JPH07304800A - ヒトペプシノゲンに対するモノクローナル抗体 - Google Patents
ヒトペプシノゲンに対するモノクローナル抗体Info
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- JPH07304800A JPH07304800A JP6116042A JP11604294A JPH07304800A JP H07304800 A JPH07304800 A JP H07304800A JP 6116042 A JP6116042 A JP 6116042A JP 11604294 A JP11604294 A JP 11604294A JP H07304800 A JPH07304800 A JP H07304800A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ヒトペプシノゲン（Ｉ）又は（II）を免疫化
学的に測定するための方法及びそのためのモノクローナ
ル抗体を提供する。 【構成】 ヒトペプシノゲン（Ｉ）又は（II）に対する
モノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、
このハイブリドーマを用いる抗体の製造方法、並びにヒ
トペプシノゲン（Ｉ）又は（II）の測定方法、及びその
ための試薬。 【効果】 本発明の方法によれば、ヒトペプシノゲンＩ
又はIIが特異的に且つ正確に定量することができる。
学的に測定するための方法及びそのためのモノクローナ
ル抗体を提供する。 【構成】 ヒトペプシノゲン（Ｉ）又は（II）に対する
モノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、
このハイブリドーマを用いる抗体の製造方法、並びにヒ
トペプシノゲン（Ｉ）又は（II）の測定方法、及びその
ための試薬。 【効果】 本発明の方法によれば、ヒトペプシノゲンＩ
又はIIが特異的に且つ正確に定量することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトペプシノゲンＩ
（ｈＰＧＩと称す場合がある）に対するモノクローナル
抗体及びヒトペプシノゲンII（ｈＰＧIIと称する場合が
ある）に対するモノクローナル抗体、該モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体
の製造方法、並びに該モノクローナル抗体を用いる、ｈ
ＰＧＩ又はｈＰＧIIの測定方法、及びそのための試薬に
関する。
（ｈＰＧＩと称す場合がある）に対するモノクローナル
抗体及びヒトペプシノゲンII（ｈＰＧIIと称する場合が
ある）に対するモノクローナル抗体、該モノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体
の製造方法、並びに該モノクローナル抗体を用いる、ｈ
ＰＧＩ又はｈＰＧIIの測定方法、及びそのための試薬に
関する。
【０００２】
【従来の技術】ペプシノゲンの分泌量は、胃酸分泌量に
ほぼ並行しており、血液、尿のペプシノゲンも胃ペプシ
ノゲン分泌量に並行していることが知られている。萎縮
性胃炎ではｈＰＧＩが減少し胃潰瘍・十二指腸潰瘍では
ｈＰＧＩ・II共に増量（松本恭一：他臨床病理４０：９
７７〜９８１，１９９２）する。また、胃癌ではｈＰＧ
Ｉは減少し、ｈＰＧIIが増加するとも言われている。さ
らに、ｈＰＧＩ・II共に内分泌機能と密接に関係し、粘
液水腫・アジソン病では減少、甲状腺機能亢進・クッシ
ング症候群・ストレス・ステロイド投与等では増量す
る。また、胃切除例では切除の大きいほど減少し、胃機
能の回復とともに増量することが知られている。
ほぼ並行しており、血液、尿のペプシノゲンも胃ペプシ
ノゲン分泌量に並行していることが知られている。萎縮
性胃炎ではｈＰＧＩが減少し胃潰瘍・十二指腸潰瘍では
ｈＰＧＩ・II共に増量（松本恭一：他臨床病理４０：９
７７〜９８１，１９９２）する。また、胃癌ではｈＰＧ
Ｉは減少し、ｈＰＧIIが増加するとも言われている。さ
らに、ｈＰＧＩ・II共に内分泌機能と密接に関係し、粘
液水腫・アジソン病では減少、甲状腺機能亢進・クッシ
ング症候群・ストレス・ステロイド投与等では増量す
る。また、胃切除例では切除の大きいほど減少し、胃機
能の回復とともに増量することが知られている。
【０００３】上記ペプシノゲンの測定によれば、各種疾
患の診断を始めとして胃切除手術の術前・術中・術後患
者の予後診断の重要な指標の１つとして、その臨床的意
義は非常に大きい。従来の測定法は主として、アイソト
ープを用いる測定法（岡博：他、臨床成人病１９：５３
１〜５３７，１９８９）であり測定施設の問題、廃棄物
の処理等種々の制約を受けるものであった。
患の診断を始めとして胃切除手術の術前・術中・術後患
者の予後診断の重要な指標の１つとして、その臨床的意
義は非常に大きい。従来の測定法は主として、アイソト
ープを用いる測定法（岡博：他、臨床成人病１９：５３
１〜５３７，１９８９）であり測定施設の問題、廃棄物
の処理等種々の制約を受けるものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、ヒト
の胃・十二指腸疾患に有用な医薬の開発等に応用できる
ｈＰＧＩ及びｈＰＧIIの測定方法及びそのための試薬を
提供しようとするものであり、そのための手段としてｈ
ＰＧＩに対するモノクローナル抗体及びｈＰＧIIに対す
るモノクローナル抗体、それらを産生するハイブリドー
マ、並びに該モノクローナル抗体の製造方法を提供しよ
うとするものである。
の胃・十二指腸疾患に有用な医薬の開発等に応用できる
ｈＰＧＩ及びｈＰＧIIの測定方法及びそのための試薬を
提供しようとするものであり、そのための手段としてｈ
ＰＧＩに対するモノクローナル抗体及びｈＰＧIIに対す
るモノクローナル抗体、それらを産生するハイブリドー
マ、並びに該モノクローナル抗体の製造方法を提供しよ
うとするものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の課題
を解決すべく種々検討した結果、ｈＰＧＩ分子構造上の
異なるエピトープを認識する複数のモノクローナル抗体
及び同様にｈＰＧIIの異なるエピトープを認識する複数
のモノクローナル抗体の作製に成功し、さらにこれらを
組合わせて用いることによりｈＰＧＩ及びｈＰＧIIを非
放射能性免疫化学的かつ非競合的反応系で測定すること
ができることを確認して、本発明を完成した。従って本
発明は、ヒトペプシノゲンＩ（ｈＰＧＩ）の複数のエピ
トープと各々特異的に反応するモノクローナル抗体；及
びヒトペプシノゲンII（ｈＰＧII）と同様に特異的に反
応するモノクローナル抗体を提供する。
を解決すべく種々検討した結果、ｈＰＧＩ分子構造上の
異なるエピトープを認識する複数のモノクローナル抗体
及び同様にｈＰＧIIの異なるエピトープを認識する複数
のモノクローナル抗体の作製に成功し、さらにこれらを
組合わせて用いることによりｈＰＧＩ及びｈＰＧIIを非
放射能性免疫化学的かつ非競合的反応系で測定すること
ができることを確認して、本発明を完成した。従って本
発明は、ヒトペプシノゲンＩ（ｈＰＧＩ）の複数のエピ
トープと各々特異的に反応するモノクローナル抗体；及
びヒトペプシノゲンII（ｈＰＧII）と同様に特異的に反
応するモノクローナル抗体を提供する。
【０００６】本発明はさらに、ヒトペプシノゲンＩ（ｈ
ＰＧＩ）により免疫された動物の抗体産生細胞と腫瘍細
胞とを融合させて得られる、ヒトペプシノゲンＩ（ｈＰ
ＧＩ）と反応するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ；及びヒトペプシノゲンII（ｈＰＧII）により
免疫された動物の抗体産生細胞と腫瘍細胞とを融合させ
て得られる、ヒトペプシノゲンII（ｈＰＧ２）と反応す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供
する。
ＰＧＩ）により免疫された動物の抗体産生細胞と腫瘍細
胞とを融合させて得られる、ヒトペプシノゲンＩ（ｈＰ
ＧＩ）と反応するモノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ；及びヒトペプシノゲンII（ｈＰＧII）により
免疫された動物の抗体産生細胞と腫瘍細胞とを融合させ
て得られる、ヒトペプシノゲンII（ｈＰＧ２）と反応す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供
する。
【０００７】本発明はさらに、前記のｈＰＧＩに対する
モノクローナル抗体の製造方法であって、該モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを増殖せしめ、次に
該モノクローナル抗体を採取することを特徴とする方
法；並びに前記ｈＰＧIIに対するモノクローナル抗体の
製造方法であって、該モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを増殖せしめ、次に該モノクローナル抗体
を採取することを特徴とする方法を提供する。
モノクローナル抗体の製造方法であって、該モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを増殖せしめ、次に
該モノクローナル抗体を採取することを特徴とする方
法；並びに前記ｈＰＧIIに対するモノクローナル抗体の
製造方法であって、該モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを増殖せしめ、次に該モノクローナル抗体
を採取することを特徴とする方法を提供する。
【０００８】本発明はさらに、ヒトペプシノゲンＩ（ｈ
