惊奇地发现，Glu-纤溶酶原比成熟形式的Lys-纤溶酶原或纤溶酶具有明显更高的所需活性。然而，Glu-纤溶酶原的实用价值仍然受到其有限来源的限制。分离Glu-纤溶酶原的已知方法，例如级分方法，很少令人满意。

因此，需要有效的方法来获得和分离Glu-纤溶酶原，特别是可重复、大规模和大量地分离方法。

鉴于以上现实，获得和分离Glu-纤溶酶原的有效方法仍未满足的需求。纯化的Glu-纤溶酶原还可以为治疗患者提供进一步的治疗前景，例如治疗患有器官衰竭或有发展器官衰竭的风险的患者，并可以从血液成分中获得此类化合物。

Glu-纤溶酶原是人体血浆中的自然循环亚型。由于不同的分离和纯化过程，Glu-纤溶酶原可被裂解为Lys-纤溶酶原。在1982年，有人对血栓性疾病，遗传性纤溶酶原缺乏症进行了研究(Hasegawa D，Tyler B，Edson JR.："遗传性纤溶酶原缺乏症的三个家族的血栓性疾病"。《血液》1982；60：213a)。最初，许多研究人员试图用Lys-纤溶酶原注射液治疗这些患者，导致大量副作用，例如出血。患者出现腹股沟血肿，栓塞和肉眼可见的肉尿(Jean-Noel Fiessinger，1985，"动脉缺血性下肢动脉内尿激酶-Lys-纤溶酶原输注的并发症"。与天然存在的Glu-纤溶酶原相比，Lys-纤溶酶原形式具有另一种构象，并且对上皮细胞具有更高的亲和力。增加的亲和力导致Lys-纤溶酶原的非特异性结合。结合的分子直接转化为纤溶酶，纤溶酶切割上皮细胞。对于遗传性纤溶酶原缺乏症，其不良反应高于有益的治疗作用。随机和不精确的治疗效果导致了Lys-纤溶酶原的产品失败。

早期实验表明，静脉内注射纤溶酶会导致出血形式的严重不良反应。纤溶酶很少用于减少局部的血栓形成事件，例如在手术过程中(BIRD F，CLIFFTON EE.："人纤溶酶(纤维蛋白溶素)用于治疗急性脓肿")，《外科手术》，1957年7月；42(1)：249-55；MOSER KM.："纤溶酶(纤溶酶)静脉给药对人的效果"。《血液循环》1959年7月；20(1)：42-55)。然而，通过直接注射纤溶酶不可能解决微血栓形成事件。只有静脉注射Glu-纤溶酶原才能到达分支微循环中的微凝块。当Glu-纤溶酶原达到血纤蛋白微凝块时，Glu-纤溶酶原就被激活，纤溶酶可以溶解血栓。

很少的Lys-纤溶酶原就足以将其余的Glu-纤溶酶原转化为Lys-纤溶酶原并随之转化为纤溶酶。此外，由于敏感的自动激活机制，当一些分子转化为Lys-纤溶酶原时，Glu-纤溶酶原的产量就会大大降低。因此，正确地选择最佳且合理的纯化机制有着重大的后果。

令人惊讶地，在进行的实验中发现，可以容易地从血浆和血浆级分，特别是低温贫瘠血浆中获得Glu-纤溶酶原，并且可以用作治疗器官衰竭患者和高危人群的有效药物。

因此，本发明的第一方面涉及一种分离Glu-纤溶酶原的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供血浆或含Glu-纤溶酶原的血浆级分；

(ii)使血浆或血浆级分与基于含阳离子基团的树脂的阴离子交换剂接触；

(iii)用第一缓冲液B1洗涤从步骤(ii)获得的负载有血浆或血浆级分的阴离子交换剂，该第一缓冲液B1不含与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争的阳离子；

(iv)用第二缓冲液B2从步骤(iii)洗涤的阴离子交换剂上洗脱Glu-纤溶酶原，所述第二缓冲液B2包含与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争的阳离子，从而获得包含缓冲液B2和Glu-纤溶酶原的溶液；

(v)任选地，将由步骤(iv)获得的溶液的pH调节至所需范围内；

(vi)任选地，向步骤(iv)，(v)或(vii)中任何一个获得的溶液中，添加一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂以稳定Glu-纤溶酶原；

(vii)任选地，对步骤(iv)至(vi)中任一项的溶液进行一种或多种抗病毒处理；和

(viii)任选地，干燥或冷冻干燥从步骤(iv)或(vii)中的任何一个获得的包含Glu-纤溶酶原的溶液。

该方法能够从现有血浆级分方法获得的不同血浆级分中获得相当高产率的相当纯的Glu-纤溶酶原(基于所有多肽成分，通常纯度大于重量90％)。与本领域中已知的方法相比，本发明的方法能够获得增加的蛋白产量，最小化Glu-纤溶酶原的激活(即形成Lys-纤溶酶原或纤溶酶)，且具高的总体蛋白纯度。

本发明的方法可以整合到现有的血浆分离过程中。起始的血浆中间体包括低温贫瘠血浆(cryo-poor plasma)，Glu-纤溶酶原提取之后的液体可直接流入Cohn过程。此外，在Cohn过程之后得到的糊I+II+III(即I-III)或糊I+III(或分别是I+II+III或I+IIII)的废料级分也可以利用。

可以使用包含Glu-纤溶酶原的任何一个Cohn级分，例如糊I，糊I+III，糊I+II+III和几种中间体。最优选地，该方法对级分的处理不影响现有产品(例如IgG，白蛋白)的生产。经过纯化主要产品后，通常会将这些废料部分丢弃。挑战性的问题是如何保持Glu-纤溶酶原的形式并有可接受的蛋白质产量。主要的挑战是找到一种有收益的方法，产量高，产品稳定，且对Cohn或Kistler-Nitschmann所定义的典型血浆分离工艺的标准最少干预。

本发明的方法允许从各种纤溶酶级分中分离Glu-纤溶酶原，包括在本领域血浆级分分离程序中被认为是废料的级分。

如本文所用，在增加组合物中分离的Glu-纤溶酶原的含量时，"分离"在广义上可与"纯化"互换使用。它不一定是纯净的。然而，优选地，基于总蛋白重量，该方法的产物包含至少25％(w/w)的Glu-纤溶酶原。更优选地，该方法的产物包含至少50％(w/w)，甚至更优选至少70％(w/w)，甚至更优选至少80％(w/w)，特别是至少90％％(w/w)，基于总蛋白重量，Glu-纤溶酶原。

采用本发明的方法，通常会增加含Glu-纤溶酶原制剂的纯度。可以使用进一步的纯化步骤以进一步提高纯度。产品规格决定Glu-纤溶酶原高纯度的纯化。杂质(例如，在使用的血浆中，使用的血浆级分中，以及残留在产品中)可以包括如IgG，IgM，白蛋白和/或其他血浆蛋白。优选地，通过本发明的方法(基本上)可以除去活化的蛋白酶。优选地，基于蛋白质的总重量，最终产物中的Lys-纤溶酶原的含量相当低(例如，低于0.5％，优选低于0.1％，更优选低于0.05％，特别是低于0.01％)，特别是低到基本上不可检测。

通过本发明的方法获得的Glu-纤溶酶原也可以以Glu-纤溶酶原的形式稳定化(即，例如，(基本上)不转化为Lys-纤溶酶原的形式)。从Glu-到Lys-纤溶酶原很少的转化都会破坏产品的稳定性。最终产物中的(主要)杂质最优选为白蛋白，其可能导致更高的稳定性。

在一个优选的实施方案中，Glu-纤溶酶原在最终产物中具有至少95％或更高的纯度。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法进一步包括对从步骤(v)至(viii)中的任何一个获得的溶液进行渗滤的步骤，优选地对步骤(v)所获得的溶液进行渗滤，特别是其中所述的渗滤步骤是渗入甘氨酸缓冲液中。该步骤可用于提高Glu-纤溶酶原产品的稳定性。该步骤的产物可以是溶液，可以进一步经受步骤(v)至(viii)中的任何步骤，特别是步骤(vi)至(viii)中的任何步骤。

与现有技术相比，本发明的方法对获得的Glu-纤溶酶原产物的纯度和稳定性的提高，令人惊讶。

通过本发明的方法获得的纯化Glu-纤溶酶原可以优选地被渗滤(例如，在甘氨酸缓冲液中)。该附加步骤显示特别高稳定性的Glu-纤溶酶原产物，没有蛋白水解活性，没有聚集体，没有碎片，并且具有高的Glu-纤溶酶原产率。

术语"蛋白质"，"多肽"和"肽"在本发明中可以互换，最广义地理解为主要由氨基酸残基组成并包含至少二十个氨基酸残基通过酰胺键依次连接的任何化学实体。应该理解，本发明意义上的蛋白质可以含有或不含有一种或多种翻译后的修饰和/或与一种或多种非氨基酸残基/基团的缀合。蛋白质的末端可以任选地通过本领域已知的任何方式加帽，例如酰胺化，乙酰化，甲基化，酰化。

翻译后的修饰是本领域公知的，可以是但不限于脂化，磷酸化，硫酸化，糖基化，截短，氧化，还原，脱羧，乙酰化，酰胺化，脱酰胺，二硫键形成，氨基酸添加，辅因子添加(例如生物素化，血红素添加，类二十烷酸添加，类固醇添加)和金属离子，非金属离子，肽或小分子的络合以及硫化铁簇的添加。此外，任选地，辅因子，特别是环状单磷酸胍盐(cGMP)(但也可任选其它的，例如，ATP，ADP，NAD+,NADH+H+,NADP+,NADPH+H+，金属离子，阴离子，脂质等)，不论这些辅因子的生物学影响如何，都可以用来与蛋白质结合。

对于Glu-纤溶酶原，特别地糖基化可能有一定作用。本发明方法的一个优点是在纯化的产物中可以观察到两个Glu-纤溶酶原的糖基化模式。

就本发明而言，Glu-纤溶酶原可以是任何物种的Glu-纤溶酶原。优选地，Glu-纤溶酶原是人或哺乳动物来源的，特别是人Glu-纤溶酶原。Glu-纤溶酶原(即天然完整的人纤溶酶原)是具有多达24个二硫键的291个氨基酸残基的糖蛋白。

Glu-纤溶酶原包含单个N-连接的唾液酸化双触角聚糖。两个O-聚糖具有一个Galβ-1-3GalNAc核心，其在末端Gal处被α-2-3唾液酸化。另外的双唾液酸化形式具有第二个唾液酸残基，该残基以α-2-6键与GalNAc相连。在人纤溶酶原中，单和双唾液酸化形式的摩尔比为80:20。人纤溶酶原激活剂的最佳存在条件是37℃和pH7.4(Wohl，R.C.；Summaria，L.；Robbins，K.C.："在pH 7.4和37摄氏度下，不同激活剂激活人纤溶酶原的动力学"。《生物化学杂志》1980，2005–2013页)。血浆中PLG的浓度(2.2μM)超过血浆和组织液中受体的占有率的50％。PLG受体在细胞表面富集(37,000/血小板至多于10⁷个位点/内皮细胞)，且不仅限于一类分子。纤溶酶的分子量为83kDa(Robbins,K.C.；Boreisha,I.G.；Arzadon,L.；Summaria,L.:"NH₂末端为谷氨酸和赖氨酸形式的人纤溶酶原及其衍生的具有NH₂末端赖氨酸重链(A)的纤溶酶的理化性质"。《生物化学杂志》，1975，4044-4047页；Barlow,G.H.；Summaria,L.；Robbins,K.C.："在微克水平上对人纤溶酶原和纤溶酶的分子量研究"。《生物化学杂志》1969，1138–1141页)。游离纤溶酶的半衰期为0.1秒，而相应的抑制剂α-2-抗纤溶酶(A2AP)的半衰期则为2.6天。

众所周知，Glu-纤溶酶原可以裂解而成熟为Lys-纤溶酶原(通常在N末端裂解Glu-纤溶酶原的氨基酸残基Lys77)，成为Glu-纤溶酶(通常在氨基酸残基Arg561和Arg562之间裂解)，和成为(Lys-)纤溶酶(通常切割Glu-纤溶酶原N末端的氨基酸残基Arg561和Val562之间的氨基酸残基Lys77)。

组织纤溶酶原激活物(tPa)可促进Glu-纤溶酶原的氨基酸部分Lys77在N末端的切割。纤溶酶可以自动催化促进Glu-纤溶酶原的氨基酸部分Arg561和Val562之间的切割。

血浆(也称为"血浆"，"血浆"或"血液血浆"等)可从任何来源获得。例如，它可以从血液已经被去除的血液保存物中获得。血浆也可以从各种供应商商购获得。

在本发明的上下文中，特别是其步骤(i)和(ii)，术语"血浆级分"可以最广义地理解为与血浆分离的包含Glu-纤溶酶原的任何部分。本领域技术人员知道几种从血浆制备血浆级分的方法。一个众所周知的例子是基于冻融循环并逐渐增加溶液中乙醇浓度的Cohn工艺(也称为Cohn方法)。

将步骤(iv)获得的溶液的pH调节至所需范围的pH的步骤(v)可以是将步骤(iv)获得的溶液的pH调节至4.5至10.3的范围。

例如，将步骤(iv)获得的溶液的pH调节至所需范围的pH的步骤(v)可以是将步骤(iv)获得的溶液的pH调节至所需范围的pH。7到8，从4.5到5.5，从5.5到6.5，从6.5到7.3，从7.3到8.0，或从8.0到10.3。

在一个优选的实施方案中，步骤(v)将步骤(iv)获得的溶液的pH调节至7到8或4.5到5.5，特别是7到8，这是在生理范围内或附近的值。

在一个替代的优选实施方案中，步骤(v)将步骤(iv)获得的溶液的pH调节至4.5到5.5、5.5到6.5、6.5到7.3、7.3到8.0，或8.0到10.3。这样的pH值可以稳定Glu-纤溶酶原和任选的其他成分。

所述的任何溶液都可选地选择过滤。

应该理解，步骤(ii)-(viii)中的每一个可以可选地重复。

因此，本发明的一个优选实施例涉及的方法包括以下步骤：

(i)提供血浆或包含Glu-纤溶酶原的血浆级分；

(ii)使血浆或血浆级分与阴离子交换剂(其基于包含阳离子基团的树脂)接触；

(iii)用不含与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争的阳离子的第一缓冲液B1洗涤从步骤(ii)获得的负载有血浆或血浆级分的阴离子交换剂；

(iv)用第二缓冲液B2从步骤(iii)的洗涤的阴离子交换剂上洗脱Glu-纤溶酶原，所述第二缓冲液B2含有阳离子，其与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争，从而获得包含缓冲液B2和Glu-纤溶酶原的溶液；

(v)任选地将由步骤(iv)获得的溶液的pH调节至所需范围；

(vi)将一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂添加到从步骤(iv)，(v)或(vii)中获得的溶液中以稳定Glu-纤溶酶原；

(vii)使步骤(iv)至(vi)中任一项的溶液进行一种或多种抗病毒处理，特别是其中所述抗病毒处理为：

(vii-I)加入一种或多种去污剂，优选一种或多种选自Tween-20，Tween-80和Triton-X-100的去污剂，以及一种或多种其他抗病毒剂，例如磷酸酯，特别是磷酸三正丁酯；和

(vii-II)移去步骤(vii-I)的溶液；

(ii*)使由步骤(vii)获得的溶液与基于含有阳离子基团的树脂的阴离子交换剂接触；

(iii*)用第一缓冲液B1洗涤从步骤(ii*)获得的负载有血浆或血浆级分的阴离子交换剂，所述第一缓冲液B1不包含与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争的阳离子；

