JPH06205692A - 新規な抗ヒトトロンボモジュリンモノクロ−ナル抗体およびその抗体を用いたヒトトロンボモジュリンの高感度測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規な抗ヒトトロンボモジュリンモノクロ−
ナル抗体の取得およびその抗体を用いた免疫学的測定法
によるヒトトロンボモジュリンあるいはその断片ペプチ
ドの高感度測定方法の確立 【構成】 トロンボモジュリンを抗原として免疫したマ
ウスの脾臓細胞とマウスミエロ−マ細胞を融合し、抗ト
ロンボモジュリン抗体産生ハイブリド−マを得る。トロ
ンボモジュリンの活性発現最小領域であるＥ４５６を認
識する抗体、およびトロンボモジュリンのトロンビン結
合作用あるいはプロテインＣ活性化作用を阻害する抗体
または阻害しない抗体を選別し、これらの抗体の組合わ
せによる酵素免疫測定法のうち最も感度の優れた組合わ
せを選ぶ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒトトロンボモジュリン
（以下ＴＭと略する）に対するモノクロ−ナル抗体およ
びそのモノクロ−ナル抗体を用いた酵素免疫測定法によ
るヒトトロンボモジュリンあるいはその断片ペプチド抗
原の定量法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＴＭは分子量約７８，０００ダルトン、
５５７アミノ酸からなる血管内皮上に存在する一本鎖糖
蛋白質であり、そのアミノ末端は細胞外に位置し、細胞
膜を貫通し細胞内にそのカルボキシル末端を有する。そ
の構成はアミノ末端側からレクチン様構造を持つドメイ
ン１、６個の繰り返しのエピダ−マル グロウス ファ
クタ−（ＥＧＦ）様構造を持つドメイン２、糖鎖付加領
域であるドメイン３、細胞膜内貫通領域であるドメイン
４、細胞内領域であるドメイン５の５つのドメインから
なる。このうちトロンビンと結合しそのプロテインＣ活
性化を促進する作用を有するのは、ドメイン２のＥＧＦ
様構造のうちアミノ末端側から数えて４、５、６番目の
部分（以後Ｅ４５６と略する。）である（Ｍ．Ｚｕｓｈ
ｉら、ジャ−ナル オブ バイオロジカル ケミストリ
−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６４、１６３３５
１、（１９８９））。ＴＭはトロンビンと結合し、トロ
ンビンのフィブリン形成作用および血小板凝集作用等を
阻害すると共に、そのプロテインＣ活性化作用を数千倍
に促進する。つまりＴＭはトロンビンのもつ凝固作用を
抗凝固作用に変換する能力を有し、血管内皮の抗凝固シ
ステムに重要な役割を果たしていると考えられている
（Ｃ．Ｔ．Ｅｓｍｏｎ、ジャ−ナル オブ バイオロジ
カル ケミストリ−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２
６４、４７４３（１９８９））。

