WO2021107105A1 - 免疫反応を利用したアナライトの測定方法及び測定試薬 - Google Patents

免疫反応を利用したアナライトの測定方法及び測定試薬 Download PDF

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WO2021107105A1
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antibody
pivka
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monoclonal
antibodies
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智英 浅井
剛広 田中
郁美 鈴木
理子 妹尾
智之 臼井
知 清水
宮崎　修
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積水メディカル株式会社
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    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring an analysis using an immune reaction and a measurement reagent. More specifically, in a sandwich immunoassay method using a first antibody and a second antibody, an antibody that recognizes a linear epitope and an antibody that recognizes a higher-order structure epitope are mixed as the first antibody and / or the second antibody. It relates to the measuring method and measuring reagent of the antibody used.
  • PIVKA-II refers to a protein that does not have coagulation factor activity among prothrombin, which is a blood coagulation factor II, and is also called abnormal prothrombin.
  • Prothrombin is synthesized in the liver and requires the conversion of glutamate (Glu) residues to ⁇ -carboxyglutamic acid (Gla) residues by vitamin K-dependent ⁇ -glutamylcarboxylase during its production.
  • Glu glutamate
  • Ga ⁇ -carboxyglutamic acid
  • PIVKA-II was initially found in the blood of patients treated with vitamin K deficiency or vitamin K antagonists.
  • PIVKA-II is an abbreviation for protein induced by Vitamin Kabsence or antagonist-II, and is also called des- ⁇ -carboxy prothrombin (DCP) (References: Weitz, I. 1993) Hepatology 18, 990-997, Suzuki M, Shiraha H, Fujikawa T, Takaoka N, Ueda N, Nakanishi Y, Koike K, Takaki A, Shiratori Y .; J Biol Chem. 2005 Feb 25; 280 6409-15, A. Nakao, A. Virji, Y. Iwaki, B. Carr, S. Iwatsuki, and E. Starzl; Hepatogastroenterology. 1991 October; 38 (5): 450-453).
  • DCP des- ⁇ -carboxy prothrombin
  • Picormi registered trademark
  • PIVKA-II MONO kit (Sekisui Medical Co., Ltd.) is on the market as a reagent for specifically measuring PIVKA-II in a sample.
  • This product uses an anti-PIVKA-II mouse monoclonal antibody-bound bead as a solid phase and is electrochemically luminescent by the sandwich method using an anti-protrombin mouse monoclonal antibody labeled with a ruthenium (Ru) complex that emits light by electrochemical changes.
  • the measurement principle is the measurement method (ECLIA).
  • the measurement range of the PIVKA-II MONO kit of Pikorumi is 10 to 75,000 mAU / mL, and it is characterized by high sensitivity and a wide measurement range.
  • the upper limit of the PIVKA-II standard in serum or plasma of healthy adults is 28 mAU / mL
  • the cutoff value calculated from the sensitivity and specificity in patients with hepatocellular carcinoma, cirrhosis, and chronic hepatitis is 40 mAU / mL.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-13830 can perform a human hemoglobin-specific agglutination reaction accurately and easily by using a mixture of a plurality of monoclonal antibodies that specifically react with human hemoglobin bound to a carrier. It discloses that human hemoglobin in a biological sample can be measured specifically and with high sensitivity, can be used for measuring hemoglobin in human stool and urine, and can be applied to diagnosis of colon cancer, renal disease, and the like.
  • the present inventors have been diligently working on the development of a highly sensitive measurement method for PIVKA-II, and when a plurality of labeled monoclonal antibodies are used in a sandwich immunoassay method using a first antibody and a second antibody, the present inventors have been working diligently. It was noticed that there were some combinations in which the sensitivity was significantly improved and some combinations in which the sensitivity was not significantly improved as compared with the case where these multiple antibodies were used alone.
  • the antibody combination that significantly improved the sensitivity was a combination of a monoclonal antibody that recognizes a linear epitope and a monoclonal antibody that recognizes a higher-order structural epitope.
  • the present invention was completed.
  • the problem to be solved by the present invention is to improve the sensitivity when the analyst in the sample is measured by the sandwich immunoassay method.
  • the problem to be solved by the present invention is to improve the sensitivity of the measurement, especially when the cutoff value of the analyst is located near the lower limit of the measurement range of the measurement method. ..
  • the present inventors have conducted a first method in a sandwich immunoassay method using a first antibody (singular or plural; the same applies hereinafter) and a second antibody (singular or plural; the same applies hereinafter).
  • a first antibody single or plural; the same applies hereinafter
  • a second antibody single or plural; the same applies hereinafter.
  • the sensitivity can be significantly improved by using one or both of the antibody or the second antibody as a mixture of a monoclonal antibody that recognizes a linear epitope and a monoclonal antibody that recognizes a higher-order structural epitope, and completes the present invention. It came to. That is, the present invention has the following configuration.
  • [Phase 1] A sandwich immunoassay for measuring analysts using first and second antibodies, in which one or both of the first and second antibodies are monoclonal antibodies and higher-order structures that recognize linear epitopes.
  • a sandwich immunoassay a mixture of monoclonal antibodies that recognize epitopes.
  • Sandwich immunoassay for measuring analytes in a sample including the following steps: The process of providing the sample; A step of contacting the sample with the first antibody to provide the first reactant; Optionally, a step of recovering the first antibody-analyte complex contained in the first reaction product; The step of contacting the first antibody or the first antibody-analyte complex with the second antibody to provide the second reaction; The step of recovering the first antibody-analyte-second antibody complex contained in the second reaction product; and the signal of the label of the recovered first antibody-analyte-second antibody complex are measured.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies having different epitopes on the analyst.
  • first antibody and the second antibody is a mixture of a monoclonal antibody that recognizes a linear epitope and a monoclonal antibody that recognizes a higher-order structural epitope.
  • first antibody is a solid phase antibody.
  • second antibody is a solid phase antibody.
  • Embodiment 5 The method according to any one of embodiments 1 to 3, wherein the second antibody is a labeled antibody.
  • Embodiment 6 The method according to any one of embodiments 1, 2, and 4, wherein the first antibody is a labeled antibody.
  • FIG. 7 The method according to any one of embodiments 1 to 6, wherein the analyst is PIVKA-II.
  • the monoclonal antibody that recognizes the linear epitope is a peptide having the sequence of the 26th to 44th amino acids of PIVKA-II ((E / ⁇ ) AF (E / ⁇ ) AL (E / ⁇ ) SSTATDVF WAKY).
  • the monoclonal antibody that recognizes the higher-order structural epitope is the 33rd to 45th amino acid sequence (SSTATDVFWAKYT) of PIVKA-II, the 35th to 45th amino acid sequence (TATDVFWAKYT), or the 35th.
  • a sandwich immunoassay reagent for measuring an analysis comprising a first antibody and a second antibody, wherein one or both of the first antibody and the second antibody are monoclonal antibodies and high high antibodies that recognize linear epitopes.
  • a reagent for sandwich immunoassay which is a mixture of monoclonal antibodies that recognize next-structure epitopes.
  • Embodiment 11 The method according to any one of embodiments 1 to 9, or the reagent according to embodiment 10, wherein the mixture is a mixture of two monoclonal antibodies derived from two hybridomas.
  • Embodiment 12 Embodiment 1: The monoclonal antibody that recognizes the linear epitope is a monoclonal antibody derived from the first hybridoma, and the monoclonal antibody that recognizes the higher-order structural epitope is a monoclonal antibody derived from the second hybridoma. The method according to any one of 9 to 9, or the reagent according to embodiment 10.
  • the present invention more accurate measurement of analytes is possible.
  • the cut-off value of the relevant analyst is located near the lower limit of the measurement range of the existing sandwich immunoassay method using the first antibody and the second antibody, it assists in the diagnosis or diagnosis of the disease / clinical condition. , Can be done with higher reliability.
  • Ru-labeled anti-F1 antibody only for monoclonal antibodies that recognize linear epitopes or monoclonal antibodies that recognize higher-order structural epitopes, based on the measured values (counts) of standard antigen solutions of 10 mAU / mL, 100 mAU / mL, and 1000 mAU / mL. (1) and a mixture of a monoclonal antibody that recognizes a linear epitope and a monoclonal antibody that recognizes a higher-order structural epitope are used as a Ru-labeled anti-F1 antibody (2). is there.
  • First antibody / second antibody As used herein, the term “first antibody” means one antibody of a sandwich structure (antibody-analyte-antibody complex) formed by sandwich immunoassay.
  • the term “second antibody” means the other antibody that forms a complex with the first antibody via an analysis. That is, in the sandwich structure, the first antibody and the second antibody sandwich the analyst.
