JP2673619B2 - 抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体、それを用いたヒトセルロプラスミンの検出方法及びそれを産生するハイブリドーマ - Google Patents
抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体、それを用いたヒトセルロプラスミンの検出方法及びそれを産生するハイブリドーマInfo
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- JP2673619B2 JP2673619B2 JP3260539A JP26053991A JP2673619B2 JP 2673619 B2 JP2673619 B2 JP 2673619B2 JP 3260539 A JP3260539 A JP 3260539A JP 26053991 A JP26053991 A JP 26053991A JP 2673619 B2 JP2673619 B2 JP 2673619B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗ヒトセルロプラスミ
ンモノクローナル抗体、それを用いたヒトセルロプラス
ミンの検出方法及びそれを産生するハイブリドーマに関
する。
ンモノクローナル抗体、それを用いたヒトセルロプラス
ミンの検出方法及びそれを産生するハイブリドーマに関
する。
【０００２】
【従来の技術】セルロプラスミンはα2 マクログロブリ
ン分画に存在する血漿タンパク質の１種であり、銅を含
有する糖タンパク質であって健常人の血清中には２０〜
５０ｍｇ／ｄｌの濃度で存在し、２価の鉄を酸化して３
価の鉄にする作用があり、鉄代謝において重要な役割を
果たしている。血清中のセルロプラスミン量は、肝疾
患、ウイルソン病、感染症、妊娠等により変動するの
で、その測定はこれらの診断に際して有用な指標をもた
らす。
ン分画に存在する血漿タンパク質の１種であり、銅を含
有する糖タンパク質であって健常人の血清中には２０〜
５０ｍｇ／ｄｌの濃度で存在し、２価の鉄を酸化して３
価の鉄にする作用があり、鉄代謝において重要な役割を
果たしている。血清中のセルロプラスミン量は、肝疾
患、ウイルソン病、感染症、妊娠等により変動するの
で、その測定はこれらの診断に際して有用な指標をもた
らす。
【０００３】ヒトセルロプラスミンに対するモノクロー
ナル抗体はＴ．Ｂ．Ｍｅｇｒａｂｉａｎらにより報告さ
れている（文献：Biokhimiya, vol.55, No.2, 361-367
(1990)が、セルロプラスミンのペルオキシダーゼ活性を
中和することができるモノクローナル抗体は報告されて
いない。Ｍｅｇｒａｂｉａｎらは、モノクローナル抗体
を用いてヒトセルロプラスミンの定量を行なっている。
しかし、このモノクローナル抗体は、セルロプラスミン
の活性中和能を有しておらず、従って、セルロプラスミ
ンの活性部位以外の部分をエピトープとしている。一
方、セルロプラスミンは血清中の酵素により切断される
ので生体中で不安定であり、活性を失っているものも少
なくない。従って、活性部位以外の部分をエピトープと
するＭｅｇｒａｂｉａｎらのモノクローナル抗体を用い
て生体中のセルロプラスミンを定量すると、活性型セル
ロプラスミンのみならず不活性なセルロプラスミンをも
検出してしまうことになり、活性型セルロプラスミンの
みを検出することができなかった。
ナル抗体はＴ．Ｂ．Ｍｅｇｒａｂｉａｎらにより報告さ
れている（文献：Biokhimiya, vol.55, No.2, 361-367
(1990)が、セルロプラスミンのペルオキシダーゼ活性を
中和することができるモノクローナル抗体は報告されて
いない。Ｍｅｇｒａｂｉａｎらは、モノクローナル抗体
を用いてヒトセルロプラスミンの定量を行なっている。
しかし、このモノクローナル抗体は、セルロプラスミン
の活性中和能を有しておらず、従って、セルロプラスミ
ンの活性部位以外の部分をエピトープとしている。一
方、セルロプラスミンは血清中の酵素により切断される
ので生体中で不安定であり、活性を失っているものも少
なくない。従って、活性部位以外の部分をエピトープと
するＭｅｇｒａｂｉａｎらのモノクローナル抗体を用い
て生体中のセルロプラスミンを定量すると、活性型セル
ロプラスミンのみならず不活性なセルロプラスミンをも
検出してしまうことになり、活性型セルロプラスミンの
みを検出することができなかった。