(iv*)用第二缓冲液B2从步骤(iii*)洗涤的阴离子交换剂上洗脱Glu-纤溶酶原，所述第二缓冲液B2包含阳离子，其与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争，从而获得包含缓冲液B2和Glu-纤溶酶原的溶液；

(vii)使步骤(iv)至(vi)中任一项的溶液进行一种或多种抗病毒处理，特别是其中所述抗病毒处理为：

(vii-III*)超滤，特别是纳滤；

(v*)任选地将由步骤(vii*)获得的溶液的pH调节至期望范围(如上所述，在一个优选的实施方案中，例如，pH为7到8或4.5到5.5，特别是7到8的范围内；

(vi*)任选地向从步骤(v*)获得的溶液中添加一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂以稳定Glu-纤溶酶原，特别是其中所述稳定剂选自抑肽酶，α-2-抗纤溶酶(A2AP)，D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-精氨酸氯甲基酮，小分子稳定剂及其组合；和

(viii)任选地干燥或冷冻干燥从步骤(vii*)，(v*)或(vi*)中的任何一个获得的含有Glu-纤溶酶原的溶液，特别是通过冷冻干燥。

除去溶液的子步骤(vii-I)中可以通过用任何合适的缓冲液洗涤来进行(vii-II)。示例性地，可以使用乙酸盐缓冲液(10-250mM乙酸盐，pH在5.4-7.4的范围)，例如pH5.75的25mM乙酸盐缓冲液。

在一个优选的实施方案中，血浆级分选自：

(a)冷冻贫瘠血浆(b)Cohn或Kistler-Nitschmann工艺的糊I+II+III或I+III的废料级分，或这些级分中的两种或全部三种的组合；和

(c)Cohn或Kistler-Nitschmann方法的糊I+II+III或糊I+III，或其任何含有Glu-纤溶酶原的级分或废料级分。

在一个更优选的实施方案中，血浆级分选自：

(a)低温贫瘠血浆，通常是血浆的上清液经过冷冻然后融化后获得的；和(b)Cohn或Kistler-Nitschmann工艺的糊I+II+III或I+III的废料级分，或这些级分中的两种或三种的组合。

在一个优选的实施方案中，血浆级分选自：

(a)低温贫瘠血浆，通常是血浆的上清液经过冷冻然后融化后获得的；和

(b)Cohn工艺的糊I+II+III或糊I+III的废料级分，或这些级分中的两个或全部三个的组合。

Cohn法的糊I+II+III(即I-III)或糊I+III的废料部分通常是级分I+II+III(即I-III)或I+III的糊状物相。

在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法是分离Glu-纤溶酶原的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供包含Glu-纤溶酶原的冷冻贫瘠血浆(包括其子级分)；

(ii)使所述冷冻贫瘠血浆与基于含有阳离子基团的树脂的阴离子交换剂接触；

(iii)用第一缓冲液B1洗涤从步骤(ii)获得的负载有冷冻贫瘠血浆的阴离子交换剂，所述第一缓冲液B1不包含与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争的阳离子；

(iv)用第二缓冲液B2从步骤(iii)洗涤的阴离子交换剂上洗脱Glu-纤溶酶原，所述第二缓冲液B2包含阳离子，其与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争，从而获得包含缓冲液B2和Glu-纤溶酶原的溶液；

(v)任选地将由步骤(iv)获得的溶液的pH调节至所需范围；

(vi)任选地向步骤(iv)，(v)或(vii)中任何一个获得的溶液中添加一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂以稳定Glu-纤溶酶原；

(vii)任选地使步骤(iv)至(vi)中任一项的溶液经受一种或多种抗病毒处理；和

(viii)任选地干燥或冷冻干燥从步骤(iv)或(vii)中的任何一个获得的包含Glu-纤溶酶原的溶液。

可以在本领域最广泛的意义上定义"冷冻贫瘠血浆"。术语"冷冻贫瘠血浆或低温贫瘠血浆(cryo poor plasma)"，"冷冻上清液(cryosupernatant)"，冷冻沉淀耗尽(cryoprecipitate depleted)”可以彼此互换使用。通常将其理解为从中除去了冷沉淀物的血浆，因此，是血浆的上清液经冷冻并随后解冻所得。

在一个优选的实施方案中，本发明方法的步骤(i)是提供包含Glu-纤溶酶原的血浆级分，其中所述血浆级分是糊I+III和/或糊I+II+III，或糊I+III的废糊，和/或经辛酸和(可选)三磷酸钙处理后的糊I+II+III。

在一个优选的实施方案中，本发明方法的步骤(i)是提供包含Glu-纤溶酶原的血浆级分，其中所述血浆级分是糊I+III和/或糊I+II+III经经辛酸(和可选的三磷酸钙处理)之后的沉淀。

在一个替代的优选实施方案中，本发明方法的步骤(i)提供包含Glu-纤溶酶原的血浆级分，其中所述血浆级分是糊剂I+III和/或糊剂I+II+III经辛酸和(可选)三磷酸钙处理后的上清液。

应当理解，糊I+III和糊I+II+III也可以从先前经历了冻融循环的产品(即，贫冷血浆)中获得。

此外，有可能从糊I+III和/或I-III以及任选地在辛酸和三磷酸钙处理后得到的废物级分中纯化Glu-纤溶酶原。级分I+II+III可以从纯化主要产物IgG的方法获得。在前面的步骤中，可以将糊的悬浮液溶解在乙酸盐缓冲液(10mM-250mM，pH 5.0-6.0)中。

随后，可以添加辛酸和三磷酸钙，并且可以在深度过滤步骤中将其除去。滤液可以用于IgG的进一步纯化步骤，而滤饼(废物级分)可以任选地再次洗涤。取决于具体的分级过程，特定的洗涤步骤可能会洗脱出Glu-纤溶酶原。可以调节pH值。然后，可以进行如上所述的本发明的方法，纯化Glu-纤溶酶原。

从糊I+III和/或从糊悬浮液I+II+III，也可以直接纯化Glu-纤溶酶原。Glu-纤溶酶原的产率略微降低(例如，大约为60至80μg/mL，在一示例中为73μg/mL)，相比之下，血浆浓度约是80至100μg/mL，在一示例中为90μg/mL。示例性地，获得的产率低于血浆浓度的0.5至0.9倍，优选0.6至0.8倍，特别是0.70至0.75倍。Glu-纤溶酶原的浓度可能高于废料级分中的浓度，后者通常<30μg/mL。因此，与废料级分相比，Glu-纤溶酶原浓度可以增加至少1.1倍，优选至少1.3倍，更优选至少1.7倍，甚至更优选至少2倍，特别是至少2.5倍。但是，使用废料级分有着显着的优势，在不影响蛋白质产品(例如IgG)的现有生产程序的情况下，额外地利用了原本被丢弃的蛋白质。这样便获得了一种新颖的纯化方法，可得到额外的新蛋白质产品。通常，可以从糊I+III，级分I+II+III和级分I+II+III的废料级分中分离出Glu-纤溶酶原。每个具体的Cohn或Kistler-Nitschmann工艺，其浓度可能不同。

原则上，阴离子交换剂可以是本领域已知的适合于蛋白质特别是Glu-纤溶酶原纯化的任何阴离子交换剂。

通常，采用承载树脂的柱(特别是色谱柱)作为固相。最典型地，树脂形成珠粒(大部分在微米大小尺寸的范围内)。

这样的珠粒可以是(基本上)球形珠粒，重均颗粒在1-1000μm，优选10-500μm，更优选20-200μm，甚至更优选50-150μm，甚至更优选60-120微米，特别是70至100微米。

可替代地，也可以使用固定式过滤器和整体式载体。可以使用任何固相，例如二氧化硅，陶瓷，多糖或其两种或更多种的组合。阴离子交换剂的树脂通常在其表面上带有阳离子基团或其盐以能够进行阴离子交换。在本发明的上下文中，这样的阳离子基团可以是能够与Glu-纤溶酶原进行阴离子交换而不会破坏Glu-纤溶酶原的任何阳离子基团。优选的树脂具有高粘合能力，坚固的材料和高流速的可用性。优选地，阴离子交换剂(基本上)不修饰Glu-纤溶酶原，特别是不导致其转化为Lys-纤溶酶原。此外，优选地，阴离子交换剂的使用不会增加蛋白水解活性。

在一个优选的实施方案中，阴离子交换剂树脂带有氨基或其盐，优选伯氨基或其盐。

在一个优选的实施方案中，阴离子交换剂树脂带有氨基或其盐，优选伯氨基或其盐，更优选地，带有结构为-R-NH₂或-R-NH₃++A-的基团，其中R是有机基团，其不超过二十个碳原子，优选选自支链或直链的C₁-C₁₀(杂)亚烷基残基，支链或直链的C₁-C₁₀(杂)亚烯基残基，支链或直链的C₁-C₁₀(杂)亚炔基残基，C₄-C₁₀(杂)亚环烷基残基，C₄-C₁₀(杂)芳族残基，其中所有这些残基可任选地被一个或多个上述残基取代，和A^-是抗衡离子，特别是其中阴离子交换剂带有赖氨酰基。

在一个更优选的实施方案中，阴离子交换剂的树脂带有结构部分-R-NH₂或-R-NH₃ ⁺+A^-，其中R是C₁-C₁₀亚烷基残基，A^-是阴离子抗衡离子。在特别优选的实施方案中，阴离子交换剂带有赖氨酰基。赖氨酰基可以是L-赖氨酰基或D-赖氨酰基，特别是L-赖氨酰基。

优选地，本发明的方法也是一种用于降低Glu-纤溶酶原的蛋白水解活性的方法。

阴离子交换剂可以具有任何结合能力。在一个优选的实施方案中，阴离子交换剂具有>0.1mg纤溶酶原/mL树脂的结合能力，优选>0.2mg纤溶酶原/mL树脂，更优选>0.5mg纤溶酶原/mL树脂，甚至更优选>1.0mg纤溶酶原/mL树脂，特别是>1.5mg纤溶酶原/mL树脂。

所使用的树脂可以具有高的可压缩性，特别是当固相基于陶瓷时。因此，在一个优选的实施方案中，阴离子交换剂的固相基于陶瓷。例如，结合至陶瓷珠的赖氨酸残基可以用作阴离子交换剂。当使用高密度的配体(例如，基于赖氨酸残基)时，可以实现柱的快速填充，这可以在几分钟内完成。

例如，可以使用赖氨酸Hyper-D亲和层析吸附剂(可从美国Pall商购获得)作为阴离子交换树脂。Hyper-D树脂相当坚硬，可以使用高流速而不会增加压力或树脂的收缩或溶胀。此外，由于高粘合力，这种树脂的特性可使生产率增高。优选地，粘合力不过高，以便避免Glu-纤溶酶原难于洗脱并避免蛋白水解激活机制。

也可以使用其它适合于纤溶酶和纤溶酶原的阴离子交换剂，例如GB-A1305504，WO2002/095019或Boi等人(Journal of Membrane Science，2015，475：71-79)所公开的阴离子交换剂。

在一个替代的优选实施方案中，阴离子交换剂的固相基于多糖或多糖的组合。在一个更优选的实施方案中，阴离子交换剂的固相基于琼脂糖凝胶。例如，结合到琼脂糖珠上的赖氨酸部分可以用作阴离子交换剂。琼脂糖通常是基于部分交联的琼脂糖。它可以含有约1至10％的交联琼脂糖，优选2至5％的交联琼脂糖，特别是约4％的交联琼脂糖。例如，ECH-快速流动赖氨酸琼脂糖4(ECH-Lysine Sepharose 4Fast Flow，源自英国GEHealthcare)可以用作阴离子交换树脂。该树脂基于4％的交联琼脂糖，因此能够快速处理大量样品。

可以使用任何流速。例如，可以使用10至5000cm/h，优选20至1000cm/h，更优选50至500cm/h，特别是至少200cm/h的流速。

在步骤(i)中，将血浆或血浆级分的进料体积进料到柱中。在一个优选的实施方案中，在步骤(i)中，5至50个柱体积(columnvolumes，CV)，优选8至25CV，更优选10至22CV，甚至更优选15至21CV，特别是(约)20CV的血浆或血浆级分用作进料。

优选地，Glu-纤溶酶原与阴离子交换剂之间的接触时间相当短。在一个优选的实施方案中，Glu-纤溶酶原与阴离子交换剂之间的接触时间为1至60分钟，优选为2至45分钟，更优选为3至30分钟，甚至更优选为5至20分钟，甚至更优选在7至15分钟，特别是大约10分钟。该接触时间也可以定义为Glu-纤溶酶原分子通过色谱柱所需要的时间。

基于接触时间，本发明方法中使用的(线性)流速，特别是当使用5-25cm的柱高时，可优选10cm/h至100cm/h，更优选在20cm/h至80cm/h，甚至更优选在30cm/h至50cm/h，特别是在41cm/h至46cm/h。

应该理解，抗衡离子A-可以是适合于该目的的任何阴离子。通常，抗衡离子的分子量将低于500Da。优选地，抗衡离子A-是药学上可接受的。优选但非必须地，抗衡离子A-选自氯离子，磷酸根，磷酸氢根，磷酸二氢根，硫酸根，羟基，碳酸根和碳酸氢根。通常将抗衡离子A^-包含在与之一起冲洗色谱柱的缓冲液中。抗衡离子A^-不应与-R-NH₃ ⁺牢固结合，以便能够快速交换阴离子，即与Glu-纤溶酶原的阴离子基团。

在一个优选的实施方案中，在使血浆或血浆级分在步骤(ii)与阴离子交换剂接触之前，进行附加步骤：

(o)用缓冲液平衡阴离子交换剂，所述缓冲液的pH在6至8范围内，特别是在6.5至pH 7.4范围内。

缓冲液B1和/或缓冲液B2的缓冲剂可以以任何浓度使用。优选地，缓冲液B1和/或缓冲液B2中缓冲剂的浓度彼此独立地在0.1mM至1M的范围内，优选在1mM到0.5M的范围内，特别是在0.01到0.1M的范围内。应该理解，即使在B1和B2中可以使用相当的浓度和/或pH值，两种缓冲液也可以包含相同或不同的缓冲剂和可选的其他成分。

缓冲液B1和/或缓冲液B2的缓冲剂可以具有任何导电性。优选地，缓冲剂B1和/或缓冲剂B2的电导率彼此独立地在低于500mS/cm，优选低于200mS/cm，更优选低于100mS/cm，甚至更优选0.1至50mS/cm，甚至更优选0.2至20mS/cm，甚至更优选为0.5至15mS/cm，甚至更优选为1至10mS/cm，特别是大约5mS/cm。

示例性地，pH 6.6的磷酸盐缓冲盐水(PBS)可用于该平衡步骤。在一个特别优选的实施方案中，0.05M磷酸盐缓冲液(pH 6.6)可用于该平衡步骤。

缓冲液B1和B2的pH可以，在Glu-纤溶酶原可接受的范围内(特别地，不分解其酰胺键)，彼此独立地选择。应该理解，所使用的缓冲液的pH可以适合于所选择的柱的树脂。特别地，当使用包含伯氨基的树脂时，pH优选在碱性范围内。