  • first antibody means, in one embodiment, the first monoclonal antibody. In this case, the "first antibody” is not a mixture of multiple monoclonal antibodies.
  • first antibody means a set of first monoclonal antibodies. In this case, the "first antibody” is a mixture of multiple monoclonal antibodies.
  • sample means a biological sample of a mammal, preferably a human.
  • the biological sample may be any sample in which prothrombin may be present (for example, a sample derived from a tissue expressing prothrombin, a body fluid in which prothrombin is circulated, etc.), but blood or serum. , Plasma, or lymph is preferred.
  • the object to be measured is not particularly limited as long as it is a molecule that can utilize the antigen-antibody reaction, for example, PIVKA-II, prothrombin, CRP (C-reactive protein), Lp (a), MMP3 (matrix metalloproteinase 3).
  • Type IV collagen Type IV collagen, PSA (proteospecific antigen), BNP (cerebral sodium diuretic peptide), insulin, microalbumin, cystatin C, antiphospholipid antibody, antitreponema paridum antibody, FDP (fibrin fibrinogen degradation product), D Dimer, SF (soluble fibrin), TAT (thrombin-antithrombin III complex), factor XIII, pepsinogen I / II and the like.
  • PSA proteospecific antigen
  • BNP cerebral sodium diuretic peptide
  • insulin microalbumin
  • cystatin C antiphospholipid antibody
  • antitreponema paridum antibody FDP (fibrin fibrinogen degradation product)
  • D Dimer D Dimer
  • SF soluble fibrin
  • TAT thrombin-antithrombin III complex
  • factor XIII pepsinogen I / II and the like.
  • PIVKA-II When used herein as "PIVKA-II", it means mammalian, preferably human PIVKA-II.
  • Prothrombin In the present specification, both normal and abnormal prothrombin are collectively referred to as “prothrombin”. Further, in the present specification, "abnormal prothrombin” means PIVKA-II, and “normal prothrombin” means prothrombin other than PIVKA-II.
  • Sandwich immunoassay The term “sandwich immunoassay” as used herein is used in a manner well known to those of skill in the art.
  • an immunoassay that allows specific measurements of ananalyte by binding both the first and second antibody to the analyst to form a so-called “sandwich” structure.
  • sandwich immunoassays known to those skilled in the art include electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), latex turbidity immunoassay (LTIA), and lateral flow immunoassay.
  • ELIA electrochemiluminescence immunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • LTIA latex turbidity immunoassay
  • lateral flow immunoassay can be mentioned.
  • Linear epitope As used herein, the term “linear epitope” means a site of an antigen to which an antibody recognizes or binds, and is formed by the primary structure of a protein or polypeptide.
  • higher-order structural epitopes When used herein as “higher-order structural epitopes,” the native antibody is the site of the antigen that the antibody recognizes or binds to and does not react with the linear peptide from which the primary structure of the protein has been extracted. Means a site that reacts in an antigen having a higher-order structure. As used herein, the term “conformation” is used synonymously with the term “higher order structure”.
  • Monoclonal antibody As used herein, the term "a / the monoclonal antibody” means a collection of immunoglobulin molecules of a single molecular species having the same structure.
  • the term "monoclonal antibody” as used herein may be the antibody itself, but it may also be a fragment having an antigen-binding activity such as a Fab fragment or an F (ab') 2 fragment.
  • the monoclonal antibody may be obtained by classical immunization of a non-human animal with an antigen, or by a gene recombination technique, a gene immunization method, or the like, regardless of the acquisition method.
  • the antibody may be bound to a known labeling substance such as ruthenium (Ru) complex, peroxidase, alkaline phosphatase, biotin, metal colloid, FITC and the like.
  • a known labeling substance such as ruthenium (Ru) complex, peroxidase, alkaline phosphatase, biotin, metal colloid, FITC and the like.
  • the "reagent containing an antibody” may contain an appropriate salt, buffer, preservative, surfactant, reducing agent, cryoprotectant and the like.
  • the use of two types of monoclonal antibodies is mandatory, but this is not intended to exclude the use of the third and subsequent types.
  • the two types of monoclonal antibodies used by immobilizing on the carrier particles are further formulated in a free state without being immobilized on the carrier particles.
  • Immobilization As used herein, the term “immobilization” is used interchangeably with “immobilization” or “sensitization.”
  • Carrier particles Examples of the carrier particles (insoluble carrier) used in the present invention include magnetic beads, organic polymer powder, inorganic substance powder, microorganisms, blood cells, cell debris and the like.
  • examples of the organic polymer powder include natural polymer powders such as insoluble agarose, cellulose, and insoluble dextran, polystyrene, styrene-styrene sulfonate copolymer, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer, and vinyl chloride-acrylic acid.
  • Examples thereof include synthetic polymer powders such as ester copolymers and vinyl acetate-acrylic acid ester copolymers, and latex particles in which the synthetic polymer powder is uniformly suspended are particularly preferable.
  • examples of the inorganic substance powder include metal pieces such as gold, titanium, iron and nickel, silica, alumina, carbon powder and the like.
  • the average particle size of the insoluble carrier is usually 0.05 to 10.0 ⁇ m.
  • the particle size and material of the two carrier particles carrying the two monoclonal antibodies may be the same or different.
  • Preparation method As the anti-PIVKA-II monoclonal antibody (MU-3 antibody), an antibody prepared by the method itself described in Example 1 of Japanese Patent Publication No. 5-43357 was used.
  • PIVKA-II 50 ⁇ g was intraperitoneally administered to BALB / C mice (female, 4 weeks old) together with the same volume of Freund's complete azimuth band, and 2 weeks later, PIVKA-II (15 ⁇ g) was injected into the tail vein. After administration, splenocytes were excised 3 days later and fused with the tumor cell line P3U1. Cell fusion was performed by a method such as Watanabe using polyethylene glycol 4000. Next, cloning was performed three times using a 96-well microplate by the limiting dilution method. For the assay for cloning, the decarboxylated human prothrombin in A and finally the native PIVKA-II were used.
  • screening for anti-PIVKA-II antibodies produced by hybridomas obtained by immunizing PIVKA-II is performed on decarboxylated human prothrombin and ultimately native PIVKA-II. It was done through an assay for cloning the antibody-producing hybridoma used.
  • the epitope site of the MU-3 antibody was found in the detailed study of the binding ability using peptide fragments of various lengths synthesized based on the Gla region amino acid sequence of PIVKA-II. It has been identified and confirmed as "the decarboxyl peptide site at position 23" (Japanese Patent Laid-Open No. 7-20127). Therefore, in addition to the native PIVKA-II and decarboxylated human prothrombin described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-43357, various compounds synthesized based on the Gla region amino acid sequence of PIVKA-II described in JP-A-7-20127.
  • Anti-PIVKA-II antibody can be screened by appropriately combining peptide fragments of the same length and comparing and confirming the binding ability of the antibody to substances other than PIVKA-II and PIVKA-II. As a result, a new anti-PIVKA-II antibody other than the MU-3 antibody can be obtained.
  • This specification includes the entire description of Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-43357 (Japanese Patent Publication No. 5-43357) and Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-20127 for reference.
  • anti-PIVKA-II antibodies are known in addition to MU-3.
  • the 2G4 antibody described in JP-A-9-43237, the antibody described in JP-A-60-60557, and the antibody described in JP-A-7-313186 are also anti-PIVKA-II antibodies of the present invention. It is considered that it can be used as.
  • ⁇ Monclonal antibody (anti-prothrombin F1 region antibody): 242202 antibody, 242203 antibody, 242205 antibody, 242206 antibody>
  • Preparation method i) Preparation of hybridoma Purified silk moth expression PIVKA-II (manufactured by Ozeki Co., Ltd.) or synthetic peptide (amino acid sequence at positions 29-47) (SEQ ID NO: 1) and Freund's complete adjuvant (manufactured by GIBCO) ) And 1 to 1 were mixed and emulsified to form an emulsion, which was subcutaneously administered to 8-week-old female BALB / C mice (manufactured by Charles River Japan) 5 times at 2-week intervals at a dose of 20 ⁇ g / 100 ⁇ L.
  • the spleen was removed 3 days after the final immunization.
  • Spleen cells obtained from the excised spleen and myeloma cells SP2 / O-Ag14 are mixed at a ratio of 10: 1 and fused in the presence of 50% by weight polyethylene glycol 1540 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). It was.
  • the fused cells were suspended in HAT medium so as to be 2.5 ⁇ 10 6 cells / mL as spleen cells, and 0.2 mL each was dispensed into a 96-well culture plate (manufactured by CORNING). This was cultured at 37 ° C. in a 5% by volume CO 2 incubator.
