BR112014011488B1 - Medicamento para tratamento terapêutico e/ou melhora de sépsis - Google Patents

Abstract

MEDICAMENTO PARA TRATAMENTO TERAPÊUTICO E/OU MELHORA DE SÉPSIS Um medicamento para o tratamento eficaz e/ou melhora de sépsis em um paciente sofrendo de sépsis grave que afetou um ou mais órgãos, e com o valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida do paciente sendo maior do que 1,4, compreende trombomodulina como um ingrediente ativo.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se a um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou melhora da sépsis em um paciente séptico grave.

ARTE ANTECEDENTE

[0002] A sépsis é uma síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS) induzida por infecção. Especificamente, sépsis é definida como uma condição patológica que atende, além da presença de infecção, a dois ou mais dos itens SIRS ((1) temperatura corporal > 38°C ou < 36°C, (2) taxa cardíaca > 90/minuto (3), taxa de respiração > 20/minuto, ou PaCO2 < 32 torr, e (4) contagem de leucócitos > 12000/μL ou < 4000/μL, ou leucócitos imaturos > 10%). Embora a presença de bactérias no sangue (bacteremia) tenha sido significativamente focalizada até agora, resultado positivo para bactérias da cultura de sangue não é necessariamente obrigatório de acordo com a definição acima. Entre sépsis, uma condição de apresentar disfunção de órgãos, hipoperfusão ou hipotensão de órgãos é chamada de sépsis grave. A hipoperfusão do órgão ou perfusão anormal inclui acidose láctica, oligúria, confusão mental, e similares. Entre a sépsis grave, uma condição continuamente apresentando hipotensão apesar de carga suficiente de terapia com fluidos é chamada choque séptico (documento não-patente 1). Considera-se que a insuficiência circulatória observada nestas condições patológicas é causada pelo mau funcionamento do sistema nervoso simpático, ou um mediador liberado de neutrófilos e similares, e a disfunção de órgãos é causada por hipóxia de tecido (disóxia).

[0003] A trombomodulina é conhecida como uma substância que atua de modo a ligar-se especificamente a trombina, de modo a inibir a atividade de coagulação do sangue de trombina e, ao mesmo tempo, exercer uma atividade anticoagulante, de modo a promover significativamente a capacidade da trombina para ativar proteína C. Também se sabe que a trombomodulina exerce para prolongar o tempo de coagulação pela trombina, ou suprime a agregação de plaquetas pela trombina. A proteína C é uma proteína dependente da vitamina K, que desempenha um papel importante na coagulação do sangue e fibrinólise, sendo ativada pela ação da trombina para ser convertida como proteína C ativada. Sabe-se que a Proteína C ativada inativa o fator de coagulação do sangue ativado V e fator de coagulação do sangue ativado VIII in vivo, e está envolvida na geração de um ativador do plasminogênio tendo ação trombolítica (documento não-patente 2). Portanto, considerou-se que a trombomodulina promove a ativação da proteína C pela trombina e, portanto, é útil como um anti-coagulante, ou um agente trombolítico. Também foi relatado que, em testes com animais, trombomodulina é eficaz para terapia ou profilaxia de doenças associadas com um estado hipercoagulável (documento não-patente 3).

[0004] A trombomodulina foi descoberta pela primeira vez e obtida como uma glicoproteína expressa nas células endoteliais vasculares de diversas espécies animais, incluindo humanos, e, então, clonadas com sucesso. Especificamente, um gene de um precursor da trombomodulina humana, incluindo um peptídeo sinal, foi clonado a partir de uma biblioteca de cDNA de pulmão humano através de técnicas de engenharia genética e a sequência do gene completa da trombomodulina foi analisada e, como um resultado, uma sequência de aminoácidos consistindo de 575 resíduos contendo um peptídeo de sinal (em geral, 18 resíduos de aminoácidos são exemplificados) foi revelada (documento de patente 1). Sabe-se que a trombomodulina madura, a partir da qual o peptídeo sinal é clivado, é composta de 5 regiões, isto é, uma região N-terminal (resíduos de aminoácidos 1 a 226, estas posições são definidas sob a suposição de que o peptídeo sinal consiste de 18 resíduos de aminoácidos, e o mesmo se aplica às seguintes descrições), uma região tendo seis estruturas de tipo EGF (resíduos de aminoácidos 227 a 462), uma região de glicosilação O-ligada (resíduos de aminoácidos 463 a 498), uma região de transmembrana (resíduos de aminoácidos 499 a 521), e uma região citoplasmática (resíduos de aminoácidos 522 a 557), a partir do lado N -terminal do peptídeo maduro. Sabe-se também que uma proteína parcial tendo a mesma atividade que a de trombomodulina de comprimento completo (isto é, uma unidade ativa mínima) é constituída, principalmente, das quarta, quinta, e sexta estruturas de tipo EGF a partir do lado N-terminal na região tendo seis estruturas de tipo EGF (documento não-patente 4).

[0005] A trombomodulina de comprimento completo é dificilmente dissolvida na ausência de um tensoativo, e adição de um tensoativo é essencial para a fabricação de uma preparação de trombomodulina completa. A trombomodulina solúvel também está disponível, que pode ser totalmente dissolvida, mesmo na ausência de um tensoativo. A trombomodulina solúvel pode ser preparada por remoção de pelo menos uma parte da região transmembranar ou da região transmembranar completa. Por exemplo, foi confirmado que uma trombomodulina solúvel consistindo de apenas 3 regiões, isto é, a região N-terminal, a região tendo seis estruturas do tipo EGF, e a região de glicosilação O- ligada (ou seja, uma trombomodulina solúvel com uma sequência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácido 19 a 516 de SEQ ID NO: 9) pode ser obtida através da aplicação de técnicas de recombinação, e que a trombomodulina solúvel recombinante resultante tem a mesma atividade que a de uma trombomodulina completa (documento de Patente 1). Alguns outros relatos também estão disponíveis com relação à trombomodulinas solúveis (documentos de patentes 2 a 9). Uma trombomodulina solúvel derivada de urina humana e similares são também exemplificadas como trombomodulinas nativas (documentos de patentes 10 e 11).

[0006] Tal como é reconhecido em muitos casos, como resultado de mutações espontâneas ou mutações que ocorrem no momento da obtenção, mutações polimórficas foram encontradas nos genes humanos. Atualmente, proteínas de trombomodulina em que o aminoácido na posição 473 de precursor da trombomodulina humana tendo a sequência de aminoácidos consistindo de 575 resíduos de aminoácidos é convertido em Vai ou Ala foram identificados. Na sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos, esta variação do resíduo de aminoácidos corresponde a uma mutação de T ou C na posição 1418 (documento não-patente 5). No entanto, os dois tipos de trombomodulinas são completamente idênticos em termos de sua atividade e propriedades físico-químicas, e pode ser considerado que eles são substancialmente idênticos.

[0007] Tem sido relatado que a trombomodulina é eficaz para um tratamento terapêutico de coagulação intravascular disseminada (a seguir também referido como DIC) (documento não-patente6). Quanto ao uso de trombomodulina, além do uso acima mencionado, trombomodulina deverá ser usada em tratamentos terapêuticos e profiláticos de várias doenças, como síndrome coronariana aguda (ACS), trombose, obstrução dos vasos periféricos, arteriosclerose obstrutiva, vasculite, distúrbio funcional que ocorre após cirurgia cardíaca, complicação causada por transplante de órgãos, angina de peito, ataque isquêmico transiente, toxemia da gravidez, diabetes, VOD hepática (doença veno-oclusiva hepática, por exemplo, hepatite fulminante, doença venooclusiva do fígado ocorrendo após transplante de medula óssea), e trombose venosa profunda (DVT), e, ainda, sépsis e síndrome da angústia respiratória do adulto (ARDS) (documento de patente 12). [REFERÊNCIAS DA ARTE ANTERIOR]

[0008] [Documentos de patente] Documento de Patente 1: Publicação não examinada de patente japonesa (Kokai) No. 64-6219 Documento de Patente 2: Publicação não examinada de patente japonesa No. 5-213998 Documento de Patente 3: Publicação não examinada de patente japonesa No. 2-255699 Documento de Patente 4: Publicação não examinada de patente japonesa No. 3-133380 Documento de Patente 5: Publicação não examinada de patente japonesa No. 3-259084 Documento de Patente 6: Publicação não examinada de patente japonesa No. 4-210700 Documento de Patente 7: WQ92/00325 Documento de Patente 8: WO92/03149 Documento de Patente 9: WO93/15755 Documento de Patente 10: Publicação não examinada de patente japonesa No. 3-86900 Documento de Patente 11: Publicação não examinada de patente japonesa No. 3-218399 Documento de Patente 12: W003/061687

[0009] Documentos não-patente Documento não-patente 1: American College of Chest Physicians, CHEST/101/6-/JUNE, 1992:1481-1483 Documento não-patente 2: Koji Suzuki, Igaku no Ayumi (Progress of Medicine), Vol. 125, 901 (1983) Documento não-patente 3: K. Gomi et al., Blood, 75, 1396-1399 (1990) Documento não-patente 4: M. Zushi et al., J. Biol. Chem., 246, 10351-10353 (1989) Documento não-patente 5: D.Z. Wen et al., Biochemistry, 26, 4350-4357 (1987) Documento não-patente 6: S.M. Bates et al., Br. J. Pharmacol., 144, 10171028 (2005)

SUMÁRIO DA INVENÇÃO OBJETO A SER ALCANÇADO PELA INVENÇÃO

[0010] Um objeto da presente invenção é fornecer um medicamento ou método para o tratamento terapêutico eficaz ou melhora de sépsis em um paciente séptico grave.

Meios para atingir os objetos

[0011] A Razão Normalizada Internacional (a seguir também abreviada como "INR"), em uma amostra de plasma de um paciente com sépsis é conhecida para indicar coagulopatia. Por exemplo, no Congress of Critical Care Medicine (CCM), realizado em 2003, INR > 1,5 é relatada, bem como um PPT > 60 segundos, como critérios de coagulopatia (Crit. Care Med., 31, pp.1250 -1256 (2003)). No entanto, o valor de INR ainda não tinha sido autorizado como um critério claro, porque o valor não foi verificado por meio de testes clínicos, e similar. Na verdade, através de testes clínicos Fase III para o tratamento de pacientes com sépsis grave, Tifagofin como um inibidor da via do fator tecidual em uma classe de anticoagulantes é relatado para tendo alcançado um resultado mais favorável em um grupo de pacientes com INR < 1,2 do que um grupo de pacientes com INR >1,2 como resultado de teste clínico em que pacientes com INR >1,2 foram principalmente marcados (JAMA, 9 de julho, Vol. 290, No. 2, pp.238 -247 (2003)). Enquanto como outro resultado do teste clínico acima mencionado, entre a classe de pacientes com INR > 1,2, o fármaco é relatado como tendo alcançado um efeito maior em pacientes com INR > 1,5 do que em pacientes com INR > 1,2. Além disso, com Xigris, que é o único fármaco tendo sido verificado como eficaz contra sépsis através do estudo clínico, o prolongamento do tempo de protrombina (PT) foi observado na maioria dos pacientes no estudo (93,4 %).

[0012] Tal como explicado acima, no tratamento terapêutico de pacientes com sépsis por um anticoagulante, uma elevada eficácia é esperada pela escolha de uma classe de pacientes acompanhados com coagulopatia em vista de alguns dos resultados dos estudos clínicos. No entanto, considera-se que a definição de coagulopatia ainda não tinha sido autorizada, porque, por exemplo, também foram obtidos resultados clínicos em contrário. Em outras palavras, como um excelente resultado pode ser obtido pela escolha de pacientes alvos por meio do valor de INR não foi elucidado, e não há conhecimento técnico comum de qual nível de valor de INR de um paciente com sépsis assegura uma eficácia particular do fármaco. Com relação à correlação do valor INR com eficácia clínica, considera-se que apenas uma parte limitada da correlação foi conhecida em uma base caso-a-caso, como para alguns dos fármacos individuais.

