JPH03218399A - 尿由来の抗血液疑固物質、その製法およびそれを含有する医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はヒト尿中の新規な抗血液凝固物質、その製法な
らびにそれを有効成分として含有することを特徴とする
、血液凝固能異常に係わる疾患の予防剤及び治療剤に関
する。

［従来技術コ 現在、抗血液凝固剤としてはヘパリンやアンチトロンビ
ン■が使用されている。また、血栓溶解剤としては、尿
または培養腎細胞から分離されたウロキナーゼや、β溶
連菌より抽出されたストレプトキナーゼなどが実用に供
されており、さらに最近では、組織ブラスミノーゲンア
クチベーターも使用され始めている。

しかし、これらの物質は、出血傾向等の副作用を有し、
作用が抗血液凝固あるいは血栓溶解のいずれかに偏って
いる。

基礎研究の分野で、近年、Ｎ，　Ｌ．　Ｅｓｍｏｎらに
より、線溶を促進するプロテインＣの活性化促進作用と
血液凝固阻害作用とを有する物質が家兎肺組織抽出物に
存在することが報告され、トロンボモジュリンと命名さ
れた（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　　２　５　７　
：８　５　９，　　１　９　８　２）。トロンボモジュ
リンは血管内皮細胞上に存在するトロンビンレセプター
であり、トロンボモジュリンと結合したトロ、ンビンは
血液凝固作用を失い、トロンビンートロンポモジュリン
複合体はプロテインＣを活性化することにより抗凝固作
用を示すことが丸山らにより報告されている（Ｊ．　Ｃ
ｌｉｎ．　　Ｉｎｖｅｓｔ．　　７　５　：　９　８　
７，　　１　９８５）。すなわち、トロンボモジュリン
は血液凝固阻害作用と線溶促進作用の両方の作用を発揮
す−７− る可能性が有り、臨床応用が期待されている。

トロンボモジュリンはタンパク質であるから、臨床応用
にあたっては、抗原性の少ないヒト由来のものを用いる
べきである。現在までに、ヒトのトロンボモジュリンに
ついては、以下のような取得例が報告されている。なお
、分子量については、断りのない限りドデシル硫酸ナト
リウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）により、非還元状態での測定値を示した。

Ｐ．　Ｗ．　Ｍａｊｅｒｕｓらは、ヒト胎盤よりトロン
ボモジュリンを精製し、分子量７５Ｋと報告した（Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１２２４６，１９８４）
。

丸山らは、ヒト肺よりトロンボモジュリンを精製し、そ
の性質は胎盤のものと同じであると報告した（Ｊ．　Ｃ
ｌｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　７５：　９８７，　１９８
５）。また、青木らは、ヒト胎盤からトロンボモジュリ
ンを精製し、分子ＭＶ　Ｉ　Ｋと報告した（Ｔｈｒｏｍ
ｂｏｓｉｓ　　Ｒｅｓ．　　３７：　３５３，　　１９
８５および特開昭６０−１９９８１９号）。さらに、鈴
木らは、ヒト血小板よりトロンボモジュリンを部分精製
し、−８− 分子量を７８Ｋと決めた上で、電気泳動上の挙動、トロ
ンビンとの親和性およびプロテインＣとの基質親和性よ
り、血小板、胎盤および肺血管内皮細胞のトロンボモジ
ュリンは互いに等しい性質を持つことを報告した（Ｊ．
　Ｂｉｏｌ．　　１０４：　６２８，　　１９８８）。

また、前記のヒト・トロンボモジュリンと類似の性質を
有する物質については、以下のような存在例が報告され
ている。

Ｐ．　Ｗ．　Ｍａｊｅｒｕｓらはヒト血漿から部分精製
し、分子ＩＬ６３Ｋと５４Ｋのものが存在することを示
した。また、尿中にも類似の物質が存在することを示し
た（Ｊ．　ＣＩｉｎ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　　７５：　２
１７８，　　１９８５）。さらに、石井らは尿中には、
分”子量１０５Ｋ，６３Ｋ，６０Ｋ，３３Ｋ，３１Ｋお
よび２８Ｋ（何れも還元・非還元の別が不明）のものが
排泄されることを報告したく第１０８回薬学会抄録，６
ＦＯ５，１１−１，１９８８）。その他、尿中からの取
得例として、分子ｆｉ２００Ｋ，４８Ｋおよび４０Ｋの
混合物（特開昭６３−３０４２３号）、および、３９Ｋ
および３１Ｋ（特開昭６３−１４６８９８号）のものが
報告されている。

一方、遺伝子工学の手法により、鈴木らはヒト肺ｃＤＮ
Ａライブラリーから、トロンボモジュリンの遺伝子をク
ローニングし、全遺伝子構造を解明し、５５７残基のア
ミノ酸配列を明らかにした（ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ
　６　：　１　８９　１、１　９８７）。さらに、鈴木
らは、トロンボモジュリン分子の一部分に相当する種々
のべブチドを遺伝子工学的に産生じ、そのプロテインＣ
活性化能を測定することにより、トロンボモジュリン様
活性がアミン末端から３４５−４６２番目のアミノ酸残
基に限局されており、その部分が一部でも欠けると活性
を失うことを示した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　　２
　６　４　：　１　０　３　５　１１９８９および第１
２回国際血栓止血学会抄録３３４頁、演題番号１０３９
、１９８９）。

［発明が解決しようとする課題１ 従来報告されているヒト・トロンボモジュリンは、ヒト
胎盤、ヒト肺あるいはヒト血小板由来であり、これらを
用いて大量のトロンボモジュリンを得るのは原料の供給
の面から大変困難である。

さらに、これらのトロンボモジュリンを可溶化するには
界面活性剤が必要であり、取扱いに難点がある上、医薬
品としても界面活性剤の混入は好ましくない。従って、
大量に入手が可能で、水に易溶なトロンボモジュリン様
物質が望まれる。

また、従来のトロンボモジュリン様物質は、蛋白単゛位
重量当りのプロテインＣ活性化能や抗血液凝固活性が十
分高くないため、より生物活性が高く、医薬品として応
用した際により有用性の高い新規なトロンボモジュリン
様物質が望まれている。

