KR20140095559A - 패혈증의 치료 및/또는 개선을 위한 의약 - Google Patents

Abstract

트롬보모듈린을 유효 성분으로서 포함하고, 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 큰 값으로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에서의 패혈증을 효과적으로 치료 및/또는 개선하기 위한 의약.

Description

패혈증의 치료 및/또는 개선을 위한 의약{MEDICAMENT FOR THERAPEUTIC TREATMENT AND/OR IMPROVEMENT OF SEPSIS}

본 발명은 중증 패혈증 환자에서의 패혈증을 치료 및/또는 개선하기 위한 의약에 관한 것이다.

패혈증은, 감염에 의해 야기된 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome: SIRS)이다. 즉 감염의 존재에 덧붙여, SIRS 항목((1) 체온＞38℃ 또는 ＜36℃, (2) 심박수＞90/분, (3) 호흡수＞20/분 또는 PaCO₂＜32 torr, (4) 백혈구수＞12,000/μL 또는 ＜4000/μL 또는 미숙형 백혈구＞10%)의 2항목 이상을 만족하는 병태로 정의된다. 종래는, 혈액 중의 균체의 존재(균혈증)가 강조되어 왔지만, 이 정의에서는 반드시 혈액 배양 양성을 필요로 하지 않는다. 패혈증 중에서, 장기 장해, 장기 관류 저하 또는 저혈압을 나타내는 상태는 중증 패혈증(severe sepsis)이라고 불린다. 장기 관류 저하 또는 관류 이상에는, 젖산 아시도시스, 핍뇨, 의식 혼탁 등이 포함된다. 중증 패혈증 중에서, 충분한 수액 부하를 행해도 저혈압이 지속되는 것은 패혈증성 쇼크(septic shock)라고 불린다(비특허문헌 1). 이들 병태에서 보이는 순환 부전은, 교감 신경계의 기능 실조 혹은 호중구 등으로부터 방출되는 미디에이터에 의해 발생하고, 또한 장기 장해는 조직 산소 대사 실조(dysoxia)에 의해 발생하는 것으로 생각되고 있다.

한편, 트롬보모듈린은, 트롬빈과 특이적으로 결합하여 트롬빈의 혈액 응고 활성을 저해함과 동시에 트롬빈의 프로테인 C 활성화능을 현저히 촉진하는 작용을 갖는 물질로서 알려져, 강력한 혈액 응고 저해 작용을 갖는 것이 알려져 있다. 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 것이나, 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 것이 알려져 있다. 프로테인 C는, 혈액 응고 선용계에서 중요한 역할을 하고 있는 비타민 K 의존성의 단백질로, 트롬빈의 작용에 의해 활성화되어, 활성화 프로테인 C가 된다. 이 활성화 프로테인 C는, 생체 내에서 혈액 응고계 인자의 활성형 제Ⅴ 인자, 및 활성형 제Ⅷ 인자를 실활시키고, 또한 혈전 용해 작용을 갖는 플라스미노겐 액티베이터의 산생에 관여하고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 2). 따라서, 트롬보모듈린은, 이 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하여 항혈액응고제 또는 혈전 용해제로서 유용하다고 되어 있고, 응고 항진을 수반하는 질환의 치료, 예방에 유효하다는 동물 실험에 관한 보고도 있다(비특허문헌 3).

종래, 트롬보모듈린은, 인간을 비롯한 여러 동물종의 혈관 내피 세포 상에 발현하고 있는 당단백질로서 발견 취득되고, 그 후, 클로닝이 달성되었다. 즉, 유전자 공학적 수법을 이용하여 인간 폐 cDNA 라이브러리로부터 시그널 펩티드를 포함하는 인간 트롬보모듈린 전구체의 유전자를 클로닝하고, 또한 트롬보모듈린의 전유전자 서열을 해석하여, 시그널 펩티드(통상은, 18 아미노산 잔기가 예시됨)를 포함하는 575 잔기의 아미노산 서열이 밝혀져 있다(특허문헌 1). 시그널 펩티드가 절단된 성숙한 트롬보모듈린은, 그 성숙한 펩티드의 N 말단측으로부터 N 말단 영역(1-226번째 : 시그널 펩티드가 18 아미노산 잔기라고 생각한 경우의 위치 표시, 이하 동일), 6개의 EGF형 구조를 갖는 영역(227-462번째), O형 당쇄 부가 영역(463-498번째), 막 관통 영역(499-521번째), 그리고 세포질내 영역(522-557번째)의 5개의 영역으로 구성되어 있다. 전체 길이의 트롬보모듈린과 동일한 활성을 갖는 부분(즉, 최소 활성 단위)은, 6개의 EGF형 구조를 갖는 영역 중, 주로 N 말단측으로부터 4, 5, 및 6번째의 EGF형 구조로 이루어지는 부분인 것이 알려져 있다(비특허문헌 4).

전체 길이의 트롬보모듈린은 계면 활성제의 존재하가 아니면 용해하기 어려워, 제제로서는 계면 활성제의 첨가가 필수인 반면, 계면 활성제의 비존재하라도 깨끗히 용해할 수 있는 가용성 트롬보모듈린의 존재가 알려져 있다. 가용성 트롬보모듈린은, 적어도, 막 관통 영역의 일부 또는 전부를 함유시키지 않도록 조제하면 되고, 예컨대, N 말단 영역과 6개의 EGF형 구조를 갖는 영역과 O형 당쇄 부가 영역의 3개의 영역만으로 이루어지는(즉, 서열번호 9의 제19∼516위의 아미노산 서열로 이루어지는) 가용성 트롬보모듈린은, 재조합 기술의 응용에 의해 취득할 수 있는 것, 그리고 그 재조합체 가용성 트롬보모듈린은, 천연의 트롬보모듈린의 활성을 갖고 있는 것이 확인되어 있다(특허문헌 1). 그 외에 가용성 트롬보모듈린의 예로서 몇가지 보고가 있다(특허문헌 2∼9). 혹은 천연형으로서 인간 뇨 유래의 가용성 트롬보모듈린 등도 예시된다(특허문헌 10, 11).

덧붙여서, 유전자에 있어서는, 자연의 변이 또는 취득시의 변이에 의해, 많은 케이스에서 확인되는 바와 같이, 인간에 있어서도 다형성(多形性)의 변이가 발견되고 있고, 상술한 575 잔기의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 트롬보모듈린 전구체의 제473위의 아미노산에 있어서 Val인 것과, Ala인 것이 현재 확인되어 있다. 이 아미노산을 코드하는 염기 서열에 있어서는, 제1418위에 있어서, 각각 T와 C의 변이에 상당한다(비특허문헌 5). 그러나, 활성 및 물성에 있어서는 전혀 차이가 없고, 양자는 실질적으로 동일한 것으로 생각할 수 있다.

트롬보모듈린은 파종성(범발성) 혈관내 혈액 응고 증후군(이하, DIC라고 하는 경우가 있음)의 치료에 있어서 효과가 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 6). 트롬보모듈린의 용도로는 상술한 것 외에, 예컨대, 급성 관동맥 증후군(ACS), 혈전증, 말초 혈관 폐색증, 폐색성 동맥 경화증, 혈관염, 심장 수술에 속발하는 기능성 장해, 장기 이식의 합병증, 협심증, 일과성 뇌허혈 발작, 임신 중독증, 당뇨병, 간 VOD(Liver veno-occlusive disease; 전격성 간염이나 골수 이식 후의 간정맥 폐색증), 심부정맥 혈전증(DVT; Deep venous thrombosis) 등이나, 또한 패혈증이나 성인 호흡 궁박 증후군(ARDS)의 질환의 치료 및 예방에 이용될 것이 기대되고 있다(특허문헌 12).

특허문헌 1 : 일본 특허 공개 소64-6219호 공보 특허문헌 2 : 일본 특허 공개 평5-213998호 공보 특허문헌 3 : 일본 특허 공개 평2-255699호 공보 특허문헌 4 : 일본 특허 공개 평3-133380호 공보 특허문헌 5 : 일본 특허 공개 평3-259084호 공보 특허문헌 6 : 일본 특허 공개 평4-210700호 공보 특허문헌 7 : 국제 공개 WO92/00325호 특허문헌 8 : 국제 공개 WO92/03149호 특허문헌 9 : 국제 공개 WO93/15755호 특허문헌 10 : 일본 특허 공개 평3-86900호 공보 특허문헌 11 : 일본 특허 공개 평3-218399호 공보 특허문헌 12 : 국제 공개 WO2003/061687호

비특허문헌 1 : American Colledge of Chest Physicians, CHEST/101/6/JUNE, 1992 : 1481-1483 비특허문헌 2 : 스즈키 코지, 의학의 진보 1983 ; 125 : 901 비특허문헌 3 : Gomi K et al., Blood 1990 ; 75 : 1396-1399 비특허문헌 4 : Zushi M et al., J Biol Chem 1989 ; 246 : 10351-10353 비특허문헌 5 : Wen DZ et al, Biochemistry 1987 ; 26 : 4350-4357 비특허문헌 6 : S. M. Bates et al., Br. J. of Pharmacol., 2005 ; 144 : 1017-1028

본 발명의 과제는, 중증 패혈증 환자에서의 패혈증을 효과적으로 치료 및/또는 개선하기 위한 의약, 또는 그 방법을 제공하는 것에 있다.

패혈증 환자에서의 혈장 검체의 국제 표준비(International Normalized Ratio, 이하, 「INR」이라고 약기하는 경우가 있음)는, 응고 이상(Coagulopathy)을 의미하는 것으로서 공지되어 있다. 예컨대, 2003년의 국제 구급 치료 의학회(CCM)에서 보고된 응고 이상의 지표로는, aPPT＞60초와 함께, INR＞1.5가 제시되어 있다(Crit. Care Med., 2003 ; 31 : 1250-1256). 그러나, 이 INR 값은 임상 시험 등에 의해 검증된 것은 아니며, 아직 명확한 결과로서 확정된 것은 아니다. 실제로, 항응고제인 조직 인자 경로 억제제의 티파코진(Tifacogin)의 중증 패혈증 환자를 대상으로 한 제3상 임상 시험에 있어서, INR＞1.2의 환자를 주요한 대상으로 하여 실시한 결과로서, INR≤1.2의 환자군 쪽이 INR＞1.2의 환자군보다 효과가 양호했다는 취지를 보고하고 있다(JAMA, July 9, 2003, Vol.290. No.2, P238-247). 한편으로 본 임상 시험의 결과 중에서, INR＞1.2의 환자 집단 중에서는, INR＞1.5의 환자 쪽이 INR＞1.2의 환자보다 효과가 높은 경향이 있었던 것이 보고되어 있다. 또한 유일하게 패혈증의 임상 시험에 있어서 유효성이 나타난 자이그리스(Xigris)에 있어서도, 대상 환자의 대다수(93.4%)에서 프로트롬빈 시간(PT)의 연장이 확인되어 있다.

이와 같이, 패혈증에 대한 항응고제의 치료시에는, 응고 이상을 수반하는 환자를 대상으로 함으로써, 높은 효과가 일부의 시험 결과로부터 기대되기는 하지만, 그 반대의 결과도 얻어지는 등, 응고 이상의 정의는 아직 확정되었다고는 말하기 어렵다. 즉, INR 값을 이용하여 대상 환자를 어떻게 규정하면 양호한 결과가 얻어질 것인가라는 명제에 관해서는 아직 명확해져 있지 않고, 어떠한 INR 값을 갖는 패혈증 환자에게 약제가 특히 유효한가에 관한 기술 상식도 존재하지 않는다. INR 값과 치료 효과의 관계에 관해서는, 그 일부가 겨우 각 약제마다의 개별 케이스로서 알려져 있는 것에 불과한 것으로 여겨진다.

이러한 가운데, 본 발명자들은 항응고약 중에서도 트롬보모듈린에 착안하여, 패혈증에 대한 치료 및/또는 개선 효과에 관해 예의 검토를 행했다. 그 결과, 패혈증 환자 중에서도 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자(다만, 간장 또는 신장만의 장기 장해를 갖는 패혈증 환자를 제외함)를 대상으로 한 경우에는, 장기 장해가 없는 환자에 비해, 의외로 환자에서의 INR이 1.4보다 큰 경우에, 보다 효과적으로 패혈증을 치료 및/또는 개선할 수 있는 것, 즉 트롬보모듈린의 패혈증 치료 및/또는 개선에 관해, 패혈증 환자 중에서도 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자와 INR＞1.4의 사이에 당업자는 예상할 수 없는 특별한 관계가 있는 것을 발견했다. 또한, 놀랍게도 INR이 1.4보다 크고 1.6 이하의 값인 중증 패혈증 환자에 있어서는, 트롬보모듈린-플라세보 사이의 사망률차가 15%를 초과한다는 특히 현저한 효과가 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 사망률차가 15%라는 이 수치는, 현재 유일한 패혈증 치료제로서 유럽에서 판매되고 있는 자이그리스(Xigris)가 갖는 약제-플라세보 사이의 사망률차가 6% 정도인(N. Engl. J. Med., Vol.344, No.10, March 8, 2001, P699-709) 것을 생각하면 약 2.5배 정도의 크기라는 현저한 수치로서, 본 발명의 일 양태는 매우 놀라운 효과를 갖고 있음을 알 수 있다.