[0013] Nestas circunstâncias, os inventores dedicaram a sua atenção para a trombomodulina entre anticoagulantes, e conduziram várias pesquisas sobre o efeito terapêutico e/ou de melhora contra sépsis. Como resultado, eles descobriram inesperadamente que a sépsis pode ser terapeuticamente tratada e/ou melhorada de forma mais eficaz em pacientes sépticos graves com uma ou mais disfunções de órgãos (exceto paciente séptico grave com disfunção de órgãos limitada ao fígado ou ao rim) do que em pacientes sépticos graves sem disfunção de órgãos, quando o valor de INR dos pacientes é superior a 1,4, em outras palavras, como para o tratamento terapêutico e/ou de melhora da sépsis por trombomodulina, os inventores verificaram que existe uma correlação particular entre pacientes sépticos graves com uma ou mais disfunções de órgãos, entre a classe de pacientes sépticos, e o valor de INR superior a 1,4, o que é inesperado para um versado na arte. Ainda mais surpreendentemente, os inventores descobriram que, para pacientes sépticos graves com o valor de INR maior do que 1,4 e igual ou inferior a 1,6, efeito particularmente notável foi alcançado em que uma diferença na taxa de mortalidade entre os grupos em trombomodulina e o grupo placebo era maior do que 15% e, como um resultado, realizaram a presente invenção. Em vista da diferença na taxa de mortalidade de cerca de 6% entre o grupo em fármaco e grupo placebo alcançada por Xigris (N. Engl. J. Med. Chem., 344, No.10, 08 de março, pp.699 - 709 (2001)), que é a única fármaco disponível comercialmente na Europa para o tratamento de sépsis, o valor de 15% como a diferença na taxa de mortalidade é um valor notável tão elevado como cerca de 2,5 vezes, e, portanto, pode ser reconhecido que uma das formas de realização da presente invenção alcança um efeito inesperadamente surpreendente.

[0014] Especificamente, a presente invenção inclui os seguintes:

[0015] [A1] Um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou melhora da sépsis que compreende trombomodulina como um ingrediente ativo, em que o referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

[0016] [A1-2] Um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou melhora da sépsis acompanhada com coagulopatia trombomodulina que compreende como um ingrediente ativo, em que o referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

[0017] [A2] O medicamento de acordo com [A1] ou [A1-2] acima mencionado, em que o referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de em uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4 e igual ou menor do que 1,6.

[0018] [A3] O medicamento de acordo com qualquer um de [A1] a [A2] acima mencionado, em que o paciente com sépsis grave é um paciente séptico grave que não é um paciente séptico com disfunção de órgãos limitada ao fígado ou rim.

[0019] Quando os números dos itens referidos são indicados com um tal faixa como “[A1] a [A2]” mencionada acima, e a faixa de produtos inclui um item indicado com um número tendo um subnúmero como [A1-2], significa-se que o item indicado com o número tendo um subnúmero como [A1-2] também é citado. O mesmo se aplica seguintes definições.

[0020] [A4] O medicamento de acordo com qualquer um de [A1] a [A3] acima mencionado, em que o referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos selecionadas entre o grupo consistindo de disfunção do fígado, disfunção do rim, disfunção de órgão respiratório e disfunção de órgão circulatório.

[0021] [A5] O medicamento de acordo com qualquer um de [A1] a [A4] acima mencionado, em que a trombomodulina é uma trombomodulina solúvel.

[0022] [A5-2] O medicamento de acordo com qualquer um de [A1] a [A5] acima mencionado, em que a trombomodulina solúvel apresenta as seguintes propriedades (1) a (4): (1) uma ação de se ligar seletivamente a trombina, (2) uma ação de promover a ativação da proteína C pela trombina, (3) uma ação de prolongar o tempo de coagulação da trombina, e (4) uma ação de suprimir a agregação plaquetária causada pela trombina.

[0023] [A5-3] O medicamento de acordo com qualquer um de [A1] a [A5] acima mencionado, em que a trombomodulina solúvel apresenta as seguintes propriedades (1) a (5): (1) uma ação de se ligar seletivamente a trombina, (2) uma ação de promover a ativação da proteína C pela trombina, (3) uma ação de prolongar o tempo de coagulação da trombina, (4) uma ação de suprimir a agregação de plaquetas causada pela trombina, e (5) ação anti- inflamatória.

[0024] [A6] O medicamento de acordo com qualquer um de [A1 ] a [A5-3] acima mencionado, em que a trombomodulina é um peptídeo obtido a partir de uma célula transformada preparada através da transfecção de uma célula hospedeira com um DNA codificando para a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11.

[0025] [A7] O medicamento de acordo com qualquer um de [A1] a [A6] acima mencionado, em que a trombomodulina solúvel é um peptídeo contendo a sequência de aminoácidos de (i-1) ou (i-2) mencionados abaixo, e referido peptídeo é um peptídeo tendo a atividade de trombomodulina;

[0026] (i-1) a sequência de aminoácidos das posições 19 a 516 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou 11, ou

[0027] (i-2) a sequência de aminoácidos de (i-1) acima mencionada, que inclui ainda a substituição, deleção ou adição de um ou mais resíduos de aminoácidos.

[0028] [A7-2] O medicamento de acordo com qualquer um de [A1] a [A6] acima mencionado, em que a trombomodulina solúvel é um peptídeo contendo: (1) a sequência de aminoácidos das posições 367 a 480 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou 11, e a sequência de aminoácidos de (ii-1) ou (II2) mencionado abaixo, e referido peptídeo é um peptídeo tendo as atividades de trombomodulina: (ii-1) a sequência de aminoácidos das posições 19 a 244 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou 11, ou (ii-2) a sequência de aminoácidos de (ii-1) acima mencionada, que inclui ainda a substituição, deleção ou adição de um ou mais resíduos de aminoácidos,

[0029] [A8] O medicamento de acordo com qualquer um de [A1] a [A7-2] acima mencionado, em que a trombomodulina é administrada em uma dose de 0,005 a 1 mg/kg no prazo de 5 minutos de administração de bolo intravenoso.

[0030] [B1] Um método para tratamento terapêutico e/ou melhora de sépsis, que compreende a etapa de administrar trombomodulina a um paciente com sépsis grave, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

[0031] [B1-2] Um método para o tratamento terapêutico e/ou melhora da sépsis acompanhada com coagulopatia, que compreende a etapa de administrar trombomodulina a um paciente com sépsis grave, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

[0032] [B-2] O método de acordo com [B1] ou [B1-2] acima mencionado, que compreende a etapa de administrar trombomodulina a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4 e igual ou inferior a 1,6.

[0033] [B3] O método de acordo com qualquer um de [B1] a [B-2] acima mencionado, em que o paciente com sépsis grave é um paciente séptico grave que não é um paciente séptico com disfunção de órgãos limitados ao fígado ou rim.

[0034] [B4] O método de acordo com qualquer um de [B1] a [B3] acima mencionado, que compreende a etapa de administrar trombomodulina a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos selecionadas entre o grupo consistindo de disfunção do fígado, disfunção do rim, disfunção de órgão respiratório, disfunção de órgão circulatório.

[0035] [B5] O método de acordo com qualquer um de [B1] a [B4] acima mencionado, em que a trombomodulina é uma trombomodulina solúvel.

[0036] [B6] O método de acordo com qualquer um de [B1] a [B5] acima mencionado, em que a trombomodulina é um peptídeo obtido a partir de uma célula transformada preparada através da transfecção de uma célula hospedeira com um DNA codificando para a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11.

[0037] [B7] O método de acordo com qualquer urn de [B1] a [B6] acima mencionado, em que a trombomodulina solúvel é um peptídeo contendo a sequência de aminoácidos de (i-1) ou (i-2) mencionada abaixo, e referido peptídeo é um peptídeo tendo a atividade de trombomodulina; (i-1) a sequência de aminoácidos das posições 19 a 516 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou 11, ou (i-2) a sequência de aminoácidos de (i-1) acima mencionada, que inclui ainda substituição, deleção ou adição de um ou mais resíduos de aminoácidos.

[0038] [B8] O método de acordo com qualquer um de [B1] a [B7] acima mencionado, em que a trombomodulina é administrada em uma dose de 0,005 a 1 mg/kg no prazo de 5 minutos de administração de bolo intravenoso.

[0039] [B8-2] O método de acordo com qualquer um de [B1] a [B8] acima mencionados, em que a trombomodulina é uma trombomodulina tendo as características mencionadas em [A5-2], [A5-3] ou [A7-2] mencionados acima.

[0040] [B9] Uso de trombomodulina como um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou melhora de sépsis, em que o referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

[0041] [B9-2] O uso de acordo com [B9] acima mencionado, em que a trombomodulina é uma trombomodulina tendo as características mencionadas em [A5-2], [A5-3] ou [A7-2] acima mencionados.

[0042] [B9-3] O uso de acordo com [B9] acima mencionado, tendo as características mencionadas em qualquer um de [A1] a [A8] acima mencionados.

[0043] [C1] Um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou melhora da coagulação intravascular disseminada, em que o referido medicamento é para administração a um paciente com coagulação intravascular disseminada acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

[0044] [C2] O medicamento de acordo com [C1] acima mencionado, que têm as características mencionadas em qualquer um de [A1 ] a [A8] acima mencionados.

EFEITO DA INVENÇÃO

[0045] Com o medicamento da presente invenção contendo trombomodulina, sépsis em um paciente séptico grave, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4, pode ser tratada e/ou melhorada de modo eficaz.

MODOS PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[0046] A seguir, várias formas de realização preferidas da presente invenção (modos preferidos para a realização da invenção, abaixo também designados por "formas de realização” no relatório) serão especificamente explicadas. No entanto, o escopo da presente invenção não é limitado às formas de realização específicas explicadas abaixo.

[0047] A trombomodulina desta forma de realização preferivelmente é conhecida como tendo uma ação de (1) se ligar seletivamente a trombina (2) para promover a ativação da proteína C pela trombina. Além disso, é preferível que a trombomodulina seja confirmada como tendo, geralmente, (3) uma ação de prolongar o tempo de coagulação da trombina, (4) uma ação de supressão da agregação de plaquetas causada pela trombina, e/ou (5) ação anti-inflamatória. Tais ações que a trombomodulina possui podem ser referidas como atividades de trombomodulina.

[0048] Como as atividades da trombomodulina, a trombomodulina tem preferivelmente ações de (1) e (2) acima mencionados, e mais preferivelmente tem as ações de (1) a (4) acima mencionados. Como as atividades da trombomodulina, trombomodulina tem mais preferivelmente todas as ações de (1) a (5) acima mencionados.

[0049] A ação da trombomodulina para se ligar com a trombina pode ser confirmada pelos métodos de estudo descritos em várias publicações conhecidas, como Trombosis and Haemostasis, 70(3):418-422 (1993) e The Journal of Biological Chemistry, 264, 9, pp 4872-4876 (1989). Quanto à ação de promover a ativação da proteína C pela trombina, o grau de atividade de promover a ativação da proteína C pela trombina ou presença ou ausência da ação pode ser facilmente confirmado por métodos de estudo claramente descritos em várias publicações conhecidas, incluindo, por exemplo, Publicação de Patente Japonesa não examinada N° 646219. Além disso, a ação de prolongar o tempo de coagulação da trombina, e/ou a ação de supressão da agregação de plaquetas causada pela trombina podem ser similarmente e facilmente confirmadas. Além disso, a ação anti-inflamatória também pode ser confirmada pelos métodos de estudo descritos em várias publicações conhecidas, incluindo, por exemplo, Blood, 112:3361-3670 (2008) e The Journal of Clinical Investigação, 115, 5:1267-1274 (2005).

[0050] A trombomodulina usada para a presente invenção não é particularmente limitada na medida em que tenha as atividades da trombomodulina. A trombomodulina é preferivelmente uma trombomodulina solúvel sob a condição sem tensoativos. A solubilidade da trombomodulina solúvel em água, como água destilada usada para injeção (na ausência de um tensoativo, como Triton X-100 ou o polidocanol, e geralmente em torno da faixa de pH neutro) é, preferivelmente, por exemplo, 1 mg/mL ou mais ou 10 mg/mL ou mais; preferivelmente de 15 mg/mL ou mais, ou 17 mg/mL ou mais; mais preferivelmente, 20 mg/mL ou mais, de 25 mg/mL ou mais, ou 30 mg/mL ou mais; particularmente preferivelmente 60 mg/ml ou mais. Em alguns casos, a solubilidade é, por exemplo, 80 mg/mL ou mais, ou 100 mg/mL ou mais. Para determinar se ou não uma trombomodulina solúvel é dissolvida com sucesso em água, entende-se que a aparência límpida de uma solução e a ausência de substâncias insolúveis aparentemente observáveis servem como critérios simples, depois da trombomodulina solúvel ser dissolvida em água e a solução observada por inspeção visual, por exemplo, apenas sob uma luz branca em uma posição correspondendo a uma iluminação de aproximadamente 1.000 luxes. Também é possível observar a presença ou ausência de qualquer resíduo depois da filtração.