一方、従来の尿からのトロンボモジュリン様物質の精製
方法では、アブロチニンやベスタチンなどの蛋白分解酵
素阻害剤を用いて分解を防止しているが、尿中にはこれ
らの蛋白分解酵素阻害剤では、事実上完全に阻害されな
いウロペプシンなどの酵素も含まれるため、精製過程に
おけるトロンボモジュリン様物質の分解を完全に阻止す
ることは困難であり、得られる収量が少ないという問題
−１１− 点がある。

さらに、トロンボモジュリンは糖タンパク質であり、遺
伝子工学の手法による合成法では、完全にヒトと同じ糖
鎖を持った分子を得ることができない。従って、その違
いが副作用など好ましくない性質をもたらす恐れがある
ため、より天然に近いトロンボモジニリンを得ることが
望まれている。

［課題を解決するための手段コ 本発明者らは、ヒト尿中に存在する抗血液凝固物質の取
得法について鋭意検討した結果、既に報告されている尿
中トロンボモジュリン様物質とは分子量的に異なり、プ
ロテインＣの活性化能や血液凝固抑制作用が従来のトロ
ンボモジュリン様物質に比べて著しく高く、かつ、より
優れた薬理作用を有する、新たなトロンビン結合性の抗
血液凝固物質を精製・取得することに成功し、本発明を
完成した。

以下に本発明を詳細に説明する。

本発明は、ヒト尿由来の新規なトロンビン結合−１２− 性の抗血液凝固物質とその製法、ならびにそれを有効成
分として含有することを特徴とする、血液凝固能異常に
係わる疾患の予防及び治療剤に関するものである。

本発明の抗血液凝固物質（以後本発明物質と呼び、後述
のＴＭＩあるいはＴＭ２を示す）は、ヒトの新鮮尿また
はその濃縮液を、ｐＨ８．３±０．３に調整し、析出し
た沈澱物を除去した後に、ｐＨを７．３±０．２に調整
し、６０±５°Ｃ１１５±５分間加熱処理を行った後、
イオン交換クロマトグラフィー　トロンビンをリガンド
としたアフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾
過クロマトグラフィーのうちから選ばれる少な《とも１
つを用いて製造することができる。

すなわち、健康な男子の新鮮尿をｐＨ８〜９、好ましく
はｐＨ８．３±０．　　３に調整して一部の蛋白分解酵
素を不活性化した後、析出した沈澱物を除去し、必要に
応じて分画分子量１万〜４万の限外濾過膜等を用いて濃
縮する。ついで、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ７．３
±０．２に調整した後に、蛋白分解酵素を不活性化する
ため、５０〜７０°Ｃで５〜４５分間、好ましくは６０
±５°Ｃで１５±５分間処理し、ｐＨ５．５〜７．５、
好マシ＜はｐＨ６．５±０．２にコンディショニングし
た陰イオン交換樹脂カラムに通して活性画分を吸着させ
る。ついで、ｐＨ２〜４．５、好ましくはｐＨ４．０±
０．０５の緩衝液で活性画分を溶出する。溶出液を、透
析により脱塩あるいは分画分子量１万〜４万の限外濾過
膜で脱塩濃縮した後、トロンビンをリガンドとしたアフ
ィニティカラムに通し、０．０５　〜０．８Ｍ　　Ｎａ
Ｃｌ、好ましくは０．１〜０．７Ｍ　　ＮａＣ１を含む
洗浄液で洗浄後０．９〜２．０Ｍ　　ＮａＣ１，好まし
くは１．０±０．０５Ｍ　　ＮａＣ１を含む溶出液で活
性画分を溶出する。溶出液を脱塩濃縮した後、必要に応
じてトロンビンをリガンドとしたアフィニティー力ラム
で上記と同様の操作を繰り返す。

次に脱塩濃縮した活性画分を、ゲル濾過カラムに通して
、溶出される本発明物質（ＴＭ１およびＴＭ２）に相当
する活性画分をそれぞれ採取する。

これらの各画分を、それぞれ必要に応じて繰り返しゲル
濾過カラムに通し、活性を有する画分を分耳マすれば、
本発明物質をおのおの純粋な形で得ることができる。

また、アフイニテイーカラムにて溶出した画分を脱塩濃
縮後、非還元状態のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、本発明
物質をそれ！れ純粋な形で得ることもできる。

一方、必要に応じ陽イオン交換クロマトグラフィー、吸
着クロマトグラフイーあるいは疎水クロマトグラフィー
を、陰イオン交換クロマトグラフィー　トロンビンをリ
ガンドとしたアフイニテイークロマトグラフィーあるい
はゲル濾過クロマトグラフィー等の他に用いることもで
きる。

得られた本発明物質は、６０±２゜Ｃで１０時間処理を
することによりウイルスを不活化し、医薬品としてより
適した状態にすることができる。

上述した精製過程で用いる陰イオン交換樹脂としては、
ＤＥＡＥセルロース、ＤＥＡＥセファロース、ＤＥＡＥ
セルロファイン、ＤＥＡＥ　｝ヨパ−１５− ールなどがあり、トロンビンをリガンドとしたアフィニ
ティカラムは、セルロース、アガロース、デキストラン
などの担体に、臭化シアンを用いてトロンビンを結合さ
せた後、ジイソブ口ピルフルオ口フォスフェート（ＤＦ
Ｐ）、フェニルメタンスルフォニルフロリド（ＰＭＳＦ
．）などで処理したものを使用する。ゲル濾過用の樹脂
としては、セフアクリルＳ−２００，セフアクリルＳ−
３００、セファデックスＧ１５０、セファデックスＧ１
００、セファデックスＧ２００、トヨパールＨＷ５５、
バイオゲルＰ１００、バイオゲルＰ１５０、セファロー
ス６Ｂなどを用いることができる。

上記の方法により、本発明物質をそれぞれ純粋な形で得
ることができる。本発明物質を得る過程で、類似した性
質を持つ別物質（ＴＭ３およびＴＭ４）を得ることもで
きる。