즉, 본 발명으로서 구체적으로는 이하의 것을 들 수 있다.

[A1] 트롬보모듈린을 유효 성분으로서 포함하는 패혈증의 치료 및/또는 개선을 위한 의약으로서, 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 큰 값 인 중증 패혈증 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여되기 위한 상기 의약.

[A1-2] 트롬보모듈린을 유효 성분으로서 포함하는 응고 이상을 수반하는 패혈증의 치료 및/또는 개선을 위한 의약으로서, 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 큰 값인 중증 패혈증 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여되기 위한 상기 의약.

[A2] 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 크고 1.6 이하의 값인 중증 패혈증 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여되기 위한, 상기 [A1] 또는 [A1-2]에 기재된 의약.

[A3] 중증 패혈증 환자가, 간장 또는 신장만의 장기 장해를 갖는 패혈증 환자를 제외한 중증 패혈증 환자인 상기 [A1]∼[A2] 중 어느 하나에 기재된 의약.

한편, 상기 [A1]∼[A2]와 같이 인용하는 항 번호가 범위로 표시되고, 그 범위 내에 [A1-2] 등의 가지 번호를 갖는 항이 배치되어 있는 경우에는, [A1-2] 등의 가지 번호를 갖는 항도 인용되는 것을 의미한다. 이하에 있어서도 마찬가지이다.

[A4] 간장, 신장, 호흡기, 및 순환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여되기 위한, 상기 [A1]∼[A3] 중 어느 하나에 기재된 의약.

[A5] 상기 트롬보모듈린이 가용성 트롬보모듈린인 상기 [A1]∼[A4] 중 어느 하나에 기재된 의약.

[A5-2] 상기 트롬보모듈린이, 하기 (1)∼(4)의 성질을 갖는 트롬보모듈린인 상기 [A1]∼[A5] 중 어느 하나에 기재된 의약;

(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,

(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,

(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용, 및

(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용.

[A5-3] 상기 트롬보모듈린이, 하기 (1)∼(5)의 성질을 갖는 가용성 트롬보모듈린인 상기 [A1]∼[A5] 중 어느 하나에 기재된 의약;

(1) 트롬빈과 선택적으로 결합하는 작용,

(2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용,

(3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용,

(4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및

(5) 항염증 작용.

[A6] 상기 트롬보모듈린이, 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 숙주 세포에 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포로부터 취득되는 펩티드인 상기 [A1]∼[A5-3] 중 어느 하나에 기재된 의약.

[A7] 상기 트롬보모듈린이, 하기 (i-1) 또는 (i-2) 중 어느 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드가 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드인 상기 [A1]∼[A6] 중 어느 하나에 기재된 의약;

(i-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19∼516위의 아미노산 서열, 또는

(i-2) 상기 (i-1)의 아미노산 서열의 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열.

[A7-2] 상기 가용성 트롬보모듈린이,

(i) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제367∼480위의 아미노산 서열을 포함하며, 또한 하기 (ii-1) 또는 (ii-2) 중 어느 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드가 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드인 상기 [A1]∼[A6] 중 어느 하나에 기재된 의약;

(ii-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19∼244위의 아미노산 서열, 또는

(ii-2) 상기 (ii-1)의 아미노산 서열의 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열.

[A8] 상기 트롬보모듈린이, 0.005∼1 mg/kg의 투여량으로 5분 이내에 정맥내 급속 투여되는, 상기 [A1]∼[A7-2] 중 어느 하나에 기재된 의약.

[B1] 패혈증을 치료 및/또는 개선하는 방법으로서, 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 큰 값인 중증 패혈증 환자에게 트롬보모듈린을 투여하는 공정을 포함하는 상기 방법.

[B1-2] 응고 이상을 수반하는 패혈증을 치료 및/또는 개선하는 방법으로서, 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 큰 값인 중증 패혈증 환자에게 트롬보모듈린을 투여하는 공정을 포함하는 상기 방법.

[B2] 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 크고 1.6 이하의 값인 중증 패혈증 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 상기 [B1] 또는 [B1-2]에 기재된 방법.

[B3] 중증 패혈증 환자가, 간장 또는 신장만의 장기 장해를 갖는 패혈증 환자를 제외한 중증 패혈증 환자인 상기 [B1]∼[B2] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[B4] 간장, 신장, 호흡기, 및 순환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여하는 공정을 포함하는, 상기 [B1]∼[B3] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[B5] 상기 트롬보모듈린이 가용성 트롬보모듈린인 상기 [B1]∼[B4] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[B6] 상기 트롬보모듈린이, 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 숙주 세포에 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포로부터 취득되는 펩티드인 상기 [B1]∼[B5] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[B7] 상기 트롬보모듈린이, 하기 (i-1) 또는 (i-2) 중 어느 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드가 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드인 상기 [B1]∼[B6] 중 어느 하나에 기재된 방법;

(i-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19∼516위의 아미노산 서열, 또는

(i-2) 상기 (i-1)의 아미노산 서열의 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열.

[B8] 상기 트롬보모듈린이, 0.005∼1 mg/kg의 투여량으로 5분 이내에 정맥내 급속 투여되는, 상기 [B1]∼[B7] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[B8-2] 상기 트롬보모듈린이 상기 [A5-2], [A5-3], 또는 [A7-2] 중 어느 하나에 기재된 특징을 갖는 트롬보모듈린인, 상기 [B1]∼[B8] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[B9] 패혈증의 치료 및/또는 개선을 위한 의약으로서의 트롬보모듈린의 사용으로서, 상기 의약이 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 큰 값인 중증 패혈증 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여되기 위한 의약인 상기한 사용.

[B9-2] 상기 트롬보모듈린이 상기 [A5-2], [A5-3], 또는 [A7-2] 중 어느 하나에 기재된 특징을 갖는 트롬보모듈린인, 상기 [B9]에 기재된 사용.

[B9-3] 상기 [A1]∼[A8] 중 어느 하나에 기재된 특징을 갖는, 상기 [B9]에 기재된 사용.

[C1] 트롬보모듈린을 유효 성분으로서 포함하는 파종성 혈관내 혈액 응고 증후군의 치료 및/또는 개선을 위한 의약으로서, 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 큰 값인 파종성 혈관내 혈액 응고 증후군 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 파종성 혈관내 혈액 응고 증후군 환자에게 투여되기 위한 상기 의약.

[C2] 상기 [A1]∼[A8] 중 어느 하나에 기재된 특징을 갖는, 상기 [C1]에 기재된 의약.

본 발명의 트롬보모듈린을 함유하는 의약에 의해, 환자의 혈장 검체의 INR이 1.4보다 큰 값인 중증 패혈증 환자에서의 패혈증을 효과적으로 치료 및/또는 개선할 수 있다.

이하, 본 발명을 몇가지의 바람직한 양태(본 발명을 실시하기 위한 바람직한 형태 : 이하, 본 명세서에 있어서 「실시형태」라고 약기하는 경우가 있음)에 관해 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기에 설명하는 특정한 양태에 한정되는 경우는 없다.

본 실시형태에서의 트롬보모듈린은, (1) 트롬빈과 선택적으로 결합하고 (2) 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 갖는 것이 알려져 있다. 또한, (3) 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용, (4) 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용, 및/또는 (5) 항염증 작용이 통상 확인되는 것이 바람직하다. 이들 트롬보모듈린이 갖는 작용을 트롬보모듈린 활성이라고 하는 경우가 있다.

트롬보모듈린 활성으로는, 상기 (1) 및 (2)의 작용을 갖고, 또한 상기 (1)∼(4)의 작용을 갖고 있는 것이 바람직하다. 또한, 트롬보모듈린 활성으로는, (1)∼(5)의 작용을 전부 구비하고 있는 것이 보다 바람직하다.

트롬보모듈린의 트롬빈과의 결합 작용은, 예컨대, Thrombosis and Haemostasis 1993 70(3): 418-422나 The Journal of Biological Chemistry 1989 Vol.264, No.9 pp.4872-4876을 비롯한 각종 공지 문헌에 기재된 시험 방법에 의해 확인할 수 있다. 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용은, 예컨대, 일본 특허 공개 소64-6219호 공보를 비롯한 각종 공지 문헌에 명확히 기재된 시험 방법에 의해 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용의 활성량이나 그 유무를 용이하게 확인할 수 있는 것이다. 또한, 트롬빈에 의한 응고 시간을 연장하는 작용, 및/또는 트롬빈에 의한 혈소판 응집을 억제하는 작용에 관해서도 마찬가지로 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 항염증 작용에 관해서도, 예컨대 blood 2008 112: 3361-3670, The Journal of Clinical Investigation 2005 115 5: 1267-1274를 비롯한 각종 공지 문헌에 기재된 시험 방법에 의해 확인할 수 있다.

본 발명에서의 트롬보모듈린으로는, 트롬보모듈린 활성을 갖고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 계면 활성제의 비존재하에서 물에 가용인 가용성 트롬보모듈린인 것이 바람직하다. 가용성 트롬보모듈린의 용해성의 바람직한 예시로는, 물, 예컨대 주사용 증류수에 대하여(트리톤 X-100이나 폴리도카놀 등의 계면 활성제의 비존재하, 통상은 중성 부근에서), 1 mg/mL 이상, 또는 10 mg/mL 이상을 들 수 있고, 바람직하게는 15 mg/mL 이상, 또는 17 mg/mL 이상을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 20 mg/mL 이상, 25 mg/mL 이상, 또는 30 mg/mL 이상이 예시되고, 특히 바람직하게는 60 mg/mL 이상을 들 수 있고, 경우에 따라서는, 80 mg/mL 이상, 또는 100 mg/mL 이상을 각각 들 수 있다. 가용성 트롬보모듈린이 용해되었는지의 여부를 판단함에 있어서는, 용해한 후에, 예컨대 백색 광원의 바로 아래, 약 1000 룩스 밝기의 위치에서, 육안으로 관찰한 경우에, 깨끗하고 맑아, 명확히 확인되는 정도의 불용성 물질을 포함하지 않는 것이 단적인 지표가 되는 것으로 이해된다. 또한, 여과하여 잔사의 유무를 확인할 수도 있다.

트롬보모듈린은 상기 개시한 바와 같이, 트롬보모듈린 활성을 갖고 있으면, 그 분자량은 한정되지 않지만, 분자량의 상한으로는 100,000 이하가 바람직하고, 90,000 이하가 보다 바람직하고, 80,000 이하가 더욱 바람직하고, 70,000 이하가 특히 바람직하고, 분자량의 하한으로는, 50,000 이상이 더욱 바람직하고, 60,000 이상이 특히 바람직하다. 가용성 트롬보모듈린의 분자량은, 단백질의 분자량을 측정하는 통상의 방법으로 용이하게 측정이 가능한데, 질량 분석법으로 측정하는 것이 바람직하고, MALDI-TOF-MS 법이 보다 바람직하다. 원하는 범위의 분자량의 가용성 트롬보모듈린을 취득하기 위해서는, 후술하는 바와 같이, 가용성 트롬보모듈린을 코드하는 DNA를 벡터에 의해 숙주 세포에 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포를 배양함으로써 취득되는 가용성 트롬보모듈린을 컬럼 크로마토그래피 등에 의해 분획함으로써 취득할 수 있다.