[0051] O peso molecular da trombomodulina não é limitado desde que tenha as atividades da trombomodulina, como descritas acima. O peso molecular é preferivelmente de 100.000 ou menos, mais preferivelmente de 90.000 ou menos, ainda mais preferivelmente de 80.000 ou menos, mais preferivelmente de 70.000 ou menos, e o peso molecular é preferivelmente de 50.000 ou maior, mais preferivelmente de 60.000 ou maior. O peso molecular da trombomodulina solúvel pode ser facilmente medido por meio de métodos comuns para a medição do peso molecular da proteína. Medição por espectrometria de massa é preferida, e o método MALDI -TOF-MS é o mais preferido. Para a obtenção de trombomodulina solúvel com um peso molecular dentro de uma faixa desejada, uma trombomodulina solúvel, que é obtida por cultura de uma célula transformante preparada através da transfecção de uma célula hospedeira com uma trombomodulina solúvel codificando DNA usando um vetor, pode ser submetida a fracionamento usando cromatografia de coluna ou similares, como descrito depois.

[0052] A trombomodulina usada para a presente invenção compreende, preferivelmente, a sequência de aminoácidos consistindo nos resíduos de aminoácidos nas posições 19 a 132 de SEQ ID NO: 1, que era conhecida como a porção central das atividades de trombomodulina da trombomodulina humana, e a trombomodulina não é particularmente limitada, desde que a trombomodulina compreenda a sequência de aminoácidos consistindo dos resíduos de aminoácidos nas posições 19 a 132 de SEQ ID NO: 1. A sequência de aminoácidos consistindo dos resíduos de aminoácidos nas posições 19 a 132 de SEQ ID NO: 1 pode ser naturalmente ou artificialmente mudada, desde que a sequência tenha uma ação para promover a ativação de proteína C por trombina, ou seja, uma das atividades da trombomodulina. Especificamente, a sequência pode compreender substituição, deleção ou adição de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos consistindo dos resíduos de aminoácido nas posições 19 a 132 de SEQ ID NO: 1. Nível aceitável da mutação não é particularmente limitado, desde que a sequência de aminoácidos tenha as atividades de trombomodulina. Um exemplo inclui uma homologia de 50% ou mais como as sequências de aminoácidos e a homologia é preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, particularmente preferivelmente 95% ou mais, e mais preferivelmente 98% ou mais. Tal sequência de aminoácidos mudada incluindo substituição, deleção ou adição de um ou mais resíduos de aminoácidos é designada como sequência de mutação homóloga. Como descrito depois, estas sequências de aminoácidos mudadas podem ser facilmente produzidas usando técnicas de manipulação de genes comuns. A trombomodulina não é particularmente limitada desde que ela tenha a sequência acima mencionada e a ação de se ligar seletivamente à trombina para promover a ativação da proteína C pela trombina, pelo menos, como a trombomodulina completa, mas a trombomodulina preferivelmente também tem ação anti-inflamatória.

[0053] A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 compreende a mutação de Vai como o aminoácido na posição 125 da sequência de SEQ ID NO: 1 para Ala. A trombomodulina usada para a presente invenção também preferivelmente compreende a sequência de aminoácidos da posição 19 a 132 de SEQ ID NO: 3.

[0054] Como descrito, apesar da trombomodulina usada para a presente invenção não ser particularmente limitada desde que a trombomodulina tenha, pelo menos, a sequência de aminoácidos da posição 19 a 132 de SEQ ID NO: 1 ou 3, ou uma sequência de mutação homóloga da mesma, e compreenda pelo menos uma sequência de peptídeos tendo as atividades de trombomodulina, exemplos preferidos da trombomodulina incluem um peptídeo consistindo da sequência a partir da posição 19 a 132 ou 17 a 132 em qualquer uma de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, e um peptídeo consistindo de uma sequência de mutação homóloga da sequência acima mencionada e tendo pelo menos as atividades de trombomodulina. Um peptídeo consistindo da sequência a partir da posição 19 a 132 em qualquer uma de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 é mais preferido. Em outra forma de realização, um peptídeo consistindo de uma sequência de mutação homóloga da sequência a partir da posição 19 a 132 ou 17 a 132 em qualquer uma de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 e tendo pelo menos as atividades de trombomodulina é mais preferido.

[0055] Como outra forma de realização da trombomodulina de acordo com a presente invenção, a trombomodulina preferivelmente compreende a sequência de aminoácidos a partir das posições 19 a 480 de SEQ ID NO: 5, que não é 5 particularmente limitada desde que a trombomodulina compreenda a sequência de aminoácidos da posição 19 a 480 de SEQ ID NO: 5. A sequência de aminoácidos a partir das posições 19 a 480 de SEQ ID NO: 5 pode ser uma sequência de mutação homóloga da mesma, desde que a sequência tenha uma ação para promover a ativação de Proteína C por trombina, isto é, uma das atividades de trombomodulina. 10

[0056] A sequência de SEQ ID NO: 7 compreende a mutação de Vai como o aminoácido na posição 473 da sequência de SEQ ID NO: 5 para Ala. A trombomodulina usada para a presente invenção também preferivelmente compreende a sequência de aminoácidos da posição 19 a 480 de SEQ ID NO: 7.

[0057] como descrito acima, apesar da trombomodulina usada para a 15 presente invenção não ser particularmente limitada desde que a trombomodulina tenha, pelo menos, a sequência a partir da posição 19 a 480 em qualquer uma de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, ou uma sequência de mutação homóloga da mesma, e compreenda pelo menos uma sequência de peptídeos tendo as atividades de trombomodulina, exemplos preferidos da trombomodulina incluem um peptídeo 20 consistindo da sequência a partir da posição 19 a 480 ou 17 a 480 em qualquer uma de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, e um peptídeo consistindo de uma sequência de mutação homóloga da sequência acima mencionada e tendo pelo menos as atividades de trombomodulina. Um peptídeo consistindo da sequência a partir da posição 19 a 480 de SEQ ID NO: 5 ou 7 é mais preferido. Em outra forma de 25 realização, um peptídeo consistindo de uma sequência de mutação homóloga da sequência a partir da posição 19 a 480 ou 17 a 480 em qualquer uma de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7, e tendo as atividades de trombomodulina é mais preferido .

[0058] Como outra forma de realização da trombomodulina de acordo com a presente invenção, a trombomodulina preferivelmente compreende a sequência de 30 aminoácidos da posição 19 a 515 de SEQ ID NO: 9, que não é particularmente limitada desde que a trombomodulina compreenda a sequência de aminoácidos da posição 19 a 515 de SEQ ID NO: 9. A sequência de aminoácidos a partir da posição 19 a 515 de SEQ ID NO: 9 pode ser uma sequência de mutação homóloga da mesma, desde que a sequência tenha uma ação para promover a ativação de Proteína C por trombina, isto é, as atividades de trombomodulina.

[0059] A sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 compreende a mutação de Vai como o aminoácido na posição 473 de SEQ ID NO: 9 a Ala. A trombomodulina usada para a presente invenção também preferivelmente compreende a sequência de aminoácidos da posição 19 a 515 de SEQ ID NO: 11.

[0060] Como descrito acima, apesar da trombomodulina usada para a presente invenção não ser particularmente limitada desde que a trombomodulina tenha, pelo menos, a sequência a partir da posição 19 a 515 em qualquer uma de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11, ou uma sequência de mutação homóloga da mesma, e compreenda uma sequência de peptídeos tendo pelo menos as atividades de trombomodulina, outros exemplos preferidos incluem um peptídeo tendo a sequência a partir de posição 19 a 516, 19 a 515, 17 a 516, ou 17 a 515 em qualquer uma de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11, e um peptídeo consistindo de uma sequência de mutação homóloga da sequência acima mencionada e tendo pelo menos as atividades de trombomodulina. Um peptídeo tendo a sequência a partir da posição 19 a 516, 19 a 515, 17 a 516, ou 17 a 515 de SEQ ID NO: 9 é particularmente preferido. Uma mistura dos mesmos é também um exemplo preferido. Em outra forma de realização, um peptídeo tendo uma sequência a partir da posição 19 a 516, 19 a 515, 17 a 516, ou 17 a 515 de SEQ ID NO: 11 é particularmente preferido. Uma mistura dos mesmos é também um exemplo preferido. Além disso, um peptídeo consistindo de uma sequência de mutação homóloga do mesmo e tendo pelo menos as atividades de trombomodulina é também um exemplo preferido. Prefere-se que a trombomodulina solúvel também tenha a ação anti-inflamatória.

[0061] Um peptídeo tendo uma sequência de mutação homóloga é como descrito acima, e significa um peptídeo que pode compreender substituição, deleção ou adição, de, pelo menos, um ou seja um ou mais, preferivelmente vários (por exemplo, 1 a 20, preferivelmente 1 a 10, mais preferivelmente 1 a 5, particularmente preferivelmente 1 a 3) resíduos de aminoácidos, na sequência de aminoácidos de do peptídeo submetido. Apesar do nível aceitável de mutação não ser particularmente limitado desde que um peptídeo tenha as atividades de trombomodulina, um exemplo aceitável de homologia inclui 50% ou mais como sequências de aminoácidos, e a homologia pode ser, preferivelmente 70% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, ainda preferivelmente 90% ou mais, particularmente preferivelmente 95% ou mais, e o mais preferivelmente 98% ou mais.

[0062] Exemplos preferidos da trombomodulina usada para a presente invenção também incluem o peptídeo consistindo da sequência de SEQ ID NO: 14 (462 resíduos de aminoácidos), o peptídeo consistindo da sequência de SEQ ID NO: 8 (272 resíduos de aminoácidos), e o peptídeo consistindo da sequência de SEQ ID NO: 6 (236 resíduos de aminoácidos) descritos em publicação não examinada de patente japonesa No. 64-6219.

[0063] A trombomodulina usada para a presente invenção não é particularmente limitada desde que a trombomodulina tenha, pelo menos, a sequência de aminoácidos da posição 19 a 132 em qualquer uma de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3. Como tal trombomodulina, um peptídeo tendo pelo menos a sequência de aminoácidos da posição 19 a 480 em qualquer uma de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7 é preferido, e um peptídeo tendo pelo menos a sequência de aminoácidos da posição 19 a 515 em qualquer uma de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11 é mais preferido. Um exemplo mais preferido do peptídeo tendo pelo menos a sequência de aminoácidos da posição 19 a 515 em qualquer uma de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11 é um peptídeo tendo uma sequência a partir da posição 19 a 516, 19 a 515, 19 a 514, 17 a 516, 17 a 515, ou 19 a 514 em qualquer uma de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11. Ainda mais, uma mistura de peptídeos, cada consistindo da sequência a partir da posição 19 a 516, 19 a 515, 19 a 514, 17 a 516, 17 a 515, ou 19 a 514 em qualquer uma de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11 é também um exemplo preferido.

[0064] No caso da mistura acima mencionada, a razão de mistura de um peptídeo que se inicia a partir da posição 17 e um peptídeo que se inicia a partir da posição 19 para cada uma de SEQ ID NOS: 9 e 11 é, por exemplo, 30:70 a 50:50, preferivelmente 35:65 a 45:55.

[0065] Além disso, a razão de mistura de um peptídeo que termina na posição 514, um peptídeo que termina na posição 515, e um peptídeo que termina na posição 516 para cada uma de SEQ ID NOS: 9 e 11 é, por exemplo, 0:0:100 a 0:90:10, ou 0:70:30 a 10:90:0, ou 10:0:90 a 20:10:70, se desejado.

[0066] A razão de mistura dos peptídeos pode ser determinada por um método comum.