  • hybridoma strain that reacts with PIVKA-II was selected by measuring with a microplate reader (Abs.492 nm). From the selected hybridoma strains, hybridomas 242202, 242203, 242205, and 242206, which give good results when a sandwich immunoassay system was constructed in combination with the MU-3 antibody, were obtained.
  • Hybridomas 242202, 242203, and 242205 were obtained from mice immunized with PIVKA-II, and hybridomas 242206 were obtained from mice immunized with synthetic peptides.
  • Hybridomas were cultured until after 1L seeded into a flask at 1 ⁇ 10 5 / 4mL serum-free medium (Esukuron SF-B), to obtain a culture solution containing the antibody.
  • the culture broth was centrifuged to obtain a supernatant.
  • the supernatant was mixed with an equal amount of adsorption buffer (3 mol / L NaCl-1.5 mol / L Glycine-NaOH, pH 8.5) and then filtered.
  • the filtrate was passed through a protein A column (HiTrap rProteinA FF, manufactured by GE Healthcare Japan) equilibrated with an adsorption buffer, and the antibody was adsorbed on the column.
  • This region is the region from the C-terminal side of the Gla domain in the F1 region of PIVKA-II to the region immediately upstream of the thrombin cleavage site (51st position ⁇ 52nd position).
  • the region after the 33rd amino acid of PIVKA-II has an amino acid sequence common to the corresponding region of prothrombin.
  • Peptides L1 to L7 (SEQ ID NOs: 2 to 8) purchased from Toray Industries, Inc. were used for the screening. The N-terminus of each peptide was biotinylated. The peptide was dissolved in PBS to 10 nM. DynabeadsTM M-270 Streptavidin was suspended in these peptide solutions to prepare a 10 mg / mL solution.
  • peptide solid phase magnetic beads After allowing to stand for 10 minutes, it was washed 3 times with the Ru diluted solution (1) described later to obtain peptide solid phase magnetic beads, and the beads were diluted to 1 mg / mL to prepare a peptide solid phase magnetic bead solution.
  • anti-mouse IgG Fab antibody prepared to 1 mg / mL
  • 68 ⁇ L (10 mg / mL) of a Ru complex compound of succinimid group-modified ruthenium tridipyridyl was added, and the reaction was carried out at room temperature for 30 minutes with stirring. 50 ⁇ L of 2 mol / L glycine was added, the reaction was stopped, and the reaction was further carried out at room temperature with stirring for 10 minutes.
  • Ru-labeled anti-mu a Ru-labeled anti-mouse IgG Fab antibody
  • the obtained Ru-labeled anti-mouse IgG Fab antibody was diluted with Ru diluted solution (1) to a final concentration of 2 ⁇ g / mL before use.
  • the composition of the Ru diluent (1) is shown below.
  • Composition of Ru diluent (1) 50 mM HEPES, 1 mM EDTA-4Na, 0.05% NaN3, 1% BSA, 0.1% Tween20, pH 7.8
  • the monoclonal obtained by electrochemiluminescence immunoassay using the prepared peptide solid-phase magnetic bead solution, Ru-labeled anti-mouse antibody solution, and ECLIA automatic measuring device "Picormi III" (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.). The epitope of the antibody was analyzed.
  • Appropriate functional groups that react with cysteine were added to the C-terminal and N-terminal of each peptide.
  • the synthesized peptide group was cyclized by forming a thioester bond with the cysteine with a functional group to add a higher-order structure, and was printed on a microarray.
  • Rockland blocking buffer MB-070 was added to the microarray, blocked for 30 minutes, and 1, 10, 100 ⁇ g / in incubation buffer (PBS, 0.005% Tween 20, 10-fold diluted solution with pH 7.4).
  • the 202 and 203 antibodies prepared in mL were reacted at 4 ° C. for 16 hours with shaking at 140 rpm. Wash twice for 10 seconds with PBS, 0.005% Tween20, pH 7.4, react 5000-fold diluted Goat anti-mouse IgG (H + L) DyLight680 with incubation buffer for 45 minutes at room temperature, and LI-COR Odyssey. The measurement was performed with the Imaging System at a setting of offset 0.65 mm and resolution 21 ⁇ m.
  • the 202 antibody bound the cyclic peptide SSTATDVFWAKYT (peptide No. 40) most strongly, and the 203 antibody bound the cyclic peptide STATDVFWAKYTA (peptide No. 41) most strongly. Therefore, it was shown that the 202 and 203 antibodies recognize the higher-order structural epitopes at positions 35-45 of PIVKA-II. More specifically, the 202 antibody recognizes the higher-order structural epitope at positions 35-44 of PIVKA-II, and the 203 antibody recognizes the higher-order structural epitope at positions 36-45 of PIVKA-II / prothrombin. It has been shown to be an antibody that produces.
  • both antibodies may recognize the motif of TATDVFWA at positions 35-42.
  • ⁇ Preparation of MU-3 monoclonal antibody-immobilized magnetic bead solution As resin particles, 2.0 g of Micropearl EX-003 (particle size 3.01 ⁇ m, CV 3.1%, manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) was ultrasonically dispersed in 40.0 g of ion-exchanged water to obtain a core particle dispersion. Subsequently, 4.0 mL of the magnetic fluid EMG707 (manufactured by Ferrotec Inc.) was added while stirring under ultrasonic irradiation, and ultrasonic dispersion was performed for another 30 minutes.
  • the magnetic fluid EMG707 manufactured by Ferrotec Inc.
  • the obtained dispersion was filtered, washed with ion-exchanged water, and excess magnetic fluid was removed to obtain magnetically responsive beads.
  • the magnetically responsive beads EP were ultrasonically dispersed in PBS to a concentration of 3.0% by weight, and then 0.5 mL was dispensed into a test tube. After trapping with a magnet and discarding the supernatant, 1 mL of MU-3 monoclonal antibody (1.07 mg / mL, 150 mM phosphate buffer, pH 7.8) was added to the magnetic beads, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 72 hours. It was reacted.
  • MU-3 monoclonal antibody-immobilized magnetic bead solution
  • antibody beads usually diluted to 1 mg / mL with a bead diluent before use.
  • the composition of the bead diluent is shown below.
  • composition of bead diluent 0.025 mol / L Tris buffer (pH 7.8), 0.01 mol / L NaCl, 0.025% Tween20, 0.09% NaN 3 , 0.5 mM EDTA-2Na, 1% saccharose, 0.5% bovine serum albumin
  • Ru-labeled a Ru-labeled anti-prothrombin F1 region monoclonal antibody
  • anti-F1 antibody a Ru-labeled anti-prothrombin F1 region monoclonal antibody
  • Ru diluent (2) 0.05 mol / L HEPES buffer (pH 7.8), 0.09% NaN 3 , 0.2 mg / mL mouse IgG, 0.003M EDTA-4Na, 0.1% Tween 20
  • PIVKA-II The measurement of PIVKA-II was carried out using the ECLIA automatic measuring device "Picormi III".
  • MU-3 monoclonal antibody-immobilized magnetic bead solution 25 ⁇ L of MU-3 monoclonal antibody-immobilized magnetic bead solution was injected, and the reaction was carried out at a temperature of 30 ⁇ 2 ° C. for 5 minutes. During the reaction, the reaction solution is stirred at regular intervals for several seconds. After the magnet was brought close to the reaction tube and the beads were collected on the reaction tube wall, the liquid in the reaction tube was removed by suction. As a cleaning step, 350 ⁇ L of Picormi BF cleaning solution (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.) is injected into the reaction tube and stirred, a magnet is brought close to the reaction tube to collect beads on the reaction tube wall, and then the solution in the reaction tube is sucked. Removed.
  • Picormi BF cleaning solution manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.
  • part of the F1 region of PIVKA-II (which has the same primary sequence as the F1 region of prothrombin) is denatured and loses its native higher-order structure. It is expected to be.
  • an antibody that recognizes a linear epitope and an antibody that recognizes a higher-order structural epitope it is possible that PIVKA-II contained in the reaction solution can be captured without omission.
  • the method and reagent for measuring Anna Reed using the immune response according to the present invention can be used for diagnosis or assistance in diagnosis of hepatocellular carcinoma and the like. Further, according to the present invention, it is possible to improve the sensitivity of the measurement method and the measurement reagent of the analysis using the existing immune reaction.