【０００３】近年、ＴＭが血液および尿中に存在し、こ
の量がある種の病態と関わっていることが明かとされて
いる（石井ら、臨床病理、３７、２６６（１９８９）、
Ｓ．Ｔａｋａｎｏら、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、７６、
２０２４（１９９０）、鈴木宏治ら、特開平３−１９８
７９３）。これは血管内皮が破壊される過程で血管内皮
上のＴＭがプロテア−ゼ等により分解されたものと考え
られる。また、ＴＭは前述のような強力な抗凝固作用を
有することから、血栓症、汎発性凝固症候群等の凝固亢
進による疾患に対する治療剤として有望であり、可溶型
のＴＭとしてドメイン１，２，３からなるもの（以後Ｔ
Ｍ１２３と略する）、あるいはＥ４５６等が遺伝子工学
を利用し合成され、その薬効は動物実験等において確認
されており（Ｋ．Ｇｏｍｉら、ブラッド（Ｂｌｏｏ
ｄ）、７５、１３９６（１９９０）、Ｋ．Ｎａｗａら、
トロンボシス アンド ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ．
Ｈａｅｍｏｓｔ．）、６７、３６６、（１９９２））、
近い将来それらの疾患に対する治療剤として適用される
ものと思われる。これらのことから、ＴＭあるいはその
断片ペプチドの簡便な測定法の開発が強く望まれてい
る。これまで血中のＴＭを定量するためのいくつかの酵
素免疫測定方法（鈴木宏治ら、特開平３−１９８７９
３、Ｈ．Ｉｓｈｉｉら、トロンボシス アンド ヘモス
タシス（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．）、６３、１
５７、（１９９０）、Ｓ．Ｔａｋａｎｏら、ブラッド
（Ｂｌｏｏｄ）、７６、２０２４（１９９０）等）が報
告されている。しかし正常人の血中ＴＭ量は使用した抗
体、測定方法によりバラツキがあり、鈴木らの報告によ
れば２．９６±０．７１ｎｇ／ｍｌ、Ｉｓｈｉｉらの報
告によれば３５．２±８．３２ｎｇ／ｍｌ、またＴａｋ
ａｎｏらの報告によれば１１．８±５．２ｎｇ／ｍｌお
よび７．５±５．３ｎｇ／ｍｌである。また、これらの
酵素免疫測定方法の感度は０．５〜２ｎｇ／ｍｌと低
い。このバラツキは用いているトロンボモジュリン抗原
がいずれもヒト胎盤由来であることから、抗体の認識部
位に違いが生じるために起きる問題である。ＴＭの定量
を行うための条件として、ＴＭの活性発現最小領域を認
識すること、および正常人の血中ＴＭ量を正確に測定で
きるだけの十分な感度が得られることの２つが必要であ
り、前記の測定法は十分なものとは言えない。なお、Ｔ
Ｍの活性発現最小領域とは、前述のＥ４５６領域を意味
する。また前記の測定法はいずれもＴＭの抗原量を測定
するものであるが、血中の活性を持つＴＭを測定するた
めにはＴＭ活性量をも精度良く測定できる系が望まれ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＴＭ
の活性発現最小領域を認識する抗ＴＭモノクロ−ナル抗
体、およびそれを用いたＴＭおよびその断片ペプチド量
を測定する高感度な測定法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＴＭの活性発
現最小領域を認識するがそのプロテインＣ活性化作用を
阻害しない抗ＴＭモノクロ−ナル抗体と、ＴＭの活性発
現最小領域を認識しＴＭとトロンビンの結合を阻害する
ことによりプロテインＣ活性化作用を阻害する抗ＴＭモ
ノクロ−ナル抗体の組合せからなる酵素免疫測定法が高
感度なＴＭあるいはその断片ペプチド抗原の定量を可能
にすることを明らかにし、本発明を完成した。また、Ｔ
Ｍの活性発現最小領域を認識するがそのプロテインＣ活
性化作用を阻害しない抗ＴＭモノクロ−ナル抗体を固相
化抗体とし、これにより捕捉されたＴＭに対し、トロン
ビン、プロテインＣ、アンチトロンビンＩＩＩとヘパリ
ンの混合物、発色基質を順次加えることにより、ＴＭの
活性量をも測定できることを示した。

【０００６】以下本発明を詳細に説明する。抗ＴＭモノ
クロ−ナル抗体の取得法は、一般的なモノクロ−ナル抗
体産生法により取得できる。まずＴＭを抗原として免疫
したマウスの脾臓細胞とマウスミエロ−マ細胞を融合
し、抗ＴＭ抗体産生ハイブリド−マを得る。この中から
ＴＭの活性発現最小領域であるＥ４５６を認識する抗体
であり、かつＴＭのプロテインＣ活性化作用を阻害する
抗体および阻害しない抗体を産生するハイブリド−マを
選別して取得する。なお、プロテインＣ活性化作用を阻
害する抗体には、トロンビン結合を阻害することにより
プロテインＣ活性化作用を阻害する抗体とトロンビン結
合は阻害しないがプロテインＣ活性化作用を阻害する抗
体の２種類があり、これらを区別して取得する必要があ
る。酵素免疫測定法としては、第一抗体固相法、二抗体
法、エミット法、エンザイムチャンネリングイミュノア
ッセイ法、酵素活性修飾物質標識イミュノアッセイ法お
よびリポソ−ム膜−酵素イミュノアッセイ法、サンドウ
ィチ法、イミュノエンザイムメトリックアッセイ法およ
びプロキシマ−ルリンケ−ジイミュノアッセイ法などが
使用できる。これらの測定法においては、固相化担体と
して抗原や抗体などの蛋白質の吸着能に優れるポリスチ
レン製、ポリカ−ボネ−ト製、ポリプロピレン製あるい
はポリビニ−ル製の、ボ−ル、マイクロプレ−ト、ステ
ィック、チュ−ブ等、例えばヌンク社製またはダイナテ
ック社製９６穴イミュノプレ−ト、ヌンク社製スタ−チ
ュ−ブ等が使用可能である。また実施例においてはベ−
タガラクトシダ−ゼおよび西洋ワサビパ−オキシダ−ゼ
を標識酵素として用いているが、その他のパ−オキシダ
−ゼ、アルカリフォスファタ−ゼ等も使用可能であり、
酵素活性の測定方法として比色法、蛍光法、生物発光
法、化学発光法等が利用できる。また抗体の標識化法と
しては、アビジン−ビオチン法、ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−
マレイミドカプロイルオキシ）コハク酸イミド）または
ＳＡＮＰＡＨ（Ｎ−（ε−（４’−アジド−２’−ニト
ロフェニルアミノ）カプロイルオキシ）コハク酸イミ
ド）等のクロスリンク剤を用いた方法等が可能である。
抗体自身としては硫安分画後、プロテインＡセファロ−
スカラムにより精製した抗体あるいはそれをペプシン消
化によりＦａｂ’としたものが利用できる。また免疫学
的発色基質測定法においては、抗体の固相化支持体とし
ては蛋白吸着能に優れるポリスチレン製、ポリカ−ボネ
−ト製、ポリプロピレン製あるいはポリビニ−ル製の、
ボ−ル、マイクロプレ−ト、スティック、チュ−ブ等、
例えばヌンク社製またはダイナテック社製９６穴イミュ
ノプレ−ト、ヌンク社製スタ−チュ−ブ等が使用可能で
ある。また実施例ではトロンビン阻害剤としてアンチト
ロンビンＩＩＩとヘパリンの混合物を用いているが、ト
ロンビンを阻害し活性化プロテインＣを阻害しないもの
ならば基本的にすべて使用可能であり、例えばアルガト
ロパン、メシル酸ナファモスタット、メシル酸ガベキセ
−ト等が挙げられる。発色基質としては、活性化プロテ
インＣにより切断され発色するものならばその種類を問
わない。実施例においては、ＫＡＢＩ社製Ｓ−２３６６
を用いているがＫＡＢＩ社製Ｓ−２２３８等も使用可能
である。また、遊離基をＳ−２３６６のパラニトロアニ
リンではなく蛍光物質等を用いることも可能である。本
発明においてはヒト、サル、ラット等の哺乳類の体液、
排泄物、組織中におけるヒトＴＭの抗原量の測定が可能
である。

