CN113424060A - 抗纳洛酮和抗纳曲酮单克隆抗体及其生产和使用方法 - Google Patents
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Abstract
公开了特异性结合纳洛酮或纳曲酮的抗体。还公开了用于产生抗体的缀合物，以及产生抗体的方法。还公开了在纳洛酮或纳曲酮的直接测定中使用抗体的方法。进一步公开了使用抗体在阿片剂测定中减少纳洛酮或纳曲酮干扰的方法。
Description
相关申请的交叉引用/通过引用并入声明
不适用。
关于联邦资助的研究或开发的声明
不适用。
背景
纳洛酮通常用作滥用的阿片样物质的拮抗剂，通常在药物过量的情况下。纳洛酮是一种拯救生命的短效药物，其通过从阿片剂受体剥离阿片剂，使患者摆脱阿片剂过量。向患者给予纳洛酮(NARCAN®(盐酸纳洛酮)，ADAPT Pharma, Inc., Radnor, PA.)的重复注射以使药物受体饱和，使得使对滥用的阿片样物质的药理学应答最小化。纳洛酮在数分钟内起作用并持续约一小时。
纳曲酮是另一种通常使用的阿片样物质拮抗剂药物，其也用于酗酒情况下；纳曲酮是一种阿片剂/酒精阻断剂，其已使用持续最近30年。纳曲酮作用缓慢且持续时间比纳洛酮更长。VIVITROL® (Alkermes, Inc., Dublin, Ireland)是纳曲酮的延长释放形式。VIVITROL®的延长释放形式有助于患者依从性，因为不需要每天使用。
纳洛酮和纳曲酮两者也将钝化酒精的作用，且因此，它们经常在从住院治疗计划出院后使用以防止酒精复发。
纳洛酮快速分布于全身。平均血清半衰期已显示范围为30至81分钟，这比一些阿片剂的平均半衰期更短，并且如果必须停止阿片样物质受体以免于触发延长时间段，则需要重复给药。纳洛酮主要由肝脏代谢；其主要代谢物是纳洛酮-3-葡糖苷酸，其排泄在尿液中。
纳曲酮主要在肝脏中被二氢二醇脱氢酶代谢为6β-纳曲醇。其他代谢物包括2-羟基-3-甲氧基-6β-纳曲醇和2-羟基-3-甲氧基-纳曲酮。然后这些中间体通过与葡糖苷酸缀合而进一步代谢。纳曲酮及其代谢物6β-纳曲醇的血浆半衰期分别为约四(4)和十三(13)小时。
Randox Toxicology (Crumlin, United Kingdom)提供了基于BioChip ArrayTechnology (BAT)的纳洛酮测定法，其基于酶联免疫吸附测定(ELISA)原理。BiochipArray Technology是一种精密的多重测试平台，其允许同时定量或定性检测来自单一样品的范围广泛的分析物。Biochip是一种具有离散的测试位点的固态装置，对不同药物化合物特异性的抗体被固定和稳定至所述测试位点上。然后采用竞争性化学发光免疫测定法，提供了高度灵敏的筛选。然而，对于该测定，纳曲酮交叉反应性的水平为12.5%，且纳洛酮3-B-D葡糖苷酸交叉反应性的水平为70.6%。
Immunalysis Corporation (Pomona, CA)提供了一种用于口腔流体和法医用途且还基于ELISA原理的ELISA纳曲酮测定(参见，例如，目录号239-0096和239-0480)。
Neogen Corporation (Lansing, MI)提供了一种纳曲酮/纳布啡ELISA试剂盒，它是一种定性一步式试剂盒，其被设计用作用于检测纳曲酮、纳布啡和/或其他代谢物的筛选装置。然而，该测试对纳洛酮仅具有4%的交叉反应性(参见，例如，目录号133015和133019)。
检测纳洛酮和纳曲酮的其他方法涉及高效液相色谱/串联质谱(LC-MS/MS)分析。例如，NMS Labs (Willow Grove, PA)对于尿液中的纳曲酮(总量)和代谢物6-β-纳曲醇(总量)提供了LC-MS/MS分析(参见，例如，测试代码3116U，测试名称纳曲酮和代谢物 – 总量(缀合的/未缀合的)，尿液)。
然而，目前没有已知的均相免疫测定可用于这两种药物中的一种或两种。因此，本领域需要特异性结合纳洛酮和/或纳曲酮的单克隆抗体，以及可用于检测生物样品中这些药物的存在和/或提供其定性筛选和/或定量临床测量的均相免疫测定。
此外，考虑到纳洛酮和纳曲酮与各种阿片剂的相似结构(参见图1)，这些药物在各种阿片剂测定中可以交叉反应。具体而言，通常观察到各种阿片剂测定为经历纳洛酮/纳曲酮治疗的患者提供假阳性结果。因此，本领域还需要中和生物样品中存在的纳洛酮和纳曲酮，以由此防止任何假阳性或假性升高的阿片剂测量，因此在临床阿片剂测定中提供更准确的定性筛选和定量测量。
附图简述
图1描绘了纳洛酮和纳曲酮以及在各种阿片剂测定中纳洛酮和纳曲酮与其交叉反应的各种阿片剂的化学结构。
图2示意性地描绘了通过C-3位置连接的纳曲酮半抗原、KLH免疫原以及卵清蛋白和G6PDH缀合物的合成。
图3示意性地描绘了通过C-3位置连接的纳洛酮半抗原、KLH免疫原以及卵清蛋白和G6PDH缀合物的合成。
图4示意性地描绘了通过C-6位置连接的纳曲酮半抗原、KLH免疫原以及卵清蛋白和G6PDH缀合物的合成。
图5示意性地描绘了通过C-6位置连接的纳洛酮半抗原、KLH免疫原以及卵清蛋白和G6PDH缀合物的合成。
图6图示描绘了使用从用纳洛酮-或纳曲酮-KLH缀合物免疫的选定小鼠获得的各种出血进行的针对各种阿片剂的ELISA抑制测定。
图7图示描绘了使用八种关键阿片样物质(图右下方指示的免疫原)对五种选定的抗纳洛酮单克隆抗体的ELISA抑制测定。
图8图示描绘了使用八种关键阿片样物质(图的下方小图中指示的免疫原)对八种选定的抗纳曲酮单克隆抗体的ELISA抑制测定。
图9图示描绘了使用单克隆抗体179A 6H6(使用含纳洛酮的免疫原产生)的纳洛酮和纳曲酮组合特异性测定。
图10图示描绘了使用单克隆抗体180C 2A12(使用含纳曲酮的免疫原产生)的纳洛酮和纳曲酮组合特异性测定。
图11举例说明在阿片剂酶倍增免疫测定中的单克隆抗体180A 3D3的评估。
图12举例说明在阿片剂酶倍增免疫测定中的单克隆抗体179A 6H6的评估。
图13举例说明在阿片剂酶倍增免疫测定中的单克隆抗体180C 2A12的评估。
详细描述
在通过示例性语言和结果的方式详细解释本公开的至少一个实施方案之前，应理解，所述本公开不限于下面的描述中阐述的其对组分的构造和排列的细节的应用。本公开能够具有其他实施方案，或者能够以各种方式实践或实施。因此，本文使用的语言意欲被给予最广泛的可能范围和含义；并且实施方案意味着是示例性的—而非穷举性的。而且，应该理解，本文采用的措辞和术语是为了描述的目的，并且不应被认为是限制性的。
除非本文另有定义，否则结合本公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、以及蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交相关利用的术语及其技术是本领域中众所周知和常用的那些。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的或如本文所述进行。前述技术和程序通常根据本领域中众所周知的常规方法、并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述而进行。参见例如，Sambrook等人 Molecular Cloning: ALaboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y. (1989)和Coligan等人 Current Protocols in Immunology (CurrentProtocols, Wiley Interscience (1994))，其通过引用并入本文。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及药用和药物化学结合利用的命名及其实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
