JP2013541936A - Ｐｉｖｋａ−ｉｉに関する抗体およびその使用 - Google Patents

Ｐｉｖｋａ−ｉｉに関する抗体およびその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝癌および関連の状態の診断、処置および予防において用いるための抗体およびイムノアッセイ方法に関する。

Description

本開示は、例えば、肝細胞癌（ＨＣＣ）、肝癌および関連の病状の診断、処置および予防において用いられ得る抗体およびイムノアッセイ方法に関する。
タンパク質プロトロンビンＩＩはＩＩ因子としても知られており、ビタミンＫの存在下、合成後修飾を受け、ＧＬＡ−ドメインにおける１０個のグルタミン酸残基（ＧＬＡ）がｇ−カルボキシグルタミン酸にカルボキシ化されている。カルボキシ化のプロセスは、プロトロンビンがＰＩＶＫＡ−ＩＩ（ビタミンＫ欠乏時誘導蛋白）に変換される病状およびプロセスにおいて異常であり、不完全である。ＰＩＶＫＡ−ＩＩは分子量７２ｋＤａを有する大型の糖タンパク質であり、ＨＣＣ患者の場合に上昇することが知られている（Ｌｉｅｂｍａｎら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９８４年）、３１０巻（２２）、１４２７−１４３１頁；Ｆｕｊｉｙａｍａら、Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（１９８６年）３３巻、２０１−２０５頁；Ｍａｒｒｅｏら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００３年）、３７巻、１１１４−１１２１頁）。現在、生物マーカーの使用によってＨＣＣまたは肝癌を検出するための利用可能な方法は効果的でない（Ｋｏｔｅｉｓｈら、Ｊ．Ｖａｓｅ．Ｉｎｔｅｒｖ．Ｒａｄｉｏｌ．、（２００２年）、１３巻、１８５−１９０頁；Ｙｕｅｎら、Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００５年）、１９巻、９１−９９頁；Ｈｅｒａｉら、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ（２００７年）、３２巻（２）、２０５−２１０頁；Ｄｕｒａｚｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００８年）、２３巻、１５４１−１５４８頁；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．（２００８年）、４６巻（３）、４１１−４１６頁も参照されたい）。さらに、このような状態を効果的に検出するイムノアッセイにおいて有用であるため、またはこのような状態を処置するために必要とされる結合特異性を有するモノクローナル抗体は殆んど知られていない（Ｎａｒａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（２００２年）、１５８６巻、２８７−２９８頁）。したがって、腫瘍学において、ＨＣＣまたは肝癌を検出するのに有効に用いられ得る抗体の開発が極めて必要とされている。
Ｌｉｅｂｍａｎら、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９８４年）、３１０巻（２２）、１４２７−１４３１頁 Ｆｕｊｉｙａｍａら、Ｈｅｐａｔｏ−ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（１９８６年）３３巻、２０１−２０５頁；Ｍａｒｒｅｏら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００３年）、３７巻、１１１４−１１２１頁 Ｍａｒｒｅｏら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００３年）、３７巻、１１１４−１１２１頁 Ｋｏｔｅｉｓｈら、Ｊ．Ｖａｓｅ．Ｉｎｔｅｒｖ．Ｒａｄｉｏｌ．、（２００２年）、１３巻、１８５−１９０頁 Ｙｕｅｎら、Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔｉｃｅ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００５年）、１９巻、９１−９９頁 Ｈｅｒａｉら、Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ（２００７年）、３２巻（２）、２０５−２１０頁 Ｄｕｒａｚｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００８年）、２３巻、１５４１−１５４８頁 Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．（２００８年）、４６巻（３）、４１１−４１６頁 Ｎａｒａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（２００２年）、１５８６巻、２８７−２９８頁
（発明の要旨）
一態様において、本開示は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統を提供する。本開示は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体も提供する。
別の一態様において、本開示は、プロトロンビン誘導ビタミンＫアンタゴニストＩＩ（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）のアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を含む単離された結合性タンパク質を提供する。例示の一実施形態において、単離された結合性タンパク質は約４．０×１０−９Ｍまたはそれより低い結合解離定数を有する。
別の一態様において、本開示は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する結合性タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供し、結合性タンパク質は可変重鎖領域を有し、可変重鎖領域のアミノ酸配列は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有する。結合性タンパク質に関して、単離された核酸分子は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有する結合性タンパク質をコードし得る。単離された核酸分子はベクターにおいて提供されてもよい。単離された宿主細胞はこのようなベクターを含むことができる。
別の一態様において、本開示は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体のアミノ酸の配列に少なくとも７０％の配列同一性を有する、精製されたアミノ酸の配列を提供する。
別の一態様において、本開示は、方法が、ａ）調節エレメントに操作可能に連結している上記に記載した核酸分子を含むベクターを構築するステップ、ｂ）得られたベクターを宿主細胞中に形質転換で導入するステップ、ｃ）結合性タンパク質を生成するのに十分な時間および条件下、宿主細胞を培養するステップを含む、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合することができる結合性タンパク質を生成する方法を提供する。本開示は、このような方法にしたがって生成される単離された結合性タンパク質をさらに提供する。
別の一態様において、本開示は、方法が、ａ）試験試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有する抗体と、抗体−抗原複合体の形成に十分な時間および条件下、接触させるステップ、およびｂ）抗原−抗体複合体の存在は試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の存在を示す、抗原−抗体複合体の存在を検出するステップを含む、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出するための方法を提供する。抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体であることができる。
試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩとして検出するための上記の方法において、および本明細書に記載するあらゆる方法において、試験試料は、全血、血清、または血漿であることができる。本方法において、抗体は検出可能な標識で標識化されていてもよく、方法は、検出可能な標識によって生成され、または検出可能な標識から放射されるシグナルを測定するステップ、および試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出するステップを含むことができる。検出可能な標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識であることができる。検出可能な標識は、例えば、アクリジニウム化合物であることができる。検出可能な標識がアクリジニウム化合物である場合、方法は、ａ）過酸化水素の源を生成し、または抗体−抗原複合体に提供するステップ、ｂ）塩基性溶液をステップ（ａ）の混合物に加えるステップ、およびｃ）ステップ（ｂ）において生成され、または放射される光シグナルを測定し、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するステップをさらに含むことができる。
別の一態様において、本開示は、ａ）試験試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性部分を有する第１の抗体と、第１の抗体−抗原複合体の形成に十分な時間および条件下、接触させるステップ、ｂ）第２の抗体がＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有し、検出可能な標識にコンジュゲートしている、第２の抗体を第１の抗体／抗原複合体に、第１の抗体／抗原／第２の抗体の複合体を形成するのに十分な時間および条件下、加えるステップ、ならびにｃ）検出可能な標識によって生成され、または検出可能な標識から放射されるシグナルを測定し、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出するステップを含む、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出する方法を提供する。第１の抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６３８を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体であることができる。第２の抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体であることができる。
別の一態様において、本開示は、ａ）試験試料を、１）検出可能なシグナルを生成することができる検出可能な標識に付いている、ＰＩＶＫＡ−ＩＩレファレンス抗原、および２）ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原に対する抗体と、ＰＩＶＫＡ−ＩＩレファレンス抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下、接触させるステップ；ｂ）試験試料中に検出されるＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量が、抗体に結合しているＰＩＶＫＡ−ＩＩレファレンス抗原の量に逆比例する、検出可能な標識によって生成されるシグナルを検出するステップを含む、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出する方法を提供する。本方法において、抗体は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを含むことができ、例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体であることができる。
別の一態様において、本開示は、ａ）ＧＡＮＰマウスを、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１７を含む抗原で、マウスが抗原に対する抗体を生成するのに十分な時間および条件下、免疫化するステップ、ｂ）マウスの脾臓から細胞８個を収集し、精製するステップ、ｃ）ハイブリドーマを生成するために、脾臓細胞をミエローマ細胞と融合するステップ、ならびにｄ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを含む結合性タンパク質を発現するハイブリドーマ細胞系統を選択するステップを含む、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを含む結合性タンパク質を発現するハイブリドーマ細胞系統を生成する方法を提供する。本方法において、ハイブリドーマ細胞系統は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有する細胞系統であることができる。
別の一態様において、本開示は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを含む結合性タンパク質および薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物を提供する。薬剤組成物において、結合性タンパク質は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体を含むことができる。
別の一態様において、本開示は、ａ）患者から生物学的試料を単離するステップ、ｂ）生物学的試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原のアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを含む抗体と接触させるステップ、ならびにｃ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の存在を検出するステップ、ｄ）複合体中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を、複合体中に存在する抗体から解離するステップ、ならびにｅ）解離したＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量を測定するステップ（予め決定されたレベルを超える解離したＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量は、患者におけるＨＣＣまたは肝癌の診断を示す。）を含む、ＨＣＣまたは肝癌を有することが疑われる患者におけるＨＣＣまたは肝癌を診断する方法を提供する。本方法において、予め決定されたレベルは、例えば、約４０ｍＡＵ／ｍＬであることができる。本方法において、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体であることができる。
別の一態様において、本開示は、ａ）患者から生物学的試料を単離するステップ、ｂ）生物学的試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原のアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性ドメインを含む第１の抗体と接触させるステップ、ｃ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを有する第２の抗体を含み、検出可能なシグナルを生成することができる検出可能な標識に付いているコンジュゲートを、得られたＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体に、結合しているＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原にコンジュゲートを結合させるのに十分な時間および条件下、加えるステップ、ｄ）検出可能な標識によって生成されるシグナルを検出することによって、生物学的試料中に存在し得るＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の存在を検出するステップ、ならびにｅ）シグナルの強度を測定することによって試験試料中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量を測定するステップ（予め決定されたレベルを超えるＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量は、患者におけるＨＣＣまたは肝癌の存在を示す。）を含む、ＨＣＣまたは肝癌を有することが疑われる患者におけるＨＣＣまたは肝癌を診断する方法を提供する。本方法において、予め決定されたレベルは、約４０ｍＡＵ／ｍＬであることができる。本方法において、第１の抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６３８を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ ３Ｃ１０）であることができる。第２の抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体であることができる。第１の抗体は固相上に、第１の抗体−抗原複合体の形成の前または後のいずれかに固定化され得る。
別の一態様において、本開示は試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を検出および／または定量するためのキットを提供し、キットは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体、またはＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを有する結合性タンパク質を含有する容器を含む。キットは、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性ドメインを有する結合性タンパク質を含有する容器をさらに含むことができる。
別の一態様において、本開示は試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を検出および／または定量するためのキットを提供し、キットは、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有する抗体を含む検出試薬、ならびに試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を検出および／または定量するための指示書を含む。本キットにおいて、抗体は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体であることができる。本キットにおいて、検出可能な標識は抗体に付いていることができ、検出可能な標識は検出可能なシグナルを生成することができる。上記のキットにおいて、またあらゆる上記の方法において、検出可能な標識が用いられる場合、検出可能な標識は、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択され得、特にアクリジニウム化合物であることができる。アクリジニウム化合物は、
式Ｉ：
Figure 2013541936
 ［式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
Figure 2013541936
 は陰イオンである］
による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキサミドであることができる。
あるいは、アクリジニウム化合物は、
式ＩＩ：
Figure 2013541936
 ［式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルであり、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、
場合によって、存在する場合は、
Figure 2013541936
 は陰イオンである］
による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルであることができる。上記のキットにおいて、アクリジニウム化合物が検出可能な標識として含まれる場合、キットは塩基性溶液をさらに含むことができる。塩基性溶液は、少なくとも約１０のｐＨを有する溶液であることができる。キットは、過酸化水素を含むバッファーまたは溶液など、過酸化水素の源も含むことができる。過酸化水素の源は、過酸化水素生成酵素、例えば、（Ｒ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、（Ｓ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、３−ａｃｉ−ニトロプロパン酸オキシダーゼ、３−ヒドロキシアントラニル酸オキシダーゼ、４−ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ、６−ヒドロキシニコチン酸デヒドロゲナーゼ、アブシジン酸−アルデヒドオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ（銅含有）、アミンオキシダーゼ（フラビン含有）、アリール−アルコールオキシダーゼ、アリール−アルデヒドオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コルンバミンオキシダーゼ、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ、チトクロームｃオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アスパラギン酸オキシダーゼ、Ｄ−グルタミン酸オキシダーゼ、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−アスパラギン酸）オキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ジヒドロウラシルオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシダーゼ、Ｄ−マンニトールオキシダーゼ、エクジソンオキシダーゼ、
Figure 2013541936
 エタノールアミンオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリシンオキシダーゼ、グリオキシル酸オキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ、インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−リジン６−オキシダーゼ、Ｌ−リジンオキシダーゼ、長鎖アルコールオキシダーゼ、Ｌ−ピペコリン酸オキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、リンゴ酸オキシダーゼ、メタンチオールオキシダーゼ、モノアミノ酸オキシダーゼ、Ｎ６−メチルリジンオキシダーゼ、Ｎ−アシルヘキソサミンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ニトロアルカンオキシダーゼ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼ、シュウ酸オキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ポリビニルアルコールオキシダーゼ、プレニルシステインオキシダーゼ、タンパク質−リジン６−オキシダーゼ、プトレシンオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ピリドキサール５’−リン酸合成酵素、ピリドキシン４−オキシダーゼ、ピロロキノリンキノン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ（ＣｏＡ−アセチル化）、レチクリンオキシダーゼ、レチナールオキシダーゼ、リファマイシン−Ｂオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、２級アルコールオキシダーゼ、亜硫酸オキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、スーパーオキシドレダクターゼ、テトラヒドロベルベリンオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、トリプトファンα，β−オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ、尿酸オキシダーゼ）、バニリル−アルコールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される過酸化水素生成酵素を含むことができる。検出可能な標識がアクリジニウム化合物である場合、キットは塩基性溶液をさらに含むことができる。塩基性溶液は、例えば、少なくとも約１０のｐＨを有する溶液であり得る。キットは、過酸化水素の源をさらに含むことができる。過酸化水素の源は、過酸化水素を含むバッファーまたは溶液を含むことができる。過酸化水素の源は、過酸化水素生成酵素を含むことができる。過酸化水素生成酵素は、（Ｒ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、（Ｓ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、３−ａｃｉ−ニトロプロパン酸オキシダーゼ、３−ヒドロキシアントラニル酸オキシダーゼ、４−ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ、６−ヒドロキシニコチン酸デヒドロゲナーゼ、アブシジン酸−アルデヒドオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ（銅含有）、アミンオキシダーゼ（フラビン含有）、アリール−アルコールオキシダーゼ、アリール−アルデヒドオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コルンバミンオキシダーゼ、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ、チトクロームｃオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アスパラギン酸オキシダーゼ、Ｄ−グルタミン酸オキシダーゼ、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−アスパラギン酸）オキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ジヒドロウラシルオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシダーゼ、Ｄ−マンニトールオキシダーゼ、エクジソンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリシンオキシダーゼ、グリオキシル酸オキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ、インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−リジン６−オキシダーゼ、Ｌ−リジンオキシダーゼ、長鎖アルコールオキシダーゼ、Ｌ−ピペコリン酸オキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、リンゴ酸オキシダーゼ、メタンチオールオキシダーゼ、モノアミノ酸オキシダーゼ、Ｎ６−メチルリジンオキシダーゼ、Ｎ−アシルヘキソサミンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ニトロアルカンオキシダーゼ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼ、シュウ酸オキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ポリビニルアルコールオキシダーゼ、プレニルシステインオキシダーゼ、タンパク質−リジン６−オキシダーゼ、プトレシンオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ピリドキサール５’−リン酸合成酵素、ピリドキシン４−オキシダーゼ、ピロロキノリンキノン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ（ＣｏＡ−アセチル化）、レチクリンオキシダーゼ、レチナールオキシダーゼ、リファマイシン−Ｂオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、２級アルコールオキシダーゼ、亜硫酸オキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、スーパーオキシドレダクターゼ、テトラヒドロベルベリンオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、トリプトファンα，β−オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ、尿酸オキシダーゼ）、バニリルアルコールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択され得る。
別の一態様において、本開示は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性部分を含む第１の単離された結合性タンパク質、およびＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を含む第２の単離された結合性タンパク質を含む、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を検出および／または定量するためのキットを提供する。第１および第２の単離された結合性タンパク質はモノクローナル抗体であることができる。第１のモノクローナル抗体は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−９６３８によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成される抗体であることができ、第２のモノクローナル抗体は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成される抗体であることができる。
別の一態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合性タンパク質の使用を含む、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を決定するための方法を提供し、各結合性タンパク質は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのサブセットのアミノ酸１−３３に特異的に結合する抗原結合性部分を含み、各結合性タンパク質の抗原結合性部分は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−３３の異なるサブセットに結合する。結合性タンパク質は、モノクローナル抗体であることができる。第１のモノクローナル抗体は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する抗原結合性部分を有することができ、第２のモノクローナル抗体は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する抗原結合性部分およびプロトロンビンの少なくともサブセットのアミノ酸１−３３に結合する抗原結合性部分を有することができる。第１のモノクローナル抗体は、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性部分を有することができ、第２のモノクローナル抗体は、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有することができる。第１のモノクローナルは、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−９６３８によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成される抗体であることができ、第２のモノクローナル抗体は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成される抗体であることができる。