【０００７】

【実施例】次に実施例によって本発明をさらに詳細に説
明する。

【０００８】

【実施例１】 抗ＴＭモノクロ−ナル抗体の作成、精製および標識 （１）ＴＭ抗原によるマウスの免疫 五味らの方法（Ｋ．Ｇｏｍｉら、ブラッド（Ｂｌｏｏ
ｄ）、７５、１３９６（１９９０））に従い、ＴＭ抗原
となる可溶型トロンボモジュリン（ＴＭ１２３）を作成
した。つまりＴＭのｃＤＮＡのうちドメイン１、２、３
に相当する配列を作成し、発現ベクタ−に挿入しチャイ
ニ−ズハムスタ−卵巣（ＣＨＯ）細胞において生産さ
せ、常法に従い精製した。このようにして得られたＴＭ
１２３を以下の２つの方法でマウスに免疫した。

【０００９】（ａ）フロインド完全アジュバント法 Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（５週齢）４匹に０．２ｍｌのフ
ロインド完全アジュバント（ＢＡＣＴＯ）中に懸濁した
３００μｇのＴＭ１２３を腹腔内投与しマウスに初回免
疫した。二週間後、０．２ｍｌのフロインド完全アジュ
バント中に懸濁した２４０μｇの上記のＴＭ１２３を腹
腔内投与し二回目の追加免疫を行い、さらに二週間後、
二回目の免疫と同様に三回目の追加免疫を行った。