本说明书中提及的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物指示本公开所属领域的技术人员的技术水平。在本申请的任何部分中引用的所有专利、公开的专利申请和非专利出版物在本文中明确地通过引用以其整体并入，其程度如同每个单独的专利或出版物被具体和个别地指出通过引用并入一样。
鉴于本公开，无需过度实验即可制备和执行本文公开的所有组合物、试剂盒和/或方法。尽管已经在具体实施方案的方面描述了所述组合物、试剂盒和/或方法，但对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本公开的构思、精神和范围的情况下，可对所述组合物、试剂盒和/或方法、以及在本文描述的方法的步骤或步骤顺序中应用变化。认为对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似的替代和修改在如所附权利要求书限定的本公开的精神、范围和构思内。
如根据本公开所利用，除非另有指示，否则以下术语应理解为具有以下含义：
与权利要求和/或说明书中的术语“包括”结合使用时，术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”的使用可意味着“一个/种(one)”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”和“一个/种或多于一个/种”的含义一致。因此，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另有明确指示。因此，例如，对“一种化合物”的提及可指一种或多种化合物、2种或更多种化合物、3种或更多种化合物、4种或更多种化合物或更大数目的化合物。术语“多个/种”是指“两个/种或更多个/种”。
术语“至少一个/种”的使用将被理解为包括一个/种以及多于一个/种的任何数量，包括但不限于2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100个/种等。术语“至少一个/种”可延伸多至100或1000或更多个/种，这取决于它所附接的术语；此外，100/1000的数量不视为限制性的，因为更高的限值也可产生令人满意的结果。此外，术语“X、Y和Z中的至少一个/种”的使用将被理解为包括单独的X，单独的Y和单独的Z，以及X、Y和Z的任何组合。序数术语(即，“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等)的使用仅用于区分两个或更多个事项的目的，并且不意味着暗示例如一个事项相对于另一事项的任何顺序或次序或重要性、或任何添加次序。
在权利要求中使用术语“或”用于意指包括性的“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或者除非替代方案是互相排斥的。例如，以下任一种都满足条件“A或B”：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，以及A和B两者均为真(或存在)。
如本文所用，对“一个实施方案(one embodiment)”、“一个实施方案(anembodiment)”、“一些实施方案”、“一个实例(one example)”、“例如”或“一个实例(anexample)”的任何引用意指结合该实施方案描述的具体要素、特征、结构或特点包括在至少一个实施方案中。例如，说明书中各个地方出现的短语“在一些实施方案中”或“一个实例”不一定全部是指同一实施方案。此外，对一个或多个实施方案或实例的所有引用都应被解释为对权利要求非限制性的。
贯穿本申请，术语“约”用于指示，值包括用于测定该值的组合物/仪器/装置、方法的误差的固有变化，或研究受试者间存在的变化。例如，但不限于，当利用术语“约”时，指定值可以与指示值相差正负20%，或15%，或12%，或11%，或10%，或9%，或8%，或7%，或6%，或5%，或4%，或3%，或2%，或1%，因为此类变化适用于执行公开的方法并由本领域普通技术人员所理解。
如在本说明书和权利要求中所用，词语“包含(comprising)”(和任何形式的包含，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和任何形式的包括，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(和任何形式的含有，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)都是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。
如本文所用的术语“或其组合”是指所述术语之前列出的事项的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”意欲包括以下中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果次序在特定上下文中是重要的，则也包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例，明确包括的是含有一个或多个事项或术语的重复的组合，诸如BB、AAA、AAB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等等。技术人员将理解，除非从上下文可见，否则通常对任何组合中的事项或术语的数量没有限制。
如本文所用，术语“基本上(substantially)”意味着随后描述的事件或情况完全发生或者随后描述的事件或情况在大范围或程度上发生。例如，当与具体事件或环境相关时，术语“基本上”意味着随后描述的事件或情况发生在至少80%的时间、或至少85%的时间、或至少90%的时间、或至少95%的时间。术语“基本上相邻”可以意指两个事项与彼此100%相邻，或者两个事项与彼此密切接近，但与彼此不是100%相邻，或者两个事项之一的一部分与另一事项不是100%相邻，而是与另一事项密切接近。
术语“类似物”和“衍生物”在本文中可互换使用，并且是指在其作为给定化合物的结构中包含相同基本碳骨架和碳官能度、但也可以含有对其的一个或多个取代的物质。如本文中所用，术语“取代”将被理解为是指用残基R替换化合物上的至少一个取代基。在某些非限制性实施方案中，R可以包括H，羟基，硫醇，选自氟化物、氯化物、溴化物或亚碘酸盐(iodite)的卤化物，选自下列之一的C1-C4化合物：任选取代的直链、支链或环状烷基，和直链支链或环状烯基，其中任选的取代基选自一种或多种烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基，其中每个是任选取代的，其中所述任选的取代基选自下列中的一种或多种：烯基烷基、炔基烷基、环烷基、环烯基烷基、芳基烷基、烷基芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、任选取代的杂环烯基烷基、芳基环烷基和芳基杂环烷基、苯基、氰基、羟基、烷基、芳基、环烷基、氰基、烷氧基、烷硫基、氨基、-NH(烷基)、-NH(环烷基)2、羧基和-C(O))-烷基。