在一个优选的实施方案中，第一缓冲液B1的pH为7.1至11.5，优选为8.5至11，特别是10至11的pH。在另一个优选的实施方案中，第二缓冲液B2的pH为7.1至11.5，优选8.5至11，特别是10至11。因此，在优选的实施方案中，第一缓冲液B1和/或第二缓冲液B2是碱性缓冲液，pH为7.1至11.5，优选8.5-11，特别是10-11。第一缓冲液B1和/或第二缓冲液B2的pH可以相同或不同。优选地，缓冲液B1和B2的pH差小于ΔpH2，更优选小于ΔpH1，甚至更优选小于ΔpH0.5，特别是不大于ΔpH0.3或(基本)相等。优选该步骤，有利于洗脱(高度纯化的)Glu-纤溶酶原产物并获得＞80％的产率。

因此，在一个优选的实施方案中，该方法实现了>80％，优选>85％，特别是>90％的Glu-纤溶酶原的产率(基于血浆或血浆级分中Glu-纤溶酶原的初始量)。

优选但非必须地，缓冲液B1和B2的组成(除了存在与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争的阳离子外)基本上相同。优选地，缓冲液B1包含0.01至0.1M(优选0.03至0.07M，特别是0.05M)的乙酸钠。示例性地，缓冲液B1可以包含0.01至0.1M(优选0.03至0.07M，特别是0.05M)的乙酸钠和0.01至0.1M(优选0.03至0.07M，特别是0.05M)的甘氨酸，并且可以调节pH到8.5至11的范围内(优选10至11，特别是pH 10.3)。

优选地，缓冲液B2包含0.01至0.1M(优选0.03至0.07M，特别是0.05M)的乙酸钠。示例性地，缓冲液B2可包含0.01至0.1M(优选0.03至0.07M，特别是0.05M)的乙酸钠和0.01至0.1M(优选0.03至0.07M，特别是0.05M)的甘氨酸和0.01至0.05M(优选0.02和0.03M，特别是0.025M)赖氨酸，并且可以调节pH到8.5至11范围内(优选10至11，特别是pH 10.5)。

如前所述，第二缓冲液B2包括的阳离子(竞争性阳离子CC，即抗衡离子)，其与阴离子交换剂的阳离子基团竞争。原则上，这可以是任何阳离子，只要其能够与阴离子交换剂树脂的阳离子竞争与Glu-纤溶酶原的离子相互作用。

在一个优选的实施方案中，为了能够与阴离子交换剂的树脂进行特别有利的竞争，缓冲液B2中使用的竞争性阳离子CC具有与阴离子交换剂的树脂相似的化学和物理化学性质。因此，对于缓冲液B2中使用的竞争性阳离子CC，本领域技术人员将优选根据所采用的树脂进行合适的选择。

因此，鉴于上述情况，在一个优选的实施方案中，第二缓冲剂B2包含可溶性胺或其盐，优选伯C₁-C₁₀胺或其盐，特别是赖氨酸或其盐，作为阳离子与阴离子交换剂的阳离子基团竞争。所述阳离子(阳离子竞争剂，例如赖氨酸或其盐)的浓度可以根据该方法的离析物进行合适的选择。

在一个优选的实施方案中，阳离子(阳离子竞争剂，例如赖氨酸或其盐)的浓度在0.001mol/L至1.0mol/L的范围内，优选0.01mol/L至0.1mol/L，更优选0.01mol/L至0.15mol/L，甚至更优选0.01mol/L至0.05mol/L，甚至更优选0.02mol/L至0.04mol/L，特别是(大约)0.025mol/L(即25mmol/L)。

在步骤(v)中，可以通过任何方式对步骤(iv)获得的溶液的pH调节至所需的范围(例如7至8)。任选地，通过添加柠檬酸来调节pH。示例性地，可以将pH调节至7.5。或者，可通过添加酸性酸(acidic acid)将pH调整到5.0至6.0或6.0至7.5。步骤(vi)所用的稳定剂可以是任何化学实体，只要能防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原即可。优选地，稳定剂可以(立即)捕获已转化的纤溶酶分子，以避免这些分子进一步活化纤溶酶原分子。优选地，在人体服用Glu-纤溶酶原产物后，所含的稳定剂对人体没有负面影响。特别地，稳定剂是无毒的，并且特别优选是药学上可接受的。

在一个优选的实施方案中，步骤(vi)的稳定剂是天然稳定剂。因此，稳定剂不是人工合成的。特别地，本领域已知的所有能稳定Glu-纤溶酶原的稳定剂均适用于本发明。

在一个优选的实施方案中，步骤(vi)的稳定剂选自抑肽酶，α-2-抗纤溶酶(A2AP)，D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-精氨酸氯甲基酮，小分子稳定剂及其组合。在一个更优选的实施方案中，步骤(vi)的稳定剂选自抑肽酶，α-2-抗纤溶酶，D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-精氨酸氯甲基酮及其组合。替代地或另外地，丝氨酸蛋白酶抑制剂，甘油和/或一种或多种碳水化合物或其衍生物也可以用作稳定剂。例如，碳水化合物可以选自单糖(例如葡萄糖，果糖，岩藻糖，木糖，阿拉伯糖，甘露糖，半乳糖，山梨糖)，二糖(例如蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，乳糖，木糖，杜兰糖，海藻糖，蜜二糖)，三糖(例如松三糖，棉子糖)以及寡糖和多糖(例如葡聚糖，淀粉，纤维素，琼脂糖)。可以使用的碳水化合物还可以是Hawke和Lea所述的用于稳定lipovitelllinIII的碳水化合物(Biochem.J.1953Jun；54(3)：475-9)和Zimmermann所述的用于稳定生物体的碳水化合物(J.Bacteriol.,1962，84：1297-1302)。碳水化合物衍生物可以是例如其酰化(例如，乙酰化，甲酰化)或硫酸化的形式，例如，羟丙基甲基纤维素(HPMC，羟丙甲纤维素)，羟甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟甲基淀粉，羟乙基淀粉或其中两个或多个的组合。

可以使用任何浓度的稳定剂。但该浓度应该适当，以避免Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原。

例如，抑肽酶(任选地重组的)的使用浓度可以是0.1至50μg/mL，特别是以0.5至35μg/mL。

例如，抑肽酶(可选地重组的)的使用浓度可以是30μg/mL，6μg/mL，2μg/mL或0.6μg/mL。优选地，抑肽酶(可选地重组的)的使用浓度范围为每微克Glu-纤溶酶原1ng至1μg，更优选10ng至0.75μg，特别是0.016至0.48μg。

例如，人白蛋白的使用浓度可以是0.1μg/mL至100mg/mL，优选1μg/mL至50mg/mL，更优选5至20mg/mL，特别是0.01至10mg/mL。优选地，白蛋白的使用浓度范围为每微克Glu-纤溶酶原1ng至1μg，更优选10ng至25μg，特别是0.2μg至15μg。

pH和缓冲液组成可能会影响Glu-纤溶酶原中间产物的稳定性。

在优选的实施方案中，在一个额外的步骤中，可以将Glu-纤溶酶原产物渗滤到另一缓冲液中。优选地，该另外的缓冲液可以选自磷酸盐缓冲剂，柠檬酸盐缓冲剂，甘氨酸缓冲剂及其两种或更多种的组合。更优选地，该另外的缓冲液可以选自pH6.6-8.0的0.005-0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.0-7.4的0.005-0.1M柠檬酸盐缓冲液和pH4.5-5.5的0.01-0.1M甘氨酸缓冲液，及其两个或多个的组合。

与其他纯化方法相比，本发明的纯化方法令人惊讶地获得了更高稳定性的Glu-纤溶酶原产品。

如上所述，可以对步骤(iv)至(vi)中任一个获得的溶液进行抗病毒处理。在医学上，这可能会提高纯化的Glu-纤溶酶原的可用性，因为从血液获得的产品中病毒污染是一个问题。可以采用本领域已知的任何抗病毒处理方法。

在一个优选的实施方案中，对步骤(iv)至(vi)中任一个获得的溶液进行步骤(vii)的抗病毒处理，其中所述抗病毒处理选自：

(vii-a)加入一种或多种去污剂，优选一种或多种选自Tween-20，Tween-80和Triton-X-100的去污剂；

(vii-b)添加一种或多种其他抗病毒剂，例如磷酸酯，特别是磷酸三正丁酯(TnBP)；

(vii-c)超滤，特别是纳滤；

(vii-d)前述中的两个或多个的组合；和

在添加一种或多种去污剂(或溶剂去污剂(SD))之后(步骤vii-a)，除去所述去污剂，优选通过特定的SD-去除树脂和/或阴离子交换剂。优选地，所述去除洗涤剂的方法(基本上)对Glu-纤溶酶原没有影响，并且不对Glu-纤溶酶原进行任何修饰。优选地，在进行第二次去除病毒步骤之前基本上去除(如捕获)去污剂。

示例性地，可以使用0.1-5％(w/v)，优选0.5-1.5％(w/v)，特别是1％(w/v)的吐温20。示例性地，可以使用0.1至0.5％(w/v)，优选0.2至0.4％(w/v)，特别是0.3％(w/v)的TnBP。示例性地，可以使用0.1％至5％(w/v)的Tween-20和0.1％至0.5％(w/v)的TnBP的组合。特别地，可以使用1％(w/v)Tween-20和0.3％(w/v)TnBP的组合。

作为上述任何抗病毒处理的补充或替代，可以对步骤(iv)至(vii)中的任何一个获得的溶液或由步骤(viii)获得的固体用紫外线照射，从而(基本上)达到无菌(sterilized)。在一个优选的实施方案中，作为附加的抗病毒去除步骤，对其进行纳滤(nanofiltration)。

在一个非常优选的实施例中，该方法包括以下步骤：

(i)提供血浆或包含Glu-纤溶酶原的血浆级分；

(ii)使血浆或血浆级分与阴离子交换剂接触，所述阴离子交换剂接触基于带有结构基团-R-NH₂或-R-NH₃ ⁺+A^-的树脂，其中R为C₁-C₁₀亚烷基，A^-为阴离子抗衡离子，特别是赖氨酰基残基；

(iii)用第一缓冲液B1洗涤从步骤(ii)获得的负载有血浆或血浆级分的阴离子交换剂，所述第一缓冲液B1的pH为8.5至11，其中不包含可以与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争的阳离子；

(iv)用第二缓冲液B2从步骤(iii)的洗涤过的阴离子交换剂上洗脱Glu-纤溶酶原，所述第二缓冲液B2的pH为8.5至11，并含有伯C₁-C₁₀胺或其盐，特别是赖氨酸或其盐，其与阴离子交换剂的氨基竞争，从而获得包含Glu-纤溶酶原的溶液；

(v)将步骤(iv)获得的溶液调节至所需的pH范围(例如，pH在7至8或4.5至5.5的范围内，特别是在7至8的范围内)；

(vi)向步骤(iv)，(v)或(vii)中任何一个获得的溶液中添加一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂，用以稳定Glu-纤溶酶原，特别是所述稳定剂选自抑肽酶，α-2-抗纤溶酶，D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-精氨酸氯甲基酮，小分子稳定剂及其组合；和

(vii)对步骤(iv)至(vi)中任一项的溶液进行抗病毒处理，特别是其中所述抗病毒处理为：

(vii-I)在其中加入一种或多种去污剂，优选一种或多种选自Tween-20，Tween-80和Triton-X-100的去污剂，以及一种或多种其他抗病毒剂，例如磷酸酯，特别是磷酸三正丁酯；

(vii-II)除去步骤(vii-I)加入的溶液，从而除去一种或多种去污剂(或溶剂去污剂(SD))；和

(vii-III)超滤，特别是纳滤；和

(viii)任选地干燥或冷冻干燥从步骤(iv)或(vii)中获得的包含Glu-纤溶酶原的溶液，特别是冷冻干燥。

优选地，缓冲液B1和B2如上文以及在实施例部所定义，特别是关于它们的浓度和/或其电导率。

此外，可以使用一种或多种稳定剂，其用量如上文以及在实施例部所定义。

任选地，可以用从步骤(v)-(vii)中任何一个获得的任何溶液重复进行步骤(ii)-(iv)。这里，可以使用与上述相同的条件或其他的条件。同样，所有其他步骤也可以重复进行。这可以示例性地按如下所述进行：

在一个特别优选的实施例中，该方法包括以下步骤：

(i)提供血浆或包含Glu-纤溶酶原的血浆级分；

(ii)使血浆或血浆级分与阴离子交换剂接触，所述阴离子交换剂接触基于带有结构基团-R-NH₂或-R-NH₃ ⁺+A^-的树脂，其中R为C₁-C₁₀亚烷基，A^-为阴离子抗衡离子，特别是赖氨酰基残基；

(iii)用第一缓冲液B1洗涤从步骤(ii)获得的负载有血浆或血浆级分的阴离子交换剂，所述第一缓冲液B1的pH为8.5至11，其中不包含可以与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争的阳离子；

(iv)用第二缓冲液B2从步骤(iii)的洗涤过的阴离子交换剂洗脱Glu-纤溶酶原，所述第二缓冲液B2的pH为8.5至11，所述第二缓冲液B2包含C₁-C₁₀伯胺或其盐，特别是赖氨酸或其盐，其与阴离子交换剂的氨基竞争，从而获得包含Glu-纤溶酶原的溶液；

(v)调节步骤(iv)获得的溶液的pH至期望的范围内；

(vi)向步骤(iv)，(v)或(vii)中任何一个获得的溶液中添加一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂，用以稳定Glu-纤溶酶原，特别是所述稳定剂选自抑肽酶，α-2-抗纤溶酶，D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-精氨酸氯甲基酮，小分子稳定剂及其组合；和

(vii)对步骤(vi)的溶液进行抗病毒治处理，特别是其中所述抗病毒处理为：

(vii-I)加入一种或多种去污剂，优选一种或多种选自Tween-20，Tween-80和Triton-X-100的去污剂，以及一种或多种其他抗病毒剂，例如磷酸酯，特别是磷酸三正丁酯；和

(vii-II)除去步骤(vii-I)的溶液；和

(ii*)使由步骤(vii)获得的溶液与与阴离子交换剂接触，所述阴离子交换剂接触基于带有结构基团-R-NH₂或-R-NH₃ ⁺+A^-的树脂，其中R为C₁-C₁₀亚烷基，A^-为阴离子抗衡离子，特别是赖氨酰基残基；

(iii*)用pH 8.5至11的第一缓冲液B1洗涤从步骤(ii*)获得的负载Glu-纤溶酶原的阴离子交换剂，所述第一缓冲液B1不包含能与阴离子树脂的阳离子基团竞争的阳离子；

(iv*)用第二缓冲液B2从步骤(iii*)的洗涤过的阴离子交换剂洗脱Glu-纤溶酶原，所述第二缓冲液B2的pH为8.5至11，并包含伯C₁-C₁₀胺或其盐，特别是赖氨酸或盐，其与阴离子交换剂的氨基竞争，从而获得包含Glu-纤溶酶原的溶液；

(vii*)对步骤(iv)至(vi)中任一项的溶液进行抗病毒处理，特别是其中所述抗病毒处理为：

(vii-III*)超滤，特别是纳滤；和

(v*)任选地将由步骤(vii*)获得的溶液的pH调节至所需的范围(例如，pH在7至8或4.5至5.5的范围内，特别是在7至8)；

(vi*)任选地向从步骤(v*)获得的溶液中添加一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂以稳定Glu-纤溶酶原，特别是其中所述稳定剂选自抑肽酶，α-2-抗纤溶酶，D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰-精氨酸氯甲基酮，小分子稳定剂及其组合；和