【００１０】（ｂ）ＲＩＢＩアジュバント法 Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（５週齢）４匹に０．２ｍｌのＲ
ＩＢＩのアジュバント（ＲＩＢＩ）中に溶解した６００
μｇのＴＭ１２３を腹腔内投与しマウスに初回免疫し
た。さらに二週間後および四週間後、初回免疫と同様に
二回目、三回目の追加免疫を行った。以上のように免疫
を行ったマウスの抗体価の測定を以下のようにして行っ
た。つまり三回目の免疫から３日後のマウス尾動静脈よ
り採血し、これを血清とした後、あらかじめＴＭ１２３
でコ−テイングし、ウシ血清アルブミン（以後ＢＳＡと
略す）を含むリン酸緩衝生理食塩水（以後ＰＢＳと略
す）でブロックした９６穴イミュノプレ−トに上記の血
清を５００、２５００、１２５００、６２５００倍に１
％のＢＳＡを含むＰＢＳにて希釈したものを加え室温で
２時間放置した。その後９６穴イミュノプレ−トを０．
０１％Ｔｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳ（以後洗浄液と略
す）で洗浄し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳにて１０００
０倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（以後ＰＯ
Ｄと略する）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅ
ｌ）を加え２時間室温で放置した。その後洗浄液で洗浄
し、ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素水を含む
クエン酸−リン酸緩衝液を加え、室温で５分間放置後、
４．５Ｍ硫酸を加え発色を停止した。それぞれの免疫法
のうちで抗体価の最も高かったマウスに対し三回目の免
疫から３週間後、０．２ｍｌの生理食塩水で溶解した６
００μｇのＴＭ１２３を腹腔内投与し最終免疫を行っ
た。 （２）細胞融合 このようにして２つの方法により免疫されたマウスを用
いて、細胞融合によるハイブリド−マの作成を行った。
つまり、上記のマウスから脾臓を摘出し、脾臓細胞を調
整した。あらかじめ１０％のウシ胎児血清（以後ＦＣＳ
と略す）（ＧＩＢＣＯ）を含むＭｅｄｉａ−１培地（免
疫生物研究所）にて３７℃炭酸ガス培養装置中で培養し
たマウスミエロ−マ細胞（Ｐ３Ｕ１）と脾臓細胞が１対
４になるように混合し遠心分離後、上清を除去しペレッ
ト状になった細胞をほぐし、ポリエチレングリコ−ル４
０００（ＰＥＧ４０００、Ｍｅｒｃｋ）１ｍｌを緩やか
に攪拌しながら１分間かけて滴下した。滴下終了後、さ
らに１分間緩やかに攪拌した後、Ｍｅｄｉａ−培地１０
ｍｌを緩やかに攪拌しながら５分間かけて滴下した。遠
心分離後上清を除去し、細胞を１０％ＦＣＳ、ハイポキ
サンチン、チミジンを含むＭｅｄｉａ−１培地（以後Ｈ
Ｔ培地と略す）に懸濁し９６穴培養プレ−トに分注後、
３７℃炭酸ガス培養装置中にて培養した。翌日、アミノ
プテリンを含むＨＴ培地（以後ＨＡＴ培地と略す）を１
ウェルあたり１００μｌずつ加え培養を継続した。さら
に５日後に各ウェルの上清１００μｌを取り取り、１０
０μｌのＨＡＴ培地を加えて、培養を継続した。 （３）抗ヒトトロンボモジュリンモノクロ−ナル抗体産
生ハイブリド−マの選択 上記の培養５日後に抜き取った培養上清を以下のＴＭ抗
原特異抗体選別試験に供した。つまり、あらかじめＴＭ
１２３でコ−テイングし、ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッ
クした９６穴イミュノプレ−トに上記の培養上清を加え
室温で２時間放置した。その後９６穴イミュノプレ−ト
を洗浄液で洗浄し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳにて１０
０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダ−ゼ（以後
ＰＯＤと略する）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を加え２
時間室温で放置した。その後洗浄液で洗浄し、ｏ−フェ
ニレンジアミンおよび過酸化水素水を含むクエン酸−リ
ン酸緩衝液を加え、室温で５分間放置後、４．５Ｍ硫酸
を加え発色を停止した。この時陽性であったウェルに対
し以下のキャピラリ−クロ−ニングを実施した。つまり
陽性ウェルに存在するコロニ−の一部分を顕微鏡下にて
ガラスキャピラリ−にて吸い取り、これをあらかじめ３
７℃炭酸ガス培養装置中で加温した９６穴培養プレ−ト
に移した。このように陽性ウェルに存在するすべてのコ
ロニ−の移植を行った後、これをさらに３７℃炭酸ガス
培養装置中で培養した。培養７〜１０日後、培養液が黄
変したウェルに対し、前述のＴＭ抗原特異抗体選別試験
を実施した。この時陽性であったもののうち、成長の遅
かったものは除き、２４穴培養プレ−トに移植しさらに
培養を続け、安定に増殖しかつ抗体を産生するクロ−ン
を選択した。これらのクロ−ンを完全にモノクロ−ン化
するために限界希釈法によるリクロ−ニングを行った。
つまり、前述のクロ−ンを９６穴培養プレ−トに１０ウ
ェルあたり１個の細胞が入るように加え培養し、コロニ
−の生成が認められたウェルに対して、前述のＴＭ抗原
特異抗体選別試験を実施し、陽性であったものをさらに
２４穴培養プレ−トに移植しさらに培養を続け安定に増
殖しかつ抗体を産生するハイブリド−マを選択し、微工
研菌寄第１３３４５号および第１３３４６号を始め多数
の株を得た。このようにして作成したハイブリド−マは
完全なモノクロ−ンであると考えられる。 （４）抗ヒトトロンボモジュリンモノクロ−ナル抗体の
アイソタイピング 上記のハイブリド−マの産生するモノクロ−ナル抗体の
アイソタイピングを行った。つまりアイソタイピングキ
ット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、ハイブリド−マ培
養上清を調べ、ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２
ｂを除きＩｇＧ１のみ選択した。この時点で、免疫方法
がフロインド完全アジュバント法であるモノクロ−ナル
抗体１５種類、ＲＩＢＩアジュバント法であるモノクロ
−ナル抗体２４種類、計３９種類（表１）の抗ヒトトロ
ンボモジュリンモノクロ−ナル抗体（ＩｇＧ１）を得
た。 （５）ハイブリド−マのマウス腹水化による抗ヒトトロ
ンボモジュリンモノクロ−ナル抗体大量生産 上記のモノクロ−ナル抗体の大量生産の検討を行った。
つまり、得られたハイブリド−マをＨＴ培地にて増殖さ
せ、これをあらかじめプリスタン（２，６，１１，１４
−テトラメチルペンタデカン、和光純薬）で処理したＢ
ａｌｂ／ｃ雌マウス（５週齢）に１匹あたり０．８〜
１．５Ｘ１０⁷ 個の細胞を腹腔内投与し、前記の３９種
類の抗ヒトトロンボモジュリンモノクロ−ナル抗体産生
ハイブリド−マのうち３３種類（表１）のハイブリド−
マにおいて腹水化が成功した。 （６）活性発現最小領域を認識する抗ヒトトロンボモジ
ュリンモノクロ−ナル抗体の選択 林らの方法（Ｔ．Ｈａｙａｓｈｉら、ジャ−ナル オブ
バイオロジカル ケミストリ−（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．）、２６５、２０１５６（１９９０））に従い、
活性部位フラグメント（Ｅ４５６）を作成した。つまり
ＴＭのｃＤＮＡのうちＥ４５６に相当する配列を作成
し、発現ベクタ−に挿入しＣＯＳ−１細胞において生産
させ、常法に従い精製した。このようにして得られたＥ
４５６で９６穴イミュノプレ−トをコ−テイングし、Ｂ
ＳＡを含むＰＢＳでブロックした後、前記（３）で得た
培養上清を加え室温で１時間放置した。その後９６穴イ
ミュノプレ−トを洗浄液で洗浄し、１％のＢＳＡを含む
ＰＢＳにて１００００倍に希釈した西洋ワサビペルオキ
シダ−ゼ（以後ＰＯＤと略する）標識ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を加え１時間室温で放置した。その後洗浄液で洗
浄し、ｏ−フェニレンジアミンおよび過酸化水素水を含
むクエン酸−リン酸緩衝液を加え、室温で５分間放置
後、４．５Ｍ硫酸を加え発色を停止した。３９種類のう
ち２３種類（表１）の抗ヒトトロンボモジュリンモノク
ロ−ナル抗体が陽性であり、これらはＴＭの活性発現最
小領域を認識した。 （７）トロンビン結合阻害抗ヒトトロンボモジュリンモ
ノクロ−ナル抗体の選択 あらかじめＴＭ１２３でコ−テイングし、ＢＳＡを含む
ＰＢＳでブロックした９６穴イミュノプレ−トに前記
（３）で得た培養上清を加え室温で２時間放置した。そ
の後９６穴イミュノプレ−トを洗浄液で洗浄し、１μｇ
／ｍｌのトロンビン５０μｌを加え室温で３０分放置し
た。その後洗浄液で洗浄し、０．２８ｍｇ／ｍｌの発色
基質Ｓ−２２３８（ＫＡＢＩ）１００μｌを加え室温で
一時間放置後、酢酸を加え発色を停止した。３９種類の
うち１３種類（表１）の抗ヒトトロンボモジュリンモノ
クロ−ナル抗体がＴＭのトロンビン結合を阻害した。 （８）プロテインＣ活性化作用阻害抗ヒトトロンボモジ
ュリンモノクロ−ナル抗体の選択 ４００ｎｇ／ｍｌのＴＭ１２３と前記（３）で得た培養
上清を同量混合し、一夜放置した。この溶液７．５μｌ
と６Ｕ／ｍｌのトロンビン３７．５μｌを混合し、３７
℃にて１５分間加温した後、２７０ｎｇ／ｍｌのウシプ
ロテインＣ７．５μｌを加えさらに３７℃にて１５分間
加温した。この溶液にアンチトロンビンＩＩＩおよびヘ
パリンの混合液を加え３７℃にて１５分間加温し、トロ
ンビンを阻害した後、蛍光合成基質を加え、さらに２０
分間３７℃にて加温後、酢酸を加え発色を停止した。３
９種類のうち２３種類（表１）の抗ヒトトロンボモジュ
リンモノクロ−ナル抗体が陰性であり、これらはＴＭに
よるプロテインＣ活性化作用を阻害した。 （９）抗ヒトトロンボモジュリンモノクロ−ナル抗体の
精製および標識化 得られた腹水を硫安分画し、グロブリン画分とした後、
プロテインＡアフィニティクロマトグラム（ＭＡＰＳ−
ＩＩキット、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて精製した。この
ようにして精製したＩｇＧを以下の３つの方法により標
識化した。