【０００４】また、ヒトセルロプラスミンを基質の分解
活性により測定する方法（Ｓｃｈｏｓｉｎｓｋｙら、Ｃ
ｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０１ １９７４）もあるが、セル
ロプラスミンにのみ特異的な基質がなく、従って、セル
ロプラスミンのみを定量することができないという問題
がある。
活性により測定する方法（Ｓｃｈｏｓｉｎｓｋｙら、Ｃ
ｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０１ １９７４）もあるが、セル
ロプラスミンにのみ特異的な基質がなく、従って、セル
ロプラスミンのみを定量することができないという問題
がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、ペルオキシダーゼ活性を有する活性型ヒトセルロプ
ラスミンと特異的に反応する抗ヒトセルロプラスミンモ
ノクローナル抗体を提供し、それを用いて活性型ヒトセ
ルロプラスミンを検出する方法を提供することである。
は、ペルオキシダーゼ活性を有する活性型ヒトセルロプ
ラスミンと特異的に反応する抗ヒトセルロプラスミンモ
ノクローナル抗体を提供し、それを用いて活性型ヒトセ
ルロプラスミンを検出する方法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本願発明者は、鋭意研究
の結果、ヒトセルロプラスミンのペルオキシダーゼ活性
を中和する能力を有する抗ヒトセルロプラスミンモノク
ローナル抗体を得ることに成功し、また、これを用いて
活性型ヒトセルロプラスミンを特異的に検出する方法を
提供することに成功し、本発明を完成した。
の結果、ヒトセルロプラスミンのペルオキシダーゼ活性
を中和する能力を有する抗ヒトセルロプラスミンモノク
ローナル抗体を得ることに成功し、また、これを用いて
活性型ヒトセルロプラスミンを特異的に検出する方法を
提供することに成功し、本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は、ペルオキシダーゼ活
性を有する活性型ヒトセルロプラスミンと特異的に反応
し、ヒトセルロプラスミンのペルオキシダーゼ活性の中
和能を有する抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗
体を提供する。なお、「ペルオキシダーゼ活性を有する
活性型ヒトセルロプラスミンと特異的に反応」すると
は、ペルオキシダーゼ活性を有する活性型ヒトセルロプ
ラスミンと反応するが、ペルオキシダーゼ活性を有さな
い不活型ヒトセルロプラスミンとは反応しないことを意
味する。
性を有する活性型ヒトセルロプラスミンと特異的に反応
し、ヒトセルロプラスミンのペルオキシダーゼ活性の中
和能を有する抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗
体を提供する。なお、「ペルオキシダーゼ活性を有する
活性型ヒトセルロプラスミンと特異的に反応」すると
は、ペルオキシダーゼ活性を有する活性型ヒトセルロプ
ラスミンと反応するが、ペルオキシダーゼ活性を有さな
い不活型ヒトセルロプラスミンとは反応しないことを意
味する。
【０００８】また、本発明は、試料中のペルオキシダー
ゼ活性型ヒトセルロプラスミンを、上記本発明のモノク
ローナル抗体との特異的反応を利用してサンドイッチエ
ライザにより検出することから成る、活性型ヒトセルロ
プラスミンの検出方法を提供する。
ゼ活性型ヒトセルロプラスミンを、上記本発明のモノク
ローナル抗体との特異的反応を利用してサンドイッチエ
ライザにより検出することから成る、活性型ヒトセルロ
プラスミンの検出方法を提供する。
【０００９】さらに、また、本発明は、上記本発明のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（ただし、
ヒトをヒトセルロプラスミンで免疫した後該ヒトから回
収した抗体産生細胞由来のものを除く）を提供する。
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（ただし、
ヒトをヒトセルロプラスミンで免疫した後該ヒトから回
収した抗体産生細胞由来のものを除く）を提供する。
【００１０】上述のように、本発明のモノクローナル抗
体は、ヒトセルロプラスミンに対して特異的に結合する
のみならず、ヒトセルロプラスミンのペルオキシダーゼ
活性を中和する能力を有する。中和能の測定は、後述の