３匹の胚中心関連ＤＮＡプライマーゼ（ＧＡＮＰ）トランスジェニックＢａｌｂ／Ｃマウスおよび３匹のＧＡＮＰトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化するためのペプチドＫＬＨの使用を示す模式図である。 ｍＡｂ ３Ｃ１０（抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ １７−２４）を用いたサンドイッチ反応性を用いたハイブリドーマスクリーニングの結果を示す棒グラフである。 ＰＩＶＫＡ−ＩＩ １−１３ペプチドに対するｍＡｂ ６Ｈ６のＫｄが３７±４ｎＭであることを示す、ｍＡｂ ６Ｈ６（抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ １−１３）およびＡｌｅｘａ４８８標識化したＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１−１３）の結合曲線を示すグラフである。 プロトロンビンペプチドに対する６Ｈ６ ｍＡｂのＫｄが４．６±０．５μＭであることを示す、ｍＡｂ ６Ｈ６およびＡｌｅｘａ４８８標識化したプロトロンビンペプチド（１−１３）の結合曲線を示すグラフである。 抗体反応性の部位を示すヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩ分子を示す模式図である。 ｍＡｂ ６Ｈ６を用いた自動化イムノアッセイフォーマットを示す模式図である。 図５において示したアッセイフォーマットによる、対照のコンジュゲート（ＭＡＣ１−１８）および６Ｈ６コンジュゲートの測定性能に用いた６個のＰＩＶＫＡ−ＩＩキャリブレーター各々に対するＲＬＵ（相対的な光単位）値を示すグラフである。 ０−２００００ｍＡＵ／ｍＬの範囲のピコルミＰｉｃｏｌｕｍｉ値にわたるＭＡＣ１−１８対Ｐｉｃｏｌｕｍｉを用いたアッセイ結果の相関を示すグラフである。 ０−２００００ｍＡＵ／ｍＬの範囲のピコルミＰｉｃｏｌｕｍｉ値にわたる６Ｈ６対Ｐｉｃｏｌｕｍｉを用いたアッセイ結果の相関を示すグラフである。 ＧＡＮＰトランスジェニックマウスまたは野生型マウスからのハイブリドーマの、３５ ＰＩＶＫＡ−ＩＩおよびプロトロンビンに対する反応性を示す、各群において選択されたトップ５つのハイブリドーマに関連するＰＩＶＫＡ−ＩＩおよびプロトロンビンの反応性を示す図である。 Ｍａｂ３Ｃ１０のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原に対する強力な反応性を示す、いくつかの抗体のシグナルを示す図である。 実施例６において記述した手順に関する、差し引かれたＰＩＶＫＡ−ＩＩシグナルおよびバックグラウンドを示す図である。 直接結合性実験において測定した、抗原の平衡解離定数（Ｋｄ）を示す図であり、Ａｌｅｘａ−４８８標識化されたＰＩＶＫＡＩＩ Ｇｌａドメインペプチド（１３−２７）を０．０５ｎＭに保ち、一方ＢＨＱ−ｍＡｂの濃度を５０ｎＭから０．０００２ｎＭに変化させた。 直接結合性実験において測定した抗原の平衡解離定数（Ｋｄ）を示す図であり、Ａｌｅｘａ−４８８標識化されたＰＩＶＫＡ−ＩＩ Ｇｌａドメインペプチド（１３−２７）を０．２ｎＭに保ち、一方ｍＡｂの濃度を１ｐＭからナノモル未満に変化させた。 個々の試料のＦＣＳ測定値を示す図であり、Ａｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１３−２７ｃｙｃ）を、ｍＡｂ ３Ｃ１０と予備混合し、次いで、様々な量のＧｌｕ置換したペプチド（Ｇｌａ１４、Ｇｌａ１６、Ｇｌａ１９、Ｇｌａ２０、Ｇｌａ２５、Ｇｌａ２６）を、抗原−抗体複合体に加えた。 各試料のさらなるＦＣＳ測定を示す図であり、Ａｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１３−２７ｃｙｃ）を、ｍＡｂ ３Ｃ１０と予備混合し、異なる調製物からの様々な量のＰＩＶＫＡ−ＩＩを抗原−抗体複合体に加えた。 様々なＰＩＶＫＡＩＩ Ｇｌａドメイン（１３−２７）類似体の、Ａｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（１３−２７）およびｍＡｂ ３Ｃ１０との競合的結合性の測定を用いてｍＡｂ ３Ｃ１０との交差反応性を試験したときに得られた結果を示す図である。
Ａ．序文および定義
ＰＩＶＫＡ−ＩＩタンパク質のＧＬＡドメインは、１０個のＧＬＡアミノ酸を含む、アミノ酸１−４６（またはプロトロンビン配列の４４−８８）からなる。ＰＩＶＫＡタンパク質は、脱炭酸されたＧＬＡの位置および数に関して変化する複数の形態において存在する。現在利用可能なＰＩＶＫＡ−ＩＩに対するイムノアッセイは一部分のタンパク質だけ（主に、環状ジスルフィド結合のアミノ酸１７−２３の配列）、および周囲の配列、すなわちアミノ酸１３−２７を検出する。その結果、アミノ酸１７−２３のＧＬＡの外側（脱炭酸されたＧＬＡを含む。）は検出されない。本明細書に開示する新たな抗体および方法は、ＰＩＶＫＡのアミノ酸１−１７、およびアミノ酸１７−２３の領域における脱炭酸された残基を検出するための方法を提供する。これは、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性部分を有する第１の抗ＰＩＶＫＡ抗体、およびＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有する第２の抗ＰＩＶＫＡ抗体を用いることによって実現され得る。第２の抗体は、ＰＩＶＫＡの脱炭酸されたアミノ酸残基と強力に反応することができ、脱炭酸された（通常の）アミノ酸残基と中程度に反応することができる。アッセイにおいて両方の抗体を用いることで、高レベルの特異性でＰＩＶＫＡ１３−２７およびＰＩＶＫＡ１−２７の両方を検出することができ、したがってＰＩＶＫＡ１３−２７単独を検出することによって生成されるものよりも強力なシグナルを生成する。
本開示は、したがって３７±４ｎＭまたはそれ未満のＫｄで、好ましくは１×１０−９Ｍまたはそれを超える範囲の、好ましくは約１×１０１０Ｍまたはそれを超える、ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチドに対するＫｄで、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの１つまたは複数のエピトープに結合する結合性タンパク質、特に、本明細書以後「６Ｈ６」と呼ぶモノクローナル抗体を提供する。特に、本開示の結合性タンパク質または抗体は、約１×１０−９Ｍまたはそれを超える、好ましくは約１×１０−１０Ｍまたはそれを超える、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸領域１−１３に対する解離定数（Ｋｄ）を有する。抗体はこのように、ＰＩＶＫＡ−ＩＩを特異的に認識し結合することができる。抗体がＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合した後は、例えば、プロトロンビンによって置換されない。抗体がＰＩＶＫＡ−ＩＩおよびプロトロンビンに同時に曝露された場合、本開示の６Ｈ６抗体は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩよりもプロトロンビンに対して約１０倍から約１０００倍低い親和性を有することは注目すべきことである。本発明は、本発明の抗体の可変軽鎖および可変重鎖をコードする単離されたヌクレオチド配列（およびそれらのフラグメント）、ならびにこれらのコードヌクレオチド配列に少なくとも約７０％（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％もしくは７９％）、好ましくは少なくとも約８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％もしくは８９％）、より好ましくは少なくとも約９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％）同一な配列を含む、またはそれらに対応する、同一である、ハイブリダイズ可能である、もしくは相補的である配列を有するヌクレオチド配列（またはそれらのフラグメント）も含む。（７０％と１００％の間（これらの値を含む）の整数（およびこれらの部分）は全て、パーセント同一性に関して本開示の範囲内にあるとみなされる。）このような配列はあらゆる源に由来していてよい（例えば、天然の供給源から単離され、半合成的な経路によって生成され、または新規に合成され、のいずれか）。特に、このような配列は、例に記載されている以外の源（例えば、細菌、真菌、藻類、マウスもしくはヒト）から単離されてよく、または由来していてよい。上記に記載したヌクレオチド配列の他に、本発明は、本明細書に記載する抗体の可変軽鎖および可変重鎖のアミノ酸配列（またはこれらのアミノ酸配列のフラグメント）も含む。
さらに、本開示は、本開示のタンパク質のアミノ酸配列に、少なくとも約７０％（例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％もしくは７９％）、好ましくは少なくとも約８０％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％もしくは８９％）、より好ましくは少なくとも約９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％）同一である配列を含む、またはそれらに対応する、同一である、もしくは相補的であるアミノ酸配列（またはそれらのフラグメント）も含む。（やはり、７０％と１００％の間（これらの値を含む）の整数（およびこれらの部分）は全て、（上記に注目したヌクレオチド配列の同一性に関して列挙したのと同様）パーセント同一性に関して本開示の範囲内にあるとみなされる。）本開示の目的で、ヌクレオチド配列の「フラグメント」は、指定されるヌクレオチド配列の領域に対応する、少なくともおよそ６ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドの近接する配列と定義される。「同一性」の語は、特定の比較ウインドウまたはセグメントにわたる、ヌクレオチドごとをベースとした２つの配列の関連性を意味する。したがって、同一性は、２つのＤＮＡセグメント（もしくは２つのアミノ酸配列）の同じ鎖（センスもしくはアンチセンスのいずれか）間の酷似の度合い、一致の度合い、または同等性の度合いと定義される。「配列同一性のパーセント値」は、特定の領域にわたって最適にアラインされている２つの配列を比較し、マッチする位置の数１５をもたらすために両方の配列において生じる同一の塩基またはアミノ酸の位置の数を決定し、このような位置の数を比較されるセグメントにおける合計数によって除し、結果に１００を乗じることによって算出される。配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．、２巻、４８２頁（１９８１年））のアルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁（１９７０年）のアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８５巻、２４４４頁（１９８８年）の方法によって、および関連のアルゴリズムを実行するコンピュータプログラム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｍａｃａｗ Ｐｉｌｅｕｐ（ｈｔｔｐ：／／ｃｍｇｍ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｉｏｃｈｅｍ２１８／１１Ｍｕｌｔｉｐｌｅ．ｐｄｆ；Ｈｉｇｇｉｎｓら、ＣＡＢＩＯＳ．５Ｌ１５１−１５３頁（１９８９年））によって、ＦＡＳＴＤＢ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５巻：３３８９−３４０２頁（１９９７年））、ＰＩＬＥＵＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ、７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって行われ得る。（米国特許第５，９１２，１２０号を参照されたい）。
本開示の目的で、「相補性」は、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の度合いと定義される。これは、二重らせんを形成するのに好適な条件下、他のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズするセンス鎖の１ＤＮＡセグメントの能力を測定することによって決定される。「コンプリメント（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）」は、基準の塩基対ルールに基づいて所与の配列と対になる配列と定義される。例えば、１ヌクレオチド鎖における配列Ａ−Ｇ−Ｔは、他の鎖におけるＴ−Ｃ−Ａに「相補的」である。二重らせんにおいて、アデニンが一方の鎖に出現し、チミンが他方の鎖に出現する。同様に、一方の鎖においてグアニンが見出される場合はいつでも、他方にシトシンが見出される。２つのＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列間の関連性が大きいほど、２つのＤＮＡセグメントの鎖間にハイブリッドの二本鎖を形成する能力が大きい。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、両配列における、一連の同一で、保存されているアミノ酸残基の存在と定義される。２つのアミノ酸配列間の類似性の度合いが高いほど、２つの配列の一致性、同一性または同等性は高い。（２つのアミノ酸配列間の同一性は、両方の配列における一連の全く同様または不変のアミノ酸残基の存在と定義される。）「相補性」、「同一性」および「類似性」の定義は、当業者にはよく知られている。「によってコードされる」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ポリペプチド配列またはその部分は、核酸配列によってコードされるポリペプチドから、少なくとも３個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸のアミノ酸配列を含んでいる。
本明細書で用いられる「生物学的活性」の語は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの固有の生物学的性質全てを意味する。このような性質は、例えば、本明細書に記載する抗体に結合する能力を含む。本明細書で用いられる「機能的同等物」は、本開示の抗体と同じ特徴（例えば、結合親和性）を有するタンパク質（例えば、抗体）を意味する。
本明細書で用いられる「ポリペプチド」の語は、アミノ酸のあらゆるポリマー鎖を意味する。「ペプチド」および「タンパク質」の語はポリペプチドの語と区別しないで用いられ、アミノ酸のポリマー鎖をやはり意味する。「ポリペプチド」の語は、天然のタンパク質または人工のタンパク質、タンパク質フラグメントおよびタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドはモノマー性でも、またはポリマー性でもよい。「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」の語は、その起源または由来の源によって、その天然の状態においてそれに付随する天然に関連する構成成分に関連しないタンパク質またはポリペプチドであり、同じ種からの他のタンパク質が本質的になく、異なる種からの細胞によって発現され、または天然に存在しない。したがって、化学的に合成されるポリペプチド、またはそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞のシステムにおいて合成されるポリペプチドは、その天然に関連する構成成分から「単離されて」いる。タンパク質は、また、当技術分野においてよく知られているタンパク質精製技術を用いて、単離することによって、天然に関連する構成成分が本質的にないようにされてよい。
本明細書で用いられる「回収する」の語は、例えば、当技術分野においてよく知られているタンパク質精製技術を用いて、単離によって天然に関連する構成成分が本質的にないポリペプチドなどの化学種にするプロセスを意味する。
本明細書で用いられる「結合」、「特異的結合」または「特異的に結合する」の語は、抗体、タンパク質またはペプチドの、第２の化学種との相互作用に関して、相互作用が化学種上の特定の構造（例えば、抗原性決定基もしくはエピトープ）の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は、一般的にタンパク質よりもむしろ特異的なタンパク質構造を認識し、結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識化されている「Ａ」および抗体を含む反応における、エピトープＡ（または遊離の、非標識のＡ）を含む分子の存在は、抗体に結合する標識化されているＡの量を低減する。
本明細書で用いられる「抗体」の語は、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖からなるあらゆる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、またはＩｇ分子の本質的なエピトープ結合性の性質を保持している、あらゆる機能上のこれらのフラグメント、変異体、変形もしくは誘導体を広く意味する。このような変異体、変形、または誘導体の抗体のフォーマットは、当技術分野において知られている。この非制限的な実施形態を以下に論じる。全長の抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略記する）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、ＣＬの１つのドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域に散りばめられる、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。ＶＨおよびＶＬは各々、以下：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番においてアミノ末端からカルボキシ末端まで配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。免疫グロブリン分子はあらゆるタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであってよい。
本明細書で用いられる、抗体の「抗原結合性部分」（または、単に「抗原部分」）の語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントを意味する（例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの１つまたは複数のエピトープ）。抗体の抗原結合性の機能は、全長の抗体の１つまたは複数のフラグメントによって行われ得ることが示されている。このような抗体の実施形態は、二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、二特異性（ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃ）、または多重特異性であってもよく、２つまたはそれを超える異なる抗原に特異的に結合する。抗体の「抗原結合性部分」の語の範囲内に包含される結合性フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価のフラグメントであるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）単一の可変ドメインを含むＤＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻、５４４−５４６頁、本明細書に参照により組み込む、Ｗｉｎｔｅｒら、国際公開第９０／０５１４４ Ａ１号）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、これらは組換え方法を用いて、ＶＬ領域およびＶＨ領域の対が１価の分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製されるのを可能にする合成のリンカーによって、連結され得る（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、４２３−４２６頁、およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、５８７９−５８８３頁を参照されたい）。このような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合性部分」の語の範囲内に包含される。ダイアボディなどの他の形態の単鎖抗体も包含される。ダイアボディは２価の、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現される二重特異性抗体であるが、非常に短いので同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするリンカーを用いて、それによってドメインを別の鎖の相補的なドメインと対を作らせ、２つの抗原結合性部位を作り出す（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４４−６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻、１１２１−１１２３頁を参照されたい）。このような抗体結合性部分は当技術分野において知られている（ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２００１年）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、７９０頁（ＩＳＢＮ３−５４０−４１３５４−５）。
本明細書で用いられる「抗体構築物」の語は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインに連結している、本開示の抗原結合性部分を１つまたは複数含むポリペプチドを意味する。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合によって連結されている２つまたはそれを超えるアミノ酸残基を含み、１つまたは複数の抗原結合性部分に連結させるのに用いられる。このようなリンカーポリペプチドは当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６４４４−６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻、１１２１−１１２３頁を参照されたい）。免疫グロブリン定常ドメインは、重鎖または軽鎖の定常ドメインを意味する。ヒトＩｇＧの重鎖および軽鎖の定常ドメインのアミノ酸配列は当技術分野において知られている。その上さらに、抗体またはその抗原結合性部分は、抗体または抗体の部分の、１つもしくは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合性または非共有結合性の会合によって形成される、より大型の免疫接着分子の部分であってよい。このような免疫接着分子の例は、四量体のｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９５年）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６巻、９３−１０１頁）、ならびに２価のビオチン化したｓｃＦｖ分子を作製するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、Ｓ．Ｍ．ら（１９９４年）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻、１０４７−１０５８頁）を含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの抗体の部分は、抗体全体から、抗体全体の、それぞれパパイン消化またはペプシン消化などの従来の技術を用いて調製され得る。さらに、抗体、抗体の部分および免疫接着分子は、本明細書に記載する標準の組換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
本明細書で用いられる「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体（例えば、本開示の抗体が反応性であるＰＩＶＫＡ−ＩＩの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合し、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ内に存在するもの以外の抗原またはエピトープに特異的に結合する抗体が本質的にない、単離された抗体）を意味するものとされる。
「Ｋａｂａｔナンバリング」、「Ｋａｂａｔの定義」および「Ｋａｂａｔラベリング」は、本明細書において区別しないで用いられる。これらの語は、当技術分野において認められており、抗体の重鎖および軽鎖可変領域、またはその抗原結合性部分において、他のアミノ酸残基よりも可変性である（すなわち、超可変性である）アミノ酸残基を番号付けるシステムを意味する（Ｋａｂａｔら（１９７１年）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ、Ｓｃｉ．、１９０巻、３８２−３９１頁、およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第９１−３２４２）。
本明細書で用いられる「ＣＤＲ」の語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖および軽鎖の各可変領域において３個のＣＤＲが存在し、これらは各可変領域に対してＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれている。
本明細書で用いられる「ＣＤＲセット」の語は、抗原に結合することができる単一の可変領域中に生じる１グループの３個のＣＤＲを意味する。これらＣＤＲの正確な境界は、様々なシステムにしたがって様々に定義されている。Ｋａｂａｔによって記載されているシステムは（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９８７年）および（１９９１年））、抗体のあらゆる可変領域に適用可能な明確な残基のナンバリングシステムを提供するだけでなく、３個のＣＤＲを規定する正確な残基の境界も提供する。これらＣＤＲはＫａｂａｔのＣＤＲと呼ばれることがある。Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１−９１７頁（１９８７年）、およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻、８７７−８８３頁（１９８９年））は、ＫａｂａｔのＣＤＲ内のあるサブ部分が、アミノ酸配列のレベルで際立った多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチドのバックボーンの高次構造を適用していることを見出した。これらサブ部分はＬ１、Ｌ２およびＬ３、またはＨ１、Ｈ２およびＨ３と呼ばれ、「Ｌ」および「Ｈ」はそれぞれ軽鎖および重鎖の領域をさす。これらの領域はＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲと呼ばれることがあり、ＫａｂａｔのＣＤＲと重複する境界を有する。ＫａｂａｔのＣＤＲと重複するＣＤＲを規定する他の境界はＰａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ Ｊ．、９巻、１３３−１３９頁（１９９５年））、およびＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＬＴ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２６２巻（５）、７３２−４５頁（１９９６年））によって記載されている。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、上記のシステムの１つに厳密に従わなくてもよいが、特定の残基もしくは残基のグループ、またはさらにＣＤＲ全体が抗原結合性に著しく影響を及ぼさないという予測または実験上の知見を考慮して短縮または延長され得るとはいえ、それにもかかわらずＫａｂａｔのＣＤＲと重複する。本明細書で用いられる方法は、あらゆるこれらのシステムにしたがって規定されるＣＤＲを利用することがあるが、好ましい実施形態はＫａｂａｔまたはＣｏｔｈｉａが規定したＣＤＲを用いるものである。
本明細書で用いられる「基準の」残基の語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（両方とも参照により本明細書に組み込む、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻、９０１−９０７頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７巻、７９９頁（１９９２年））によって規定される特定の基準のＣＤＲ構造を規定するＣＤＲまたはフレームワークにおける残基を意味する。Ｃｈｏｔｈｉａらによると、多くの抗体のＣＤＲの決定的な部分は、アミノ酸配列のレベルで際立った多様性があるのにかかわらず、ほぼ同一のペプチドバックボーンの高次構造を有する。各々の基準の構造は、ループを形成するアミノ酸残基の近接するセグメントに対して１セットのペプチドバックボーンのねじれ角を主に特定する。
本明細書で用いられる「主要な」残基の語は、抗体、とりわけヒト化抗体の結合特異性および／または結合親和性に対してより影響を有する可変領域内のある残基を意味する。主要な残基は、それだけには限定されないが、以下の１つまたは複数：ＣＤＲに隣接する残基、潜在的なグリコシル化部位（Ｎ−グリコシル化部位またはＯ−グリコシル化部位のいずれかであってよい）、稀な残基、抗原と相互作用することができる残基、ＣＤＲと相互作用することができる残基、基準の残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニヤゾーン（Ｖｅｒｎｉｅｒ ｚｏｎｅ）内の残基、Ｃｏｔｈｉａの定義の可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔ定義の第１の重鎖フレームワークとの間の重複する領域における残基を含む。本明細書で用いられる「バーニヤ」ゾーンは、ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ（参照により本明細書に組み込む、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２４巻、４８７−４９９頁）によって記載される、ＣＤＲ構造に調節し、抗原に対する結合を微調整することができるサブセットのフレームワーク残基を意味する。バーニヤゾーン残基は、ＣＤＲの根底をなす層を形成し、抗体のＣＤＲの構造および親和性に影響を及ぼすことがある。
「活性」の語は、本開示の抗体が反応性である抗原または抗原（複数）などの、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性などの活性を含む。
「エピトープ」の語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるあらゆるポリペプチドの決定基を含む。ある実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖の側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面のグループ分けを含み、ある実施形態において、特異的な３次元構造の特徴、および／または特異的な電荷の特徴を有することがある。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。ある実施形態において、抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複合体混合物においてその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。