【００１１】（ａ）ビオチン標識化 抗ヒトトロンボモジュリンモノクロ−ナル抗体溶液を
０．１Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液に対して透析した後、
ＮＨＳ−ビオチンを加え室温にて６時間攪拌し、その後
ＰＢＳに対して透析を行いビオチン化抗体を得た。 （ｂ）ＰＯＤ標識化 抗ヒトトロンボモジュリンモノクロ−ナル抗体を酢酸ナ
トリウム緩衝液中にて抗体蛋白の対して２０％（ｗ／
ｗ）のペプシンを加え、室温にて４８時間消化した。そ
の消化物をＳ−３００ゲル（ファルマシア）を用いたゲ
ル濾過を行うことによりＦ（ａｂ’）２画分を得た。こ
の画分にエチレンジアミン４酢酸および２−メルカプト
エチルアミンを加え３７℃で９０分間還元し、この還元
物を脱塩を兼ねてＧ−２５ゲル（ファルマシア）を用い
たゲル濾過により精製し、Ｆａｂ’画分を得た。この画
分を濃縮後、あらかじめＮ−マレイミド化されたＰＯＤ
と氷冷下混合し一夜攪拌後、この反応液をＧ−２５ゲル
（ファルマシア）を用いたゲル濾過を行うことによりＰ
ＯＤ標識Ｆａｂ’を得た。