実施例において具体的に記載するように、モノクローナ
ル抗体とヒトセルロプラスミンを反応させて抗原抗体複
合物を形成させ、次いで、該抗原抗体複合物のペルオキ
シダーゼ活性を測定することにより行なうことができ
る。
体は、ヒトセルロプラスミンに対して特異的に結合する
のみならず、ヒトセルロプラスミンのペルオキシダーゼ
活性を中和する能力を有する。中和能の測定は、後述の
実施例において具体的に記載するように、モノクローナ
ル抗体とヒトセルロプラスミンを反応させて抗原抗体複
合物を形成させ、次いで、該抗原抗体複合物のペルオキ
シダーゼ活性を測定することにより行なうことができ
る。
【００１１】本発明のモノクローナル抗体は以下のよう
にして得ることができる。
にして得ることができる。
【００１２】まず、ヒトセルロプラスミンを哺乳動物に
免疫する。精製されたヒトセルロプラスミンは市販され
ており、このような市販品を免疫原として用いることが
できる。哺乳動物としては特に限定されず、霊長類（ヒ
トを除く）、マウス、ラット及びウサギ等のげっ歯類、
ウシ、ヒツジ、ヤギ及びイヌ等を用いることができる。
免疫は常法により行うことができる。
免疫する。精製されたヒトセルロプラスミンは市販され
ており、このような市販品を免疫原として用いることが
できる。哺乳動物としては特に限定されず、霊長類（ヒ
トを除く）、マウス、ラット及びウサギ等のげっ歯類、
ウシ、ヒツジ、ヤギ及びイヌ等を用いることができる。
免疫は常法により行うことができる。
【００１３】次いで、免疫した動物から例えば脾細胞の
ような抗体産生細胞を取り出し、これをミエローマ細胞
と融合させる。ミエローマ細胞はこの分野で周知であ
り、例えばｐ３ｘ６３−Ａｇ８−６５３、ＮＳ−０、Ｎ
Ｓ−１、Ｐ３Ｕ１等を用いることができる。また、細胞
融合操作は、常法により行なうことができる。
ような抗体産生細胞を取り出し、これをミエローマ細胞
と融合させる。ミエローマ細胞はこの分野で周知であ
り、例えばｐ３ｘ６３−Ａｇ８−６５３、ＮＳ−０、Ｎ
Ｓ−１、Ｐ３Ｕ１等を用いることができる。また、細胞
融合操作は、常法により行なうことができる。
【００１４】次いで、常法により、融合後の細胞をＨＡ
Ｔ選択培地で培養し、ハイブリドーマを選択する。次い
で抗ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
をスクリーニングする。スクリーニングは、ヒトセルロ
プラスミンを吸着させたウェルに抗体が結合するか否か
を常法であるサンドイッチエライザ等で調べることによ
り行なうことができる。この際、二次抗体としてはペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオ
キシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素等で標
識した、免疫した動物の免疫グロブリンに対する抗体を
用いることができる。標識物の検出は、標識酵素と基質
とを反応させ、反応による発色の程度を測定すること等
により行なうことができる。ここで基質としては、３，
３−ジアミノベンチジン、２，２−ジアミノビス−ｏ−
ジアニシジン、４−クロロナフトール、４−アミノアン
チピリン、ｏ−フェニレンジアミンなどを用いることが
できる。
Ｔ選択培地で培養し、ハイブリドーマを選択する。次い
で抗ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
をスクリーニングする。スクリーニングは、ヒトセルロ
プラスミンを吸着させたウェルに抗体が結合するか否か
を常法であるサンドイッチエライザ等で調べることによ
り行なうことができる。この際、二次抗体としてはペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオ
キシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素等で標
識した、免疫した動物の免疫グロブリンに対する抗体を
用いることができる。標識物の検出は、標識酵素と基質
とを反応させ、反応による発色の程度を測定すること等
により行なうことができる。ここで基質としては、３，
３−ジアミノベンチジン、２，２−ジアミノビス−ｏ−
ジアニシジン、４−クロロナフトール、４−アミノアン
チピリン、ｏ−フェニレンジアミンなどを用いることが
できる。
【００１５】上記操作により、抗ヒトセルロプラスミン
抗体を産生するハイブリドーマを選択することができ