본 발명에서의 트롬보모듈린으로는, 인간형의 트롬보모듈린에 있어서 트롬보모듈린 활성의 중심 부위로서 알려져 있는 서열번호 1의 제19∼132위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 서열번호 1의 제19∼132위의 아미노산 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 상기 서열번호 1의 제19∼132위의 아미노산 서열은, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용, 즉 트롬보모듈린 활성을 갖는 한 자연 또는 인공적으로 변이되어 있어도 좋고, 즉 서열번호 1의 제19∼132위의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가되어 있어도 좋다. 허용되는 변이의 정도는, 트롬보모듈린 활성을 가지면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 아미노산 서열로서 50% 이상의 상동성이 예시되고, 70% 이상의 상동성이 바람직하고, 80% 이상의 상동성이 보다 바람직하고, 90% 이상의 상동성이 더욱 바람직하고, 95% 이상의 상동성이 특히 바람직하고, 98% 이상의 상동성이 가장 바람직하다. 이와 같이 아미노산 서열의 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가되어 있는 아미노산 서열을 상동 변이 서열이라고 한다. 이들 변이에 관해서는 후술하는 바와 같이, 통상의 유전자 조작 기술을 이용하면 용이하게 취득 가능하다. 트롬보모듈린은 상기 서열을 갖고, 적어도 트롬보모듈린 전체로서 트롬빈과 선택적으로 결합하고 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용을 갖고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 동시에 항염증 작용을 갖는 것이 바람직하다.

서열번호 3의 서열은, 서열번호 1의 제125위의 아미노산인 Val이 Ala로 변이된 것인데, 본 발명에서의 트롬보모듈린으로서, 서열번호 3의 제19∼132위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것도 바람직하다.

이와 같이 본 발명에서의 트롬보모듈린으로는, 서열번호 1 혹은 서열번호 3의 제19∼132위의 서열, 또는 이들의 상동 변이 서열을 적어도 갖고, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 서열번호 1 혹은 서열번호 3에서의 제19∼132위 혹은 제17∼132위의 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 상기 서열의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드를 바람직한 예로서 들 수 있고, 서열번호 1 혹은 서열번호 3의 제19∼132위의 서열로 이루어지는 펩티드가 보다 바람직하다. 또한, 서열번호 1 혹은 서열번호 3에서의 제19∼132위 혹은 제17∼132위의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드가 보다 바람직한 별도의 양태도 있다.

또한 본 발명에서의 트롬보모듈린의 별도의 양태로서, 서열번호 5의 제19∼480위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 서열번호 5의 제19∼480위의 아미노산 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 상기 서열번호 5의 제19∼480위의 아미노산 서열은, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용, 즉 트롬보모듈린 활성을 갖는 한 그 상동 변이 서열이어도 좋다.

서열번호 7의 서열은, 서열번호 5의 제473위의 아미노산인 Val이 Ala로 변이된 것인데, 본 발명에서의 트롬보모듈린으로서, 서열번호 7의 제19∼480위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것도 바람직하다.

이와 같이 본 발명에서의 트롬보모듈린으로는, 서열번호 5 혹은 서열번호 7의 제19∼480위의 서열, 또는 이들의 상동 변이 서열을 적어도 갖고, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 서열번호 5 혹은 서열번호 7에서의 제19∼480위 혹은 제17∼480위의 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 상기 서열의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드를 바람직한 예로서 들 수 있고, 서열번호 5 혹은 서열번호 7의 제19∼480위의 서열로 이루어지는 펩티드가 보다 바람직하다. 또한, 서열번호 5 혹은 서열번호 7에서의 제19∼480위 혹은 제17∼480위의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드가 보다 바람직한 별도의 양태도 있다.

또한 본 발명에서의 트롬보모듈린의 별도의 양태로서, 서열번호 9의 제19∼515위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것이 바람직하고, 서열번호 9의 제19∼515위의 아미노산 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않는다. 상기 서열번호 9의 제19∼515위의 아미노산 서열은, 트롬빈에 의한 프로테인 C의 활성화를 촉진하는 작용, 즉 트롬보모듈린 활성을 갖는 한 그 상동 변이 서열이어도 좋다.

서열번호 11의 서열은, 서열번호 9의 제473위의 아미노산인 Val이 Ala로 변이된 것인데, 본 발명에서의 트롬보모듈린으로서, 서열번호 11의 제19∼515위의 아미노산 서열을 포함하고 있는 것도 바람직하다.

이와 같이 본 발명에서의 트롬보모듈린으로는, 서열번호 9 혹은 서열번호 11의 제19∼515위의 서열, 또는 이들의 상동 변이 서열을 적어도 갖고, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드 서열을 포함하고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 서열번호 9 혹은 서열번호 11에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제17∼516위, 혹은 제17∼515위의 서열로 이루어지는 펩티드, 또는 상기 서열의 상동 변이 서열로 이루어지고 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드를 보다 바람직한 예로서 들 수 있고, 서열번호 9에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제17∼516위, 혹은 제17∼515위의 서열로 이루어지는 펩티드가 특히 바람직하다. 이들의 혼합물도 바람직한 예 로서 들 수 있다. 또한, 서열번호 11에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제17∼516위, 혹은 제17∼515위의 서열로 이루어지는 펩티드가 특히 바람직한 별도의 양태도 있다. 이들의 혼합물도 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한 이들의 상동 변이 서열로 이루어지고, 적어도 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드도 바람직한 예로서 들 수 있다. 트롬보모듈린은, 동시에 항염증 작용을 갖는 것이 바람직하다.

상동 변이 서열을 갖는 펩티드란, 상술한 바와 같지만, 대상으로 하는 펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상, 즉 하나 또는 복수의 아미노산, 더욱 바람직하게는 여러개(예컨대 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 특히 바람직하게는 1 내지 3개)의 아미노산이 치환, 결실, 부가되어 있어도 좋은 펩티드도 의미한다. 허용되는 변이의 정도는, 트롬보모듈린 활성을 가지면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 아미노산 서열로서 50% 이상의 상동성이 예시되고, 70% 이상의 상동성이 바람직하고, 80% 이상의 상동성이 보다 바람직하고, 90% 이상의 상동성이 더욱 바람직하고, 95% 이상의 상동성이 특히 바람직하고, 98% 이상의 상동성이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명에서의 트롬보모듈린으로는, 일본 특허 공개 소64-6219호 공보에서의 서열번호 14(462 아미노산 잔기)로 이루어지는 펩티드, 서열번호 8(272 아미노산 잔기)로 이루어지는 펩티드, 또는 서열번호 6(236 아미노산 잔기)으로 이루어지는 펩티드도 바람직한 예로서 들 수 있다.

본 발명에서의 트롬보모듈린으로는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 제19∼132위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드이면 특별히 한정되지 않지만, 그 중에서도 서열번호 5 또는 서열번호 7의 제19∼480위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드인 것이 바람직하고, 서열번호 9 혹은 서열번호 11의 제19∼515위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드인 것이 보다 바람직하다. 서열번호 9 혹은 서열번호 11의 제19∼515위의 아미노산 서열을 적어도 갖고 있는 펩티드로는, 서열번호 9 혹은 서열번호 11의 각각에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제19∼514위, 제17∼516위, 제17∼515위, 혹은 제17∼514위의 서열로 이루어지는 펩티드를 보다 바람직한 예로서 들 수 있다. 또한, 서열번호 9 혹은 서열번호 11의 각각에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제19∼514위, 제17∼516위, 제17∼515위, 혹은 제17∼514위의 서열로 이루어지는 펩티드의, 서열번호 9 혹은 서열번호 11 각각에 관한 혼합물도 보다 바람직한 예로서 들 수 있다.

상기 혼합물의 경우, 서열번호 9 혹은 서열번호 11의 각각에서의 제17위로부터 시작되는 펩티드와 제19위로부터 시작되는 펩티드의 혼합 비율로는, (30 : 70)∼(50 : 50)이 예시되고, (35 : 65)∼(45 : 55)를 바람직한 예로서 들 수 있다.

또한, 서열번호 9 혹은 서열번호 11의 각각에서의 제514위, 제515위, 및 제516위에서 끝나는 펩티드의 혼합 비율로는, (0 : 0 : 100)∼(0 : 90 : 10)이 예시되고, 경우에 따라서는, (0 : 70 : 30)∼(10 : 90 : 0), (10 : 0 : 90)∼(20 : 10 : 70)이 예시된다.

이들 펩티드의 혼합 비율은, 통상의 방법에 의해 구할 수 있다.

또, 서열번호 1의 제19∼132위의 서열은, 서열번호 9의 제367∼480위의 서열에 상당하고, 서열번호 5의 제19∼480위의 서열은, 서열번호 9의 제19∼480위의 서열에 상당한다. 또한, 서열번호 3의 제19∼132위의 서열은, 서열번호 11의 제367∼480위의 서열에 상당하고, 서열번호 7의 제19∼480위의 서열은, 서열번호 11의 제19∼480위의 서열에 상당한다. 또한, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 및 11의 각각에서의 제1∼18위의 서열은, 전부 동일한 서열이다.

이들 본 발명에서의 트롬보모듈린은 후술하는 바와 같이, 이들의 펩티드를 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 또는 서열번호 12 등의 염기 서열)를 벡터에 의해 숙주 세포에 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포로부터 취득할 수 있다.

또한, 이들의 펩티드는, 상기한 아미노산 서열을 가지면 되고, 당쇄가 부여되어 있어도 좋고, 또한 부여되어 있지 않아도 좋고, 이 점은 특별히 한정되지 않는다. 또한 유전자 조작에 있어서는, 사용하는 숙주 세포의 종류에 따라, 당쇄의 종류나, 부가 위치나 부가의 정도는 상이한 것이고, 어느 것이나 이용할 수 있다. 당쇄의 결합 위치 및 종류에 관해서는, 일본 특허 공개 평11-341990호 공보에 기재된 사실이 알려져 있고, 본 발명에서의 트롬보모듈린에 관해서도 동일한 위치에 동일한 당쇄가 부가되는 경우가 있다. 본 실시형태의 트롬보모듈린에는 푸코실 바이안테너리형과 푸코실 트리안테너리형의 2종류의 N 결합형 당쇄가 결합하고, 그 비율은 (100 : 0)∼(60 : 40)이 예시되고, (95 : 5)∼(60 : 40)이 바람직하고, (90 : 10)∼(70 : 30)을 보다 바람직한 예로서 들 수 있다. 이들 당쇄의 비율은, 생물 화학 실험법 23 당단백질 당쇄 연구법, 학회 출판 센터(1990년) 등에 기재된 2차원 당쇄 맵에 의해 측정할 수 있다. 또한, 본 실시형태의 트롬보모듈린의 당 조성을 조사하면, 중성당, 아미노당 및 시알산이 검출되고, 단백질 함량에 대하여, 각각 독립적으로 중량비로 1∼30%의 비율이 예시되고, 2∼20%가 바람직하고, 5∼10%가 보다 바람직하다. 이들 당 함량은, 신생 화학 실험 강좌 3 당질 I 당단백질(상), 동경 화학 동인(1990년)에 기재된 방법(중성당 : 페놀-황산법, 아미노당 : 엘손-모르간법, 시알산 : 과요오드산-레조르시놀법)에 의해 측정할 수 있다.

후술하는 바와 같이, 트롬보모듈린의 취득은 유전자 조작에 의해 취득하는 것에 한정되는 것은 아니지만, 유전자 조작에 의해 취득하는 경우에는, 발현시에 이용할 수 있는 시그널 서열로는, 서열번호 9의 제1∼18위의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열, 서열번호 9의 제1∼16위의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열, 기타 공지된 시그널 서열, 예컨대, 인간 조직 플라스미노겐 액티베이터의 시그널 서열을 이용할 수 있다(국제 공개 88/9811호 공보).

트롬보모듈린을 코드하는 DNA 서열을 숙주 세포에 도입하는 경우에는, 바람직하게는 트롬보모듈린을 코드하는 DNA 서열을, 벡터, 특히 바람직하게는, 동물 세포에 있어서 발현 가능한 발현 벡터에 삽입하여 도입하는 방법을 들 수 있다. 발현 벡터란, 프로모터 서열, mRNA에 리보솜 결합 부위를 부여하는 서열, 발현하고 싶은 단백질을 코드하는 DNA 서열, 스플라이싱 시그널, 전사 종결의 터미네이터 서열, 복제 기원 서열 등으로 구성되는 DNA 분자이고, 바람직한 동물 세포 발현 벡터의 예 로는, Mulligan RC 등[Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 2072-2076]이 보고하고 있는 pSV2-X나, Howley PM 등[Methods in Emzymology 1983; 101: 387-402, Academic Press]이 보고하고 있는 pBP69T(69-6) 등을 들 수 있다. 또한, 미생물에 있어서 발현 가능한 발현 벡터에 삽입하는 별도의 바람직한 양태도 있다.

이들 펩티드를 제조할 때에 이용할 수 있는 숙주 세포로는, 동물 세포를 들 수 있다. 동물 세포로는, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS-1 세포, COS-7 세포, VERO(ATCCCCL-81) 세포, BHK 세포, 개 신장 유래 MDCK 세포, 햄스터 AV-12-664 세포 등이, 또한 인간 유래 세포로서 HeLa 세포, WI38 세포, 인간 293 세포, PER.C6 세포를 들 수 있다. CHO 세포가 매우 일반적이고 바람직하며, CHO 세포에 있어서는, 디히드로엽산 환원 효소(DHFR) 결손 CHO 세포가 더욱 바람직하다.