本明細書で用いられる「表面プラズモン共鳴法」の語は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、ＳｗｅｄｅｎおよびＰｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度における変更を検出することによって、リアルタイムの生体分子特異的な相互作用を分析することができる光学的現象を意味する。さらなる記載には、Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９３年）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．、５１巻、１９−２６頁；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｕ．ら（１９９１年） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１１巻、６２０−６２７頁；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．ら（１９９５年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、８巻、１２５−１３１頁；およびＪｏｈｎｎｓｏｎ、Ｂ．ら（１９９１年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８巻、２６８−２７７頁を参照されたい。
本明細書で用いられる「Ｋｏｎ」の語は、当技術分野において知られている、抗体が抗原に対して会合して抗体／抗原複合体を形成するオンの速度定数を意味するものとされる。
本明細書で用いられる「Ｋｏｆｆ」の語は、当技術分野において知られている、抗体が抗体／抗原複合体から解離するオフの速度定数を意味するものとされる。
本明細書で用いられる「Ｋｄ」の語は、当技術分野において知られている、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を意味するものとされる。
本明細書で用いられる「標識化されている結合性タンパク質」の語は、結合性タンパク質の同定をもたらす、組み入れられている標識を有するタンパク質を意味する。好ましくは、標識は検出可能なマーカー、例えば、放射標識されたアミノ酸の組入れ、または標識化されているアビジンによって検出され得るビオチニル部分のポリペプチドに対する付着である（例えば、光学的方法または比色法によって検出され得る蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）。ポリペプチドに対する標識の例は、それだけには限定されないが、以下：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド、リン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、２次レポーターによって認識される予め決定されたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、２次抗体に対する結合性部位、金属結合性ドメイン、エピトープタグ）、ならびにガドリニウムキレートなどの磁性物質を含む。
「抗体コンジュゲート」の語は、治療物質または細胞毒性物質などの第２の化学部分に化学的に連結している、抗体などの結合性タンパク質を意味する。
「物質」の語は、本明細書において、化学物質、化学物質の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的材料から作られる抽出物を表すのに用いられる。好ましくは、治療物質または細胞毒性物質は、それだけには限定されないが、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体またはホモログを含む。
本明細書で用いられる「結晶」および「結晶化した」の語は、結晶の形態において存在する抗体またはその抗原結合性部分を意味する。結晶は、無定形な固体状態または液晶状態などの他の形態とは異なる、物質の固体状態の一形態である。結晶は、規則的な、繰り返しの、三次元の、原子、イオン、分子（例えば、抗体などのタンパク質）、または分子アセンブリ（例えば、抗原／抗体複合体）の配列からなる。これら３次元の配列は、当技術分野において十分理解されている特定の数学的関係にしたがって配列されている。結晶において繰り返される根本的な単位または構築ブロックは、非対称ユニットと呼ばれる。所与の、明確な、結晶学的な対称性に合致させる整列における非対称ユニットの繰返しが、結晶の「単位格子」を提供する。全ての３次元における規則的な翻訳による単位格子の繰返しが結晶を提供する。Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．およびＤｕｃｒｕｉｘ，Ａ．Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第２版、２０頁、１−１６、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９９９年）を参照されたい。
本明細書に言及される「ポリヌクレオチド」の語は、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型の、２つまたはそれを超えるヌクレオチドのポリマー型を意味する。この語は、一重鎖および二重鎖の形態のＤＮＡを含むが、二重鎖ＤＮＡが好ましい。
本明細書で用いられる「単離されたポリヌクレオチド」の語は、その起源のせいで、「単離されたポリヌクレオチド」が天然において見られるポリヌクレオチドの全部または部分と関連せず、天然において連結していないポリヌクレオチドに操作可能に連結しており、またはより大型の配列の部分として天然において存在しない、（例えば、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、もしくは合成起源の、またはこれらのいくつかの組合せの）ポリヌクレオチドを意味する。
本明細書で用いられる「ベクター」の語は、それに連結されている別の核酸を運搬することができる核酸分子を意味するものとされる。一タイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、その中にさらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二重鎖ＤＮＡループを意味する。別の一タイプのベクターはウイルスベクターであり、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。ある種のベクターは、その中にベクターが導入された宿主細胞において自主的に複製することができる（例えば、細菌の複製開始点およびエピソームの哺乳動物ベクターを有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入されたときに宿主細胞のゲノム中に組み入れられ得、それによって宿主のゲノムと一緒に複製される。さらに、ある種のベクターは、それに対して操作可能に連結される遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または、単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用性のある発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられる形態のベクターであるとして、区別しないで用いられてよい。しかし、本発明は、等価の機能を供給するウイルスベクター（例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など、このような他の形態の発現ベクターを含むものとされる。
「操作可能に連結している」の語は並置を意味し、記載されている構成成分が意図されたやり方において機能するのを可能にする関係にある。コード配列に「操作可能に連結している」制御配列は、制御配列に適合する条件下、コード配列の発現が実現される方法でライゲートされている。「操作可能に連結している」配列は、対象の遺伝子と近接する発現制御配列、およびトランスにおいて、または対象の遺伝子を制御する距離で作用する発現制御配列の両方を含む。
本明細書で用いられる「発現制御配列」の語は、それに対してライゲートしているコード配列の発現およびプロセシングをもたらすのに必要であるポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、好適な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質のｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を増強する配列；ならびに所望の場合、タンパク質分泌を増強する配列を含む。このような制御配列の性質は宿主の生物体に応じて異なり；原核生物において、このような制御配列は一般的にプロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含み、真核生物において、このような制御配列は一般的にプロモーターおよび転写終結配列を含む。
「制御配列」の語は、その存在が発現およびプロセシングに不可欠である構成成分を含むものとされ、リーダー配列および融合パートナー配列など、その存在が有利であるさらなる構成成分も含むことができる。本明細書において規定する「形質転換」は、それによって外来のＤＮＡが宿主細胞に入るあらゆるプロセスを意味する。形質転換は、当技術分野においてよく知られている様々な方法を用いて、天然または人工的な条件下で生じ得る。形質転換は、外来の核酸配列の、原核生物または真核生物の宿主細胞中への挿入のためのあらゆる知られている方法によるものでよい。方法は、形質転換される宿主細胞に基づいて選択され、それだけには限定されないが、ウイルス感染、電気穿孔、リポフェクションおよび微粒子銃を含むことができる。このような「形質転換された」細胞は、挿入されたＤＮＡが自己複製するプラスミドとして、または宿主の染色体の一部としてのいずれかで複製することができる、安定に形質転換された細胞を含む。これらはまた、限られた期間、挿入されたＤＮＡまたはＲＮＡを一過性に発現する細胞も含む。
本明細書で用いられる「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）の語は、その中に外来のＤＮＡが導入されている細胞を意味するものとされる。このような語は、特定の対象の細胞だけを意味するものとされるのではなく、このような細胞の子孫も意味するものとされることを理解すべきである。ある種の修飾は、変異または環境の影響のいずれかのせいで後世において生じることがあるので、このような子孫は、実際、親細胞と同じではないかもしれないが、本明細書で用いられる「宿主細胞」の語の範囲内に依然として含まれる。宿主細胞は、生命のあらゆる界から選択される原核細胞および真核細胞を含んでいるのが好ましい。好ましい真核細胞は、原生生物細胞、真菌細胞、植物細胞および動物細胞を含む。最も好ましくは、宿主細胞は、それだけには限定されないが、原核細胞系統エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）；哺乳動物細胞系統ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３およびＣＯＳ；昆虫細胞系統Ｓｆ９；および真菌細胞サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含む。標準的な技術が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織の培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）に用いられてよい。酵素反応および精製の技術は、製造元の規格にしたがって、または当技術分野において一般的に行われ、もしくは本明細書に記載される通りに行われてよい。前述の技術および手順は、一般的に、当技術分野においてよく知られている従来の方法にしたがって、および本明細書を通して引用され、論じられる様々な一般的でより詳しい参照に記載されている通りに行われてよい。例えば、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。当技術分野において知られており、本明細書で用いられる「トランスジェニック生物体」は、導入遺伝子を含む細胞を有する生物体を意味し、生物体（または、生物体の先祖）中に導入される導入遺伝子は、生物体において天然に発現されないポリペプチドを発現する。「導入遺伝子」は、それからトランスジェニック生物体が発生し、トランスジェニック生物体の１つもしくは複数の細胞型または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を指示する、細胞のゲノム中に安定に、操作可能に組み入れられるＤＮＡ構築物である。
「調節する」および「モジュレートする」の語は区別しないで用いられ、本明細書で用いられる通り、対象の分子の活性における変化または変更を意味し、モジュレーションは対象の分子のある種の活性または機能の大きさにおける増大または低減であってよい。例示の分子の活性および機能は、それだけには限定されないが、結合性の性質、酵素活性、細胞受容体活性化およびシグナル伝達を含む。同様に、本明細書で用いられる「モジュレーター」の語は、対象の分子の活性または機能を変化または変更することができる化合物である。例えば、モジュレーターは、モジュレーターの非存在下で観察される活性または機能の大きさに比べて、分子のある種の活性または機能の大きさにおける増大または低減を引き起こすことができる。ある実施形態において、モジュレーターは、分子の活性または機能の少なくとも１つの大きさを低減するインヒビターである。例示のインヒビターは、それだけには限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、炭水化物または有機小分子を含む。ペプチボディは、例えば、国際公開第０１／８３５２５号に記載されている。
本明細書で用いられる「アゴニスト」の語は、対象の分子と接触させた場合、アゴニストの非存在下で観察される活性または機能の大きさに比べて、分子のある種の活性または機能の大きさにおける増大を引き起こすモジュレーターを意味する。
本明細書で用いられる「アンタゴニスト」または「インヒビター」の語は、対象の分子と接触させた場合、アンタゴニストの非存在下で観察される活性または機能の大きさに比べて、分子のある種の活性または機能の大きさにおける低減を引き起こすモジュレーターを意味する。
本明細書で用いられる「有効量」の語は、障害または１つもしくは複数のその症状の重症度および／または期間を低減または改善し、障害の前進を予防し、障害の退行をもたらし、障害に伴う１つもしくは複数の症状の再発、発症、開始または進行を予防し、障害を検出し、または別の治療（例えば、予防薬または治療薬）の予防効果または治療効果（１つもしくは複数）を増強もしくは改善するのに十分である治療の量を意味する。
本明細書で用いられる「試料」の語は、その最も広い意味において用いられる。本明細書で用いられる「生物学的試料」は、それだけには限定されないが、生存するものまたは以前に生存したものからのあらゆる量の物質を含む。このような生存するものは、それだけには限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ウサギおよび他の哺乳動物または非哺乳動物の動物を含む。このような物質は、それだけには限定されないが、血液、血清、尿、滑液、細胞、臓器、組織（例えば、脳）、骨髄、リンパ節、脳脊髄液および脾臓を含む。
本明細書において別段の規定がなければ、本開示に関連して用いられる科学技術用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。用語の意味および範囲は明確でなければならないが、あらゆる潜在的な不明確さの場合には、本明細書に提供される定義が、あらゆる辞書上の、または本質的でない定義を凌いで前例を取る。さらに、状況によって他の方法が必要とされなければ、単数の語は複数を含み、複数の語は単数を含む。
本出願において、別段の記載がなければ、「または」の使用は「および／または」を意味する。さらに「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の語、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は限定的なものではない。また、「エレメント」または「構成成分」などの語は、特に別段の記載がなければ、１つのユニットおよびエレメントを含むエレメントおよび構成成分、ならびに１つを超えるサブユニットを含むエレメントおよび構成成分の両方を包含する。一般的に、本明細書に記載する、細胞培養および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸の化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法および技術はよく知られており、当技術分野において一般的に用いられているものである。
本明細書で用いられる「過酸化水素生成酵素」の語は、分子式Ｈ２Ｏ２を有する化学物質、すなわち過酸化水素を、反応生成物として生成することができる酵素を意味する。過酸化水素生成酵素の非限定的な例を以下の表Ａにおいて列挙する。
Figure 2013541936
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本発明の方法および技術は、一般的に、当技術分野においてよく知られている従来の方法にしたがって行われ、別段の指摘がなければ本明細書を通して引用され、論じられる様々な一般的な、より詳しい参照に記載される通りに行われる。酵素反応および精製技術は、製造元の規格にしたがって、当技術分野において一般的に達成される通り、または本明細書に記載される通りに行われる。本明細書に記載する、分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および薬剤化学に関連して、またこれらの検査法および検査技術において用いられる命名法は、当技術分野においてよく知られており、一般的に用いられているものである。化学合成、化学分析、薬剤調製、調合および送達、ならびに患者の処置に、標準的技術が用いられる。
本発明にしたがって、特に、本発明の抗体の結合親和性を評価する目的で、プロセスは、参照により本明細書に全体を組み込む、国際公開第２００４／０６７５６１号に記載されている通りに用いられてよい。前記プロセスは、天然の、組換えもしくは合成のペプチド、またはその誘導体をアンフォールディングし；少なくとも部分的にアンフォールディングされたペプチドまたはその誘導体を洗剤に曝し、洗剤の作用を低減し、インキュベートを続けることを含む。ペプチドをアンフォールディングする目的で、例えば、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）などの水素結合破壊剤（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ−ｂｒｅａｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ）が、タンパク質に対して作用させられてもよい。作用温度が約２０℃から５０℃までである場合、とりわけ約３５℃から４０℃までである場合、約１０分から６０分までなど、数分の作用時間で十分である。蒸発乾固された残渣は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの水性バッファーと混和性の適切な有機溶媒中、好ましくは濃縮された形態において引き続き溶解され、少なくとも部分的にアンフォールディングされたペプチドまたはその誘導体の懸濁液がもたらされてこれが引き続き用いられてよい。必要であれば、懸濁貯蔵液は、約−２０℃などの低温でしばらく貯蔵されてよい。別法として、ペプチドまたはその誘導体は、約１０ｍＭのＨＣｌ水溶液など、わずかに酸性の、好ましくは水溶液中に取り込まれてもよい。通常数分のインキュベート時間の後、不溶性成分は遠心分離によって除去される。１００００ｇで数分が好都合である。これらの方法のステップは、室温、すなわち２０℃から３０℃までの範囲の温度で行うのが好ましい。遠心分離後に得られた上清は、ペプチドまたはその誘導体を含んでおり、しばらくの間、約−２０℃などの低温で貯蔵してもよい。
Ｂ．モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組合せの使用を含む、当技術分野において知られている広範囲の技術を用いて調製され得る。例えば、本開示のモノクローナル抗体は、当技術分野において知られており、教示されているものを含むハイブリドーマ技術、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−ＣｅＩｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、５６３−６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年）（前記参照はその全文が参照により組み込まれる）を用いて生成されるのが好ましい。
本明細書で用いられる「モノクローナル抗体」の語は、ハイブリドーマ技術によって生成される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」の語は、あらゆる真核生物、原核生物、またはファージクローンを含めた単一のクローンに由来する抗体を意味し、それによってそれが生成される方法ではない。
ハイブリドーマ技術を用いて特異的な抗体を生成し、スクリーニングするための技術は、当技術分野において日常的であり、よく知られている。一実施形態において、本開示は、モノクローナル抗体、および本開示の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法によって生成される抗体を産生する方法を提供し、ハイブリドーマは、本開示の抗原で免疫化されたマウスから単離される脾細胞をミエローマ細胞と融合し、次いで本開示のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに対して、融合物から得られるハイブリドーマをスクリーニングすることによって産生されるのが好ましい。簡潔に述べると、マウスは対象の抗原で免疫化され得る。好ましい一実施形態において、抗原は、免疫反応を刺激するためのアジュバントと一緒に投与される。このようなアジュバントは、フロイントの完全アジュバントもしくは不完全アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激性複合体）を含む。このようなアジュバントは、局所沈着物中にポリペプチドを捕捉することによって速やかな分散からポリペプチドを保護することがあり、またはこれらはマクロファージおよび免疫系の他の構成成分に対して走化性である因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含んでいることがある。好ましくは、ポリペプチドが投与される場合、免疫化のスケジュールは、数週間に渡って拡散される、ポリペプチドの２つまたはそれを超える投与を伴う。
動物が抗原で免疫化された後、抗体および／または抗体産生細胞は動物から得ることができる。抗体を含有する血清は、動物から、動物を出血させ、または屠殺することによって得られる。血清は、動物からそれが得られたまま用いられてよく、免疫グロブリン分画は血清から得られてよく、または抗体は血清から精製されてよい。このやり方で得られた血清または免疫グロブリンはポリクローナルであり、したがって不均一な配列の性質を有する。
例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されるなど、免疫反応が検出された後、マウスの脾臓を収集し、脾細胞を単離する。次いで、脾臓細胞を、よく知られている技術によって、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手できる細胞系統ＳＰ２０からの細胞など、あらゆる適切なミエローマ細胞に融合する。ハイブリドーマを選択し、限外希釈法によってクローニングする。次いで、ハイブリドーマクローンを、対象のペプチドまたは抗原に結合することができる抗体を分泌する細胞に対して、当技術分野において知られている方法によってアッセイする。一般的に高レベルの抗体を含んでいる腹水は、ポジティブのハイブリドーマクローンで免疫化したマウスによって産生され得る。
別の実施形態において、抗体生成性の不死化ハイブリドーマは、免疫化した動物から調製され得る。免疫化後、動物を屠殺し、当技術分野においてよく知られている通り、脾臓Ｂ細胞を不死化したミエローマ細胞と融合する。例えば、上述ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅを参照されたい。好ましい一実施形態において、ミエローマ細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞系統）。融合および抗生物質選択の後、ハイブリドーマは、抗原もしくはその部分、または抗原を発現する細胞を用いてスクリーニングされる。好ましい一実施形態において、最初のスクリーニングは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、好ましくはＥＬＩＳＡを用いて行われる。ＥＬＩＳＡスクリーニングの一例は、参照により本明細書に組み込む、国際公開第００／３７５０４号に提供されている。
抗体生成性ハイブリドーマが選択され、クローニングされ、ハイブリドーマの活発な成長、抗体の高生成性、および下記にさらに論じる所望の抗体の特徴を含めた望ましい性質に対してさらにスクリーニングされる。ハイブリドーマは、ヌードマウスなどの免疫系を欠く動物などの同質遺伝子的な動物においてインビボで、またはインビトロの細胞培養において培養および拡張されてもよい。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、拡張する方法は、当業者にはよく知られている。
好ましい一実施形態において、ハイブリドーマは、上記に記載した通り、マウスのハイブリドーマである。別の好ましい一実施形態において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマなどの非ヒトの、非マウスの種において生成される。別の一実施形態において、ハイブリドーマは、ヒトの非分泌性のミエローマが抗体を発現するヒトの細胞と融合しているヒトハイブリドーマである。
Ｃ．抗体を生成する他の方法
上記に記述した通り、本開示の抗体は、当技術分野において知られているあらゆる数々の技術によって生成されてよい。例えば、抗体は、宿主細胞からの発現に基づいて生成されてよく、この場合、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（１つまたは複数）が、標準の技術によって宿主細胞中に形質転換される。様々な形態の「形質転換」の語が、外来のＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞中に導入するのに一般的に用いられる広範囲の技術（例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈澱、ＤＥＡＥ−デキストラン形質転換など）を包含するものとされる。本開示の抗体を原核生物または真核生物の宿主細胞のいずれかにおいて発現させるのは可能であるが、真核細胞における抗体の発現が好ましく、哺乳動物の宿主細胞におけるのが最も好ましい、というのはこのような真核細胞（特に、哺乳動物細胞）は、原核細胞よりも集合し、適切に折りたたまれた免疫学的に活性な抗体を分泌する可能性が高いからである。
本開示の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物の宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＤＨＦＲ選択可能マーカーと一緒に用いられるＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、（１９８０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻、４２１６−４２２０頁に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む（例えば、Ｒ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２年）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９巻、６０１−６２１頁に記載されている通り））、ＮＳＯミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物の宿主細胞中に導入された場合、宿主細胞を、宿主細胞中で抗体の発現を可能にするのに十分な期間培養することによって、またはより好ましくは、宿主細胞を増殖させた培地中に抗体を分泌させることによって、抗体が生成される。抗体は、標準のタンパク質精製方法を用いて、培地から回収され得る。
宿主細胞が、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子などの機能的な抗体フラグメントを生成するのに用いられてもよい。上記の手順に対する変形も本開示の範囲内であることが理解される。例えば、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖いずれかの機能的なフラグメントをコードするＤＮＡを宿主細胞にトランスフェクトするのが望ましいことがある。組換えＤＮＡの技術が、対象の抗原に結合するのに必要ではない軽鎖および重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡのいくつかまたは全てを除去するのに用いられてもよい。このような切断されたＤＮＡ分子から発現される分子も、本開示の抗体によって包含される。さらに、標準的な化学的架橋結合の方法によって本開示の抗体を第２の抗体に架橋結合することによって、一方の重鎖および一方の軽鎖が本開示の抗体であり、他方の重鎖および軽鎖が対象の抗原以外の抗原に特異的である、二機能性抗体が生成され得る。
本開示の抗体またはその抗原結合性部分を組換え発現させるための好ましい一システムにおいて、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターが、リン酸カルシウムが媒介するトランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞中に導入される。組換え発現ベクター内で、抗体の重鎖および軽鎖の遺伝子は各々、遺伝子の高レベルの転写を駆動するように、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントに操作的に連結している。組換え発現ベクターはまたＤＨＦＲ遺伝子を保有しており、ＤＨＦＲ遺伝子は、メトトレキセート選択／増幅を用いてベクターにトランスフェクトされるＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体の宿主細胞を培養して、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にし、インタクトな抗体が培地から回収される。標準の分子生物学技術を用いて、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培地から抗体を回収する。またさらに、本発明は、本開示の組換え抗体が合成されるまで適切な培地中で本開示の宿主細胞を培養することによって、本開示の組換え抗体を合成する方法を提供する。方法は、培地から組換え抗体を単離することをさらに含むことができる。
Ｄ．診断および他の適用のための抗体の調製
上記に記述した通り、本開示の抗体を、例えば、当技術分野において知られているいくつかのインビトロおよびインビボアッセイのいずれか１つによって評価して、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの１つまたは複数のエピトープに対して高い結合親和性を表すのが好ましい（例えば、下記の例を参照されたい）。