[0067] A sequência das posições 19 a 132 em SEQ ID NO: 1 corresponde à sequência das posições 367 a 480 em SEQ ID NO: 9, e a sequência das posições 19 a 480 em SEQ ID NO: 5 corresponde à sequência das posições 19 a 480 em SEQ ID NO: 9. Além disso, a sequência das posições 19 a 132 em SEQ ID NO: 3 corresponde à sequência das posições 367 a 480 em SEQ ID NO: 11, e a sequência das posições 19 a 480 em SEQ ID NO: 7 corresponde à sequência das posições 19 a 480 em SEQ ID NO: 11. Ainda mais, todas as sequências das posições 1 a 18 em SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9 e 11 são sequências idênticas.

[0068] Como descrito abaixo, estas trombomodulinas de acordo com a presente invenção podem ser obtidas a partir de células transformantes preparados por transfecção de células hospedeiras com um DNA codificando para o peptídeo (especificamente, as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, e similares), usando um vetor.

[0069] É suficiente que esses peptídeos tenham apenas as sequências de aminoácidos acima mencionadas, e uma cadeia de açúcar pode estar fixada ou não fixada, o que não é particularmente limitado. Em técnicas de manipulação de genes, um tipo de uma cadeia de açúcar, uma posição em que uma cadeia de açúcar é adicionada, e um nível de adição dos mesmos diferem dependendo de um tipo de células hospedeiras usadas, e podem ser usados quaisquer técnicas. Como para a posição de ligação de uma cadeia de açúcar e um tipo da mesma, fatos descritos na publicação não examinada de patente de japonesa 11-341990 são conhecidos, e as trombomodulinas de acordo com a presente invenção podem ser adicionadas com a mesma cadeia de açúcar, na mesma posição. Dois tipos de cadeias de açúcar N- ligadas, os do tipo fucosil biantenário e tipo fucosil triantenário, podem ligar-se a trombomodulina desta forma de realização, e a razão dos mesmos é, por exemplo, 100:0 a 60:40, preferivelmente de 95:5 a 60:40, mais preferivelmente de 90:10 a 70:30. A razão destas cadeias de açúcar pode ser medida em um mapa de cadeia de açúcar bidimensional descrito em Biochemical Experimental Métodos, Vol. 23, Métodos of Researches on Glycoprotein Sugar Chains, Japan Scientific Societies Press (1990), e similares. Além disso, quando uma composição de açúcar da trombomodulina desta forma de realização é examinada, sacarídeos neutros, amino sacarídeos, e ácido siálico são detectados, cujo teor pode ser, cada independentemente, por exemplo, 1 a 30%, preferivelmente 2 a 20%, mais preferivelmente 5 a 10%, em termos de razão em peso com base no teor de proteína. Os teores de açúcar podem ser medidos por métodos descritos em Lecture of New Biochemical Experiments, vol. 3, Sugar I Glycoprotein (Book 1), Tokyo Kagaku Dojin (1990) (sacarídeos neutros: método fenol-ácido sulfúrico, amino sacarídeos: método Elson -Morgan, ácido siálico: Método ácido periódico-resorcinol).

[0070] Apesar do método para obter a trombomodulina não ser limitado para a sua obtenção por manipulação genética, como descrito depois, como uma sequência de sinal que pode ser usada para a expressão onde a trombomodulina é obtida por manipulação de genes, uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos das posições 1 a 18 em SEQ ID NO: 9, e a sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos das posições 1 a 16 em SEQ ID NO: 9 podem ser usadas, e outras sequências de sinal conhecidas, como a sequência de sinal de ativador de plasminogênio de tecido humano também podem ser usadas. (Publicação internacional WO88/9811).

[0071] Quando uma sequência de DNA codificando trombomodulina é introduzida em uma célula hospedeira, exemplos de métodos preferidos incluem um método de incorporar uma sequência de DNA codificando trombomodulina em, preferivelmente, um vetor, mais preferivelmente um vetor de expressão capaz de ser expresso em células de animais e, então, introduzindo o DNA com o vetor. Um vetor de expressão é uma molécula de DNA que é constituída com uma sequência de promotor, uma sequência para adicionar um sítio de ligação de ribossoma a mRNA, uma sequência de DNA codificando uma proteína a ser expressada, um sinal de emenda, uma sequência de terminador para terminação da transcrição, uma sequência de origem de replicação, e similares. Exemplos de vetor de expressão de células de animais preferidos incluem pSV2-X relatado por Mulligan R.C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 78, 2072 (1981)); pBP69T (69-6) relatado por Howley P.M. et al. (Methods in Emzymology, 101, 387 (1983), Academic Press), e similares. Além disso, também se tem outra forma de realização preferida em que o DNA é introduzido em um vetor de expressão expressível em um microorganismo.

[0072] Exemplos de célula hospedeira que podem ser usados na produção de tais peptídeos, como mencionado acima incluem células de animais. Exemplos das células de animais incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), células COS-1, células COS-7, células VERO (ATCC CCL-81), células BHK, células MDCK derivadas de rim canino, células AV-12-664 de hamster, e similares. Além disso, exemplos de célula hospedeira derivada de humano incluem células HeLa, células WI38, células 293humanas, e células PER.C6. Dentre estas, as células CHO são muito comuns e preferidas e dentre as células CHO, as células CHO deficientes em dihidrofolato redutase são mais preferidas.

[0073] Em um processo de manipulação de genes, ou um processo de produção de peptídeos, microorganismos, como Escherichia coli, também são usados com freqüência. Um sistema de hospedeiro-vetor apropriado para cada processo é preferivelmente usado, e um sistema de vetor apropriado também pode ser selecionado para as células hospedeiras acima mencionadas. O gene de trombomodulina usado em uma técnica de recombinação genética foi clonado. Exemplos de produção de trombomodulina por tal técnica de recombinação genética foram descritos, e ainda, métodos para purificar trombomodulina para obter um produto purificado da mesma também são conhecidos (Publicação não examinada de patente japonesa Nos. 64-6219, 2-255699, 5-213998, 5-310787, 7-155176; e J. Biol. Chem., 264:10351-10353 (1989)). Assim, a trombomodulina usada para a presente invenção pode se produzida usando os métodos descritos nos relatos acima mencionados ou por métodos similares. Por exemplo, publicação não 5 examinada de patente japonesa No. 64-6219 descreve Escherichia coli K-12 cepa DH5 (ATCC acesso No. 67283) contendo um plasmídeo pSV2TMJ2 que contém um DNA codificando trombomodulina de comprimento completo Esta cepa re-depositada no antigo National Institute of Bioscience and Human-Technology (atualmente Independent Administrative Institution, National Institute of Advanced Industrial 10 Science and Technology, International Patent Organism Depositary) (Escherichia coli DH5/pSV2TMJ2) (FERM BP-5570) também pode ser usada. A trombomodulina de acordo com a presente invenção pode ser preparada por uma técnica de manipulação de genes conhecida usando um DNA codificando uma trombomodulina de comprimento completo como o material de partida. 15

[0074] A trombomodulina desta forma de realização pode ser preparada por um método convencionalmente conhecido ou um método similar. Por exemplo, o método acima mencionado de Yamamoto et al. (Publicação não examinada de patente japonesa No. 64-6219) ou o método descrito na Publicação não examinada de patente japonesa No. 5-213998 podem ser consultados. Especificamente, por 20 exemplo, um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 é preparado a partir do gene de trombomodulina derivado de humano por uma técnica de manipulação de genes, e pode ser ainda modificado, como necessário. Para esta modificação, a fim de obter um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (que especificamente consiste da sequência de nucleotideos de 25 SEQ ID NO: 12), códons codificando um aminoácido na posição 473 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (em particular, o nucleotídeo na posição 1418 em SEQ ID NO: 10) são mudados por mutagenese sítio-dirigida de acordo com o método descrito por Zoller M.J. et al. (Method in Enzymology, 100:468-500 (1983), Academic Press). Por exemplo, usando um DNA sintético para mutação tendo a 30 sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 13, o nucleotídeo T na posição 1418 em SEQ ID NO: 10 pode ser convertido no nucleotideo C para obter um DNA mudado.

[0075] O DNA preparado como descrito acima é incorporado em, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO) para obter as células transformantes. Tais células são submetidas a uma seleção apropriada, e trombomodulina purificada por um método conhecido podem ser produzidas a partir de uma solução de cultura obtida por cultura de uma célula selecionada. Como descrito acima, o DNA (SEQ ID NO: 10) codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 é preferivelmente transfectado para a célula hospedeira acima mencionada.

[0076] O método para a produção de trombomodulina da presente forma de realização não é limitado ao método acima mencionado. Por exemplo, também é possível extrair e purificar a trombomodulina a partir da urina, sangue, outros fluidos corporais e similares, ou extrair e purificar a trombomodulina a partir de um tecido produzindo trombomodulina de uma cultura do tecido acima mencionado e similares. Além disso, a trombomodulina pode ser ainda submetida a um tratamento de divagem usando uma protease, como requerido.

[0077] Para a cultura da célula transformante acima mencionado, um meio usado para a cultura celular comum pode ser usado, e é preferível cultivar a célula transformante em vários tipos de meios com antecedência para escolher um meio ótimo. Por exemplo, um meio conhecido como o meio MEM, meio DMEM, e meio 199 pode ser usado como um meio de base, e outro meio melhorado ou meio adicionado com suplementos para vários meios podem ser usados . Exemplos do método de cultura incluem a cultura de soro, em que a cultura é realizada em um meio contendo soro de sangue, e cultura isenta de soro, em que a cultura é efetuada em um meio não contendo soro sanguíneo. Embora o método de cultura não seja particularmente limitado, a cultura livre de soro é preferida.

[0078] Quando soro é adicionado a um meio, no caso da cultura de soro, soro bovino é preferido. Exemplos de soro bovino incluem soro fetal bovino, soro de bovino recém-nascido, soro de vitelo, soro de bovino adulto, e similares, e qualquer um destes exemplos pode ser usado, até agora, desde que o soro seja apropriado para a cultura de células. Como o meio isento de soro usado na cultura isenta de soro, os meios disponíveis comercialmente podem ser usados. Meio isento de soro apropriado para várias células são comercializados, e, por exemplo, para a célula de CHO, CD-CHO, CHO-S-SFMII e CHO-III-GFP são vendidos pela Invitrogen, e IS CHO, IS CHO-CD, e similares são vendidos por Irvine Scientific. Estes meios podem ser usados sem qualquer tratamento, ou eles podem ser melhorados ou adicionados com suplementos e usados. Exemplos do meio isento de soro ainda incluem o meio DMEM contendo 5 mg/L de cada um de insulina, transferrina, e ácido selenioso. Como descrito acima, o meio não é particularmente limitado na medida em que o meio pode ser usado para produzir a trombomodulina da presente forma de realização. O método de cultura não é particularmente limitado, e qualquer uma de cultura em batelada, cultura em batelada repetitiva, cultura em batelada descontínua, cultura de perfusão, e similares, pode ser usada.

[0079] Quando a trombomodulina usada para a presente invenção é preparada pelo método de cultura de células acima mencionado, diversidade pode ser observada no aminoácido N-término devido à modificação pós-translacional da proteína. Por exemplo, o aminoácido da posição 17, 18, 19 ou 22 em SEQ ID NO: 9 pode servir como o aminoácido N-término. Além disso, por exemplo, o aminoácido N-término pode ser modificado de modo que o ácido glutâmico na posição 22 é mudado para ácido piroglutâmico. Prefere-se que o aminoácido da posição 17 ou 19 sirva como o aminoácido N-término, e é mais preferido que o aminoácido da posição 19 sirva como o aminoácido N-término. Além disso, também se tem outra forma de realização em que o aminoácido da posição 17 serve como o aminoácido N-término, que é uma forma de realização preferida. Como para a modificação, diversidade e similar, mencionados acima, exemplos similares podem ser mencionados para uma sequência de SEQ ID NO: 11.