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Abstract

本発明が解決しようとする課題は、試料中のアナライトをサンドイッチ免疫測定法で測定する際に、感度を向上させることである。　第1抗体と第2抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法において、第1抗体又は第2抗体の一方又は両方を、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体と高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体との混合物とすることにより、感度を著しく向上できる。

Description

免疫反応を利用したアナライトの測定方法及び測定試薬
　本発明は、免疫反応を利用したアナライトの測定方法及び測定試薬に関する。更に詳しくは、第1抗体と第2抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法において、第1抗体及び/又は第2抗体として、直線状エピトープを認識する抗体と高次構造エピトープを認識する抗体を混合して用いるアナライトの測定方法及び測定試薬に関する。
　PIVKA-IIは血液凝固第II因子であるプロトロンビンのうち、凝固因子活性を持たないタンパク質をいい、異常プロトロンビンとも称される。プロトロンビンは肝臓で合成され、その生成過程において、ビタミンK依存性γグルタミルカルボキシラーゼによるグルタミン酸(Glu)残基のγカルボキシグルタミン酸(Gla)残基への変換を必要とする。正常なプロトロンビンのN末端付近には、10個のGla残基が存在しているが、PIVKA-IIにおいては、10個の全て、あるいは一部がGlaに変換されずに、Glu残基として残っている。PIVKA-IIは当初、ビタミンK欠乏あるいはビタミンK拮抗薬投与患者の血液から見出された。近年では、肝細胞がんに伴って血中濃度が上昇する事から、肝細胞がんの腫瘍マーカーとして測定されている。PIVKA-IIはprotein induced by Vitamin K absence or antagonists-IIの略であり、des-γ-carboxy prothrombin(DCP)とも呼ばれる (参考文献:Weitz, I. C., and Liebman, H. A.; (1993) Hepatology 18, 990-997、 Suzuki M, Shiraha H, Fujikawa T, Takaoka N, Ueda N, Nakanishi Y, Koike K, Takaki A, Shiratori Y.; J Biol Chem. 2005 Feb 25;280(8):6409-15、A. Nakao, A. Virji, Y. Iwaki, B. Carr, S. Iwatsuki, and E. Starzl; Hepatogastroenterology. 1991 October; 38(5): 450-453) 。
　試料中のPIVKA-IIを特異的に測定するための試薬として、ピコルミ(登録商標)PIVKA-II MONOキット(積水メディカル株式会社)が販売されている。本製品は、抗PIVKA-IIマウスモノクローナル抗体を結合したビーズを固相とし、電気化学的変化で発光するルテニウム(Ru)錯体を標識した抗プロトロンビンマウスモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法による電気化学発光免疫測定法(ECLIA)を測定原理としている。第一反応において、抗PIVKA-IIマウスモノクローナル抗体結合ビーズと検体を反応させると、検体中のPIVKA-IIがビーズの抗PIVKA-IIマウスモノクローナル抗体と結合する。次に、第二反応として、ビーズを洗浄後、ビーズに結合したPIVKA-IIにルテニウム標識抗プロトロンビンマウスモノクローナル抗体を反応させると、サンドイッチ状に結合する。更に、ビーズを洗浄後、電極上にて電気エネルギーを加えると、PIVKA-IIを介してビーズに結合したルテニウム標識抗プロトロンビンマウスモノクローナル抗体量に応じて、ルテニウム錯体が発光する。この発光を計測することにより、検体中のPIVKA-II量を正確に測定することができる(ピコルミ(登録商標)PIVKA-II MONOキット添付文書、第5版参照)。ピコルミ(登録商標)PIVKA-II MONOキットの測定範囲は10～75,000mAU/mLであり、高感度と広い測定レンジを特徴としている。
　一方で、健康成人の血清又は血漿中PIVKA-II基準上限値は28mAU/mLであり、肝細胞癌、肝硬変、慢性肝炎患者における感度、特異性より算定したカットオフ値は40mAU/mLとされている。従って、このカットオフ値は、ピコルミ(登録商標)PIVKA-II MONOキットの広い測定レンジの下端付近に位置しているので、更に高感度な測定法の開発に対するニーズが存在する。
　特開平6-113830号公報は、ヒトヘモグロビンと特異的に反応する複数のモノクローナル抗体の混合物を担体に結合させたものを用いることによって、ヒトヘモグロビン特異凝集反応を精度よく簡単に行うことができ、生体試料中のヒトヘモグロビンを特異的に、かつ高感度で測定でき、ヒト便、尿中のヘモグロビンの測定に利用でき、大腸がんや腎疾患等の診断に応用できることを開示している。
　本発明者らは、PIVKA-IIの高感度な測定法の開発に鋭意取り組んでいたところ、第1抗体と第2抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法において、複数の標識モノクローナル抗体を用いた場合に、それらの複数の抗体を単独で用いた場合と比較して、著しく感度が向上する組合せと、感度の向上が見られない組合せが存在することに気が付いた。
　本発明者らがこれらの抗体のエピトープを決定したところ、驚くべきことに、著しく感度が向上する抗体の組合せは、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体と高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体の組合せであることを見出し、本発明を完成した。
特開平6-113830号公報 特公平5-43357号公報
　本発明が解決しようとする課題は、試料中のアナライトをサンドイッチ免疫測定法で測定する際に、感度を向上させることである。別の態様において、本発明が解決しようとする課題は、特に、当該アナライトのカットオフ値が当該測定法の測定レンジの下限の近傍に位置する場合に、測定の感度を向上させることである。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、第1抗体(単数又は複数。以下同じ)と第2抗体(単数又は複数。以下同じ)を用いるサンドイッチ免疫測定法において、第1抗体又は第2抗体の一方又は両方を、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体と高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体との混合物とすることにより、感度を著しく向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は以下の構成を有する。
　[実施態様1]
　第1抗体と第2抗体を用いる、アナライトを測定するためのサンドイッチ免疫測定法であって、第1抗体と第2抗体の一方又は両方が、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体と高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体の混合物である、サンドイッチ免疫測定法。
　[実施態様2]
　以下の工程を含む、試料中のアナライトを測定するためのサンドイッチ免疫測定法:
　試料を提供する工程;
　前記試料に第1抗体を接触させ、第1の反応物を提供する工程;
　随意により、前記第1の反応物に含まれる第1抗体-アナライト複合体を回収する工程;
　前記第1の反応物又は第1抗体-アナライト複合体に第2抗体を接触させ、第2の反応物を提供する工程;
　前記第2の反応物に含まれる第1抗体-アナライト-第2抗体複合体を回収する工程; 及び
　前記の回収した第1抗体-アナライト-第2抗体複合体の標識のシグナルを計測することにより、試料中のアナライトを測定する工程;
　ここで、
　前記第1抗体と前記第2抗体は、前記アナライトに対する互いにエピトープの異なる抗体であり、
　前記第1抗体と前記第2抗体の一方又は両方は、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体と高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体の混合物である。
　[実施態様3]
　前記第1抗体が固相化抗体である、実施態様1又は2に記載の方法。
　[実施態様4]
　前記第2抗体が固相化抗体である、実施態様1又は2に記載の方法。
　[実施態様5]
　前記第2抗体が標識抗体である、実施態様1～3の何れかに記載の方法。
　[実施態様6]
　前記第1抗体が標識抗体である、実施態様1、2、及び4の何れかに記載の方法。
　[実施態様7]
　前記アナライトがPIVKA-IIである、実施態様1～6の何れかに記載の方法。
　[実施態様8]
　前記直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体が、PIVKA-IIの第26番目から第44番目のアミノ酸の配列((E/γ)AF(E/γ)AL(E/γ)SSTATDVFWAKY)を有するペプチド、又は、PIVKA-IIの第29番目から第44番目のアミノ酸の配列((E/γ)AL(E/γ)SSTATDVFWAKY)を有するペプチドを認識する抗体である、実施態様1～7の何れかに記載の方法。
　[実施態様9]
　前記高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体が、PIVKA-IIの第33番目から第45番目のアミノ酸配列(SSTATDVFWAKYT)、又は、第35番目から第45番目のアミノ酸配列(TATDVFWAKYT)、又は、第35番目から第42番目のアミノ酸配列(TATDVFWA)の高次構造を認識する抗体である、実施態様1～8の何れかに記載の方法。