또한, 유전자 조작의 과정이나 펩티드의 제조 과정에서, 대장균 등의 미생물도 많이 사용되고, 각각에 알맞은 숙주-벡터계를 사용하는 것이 바람직하고, 상술한 숙주 세포에 있어서도, 적절한 벡터계를 선택할 수 있다. 유전자 재조합 기술에 이용하는 트롬보모듈린의 유전자는, 클로닝되어 있고, 또한 트롬보모듈린의 유전자 재조합 기술을 이용한 제조예가 개시되어 있고, 나아가서는 그 정제품을 얻기 위한 정제 방법도 알려져 있다[일본 특허 공개 소64-6219호 공보, 일본 특허 공개 평2-255699호 공보, 일본 특허 공개 평5-213998호 공보, 일본 특허 공개 평5-310787호 공보, 일본 특허 공개 평7-155176호 공보, J Biol Chem 1989; 264: 10351-10353]. 따라서 본 발명에서 이용하는 트롬보모듈린은, 상기한 보고에 기재되어 있는 방법을 이용함으로써, 혹은 이들에 기재된 방법에 준함으로써 제조할 수 있다. 예컨대 일본 특허 공개 소64-6219호 공보에서는, 전체 길이의 트롬보모듈린을 코드하는 DNA를 포함하는 플라스미드 pSV2TMJ2를 포함하는, 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) K-12 균주 DH5(ATCC 기탁 번호 67283호)가 개시되어 있다. 또한, 이 균주를 생명 연구(현독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터)의 균주(에쉐리키아 콜라이 DH5/pSV2TM J2)(FERM BP-5570)를 이용할 수도 있다. 이 전체 길이의 트롬보모듈린을 코드하는 DNA를 원료로 하여, 공지된 유전자 조작 기술에 의해, 본 발명의 트롬보모듈린을 조제할 수 있다.

본 실시형태에서의 트롬보모듈린은, 종래 공지된 방법 또는 그것에 준하여 조제하면 되는데, 예컨대, 상기 야마모토 등의 방법[일본 특허 공개 소64-6219호 공보], 또는 일본 특허 공개 평5-213998호 공보를 참고로 할 수 있다. 즉 인간 유래의 트롬보모듈린 유전자를 유전자 조작 기술에 의해, 예컨대, 서열번호 9의 아미노산 서열을 코드하는 DNA로 하고, 또한 필요에 따른 개변을 행하는 것도 가능하다. 이 개변으로는, 예컨대, 서열번호 11의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 12의 염기 서열로 이루어짐)로 하기 위해, 서열번호 9의 제473위의 아미노산을 코드하는 코돈(특히, 서열번호 10의 제1418위의 염기)에, Zoller MJ 등[Methods in Enzymology 1983; 100: 468-500, Academic Press]의 방법에 따라, 부위 특이적 변이를 행한다. 예컨대, 서열번호 10의 제1418위의 염기 T는, 서열번호 13에 표시된 염기 서열을 갖는 변이용 합성 DNA를 이용하여 염기 C로 변환한 DNA로 할 수 있다.

이와 같이 하여 조제한 DNA를, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 삽입하여, 형질 전환 세포로 하고, 적절히 선택하고, 이 세포를 배양하여 얻은 배양액으로부터, 공지된 방법에 의해 정제된 트롬보모듈린을 제조할 수 있다. 상술한 바와 같이 서열번호 9의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(서열번호 10)를 상기 숙주 세포에 트랜스펙트하는 것이 바람직하다.

본 실시형태에서의 트롬보모듈린의 생산 방법은, 상기한 방법에 한정되지 않고, 예컨대, 뇨나 혈액, 기타 체액 등으로부터 추출 정제함으로써도 가능하고, 또한 트롬보모듈린을 생산하는 조직 또는 이들 조직 배양액 등으로부터 추출 정제하는 것도, 또한 필요에 따라 더욱 단백 분해 효소에 의해 절단 처리하는 것도 가능하다.

상기한 형질 전환 세포를 배양함에 있어서는, 통상의 세포 배양에 이용되는 배지를 사용하는 것이 가능하고, 그 형질 전환 세포를 각종 배지에서 사전에 배양하여, 최적의 배지를 선택하는 것이 바람직하다. 예컨대, MEM 배지, DMEM 배지, 199 배지 등의 공지된 배지를 기본 배지로 하고, 더욱 개량 혹은 각종 배지용의 서플리먼트를 첨가한 배지를 사용하면 된다. 배양 방법으로는, 혈청을 첨가한 배지에서 배양하는 혈청 배양, 또는 혈청을 첨가하지 않는 배지에서 배양하는 무혈청 배양을 들 수 있다. 배양 방법은 특별히 한정되는 경우는 없지만, 무혈청 배양이 바람직하다.

혈청 배양에 있어서, 배지에 혈청을 첨가하는 경우에는 소 혈청이 바람직하다. 소 혈청에는, 소 태아 혈청, 신생아 소 혈청, 송아지 혈청, 성장한 소 혈청 등이 있는데, 세포 배양에 알맞은 것이면, 어느 것을 사용해도 좋다. 한편, 무혈청 배양에 있어서, 사용하는 무혈청 배지는, 시판되는 배지를 사용하는 것이 가능하다. 각종 세포에 알맞은 무혈청 배지가 시판되고 있으며, 예컨대 CHO 세포에 대해서는, 인비트로젠사에서 CD-CHO, CHO-S-SFMII, CHO-III-PFM이, 아바인 사이언티픽사에서 IS CHO, IS CHO-CD 배지 등이 판매되고 있다. 이들 배지를 그대로, 개량 혹은 서플리먼트를 첨가하여 사용해도 좋다. 또한, 무혈청 배지로는, 인슐린, 트랜스페린, 및 아셀렌산을 각각 5 mg/L가 되도록 첨가한 DMEM 배지가 예시된다. 이와 같이, 본 실시형태의 트롬보모듈린을 산생할 수 있는 배지이면, 특별히 한정되지 않는다. 배양 방법은 특별히 한정되지 않고, 배치 배양, 반복 배치 배양, 페드 배치 배양, 관류 배양 등 어떠한 배양법이어도 좋다.

상기 세포 배양 방법에 의해 본 발명에서의 트롬보모듈린을 제조하는 경우, 단백질의 번역 후 수식에 의해, N 말단 아미노산에 다양성이 확인되는 경우가 있다. 예컨대, 서열번호 9에서의 제17위, 18위, 19위, 혹은 22위의 아미노산이 N 말단이 되는 경우가 있다. 또한, 예컨대 제22위의 글루타민산이 피로글루타민산으로 변환되도록, N 말단 아미노산이 수식되는 경우도 있다. 제17위 또는 19위의 아미노산이 N 말단이 되는 것이 바람직하고, 제19위의 아미노산이 N 말단이 되는 것이 보다 바람직하다. 또한, 제17위의 아미노산이 N 말단이 되는 것이 바람직한 별도의 양태도 있다. 이상의 수식이나 다양성 등에 관해서는 서열번호 11에 관해서도 동일한 예를 들 수 있다.

또한, 서열번호 10의 염기 서열을 갖는 DNA를 이용하여 가용성 트롬보모듈린을 제조하는 경우, C 말단 아미노산의 다양성이 확인되는 경우가 있고, 1 아미노산 잔기 짧은 펩티드가 제조되는 경우가 있다. 즉, 제515위의 아미노산이 C 말단이 되고, 또한 상기 제515위가 아미드화되는 것과 같이, C 말단 아미노산이 수식되는 경우가 있다. 또한, 2 아미노산 잔기 짧은 펩티드가 제조되는 경우도 있다. 즉, 제514위의 아미노산이 C 말단이 되는 경우가 있다. 따라서, N 말단 아미노산과 C 말단 아미노산이 다양성이 풍부한 펩티드, 또는 이들의 혼합물이 제조되는 경우가 있다. 제515위의 아미노산 또는 제516위의 아미노산이 C 말단이 되는 것이 바람직하고, 제516위의 아미노산이 C 말단이 되는 것이 보다 바람직하다. 또한, 제514위의 아미노산이 C 말단이 되는 것이 바람직한 별도의 양태도 있다. 이상의 수식이나 다양성 등에 관해서는 서열번호 12의 염기 서열을 갖는 DNA에 관해서도 마찬가지이다.

상기 방법으로 얻어지는 트롬보모듈린은, N 말단 및 C 말단에 다양성이 확인되는 펩티드의 혼합물인 경우가 있다. 구체적으로는, 서열번호 9에서의 제19∼516위, 제19∼515위, 제19∼514위, 제17∼516위, 제17∼515위, 혹은 제17∼514위의 서열로 이루어지는 펩티드의 혼합물을 들 수 있다.

계속해서 상기에 의해 취득된 배양 상청, 또는 배양물로부터의 트롬보모듈린의 단리 정제 방법은, 공지된 수법[호리오 다케이치 편집, 단백질·효소의 기초 실험법, 1981]에 준하여 행할 수 있다. 예컨대, 트롬보모듈린과 반대의 전하를 갖는 작용기를 고정화한 크로마토그래피 담체와, 트롬보모듈린 사이의 상호 작용을 이용한 이온 교환 크로마토그래피나 흡착 크로마토그래피의 사용도 바람직하다. 또한, 트롬보모듈린과의 특이적 친화성을 이용한 어피니티 크로마토그래피도 바람직한 예 로서 들 수 있다. 흡착체의 바람직한 예로서, 트롬보모듈린의 리간드인 트롬빈이나 트롬보모듈린의 항체를 이용하는 예를 들 수 있다. 이 항체로는, 적절한 성질, 혹은 적절한 에피토프를 인식하는 트롬보모듈린의 항체를 이용할 수 있고, 예컨대, 일본 특허 공개 평5-42920호 공보, 일본 특허 공개 소64-45398호 공보, 일본 특허 공개 평6-205692호 공보 등에 기재된 예를 들 수 있다. 또한, 트롬보모듈린의 분자량 사이즈를 이용한, 겔 여과 크로마토그래피나 한외여과를 들 수 있다. 그리고 또한, 소수성기를 고정화한 크로마토그래피 담체와, 트롬보모듈린이 갖는 소수성 부위 사이의 소수 결합을 이용한 소수성 크로마토그래피를 들 수 있다. 또한, 흡착 크로마토그래피로서 하이드록시아파타이트를 담체로서 이용하는 것도 가능하고, 예컨대, 일본 특허 공개 평9-110900호 공보에 기재한 예를 들 수 있다. 이들 수법은 적절히 조합할 수 있다. 정제의 정도는, 사용 목적 등에 따라 선택할 수 있지만, 예컨대 전기 영동, 바람직하게는 SDS-PAGE의 결과가 단일 밴드로서 얻어지거나, 혹은 단리 정제품의 겔 여과 HPLC 또는 역상 HPLC의 결과가 단일의 피크가 될 때까지 순수화하는 것이 바람직하다. 물론, 복수종의 트롬보모듈린을 이용하는 경우에는, 실질적으로 트롬보모듈린만의 밴드가 되는 것이 바람직한 것이고, 단일의 밴드가 되는 것을 요구하는 것은 아니다.

본 발명에서의 정제법을 구체적으로 예시하면, 트롬보모듈린 활성을 지표로 정제하는 법을 들 수 있고, 예컨대 이온 교환 컬럼의 Q-세파로오스 패스트 플로우(Fast Flow)로 배양 상청 또는 배양물을 조(粗)정제하여 트롬보모듈린 활성을 갖는 획분을 회수하고, 이어서 어피니티 컬럼의 DIP-트롬빈-아가로오스(디이소프로필포스포릴트롬빈 아가로스) 컬럼으로 주정제하여 트롬보모듈린 활성이 강한 획분을 회수하고, 회수 획분을 농축하고, 겔 여과에 가하여 트롬보모듈린 활성 획분을 순품으로서 취득하는 정제 방법[Gomi K et al, Blood 1990; 75: 1396-1399]을 들 수 있다. 지표로 하는 트롬보모듈린 활성으로는, 예컨대 트롬빈에 의한 프로테인 C 활성화의 촉진 활성을 들 수 있다. 그 외에, 바람직한 정제법을 예시하면 이하와 같다.