如本文所用的术语“样品”将被理解为包括可以根据本公开利用的任何类型的生物样品。可利用的流体生物样品的实例包括但不限于：全血或其任何部分(即，血浆或血清)、尿液、唾液、痰、脑脊液(CSF)、皮肤、肠液、腹膜内液、囊液(cystic fluid)、汗液、间质液、细胞外液、泪液、粘液、膀胱洗液(bladder wash)、精液、粪便、胸膜液、鼻咽液、其组合等。
如本文所用的术语“特异性结合配偶体”应理解为是指能够与macrophilin-结合药物特异性缔合以用于其检测的目的的任何分子。例如，但不通过限制的方式，所述特异性结合配偶体可以是抗体、受体、配体、适体、分子印迹聚合物(即无机基质)或其任何组合和/或衍生物，以及能够特异性结合macrophilin-结合药物的任何其他分子。
术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用并且是指例如完整单克隆抗体和多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、表现出期望的分析物结合的生物学活性的其抗体片段及缀合物(诸如，但不限于，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、双抗体、单链抗体和其他抗体片段及其缀合物，其保留完整抗体的可变区的至少一部分)、抗体替代蛋白或肽(即，工程改造的结合蛋白/肽)及其组合或衍生物。所述抗体可以是任何类型或类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文用来指氨基酸残基的聚合物。如本文所用的术语“多肽”是指天然蛋白、蛋白片段或多肽序列的类似物的通用术语。因此，天然蛋白、蛋白片段和类似物是多肽属的种。如本文所用的术语“分离的肽/多肽/蛋白”是指cDNA、重组RNA或合成来源或其一些组合的肽/多肽/蛋白，依其来源的属性或衍生来源，“分离的肽/多肽/蛋白”：(1)不与自然界中发现的肽/多肽/蛋白缔合，(2)没有来自相同来源的其他肽/多肽/蛋白，例如，不含鼠蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，和/或(4)在自然界中不存在。
如本文所用，术语“氨基酸”包括所有分子，无论是天然的还是合成的，其包括氨基官能团和酸官能团两者并且能够包含在天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性氨基酸包括天然存在的氨基酸；其类似物、衍生物和同类物；具有变体侧链的氨基酸类似物；以及上述任一种的所有立体异构体。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的多个基因座(一个基因座)、外显子、内含子、信使RNA (mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可能被非核苷酸组分打断。可以进一步修饰多核苷酸，诸如通过与标记组分缀合。术语“分离的核酸”和“分离的多核苷酸”可互换使用；如果核酸或多核苷酸满足以下条件，则其被认为是“分离的”：(1)与其中在自然界中发现“分离的多核苷酸”的多核苷酸的全部或部分不缔合，(2)与其在自然界中不连接的多核苷酸连接，或(3)在自然界中不作为更大序列的一部分存在。
如本文所用的术语“载体”意指能够转运已与之连接的另一核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接额外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接至病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合至宿主细胞的基因组中，且由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
如本文所用的适用于客体的术语“天然存在的”是指客体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的可以从自然来源分离且尚未通过实验室中人员或其他方式有意修饰的多核苷酸或多肽序列是天然存在的。术语“天然存在的”在本文中可以与术语“天然的”互换使用。
本文所指的术语“选择性杂交”意指可检测地和特异性地结合。编码根据发明构思的肽/多肽/蛋白的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在使与非特异性核酸的可检测结合的可评估量最小化的杂交和洗涤的条件下与核酸链选择性杂交。可以使用高严格条件来实现本领域所知和在本文中所讨论的选择性杂交条件。通常，发明构思的多核苷酸、寡核苷酸和片段和目标核酸序列之间的核酸序列同源性将为至少80%，且最通常地具有至少85%、90%、95%、99%和100%的增加的同源性。如果两个氨基酸序列之间存在部分或完全同一性，则它们是同源的。例如，当两个序列为最大匹配进行比对时，85%同源性意指85%的氨基酸是相同的。在最大匹配中允许空位(匹配的两个序列中的任一个)；5或更少的空位长度是优选的(但非限制)，而2或更少是更优选的(但非限制)。或者，如该术语在本文中所用，如果使用具有突变数据矩阵和6或更多的空位罚分的程序ALIGN，两个蛋白序列(或衍生自它们的长度为至少30个氨基酸的多肽序列)具有大于5(以标准偏差单位)的比对评分，则它们是同源的。参见Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (第5卷,National Biomedical Research Foundation (1972))及对此卷的增刊2, pp. 1-10。当使用ALIGN程序最佳比对时，如果两个序列或其部分的氨基酸大于或等于50%相同，则它们更优选地是同源的。本文使用术语“对应于”意指多核苷酸序列与参考多核苷酸序列的全部或部分是同源的(即为相同，非严格进化地相关)，或多肽序列与参考多肽序列相同。对比下，本文使用术语“与…互补”意指互补序列与参考多核苷酸序列的全部或部分同源。用于举例说明，核苷酸序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”且与参考序列“GTATA”互补。