(viii)任选地干燥或冷冻干燥从步骤(vii*)，(v*)或(vi*)中的任何一个获得的、含有Glu-纤溶酶原的溶液，特别是冷冻干燥。

优选地，缓冲液B1和B2在每次出现时都如上文所定义，尤其是关于其浓度和/或电导率。

在一个特别优选的实施例中，本发明的方法包括以下步骤：

(i)含Glu-纤溶酶原的血浆级分，选自：

(a)冷冻贫瘠血浆，其通常是血浆的上清液经过冷冻然后融化后获得的；和

(b)Cohn或Kistler-Nitschmann工艺产生的糊I+II+III(也称为I-III)或I+III的废料级分，或这些级分中的两种或全部三种的组合，特别是Cohn或Kistler-Nitschmann工艺产生的糊I+III或糊I+II+III的废料级分；

(ii)使血浆或血浆级分与阴离子交换剂接触，所述阴离子交换剂是基于带有结构为-R-NH₂或-R-NH₃++A-基团的树脂，其中R为C₁-C₁₀亚烷基，A^-为阴离子抗衡离子，特别是赖氨酰基残基；

(iii)用浓度为0.01至0.1M、pH为8.5至11的第一缓冲液B1洗涤步骤(ii)获得的负载有血浆或血浆级分的阴离子交换剂，其中所述第一缓冲液B1不包含能与阴离子交换剂树脂的阳离子基团竞争的阳离子；

(iv)用浓度为0.01至0.1M、pH为8.5至11的第二缓冲液B2从步骤(iii)洗涤过的阴离子交换剂洗脱Glu-纤溶酶原，其中所述第二缓冲液B2包含C₁-C₁₀伯胺或其盐，特别是赖氨酸或其盐，其与阴离子交换剂的氨基竞争，从而获得包含Glu-纤溶酶原的溶液；

(v)调节步骤(iv)获得的溶液的pH至期望范围内；

(vi)向从步骤(iv)，(v)或(vii)中任何一个获得的溶液中添加一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂以稳定Glu-纤溶酶原，所述稳定剂选自抑肽酶，α-2-抗纤溶酶，D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-精氨酸氯甲基酮，小分子稳定剂及其组合；和

(vii)任选地对步骤(vi)的溶液进行抗病毒处理。

在一个优选的实施方案中，可以在洗脱Glu-纤溶酶原的步骤(iv)之后进行阴离子交换剂的再生。这可以通过使阴离子交换剂与含有NaOH或KOH的水溶液接触来实现。例如，为此目的可以使用0.2至1.5M NaOH，更优选0.5至1M NaOH。最优选地，可以使用0.1M NaOH和0.1M HCl。这可能延长各个阴离子交换剂的使用寿命。

应当理解，从本发明方法获得的Glu-纤溶酶原特别纯净，并且可良好地用于多种应用，特别是在治疗疾病方面。

因此，本发明的另一方面涉及可用本发明方法获得的Glu-纤溶酶原。

应当理解，在以上必要的变通方法的上下文中提供的定义和/或优选实施方案同样适用于根据本发明的Glu-纤溶酶原。

纯化的天然存在的蛋白质Glu-PLG与人体内的纤溶酶原具有相同的理化和生物学特性。体内物理化学和生物学性质在本文中有更详细地描述。

用本发明的方法获得的Glu-纤溶酶原也可以在冷冻，深度冷冻或冷冻干燥的状态下制备和/或储存，然后可以在低于冰点的任何温度下储存，例如，在-35°，-80℃或在液氮中。

在一个优选的实施方案中，将根据本发明的Glu-纤溶酶原冷冻干燥(也称为冻干)。冷冻干燥的粉末也可以在环境温度下存储。

在冻干步骤中，可以存在一种或多种稳定和保护Glu-纤溶酶原的试剂。这可以是如上所述的稳定剂，一种或多种碳水化合物或其衍生物。例如，可以存在碳水化合物或其衍生物和/或甘油。

碳水化合物可以例如选自单糖(例如葡萄糖，果糖，岩藻糖，木糖，阿拉伯糖，甘露糖，半乳糖，山梨糖)，二糖(例如蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，乳糖，木糖，杜兰糖，海藻糖，蜜二糖)，三糖(例如松三糖，棉子糖)以及寡糖和多糖(例如葡聚糖，淀粉，纤维素，琼脂糖)。可以使用的碳水化合物还可以是Hawke和Lea所述的用于稳定lipovitelllin III的碳水化合物(Biochem.J.1953Jun；54(3)：475-9)和Zimmermann所述的用于稳定生物体的碳水化合物(J.Bacteriol.,1962，84：1297-1302)。碳水化合物衍生物可以是例如其酰化(例如，乙酰化，甲酰化)或硫酸化的形式，例如，羟丙基甲基纤维素(HPMC，羟丙甲纤维素)，羟甲基纤维素，羟乙基纤维素，羟甲基淀粉，羟乙基淀粉或其中两个或多个的组合。

如上所述，本发明的方法能够获得非常高纯度的Glu-纤溶酶原。

因此，本发明的另一个方面涉及一种蛋白质组合物，其包含基于总蛋白质重量至少80重量％的Glu-纤溶酶原。

在一个优选的实施方案中，基于总蛋白质重量，所述蛋白质组合物包含至少重量85％，更优选至少重量90％或甚至至少95重量％的Glu-纤溶酶原。

通常，这种蛋白质组合物具有特别高的稳定性和显着降低的蛋白水解活性，特别是(基本上)没有蛋白水解活性。

在这种高度纯化的蛋白质组合物中可以鉴定出Glu-纤溶酶原的两种糖基化形式。优选地，主要杂质是白蛋白。更优选地，白蛋白(基本上)是唯一的杂质。如上所述，白蛋白可以对Glu-纤溶酶原具有稳定作用。因此，蛋白质组合物中可以有意地存在少量的白蛋白。上面对其进行了更详细的描述，包括其优选的浓度。

在一个优选的实施方案中，包含在该组合物中的Glu-纤溶酶原是用本发明的方法获得的。

蛋白质组合物可以是溶液，悬浮液，乳剂或干燥形式，这些在上述关于Glu-纤溶酶原制备方法中已经描述。特别地，蛋白质组合物是冻干粉末如上所述，蛋白质组合物，特别是当其为冻干粉末或溶液时，可任选地包含一种或多种稳定剂，例如如上所述的一种或多种糖和/或稳定剂。其用量范围也如前所述。

本领域技术人员知道，这类蛋白质通常不以纯干蛋白质的形式给药，而是以药物组合物的形式给药。

因此，在另一方面，本发明还涉及包含Glu-纤溶酶原和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。

应当理解，在上述关于Glu-纤溶酶原制备方法和Glu-纤溶酶原组合物的描述中，所例举的定义和/或优选实施方案也适用于本发明的药物组合物。术语“药物组合物”和“药物制剂”可以互换地理解。

在一个优选的实施方案中，本发明药物组合物中所包含的Glu-纤溶酶原是通过本发明的方法获得的Glu-纤溶酶原。

对于本发明，术语“药学上可接受的载体”，“药学上可接受的赋形剂”，“载体”和“赋形剂”在最广义上可以互换理解为药理学可接受的任何适合Glu-纤溶酶原的物质。

对于本发明药物组合物，优选能够克服首过效应的给药途径。更优选地，药物组合物的剂型合适于注射给药(例如，适合于选自静脉内(iv)，动脉内(ia)，腹膜内(ip)，肌内(im)，以及皮下(sc)注射)。替代地或另外地，药物组合物的剂型也可以适合于其他给药途径，例如鼻腔或透皮给药。

药物组合物优选是液体制剂，特别是在注射状态时。储存状态时也可以是液体，但也可以是干燥形式(例如粉末，例如包括干燥或冷冻干燥的Glu-纤溶酶原的粉末)，或者是糊剂或糖浆剂等。任选地，将干燥形式、糊剂或糖浆剂的药物组合物溶解或乳化然后施用于患者。

药学上可接受的载体可以示例性地选自水性缓冲液，盐水，水，二甲基亚砜(DMSO)，乙醇，植物油，石蜡油或其两种或更多种的组合。此外，药学上可接受的载体可以任选地包含一种或多种去污剂，一种或多种起泡剂(例如月桂基硫酸钠(SLS)，十二烷基硫酸钠(SDS))，一种或多种着色剂(例如食用色素)，一种或多种维生素，一种或多种盐(例如钠，钾，钙，锌盐)，一种或多种保湿剂(例如山梨糖醇，甘油，甘露醇，丙二醇，聚葡萄糖)，一种或多种酶，一种或多种防腐剂(例如，苯甲酸，对羟基苯甲酸甲酯)，一种或多种抗氧化剂，一种或多种草药和植物提取物，一种或多种稳定剂，一种或多种螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA)和/或一种或多种摄取介体(例如聚乙烯亚胺(PEI))，细胞穿透肽(CPP)，蛋白质转导结构域(PTD)，抗菌肽等)。

本发明还涉及本发明药物组合物的剂量形式。示例性地，根据本发明，其可以是单剂量形式或多剂量形式。

如上所述，本发明Glu-纤溶酶原(特别是包含在药物组合物中)可以很好地用于药物领域。

因此，在另一方面，本发明还涉及Glu-纤溶酶原的医疗用途，用于治疗患者其患有(有风险患有)选自器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)及其其中两种或更多种，特别是在器官衰竭中的医疗用途。

在一个优选的实施方案中，所述疾病是器官衰竭或血栓形成事件。

纤溶酶原可用作直接治疗手段。当前使用的tPA(组织纤溶酶原激活物或uPA(尿激酶))是间接疗法，其需要正常纤溶酶原水平。tPA可能将纤溶酶原激活为纤溶酶。这可以用来溶解已经形成的血栓，后者可能导致后续的附加组织损伤。在这些情况下，纤溶酶原水平低可能是由于体内Glu-纤溶酶原蛋白的消耗引起的。已经发现患者在关键的48小时内血浆中的纤溶酶原浓度通常较低。注射Glu-纤溶酶原后，纤溶酶原的总水平随时间增加。另外，不仅纤溶酶原的水平可能是决定性的，而且α-2-抗纤溶酶的量也可能是决定性的。Alpha-2-抗纤溶酶水平的升高可能会抑制可用的纤溶酶原分子。同样，在这种情况下，注射Glu-纤溶酶原可以抗衡高浓度的α-2-抗纤溶酶，并可能在关键的48小时内改善病情。

因此，在更优选的方面，本发明还涉及用于治疗患有器官衰竭或处于发展器官衰竭的风险的患者的方法中所采用的Glu-纤溶酶原。

应当理解，在以上描述的方法和/或药物组合物中所给出的定义和优选的实施方案可以变通地适用于本发明Glu-纤溶酶原的用途。

换句话说，本发明还涉及一种用于治疗患有疾病或有患疾病风险的患者的方法，所述疾病选自器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC))及其两种或更多种的组合，特别是器官衰竭，其中所述方法包括将Glu-纤溶酶原施用于需要其的患者。

器官衰竭，尤其是多器官衰竭，可能由以下的疾病引起：感染，败血症，(微)循环障碍(例如瘀血，动脉粥样硬化等)，中毒，移植，伤害及其两种或更多种的组合。血栓形成事件可以选自深静脉血栓形成和慢性血栓栓塞性肺动脉高压(thromboembolic pulmonaryhypertensio)。动脉阻塞性疾病可能与心肌，脑，肾或肝梗塞有关或由其引起。

在一个优选的实施方案中，器官衰竭是选自肾脏，心脏，肺，脑和静脉的器官衰竭。在一个优选的实施方案中，器官衰竭是肾衰竭，优选急性肾衰竭(AKI)，例如急性肾损伤。

因此，在另一方面，本发明还涉及采用Glu-纤溶酶原治疗患有以下疾病或有患以下疾病风险的患者的方法：器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)及其两种或更多种的组合，特别是器官衰竭。所述方法包括给予所述患者Glu-纤溶酶原。

在一个优选的实施方案中，发生所述疾病(选自器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)及其两种或更多种的组合)的风险是由先天性或优选地获得性纤溶酶原缺乏症引起的。

因此，在一个更优选的实施方案中，发生器官衰竭或血栓形成事件的风险是由获得性纤溶酶原缺乏引起的。在一个替代的优选实施方案中，发生所述疾病(选自器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)及其两种或更多种的组合)的风险是由微凝血障碍(micro-coagulation disorder)引起的。

因此，在一个更优选的实施方案中，发生器官衰竭或血栓形成事件的风险是由微凝血障碍引起的。

在一个优选的实施方案中，所述患者患有，或有风险患有，深静脉血栓形成和/或肺栓塞。

因此，在优选的实施方案中，本发明还涉及采用Glu-纤溶酶原用于治疗患者，其患有，或有风险患有，深静脉血栓形成。

因此，在优选的实施方案中，本发明还涉及采用Glu-纤溶酶原用于治疗患者，其患有，或有风险患有，肺栓塞。

在一个优选的实施方案中，发生所述疾病(选自器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)及其两种或更多种的组合)的风险是由获得性纤溶酶抑制剂的升高引起，特别是其中纤溶酶抑制剂为α-2-抗纤溶酶(A2AP)。

因此，在一个更优选的实施方案中，发生器官衰竭或血栓形成事件的风险是由获得性纤溶酶抑制剂的升高引起，特别是其中纤溶酶抑制剂为α-2-抗纤溶酶。

在一个优选的实施方案中，所述疾病选自器官衰竭，深静脉血栓形成，慢性或急性器官栓塞，器官梗塞(特别是心脏，肾脏，肝，肺或脑梗塞)，引起纤溶系统局部或产生失衡的急性或慢性炎症(例如急性移植排斥)，高凝，弥散性血管内凝血(DIC)和器官的血栓形成事件，特别是所述器官选自心脏，肺和静脉。

在一个优选的实施方案中，患者患有纤溶酶原缺陷症，其可能是先天性的或后天性的。纤溶酶原缺乏症可以是获得性纤溶酶原缺乏症和/或凝血/纤维蛋白溶解的失衡引起，优选在微血栓形成，血栓形成和深静脉血栓形成事件时发生时产生。但是，创伤，巨大的上皮破坏或急性或慢性炎症也会导致获得性纤溶酶原缺乏和/或凝血/纤溶平衡失调(失衡)。因此，对于治疗有器官衰竭指征的患者，最好在首次血液检查中测量患者的纤溶酶原和α-2-抗纤溶酶(A2AP)的水平。降低的纤溶酶原水平或增加的α-2-抗纤溶酶抑制剂水平可用作凝血和纤溶系统失衡的指标。由于该系统对于施用Glu-纤溶酶原非常敏感，这样做可以使系统达到平衡并避免高凝性。

如在本发明的上下文中使用的，术语“患者”可以最广义地理解为任何生物，其优选地是任何动物，更优选地是包括人在内的哺乳动物，特别是人。可以理解的是，为了避免免疫反应，Glu-纤溶酶原通常与待治疗的患者源自同一物种。

如本文所用，术语“患有”可以最广义地理解为患者已经产生与以下疾病相关的病理状态(pathological condition)：器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)及其两种或更多种的组合，特别是在器官衰竭。也就是说，患者体内已存在所述疾病。在优选的实施方案中，如本文所用的术语“患有”可在最广泛的意义上理解为患者已经产生与器官衰竭相关的病理状态，即患者体内已经存在器官衰竭。