【００１２】（ｃ）ｂ−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ標識化 前述のようにして得られたＦａｂ’画分とあらかじめＮ
−マレイミド化されたｂ−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ（以後
とＧＡＬと略す）を氷冷下混合し４０時間４℃にて静置
後、この反応液をＳ−３００ゲル（ファルマシア）を用
いたゲル濾過を行うことによりｂ−Ｄ−ガラクトシダ−
ゼ標識Ｆａｂ’を得た。

【００１３】

【実施例２】 抗ヒトトロンボモジュリンモノクロ−ナル抗体を用いた
酵素免疫測定法 （１）固相化抗体とビオチン標識抗体の組み合わせによ
る酵素免疫測定法 実施例１−（５）記載の腹水化可能な抗ヒトトロンボモ
ジュリンモノクロ−ナル抗体のうちＥ４５６を認識し、
かつその性格（トロンビン結合阻害、プロテインＣ活性
化阻害）のはっきり現われている（＋＋以上又は−）抗
体を用いて最も良い組み合わせの検討を行った。まず調
整の簡便さからビオチン化抗体を用いた組み合わせの検
討を行った。ここで用いられた抗体は以下の８株であ
る。

【００１４】Ｅ４５６を認識しＴＭのトロンビンとの結
合を阻害する株（以後Ａグル−プと略す） Ｆ１Ａ１１、Ｆ１Ｇ１１、Ｆ２Ａ８、Ｆ２Ｈ８、Ｒ４Ｄ
１（微工研菌寄第１３３４６号） Ｅ４５６を認識しＴＭのトロンビンとの結合を阻害しな
い株（以後Ｂグル−プと略す。） Ｒ７Ｂ３、Ｒ７Ｄ７、Ｒ４Ｂ６（微工研菌寄第１３３４
５号）、Ｒ４Ｃ１１そこで上記のビオチン化抗体を用い
て、アビジン−ビオチン法によるサンドイッチ型酵素免
疫法により組み合わせの検討を行った。つまり、Ａグル
−プの抗体によりコ−ティングしＢＳＡを含むＰＢＳで
ブロックした９６穴イミュノプレ−ト中に０、１０、１
００、１０００ｎｇ／ｍｌのＴＭ１２３を加え室温で２
時間放置した。その後９６穴イミュノプレ−トを洗浄液
で洗浄し、ビオチン化したＢグル−プの抗体を加え室温
で２時間放置した後、アビジン化ＰＯＤを加え１時間室
温で放置した。その後洗浄液で洗浄し、ｏ−フェニレン
ジアミンおよび過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸緩
衝液を加え、室温で１０分間放置後、４．５Ｍ硫酸を加
え発色を停止した。Ｂグル−プの抗体を固相化抗体と
し、Ａグル−プの抗体をビオチン化抗体とした系につい
ても同様に実施した。その結果、以下の組み合わせが感
度において特に優れていることが判明した。