使用下述术语描述两个或更多个多核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系：“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本同一性”。“参考序列”被定义为用作序列比较的基础的序列；参考序列可以是较大序列的子集，例如，为序列表中给定的全长cDNA或基因序列的区段或可以包含完整cDNA或基因序列。通常，参考序列长为至少18 个核苷酸或6个氨基酸，通常长为至少24个核苷酸或8个氨基酸，且经常长为至少48个核苷酸或16个氨基酸。因为两个多核苷酸或氨基酸序列可以各自(1)包含两个分子之间类似的序列(即完整多核苷酸或氨基酸序列的部分)，且(2)可以进一步包含两个多核苷酸或氨基酸序列之间相异的序列，两个(或更多个)分子之间的序列比较通常通过在“比较窗口”比对两个分子的序列来进行，以鉴定和比较序列相似的局部区域。如本文所用的“比较窗口”是指至少18个连续核苷酸位置或6个氨基酸的概念上的区段，其中多核苷酸序列或氨基酸序列可以与至少18个连续核苷酸或6个氨基酸序列的参考序列比较，且其中当针对两个序列的最佳比对与参考序列(其不包括添加或缺失)比较时，比较窗口中多核苷酸序列的部分可包含20%或更少的添加、缺失、取代等(即空位)。比对比较窗口的序列最佳比对可以通过Smith和Waterman (Adv. Appl. Math., 2:482 (1981))的局部同源性算法、由Needleman和Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443 (1970))的同源性比对算法、由对Pearson和Lipman(Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 85:2444 (1988))的相似性搜索方法、由这些算法(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)，Geneworks，或MacVector软件包)的计算机化实施或由检查进行，且选择各种方法产生的最佳比对(即在比较窗口导致最高同源性百分比)。
术语“序列同一性”意指两个多核苷酸或氨基酸序列在比较窗口是相同的(即在核苷酸-对-核苷酸或残基-对-残基基础上)。术语“序列同一性百分比”通过如下计算：在比较窗口比较两个优化比对的序列，测定位置数目(其中相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、U或I)或残基发生在两个序列中以产生匹配位置数目)，将匹配位置数目除以比较窗口中位置的总数(即窗口大小)，且将结果乘以100以产生序列同一性百分比。如本文所用的术语“基本同一性”表示多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口，经常为至少24-48个核苷酸(8-16个氨基酸)位置的窗口，多核苷酸或氨基酸包含的序列与参考序列相比具有至少85%序列同一性、诸如至少90%至95%序列同一性、或至少99%序列同一性的序列，其中序列同一性百分比通过在比较窗口比较参考序列与可以包括缺失或添加参考序列的总的20%或更少的序列进行计算。参考序列可以是较大序列的子集。
如本文所用，20种常规氨基酸和它们的缩写遵循常规用法。参见Immunology--ASynthesis (第2版, E. S. Golub和D. R. Gren, 编, Sinauer Associates,Sunderland, Mass. (1991))，其通过引用并入本文。20种常规氨基酸、非天然氨基酸诸如：α-、α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规的氨基酸的立体异构体(例如：D-氨基酸)也可以是本公开的多肽的合适的组分。非常规的氨基酸的实例包括：4-羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸、和其他类似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文所用的多肽表示法中，根据标准用法和惯例，左手方向为氨基末端方向，且右手方向为羧基-末端方向。
如对于多肽所适用，术语“基本同一性”意指当进行最佳比对(诸如通过使用默认空位权重的程序GAP或BESTFIT)时，两个肽序列共有至少80%序列同一性、诸如至少90%序列同一性、或至少95%序列同一性或至少99%序列同一性。在某些具体(但非限制)实施方案中，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；且具有含硫侧链的氨基酸组为半胱氨酸及甲硫氨酸。具体的保守氨基酸取代组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
术语参考多肽的“变体”是指相对于参考多肽具有一个或多个氨基酸取代、缺失或插入的多肽。氨基酸取代可以是“保守的”或“非保守的”。“保守”氨基酸取代是指用具有相似特性(诸如但不限于大小和电荷)的另一氨基酸取代多肽中的氨基酸。保守置换是氨基酸家族中发生的那些，其与它们的侧链相关。遗传编码的氨基酸通常被分为以下家族：(1)酸性=天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性=赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电极性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。更具体的家族为：丝氨酸和苏氨酸为脂肪族-羟基家族；天冬酰胺和谷氨酰胺为含酰胺家族；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸为脂肪族家族；且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸为芳香族家族。例如，合理预期以异亮氨酸或缬氨酸对亮氨酸分离置换、以谷氨酸对天冬氨酸分离置换、以丝氨酸对苏氨酸分离置换或以结构相关的氨基酸类似置换氨基酸将不会对所得分子的结合或特性具有重大影响，特别是如果置换不涉及框架位点内的氨基酸。氨基酸改变是否导致功能肽可以容易地通过测定多肽衍生物的特异性活性进行确定。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可以通过本领域普通技术人员容易地制备。优选的片段或类似物的氨基-和羧基-末端发生在功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可以通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或私人序列数据库比较来鉴定。在具体(但非限制)实施方案中，使用计算机化比较方法来鉴定序列基序或预测的蛋白构型结构域(其发生在已知结构和/或功能的其他蛋白中)。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的(Bowie 等人Science, 253:164 (1991))。因此，上述实例表明本领域技术人员可以识别可用用于定义根据本公开的结构和功能结构域的序列基序和结构构型。