る。次いで、選択したハイブリドーマを常法である限界
希釈法や軟寒天法等によりクローニングする。所望なら
ば、クローニングしたハイブリドーマを血清培地若しく
は無血清培地を用いた大量培養法により、又はマウスの
腹腔にハイブリドーマを接種し、マウスの腹水から回収
することにより、ハイブリドーマを大量に得ることがで
きる。
抗体を産生するハイブリドーマを選択することができ
る。次いで、選択したハイブリドーマを常法である限界
希釈法や軟寒天法等によりクローニングする。所望なら
ば、クローニングしたハイブリドーマを血清培地若しく
は無血清培地を用いた大量培養法により、又はマウスの
腹腔にハイブリドーマを接種し、マウスの腹水から回収
することにより、ハイブリドーマを大量に得ることがで
きる。
【００１６】次いで、選択された抗ヒトセルロプラスミ
ン抗体のうち、ヒトセルロプラスミンのペルオキシダー
ゼ活性中和能を有するものを選択する。これは、抗ヒト
セルロプラスミンモノクローナル抗体と精製ヒトセルロ
プラスミンを反応させて抗原抗体複合物を形成させ、該
抗原抗体複合物を例えば３，３−ジアミノベンジジンの
ような基質と反応させてそのペルオキシダーゼ活性を測
定することにより行なうことができる。抗原抗体複合物
がペルオキシダーゼ活性を喪失しておれば、その抗体は
ヒトセルロプラスミンのペルオキシダーゼ活性中和能を
有していることになる。
ン抗体のうち、ヒトセルロプラスミンのペルオキシダー
ゼ活性中和能を有するものを選択する。これは、抗ヒト
セルロプラスミンモノクローナル抗体と精製ヒトセルロ
プラスミンを反応させて抗原抗体複合物を形成させ、該
抗原抗体複合物を例えば３，３−ジアミノベンジジンの
ような基質と反応させてそのペルオキシダーゼ活性を測
定することにより行なうことができる。抗原抗体複合物
がペルオキシダーゼ活性を喪失しておれば、その抗体は
ヒトセルロプラスミンのペルオキシダーゼ活性中和能を
有していることになる。
【００１７】本発明のモノクローナル抗体を用いて、試
料中の活性型ヒトセルロプラスミンを検出することがで
きる。この検出は、常法であるサンドイッチエライザに
基づいて行なうことができる。例えば、ウェルに抗ヒト
セルロプラスミンポリクローナル抗体を固相化し、次い
で、種々の既知の濃度の精製ヒトセルロプラスミンを反
応させ、洗浄後、本発明のモノクローナル抗体を反応さ
せ、さらにモノクローナル抗体の由来動物の免疫グロブ
リンに対する標識抗体を反応させて、その標識物を検出
する。検出された標識物の量は、用いたヒトセルロプラ
スミンの濃度に依存して変化しており、用いたヒトセル
ロプラスミンの濃度が既知であるから、これにより検量
線を作成することができる。試料中のヒトセルロプラス
ミンを定量する場合には、上記と同様に反応させ、得ら
れた測定値を上記で得られた検量線にあてはめて試料中
のヒトセルロプラスミンの量を知ることができる。
料中の活性型ヒトセルロプラスミンを検出することがで
きる。この検出は、常法であるサンドイッチエライザに
基づいて行なうことができる。例えば、ウェルに抗ヒト
セルロプラスミンポリクローナル抗体を固相化し、次い
で、種々の既知の濃度の精製ヒトセルロプラスミンを反
応させ、洗浄後、本発明のモノクローナル抗体を反応さ
せ、さらにモノクローナル抗体の由来動物の免疫グロブ
リンに対する標識抗体を反応させて、その標識物を検出
する。検出された標識物の量は、用いたヒトセルロプラ
スミンの濃度に依存して変化しており、用いたヒトセル
ロプラスミンの濃度が既知であるから、これにより検量
線を作成することができる。試料中のヒトセルロプラス
ミンを定量する場合には、上記と同様に反応させ、得ら
れた測定値を上記で得られた検量線にあてはめて試料中
のヒトセルロプラスミンの量を知ることができる。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、活性型のヒトセルロプラ
スミンと特異的に反応するモノクローナル抗体が提供さ
れた。本発明のモノクローナル抗体を用いることによ
り、活性型のヒトセルロプラスミンを特異的に検出する
ことが可能になった。従って、本発明は、ヒトセルロプ
ラスミンに関わる疾病の診断及び治療に大いに貢献する
ものと思われる。
スミンと特異的に反応するモノクローナル抗体が提供さ
れた。本発明のモノクローナル抗体を用いることによ
り、活性型のヒトセルロプラスミンを特異的に検出する
ことが可能になった。従って、本発明は、ヒトセルロプ
ラスミンに関わる疾病の診断及び治療に大いに貢献する