ある実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域がＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域であるのが好ましい。さらに、抗体は、カッパ軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域のいずれかの軽鎖定常領域を含むことができる。抗体がカッパ軽鎖定常領域を含むのが好ましい。あるいは、抗体部分は、例えば、Ｆａｂフラグメントまたは単鎖Ｆｖフラグメントであってよい。
抗体のエフェクター機能を変更するためのＦｃ部分におけるアミノ酸残基の置換は、当技術分野において知られている（Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２６０号および第５，６２４，８２１号）。抗体のＦｃ部分は、いくつかの重要なエフェクター機能、例えば、サイトカイン誘導、ＡＤＣＣ、食作用、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）ならびに抗体および抗原−抗体複合体の半減期／クリアランス速度を媒介する。ある場合には、これらのエフェクター機能は治療用抗体には望ましいが、他の場合には、治療上の目的に応じて不必要であり、または有害でさえあることもある。ある種のヒトＩｇＧイソ型、とりわけＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、それぞれＦｃγＲおよび補体のＣ１ｑに結合することによってＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介する。新生児のＦｃ受容体（ＦｃＲｎ）は、抗体の循環半減期を決定する決定的な構成成分である。さらに別の一実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸残基が、抗体のエフェクター機能が変更されるように、抗体のＦｃ領域などの抗体の定常領域において置換されている。
一実施形態は、標識化された結合性タンパク質を提供するものであり、この場合、本開示の抗体または抗体の部分は誘導体化され、または別の機能的な分子（例えば、別のペプチドもしくはタンパク質）に連結している。例えば、本開示の標識化された結合性タンパク質は、本開示の抗体または抗体の部分を、別の抗体（例えば、二重特異性抗体もしくはダイアボディ）、検出可能な物質、細胞毒性物質、薬剤、および／または抗体もしくは抗体部分の別の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグ）との会合を媒介することができるタンパク質またはペプチドなどの、１つまたは複数の他の分子実体に機能的に連結（化学的なカップリング、遺伝子融合、非共有結合性の連結もしくはその他の方法によって）することによって派生していてよい。
本開示によるイムノアッセイは、その各々がＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合する１つまたは複数の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体を使用する。ある実施形態において、本明細書に開示する抗体は検出可能な標識を有する。本開示の検出抗体において用いるのに適する検出可能な標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段によって検出可能な部分を有するあらゆる化合物または組成物を含む。このような標識は、例えば、酵素、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、ケミルミノフォア（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）、フルオロフォア、蛍光消光剤、化学発光消光剤、またはビオチンを含む。したがって、例えば、光学シグナル（ｏｐｔｉｃａｌ ｓｉｇｎａｌ）を用いるイムノアッセイにおいて、光学シグナルは、化学発光、蛍光、リン光、電気化学発光、紫外吸収、可視吸収、赤外吸収、屈折、表面プラズモン共鳴における分析物濃度依存性の変化として測定される。電気シグナルを用いるイムノアッセイにおいて、電気シグナルは、電流、抵抗、電位、質量対電荷比、またはイオン計数における分析物濃度依存性の変化として測定される。状態変化（ｃｈａｎｇｅ−ｏｆ−ｓｔａｔｅ）シグナルを用いるイムノアッセイにおいて、状態変化シグナルが、サイズ、溶解度、質量、または共鳴における分析物濃度依存性の変化として測定される。
本開示による有用な標識は、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ローダミン、緑色蛍光タンパク質）など（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ．、米国を参照されたい。）、化学発光化合物、例えば、アクリジニウム（例えば、アクリジニウム−９−カルボキサミド）、フェナントリジニウム、ジオキセタン、ルミノールなど、放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３２Ｐ）、酵素などの触媒（例えば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて通常用いられるその他）、ならびに比色用標識、例えば、金コロイド（例えば、高い効率で緑色光を散乱する直径サイズ範囲が４０−８０ｎｍの金粒子）、または色ガラスもしくは着色プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズを含む。このような標識の使用を教示する特許は、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、および第４，３６６，２４１号を含む。
標識は、生物学的試料との接触前、または接触間、または接触後に各抗体に付いていてもよい。いわゆる「直接標識」は、アッセイにおいて使用する前に検出抗体に直接付いており、または抗体中に組み入れられている検出可能な標識である。直接標識は、当業者によく知られているあらゆる数々の手段によって抗体に付いており、または抗体中に組み入れられてもよい。これとは対照的に、いわゆる「間接標識」は、典型的に、アッセイの間のいくつかの点で各抗体に結合する。しばしば、間接標識は、使用前に検出剤に付いており、または検出剤中に組み入れられている部分に結合する。したがって、例えば、各抗体は、アッセイにおける使用の前にビオチン化されていてもよい。アッセイの間、アビジンコンジュゲートしたフルオロフォアはビオチンを有する（ｂｉｏｔｉｎ−ｂｅａｒｉｎｇ）検出剤に結合して、容易に検出される標識を提供することができる。
間接標識化の別の一例において、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧなど、免疫グロブリン定常領域に特異的に結合することができるポリペプチドは、検出抗体用の標識としても用いられ得る。これらのポリペプチドは、レンサ球菌性細菌の細胞壁の通常の構成成分である。これらは、様々な種からの免疫グロブリン定常領域との強力な非免疫原性の反応性を示す（全般的に、Ｋｒｏｎｖａｌら（１９７３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１巻、１４０１−１４０６頁、およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ（１９８５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３５巻、２５８９−２５４２頁を参照されたい。）。このようなポリペプチドはしたがって標識化され、アッセイ混合物に加えられてもよく、アッセイ混合物でポリペプチドは各抗体および自己抗体に結合し、全てを標識化し、試料中に存在する分析物および自己抗体に起因し得る複合性のシグナルを提供する。
本開示において有用ないくつかの標識は、検出可能なシグナルを生成するためにさらなる試薬（単数または複数）の使用を必要とすることがある。例えば、ＥＬＩＳＡにおいて、酵素標識（例えば、ベータ−ガラクトシダーゼ）は、検出可能なシグナルを生成するために基質（例えば、Ｘ−ｇａｌ）の添加を必要とする。直接標識としてアクリジニウム化合物を用いるイムノアッセイにおいて、塩基性溶液および過酸化水素の源が加えられる。
例示の一実施形態において、化学発光化合物が、抗体にコンジュゲートしている直接標識として用いられる。化学発光化合物は、例えば、アクリジニウム化合物であることができる。次いで、アクリジニウム化合物が検出可能な標識として用いられる場合、上記に記載した方法は、過酸化水素の源を生成し、または試験試料を標識化した抗体と接触させたことに起因する混合物に提供し、少なくとも１つの塩基性溶液を混合物に加えて光シグナルを生成することをさらに含むことができる。次いで、混合物によって生成または放射された光シグナルが測定されて、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩが検出される。
過酸化水素の源は、過酸化水素、または試験試料に加えた場合に過酸化水素を生成する酵素を含むバッファー溶液または溶液であることができる。塩基性溶液はトリガー溶液として働き、少なくとも１つの塩基性溶液および検出可能な標識が加えられる順序は重大ではない。本方法において用いられる塩基性溶液は、少なくとも１つの塩基を含み、１０を超えまたはそれに等しく、好ましくは１２を超えまたはそれに等しいｐＨを有する溶液である。塩基性溶液の例は、それだけには限定されないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、および炭酸水素カルシウムを含む。試験試料に加えられる塩基性溶液の量は、アッセイにおいて用いられる塩基性溶液の濃度に依存する。用いられる塩基性溶液の濃度に基づいて、当業者であれば、本明細書に記載される方法において用いられる塩基性溶液の量を容易に決定することができる。
本開示による、および検出可能な標識としてアクリジニウム化合物を用いる化学発光イムノアッセイにおいて、アクリジニウム化合物がアクリジニウム−９−カルボキサミドであるのが好ましい。特に、アクリジニウム−９−カルボキサミドは、式Ｉによる構造を有し：
Figure 2013541936
 Ｒ１およびＲ２は各々独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、
Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、さらに、あらゆるアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキルは１つまたは複数のヘテロ原子を含むことができ、
場合によって、存在する場合は、
Figure 2013541936
 は陰イオンである。
アクリジニウム９−カルボキサミドを調製するための方法は、Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．、Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．、６巻、１０７−１４頁（１９９１年）；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｙ．，Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｐａｎ，Ｙ．Ｊ．、Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６３巻、５６３６−５６３９頁（１９９８年）；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｙ．；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．；Ｓｈｒｅｄｅｒ，Ｋ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５５巻、１０８９９−１０９１４頁（１９９９年）；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．；Ｐａｎ，Ｙ．、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、１巻、７７９−７８１頁（１９９９年）；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｃｈｅｎ，Ｙ．−Ｙ．；Ｆｉｓｈｐａｕｇｈ，Ｊ．Ｒ．；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｐａｎ，Ｙ．；Ｓｈｒｅｄｅｒ，Ｋ．；Ｙｕ，Ｚ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１１巻、７１４−７２４頁（２０００年）；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｄｙｋｅ，Ｋ．Ｖ．編集；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、７７−１０５頁（２００２年）；Ａｄａｍｃｚｙｋ，Ｍ．；Ｍａｔｔｉｎｇｌｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．；Ｐａｎ， Ｙ．、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．、５巻、３７７９−３７８２頁（２００３年）；ならびに米国特許第５，４６８，６４６号、第５，５４３，５２４号、および第５，７８３，６９９号において記載されている（各々、これに関する教示に対してこれらの全文が参照によって本明細書に組み入れられる）。
あるいは、アクリジニウム化合物はアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルであってもよく、アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルは、式ＩＩによる構造を有することができる：
Figure 2013541936
本開示において用いられ得る上記の式ＩＩを有するアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルの例は、それだけには限定されないが、１０−メチル−９−（フェノキシカルボニル）アクリジニウムフルオロスルホネート（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩから入手可能）を含む。アクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルを調製するための方法は、ＭｃＣａｐｒａ，Ｆ．ら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．、４巻、１１１１−２１頁（１９６５年）；Ｒａｚａｖｉ，Ｚら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、１５巻、２４５−２４９頁（２０００年）；Ｒａｚａｖｉ，Ｚら、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、１５巻、２３９−２４４頁（２０００年）；および米国特許第５，２４１，０７０号に記載されている。（各々、これに関する教示に対してこれらの全文が参照によって本明細書に組み入れられる）。
本開示の別の一実施形態は、結晶化した結合性タンパク質を提供する。好ましくは、本発明は、本明細書に開示する抗体全体およびそのフラグメントの結晶、ならびにこのような結晶を含む製剤および組成物に関する。一実施形態において、結晶化した結合性タンパク質は、結合性タンパク質の可溶性の対応物よりもインビボにおいて長い半減期を有する。別の一実施形態において、結合性タンパク質は、結晶化後、生物学的活性を保持している。本開示の結晶化した結合性タンパク質は、当技術分野において知られている方法、および参照により本明細書に組み込む、国際公開第０２／０７２６３６号において開示されている方法にしたがって生成されてよい。本開示の別の一実施形態は、抗体またはその抗原結合性部分が１つまたは複数の炭水化物残基を含む、グリコシル化されている結合性タンパク質を提供する。発生期のインビボのタンパク質生成は、翻訳後修飾として知られているさらなるプロセシングを受けることがある。特に、糖（グリコシル）残基が酵素的に加えられてよく、これはグリコシル化として知られているプロセスである。共有結合性に連結しているオリゴ糖側鎖を有する得られたタンパク質は、グリコシル化されているタンパク質または糖タンパク質として知られている。抗体は、Ｆｃドメインおよび可変ドメインにおいて１つまたは複数の炭水化物残基を有する糖タンパク質である。Ｆｃドメインにおける炭水化物残基は、Ｆｃドメインのエフェクター機能に対して重要な効果を有し、抗体の抗原結合性または半減期に対して最小の効果を有する（Ｒ．Ｊｅｆｆｅｒｉｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２１巻（２００５年）、１１−１６頁）。これとは対照的に、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合性活性に対して効果を有することがある。可変ドメインにおけるグリコシル化は、おそらく立体障害のおかげで、抗体結合性の親和性に対して負の効果を有することがあり、（Ｃｏ、Ｍ．Ｓ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３年）３０巻、１３６１−１３６７頁）、または抗原に対する親和性の増大をもたらすことがある（Ｗａｌｌｉｃｋ，Ｓ．Ｃ、ら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９８８年）１６８巻、１０９９−１１０９頁；Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．（１９９１年）１０巻、２７１７−２７２３頁）。
本開示の一態様は、結合性タンパク質のＯ−連結またはＮ−連結したグリコシル化部位が変異されている、グリコシル化部位変異体の産生に対するものである。当業者であれば、標準的なよく知られている技術を用いてこのような変異体を産生することができる。生物学的活性を保持しているが増大または低減した結合性活性を有するグリコシル化部位変異体の作製は、本開示の別の一目的である。
さらに別の一実施形態において、本開示の抗体または抗原結合性部分のグリコシル化は修飾されている。例えば、アグリコスレーテッド（ａｇｌｙｃｏｓｌａｔｅｄ）抗体（すなわち、グリコシル化を欠く抗体）が作製されてよい。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大するように改変されてよい。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列内の１つまたは複数の部位のグリコシル化を改変することによって行われ得る。例えば、１つまたは複数の可変領域のグリコシル化部位の排除をもたらして、それによってその部位のグリコシル化を除去する、１つまたは複数のアミノ酸置換が行われてよい。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大することがある。このような取組みは、各々その全体を参照により本明細書に組み込む、国際公開第０３／０１６４６６Ａ２号、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５０，８６１号においてさらに詳しく記載されている。
さらに、または別法として、低減された量のフコシル残基を有する低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体、または増大する二分するＧｌｃＮＡｃ構造を有する抗体などの改変されたタイプのグリコシル化を有する、本開示の修飾された抗体が作られてよい。このような改変されたグリコシル化のパターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大することが実証されている。このような炭水化物の修飾は、例えば、改変されたグリコシル化の機構を有する宿主細胞において抗体を発現させることによって行われ得る。改変されたグリコシル化の機構を有する細胞は、当技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現させて、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を生成する宿主細胞として用いられ得る。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ら（２００２年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７７巻、２６７３３−２６７４０頁；Ｕｍａｎａら（１９９９年）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７巻、１７６−１頁、ならびに各々その全体を参照により本明細書に組み込む、欧州特許第１，１７６，１９５号；国際公開第０３／０３５８３５号および第９９／５４３４２ ８０号を参照されたい。
タンパク質のグリコシル化は、対象のタンパク質のアミノ酸配列、およびタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。異なる生物体は異なるグリコシル化酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）を生成することがあり、利用可能な異なる基質（ヌクレオチド糖）を有することがある。このような因子のおかげで、タンパク質のグリコシル化パターンおよびグリコシル残基の組成は、特定のタンパク質が発現される宿主のシステムに応じて異なることがある。本発明において有用であるグリコシル残基は、それだけには限定されないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ−アセチルグルコサミンおよびシアル酸を含むことができる。グリコシル化された結合性タンパク質は、グリコシル化のパターンがヒトのものとなるようにグリコシル残基を含むことが好ましい。
当業者には、タンパク質のグリコシル化が異なれば、異なるタンパク質の性質をもたらし得ることが知られている。例えば、酵母などの微生物の宿主において生成され、酵母の内在性の経路を利用してグリコシル化された治療用タンパク質の有効性は、ＣＨＯ細胞系統などの哺乳動物細胞において発現された同じタンパク質の有効性に比べて低減され得る。このような糖タンパク質はヒトにおいてやはり免疫原性であり、投与後インビボの半減期の低減を示すことがある。ヒトおよび他の動物における特異的な受容体は、特異的なグリコシル残基を認識し、血流からのタンパク質の速やかなクリアランスを促進することがある。他の有害作用は、タンパク質のフォールディング、可溶性、プロテアーゼに対する感受性、トラフィッキング、輸送、区画化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性、またはアレルゲン性における変化を含み得る。したがって、医師は、例えば、ヒト細胞において、または意図する対象の動物の種特異的な細胞において生成されるものに同一の、または少なくとも類似のグリコシル化の組成およびパターンなど、特異的なグリコシル化の組成およびパターンを有する治療用タンパク質を好むことがある。
宿主細胞のものとは異なるグリコシル化タンパク質の発現は、異種性のグリコシル化酵素を発現する宿主細胞を遺伝子的に改変することによって達成されることがある。当技術分野において知られている技術を用いて、医師は、ヒトタンパク質のグリコシル化を示す抗体またはその抗原結合性部分を産生することができる。例えば、酵母系統は、天然に存在しないグリコシル化酵素を発現するように遺伝子的に改変されており、その結果これら酵母系統において生成されたグリコシル化されたタンパク質（糖タンパク質）は動物細胞、特にヒト細胞のタンパク質グリコシル化に同一のタンパク質グリコシル化を示す（米国特許出願公開第２００４００１８５９０号および第２００２０１３７１３４号、ならびに国際公開第０５／１００５８４ Ａ２号）。
「多価結合性タンパク質」の語は、本明細書において用いられて、２つまたはそれを超える抗原結合性部位を含む結合性タンパク質を意味する。多価結合性タンパク質は３つまたはそれを超える抗原結合性部位を有するように構築されるのが好ましく、一般的に天然に存在する抗体ではない。「多重特異性結合性タンパク質」の語は、２つまたはそれを超える関連の標的または非関連の標的に結合することができる結合性タンパク質を意味する。本明細書で用いられる二重可変ドメイン（ｄｕａｌ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）（ＤＶＤ）結合性タンパク質は、２つまたはそれを超える抗原結合性部位を含む結合性タンパク質であり、４価または多価の結合性タンパク質である。このようなＤＶＤは単一特異性であってよく、すなわち１つの抗原に結合することができ、または多特異的であってよく、すなわち２つまたはそれを超える抗原に結合することができてよい。２つの重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび２つの軽鎖ＤＶＤポリペプチドを含むＤＶＤ結合性タンパク質は、ＤＶＤＩｇと呼ばれる。ＤＶＤＩｇの半分は各々、重鎖ＤＶＤポリペプチドおよび軽鎖ＤＶＤポリペプチド、ならびに２つの抗原結合性部位を含んでいる。各結合性部位は重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含んでおり、抗原結合性部位１個につき合計６個のＣＤＲが抗原結合性に関与する。ＤＶＤ結合性タンパク質およびＤＶＤ結合性タンパク質を作成する方法は米国特許出願第１１／５０７，０５０号において開示されており、参照により本明細書に組み込む。
本開示の一態様は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩの１つまたは複数のエピトープに結合することができる結合性タンパク質を含むＤＶＤ結合性タンパク質に関する。ＤＶＤ結合性タンパク質がエピトープおよび第２の標的に結合することができるのが好ましい。
結合性タンパク質の他に、本発明は、本開示のこのような結合性タンパク質に特異的な抗イディオタイプの（抗Ｉｄ）抗体に対するものでもある。抗Ｉｄ抗体は、別の抗体の抗原結合性領域に一般的に付随する独特の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄは、結合性タンパク質またはその領域を含むＣＤＲで動物を免疫化することによって調製され得る。免疫化された動物は、免疫化する抗体のイディオタイプの決定基を認識し、反応し、抗Ｉｄ抗体を生成する。抗Ｉｄ抗体をさらに別の動物における免疫反応を誘発するための「免疫原」としてやはり用いて、いわゆる抗−抗Ｉｄ抗体を生成してもよい。
さらに、当業者には、様々なグリコシル化酵素を発現するように遺伝子操作された宿主細胞のライブラリーを用いて、宿主細胞のメンバーのライブラリーが変異体のグリコシル化パターンを有する対象のタンパク質を生成するように、対象のタンパク質が発現され得ることが理解される。次いで、医師は、特定の新規なグリコシル化パターンを有する対象のタンパク質を選択し、単離することができる。特に選択された新規なグリコシル化パターンを有するタンパク質が、改善または改変された生物学的性質を示すのが好ましい。
Ｅ．抗体を使用する方法
ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、またはそのエピトープもしくはその部分に結合する本明細書に記載する抗体の能力を考慮すると、本明細書に記載する抗体は、従来の競合的または非競合的なイムノアッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫測定、サンドイッチアッセイもしくは免疫組織化学）を用いて、生物学的試料（例えば、血清、血液、組織もしくは血漿など）中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を検出および／または定量するのに用いられ得る。次いで、このような検出は、生物学的試料が得られた患者に対するＨＣＣまたは肝癌の診断をもたらし得る。
生物学的試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するための方法は、例えば、第１の抗体−抗原複合体の形成に十分な時間および条件下、生物学的試料を本開示の抗体（またはその抗体部分）と接触させ、抗原／抗体複合体の形成を検出することによってＰＩＶＫＡ−ＩＩまたは部分（例えば、そのエピトープ）を検出することを含む。抗体は、結合している抗原もしくは非結合の抗原（すなわち、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）の検出および／または定量を促進するために、検出可能な物質で直接的または間接的に標識化され得る。
試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出する方法は、ａ）試験試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性部分を有する第１の抗体と、第１の抗体−抗原複合体の形成に十分な時間および条件下、接触させるステップ、ｂ）第２の抗体がＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有し、検出可能な標識にコンジュゲートしている、第２の抗体を第１の抗体／抗原複合体に、第１の抗体／抗原／第２の抗体の複合体を形成するのに十分な時間および条件下、加えるステップ、ならびにｃ）検出可能な標識によって生成され、または検出可能な標識から放射されるシグナルを測定し、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出するステップを代替的に含むことができる。第１の抗体は、例えば、ｍＡｂ ３Ｃ１０、すなわち、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６３８を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体である。第２の抗体は、例えば、６Ｈ６、すなわち、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体である。
イムノアッセイに基づく定量方法はよく知られており、例えば、イムノアッセイの出力から決定されたＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を、閾値またはカットオフ値など、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのレベルがそれを超えるとＨＣＣもしくは肝癌であることを示す、予め決定されたレベルに比べることを含むことができる。例示の閾値またはカットオフレベルは約４０ｍＡＵ／ｍＬであるが、ヒト対象に対して最高約１００ｍＡＵ／ｍＬ（０．１ＡＵ／ｍＬ）の範囲であることができる。例えば、カットオフレベルは約５０、約６０、約７０、約８０、または約９０ｍＡＵ／ｍＬであることができる。用いられる予め決定されたカットオフ値は、対象の年齢、性別、民族性、および病歴を含めた多くの因子に基づいて変化し得ることが理解されよう。
ＨＣＣまたは肝癌を有することが疑われる患者においてＨＣＣまたは肝癌を診断する方法は、したがって、例えば、ａ）患者から生物学的試料を単離するステップ、ｂ）生物学的試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原のアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を含む抗体と接触させるステップ、ｃ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の存在を検出するステップ、ｄ）複合体中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を、複合体中に存在する抗体から解離するステップ、ならびにｅ）解離したＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量を測定するステップ（予め決定されたレベルを超える解離したＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量は、患者におけるＨＣＣまたは肝癌の診断を示す。）を含むことができる。予め決定されたレベルは、例えば約４０ｍＡＵ／ｍＬであってもよいが、上記で説明した最高約１００ｍＡＵ／ｍＬほど高いレベルであってもよい。あるいは、患者におけるＨＣＣまたは肝癌を診断する方法は、ａ）患者から生物学的試料を単離するステップ、ｂ）生物学的試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原のアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を含む抗体と接触させるステップ、ならびにｃ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の存在を検出するステップ、ｄ）複合体中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を、複合体中に存在する抗体から解離するステップ、ならびにｅ）解離したＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量を測定するステップ（予め決定されたレベルを超える解離したＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量は患者におけるＨＣＣまたは肝癌の診断を示す。）を含むことができる。