优选的氨基酸取代为那些，其：(1)降低对蛋白水解的敏感性、(2)降低对氧化的敏感性、(3)改变对形成蛋白复合物的结合亲和力、(4)改变结合亲和力和(5)赋予或修饰此类类似物的物理化学或功能特性。类似物可以包括除了天然存在的肽序列以外的序列的各种突变。例如，单一或多氨基酸取代(诸如但不限于保守氨基酸取代)可在天然存在的序列中(诸如但不限于在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分中)进行。保守氨基酸取代不应实质上改变亲本序列的结构特征(例如，置换氨基酸不应当趋于破坏亲本序列中存在的螺旋，或中断表征亲本序列的其他类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级与三级结构的实例描述于Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, 编, W. H.Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure©(Branden和J. Tooze, 编, Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); 和Thornton等人 (Nature 354:105 (1991))，其各自通过引用并入本文。
如本文所用的术语“多肽片段”是指具有氨基-末端和/或羧基-末端缺失、但其中剩余氨基酸序列与天然存在的序列中的对应位置相同的多肽。多肽片段可以是小于参考多肽长度的任何长度。
术语“抗体”以最广义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的生物活性。因此，术语“抗体”或“抗体肽”是指全长免疫球蛋白分子(即，完整抗体)，或其与完整抗体竞争特异性抗原结合的结合片段。结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、二硫化物连接的Fv、Fd、双抗体、单链抗体、单结构域抗体(诸如但不限于，NANOBODIES®)和保留完整抗体的可变区的至少一部分的其他抗体片段。参见，例如，Hudson等人 (Nature Med., 9:129-134(2003))。
如本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”和“抗原结合部分”是指保留结合抗原的能力的一种或多种抗体片段。抗体的抗原结合功能可以由完整抗体的片段进行。术语抗体的“抗原结合片段”内包括的结合片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、二硫化物连接的Fv、Fd、双抗体、单链抗体、单结构域抗体(诸如但不限于，NANOBODIES®)、分离的CDRH3和保留完整抗体的可变区的至少一部分的其他抗体片段。这些抗体片段使用常规重组和/或酶促技术获得，并且以与完整抗体相同的方式针对抗原结合进行筛选。
如本文所用的“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。
如本文所用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
术语“CDR”及其复数“CDRs”是指抗体或抗体片段的互补决定区(CDR)，其决定抗体或抗体片段的结合特征。在大多数情况下，三个CDR存在于轻链可变区(CDRL1、CDRL2和CDRL3)中，并且三个CDR存在于重链可变区(CDRH1、CDRH2和CDRH3)中。CDR对抗体分子的功能活性有贡献，并且通过包含支架或构架区的氨基酸序列分开。在各个CDR中，CDR3序列，特别是CDRH3是最多样的，并且因此对抗体特异性具有最强贡献。存在至少两种用于测定CDR的技术：(1)基于交叉物种序列变异性的方法(即，Kabat等人, Sequences of Proteins ofImmunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. (1987)，其以其整体通过引用并入)；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶学研究的方法(Chothia等人,Nature, 342:877 (1989)，其以其整体通过引用并入)。
术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。在某些实施方案中，表位是抗原的被抗体特异结合的区域。表位决定簇通常包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基。在某些实施方案中，表位可以具有特定三维结构特征(例如，“构象表位”)以及特定电荷特征。
一个表位被定义为与另一个表位“相同”，如果特定抗体特异性结合这两个表位。在某些实施方案中，具有不同一级氨基酸序列的多肽可以包含相同的表位。在某些实施方案中，相同的表位可以具有不同的一级氨基酸序列。如果不同的抗体竞争特异性结合相同表位，则它们被称为结合该相同表位。
当抗体优先识别蛋白和/或大分子的复杂混合物中的抗原时，其“特异结合”该抗原。在某些实施方案中，抗体包含特异性结合特定表位的抗原结合位点。在某些此类实施方案中，抗体能够结合不同的抗原，只要所述不同的抗原包含该特定表位或密切相关的表位。在某些情况下，例如，来自不同物种的同源蛋白可以包含相同表位。在某些实施方案中，抗体以不大于10-6 M、10-7 M、10-8 M或10-9 M的解离常数特异性结合抗原。当抗体特异性结合受体或配体(即，反受体)时，它可以基本上抑制受体与配体的粘附。如本文所用，当过量的抗体使与配体结合的受体的量减少至少约20%、40%、60%或80%、85%或90%时，抗体基本上抑制受体与配体的粘附(如在体外竞争性结合测定中所测量)。
"分离的"抗体是已从产生其的环境的组分中分离和/或回收的抗体。其产生环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其他蛋白或非蛋白溶质。在某些实施方案中，如至少三种不同的方法所测量，抗体将被纯化至：1)如通过Lowry方法所测定，按抗体的重量计，大于50重量%，诸如超过75重量%或超过85重量%或超过95重量%或超过99重量%；2)足以通过使用转杯式测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少10个残基，诸如序列的至少15个残基的程度；或3)均质，通过使用考马斯蓝或可替代地银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为产生抗体的环境中的至少一种组分将不存在。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。此外，“分离的抗体”基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体。然而，分离的抗体可以与其他相关抗原具有一定的交叉反应性。