かくして得られる本発明物質およびその類似物質は、次
の性質を有する。

（１）分子量 ＴＭＩ　　　７２，０００±ａ，ｏｏｏ一１６一 ＴＭ２　　　　７９，０００±３，ｏｏｏＴＭ３　　　
　９４，０００±３，０００ＴＭ４　　１１４，０００
±３，０００測定方法：　Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａ
ｔｕｒｅ　　２　２　７、６８０、１９７０）に準じ、
０．１％（Ｗ／Ｖ）　Ｓ　Ｄ　Ｓを含む７．５％ポリア
クリルアミドゲノレを用０た電気泳動により非還元状態
で測定した。分子量標準品として、分子量測定キ・ソト
（生化学工業製、ゲル濾過用）およびフオスフオリラー
ゼＢ（ベーリンガーマンハイム社製）を用い、７ｍＡで
２０時間電気泳動を行った。

（２）アミノ酸組成（ｍｏｌ％） アスパラギン酸 トレオニン セリン グルタミン酸 プロリン グリシン アラニン システイン ９．５±２．０ ４．０±１．５ ５．１±１．５ １０．９±２．５ ９．３±１．５゛ １１．０±３．０ １１．７±３．５ ８．０±４．０ バリン　　　　　　５．９±１．５ メチオニン　　　　１．１±０．５ イソロイシン　　　２．８±１．５ ロイシン　　　　　　７．５±２．０ チロシン　　　　　１．６±１．５ フェニルアラニン　３．７±１．５゛ ヒスチジン　　　　２．５±１．０ リジン　　　　　　０．８±０．５ アルギニン　　　　４．６±１．５ 測定方法二本発明物質（ＴＭＩおよびＴＭ２）１ｍｇを
用いてＭｏｏｒｅらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．６：８１９，１９６３）に準じて完全酸
加水分解した後、アミノ酸分析装置（ベックマン社製）
によりアミノ酸組成分析を行った。

なお、本方法で測定されるアスパラギン酸量は蛋白質中
のアスパラギンとアスパラギン酸量の和であり、グルタ
ミン酸量はグルタミンとグルタミン酸量の和である。ト
リプトファンは本法では測定できない。

本発明物質のＴＭＩおよびＴＭ２は同一のアミノ酸組成
を有する。

（３）末端アミノ酸配列 本発明物質（ＴＭＩおよびＴＭ２）のＮ末端側およびＣ
末端側のアミノ酸配列の分析結果を下に示す。

Ｎ末端：　Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−
Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｈｉ　ｓ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−
Ｐｈｅ−Ａ　１　ａ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌ　
ｙ−Ｐｒｏ−Ａ　Ｉａ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｃ末
端：　−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ ［Ａｌａ：アラニン残基Ｐｒｏ：プロリン残基Ｇｌｕ：
グルタミン酸残基Ｇｌｎ：グルタミン残基Ｇｌｙ：グリ
シン残基Ｓｅｒ　：セリン残基Ｃｙｓ：システイン残基
Ｖａｌ　：バリン残基Ｈｉｓ：ヒスチジン残基Ａｓｐ：
アスパラギン酸残基Ｐｈｅ：フェニルアラニン残基Ｌｅ
ｕ：ロイシン残基Ｔｙｒ：ｆロシン残基Ｔｈｒ：トレオ
ニン残基Ａｒｇ　：アルギニン残基をそれぞれ表わす］
測定法二本発明物質各２５ｍｇをｃ、　Ｈ．　Ｈｉｒｓ
らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．　
　１　１、１９９、１−１９− ９６７）に準じて還元カルボキシメチル化した後、脱塩
し、アミノ酸配列分析用試料とした。

Ｎ末端アミノ酸配列分析は、気相アミノ酸配列自動分析
装置（アプライドバイオシステムズ社製、４７０Ａ型）
により行い、Ｃ末端アミン，酸配列分析は、Ｓ．　Ｙｏ
ｋｏｙａｍａらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓＡｃｔａ．３９７：　４４３、１９７５）に準じて
カルボキシペプチダーゼＰ（ペプチド研究所）処理して
、遊離するアミノ酸を高速液体クロマトグラフィーを用
いたアミノ酸分析装置（日本分光社製）により定量分析
することにより行った。

本発明物質のＴＭＩおよびＴＭ２は同一のアミノ酸配列
を有する。

この結果から解るとおり、本発明物質のＮ末端アミノ酸
配列は、これまで明らかにされているヒト・トロンボモ
ジュリンの報告と全く一致するが、Ｃ末端側のアミノ酸
配列は、これまでの報告にあるものとは異なり、今回の
結果である−Ｌｅｕ−Ａ　１　ａ−Ａｒｇは鈴木らの報
告の４５４−４５６番目のアミノ酸残基の部分に該当す
る。すなわち、本発明物質−２０− のＣ末端は、鈴木らの主張する活性最小単位の３４５−
４６２番目のアミノ酸配列を有するペプチドのＣ末端よ
り、６アミノ酸残基短い部分に該当する。このことは、
トロンボモジュリン様物質の活性の発現には、彼らの主
張するアミノ酸配列３４　５−４　６　２残基の全てが
必須でないことを示している。またヒト・トロンボモジ
ュリンにおいては、本発明物質のＣ末端から２番目に含
まれている４５５番目のＡｌａのみがＶａｌに変わった
相同変異体が知られており、本発明はこの変異体物質を
も含む。

（４）糖含量 ＴＭＩ 中性糖　：５．５±１．　　０ アミン糖＝２．２±１．０ シアル酸：２．８・±１．５ ＴＭ２ 中性糖　＝６．２±１．０ アミノ糖：３．１±１．０ シアル酸：３．８±１．　　５ 測定方法：中性糖はフェノールー硫酸法（Ｎａｔｕｒｅ
１６８：１０７．１９５１）により、アミノ糖は本発明
物質を４Ｍ　　ＨＣＩ溶液中で１００°Ｃ，　４時間処
理後、Ｂｌｉｘらの方法（Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ．　Ｓｃ
ａｎｄ．２　：　４　６　７，　　１　９　４　８）　
　（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ法のＢｌｉＸ変法）によ
り、またシアル酸は０．１Ｍ　　ＭＣＩ溶液中で８０℃
、　　１時間処理後、Ｗａｒｒｅｎらの方法（Ｊ．　Ｂ
ｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　　２３４：１９７　１，　　１
９５９）により、それぞれ定量した。なお、結果は重量
％で示した。