患有疾病的患者任选地，但不是必须的，出现医学症状，例如出现选自酸碱紊乱(例如呼吸性碱中毒或乳酸性酸中毒)，少尿(甚至无尿)，高血糖症，胰岛素需求量增加，呼吸急促，低碳酸血症，低氧血症，肝功能障碍，血液异常，氮质血症，凝血异常和缺血性结肠炎的一种或多种症状。

术语“有风险患有”是指患者具有产生与以下疾病相关的疾患的特定的风险：器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)，以及其中两种或多种的组合，尤其是器官衰竭。这里，所述风险是指与整体人群的平均风险相比在未来一周(即7天)内患有上述疾病的风险增加。更优选地，所述风险增加至少5倍，甚至更优选地，所述风险增加至少10倍，甚至更优选地，所述风险增加至少100倍，甚至更优选地，所述风险至少1000倍。

在一个优选的实施方案中，本发明涉及Glu-纤溶酶原的用途，用于治疗患有选自以下疾病的患者：器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)，以及其中两种或多种的组合，尤其是器官衰竭。

优选地，给药途径是全身性给药(例如，静脉内(i.v.)，动脉内(i.a.)，腹膜内(i.p.)，肌内(i.m.)，皮下(s.c.)，透皮，鼻腔内)。或者，给药也可以是局部性给药，例如鞘内或玻璃体内(intrathecally或intravitreally)。优选全身性给药，特别是静脉内注射。

在高度优选的实施方案中，所述疾病选自器官衰竭，深静脉血栓形成(DVT)和栓塞(例如，慢性或急性器官栓塞)。DVT是深静脉(最常见的是腿部)中的血块形成。并发症可能包括肺栓塞(因游离的血块进入肺引起)和血栓后综合症。危险因素包括手术后，癌症，外伤，缺乏运动，肥胖，吸烟，荷尔蒙节育，怀孕和分娩后，抗磷脂综合症和某些遗传病(E.Previtali，P.Bucciarelli，S.M.Passamonti，I.Martinelli：“静脉和动脉血栓形成的危险因素，输血”，Transfusione del sangue，9(2011)120-138；J.Stone，P.Hangge：“深静脉血栓形成：发病机制，诊断和医疗管理”，《心血管疾病的诊断和治疗》，第7卷(2017年)，276-284页)。遗传因素包括凝血酶，蛋白C和蛋白S以及因子V的基因突变(J.Stone，P.Hangge：“深静脉血栓形成：发病机制，诊断和医疗管理”，《心血管疾病的诊断和治疗》，第7版(2017)，276-284页)。潜在的机制通常涉及血液流速降低，凝结趋势增加和血管壁损伤的某种组合。

纤溶酶替代疗法的适应症还包括其它一些临床状态，这些状态可导致血液凝固性过高(甚至引起弥散性血管内凝血：DIC)或血纤维蛋白溶解力不足，而形成血栓或微血栓或血凝块溶解延迟(AA Sharp：“血栓溶解”，J.Clin.Path。22(1969)369)。适应症也包括纤溶系统的不平衡(抑制剂超过酶纤溶酶原：α-2-抗纤溶酶[mg/mL]/纤溶酶原[mg/mL]的比例比例大于1.25。如果检测到的先天或后天的纤溶酶原缺乏或检测到的过量抑制剂，并同时有一些其它临床症状，表明肾脏，肺，心脏，脑即将发生器官衰竭或有风险发生栓塞事件或静脉血栓形成，这可能也是使用血纤蛋白溶酶治疗的适应症。

通常有几种因素共同导致血栓形成。这些可能是遗传因素和外部因素(E.Previtali，P.Bucciarelli，S.M.Passamonti，I.Martinelli：“静脉和动脉血栓形成的危险因素”，《输血杂志》9(2011)120-138；M.A.Islam，S.S.Khandker，F.Alam，M.A.Kamal，S.H.Gan:"血栓性原发性抗磷脂综合征的遗传危险因素：通过生物信息学分析进行系统综述"，《自身免疫综述》，(2018))。

静脉血栓形成的原因是所谓的Virchowian三联症：

1.血液成分的变化

2.血流速度降低(停滞)。

3.血管内壁损坏(内皮)

血栓形成的危险因素是口服避孕药，尤其是与吸烟，身体不活动，特别是长时间因病卧床，肥胖，脱水，癌症，既往血栓形成史，怀孕同时发生。最常受深静脉血栓形成影响的是腿。这里说的是大腿或小腿静脉血栓形成。如果小腿和大腿都受到影响，则称为多级血栓形成。骨盆静脉血栓形成虽然不常见，但由于其血管尺寸和引发肺栓塞的风险较高，因此更为危险。孕妇要担心骨盆静脉血栓形成，由于缺乏子宫压缩，分娩后血栓可能会分撒，进而导致肺栓塞，这可能是致命的。血栓形成本身和DVT的另一种并发症是弥散性血管内凝血(DIC)。

这是获得性综合症的典型例子，其特征是出现血管内凝血的激活，由例如感染性损伤(例如败血症)和非感染性损伤(例如创伤)引起。DIC的内在机制是由炎症细胞因子激活的组织因子依赖性凝血激活，抗凝途径控制的不足，以及纤溶酶原激活物抑制剂1介导的对纤溶的抑制。DIC有多种临床并发症，例如创伤，肝脏疾病，器官破坏(重度胰腺炎)和恶性肿瘤等(Gando，M.Levi，C.H.Toh：“弥散性血管内凝血”，《疾病引物》，2(2016)16037)。

给药的频率可因个体患者而异。首先，优选测量纤溶酶原和α-2-抗纤溶酶的水平，这可以通过常规测试分析。可以给药一次，两次或更频繁或连续地进行(例如通过滴注)。示例性地，给药可以每天三次，每天两次或每两天一次，或更长的间隔。

在一个优选的实施方案中，患者的特征在于：

(a)患者血液中的α-2-抗纤溶酶与纤溶酶原(优选Glu-纤溶酶原)的比率比同种种群中的平均比率至少高1.1倍；和/或

(b)患者血液中的纤溶酶原水平(优选Glu-纤溶酶原水平)比同种种群的平均水平低至少1％(mol/mol)。

优选地，与同种种群的平均值相比，患者血液中的α-2-抗纤溶酶与纤溶酶原(优选Glu-纤溶酶原)的比例至少高1.15倍，更优选高至少1.2倍，特别是高1.25倍以上。经验发现，对于患有以下严重疾病的患者，该值平均高出1.26倍：器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)及其两种或更多种的组合，特别是器官衰竭。

优选地，与同种种群的平均值相比，患者血液中的纤溶酶原(优选Glu-纤溶酶原)水平降低至少2％(mol/mol)，更优选降低至少5％(mol/mol)，特别是降低至少10％(mol/mol)。

Glu-纤溶酶原水平降低可能会导致凝血和纤溶的失衡。大量的A2AP和PLG的失衡使纤维蛋白溶解活性丧失，凝血不被抗衡。尤其是对于患有以下疾病的患者：器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)以及其中两种或多种疾病的组合，特别是器官衰竭，他们血液中的α-2-抗纤溶酶(A2AP)与Glu-纤溶酶原(PLG)的比例很高。因此，Glu-纤溶酶原的应用可与现有的“标准护理”疗法结合起来为患者“买时间”(即稳定患者的病情)。一个典型的例子(买时间)是维持患者的生命和最重要的器官功能至少48小时，在其期间可以选择最佳的治疗方案。

任选地，特别是当患者表现出一种或多种上述临床症状时，除了给予Glu-纤溶酶原外，还可以对患者同时进行治疗。

示例性地，可以对患者进行血液动力学的稳定措施和/或人工呼吸。本发明的治疗可以显着降低患者的死亡率，并可以改善标准护理的效果。

在急性肾衰竭的情况下，当前的治疗选择是用抗凝剂(例如肝素)作为额外的治疗。肝素可能抑制进一步的凝血。人源化纤溶酶原通常(基本上)对凝血没有影响，但会引发已经形成的血凝块的溶解。已知与肝素的合用可以增加纤溶酶的活性。然而，这需要二者(抗凝剂和Glu-纤溶酶原)之间不发生(显着的)药代动力学药物相互作用。

在一个优选的实施方案中，对于因败血症引起的多器官衰竭的患者还可以同时使用(另外)治疗手段，如自抗生素，血栓形成的预防措施，器官特异性治疗例如针对肾衰竭的透析，外科手术，通气疗法和抗感染疗法(针对每种细菌)，全身性血管作用的药物(儿茶酚胺，如肾上腺素或去甲肾上腺素)，血液动力学稳定措施，活化蛋白C(可选重组)和免疫球蛋白(例如IgG和IgM)，以及天然蛋白酶抑制剂(例如抗凝血酶III，主要抑制F.Xa和凝血酶)。

器官衰竭可以广义地理解为器官的任何严重功能障碍。优选地，就本发明而言，器官衰竭是指器官无法执行其预期功能，以至于在没有外部临床干预来补偿器官功能障碍的情况下不能维持正常的稳态。

令人惊讶地发现，施用Glu-纤溶酶原(Glu-PLG)可以抗衡A2AP水平的升高(Seitz,R.；Karges,H.E.；Wolf,M.；Egbring,R.：“在急性肾衰竭中纤维蛋白溶解能力的降低，及通过纤溶酶原替代恢复纤溶能力”。《国际组织反应杂志》1989，39-46页)。已发现这能够逆转器官衰竭并降低这些患者的死亡率。此外，不可逆的血液凝固也出现在多种疾病中，如多发性皮肤坏死(Waterhouse Friedrichsen综合征)，败血症，和肝炎。肾脏移植(cadaverkidney transplantation)也显示，PLG和A2AP的相对高的浓度有利于移植的存活。

在一个优选的实施方案中，器官衰竭是下述情况或与其有关：病理性急性肾衰竭，急性移植排斥，高凝，弥散性血管内凝血(DIC)和血栓形成事件，特别是所述器官选自：心脏，肺和静脉。

在一个优选的实施方案中，用于治疗患有器官衰竭或有发生器官衰竭风险的患者的方法中，所用的Glu-纤溶酶原是本发明的方法获得或形成本发明药物组合物的一部分。

在一个优选的实施方案中，用于治疗患有器官衰竭或有发生器官衰竭风险的患者的方法中，Glu-纤溶酶原是以药物组合物的形式给药。因此，换句话说，本发明还涉及药物组合物(包含Glu-纤溶酶原和至少一种药学上可接受的载体)，该药物组合物用于治疗患有或有风险患有以下疾病的方法：器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)，以及其中两种或多种的组合，尤其是器官衰竭

可以进行进一步的处理步骤。目前治疗处于高凝状态患者的选择是服用维生素K拮抗剂，肝素或F.Xa抑制剂。这些只能作为预防性治疗，以防止新的血块形成和现有血块的延长。血栓溶解则可以通过tPA(组织纤溶酶原激活物)或uPA(尿激酶)诱导。两种疗法仅在有限数量的患者中有效，而且对于患有获得性纤溶酶原缺乏症的患者，似乎没有效果。

一旦检测到这种缺陷，就是使用纤溶酶原替代治疗的指征(Stoll G.：“缺血性中风中血栓形成的分子机制：新颖的见解和治疗靶点”，《血液》2008，112：3555-3562；doi:https：//doi.org/10.1182/blood-2008-04-144758)。该作者发现急性血栓栓塞性中风的主要治疗目标是迅速实现闭塞性脑血管的再通。如果出现永久性血管阻塞，就不可避免地会发生完全的梗塞。目前，早期的静脉内或动脉内溶栓治疗是唯一确定的治疗选择(美国国家神经疾病和中风研究所：“用于急性缺血性中风的组织纤溶酶原激活剂”。N Engl J Med1995；333：1581-1588；Choi JH，Bateman BT，Mangla S等：“急性缺血性卒中的血管内再通治疗”，《中风》2006；37：419-424)。由于症状发作后只有3到6小时的时间窗口(因为之后的施用可能会导致严重的脑出血)，只有不到10％的患者可能得到这种治疗(Adams H,AdamsR,del Zoppo G,Goldstein LB：“缺血性中风患者早期治疗指南”，《中风》2005；36：916-921)。使用重组去氨普酶(一种新型纤溶酶原激活剂)试图将治疗窗口延长至9小时的试验失败了(“用于急性缺血性中风的去氨普酶”，http://www.strokecenter.org/trials/TrialDetail.aspx？tid＝515，2018年2月23日阅读)。出于目前还未知的原因，溶栓治疗在某些情况下会溶解导致血管闭塞的血栓，而在其他情况下则不会。

以下实施例和权利要求旨在提供说明性实施方案，而不对发明主题的范围提供任何限制。

实施例

谷氨酰胺纤溶酶原制剂的生产方法葡萄糖纤溶酶原的纯化工艺

可从血浆，低温贫瘠血浆，Cohn/Kistler-Nitschmann(KN)工艺的级分，或4-PCC(凝血酶原复合浓缩物)工艺的可选洗脱液，分离Glu-纤溶酶原。分离过程可以总结如下：

1.提供血浆或低温血浆

2.任选：捕获4-PCC复合体

3.分离并稳定Glu-纤溶酶原

4.进行第一次病毒灭活(溶剂/洗涤剂(SD)处理)

5.去除SD

6.最终纯化Glu-纤溶酶原复合物

7.进行第二次病毒灭活(超滤/纳滤)

8.制剂(超滤(纳滤)，稳定化，冷冻，干燥)

9.获得谷氨酸纤溶酶原产物

在此过程中，步骤2可以进一步用于产生下一代4-PCC产物。可以将步骤3的分级引入Cohn/KN(Kistler-Nitschmann)过程。

可以将步骤1-3称为纤溶酶原捕获步骤。步骤4和5可以称为SD处理/病毒清除步骤。步骤6和7可以称为最终纤溶酶原纯化步骤。

这里对所述工艺过程作一般性评论：

现代色谱技术(新的树脂和微珠结构，已用于许可产品的生产过程)可用来处理消毒标准品(1M NaOH)，使其可重复使用性最大化。

赖氨酸修饰的凝胶用于Glu-纤溶酶原的分离过程。但是也可以使用其他含有游离氨基的凝胶，如其他天然或合成氨基酸，以及其它天然和合成化合物，其含有不同间隔基的游离氨基。

该过程可以整合到既定的分级过程中，其对低温贫瘠血浆的处理过程所需要的调节和变化也很少。低温贫瘠血浆无需进行任何改变即可直接用于Cohn/KN(Kistler-Nitschmann)的工艺中以分离IgG，白蛋白和其他蛋白质。

由于使用现代色谱和树脂技术，纤溶酶原的活化降至最低，因此捕获步骤可实现更高的Glu-纤溶酶原产量。所获得的Glu-纤溶酶原产量(分步产量/总产量，重量百分比)如下：

1.血浆(100/100)

2.低温贫瘠血浆(90/90)

3.分离和稳定Glu-纤溶酶原(80/72)

4.首次病毒灭活(溶剂/洗涤剂(SD)处理)(98/71)

5.去除SD(95/67)

6.Glu-纤溶酶原复合物的最终纯化(95/64)

7.第二次病毒灭活(超/纳滤)(98/62)

8.制剂(超滤，稳定，冷冻，干燥)(90/56)