ものと思われる。
【００１９】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。
【００２０】実施例１ (1) マウスの免疫 ヒトセルロプラスミン（シグマ社製）をフロイントコン
プリートアジュバントと等量混合して乳化し、この乳化
物をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、メス、８週令）の腹腔内に
投与し、２週間後にヒトセルロプラスミンをフロイント
インコンプリートアジュバントと等量混合して乳化した
ものを追加免疫した。細胞融合に供する３〜４日前に、
マウスの眼底より抗原のみを投与した。
プリートアジュバントと等量混合して乳化し、この乳化
物をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、メス、８週令）の腹腔内に
投与し、２週間後にヒトセルロプラスミンをフロイント
インコンプリートアジュバントと等量混合して乳化した
ものを追加免疫した。細胞融合に供する３〜４日前に、
マウスの眼底より抗原のみを投与した。
【００２１】(2) 細胞融合 最終免疫より３〜４日後に、(1) の方法で免疫したマウ
スから脾臓を摘出した。メッシュにより脾臓を破砕し、
脾臓細胞をＰＢＳに浮遊調製した。次いで、脾臓細胞と
ミエローマ細胞（ｐ３ｘ６３ａｇ８６５３）を１０：１
の割合に調整し、５０％ポリエチレングリコール存在下
で３分間放置した。１２００ｒｐｍ、８分間遠心分離
し、上清を除いた後、ＲＰＭＩ−１６４０培地２５ｍｌ
を徐々に加え、さらに１２００ｒｐｍ、８分間遠心分離
した。最終的に、１０％ＦＣＳ含有ＨＡＴ ＲＰＭＩ−
１６４０培地に、脾臓細胞が３．５ｘ１０6 個／ｍｌに
なるように調整し、９６ウェルマイクロプレートに０．
１ｍｌ／ウェルになるように分注した。この９６ウェル
マイクロプレートを、５％ＣＯ2 雰囲気下、３７℃で培
養した。培養開始から２〜３日後に、１０％ＦＣＳ含有
ＨＡＴ ＲＰＭＩ−１６４０培地を０．１ｍｌ添加し、
さらに３〜４日おきに培地を半量交換した。培養開始よ
り７〜１０日後にコロニー形成が見られ、少なくとも１
個のウェルに、免疫原に対する十分な抗体が産生され
た。この抗体産生ウェルの培養上清について、抗体のス
クリーニングを行なった。
スから脾臓を摘出した。メッシュにより脾臓を破砕し、
脾臓細胞をＰＢＳに浮遊調製した。次いで、脾臓細胞と
ミエローマ細胞（ｐ３ｘ６３ａｇ８６５３）を１０：１
の割合に調整し、５０％ポリエチレングリコール存在下
で３分間放置した。１２００ｒｐｍ、８分間遠心分離
し、上清を除いた後、ＲＰＭＩ−１６４０培地２５ｍｌ
を徐々に加え、さらに１２００ｒｐｍ、８分間遠心分離
した。最終的に、１０％ＦＣＳ含有ＨＡＴ ＲＰＭＩ−
１６４０培地に、脾臓細胞が３．５ｘ１０6 個／ｍｌに
なるように調整し、９６ウェルマイクロプレートに０．
１ｍｌ／ウェルになるように分注した。この９６ウェル
マイクロプレートを、５％ＣＯ2 雰囲気下、３７℃で培
養した。培養開始から２〜３日後に、１０％ＦＣＳ含有
ＨＡＴ ＲＰＭＩ−１６４０培地を０．１ｍｌ添加し、
さらに３〜４日おきに培地を半量交換した。培養開始よ
り７〜１０日後にコロニー形成が見られ、少なくとも１
個のウェルに、免疫原に対する十分な抗体が産生され
た。この抗体産生ウェルの培養上清について、抗体のス
クリーニングを行なった。
【００２２】(3) スクリーニング 抗体のスクリーニングは、エライザ法（酵素抗体法、Ｉ
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８：８７１−８７４，
１９７１）により行なった。ＰＢＳで懸濁し調製した抗
原液５０μｌを予め吸着させておいた９６ウェルマイク
ロプレートに培養上清を５０μｌ入れ、３０℃、２時間
反応後、さらにペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロ
ブリン抗体と３０℃、１時間反応させた。最後に、ｏ−
フェニレンジアミンを基質とし、発色により判定した。
ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，８：８７１−８７４，
１９７１）により行なった。ＰＢＳで懸濁し調製した抗
原液５０μｌを予め吸着させておいた９６ウェルマイク
ロプレートに培養上清を５０μｌ入れ、３０℃、２時間
反応後、さらにペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロ
ブリン抗体と３０℃、１時間反応させた。最後に、ｏ−
フェニレンジアミンを基質とし、発色により判定した。
【００２３】 (4) クローニング スクリーニングの結果、陽性と判定したウェルから細胞
を取り出し、軟寒天法によりクローニングを行なった。
すなわち、ハイブリドーマ（１．０ｘ１０6 個／ｍｌ）
の細胞浮遊１０％ＦＣＳ含有ＨＴ−ＲＰＭＩ １６４０
培地を軟寒天と混ぜ、５ｍｌずつシャーレに分注した。
３７℃で約７〜１０日間培養後、コロニーを拾い、抗体
陽性を示すコロニーを、目的のモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマとした。同様の手順を２回繰り返し、目
的の抗体産生ハイブリドーマをヒトセルロプラスミンに
対して３株得た。
を取り出し、軟寒天法によりクローニングを行なった。
すなわち、ハイブリドーマ（１．０ｘ１０6 個／ｍｌ）
の細胞浮遊１０％ＦＣＳ含有ＨＴ−ＲＰＭＩ １６４０
培地を軟寒天と混ぜ、５ｍｌずつシャーレに分注した。
３７℃で約７〜１０日間培養後、コロニーを拾い、抗体
陽性を示すコロニーを、目的のモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマとした。同様の手順を２回繰り返し、目
的の抗体産生ハイブリドーマをヒトセルロプラスミンに
対して３株得た。
【００２４】(5) モノクローナル抗体の生産 ハイブリドーマをプリスタン処理済ｂａｌｂ／ｃマウス
の腹腔に移植し、２〜３週間後、腹水を回収した。
の腹腔に移植し、２〜３週間後、腹水を回収した。
【００２５】(6) 活性中和能 精製ヒトセルロプラスミンと、(5) で得られた抗体含有
腹水を混合し、インキュベートした後、８〜２５％勾配
ＳＤＳ電気泳動にかけた後、ペルオキシダーゼ活性をジ
アミノベンジジンを用いて測定した。この操作はより詳
細には次のように行なった。すなわち、(5) で得られた
３種類の抗体含有腹水（ＣＰ３、ＣＰ４及びＣＰ１３）
のそれぞれ又はＰＢＳと２μｇ／ｍｌの精製ヒトプラス
ミンとをそれぞれ１：１で混合し、３７℃で３０分間イ
ンキュベートを行なった。次いで、これらのそれぞれに
ついて、８〜２５％勾配ＳＤＳ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧ
Ｅを行なった。結果を図１に示す。図１中、Ａはコマシ
ーブルーで染色したものであり、Ｂはペルオキシダーゼ
活性に基づき染色を行なったものである。図中、ＡＢ−
ＣＰは精製セルロプラスミンとモノクローナル抗体との
結合物を示し、ＣＰは精製セルロプラスミンを示す。
Ａ、Ｂにおいて、レーン１はＣＰ３、レーン２はＣＰ
４、レーン３はＣＰ１３、レーン４はＰＢＳについての
結果を示す。Ａではレーン１、２、３のいずれにもＡＢ
−ＣＰが認められるが、ＢではＡＢ−ＣＰのバンドがレ
ーン１と３にしか認められず、レーン２には認められな
い。このことから、レーン１及びレーン３は抗原抗体複
合物がセルロプラスミン活性を有するのに対し、レーン
２はセルロプラスミン活性を有していないことが示され
た。すなわち、ＣＰ４モノクローナル抗体に活性中和能
が認められた。ＣＰ４を産生するハイブリドーマ株は微
工研に寄託されており、その受託番号は微工研菌寄第１
２４２１号である。
腹水を混合し、インキュベートした後、８〜２５％勾配
ＳＤＳ電気泳動にかけた後、ペルオキシダーゼ活性をジ
アミノベンジジンを用いて測定した。この操作はより詳
細には次のように行なった。すなわち、(5) で得られた
３種類の抗体含有腹水（ＣＰ３、ＣＰ４及びＣＰ１３）
のそれぞれ又はＰＢＳと２μｇ／ｍｌの精製ヒトプラス
ミンとをそれぞれ１：１で混合し、３７℃で３０分間イ
ンキュベートを行なった。次いで、これらのそれぞれに
ついて、８〜２５％勾配ＳＤＳ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧ
Ｅを行なった。結果を図１に示す。図１中、Ａはコマシ
ーブルーで染色したものであり、Ｂはペルオキシダーゼ
活性に基づき染色を行なったものである。図中、ＡＢ−
ＣＰは精製セルロプラスミンとモノクローナル抗体との
結合物を示し、ＣＰは精製セルロプラスミンを示す。
Ａ、Ｂにおいて、レーン１はＣＰ３、レーン２はＣＰ
４、レーン３はＣＰ１３、レーン４はＰＢＳについての
結果を示す。Ａではレーン１、２、３のいずれにもＡＢ
−ＣＰが認められるが、ＢではＡＢ−ＣＰのバンドがレ
ーン１と３にしか認められず、レーン２には認められな