（５）紫外吸収 ２８０ｎｍにおける１％水溶液のｌｃｍ光路長の吸光度 ＴＭ１　　　　７．７±１．　　０ ＴＭ２　　　　６．７±１．０ 測定方法二本発明物質の凍結乾燥品１０ｍｇを１ｍｌの
蒸留水に溶解し、さらに蒸留水を用いて適当な倍率に希
釈した後、ｌｃｍ光路長のセルを用いて、分光光度計（
日立製作所製：　Ｕ−３２００型）で波長２　８　０　
ｎｍにおける吸光度を測定した。測定値に希釈倍率を乗
じて、値を求めた。

（６）等電点 ＴＭＩ　　　　３．９±０．２ ＴＭ２　　　　３．８±０．２ ＴＭ３　　　　　　３．８±０．２ ＴＭ４　　　　３．７±０．２ 測定方法：アンフォライト（ＬＫＢ社製、ｐＨ２．５〜
４．５）を用いた等電点電気泳動法により測定した。泳
動条件は５００■で４０時間とした。

各フラクションについてｐＨを測定すると共に、透析し
た後に、別項に記載した方法によりプロテインＣ活性化
能を測定し、活性ピークの溶出されるｐＨを求めた。

（７）安定性 本発明物質の安定性について検討した結果を第１表に示
した。

（以下余白） −２３− 第１表 １から６の条件については、本発明物質ＴＭＩまたはＴ
Ｍ２を６　０　μｇ　／　ｍ　Ｌの濃度で２５°Ｃ，１
５０分間処理した。また、７の条件については本発明物
質を各６０μｇ　／　ｍ　Ｌの濃度でｐＨ７．５で処理
した。いずれの場合も処理後１００倍に希釈してトロン
ビン共存下でのプロテインＣの活性化能を測定した。測
定方法は、別項に述べる方法を用いた。活性残存率は非
処理検体を１００％−２４− とした時の処理検体の残存活性で示した。

本発明物質は還元剤中では失活したが、変成剤中（１％
ＳＤＳ，６Ｍ塩酸グアニジンおよび８Ｍ尿素水溶液中）
では安定であった。また、ｐＨ２ならびにｐＨ１　０の
条件下と６０°Ｃ，３００分の加熱条件下では安定であ
った。

（８）溶解性 本発明物質（ＴＭ１およびＴＭ２）は、室温において少
なくとも３０ｍｇ／ｍＬの濃度まで蒸留水に溶解する。

以上のように、本発明物質は従来単離されたトロンボモ
ジニリン様物質とは異なる分子量を示す新規物質である
。また溶解するのに界面活性剤を必要としない点で従来
のトロンボモジュリンより有用な特徴を有する。

本発明物質は以下のような作用を有する。

（１）｝ロンビンに対する親和性（抗トロンビン作用） ａ）ＤＩＰ−トロンビンアガロースを用いるクロマトグ
ラフィー処理で、本発明物質ＴＭＩおよびＴＭ２はほぼ
１００％吸着された。

ｂ）牛トロンビン（ＩＵ／ｍＬ，持田製薬社製）１００
μＬと本発明物質ＴＭＩまたはＴＭ２を含む溶液１００
μＬを混和し、３７°Ｃで３０分間加温した後、ヒトフ
ィブリノーゲン（　２　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｌ　）１００
μＬを加え、コアギュロメーター（アメルング社製）に
て凝固時間を測定した。結果を第２表に示す。

第２表 この結果に示されるように、本発明物質はトロンピンと
結合し、その凝固活性を著しく抑制する作用を有する。

第，２表の結果は、本発明物質の抗トローンビン作用が
すでに報告されているヒト・トロンボモジュリンに比べ
、数十倍以上強いことを示している。

このことは、例えば下記のような比較によって裏付ける
ことができる。

第３表に特開昭６２−１６９７２８号公報記載のヒト胎
盤トロンボモジュリンについての凝固時間の測定結果を
引用して示す。さらに、同公報の記載によれば、このヒ
ト胎盤トロンボモジュリンは既存のヒト・トロンボモジ
ュリンよ切２倍以上強力であるとの記載があり、第２表
と第３表の比較から、本発明物質は既存のトロンボモジ
ュリンよりも強力な抗トロンビン作用を有すると考えら
れる。

−２７− 第３表 また、ヒト尿中トロンボモジュリンの抗凝固作用につい
てのデータを特開昭６　３　−　３．０　４　２　３号
公報より引用して第４表に示す。第２表と第４表との比
較によっても、本発明物質が既存のトロンボモジュリン
よりも強力な作用を有することが明らかである。

−２８ー 第４表 （２）プロテインＣ活性化能 トロンビン共存下でのプロテインＣの活性化能を合成基
質Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（
財団法人蛋白質研究奨励会ペプチド研究所製）を用い、
ウサギトロンボモジュリン（アメリカンダイアグノステ
ィカ社製）を標準物質として測定した。すなわち、０．
１Ｍｌ−リス塩酸緩衝液（１）Ｈ７．５）６０μＬに生
トロンビン（持田製薬社製）ＩＯＵ／ｍＬ溶液を２０μ
Ｌ添加し、上記緩衝液で適当濃度（０〜１５μｇ／ｍＬ
）に希釈したウサギ肺トロンボモジュリンもしくは本発
明物質（ＴＭＩまたはＴＭ２）１０μＬを添加し、さら
に、ヒトプロテインＣ（アメリカンダイアグノスティカ
社製）の５００μｇ／ｍＬ溶液を１０μＬ添加する。３
７°Ｃで３０分間反応した後、反応液にヒトアンチトロ
ンビン■（ミドリ十字社製）ＩＵ／ｍＬとヘパリン（持
田製薬社製）ＩＯＵ／ｍＬの等量混合液を１５０μＬ添
加して混和後、さらに、３７゜Ｃで１５分間反応する。