ＰＧＩ）の測定方法であって、被験試料とｈＰＧＩに対
するモノクローナル抗体とを接触せしめ、次に反応を測
定することを特徴とする方法；並びにヒトペプシノゲン
II（ｈＰＧII）の測定方法であって、被験試料とｈＰＧ
IIに対するモノクローナル抗体とを接触せしめ、次に反
応を測定することを特徴とする方法を提供する。
ＰＧＩ）の測定方法であって、被験試料とｈＰＧＩに対
するモノクローナル抗体とを接触せしめ、次に反応を測
定することを特徴とする方法；並びにヒトペプシノゲン
II（ｈＰＧII）の測定方法であって、被験試料とｈＰＧ
IIに対するモノクローナル抗体とを接触せしめ、次に反
応を測定することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】本発明はさらに、ヒトペプシノゲンＩ（ｈ
ＰＧＩ）と反応するモノクローナル抗体を含んで成る、
ヒトペプシノゲンＩ（ｈＰＧＩ）測定用試薬；並びにヒ
トペプシノゲンII（ｈＰＧII）と反応するモノクローナ
ル抗体を含んで成る、ヒトペプシノゲンＩ（ｈＰＧII）
測定用試薬を提供する。
ＰＧＩ）と反応するモノクローナル抗体を含んで成る、
ヒトペプシノゲンＩ（ｈＰＧＩ）測定用試薬；並びにヒ
トペプシノゲンII（ｈＰＧII）と反応するモノクローナ
ル抗体を含んで成る、ヒトペプシノゲンＩ（ｈＰＧII）
測定用試薬を提供する。
【００１０】
【具体的な説明】本発明において使用される融合細胞い
わゆるハイブリドーマは、ｈＰＧＩまたはIIを含む抗原
で免疫された動物から得られたｈＰＧＩまたはIIに対す
る抗体を産生する細胞（以下、抗体産生細胞と略称す
る）と腫瘍細胞である骨髄腫細胞とを融合させることに
よって形成される。抗体産生細胞としてはｈＰＧＩまた
はIIを含む抗原で免疫された動物からの脾臓細胞を使用
することが望ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞
は、これらが融合可能な限りにおいて供給源である動物
の種類は限定されないが、融合効率や抗体産生の安定性
から同じ種族の動物を使用するのが好適であり、例えば
マウス等を使用することができる。
わゆるハイブリドーマは、ｈＰＧＩまたはIIを含む抗原
で免疫された動物から得られたｈＰＧＩまたはIIに対す
る抗体を産生する細胞（以下、抗体産生細胞と略称す
る）と腫瘍細胞である骨髄腫細胞とを融合させることに
よって形成される。抗体産生細胞としてはｈＰＧＩまた
はIIを含む抗原で免疫された動物からの脾臓細胞を使用
することが望ましい。抗体産生細胞および骨髄腫細胞
は、これらが融合可能な限りにおいて供給源である動物
の種類は限定されないが、融合効率や抗体産生の安定性
から同じ種族の動物を使用するのが好適であり、例えば
マウス等を使用することができる。
【００１１】ｈＰＧＩまたはIIを含む抗原としては、精
製されたｈＰＧＩまたはIIのみを含む溶液が好ましい
が、ｈＰＧＩまたはIIを主要な構成成分とする胃粘膜ホ
モジナイズ溶液、または胃粘膜組織なども使用可能であ
る。免疫原としてｈＰＧＩ又はｈＰＧIIの一方のみを使
用してもよく、又はこれらの両者を含む免疫原を使用す
ることもできる。後者の場合は、ハイブリドーマをクロ
ーニングする段階で、ｈＰＧＩに対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマと、ｈＰＧＩに対するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを分別選抜
することができる。
製されたｈＰＧＩまたはIIのみを含む溶液が好ましい
が、ｈＰＧＩまたはIIを主要な構成成分とする胃粘膜ホ
モジナイズ溶液、または胃粘膜組織なども使用可能であ
る。免疫原としてｈＰＧＩ又はｈＰＧIIの一方のみを使
用してもよく、又はこれらの両者を含む免疫原を使用す
ることもできる。後者の場合は、ハイブリドーマをクロ
ーニングする段階で、ｈＰＧＩに対するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマと、ｈＰＧＩに対するモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを分別選抜
することができる。
【００１２】本発明の実施のための１つの好ましいハイ
ブリドーマは、ｈＰＧＩ及び／又はIIで免疫したマウス
の脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞を融合させて得られる
ものであり、例えば、あらかじめｈＰＧＩ（もしくはI
I）で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの抗ｈＰＧＩ（も
しくはII）抗体産生脾臓細胞と、ＢＡＬＢ／ｃマウスの
骨髄腫細胞との融合ハイブリドーマである。細胞融合
後、ハイブリドーマをクローン化し、このクローンを培
養し、そのクローン群からｈＰＧＩまたはIIに対して特
異性を示す抗体を産生するクローンを選別する。かかる
クローンによって産生される抗体は一般にモノクローナ
ル抗体と称される。
ブリドーマは、ｈＰＧＩ及び／又はIIで免疫したマウス
の脾臓細胞とマウスの骨髄腫細胞を融合させて得られる
ものであり、例えば、あらかじめｈＰＧＩ（もしくはI
I）で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの抗ｈＰＧＩ（も
しくはII）抗体産生脾臓細胞と、ＢＡＬＢ／ｃマウスの
骨髄腫細胞との融合ハイブリドーマである。細胞融合
後、ハイブリドーマをクローン化し、このクローンを培
養し、そのクローン群からｈＰＧＩまたはIIに対して特
異性を示す抗体を産生するクローンを選別する。かかる
クローンによって産生される抗体は一般にモノクローナ
ル抗体と称される。
【００１３】ｈＰＧＩまたはIIに対するモノクローナル
抗体の製造は、上記抗体産生クローンを培地中におい
て、また組織適合性動物またはヌードマウスの体内にお
いて維持生育させることにより行われる。産生されたモ
ノクローナル抗体は培地からまた動物の血清もしくは腹
水上清から回収される。（例えば、岩崎辰夫ら、「単ク
ローン抗体」、８８−９４頁（１９８３）参照）。
抗体の製造は、上記抗体産生クローンを培地中におい
て、また組織適合性動物またはヌードマウスの体内にお
いて維持生育させることにより行われる。産生されたモ
ノクローナル抗体は培地からまた動物の血清もしくは腹
水上清から回収される。（例えば、岩崎辰夫ら、「単ク
ローン抗体」、８８−９４頁（１９８３）参照）。
【００１４】以下に、更に詳細に、前記ハイブリドーマ
を形成させるための好適な方法を説明する。なお、ＢＡ
ＬＢ／ｃマウス由来の骨髄腫細胞とｈＰＧＩ（もしくは
ｈＰＧII）で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓
細胞のみならず、ほかの動物由来の骨髄腫細胞および抗
体産生細胞を用いることもできる。
を形成させるための好適な方法を説明する。なお、ＢＡ
ＬＢ／ｃマウス由来の骨髄腫細胞とｈＰＧＩ（もしくは
ｈＰＧII）で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓
細胞のみならず、ほかの動物由来の骨髄腫細胞および抗
体産生細胞を用いることもできる。
【００１５】（１）融合のための脾臓細胞の調製 精製されたｈＰＧＩまたはIIを含んだ生理食塩液をフロ
イント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバントで乳化し、
この乳化液をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射し、さ
らに２週間間隔で３〜４回、ｈＰＧＩまたはｈＰＧIIを
Ｆｒｅｕｎｄｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ
で乳化して該マウス腹腔内に追加注射する。そして最後
の追加注射の１０日後に眼底静脈叢より試験採血して血
清抗体力価を定量して高抗体力価を確認する。そして細
胞融合を実施する３日前に更に該マウスの尾静脈にｈＰ
ＧＩまたはｈＰＧII液を含む生理食塩液を注射する。
イント（Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバントで乳化し、
この乳化液をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射し、さ
らに２週間間隔で３〜４回、ｈＰＧＩまたはｈＰＧIIを
Ｆｒｅｕｎｄｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ
で乳化して該マウス腹腔内に追加注射する。そして最後
の追加注射の１０日後に眼底静脈叢より試験採血して血
清抗体力価を定量して高抗体力価を確認する。そして細
胞融合を実施する３日前に更に該マウスの尾静脈にｈＰ
ＧＩまたはｈＰＧII液を含む生理食塩液を注射する。
【００１６】静脈注射３日目に該マウスを脱血・ト殺
し、脾臓を摘出する。脾臓細胞懸濁液をウイ（Ｏｉ）ら
により報告されている方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ：３５１−３７４頁（１９８０））で調製する。混
在する赤血球細胞をフィコールペイクを用いた比重遠心
法により沈でん除去する。この様にして得られる小リン
パ球画分を含む脾臓細胞懸濁液をＲＰＭＩＬ６４０培地
（pH７．４）中での遠心分離により洗浄し懸濁させる。
し、脾臓を摘出する。脾臓細胞懸濁液をウイ（Ｏｉ）ら
により報告されている方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ：３５１−３７４頁（１９８０））で調製する。混