[0080] Além disso, quando a trombomodulina solúvel é preparada usando DNA tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 10, diversidade do aminoácido C-término pode ser observada, e um peptídeo mais curto por um resíduo de aminoácido pode ser produzido. Especificamente, o aminoácido C-término pode ser modificado de modo que o aminoácido da posição 515 serve como o aminoácido C-término, e ainda a posição 515 é amidada. Além disso, um peptídeo mais curto por dois resíduos de aminoácidos pode ser produzido. Especificamente, o aminoácido da posição 514 pode servir como o aminoácido C-término. Assim, qualquer um dos peptídeos tendo diversidade significante do aminoácido N-término e aminoácido C-término, ou uma mistura dos mesmos, pode ser produzido. Prefere- se que o aminoácido da posição 515 ou o aminoácido da posição 516 sirva como o aminoácido C-término, e é mais preferido que o aminoácido da posição 516 sirva como o aminoácido C-término. Além disso, também existe outra forma de realização em que o aminoácido da posição 514 serve como o aminoácido C-término, que é uma forma de realização preferida. Com relação à modificação, diversidade e similares descritos acima, o mesmo também se aplica a um DNA tendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12.

[0081] A trombomodulina obtida pelo método descrito acima, pode ser uma mistura de peptídeos tendo a diversidade nos aminoácidos N-terminal e C-terminal. Os exemplos específicos incluem uma mistura de peptídeos tendo as sequências das posições 19 a 516, posições 19 a 515, posições 19 a 514, posições 17-516, posições 17-515, e posições 17-514 na SEQ ID NO: 9.

[0082] Em seguida, o isolamento e a purificação de trombomodulina de um sobrenadante de cultura ou de cultura obtida como descrito acima podem ser realizados através de métodos conhecidos [Editado por Takeichi Horio, Tanpakushitsu/Koso no Kiso Jikken Ho (Métodos experimentais fundamentais para proteínas e enzimas) (1981)]. Por exemplo, é preferível usar cromatografia de troca iônica ou cromatografia de adsorção, que usa uma interação entre a trombomodulina e um carreador cromatográfico em que os grupos funcionais tendo uma carga oposta à da trombomodulina são imobilizados. Outro exemplo preferido é a cromatografia de afinidade usando afinidade específica com trombomodulina. Os exemplos preferidos de adsorventes incluem trombina, que é um ligando de trombomodulina e um anticorpo anti-trombomodulina. Como o anticorpo, os anticorpos anti- trombomodulina tendo propriedades apropriadas ou que reconhecem epítopos apropriados podem ser usados. Exemplos incluem, por exemplo, aqueles descritos na Publicação de Patente Japonesa (Kokoku) N ° 5-42920, Publicações Não Examinadas de Patente Japonesa N°s 64-45398 e 6-205692 e similares. Outros exemplos incluem a cromatografia de filtração em gel e ultrafiltração, que usam o tamanho molecular da trombomodulina. Outros exemplos incluem ainda cromatografia hidrofóbica que usa ligação hidrofóbica entre um carreador cromatográfico em que os grupos hidrofóbicos são imobilizados, e uma porção hidrofóbica de trombomodulina. Por outro lado, hidroxiapatita pode ser usada como um veículo em cromatografia de adsorção, cujos exemplos incluem, por exemplo, os descritos na Publicação não examinada de patente japonesa No. 9-110900. Estes meios podem ser usados em combinação, como necessário. Apesar do grau de purificação poder ser selecionado dependendo de uma finalidade de uso e similares, é desejável purificar trombomodulina até que uma única banda seja obtida como resultado da eletroforese, preferivelmente, SDS- PAGE, ou um único pico é obtido como um resultado de HPLC de filtração em gel ou HPLC de fase reversa do produto isolado e purificado. Deve ser entendido que, quando são usados dois ou mais tipos de trombomodulinas, é preferível que apenas as bandas das trombomodulinas sejam substancialmente obtidas, e isto não é necessário para obter uma banda única.

[0083] Os exemplos específicos do método de purificação usado na presente invenção incluem um método de purificação usando a atividade de trombomodulina como um critério, por exemplo, um método de purificação compreendendo grosseiramente a purificação de um sobrenadante de cultura ou de um produto de cultura com uma coluna de permuta iônica Q - Sepharose Fast Flow para coletar uma fração tendo as atividades de trombomodulina; então, purificar a fração com uma coluna de afinidade, coluna DIP-trombina-agarose (diisopropilfosforiltrombina agarose), como o principal passo de purificação para se recuperar uma fração tendo atividades da trombomodulina potentes; então, concentrar a fração recuperada e seguido de filtração em gel para obter uma fração ativa de trombomodulina como um produto purificado (Gomi K. et al, Blood, 75:. 1396-1399 (1990)). Um exemplo das atividades de trombomodulina usadas como critério é uma atividade de promover a ativação da proteína C pela trombina. Outros exemplos preferidos do método de purificação serão exemplificados abaixo.

[0084] Uma resina de troca iônica apropriada tendo boas condições de adsorção para a trombomodulina é selecionada e purificação por cromatografia de permuta iônica é realizada. Um exemplo particularmente preferido é um método que compreende o uso de fluxo rápido de Q-Sepharose equilibrado com um tampão de Tris-HCI de 0,02 mol/L (pH 7,4), contendo 0,18 mol/L de NaCI. Após a lavagem, conforme necessário, a eluição pode ser realizada com um tampão de 0,02 mol/L Tris-HCI (pH 7,4) contendo 0,3 mol/L de NaCI, por exemplo, para obter a trombomodulina como um produto grosseiramente purificado.

[0085] Então, por exemplo, uma substância tendo afinidade específica para a trombomodulina pode ser imobilizada em uma resina para realizar a purificação por cromatografia de afinidade. Os exemplos preferidos incluem uma coluna DIP- trombina-agarose e uma coluna de anticorpo monoclonal anti-trombomodulina. No caso de uma coluna DIP- trombina-agarose, a coluna é equilibrada previamente com um tampão de Tris-HCI de 20 mmol/L (pH 7,4), contendo 100 mmol/L de NaCI, 0,5 mmol/L de cloreto de cálcio, e o referido produto grosseiramente purificado é então carregado na coluna, lavado como necessário, e então eluído com, por exemplo, um tampão Tris- HCI de 20 mmol/L (pH 7,4) contendo 1,0 mol/L de NaCI, 0,5 mmol/L de cloreto de cálcio para obter trombomodulina como um produto purificado. No caso de uma coluna de anticorpo monoclonal anti-trombomodulina, um exemplo do método compreende: o contato de uma solução de anticorpo monoclonal anti- trombomodulina em um tampão de 0,1 mol/L de NaHCO3 (pH 8,3) contendo 0,5 mol/L de NaCI, com Sepharose 4FF (GE Health Care Biosciences) previamente ativado com CNBr para obter a resina de Sepharose 4FF copulada com os anticorpos monoclonais anti-trombomodulina, equilibrando a resina cheia em uma coluna previamente, por exemplo, um tampão fosfato de 20 mmol/L (pH 7,3) contendo 0,3 mol/L de NaCI, lavando, como necessário, e depois realizando a eluição com um tampão de glicina- HCI a 100 mmol/L (pH 3,0) contendo 0,3 mol/L de NaCI. Um efluente pode ser neutralizado com um tampão apropriado para obter um produto na forma de um produto purificado.

[0086] Subsequentemente, o produto purificado é ajustado a pH 3,5, e depois carregado sobre um trocador catiônico, preferivelmente SP - Sepharose FF (GE Health Care Biosciences) como um trocador catiônico forte, equilibrado com 100 mmol/L de tampão de glicina-HCI (pH 3,5) contendo 0,3 mol/L de NaCI, e a lavagem é realizada com o mesmo tampão para obter uma fração não adsorvente. A fração resultante é neutralizada com um tampão apropriado para obter um produto altamente purificado. Estes produtos são, preferivelmente, concentrados por ultrafiltração.

[0087] Além disso, é também preferível trocar o tampão por filtração em gel. Por exemplo, um produto altamente purificado concentrado por ultrafiltração pode ser carregado em uma coluna Sephacryl S-300 ou coluna S-200 equilibrada com um tampão fosfato 20 mmol/L (pH 7,3) contendo 50 mmol/L de NaCI, e, então, revelada para fracionamento com um tampão fosfato 20 mmol/L (pH 7,3) contendo 50 mmol/L de NaCI. A atividade para promover a ativação da proteína C pela trombina pode ser confirmada para coletar uma fração ativa e, assim, obter um produto altamente purificado trocado em tampão. A fim de melhorar a segurança, um produto altamente purificado, obtido como descrito acima, é preferivelmente filtrado através de um filtro apropriado para a eliminação de vírus, como Planova 15N (Asahi Kasei Medical Co., Ltd.), e, então, o produto resultante pode ser concentrado por ultrafiltração até uma concentração desejada. Finalmente, o produto é preferivelmente filtrado através de um filtro de filtração asséptico.

[0088] De acordo com a presente invenção, provê-se um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou melhora da sépsis que compreende trombomodulina como um ingrediente ativo, em que o referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

[0089] Isto é, o medicamento para o tratamento terapêutico e/ou melhora da sépsis de acordo com esta forma de realização é um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou melhora da sépsis em um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

[0090] Provê-se, também, um medicamento para diminuir a mortalidade de um paciente humano com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

[0091] Tal como para o tratamento terapêutico e/ou melhora da sépsis, exemplos de efeitos preferidos destes incluem, por exemplo, “prevenção da morte de um paciente devido a sépsis". Exemplos incluem também “prevenção de agravamento das condições gerais do paciente por sépsis".

[0092] A sépsis referida na presente forma de realização é conhecida como uma doença infecciosa sistêmica grave em que os microrganismos de forma contínua ou intermitente invadem o sangue a partir de um foco de infecção, esta doença sendo induzida por uma doença, como doenças infecciosas, tumores malignos, cirrose hepática, insuficiência renal, diabetes, e distocia, ou um tratamento terapêutico para lesão ou doença, como uso de um cateter interno, dispositivo de infusão, diálise, e similares, e traqueostomia. Se os sintomas avançam, um choque sistêmico é induzido por choque séptico, ou seja, diminuição rápida da pressão arterial e insuficiência circulatória periférica, e letalidade é dada por disfunções de órgãos de órgãos vitais, como o pulmão, rim, fígado, coração, canal gastrointestinal, e sistema nervoso central. Como complicação que acompanha a sépsis, é induzida a síndrome da angústia respiratória do adulto (ARDS) caracterizada por edema do estroma pulmonar, hemorragia e insuficiência respiratória aguda devido à obstrução capilar pulmonar associada com DIC ou ativação de neutrófilos e migração e acúmulo dos mesmos no parênquima pulmonar, o que resulta em prognóstico muito ruim.

[0093] A sépsis referida nesta forma de realização é a síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS) induzida por infecção. Mais especificamente, ela inclui uma condição patológica que atenda, além da presença de infecção, dois ou mais dos itens de SIRS ((1) temperatura corporal > 38°C ou < 36°C, (2) taxa cardíaca > 90/minuto, (3) taxa de respiração > 20/minuto, ou PaCO2< 32 torr, e (4) contagem de leucócitos >12,000/μL ou < 4000/μL, ou bandemia> 10%), e sépsis pode ser basicamente diagnosticada com base em uma condição patológica.

[0094] Existem vários métodos para o diagnóstico da sépsis, e eles são resumidos em Levy M. et al., Crit. Care. Med., 31:1250-1256. Por exemplo, existe um método com base em diagnostico realizado por um medico, e um método de usar os valores de teste e similares. Exemplos do último incluem um método em que quando dois itens são atendidos dentre os quatro itens de (1) temperatura corporal > 38°C ou < 36°C, (2) taxa cardíaca > 90/minuto, (3) taxa de respiração > 20/minuto, ou necessidade de respiração artificial, e (4) contagem de leucócitos > 12.000/μL ou < 4000/μL, ou bandemia> 10%, o diagnóstico de SIRS é estabelecido, e SIRS para o qual um microorganismo é identificado ou suspeito de ser a causa de é diagnosticado como sépsis [LaRosa S., a homepage de The Cleveland Clinic]. Outro método similar ao método acima é descrito em Members of the American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: Crit. Care Med., 20, 864-874 (1992).

[0095] Os exemplos dos sintomas da sépsis incluem, por exemplo, bacteriemia, septicemia, síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS), sépsis (SIRS para que um microorganismo é identificado ou suspeito de ser a causa da mesma), sépsis grave, choque séptico, choque séptico intratável, e síndrome de disfunção de múltiplos órgãos (a seguir também referido como MODS) Harrison’s Principals of Internal Medicine, 15 a edição da obra original, Seção 124, pp.828 -833, Medical Science International, Ltd). As condições acima referidas são exemplificadas como sintomas em que o medicamento da presente invenção para o tratamento terapêutico e/ou melhora é eficaz.