ついで、反応液に前記合成基質０．１ｍＭ溶液を２５０
μＬ添加して、３７°Ｃで１０分反応後に、２０％酢酸
溶液５００μＬを添加して反応を停止する。その後、反
応液を蛍光光度計（日立製作所製）を用いて、励起波長
３８０ｎｍ、発光波長４６０ｎｍで蛍光強度を測定する
。ウサギ肺トロンポモジュリンについて得られた反応液
の蛍光強度から検量線を作成し、それを用いて、本発明
物質のプロテインＣ活性化能をウサギ肺トロンボモジュ
リンに換算した力価として算出した。その結果、ＴＭＩ
は、２．３ｍｇ力価／ｍｇ蛋白、ＴＭ２は２．２ｍｇ力
価／ｍｇ蛋白の比活性を有することかわかった。なお、
蛋白質濃度はＬｏｗｒｙらの方法（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　
Ｃｈｅｍ．　　１９３：　２６５，　　１９５１）に従
って測定した。この結果に示されるように、本発明物質
はトロンビン共存下で著しいプロテインＣ活性化能を有
し、しかも、その作用は既存のトロンボモジュリンに比
べ、より強力であることが確認された。

（３）抗血液凝固活性 健常人クエン酸添加乏血小板血漿１００μＬと、本発明
物質を含む溶液（１０〜１０００μｇ力価／ｍＬ）１０
μＬとを混和し、３７°Ｃで２分間加温した後、ヒトト
ロンビン（ミドリ十字社製）（２Ｕ／ｍＬ）１　００μ
Ｌを加え、凝固時間を測定した。その結果を３例の平均
値として第５表に示す。

（以下余白） −３１− 第５表 この結果に示されるように、本発明物質は強力な血液凝
固時間延長作用を示した。

次に本発明物質のｉｎ　　ｖｉｖｏにおける抗血液凝固
作用を実験例にて示す。

（実験例　１）ラットエンドトキシンＤＩＣ（汎発性血
管内凝固）モデルにおける有効性吉川らの方法（日本血
液学会雑誌、第４５巻、第３号、６３３〜６４０頁、１
９８２）に準じて−３２− 実験を行なった。すなわち、体重１６０〜２００ｇの雌
性ウィスタ一系ラットをベントバルビタールナトリウム
により麻酔し、生理食塩水に溶解したりポポリサッカラ
イド（ディフコ社製）を、２５　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇの
用量で、左大腿静脈より４時間かけて一定の速度で持続
注入してＤＩＣモデルを作成した。同時に本発明物質Ｔ
ＭＩ、あるいはヒト胎盤トロンボモジュリンの１．２ｍ
ｇ蛋白／ｋｇを０．　　１％ヒト血清アルブミン及び０
．１４ＭのＮａＣｌを含む０．ＯＩＭリン酸緩衝液（ｐ
　Ｈ　７．０）（ヒト胎盤トロンボモジュリンについて
は０．００５％ルブロール含有）に溶解して４時間かけ
て一定速度で持続注入した。持続注入前及び注入終了後
に頚静脈より血液を採取し、血小板数及び血漿フィブリ
ノーゲン量の測定を行った。対照群として、薬物を含ま
ない溶媒をリポポリサッカライドと同時にラットに持続
注入した。その結果を持続注入前の測定値に対する抑制
率として第１図に示す。なお、縦軸の抑制率（％）は次
式で示される。

抑制率（％）＝　［　（Ａ−Ｂ）÷Ａ）ＸＩＯＯ但し、
Ａ：コントロール群の減少量 Ｂ：投与群の減少量 ＤＩＣの病態の指標である血小板数及び血漿フィブリノ
ーゲン量の減少は、本発明物質の投与により顕著に抑制
された。この作用は、ヒト胎盤トロンボモジニリンに比
較して明らかに強力なものであり、ｉｎ　　ｖ１ｖｏに
おいても本発明物質は既存のトロンボモジュリンよりも
優れた抗凝固活性を有することが示された。また、鈴木
らが遺伝子工学的に生産させたトロンボモジュリン様物
質は、既存の組織抽出トロンボモジュリンと同じ活性を
示す（ＥＭＢＯ　Ｊｏｕｒｎａｌ　６　：　１　８　９
　１，　　１　９　８７および特開平１−６２１９号）
ことから、本発明物質が、遺伝子工学的に合成されたト
ロンポモジュリン様物質よりも強力な活性を有すること
は自明である。

（実験例２）　ラットトロンポプラスチンＤ，ＩＣ（汎
発性血管内凝固）モデルにおける有効性大野らの方法（
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　　Ｒｅｓ．　　２　４　：　４
　４５，１９８１）に準じて実験を行なった。すなわち
、体重２４０〜２７０ｇの雄性ウィスータ一系ラットを
カルバミン酸エチルにより麻酔し蒸留水に溶解したトロ
ンボプラスチン（シンプラスチン■ゼネラルダイアグノ
スティクス社製）を２００ｍｇ／ｋｇの用量で２０分間
持続注入してＤＩＣモデルを作成した。本発明物質ある
いは、ヒト胎盤トロンボモジュリン０．２５ｍｇ蛋白／
ｋｇを０．１％ヒト血清アルブミン、０．１４ＭＮａＣ
１及び０．０１％ルブロールを含む０，ＯＩＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、トロンボプラスチン投
与開始３０分前より９０分間かけて一定速度で持続注入
した。薬物持続注入前、及び注入終了１時間後に頚静脈
より血液を採取し、血小板数、及び血漿フィブリノーゲ
ン量の測定を行なった。

対照群として薬物を含まない溶媒を薬物投与時と同様の
方法で持続注入した。その結果を対照群に対する抑制率
として第２図に示す。なお、縦軸の抑制率（％）は第１
図の記載と同じ式で表わされ−３５＝ る。

ＤＩＣの病態の指標である血小板数、及び血漿フィブリ
ノーゲン量の減少は、本発明物質の投与により顕著に抑
制された。この作用は、ヒト胎盤トロンボモジュリンに
比較して明らかに強力なものであり、ｉｎ　　ｖｉｖｏ
　　においても本発明物質は既存のトロンボモジュリン
よりも優れた抗凝固活性を有することが示された。

（実験例　３）マウスにおける急性毒性本発明物質の急
性毒性を調べた。１０匹のｄｄＹ系雄性マウスを用いて
、本発明物質のＴＭＩまたはＴＭ２を２００ｍｇ力価／
ｋｇの用量にて静脈内投与し、７日後までの観察を行な
ったが、著明な毒性や死亡例は１例も認められながった
。