　[実施態様10]
　第1抗体と第2抗体を備える、アナライトを測定するためのサンドイッチ免疫測定法用試薬であって、第1抗体と第2抗体の一方又は両方が、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体と高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体の混合物である、サンドイッチ免疫測定法用試薬。
　[実施態様11]
　前記混合物は2種のハイブリドーマに由来する2種のモノクローナル抗体の混合物である、実施態様1～9の何れかに記載の方法、又は、実施態様10に記載の試薬。
　[実施態様12]
　前記直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体が第1のハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体であり、かつ、前記高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体が第2のハイブリドーマに由来するモノクローナル抗体である、実施態様1～9の何れかに記載の方法、又は、実施態様10に記載の試薬。
　[実施態様13]
　前記混合物が2種の免疫グロブリン分子からなる、実施態様1～9の何れかに記載の方法、又は、実施態様10に記載の試薬。
　[実施態様14]
　前記直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体が第1の免疫グロブリン分子からなり、かつ、前記高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体が第2の免疫グロブリン分子からなる、実施態様1～9の何れかに記載の方法、又は、実施態様10に記載の試薬。
　本発明によれば、アナライトのより精確な測定が可能となる。また、当該アナライトをマーカーとする疾患・臨床状態の診断又は診断の補助を、より高い信頼性をもって行うことができる。特に、当該アナライトのカットオフ値が、第1抗体と第2抗体を用いる既存のサンドイッチ免疫測定法の測定レンジの下限の近傍に位置する場合に、疾患・臨床状態の診断又は診断の補助を、より高い信頼性をもって行うことができる。
10mAU/mL、100mAU/mL、及び1000mAU/mLの標準抗原液の測定値(カウント数)を、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体又は高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体のみをRu標識抗F1抗体として用いた場合(1)と、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体と高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体との混合物をRu標識抗F1抗体として用いた場合(2)に分けてプロットした図である。
　[定義]
　第1抗体/第2抗体: 本明細書において、「第1抗体」という用語は、サンドイッチ免疫測定法で形成されるサンドイッチ構造(抗体-アナライト-抗体複合体)の一方の抗体を意味し、「第2抗体」という用語は、アナライトを介して第1抗体と複合体を形成する他方の抗体を意味する。即ち、前記サンドイッチ構造において、第1抗体と第2抗体がアナライトを挟んでいる。本願明細書において、「第1抗体」というときは、一態様において、第1のモノクローナル抗体を意味する。この場合、「第1の抗体」は、複数のモノクローナル抗体の混合物ではない。しかし、別の態様において、「第1抗体」という用語は、第1のモノクローナル抗体のセットを意味する。この場合、「第1抗体」は、複数のモノクローナル抗体の混合物である。「第2抗体」という用語についても同様である。前記サンドイッチ構造を形成するために、第1抗体と第2抗体は異なるエピトープを認識する必要がある(互いに他方の結合を阻害しない)ことは、当業者に明らかであろう。一方で、第1抗体(又は第2抗体)が複数のモノクローナル抗体の混合物である場合、これら複数のモノクローナル抗体のエピトープは、必ずしも異なる必要は無く、同一でも良いし、あるいは、部分的に重なっても良い。
　試料: 本願明細書で「試料」というときは、哺乳類、好ましくはヒトの生体試料を意味する。生体試料は、プロトロンビンが存在する可能性のある試料(例えば、プロトロンビンを発現する組織に由来するものや、プロトロンビンが循環している体液など)であればどのようなものでも良いが、血液、血清、血漿、又はリンパ液が好ましい。
　アナライト: 測定対象物に関しては、抗原抗体反応を利用できる分子であれば特に限定はなく、例えばPIVKA-II、プロトロンビン、CRP(C反応性タンパク質)、Lp(a)、MMP3(マトリクスメタロプロテイナーゼ3)、IV型コラーゲン、PSA(前立腺特異抗原)、BNP(脳性ナトリウム利尿ペプチド)、インスリン、マイクロアルブミン、シスタチンC、抗リン脂質抗体、抗トレポネーマ・パリダム抗体、FDP(フィブリン・フィブリノーゲン分解産物)、Dダイマー、SF(可溶性フィブリン)、TAT(トロンビン-アンチトロンビンIII複合体)、XIII因子、ペプシノーゲンI・IIなどが挙げられる。但し、本発明の原理上、直線状エピトープや高次構造エピトープを観念できない低分子化合物や短いペプチド分子をアナライトとすることはできない。
　PIVKA-II:本願明細書で「PIVKA-II」というときは、哺乳類、好ましくはヒトのPIVKA-IIを意味する。
　プロトロンビン:本願明細書においては、正常及び異常プロトロンビンの両者を総称して「プロトロンビン」と呼ぶ。また、本願明細書においては、「異常プロトロンビン」とはPIVKA-IIを意味し、「正常プロトロンビン」とはPIVKA-II以外のプロトロンビンを意味する。
　サンドイッチ免疫測定法: 本願明細書で使用される「サンドイッチ免疫測定法」という用語は、当業者に周知の意味で用いる。より具体的には、第1の抗体と第2の抗体の両方がアナライトに結合して、所謂「サンドイッチ」構造を形成することにより、アナライトの特異的な測定を可能にする免疫測定法を意味する。当業者に公知の「サンドイッチ免疫測定法」としては、電気化学発光免疫測定法(ECLIA)、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ラテックス比濁免疫測定法(LTIA)、ラテラルフロー免疫測定法が挙げられる。
　直線状エピトープ:本明細書で「直線状エピトープ」というときは、抗体が認識又は結合する抗原の部位であり、タンパク質又はポリペプチドの一次構造で形成されるものを意味する。本明細書において、「直線状」構造、「線形」構造、「一次」構造、「1次」構造等の用語は同義で用いる。
　高次構造エピトープ: 本明細書で「高次構造エピトープ」というときは、抗体が認識又は結合する抗原の部位であり、タンパク質の一次構造を抜き出した直線状のペプチドとは反応しない抗体が、ネイティブで高次構造を有する抗原中で反応する部位を意味する。本明細書において、「立体構造(conformation)」という用語は「高次構造(higher order structure)」という用語と同義で用いる。
　モノクローナル抗体: 本明細書において、「モノクローナル抗体(a/the monoclonal antibody)」という用語は、同一の構造を有する単一の分子種の免疫グロブリン分子の集合を意味する。本願明細書で「モノクローナル抗体」というときは、抗体そのものでも良いが、Fab断片やF(ab')2断片などの抗原への結合活性を有する断片でも良い。前記モノクローナル抗体は、古典的な、抗原の非ヒト動物への免疫により得られるもののほか、遺伝子組換え技術や遺伝子免疫法等により得られるものなど、その取得方法の如何を問わない。また、抗体はルテニウム(Ru)錯体、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、金属コロイド、FITCなどの公知の標識物質と結合していてもよい。また、「抗体を含有する試薬」は適当な塩、緩衝剤、保存料、界面活性剤、還元剤、凍結保護物質などを含有していても良い。なお、本発明において、2種類のモノクローナル抗体の使用を必須としているが、これは3種類目以降の使用を排除することを意図していない。さらに、担体粒子に固相化して使用している2種類のモノクローナル抗体を、担体粒子に固相化させず、遊離の状態で、さらに処方することも排除していない。
　固相化:本願明細書では、「固相化」という用語は、「固定化」又は「感作」と同様の意味で用いる。
　担体粒子:本発明で使用される担体粒子(不溶性担体)としては、例えば、磁気ビーズ、有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球及び細胞片等が挙げられる。
　上記有機高分子粉末としては、例えば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等の天然高分子粉末、ポリスチレン、スチレン-スチレンスルホン酸塩共重合体、アクリロニトリル-ブタジエン-スチレン共重合体、塩化ビニル-アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル-アクリル酸エステル共重合体等の合成高分子粉末などが挙げられ、特に合成高分子粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が好ましい。
　上記無機物質粉末としては、例えば、金、チタン、鉄、ニッケル等の金属片、シリカ、アルミナ、炭素末などが挙げられる。
　上記不溶性担体の平均粒径は、0.05～10.0μmのものが通常用いられる。2種類のモノクローナル抗体を担持させる2種の担体粒子の粒径及び材質は、同一であっても、異なっていてもよい。
　接触させる:本願明細書で、生体試料に担体粒子を「接触させる」というときは、これらを固体、水溶液、又は懸濁液のいずれかの形態で混合することを意味する。
　[実験材料及び方法]
　<モノクローナル抗体(抗PIVKA-II抗体):MU-3抗体>
　(1)作成方法