あるいは、患者におけるＨＣＣまたは肝癌を診断する方法は、２つまたはそれを超える抗ＰＩＶＫＡ抗体の使用を含むことができる。例えば、このような方法は、ａ）患者から生物学的試料を単離するステップ、ｂ）生物学的試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原のアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性ドメインを有する第１の抗体と接触させるステップ、ｃ）コンジュゲートを、得られたＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体に、結合しているＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原にコンジュゲートを結合させるのに十分な時間および条件下、加えるステップ（コンジュゲートは、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを有する第２の抗体を含み、検出可能なシグナルを生成することができる検出可能な標識に付いている。）、ｄ）検出可能な標識によって生成されるシグナルを検出することによって、生物学的試料中に存在する可能性があるＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の存在を検出するステップ、ならびにｅ）シグナルの強度を測定することによって試験試料中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量を測定するステップ（予め決定されたレベルを超えるＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量は、患者におけるＨＣＣまたは肝癌の診断を示す。）を含むことができる。本方法において、予め決定されたレベルは約４０ｍＡＵ／ｍＬであってもよいが、上記で説明した最高約１００ｍＡＵ／ｍＬほど高いレベルであってもよい。第１の抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６３８を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体（ｍＡｂ ３Ｃ１０）であることができ、第２の抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体であることができる。第１の抗体は固相上に、第１の抗体−抗原複合体の形成の前または後のいずれかに固定化され得る。
本方法は、このように、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する少なくとも２つの異なる結合性タンパク質の使用を包含し、各結合性タンパク質はＰＩＶＫＡ−ＩＩのサブセットのアミノ酸１−３３に特異的に結合する抗原結合性部分を含み、各結合性タンパク質の抗原結合性部分はＰＩＶＫＡ−ＩＩの異なるサブセットのアミノ酸１−３３に結合する。例えば、２つの結合性タンパク質を用いる方法は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する抗原結合性部分を有するｍＡｂ ３Ｃ１０などの第１のモノクローナル抗体（すなわち、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−９６３８によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成される抗体）、ならびにＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する抗原結合性部分およびプロトロンビンの少なくともサブセットのアミノ酸１−３３に結合する抗原結合性部分もまた有する６Ｈ６などの第２のモノクローナル抗体（すなわち、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成される抗体）を用いることができる。両方が、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに特異的に結合することができるが異なる抗原結合性ドメインを有し、ＰＩＶＫＡ−ＩＩタンパク質の異なるサブセットのアミノ酸１−３３に結合する、少なくとも２つの異なる抗体の使用は、単一のモノクローナル抗体の使用よりも極めて高いシグナルを生成する。
抗体を標識化するのに適切な検出可能な物質は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ｐ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み、適切な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み、適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリンを含み、発光物質の例はルミノールを含み、適切な放射性物質の例は、放射核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍ）を含む。
抗体の標識化の代替として、検出可能な物質および非標識の抗体で標識化された組換えの標準を利用して、競合的イムノアッセイ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）によって生体液中の抗原がアッセイされ得る。このアッセイにおいて、生物学的試料、標識化された組換え抗原の標準および抗体が合わされ、非標識の抗体に結合した標識化されたペプチドの標準の量が測定される。生物学的試料中の抗原の量は、抗体に結合している標識化された抗原の標準の量に逆比例する。この方法において、抗体は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメイン、すなわち、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体である、６Ｈ６を含むことができる。
本開示に関連して上記のアッセイを説明するために、６Ｈ６（またはｍＡｂ ３Ｃ１０）などのＰＩＶＫＡ−ＩＩに対する（または全長のＰＩＶＫＡ−ＩＩのエピトープもしくは部分に対する）抗体が、例えば固相上でコーティングされる（または液相中に存在する）。次いで試験試料または生物学的試料（例えば、血清、血漿、尿など）が固相と接触させられる。ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原が試料中に存在する場合、固相に結合している抗体はＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原に結合し、次いでＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原は直接的または間接的いずれかの方法によって検出され得る。直接的方法は、複合体自体の存在、したがってＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の存在を単に検出することを含む。間接的方法において、結合しているＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原にコンジュゲートが加えられる。コンジュゲートは第２の抗体（通常、固相上にコーティングされている第１の抗体と異なる）を含み、第２の抗体がシグナル生成性の化合物または標識に付着している、結合しているＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原に結合する。結合している抗原に第２の抗体が結合すると、シグナル産生性の化合物は測定可能なシグナルを産生する。次いで、このようなシグナルは、試験試料中の抗原の存在を示す。イムノアッセイにおいて用いられる（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出するための）最初の捕捉抗体は、固相に共有結合性または非共有結合性に（例えば、イオン性、疎水性など）付着され得ることに留意すべきである。共有結合性付着のための連結剤は当技術分野において知られており、固相の部分であってよく、またはコーティング前に誘導体化されていてよい。
診断用のイムノアッセイにおいて用いられる固相の例は、多孔性および非多孔性の材料、ラテックス粒子、磁性粒子、微粒子（米国特許第５，７０５，３３０号を参照されたい）、ビーズ、膜、マイクロタイターウエルおよびプラスチックチューブである。所望により、固相材料およびコンジュゲート中に存在する抗原または抗体を標識化する方法の選択は、所望のアッセイフォーマットの性能の特徴に基づいて決定される。
上記に記述した通り、コンジュゲート（または指示薬）は、シグナル産生性化合物または標識に付着している抗体（または、アッセイに応じておそらく抗−抗体）を含む。このシグナル産生性化合物または「標識」はそれ自体検出可能であり、または１つもしくは複数のさらなる化合物と反応して検出可能な生成物を産生することができる。シグナル産生性化合物の例は、色素原、放射性同位体（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓおよび１４Ｃ）、化学発光化合物（例えば、アクリジニウム）、粒子（可視もしくは蛍光）、核酸、錯化剤、または酵素などの触媒（例えば、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびリボヌクレアーゼ）を含む。酵素の使用の場合は（例えば、アルカリホスファターゼもしくは西洋ワサビのペルオキシダーゼ）、色素生産性、蛍光発生的、またはルモジェニック（ｌｕｍｏｇｅｎｉｃ）な基質の添加が検出可能なシグナルの産生をもたらす。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）およびラマン分光法などの他の検出システムも有用である。
上記のイムノアッセイによって試験され得る生体液の例は、血漿、尿、全血、乾燥全血、血清、脳脊髄液、唾液、涙液、鼻洗浄液または組織および細胞の水性抽出物を含む。
別法として、生物学的試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの存在を検出するために、固相をＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原でコーティングし、次いで固相をモノクローナル抗体６Ｈ６（またはｍＡｂ ３Ｃ１０）などのＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原に対する標識化した抗体と、免疫化した抗原を標識化した抗体に結合させるのに十分な時間および条件下、接触させてもよい。その後、試験試料は抗原−抗体複合体に加えられてよい。ＰＩＶＫＡ−ＩＩが試験試料中に存在する場合、次いでそれは結合した標識化された抗体に結合する。次いで、検出可能なシグナルが標識によって産生され、これは試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の存在を示している。
さらに、代替のアッセイフォーマットにおいて、検出可能な物質で標識化されたＰＩＶＫＡ−ＩＩ組換え標準および６Ｈ６（またはｍＡｂ ３Ｃ１０）などの非標識の抗体を用いてもよい。このアッセイにおいて、生物学的試験試料、標識化された組換えＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原標準および６Ｈ６（またはｍＡｂ ３Ｃ１０）モノクローナル抗体が合わされ、非標識の抗体に結合している標識化されたＰＩＶＫＡ−ＩＩ標準の量が測定される。生物学的試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量は、抗体に結合している標識化されたＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原標準の量に逆比例する。
抗原および抗体を同時に検出するために、本開示の目的に用いられ得る他のアッセイフォーマットは、デュアルアッセイストリップブロット（Ｄｕａｌ ａｓｓａｙ ｓｔｒｉｐ ｂｌｏｔ）、迅速試験、ウエスタンブロット、およびＡｒｃｈｉｔｅｃｔ（登録商標）アッセイなどにおける常磁性粒子の使用を含む（Ｆｒａｎｋ Ｑｕｉｎｎ、Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、Ｄａｖｉｄ Ｗｉｌｄ編、３６３−３６７頁、２００１年）。このようなフォーマットは当業者には知られている。
上記に記載したアッセイのエレメントは、キットの形態における使用に特に適することも留意すべきである。キットは、バイアルなどの容器を１個、ボトルまたはストリップをやはり含むことができ、各容器は予めセッティングした固相を有し、他の容器はそれぞれのコンジュゲートを含んでいる。これらのキットは、洗浄試薬、プロセシング試薬および指示薬など、アッセイを行うのに必要とされる他の試薬のバイアルまたは容器も含むことができる。
本明細書におけるあらゆる例示のフォーマット、および本発明によるあらゆるアッセイまたはキットは、米国特許第５，０８９，４２４号および第５，００６，３０９号などに記載されている通り、ならびにそれだけには限定されないが、ＡｂｂｏｔｔのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭおよびＱｕａｎｔｕｍ ＩＩプラットフォームおよび他のプラットフォームを含めてＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）によって販売されている、自動化および半自動化のシステム（微粒子を含む固相が存在するシステムを含む）の使用に適用または最適化されていてよい。
さらに、本発明のアッセイおよびキットはＡｂｂｏｔｔ’ｓ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ（ｉ−ＳＴＡＴＩｍ）電気化学的イムノアッセイシステムを含むポイントオブケアアッセイシステムに適用または最適化されていてよい。免疫センサー、および免疫センサーを製造し、使い捨ての試験装置において操作する方法は、例えば、米国特許第５，０６３，０８１号、ならびに公開されている米国特許出願第２００３０１７０８８１号、第２００４００１８５７７号、第２００５００５４０７８号および第２００６０１６０１６４号において記載されている（これらに関する教示に関して本明細書に参照により組み込む）。
さらに、ＰＩＶＫＡ−ＩＩは腫瘍の悪性度を誘発し得ることが注目されている（Ｓｈｉｒａｈａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００５年２月２５日、２８０巻（８）、６４０９−１５頁）。したがって、本開示は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ活性が関連する疾患または障害（例えば、肝癌もしくはＨＣＣ）に罹患しているヒトにおける、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ活性を低減するための方法も提供する。この方法は、本開示の抗体（すなわち、６Ｈ６）またはその部分（例えば、Ｆａｂ’フラグメント）を対象に投与し、その結果対象におけるＰＩＶＫＡ−ＩＩ活性が低減される（すなわち、受動免疫化）ことを含む。さらに、本開示の抗体（またはそのフラグメント）は、治療目的で、他の獣医学的目的で、またはヒトにおいて見られる病状を擬する病状を有する動物における抗体の効果を研究するために非ヒトの哺乳動物に投与されてよい。特に、このような動物モデルは、本開示の抗体の治療上の有効性を評価するのに有用であり得る（例えば、投与量および投与の時間経過の試験）。
本開示の抗体で処置され得る障害の非限定的な例は、本開示の抗体の薬剤組成物に関する以下の段落において論じられる障害を含む。
Ｆ．薬剤組成物
上記に記述した通り、本発明は、本開示の抗体またはその抗原結合性部分、および薬学的に許容される担体を含む薬剤組成物も提供する。薬剤組成物は、例えば、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有する結合性タンパク質を含むことができる。結合性タンパク質は、本明細書に記載するモノクローナル抗体、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系によって生成されるモノクローナル抗体であることができる。本開示の抗体を含む薬剤組成物は、それだけには限定されないが、障害の診断、検出、またはモニタリングにおける、障害または１つもしくは複数のその症状の防止、処置、マネージメント、または回復における、および／または調査における使用のためのものである。薬剤組成物は、例えば、ＨＣＣまたは肝癌などの癌の処置または診断における使用に用いられてもよい。薬剤組成物は、本開示の１つまたは複数の抗体を含むことができる。別の実施形態において、薬剤組成物は、１つまたは複数の本開示の抗体、およびＰＩＶＫＡ−ＩＩ活性が有害である障害を処置するための本開示の抗体以外の１つまたは複数の予防薬または治療薬を含む。予防薬または治療薬が、障害または１つもしくは複数のその症状の予防、処置、管理または改善において有用であり、またはこれまでに用いられていた、または現在用いられていることが知られているのが好ましい。これらの実施形態にしたがって、組成物は、担体、希釈剤または賦形剤をさらに含むことができる。
本開示の抗体および抗体の部分は、対象に投与するのに適する薬剤組成物中に組み入れられ得る。典型的に、薬剤組成物は本開示の抗体（例えば６Ｈ６）または抗体の部分、および薬学的に許容される担体を含んでいる。本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性であるあらゆる全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにこれらの組合せのうちの１つまたは複数を含む。多くの場合、組成物中に、マンニトール、ソルビトールなどの糖、多価アルコール、または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むのが好ましい。薬学的に許容される担体は、抗体または抗体の部分の保存期間または有効性を増強する、湿潤剤または乳化剤、保存剤またはバッファーなどの補助物質を少量さらに含むことができる。
様々な送達系が知られており、１つまたは複数の本開示の抗体、または障害または１つもしくは複数のその症状を予防、管理、処置、または改善するのに有用な１つまたは複数の本開示の抗体および予防薬または治療薬の組合せを投与するのに用いられ得る（例えば、リポソーム中のカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、抗体または抗体フラグメントを発現することができる組換え細胞、受容体が媒介するエンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６２巻、４４２９−４４３２頁（１９８７年）を参照されたい）、レトロウイルスもしくは他のベクターの部分として核酸の構築など）。本開示の予防薬または治療薬を投与する方法は、それだけには限定されないが、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外投与、腫瘍内投与ならびに粘膜投与（例えば、鼻腔内および経口の経路）を含む。さらに、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤との製剤の使用によって、経肺投与が用いられ得る。例えば、各々全文を参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，０１９，９６８号、第５，９８５，３２０号、第５，９８５，３０９号、第５，９３４、２７２号、第５，８７４，０６４号、第５，８５５，９１３号、第５，２９０，５４０号および第４，８８０，０７８号；ならびに国際公開第９２／１９２４４号、第９７／３２５７２号、第９７／４４０１３号、第９８／３１３４６号および第９９／６６９０３号を参照されたい。一実施形態において、本明細書に記載する抗体、併用治療、または本開示の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ ＡＩＲ（登録商標）経肺薬物送達法（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて投与される。特定の実施形態において、本開示の予防薬または治療薬は、筋肉内、静脈内、腫瘍内、経口的、鼻腔内、経肺、または皮下投与される。予防薬または治療薬は、あらゆる従来の経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚の内膜（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収によって投与されてもよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてもよい。投与は全身性でも、または局所的でもよい。
特定の実施形態において、本開示の予防薬または治療薬を、処置を必要とする領域に局所的に投与するのが望ましいことがあり、これは、例えば、限定によるものではないが、局所注入、注射、または埋め込みによって実現されてよく、前記埋め込みはシアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜、ポリマー、繊維状マトリクス（例えば、Ｔｉｓｓｕｅｌ（登録商標））またはコラーゲンマトリクスなどの膜およびマトリクスを含めた多孔性または非多孔性の材料である。一実施形態において、本開示の１つまたは複数の抗体の有効量を対象の罹患している領域に局所的に投与して、障害またはその症状を予防、処置、管理および／または改善する。別の一実施形態において、本開示の１つまたは複数の抗体の有効量が、本開示の抗体以外の１つまたは複数の治療（例えば、１つもしくは複数の予防薬もしくは治療薬）の有効量と組み合わされて、障害または１つもしくは複数のその症状を予防、処置、管理および／または改善するために、対象の罹患している領域に局所的に投与される。
別の一実施形態において、予防薬または治療薬は、徐放または持続放出のシステムにおいて送達されてよい。一実施形態において、徐放または持続放出を達成するためにポンプが使用されてよい（Ｌａｎｇｅｒ、上述；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７年、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．、１４巻、２０頁；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０年、Ｓｕｒｇｅｒｙ、８８巻、５０７頁；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９年、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２１巻、５７４頁を参照されたい）。別の一実施形態において、ポリマー材料が本開示の治療の徐放または持続放出を達成するために用いられてよい（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９７４年）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４年）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、１９８３年、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２３巻、６１頁を参照されたい；Ｌｅｖｙら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２８巻、１９０頁；Ｄｕｒｉｎｇら、１９８９年、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒａｌ．、２５巻、３５１頁；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、７巻１、１０５頁も参照されたい）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号、米国特許第５，９１２，０１５号、米国特許第５，９８９，４６３号、米国特許第５，１２８，３２６号、国際公開第９９／１５１５４号、および国際公開第９９／２０２５３号）。持続放出製剤において用いられるポリマーの例は、それだけには限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルポロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルを含む。好ましい一実施形態において、持続放出製剤において用いられるポリマーは不活性であり、浸出性の不純物がなく、貯蔵時に安定であり、無菌で生分解性である。さらに別の一実施形態において、徐放または持続放出のシステムは予防または治療の標的の近くに配置されてよく、したがってわずかな全身投与量を必要とする（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、「Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ」、上述、第２巻、１１５−１３８頁（１９８４年）を参照されたい）。
徐放システムはＬａｎｇｅｒ（１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻１５２７−１５３３頁）による再考において論じられている。当業者に知られているあらゆる技術が、本開示の治療薬を１つまたは複数含む持続放出製剤を生成するのに用いられてよい。例えば、各々全体を参照により本明細書に組み込む、米国特許第４，５２６，９３８号、国際公開第９１／０５５４８号、国際公開第９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇら、１９９６年、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ Ｇｅｌ」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、３９巻、１７９−１８９頁、Ｓｏｎｇら、１９９５年、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｌｕｎｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５０巻、３７２−３９７頁、Ｃｌｅｅｋら、１９９７年、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ａ ｂＦＧＦ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２４巻、８５３−８５４頁、およびＬａｍら、１９９７、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．、２４巻、７５９−７６０頁を参照されたい。
特定の実施形態において、本開示の組成物が予防薬または治療薬をコードする核酸である場合、核酸を好適な核酸発現ベクターの部分として構築し、核酸が細胞内になるように投与することによって（例えば、レトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、または直接注射によって、または微粒子銃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト試薬でコーティングすることによって、または核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドへ連結して投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻、１８６４−１８６８頁を参照されたい）、核酸がコードする予防薬または治療薬の発現を促進するために、核酸（本開示の抗体をコードする）がインビボで投与されてよい。別法として、核酸は細胞内に導入され、相同的組換えによる発現用に宿主細胞のＤＮＡ内に組み入れられ得る。
本開示の薬剤組成物は、意図される投与経路に適合性であるように調合される。投与経路の例は、それだけには限定されないが、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口、鼻腔内（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜および直腸投与を含む。特定の実施形態において、組成物は、ヒトへの静脈内、皮下、筋肉内、経口、鼻腔内または局所の投与に適応された、薬剤組成物が日常的な手順にしたがって調合される。典型的に、静脈内投与用の組成物は、無菌の等張バッファーの水中溶液である。必要な場合には、組成物はまた可溶化剤、および注射部位の痛みを和らげるためのリドカインなどの局所麻酔薬も含むことができる。
本開示の組成物が局所投与される場合、組成物は、軟膏剤、クリーム剤、経皮パッチ剤、ローション剤、ゲル剤、シャンプー剤、スプレー剤、エアロゾル剤、液剤、乳剤の形態、または当業者にはよく知られている他の形態において調合されてよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ、第１９版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９５年）を参照されたい。スプレーできない局所剤形には、局所投与に適合する担体または１つもしくは複数の賦形剤を含み、好ましくは水より大きな動的粘度を有する、粘稠性から半固体または固体の形態が典型的に用いられる。適切な製剤は、制限なく、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、膏薬（ｓａｌｖｅ）などを含み、これらは、所望により、滅菌され、または浸透圧などの様々な性質に影響を及ぼすための補助剤（例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、バッファーもしくは塩）と混合される。他の適切な局所用剤形は噴霧可能なエアロゾル調製物を含み、この場合有効成分は、好ましくは固体または液体の不活性な担体と組み合わされて、加圧揮発剤（例えば、フレオンなどのガス噴射剤）との混合物において、または圧搾ボトル中に包装される。保湿剤または湿潤剤も、所望により薬剤組成物および剤形に加えられてよい。このようなさらなる成分の例は、当技術分野においてよく知られている。
本開示による方法が組成物の鼻腔内投与を含む場合、組成物はエアロゾル形態、スプレー、ミストまたは液滴の形態において調合されてよい。特に、本開示にしたがって用いるための予防薬または治療薬は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）を使用して、加圧包装からのエアロゾルスプレーの体裁またはネブライザーの形態において好都合に送達され得る。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定されてよい。吸入器または空気吸入器において用いるためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチンから構成される）は、化合物、およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の混合粉末を含んで調合されてよい。