트롬보모듈린과 양호한 흡착 조건을 갖는 적당한 이온 교환 수지를 선정하여, 이온 교환 크로마토 정제를 행한다. 특히 바람직한 예로는, 0.18 mol/L NaCl을 포함하는 0.02 mol/L 트리스염산 완충액(pH 7.4)으로 평형화한 Q-세파로오스 패스트 플로우를 이용하는 방법이다. 적절히 세정 후, 예컨대 0.3 mol/L NaCl을 포함하는 0.02 mol/L 트리스염산 완충액(pH 7.4)으로 용출하여 조정제품의 트롬보모듈린을 얻을 수 있다.

다음으로, 예컨대 트롬보모듈린과 특이적 친화성을 갖는 물질을 수지에 고정화하여 어피니티 크로마토 정제를 행할 수 있다. 바람직한 예로서 DIP-트롬빈-아가로오스 컬럼의 예와, 항트롬보모듈린 모노클로날 항체 컬럼의 예를 들 수 있다. DIP-트롬빈-아가로오스 컬럼은, 미리, 예컨대, 100 mmol/L NaCl 및 0.5 mmol/L 염화칼슘을 포함하는 20 mmol/L 트리스염산 완충액(pH 7.4)으로 평형화시키고, 상기한 조정제품을 차지(charge)하여, 적절한 세정을 행하고, 예컨대, 1.0 mol/L NaCl 및 0.5 mmol/L 염화칼슘을 포함하는 20 mmol/L 트리스염산 완충액(pH 7.4)으로 용출하여 정제품의 트롬보모듈린을 취득할 수 있다. 또한 항트롬보모듈린 모노클로날 항체 컬럼에 있어서는, 미리 CNBr에 의해 활성화한 세파로오스 4FF(GE 헬스 케어 바이오사이언스사)에, 항트롬보모듈린 모노클로날 항체를 용해한 0.5 mol/L NaCl 함유 0.1 mol/L NaHCO₃ 완충액(pH 8.3)에 접촉시키고, 세파로오스 4FF에 항트롬보모듈린 모노클로날 항체를 커플링시킨 수지를 충전한 컬럼을, 미리 예컨대 0.3 mol/L NaCl을 포함하는 20 mmol/L 인산염 완충액(pH 7.3)으로 평형화하고, 적절한 세정 후, 예컨대, 0.3 mol/L NaCl을 포함하는 100 mmol/L 글리신염산 완충액(pH 3.0)으로 용출시키는 방법이 예시된다. 용출액은 적당한 완충액으로 중화하고, 정제품으로서 취득할 수도 있다.

다음으로 얻어진 정제품을 pH 3.5로 조정한 후에, 0.3 mol/L NaCl을 포함하는 100 mmol/L 글리신염산 완충액(pH 3.5)으로 평형화한 양이온 교환체, 바람직하게는 강양이온 교환체인 SP-세파로오스 FF(GE 헬스 케어 바이오사이언스사)에 차지하고, 동완충액으로 세정하여 얻어진 비흡착 획분을 얻는다. 얻어진 획분은 적당한 완충액으로 중화하고, 고순도 정제품으로서 취득할 수 있다. 이들은, 한외여과에 의해 농축하는 것이 바람직하다.

또한, 겔 여과에 의한 완충액 교환을 행하는 것도 바람직하다. 예컨대, 50 mmol/L NaCl을 포함하는 20 mmol/L 인산염 완충액(pH 7.3)으로 평형화시킨 세파크릴 S-300 컬럼 혹은 S-200 컬럼에, 한외여과에 의해 농축한 고순도 정제품을 차지하고, 50 mmol/L NaCl을 포함하는 20 mmol/L 인산염 완충액(pH 7.3)으로 전개 분획하고, 트롬빈에 의한 프로테인 C 활성화의 촉진 활성의 확인을 행하여 활성 획분을 회수하고, 완충액 교환한 고순도 정제품을 취득할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 고순도 정제품은 안전성을 높이기 위해 적당한 바이러스 제거막, 예컨대 플라노바 15N(아사히 카세이 메디컬 주식회사)을 이용하여 여과하는 것이 바람직하고, 그 후 한외여과에 의해 원하는 농도까지 농축할 수 있다. 마지막으로 무균 여과막에 의해 여과하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의해, 트롬보모듈린을 유효 성분으로서 포함하는 패혈증의 치료 및/또는 개선을 위한 의약으로서, 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 큰 값인 중증 패혈증 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여되기 위한 상기 의약이 제공된다.

즉, 본 실시형태에서의 패혈증의 치료 및/또는 개선을 위한 의약은, 환자의 혈장 검체의 INR의 값이 1.4보다 큰 값인 중증 패혈증 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에서의 패혈증의 치료 및/또는 개선을 위한 의약이다.

또한 마찬가지로, 환자의 혈장 검체의 INR의 값이 1.4보다 큰 값인 중증 패혈증 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증을 앓는 인간 환자의 사망 가능성을 감소시키기 위한 약제가 제공된다.

패혈증의 치료 및/또는 개선으로는, 예컨대 「패혈증에 의한 환자의 사망을 막는 것」을 바람직한 효과의 하나로서 들 수 있다. 또한 「패혈증에 의해 환자의 전신 상태가 악화되는 것을 막는 것」도 바람직한 효과로서 들 수 있다.

본 실시형태에서의 패혈증은, 감염증, 악성 종양, 간경변, 신부전, 당뇨병, 이상 분만과 같은 질병이나, 유치 카테터, 수액 기구, 투석, 기관 절개와 같은 상처나 병에 대한 치료가 원인이 되어, 감염 장소로부터 끊임없이 또는 단속적으로 미생물이 혈액에 침입해 오는 중증 전신성 감염증으로서 알려져 있다. 증상이 진행되면, 패혈성 쇼크, 즉 급격한 혈압 강하, 말초 순환 부전에 의해 전신성 쇼크가 유발되어, 폐, 신장, 간장, 심장, 소화관, 또한 중추 신경계 등 중요 장기의 장해에 의해 사망한다. 또한, 패혈증에 수반하는 합병증으로서, DIC나, 호중구의 활성화와 폐실질로의 유주 집적에 수반하는 폐 모세 장해에 의해, 폐간질의 부종, 출혈이나 급성 호흡 부전을 특징으로 하는 성인 호흡 궁박 증후군(ARDS)이 유발되어, 예후는 매우 나빠진다.

본 실시형태에서의 패혈증으로는, 감염에 의해 야기된 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome: SIRS)이다. 즉 감염의 존재에 더붙여, SIRS 항목((1) 체온＞38℃ 또는 ＜36℃, (2) 심박수＞90/분, (3) 호흡수＞20/분 또는 PaCO₂＜32 torr, (4) 백혈구수＞12,000/μL 또는 ＜4000/μL 또는 미숙형 백혈구＞10%)의 2항목 이상을 만족하는 병태를 들 수 있고, 기본적으로는 상기 병태로써 패혈증으로 진단할 수 있다.

패혈증의 진단 방법으로는 몇가지의 방법이 있다. 이들은 Levy M. 등, Crit. Care. Med., 31: 1250-1256에 정리되어 있다. 예컨대, 의사에 의해 그 진단을 행하는 방법, 혹은 검사치 등을 이용하는 방법이 있다. 후자의 예로서, 1) 체온＞38℃ 또는 ＜36℃, 2) 심박수＞90/분, 3) 호흡수＞20/분 또는 인공 호흡을 필요로 함, 4) 백혈구수＞12,000/μL 또는 ＜4,000/μL, 또는 유약구(幼弱球)＞10%의 4항목 중, 2항목을 만족하는 경우 SIRS로 진단하고, 미생물이 병인으로 증명되었거나 또는 의심된 SIRS를 패혈증으로 진단하는 방법이 있다[LaRosa S., The Cleveland Clinic의 홈페이지]. 이것에 가까운 방법이 Members of the American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: Crit Care Med, 20, 864-874(1992)에 기재되어 있다.

패혈증(sepsis)의 상태로는, 예컨대 균혈증, 패혈증(septicemia), 전신성 염증 반응 증후군(SIRS), 패혈증(미생물이 병인으로 증명되었거나 또는 의심된 SIRS), 중증 패혈증, 패혈증성 쇼크, 난치성 패혈증성 쇼크, 또는 다장기 기능 장해(이하, MODS라고 불리는 경우가 있음)가 예시된다(해리슨 내과학 원저 제15판 124항 P828-833 주식회사 메디컬·사이언스·인터내셔널). 상기 각 상태는, 본 발명의 치료 및/또는 개선제가 효과적인 증상으로서 예시된다.

패혈증으로는, 상기한 진단 기준을 만족하는 패혈증이면 특별히 한정되지 않지만, 응고 이상을 수반하는 패혈증(sepsis with coagulopathy)이 바람직하다. 응고 이상으로는, 환자의 혈장 검체의 INR이 1.2보다 큰 상태이면 특별히 한정되지 않지만, 1.3보다 큰 것이 바람직하고, 1.4보다 큰 것이 보다 바람직하다.

균혈증으로는, 혈액 배양 양성으로 증명되는 혈액 중의 세균의 존재가 확인되는 상태가 예시된다.

패혈증(septicemia)으로는, 혈액 중의 미생물 또는 다른 독소의 존재가 확인되는 상태가 예시된다.

전신성 염증 반응 증후군(SIRS)으로는, 상기한 바와 같이 DIC 준비 단계에 있는 상태가 예시된다.

중증 패혈증으로는, 대사성 아시도시스, 장기 관류 저하, 급성 뇌증, 핍뇨, 저산소혈증 또는 파종성 혈관내 응고 등의 장기 장해 또는 저혈압의 증상을 하나 또는 복수 수반하는 패혈증이 예시된다. 패혈증 중에서, 장기 장해, 장기 관류 저하 또는 저혈압을 나타내는 상태를 중증 패혈증(severe sepsis)이라고 한다. 장기 관류 저하 또는 관류 이상에는, 젖산 아시도시스, 핍뇨, 의식 혼탁 등이 포함된다. 중증 패혈증 중에서, 충분한 수액 부하를 행해도 저혈압이 지속되는 것을 패혈증성 쇼크(septic shock)라고 한다.

본 실시형태에서의 중증 패혈증으로는, 보다 구체적으로는 이하에 나타내는 바와 같다.

패혈증성 쇼크로는, 저혈압(혈압 90 mmHg 이하 또는 통상의 혈압보다 40 mmHg 이하)으로, 보액에 의한 소생법에도 반응하지 않고, 장기 부전을 수반하는 것이 예시된다.

난치성 패혈증성 쇼크로는, 패혈증성 쇼크가 1시간 이상 지속되고, 보액 승압제에 반응하지 않는 것이 예시된다.

다장기 기능 장해(MODS)로는, 1 장기 이상의 기능 부전이 있고, 항상성을 유지하기 위해 의학적 개입을 필요로 하는 것이 예시된다.

본 실시형태에서의 INR이란, 혈액 응고 이상을 정의하는 검사 지표이다. INR은, 트롬보플라스틴 제제의 제조 로트 사이의 차이를 표준화한 프로트롬빈 시간(prothrombin time, 이하, PT라고 약기하는 경우가 있음)을 의미하며, INR은 이하와 같이 정의된다.

INR 값=(피검 검체의 응고 시간(초)/컨트롤 검체의 응고 시간(초))^(ISI값)

식 중, 피검 검체의 응고 시간(초)이란, 측정 대상의 혈장 피검 검체의 PT를 나타낸다.

또한, ISI는 국제 감도 지수를 나타낸다.

본 실시형태에서의 중증 패혈증은, 상기한 바와 같이 대사성 아시도시스, 급성 뇌증, 핍뇨, 저산소혈증 또는 파종성 혈관내 응고 등의 장기 장해 또는 저혈압의 증상을 하나 또는 복수 수반하는 패혈증이 예시된다. 중증이란, 생명에 관련된 무거운 병태에 있는 것을 말한다. 특히 중증 패혈증으로는 하나 이상의 장기 장해를 갖는 패혈증을 들 수 있다. 장기 장해란, 패혈증에 의해 장해가 생기는 장기의 장해이면 특별히 한정되지 않지만, 생명의 유지에 필수가 되는 장기의 장해가 바람직하다. 하나 이상의 장기 장해로는, 순환기 장해, 호흡기 장해, 신장 장해, 및 간 장해로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 장기 장해를 들 수 있고, 호흡기 장해, 순환기 장해, 및 신장 장해로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 장기 장해인 것이 바람직하고, 호흡기 장해 및 순환기 장해로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 장기 장해인 것이 보다 바람직하다. 장기 장해의 수는 하나 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 2개 이상이 바람직한 경우가 있다. 특히, 호흡기 장해 및 순환기 장해의 2개의 장기 장해를 동시에 갖는 것이 바람직하다.