　抗PIVKA-IIモノクローナル抗体(MU-3抗体)は、特公平5-43357号公報の実施例1に記載されている方法そのものにより作製された抗体を使用した。
　以下、特公平5-43357号公報の実施例1に記載の抗体作成方法を一部省略して引用する。
　『B ワーファリン服用者血漿にBaSO4およびBaCO3をそれぞれ100mg/mLの割合で加え、120分間攪拌し正常プロトロンビンを吸着除去し、次にDE-52celluloseに加えてイオン交換をおこない、正常プロトロンビンおよびPIVKA-IIの両者に対する共通部分のモノクロナール抗体を用いたアフイニティーカラムにかけ、4M塩酸グアニジンで溶出させて、透析し、濃縮してPIVKA-IIを精製した。得られたPIVKA-II (50μg)を同容量のフロイント完全アジユバンドと共にBALB/Cマウス(メス、4週齢)の腹腔内に投与し、さらに2週後にPIVKA-II (15μg)を尾静脈内へ投与し、3日後に脾細胞を摘出し、腫瘍細胞株P3U1と細胞融合した。細胞融合はポリエチレングリコール4000を用いて渡辺等の方法でおこなった。次に96ウエルマイクロプレートを用いて限界希釈法により三回クローニングをおこなった。なおクローニングのためのアッセイには前記Aでの脱カルボキシル化ヒトプロトロンビンおよび最終的にはネーテイブなPIVKA-IIを用いた。クローニングによって確立された抗体産生ハイブリドーマのセルラインにはそれぞれ、・・・、MU-3、・・・の識別記号を付した。・・・。セルラインMU-3よりモノクロナール抗PIVKA-II抗体を常法により得た。』
　上記、引用中に記載されているように、PIVKA-IIを免疫して得られるハイブリドーマが産生する抗PIVKA-II抗体のスクリーニングは、脱カルボキシル化ヒトプロトロンビン及び最終的にはネイティブなPIVKA-IIを用いた抗体産生ハイブリドーマのクローニングのためのアッセイ等を通じてなされた。
　また、MU-3抗体のエピトープ部位は、PIVKA-IIのGla領域アミノ酸配列をもとに合成された種々の長さのペプチドフラグメントを用いた結合能の詳細研究により、『プロトロンビンのアミノ酸配列13～23位のデカルボキシルペプチド部位』であることが同定・確認されている(特開平7-20127)。従って、特公平5-43357号公報に記載のネイティブPIVKA-II、脱カルボキシル化ヒトプロトロンビンに加えて、特開平7-20127に記載のPIVKA-IIのGla領域アミノ酸配列をもとに合成された種々の長さのペプチドフラグメント等を、適宜組み合わせて、抗体のPIVKA-II及びPIVKA-II以外の物質との結合能を比較・確認することにより抗PIVKA-II抗体のスクリーニングを行うことができるので、これによりMU-3抗体以外の新たな抗PIVKA-II抗体を得ることもできる。本明細書には、特公平5-43357号公報(特公平5-43357)及び特開平7-20127の全記載を参照として含める。
　またさらに、抗PIVKA-II抗体はMU-3以外にも公知である。例えば特開平9-43237に記載された2G4抗体、特開昭60-60557号公報に記載された抗体や特開平7-313186号公報に記載された抗体なども、本発明の抗PIVKA-II抗体として使用可能であると考えられる。
　<モノクローナル抗体(抗プロトロンビンF1領域抗体):242202抗体、242203抗体、242205抗体、242206抗体>
　(1) 作成方法
　i)ハイブリドーマの調製
　精製したカイコ発現PIVKA-II(大関株式会社製)又は合成ペプチド(第29-47位のアミノ酸配列)(配列番号1)とフロイントの完全アジュバント(GIBCO社製)とを1対1で混和乳化してエマルジョンとし、20μg/100μLの投与量で8週齢の雌BALB/Cマウス(日本チャールズリバー社製)の皮下に2週間間隔で5回投与した。最終免疫の3日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞SP2/O-Ag14とを10対1の割合で混合し、50重量％ポリエチレングリコール1540(和光純薬工業社製)存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として2.5×106個/mLになるようにHAT培地に懸濁し、96穴培養プレート(CORNING社製)に0.2mLずつ分注した。これを5体積％CO2インキュベーター中で37℃にて培養した。おおよそ2週間後に、ハイブリドーマが生育してきたウェルの培養上清を次に示すELISA法にしたがって評価し、PIVKA-IIに反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択した。
　具体的には、まずELISA用96穴プレート(NUNC社製)にBajahらの方法(S. Paul Bajah, Paul A. Price, and William A. Russell, Decarboxylation of γ-Carboxyglutamic Acid Residues in Human Prothrombin, Journal of Biological Chemistry 257(7):3726,1982に記載の方法)により調製したPIVKA-IIを1μg/mL固相化した。これに各培養上清を反応させた後、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗マウスIgG抗体(jackson Immuno Research)を反応させ、次いでOPD発色液 を加え発色させた。停止液 を加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー(Abs.492nm)で測定し、PIVKA-IIと反応するハイブリドーマ株を選択した。選択したハイブリドーマ株の中から、前記MU-3抗体と組み合わせてサンドイッチ免疫測定系を構築した場合に良好な結果を与える、ハイブリドーマ242202、242203、242205、及び242206を獲得した。ハイブリドーマ242202、242203、及び242205は、PIVKA-IIを免疫したマウスから得られたものであり、ハイブリドーマ242206は合成ペプチドを免疫したマウスから得られたものである。
　ii)モノクローナル抗体の調製
　ハイブリドーマ242202、ハイブリドーマ242203、ハイブリドーマ242205、及びハイブリドーマ242206から、それぞれ、下記方法により242202モノクローナル抗体(202抗体)、242203モノクローナル抗体(203抗体)、242205モノクローナル抗体(205抗体)、及び242206モノクローナル抗体(206抗体)を調製した。
　ハイブリドーマは、無血清培地(エスクロンSF-B)に1×105/4mLにてフラスコに播種したあと1Lまで培養し、抗体を含む培養液を得た。培養液を遠心処理して上清を得た。当該上清を等量の吸着用緩衝液(3mol/L NaCl-1.5mol/L Glycine-NaOH, pH8.5)と混和後、濾過した。この濾液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインAカラム(HiTrap rProteinA FF、GEヘルスケア・ジャパン社製)に通して、抗体をカラムに吸着させた。その後、0.1mol/Lクエン酸緩衝液(pH3.0)で溶出させてモノクローナル抗体を精製した。
　(2) モノクローナル抗体エピトープの決定
　i)直線状ペプチドによる解析
　予備的な解析により、ハイブリドーマ242202、242203、242205、及び242206が産生する抗体のいずれも、PIVKA-IIのFragment1(F1)領域に結合することが明らかになった。これらの抗体のエピトープを同定するために、PIVKA-IIの第26番目から第47番目のアミノ酸の配列に対応するペプチドとの反応性により抗体をスクリーニングした。当該領域は、PIVKA-IIのF1領域中のGlaドメインのC末端側からトロンビン切断部位(第51位↓第52位)の直ぐ上流までの領域である。PIVKA-IIの第33番目のアミノ酸以降の領域は、プロトロンビンの対応する領域と共通するアミノ酸配列を有する。スクリーニングには、東レ株式会社社から購入した、ペプチドL1～L7(配列番号2～8)を用いた。 各ペプチドのN末端はビオチン化した。
　前記ペプチドを10nMになるようPBSに溶解した。これらのペプチド溶液でDynabeadsTM M-270　Streptavidinを懸濁し、10mg/mL溶液を調製した。10分間静置した後、後記のRu希釈液(1)で3回洗浄してペプチド固相磁性ビーズを獲得し、当該ビーズを1mg/mLに希釈してペプチド固相磁性ビーズ溶液とした。
　1mLの抗マウスIgG Fab抗体(1mg/mLに調製)に、サクシニミド基修飾ルテニウム・トリ・ジピリジルのRu錯体化合物を68μL(10mg/mL)加え、室温で30分撹拌しながら反応させた。2mol/Lグリシンを50μL加え、反応を停止し、さらに室温で10分間撹拌しながら反応させた。最後に試料をセファデックスG-25(10mmol/Lリン酸緩衝液で平衡化)に流し、Ru結合の蛋白分画を集め、Ru標識抗マウスIgG Fab抗体を調製した(以下、「Ru標識抗マウス抗体」と略称することがある)。得られたRu標識抗マウスIgG Fab抗体は、使用時、Ru希釈液(1)で終濃度2μg/mLに希釈して用いた。Ru希釈液(1)の組成を下記に示す。
　Ru希釈液(1)の組成: 50mM HEPES, 1mM EDTA-4Na, 0.05％ NaN3, 1％ BSA, 0.1％ Tween20, pH7.8
　前記調製したペプチド固相磁性ビーズ溶液、Ru標識抗マウス抗体液、およびECLIA自動測定装置「ピコルミIII」(積水メディカル(株)製)を用いて、電気化学発光免疫測定法により、前記獲得したモノクローナル抗体のエピトープを解析した。
　100μLのRu希釈液(1)に各モノクローナル抗体液(0.5μg/mL)20μLとペプチド固相磁性ビーズ12.5μLを添加し9分間反応させた。Ru希釈液(1)で0.2mg/mLに希釈したRu標識抗マウス抗体液を200μL添加し9分間反応後、磁性粒子を洗浄して測定した 。カウント値2000未満を-、2000以上10000未満を+-、10000以上20000未満を+、20000以上30000未満を++、30000以上を+++とし、この分析結果を下記表1にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　この分析結果から、205抗体はPIVKA-IIの第26-44位、206抗体はPIVKA-IIの第29-44位のペプチド配列に反応することが確認された。一方202抗体及び203抗体と表1のL1～L7ペプチドとの強固な結合は確認されなかった。