い。このことから、レーン１及びレーン３は抗原抗体複
合物がセルロプラスミン活性を有するのに対し、レーン
２はセルロプラスミン活性を有していないことが示され
た。すなわち、ＣＰ４モノクローナル抗体に活性中和能
が認められた。ＣＰ４を産生するハイブリドーマ株は微
工研に寄託されており、その受託番号は微工研菌寄第１
２４２１号である。
【００２６】(7) ウェスタンブロットによる抗原フラグ
メントのの分子量の決定 精製ヒトセルロプラスミンを８％ＳＤＳゲルで電気泳動
した後、常法に従いイムノブロットを行ない、抗原フラ
グメントの分子量を決定した。その結果、この抗体は、
３１ｋｄの分子を認識していた。
メントのの分子量の決定 精製ヒトセルロプラスミンを８％ＳＤＳゲルで電気泳動
した後、常法に従いイムノブロットを行ない、抗原フラ
グメントの分子量を決定した。その結果、この抗体は、
３１ｋｄの分子を認識していた。
【００２７】実施例２ サンドイッチエライザによる
活性型ヒトセルロプラスミンの測定 (1) 検量線の作成 ９６穴平底マイクロタイタープレートに抗ヒトセルロプ
ラスミンポリクローナル抗体を１ウェルあたり１００μ
ｌ添加し、４℃で一夜放置し、固相化した。これをＴｗ
ｅｅｎＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング剤３００μｌ
を添加し、３０℃で２時間放置した。次に添加したブロ
キング剤を捨てた。これに０〜１００ｎｇ／ｍｌ、０〜
１００μｇ／ｍｌに希釈したヒトセルロプラスミンをそ
れぞれ１００μｌ添加した。３０℃で２時間反応後、３
回洗浄し、抗ヒトセルロプラスミン抗体を１００μｌず
つ添加した。さらに３０℃で２時間反応後、３回洗浄
し、抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社製）を１００μｌ
ずつ添加し、３０℃で２時間放置した。次いで、３回洗
浄し、ｏ−フェニレンジアミン溶液を１００μｌずつ添
加して反応を停止した。プレートリーダーを用い、波長
４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ヒトセルロ
プラスミンの濃度の上昇と共に吸光度が上昇し、検量線
が得られた。このことから、本発明のモノクローナル抗
体を用いてヒトセルロプラスミンの定量ができることが
証明された。得られた検量線を図２に示す。
活性型ヒトセルロプラスミンの測定 (1) 検量線の作成 ９６穴平底マイクロタイタープレートに抗ヒトセルロプ
ラスミンポリクローナル抗体を１ウェルあたり１００μ
ｌ添加し、４℃で一夜放置し、固相化した。これをＴｗ
ｅｅｎＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング剤３００μｌ
を添加し、３０℃で２時間放置した。次に添加したブロ
キング剤を捨てた。これに０〜１００ｎｇ／ｍｌ、０〜
１００μｇ／ｍｌに希釈したヒトセルロプラスミンをそ
れぞれ１００μｌ添加した。３０℃で２時間反応後、３
回洗浄し、抗ヒトセルロプラスミン抗体を１００μｌず
つ添加した。さらに３０℃で２時間反応後、３回洗浄
し、抗マウスＩｇＧ抗体（カッペル社製）を１００μｌ
ずつ添加し、３０℃で２時間放置した。次いで、３回洗
浄し、ｏ−フェニレンジアミン溶液を１００μｌずつ添
加して反応を停止した。プレートリーダーを用い、波長
４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ヒトセルロ
プラスミンの濃度の上昇と共に吸光度が上昇し、検量線
が得られた。このことから、本発明のモノクローナル抗
体を用いてヒトセルロプラスミンの定量ができることが
証明された。得られた検量線を図２に示す。
【００２８】（２）健常人血清中の活性型ヒトセルロプ
ラスミンの定量 健常人４人より採集した血清をＰＢＳで１００００倍希
釈したものを（１）と同様の方法で試験し、同時に実施
して作成した検量線より、血清中活性型ヒトセルロプラ
スミン量を調べた結果、２０〜３０ｍｇ／ｄｌであっ
た。
ラスミンの定量 健常人４人より採集した血清をＰＢＳで１００００倍希
釈したものを（１）と同様の方法で試験し、同時に実施
して作成した検量線より、血清中活性型ヒトセルロプラ
スミン量を調べた結果、２０〜３０ｍｇ／ｄｌであっ
た。
【図１】モノクローナル抗体のペルオキシダーゼ活性中
和能を調べた結果を示す電気泳動図。
和能を調べた結果を示す電気泳動図。