순환기 장해로는, 순환기 장해로서 일반적으로 알려져 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 혈압 저하 또는 쇼크를 들 수 있다.

호흡기 장해로는, 호흡기 장해로서 일반적으로 알려져 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 저산소혈증, 급성 폐 장해, 또는 호흡 곤란을 들 수 있다.

신장 장해로는, 신장 장해로서 일반적으로 알려져 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 신장 기능 장해, 핍뇨, 또는 신부전을 들 수 있다.

간 장해로는, 간 장해로서 일반적으로 알려져 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 간 기능 장해, 황달, 또는 간부전 등을 들 수 있다.

이들 각 장기 장해는, 출원 전 공지 간행물인 「패혈증의 해명과 치료 전략」(후나다 히사시 2006 의약 저널사, p38∼), 또는 「Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock 2008.」(Crit Care Med. 2008 Jan; 36(1): 296-327) 등에 기재된 바와 같이, 일반적으로 알려져 있는 것이다.

또, 중증 패혈증 환자로는, 약제성 장기 장해 등 패혈증에 한정되지 않는 요인으로부터 발현될 가능성이 상정되는 점에서, 간장 또는 신장만의 장기 장해를 갖는 환자는 제외되는 것이 바람직하다. 또한 장기 장해의 결과로서 혈소판수 감소증(Thrombocytopenia)이 발증하는 것이 알려져 있다. 본 실시형태에서의 의약이 투여되는 환자에서의 혈소판수는 30만/μL 미만이면 특별히 한정되지 않지만, 20만/μL 미만이 바람직하고, 또한 15만/μL 미만이 바람직하다.

본 실시형태에서의 패혈증 환자의 혈장 검체의 INR의 값으로는, 1.4보다 크면 특별히 한정되는 경우는 없고, INR이 1.4보다 큰 경우에, 하나 이상의 장기 장해를 갖는 패혈증 환자에 대하여 트롬보모듈린이 보다 효과적이게 된다. INR의 상한으로는, 2.0 이하가 예시되고, 1.9 이하인 것이 바람직하고, 1.8 이하인 것이 보다 바람직하고, 1.7 이하인 것이 더욱 바람직하고, 1.6 이하인 것이 특히 바람직하다. 1.5 이하가 바람직한 경우도 있다. 또한, INR=1.7은 제외되는 것이 바람직한 경우가 있다.

또, 「INR이 1.4보다 크다」는 「INR＞1.4」로 표기되는 경우도 있다.

본 실시형태에 있어서, DIC란, 여러가지 질환에 의한 조직 장해에 의해 혈관 응고 촉진 물질이 대량으로 유출되어 응고계의 기능이 극도로 항진하고, 작은 혈전이 전신의 혈관에 발생(미소 혈전 형성)하여, 작은 혈관을 막히게 함과 동시에, 이에 따라 출혈의 제어에 필요한 혈소판이나 응고 인자가 소비되어 부족한 결과, 지혈 이상을 일으키는 질환 혹은 증후군이다. 구체적으로는 혈관내 피브린 형성에 의해, 소비성 응고 선용 장해에 의한 출혈 증상이나 미소 혈전 형성에 의한 장기 부전 증상이 확인된다. DIC는, 파종성 혈관내 응고 증후군 또는 범발성 혈관내 응고 증후군이라고 불리는 경우도 있다.

DIC의 임상 증상은 기초 병태의 종류에 따라 여러가지이지만, DIC의 진단 방법으로는 출혈 증상, 장기 증상의 관찰에 덧붙여, 다음에 개시하는 몇가지 검사치에 의해 DIC 스코어를 매기고, 어느 일정 이상의 스코어에 도달한 경우에 DIC인 것으로 진단하는 것이 바람직하다. 검사치로는, 예컨대, 혈중의 혈소판수, 플라스민에 의해 분해된 피브린 및 피브리노겐 분해 산물(이하, FDP라고 약기하는 경우가 있음) 농도, D-다이머 농도, 피브리노겐 농도, 또는 프로트롬빈 시간 등을 들 수 있다. 또한, DIC 스코어를 매기지 않고, 혈소판 저하, D-다이머, 혹은 FDP 농도 상승 등으로부터 preDIC로 진단할 수도 있다(나카가와 마사오. 「파종성 혈관내 응고(DIC) 진단 기준의 이용에 관한 조사 보고」 후생성 특정 질환 혈액 응고 이상증 조사 연구반, 1999년도 연구 보고서. 1999: 65-72, 데구치 카츠미. 「DIC 조기 치료 개시 기준에 관한 시안에 관하여」 후생성 특정 질환 혈액 응고 이상증 조사 연구반, 1999년도 연구 보고서. 1999: 73-77, 나카가와 카츠미, 츠지 하지메. 「DIC 진단의 현황-앙케이트 조사 결과 보고」 임상 혈액. 1999; 40: 362-364).

또한 본 실시형태에 있어서, 환자 혈장 검체의 INR의 값이 1.2보다 큰, 바람직하게는 1.3보다 큰, 보다 바람직하게는 1.4보다 큰 패혈증 환자를 광의의 DIC 환자라고 할 수 있고, 본 실시형태에서의 패혈증의 치료 및/또는 개선을 위한 의약은, DIC의 치료 및/또는 개선을 위한 의약으로서 사용할 수 있는 경우가 있다.

본 실시형태에서의 의약은 DIC에 대해서도 사용할 수 있는 경우가 있다. 패혈증은, 감염성의 위독한 임상적 침습에 의해 발생하는 SIRS로도 간주되고, 감염증을 원인 질환으로 하는 DIC와 밀접한 관계에 있다. 패혈증에 있어서 DIC를 병발하는 경우는 종종 있고, 그와 같은 DIC를 병발한 패혈증 환자에 대해서도 본 실시형태에서의 의약을 사용할 수 있는 경우가 있다. 즉, 본 실시형태에서의 의약은, DIC 또는 패혈증 중 어느 한쪽, 또는 양쪽을 앓는 환자, 또는 앓고 있는 것이 의심되는 환자에 대하여 사용할 수 있는 경우가 있다.

본 실시형태에서의 INR은, 예컨대 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 시트르산나트륨을 첨가하여 얻어진 혈장(피검 검체)에 조직 트롬보플라스틴, Ca²⁺를 첨가하여 응고(피브린 석출)되기까지의 시간(PT)을 측정하여, 그 초수로 판정하고, 컨트롤 검체와의 상대비(활성률)로 평가를 행한다. 활성률은, 「피검 검체의 응고 시간(초)/컨트롤 검체의 응고 시간(초)」에 의해 구해지지만, 사용하는 조직 트롬보플라스틴의 감도가 상이한 것에 의해 검사 실시 기관에 따라 검사치의 격차가 생긴다. INR값은 이러한 격차를 해소하기 위해 고안되어, 국제 감도 지수(International sensitivity Index, 이하, ISI라고 약기하는 경우가 있음)로 보정한 INR값으로 PT를 평가함으로써, 시설간의 차를 없애고 표준적인 결과를 얻을 수 있다. ISI는 국제 표준 시료와 얼마만큼 상이한가를 표시한 것이다. ISI는 각 조직 트롬보플라스틴 시약마다 결정되어, 시약에 첨부되어 있다. 트롬보플라스틴 시약으로는, 트롬보렐 S(등록 상표 : 시스멕스사 제조)나 트롬보플라스틴 C+(등록 상표 : 시스멕스사 제조) 등이 예시되지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 트롬보렐 S(등록 상표)에서는 인간 태반 트롬보플라스틴(ISI값은 1.0에 가까움)이, 트롬보플라스틴 C+(등록 상표)에서는 토끼 뇌 트롬보플라스틴(ISI값은 약 1.8)이 사용되고 있다.

조직 트롬보플라스틴 시약에는 ISI가 부여되어 있고, INR값은 상기 식 1의 계산식에 의해 구해진다.

컨트롤 검체로는, 시판되는 정상 인간 풀 혈장이면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 코진 바이오(주)사나 국제 바이오(주)사에서 구입 가능한 시판 정상인 풀 시트르산 Na 혈장 등을 사용할 수 있다.

패혈증의 치료는 일반적으로 공지 문헌(Surviving Sepsis Campaign: International guidelines for management of severe sepsis and septic shock: Crit Care Med. 2008 36 296-327., Crit Care Med. 2003 32(3) 1250-56)에 기초하여, 이하와 같은 기초 치료가 행해지고, 트롬보모듈린과 별도의 약제가 병용되는 경우가 있는데, 병용은 이들 약제에 제한되지 않는다.

패혈증성 쇼크의 환자가, 중심 정맥압(CVP)이 목표치까지 상승한 후에도 저혈압이 지속되는 경우, 평균 혈압을 적어도 60 mmHg까지 상승시키기 위해 도파민이 투여되는 경우가 있다. 또한 도파민 용량이 20 ㎍/kg/분을 초과하는 경우, 다른 혈관 수축약(통상은 노르에피네프린)이 첨가되는 경우가 있다.

패혈증의 원인균의 치료를 위해, 일반적으로 항생 물질이 사용된다. 항생 물질의 선택에는, 의심스러운 원인, 임상 상황, 미생물의 지식과 그 특정 입원 병동에 공통되는 감수성의 패턴에 관한 지식, 및 사전의 배양 검사의 결과 등에 기초한 근거 있는 추측이 필요하다.

패혈증 환자에서의 혈당치의 철저한 정상화는, 위독한 상태의 환자에 있어서 전귀(轉歸)를 개선한다.

항생 물질의 사용에 있어서는, 혈액, 체액 혹은 창상부 등의 검체를 조사하여, 기인균에 유효한 약제를 선택할 수 있다. 예컨대, 원인 불명의 패혈증 쇼크 등에서는, 겐타마이신 또는 토브라마이신과 제3세대 세팔로스포린의 병용 투여가 이루어지는 경우가 있다. 또한 내성 포도상구균 또는 장구균이 의심되는 경우에는, 반코마이신이 추가된다.

일반적으로 인슐린의 지속 정맥 주사에 의해, 혈당치를 80∼110 mg/dL(4.4∼6.1 mmol/L)로 유지하기 위해 투여량을 조절할 수 있다.

코르티코스테로이드 요법은 패혈증의 치료에 효과를 나타내는 점에서, 보충 용량으로 투여되는 경우가 있다.

사망 리스크가 높은 환자(APACHE II 스코어≥25, 패혈증에 의한 다장기 부전, 패혈증성 쇼크, 패혈증에 의한 ARDS)에서는, 금기(출혈 등)가 없는 경우에, 재조합형 활성화 프로테인 C(rhAPC; 드로트레코긴 α)가 투여되는 경우가 있다.

대상 환자는 한정되지만, 농후 적혈구를 Hb 7.0∼9.0 g/dL를 목표로 하여 수혈되는 경우가 있다.

패혈증 환자에서 신부전에 의한 적혈구 산생 장해시에는, 에리트로포이에틴(Erythropoietin(EPO))이 투여되는 경우가 있다.

중증 패혈증에서는 저용량 헤파린 혹은 저분자 헤파린 투여에 의한 DVT의 예방 투여가 행해지는 경우가 있다.

본 발명의 의약은, 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에서 이용할 수 있는 담체로는, 수용성의 담체가 바람직하고, 통상은, 의약품의 첨가제로서 허용할 수 있는, 등장화제, 완충화제, 증점제, 계면 활성제, 보존제, 방부제, 무통화제, pH 조정제 등이 바람직하다. 예컨대, 자당, 글리세린 등이나, 그 외의 무기염의 pH 조정제 등을 첨가제로서 첨가하여 조제할 수 있다. 또한 필요에 따라, 일본 특허 공개 평1-6219호 공보 및 일본 특허 공개 평6-321805호 공보에 개시된 바와 같이, 아미노산, 염류, 당질, 계면 활성제, 알부민, 젤라틴 등을 첨가해도 좋다. 이들의 첨가 방법은 특별히 한정되지 않지만, 동결 건조로 하는 경우에는, 통상 행해지는 바와 같이, 예컨대, 면역 억제제, 조혈기 악성 종양 치료약으로부터 선택되는 적어도 하나를 함유하는 용액과 트롬보모듈린 함유 용액을 혼합한 후, 첨가물을 첨가 혼합하는 방법이나, 또는 미리 첨가물을 물, 주사용 증류수 혹은 적당한 완충액에 용해한 면역 억제제, 조혈기 악성 종양 치료약으로부터 선택되는 적어도 하나에 혼합한 후, 트롬보모듈린 함유 용액을 첨가 혼합으로 하는 방법에 의해 용액을 조제하고, 동결 건조시키는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 의약이 각 의약 성분을 조합하여 이루어지는 의약인 경우에는, 각 의약은, 적절한 제조방법에 의해 담체를 첨가하여 제조하는 것이 바람직하다. 본 발명의 의약으로는, 주사액의 형태로 제공되어도 좋고, 또한 동결 건조 제제를 사용시에 용해시켜 사용하는 형태로 제공되어도 좋다.