9.获得Glu-纤溶酶原产物，总产率：56重量％

分离后，即用柠檬酸将Glu-纤溶酶原的pH值调节至7.5，并添加稳定剂，如抑肽酶或α-2-抗纤溶酶(A2AP)。

从低温贫瘠血浆/血浆级分中分离Glu-纤溶酶原的工艺步骤

捕获步骤：将人血浆或低温贫瘠血浆直接捕获在赖氨酸凝胶上(使用9CV负载能力)，然后分离并稳定原始的Glu-纤溶酶原(参见实施例1.1)。

SD处理/第一次病毒去除：向原始的Glu-纤溶酶原中加入1％Tween-20和0.3％TnBP。使用的条件：22℃，2h并轻轻摇动。

SD的去除：在阴离子交换剂(Fractogel M TMEA，默克公司产)注入SD溶液(1:10稀释，用10mM柠檬酸盐缓冲液pH 7.6；平衡凝胶，用25mM乙酸盐缓冲液pH 5.75)，将SD-试剂洗涤至规定的水平)。再用25mM乙酸盐缓冲液(含0.5M NaCl，pH 5.75)洗脱Glu-纤溶酶原。

最终纯化步骤：与捕获步骤相同。

Glu-纤溶酶原的分离过程(从Cohn/KN工艺的糊I-III废料级分)

Cohn/KN工艺过程中的废料级分糊I+II+III(即I-III)或糊I+III可用于分离Glu-纤溶酶原。

1.从Cohn/KN(Kistler-Nitschmann)工艺中获得废料级分糊I+II+III糊(即I-III)或糊I+III

2.解冻，稀释，调节pH，过滤

3.分离Glu-纤溶酶原

4.稳定Glu-纤溶酶原

5.获得Glu-纤溶酶原产物

这里，步骤2-4也可以称为Glu-纤溶酶原捕获步骤。

实验数据

测定方法

谷氨酸纤溶酶原产品的检测

进行检测的方法如下(数据未显示)：采用Siemens Healthcare diagnostic公司(Newark,DE 19714U.S.A.)的Berichrom Plasminogen产品进行纤溶酶原的显色测定。

检测Glu-纤溶酶原(TECHNOZYMGlu法)

采用Glu-纤溶酶原ELISA试剂盒96T(产品号：TC12040 Technoclone GmbH，奥地利)。TECHNOZYMGlu法检法是一种检测Glu-纤溶酶原的固相酶免疫法，用于测定Glu-纤溶酶原而非Lys-纤溶酶原的量。该测定法测定的Glu-纤溶酶原的含量范围为0.06-0.5μg/mL。正常血浆水平为60-250μg/mL。批间和批内差异分别小于10％和5％。

96孔板预先涂有单克隆抗纤溶酶原抗体，并用冻干的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭。(TC代码GX)。用温育缓冲液(PBS；pH 7.3)稀释样品和标准品(冻干的正常血浆，(TC代码BJ))。含有稳定剂蛋白；0.05％普罗林(proclin)；和蓝色染料。标准曲线的Glu-纤溶酶原浓度分别为0.5μg/mL，0.25μg/mL，0.125μg/mL，0.063μg/mL和0.0μg/mL。

吸取0.1mL稀释的样品/标准液到单独的孔中。建议一式两份运行标准品/样品。用塑料膜覆盖板，并在4℃下孵育过夜。通过向孔中添加0.25mL洗涤缓冲液(浓缩液-预稀释1+11.5倍)(PBS；pH 7.3，含去污剂；0.01％硫醇盐)以得到必须的重构条(Reconstitutestrips)，并倾倒内容物。用洗涤缓冲液进一步洗涤重构条四次。轻轻拍打吸收纸上的重构条，确保孔完全干燥。向所有孔中添加0.1mL稀释的POX抗纤溶酶原抗体，最好使用多通道移液器。盖上盖并在37℃下孵育1小时。如前述方法洗涤五次。加入0.1mL TMB底物至所有孔中。在室温下孵育15分钟。加入0.1mL终止溶液至所有孔中。测量450nm处的吸光度(如果有的话，使用620nm参考滤光片)。在加入终止溶液后一小时内，读取吸光度。绘制标准曲线，在曲线上找到每个样品的吸光度，并从水平轴读取相应的值。该值需要乘以样品的稀释倍数。

DS-PAGE电泳

用SDS-PAGE与考马斯染色技术确定Glu-纤溶酶原的纯度。采用BioRad Mini-Protean TGX无污凝胶4-20％(货号：456-9093)，Precision Plus all blue蛋白质标准品(BioRad货号：161-0373)，Glu-纤溶酶原标准品(Coachrom货号：HPGG)和Lys-纤溶酶原标准品(Coachrom货号：HPGL)。蛋白质用Bio Safe TM Coomassie G-250染色剂(BioRad货号：161-0786)染色。用蒸馏水使背景脱色。

总蛋白质的测定(Bradford法)

Quick Start^TMBradford蛋白质测定盒是一种简单而准确的测定溶液中蛋白质浓度的方法。该测定盒提供1x浓度的即用型染料试剂(BioRad：货号500-0205)，可一步确定蛋白质浓度。该测定盒提供牛血清白蛋白标准组(BioRad：货号500-0206)。从样品中以及从预先稀释的标准(浓度0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5和2.0mg/ml)中，取5μL加入聚丙烯96孔板的孔中(Eppendorf：批号：G171297G)。最后，将250μL的Dye Reagent(染料试剂)添加到每个孔中。混合孔内容物，并在37℃下孵育96孔板5分钟(最多60分钟)。使用分光光度计，在595nm和37℃下测量动态吸收值。在曲线上找到每个样品的吸光度，并从水平轴读取相应的值。

Glu-纤溶酶原产物的分子大小分布测定(HPLC尺寸排阻色谱法)

可以使用以下方法确定Glu-纤溶酶原制剂中的聚集体百分比(如实施例1.4、1.6中所用)。

测试溶液：样品在大约190℃下未经稀释注入。进样量为100μL，浓度约为1g/L。参考溶液采用Glu-纤溶酶原(如来自Coachrom公司的HPPG)。标准溶液来自Bio-Rad(凝胶过滤标准品，货号151-1901)

使用Tosoh Bioscience TSK-Gel G4000 SWXL固定相色谱柱(尺寸：l＝30mm， )。缓冲液作为流动相，所述缓冲液的制备：将4.873g磷酸氢二钠二水合物，1.741g磷酸二氢钠单水合物，11.688g氯化钠和50mg叠氮化钠，溶于1升水中。流速为0.5mL/min。

在280nm处用分光光度法进行检测。将获得的色谱图与参考溶液的色谱图进行比较。根据以下方案对色谱图进行积分，并鉴定出峰值：

·聚合物(>1200kD)，10-13分钟

·高分子量蛋白质(150-900kD)，13-22分钟

·Glu-纤溶酶原(92kDa)：22-24分钟

·白蛋白(66kD)，25-27分钟

·蛋白片段(<100kD)，26-40分钟

蛋白水解活性的测定

通过在37℃和70℃下混合显色底物(特别是对至少一种丝氨酸蛋白酶敏感的底物)和Glu-纤溶酶原制剂的样品(通常在缓冲液中稀释以满足测定的线性范围)来评估蛋白水解活性。使用分光光度计监测吸收动力学。根据公式C(U/L)＝S xΔE/min x F(C＝蛋白水解活性；S＝与显色底物的特定吸附变化有关的转换因子；F＝稀释系数)，从初始吸收(消光E)差(ΔE/min)计算样品的蛋白水解活性。根据底物供应商的说明使用底物。特别地，可以通过以下步骤评估蛋白水解活性:

(a)将25mg底物S-2288(Chromogenix)溶解在7.2mL注射用水中；

(b)将Glu-纤溶酶原制剂的样品稀释到缓冲液(100mM Tris-HCl pH 8.4，106mMNaCl)中使测定在线性范围，并将温度调节至37℃；

(c)将等量(例如100μl)的稀释的Glu-纤溶酶原制剂和溶解的底物混合；

(d)使用分光光度计，在37℃，405nm处测定吸收动力学1至3分钟；

(e)根据公式C(U/L)＝313x ΔE/min x F(C＝蛋白水解活性，F＝稀释倍数)由初始吸收差(ΔE/min)计算样品的蛋白水解活性

该方法的定量极限为8U/L，使用Glu-纤溶酶原制剂的样品无法检测到蛋白水解活性。因此，证明最终产物中的蛋白水解活性水平低于8U/L。

实施例1：Glu-纤溶酶原的分离过程

材料与方法

色谱实验用1cm内径，5cm床高的色谱柱(Labortechnic)和Bio-Rad NGC色谱系统进行的。用PBS缓冲液pH 6.6(5x)平衡柱(赖氨酸Hyper D树脂)5分钟。然后加载低温贫瘠血浆/PCC产物流并让其接触5分钟。

然后用0.05M乙酸钠/0.05M甘氨酸缓冲液(pH 10.3)洗涤至基线吸光度。

然后再用0.05M乙酸钠/0.05M甘氨酸缓冲液/0.025M赖氨酸(pH 10.3)进行洗脱，接触时间为5分钟。柱用0.5M氢氧化钠再生。通过比浊法(nephelometry)分析负载，未结合和洗脱的级分，以确定IgG和白蛋白含量。用SDS PAGE确定纯度。用ELISA确定纤溶酶原含量。

结果

从4-PCC产物流分级中分离出纤溶酶原，产率为84％(回收率84％)。

总蛋白质

柱流级分中的总蛋白(TP)产量在误差范围内进行定量。纤溶酶原捕获级分的TP含量为1.0g/L，表明产品非常纯净。白蛋白IgG与色谱柱无相互作用，导致100％的流过率。洗脱的Glu-纤溶酶原蛋白的总浓度非常低，从而使杂质降至最低。

白蛋白

柱流级分中的白蛋白含量为104％(定量，在误差范围内)。

IgG

柱流级分中的IgG含量为99.5％(定量，在误差范围内)。

实施例1.1：从低温贫瘠血浆中分离Glu-纤溶酶原

可以用实施例1中提到的方法从低温贫瘠血浆中纯化Glu-纤溶酶原。采用10分钟的接触时间。低温贫瘠血浆的负载能力为8CV(40mL低温贫瘠血浆)。洗脱的Glu-纤溶酶原的产率与实施例1相当，为76％，Glu-纤溶酶原的回收率为85％。

Glu-纤溶酶原的产品规格及其使用

纯化的天然Glu-纤溶酶原蛋白将在几天内多次使用。

纤溶酶原制剂的目标纯度≥90％，最好的情况下，仅含有Glu-纤溶酶原而不包含Lys-纤溶酶原。Glu-纤溶酶原分子的激活可由Lys-纤溶酶原引发。Lys-纤溶酶原已被酶裂解，具有开放构象，可更快地激活成纤溶酶。因此，Lys-纤溶酶原由于其非特异性活化并随之产生很强的副作用，而不能用于人体。现代色谱树脂技术和SD处理使在整个过程中纤溶酶原的损失极小，并产生高产率的未激活Glu-纤溶酶原。抑肽酶抗衡了从Glu-到Lys-纤溶酶原的潜在活化，其抑制产生Lys-纤溶酶原和纤溶酶的活化过程。另外，测试了几种抑制剂，例如天然抑制剂A2AP和pPack，用以稳定Glu-纤溶酶原产物。

实施例2：Glu-纤溶酶原捕获(从PCC产物流分级)步骤的缓冲液和树脂的比较。为了确定两种不同树脂对Glu-纤溶酶原捕获的效率，对赖氨酸Hyper D(Pall)和ECH-赖氨酸Sepharose TM 4Fast Flow(GE Healthcare)两种树脂进行了分析研究。从凝血酶原复合物(PCC)的进料流纯化Glu-纤溶酶原。该进料含IgM 0.8g/L，IgG 8.83g/L，白蛋白32.49g/L，总蛋白(TP)57g/L和Glu-纤溶酶原74μg/mL。使用Biorad NGC色谱系统和色谱柱(d：1cm，h：20cm)进行柱色谱分离。

使用的色谱柱体积(CV)为4–5mL。每个实验中均采用7或8分钟的恒定接触时间。进料以0.5–0.6mL/min的流速通过色谱柱。进料负载能力恒定在10CV。

用0.05M磷酸盐缓冲液pH 6.6(方法1)或0.01M柠檬酸三钠/1mM CaCl₂/0.12MNaCl pH 7.0(方法2)或0.1M磷酸盐缓冲溶液pH 7.4(方法3)平衡色谱柱(4CV)。将PCC的纯净液(pH 7.3 13.5mS/cm)通过色谱柱。采用的洗涤缓冲液为0.05M乙酸盐/0.05M甘氨酸pH10.3(方法1)或0.01M柠檬酸三钠/1mM CaCl₂/0.12M NaCl pH 7.0(方法2)或0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.4(方法3)。将流液收集在瓶中，冷冻在-35℃。对于Glu-纤溶酶原，所用的洗脱液为0.05M乙酸盐/0.05M甘氨酸/0.025M赖氨酸pH 10.3(方法1)，0.05M Tris/0.025M赖氨酸/1M NaCl pH9.0(方法2)或0.1M磷酸盐缓冲液0.2M-氨基己酸pH 7.4(方法3)。作为原位清洗(CIP)程序，使用0.1M NaOH(4CV)，0.1M HCl(4CV)，色谱柱存储在20％乙醇中。最终的Glu-纤溶酶原产物冷冻在-35℃。Glu-纤溶酶原酶联免疫吸附测定技术(ELISA)用于测定Glu-纤溶酶原的浓度。用比浊法分析免疫球蛋白的浓度。通过多色终点测定法测定白蛋白浓度，并通过Bradford方法测定TP。

结果表明，使用不同的树脂和不同的缓冲条件会导致不同的结果。想要达到的目的是首先结合Glu-纤溶酶原，然后以高产率洗脱Glu-纤溶酶原，而其他蛋白质应该100％通过。得到的流过液主要是用于其他过程中的进一步纯化。结果表明，通过使用两种树脂，IgG和白蛋白的流过率均为100％。IgM分子根据不同的缓冲液条件会与色谱柱相互作用。使用方法1，两种树脂均可获得最佳的效果(表1)。

表1：使用方法1、2和3在两种不同树脂上纯化Glu-纤溶酶原(经流液分析)

*批内和批间的差异分别为±5％和±10％。

采用赖氨酸Hyper D树脂时，Glu-纤溶酶原的产量随三种不同的方法而异。方法1获得最高的Glu-纤溶酶原产量，产率为90％，回收率约为95％(Glu-纤溶酶原的产率和流经的Glu-纤溶酶原)。而采用ECH-赖氨酸琼脂糖凝胶树脂时，这三种方法获得的Glu-纤溶酶原产量相当。

与方法2和3相比，方法1与赖氨酸Hyper D和赖氨酸Sepharose树脂一起使用，可产生更高纯度的Glu-纤溶酶原制剂。

表2：使用方法1、2和3在两种不同的树脂上纯化Glu-纤溶酶原(“洗脱液分析”)

*批内和批间的差异分别为±5％和±10％

实施例3：用10mM乙酸盐缓冲液纯化Glu-纤溶酶原，负载量为25CV。

这个实施例用来确定在Glu-纤溶酶原捕获步骤中ECH-赖氨酸Sepharose TM4Fast Flow(GE Healthcare)树脂的结合能力。从凝血酶原复合物(PCC)的进料流中纯化Glu-纤溶酶原。该进料含IgM 0.8g/L，IgG 8.83g/L，白蛋白32.49g/L，总蛋白(TP)57g/L和Glu-纤溶酶原74μg/mL。使用Biorad NGC色谱系统和柱(d：1cm；h：20cm)进行柱色谱。

使用柱体积(CV)为5.02mL的色谱柱，并以7.8分钟的恒定接触时间进行色谱纯化。进料以0.64mL/min的流速通过色谱柱。进料负载能力为25CV。

用0.05M pH 6.6的磷酸盐缓冲液平衡色谱柱(4CV)(方法1)。PCC的纯净液(pH 7.313.5mS/cm)通过色谱柱。洗涤缓冲液为0.01M醋酸盐/0.05M甘氨酸pH10。将经流物和洗涤级分收集在瓶中并冷冻在-35℃。使用缓冲液0.01M乙酸盐/0.05M甘氨酸/0.025M赖氨酸pH10.3洗脱Glu-纤溶酶原。更高的酸性或中性pH值会导致Glu-纤溶酶原产量降低。对于CIP程序，使用0.1M NaOH(4CV)，0.1M HCl(4CV)，并将色谱柱存储在20％乙醇中。

用1M乙酸将洗脱的Glu-纤溶酶原产物的pH值调节至pH 5.0。为了生产不含添加剂的稳定的Glu-纤溶酶原，将产品渗滤(Pall 10kDa离心装置，编号MCP010C41)到0.32M的甘氨酸缓冲液中，并在-35℃下冷冻。用Glu-纤溶酶原酶联免疫吸附测定技术(ELISA)测定Glu-纤溶酶原的浓度。用比浊法测定免疫球蛋白的浓度。用多色终点测定法测定白蛋白浓度，并通过Bradford方法测定TP。

该实施例证明，ECH-赖氨酸琼脂糖与0.01M乙酸盐缓冲液(用于洗涤和洗脱Glu-纤溶酶原)组合使用时效果较好。在上述条件下，该树脂可提供高于25CV的进料负载能力，和高达93％的Glu-纤溶酶原产率。ECH-赖氨酸琼脂糖凝胶结合能力高，至少为1.85mg纤溶酶原/mL树脂。特别是所得到的Glu-纤溶酶原产品的纯度极高，高于90％。用SDS-PAGE考马斯染色法能检测到的杂质是白蛋白，含量小于10％。然而，白蛋白的存在却提供了额外的稳定作用(表3)。

表3：使用10mM乙酸盐缓冲液和25CV的负载量，Glu-纤溶酶原纯化过程的分步产率。

*批内和批间的差异分别是±5％和±10％

实施例4：从级分I+II+III及其产生的废物级分中捕获Glu-纤溶酶原将源自人血浆的冷乙醇分级分离的级分I+II+III(140g)悬浮在760mL缓冲液(0.1M乙酸盐缓冲液pH5.05)中。在悬浮液温度达到(22℃)后，将悬浮液混合15-30分钟。在悬浮液中，测得的Glu-纤溶酶原浓度为73μg/mL。通过深度过滤或离心过滤后，可根据实施例3从所得滤液/上清液中获得纯化的Glu-纤溶酶原。

在第二种选择中，可以用辛酸(每千克级分I+II+III的使用量为0.110kg)进一步处理悬浮液。使用振动混合器(尺寸4)将蛋白质溶液进一步混合80分钟，并在30分钟内缓慢加入辛酸。再加入约0.015x I+II+III级分量的磷酸三钙(Ca₃(PO₄)₂)，并将蛋白质溶液进一步混合15-30分钟。将助滤剂P100(4.3-5.7g/kg蛋白质溶液)添加到悬浮液中，并孵育15分钟。另外，将助滤剂900(10g/kg蛋白质溶液)添加到悬浮液中并孵育15分钟。

通过深度过滤将沉淀物与滤液分离。滤液包含起始悬浮液的80％的IgG，IgM和白蛋白，而Glu-纤溶酶原的量低到无法检测。但是，蛋白质保留在滤饼中(废料)，通常将其除去并丢弃，但似乎有再生新蛋白质(Glu-Pasminogen)的高潜力。通过几个洗涤步骤，可成功地从沉淀物(滤饼)中分离出Glu-纤溶酶原，其浓度约为28μg/mL，从起始原料中获得的回收率为38％。由于滤饼通常作为废物级分丢弃，因此相对较低的产量不能掩盖这个事实的意义：可以从废物级分获得天然的Glu-纤溶酶原。而且，也可以利用Cohn/KN工艺过程的其他废物级分分离和纯化天然的Glu-纤溶酶原。

从滤饼分离的Glu-纤溶酶原可以进一步纯化：将Glu-纤溶酶原溶液在pH 6.6的0.05M磷酸盐缓冲液中稀释。根据实施例3进行最后的Glu-纤溶酶原捕获步骤。

通常，可以从I+II+III的每个级分中分离出Glu-纤溶酶原，并产生废物级分。每个Cohn或Kistler-Nitschmann过程的级分的Glu-纤溶酶原浓度不同。

实施例5：Glu-纤溶酶原制剂的纯度

采用选择性亲和色谱法纯化Glu-纤溶酶原产物。赖氨酸残基具有高亲和力，但也可以捕获杂质。此外，Glu-纤溶酶原的纯化过程也会产生聚集体或碎片。Glu-纤溶酶原制剂应具有高纯度，且不存在聚集体或碎片。在表4中，显示了通过实施例2纯化的Glu-纤溶酶原产物的SEC分析结果。数据显示，不同的方法获得相似的结果。唯独方法2与赖氨酸Hyper D的组合得到的Glu-纤溶酶原产物含有高分子量的分子。其他方法得到的Glu-纤溶酶原产品不包含任何碎片，也不包含聚集体。Glu-纤溶酶原产品中的白蛋白含量在10％至20％之间。

表4：Glu-纤溶酶原(PLG)产品的SEC分析(左栏，方法1-3)

*批内和批间的差异分别是±5％和±10％；n.d.＝没有测定

实施例6：确定纯化的Glu-纤溶酶原产物的残余蛋白水解活性根据实施例2进行Glu-纤溶酶原的纯化。使用显色底物S-2288(Chromogenix)测定前述方法纯化的Glu-纤溶酶原产物(含量为250μg/mL)样品中的蛋白水解活性。按照试剂制造商的说明书进行操作，将25mg的底物S-2288(Chromogenix)溶解在7.2mL注射用水中。将样品稀释至缓冲液(100mMTris/HCl pH 8.4，106mM NaCl)中以使测试在线性范围内，将100μL缓冲液与100μL样品混合(混合并调节至37℃的温度)。在96孔板中，将100μL的预稀释样品与100μL的显色底物溶液混合。使用分光光度计在37℃下于405nm测量吸收动力学(1-3分钟)。通过公式C(U/L)＝313*ΔE/min*F(C＝蛋白水解活性，F＝稀释倍数)，由初始吸收差(ΔE/min)计算样品的蛋白水解活性。

表5：Glu-纤溶酶原产物的蛋白水解活性。

*批内和批间的差异分别是±5％和±10％

取决于不同的纯化方法，纯化的Glu-纤溶酶原产物显示出不同的蛋白水解活性水平。在某些样品中，由于缓冲条件或树脂特性，可以确定蛋白水解活性的增加。为了比较不同的纯化方法，使每个样品中的Glu-纤溶酶原浓度相似。使用ECH-赖氨酸-琼脂糖纯化的Glu-纤溶酶原产物没有蛋白水解活性。

该结果表明，所述纯化方法不激活Glu-纤溶酶原，并且不纯化其他蛋白酶杂质。

用赖氨酸Hyper D树脂纯化的样品，测定到相对高的蛋白水解活性，且随使用的缓冲液条件的不同而变化。用抑肽酶饱和赖氨酸Hyper D柱可最大程度地降低Glu-纤溶酶原制剂的蛋白水解活性。此外，渗滤到0.32M甘氨酸缓冲液中后，蛋白水解活性急剧降低。

实施例7：储存液体Glu-纤溶酶原产物的稳定性研究

将根据实施例2和3制备的Glu-纤溶酶原产物在37℃下孵育48小时，然后用SDS-PAGE分析降解产物(如Lys-纤溶酶原)的存在。此外，孵育48小时后，用Glu-纤溶酶原ELISA测定Glu-纤溶酶原的剩余含量。

根据考马斯染色的SDS-PAGE的结果，制剂中Glu-纤溶酶原的稳定性取决于用于纯化的层析树脂以及用于Glu-纤溶酶原的洗脱和储存的缓冲液。使用方法1和赖氨酸-琼脂糖产生的Glu-纤溶酶原，并将其渗滤到0.32M甘氨酸缓冲液pH 4.3中，Glu-纤溶酶原含量在37℃、48小时内保持恒定。在样品中，未检测到降解产物Lys-纤溶酶原。而根据实施例2制备的一些其他Glu-纤溶酶原产物，则可出现Glu-纤溶酶原的降解。

这种趋势也可以通过测定Glu-纤溶酶原的剩余含量证明：在37℃、48小时后用ELISA法测定不同Glu-纤溶酶原制剂的残留Glu-纤溶酶原含量(表6)。将在时间点t＝0时每个样品的Glu-纤溶酶原浓度定义为100％。

表6：液体Glu-纤溶酶原产物的稳定性研究

*批内和批间的差异分别是±5％和±10％

通常可以观察到，与赖氨酸Hyper D相比，如果用ECH-赖氨酸Sepharose纯化，则Glu-纤溶酶原产物显示出更高的稳定性。但是，无论采用何种树脂，如果用乙酸盐缓冲液洗脱的Glu-纤溶酶原产物，渗入甘氨酸缓冲液进一步稳定后，则显示出类似的高稳定性。稳定性分析表明，使用方法1的缓冲条件可得到高度稳定的纯化Glu-纤溶酶原产物。

在37℃下温育此制剂48小时后，产物仍保持在规定的指标范围内。这些指标显示Glu-纤溶酶原制品的稳定性：SDS-PAGE，降解产物(例如Lys-纤溶酶原)的存在，聚集和碎片含量(用高效尺寸排阻色谱法(HPSEC)测定)，蛋白水解活性(PA)，孵育48小时后的Glu-纤溶酶原的剩余含量(用Glu-纤溶酶原ELISA法测定)(参见表7)。

还确定了其他的参数，如着色，乳光度，pH值，其在整个研究期间保持不变。

在正在进行的稳定性研究中，同样在96小时后，制剂也显示出相同的稳定性，从而证实了Glu-纤溶酶原产品的稳定性取决于缓冲液组成，所使用的色谱树脂，pH值和电导率的假设。

此外，在37℃下48小时内进行的第二次稳定性研究中，证明添加重组的抑肽酶(0.019μg抑酶肽/μg Glu-纤溶酶原)可进一步提高Glu-纤溶酶原产品的稳定性，而这与所用的存储缓冲液无关。

表7：液体Glu-纤溶酶原产品的稳定性研究(方法1，赖氨酸-琼脂糖，甘氨酸渗滤)

*批内和批间的差异分别是±5％和±10％；n.t.＝未测试

实施例8：作用方式的研究

曼海姆大学医院的一项针对急性肾衰竭患者的最新诊断研究表明，在对照组(55例)和患者(25例)中检测到A2AP和PLG的比率显着增加。

对败血症患者进行的事后(post-mortem)研究表明，许多器官(包括肾脏，肝脏，肺脏，肠，肾上腺和大脑)有微血管血栓形成，器官损伤的程度与血栓的数量有关。为了分析器官衰竭，使用败血症的动物模型来证明抑制凝血或促进纤维蛋白溶解的疗效，从而降低器官衰竭和死亡率。

但是，使用这些败血症模型会导致纤维蛋白溶解阳性反应的分析不准确。纤溶酶原的作用机制无法在复杂的疾病模型中定义。

临床前实验中的四种潜在作用模式(MoA)模型可以定义Glu-纤溶酶原的治疗潜力。

如果Glu-纤溶酶原可以引发纤维蛋白溶解，能否稳定蛋白质和抑制剂之间的平衡。事实可以证明哪种MoA合适。

2.1.鼠模型中腔静脉的完全闭塞(慕尼黑大学安德斯教授)。

假设(根据先前的实验)

静脉注射Glu-纤溶酶原有可能使平衡朝着纤维蛋白溶解的方向转移，以解决现有的静脉血栓。

简要概述

过程：3天之内，形成深静脉血栓。

分析：研究的终点>测量血块大小

材料与方法

体内实验

七到八周大的雄性C57BL/6N小鼠是从德国萨尔茨菲尔德的Charles RiverLaboratories购买。他们被维持在标准居住条件下，可以自由获得食物和水。所有动物均接受IVC结扎手术，并在手术后观察72小时。在研究结束时通过颈脱位法处死所有小鼠。所有动物实验均根据欧洲动物福利保护法进行，并获得当地政府机构Regierung vonOberbayern的批准(参考编号：55.2-1-54-2532-54-2017)。

实验系统

动物的收养，适应和观察

合格的技术人员在收货时对每只动物进行检查。被判定为健康良好且适合作为测试动物的动物被隔离至少1周。

在研究的适应阶段和生物学阶段，每天观察动物一次，观察其总体外观和行为的变化。

分组和处理

将小鼠随机分为两组。对照/PBS组(n＝12)和Glu-纤溶酶原组(n＝9)。

手术

所有手术程序均在无菌和指定区域进行。在手术前，每只动物注射100μl麻醉，并让它们进入37℃的繁殖室内5-10分钟，以进行深度睡眠。10分钟后，将动物取出并放在预热(40℃)的加热板上，以便在手术过程中保持动物的体温。打开1-2厘米的腹部切口，并定位下腔静脉(IVC)。使用7-0(8.0mm0mm 3/8c8c)聚丙烯单丝不可吸收缝合线(Prolene#8735H，Ethicon，Norderstedt，德国)将IVC结扎(100％狭窄)。成功结扎后，关闭腹部切口，注入200μL拮抗剂和丁丙诺啡，然后再次放回到37℃的繁殖室内，并继续观察一小时是否有任何手术并发症。

疗程

给药途径	静脉注射
		次数	手术后15小时一次性注射
给药体积	180微升总体积；4.755微克/毫升的浓度

处死

将所有动物放回动物设施中并进行监测，每12小时注射200μl丁丙诺啡。将所有动物的情绪状况记录在规定的评分表中(表2)。手术后72小时，用颈脱位法处死所有动物。切出IVC，测量并记录血栓凝块的重量。

观察

死亡率和临床体征

每天两次观察动物的任何异常临床体征和严重的不良事件，例如死亡。

血栓形成与消退

处死后，评估个体动物的血栓形成(对照动物)和消退(治疗动物)。记录每只动物的血栓重量并评估药物功效。

结果

死亡率

两只对照组动物和一只Glu-纤溶酶原组动物由于手术并发症而死亡。

血栓形成与消退

所有对照/PBS组的动物均出现大量血栓凝块，而几乎所有Glu-纤溶酶原治疗组的动物均未显示凝块或达到可分辨的凝块(表1和图1-5)。

讨论和结论

根据本发明生产的Glu-plasminogn具有令人惊奇的、优异的高纤溶活性。因此，我们假设本发明的产品可解决已经形成的血栓。

为了验证该假设，我们在鼠模型静脉血栓形成中使用了100％的IVC狭窄结扎。注射媒介物的对照小鼠在狭窄72小时后均出现血栓凝块。与对照组小鼠的血栓重量相比，Glu-纤溶酶原组动物在施用Glu-纤溶酶原提取物后没有出现血栓或血栓重量明显减少。因此，注射Glu-纤溶酶原不会导致负面影响，并将凝血和纤维蛋白溶解的不平衡向纤维蛋白溶解活性增加的方向转移。两组中均出现了由手术并发症导致的死亡。

因此，我们得出的结论是，本发明的Glu-纤溶酶原具有在实验性静脉血栓形成模型上启动纤溶活性的能力。

表8：表1显示血栓重量(克)

两组动物血栓重量的代表性图示。血栓重量以克为单位，数据表示平均值±SEM。p＜0.0001(n＝10对照组；n＝8治疗组)。这些数据表明注射Glu-纤溶酶原后已经形成的血栓显着(****)减少。

实施例8.1。小鼠模型中的肾脏的瞬态缺血-再灌注。

过程：肾小管缺血性坏死

分析：肾小球滤过率(第1天和第30天)，肾脏三角肌重量(第30天)，肾脏纤维化程度(第30天)。慕尼黑大学安德斯教授

实施例8.2。小鼠模型中的肾脏移植

过程：分析由于肾脏组织的坏死和毛细血管微凝块的形成而导致的肾脏排斥反应。分析：肾小球滤过率(第1天和第30天)，肾脏三角肌重量(第30天)，肾脏纤维化的大小(第30天)和血凝块形成。

实施例8.3。鼠模型中的移植物抗宿主病(GvHD)

过程：骨髓移植，由于Von Willebrand因子激活和多聚体血小板聚集而导致的GvHD。

分析：研究的终点–是否延长寿命。

实施例9.Glu-纤溶酶原的适应症

在30年前的出版物中，已经公开了肾脏移植患者中检测到的α-2-抗纤溶酶(A2AP)和纤溶酶原(PLG)的比例增加。

此外，已知纤溶酶原的施用改善了败血症患者的身体状况。

α-2-抗纤溶酶(大量)和纤溶酶原的失衡会导致纤维蛋白溶解活性的丧失，故凝血不平衡。一项针对急性肾衰竭患者的新诊断研究显示，在对照组(55例)和患者(25例)的比较中发现了显着的比率失衡。

原始数据：急性肾功能衰竭患者中PLG和A2AP的测量。

对照人群(55名健康献血者)的正常范围：

PLG：82.7％-144.5％

A2AP：96.9％-118.9％

比率：0.80-1.26

25例急性肾衰竭患者的非统计正态分布结果：

1. 12/25(48％)患者<82.67％PLG

2. 14/25(56％)患者<96％A2AP

3. 6/25(24％)患者>1.26比(A2AP/PLG)

4. 4/25(16％)患者>1.26比率且<82％PLG

患者(Pat，患有急性肾衰竭)与对照组(NP，健康个体)之间在不同指标上存在显着差异(测量值四舍五入)：

	对照组[55名]	患者[25名]
			α-2-抗纤溶酶(A2AP)	107.7±7.2	83.1±4.1
Glu-纤溶酶原(PLG)	108.3±18.8	78.2±28.8
			A2AP/PLG[P＝0.16]	1.02±0.21	1.26±0.95

急性肾衰竭(AKI)导致的获得性纤溶酶原缺乏症(正在进行的研究)。

研究概述：急性肾衰竭(AKI)

测量α-2-抗纤溶酶(A2AP)和Glu-纤溶酶原(PLG)

77例急性肾衰竭患者(AKI)

53个对照人群(CP)

t检验曼惠特尼分析(t-test-Mann Whitney analysis)结果：

AKI患者中出现显着(**)的获得性纤溶酶原缺乏症

AKI患者中出现显着(**)的获得性alpha-2-antiplasmin缺乏症比率(A2AP/PLG)无明显差异结论：

患有急性肾功能衰竭(AKI)的患者具有很显着的获得性纤溶酶原缺乏症，即Glu-纤溶酶原替代疗法的适应症。

表9：纤溶酶原浓度的曼·惠特尼检验(Mann Whitney)分析。

表10：α-2-抗纤溶酶浓度的MannWhitney分析

表11：(A2AP/PLG)比率的Mann Whitney分析

实施例9.1弥散性血管内凝血(DIC)

研究概要：

测量alpha-2-antiplasmin(A2AP)，Glu-plasminogen(PLG)，D-Dimer

21例DIC患者

53例对照人群

Mann Whitney分析结果：

DIC患者中出现显着(**)的获得性纤溶酶原缺乏症

DIC患者中无获得性α-2-抗纤溶酶缺乏症比率(A2AP/PLG)有显着(***)差异

结论：

DIC患者具有很显着的获得性纤溶酶原缺乏症，即Glu-纤溶酶原替代疗法的适应症。

表12：纤溶酶原浓度的Mann Whitney分析

表13：α-2-抗纤溶酶的浓度的Mann Whitney分析

表14：A2AP/PLG对比率的Mann Whitney分析。

实施例9.2败血症

研究概要：

测量α-2-抗纤溶酶(A2AP)，Glu-纤溶酶原(PLG)，PCTP 9位患者

53个对照人群

t检验曼惠特尼分析的结果：

败血症患者中出现显着(*)的获得性纤溶酶原缺乏症

败血症患者无获得性α-2-抗纤溶酶缺乏症

比率(A2AP/PLG)无明显差异

结论：

败血症患者具有很显着的获得性纤溶酶原缺乏症，即，Glu-纤溶酶原替代疗法的适应症。

表15：纤溶酶原浓度的Mann Whitney分析

表16：α-2-抗纤溶酶的浓度的Mann Whitney分析

表17：A2AP/PLG对比率的Mann Whitney分析

总结：

获得性纤溶酶原缺乏症是一种高度复杂的疾病，由于未对处于风险中的患者进行纤溶酶原和/或α-2-抗纤溶酶测试，目前未得到充分诊断。对这些患者进行风险检测可能会提示使用Glu-纤溶酶原替代疗法。同样，在疾病过程中对这两个参数的测试也可以确定Glu-纤溶酶原替代疗法的指征。

Claims (21)

1.一种分离Glu-纤溶酶原的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供血浆或包含Glu-纤溶酶原的血浆级分；

(ii)使血浆或血浆级分与基于包含阳离子基团的树脂的阴离子交换剂接触；

(iii)用第一缓冲液B1洗涤从步骤(ii)获得的负载有血浆或血浆部分的阴离子交换剂，所述第一缓冲液不包含与阴离子交换剂的树脂的阳离子基团竞争的阳离子；

(iv)用第二缓冲液B2从步骤(iii)的洗涤的阴离子交换剂上洗脱Glu-纤溶酶原，所述第二缓冲液B2包含与阴离子交换剂的树脂的阳离子基团竞争的阳离子，从而获得包含缓冲液B2和Glu-纤溶酶原的溶液；

(v)任选地，将由步骤(iv)获得的溶液的pH调节至所需的范围内；

(vi)任选地，通过向步骤(iv)，(v)或(vii)中任何一步获得的溶液中添加一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂，用于稳定Glu-纤溶酶原；

(vii)任选地，使步骤(iv)至(vi)中任一步的溶液经受一种或多种抗病毒处理；和

(viii)任选地，干燥或冷冻干燥从步骤(iv)或(vii)中的任何一步获得的包含Glu-纤溶酶原的溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆级分选自：

(a)低温贫瘠血浆，通常是血浆的上清液经过冷冻—融化后获得的；

(b)Cohn或Kistler-Nitschmann工艺的糊I+II+III或I+III的废料级分，或这些级分中的两种或全部三种的组合；和

(c)Cohn或Kistler-Nitschmann工艺的糊I+II+III或糊I+III，或其任何含有Glu-纤溶酶原的级分或废料级分。

3.根据权利要求1或2中任一项的方法，其中所述阴离子交换剂的树脂带有氨基或其盐，优选伯氨基或其盐，更优选带有结构为-R-NH₂或-R-NH₃ ⁺+A^-的基团，其中R是C₁-C₁₀亚烷基残基，A^-是阴离子抗衡离子，特别是其中阴离子交换剂带有赖氨酰基的残基。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述第一缓冲液B1和/或所述第二缓冲液B2是pH为7.1至11.5，优选为8.5至11，特别是10至11的碱性缓冲液。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中第二缓冲剂B2包含可溶性胺或其盐，优选为伯C₁-C₁₀伯胺或其盐，特别是赖氨酸或其盐，其作为与阴离子交换剂的阳离子基团竞争的阳离子。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(vi)的稳定剂选自抑肽酶，α-2-抗纤溶酶，D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-精氨酸氯甲基酮，小分子稳定剂，及其组合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中对步骤(iv)至(vi)中的任何一步获得的溶液进行步骤(vii)的抗病毒处理，其中所述抗病毒处理选自：

(vii-a)加入一种或多种去污剂，优选一种或多种选自Tween-20，Tween-80和Triton-X-100的去污剂；

(vii-b)加入一种或多种其他抗病毒剂，例如磷酸酯，特别是磷酸三正丁酯；

(vii-c)超滤，特别是纳滤；和

(vii-d)前述中的两个或更多个的组合。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(i)提供血浆或包含Glu-纤溶酶原的血浆级分；

(ii)使血浆或血浆级分与基于树脂的阴离子交换剂接触，所述树脂带有结构为-R-NH₂或-R-NH₃+A^-的基团，其中R为C₁-C₁₀亚烷基，A^-为阴离子抗衡离子，特别是赖氨酰基残基；

(iii)用第一缓冲液B1洗涤从步骤(ii)获得的负载有血浆或血浆级分的阴离子交换剂，所述第一缓冲液B1的pH为8.5至11，且不包含与阴离子交换剂的树脂的阳离子基团竞争的阳离子；

(iv)用第二缓冲液B2从步骤(iii)的洗涤的阴离子交换剂上洗脱Glu-纤溶酶原，所述第二缓冲液B2的pH为8.5至11，其包含伯C₁-C₁₀伯胺或其盐，特别是赖氨酸或其盐，并与阴离子交换剂的氨基竞争，从而获得包含Glu-纤溶酶原的溶液；

(v)将步骤(iv)获得的溶液的pH调节至7至8或4.5至5.5，特别是7至8；

(vi)向从步骤(iv)，(v)或(vii)中任一步获得的溶液中添加一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂，用于稳定Glu-纤溶酶原，特别是其中所述稳定剂选自抑肽酶，α-2-抗纤溶酶，D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-精氨酸氯甲基酮，小分子稳定剂及其组合；和

(vii)对步骤(iv)至(vi)中任一步的溶液进行抗病毒处理，特别是其中所述抗病毒处理为:

(vii-I)在其中加入一种或多种去污剂，优选一种或多种选自Tween-20，Tween-80和Triton-X-100的去污剂，以及一种或多种其他抗病毒剂，例如磷酸酯，特别是磷酸三正丁酯；

(vii-II)除去步骤(vii-I)的溶液；和

(vii-III)超滤，特别是纳滤；和

(viii)任选地，干燥或冷冻干燥从步骤(iv)或(vii)中的任何一步获得的包含Glu-纤溶酶原的溶液，特别是冷冻干燥。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述方法包括以下步骤：

(i)包含Glu-纤溶酶原的血浆级分，其选自：

(a)低温贫瘠血浆，其通常是血浆上清液经过冷冻然后融化后获得；和

(b)Cohn或Kistler-Nitschmann工艺的糊I+II+III或I+III的废料级分，或这些级分中的两种或三种的组合，

特别是Cohn或Kistler-Nitschmann工艺的糊I+II+III或I+III的废料级分；

(ii)使血浆或血浆级分与基于树脂的阴离子交换剂接触，所述树脂具有结构为-R-NH₂或-R-NH₃ ⁺+A^-的基团，其中R如上定义，特别是其中R为C₁-C₁₀亚烷基残基，且A^-是阴离子抗衡离子，特别是赖氨酰基；

(iii)用0.01至0.1M的pH为8.5至11的第一缓冲液B1洗涤从步骤(ii)获得的负载有血浆或血浆级分的阴离子交换剂，其中所述第一缓冲液B1不含有与阴离子交换剂的树脂的阳离子基团竞争的阳离子；

(iv)用0.01至0.1M的pH为8.5至11的第二缓冲液B2从步骤(iii)洗涤的阴离子交换剂洗脱Glu-纤溶酶原，其中所述第二缓冲液B2包含C₁-C₁₀伯胺或其盐，特别是赖氨酸或其盐，其与阴离子交换剂的氨基竞争，从而获得包含Glu-纤溶酶原的溶液；

(v)将步骤(iv)获得的溶液的pH调节至期望范围内；

(vi)任选地，向步骤(iv)，(v)或(vii)获得的溶液中添加一种或多种防止Glu-纤溶酶原成熟为纤溶酶或Lys-纤溶酶原的稳定剂用于稳定Glu-纤溶酶原。特别地，其中所述稳定剂选自抑肽酶，α-2-抗纤溶酶，D-苯丙氨酰基-L-脯氨酰基-精氨酸氯甲基酮，小分子稳定剂及其组合；和

(vii)任选地，使步骤(vi)的溶液经受抗病毒处理。

10.一种Glu-纤溶酶原，其用权利要求1至9中任一项的方法获得。

11.一种蛋白质组合物，包含基于总多肽质量至少80重量％的Glu-纤溶酶原，特别是其中所述Glu-纤溶酶原可用权利要求1至9中任一项的方法获得。

12.一种药物组合物，包含Glu-纤溶酶原，优选权利要求10的Glu-纤溶酶原，和至少一种药学上可接受的载体。

13.一种谷氨酰胺纤溶酶原的用途，用于治疗患有某些疾病或有患某些疾病风险的患者，所述某些疾病选自器官衰竭，血栓形成事件，动脉阻塞性疾病，微循环，弥散性血管内凝血(DIC)，以及其中两种或更多种的组合，特别是其中所述疾病是器官衰竭。

14.根据权利要求13所述的使用Glu-纤溶酶原的用途，其中所述患者的特征在于：

(a)在患者血液中，α-2-抗血纤维蛋白溶酶与Glu-血纤维蛋白溶酶原的比率比同一物种群体的平均值高至少1.1倍；和/或

(b)在患者血液中，Glu-纤溶酶原水平比同一物种群体的平均值低至少1％(mol/mol)。

15.根据权利要求13或14中任一项的使用Glu-纤溶酶原的用途，其中所述器官衰竭是以下病症或与以下病症相关：病理性急性肾衰竭，急性移植排斥，高凝，弥散性血管内凝血(DIC)和器官血栓形成事件，尤其是其中器官选自心脏，肺和静脉。

16.根据权利要求13至15中任一项的使用Glu-纤溶酶原的用途，其中所述Glu-纤溶酶原是权利要求10的Glu-纤溶酶原和/或形成权利要求12的药物组合物的一部分。

17.根据权利要求13至16中任一项的使用Glu-纤溶酶原的用途，其中发生器官衰竭或血栓形成事件的风险是由获得性纤溶酶原缺乏引起。

18.根据权利要求13至17中任一项的使用Glu-纤溶酶原的用途，其中发生器官衰竭或血栓形成事件的风险是由微凝血障碍引起。

19.根据权利要求13至18中任一项的使用Glu-纤溶酶原的用途，其中所述患者患有，或有风险患有，深静脉血栓和/或肺栓塞。

20.根据权利要求13至19中任一项的使用Glu-纤溶酶原的用途，其中发生器官衰竭或血栓形成事件的风险是由获得性纤溶酶抑制剂的增加引起，特别是其中所述纤溶酶抑制剂是α-2-抗纤溶酶。

21.根据权利要求13至20中任一项的使用Glu-纤溶酶原的用途，其中所述疾病选自器官衰竭，深静脉血栓形成，慢性或急性器官栓塞，器官梗塞，引起的局部纤溶系统的失衡的急性或慢性炎症如急性移植排斥，过度凝结，弥散性血管内凝血(DIC)和器官中血栓形成事件，特别是所述器官选自心脏，肺和静脉。