本開示の方法が経口投与を含む場合、組成物は錠剤、カプセル剤、カシェ剤、ジェルカプセル剤、液剤、懸濁剤などの形態において経口用に調合されてよい。錠剤またはカプセル剤は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）、崩壊剤（例えば、バレイショデンプンもしくはカルボキシメチルスターチナトリウム）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤と一緒に従来の手段によって調製されてよい。錠剤は当技術分野においてよく知られている方法によってコーティングされてよい。経口投与用の液体調製物は、それだけには限定されないが、液剤、シロップ剤もしくは懸濁剤の形態をとることができ、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥製品として提示されてもよい。このような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂肪）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）、非水性のビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分留した植物油）および保存剤（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸もしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に許容される添加剤と一緒に従来の手段によって調製され得る。調製物は、適宜、緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含むことができる。経口投与用の調製物は、予防薬または治療薬（１つまたは複数）の緩効、徐放または持続性放出用に適切に調合されてよい。
本開示の方法は、エアロゾル化剤と一緒に調合された組成物の、例えば、吸入器またはネブライザーの使用による、経肺投与を含むことができる。例えば、各々全体を参照により本明細書に組み込む、米国特許第６，０１９，９６８号、第５，９８５，３２０号、第５，９８５，３０９号、第５，９３４，２７２号、第５，８７４，０６４号、第５，８５５，９１３号、第５，２９０，５４０号および第４，８８０，０７８号；ならびに国際公開第９２／１９２４４号、第９７／３２５７２号、第９７／４４０１３号、第９８／３１３４６号、および第９９／６６９０３号を参照されたい。特定の実施形態において、本開示の抗体、併用治療および／または本開示の組成物は、Ａｌｋｅｒｍｅｓ ＡＩＲ（登録商標）経肺薬物送達法（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて投与される。
本開示の方法は、注射（例えば、ボーラス注射または持続的注入）による非経口投与用に調合された組成物の投与を含むことができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、単位剤形において（例えば、アンプルにおいて、またはマルチドーズ容器において）提示され得る。組成物は、油性または水性のビヒクル中、懸濁剤、液剤または乳剤などの形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤用薬剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含むことができる。別法として、有効成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、無菌のパイロジェンフリー水）と一緒に構成するための粉末の形態に含めてもよい。
本開示の方法は、デポー調製物として調合された組成物の投与をさらに含むことができる。このような長時間作用性の製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下もしくは筋肉内に）または筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、組成物は適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中の乳剤として）もしくはイオン交換樹脂と調合されてよく、またはやや溶けにくい誘導体として（例えば、やや溶けにくい塩として）調合されてよい。
本開示の方法は、中性または塩の形態として調合されたＷ組成物の投与を包含する。薬学的に許容される塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンで形成された塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンで形成された塩を含む。一般的に、組成物の成分は、例えば、有効薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの気密密閉された容器において、凍結乾燥した粉末または水を含まない濃縮物として、別々に、または単位剤形において一緒に混合されてのいずれかで提供される。投与様式が注入である場合、組成物は、無菌の製薬用グレードの水または食塩水を含む注入ボトルで分配されてよい。投与様式が注射による場合、成分が投与前に混合され得るように、滅菌の注射用水または食塩水のアンプルが提供されてよい。
特に、本発明は１つもしくは複数の予防薬もしくは治療薬も提供し、または本開示の薬剤組成物は、予防薬または治療薬の量を示すアンプルまたはサシェなどの気密密閉された容器中に包装される。一実施形態において、本開示の１つまたは複数の予防薬もしくは治療薬、または薬剤組成物は、気密密閉された容器において凍結乾燥した無菌の粉末または水を含まない濃縮物として提供され、（例えば、水もしくは食塩水で）対象に投与するのに好適な濃度に再構成されてよい。好ましくは、本開示の１つまたは複数の予防薬もしくは治療薬、または薬剤組成物は、少なくとも５ｍｇ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、少なくとも７５ｍｇまたは少なくとも１００ｍｇの単位投与量で気密密閉された容器において凍結乾燥した無菌の粉末として提供される。凍結乾燥された、本開示の予防薬もしくは治療薬、または薬剤組成物は、そのオリジナルの容器中２℃と８℃の間で貯蔵されなければならず、本開示の予防薬もしくは治療薬、または薬剤組成物は、再構成後１週間以内、好ましくは５日以内、７２時間以内、４８時間以内、２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、３時間以内または１時間以内に投与されなければならない。代替の一実施形態において、本開示の予防薬もしくは治療薬、または薬剤組成物の１つまたは複数は、薬剤の量および濃度を示す、気密密閉された容器中に液体の形態において提供される。好ましくは、液体形態の投与される組成物は、気密密閉された容器中少なくとも０．２５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも８ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも２５ｍｇ／ｍｌ、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも７５ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌ提供される。液体形態はそのオリジナルの容器中２℃と８℃の間で貯蔵されなければならない。
本開示の抗体および抗体の部分は、非経口投与に適する薬剤組成物中に組み入れられてよい。好ましくは、抗体または抗体の部分は、抗体０．１−２５０ｍｇ／ｍｌを含む注射用溶液として調製される。注射用溶液は、フリントガラスまたはアンバーガラスのバイアル中、アンプルまたはプレフィルシリンジにおいて、液体または凍結乾燥した剤形のいずれかから構成されてよい。バッファーは、ｐＨ５．０から７．０（最適にはｐＨ６．０）のＬ−ヒスチジン（１−５０ｍＭ）、最適には５−１０ｍＭであってよい。他の適切なバッファーは、それだけには限定されないが、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムを含む。０−３００ｍＭ（液体剤形に対して最適には１５０ｍＭ）の濃度の溶液の毒性を改変するのに、塩化ナトリウムが用いられてよい。凍結乾燥した剤形には、主にショ糖０−１０％（最適には０．５−１．０％）の凍結保護物質が含まれていてよい。他の適切な凍結保護物質はトレハロースおよびラクトースを含む。凍結乾燥した剤形には、主にマンニトール１−１０％（最適には２−４％）である増量剤が含まれてよい。液体および凍結乾燥した剤形の両方において、主にＬ−メチオニン１−５０ｍＭ（最適には５−１０ｍＭ）である安定化剤が用いられてよい。他の適切な増量剤は、グリシン、アルギニンを含み、ポリソルベート−８０ ０−０．０５％（最適には０．００５％−０．０１％）として含まれてよい。さらなる界面活性剤は、それだけには限定されないが、ポリソルベート２０およびＢＲＩＪ界面活性剤を含む。非経口投与用の注射用液剤として調製される本開示の抗体および抗体の部分を含む薬剤組成物は、治療用タンパク質（例えば、抗体）の吸収または分散を増大するのに用いられるものなど、アジュバントとして有用な薬剤をさらに含むことができる。特に有用なアジュバントは、Ｈｙｌｅｎｅｘ（登録商標）（組換えヒトヒアルロニダーゼ）などのヒアルロニダーゼである。注射用液剤におけるヒアルロニダーゼの添加は、非経口投与、特に皮下投与の後のヒトのバイオアベイラビリティを改善する。これはまた注射部位の体積を大きくし（すなわち１ｍｌを超える）痛みおよび不快感を低減し、注射部位の反応の発生を最小にする（参照により本明細書に組み込む、国際公開第０４／０７８１４０号、および米国特許出願公開第ＵＳ２００６１０４９６８号を参照されたい）。
本発明の組成物は様々な形態で含むことができる。これらは、例えば、液体、半固体および固体の剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射用および注入用溶液）、分散剤および懸濁剤、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤を含む。好ましい形態は意図される投与様式および治療の適用に依存する。典型的な好ましい組成物は、他の抗体でのヒトの受動免疫化に用いられるものと同様の組成物などの、注射用または注入用溶液の形態で含まれる。好ましい投与様式は非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい一実施形態において、抗体は静脈内注入または静脈内注射によって投与される。別の好ましい一実施形態において、抗体は筋肉内注射または皮下注射によってＷ投与される。
治療用組成物は、典型的に滅菌でなければならず、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。組成物は、高い薬物濃度に適する、液剤、マイクロエマルジョン、分散剤、リポソーム、または他の指示された構造として調合されてよい。滅菌の注射用液剤は、必要とされる量の有効化合物（すなわち抗体または抗体の部分）を、所望により上記に列挙した成分の１つまたは組合せと一緒に好適な溶媒中に組み入れ、その後ろ過滅菌することによって調製され得る。一般的に、分散剤は、有効化合物を、基本的な分散媒体および上記に列挙したものからの必要とされる他の成分を含む滅菌のビヒクル中に組み入れることによって調製される。滅菌の注射用液剤を調製するための滅菌の凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分プラス予め滅菌−ろ過したその溶液からのあらゆるさらなる所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥および噴霧乾燥である。例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤の使用によって、溶液の適切な流動性は維持され得る。注射用組成物の吸収の延長は、組成物中に、モノステアリン酸塩およびゼラチンなど、吸収を遅らせる物質を含むことによってもたらされ得る。
本発明の抗体および抗体の部分は当技術分野において知られている様々な方法によって投与され得るが、多くの治療用の適用に対して、好ましい投与経路／様式は皮下注射、静脈内注射または注入である。当業者であれば理解されるように、投与経路および／または様式は所望の結果に応じて変化する。ある実施形態において、有効化合物は、化合物を速やかな放出から保護する担体、例えば、埋め込みを含めた徐放製剤、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化した送達システムと一緒に調製されてよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生物分解性の、生体適合性のポリマーが用いられてよい。
このような製剤を調製するための多くの方法が特許を得ており、または当業者に一般的に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８年を参照されたい。ある実施形態において、本開示の抗体または抗体の部分は、例えば、不活性な希釈剤または消化される食用の担体と一緒に経口投与されてよい。化合物（および所望により他の成分）も、ハードまたはソフトシェルのゼラチンカプセル中に封入され、錠剤に圧縮され、または対象の食餌中に直接組み入れられてもよい。治療用の経口投与では、化合物は賦形剤と一緒に組み入れられ、摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハーなどの形態において用いられてよい。本開示の化合物を非経口投与以外によって投与するために、不活性化を防ぐ材料で化合物をコーティングし、または不活性化を防ぐ材料と化合物を同時投与するのが必要であることがある。
補足的な有効化合物が組成物中に組み入れられてもよい。ある実施形態において、本開示の抗体または抗体の部分は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ活性が有害である障害を処置するのに有用である１つまたは複数のさらなる治療薬と一緒に調合されおよび／または同時投与される。例えば、本開示の抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗体または抗体の部分は、他の標的に結合する１つまたは複数のさらなる抗体（例えば、他のサイトカインに結合する抗体、または細胞表面分子に結合する抗体）と一緒に調合されおよび／または同時投与されてよい。
さらに、本開示の１つまたは複数の抗体は、２つまたはそれを超える前述の治療薬と併用して用いられてもよい。このような併用治療は、低投与量の投与される治療薬を有利に利用し、したがって様々な単独療法に付随する可能な毒性または合併症を避けることができる。ある実施形態において、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに対する抗体またはそのフラグメントは、当技術分野において知られている半減期を延長するビヒクルに連結されている。このようなビヒクルは、それだけには限定されないが、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコールおよびデキストランを含む。このようなビヒクルは、例えば、あらゆる目的で参照により本明細書に組み込む、米国特許出願第０９／４２８，０８２号および国際公開第９９／２５０４４号において記載されている。
特定の実施形態において、本開示の抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列、または本開示の別の予防薬もしくは治療薬は、遺伝子治療によって、障害または１つもしくは複数のその症状を処置、予防、管理または改善するために投与される。遺伝子治療は、対象に、発現されたまたは発現可能な核酸を投与することによって行われる治療を意味する。本開示のこの実施形態において、核酸は、核酸がコードする抗体、または予防効果もしくは治療効果を媒介する本開示の予防薬もしくは治療薬を生成する。当技術分野において利用可能な遺伝子治療のためのあらゆる方法が、本開示にしたがって用いられてよい。遺伝子治療の方法の一般的な再考には、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ、１２巻、４８８−５０５頁；ＷｕおよびＷｕ、１９９１年、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、３巻、８７−９５頁；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２巻、５７３−５９６頁；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０巻、９２６−９３２頁（１９９３年）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２巻、１９１−２１７頁；１９９３年５月、ＴＩＢＴＥＣＨ、１１巻（５）：１５５−２１５頁を参照されたい。用いられ得る組換えＤＮＡ技術の技術分野において一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３年）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０年）において記載されている。遺伝子治療の様々な方法の詳しい記載は、例えば参照により全体を本明細書に組み込む、米国特許出願公開第２００５００４２６６４ Ａ１号に提供されている。
本開示の抗体またはその抗原結合性部分は、肝臓に関連する疾患を処置するために単独または併用で用いられてよい。例えば、抗体はオートクラインの（ａｕｔｏｃｌｉｎｅ）癌の増殖を予防するための標的治療として用いられてよく、毒性の化学療法剤（すなわち毒性の性質を有する小分子または大分子）に付着していてよい。さらに、抗体は、画像化の目的で標識化されていてよい。本開示の抗体またはその抗原結合性部分は、単独、または１つもしくは複数のさらなる薬剤、例えば、治療薬（例えば、小分子もしくは生物学的）と併用して用いられてよく、前記さらなる薬剤は当業者によってその意図される目的に選択される。さらなる薬剤は、治療用組成物に有益な特性を与える薬剤、例えば、組成物に粘性をもたらす薬剤であってもよい。本発明の範囲内に含まれるべき組合せは、これらの意図する目的に有用であるこれらの組合せであることをさらに理解すべきである。以下に記載する薬剤は説明の目的であって、限定的であることを意図するものではない。組合せは本発明の一部分であって、本開示の抗体、および以下のリストから選択される少なくとも１つのさらなる薬剤であってよい。組合せはまた、１つを超えるさらなる薬剤、例えば、組合せが、形成された組成物がその意図された機能を行うことができるようである場合は２つまたは３つのさらなる薬剤を含むことができる。
本開示の薬剤組成物は「治療有効量」または「予防有効量」の、本開示の抗体または抗体の部分を含むことができる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するのに、必要な投与量および期間、有効な量を意味する。抗体または抗体の部分の治療有効量は当業者によって決定されてよく、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに抗体または抗体の部分が個体における所望の反応を誘発する能力などの因子にしたがって変化することがある。治療有効量はまた、抗体または抗体の部分のあらゆる毒性作用または有害作用を、治療上有益な効果が上回るものである。「予防有効量」は、所望の予防結果を達成するのに、必要な投与量および期間、有効な量を意味する。典型的に、疾患の前または疾患の初期段階に予防投与量が対象において用いられるので、予防有効量は治療有効量よりも少ない。
投与量レジメンは、最適の所望の反応（例えば、治療上または予防上の反応）をもたらすように調節されてよい。例えば、単回のボーラスが投与されてよく、いくつかの分割投与量が経時的に投与されてよく、または投与量は治療状況の要件によって示されるように比例的に低減または増大されてよい。投与を容易にし、投与量を均一にするための投与単位形態において非経口の組成物を調合するのが特に有利である。本明細書で用いられる投与単位形態は、処置されるべき哺乳動物の対象に対する単位の投与量として適合された、物理的に別々の単位を意味し、各単位は、必要とされる薬剤上の担体に関連して所望の治療効果を生成するように計算されている有効化合物の予め決定された量を含んでいる。本開示の投与単位形態に対する規定は、（ａ）有効化合物の独特の特性および達成されるべき特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）個体における感受性を治療するためにこのような有効化合物を配合する当技術分野に固有の制限によって指示され、直接的にこれらに依存する。
本開示の抗体または抗体の部分の治療有効量または予防有効量に対する例示の、非限定的な範囲は、０．１−２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは１−１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、改善されるべき病状のタイプおよび重症度とともに変化し得ることに留意されたい。あらゆる特定の対象に対して、詳しい投与量レジメンは、個体の必要性および組成物を投与し、または組成物の投与を監督する人間の専門的な判断にしたがって経時的に調節されるべきであり、本明細書において記載する投与量の範囲は例示的なものにすぎず、特許請求する組成物の範囲または実践を制限することを意図するものではないことをさらに理解されたい。
Ｇ．本開示の組成物および方法の適応
本明細書において言及する全ての特許および出版物は、本開示が関係する技術分野の技術者のレベルを示すものである。全ての特許および出版物は、個々の各出版物が参照によって組み入れられると特に、および個々に示されたごとく、同じ程度に参照によって本明細書に組み入れられる。
本明細書に例示的に記載される本開示は、本明細書に特に開示されていないあらゆるエレメントまたは（複数の）エレメント、制限または（複数の）制限の非存在下で適切に行われることがある。したがって、例えば、本明細書の各場合において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる」、および「からなる」のあらゆる語は、他の２語のいずれかで置き換えられることがある。用いられている語および表現は、限定の語としてではなく記述の語として用いられるものであり、このような語および表現を使用することで示され記載される特徴またはその部分のあらゆる同等物を除外しようという意向はないが、請求する本開示の範囲内に様々な修飾が可能であることが認められる。したがって、本開示は、好ましい実施形態および任意選択の特徴によって特に開示されているが、本明細書に開示される構想の改変および変形は当業者によって行使されることがあり、このような改変および変形は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内であるとみなされることを理解されたい。
例示により、限定を目的とせず、本開示の実施例をこれにより記載する。
［実施例１]６Ｈ６モノクローナル抗体の開発
免疫原のデザイン：ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（すなわち、血液凝固ＩＩ因子の非存在下ビタミンＫによって誘導されるタンパク質）特異的領域のＰＩＶＫＡ−ＩＩ １−１７におけるアミノ酸長１７個のペプチドを免疫原として選択した。ＰＩＶＫＡ−ＩＩにおけるアミノ酸長１７個のペプチド中にグルタミン酸の脱炭酸されたアミノ酸が４個存在し、プロトロンビン（ＩＩ因子）はアミノ酸長１７個のペプチド中に脱炭酸されたグルタミン酸（ＧＬＡ）を４個有していた。Ｃ末端にシステインを有する、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ特異的なアミノ酸長１７個のペプチドは、マレイミド活性化されたキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に選択的にコンジュゲートしていた。ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（１−１７）Ｃ末端コンジュゲートしたＫＬＨを使用することで、抗原としてＰＩＶＫＡ−ＩＩのＮ末端部分が提示される。ペプチドの合成およびＫＬＨに対するコンジュゲートは標準方法で行った。ペプチドのＮ末端領域はＫＬＨに結合していた。６Ｈ６モノクローナル抗体は、担体としてキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連結している以下の合成ペプチド（配列番号１８）を用いて生成された。
Figure 2013541936
免疫化：ペプチドＫＬＨを用いて、図１に示す通り、胚中心関連ＤＮＡプライマーゼ（ＧＡＮＰ）トランスジェニックＢａｌｂ／ｃマウス３匹およびＧＡＮＰトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス３匹を免疫化した。ＧＡＮＰトランスジェニックマウスの生成方法および免疫化方法は、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７４巻（２００５年）、４４８５−４４９４頁に記載されている方法にしたがった。ＰＩＶＫＡ−ＩＩおよびプロトロンビンに対する反応性の決定：プロトロンビン乾燥粉末（Ｓｉｇｍａ Ｆ５１３２）を１１０℃で８時間加熱することによって、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を調製した（Ｂａｊａｊら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２年４月１０日）、２５７巻（７）、３７２６−３１頁を参照されたい。）。免疫化から８週間を超えた後、マウスの血清を出血させ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに対する反応性およびプロトロンビンに対する反応性を、以下の手順を用いて決定した：ＰＩＶＫＡ−ＩＩ １ｕｇ／ｍＬまたはプロトロンビン５ｕｇ／ｍＬを、９６ウエルのエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）プレート中に加え、ＰＩＶＫＡ−ＩＩまたはプロトロンビンをウエル表面にコーティングした。Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅを含む溶液によってブロックした後、マウス血清を希釈し、次いでウエルに加えた。洗浄ステップの後、西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によって標識化した抗マウス抗体を加えた。もう洗浄ステップをさらに１回行った後、基質溶液を加え、次いで分光光度計によって吸光度を測定した。各群においてＰＩＶＫＡ−ＩＩに対して最高の反応性を示し、プロトロンビンに対して最小の反応性を示したマウスを、次のステップのために選択した。
融合：ＧＡＮＰトランスジェニックＢａｌｂ／ｃおよびＧＡＮＰトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６の各群から選択したマウス１匹からの脾臓細胞を、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７４巻（２００５年）、４４８５−４４９４頁において記載されている標準方法でミエローマ細胞に融合した。ハイブリドーマ細胞を限外希釈法によって希釈し、次いで培養上清をハイブリドーマのスクリーニングに用いた。
ハイブリドーマのスクリーニング：以下の手順を用いることによってハイブリドーマのスクリーニングを行った：（１）ＰＩＶＫＡ−ＩＩに対する反応性：ＰＩＶＫＡ−ＩＩ １ｕｇ／ｍＬを９６ウエルのＥＩＡプレート中に加え、ＰＩＶＫＡ−ＩＩをウエル表面上にコーティングした。Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅを含む溶液によってブロックした後、次いでハイブリドーマの上清をウエルに加えた。洗浄ステップの後、西洋ワサビのペルオキシダーゼによって標識化した抗マウス抗体を加えた。洗浄ステップをさらに１回行った後、基質溶液を加え、次いで分光光度計によって吸光度を測定した。高い反応性を示したウエルを次のステップのために選択した。（２）ｍＡｂ ３Ｃ１０（抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩ １７−２４抗体）を用いたサンドイッチ反応性：マウスＦｃに対する抗体１０ｕｇ／ｍＬを９６ウエルＥＩＡプレート中に加え、抗マウスＦｃ抗体をウエル表面上にコーティングした。Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅを含む溶液によってブロックした後、次いで、１：１００倍希釈したハイブリドーマの上清をウエルに加えた。洗浄ステップの後、異好性ブロッカー試薬（ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌｉｃ ｂｌｏｃｋｅｒ ｒｅａｇｅｎｔ）（ＨＢＲ）をウエルに加えて、予めコーティングした抗マウスＦｃ抗体の残存する反応部位をキャッピングした。洗浄ステップの後、ビオチン化した抗ＰＩＶＫＡ１７−２４モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ＃３Ｃ１０）をウエルに加えた。洗浄ステップの後、西洋ワサビのペルオキシダーゼによって標識化したアビジンを加えた。洗浄ステップをさらに１回行った後、基質溶液を加え、次いで分光光度計によって吸光度を測定した。結果を図２に示した。１ＯＤを超える吸光度を示したハイブリドーマを、次のステップのために選んだ。
クローンの確立：ハイブリドーマ６Ｈ６ハイブリドーマのクローニングを、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７４巻（２００５年）、４４８５−４４９４頁において記載されている標準手順を用いて行った。次いで６Ｈ６のクローンを確立した。
［実施例２］６Ｈ６モノクローナル抗体親和性のキャラクタリゼーション
蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いて、ｍＡｂ ６Ｈ６およびＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１−１３）、ｍＡｂ ６Ｈ６およびプロトロンビンペプチド（１−１３）のＫｄを決定した。ＦＣＳは、蛍光分子の拡散係数を測定することができる、溶液相の、単分子レベルの蛍光技術である。遊離の、および抗体結合したＡｌｅｘａ４８８−ペプチドの分子量における大きな差が拡散係数における実質的な変化をもたらし、次にこの変化を用いてペプチドと抗体との相互作用をモニタリングすることができる。
ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１−１３）の配列はＡｌｅｘａ４８８−ＣＡＮＴＦＬＥＥＶＲＫＧＮＬ（配列番号１９）であり、プロトロンビンペプチド（１−１３）の配列はＡｌｅｘａ４８８−ＣＡＮＴＦＬＥ＊Ｅ＊ＶＲＫＧＮＬ（配列番号２０）であった。標識化したペプチドの濃度を、Σ４９５＝７１０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて１ｃｍキュベット中の吸光度によって決定した。ｍＡｂ ６Ｈ６の濃度を、Σ２８０＝２１８０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて決定した。Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００蛍光倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＩｎｓＴｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．神奈川、日本）と一体化した２チャンネル蛍光相関分光計ＡＬＢＡ（ＩＳＳ、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、ＩＬ）を用いて、ＦＣＳ実験を行った。詳しい情報はＳ．Ｙ．Ｔｅｔｉｎら（２００６年）、「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｗｏ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ ＢＮＰ：ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５巻（４７）、１４１５５−６５頁）に記載されている。ペプチドおよびペプチドの抗体の平衡解離係数（Ｋｄ）を、直接結合実験において、ｍＡｂ ６Ｈ６の存在下、蛍光標識化したペプチドの自己相関曲線における変化をモニタリングすることによって測定した。Ａｌｅｘａ−４８８で標識化したペプチドを２ｎＭで維持し、抗体濃度を、一連の１５個の試料において、ナノモル以下からマイクロモルまで増加性に増大した。抗体結合したペプチドの分画を、２成分適合モデル（ｔｗｏ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ−ｆｉｔｔｉｎｇ ｍｏｄｅｌ）を用いて各自己相関曲線から算出した。適合のルーチン（ｆｉｔｔｉｎｇ ｒｏｕｔｉｎｅ）およびＫｄの算出はＳ．Ｙ Ｔｅｔｉｎら（２００６年）において記載されている。