在する赤血球細胞をフィコールペイクを用いた比重遠心
法により沈でん除去する。この様にして得られる小リン
パ球画分を含む脾臓細胞懸濁液をＲＰＭＩＬ６４０培地
（pH７．４）中での遠心分離により洗浄し懸濁させる。
【００１７】（２）細胞融合に用いる骨髄腫細胞の調製 ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．，６巻，５１１−５１９頁（１９７６）により報
告されているヒポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）が欠損したＢＡＬＢ／
ｃマウスの骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ1 （以
下Ｐ3 Ｕ1 と略す）を、牛胎児血清１０％を含むＲＰＭ
ＩＬ６４０培地中に維持する。Ｐ3 Ｕ1 の生育は、選択
培地、例えばヒポキサンチン−アミノプリテン−チミジ
ン（ＨＡＴ）培地により阻害される。
ｏｌ．，６巻，５１１−５１９頁（１９７６）により報
告されているヒポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）が欠損したＢＡＬＢ／
ｃマウスの骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ1 （以
下Ｐ3 Ｕ1 と略す）を、牛胎児血清１０％を含むＲＰＭ
ＩＬ６４０培地中に維持する。Ｐ3 Ｕ1 の生育は、選択
培地、例えばヒポキサンチン−アミノプリテン−チミジ
ン（ＨＡＴ）培地により阻害される。
【００１８】（３）ハイブリドーマの作製 前記方法により調製される脾臓細胞および骨髄腫細胞を
渡辺武ら（免疫実験操作法IX：２９６３−２９６７頁
（１９８０）が報告を一部ｍｏｄｉｆｙして、ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）１５００の存在下において融
合させる。融合後、細胞をＨＡＴ培地に懸濁させ、次い
で組織培養プレート、例えば９６穴（ウエル）マイクロ
タイタープレートの個々の穴（ウエル）に分注して培養
する。
渡辺武ら（免疫実験操作法IX：２９６３−２９６７頁
（１９８０）が報告を一部ｍｏｄｉｆｙして、ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）１５００の存在下において融
合させる。融合後、細胞をＨＡＴ培地に懸濁させ、次い
で組織培養プレート、例えば９６穴（ウエル）マイクロ
タイタープレートの個々の穴（ウエル）に分注して培養
する。
【００１９】（４）抗体の検出 前記ハイブリドーマが産生する抗体の検出には、ホラー
（Ｖｏｌｌｅｒ）ら（Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ，５３巻、５５
−６５頁（１９７６）が報告している酵素抗体法が優れ
ており、この酵素抗体法が本発明におけるｈＰＧＩ（も
しくはII）に対するモノクローナル抗体の検出に適用さ
れる。イムノアッセイ用プレート、例えば９６穴（ウエ
ル）マイクロタイタープレートの穴（ウエル）壁に固定
したｈＰＧＩまたはｈＰＧIIにハイブリドーマ培養液ま
たはハイブリドーマを接種したマウスの腹水上清を加え
る。
（Ｖｏｌｌｅｒ）ら（Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ，５３巻、５５
−６５頁（１９７６）が報告している酵素抗体法が優れ
ており、この酵素抗体法が本発明におけるｈＰＧＩ（も
しくはII）に対するモノクローナル抗体の検出に適用さ
れる。イムノアッセイ用プレート、例えば９６穴（ウエ
ル）マイクロタイタープレートの穴（ウエル）壁に固定
したｈＰＧＩまたはｈＰＧIIにハイブリドーマ培養液ま
たはハイブリドーマを接種したマウスの腹水上清を加え
る。
【００２０】次いで、ベルオキシダーゼを標識した抗マ
ウスイムノグロブリン抗体を加えた後、それのペルオキ
シダーゼ活性をオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）の
発色で検定する。このＯＰＤの発色は抗体の存在を示唆
する。ハイブリドーマ培養液またはハイブリドーマを接
種したマウスの腹水の抗ｈＰＧＩまたはｈＰＧII抗体力
価はＯＰＤの５０％発色を与える該培養液、または腹水
上清の最終希釈倍数で示される。ＢＡＬＢ／ｃマウスの
骨髄腫細胞（Ｐ3 Ｕ1 ）の培養液、ならびに同細胞をＢ
ＡＬＢ／ｃマウスに接種して得られる血清および腹水上
清は、ｈＰＧＩまたはIIに対する抗体活性を有していな
い。
ウスイムノグロブリン抗体を加えた後、それのペルオキ
シダーゼ活性をオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）の
発色で検定する。このＯＰＤの発色は抗体の存在を示唆
する。ハイブリドーマ培養液またはハイブリドーマを接
種したマウスの腹水の抗ｈＰＧＩまたはｈＰＧII抗体力
価はＯＰＤの５０％発色を与える該培養液、または腹水
上清の最終希釈倍数で示される。ＢＡＬＢ／ｃマウスの
骨髄腫細胞（Ｐ3 Ｕ1 ）の培養液、ならびに同細胞をＢ
ＡＬＢ／ｃマウスに接種して得られる血清および腹水上
清は、ｈＰＧＩまたはIIに対する抗体活性を有していな
い。
【００２１】（５）抗体産生細胞のクローニング 上記酵素抗体法により抗体の産生が検出されたハイブリ
ドーマについて限界希釈法もしくは乾寒天ゲル内コロニ
ー法によるクローニング操作を繰り返すことによって、
この発明のｈＰＧＩ（もしくはｈＰＧII）抗体を産生す
るハイブリドーマが確立される。そして、ハイブリドー
マを培養することにより、ｈＰＧＩ（もしくはｈＰＧI
I）に対して特異的に反応するモノクローナル抗体が産
生される。この抗ｈＰＧＩ（もしくはｈＰＧII）抗体
が、ヒトの血液、尿、胃液、体液、組織、細胞培養液な
どに存在しているｈＰＧＩまたはｈＰＧII定量用試薬と
して有用である。
ドーマについて限界希釈法もしくは乾寒天ゲル内コロニ
ー法によるクローニング操作を繰り返すことによって、
この発明のｈＰＧＩ（もしくはｈＰＧII）抗体を産生す
るハイブリドーマが確立される。そして、ハイブリドー
マを培養することにより、ｈＰＧＩ（もしくはｈＰＧI
I）に対して特異的に反応するモノクローナル抗体が産
生される。この抗ｈＰＧＩ（もしくはｈＰＧII）抗体
が、ヒトの血液、尿、胃液、体液、組織、細胞培養液な
どに存在しているｈＰＧＩまたはｈＰＧII定量用試薬と
して有用である。
【００２２】本発明のモノクローナル抗体は常法に従っ
て回収・精製することができる。本発明はまた、前記モ
ノクローナル抗体のフラグメントに関し、このフラグメ
ントとは、モノクローナル抗体の部分から成り、且つそ
のモノクローナル抗体の抗原結合性を維持しているもの
を意味する。この様な抗体フラグメントとして、例えば
Ｆａｂ′フラグメント等を挙げることができ、これらは
本発明のモノクローナル抗体から常法に従って得られ
る。
て回収・精製することができる。本発明はまた、前記モ
ノクローナル抗体のフラグメントに関し、このフラグメ
ントとは、モノクローナル抗体の部分から成り、且つそ
のモノクローナル抗体の抗原結合性を維持しているもの
を意味する。この様な抗体フラグメントとして、例えば
Ｆａｂ′フラグメント等を挙げることができ、これらは
本発明のモノクローナル抗体から常法に従って得られ
る。
【００２３】本発明はさらに、抗ｈＰＧＩまたは抗ｈＰ
ＧII抗体を用いる抗ｈＰＧＩまたは抗ｈＰＧIIの測定方
法及びそのための試薬に関する。ここで測定とは、抗ｈ
ＰＧＩまたは抗ｈＰＧII抗体を検出し、その存否を決定
すること、およびその量又は濃度を決定することを含
む。この測定方法は、被験試料と本発明の抗体とをなん
らかの形で接触せしめ、被験試料中にｈＰＧＩまたはｈ
ＰＧIIが存在する場合にはそれと抗ｈＰＧＩ抗体または
抗ｈＰＧII抗体との反応を生じさせ、この反応存否又は
量を測定するものであり、そのための具体的な方法とし
ては、種々の免疫測定系を用いることができる。
ＧII抗体を用いる抗ｈＰＧＩまたは抗ｈＰＧIIの測定方
法及びそのための試薬に関する。ここで測定とは、抗ｈ
ＰＧＩまたは抗ｈＰＧII抗体を検出し、その存否を決定
すること、およびその量又は濃度を決定することを含
む。この測定方法は、被験試料と本発明の抗体とをなん
らかの形で接触せしめ、被験試料中にｈＰＧＩまたはｈ
ＰＧIIが存在する場合にはそれと抗ｈＰＧＩ抗体または
抗ｈＰＧII抗体との反応を生じさせ、この反応存否又は
量を測定するものであり、そのための具体的な方法とし
ては、種々の免疫測定系を用いることができる。
【００２４】例えば、反応系として競争的測定法及び非
競争的な測定法を用いることができ、また検出系として
酵素免疫測定法、放射能免疫測定法、蛍光免疫測定法等
を用いることができる。酵素免疫測定法は、抗原もしく
は抗体のいずれか、又はそのいずれかに対する抗体を酵
素により標識するものであり、酵素としてはペルオキシ
ダーゼやアルカリフォスファターゼ等が使用され、検出
のためには、例えばペルオキシダーゼの場合は基質とし
て過酸化水素、発色試薬としてオルトフェニレンジアミ
ン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジン等が主
として用いられる。
競争的な測定法を用いることができ、また検出系として
酵素免疫測定法、放射能免疫測定法、蛍光免疫測定法等
を用いることができる。酵素免疫測定法は、抗原もしく
は抗体のいずれか、又はそのいずれかに対する抗体を酵
素により標識するものであり、酵素としてはペルオキシ
ダーゼやアルカリフォスファターゼ等が使用され、検出
のためには、例えばペルオキシダーゼの場合は基質とし
て過酸化水素、発色試薬としてオルトフェニレンジアミ