제제화 공정에서는, 앰플 또는 바이알에, 0.1∼10 mg의 트롬보모듈린, 주사용수, 또한, 첨가제를 함유하는 용액을, 예컨대 0.5∼10 mL 충전하여 수용액 주사용 제제로서 조제할 수 있다. 또한, 동결시키고 감압하에서 건조시켜 동결 건조 제제로서 조제하는 방법이 예시된다.

본 발명의 의약은, 비경구 투여법, 예컨대 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 등에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 또한 경구 투여, 직장내 투여, 비내(鼻內) 투여, 설하(舌下) 투여 등도 가능하다. 본 발명의 의약이 각 의약 성분을 조합하여 이루어지는 의약인 경우에는, 각각의 의약 성분은, 적절한 투여 방법에 의해 투여하는 것이 바람직하다.

정맥내 투여의 경우, 한번에 원하는 양을 투여하는 방법(정맥내 급속 투여) 또는 점적 정맥내 투여를 들 수 있다.

한번에 원하는 양을 투여하는 방법(정맥내 급속 투여)은 투여 시간이 짧은 점에서 바람직하다. 특히 패혈증의 환자에서는 시급한 경우도 많아, 단시간에 투여하는 것이 바람직한 경우가 있다. 한번에 투여하는 경우에는, 주사기로의 투여에 요하는 시간에 통상폭이 있는데, 투여에 요하는 시간으로는, 투여하는 액량에 따라서도 다르지만, 5분 이하가 예시되고, 3분 이하가 바람직하고, 2분 이하가 보다 바람직하고, 1분 이하가 더욱 바람직하고, 30초 이하가 특히 바람직하다. 또한 하한으로는 특별히 한정되지 않지만, 1초 이상이 바람직하고, 5초 이상이 보다 바람직하고, 10초 이상이 더욱 바람직하다. 투여량은 상기한 바람직한 투여량이면 특별히 한정되지 않는다. 또한, 점적 정맥내 투여는 트롬보모듈린의 혈중 농도를 일정하게 유지하는 것이 용이한 점에서 바람직하다.

본 발명에서의 의약의 1일 투여량은, 환자의 연령, 체중, 질환의 정도, 투여 경로 등에 따라서도 다르지만, 일반적으로 트롬보모듈린의 양으로서, 상한으로는 20 mg/kg 이하가 바람직하고, 10 mg/kg 이하가 보다 바람직하고, 5 mg/kg 이하가 더욱 바람직하고, 2 mg/kg 이하가 특히 바람직하고, 1 mg/kg 이하가 가장 바람직하고, 하한으로는 0.001 mg/kg 이상이 바람직하고, 0.005 mg/kg 이상이 보다 바람직하고, 0.01 mg/kg 이상이 더욱 바람직하고, 0.02 mg/kg 이상이 특히 바람직하고, 0.05 mg/kg 이상이 가장 바람직하다.

정맥내 급속 투여의 경우, 상기한 바람직한 투여량이면 특별히 한정되지 않지만, 1일 투여량의 상한으로는 1 mg/kg 이하가 바람직하고, 0.5 mg/kg 이하가 보다 바람직하고, 0.1 mg/kg 이하가 더욱 바람직하고, 0.08 mg/kg 이하가 특히 바람직하고, 0.06 mg/kg 이하가 가장 바람직하고, 하한으로는 0.005 mg/kg 이상이 바람직하고, 0.01 mg/kg 이상이 보다 바람직하고, 0.02 mg/kg 이상이 더욱 바람직하고, 0.04 mg/kg 이상이 특히 바람직하다.

체중이 100 kg을 초과하는 환자에게 투여하는 경우에는, 혈액량이 체중과는 비례하지 않고, 체중에 대한 혈액량이 상대적으로 저하된다는 관점에서, 6 mg의 고정 용량으로 투여하는 것이 바람직한 경우가 있다.

점적 정맥내 투여의 경우, 상기한 바람직한 투여량이면 특별히 한정되지 않지만, 1일 투여량의 상한으로는 1 mg/kg 이하가 바람직하고, 0.5 mg/kg 이하가 보다 바람직하고, 0.1 mg/kg 이하가 더욱 바람직하고, 0.08 mg/kg 이하가 특히 바람직하고, 0.06 mg/kg 이하가 가장 바람직하고, 하한으로는 0.005 mg/kg 이상이 바람직하고, 0.01 mg/kg 이상이 보다 바람직하고, 0.02 mg/kg 이상이 더욱 바람직하고, 0.04 mg/kg 이상이 특히 바람직하다.

체중이 100 kg을 초과하는 환자에게 투여하는 경우에는, 혈액량이 체중과는 비례하지 않고, 체중에 대한 혈액량이 상대적으로 저하된다는 관점에서, 6 mg의 고정 용량으로 투여하는 것이 바람직한 경우가 있다.

1일당 1회 또는 필요에 따라 여러회 투여한다. 투여 간격은, 2일 내지 14일에 1회, 바람직하게는 2일 내지 7일에 1회, 더욱 바람직하게는 3일 내지 5일에 1회로 하는 것도 가능하다.

[서열표의 설명]

서열번호 1 : TME456의 생산에 이용한 유전자가 코드하는 아미노산 서열

서열번호 2 : 서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열

서열번호 3 : TME456M의 생산에 이용한 유전자가 코드하는 아미노산 서열

서열번호 4 : 서열번호 3의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열

서열번호 5 : TMD12의 생산에 이용한 유전자가 코드하는 아미노산 서열

서열번호 6 : 서열번호 5의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열

서열번호 7 : TMD12M의 생산에 이용한 유전자가 코드하는 아미노산 서열

서열번호 8 : 서열번호 7의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열

서열번호 9 : TMD123의 생산에 이용한 유전자가 코드하는 아미노산 서열

서열번호 10 : 서열번호 9의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열

서열번호 11 : TMD123M의 생산에 이용한 유전자가 코드하는 아미노산 서열

서열번호 12 : 서열번호 11의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열

서열번호 13 : 부위 특이적 변이를 행할 때에 사용하는 변이용 합성 DNA

실시예

이하, 실시예 및 시험예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 전혀 이들에 의해 한정되지 않는다.

시험예에 이용하는 본 발명에서의 트롬보모듈린은, 상기 야마모토 등의 방법(일본 특허 공개 소64-6219호에 기재된 방법)에 따라 제조했다. 이하에 그 제조예를 나타낸다. 또, 이번 제조예에서 얻어진 트롬보모듈린은, 래트 및 원숭이를 이용한 단회 및 반복 정맥내 투여 시험, 마우스 생식 시험, 국소 자극성 시험, 안전성 약리 시험, 바이러스 불활화 시험 등에 의해 그 안전성이 확인되어 있다.

[제조예 1]

<트롬보모듈린의 취득>

상기한 방법, 즉, 서열번호 9의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 10의 염기 서열로 이루어짐)를, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 트랜스펙션하여, 이 형질 전환 세포의 배양액으로부터 상술한 정법의 정제법으로, 50 mmol/L NaCl을 포함하는 20 mmol/L 인산염 완충액(pH 7.3)으로 활성 획분을 회수한 고순도 정제품을 취득했다. 또한 한외여과막을 이용하여 농축하고, 11.0 mg/mL의 트롬보모듈린(본 명세서에 있어서 TMD123이라고 약기하는 경우가 있음) 용액을 취득했다.

<폴리솔베이트 용액 조제>

유리 비커에 폴리솔베이트 80을 0.39 g 칭량하고, 주사용수를 30 mL 첨가하여 용해시켰다.

<약액 조제·충전>

5 L의 스테인레스제 용기에, 상기 얻어진 TMD123 용액 2239 mL(가용성 트롬보모듈린의 단백질량으로서 24.63 g에 상당. 다만 5% 과량 주입.)를 넣었다. 또한, 상기에서 얻어진 폴리솔베이트 용액을 첨가하고, 염화나트륨 27.9 g을 첨가했다. 주사용수를 600 mL 첨가하여 교반했다. 1 mol/L 염산 용액을 첨가하여, pH를 6.0으로 조정했다. 또한 주사용수를 첨가하여 전량을 3940 g으로 하여 균일하게 혼합 교반했다. 이 약액을, 구멍 직경이 0.22 ㎛인 필터(밀리포어 제조 MCGL10S)로 여과 멸균했다. 여과액을 1.1 g씩 앰플에 충전하여, TMD123 제제를 얻었다.

[제조예 2]

서열번호 11의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 12의 염기 서열로 이루어짐)를, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 트랜스펙션하고, 이 형질 전환 세포의 배양액으로부터 상술한 정법의 정제법으로 정제된 트롬보모듈린(본 명세서에 있어서 TMD123M이라고 약기하는 경우가 있음) 용액을 취득하고, 상기와 동일한 방법에 의해 TMD123M 제제를 취득한다.

[제조예 3]

서열번호 1의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 2의 염기 서열로 이루어짐)를, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 트랜스펙션하고, 이 형질 전환 세포의 배양액으로부터 상술한 정법의 정제법으로 정제된 트롬보모듈린(본 명세서에 있어서 TME456이라고 약기하는 경우가 있음)을 취득하고, 상기와 동일한 방법에 의해 TME456 제제를 취득한다.

[제조예 4]

서열번호 3의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 4의 염기 서열로 이루어짐)를, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 트랜스펙션하고, 이 형질 전환 세포의 배양액으로부터 상술한 정법의 정제법으로 정제된 트롬보모듈린(이하, TME456M이라고 약기하는 경우가 있음)을 취득하고, 상기와 동일한 방법에 의해 TME456M 제제를 취득한다.

[제조예 5]

서열번호 5의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 6의 염기 서열로 이루어짐)를, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 트랜스펙션하고, 이 형질 전환 세포의 배양액으로부터 상술한 정법의 정제법으로 정제된 트롬보모듈린(본 명세서에 있어서 TMD12라고 약기하는 경우가 있음)을 취득하고, 상기와 동일한 방법에 의해 TMD12 제제를 취득한다.

[제조예 6]

서열번호 7의 아미노산 서열을 코드하는 DNA(구체적으로는, 서열번호 8의 염기 서열로 이루어짐)를, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에 트랜스펙션하고, 이 형질 전환 세포의 배양액으로부터 상술한 정법의 정제법으로 정제된 트롬보모듈린(이하, TMD12M이라고 약기하는 경우가 있음)을 취득하고, 상기와 동일한 방법에 의해 TMD12M 제제를 취득한다.

[제조예 7] 플라세보 제제의 조제

<폴리솔베이트 용액 조제>

유리 비커에 폴리솔베이트 80을 0.4 g 칭량하고, 주사용수를 30 mL 첨가하여 용해시켰다.

<약액 조제·충전>

5 L의 스테인레스제 용기에, 주사용수를 2000 mL를 넣었다. 또한, 상기에서 얻어진 폴리솔베이트 용액을 첨가했다. 또한 주사용수를 첨가하여 전량을 4000 g으로 하여 균일하게 혼합 교반했다. 이 약액을, 구멍 직경이 0.22 ㎛인 필터(밀리포어 제조 MCGL10S)로 여과 멸균했다. 여과액을 1.1 g씩 앰플에 충전하여, 플라세보 제제를 얻었다.

[실시예 1]

<시험 방법>

제조예 1에 준하여 제조한 TMD-123을 트롬보모듈린으로서 사용하고, 패혈증 및 DIC를 발증한 환자를 대상으로 한 무작위 이중맹검 플라세보(Placebo) 대상의 시험을 행했다. 대상 환자수는 총수 750 예이고, 그 중 시험약이 투여된 환자가 741 예(TMD-123 투여군 370 예, 플라세보 투여군 371 예)로 하여 시험을 실시했다. TMD-123은, 0.06 mg/kg의 용량으로 1일 1회, 6일간 연속 정맥내 급속 투여되었다. 플라세보로는 제조예 7에 준하여 제조된 것을 이용했다.

또, 체중 100 kg을 초과하는 환자에 대해서는, 과량 투여에 의한 부작용 발현을 억제할 목적으로, 일률적으로 6 mg의 고정 용량으로 1일 1회, 6일간 연속 정맥내 급속 투여되었다.

시험약 투여 전의 환자의 혈장 중 INR값은, 상기 식 1에 기재된 방법에 의해 측정했다.