[0096] Embora a sépsis não seja particularmente limitada desde que uma doença é diagnosticada como sépsis com base nos critérios de diagnósticos acima mencionados, ela é preferivelmente sépsis acompanhada por coagulação anormal (sépsis com coagulopatia). Embora a coagulopatia não seja particularmente limitada na medida em INR de uma amostra de plasma obtido a partir do paciente é superior a 1,2, ela é preferivelmente superior a 1,3, mais preferivelmente superior a 1,4.

[0097] Exemplos de bacteriemia incluem uma condição em que a presença de bactérias no sangue é verificada por um resultado positivo de cultura de sangue.

[0098] Exemplos da septicemia incluem uma condição de que a presença de microrganismos ou outras toxinas no sangue é confirmada.

[0099] Exemplos da síndrome de resposta inflamatória sistêmica (SIRS) incluem uma condição de um estágio preliminar de DIC, como descrito acima.

[00100] Exemplos de sépsis grave incluem sépsis acompanhada por um ou mais sintomas, incluindo disfunção de órgãos, como acidose metabólica, hipoperfusão do órgão, encefalopatia aguda, oligúria, hipoxemia ou coagulação intravascular disseminada, e hipotensão. Como sépsis, uma apresentando disfunção de órgãos, hipoperfusão de órgãos ou hipotensão é chamada de sépsis grave. A hipoperfusão de órgãos ou perfusão anormal inclui acidose láctica, oligúria, confusão mental, e similares. Entre a sépsis grave, uma condição apresentando de modo persistente hipotensão, apesar de carga suficiente de terapia com fluidos, é chamada de choque séptico.

[00101] Mais especificamente, a sépsis grave referida nesta forma de realização é a seguinte.

[00102] Exemplos do choque séptico incluem uma condição com hipotensão (pressão arterial de 90 mmHg ou menor ou mais baixa do que a pressão arterial normal por 40 mmHg ou mais), não respondendo à reanimação por reposição de fluidos, e acompanhado por falência de órgãos.

[00103] Exemplos do choque séptico intratável incluem uma condição com choque séptico continuando mais de 1 hora ou mais, e não respondendo a um hipertensor com terapia com fluidos.

[00104] Exemplos da síndrome da disfunção de órgãos múltipla (MODS) incluem uma condição de mau funcionamento de um ou mais órgãos, e requerendo uma intervenção médica para a manutenção da homeostase.

[00105] INR referido na presente forma de realização é um critério de exame que define coagulopatia de sangue. INR significa um tempo de protrombina (a seguir também abreviado como PT) normalizada, como para as diferenças entre bateladas 5 de fabricação de preparações de tromboplastina. INR é geralmente definido como a seguir: Valor INR = (tempo de coagulação (segundo) de amostra de teste/tempo de coagulação (segundo) de amostra de controle) (valorlsl)

[00106] Na equação, o tempo de coagulação (segundo) de amostra de teste 10 representa PT de amostra de plasma de teste de um indivíduo a ser examinado, e ISI representa índice de Sensibilidade Internacional.

[00107] Exemplos de sépsis grave referidos nesta forma de realização incluem sépsis acompanhada por um ou mais sintomas, incluindo disfunção de órgãos, como acidose metabólica, encefalopatia aguda, oligúria, hipoxemia ou 15 coagulação intravascular disseminada, e hipotensão, como descrito acima. O termo grave significa que a doença está em uma condição critica para a sustentação da vida. Exemplos de sépsis grave incluem, em particular, sépsis acompanhada por uma ou mais disfunções de órgãos. Embora a disfunção de órgãos não seja particularmente limitado na medida em que a disfunção de órgãos é induzida pela 20 sépsis, a disfunção de órgãos preferivelmente inclui o colapso de um órgão que é essencial para manter a vida. Exemplos de uma ou mais disfunções de órgãos incluem uma ou mais disfunções de órgãos selecionadas entre o grupo consistindo de disfunção de órgão circulatório, disfunção de órgão respiratório, disfunção do rim e disfunção do fígado, os exemplos preferidos incluindo uma ou mais disfunções de 25 órgãos selecionadas entre o grupo consistindo de disfunção de órgão respiratório, disfunção de órgão circulatório, e disfunção renal, e os exemplos mais preferidos incluem um ou mais disfunções de órgãos selecionadas entre o grupo consistindo de disfunção de órgão respiratório, e disfunção de órgão circulatório. Embora o número de disfunções de órgãos não seja particularmente limitado na medida em que o 30 número é um ou mais, o número pode ser preferivelmente de duas ou mais. Em particular, prefere-se que existam dois tipos de disfunções de órgãos de disfunção de órgão respiratório e disfunção de órgão circulatório.

[00108] A disfunção de órgão circulatório não é particularmente limitada desde que uma disfunção de órgão circulatório geralmente conhecida, e exemplos, incluem, por exemplo, a diminuição da pressão sanguínea e choque.

[00109] A disfunção de órgão respiratório não é particularmente limitada desde que, como geralmente conhecido, a disfunção de órgão respiratório e exemplos incluam, por exemplo, hipoxemia, lesão pulmonar aguda e dispnéia.

[00110] A disfunção do rim não é particularmente limitada desde que, como geralmente conhecido, a disfunção do rim e exemplos incluam, por exemplo, distúrbio da função renal, oligúria, e insuficiência renal.

[00111] A disfunção do fígado não é particularmente limitada desde que, como geralmente conhecido, a disfunção do fígado e os exemplos incluam, por exemplo, distúrbio da função hepática, icterícia, insuficiência hepática, e similares.

[00112] Estas disfunções de órgãos são geralmente conhecidas, como descrito em publicações publicadas antes da data de depósito do presente pedido, por exemplo, Funada H., "Elucidation and Treatment Strategy for Sepsis", lyaku Journal Co., Ltd., p.38- (2006)), "Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock 2008” (Crit. Care Med., 2008 Jan;36(1):296-327), e similares.

[00113] Supõe-se que a disfunção de órgãos possa ser induzida por um fator diferente de sépsis, como no caso da disfunção de órgãos induzidas por fármacos, e, portanto, é desejável que os pacientes com disfunção de órgãos limitados ao fígado ou rim, sejam excluídos dos pacientes com sépsis grave. Sabe-se também que a trombocitopenia pode ser desenvolvida como um resultado de disfunção dos órgãos. Apesar da contagem de plaquetas em pacientes a serem administrados com o medicamento de acordo com esta forma de realização não ser particularmente limitada na medida em que a contagem de plaquetas é inferior a 300.000/pL, a contagem é preferivelmente menor do que 200.000/pL, mais preferivelmente menor do que 150.000/μL.

[00114] Nesta forma de realização, o valor de INR em uma amostra de plasma de um paciente com sépsis não é particularmente limitado, desde que o valor não seja maior do que 1,4, e quando INR é maior do que 1,4, trombomodulina é mais eficaz para os pacientes com sépsis com uma ou mais disfunções de órgãos. O INR máximo pode ser, por exemplo, 2,0 ou menor, preferivelmente 1,9 ou menor, mais preferivelmente 1,8 ou menor, ainda mais preferivelmente 1,7 ou menor, o mais preferivelmente 1,6 ou menor. O valor também pode ser preferivelmente 1,5 ou menor. Também pode ser preferido que um paciente com um valor de INR de 1,7 seja excluído.

[00115] A expressão “INR maior do que 1,4” também pode ser indicada como "INR > 1,4".

[00116] Nesta forma de realização, DIC é uma doença ou síndrome em que grandes quantidades de substâncias acelerando a coagulação do sangue são geradas como resultado de dano ao tecido causado por várias doenças, de modo a que a função de um sistema de coagulação é excessivamente acelerada, e pequenos trombos são formados em vasos sanguíneos generalizados (formação de microtrombos) e eles entopem pequenos vasos, e, ao mesmo tempo, trombócitos ou fatores de coagulação necessários para o controle do sangramento são consumidos, causando assim anormalidade de coagulação. Especificamente, como resultado da formação de fibrina no vaso vascular, ocorre sangramento devido à coagulopatia de consumo ou a falha de órgãos, devido à formação de microtrombos. DIC é também referida como síndrome de coagulação intravascular disseminada ou síndrome de coagulação intravascular difusa.

[00117] DIC tem vários tipos de sintomas clínicos, dependendo do tipo de estado patogênico subjacente. Além da observação de sintomas de sangramento ou de órgãos, um método preferido para o diagnóstico de uma doença como DIC compreende manter a pontuação de DIC com base em vários valores de teste, como descrito abaixo e, então, diagnosticar a doença como DIC, quando a pontuação de DIC atingiu determinado nível. Exemplos de tais valores de teste incluem o número de plaquetas no sangue, a concentração dos produtos de degradação de fibrina/fibrinogênio (a seguir, abreviado como FDP, às vezes) decompostos por plasmina, uma concentração de dímero D, uma concentração de fibrinogênio, e um tempo de protrombina. Além disso, é também possível diagnosticar certa condição como pré-DIC com base em uma diminuição em plaquetas, um aumento no D- dímero ou concentração de FDP, e similar, sem manter o escore de DIC (Masao Nakagawa, “Search report regarding use of criteria of disseminated intravascular coagulation (DIC),"Research Study Team of Intractable Disease (Blood Coagulation Abnormality), Ministry of Health and Welfare, Relatório de Estudo 1999, 1999: 65-72; Katsumi Deguchi, “Tentative plan regarding standards for initiation of early treatment of DIC,” Research Study Team of Intractable Disease (Blood Coagulation Abnormality), Ministry of Health and Welfare, Relatório de Estudo 1999, 1999: 73-77; e Katsumi Nakagawa & Hajime Tsuji, “Current diagnosis of DIC - Reports on results of inquiry survey” Clinical Blood. 1999, 40: 362-364).

[00118] Nesta forma de realização, um paciente com sépsis com um valor INR superior a 1,2, preferivelmente superior a 1,3, mais preferivelmente maior do que 1,4, em uma amostra de plasma do paciente pode ser chamado de um paciente DIC em um sentido amplo, e o medicamento para tratamento terapêutico e/ou melhora da sépsis de acordo com esta forma de realização pode ser usado como um medicamento para tratamento terapêutico e/ou melhora de DIC.

[00119] O medicamento de acordo com esta forma de realização também pode ser usado para DIC. A sépsis é também considerada como SIRS induzida pela invasão clínica crítica de infecção, e está intimamente relacionada com DIC, cuja doença causadora é uma doença infecciosa. DIC é frequentemente desenvolvido simultaneamente com sépsis, e o medicamento desta forma de realização também pode ser usado para tal paciente com sépsis simultaneamente desenvolver DIC. Em outras palavras, o medicamento desta forma de realização pode ser usado para um doente que sofre de, ou suspeito de sofrer de qualquer um dentre DIC e sépsis, ou de ambos.

[00120] Nesta forma de realização, INR pode ser medido, por exemplo, como a seguir. Especificamente, tromboplastina de tecidos e Ca2+ são adicionados ao plasma (amostra de teste), obtido através da adição de citrato de sódio, o tempo (TP) necessário para a coagulação (precipitação de fibrina) é medido, e a avaliação é estabelecida com base na razão relativa do tempo em termos do segundo em relação ao de uma amostra de controle (razão de atividade). A razão de atividade pode ser obtida como “tempo de coagulação (segundo) de amostra de teste/tempo de coagulação (segundo) de amostra de controle", mas a relação pode variar entre os laboratórios em que o teste é implementado devido à diferença de sensibilidade da tromboplastina de tecido usada. O valor de INR foi projetado de forma a eliminar tal variação, e avaliando PT usando o valor de INR corrigido com um índice de sensibilidade internacional (a seguir, também abreviado como ISI), variação causada por diferença de laboratórios pode ser eliminada para obter um resultado padrão. ISI representa diferença em relação à amostra padrão internacional. ISI é determinada para cada reagente de tromboplastina de tecido, e é fixada ao reagente. Exemplos do reagente de tromboplastina incluem Thromborel S (marca registrada, Sysmex Corp ), Tromboplastina C + (marca registrada, Sysmex Corp ), e similares, mas não limitados a estes exemplos. Thromborel S (marca registrada) usa tromboplastina de placenta humana (valor ISI é de cerca de 1,0), e tromboplastina C+ (marca registrada) usa tromboplastina de cérebro de coelho (valor ISI é de cerca de 1,8).