ン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジン等が主
として用いられる。
【００２５】放射免疫測定法のための標識としてはトレ
ーサー（ 131Ｉ、 125Ｉ、14Ｃ、 3Ｈ）などが用いられ
る。また蛍光免疫測定法の標識としては蛍光色素（フル
オロレッセインイソチオシアネート、フェコエリスリ
ン、バッファローレッド、等）が使用される。本発明の
ｈＰＧＩ又はｈＰＧII測定用試薬は、前記のモノクロー
ナル抗体又はそのフラグメント自体であってもよく、又
はこれらを前記のトレーサーや酵素で標識したものであ
ってもよい。
ーサー（ 131Ｉ、 125Ｉ、14Ｃ、 3Ｈ）などが用いられ
る。また蛍光免疫測定法の標識としては蛍光色素（フル
オロレッセインイソチオシアネート、フェコエリスリ
ン、バッファローレッド、等）が使用される。本発明の
ｈＰＧＩ又はｈＰＧII測定用試薬は、前記のモノクロー
ナル抗体又はそのフラグメント自体であってもよく、又
はこれらを前記のトレーサーや酵素で標識したものであ
ってもよい。
【００２６】本発明における、最も特徴的な免疫化学的
測定法は酵素免疫測定法（サントウィッチ法）であり、
この方法においては、ｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）に対す
るモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントを固体
支持体、例えばマイクロタイタープレートに固定し、次
に分析対象としてのｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）抗原を含
有する試料を該固体支持体と接触せしめ、試料中のｈＰ
ＧＩ（又はｈＰＧII）を、固体支持体に固定された抗−
ｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）モノクローナル抗体と結合せ
しめる。
測定法は酵素免疫測定法（サントウィッチ法）であり、
この方法においては、ｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）に対す
るモノクローナル抗体もしくはそのフラグメントを固体
支持体、例えばマイクロタイタープレートに固定し、次
に分析対象としてのｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）抗原を含
有する試料を該固体支持体と接触せしめ、試料中のｈＰ
ＧＩ（又はｈＰＧII）を、固体支持体に固定された抗−
ｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）モノクローナル抗体と結合せ
しめる。
【００２７】次に、前記抗−ｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）
モノクローナル抗体が結合するｈＰＧＩ（又はｈＰＧI
I）上のエピトープとは異るエピトープに結合する抗−
ｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）モノクローナル抗体もしくは
そのフラグメントであって酵素標識されたものと、前記
固体支持体とを接触せしめることにより、固体支持体に
固定されたｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）と標識された抗−
ｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）又はそのフラグメントとを結
合させる。
モノクローナル抗体が結合するｈＰＧＩ（又はｈＰＧI
I）上のエピトープとは異るエピトープに結合する抗−
ｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）モノクローナル抗体もしくは
そのフラグメントであって酵素標識されたものと、前記
固体支持体とを接触せしめることにより、固体支持体に
固定されたｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）と標識された抗−
ｈＰＧＩ（又はｈＰＧII）又はそのフラグメントとを結
合させる。
【００２８】次に、未結合の標識モノクローナル抗体を
洗浄除去した後、固体支持体を、前記酵素に対する基質
を含有する検出用試薬、例えば発色試薬と接触せしめる
ことにより発色せしめ、その発色を例えば分光光度計を
用いて測定する。さらに、本発明の分析試薬は、上記の
抗体又はそのフラグメント（場合によっては標識されて
いる）と、抗原としてのｈＰＧＩ又はIIあるいはこれら
を前記のごとく標識したものとを組合わせた分析キット
の形であってもよい。この様なキットはさらに、酵素標
識を検出するための検出試薬を含んでいてもよい。前記
の試薬成分は、緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ
緩衝液等に溶解した溶液の形でもよく、又は凍結乾燥等
により乾燥したものでもよい。
洗浄除去した後、固体支持体を、前記酵素に対する基質
を含有する検出用試薬、例えば発色試薬と接触せしめる
ことにより発色せしめ、その発色を例えば分光光度計を
用いて測定する。さらに、本発明の分析試薬は、上記の
抗体又はそのフラグメント（場合によっては標識されて
いる）と、抗原としてのｈＰＧＩ又はIIあるいはこれら
を前記のごとく標識したものとを組合わせた分析キット
の形であってもよい。この様なキットはさらに、酵素標
識を検出するための検出試薬を含んでいてもよい。前記
の試薬成分は、緩衝液、例えばリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ
緩衝液等に溶解した溶液の形でもよく、又は凍結乾燥等
により乾燥したものでもよい。
【００２９】
【実施例】次に本発明を実施例によりさらに具体的に説
明する。実施例１ ．モノクローナル抗体の作製 （１）ｈＰＧＩまたはIIの精製 手術時に得られた部分切除胃の粘膜を、ガラス板で剥離
し、ＴＮＧ緩衝液（pH７．０、１０ｍＭ トリスＨＣ
Ｌ、２０％グリセリン、０．０２％ＮａＮ3 ）中にて超
音波によるホモジナイズを行った。溶液を２０，０００
rpm ４℃で２０分遠心した後、ＴＮＧ緩衝液にて平衡化
したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社ｃｏｄｅ １７−０７１０−０１）２．５
＊５０cmのカラムにかけ、ＮａＣＬ濃度を０．７Ｍにま
で上げるグラジエントを行って、粗ＰＧＩ分画およびＰ
ＧII分画を得た。
明する。実施例１ ．モノクローナル抗体の作製 （１）ｈＰＧＩまたはIIの精製 手術時に得られた部分切除胃の粘膜を、ガラス板で剥離
し、ＴＮＧ緩衝液（pH７．０、１０ｍＭ トリスＨＣ
Ｌ、２０％グリセリン、０．０２％ＮａＮ3 ）中にて超
音波によるホモジナイズを行った。溶液を２０，０００
rpm ４℃で２０分遠心した後、ＴＮＧ緩衝液にて平衡化
したＤＥＡＥ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ６Ｂ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社ｃｏｄｅ １７−０７１０−０１）２．５
＊５０cmのカラムにかけ、ＮａＣＬ濃度を０．７Ｍにま
で上げるグラジエントを行って、粗ＰＧＩ分画およびＰ
ＧII分画を得た。
【００３０】ＰＧＩ分画およびII分画はそれぞれ燐酸緩
衝液（pH７．０、１０ｍＭリン酸Ｎａ、０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、２０％グリセリン、０．１％ＮａＮ3 ）に透析し
た後、ヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏｒａｄ社ｃｏｄｅ
１３０−０４２０）２．５＊１０cmにかけ燐酸濃度を
０．４Ｍに上げるグラジエンドを行った。溶出された各
ＰＧ分画を燐酸緩衝液（pH７．０、２０ｍＭ燐酸Ｎａ）
に透析した後、カラムにＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソ−社ｃ
ｏｄｅ ０７１６４）を用いたＨＰＬＣにかけＮａＣｌ
濃度を０．７Ｍに上げるグラジエンドにより精製ｈＰＧ
ＩおよびｈＰＧIIを得た。
衝液（pH７．０、１０ｍＭリン酸Ｎａ、０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、２０％グリセリン、０．１％ＮａＮ3 ）に透析し
た後、ヒドロキシアパタイト（Ｂｉｏｒａｄ社ｃｏｄｅ
１３０−０４２０）２．５＊１０cmにかけ燐酸濃度を
０．４Ｍに上げるグラジエンドを行った。溶出された各
ＰＧ分画を燐酸緩衝液（pH７．０、２０ｍＭ燐酸Ｎａ）
に透析した後、カラムにＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソ−社ｃ
ｏｄｅ ０７１６４）を用いたＨＰＬＣにかけＮａＣｌ
濃度を０．７Ｍに上げるグラジエンドにより精製ｈＰＧ
ＩおよびｈＰＧIIを得た。
【００３１】（２）ハイブリドーマの作製および腹水抗
体の製造 ｈＰＧＩ（もしくはII）の０．４mgを０．４mlの日本薬
局方生理食塩液（以下、生食と略称する）に溶解し、こ
の溶液にフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）０．
２６mlを加えて乳化（Ｗ／Ｏ型）させた後、得られた乳
化液を４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射した
（１００μｇ／ｍｏｕｓｅ）。２週間後、更に０．４ml