以上の説明及び実験結果から明らかなように、本発明物
質は強力な抗血液凝固作用を有し、ｉｎｖｉｖｏにおい
ても既存のトロンボモジュリンよりも優れた抗凝固活性
を示し、さらに毒性も低ー３６一 いことから、例えば、ＤＩＣ、各種血栓症、末梢血管閉
塞症、心筋梗塞、脳梗塞、一過性脳虚血発（″臥妊娠中
毒症、肝不全、腎不全など、血液凝固能異常に係わる疾
患の治療および予防に有効である。

本発明物質は、薬剤として一般的に用いられる適当な担
体または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油、無
害性有機溶媒等、さらには必要に応じて賦形剤、着色剤
、乳化剤、懸濁剤、安定化剤または保存剤等と適宜組合
せて、患者に効果的に投与するのに適した医薬用製剤と
して、注射剤、吸入剤、座剤、好ましくは注射剤に調製
することができる。本発明物質を注射剤として用いる場
合には、一日１回ないし６回に分割して、一度にあるい
は持続的に患者に投与される。その一日投与量は、本発
明物質０．０５〜５００ｍｇ力価、好ましくは０．１〜
１０ｍｇ力価であるが、患者の年齢、体重、症状等に応
じて適宜増減することが出来る。

さらに、本発明の抗血液凝固物質は人工血管、人工臓器
、カテーテルなどの医用器材の表面に架橋剤などを用い
て結合・吸着させて使用することができる。これにより
、医用器材表面での血液凝固を防ぐことができる。

［実施例コ 次に本発明物質の製造方法を実施例により具体的に示す
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例　１） フェノール等の防腐剤を使用して採取した健康な男子の
新鮮尿１００Ｌを、１０％ＮａＯＨでｐＨ８．５に調整
し、析出した沈殿物を除去した。

次いで、尿のｐＨを４Ｍ　ＨＣｌでｐＨ５．５に調整し
た後、アクリロニトリル繊維で濾過し尿中のウロキナー
ゼを吸着除去し、通過尿を分画分子量４万の限外濾過膜
を使用して脱塩濃縮した。ｐＨを７．３に調整した後、
６０°Ｃで１５分間処理した。０．０６８Ｍ　　ＮａＣ
１を含有する０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で
予めコンディショニンクシておいたＤＥＡＥセルロース
（ワッ１マン社製）の３００ｍＬカラムに濃縮尿を通過
させて活性画分を吸着させ、コンディシコニングに使用
したと同じ緩衝液７５０ｍＬで洗浄した後、０．０５Ｍ
　　ＮａＣ１を含む酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で活性画
分を溶出した。

溶出液は、分画分子量３万の限外濾過膜で濃縮し、２Ｍ
　　ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整し、０．１Ｍ　　Ｎａ
Ｃ！、１ｍＭペンザミジン塩酸塩および０．５ｍＭ　　
ＣａＣ１２を含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７
．５）で予めコンディショニングしたＤ　Ｉ　Ｐ−　｝
ロンビンーアガロースの２．５ｍＬ力ラムを通過させて
活性画分を吸着させた。

次いで、コンディショニングに使用したと同じ緩衝液２
５ｍＬで洗浄した後、ＬＭ　　ＮａＣＩ，１ｍＭペンザ
ミジン塩酸塩および０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡを含む０．
０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し、この
溶出液をコンディショニングに使用したと同じ緩衝液に
対して透析後、再度前−３９− 回と同様の条件にコンディシロニングしたＤＩＰ−トロ
ンビンーアガロースクロマトグラフィーで精製した。２
回目のＤＩＰ−｝ロンビンーアガロースクロマトグラフ
ィーにおいても同容のカラムを用い、コンディショニン
グで使用した緩衝液１０ｍＬで洗浄した後に、１０ｍＬ
の０．　　８Ｍ　　Ｎａｃ１，１ｍＭペンザミジン塩酸
塩および０．　　５ｍＭ　　ＣａＣｌｚを含む０．０２
Ｍ｝リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄し、ＩＭ　　
ＮａＣ１，１ｍＭベンザミジン塩酸塩および０．５ｍＭ
　　ＥＤＴＡを含む０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ　
Ｈ　７．５）で活性画分を溶出した。

溶出液は、分画分子量３万の限外濾過膜で濃縮し、あら
かじめ０．１４Ｍ　　ＮａＣ１を含む０．０１Ｍ　リン
酸緩衝液（ｐＨ７．ｏ）でコンディショニングしておい
たセフアクリルＳ−３００　（ファルマシアファインケ
ミカル社製）の５００ｍＬ力ラムでゲル濾過して、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分子量７２，０００±３，０００に相当
する活性画分を採取した。この画分を、再度前回と同様
の条−４０＝ 件にコンディショニングした同容のセフアクリルＳ−３
００でゲル濾過して、活性を有する画分を分画分取した
。

以上の製造方法により、最終的に得られた活性画分は、
ウサギ肺トロンボモジュリンに換算してＴＭＩでは２４
７μｇ力価、ＴＭ２では１６６μｇ力価であった。

この様にして得られた本発明物質、および参考例に示す
ヒト胎盤トロンボモジュリンの非還元状態でのＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果を第３図に示す。

図中に５、６および４の符号で示すとおり、本発明物質
であるＴＭＩ　（第３図中５）およびＴＭ２（同６）は
、それぞれ胎盤トロンボモジュリン（同４）とは明らか
に異なる分子量を有する。またそれぞれが単一バンドを
示す。

次に本発明物質を含有する製剤の実施例を示す。

（実施例　２） ＴＭＩ ２０ｍｇ（力価） 精製ゼラチン　　　　　　５　０ｍｇ リン酸ナトリウム　　３４．８ｍｇ 塩化ナトリウム　　　８１．８ｍｇ マンニトール　　　　　　２　５ｍｇ 上記成分を注射用蒸留水１　０ｍＬに溶解し、無菌濾過
した後に１．ＯｍＬずつ無菌バイアルに分注し、凍結乾
燥して、注射用製剤を調製した。