术语“抗体突变体”是指其中一个或多个氨基酸残基已被修饰的抗体的氨基酸序列变体。此类突变体必需与抗体的重链或轻链可变结构域的氨基酸序列具有小于100%序列同一性或相似性，与所述氨基酸序列具有至少75%氨基酸序列同一性或相似性，诸如至少80%、或至少85%、或至少90%、或至少95%氨基酸序列同一性或相似性。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从特异性结合相同表位的基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，构成群体的各个抗体除了可少量存在的可能天然存在的突变以外是相同的。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体是有利的，因为在一种生产方法中，它们可通过杂交瘤培养来合成，且因此未被其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表明抗体从抗体的基本上同质群体获得的特征，而不应被解释为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，在一个实施方案中，根据本公开产生的单克隆抗体可以通过首先由Kohler和Milstein (Nature, 256:495 (1975))描述的杂交瘤方法来制备。
根据本公开利用的单克隆抗体可以通过本领域已知的任何方法来产生，所述方法包括，但不限于，主动免疫方案的结果；导致在疾病或癌症的过程中天然产生抗体的免疫应答的结果；噬菌体衍生的抗体；等。除了上面列出的杂交瘤产生方法以外，本公开的单克隆抗体可以通过其他各种方法来产生，所述方法诸如，但不限于，重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)；从噬菌体展示文库分离抗体片段(参见，例如，Clackson等人,Nature, 352:624-628 (1991);和Marks等人, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))；以及各种其他单克隆抗体产生技术(参见，例如，Harlow和Lane (1988), Antibodies:ALaboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)。
一旦已获得抗体，例如一旦已鉴定个体B细胞和/或已产生单克隆抗体，就可以获得编码这些抗体的可变区的序列。可例如通过如下获得可变区序列：首先对杂交瘤、B-细胞或噬菌体产生的抗体蛋白进行测序，并确定编码核酸序列。在一个实施方案中，也可以对免疫球蛋白可变区(VH和 VL) DNA或cDNA进行测序。当抗体衍生自杂交瘤细胞系或分离的B-细胞时，可以使用PCR，通过例如Babcook等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:7843-7848 (1996))和PCT公开号WO 92/02551中描述的方法对编码可变区的cDNA进行扩增。两篇参考文献的内容均清楚地以其整体通过引用并入本文。
术语“中和抗体”或“中和的抗体”是指降低包含抗体特异性结合的表位的多肽的至少一种活性的抗体。在某些实施方案中，中和抗体降低体外和/或体内活性。
术语“抗原结合位点”是指抗体的能够特异性结合抗原的部分。在某些实施方案中，抗原结合位点由一个或多个抗体可变区提供。
如本文所用，“基本上纯”意指目标种类为主要存在的种类(即基于摩尔，其比组合物中任何其他个别种类更丰富)。通常，基本上纯的组合物将包含所有存在于组合物中的大分子种类的超过约50%，诸如超过约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和99%。在一个实施方案中，目标种类被纯化到基本上同质(在组合物中不能通过常规检测方法检测到污染种类)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语“试剂”是指化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。在某些实施方案中，“试剂”可以是根据本公开的单克隆抗体。
术语“拮抗剂”是指降低蛋白/酶的活性的试剂。
术语“激动剂”是指增加蛋白/酶的活性的试剂。
如本文所用的术语“载体蛋白”应被理解为是指为了刺激以产生针对小分子的抗体的形式的免疫系统应答的目的可附接至小分子(诸如(但不限于)药物、有机化合物以及具有小于2-5 kDa的分子量的肽和寡糖)的免疫原性蛋白，所述小分子通常不是免疫原性的。
现在转向发明构思，本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳洛酮和/或纳曲酮的抗体或其功能片段。这两种化合物分别在下面描绘为式I和II。
在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段特异性结合包含与载体蛋白结合的纳洛酮和/或纳曲酮的缀合物。所述缀合物可以含有本领域中已知或本文以其他方式考虑的任何载体蛋白，只要所述载体蛋白：(1)可以与纳洛酮和/或纳曲酮缀合；(2)是免疫原性的；且(3)可以发挥功能以刺激以产生针对纳洛酮和/或纳曲酮的抗体的形式的免疫系统应答。可以根据本公开利用的载体蛋白的非限制性实例包括KLH(钥孔
血蓝蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)、卵清蛋白、BTG(牛甲状腺球蛋白)和BGG(牛γ球蛋白)。
在某些非限制性实施方案中，所述载体蛋白附接至纳洛酮和/或纳曲酮上的特定碳位置。例如(但不通过限制的方式)，所述载体蛋白可以附接至纳洛酮和/或纳曲酮的1-碳、2-碳、3-碳、6-碳、7-碳或8-碳位置。这些缀合物免疫原的非限制性实例显示于下面的式III-VIII中。注意，这些式各自涵盖纳洛酮和纳曲酮两者，并且所述载体蛋白被举例说明为附接至每个式中的不同碳(式III：3-碳；式IV：1-碳；式V：2-碳；式VI：6-碳；式VII：8-碳；和式VIII：7-碳)。
其中，在式III中：A是杂原子(诸如，但不限于：-O-、-N-或-S-)；B是官能团(诸如，但不限于：-CO-、低级烷基(C0至C10)、-CONH-、-SO2-、-PO4-等)；C是载体蛋白(诸如，但不限于：KLH、BSA、OVA、BGG、G6PDH或聚(氨基酸))；且R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基。
其中，在式IV中：D是杂原子(诸如，但不限于：O-、S-、CO-或CH2-)；E是低级烷基、CO2-、CONH-、SO2-或PO4-；F是载体蛋白(诸如，但不限于：KLH、BSA、OVA、BGG、G6PDH或聚(氨基酸))；R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基；且R1是H或CH3。
其中，在式V中：D是杂原子(诸如，但不限于：O-、S-、CO-或CH2-)；E是低级烷基、CO2-、CONH-、SO2-或PO4-；F是载体蛋白(诸如，但不限于：KLH、BSA、OVA、BGG、G6PDH或聚(氨基酸))；R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基；且R1是H或CH3。
其中，在式VI中：G是连接基团，其包括以下中的至少两个：低级烷基链、CO2-、CONH-、SO2-和PO2-；H是载体蛋白(诸如，但不限于：KLH、BSA、OVA、BGG、G6PDH或聚(氨基酸))；R1是H或CH3；且R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基。