結合性の測定は全て、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．４中で行った。図３は、ｍＡｂ ６Ｈ６およびＡｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチドの結合曲線を示す。ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチドに対するｍＡｂ ６Ｈ６のＫｄは３７±４ｎＭである。図４は、ｍＡｂ ６Ｈ６およびＡｌｅｘａ４８８−プロトロンビンペプチド（１−１３）の結合曲線を示す。曲線上の各データ点を、各自己相関曲線の適合から抽出した（データは示さず）。６Ｈ６ ｍＡｂおよびプロトロンビンペプチドのＫｄは４．６±０．５ｕＭである。
ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチドＣｙｓ１−１３の標識化：Ａｌｅｘａ４８８ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１−１３）を調製するために、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（ｃｙｓ１−１３）６ｍｇを４ｍＬガラスバイアル中に秤量し、５０ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．２ ２ｍＬ中に溶解し、この溶液に、ＤＭＦ（すなわち、ジメチルホルミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍｉｄｅ）０．２ｍＬ中Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８マリミド（ｍａｌｉｍｉｄｅ）１ｍｇを加えた。混合物を室温で２時間インキュベートした。Ａｌｅｘａ４８８ ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１−１３）を、６０分間、アセトニトリル水（１０−４０％）の勾配を用いてＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０ｕ、Ｃ１８（２）２５０×５０ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）上で精製した。ピークの純粋な分画をプールし、凍結乾燥して乾燥粉末０．６ｍｇを得た。標識化したペプチドの濃度を、Ｅ４９５＝７１０００Ｍ−ｌｃｍ−１を用いて１ｃｍキュベット中の吸光度によって決定した。
［実施例３］イムノアッセイ自動化イムノアッセイにおける６Ｈ６の使用
無血清培地中でハイブリドーマを培養した。培養上清中の抗体を、タンパク質Ａカラムで精製した。精製した３Ｃ１０ ＰＩＶＫＡ−ＩＩ特異的モノクローナル抗体を、磁性微粒子にコーティングした（カルボキシル基を、微粒子（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＬ）の表面上に、塩酸１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いて共有結合で付けた。）。コーティングした微粒子を、ウシ血清アルブミン（試薬Ａを作成するためのＢＳＡ）を含んでいたバッファー溶液中に分散させた。
アクリジニウムコンジュゲートを、上記に記載した６Ｈ６モノクローナル抗体から作成した。抗体を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化したアクリジニウムエステル（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＬ）を用いて標識化した。標識化した抗体を、ＢＳＡを含むバッファー中に希釈して試薬Ｂを調製した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むバッファー溶液を試薬Ｃとして調製した。イムノアッセイを、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴｉ２０００（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＬ）の自動化イムノアッセイシステムを利用した以下の手順で自動的に行った。特に、試薬Ａ５０ｕＬおよび試薬Ｃ５０ｕＬを、試料５０ｕＬと混合した。混合物を３７℃で１８分間インキュベートして、試料中の磁性微粒子上にコーティングされた抗体および反応性物質（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）を結合させた。磁性微粒子を磁石によって引きつけ、次いで残余の溶液を除去した。磁性微粒子の表面上に非特異的に結合した不純物が除去されるように、磁性微粒子をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によって洗浄した。次いで、試薬Ｂ ５０ｕＬを微粒子に加え、次いで（抗体がコーティングした磁性微粒子）−（試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ）−（アクリジニウム標識化した抗体）の複合体が形成された。ＰＢＳによる洗浄ステップの後、アルカリ性条件下でペルオキシドを加え、次いでアクリジニウムエステルが発光シグナルを生成し、このシグナルを光電子増倍管（ＰＭＴ）によって検出した。
ＰＩＶＫＡ−ＩＩ溶液を、磁性微粒子上にコーティングした４つの抗体を用いて、Ａｒｃｈｉｔｅｃｔイムノアッセイで試験した（図２）。クローン３Ｃ１０は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原に対して最も強い反応性を示した。これらの結果は３Ｃ１０抗体がＰＩＶＫＡ−ＩＩに対して高い特異性を示し、ＰＩＶＫＡ−ＩＩと高度に反応性であったことを示していた。アッセイは、ＢＳＡおよび抗微生物剤を含むｐＨ７．４のリン酸バッファー中ＰＩＶＫＡ ０から３００００ｍＡＵ／ｍＬの濃度の６つのキャリブレーターを用いてキャリブレートされる。ヒトＰＩＶＫＡ−ＩＩ分子の図を抗体反応性の部位とともに図５Ａに示す。アッセイフォーマットの図を図５Ｂに示す。
アッセイ性能の評価：６つのキャリブレーターを５回繰り返してアッセイし、ヒトプロトロンビン（Ａｂｂｏｔｔ Ｊａｐａｎ、東京、日本）に対する対照のコンジュゲートおよび６Ｈ６コンジュゲートの反応を用いて各キャリブレーターに対するＲＬＵ（相対的な光単位）の平均値を、表Ｂおよび図６に示す通り比較した。両方のコンジュゲートともアッセイにおいて良好な応答をもたらした。
Figure 2013541936
２つのＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイからの結果を、ポリクローナル抗ヒトプロトロンビンコンジュゲートを用いる市販のＰＩＶＫＡ−ＩＩアッセイ（Ｐｉｃｏｌｕｍｉ、ＥＩＳＡＩ、日本）からの結果に比較した。見かけ上健康な人からの試料（ＰｒｏＭｅｄＤｘ ＬＬＣ、Ｎｏｒｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）および肝細胞癌患者からの試料（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ、Ｗｅｓｔ Ｙａｒｍｏｕｔｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いた。両方のアッセイフォーマット対Ｐｉｃｏｌｕｍｉに対する相関を図７−８に示す。これらの結果は、ヒト血清中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するこれらのアッセイの能力を実証している。
［実施例４］３Ｃ１０細胞系統の開発
免疫原のデザイン：ＰＩＶＫＡ−ＩＩ １３−２７のＰＩＶＫＡ−ＩＩ特異的領域における、アミノ酸長１７個のペプチドを免疫原として選択した。ＰＩＶＫＡ−ＩＩにおけるアミノ酸長１５個のペプチドはグルタミン酸の脱炭酸されたアミノ酸６個を有し、プロトロンビン（ＩＩ因子）はアミノ酸長１５個のペプチド中に脱炭酸されたグルタミン酸（ＧＬＡ）６個を有していた。Ｎ末端にリンカーを有し、リンカーがキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とコンジュゲートしているｗ−ＬＥＲＥＣＶＥＥＴＣＣＳＹＥＥＡ（配列番号２１；２個のシステイン間にジスルフィド結合）（ｘ＝イプシロン−アミノカプロン酸）であった、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ特異的なアミノ酸長１５個のペプチドを免疫原としてデザインした。ペプチドの合成およびＫＬＨへのコンジュゲートは標準方法で行った。ペプチドのＮ末端領域はＫＬＨに結合していた。免疫化：ペプチドＫＬＨを用いて野生型Ｂａｌｂ／ｃマウス、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス、胚中心関連ＤＮＡプライマーゼ（ＧＡＮＰ）トランスジェニックＢａｌｂ／ｃマウスおよびＧＡＮＰトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した。ＧＡＮＰトランスジェニックマウスの生成方法および免疫化方法は、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７４巻（２００５年）、４４８５−４４９４頁において記載されている方法にしたがった。ＰＩＶＫＡ−ＩＩおよびプロトロンビンに対する反応性の決定：乾燥プロトロンビン粉末（Ｓｉｇｍａ Ｆ５１３２）を１１０℃で８時間加熱することによって、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を調製した（Ｂａｊａｊら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２年４月１０日）、２５７巻（７）、３７２６−３１頁を参照されたい）。
免疫化から８週間を超えた後、マウスの血清を出血させ、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに対する反応性およびプロトロンビンに対する反応性を、以下の手順を用いて決定した。ＰＩＶＫＡ−ＩＩ ５ｕｇ／ｍＬまたはプロトロンビン５ｕｇ／ｍＬを、９６ウエルのエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）プレート中に加え、ＰＩＶＫＡ−ＩＩまたはプロトロンビンをウエル表面上にコーティングした。マウス血清を希釈し、次いでウエルに加えた。洗浄ステップの後、西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によって標識化した抗マウス抗体を加えた。洗浄ステップをさらに１回行った後、基質溶液を加え、次いで分光光度計によって吸光度を測定した。各群においてＰＩＶＫＡ−ＩＩに対して最高の反応性を示し、プロトロンビンに対して最小の反応性を示したマウスを、次のステップ用に選択した。
融合：野生型Ｂａｌｂ／ｃ、野生型Ｃ５７ＢＬ／６、ＧＡＮＰトランスジェニックＢａｌｂ／ｃおよびＧＡＮＰトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６の各群から選択したマウス４匹からの脾臓細胞を、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７４巻（２００５年）、４４８５−４４９４頁において記載されている標準方法でミエローマ細胞に融合した。ハイブリドーマ細胞を限外希釈法によって希釈し、次いで培養上清をハイブリドーマのスクリーニングに用いた。
ハイブリドーマのスクリーニング：以下の手順を用いることによってハイブリドーマのスクリーニングを行った：ＰＩＶＫＡ−ＩＩ １ｕｇ／ｍｌまたはプロトロンビン５ｕｇ／ｍｌを９６ウエルのＥＩＡプレート中に加え、ＰＩＶＫＡ−ＩＩまたはプロトロンビンをウエル表面上にコーティングした。ＢｌｏｃｋＡｃｅを含む溶液によってブロックした後、次いでハイブリドーマの上清をウエルに加えた。洗浄ステップの後、西洋ワサビのペルオキシダーゼによって標識化した抗マウス抗体を加えた。洗浄ステップをさらに１回行った後、基質溶液を加え、次いで分光光度計によって吸光度を測定した。各群においてトップ５つのハイブリドーマを以下の基準によって選択した：（１）プロトロンビンに対して反応性なし、次いで（２）ＰＩＶＫＡ−ＩＩに対してトップ５つの反応性。野生型マウスから、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに強力に反応したハイブリドーマは得られなかった。ＧＡＮＰトランスジェニックＣ５８ＢＬ／６からのハイブリドーマ＃３Ｃ１０はＰＩＶＫＡ−ＩＩに対して強力な反応性を示し、プロトロンビンに対して反応性を示さなかった。ＧＡＮＰトランスジェニックマウスを、免疫原としてＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチドと一緒に用いる方法により、野生型マウスよりＰＩＶＫＡ−ＩＩに対して高い反応性を有し、プロトロンビンに対して反応性のない抗体を生成するクローンを生成することができた。
クローンの確立：ハイブリドーマ＃３Ｃ１０および＃２Ｈ４のクローニングを、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７４巻（２００５年）、４４８５−４４９４頁において記載されている標準方法を用いて行った。次いで３Ｃ１０および２Ｈ４のクローンを確立した。同じ融合の手順を用いて、ハイブリドーマのスクリーニングおよびクローンの確立を、上記に記載した通り、ＧＡＮＰトランスジェニックＢａｌｂ／ｃおよびＧＡＮＰトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス、ＧＡＮＰトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスからのクローン＃１２Ｄ６およびＧＡＮＰトランスジェニックＢａｌｂ／ｃマウスからのクローン＃７Ｂ１０の各群の１つに対して確立した。これらのクローンはＰＩＶＫＡ−ＩＩに対して強力な反応性を有し、プロトロンビンに対して反応性はなかった。
［実施例５］ＡＲＣＨＴＥＣＴシステムを使用する自動化イムノアッセイでのハイブリドーマスクリーニング
自動化イムノアッセイ：各ハイブリドーマを無血清培地中培養した。培養上清中の抗体をＰｒｏｔｅｉｎＡカラムで精製した。抗体を、磁性微粒子にコーティングした。（カルボキシル基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いて共有結合で微粒子（Ａｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＬ）の表面に付着させた。）コーティングした微粒子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むバッファー溶液中に分散し、次いで試薬Ａを調製した。Ｈｙｐｈｅｎ Ｂｉｏｍｅｄ（フランス）からの抗プロトロンビン抗体（コード＃ＰＡ１５０）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）が活性化したアクリジニウムエステル（Ａｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＬ）によって標識化した。標識化した抗体を、ＢＳＡを含むバッファー中に希釈し、次いで試薬Ｂを調製した。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むバッファー溶液を試薬Ｃとして調製した。ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ ｉ２０００（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ、ＩＬ）の自動化イムノアッセイシステムを利用して、以下の手順でイムノアッセイを自動的に行った。具体的には、試薬Ａ ５０ｕＬおよび試薬Ｃ ５０ｕＬを、試料５０ｕｌと混合した。混合物を３７℃で１８分間インキュベートして、試料中、磁性微粒子および反応性物質（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）上に抗体のコーティングを結合させた。磁性微粒子をマグネットによって引きつけ、次いで残余の溶液を除去した。磁性微粒子の表面上に非特異的に結合した不純物が除去されるように、磁性微粒子をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によって洗浄した。次いで、試薬Ｂ ５０ｕＬを微粒子に加え、次いで（抗体がコーティングした磁性微粒子）−（試料中ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）−（アクリジニウム標識化した抗体）の複合体を形成させた。ＰＢＳによる洗浄ステップの後、アルカリ性条件においてペルオキシドを加え、次いでアクリジニウムエステルによって発光シグナルが生成され、これを光電子増倍管（ＰＭＴ）によって検出した。ＰＩＶＫＡ−ＩＩ溶液を、磁性微粒子にコーティングした４つの抗体を用いてＡｒｃｈｉｔｅｃｔイムノアッセイで試験した（図１０）。クローン３Ｃ１０はＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原に対して高い反応性を示した。これらの結果は３Ｃ１０抗体がＰＩＶＫＡ−ＩＩに対して高い特異性を示し、ＰＩＶＫＡ−ＩＩと高度に反応性であったことを示していた。
［実施例６］自動化イムノアッセイを用いた血漿物質に対するクローン３Ｃ１０、２Ｈ４、７Ｂ１０および１２Ｄ６の反応性
２３ｍＡＵ／ｍＬおよび２３．５ｍＡＵ／ｍＬのＰＩＶＫＡ−ＩＩ値を有することが知られている２つの正常血漿検体を、磁性微粒子上をコーティングしたクローン＃３Ｃ１０、２Ｈ４、７Ｂ１０および１２Ｄ６からの抗体４つを用いてＡｒｃｈｉｔｅｃｔイムノアッセイで試験した。クローン３Ｃ１０および７Ｂ１０は、血漿からのシグナルを全く、または殆んど示さなかった（図１１）。この結果は、３Ｃ１０および７Ｂ１０は、ＩＩ因子（プロトロンビン）、ＩＸ因子、Ｘ因子、ＶＩＩ因子、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓおよびタンパク質Ｚを含む血漿物質に対して交差反応性がなかったことを示していた。特に、ＩＩ因子はＰＩＶＫＡ−ＩＩ ＨＨ因子の前駆物質であり、カルボキシル化されたグルタミン酸を含むＧＬＡドメインを有しこれらのアミノ酸はＰＩＶＫＡ−ＩＩ中に存在しないので、抗体３Ｃ１０はこれらの変化に特異的であり、ＩＩ因子／プロトロンビンを認識しない。ＩＸ因子、Ｘ因子およびＶＩＩ因子などの他の凝固因子もＧＬＡドメインを含んでおり、数個のアミノ酸が優先的に異なる（すなわち、相同タンパク質）。それゆえ、抗体３Ｃ１０はこれらのいかなるタンパク質をも認識しないが、これらはＰＩＶＫＡ−ＩＩに対するアミノ酸配列において非常によく似ている。
［実施例７］
抗体のキャラクタリゼーション
ａ）材料と方法
Figure 2013541936
 （Ｎａｒａｋｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、（２００２年）、１５８６巻、２８７−２９８頁）。
ＰＩＶＫＡ−ＩＩ １７−２７ ペプチドの長さのエピトープ特異性を評価するためにペプチドを合成した：
Figure 2013541936
Figure 2013541936
ペプチドの同族列（環状ペプチドは全てジスルフィド形成を意味し、可変残基を太字で示す。）：
Figure 2013541936
Ｂｉｏｌｏｇｙワークベンチを用いた配列相同分析：プロトロンビンのＧＬＡドメインは、他の凝固タンパク質との配列相同性を有する。プロトロンビン、タンパク質Ｚ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｃ、Ｘ因子およびＩＸ因子のタンパク質配列を、Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏデータベースから検索し、これらのタンパク質のＧＬＡドメインを写し取り、配列アラインメント用にＢｉｏｌｏｇｙワークベンチソフトウエア（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＳＤＳＣ）、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に提供した。配列アラインメントは、プロトロンビンのＧＬＡ領域中に埋め込まれた対象の領域（すなわち、１３から２７）において相同性を示した。
ペプチド合成：ペプチドを、ＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）からのＰｉｏｎｅｅｒ合成機上、またはＣＳＢｉｏ合成機（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）を用いて、市販のＦｍｏｃが保護するアミノ酸を用いて合成した。アミノ酸を、ＰｙＢＯＰ（すなわち、ベンゾトリアゾール−１−イルオシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ｏｓｙｔｒｉｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｐｈｓｐｈｏｎｉｕｍ ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ））またはＰｙＡＯＰ（すなわち、７−アザベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ピロリドノ（ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｏ））ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）などのカップリング試薬で活性化した。Ｆｍｏｃの保護を機器上で除去し、Ｎ末端のアミンにはキャップ付けしなかった。ペプチドを、水２．５％、トリイソプロピルシラン２．５％、およびＴＦＡ（すなわち、トリフルオロ酢酸）９５％試薬混合液を用いて、室温で１−２時間切断した。切断したペプチドをエーテルで沈澱させ、５０％アセトニトリル水溶液中溶解し、凍結乾燥して必要とするペプチドを得た。これは、配列＃１から＃２０に対するペプチド合成に利用した一般的手順である（下記を参照されたい）。
ＰＩＶＫＡ−ＩＩの環化：ｄｉＡｃｍＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１３−２７）５０ｍｇを、酢酸（「ＡｃＯＨ」）：Ｈ２Ｏ混合液（１：１ｖ／ｖ）２０ｍＬ中混合した。１Ｎ ＨＣｌ ２ｍＬを加え、その後ヨウ素３０ミリグラムのメタノール（「ＭｅＯＨ」）：ＡｃＯＨ（１：１ｖ／ｖ）溶液を加えた（Ｇｒｅｇ Ｆｉｅｌｄｓ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２８９巻、１９８−２２１頁、１９９７年）。反応混合物を、暗条件下４５分間撹拌した。反応混合物は、いかなる懸濁粒子もない澄明な褐色溶液であった。
４５分後、アスコルビン酸の１０％溶液を加えることによって反応をクエンチした。特に、溶液が澄明になるまで、およそ１００ｍｇのアスコルビン酸溶液（すなわち、およそ１０ｍＬ）（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩから市販されている）を滴下添加した。溶液を水で４倍希釈し、分取ＨＰＬＣによって精製した。６０分間アセトニトリル水（１０−４０％）の勾配を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０ｕ、Ｃ１８（２）２５０×５０ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）を精製に用いた。ピークが立ち上がるときペプチドを分画中回収し、分画をＨＰＬＣによって確認した。最高純度（すなわち、＞９８％）の分画をプールし、凍結乾燥した。１１０ｍｇの環化したＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１３−２７）が得られた。
ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチドの標識化：Ａｌｅｘａ４８８ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１３−２７）を調製するために、環化したＰＩＶＫＡ−ＩＩ（１３−２７）４ｍｇを４ｍＬガラスバイアル中に秤量し、ＤＭＦ（すなわち、ジメチルホルミド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍｉｄｅ））１ｍＬ中Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｒ４８８ＴＦＰ活性エステル２ｍｇで処理した。この混合物にＤＩＥＡ（すなわち、ジイソプロピルエチルアミン）０．２ｍＬを加え、混合物を２時間インキュベートした。Ａｌｅｘａ４８８ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１３−２７）を、６０分間アセトニトリル水（１０−４０％）の勾配を用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ １０ｕ、Ｃ１８（２）２５０×５０ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）上、精製した。ピークの純粋な分画をプールし、凍結乾燥して乾燥粉末０．６ｍｇを得た。標識化したペプチドの濃度をＥ４９５＝７１０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて１ｃｍキュベット中の吸光度によって決定した。
抗体の標識化：抗ＰＩＶＫＡ−ＩＩｍＡｂ３Ｃ１０を、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡ）で選択的に標識化した。精製および標識化の手順は業者によって提供された。非標識のＢＨＱ−１０ｓを、ＰＢＳで平衡にしたＧ−２５カラム上で除去した。標識化したｍＡｂの濃度を、Σ２８０＝２１８０００Ｍ−１ｃｍ−１を用いて決定し、ＢＨＱからの寄与（Σ２８０＝２１８０００Ｍ−１ｃｍ−１）に対して補正した。モル取込み比（Ｉ．Ｒ．色素／タンパク質）を、タンパク質および発色団の濃度に基づいて計算した。ｍＡｂ３Ｃ１０に対するＩ．Ｒ．は２．３である。
蛍光ベースの方法：蛍光異方性およびフェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を用いて、Ａｌｅｘａ−４８８標識化したＰＩＶＫＡ−ＩＩＧｌａドメインペプチド（１３−２７）およびこのペプチドに対して発生されたモノクローナル抗体の解離定数を決定した。特に、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いて、Ｇｌａ置換したＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１３−２７）変異体の結合強度を比較し、ＰＩＶＫＡ−ＩＩペプチド（１３−２７）のエピトープのＧｌａ残基を同定した。ＦＣＳは、蛍光分子の拡散係数を測定することができる、溶液相の、一分子レベルの蛍光技術である。遊離および抗体結合しているＡｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡＩＩ（１３−２７）の分子量における大きな相違が拡散係数における実質的な変化をもたらし、次にこの変化を用いて分析物と抗体との相互作用をモニタリングすることができる。
計測手段：平衡の蛍光測定は全て、ＳＬＭ８１００光子計数分光蛍光計（ＳＬＭ；もはや存在しない）上で行った。異方性の測定には、２５試料を４８０ｎｍで励起し、発光蛍光シグナルを偏光子および５３０／３０ｎｍ干渉フィルタを通して回収した。各試料に対する異方性値を５回測定し、平均値を記録した。蛍光強度の測定には、試料を４８０ｎｍで励起した。発光蛍光シグナルの合計を、５３０／３０ｎｍ干渉フィルタを通して回収した（感度を改善するために偏光器は除去した。）。各試料に対する蛍光シグナルの合計を５回測定し、平均値を記録した。Ｎｉｋｏｎ ＥｃｌｉｐｓｅＴＥ３００蛍光倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ ＩｎｓＴｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｋａｎａｇａｗａ、日本）と一体化した２チャンネル蛍光相関分光計ＡＬＢＡ（ＩＳＳ、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、ＩＬ）を用いて、ＦＳＣ実験を行った。詳しい情報はＴｅｔｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６年、４５巻、１４１５５−６５頁に記載されている。
解離定数の決定：抗原（対象の抗体での）の平衡解離定数（Ｋｄ）を、直接結合実験において、蛍光異方性または蛍光強度における変化をモニタリングすることによって測定した。Ａｌｅｘａ−４８８で標識化した抗原を、十分にＫｄ未満の濃度に維持し、抗体の濃度は１５試料の連続において、ピコモル範囲からマイクロモル未満まで徐々に増大した。Ａｌｅｘａ４８８−抗原が抗体に結合している場合、Ａｌｅｘａ４８８−抗原の蛍光強度の消光が存在しないので、異方性における変化は、以下の通り、抗体に結合している抗原の割合（Ｆｂ）に直接比例する。
Figure 2013541936
 式中、Ａ（ｉ）は各抗体濃度でのＡｌｅｘａ４８８−抗原の異方性であり、ＡｍｉｎはＡｌｅｘａ４８８−抗原単独の異方性であり、ＡｍａｘはＡｌｅｘａ４８８−抗原に結合している抗体の異方性である。未結合の抗体結合性部位の濃度［ＡＢＳｆｒｅｅ］は、以下の式から計算され得る。
Figure 2013541936
 次いで、結合性のデータを単純結合性モデルに適合させて平衡解離定数を計算した。
Ｋｄ：
Figure 2013541936
高親和性モノクローナル抗体３Ｃ１０（ｍＡｂ３Ｃ１０）に対して、結合性を測定するのに、異方性測定の感度未満である、低濃度のＡｌｅｘａ４８８−抗原（５０ｐＭ）が必要とされる。したがって、異なる取組みが用いられる。特に、ブラックホールクエンチャー（蛍光発色団がない）をｍＡｂ３Ｃ１０上に導入することによって、Ａｌｅｘａ４８８−抗原の蛍光強度は、ｍＡｂ３Ｃ１０に結合したときに消光される。各抗体濃度での抗原（Ｉｉ）の蛍光５強度の消光（Ｑ）は、等式４から計算される。
Figure 2013541936
 式中、Ｉｍａｘは、抗体の非存在における抗原の蛍光強度である。Ｉｍｉｎは、抗体の最高濃度での抗原の蛍光強度である。Ｑ／Ｑｍａｘ値がそのモノクローナル抗体に結合しているＡｌｅｘａ４８８−抗原の割合に直接転換され得ることを想定すると、未結合の抗体結合性部位の濃度［ＡＢＳｆｒｅｅ］は以下の式から計算され得る。
Figure 2013541936
 式中、［ＡＢＳｔｏｔａｌ］および［Ｔｔｏｔａｌ］はそれぞれ、抗体結合性部位およびＡｌｅｘａ４８８−ペプチドの合計濃度である。次いで、結合性のデータを単純結合性モデルに適合させて平衡解離定数を計算した。
Figure 2013541936
結合性の測定は全て、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．００５％界面活性剤Ｐ２０を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーｐＨ７．４中で行った。Ａｌｅｘａ−４８８が標識化したＰＩＶＫＡＩＩ Ｇｌａドメインペプチド（１３−２７）およびｍＡｂの結合滴定曲線を図１２および１３に示す。Ａｌｅｘａ４８８−抗原がｍＡｂに結合しているときの解離定数およびＡｌｅｘａ４８８−抗原の異方性における変化を以下の表Ｃに列挙する。
Figure 2013541936