[00121] ISI é fixado a cada um dos reagentes de tromboplastina de tecido, e o valor de INR é calculado de acordo com a Equação 1 acima referida.

[00122] Embora a amostra de controle não seja particularmente limitada na medida em que a amostra é um plasma humano normal reunido comercialmente disponível, pode ser usado plasma humano normal citratado (citrato de Na) reunido comercialmente disponível e similares, disponível a partir de, por exemplo, - Kojin Bio Co., Ltd. ou Internacional Bioscience Inc.

[00123] Como os tratamentos terapêuticos da sépsis, esses tratamentos básicos, como mencionadas abaixo, são geralmente realizadas fazendo referência a publicações conhecidas (Surviving Sepsis Campaign: International guidelines for management of severe sepsis and septic shock:. Crit Care Med 2008, 36:296-327; Crit. Care Med., 32 (3), 1250-1256 (2003)), e trombomodulina e outro medicamento pode ser usado em combinação. No entanto, o outro medicamento usado em combinação não está limitado aos mencionados abaixo.

[00124] Quando a hipotensão continua em um paciente em choque séptico, mesmo depois da pressão venosa central (CVP) aumentar para um valor desejado, dopamina pode ser administrada a fim de elevar a pressão arterial média de, pelo menos, 60 mmHg. Quando a dose de dopamina é superior a 20 μg/kg/minuto, outro vasopressor (geralmente norepinafrina) pode ser adicionalmente administrado.

[00125] Para o tratamento terapêutico contra as bactérias causadoras de sépsis, um antibiótico é geralmente usado. Para a seleção do antibiótico, é necessária uma estimativa bem fundamentada com base na causa suspeita, sinal clínico, conhecimento com relação aos microorganismos e conhecimento com relação ao padrão de sensibilidade comum para uma enfermaria de hospital específica para os pacientes internados, resultados de teste de cultura preliminar, e similares. Normalização intensiva do nível de açúcar no sangue em pacientes com sépsis melhora a evolução clínica dos pacientes em condições críticas.

[00126] Quando um antibiótico é usado, uma amostra, como sangue, fluido corporal ou parte de ferida, pode ser investigada, e um fármaco eficaz para a bactéria causadora pode ser escolhido. Por exemplo, no caso de choque séptico de causa desconhecida, gentamicina ou tobramicina e uma cefalosporina de terceira geração podem ser administradas em combinação. Além disso, quando houver suspeita de infecção por bactérias Staphylococcus ou Enterococcus resistentes, vancomicina é adicionalmente administrada.

[00127] Em geral, a dose é ajustada para manter o nível de açúcar no sangue em 80 a 110 mg/dL (4,4-6,1 mmol/L), por injeção intravenosa contínua de insulina.

[00128] Desde que a terapia com corticosteróide é eficaz para o tratamento terapêutico de sépsis, ele pode ser administrado em uma dose suplementar.

[00129] Para um paciente com alto risco de morte (pontuação APACHE II > 25, falência múltipla de órgãos devido a sépsis, ARDS devido a choque séptico ou sépsis), uma Proteína C ativada recombinante (rhAPC, drotrecogina a) pode ser administrada quando não há contra-indicações (hemorragia e similares).

[00130] Embora os pacientes alvo sejam limitados, transfusão de glóbulos vermelhos embalados pode ser realizada visando um Hb 7,0 a 9,0 g/dL.

[00131] No caso de eritropoiese prejudicada em um paciente com sépsis devido a insuficiência renal, a eritropoietina (EPO) pode ser administrada.

[00132] No caso de sépsis grave, heparina pode ser administrada com uma dose baixa de heparina não fracionada ou heparina de baixo peso molecular pode ser administrada para a prevenção de DVT.

[00133] O medicamento da presente invenção pode conter um veículo. Como o veículo utilizável na presente invenção, um veículo solúvel em água é preferido, e um agente de tonicidade, agente tamponante, melhorador da viscosidade, tensoativo, conservante, anti-séptico, agente calmante, modificador de pH, como similares, aceitáveis como aditivos farmacêuticos, são geralmente preferidos. Por exemplo, o medicamento da presente invenção pode ser preparado pela adição de sacarose, glicerina, modificador de pH consistindo de um sal inorgânico, como similar, como aditivos. Além disso, se necessário, aminoácidos, sais, carboidratos, tensoativos, albumina, gelatina ou similares, podem ser adicionados como descrito nas Publicações Não Examinadas de Patente Japonesa N°s 64-6219 e 6-321805. Método para a adição destes aditivos não é particularmente limitado. No entanto, no caso da preparação de um produto liofilizado, exemplos incluem, por exemplo, um método de mistura de uma solução contendo pelo menos um agente terapêutico selecionado dentre um imunossupressor e um agente terapêutico para malignidade hematológica, e uma solução contendo trombomodulina, então, adicionando aditivos à mistura, e misturando a mistura resultante, e um método de mistura de aditivos com pelo menos um agente terapêutico selecionado a partir de um imunossupressor e um agente terapêutico para a malignidade hematológica dissolvido em água, água para injeção ou um tampão apropriado previamente, adição de uma solução contendo trombomodulina para a mistura, misturando a mistura resultante para preparar uma solução, e liofilizando a solução, em modos comumente empregados. Quando o medicamento da presente invenção é um medicamento compreendendo uma combinação dos componentes do medicamento, cada componente é preferivelmente preparado por adição de um veículo de acordo com um método de preparação apropriado. O medicamento da presente invenção pode ser provido na forma de uma injeção, ou na forma de uma preparação liofilizada a ser dissolvida no momento do uso.

[00134] Como para a preparação do medicamento da presente invenção, uma solução aquosa para injeção pode ser preparada por carga de uma solução contendo 0,1 a 10 mg de trombomodulina, água para injeção, e aditivos em uma ampola ou frasco pequeno, em um volume de, por exemplo, 0,5 a 10 ml. Exemplos do método de preparação incluem também um método de congelamento de tal solução, e secagem da solução congelada sob pressão reduzida para preparar uma preparação liofilizada.

[00135] O medicamento da presente invenção é desejavelmente administrado por administração parenteral, como administração intravenosa, administração intramuscular e administração subcutânea. O medicamento também pode ser administrado por administração oral, administração intra-retal, administração intranasal, administração sublingual, ou similar. Quando o medicamento da presente invenção é um medicamento compreendendo uma combinação de ingredientes ativos múltiplos, cada ingrediente ativo do medicamento é administrado preferivelmente por um método de administração apropriado para o ingrediente.

[00136] Exemplos de método para administração intravenosa incluem um método de administração de uma dose desejada do medicamento em uma única vez (bolo intravenoso), e administração intravenosa por infusão gota a gota.

[00137] O método de administração de uma dose desejada do medicamento em uma vez (administração de bolo intravenoso) é preferido do ponto de vista de que o método requer somente um tempo curto para administração. Especialmente, é preferido no caso de pacientes com sépsis que precisam de um tratamento urgente. Quando o medicamento é administrado de uma vez, um período requerido para a administração usando uma seringa injetável pode variar de modo geral. Em geral, o período de tempo requerido para a administração é, por exemplo, 5 minutos ou mais curto, preferivelmente 3 minutos ou mais curto, mais preferivelmente 2 minutos ou mais curto, ainda mais preferivelmente 1 minuto ou mais curto, particularmente preferivelmente 30 segundos ou mais curto, apesar de depender de um volume a ser administrado. Apesar do tempo de administração mínimo não ser particularmente limitado, o período é preferivelmente 1 segundo ou mais longo, mais preferivelmente 5 segundos ou mais longo, ainda mais preferivelmente 10 segundos ou mais longo. A dose não é particularmente limitada desde que a dose esteja dentro da dose preferida acima mencionada. A administração intravenosa por infusão gota a gota é também preferida do ponto de vista de que o nível no sangue de trombomodulina pode ser facilmente mantido constante.

[00138] Uma dose diária do medicamento da presente invenção pode variar dependendo da idade, peso corporal dos pacientes, gravidade da doença, via de administração e similar. Em geral, a dose máxima é preferivelmente 20 mg/kg ou menos, mais preferivelmente 10 mg/kg ou menos, ainda mais preferivelmente 5 mg/kg ou menos, particularmente preferivelmente 2 mg/kg ou menos, e o mais preferivelmente 1 mg/kg ou menos, e a dose mínima é preferivelmente 0,001 mg/kg ou mais, mais preferivelmente 0,005 mg/kg ou mais, ainda mais preferivelmente 0,01 mg/kg ou mais, particularmente preferivelmente 0,02 mg/kg ou mais, e o mais preferivelmente 0,05 mg/kg ou mais, em termos da quantidade de trombomodulina.

[00139] No caso de administração de bolo intravenoso, apesar da dose não ser particularmente limitada desde que a dose esteja dentro da dose preferida acima mencionada, a dose diária máxima é preferivelmente 1 mg/kg ou menos, mais preferivelmente 0,5 mg/kg ou menos, ainda mais preferivelmente 0,1 mg/kg ou menos, particularmente preferivelmente 0,08 mg/kg ou menos, e o mais preferivelmente 0,06 mg/kg ou menos, e a dose mínima é preferivelmente 0,005 mg/kg ou mais, mais preferivelmente 0,01 mg/kg ou mais, ainda mais preferivelmente 0,02 mg/kg ou mais, e particularmente preferivelmente 0,04 mg/kg ou mais.

[00140] Quando o medicamento da presente invenção é administrado a um paciente tendo um peso corporal excedendo 100 kg, ele pode ser preferivelmente administrado em uma dose fixa de 6 mg, porque o volume de sangue não é proporcional ao peso corporal, e o volume de sangue é relativamente reduzido com relação ao peso corporal em tal paciente.

[00141] No caso de uma infusão intravenosa contínua, apesar da dose não ser particularmente limitada desde que a dose esteja dentro da dose preferida acima mencionada, a dose diária máxima é preferivelmente 1 mg/kg ou menos, mais preferivelmente 0,5 mg/kg ou menos, ainda mais preferivelmente 0,1 mg/kg ou menos, particularmente preferivelmente 0,08 mg/kg ou menos, e o mais preferivelmente 0,06 mg/kg ou menos, e a dose mínima é preferivelmente 0,005 mg/kg ou mais, mais preferivelmente 0,01 mg/kg ou mais, ainda mais preferivelmente 0,02 mg/kg ou mais, e particularmente preferivelmente 0,04 mg/kg ou mais.

[00142] Quando o medicamento da presente invenção é administrado a um paciente tendo um peso corporal excedendo 100 kg, ele pode ser preferivelmente administrado em uma dose fixa de 6 mg, porque o volume de sangue não é proporcional ao peso corporal, e o volume de sangue é relativamente reduzido com relação ao peso corporal de tal paciente.

[00143] O medicamento é administrado uma vez ou várias vezes por dia, como necessário. Como para o intervalo de administração, o medicamento pode ser administrado uma vez em 2 a 14 dias, preferivelmente uma vez em 2 a 7 dias, mais preferivelmente uma vez em 3 a 5 dias.

[EXPLICAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS]

[00144] SEQ ID NO: 1: Sequência de aminoácidos codificados pelo gene usado na produção de TME456

[00145] SEQ ID NO: 2: Sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1

[00146] SEQ ID NO: 3: Sequência de aminoácidos codificados pelo gene usado na produção de TME456M

[00147] SEQ ID NO: 4: Sequência de nucleotideos codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3

[00148] SEQ ID NO: 5: Sequência de aminoácidos codificados pelo gene usado na produção de TMD12

[00149] SEQ ID NO: 6: Sequência de nucleotideos codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5

[00150] SEQ ID NO: 7: Sequência de aminoácidos codificados pelo gene usado na produção de TMD12M

[00151] SEQ ID NO: 8: Sequência de nucleotideos codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7

[00152] SEQ ID NO: 9: Sequência de aminoácidos codificados pelo gene usado na produção de TMD123

[00153] SEQ ID NO: 10: Sequência de nucleotideos codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9

[00154] SEQ ID NO: 11: Sequência de aminoácidos codificados pelo gene usado na produção de TMD123M

[00155] SEQ ID NO: 12: Sequência de nucleotideos codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11

[00156] SEQ ID NO: 13: DNA sintético para mutação usada para realizar a mutagenese sítio-dirigida.