【００１５】 固相化抗体 ビオチン化抗体 Ｆ１Ａ１１ Ｒ４Ｂ６ Ｆ１Ｇ１１ Ｒ７Ｂ３ Ｒ７Ｂ３ Ｒ４Ｄ１ Ｒ７Ｄ７ Ｒ４Ｄ１ Ｒ４Ｂ６ Ｒ４Ｄ１ （２）固相化抗体とビオチン化標識抗体の組み合わせに
よる酵素免疫測定法に対するラット血漿の影響 次にビオチン化抗体を用いて組み合わせた酵素免疫法に
対する血漿の影響について検討した。つまりＦ１Ａ１
１、Ｆ１Ｇ１１、Ｒ７Ｂ３、Ｒ７Ｄ７、Ｒ４Ｂ６により
コ−ティングしＢＳＡを含むＰＢＳでブロックした９６
穴イミュノプレ−ト中に１０％のラット血漿を含むＰＢ
Ｓに溶解した０、１０、１００、１０００ｎｇ／ｍｌの
ＴＭ１２３を加え室温で２時間放置した。その後９６穴
イミュノプレ−トを洗浄液で洗浄し、ビオチン化したＲ
４Ｂ６、Ｒ７Ｂ３、Ｒ４Ｄ１を加え室温で２時間放置し
た後、アビジン化ＰＯＤを加え１時間室温で放置した。
その後洗浄液で洗浄し、ｏ−フェニレンジアミンおよび
過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液を加え、室
温で１０分間放置後、４．５Ｍ硫酸を加え発色を停止し
た。その結果、いずれの組み合わせにおいても血漿によ
る吸光度の低下が認められたが、Ｆ１Ｇ１１−Ｒ７Ｂ
３、Ｒ４Ｂ６−Ｒ４Ｄ１（固相化抗体−ビオチン化抗
体）の組み合わせが比較的血漿の影響の少ないことが判
明した。 （３）固相化抗体とＰＯＤ標識抗体の組み合わせ酵素免
疫測定法 次に前記の組み合わせのビオチン標識抗体をＰＯＤ標識
抗体に変えて、さらに酵素免疫法の条件の検討をおこな
った。その結果、以下の条件にて行うことにより高感度
で血漿の影響の少ない酵素免疫法が完成した。つまり、
Ｆ１Ｇ１１あるいはＲ４Ｂ６を炭酸ナトリウム緩衝液に
て１００μｇ／ｍｌに希釈し９６穴イミュノプレ−ト中
に１ウェルあたり５０μｌずつ分注し室温にて２時間放
置した。ＰＢＳにて５回洗浄後、蒸留水にて４倍に希釈
した吸着防止剤ブロックエ−ス（雪印乳業）を１ウェル
あたり２００μｌずつ分注し室温にて１時間放置した。
０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳにて５回洗浄
した後、ただちに０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０および
０．４Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（以後希釈
液１と略す）を１ウェルあたり５０μｌ加え、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ−８０および適度の塩化ナトリウム（塩化
ナトリウム濃度は試料中に含まれる血漿濃度、血漿の由
来により異なる；表３）を含むリン酸緩衝液にて希釈し
た試料および標準試料（０〜１０ｎｇ／ｍｌ）を１ウェ
ルあたり１００μｌ加えた後、希釈液により希釈したＰ
ＯＤ標識Ｒ７Ｂ３あるいはＲ４Ｄ１を１ウェルあたり５
０μｌ加えた。Ｆ１Ｇ１１−ＰＯＤ標識Ｒ７Ｂ３の組み
合わせの場合は室温で一晩、Ｒ４Ｂ６−ＰＯＤ標識Ｒ４
Ｄ１の組み合わせの場合には２時間放置後、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳにて５回洗浄し、０．５
ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジアミンおよび０．０１５
％過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液を加え室
温で放置後、標準試料の吸光度が１．０〜１．５となっ
たところで４．５Ｍ硫酸を加え発色を停止した。その結
果は表２に示すように両系とも１ｎｇ／ｍｌの検出感度
の達成が可能であるが、Ｆ１Ｇ１１−Ｒ７Ｂ３系におい
ては、この検出感度の達成のために一晩の静置が必要で
ある。またＲ４Ｂ６−ＰＯＤ標識Ｒ４Ｄ１の組み合わせ
酵素免疫測定法によるヒト、サル、ラットの血漿および
サル、ラット尿に対する測定条件は表３に示した通りで
ある。また、例としてヒト血漿中におけるＲ４Ｂ６−Ｐ
ＯＤ標識Ｒ４Ｄ１の組み合わせ酵素免疫測定法によるＴ
Ｍの検量線を図１に示した。 （４）Ｒ４Ｂ６とＧＡＬ標識Ｒ４Ｄ１の組み合わせ酵素
免疫測定法 ＰＯＤ標識抗体による酵素免疫測定法は、血液干渉およ
び感度が高くないため正常人の血中に存在しているＴＭ
を検知できなかった。そこでより高い感度を達成するた
めにＰＯＤをＧＡＬに変えて酵素免疫測定を実施したと
ころ非常に高い検出感度を得ることができた。つまり、
Ｒ４Ｂ６を炭酸ナトリウム緩衝液にて５μｇ／ｍｌに希
釈し９６穴蛍光用イミュノプレ−ト中に１ウェルあたり
１００μｌずつ分注し室温にて一夜放置した。ＰＢＳに
て５回洗浄後、蒸留水にて４倍に希釈した吸着防止剤ブ
ロックエ−スを１ウェルあたり２００μｌずつ分注し室
温にて１時間放置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０を
含むＰＢＳにて５回洗浄した後、希釈後の試料中の塩化
ナトリウム濃度が１．２Ｍになるように調製した、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含むリン酸緩衝液にて希釈し
た試料（ヒト血漿）および標準試料（０〜１ｎｇ／ｍ
ｌ）を１ウェルあたり１００μｌ加え、一夜室温にて静
置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳにて
５回洗浄した後、希釈液により希釈したＧＡＬ標識Ｒ４
Ｄ１を１ウェルあたり５０μｌ加え４時間放置後、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳにて５回洗浄し、
０．１ｍｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−ｂ−
Ｄ−ガラクトシドを含むＰＢＳを１００μｌずつ加え室
温にて４時間放置後ただちに蛍光強度を測定した。その
結果、Ｒ４Ｂ６とＧＡＬ標識Ｒ４Ｄ１の組み合わせによ
り１０ｐｇ／ｍｌのＴＭ１２３の検出が可能となった。
また、１０％以下のの血漿濃度であれば、試料の希釈後
の塩濃度を１．２Ｍとすることによりほとんどヒト血漿
の影響を受けずに測定することができ、その測定可能範
囲は１０〜５００ｐｇ／ｍｌであった（図２）。