또한, 대상 환자로부터는, 간장 또는 신장만의 장기 장해를 갖는 환자를 제외시켰다. 간장 또는 신장만의 장기 장해를 갖는 환자에서는, 약제성 장기 장해 등, 패혈증에 한정되지 않는 요인으로부터 장기 장해가 발현되었을 가능성이 상정되기 때문이다.

투여 개시로부터 28일째의 전귀를 확인하여, 각 환자군의 사망률(Mortality)을 산출했다.

또한, TMD-123과 플라세보 사이의 사망률차를 디퍼런스(Difference)로서 산출했다.

<시험 결과>

장기 장해를 갖지 않는 패혈증 환자에 있어서는, 시험약 투여 전의 혈장 중 INR값이, INR＞1.5의 환자에서, TMD-123을 투여했을 때의 사망률과 플라세보를 투여했을 때의 사망률의 차(사망률차: 디퍼런스)가 최대(6.1%)가 되고, INR＞1.6의 환자에서의 사망률차가 그 뒤를 이었다(4.5%). INR＞1.4의 환자에서는 사망률차 1.7% 정도로, 절대적으로도 상대적으로도 그다지 높은 사망률차를 나타내지 않았다(표 1).

즉, 표 1로부터, INR 하한치의 극대치는 1.5∼1.6 사이에 있고, INR의 하한치가 1.5∼1.6의 밖에 있는 경우에는, 사망률차가 극단적으로 낮아지는 것을 알 수 있었다.

이에 반하여, 순환기 장해, 호흡기 장해, 신장 장해, 및 간 장해로 이루어지는 군으로부터 선택되는 장기 장해를 하나 이상 갖는 중증 패혈증 환자에 있어서는, INR＞1.5가 아니라, INR＞1.4인 환자에서 사망률차가 최대(9.7%)가 되고, 다른 INR 하한치에 비해 절대적으로도 상대적으로도 높은 사망률차를 나타냈다(표 2). 또한, 전체적으로 보더라도 순환기 장해, 호흡기 장해, 신장 장해, 및 간 장해로 이루어지는 군으로부터 선택되는 장기 장해를 하나 이상 갖는 중증 패혈증 환자에서는, 장기 장해를 갖지 않는 패혈증 환자에 비해, TMD-123과 플라세보 사이의 사망률차가 컸다. (전자 : 5.4%, 후자 : -1.1%)

또한, 순환기 장해, 호흡기 장해, 신장 장해, 및 간 장해로 이루어지는 군으로부터 선택되는 장기 장해를 하나 이상 갖는 중증 패혈증 환자에 있어서는, 1.4＜INR≤1.6의 환자에서 사망률차가 16.0%로 절대적으로 현저한 값을 나타냈다(표 3). 표 3으로부터 알 수 있듯이, 다른 어느 INR 상한치에서는, 사망률차가 전부 10∼12% 사이로, 상대적으로도 두드러지게 큰 사망률차를 나타내고 있는 것을 알 수 있다.

한편, 장기 장해를 갖지 않는 환자에 있어서는, 어느 부분만이 상대적으로 두드러지는 경향은 보이지 않고, 얻어진 사망률차도 겨우 7.1%(1.4＜INR≤1.7의 환자군)였다(표 4).

산업상 이용 가능성

본 발명의 트롬보모듈린을 함유하는 의약은, 환자의 혈장 검체의 INR이 1.4보다 큰 값인 중증 패혈증 환자에서의 패혈증을 효과적으로 치료 및/또는 개선할 수 있는 의약으로서 유용하다.

SEQUENCE LISTING <110> Asahi Kasei Pharma Corporation <120> Medicament for therapeutic treatment and/or improvement of sepsis <130> F112127-WO <150> US 61/559,864 <151> 2011-11-15 <160> 13 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 　　　5　　　　　　　 　 10　　　　　　　　 15 Phe Pro Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro 　 　　　　 20 　　　　 　　　　25 　　　　　　　　 30 Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro 　　　 35 　　　　　　　　 40 　　　 　　　　　45 Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala 50 　　　　 　　　　55 　　　　　　　　 60 Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro 65　　　 　　　　　70 　　　　　　　　 75 　　　 　　　　　80 Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu 　　　 　　　 85 　　　　　　 　　90 　　　　　 　　 95 Cys Glu Asn Gly Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly 　　　　　　100 　　 　　　　　 105 　　　　　　 　 110 Thr Phe Glu Cys Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Val Arg His Ile 　　 115 　　 　　　　　120 　　　　　　　 125 Gly Thr Asp Cys 　　130 <210> 2 <211> 396 <212> DNA <213> human <400> 2 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgacccg 60 tgcttcagag ccaactgcga gtaccagtgc cagcccctga accaaactag ctacctctgc 120 gtctgcgccg agggcttcgc gcccattccc cacgagccgc acaggtgcca gatgttttgc 180 aaccagactg cctgtccagc cgactgcgac cccaacaccc aggctagctg tgagtgccct 240 gaaggctaca tcctggacga cggtttcatc tgcacggaca tcgacgagtg cgaaaacggc 300 ggcttctgct ccggggtgtg ccacaacctc cccggtacct tcgagtgcat ctgcgggccc 360 gactcggccc ttgtccgcca cattggcacc gactgt 396 <210> 3 <211> 132 <212> PRT <213> human <400> 3 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Asp Pro Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro 　　　　　 20 25 30 Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro 35 40 45 Ile Pro His Glu Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala 50 55 60 Cys Pro Ala Asp Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ile Leu Asp Asp Gly 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agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380 accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgtcc gccacattgg caccgactgt 1440 gactccggca aggtggacgg tggcgacagc ggctctggcg agcccccgcc cagcccgacg 1500 cccggctcca ccttgactcc tccggccgtg gggctcgtgc attcgggc 1548 <210> 11 <211> 516 <212> PRT <213> human <400> 11 Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly 1 5 10 15 Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu 20 25 30 His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro Ala Thr Phe Leu Asn Ala 35 40 45 Ser Gln Ile Cys Asp Gly Leu Arg Gly His Leu Met Thr Val Arg Ser 50 55 60 Ser Val Ala Ala Asp Val Ile Ser Leu Leu Leu Asn Gly Asp Gly Gly 65 70 75 80 Val Gly Arg Arg Arg Leu Trp Ile Gly Leu Gln Leu Pro Pro Gly Cys 85 90 95 Gly Asp Pro Lys Arg Leu Gly Pro Leu Arg Gly Phe Gln Trp Val Thr 100 105 110 Gly Asp Asn Asn Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn 115 120 125 Gly Ala Pro Leu Cys Gly Pro Leu Cys Val Ala Val Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ala Thr Val Pro Ser 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Val Asp Gly Glu Cys Val Glu Pro Val Asp Pro 355 360 365 Cys Phe Arg Ala Asn Cys Glu Tyr Gln Cys Gln Pro Leu Asn Gln Thr 370 375 380 Ser Tyr Leu Cys Val Cys Ala Glu Gly Phe Ala Pro Ile Pro His Glu 385 390 395 400 Pro His Arg Cys Gln Met Phe Cys Asn Gln Thr Ala Cys Pro Ala Asp 405 410 415 Cys Asp Pro Asn Thr Gln Ala Ser Cys Glu Cys Pro Glu Gly Tyr Ile 420 425 430 Leu Asp Asp Gly Phe Ile Cys Thr Asp Ile Asp Glu Cys Glu Asn Gly 435 440 445 Gly Phe Cys Ser Gly Val Cys His Asn Leu Pro Gly Thr Phe Glu Cys 450 455 460 Ile Cys Gly Pro Asp Ser Ala Leu Ala Arg His Ile Gly Thr Asp Cys 465 470 475 480 Asp Ser Gly Lys Val Asp Gly Gly Asp Ser Gly Ser Gly Glu Pro Pro 485 490 495 Pro Ser Pro Thr Pro Gly Ser Thr Leu Thr Pro Pro Ala Val Gly Leu 500 505 510 Val His Ser Gly 515 <210> 12 <211> 1548 <212> DNA <213> human <400> 12 atgcttgggg tcctggtcct tggcgcgctg gccctggccg gcctggggtt ccccgcaccc 60 gcagagccgc agccgggtgg cagccagtgc gtcgagcacg actgcttcgc gctctacccg 120 ggccccgcga ccttcctcaa tgccagtcag atctgcgacg gactgcgggg ccacctaatg 180 acagtgcgct cctcggtggc tgccgatgtc atttccttgc tactgaacgg cgacggcggc 240 gttggccgcc ggcgcctctg gatcggcctg cagctgccac ccggctgcgg cgaccccaag 300 cgcctcgggc ccctgcgcgg cttccagtgg gttacgggag acaacaacac cagctatagc 360 aggtgggcac ggctcgacct caatggggct cccctctgcg gcccgttgtg cgtcgctgtc 420 tccgctgctg aggccactgt gcccagcgag ccgatctggg aggagcagca gtgcgaagtg 480 aaggccgatg gcttcctctg cgagttccac ttcccagcca cctgcaggcc actggctgtg 540 gagcccggcg ccgcggctgc cgccgtctcg atcacctacg gcaccccgtt cgcggcccgc 600 ggagcggact tccaggcgct gccggtgggc agctccgccg cggtggctcc cctcggctta 660 cagctaatgt gcaccgcgcc gcccggagcg gtccaggggc actgggccag ggaggcgccg 720 ggcgcttggg actgcagcgt ggagaacggc ggctgcgagc acgcgtgcaa tgcgatccct 780 ggggctcccc gctgccagtg cccagccggc gccgccctgc aggcagacgg gcgctcctgc 840 accgcatccg cgacgcagtc ctgcaacgac ctctgcgagc acttctgcgt tcccaacccc 900 gaccagccgg gctcctactc gtgcatgtgc gagaccggct accggctggc ggccgaccaa 960 caccggtgcg aggacgtgga tgactgcata ctggagccca gtccgtgtcc gcagcgctgt 1020 gtcaacacac agggtggctt cgagtgccac tgctacccta actacgacct ggtggacggc 1080 gagtgtgtgg agcccgtgga cccgtgcttc agagccaact gcgagtacca gtgccagccc 1140 ctgaaccaaa ctagctacct ctgcgtctgc gccgagggct tcgcgcccat tccccacgag 1200 ccgcacaggt gccagatgtt ttgcaaccag actgcctgtc cagccgactg cgaccccaac 1260 acccaggcta gctgtgagtg ccctgaaggc tacatcctgg acgacggttt catctgcacg 1320 gacatcgacg agtgcgaaaa cggcggcttc tgctccgggg tgtgccacaa cctccccggt 1380 accttcgagt gcatctgcgg gcccgactcg gcccttgccc gccacattgg caccgactgt 1440 gactccggca aggtggacgg tggcgacagc ggctctggcg agcccccgcc cagcccgacg 1500 cccggctcca ccttgactcc tccggccgtg gggctcgtgc attcgggc 1548 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic DNA <400> 13 aatgtggcgg gcaagggccg a 21

Claims (9)

1. 트롬보모듈린을 유효 성분으로서 포함하는 패혈증의 치료 및/또는 개선을 위한 의약으로서, 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 큰 값인 중증 패혈증 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여되기 위한 상기 의약.
2. 제1항에 있어서, 환자의 혈장 검체의 국제 표준비(INR)의 값이 1.4보다 크고 1.6 이하의 값인 중증 패혈증 환자로서 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여되기 위한 의약.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중증 패혈증 환자가, 간장 또는 신장만의 장기 장해를 갖는 패혈증 환자를 제외한 중증 패혈증 환자인 의약.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 간장, 신장, 호흡기, 및 순환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여되기 위한 의약.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 호흡기 및 순환기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 장기 장해를 갖는 중증 패혈증 환자에게 투여되기 위한 의약.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬보모듈린이 가용성 트롬보모듈린인 의약.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬보모듈린이, 서열번호 9 또는 서열번호 11에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 숙주 세포에 트랜스펙트하여 조제된 형질 전환 세포로부터 취득되는 펩티드인 의약.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬보모듈린이, 하기 (i-1) 또는 (i-2) 중 어느 아미노산 서열을 포함하는 펩티드로서, 상기 펩티드가 트롬보모듈린 활성을 갖는 펩티드인 의약;
   (i-1) 서열번호 9 또는 서열번호 11 중 어느 것에 기재된 아미노산 서열에서의 제19∼516위의 아미노산 서열, 또는
   (i-2) 상기 (i-1)의 아미노산 서열의 하나 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트롬보모듈린이, 0.005∼1 mg/kg의 투여량으로 5분 이내에 정맥내 급속 투여되는 의약.