其中，在式VII中：I是杂原子(诸如，但不限于：O-、S-、CO-或CH2-)；J是低级烷基链、CO2-、CONH-、SO2-或PO4-；K是载体蛋白(诸如，但不限于：KLH、BSA、OVA、BGG、G6PDH或聚(氨基酸))；R1是H或CH3；且R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基。
其中，在式VII中：L是杂原子(诸如，但不限于O、S、CO或CH2)；M是低级烷基链、CO2-、CONH-、SO2-或PO4-；N是载体蛋白(诸如，但不限于：KLH、BSA、OVA、BGG、G6PDH等))；R1是H或CH3；且R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段特异性结合包含附接至纳洛酮和/或纳曲酮的 3-碳位置和/或 6-碳位置的 OVA 的缀合物。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳曲酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是烯丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:4 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳曲酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳曲酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:44的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳曲酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳曲酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:84的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳曲酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:104 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳曲酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:124 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳曲酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:144 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:146的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:147的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:148的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳洛酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:162的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:163的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:164 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:166的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:167的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:168的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳洛酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:182的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:183的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:184 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:186的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:187的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:188的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳洛酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:202的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:203的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:204 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:206的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:207的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:208的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳洛酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:222的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:223的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:224 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:226的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:227的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:228的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及特异性结合纳洛酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)具有SEQ ID NO:242的氨基酸序列的重链可变区CDR1；(ii)具有SEQ ID NO:243的氨基酸序列的重链可变区CDR2；(iii)具有 