の生食に溶解した０．２mgのｈＰＧＩ（もしくはII）に
Ｆｒｅｕｎｄｅ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａ
ｎｔ（ＦＩＣＡ）０．６mlを加えて乳化（Ｗ／Ｏ型）し
たものをマウスの腹腔内に追加注射した（５０μｇ／ｍ
ｏｕｓｅ）。
体の製造 ｈＰＧＩ（もしくはII）の０．４mgを０．４mlの日本薬
局方生理食塩液（以下、生食と略称する）に溶解し、こ
の溶液にフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）０．
２６mlを加えて乳化（Ｗ／Ｏ型）させた後、得られた乳
化液を４匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射した
（１００μｇ／ｍｏｕｓｅ）。２週間後、更に０．４ml
の生食に溶解した０．２mgのｈＰＧＩ（もしくはII）に
Ｆｒｅｕｎｄｅ ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａ
ｎｔ（ＦＩＣＡ）０．６mlを加えて乳化（Ｗ／Ｏ型）し
たものをマウスの腹腔内に追加注射した（５０μｇ／ｍ
ｏｕｓｅ）。
【００３２】そして、同じ濃度のｈＰＧＩ（もしくはI
I）液にＦＩＣＡを加えて乳化したものを２週間間隔で
４回、マウス腹腔内に追加注射した（５０μｇ／ｍｏｕ
ｓｅ×４回）。そして、最後の追加注射の１０日後に眼
底静脈叢から試験採血して血清抗体力価が充分上昇して
いることを確認した。更にマウスの尾静脈にｈＰＧＩ
（もしくはII）を生食に溶解した液を注射した（１００
μｇ／ｍｏｕｓｅ）。細胞融合を行う直前にマウスを脱
血・ト殺し、脾臓を摘出し、その脾臓細胞をＲＰＭＩＬ
６４０培地（日研生物医学研究所ｃｏｄｅ ６０５１０
０）に懸濁させた。脾臓細胞懸濁液をフィコールペイク
を用いる比重遠心法により赤血球を除去した後、無血清
培地中で遠心分離（２５０×Ｇ）により、２回洗浄し、
次いで、無血清培地中に懸濁させた。
I）液にＦＩＣＡを加えて乳化したものを２週間間隔で
４回、マウス腹腔内に追加注射した（５０μｇ／ｍｏｕ
ｓｅ×４回）。そして、最後の追加注射の１０日後に眼
底静脈叢から試験採血して血清抗体力価が充分上昇して
いることを確認した。更にマウスの尾静脈にｈＰＧＩ
（もしくはII）を生食に溶解した液を注射した（１００
μｇ／ｍｏｕｓｅ）。細胞融合を行う直前にマウスを脱
血・ト殺し、脾臓を摘出し、その脾臓細胞をＲＰＭＩＬ
６４０培地（日研生物医学研究所ｃｏｄｅ ６０５１０
０）に懸濁させた。脾臓細胞懸濁液をフィコールペイク
を用いる比重遠心法により赤血球を除去した後、無血清
培地中で遠心分離（２５０×Ｇ）により、２回洗浄し、
次いで、無血清培地中に懸濁させた。
【００３３】一方、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｕ１を牛胎児
血清１０％を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた
後、ＲＰＭＩ−１６４０培地（pH７．４）中で遠心分離
（２５０×Ｇ）により、２回、洗浄し、次いで、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地中に懸濁させた。懸濁状態の脾臓細胞
とＰ３Ｕ１を混合した後、遠心分離（２５０×Ｇ）して
沈渣とし、これにポリエチレングリコール１，５００を
４５％含むＲＰＭＩ−１６４０培地（pH７．４）を１ml
加え、６分間、３７℃で細胞融合させた。
血清１０％を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた
後、ＲＰＭＩ−１６４０培地（pH７．４）中で遠心分離
（２５０×Ｇ）により、２回、洗浄し、次いで、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地中に懸濁させた。懸濁状態の脾臓細胞
とＰ３Ｕ１を混合した後、遠心分離（２５０×Ｇ）して
沈渣とし、これにポリエチレングリコール１，５００を
４５％含むＲＰＭＩ−１６４０培地（pH７．４）を１ml
加え、６分間、３７℃で細胞融合させた。
【００３４】得られた細胞混合物にＲＰＭＩ−１６４０
培地を加えて全量１０mlとして遠心分離（２５０×Ｇ）
３７℃、３分により、洗浄した後、さらに、牛胎児血清
を１０％含むＲＰＭＩＬ６４０培地１０mlに細胞を浮遊
させて遠心分離（２５０×Ｇ、３７℃、５分）したの
ち、上清を除去し、適当量のＨＴ培地を用いて１×１０
6 脾臓細胞／ml、あるいは２×１０6 脾臓細胞／mlとな
るように浮遊させ、その０．１mlを９６穴（ウエル）プ
ラスチックマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ
ｃｏｄｅ ２５８６０）に分注し、５％炭酸ガス存在
下のインキュベーター中で培養した。
培地を加えて全量１０mlとして遠心分離（２５０×Ｇ）
３７℃、３分により、洗浄した後、さらに、牛胎児血清
を１０％含むＲＰＭＩＬ６４０培地１０mlに細胞を浮遊
させて遠心分離（２５０×Ｇ、３７℃、５分）したの
ち、上清を除去し、適当量のＨＴ培地を用いて１×１０
6 脾臓細胞／ml、あるいは２×１０6 脾臓細胞／mlとな
るように浮遊させ、その０．１mlを９６穴（ウエル）プ
ラスチックマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ
ｃｏｄｅ ２５８６０）に分注し、５％炭酸ガス存在
下のインキュベーター中で培養した。
【００３５】培養開始後１日目にＨＡＴ培地を０．１ml
加え、以後２日目、３日目、５日目、８日目および１１
日目には、培養液の半分（１００μｌ）を吸引し、その
替わりにＨＡＴ培地を追加した。１４日目には、９６穴
（ウエル）プラスチックマイクロタイタープレートのす
べての培養穴（ウエル）に１穴（ウエル）あたり平均２
−３個のハイブリドーマの集落が生育した。ハイブリド
ーマが十分増殖した時点（培養開始より約２週間後）
で、培養上清のｈＰＧＩまたはIIに対する抗体力価を酵
素抗体法で検定した。抗体を産生している各穴（ウエ
ル）のハイブリドーマについて限界希釈法によるクロー
ニング操作を３回繰り返し行った。
加え、以後２日目、３日目、５日目、８日目および１１
日目には、培養液の半分（１００μｌ）を吸引し、その
替わりにＨＡＴ培地を追加した。１４日目には、９６穴
（ウエル）プラスチックマイクロタイタープレートのす
べての培養穴（ウエル）に１穴（ウエル）あたり平均２
−３個のハイブリドーマの集落が生育した。ハイブリド
ーマが十分増殖した時点（培養開始より約２週間後）
で、培養上清のｈＰＧＩまたはIIに対する抗体力価を酵
素抗体法で検定した。抗体を産生している各穴（ウエ
ル）のハイブリドーマについて限界希釈法によるクロー
ニング操作を３回繰り返し行った。
【００３６】その結果、ＰＧＩ抗体を安定に産生するク
ローン２株を選択した。これらのクローンを、各々、ハ
イブリドーマＰＧＩ−２Ｆ５（イソタイプは１ｇＧ２
ａ）、及びハイブリドーマＰＧＩ−７Ｇ３（イソタイプ
はＩｇＧ１）と命名した。また同様にＰＧII抗体を安定
に産生するクローン４株を単離し、これらのクローン
を、各々、ハイブリドーマＰＧII−２Ｄ５（イソタイプ
はＩｇＧ１）、ハイブリドーマＰＧII−２Ｆ１１（イソ
タイプはＩｇＧ２ｂ）、ハイブリドーマＰＧII−８Ｇ２
（イソイプはＩｇＧ２ａ）、及びハイブリドーマＰＧII
−１０Ｅ１１（イソタイプはＩｇＧ1 ）と命名した。
ローン２株を選択した。これらのクローンを、各々、ハ
イブリドーマＰＧＩ−２Ｆ５（イソタイプは１ｇＧ２
ａ）、及びハイブリドーマＰＧＩ−７Ｇ３（イソタイプ
はＩｇＧ１）と命名した。また同様にＰＧII抗体を安定
に産生するクローン４株を単離し、これらのクローン
を、各々、ハイブリドーマＰＧII−２Ｄ５（イソタイプ
はＩｇＧ１）、ハイブリドーマＰＧII−２Ｆ１１（イソ
タイプはＩｇＧ２ｂ）、ハイブリドーマＰＧII−８Ｇ２
（イソイプはＩｇＧ２ａ）、及びハイブリドーマＰＧII
−１０Ｅ１１（イソタイプはＩｇＧ1 ）と命名した。
【００３７】上記のハイブリドーマは、工業技術院生命
工学工業技術研究所に、平成６年（１９９４年）２月１
７日に寄託され、次の受託番号が与えられた。ハイブリドーマ 受託番号 ＰＧＩ−２Ｆ５ Ｐ−１４１５７ ＰＧＩ−７Ｇ３ Ｐ−１４１５５ ＰＧII−２Ｄ５ Ｐ−１４１５９ ＰＧII−２Ｆ１１ Ｐ−１４１５６ ＰＧII−８Ｇ２ Ｐ−１４１５８ ＰＧII−１０Ｅ１１ Ｐ−１４１６０
工学工業技術研究所に、平成６年（１９９４年）２月１
７日に寄託され、次の受託番号が与えられた。ハイブリドーマ 受託番号 ＰＧＩ−２Ｆ５ Ｐ−１４１５７ ＰＧＩ−７Ｇ３ Ｐ−１４１５５ ＰＧII−２Ｄ５ Ｐ−１４１５９ ＰＧII−２Ｆ１１ Ｐ−１４１５６ ＰＧII−８Ｇ２ Ｐ−１４１５８ ＰＧII−１０Ｅ１１ Ｐ−１４１６０
【００３８】実施例２． モノクローナル抗体の製造 腹水タイプの抗体を製造するために、前記クローンのう
ち５×１０6 細胞を有するＰＧＩ−２Ｆ５、ＰＧＩ−７
Ｇ３、ＰＧII−２Ｄ５、ＰＧII−２Ｆ１１、ＰＧII−８
Ｇ２、及びＰＧII−１０Ｅ１１のクローンを１週間前に
プリスタン０．５mlを腹腔内注射済みのＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に注射し、１週間後に抗ｈＰＧＩ（もしく
はII）抗体を含む腹水を採取した。腹水はマウス１匹当
たり５−１５ml得られた。上記の６株について得られた
培養液（培地１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４
０；４日培養）、及び腹水のｈＰＧＩ（もしくはII）に
対する抗体力価を酵素抗体法で調べた結果を表１に示
す。
ち５×１０6 細胞を有するＰＧＩ−２Ｆ５、ＰＧＩ−７
Ｇ３、ＰＧII−２Ｄ５、ＰＧII−２Ｆ１１、ＰＧII−８
Ｇ２、及びＰＧII−１０Ｅ１１のクローンを１週間前に
プリスタン０．５mlを腹腔内注射済みのＢＡＬＢ／ｃマ
ウスの腹腔内に注射し、１週間後に抗ｈＰＧＩ（もしく
はII）抗体を含む腹水を採取した。腹水はマウス１匹当
たり５−１５ml得られた。上記の６株について得られた
培養液（培地１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４
０；４日培養）、及び腹水のｈＰＧＩ（もしくはII）に
対する抗体力価を酵素抗体法で調べた結果を表１に示
す。
【００３９】
【表１】
【００４０】実施例３．モノクローナル抗体の特性決定 ヒト胃粘膜ホモジナイズ液に対するラウリル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドグラジェントゲル電気泳動
（１０％ゲル、アトー社製）の泳動ゲルニトロセルロー
ス膜を重ねて、電気的に電気泳動バンドを転写した後、
このニトロセルロース膜を風乾し、前記実施例２で得ら
れた抗ｈＰＧＩモノクローナル抗体ＰＧＩ２Ｆ５及びＰ
ＧＩ７Ｇ３を含む培養液に浸し、３７℃で１時間反応さ
せた。
ウム−ポリアクリルアミドグラジェントゲル電気泳動
（１０％ゲル、アトー社製）の泳動ゲルニトロセルロー
ス膜を重ねて、電気的に電気泳動バンドを転写した後、
このニトロセルロース膜を風乾し、前記実施例２で得ら
れた抗ｈＰＧＩモノクローナル抗体ＰＧＩ２Ｆ５及びＰ
ＧＩ７Ｇ３を含む培養液に浸し、３７℃で１時間反応さ
せた。
【００４１】未反応の抗体を洗浄除去した後、ペルオキ
シダーゼで標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体
（ＭＢＬ社製 ｃｏｄｅ ３３０）を燐酸緩衝液で２０
００培に希釈した液に浸し、３７℃で１時間反応させ
た。未反応の標識抗体を洗浄除去した後、基質である４
−クロロ−１−ナフトール溶液に浸した。ｈＰＧＩ（ま
たはII）と上記抗体を介して結合したペルオキシダーゼ
の存在を紫色の発色によって確認した。前記の種類の項
ＰＧＩモノクローナル抗体ＰＧＩ−２Ｆ５及びＰＧＩ−
７Ｇ３はいずれもｈＰＧＩに特異的に反応することが判
明した。
シダーゼで標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体
（ＭＢＬ社製 ｃｏｄｅ ３３０）を燐酸緩衝液で２０
００培に希釈した液に浸し、３７℃で１時間反応させ
た。未反応の標識抗体を洗浄除去した後、基質である４
−クロロ−１−ナフトール溶液に浸した。ｈＰＧＩ（ま
たはII）と上記抗体を介して結合したペルオキシダーゼ
の存在を紫色の発色によって確認した。前記の種類の項
ＰＧＩモノクローナル抗体ＰＧＩ−２Ｆ５及びＰＧＩ−
７Ｇ３はいずれもｈＰＧＩに特異的に反応することが判
明した。
【００４２】同様にＰＧII−２Ｄ５、ＰＧII−２Ｆ１
１、ＰＧII−８Ｇ２及びＰＧII−１０Ｅ１１は、ｈＰＧ
IIに特異的に反応した。代表例として、ＰＧＩ２Ｆ５及
びＰＧII２Ｄ５についての成績を図１に示す。図１の
（ａ）は、電気泳動の蛋白質染色バンドを示しており、
図１の（ｂ）および（ｃ）は、ペルオキシダーゼの存在
を示している。図１の（ａ）では多数のバンドが観察さ
れるが、図１の（ｂ）ではｈＰＧＩに対応する位置にペ
ルオキシダーゼの存在（矢印の位置）を示すバンドが観
察された。同様に（ｃ）ではｈＰＧIIに対応する位置に
ペルオキシダーゼの存在を示すバンドが観察された。
１、ＰＧII−８Ｇ２及びＰＧII−１０Ｅ１１は、ｈＰＧ
IIに特異的に反応した。代表例として、ＰＧＩ２Ｆ５及
びＰＧII２Ｄ５についての成績を図１に示す。図１の
（ａ）は、電気泳動の蛋白質染色バンドを示しており、
図１の（ｂ）および（ｃ）は、ペルオキシダーゼの存在
を示している。図１の（ａ）では多数のバンドが観察さ
れるが、図１の（ｂ）ではｈＰＧＩに対応する位置にペ
ルオキシダーゼの存在（矢印の位置）を示すバンドが観
察された。同様に（ｃ）ではｈＰＧIIに対応する位置に
ペルオキシダーゼの存在を示すバンドが観察された。
【００４３】実施例４．酵素抗体法によるヒトＰＧＩの
定量 酵素標識抗体の作成 まず抗ＰＧＩモノクローナル抗体ＰＧＩ−７Ｇ３もしく
はＰＧＩ−２Ｆ５を含む腹水上清をＮａ2 ＳＯ4 で透析
した後、ＤＥＡＥ−セルロースカラム及びアフィニティ
ーカラムを用いＩｇＧを得、このＩｇＧをペプシン消化
してＦ（ａｂ′）2 を得、このＦ（ａｂ′）2 を還元し
た後、Ｆａｂ′を得た（ジャーナル オブ イムノアッ
セイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）第４巻、第２０９
頁（１９８３））。ペルオキシダーゼＦａｂ′複合体は
西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼとＦａｂ′を免疫実
験操作法（第ＸＩ巻、３４９７頁（１９８２））記載の
方法で結合させた。
定量 酵素標識抗体の作成 まず抗ＰＧＩモノクローナル抗体ＰＧＩ−７Ｇ３もしく
はＰＧＩ−２Ｆ５を含む腹水上清をＮａ2 ＳＯ4 で透析
した後、ＤＥＡＥ−セルロースカラム及びアフィニティ
ーカラムを用いＩｇＧを得、このＩｇＧをペプシン消化
してＦ（ａｂ′）2 を得、このＦ（ａｂ′）2 を還元し
た後、Ｆａｂ′を得た（ジャーナル オブ イムノアッ
セイ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）第４巻、第２０９
頁（１９８３））。ペルオキシダーゼＦａｂ′複合体は
西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼとＦａｂ′を免疫実
験操作法（第ＸＩ巻、３４９７頁（１９８２））記載の
方法で結合させた。
【００４４】酵素免疫測定法 ９６穴（ウエル）マイクロタイタープレートの各穴（ウ
エル）に、前記実施例２で得られた抗ＰＧＩモノクロー
ナル抗体ＰＧＩ−２Ｆ５もしくはＰＧＩ−７Ｇ３を含む
腹水上清を炭酸緩衝液（pH９．６）で２０００培に希釈
した液を入れて４℃で、１夜放置し、次いで、各穴（ウ
エル）を洗浄後１％牛血清アルブミン（ナカライテスク
ｃｏｄｅ ０１２−６６）Ｄ′−ＰＢＳ溶液を入れて
３７℃で、２時間放置した。
エル）に、前記実施例２で得られた抗ＰＧＩモノクロー
ナル抗体ＰＧＩ−２Ｆ５もしくはＰＧＩ−７Ｇ３を含む
腹水上清を炭酸緩衝液（pH９．６）で２０００培に希釈
した液を入れて４℃で、１夜放置し、次いで、各穴（ウ
エル）を洗浄後１％牛血清アルブミン（ナカライテスク
ｃｏｄｅ ０１２−６６）Ｄ′−ＰＢＳ溶液を入れて
３７℃で、２時間放置した。
【００４５】さらに洗浄してから前記実施例１で得られ
たｈＰＧＩを標準抗原として種々の濃度で各穴（ウエ
ル）に入れて３７℃で３０分間反応させた。そして、洗
浄後ペルオキシダーゼで標識したＰＧＩ−７Ｇ３を上記
燐酸緩衝液で２０００倍に希釈した液を各穴（ウエル）
に入れて３７℃で、１時間反応させて、充分洗浄した
後、基質であるオルトフェニレンジアミン溶液を入れて
３７℃で、１０分間反応させた後、１Ｍ硫酸を５０μｌ
／ｗｅｌｌ添加して反応を止めた。
たｈＰＧＩを標準抗原として種々の濃度で各穴（ウエ
ル）に入れて３７℃で３０分間反応させた。そして、洗
浄後ペルオキシダーゼで標識したＰＧＩ−７Ｇ３を上記
燐酸緩衝液で２０００倍に希釈した液を各穴（ウエル）
に入れて３７℃で、１時間反応させて、充分洗浄した
後、基質であるオルトフェニレンジアミン溶液を入れて
３７℃で、１０分間反応させた後、１Ｍ硫酸を５０μｌ
／ｗｅｌｌ添加して反応を止めた。
【００４６】このマイクロタイタープレートの各穴（ウ
エル）で発色した溶液を波長４９２nmのマイクロプレー
トリーダー（コロナ社製）を用いて測定した。その結果
を図２に示す。図２において、ｈＰＧＩの１ｎｇ／ｍ１
から１６０ｎｇ／ｍ１の範囲の濃度と吸光度との間に直
線性が得られ、ｈＰＧＩの定量に有用であることが判明
した。酵素免疫測定法により固相に抗ＰＧＩモノクロー
ナル抗体２Ｆ５を用い、ペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ′
として抗ＰＧＩモノクローナル抗体７Ｇ３を用いた場合
の測定法の性能を調べた。同一検体（血清）を１２回同
時に測定した場合の同時再現性を表２に、また同一検体
を１日１回連続して６日測定した場合の日差再現性を表
３に示した。
エル）で発色した溶液を波長４９２nmのマイクロプレー
トリーダー（コロナ社製）を用いて測定した。その結果
を図２に示す。図２において、ｈＰＧＩの１ｎｇ／ｍ１
から１６０ｎｇ／ｍ１の範囲の濃度と吸光度との間に直
線性が得られ、ｈＰＧＩの定量に有用であることが判明
した。酵素免疫測定法により固相に抗ＰＧＩモノクロー
ナル抗体２Ｆ５を用い、ペルオキシダーゼ標識Ｆａｂ′
として抗ＰＧＩモノクローナル抗体７Ｇ３を用いた場合
の測定法の性能を調べた。同一検体（血清）を１２回同
時に測定した場合の同時再現性を表２に、また同一検体
を１日１回連続して６日測定した場合の日差再現性を表
３に示した。
【００４７】
【表２】
【００４８】
【表３】 次に、検体（血清）に精製した既知濃度のＰＧＩを添加
した場合の回収率を検討し、その結果を表４に示した。
した場合の回収率を検討し、その結果を表４に示した。
【００４９】
【表４】 表２、表３および表４の結果は検査試薬として十分に良
好な成績であり、本モノクローナル抗体を用いることに
より良好なエンザイムイムノアッセイ試薬が調製される
ことが判明した。
好な成績であり、本モノクローナル抗体を用いることに
より良好なエンザイムイムノアッセイ試薬が調製される
ことが判明した。
【００５０】実施例５．酵素抗体法によるヒトＰＧIIの
定量 酵素標識抗体の作成 先の実施例４と同様にＰＧII−２Ｄ５、ＰＧII−２Ｆ１
１、ＰＧII−８Ｇ２及びＰＧII−１０Ｅ１１についてペ
ルオキシダーゼ標識抗体を作成した。
定量 酵素標識抗体の作成 先の実施例４と同様にＰＧII−２Ｄ５、ＰＧII−２Ｆ１
１、ＰＧII−８Ｇ２及びＰＧII−１０Ｅ１１についてペ
ルオキシダーゼ標識抗体を作成した。
【００５１】酵素免疫測定法 先の実施例４と同様の操作を行った。但し、固相抗体に
ＰＧII−２Ｄ５を用いた場合、標識抗体はＰＧII−８Ｇ
２もしくはＰＧII−１０Ｅ１１を、また、固相抗体にＰ
ＧII−２Ｆ１１を用いた場合には標識抗体にはＰＧII−
８Ｇ２もしくはＰＧII−１０Ｅ１１を、同様に固相にＰ
ＧII−８Ｇ２を用いた場合には、標識抗体にはＰＧII−
２Ｄ５もしくはＰＧII−２Ｆ１１、そして固相抗体にＰ
ＧII−１０Ｅ１１を用いた場合は、標識抗体は、ＰＧII
−２Ｄ５もしくはＰＧII−２Ｆ１１を用いた。
ＰＧII−２Ｄ５を用いた場合、標識抗体はＰＧII−８Ｇ
２もしくはＰＧII−１０Ｅ１１を、また、固相抗体にＰ
ＧII−２Ｆ１１を用いた場合には標識抗体にはＰＧII−
８Ｇ２もしくはＰＧII−１０Ｅ１１を、同様に固相にＰ
ＧII−８Ｇ２を用いた場合には、標識抗体にはＰＧII−
２Ｄ５もしくはＰＧII−２Ｆ１１、そして固相抗体にＰ
ＧII−１０Ｅ１１を用いた場合は、標識抗体は、ＰＧII
−２Ｄ５もしくはＰＧII−２Ｆ１１を用いた。
【００５２】その結果を図３に示す。図３において、ｈ
ＰＧIIの１ｎｇ／mlから１６０ｎｇ／mlの範囲の濃度と
吸光度との間に直線性が得られ、ｈＰＧIIの定量に有用
であることが判明した。前記の酵素免疫測定法により固
相に抗ＰＧIIモノクローナル抗体２Ｄ５を用い、ペルオ
キシダーゼ標識Ｆａｂ′として抗ＰＧIIモノクローナル
抗体１０Ｅ１１を用いた場合の測定法の性能を調べた。
同一検体（血清）を１２回同時に測定した場合の同時再
現性を表５に、また同一検体を１日１回連続して６日測
定した場合の日差再現性を表６に示した。
ＰＧIIの１ｎｇ／mlから１６０ｎｇ／mlの範囲の濃度と
吸光度との間に直線性が得られ、ｈＰＧIIの定量に有用
であることが判明した。前記の酵素免疫測定法により固
相に抗ＰＧIIモノクローナル抗体２Ｄ５を用い、ペルオ
キシダーゼ標識Ｆａｂ′として抗ＰＧIIモノクローナル
抗体１０Ｅ１１を用いた場合の測定法の性能を調べた。
同一検体（血清）を１２回同時に測定した場合の同時再
現性を表５に、また同一検体を１日１回連続して６日測
定した場合の日差再現性を表６に示した。
【００５３】
【表５】
【００５４】
【表６】 次に、検体（血清）に精製した既知濃度のＰＧIIを添加
した場合の回収率を検討し、その結果を表７に示した。
した場合の回収率を検討し、その結果を表７に示した。
【００５５】
【表７】 表５、表６および表７の結果は検査試薬として十分に良
好な成績であり、本モノクローナル抗体を用いることに
より良好なエンザイムイムノアッセイ試薬が調製される
ことが判明した。
好な成績であり、本モノクローナル抗体を用いることに
より良好なエンザイムイムノアッセイ試薬が調製される
ことが判明した。
【００５６】
【発明の効果】以上説明したとおり、本発明の抗体は、
ｈＰＧＩ（もしくはII）に対して特異性を示すモノクロ
ーナル抗体であり、本発明の方法によれば，ｈＰＧＩ
（もしくはII）に対して特異性を示すモノクローナル抗
体を製造することができる。本発明のモノクローナル抗
体は、ヒトの血液や、尿、体液、細胞培養液などに存在
しているｈＰＧＩまたはIIをイムノアッセイ法を用い、
定量する試薬として有用である。
ｈＰＧＩ（もしくはII）に対して特異性を示すモノクロ
ーナル抗体であり、本発明の方法によれば，ｈＰＧＩ
（もしくはII）に対して特異性を示すモノクローナル抗
体を製造することができる。本発明のモノクローナル抗
体は、ヒトの血液や、尿、体液、細胞培養液などに存在
しているｈＰＧＩまたはIIをイムノアッセイ法を用い、
定量する試薬として有用である。
【図１】図１において、（ａ）は、ヒト胃粘膜ホモジナ
イズ液を電気泳動した際の蛋白染色パターンを示す図で
あり、（ｂ）は、ヒト胃粘膜ホモジナイズ液に対するＰ
ＧＩ−２Ｆ５の、同様に（ｃ）はＰＧII−２Ｄ５の、電
気泳動イムノブロッティングによるペルオキシダーゼの
存在を示す図面に代る図である。また、（ｄ）は分子量
マーカー（ファルマシア ｃｏｄｅ１７−０４４６−０
１）であり、上部よりそれぞれＲａｂｂｉｔ ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ（９４kD），Ｂｏｖｉｎｅ ａ
ｌｂｕｍｉｎ（６７kD），Ｅｇｇ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ
（４３kD），Ｂｏｖｉｎｅ ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈ
ｙｄｒａｓｅ（３０kD）そしてＳｏｙｂｅａｎ ｔｒｙ
ｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０．１kD）を示す。
イズ液を電気泳動した際の蛋白染色パターンを示す図で
あり、（ｂ）は、ヒト胃粘膜ホモジナイズ液に対するＰ
ＧＩ−２Ｆ５の、同様に（ｃ）はＰＧII−２Ｄ５の、電
気泳動イムノブロッティングによるペルオキシダーゼの
存在を示す図面に代る図である。また、（ｄ）は分子量
マーカー（ファルマシア ｃｏｄｅ１７−０４４６−０
１）であり、上部よりそれぞれＲａｂｂｉｔ ｐｈｏｓ
ｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｂ（９４kD），Ｂｏｖｉｎｅ ａ
ｌｂｕｍｉｎ（６７kD），Ｅｇｇ ｏｖａｌｂｕｍｉｎ
（４３kD），Ｂｏｖｉｎｅ ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈ
ｙｄｒａｓｅ（３０kD）そしてＳｏｙｂｅａｎ ｔｒｙ
ｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０．１kD）を示す。
【図２】図２は、ＰＧＩの測定に関して、本発明のモノ
クローナル抗体を使用した酵素抗体法の定量性を示すグ
ラフである。図中、白丸は固相に抗体ＰＧＩ−２Ｆ５、
第２抗体にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧＩ−７Ｇ３を
用いた場合のデータ、黒丸は固相に抗体ＰＧＩ−２Ｆ
５、第２抗体にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧＩ−２Ｆ
５を用いた場合のデータを示す。
クローナル抗体を使用した酵素抗体法の定量性を示すグ
ラフである。図中、白丸は固相に抗体ＰＧＩ−２Ｆ５、
第２抗体にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧＩ−７Ｇ３を
用いた場合のデータ、黒丸は固相に抗体ＰＧＩ−２Ｆ
５、第２抗体にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧＩ−２Ｆ
５を用いた場合のデータを示す。
【図３】図３は、ＰＧIIの測定に関して、本発明のモノ
クローナル抗体を使用した酵素抗体法の定量性を示すグ
ラフである。図中、固相に抗体ＰＧII−２Ｄ５、第２抗
体にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧII−８Ｇ２を用いた
場合のデータを白丸、第２抗体にペルオキシダーゼ標識
抗体ＰＧII−１０Ｅ１１を用いた場合のデータを黒丸で
示した。また、固相に抗体ＰＧII−２Ｆ１１、第２抗体
にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧII−８Ｇ２を用いた場
合のデータを白三角、第２抗体にペルオキシダーゼ標識
抗体ＰＧII−１０Ｅ１１を用いた場合のデータを黒三角
で示した。次に、固相に抗体ＰＧII−８Ｇ２、第２抗体
にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧII−２Ｄ５を用いた場
合のデータを白四角、第２抗体にペルオキシダーゼ標識
抗体ＰＧII−２Ｆ１１を用いた場合のデータを黒四角で
示した。続いて、固相に抗体ＰＧII−１０Ｅ１１、第２
抗体にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧII−２Ｄ５を用い
た場合のデータを白ひし形、第２抗体にペルオキシダー
ゼ標識抗体ＰＧII−２Ｆ１１を用いた場合のデータを黒
ひし形で示した。
クローナル抗体を使用した酵素抗体法の定量性を示すグ
ラフである。図中、固相に抗体ＰＧII−２Ｄ５、第２抗
体にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧII−８Ｇ２を用いた
場合のデータを白丸、第２抗体にペルオキシダーゼ標識
抗体ＰＧII−１０Ｅ１１を用いた場合のデータを黒丸で
示した。また、固相に抗体ＰＧII−２Ｆ１１、第２抗体
にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧII−８Ｇ２を用いた場
合のデータを白三角、第２抗体にペルオキシダーゼ標識
抗体ＰＧII−１０Ｅ１１を用いた場合のデータを黒三角
で示した。次に、固相に抗体ＰＧII−８Ｇ２、第２抗体
にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧII−２Ｄ５を用いた場
合のデータを白四角、第２抗体にペルオキシダーゼ標識