【００１６】

【実施例３】 Ｒ４Ｂ６とＧＡＬ標識Ｒ４Ｄ１の組み合わせ酵素免疫測
定法によるヒト血中ＴＭの定量 ５人の正常人からクエン酸加採血し遠心分離することに
より得た血漿中のＴＭ量を実施例２−（４）記載の方法
に従い測定した。その結果、５人の血中ＴＭ量は最低
１．３ｎｇ／ｍｌ、最高２．９ｎｇ／ｍｌ、平均２．３
ｎｇ／ｍｌ（ＴＭ１２３換算量）であり、鈴木らの報告
とほぼ同じ結果が得られた。

【００１７】

【実施例４】 Ｒ４Ｂ６抗体を固相化抗体とする免疫学的発色基質測定
法によるサル血中ＴＭ活性量の測定。 Ｒ４Ｂ６抗体を炭酸ナトリウム緩衝液にて１００μｇ／
ｍｌに希釈し９６穴イミュノプレ−ト中に１ウェルあた
り１００μｌずつ分注し室温にて２時間放置した。ＰＢ
Ｓにて５回洗浄後、蒸留水にて４倍に希釈した吸着防止
剤ブロックエ−ス（雪印乳業）を１ウェルあたり２５０
μｌずつ分注し室温にて１時間放置した。０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ−８０を含むＰＢＳ（以後洗浄液と略す）にて
５回洗浄した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−８０および
０．９Ｍの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液にて血漿
濃度が５０％以下になるように希釈した試料（サル血
漿）および標準試料（０〜１６０ｎｇ／ｍｌ）を１ウェ
ルあたり１５０μｌ加え室温にて２時間放置した。洗浄
液にて５回洗浄した後、１．１２５Ｕ／ｍｌのトロンビ
ン、３０μｇ／ｍｌのプロテインＣを含むトリス塩酸緩
衝液１００μｌを加え室温にて６０分間放置した後、ア
ンチトロンビンＩＩＩおよびヘパリンを含むトリス塩酸
緩衝液１０μｌを加え室温にて１５分間放置することに
よりトロンビンを中和し、４００μｇ／ｍｌ合成発色基
質Ｓ−２３６６および２００ｍＭの塩化セシウムを含む
トリス塩酸緩衝液１００μｌを加え室温にて３０分放置
した後、ただちに分光光度計にて４０５ｎｍの吸光度を
測定した。その結果は図３に示すように２０ｎｇ／ｍｌ
の検出感度の達成が可能であり、２０％血漿濃度までは
血漿による干渉なしに測定することができた。

【００１８】

【表１】

【００１９】

【表２】

【００２０】

【表３】

【００２１】

【発明の効果】本発明により極めて高感度なＴＭの抗原
量の測定が可能となり、ヒト血中のＴＭ量を正確に測定
できるようになった。また、ＴＭの活性発現最小領域を
認識するとともにその活性を抑制しないモノクロ−ナル
抗体を用いるために、活性を有するＴＭをも定量可能と
なった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト血漿中におけるＲ４Ｂ６−ＰＯＤ標識Ｒ４
Ｄ１の組み合わせ酵素免疫測定法によるＴＭの検量線

【図２】Ｒ４Ｂ６とＧＡＬ標識Ｒ４Ｄ１の組み合わせ酵
素免疫測定法によるＴＭの検量線

【図３】Ｒ４Ｂ６を固相化抗体とする免疫的発色基質測
定法によるサル血中ＴＭの検量線

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトトロンボモジュリン、あるいはその
   断片ペプチドが有するトロンボモジュリンの活性発現最
   小領域を認識する抗ヒトトロンボモジュリンモノクロ−
   ナル抗体。
2. 【請求項２】 ヒトトロンボモジュリンのプロテインＣ
   活性化作用を阻害する請求項１のモノクロ−ナル抗体。
3. 【請求項３】 ヒトトロンボモジュリンのプロテインＣ
   活性化作用を阻害しない請求項１のモノクロ−ナル抗
   体。
4. 【請求項４】 請求項３のモノクロ−ナル抗体と、ヒト
   トロンボモジュリンとトロンビンの結合を阻害すること
   によりプロテインＣ活性化作用を阻害する請求項２のモ
   ノクロ−ナル抗体の組み合わせからなる酵素免疫測定法
   によるヒトトロンボモジュリンあるいはその断片ペプチ
   ド抗原の定量法。
5. 【請求項５】 酵素免疫測定法の感度が１０ｐｇ／ｍｌ
   以下である請求項４の定量法。