　ii)高次構造付加ペプチドによる解析
　202抗体及び203抗体のエピトープ解析はPEPPERPRINT社のPEPperMAP(登録商標) Conformational Epitope Mappingサービスを利用して実施した。
　PIVKA-IIのFragment 1領域の配列のN末端およびC末端にGSGSGSG配列を付加したものから、連続した7、10、13個のアミノ酸をN末端から1アミノ酸ずつずらして設計したアミノ酸配列からなる480種類のペプチドを合成した。各ペプチドのC末端にシステイン、N末端にシステインと反応する適切な官能基を付加した。合成したペプチド群は、前記システインと官能基によりチオエステル結合を形成することにより環化して高次構造を付加し、マイクロアレイにプリントした。マイクロアレイにRockland blocking buffer MB-070を添加して30分間ブロッキングし、インキュベーションバッファー(Rockland blocking buffer MB-070をPBS, 0.005％ Tween20, pH7.4で10倍希釈した溶液)で1, 10, 100μg/mLに調製した202抗体及び203抗体を、140rpmで振とうしながら4℃で16時間反応させた。PBS, 0.005％ Tween20, pH7.4で10秒間の洗浄を2回実施し、インキュベーションバッファーで5000倍希釈したGoat anti-mouse IgG (H+L) DyLight680を室温で45分間反応させ、LI-COR Odyssey Imaging Systemでoffset 0.65 mm, resolution 21 μmの設定で測定した。
　その結果、202抗体は環状ペプチドSSTATDVFWAKYT(ペプチド番号40)、203抗体は環状ペプチドSTATDVFWAKYTA(ペプチド番号41)に最も強く結合した。よって202抗体および203抗体はPIVKA-IIの第35-45位の高次構造エピトープを認識することが示された。より詳細には、202抗体はPIVKA-IIの第35-44位の高次構造エピトープを認識する抗体であり、203抗体はPIVKA-II/プロトロンビンの第36-45位の高次構造エピトープを認識する抗体であることが示された。更に、両方の抗体は、第35-42位TATDVFWAのモチーフを認識している可能性が示された。当該領域は、プロトロンビンの結晶構造(PDB ID: 6BJR(http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=6BJR))において、PIVKA-IIのMU-3抗体が認識する配列(第13～23位)に対応するループとは別個のループ及びαヘリックスを形成している。従って、202抗体及び203抗体は、PIVKA-IIのGlaドメイン(第8-45位)のC末端側に位置する第33-45位のアミノ酸によって形成されるループ及び/又はαヘリックスの高次構造エピトープを認識していることが示唆される。
　<MU-3モノクローナル抗体固相化磁気ビーズ液の調製>
　樹脂粒子としてミクロパールEX-003(粒径3.01μm、CV3.1％、積水化学工業株式会社製)2.0gを、イオン交換水40.0gに超音波分散し、コア粒子分散液を得た。続いて、超音波照射下攪拌しながら、磁性流体EMG707(株式会社フェローテック製)4.0mLを加え、更に30分間超音波分散した。得られた分散液を濾過し、イオン交換水で洗浄し、余剰の磁性流体を除くことで磁気応答性ビーズを得た。
　上記、磁気応答性ビーズ1.0gをエタノール400gに超音波分散させた後、28％アンモニア水溶液(ナカライテスク株式会社製)10mL、オルトケイ酸テトラエチル1.0g、8-グリシドキシオクチルトリメトキシシラン3.0gを添加し、3時間超音波分散した。得られた分散液を濾過後、イオン交換水への分散、遠心分離を3回繰り返すことで、表面にエポキシ基を有する磁気応答性ビーズEPを得た。磁気応答性ビーズEPをPBSに3.0重量％となるように超音波分散した後、試験管に0.5mLを分取した。磁石でトラップし、上清液を捨てたあと、磁気ビーズに1mLのMU-3モノクローナル抗体 (1.07mg/mL、150mMリン酸緩衝液、pH7.8)を加え、25℃で72時間撹拌しながら反応させた。磁気ビーズを洗浄したあと、1％BSA含有リン酸緩衝液を2mL加え、室温で1昼夜撹拌しながらブロッキングし、MU-3モノクローナル抗体固相化磁気ビーズ液を調製した(以下、「MU-3抗体ビーズ」と略称することがある)。使用時、ビーズ希釈液で磁気ビーズ量を1mg/mLに希釈して用いた。ビーズ希釈液の組成を下記に示す。
　ビーズ希釈液の組成:0.025mol/Lトリス緩衝液(pH7.8)、0.01mol/L NaCl、0.025％Tween20、0.09％NaN3、0.5mM　EDTA-2Na、1％サッカロース、ウシ血清アルブミン0.5％
　<Ru標識抗プロトロンビンF1領域モノクローナル抗体液の調製>
　1mLの抗プロトロンビンF1領域モノクローナル抗体(1mg/mLに調製)に、サクシニミド基修飾ルテニウム・トリ・ジピリジルのRu錯体化合物を68μL(10mg/mL)加え、室温で30分撹拌しながら反応させた。2mol/Lグリシンを50μL加え、反応を停止し、さらに室温で10分間撹拌させた。最後に試料をセファデックスG-25(10mmol/Lリン酸緩衝液で平衡化)に流し、Ru結合の蛋白分画を集め、Ru標識抗プロトロンビンF1領域モノクローナル抗体を調製した(以下、「Ru標識抗F1抗体」と略称することがある)。得られたRu標識抗F1抗体は、使用時、Ru希釈液(2)で終濃度2μg/mLに希釈して用いた。Ru希釈液(2)の組成を下記に示す。
　Ru希釈液(2)の組成:0.05mol/L HEPES緩衝液(pH7.8)、0.09％NaN3、0.2mg/mL マウスIgG、0.003M EDTA-4Na、0.1％ Tween20
　<PIVKA-IIの測定>
　PIVKA-IIの測定は、ECLIA自動測定装置「ピコルミIII」を用いて実施した。PIVKA-II標準抗原を0mAU/mL、10mAU/mL、100mAU/mL、及び1000mAU/mLで含有する標準抗原液を調製した。測定数の反応管を用意して、全ての反応管に反応用溶液を100μLずつ注入した。標準抗原液を20μLずつそれぞれ2本の反応管に注入した。第1反応として、MU-3モノクローナル抗体固相化磁気ビーズ液を25μL注入し、温度30±2℃で5分間の反応を行った。反応中は一定の間隔で数秒間の反応液の撹拌を行う。反応管に磁石を接近させて反応管壁にビーズを集めた後、反応管内の液を吸引除去した。洗浄工程として、反応管にピコルミBF洗浄液(積水メディカル(株)製)を350μL注入して撹拌し、反応管に磁石を接近させて反応管壁にビーズを集めた後、反応管内の液を吸引除去した。この洗浄工程をもう一度繰り返した。次に、第2工程として、反応管にRu標識抗F1抗体液を100μL注入し、温度30±2℃で3分間の反応を行った。反応中は一定の間隔で数秒間の反応液の撹拌を行う。洗浄工程として、反応管にBF洗浄液を350μL注入して撹拌し、反応管に磁石を接近させて反応管壁にビーズを集めた後、反応管内の液を吸引除去した。この洗浄工程をもう一度繰り返した。最後に、反応管に発光電解液(積水メディカル(株)製)を300μL注入し、ビーズをフローセル電極に導いて、発光量を測定した。
　[結果及び考察]
　Ru標識抗F1抗体として、202抗体のみ、203抗体のみ、205抗体のみ、206抗体のみ、202抗体と203抗体の混合物、202抗体と205抗体の混合物、202抗体と206抗体の混合物、203抗体と205抗体の混合物、203抗体と206抗体の混合物、及び205抗体と206抗体の混合物を使用して、PIVKA-IIの測定を行った結果を表2及び図1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表2及び図1から明らかなように、直線状エピトープを認識する抗体(202抗体、203抗体)と高次構造エピトープを認識する抗体(205抗体、206抗体)を混合して用いた場合(網掛けで示した)に、10mAU/mLの測定値(カウント数)の顕著な増加が見られた。
　特定の理論に拘束されるものではないが、反応液中で、PIVKA-IIのF1領域(プロトロンビンのF1領域と一次配列は同じである)の一部は変性し、ネイティブな高次構造を失っていると予想される。直線状エピトープを認識する抗体と高次構造エピトープを認識する抗体を組み合わせることで、反応液中に含まれるPIVKA-IIを漏れなく捕捉できるという可能性が考えられる。
　本発明による免疫反応を利用したアナライトの測定方法及び測定試薬は、肝細胞癌などの診断又は診断補助に利用できる。また、本発明によれば、既存の免疫反応を利用したアナライトの測定方法及び測定試薬の感度を向上させることができる。

Claims (8)

  1. 　第1抗体と第2抗体を用いる、アナライトを測定するためのサンドイッチ免疫測定法であって、第1抗体と第2抗体の一方又は両方が、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体と高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体の混合物である、サンドイッチ免疫測定法。
  2. 　以下の工程を含む、試料中のアナライトを測定するためのサンドイッチ免疫測定法:
    　試料を提供する工程;
    　前記試料に第1抗体を接触させ、第1の反応物を提供する工程;
    　随意により、前記第1の反応物に含まれる第1抗体-アナライト複合体を回収する工程;
    　前記第1の反応物又は第1抗体-アナライト複合体に第2抗体を接触させ、第2の反応物を提供する工程;
    　前記第2の反応物に含まれる第1抗体-アナライト-第2抗体複合体を回収する工程; 及び
    　前記の回収した第1抗体-アナライト-第2抗体複合体の標識のシグナルを計測することにより、試料中のアナライトを測定する工程;
    　ここで、
    　前記第1抗体と前記第2抗体は、前記アナライトに対する互いにエピトープの異なる抗体であり、