蛍光相関分光法によるエピトープマッピング：Ｇｌｕが置換しているペプチドの、Ａｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（１３−２７）およびｍＡｂ３Ｃ１０との競合的結合性測定により、ｍＡｂ３Ｃ１０に対するエピトープ認識において決定的な役割を果たす１３−２７領域における１０個の特異的なＧｌａ残基が同定された。これらの各位置をＧｌｕで置換するとｍＡｂ３Ｃ１０による認識を部分的または完全に排除するので、結果は残基Ｇｌａ１９、２０および２５はｍＡｂ３Ｃ１０に対するエピトープ認識にかかわることを示していた（図１４を参照されたい）。
ＰＩＶＫＡ−ＩＩの様々な調製物の効力：ＰＩＶＫＡ−ＩＩの様々な調製物の、２０個のＡｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（１３−２７）およびｍＡｂ３Ｃ１０との競合的結合性測定を用いて、様々なロットのＰＩＶＫＡ−ＩＩの効力を比較した。結果は、加熱４時間後、試料の効力はその最高値に到達し、４時間より長く加熱した場合に改善されないことを示していた（図１５を参照されたい）。ＰＩＶＫＡ−ＩＩ Ｇｌａドメイン（１３−２７）類似体の２５交差反応性：様々なＰＩＶＫＡ−ＩＩ Ｇｌａドメイン（１３−２７）類似体の、Ａｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（１３−２７）およびｍＡｂ３Ｃ１０との競合的結合測定を用いて、ｍＡｂ３Ｃ１０とのこれらの交差活性を試験した。Ａｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（１３−２７）２ｎＭおよびｍＡｂ３Ｃ１０ １０ｍＭを予め混合して、Ａｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（１３−２７）の全てを確実に抗体に結合させた。次いで、様々なＰＩＶＫＡＩＩ Ｇｌａドメイン（１３−２７）類似体を試料に加えた。ＰＩＶＫＡＩＩ（１３−２７）を陽性対照として加え、オリジナルの試料を陰性対照として用いた。一夜インキュベート後、ＦＣＳ測定を各試料に対して行った。図１６は、各試料からの自己相関曲線および拡散係数の計算値（Ｄ）を図示するものである。結果は、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ（１３−２７）はｍＡｂ３Ｃ１０からのＡｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡＩＩ（１３−２７）を置き換えることができ、１０高いＤ値をもたらすが、他のＰＩＶＫＡＩＩペプチド類似体は全て、ｍＡｂ３Ｃ１０からのＡｌｅｘａ４８８−ＰＩＶＫＡＩＩ（１３−２７）を置き換えることができず、これらにはｍＡｂ３Ｃ１０と交差反応性がないことを示していた。

Claims (76)

  1. アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表される、ハイブリドーマ細胞系統。
  2. 請求項１に記載のハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体。
  3. プロトロンビン誘導ビタミンＫアンタゴニストＩＩ（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）のアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を含む、単離された結合性タンパク質。
  4. 約４．０×１０−９またはそれより低い結合解離定数（Ｋｄ）を有する、請求項３に記載の単離された結合性タンパク質。
  5. 約１．０×１０−９から約１．０×１０−１０までの結合解離定数（Ｋｄ）を有する、請求項３に記載の単離された結合性タンパク質。
  6. 結合性タンパク質が可変重鎖領域を有し、可変重鎖領域のアミノ酸配列が請求項２に記載のモノクローナル抗体のアミノ酸配列に少なくとも７０％の配列同一性を有する、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する結合性タンパク質をコードする単離された核酸分子。
  7. 結合性タンパク質がＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を含む、請求項６に記載の単離された核酸分子。
  8. 請求項２に記載のモノクローナル抗体のアミノ酸配列に少なくとも７０％の配列同一性を有する、精製されたアミノ酸配列。
  9. 請求項６に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
  10. 請求項９に記載のベクターを含む単離された宿主細胞。
  11. ａ）調節エレメントに操作可能に連結している請求項７に記載の核酸分子を含むベクターを構築するステップ、ｂ）得られたベクターを宿主細胞中に形質転換で導入するステップ、ｃ）結合性タンパク質を生成するのに十分な時間および条件下、前記宿主細胞を培養するステップを含む、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合することができる結合性タンパク質を生成する方法。
  12. 請求項１１に記載の方法にしたがって生成される、単離された結合性タンパク質。
  13. ａ）試験試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有する抗体と、抗体−抗原複合体の形成に十分な時間および条件下、接触させるステップ、およびｂ）前記抗体−抗原複合体の存在が前記試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の存在を示す、前記抗体−抗原複合体の存在を検出するステップ、を含む、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出する方法。
  14. 前記抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
  15. 試験試料が、全血、血清、または血漿である、請求項１３に記載の方法。
  16. 抗体が検出可能な標識で標識化されており、（ｂ）が、検出可能な標識によって生成され、または検出可能な標識から放射されるシグナルを測定するステップ、および試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出するステップを含む、請求項１３に記載の方法。
  17. 検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 検出可能な標識がアクリジニウム化合物である、請求項１６に記載の方法。
  19. ａ）過酸化水素の源を生成し、または抗体−抗原複合体に提供するステップ、ｂ）塩基性溶液をステップ（ａ）の混合物に加えるステップ、およびｃ）ステップ（ｂ）において生成され、または放射される光シグナルを測定し、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩを検出するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
  20. アクリジニウム化合物が、式Ｉ：
    Figure 2013541936
     ［式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
    Figure 2013541936
     は陰イオンである］
    による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキサミドである、請求項１８に記載の方法。
  21. アクリジニウム化合物が、式ＩＩ：
    Figure 2013541936
     ［式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルであり、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
    Figure 2013541936
     は陰イオンである］
    による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルである、請求項１８に記載の方法。
  22. 試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出する方法であって、
    ａ）試験試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性部分を有する第１の抗体と、第１の抗体−抗原複合体の形成に十分な時間および条件下、接触させるステップ、ｂ）第２の抗体がＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有し、検出可能な標識にコンジュゲートしている、第２の抗体を第１の抗体／抗原複合体に、第１の抗体／抗原／第２の抗体の複合体を形成するのに十分な時間および条件下、加えるステップ、ならびにｃ）検出可能な標識によって生成され、または検出可能な標識から放射されるシグナルを測定し、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出するステップを含む、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出する前記方法。
  23. 第１の抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９６３８を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体である、請求項２２に記載の方法。
  24. 第２の抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体である、請求項２２に記載の方法。
  25. 試験試料が、全血、血清、または血漿である、請求項２２に記載の方法。
  26. 検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
  27. 検出可能な標識がアクリジニウム化合物である、請求項２２に記載の方法。
  28. アクリジニウム化合物が、式Ｉ：
    Figure 2013541936
     ［式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
    Figure 2013541936
     は陰イオンである］
    による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキサミドである、請求項２７に記載の方法。
  29. アクリジニウム化合物が、式ＩＩ：
    Figure 2013541936
     ［式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルであり、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
    Figure 2013541936
     は陰イオンである］
    による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルである、請求項２８に記載の方法。
  30. 第１の抗体が固相上に、第１の抗体−抗原複合体の形成の前または後のいずれかに固定化される、請求項２２に記載の方法。
  31. 試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出する方法であって、
    ａ）試験試料を、１）検出可能なシグナルを生成することができる検出可能な標識に付いている、ＰＩＶＫＡ−ＩＩレファレンス抗原、および２）ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原に対する抗体と、ＰＩＶＫＡ−ＩＩレファレンス抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下、接触させるステップ、ｂ）試験試料中に検出されるＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量が、抗体に結合しているＰＩＶＫＡ−ＩＩレファレンス抗原の量に逆比例する、検出可能な標識によって生成されるシグナルを検出するステップを含む、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を検出する前記方法。
  32. 抗体が、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 抗体が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系統によって生成される、請求項３１に記載の方法。
  34. 試験試料が、全血、血清、または血漿である、請求項３１に記載の方法。
  35. 検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  36. 検出可能な標識がアクリジニウム化合物である、請求項３１に記載の方法。
  37. アクリジニウム化合物が、式Ｉ：
    Figure 2013541936
     ［式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
    Figure 2013541936
     は陰イオンである］
    による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキサミドである、請求項３６に記載の方法。
  38. アクリジニウム化合物が、式ＩＩ：
    Figure 2013541936
     ［式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルであり、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
    Figure 2013541936
     は陰イオンである］
    による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルである、請求項３６に記載の方法。
  39. ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを含む結合性タンパク質を発現するハイブリドーマ細胞系統を生成する方法であって、
    ａ）ＧＡＮＰマウスを、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１７を含む抗原で、前記マウスが前記抗原に対する抗体を生成するのに十分な時間および条件下、免疫化するステップ、ｂ）前記マウスの脾臓から８つの細胞を収集し、精製するステップ、ｃ）ハイブリドーマを生成するために、前記脾臓細胞をミエローマと融合するステップ、ならびにｄ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを含む前記結合性タンパク質を発現するハイブリドーマ細胞系統を選択するステップを含む、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性ドメインを含む結合性タンパク質を発現するハイブリドーマ細胞系統を生成する前記方法。
  40. ハイブリドーマ細胞系統がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有する、請求項３９に記載の方法。
  41. 請求項３に記載の結合性タンパク質および薬学的に許容される担体を含む、薬剤組成物。
  42. 結合性タンパク質が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１０５４１を有するハイブリドーマ細胞系によって生成されるモノクローナル抗体を含む、請求項４１に記載の薬剤組成物。
  43. ＨＣＣまたは肝癌を有することが疑われる患者におけるＨＣＣまたは肝癌を診断する方法であって、
    ａ）患者から生物学的試料を単離するステップ、ｂ）前記生物学的試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原のアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を含む抗体と接触させるステップ、ｃ）ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の存在を検出するステップ、ｄ）前記複合体中に存在する前記ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原を、前記複合体中に存在する前記抗体から解離するステップ、ならびにｅ）予め決定されたレベルを超える解離されたＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量が、前記患者における肝細胞癌（ＨＣＣ）または肝癌の診断を示す、解離したＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量を測定するステップを含む、ＨＣＣまたは肝癌を有することが疑われる患者におけるＨＣＣまたは肝癌を診断する前記方法。
  44. 予め決定されたレベルが約４０ｍＡＵ／ｍＬである、請求項４３に記載の方法。
  45. 生物学的試料が、全血、血清、または血漿である、請求項４３に記載の方法。
  46. ＨＣＣまたは肝癌を有することが疑われる患者におけるＨＣＣまたは肝癌を診断する方法であって、
    ａ）患者から生物学的試料を単離するステップ、ｂ）前記生物学的試料を、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体の形成に十分な時間および条件下、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原のアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性ドメインを有する第１の抗体と接触させるステップ、ｃ）検出可能なシグナルを産生することができるＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原のアミノ酸１−１３に抗原結合性ドメインを有し、検出可能な標識に付着している第２の抗体を含むコンジュゲートを、得られたＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原／抗体複合体に、結合しているＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原に前記コンジュゲートを結合させるのに十分な時間および条件下、加えるステップ、ｄ）前記検出可能な標識によって産生されるシグナルを検出することによって、前記生物学的試料中に存在する可能性があるＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の存在を検出するステップ、ならびにｅ）予め決定されたレベルを超えるＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量が、前記患者におけるＨＣＣまたは肝癌の存在を示す、前記シグナルの強度を測定することによって前記試験試料中に存在するＰＩＶＫＡ−ＩＩ抗原の量を測定するステップを含む、ＨＣＣまたは肝癌を有することが疑われる患者におけるＨＣＣまたは肝癌を診断する前記方法。
  47. 予め決定されたレベルが約４０ｍＡＵ／ｍＬである、請求項４６に記載の方法。
  48. 生物学的試料が、全血、血清、または血漿である、請求項４６に記載の方法。
  49. 検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
  50. 検出可能な標識がアクリジニウム化合物である、請求項４６に記載の方法。
  51. アクリジニウム化合物が、式Ｉ：
    Figure 2013541936
     ［式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
    Figure 2013541936
     は陰イオンである］
    による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキサミドである、請求項５０に記載の方法。
  52. アクリジニウム化合物が、式ＩＩ：
    Figure 2013541936
     ［式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルであり、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
    Figure 2013541936
     は陰イオンである］
    による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルである、請求項５０に記載の方法。
  53. 請求項２に記載のモノクローナル抗体または請求項３に記載の結合性タンパク質を含有する容器を含む、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を検出および／または定量するためのキット。
  54. ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性部分を有する結合性タンパク質を含有する容器をさらに含む、請求項５３に記載のキット。
  55. 結合性タンパク質が、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−９６３８によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体を含む、請求項５４に記載のキット。
  56. ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有する抗体を含む検出試薬、ならびに試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を検出および／または定量するための指示書を含む、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を検出および／または定量するためのキット。
  57. ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有する抗体が、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成されるモノクローナル抗体である、請求項５６に記載のキット。
  58. 抗体に付いている検出可能な標識をさらに含み、検出可能な標識が、検出可能な標識は検出可能なシグナルを生成することができる、請求項５６に記載のキット。
  59. 検出可能な標識が、放射性標識、酵素標識、化学発光標識、蛍光標識、温度測定標識、および免疫−ポリメラーゼ連鎖反応標識からなる群から選択される、請求項５８に記載のキット。
  60. 検出可能な標識がアクリジニウム化合物である、請求項５９に記載のキット。
  61. アクリジニウム化合物が、式Ｉ：
    Figure 2013541936
     ［式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
    Figure 2013541936
     は陰イオンである］
    による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキサミドである、請求項６０に記載のキット。
  62. アクリジニウム化合物が、式ＩＩ：
    Figure 2013541936
     ［式中、Ｒ１は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルであり、Ｒ３からＲ１５は各々独立に、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル、アミノ、アミド、アシル、アルコキシル、ヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン、ハロゲン化物、ニトロ、シアノ、スルホ、スルホアルキル、カルボキシアルキル、およびオキソアルキルからなる群から選択され、場合によって、存在する場合は、
    Figure 2013541936
     は陰イオンである］
    による構造を有するアクリジニウム−９−カルボキシレートアリールエステルである、請求項６０に記載のキット。
  63. 塩基性溶液をさらに含む、請求項６０に記載のキット。
  64. 塩基性溶液が少なくとも約１０のｐＨを有する溶液である、請求項６３に記載のキット。
  65. 過酸化水素の源をさらに含む、請求項６０に記載のキット。
  66. 過酸化水素の源が、過酸化水素を含むバッファーまたは溶液を含む、請求項６５に記載のキット。
  67. 過酸化水素の源が過酸化水素生成酵素を含む、請求項６５に記載のキット。
  68. 過酸化水素生成酵素が、（Ｒ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、（Ｓ）−６−ヒドロキシニコチンオキシダーゼ、３−ａｃｉ−ニトロプロパン酸オキシダーゼ、３−ヒドロキシアントラニル酸オキシダーゼ、４−ヒドロキシマンデル酸オキシダーゼ、６−ヒドロキシニコチン酸デヒドロゲナーゼ、アブシジン酸−アルデヒドオキシダーゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ（銅含有）、アミンオキシダーゼ（フラビン含有）、アリール−アルコールオキシダーゼ、アリール−アルデヒドオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コルンバミンオキシダーゼ、シクロヘキシルアミンオキシダーゼ、チトクロームｃオキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アラビノノ−１，４−ラクトンオキシダーゼ、Ｄ−アスパラギン酸オキシダーゼ、Ｄ−グルタミン酸オキシダーゼ、Ｄ−グルタミン酸（Ｄ−アスパラギン酸）オキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ、ジヒドロオロテートオキシダーゼ、ジヒドロウラシルオキシダーゼ、ジメチルグリシンオキシダーゼ、Ｄ−マンニトールオキシダーゼ、エクジソンオキシダーゼ、エタノールアミンオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンオキシダーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、グリシンオキシダーゼ、グリオキシル酸オキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロキシフィタン酸オキシダーゼ、インドール−３−アセトアルデヒドオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ、Ｌ−ガラクトノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、Ｌ−グロノラクトンオキシダーゼ、Ｌ−リジン６−オキシダーゼ、Ｌ−リジンオキシダーゼ、長鎖アルコールオキシダーゼ、Ｌ−ピペコリン酸オキシダーゼ、Ｌ−ソルボースオキシダーゼ、リンゴ酸オキシダーゼ、メタンチオールオキシダーゼ、モノアミノ酸オキシダーゼ、Ｎ６−メチルリジンオキシダーゼ、Ｎ−アシルヘキソサミンオキシダーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ニトロアルカンオキシダーゼ、Ｎ−メチル−Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ヌクレオシドオキシダーゼ、シュウ酸オキシダーゼ、ポリアミンオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、ポリビニルアルコールオキシダーゼ、プレニルシステインオキシダーゼ、タンパク質−リジン６−オキシダーゼ、プトレシンオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ピリドキサール５’−リン酸合成酵素、ピリドキシン４−オキシダーゼ、ピロロキノリンキノン合成酵素、ピルビン酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ（ＣｏＡ−アセチル化）、レチクリンオキシダーゼ、レチナールオキシダーゼ、リファマイシン−Ｂオキシダーゼ、サルコシンオキシダーゼ、２級アルコールオキシダーゼ、亜硫酸オキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、スーパーオキシドレダクターゼ、テトラヒドロベルベリンオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、トリプトファンα，β−オキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ（ウリカーゼ、尿酸オキシダーゼ）、バニリルアルコールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、キシリトールオキシダーゼ、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項６７に記載のキット。
  69. ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性部分を含む第１の単離された結合性タンパク質、およびＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を含む第２の単離された結合性タンパク質を含む、試験試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を検出および／または定量するためのキット。
  70. 第１および第２の単離された結合性タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項６９に記載のキット。
  71. 第１のモノクローナル抗体が、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−９６３８によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成される抗体であり、第２のモノクローナル抗体が、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成される抗体である、請求項７０に記載のキット。
  72. 少なくとも２つの異なる結合性タンパク質の使用を含み、各結合性タンパク質が、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのサブセットのアミノ酸１−３３に特異的に結合する抗原結合性部分を含み、各結合性タンパク質の抗原結合性部分が、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−３３の異なるサブセットに結合する、試料中のＰＩＶＫＡ−ＩＩの量を決定するための方法。
  73. 結合性タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項７２に記載の方法。
  74. 第１のモノクローナル抗体が、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する抗原結合性部分を有し、第２のモノクローナル抗体が、ＰＩＶＫＡ−ＩＩに結合する抗原結合性部分およびプロトロンビンの少なくともサブセットのアミノ酸１−３３に結合する抗原結合性部分を有する、請求項７３に記載の方法。
  75. 第１のモノクローナル抗体が、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１３−２７に結合する抗原結合性部分を有し、第２のモノクローナル抗体が、ＰＩＶＫＡ−ＩＩのアミノ酸１−１３に結合する抗原結合性部分を有する、請求項７４に記載の方法。
  76. 第１のモノクローナル抗体が、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−９６３８によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成される抗体であり、第２のモノクローナル抗体が、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）受託番号ＰＴＡ−１０５４１によって表されるハイブリドーマ細胞系統によって生成される抗体である、請求項７５に記載の方法。
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