【図２】本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイ
ッチエライザによりヒトセルロプラスミンを測定して得
られた検量線。
ッチエライザによりヒトセルロプラスミンを測定して得
られた検量線。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 ペルオキシダーゼ活性を有する活性型ヒ
トセルロプラスミンと特異的に反応し、ヒトセルロプラ
スミンのペルオキシダーゼ活性の中和能を有する抗ヒト
セルロプラスミンモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 微工研菌寄第１２４２１号で寄託された
ハイブリドーマが産生するＣＰ４モノクローナル抗体で
ある請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 試料中のペルオキシダーゼ活性を有する
活性型ヒトセルロプラスミンを、請求項１又は２記載の
モノクローナル抗体との特異的反応を利用してサンドイ
ッチエライザにより検出することから成る、活性型ヒト
セルロプラスミンの検出方法。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマであって、ヒトをヒトセル
ロプラスミンで免疫した後該ヒトから回収した抗体産生
細胞由来のものを除く、ハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3260539A JP2673619B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | 抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体、それを用いたヒトセルロプラスミンの検出方法及びそれを産生するハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3260539A JP2673619B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | 抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体、それを用いたヒトセルロプラスミンの検出方法及びそれを産生するハイブリドーマ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05268987A JPH05268987A (ja) | 1993-10-19 |
| JP2673619B2 true JP2673619B2 (ja) | 1997-11-05 |
Family
ID=17349372
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3260539A Expired - Fee Related JP2673619B2 (ja) | 1991-09-12 | 1991-09-12 | 抗ヒトセルロプラスミンモノクローナル抗体、それを用いたヒトセルロプラスミンの検出方法及びそれを産生するハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2673619B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE606516T1 (de) * | 1993-01-13 | 1995-03-16 | Idemitsu Kosan Co | Gegen menschlichen Ceruloplasmin monoklonaler Antikörper. |
-
1991
- 1991-09-12 JP JP3260539A patent/JP2673619B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＢＩＯＫＨＩＭＩＹＡ，５５〜２！ （１９９０） Ｐ．３６１−３６７ |
| ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＡ ＰＯＬＳＫＡ，４〜３！ （１９７９） Ｐ．２２１−２２３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05268987A (ja) | 1993-10-19 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |