JPH06113830A - ヒトヘモグロビンの特異的検出法 - Google Patents
ヒトヘモグロビンの特異的検出法Info
- Publication number
- JPH06113830A JPH06113830A JP3322900A JP32290091A JPH06113830A JP H06113830 A JPH06113830 A JP H06113830A JP 3322900 A JP3322900 A JP 3322900A JP 32290091 A JP32290091 A JP 32290091A JP H06113830 A JPH06113830 A JP H06113830A
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- hemoglobin
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Abstract
(57)【要約】
【目的】検体中のヒトヘモグロビンを鋭敏かつ容易に検
出する方法を提供する。 【構成】複数の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体
の混合物を担体に結合させたものを被検体と接触、反応
せしめることによりヒトヘモグロビンを特異的に検出す
る。 【効果】生体試料中のヒトヘモグロビンを特異的に、か
つ高感度で測定できヒト便、尿中のヘモグロビンの測定
に利用できる。
出する方法を提供する。 【構成】複数の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体
の混合物を担体に結合させたものを被検体と接触、反応
せしめることによりヒトヘモグロビンを特異的に検出す
る。 【効果】生体試料中のヒトヘモグロビンを特異的に、か
つ高感度で測定できヒト便、尿中のヘモグロビンの測定
に利用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒトヘモグロビンに特異
的に反応するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ及該モノクローナル抗体の
混合物を用いることを特徴とする、ヒトヘモグロビンの
特異的検出方法に関する。
的に反応するモノクローナル抗体、該モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ及該モノクローナル抗体の
混合物を用いることを特徴とする、ヒトヘモグロビンの
特異的検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】抗原抗体反応を利用した便潜血反応は、
微量成分の検出法として優れ、現在は、ウサギ、ヤギ等
を免疫して得たポリクローナル抗体をラテックス等の担
体へ結合させ、検体液と混合させることによって生じる
凝集反応物の有無をガラス板上で観察するか又は、光学
的に測定する方法によって行われている。
微量成分の検出法として優れ、現在は、ウサギ、ヤギ等
を免疫して得たポリクローナル抗体をラテックス等の担
体へ結合させ、検体液と混合させることによって生じる
凝集反応物の有無をガラス板上で観察するか又は、光学
的に測定する方法によって行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
検出法はポリクローナル抗体を使用しているためいくつ
かの欠点が知られている。即ち、ポリクローナル抗体の
作成には純粋な抗原を用いなければならず、その抗原を
免疫に用いても抗原分子上の多種の抗原決定基に対する
抗体が含まれていて均一なものではないため、他の動物
ヘモグロビン等の共通部分に対する抗体を含み免疫学的
交叉反応を生じる。又、特異抗血清を得るためには他の
動物ヘモグロビンによる吸収操作が不可欠であり、回収
された抗体も同様に均一なものではない。更に、免疫さ
れた動物一個体当りの抗体採取量にも限界があり大量に
同一の抗血清を得ることは困難である。この問題を解決
する方法としてモノクローナル抗体の応用が考えられ
る。モノクローナル抗体は一種類の抗原決定基に高い特
異性を有し、しかも同一の抗体を繰り返し大量に得るこ
とができる。しかし、モノクローナル抗体作成において
ヒトヘモグロビンに特異的に反応する抗体を作成するこ
とは困難なことであり、またモノクローナル抗体は単独
で担体固相化しても抗原に対して凝集反応を起こすこと
が難かしく、更にゲル内沈降反応もうまく行かず、検出
法として不向きであった。
検出法はポリクローナル抗体を使用しているためいくつ
かの欠点が知られている。即ち、ポリクローナル抗体の
作成には純粋な抗原を用いなければならず、その抗原を
免疫に用いても抗原分子上の多種の抗原決定基に対する
抗体が含まれていて均一なものではないため、他の動物
ヘモグロビン等の共通部分に対する抗体を含み免疫学的
交叉反応を生じる。又、特異抗血清を得るためには他の
動物ヘモグロビンによる吸収操作が不可欠であり、回収
された抗体も同様に均一なものではない。更に、免疫さ
れた動物一個体当りの抗体採取量にも限界があり大量に
同一の抗血清を得ることは困難である。この問題を解決
する方法としてモノクローナル抗体の応用が考えられ
る。モノクローナル抗体は一種類の抗原決定基に高い特
異性を有し、しかも同一の抗体を繰り返し大量に得るこ
とができる。しかし、モノクローナル抗体作成において
ヒトヘモグロビンに特異的に反応する抗体を作成するこ
とは困難なことであり、またモノクローナル抗体は単独
で担体固相化しても抗原に対して凝集反応を起こすこと
が難かしく、更にゲル内沈降反応もうまく行かず、検出
法として不向きであった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者はこれ
らの問題点を解決すべく種々研究を重ねた結果、ヒトヘ
モグロビンに特異的に反応するモノクローナル抗体を複
数作成することに成功し、更にその抗体の混合物を用い
ることによって、凝集反応によるヒトヘモグロビンの特
異的検出法を可能にしたものである。すなわち、本発明
は、（１）ヒトヘモグロビンに特異的に反応するモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ、（２）ヒトヘモグロ
ビンに特異的に反応するモノクローナル抗体、（３）複
数の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体の混合物を
用いたゲル内沈降反応、もしくは該モノクローナル抗体
の混合物を担体に結合させ被検体と凝集反応を生ぜしめ
ることからなるヒトヘモグロビンの特異的検出法、およ
び（４）上記（３）記載の方法からなるヒト便内潜血検
出法に関し、従来各種動物を免疫して得たポリクローナ
ル抗体を担体に結合させて行っていた凝集反応を、ヒト
ヘモグロビンに特異的に反応する複数のモノクローナル
抗体を用いて行なうことによって検体中のヒトヘモグロ
ビンを精度高く、容易に検出を行なうものである。
らの問題点を解決すべく種々研究を重ねた結果、ヒトヘ
モグロビンに特異的に反応するモノクローナル抗体を複
数作成することに成功し、更にその抗体の混合物を用い
ることによって、凝集反応によるヒトヘモグロビンの特
異的検出法を可能にしたものである。すなわち、本発明
は、（１）ヒトヘモグロビンに特異的に反応するモノク
ローナル抗体産生ハイブリドーマ、（２）ヒトヘモグロ
ビンに特異的に反応するモノクローナル抗体、（３）複
数の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体の混合物を
用いたゲル内沈降反応、もしくは該モノクローナル抗体
の混合物を担体に結合させ被検体と凝集反応を生ぜしめ
ることからなるヒトヘモグロビンの特異的検出法、およ
び（４）上記（３）記載の方法からなるヒト便内潜血検
出法に関し、従来各種動物を免疫して得たポリクローナ
ル抗体を担体に結合させて行っていた凝集反応を、ヒト
ヘモグロビンに特異的に反応する複数のモノクローナル
抗体を用いて行なうことによって検体中のヒトヘモグロ
ビンを精度高く、容易に検出を行なうものである。
【０００５】モノクローナル抗体は通常一種類の抗体で
は凝集反応を起こしにくくヒトヘモグロビンの場合もゲ
ル内沈降反応によってそれを経験している。そこで二種
類のモノクローナル抗体を組合せ、ゲル内沈降反応によ
り沈降線を形成し、更に、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked
Immunosorbent Assay)によって他の動物ヘモグロビンと
反応しないことが確認された抗体の組み合せを選び、ラ
テックス担体へ結合させガラス凝集板上で検体液と反応
させ凝集の有無によってヒトヘモグロビンの検出を行な
った。上記の条件にて選ばれた二種類の抗体はヒトヘモ
グロビンに特異的に反応しブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ
のヘモグロビンには反応しなかった。ラテックス等の担
体を用いた凝集法は目視、又は、光学的に測定が可能で
あり応用範囲も広いものである。
は凝集反応を起こしにくくヒトヘモグロビンの場合もゲ
ル内沈降反応によってそれを経験している。そこで二種
類のモノクローナル抗体を組合せ、ゲル内沈降反応によ
り沈降線を形成し、更に、ＥＬＩＳＡ（Enzyme Linked
Immunosorbent Assay)によって他の動物ヘモグロビンと
反応しないことが確認された抗体の組み合せを選び、ラ
テックス担体へ結合させガラス凝集板上で検体液と反応
させ凝集の有無によってヒトヘモグロビンの検出を行な
った。上記の条件にて選ばれた二種類の抗体はヒトヘモ
グロビンに特異的に反応しブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ
のヘモグロビンには反応しなかった。ラテックス等の担
体を用いた凝集法は目視、又は、光学的に測定が可能で
あり応用範囲も広いものである。
【０００６】本発明のモノクローナル抗体の製造は次の
ような一般的な方法で行うことができる。抗原（ヘモグ
ロビン）は温血動物に対して、投与により抗体産生が可
能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与
される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フ
ロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバント
を投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、
計３〜10回程度行われる。用いられる温血動物として
は、たとえばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウ
ス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられる。
ような一般的な方法で行うことができる。抗原（ヘモグ
ロビン）は温血動物に対して、投与により抗体産生が可
能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与
される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フ
ロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバント
を投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、
計３〜10回程度行われる。用いられる温血動物として
は、たとえばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウ
ス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられる。
【０００７】このようにして免疫された温血動物、たと
えばマウスから、例えばＥＬＩＳＡ法により、抗体価の
認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓
またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細
胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗ヒトヘモグ
ロビン抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。融合操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルス
タインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (197
5)〕に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げ
られるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞
としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０など
があげられるが、特にＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。
用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数と
の好ましい比率は１：１〜20：１程度であり、ＰＥＧ
（好ましくはＰＥＧ1000〜ＰＥＧ6000）が10〜80％程度
の濃度で添加され、20〜40℃、好ましくは30〜37℃で１
〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融
合を実施できる。
えばマウスから、例えばＥＬＩＳＡ法により、抗体価の
認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓
またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細
胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、抗ヒトヘモグ
ロビン抗体産生ハイブリドーマを調製することができ
る。融合操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルス
タインの方法〔ネイチャー（Nature)、256、495 (197
5)〕に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレ
ングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げ
られるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞
としてはたとえばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０など
があげられるが、特にＰ３Ｕ１が好ましく用いられる。
用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数と
の好ましい比率は１：１〜20：１程度であり、ＰＥＧ
（好ましくはＰＥＧ1000〜ＰＥＧ6000）が10〜80％程度
の濃度で添加され、20〜40℃、好ましくは30〜37℃で１
〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融
合を実施できる。
【０００８】抗ヒトヘモグロビン抗体産生ハイブリドー
マのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、た
とえばヒトヘモグロビンを吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗免
疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウス
の場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）ま
たはプロテインＡを加え、固相に結合した抗ヒトヘモグ
ロビンモノクローナル抗体を検出するＥＩＡ法、抗免疫
グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相に
ハイブリドーマ培養上清を添加し、ＨＲＰで標識したヒ
トヘモグロビンを加え、固相に結合した抗ヒトヘモグロ
ビンモノクローナル抗体を検出するＥＩＡ法などがあげ
られる。抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体の選
別、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン）を添加して、10〜20％牛胎児血清を含む
動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ1640）で行われる。ハイ
ブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗ヒ
トヘモグロビン抗体価の測定と同様にして測定できる。
マのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、た
とえばヒトヘモグロビンを吸着させた固相（例、マイク
ロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した抗免
疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウス
の場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）ま
たはプロテインＡを加え、固相に結合した抗ヒトヘモグ
ロビンモノクローナル抗体を検出するＥＩＡ法、抗免疫
グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相に
ハイブリドーマ培養上清を添加し、ＨＲＰで標識したヒ
トヘモグロビンを加え、固相に結合した抗ヒトヘモグロ
ビンモノクローナル抗体を検出するＥＩＡ法などがあげ
られる。抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体の選
別、育種は通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン）を添加して、10〜20％牛胎児血清を含む
動物細胞用培地（例、ＲＰＭＩ1640）で行われる。ハイ
ブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗ヒ
トヘモグロビン抗体価の測定と同様にして測定できる。
【０００９】抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体の
分離精製は免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、
アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン
交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、ゲルろ過法、
抗原抗体結合物あるいはプロテインＡあるいはプロテイ
ンＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を
解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われ
る。このようにして作製された抗体は、ＩｇＧを主たる
成分とし、ＩｇＭ、ＩｇＡ等、他の免疫グロブリンも含
む。
分離精製は免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、
アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン
交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、ゲルろ過法、
抗原抗体結合物あるいはプロテインＡあるいはプロテイ
ンＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を
解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行われ
る。このようにして作製された抗体は、ＩｇＧを主たる
成分とし、ＩｇＭ、ＩｇＡ等、他の免疫グロブリンも含
む。
【００１０】抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体と
各動物ヘモグロビンとの反応性をＥＬＩＳＡ法、ＳＲＩ
Ｄ法（Single radial immuno diffusion）等を用いて検
討し、得られた抗体産生クローンのうちヒトヘモグロビ
ンと強く反応するクローンをセルロースアセテート膜電
気泳動等で選び、その中で他の動物ヘモグロビンとは反
応せずヒトヘモグロビンとのみ反応するクローンを選
ぶ。このＥＬＩＳＡ法により見出されたヒトヘモグロビ
ンとのみ反応するモノクローナル抗体を２種類組合せ
て、オクテロニー法でゲル内沈降反応を示すものを選択
し、その中で最も良い混合比をＳＲＩＤ法で検討する。
このようにしてヒトヘモグロビンとのみ反応するモノク
ローナル抗体をラテックスに結合させ、ヒトヘモグロビ
ンとの凝集反応の標準線を作成し、同様のラテックス凝
集反応を検体で行なってこの標準線から検体中のヒトヘ
モグロビン量を測定するものである。上記ラテックスへ
の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通
常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用い
られる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、
このラテックスの他、アガロース、デキストラン、セル
ロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリ
ルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等も
用いることもできる。
各動物ヘモグロビンとの反応性をＥＬＩＳＡ法、ＳＲＩ
Ｄ法（Single radial immuno diffusion）等を用いて検
討し、得られた抗体産生クローンのうちヒトヘモグロビ
ンと強く反応するクローンをセルロースアセテート膜電
気泳動等で選び、その中で他の動物ヘモグロビンとは反
応せずヒトヘモグロビンとのみ反応するクローンを選
ぶ。このＥＬＩＳＡ法により見出されたヒトヘモグロビ
ンとのみ反応するモノクローナル抗体を２種類組合せ
て、オクテロニー法でゲル内沈降反応を示すものを選択
し、その中で最も良い混合比をＳＲＩＤ法で検討する。
このようにしてヒトヘモグロビンとのみ反応するモノク
ローナル抗体をラテックスに結合させ、ヒトヘモグロビ
ンとの凝集反応の標準線を作成し、同様のラテックス凝
集反応を検体で行なってこの標準線から検体中のヒトヘ
モグロビン量を測定するものである。上記ラテックスへ
の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通
常蛋白質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用い
られる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、
このラテックスの他、アガロース、デキストラン、セル
ロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリ
ルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等も
用いることもできる。
【００１１】
【作用】本発明の方法によって便、尿等の検体中のヒト
ヘモグロビンを鋭敏に検出でき、大腸がん、腎疾患等の
検査等に有用である。
ヘモグロビンを鋭敏に検出でき、大腸がん、腎疾患等の
検査等に有用である。
【００１２】
【実施例】各種動物ヘモクロビンとしてヒト(Sigma No,
H-7379)、ウシ(Sigma No,H-2500)、ウマ(Sigma No,H-46
32)を、またニワトリヘモグロビンは、ＮＢＬニワトリ
保存血球を精製水により溶血させたものを用いた。 １．ハイブリドーマの作成 ＢＡＬＢ／Ｃ ６週齢 雌マウスの皮下又は腹腔へ、ヒト
ヘモグロビン100μgを等量のフロイントコンプリートア
ジュバント(ＦＣＡ)と共に数回免疫し最終免疫の４日後
に免疫された脾臓細胞を得た。凍結保存されたマウス骨
髄種細胞Ｐ３Ｕ１を融合の５日前に解凍し培養し対数増
殖期にある細胞と免疫された脾臓細胞を１：５の割合に
てポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法により融合し
た。すなわち、Ｐ３Ｕ１ 2×107と脾臓細胞 1×108を遠
心操作により集め５０％に希釈されたＰＥＧ（1500)１m
1によって１分間静かに撹拌しながら融合した。数分か
けてゆっくり希釈し遠心操作にて細胞を洗浄後96ウェル
マイクロプレート１５枚へ１ウェル当たり100μ１にな
るよう融合細胞浮遊液を蒔いた。同時に４週齢のマウス
より摘出した胸線細胞を１匹当たりプレート４枚の割合
でフィーダー細胞として用いた。培地はＲＰＭＩ1640、
１０％ＦＣＳ、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン）を用いてハイブリドーマが増殖するまで
３７℃、５％ＣＯ2で培養した。１２〜１５日後増殖し
たハイブリドーマの培養上清を前もって抗原を固相化し
た９６ウェルマイクロプートへ移し反応後酵素ラベル第
二抗体を用いスクリーニングを行った。すなわちヒトヘ
モグロビン１０μｇ／ｍｌ（0.15M NaClを含む10mM リ
ン酸緩衝液 PBS)をＥＬＩＳＡ用９６ウェルマイクロプ
レート(Falcon 3912)へ５０μ１ずつ入れ室温２時間又
は、４℃一晩固相化し抗原液を除いた後１％ＢＳＡ Ｐ
ＢＳを100μ1ずつ入れ室温で1時間以上ブロッキングを
行った。抗原プレートのブロツキング液を除去した後ハ
イブリドーマの増殖した９６マイクロプレートより培養
上清を５０μ１ずつプレートへ移し室温１時間反応させ
生理食塩水にて２回洗浄後2000倍希釈したアルカリホス
ファターゼ 標識ヤギ抗マウスＩgG(TAGO NO 4650)を５
０μ１ずつ入れ同様に反応させた。陽性コントロールと
しては融合の際採血したマウス血清を１００倍に希釈し
て用い、陰性コントロールとしては培養液を用いた。反
応終了後４回洗浄し基質液（シノテストALPローゼ フ
ェニルリン酸二ナトリウム４−アミノアンチピリン）を
50μ1入れ30分後呈色液(シノテストALPローゼメタ過ヨ
ーソ酸ナトリウム)を50μ1入れ発色させ活性の強いウェ
ルの細胞を24ウェルプレートへ移し培養した。数日後限
界希釈法によりクローニングを行い残った細胞は凍結保
存した。クローニングは96ウェルプレートの各ウェルへ
細胞が１コ又は５コ入る様に希釈しフィダー細胞を融合
時と同様に用いておこなった。およそ２週間後増殖した
１つのハイブリドーマの入ったウェルをスクリーニング
法同様にアッセイし陽性クローンを２４ウェルプレート
へ移し増殖させ、更にシャーレ(９０φ)にて培養後５×
106コの細胞を１週間前に０．５mlのプリスタンを腹腔
内注射したＢＡＬＢ／Ｃマウス１０週齢へ移植し腹水を
得た。ハイブリドーマの凍結には１０％ＤＭＳＯを加え
たＦＣＳを用い−８０℃で保存した。
H-7379)、ウシ(Sigma No,H-2500)、ウマ(Sigma No,H-46
32)を、またニワトリヘモグロビンは、ＮＢＬニワトリ
保存血球を精製水により溶血させたものを用いた。 １．ハイブリドーマの作成 ＢＡＬＢ／Ｃ ６週齢 雌マウスの皮下又は腹腔へ、ヒト
ヘモグロビン100μgを等量のフロイントコンプリートア
ジュバント(ＦＣＡ)と共に数回免疫し最終免疫の４日後
に免疫された脾臓細胞を得た。凍結保存されたマウス骨
髄種細胞Ｐ３Ｕ１を融合の５日前に解凍し培養し対数増
殖期にある細胞と免疫された脾臓細胞を１：５の割合に
てポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法により融合し
た。すなわち、Ｐ３Ｕ１ 2×107と脾臓細胞 1×108を遠
心操作により集め５０％に希釈されたＰＥＧ（1500)１m
1によって１分間静かに撹拌しながら融合した。数分か
けてゆっくり希釈し遠心操作にて細胞を洗浄後96ウェル
マイクロプレート１５枚へ１ウェル当たり100μ１にな
るよう融合細胞浮遊液を蒔いた。同時に４週齢のマウス
より摘出した胸線細胞を１匹当たりプレート４枚の割合
でフィーダー細胞として用いた。培地はＲＰＭＩ1640、
１０％ＦＣＳ、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン）を用いてハイブリドーマが増殖するまで
３７℃、５％ＣＯ2で培養した。１２〜１５日後増殖し
たハイブリドーマの培養上清を前もって抗原を固相化し
た９６ウェルマイクロプートへ移し反応後酵素ラベル第
二抗体を用いスクリーニングを行った。すなわちヒトヘ
モグロビン１０μｇ／ｍｌ（0.15M NaClを含む10mM リ
ン酸緩衝液 PBS)をＥＬＩＳＡ用９６ウェルマイクロプ
レート(Falcon 3912)へ５０μ１ずつ入れ室温２時間又
は、４℃一晩固相化し抗原液を除いた後１％ＢＳＡ Ｐ
ＢＳを100μ1ずつ入れ室温で1時間以上ブロッキングを
行った。抗原プレートのブロツキング液を除去した後ハ
イブリドーマの増殖した９６マイクロプレートより培養
上清を５０μ１ずつプレートへ移し室温１時間反応させ
生理食塩水にて２回洗浄後2000倍希釈したアルカリホス
ファターゼ 標識ヤギ抗マウスＩgG(TAGO NO 4650)を５
０μ１ずつ入れ同様に反応させた。陽性コントロールと
しては融合の際採血したマウス血清を１００倍に希釈し
て用い、陰性コントロールとしては培養液を用いた。反
応終了後４回洗浄し基質液（シノテストALPローゼ フ
ェニルリン酸二ナトリウム４−アミノアンチピリン）を
50μ1入れ30分後呈色液(シノテストALPローゼメタ過ヨ
ーソ酸ナトリウム)を50μ1入れ発色させ活性の強いウェ
ルの細胞を24ウェルプレートへ移し培養した。数日後限
界希釈法によりクローニングを行い残った細胞は凍結保
存した。クローニングは96ウェルプレートの各ウェルへ
細胞が１コ又は５コ入る様に希釈しフィダー細胞を融合
時と同様に用いておこなった。およそ２週間後増殖した
１つのハイブリドーマの入ったウェルをスクリーニング
法同様にアッセイし陽性クローンを２４ウェルプレート
へ移し増殖させ、更にシャーレ(９０φ)にて培養後５×
106コの細胞を１週間前に０．５mlのプリスタンを腹腔
内注射したＢＡＬＢ／Ｃマウス１０週齢へ移植し腹水を
得た。ハイブリドーマの凍結には１０％ＤＭＳＯを加え
たＦＣＳを用い−８０℃で保存した。
【００１３】２．セルロースアセテート膜電気泳動 腹水化されたハイブリドーマの抗体産性能、抗体の精製
検定にセルロース・アセテート膜電気泳動を用いた。セ
ルロゲル（生化学工業）をトリス−バルビタール緩衞液
ｐＨ８．６に平衡化し同じ緩衝液にて200Ｖ定電圧で２
０分泳動した後１０％アミドブラックＢにて染色、脱色
後判定した。腹水中の抗体とヒトヘモグロビンの反応は
腹水を塗布した部分へ一部重ねてヒトヘモグロビンを塗
布し同じ条件で泳動し抗原抗体反応によって変化した泳
動パターンより判定した。
検定にセルロース・アセテート膜電気泳動を用いた。セ
ルロゲル（生化学工業）をトリス−バルビタール緩衞液
ｐＨ８．６に平衡化し同じ緩衝液にて200Ｖ定電圧で２
０分泳動した後１０％アミドブラックＢにて染色、脱色
後判定した。腹水中の抗体とヒトヘモグロビンの反応は
腹水を塗布した部分へ一部重ねてヒトヘモグロビンを塗
布し同じ条件で泳動し抗原抗体反応によって変化した泳
動パターンより判定した。
【００１４】３．モノクローナル抗体の精製 腹水化したモノクローナル抗体の精製はＤＥＡＥイオン
交換クロマトグラフィーと塩析によって行なった。すな
わち、腹水１０ｍ１を２０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０（ＴＢ）にて透析し不溶
物を10,000rpm２０分の遠心操作によって除去した後同
じ緩衝液にて平衡化したＤＥ５２（ワットマン）２０ｍ
ｌのカラム流速３０ｍｌ／ｈｒ ３ｍｌフラクションに
て処理した。次いで６０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴＢにて
溶出後ＩｇＧを含むフラクションをプールし４０％飽和
硫安にて塩析し室温で１時間撹拌後10,000rpm２０分遠
心し沈殿を得た。同様に塩析操作を２回繰り返した後0.
15Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２
（PBS）に充分透析後、精製ＩｇＧを得た。精製ＩｇＧ
はセルロース・アセテート膜電気泳動によって単一であ
ることを確認した。ＩｇＧ濃度はＡ280１％＝１４にて
調製し１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で４℃に保存した。
交換クロマトグラフィーと塩析によって行なった。すな
わち、腹水１０ｍ１を２０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０（ＴＢ）にて透析し不溶
物を10,000rpm２０分の遠心操作によって除去した後同
じ緩衝液にて平衡化したＤＥ５２（ワットマン）２０ｍ
ｌのカラム流速３０ｍｌ／ｈｒ ３ｍｌフラクションに
て処理した。次いで６０ｍＭ ＮａＣｌを含むＴＢにて
溶出後ＩｇＧを含むフラクションをプールし４０％飽和
硫安にて塩析し室温で１時間撹拌後10,000rpm２０分遠
心し沈殿を得た。同様に塩析操作を２回繰り返した後0.
15Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．２
（PBS）に充分透析後、精製ＩｇＧを得た。精製ＩｇＧ
はセルロース・アセテート膜電気泳動によって単一であ
ることを確認した。ＩｇＧ濃度はＡ280１％＝１４にて
調製し１０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で４℃に保存した。
【００１５】４．ＩｇＧサブクラスの同定 生化学工業のＥＬＩＳＡ法によるサブクラスタイピング
キットを用い操作法に従って行った。 ５．ＥＬＩＳＡ法 抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体と各動物ヘモグ
ロビンとの反応性は、ＥＬＩＳＡ法を用いて検討した。
すなわち各動物ヘモグロビン（ウシ、ブタ、ウマ、ト
リ）をＰＢＳにて１０μｇ／ｍｌ又は、０．０１％に調
整し９６ウェルマイクロプレートヘ５０μ１ずつ入れ室
温で２時間固相化した。続いて１％ＢＳＡ−ＰＢＳ １
００μ１にて室温１時間ブロッキングした後、10,000ｎ
ｇ／ｍｌより倍々希釈した精製モノクローナル抗体を５
０μ１ずつ入れ反応させた。室温にて１時間反応後生理
食塩水にて２回洗浄し、2,000倍希釈したアルカリホス
ファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを５０μ１添加し室
温１時間反応させ同様に４回洗浄後基質液を入れ呈色液
にて発色させイムノリーダー（日本インターメット）に
て510および620nmで測定した。
キットを用い操作法に従って行った。 ５．ＥＬＩＳＡ法 抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体と各動物ヘモグ
ロビンとの反応性は、ＥＬＩＳＡ法を用いて検討した。
すなわち各動物ヘモグロビン（ウシ、ブタ、ウマ、ト
リ）をＰＢＳにて１０μｇ／ｍｌ又は、０．０１％に調
整し９６ウェルマイクロプレートヘ５０μ１ずつ入れ室
温で２時間固相化した。続いて１％ＢＳＡ−ＰＢＳ １
００μ１にて室温１時間ブロッキングした後、10,000ｎ
ｇ／ｍｌより倍々希釈した精製モノクローナル抗体を５
０μ１ずつ入れ反応させた。室温にて１時間反応後生理
食塩水にて２回洗浄し、2,000倍希釈したアルカリホス
ファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを５０μ１添加し室
温１時間反応させ同様に４回洗浄後基質液を入れ呈色液
にて発色させイムノリーダー（日本インターメット）に
て510および620nmで測定した。
【００１６】６．オクテルロニー法 直径９０ｍｍのプラスチックシャーレへ厚さ２ｍｍとな
る様に１％アガロース（10mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ7.6
0.15M NaCl)を入れプレートを作成した。10μ1の試料が
入る穴を3mmの間隔であけ試料添加後室温にて一晩反応
させイムノビュワーにて観察し写真撮影した。抗原のヒ
トヘモグロビンは1mg/mlを用い、精製モノクローナル抗
体は10mg/mlを混合して実験に用いた。
る様に１％アガロース（10mMトリス塩酸緩衝液ｐＨ7.6
0.15M NaCl)を入れプレートを作成した。10μ1の試料が
入る穴を3mmの間隔であけ試料添加後室温にて一晩反応
させイムノビュワーにて観察し写真撮影した。抗原のヒ
トヘモグロビンは1mg/mlを用い、精製モノクローナル抗
体は10mg/mlを混合して実験に用いた。
【００１７】７.ＳＲＩＤ法 加熱溶解した１％アガロース（10mMトリス塩酸緩衝液pH
7.6 0.15MNaCl)を50℃に保温しヒトヘモグロビンを50μ
g/mlになるように添加した厚さ2mmの抗原プレートを作
成した。試料は各濃度で混合した精製モノクローナル抗
体を10μ1入れ室温にて24時間反応させ沈降輪を形成さ
せた。イムノビュワーにて観察後食塩水にて洗浄しアミ
ドブラックB10にて染色後判定した。
7.6 0.15MNaCl)を50℃に保温しヒトヘモグロビンを50μ
g/mlになるように添加した厚さ2mmの抗原プレートを作
成した。試料は各濃度で混合した精製モノクローナル抗
体を10μ1入れ室温にて24時間反応させ沈降輪を形成さ
せた。イムノビュワーにて観察後食塩水にて洗浄しアミ
ドブラックB10にて染色後判定した。
【００１８】８．ラテックス凝集反応 10mMトリス塩酸緩衝液pH8.0にて透析したラテックス(日
本合成ゴム)1％溶液に同じ緩衝液にて調製したモノクロ
ーナル抗体1mg/mlを加え室温にて2時間撹拌し結合させ
た。1000gにて2時間の遠心操作により洗浄した後0.01％
ＢＳＡ、0.15MNaClを含む10mMトリス塩酸緩衝液pH7.4
(0.1%NaN3)でラテックス１％溶液に調整し少量ずつ小分
けして4℃にて保存した。凝集反応はラテックス凝集用
ガラス板又はスライドグラス上で行い、各動物ヘモグロ
ビン溶液又は各濃度に調整されたヒトヘモグロビン溶液
をモノクローナル抗体結合ラテックス溶液とガラス板上
で混合し凝集の有無及びその強さを判定した。
本合成ゴム)1％溶液に同じ緩衝液にて調製したモノクロ
ーナル抗体1mg/mlを加え室温にて2時間撹拌し結合させ
た。1000gにて2時間の遠心操作により洗浄した後0.01％
ＢＳＡ、0.15MNaClを含む10mMトリス塩酸緩衝液pH7.4
(0.1%NaN3)でラテックス１％溶液に調整し少量ずつ小分
けして4℃にて保存した。凝集反応はラテックス凝集用
ガラス板又はスライドグラス上で行い、各動物ヘモグロ
ビン溶液又は各濃度に調整されたヒトヘモグロビン溶液
をモノクローナル抗体結合ラテックス溶液とガラス板上
で混合し凝集の有無及びその強さを判定した。
【００１９】９．ハイブリド−マの樹立 数回の融合実験において約５０の抗体産生クローンを選
びマウス腹水化を行い抗原とを交差させたセルロースア
セテート膜電気泳動にてヒトヘモグロビンと強く反応す
るクローン１０種類（ＳＵ−１０１〜１１０）を選ん
だ。更にＥＬＩＳＡ法により他の動物ヘモグロビンの反
応性を検討しヒトヘモグロビンとのみ反応するクローン
ＳＵ−１０４、ＳＵ−１０７、ＳＵ−１１０を樹立した
（表１、図１）。これらのハイブリドーマは平成３年１
２月４日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所（ＦＲＩ）に各々受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６２
６、ＦＥＲＭ Ｐ−１２６２７、ＦＥＲＭ Ｐ−１２６
２８として寄託されている。なお、図１のセルロースア
セテート膜電気泳動図のパタ−ンを模式的に説明したの
が図２である。該図中、各レーン左半分の最下位のバン
ドがモノクローナル抗体バンドを示す。ヘモグロビンを
重ねて泳動した時に（＋）側へ早く移動するヘモグロビ
ンに引かれて（抗原・抗体反応を生じ）抗体バンドが移
動、あるいは元の位置より消失することによって反応の
有無を検定することができる。抗原・抗体結合物の移動
度はヘモグロビンより早い場合と同じ位の場合とがあ
る。
びマウス腹水化を行い抗原とを交差させたセルロースア
セテート膜電気泳動にてヒトヘモグロビンと強く反応す
るクローン１０種類（ＳＵ−１０１〜１１０）を選ん
だ。更にＥＬＩＳＡ法により他の動物ヘモグロビンの反
応性を検討しヒトヘモグロビンとのみ反応するクローン
ＳＵ−１０４、ＳＵ−１０７、ＳＵ−１１０を樹立した
（表１、図１）。これらのハイブリドーマは平成３年１
２月４日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所（ＦＲＩ）に各々受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１２６２
６、ＦＥＲＭ Ｐ−１２６２７、ＦＥＲＭ Ｐ−１２６
２８として寄託されている。なお、図１のセルロースア
セテート膜電気泳動図のパタ−ンを模式的に説明したの
が図２である。該図中、各レーン左半分の最下位のバン
ドがモノクローナル抗体バンドを示す。ヘモグロビンを
重ねて泳動した時に（＋）側へ早く移動するヘモグロビ
ンに引かれて（抗原・抗体反応を生じ）抗体バンドが移
動、あるいは元の位置より消失することによって反応の
有無を検定することができる。抗原・抗体結合物の移動
度はヘモグロビンより早い場合と同じ位の場合とがあ
る。
【００２０】 クローン サブクラス ヒト ウシ ブタ ウマ トリ ＳＵ−１０１ ＩｇＧ1 ＋＋ ± − ± − １０２ ＩｇＧ1 ＋＋ ＋ − − − １０３ ＩｇＧ1 ＋＋ − − ± − １０４ ＩｇＧ1 ＋＋ − − − − １０５ ＩｇＧ2b ＋＋ ＋ − ＋ − １０６ ＩｇＧ1 ＋＋ − − ± − １０７ ＩｇＧ1 ＋＋ − − − − １０８ ＩｇＧ1 ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ １０９ ＩｇＧ1 ＋＋ ＋＋ − ＋＋ − １１０ ＩｇＧ1 ＋＋ − − − − １０．モノクローナル抗体の製造 ハイブリドーマ（ＳＵ−１０１〜１１０）をそれぞれマ
ウス腹控に移植し１０〜１４日後に一匹あたり数ｍｌの
腹水液を採取し、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィ
ーと塩析によりＩｇＧに精製し１０ｍｇ／ｍｌの濃度に
調製したモノクローナル抗体を得た。
ウス腹控に移植し１０〜１４日後に一匹あたり数ｍｌの
腹水液を採取し、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィ
ーと塩析によりＩｇＧに精製し１０ｍｇ／ｍｌの濃度に
調製したモノクローナル抗体を得た。
【００２１】１１．オクテロニー法 ２種類のモノクローナル抗体を等量混合したオクテロニ
ー法により表２に示す１２通りの組み合わせによりゲル
内沈降反応が確認された。
ー法により表２に示す１２通りの組み合わせによりゲル
内沈降反応が確認された。
【００２２】 表２ 組み合わせ 組み合わせ ＳＵ−１０１＋１０７ ＳＵ−１０３＋１０９ １０２＋１０３ １０４＋１０６ １０２＋１０６ １０４＋１１０ １０２＋１１０ １０６＋１０７ １０３＋１０４ １０６＋１０９ １０３＋１０７ １０９＋１１０ １２．ＳＲＩＤ法 ＥＬＩＳＡ法による結果より動物ヘモグロビンとの反応
性がなくかつ沈降反応を示すＳＵ−１０４＋１１０の組
み合わせについてＳＲＩＤ法により最適混合比を検討し
たところ、以下のように８：２〜２：８が実用的であ
り、中でも１：１で最大の輪径が観察され最も好ましい
と言うことができる。 SU-104:110 8:2 7:3 6:4 5:5 4:6 3:7 2:8 SRIDφ(mm) 6.4 8.5 9.0 9.6 8.7 8.5 7.2 １３．ラテックス凝集反応 ＳＵ−１０４、１１０を等量混合した抗体液１ｍｇ／ｍ
ｌを感作した１％ラテックス溶液を用いてスライドグラ
ス上で凝集反応を行った。０．０１％ＢＳＡ ＰＢＳに
て１００μｇ／ｍｌに調整した各種動物ヘモグロビン３
０μｌとモノクローナル抗体結合ラテックス溶液３０μ
ｌをよく混合し３分後に形成された凝集の有無を観察し
たところウシ、ブタ、ウマ、ニワトリヘモグロビンでは
凝集が観察されずヒトヘモグロビンとのみ反応がみられ
た。ヒトヘモグロビンの希釈率を変えて起こる凝集反応
を見たところ、１μｇ／ｍｌの濃度まで反応がみられＳ
Ｕ−１０４、１１０を混合して用いたラテックス凝集反
応系の感度はおよそ１μｇ／ｍｌであることが分かっ
た。 （１）ヘモグロビン ヒト ウシ ブタ ウマ トリ 凝集の強さ +++ − − − − （２）ヒトＨｂ(μg/ml) 1000 100 10 1 0.1 0.01 0.001 凝集の強さ +++ +++ ++ + ± - - なお、ＳＵ−１０７と１１０の組合せでも１０４と１１
０同様の効果が得られた。
性がなくかつ沈降反応を示すＳＵ−１０４＋１１０の組
み合わせについてＳＲＩＤ法により最適混合比を検討し
たところ、以下のように８：２〜２：８が実用的であ
り、中でも１：１で最大の輪径が観察され最も好ましい
と言うことができる。 SU-104:110 8:2 7:3 6:4 5:5 4:6 3:7 2:8 SRIDφ(mm) 6.4 8.5 9.0 9.6 8.7 8.5 7.2 １３．ラテックス凝集反応 ＳＵ−１０４、１１０を等量混合した抗体液１ｍｇ／ｍ
ｌを感作した１％ラテックス溶液を用いてスライドグラ
ス上で凝集反応を行った。０．０１％ＢＳＡ ＰＢＳに
て１００μｇ／ｍｌに調整した各種動物ヘモグロビン３
０μｌとモノクローナル抗体結合ラテックス溶液３０μ
ｌをよく混合し３分後に形成された凝集の有無を観察し
たところウシ、ブタ、ウマ、ニワトリヘモグロビンでは
凝集が観察されずヒトヘモグロビンとのみ反応がみられ
た。ヒトヘモグロビンの希釈率を変えて起こる凝集反応
を見たところ、１μｇ／ｍｌの濃度まで反応がみられＳ
Ｕ−１０４、１１０を混合して用いたラテックス凝集反
応系の感度はおよそ１μｇ／ｍｌであることが分かっ
た。 （１）ヘモグロビン ヒト ウシ ブタ ウマ トリ 凝集の強さ +++ − − − − （２）ヒトＨｂ(μg/ml) 1000 100 10 1 0.1 0.01 0.001 凝集の強さ +++ +++ ++ + ± - - なお、ＳＵ−１０７と１１０の組合せでも１０４と１１
０同様の効果が得られた。
【００２３】
【効果】ヒトヘモグロビンと特異的に反応する複数のモ
ノクローナル抗体の混合物を担体に結合させたものを用
いることによって、ヒトヘモグロビン特異凝集反応を精
度よく簡単に行うことができた。この方法によって、生
体試料中のヒトヘモグロビンを特異的に、かつ高感度で
測定できヒト便、尿中のヘモグロビンの測定に利用で
き、大腸癌や腎疾患等の診断に応用できる。
ノクローナル抗体の混合物を担体に結合させたものを用
いることによって、ヒトヘモグロビン特異凝集反応を精
度よく簡単に行うことができた。この方法によって、生
体試料中のヒトヘモグロビンを特異的に、かつ高感度で
測定できヒト便、尿中のヘモグロビンの測定に利用で
き、大腸癌や腎疾患等の診断に応用できる。
【図１】本発明のハイブリドーマを選択するに当って行
なったセルロースアセテート膜電気泳動図である。
なったセルロースアセテート膜電気泳動図である。
【図２】図１のパタ−ンを模式的に説明した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 5/20 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (6)
- 【請求項１】ヒトヘモグロビンに特異的に反応するモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ。 - 【請求項２】ヒトヘモグロビンに特異的に反応するモノ
クローナル抗体。 - 【請求項３】複数の抗ヒトヘモグロビンモノクローナル
抗体の混合物を用い被検体と反応させることからなる、
ヒトヘモグロビンの検出方法。 - 【請求項４】反応がゲル内沈降反応である請求項３記載
のヒトヘモグロビンの検出方法。 - 【請求項５】反応が凝集反応である請求項３記載のヒト
ヘモグロビンの検出方法。 - 【請求項６】被検体がヒト便である請求項４記載の方法
からなるヒト便内潜血検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3322900A JPH06113830A (ja) | 1991-12-06 | 1991-12-06 | ヒトヘモグロビンの特異的検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3322900A JPH06113830A (ja) | 1991-12-06 | 1991-12-06 | ヒトヘモグロビンの特異的検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113830A true JPH06113830A (ja) | 1994-04-26 |
Family
ID=18148874
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3322900A Pending JPH06113830A (ja) | 1991-12-06 | 1991-12-06 | ヒトヘモグロビンの特異的検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06113830A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015145916A1 (ja) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | 京セラ株式会社 | Ｒｎａアプタマーおよびそれを用いたセンサ |
| JP2016514831A (ja) * | 2013-03-20 | 2016-05-23 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | マウス血清中のラット抗体の特異的検出 |
| WO2021107105A1 (ja) | 2019-11-29 | 2021-06-03 | 積水メディカル株式会社 | 免疫反応を利用したアナライトの測定方法及び測定試薬 |
-
1991
- 1991-12-06 JP JP3322900A patent/JPH06113830A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016514831A (ja) * | 2013-03-20 | 2016-05-23 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | マウス血清中のラット抗体の特異的検出 |
| US10502746B2 (en) | 2013-03-20 | 2019-12-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Specific detection of rat antibodies in mouse serum |
| WO2015145916A1 (ja) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | 京セラ株式会社 | Ｒｎａアプタマーおよびそれを用いたセンサ |
| JPWO2015145916A1 (ja) * | 2014-03-28 | 2017-04-13 | 京セラ株式会社 | Ｒｎａアプタマー、ならびにそれを用いたセンサおよび検出方法 |
| WO2021107105A1 (ja) | 2019-11-29 | 2021-06-03 | 積水メディカル株式会社 | 免疫反応を利用したアナライトの測定方法及び測定試薬 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20000331 |