    　前記第1抗体と前記第2抗体の一方又は両方は、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体と高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体の混合物である。
  3. 　前記第1抗体が固相化抗体である、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 　前記第2抗体が標識抗体である、請求項1～3の何れかに記載の方法。
  5. 　前記アナライトがPIVKA-IIである、請求項1～4の何れかに記載の方法。
  6. 　前記直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体が、PIVKA-IIの第26番目から第44番目のアミノ酸の配列((E/γ)AF(E/γ)AL(E/γ)SSTATDVFWAKY)を有するペプチド、又は、PIVKA-IIの第29番目から第44番目のアミノ酸の配列((E/γ)AL(E/γ)SSTATDVFWAKY)を有するペプチドを認識する抗体である、請求項1～5の何れかに記載の方法。
  7. 　前記高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体が、PIVKA-IIの第33番目から第45番目のアミノ酸配列(SSTATDVFWAKYT)、又は、第35番目から第45番目のアミノ酸配列(TATDVFWAKYT)、又は、第35番目から第42番目のアミノ酸配列(TATDVFWA)の高次構造を認識する抗体である、請求項1～6の何れかに記載の方法。
  8. 　第1抗体と第2抗体を備える、アナライトを測定するためのサンドイッチ免疫測定法用試薬であって、第1抗体と第2抗体の一方又は両方が、直線状エピトープを認識するモノクローナル抗体と高次構造エピトープを認識するモノクローナル抗体の混合物である、サンドイッチ免疫測定法用試薬。
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Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6060557A (ja) 1983-09-13 1985-04-08 Eisai Co Ltd Ｐｉｖｋａ−２の測定方法および試薬
JPH0543357A (ja) 1991-08-06 1993-02-23 Asahi Glass Co Ltd 無機水硬性板材の製造方法
JPH06113830A (ja) 1991-12-06 1994-04-26 Nippon Bio Tesuto Kenkyusho:Kk ヒトヘモグロビンの特異的検出法
JPH0720127A (ja) 1993-05-07 1995-01-24 Eisai Co Ltd 各種ｐｉｖｋａの測定方法および測定試薬
JPH07313186A (ja) 1993-01-25 1995-12-05 Eisai Co Ltd 抗ｐｉｖｋａ−ｉｉモノクロナ−ル抗体
JPH0943237A (ja) 1995-08-03 1997-02-14 S R L:Kk 抗ｐｉｖｋａ−２抗体産生ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法
JP2002267665A (ja) * 2000-06-12 2002-09-18 Fujirebio Inc ヒトｃ−ペプチド測定法
JP2009505673A (ja) * 2005-08-31 2009-02-12 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 第ｖｉｉ因子特異抗体及びその使用
WO2009078151A1 (ja) * 2007-12-14 2009-06-25 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. 高分子アディポネクチン測定法
JP2013541936A (ja) * 2010-07-26 2013-11-21 アボット・ラボラトリーズ Ｐｉｖｋａ−ｉｉに関する抗体およびその使用
JP2014515476A (ja) * 2011-05-20 2014-06-30 アボットジャパン株式会社 非特異的結合を減少させるためのイムノアッセイ方法及び試薬
JP2016138891A (ja) * 2009-05-14 2016-08-04 ザ チャンセラー，マスターズ アンド スカラーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ オックスフォード 微量ヒト血漿タンパク質バイオマーカーの新規なパネルを使用した肝線維症の臨床診断

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2595429C1 (ru) * 2015-04-21 2016-08-27 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНОГО Mus musculus L. 5Н6 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА Е ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА, МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА 5Н6, ПРОДУЦИРУЕМЫЕ УКАЗАННЫМ ШТАММОМ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, И ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛИКОПРОТЕИНА Е ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УКАЗАННЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6060557A (ja) 1983-09-13 1985-04-08 Eisai Co Ltd Ｐｉｖｋａ−２の測定方法および試薬
JPH0543357B2 (ja) 1983-09-13 1993-07-01 Eisai Co Ltd
JPH0543357A (ja) 1991-08-06 1993-02-23 Asahi Glass Co Ltd 無機水硬性板材の製造方法
JPH06113830A (ja) 1991-12-06 1994-04-26 Nippon Bio Tesuto Kenkyusho:Kk ヒトヘモグロビンの特異的検出法
JPH07313186A (ja) 1993-01-25 1995-12-05 Eisai Co Ltd 抗ｐｉｖｋａ−ｉｉモノクロナ−ル抗体
JPH0720127A (ja) 1993-05-07 1995-01-24 Eisai Co Ltd 各種ｐｉｖｋａの測定方法および測定試薬
JPH0943237A (ja) 1995-08-03 1997-02-14 S R L:Kk 抗ｐｉｖｋａ−２抗体産生ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法
JP2002267665A (ja) * 2000-06-12 2002-09-18 Fujirebio Inc ヒトｃ−ペプチド測定法
JP2009505673A (ja) * 2005-08-31 2009-02-12 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー 第ｖｉｉ因子特異抗体及びその使用
WO2009078151A1 (ja) * 2007-12-14 2009-06-25 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. 高分子アディポネクチン測定法
JP2016138891A (ja) * 2009-05-14 2016-08-04 ザ チャンセラー，マスターズ アンド スカラーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ オックスフォード 微量ヒト血漿タンパク質バイオマーカーの新規なパネルを使用した肝線維症の臨床診断
JP2013541936A (ja) * 2010-07-26 2013-11-21 アボット・ラボラトリーズ Ｐｉｖｋａ−ｉｉに関する抗体およびその使用
JP2014515476A (ja) * 2011-05-20 2014-06-30 アボットジャパン株式会社 非特異的結合を減少させるためのイムノアッセイ方法及び試薬

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. NAKAOA. VIRJIY IWAKIB. CARRS. IWATSUKIE. STARZL, HEPATOGASTROENTEROLOGY, vol. 38, no. 5, October 1991 (1991-10-01), pages 450 - 453
S. PAUL BAJAHPAUL A. PRICEWILLIAM A. RUSSELL: "Decarboxylation of y-Carboxyglutamic Acid Residues in Human Prothrombin", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 257, no. 7, 1982, pages 3726
See also references of EP4067904A4
SUZUKI MSHIRAHA HFUJIKAWA TTAKAOKA NUEDA NNAKANISHI YKOIKE KTAKAKI ASHIRATORI Y, J BIOL CHEM., vol. 280, no. 8, 25 February 2005 (2005-02-25), pages 6409 - 15
WEITZ, I. C.LIEBMAN, H. A., HEPATOLOGY, vol. 18, 1993, pages 990 - 997

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