EXEMPLOS

[00157] A presente invenção será explicada em detalhes com referência aos exemplos e exemplos de teste. No entanto, a presente invenção não está limitada a esses exemplos.

[00158] A trombomodulina da presente invenção usada nos exemplos de teste foi preparada de acordo com o método de Yamamoto et ai acima mencionada, (o método descrito na publicação não examinada de patente japonesa No. 64-6219). Exemplos de preparação são descritos abaixo. Segurança das trombomodulinas obtidas nestes exemplos de preparação foi confirmada por testes de administração intravenosa únicos e repetitivos usando ratos e macacos, teste de reprodução de camundongos, teste de irritação local, teste de segurança farmacológica, teste de inativação virai e similares.

[Exemplo de Preparação 1] <Obtenção de trombomodulina>

[00159] Um produto altamente purificado foi obtido pelo método acima mencionado. Especificamente, as células de ovário de hamster chinês (CHO), foram transfectadas com um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (que especificamente consistia da sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 10). A partir da cultura das células transformantes acima, um produto altamente purificado foi obtido por coleta de uma fração ativa com um tampão fosfato de 20 mmol/L (pH 7,3) contendo 50 mmol/L de NaCI de acordo com o método de purificação convencional acima mencionado. O produto foi ainda concentrado usando uma membrana de ultrafiltração para obter uma solução de trombomodulina com uma concentração de 11,0 mg/pL (a seguir também abreviado como TMD123 no relatório). <Preparação de solução de Polissorbato>

[00160] Polissorbato 80 foi pesado (0,39 g) em um béquer de vidro, adicionado com água para injeção (30 mL), e dissolvido. <Preparação e carga de solução de fármaco

[00161] A solução TMD123 obtida acima (2239 mL, correspondendo a 24,63 g de proteína trombomodulina solúvel, adicionada em uma quantidade em excesso de 5%) foi colocada em um recipiente de aço inoxidável de 5 L. A solução de polissolvato obtida acima foi ainda adicionada, e cloreto de sódio (27,9 g) foi adicionado. Água para injeção (600 mL) foi adicionada, e a mistura agitada. A mistura foi ajustada a pH 6,0 pela adição de uma solução de ácido clorídrico de 1 mol/L. A água para injeção foi ainda adicionada à mistura até uma quantidade total de 3940 g, e a mistura foi uniformemente misturada e agitada. Esta solução de fármaco foi submetido à esterilização por filtração usando um filtro com um diâmetro de poro de 0,22 μm (MCGL10S, fabricado por Millipore). O filtrado foi colocado em ampolas em uma quantidade de 1,1 g cada de modo a obter uma preparação de TMD123.

[Exemplo de Preparação 2]

[00162] Células de ovário de hamster chinês (CHO) são transfectadas com um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (consistindo 5 especificamente da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12), é obtida uma solução de trombomodulina purificada a partir de uma cultura das células transformantes acima (a seguir também abreviado como TMD123M no relatório) pelo método de purificação convencional acima mencionado, e uma preparação de TMD123M é obtida do mesmo modo como descrito acima. 10 [Exemplo de Preparação 3]

[00163] Células de ovário de hamster chinês (CHO) são transfectadas com um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (consistindo especificamente da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2), é obtida trombomodulina purificada a partir de uma cultura das células transformantes acima 15 (a seguir também abreviado como TME456 no relatório) pelo método convencional de purificação acima mencionado, e uma preparação de TME456 é obtida do mesmo modo como descrito acima. [Exemplo de Preparação 4]

[00164] Células de ovário de hamster chinês (CHO) são transfectadas com 20 um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (consistindo especificamente da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4), é obtida trombomodulina purificada a partir de uma cultura das células transformantes acima (a seguir também abreviado como TME456M no relatório), pelo método de purificação convencional acima mencionado, e uma preparação de TME456M é 25 obtida do mesmo modo como descrito acima. [Exemplo de Preparação 5]

[00165] Células de ovário de hamster chinês (CHO) são transfectadas com um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (consistindo especificamente da sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6), é obtida 30 trombomodulina purificada a partir de uma cultura das células transformantes acima (a seguir também abreviado como TMD12 no relatório), pelo método de purificação convencional acima mencionado, e uma preparação de TMD12 é obtida do mesmo modo como descrito acima.

[Exemplo de Preparação 6]

[00166] Células de ovário de hamster chinês (CHO) são transfectadas com um DNA codificando a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (consistindo especificamente da sequência de nucleotideos de SEQ ID NO: 8), é obtida trombomodulina purificada a partir de uma cultura das células transformantes acima (a seguir também abreviado como TMD12M no relatório), pelo método de purificação convencional acima mencionado, e uma preparação de TMD12M é obtida do mesmo modo como descrito acima.

[Exemplo de Preparação 7] Preparação da formulação de placebo <Preparação de solução de polissorbato>

[00167] Polissorbato 80 foi pesado (0,4 g) em um béquer de vidro, adicionando com água para injeção (30 ml), e dissolvido. <Preparação e enchimento de solução de fármaco

[00168] Água para injeção (2000 ml) foi colocada em um recipiente de aço inoxidável de 5 L. A solução de polissolvato obtido acima foi ainda adicionada. Água para injeção foi ainda adicionada à mistura até um total de 4000 g, e a mistura foi uniformemente misturada e agitada. Esta solução de fármaco foi submetida à esterilização por filtração usando um filtro com um diâmetro de poro de 0,22 μm (MCGL10S, fabricado por Millipore). O filtrado foi colocado em ampolas em uma quantidade de 1,1 g cada para obter uma preparação de placebo.

[Exemplo 1] <Método Para Experimented

[00169] Usando TMD -123 preparado de acordo com Exemplo de Preparação 1 como trombomodulina, um estudo controlado por placebo duplo-cego randomizado foi conduzido em pacientes com sépsis e DIC. Número de pacientes alvo-marcados é de 750 no total, e entre estes, 741 pacientes foram administradas com o fármaco experimental (TMD -123 para 370 pacientes e placebo para 371 pacientes). TMD-123 foi administrado uma vez por dia a 0,06 mg/kg durante 6 dias sucessivos através da administração de bolo intravenoso. Como placebo, foi usada a preparação fabricada de acordo com o Exemplo de Preparação 7.

[00170] Para os pacientes acima do peso corporal de 100 kg, uma dose fixa de 6 mg foi administrada de forma uniforme, uma vez por dia, durante seis dias consecutivos por administração de bolo intravenoso, a fim de suprimir os efeitos colaterais devido à superdosagem.

[00171] Um valor de INR no plasma de um paciente antes da administração do fármaco de teste foi medido pelo método acima descrito, como Equação 1.

[00172] Pacientes sépticos graves com disfunção de órgãos limitado ao fígado ou ao rim foram excluídos da análise. Em pacientes com disfunção de órgãos limitado ao fígado e rim, a disfunção de órgãos pode ter possivelmente ocorrido com base em causas não limitados à sépsis, como a disfunção de órgãos induzida por fármacos.

[00173] Efeitos após 28 dias do início da administração foram observados e uma taxa de mortalidade (Mortalidade) de cada grupo de pacientes foi calculada.

[00174] Além disso, a diferença na taxa de mortalidade entre o grupo TMD - 123 e grupo placebo foi calculada como "Diferença".

<Resultados do estudo>

[00175] No grupo de pacientes sem disfunção de órgãos, os pacientes com o valor INR de INR > 1,5 no plasma antes da administração do fármaco de teste apresentaram uma diferença máxima (diferença: 6,1%) entre a taxa de mortalidade do grupo administrado com TMD- 123 e a do grupo administrado com placebo, e o grupo de pacientes com INR > 1,6 deu a segunda maior diferença na taxa de mortalidade (4,5%). No grupo de pacientes com INR > 1,4, não foi absolutamente ou relativamente observada uma elevada diferença significante na taxa de mortalidade, isto é, diferença na taxa de mortalidade foi de cerca de 1,7% (Tabela 1).

[00176] A partir da Tabela 1, reconhece-se que o resultado máximo pode ser encontrado entre 1,5 e 1,6 dos limites inferiores de INR, e quando os limites inferiores de INR estão fora da faixa de 1,5 a 1,6, a diferença na taxa de mortalidade foi significativamente diminuída.

[00177] Enquanto, no grupo de pacientes sépticos graves com uma ou mais disfunções de órgãos selecionadas dentre disfunção de órgão circulatório, disfunção de órgão respiratório, disfunção do rim e disfunção do fígado, o grupo de pacientes com INR > 1,4, e não o grupo com INR > 1,5, apresentou a diferença máxima na taxa de mortalidade (9,7%), o que é uma diferença absolutamente e relativamente elevada na taxa de mortalidade, em comparação com outros limites inferiores de (Tabela 2). O grupo de pacientes sépticos graves com uma ou mais disfunções de órgãos selecionadas dentre disfunção de órgão circulatório, disfunção de órgão respiratório, disfunção do rim, e disfunção do fígado apresentou uma diferença mais significativa na taxa de mortalidade entre os grupos TMD-123 e o grupo de placebo, em geral, em comparação com o grupo de pacientes sem disfunção de órgãos (o primeiro: 5,4 %, o último: 1,1%).

[00178] Além disso, no grupo de pacientes sépticos graves com uma ou mais disfunções de órgãos selecionadas dentre disfunção de órgão circulatório, disfunção de órgão respiratório, disfunção do rim e disfunção do fígado, o paciente com 1,4 < INR <1,6 apresentou uma diferença absolutamente notável na taxa de mortalidade, como sendo de 16,0% (tabela 3). Como se entende a partir da Tabela 3, qualquer um dos outros limites superiores de INR apresentou valores da diferença na taxa de mortalidade em uma faixa de 10 a 12%, o que indica uma diferença notavelmente elevada relativamente reconhecível na taxa de mortalidade do grupo acima mencionado.

[00179] Por outro lado, nenhuma tendência de aumento de pico relativamente notável em um determinado grupo foi observada no grupo de pacientes sem a disfunção de órgãos. A diferença na taxa de mortalidade obtida foi encontrada como sendo, no extremo, de 7,1% (em grupo de pacientes com 1,4 < INR < 1,7) (Tabela 4).

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

[00180] O medicamento da presente invenção contendo a trombomodulina é utilizável como um medicamento permitindo o tratamento terapêutico eficaz e/ou melhora da sépsis em um paciente com sépsis grave, em que um valor de INR de uma amostra de plasma, obtida a partir do referido paciente, é maior do que 1,4.

Claims (12)

1. Medicamento para uso no tratamento terapêutico e/ou melhora da sépsis, caracterizado pelo fato de compreender trombomodulina como um ingrediente ativo, em que referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

2. Medicamento para uso na diminuição da mortalidade de um paciente com sépsis, caracterizado pelo fato de compreender trombomodulina como um ingrediente ativo, em que referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4.

3. Medicamento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos, em que um valor de Razão Normalizada Internacional (INR) de uma amostra de plasma obtida a partir do referido paciente é maior do que 1,4 e igual a ou menor do que 1,6.

4. Medicamento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos selecionadas dentre o grupo consistindo de disfunção do fígado, disfunção do rim, disfunção de órgão respiratório, e disfunção de órgão circulatório.

5. Medicamento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que referido medicamento é para administração a um paciente com sépsis grave acompanhada com uma ou mais disfunções de órgãos selecionadas dentre o grupo consistindo de disfunção de órgão respiratório e disfunção de órgão circulatório.

6. Medicamento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a trombomodulina é uma trombomodulina solúvel.

7. Medicamento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a trombomodulina é um peptídeo obtenível de uma célula transformada preparada por transfecção de uma célula hospedeira com um DNA que codifica a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11.

8. Medicamento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a trombomodulina solúvel é um peptídeo contendo a sequência de aminoácidos de (i-1); (i-1) a sequência de aminoácidos das posições 19 a 516 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 ou 11.

9. Medicamento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que sépsis é sépsis grave com coagulopatia.

10. Medicamento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que referida disfunção de órgão circulatório é choque.

11. Medicamento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que ditas disfunções de órgãos são induzidas por sépsis.

12. Medicamento para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que referida trombomodulina é administrada ao referido paciente intravenosamente.