抗体ＰＧII−２Ｆ１１を用いた場合のデータを黒四角で
示した。続いて、固相に抗体ＰＧII−１０Ｅ１１、第２
抗体にペルオキシダーゼ標識抗体ＰＧII−２Ｄ５を用い
た場合のデータを白ひし形、第２抗体にペルオキシダー
ゼ標識抗体ＰＧII−２Ｆ１１を用いた場合のデータを黒
ひし形で示した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｄ 33/53 Ｄ 33/573 Ａ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 日浅 義雄 奈良県奈良市秋篠早月町９−１−301
Claims (10)
- 【請求項１】 免疫反応系において実質的にヒトペプシ
ノゲンII（ｈＰＧII）と反応せずヒトペプシノゲンＩ
（ｈＰＧＩ）と特異的に反応するモノクローナル抗体、
又はそれらの構造上の超可変部を含むフラグメント。 - 【請求項２】 ｈＰＧＩと反応せずヒトペプシノゲンII
（ｈＰＧII）と特異的に反応するモノクローナル抗体、
又はそれらの構造上の超可変部を含むフラグメント。 - 【請求項３】 ｈＰＧＩにより免疫されたマウスの形質
細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合させて得られるｈＰＧ
Ｉと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生する雑
種細胞２Ｆ５（工業技術院生命工学工業技術研究所受託
番号Ｐ−１４１５７）並びに７Ｇ３（Ｐ−１４１５５）
又はそれらから誘導された細胞株により生産される請求
項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ｈＰＧIIにより免疫されたマウスの形質
細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合させて得られるｈＰＧ
IIと特異的に反応するモノクローナル抗体を産生する雑
種細胞２Ｄ５（工業技術院生命工学工業技術研究所受託
番号Ｐ−１４１５９），２Ｆ１１（Ｐ−１４１５６），
８Ｇ２（Ｐ−１４１５８）並びに１０Ｅ１１（Ｐ−１４
１６０）又はそれらから誘導された細胞株により生産さ
れる請求項２に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 請求項３に記載の雑種細胞２Ｆ５（Ｐ−
１４１５７）並びに７Ｇ３（Ｐ−１４１５５）又はそれ
らから誘導される細胞株。 - 【請求項６】 請求項４に記載の雑種細胞２Ｄ５（Ｐ−
１４１５９），２Ｆ１１（Ｐ−１４１５６），８Ｇ２
（Ｐ−１４１５８）並びに１０Ｅ１１（Ｐ−１４１６
０）又はそれらから誘導される細胞株。 - 【請求項７】 少なくとも次の工程を含むことを特徴と
するｈＰＧＩの免疫化学的測定方法。 （１）第１抗体として、請求項１および請求項３に記載
のモノクローナル抗体から選ばれた１種類の抗体で固相
表面を覆う工程。 （２）標準試料および被検試料を測定系に添加して、固
定された第１抗体と試料中のｈＰＧＩを反応させる工
程。 （３）固相表面に固定された第１抗体を介して固定され
たｈＰＧＩと、第２抗体として請求項１および請求項３
に記載のモノクローナル抗体のうち前項（１）の固相表
面を覆う工程に使用しなかった１種類の抗体もしくはそ
の構造上の超可変部を含むフラグメントをあらかじめ酵
素（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等）
で標識したものを反応させる工程。 （４）固定された標識酵素に基質を添加して酵素反応を
行うことにより、標識をカウントする工程。 （５）標識のカウントを濃度既知のｈＰＧＩ標準試料に
対する検量曲線と比較することによる、被検試料中のｈ
ＰＧＩ濃度を算定する工程。 - 【請求項８】 少なくとも次の工程を含むことを特徴と
するｈＰＧIIの免疫化学的測定方法。 （１）第１抗体として、請求項２および請求項４に記載
のモノクローナル抗体から選ばれた１種類の抗体で固相
表面を覆う工程。 （２）標準試料および被検試料を測定系に添加して、固
定された第１抗体と試料中のｈＰＧＩを反応させる工
程。 （３）固相表面に固定された第１抗体を介して固定され
たｈＰＧIIと、第２抗体として請求項２および請求項４
に記載のモノクローナル抗体のうち前項（１）の固相表
面を覆う工程に使用しなかった１種類の抗体もしくはそ
の構造上の超可変部を含むフラグメントをあらかじめ酵
素で標識したものを反応させる工程。 （４）固定された標識酵素に基質を添加して酵素反応を
行うことにより、標識をカウントする工程。 （５）標識のカウントを濃度既知のｈＰＧII標準試料に
対する検量曲線と比較することによる、被検試料中のｈ
ＰＧII濃度を算定する工程。 - 【請求項９】 請求項１および請求項３のいずれか１項
に記載のモノクローナル抗体を含んで成る、請求項７に
記載のｈＰＧＩの免疫化学的測定に用いる試薬。 - 【請求項１０】 請求項２および請求項４のいずれか１
項に記載のモノクローナル抗体を含んで成る、請求項８
に記載のｈＰＧIIの免疫化学的測定に用いる試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6116042A JPH07304800A (ja) | 1994-05-06 | 1994-05-06 | ヒトペプシノゲンに対するモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6116042A JPH07304800A (ja) | 1994-05-06 | 1994-05-06 | ヒトペプシノゲンに対するモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07304800A true JPH07304800A (ja) | 1995-11-21 |
Family
ID=14677285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6116042A Pending JPH07304800A (ja) | 1994-05-06 | 1994-05-06 | ヒトペプシノゲンに対するモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07304800A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002543433A (ja) * | 1999-04-30 | 2002-12-17 | ビオヒット・ユルキネン・オサケユキテュア | 血清サンプル中のペプシノーゲンｉ（ｐｇｉ）とガストリン−１７の濃度の定量的測定の段階を含む、消化性潰瘍の危険性を評価する方法 |
| JP2011501177A (ja) * | 2007-10-26 | 2011-01-06 | ビオヒット・ユルキネン・オサケユキテュア | 自己免疫疾患および萎縮性胃炎と関連する胃癌を診断するための方法および製品 |
| CN102654499A (zh) * | 2012-05-16 | 2012-09-05 | 江苏省原子医学研究所 | 一种胃蛋白酶原ⅰ的光激发化学发光检测方法及试剂盒 |
| CN114591435A (zh) * | 2020-12-07 | 2022-06-07 | 生物岛实验室 | 胃蛋白酶原ii的特异性抗体及其制备方法与应用 |
| CN114835814A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-08-02 | 宁波赛珀生物技术有限公司 | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
-
1994
- 1994-05-06 JP JP6116042A patent/JPH07304800A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002543433A (ja) * | 1999-04-30 | 2002-12-17 | ビオヒット・ユルキネン・オサケユキテュア | 血清サンプル中のペプシノーゲンｉ（ｐｇｉ）とガストリン−１７の濃度の定量的測定の段階を含む、消化性潰瘍の危険性を評価する方法 |
| JP2011501177A (ja) * | 2007-10-26 | 2011-01-06 | ビオヒット・ユルキネン・オサケユキテュア | 自己免疫疾患および萎縮性胃炎と関連する胃癌を診断するための方法および製品 |
| CN102654499A (zh) * | 2012-05-16 | 2012-09-05 | 江苏省原子医学研究所 | 一种胃蛋白酶原ⅰ的光激发化学发光检测方法及试剂盒 |
| CN114591435A (zh) * | 2020-12-07 | 2022-06-07 | 生物岛实验室 | 胃蛋白酶原ii的特异性抗体及其制备方法与应用 |
| CN114591435B (zh) * | 2020-12-07 | 2022-11-11 | 生物岛实验室 | 胃蛋白酶原ii的特异性抗体及其制备方法与应用 |
| CN114835814A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-08-02 | 宁波赛珀生物技术有限公司 | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
| CN114835814B (zh) * | 2022-06-07 | 2023-08-25 | 宁波赛珀生物技术有限公司 | 一种抗胃蛋白酶原ii的单克隆抗体及其制备方法和应用 |
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