（実施例　３） ＴＭ２．　　　　　　　　　　４０ｍｇ（力価）アルブ
ミン　　　　　　　２０ｍｇ リン酸ナトリウム　　３４．８ｍｇ 塩化ナトリウム　　　８１．８ｍｇ マンニトール　　　　　　２　５ｍｇ 上記の各成分を秤量し、実施例２と同，様の方法にて凍
結乾燥製剤を調製した。

（参考例） ヒト胎盤トロンボモジュリンの取得例 特開昭６０−１９９８１９号の方法に準じ、ヒ？胎盤よ
り、トロンボモジュリンを精製した。すなわち、ヒト胎
盤１２ｋｇ（３０個分）を、０．２５Ｍシュークロース
、１ｍＭベンザミジン塩酸塩を含む０．０２Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、肉挽機にて破砕
し、均質化した。均質化した懸濁液を３０００回転で４
０分間遠心分離し、得られた沈澱物を上記緩衝液に懸濁
させ，１０分間撹拌後、再度遠心分離して沈澱物を分取
した。以上の操作を、１回あたり２０Ｌの緩衝液を用い
て、合計３回繰り返し行い、分取した沈澱物を、０．２
５Ｍシュークロース、１ｍＭペンザミジン塩酸塩および
０．　　５％（Ｖ／Ｖ）｝リトンＸ−１００（シグマ社
製）を含む６０Ｌの０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で抽出した。得られた抽出液中の総タンパク質
量は４６．７ｇであった（　Ｌ　ｏ　ｗ　ｒ　ｙ法によ
る、以下同じ）。粗抽出液６０Ｌを、Ｏ，ＩＭ　　Ｎａ
Ｃ１，０．５ｍＭ　　ＣａＣＩ■、１ｍＭペンザミジン
塩酸塩および０．　　５％（Ｖ／Ｖ）　　トリトンＸ−
１００を含む０．０２Ｍ｝リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５
）−４３ー でコンディショニングしたＤ　Ｉ　Ｐ−　｝ロンビンー
アガロースカラム（４φＸ１６ｃｍ）に吸着させ、】ン
ディショニングに用いたのと同じ緩衝液２Ｌて洗浄した
。次いで、ＩＭＮａＣ１、０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ，１
ｍＭ　　ペンザミジン塩酸塩および０．５％（Ｖ／Ｖ）
｝リト：／Ｘ−１００を含む０．０２Ｍ｝リス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で溶出した。溶出量は６　５０ｍＬで
あり、得られた蛋白質量は１．７ｇであった。この溶出
液を限外濾過器（ミリポア社製、分画分子量３万）を使
用して脱塩濃縮し、再度上記と同様にコンディショニン
ク七タ同容のＤＩＰ一トロンビンーアーガロースカラム
に吸着させた。次いで、０．４Ｍ　　ＮａＣＬ　０．５
’ｍＭ　　ＣａＣ１２、１ｍＭ　　ペンザミジン塩酸塩
および０．５％トリトンＸ−１００を含む１５０ｍＬの
０．０２Ｍ｝リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した
後、０．５ｍＭ　　ＥＤＴＡ，１ｍＭペンザミジン塩酸
塩および０．　　５％トリトンＸ−１００を含む０．０
２Ｍ　　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、ＮａＣＩ
　　（０．４　〜ＩＭ）−４４− を加えた溶液を用いて、濃度勾配法により溶出し、３０
ｍＬ毎に分画した。目的とする分画の液量は合計で１２
９０ｍＬで、蛋白質量は６８ｍｇであった。次いで、こ
の溶出液を限外濾過器（ミリポア社製、分画分子量３万
）を使用して脱塩濃縮し、予め０．０５％トリトンＸ−
１００、０．１４ＭＮａＣ１を含む０．ＯＩＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）でコンディシシニングしたＳ−３０
０（ファルマシア社製）カラム（２．６φｘ９０ｃｍ）
でゲル濾過し、目的とする画分を捕集した。取得した胎
盤トロンボモジュリンは蛋白質量として３．１　ｍｇで
あった。

［発明の効果コ 本発明物質は、トロンピンと結合することにより、トロ
ンビンの作用を打ち消して血液凝固抑制および血小板凝
集抑制作用を発揮すると同時に、プロテインＣを活性化
してプロテインＣが有しているとされる血液凝固抑制作
用、血栓溶解作用をも発現するため、血栓形成抑制、血
栓溶解、抗ＤＩＣなど、広範囲にわたる血液凝固能異常
の係わる疾患に対する予防及び治療効果が期待される。

また、本発明物質は、従来単離精製されたことのない新
規な物質であり、過去に報告されているトロンボモジュ
リン様物質に比べてトロンビン結合能およびプロテイン
Ｃ活性化能が強力で、より少量で抗血液凝固作用ならび
にＤＩＣなどの病態モデルでの有効性を示す。ｉｎ　　
ｖｆｖｏにおける動物モデルでの有用性について、本発
明物質は、胎盤トロンボモジュリンより優れている。従
って、血液凝固能異常のある血栓症やＤＩＣなどの疾患
に対する予防薬あるいは治療薬として医薬品に応用した
際に、従来の物質よりもより強力な効果が期待でき、あ
るいは、より少量の投与で同程度の効果が期待されるた
め、副作用発現の危険性がより少なく、また、より経済
的に使用することができる。また、現在では治療が困難
である疾患の治療が可能になるなど、全く新しい効果も
期待される。

また、本発明物質は、ヒトの尿から精製して得られる天
然の物質であるため、遺伝子工学の手法により得られる
トロンボモジ“ユリン様物質において心配されるような
アナフィラキシーショックなどの副作用がなく、医薬品
としてより安全に使用することができる。

さらに、尿由来の本発明物質は、胎盤・肺などの組織抽
出トロンボモジュリンの生体投与時の問題点である界面
活性剤を使用する必要がないため、医薬品としてより安
全に使用することができる。

本発明の抗血液凝固物質は、上記のような医薬品として
の用途以外に、人工血管、人工臓器、カテーテルなどの
医用器材の表面に架橋剤などを用いて結合・吸着させて
、血液凝固を防ぐ目的でも用いることができる。

一方、本発明物質は、従来の方法に比べて大量に入手可
能なヒト尿を原料とし、しかも尿よりウロ牛ナーゼ等の
有用物質を分離した後に目的物を分離精製できることか
ら、工業上極めて効率的に得ることが可能である。

本発明の製造方法は、ベス・クチンやアプロチニ−４７
一 ンなどの蛋白分解酵素の阻害剤の代りに、アルカリ処理
や熱処理を行うことによって、目的物の分解を防ぐ方法
を採用したため、従来完全には抑制されていなかった精
製過程での分解が押えられ、新規な抗血液凝固物質を、
より効率良く精製・取得することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明物質ＴＭＩ、また参考例として取得し
たヒト胎盤トロンボモジュリンのラットエンドトキシン
ＤＩＣモデルにおける有効性を検討した結果を示したグ
ラフである。縦軸の抑制率（％）は次式で示される。 抑制率（％）＝　（　（Ａ−Ｂ）÷Ａ：ｌＸ１００但し
、Ａ：コントロール群の減少量 Ｂ：投与群の減少量 第２図は、本発明物質ＴＭＩおよびＴＭ２、また参考例
として取得したヒト胎盤トロンボモジュリンのラットト
ロンボブラスチンＤＩＣモデルにおける有効性を検討し
た結果を示したグラフである。 −４８− なお、縦軸の抑制率（％）は第１図の記載と同じ式で表
される。第３図は、本発明物質ＴＭＩおよびＴＭ２とヒ
ト胎盤トロンボモジュリンの非還元状態でのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥの泳動パターンを示した写真である。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）次に示す性質を有するヒト尿由来の抗血液凝固物
   質。 ａ、トロンビンと親和性を有し、トロンビンのプロテイ
   ンＣ活性化能を促進する作用を有する。 ｂ、アミノ酸組成：ｍｏｌ（％）で表示 アスパラギン酸９．５±２．０ トレオニン４．０±１．５ セリン５．１±１．５ グルタミン酸１０．９±２．５ プロリン９．３±１．５ グリシン１１．０±３．０ アラニン１１．７±３．０ システイン８．０±４．０ バリン５．９±１．５ メチオニン１．１±０．５ イソロイシン２．８±１．５ ロイシン７．５±２．０ チロシン１．６±１．５ フェニルアラニン３．７±１．５ ヒスチジン２．５±１．０ リジン０．８±０．５ アルギニン４．６±１．５ ［Ｍｏｏｒｅらの方法に準じた完全酸加水分解によって
   得られるアミノ酸組成のｍｏｌ％］ ｃ、末端アミノ酸配列： Ｎ末端： 【遺伝子配列があります】 Ｃ末端： −Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ ［Ａｌａ：アラニン残基Ｐｒｏ：プロリン残基Ｇｌｕ：
   グルタミン酸残基Ｇｌｎ：グルタミン残基Ｇｌｙ：グリ
   シン残基Ｓｅｒ：セリン残基 Ｃｙｓ：システイン残基Ｖａｌ：バリン残基Ｈｉｓ：ヒ
   スチジン残基Ａｓｐ：アスパラギン酸残基Ｐｈｅ：フェ
   ニルアラニン残基Ｌｅｕ：ロイシン残基Ｔｙｒ：チロシ
   ン残基Ｔｈｒ：トレオニン残基Ａｒｇ：アルギニン残基
   をそれぞれ表わす］ｅ、安定性： ｐＨ安定性：ｐＨ２〜１０の範囲で安定。 熱安定性：６０℃、３００分処理で安定。 変性剤安定性：１％（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム
   （ＳＤＳ）、６Ｍ塩酸グアニジンおよび８Ｍ尿素溶液中
   でそれぞれ安定。
2. （２）次に示す性質を有する請求項１記載のヒト尿由来
   の抗血液凝固物質。 ａ、分子量： ７２，０００±３，０００ ［非還元状態でのＳＤＳ−ポリアクリル アミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）に より測定］ ｂ、糖含量（重量％）： 中性糖：５．５±１．０ ［フェノール硫酸法で測定］ アミノ糖：２．２±１．０ ［Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ法（Ｂｌｉｘ変法）で測定
   ］シアル酸：２．８±１．５ ［Ｗａｒｒｅｎ法で測定］ ｃ、紫外吸収：７．７±１．０ ［２８０ｎｍにおける１％水溶液の１ ｃｍ光路長の吸光度］ ｄ、等電点：３．９±０．２
3. （３）次に示す性質を有する請求項１記載のヒト尿由来
   の抗血液凝固物質。 ａ、分子量： ７９，０００±３，０００ ［非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによ り測定］ ｂ、糖含量（重量％）： 中性糖：６．２±１．０ ［フェノール硫酸法で測定］ アミノ糖：３．１±１．０ ［Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ法（Ｂｌｉｘ変法）で測定
   ］シアル酸：３．８±１．５ ［Ｗａｒｒｅｎ法で測定］ ｃ、紫外吸収：６．７±１．０ ［２８０ｎｍにおける１％水溶液の１ ｃｍ光路長の吸光度］ ｄ、等電点：３．８±０．２
4. （４）ヒト尿をｐＨ８．３±０．３に調整し、析出した
   沈澱物を除去した後に、ｐＨを７．３±０．２に調整し
   、６０±５℃、１５±５分間加熱処理を行った後、トロ
   ンビンをリガンドとして用いるアフィニティクロマトグ
   ラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾
   過クロマトグラフィーのうちから選ばれる少なくとも１
   つを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに
   記載のヒト尿由来の抗血液凝固物質の製造方法。
5. （５）請求項１に記載のヒト尿由来の抗血液凝固物質を
   有効成分として含有することを特徴とする、血液凝固能
   異常に係わる疾患の予防及び治療剤。
6. （６）請求項２に記載のヒト尿由来の抗血液凝固物質を
   有効成分として含有することを特徴とする、血液凝固能
   異常に係わる疾患の予防及び治療剤。
7. （７）請求項３に記載のヒト尿由来の抗血液凝固物質を
   有効成分として含有することを特徴とする、血液凝固能
   異常に係わる疾患の予防及び治療剤。