SEQ ID NO:244 的氨基酸序列的重链可变区 CDR3；(iv)具有SEQ ID NO:246的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；(v)具有SEQ ID NO:247的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和(vi)具有SEQ ID NO:248的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与表 2-14中概述的任何重链可变区氨基酸序列(即，SEQ IDNO:17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237或257)具有至少约70%同一性，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237或257具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237或257的不同在于少于约25个氨基酸、少于约24个氨基酸、少于约23个氨基酸、少于约22个氨基酸、少于约21个氨基酸、少于约20个氨基酸、少于约19个氨基酸、少于约18个氨基酸、少于约17个氨基酸、少于约16个氨基酸、少于约15个氨基酸、少于约14个氨基酸、少于约13个氨基酸、少于约12个氨基酸、少于约11个氨基酸、少于约10个氨基酸、少于约9个氨基酸、少于约8个氨基酸、少于约7个氨基酸、少于约6个氨基酸、少于约5个氨基酸、少于约4个氨基酸、少于约3个氨基酸、少于约2个氨基酸或少于约1个氨基酸。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，并且可替代地和/或除了上述实施方案以外，所述抗体或其功能片段具有轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列与表 2-14中概述的任何轻链可变区氨基酸序列(即，SEQ ID NO:18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238或258)具有至少约70%同一性，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238或258具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238或258的不同在于少于约21个氨基酸，少于约20个氨基酸，少于约19个氨基酸，少于约18个氨基酸，少于约17个氨基酸，少于约16个氨基酸，少于约15个氨基酸，少于约14个氨基酸，少于约13个氨基酸，少于约12个氨基酸，少于约11个氨基酸，少于约10个氨基酸，少于约9个氨基酸，少于约8个氨基酸，少于约7个氨基酸，少于约6个氨基酸，少于约5个氨基酸，少于约4个氨基酸，少于约3个氨基酸，少于约2个氨基酸，或少于约1个氨基酸。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237或257具有至少约90%同一性，和/或所述抗体或其功能片段具有轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238或258具有至少约90%同一性。在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237或257的不同在于至少约12个氨基酸，所述轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238或258的不同在于至少约12个氨基酸。
在另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:17、37、57、77、97、117、137、157、177、197、217、237或257，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:18、38、58、78、98、118、138、158、178、198、218、238或258。
在另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链，所述重链的氨基酸序列与表 2-14中概述的任何重链氨基酸序列(即，SEQ ID NO:1、21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221或241)具有至少约70%同一性，诸如(但不限于)与SEQID NO:1、21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221或241具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链，所述重链的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221或241的不同在于少于约100个氨基酸，少于约90个氨基酸，少于约80个氨基酸，少于约75个氨基酸，少于约70个氨基酸，少于约65个氨基酸，少于约60个氨基酸，少于约55个氨基酸，少于约50个氨基酸，少于约45个氨基酸，少于约40个氨基酸，少于约35个氨基酸，少于约30个氨基酸，少于约25个氨基酸，少于约24个氨基酸，少于约23个氨基酸，少于约22个氨基酸，少于约21个氨基酸，少于约20个氨基酸，少于约19个氨基酸，少于约18个氨基酸，少于约17个氨基酸，少于约16个氨基酸，少于约15个氨基酸，少于约14个氨基酸，少于约13个氨基酸，少于约12个氨基酸，少于约11个氨基酸，少于约10个氨基酸，少于约9个氨基酸，少于约8个氨基酸，少于约7个氨基酸，少于约6个氨基酸，少于约5个氨基酸，少于约4个氨基酸，少于约3个氨基酸，少于约2个氨基酸，或少于约1个氨基酸。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，并且可替代地和/或除了上述实施方案以外，所述抗体或其功能片段具有轻链，所述轻链的氨基酸序列与表 2-14中概述的任何轻链氨基酸序列(即，SEQ ID NO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225或245)具有至少约70%同一性，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225或245具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有轻链，所述轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225或245的不同在于少于约45个氨基酸，少于约40个氨基酸，少于约35个氨基酸，少于约30个氨基酸，少于约25个氨基酸，少于约24个氨基酸，少于约23个氨基酸，少于约22个氨基酸，少于约21个氨基酸，少于约20个氨基酸，少于约19个氨基酸，少于约18个氨基酸，少于约17个氨基酸，少于约16个氨基酸，少于约15个氨基酸，少于约14个氨基酸，少于约13个氨基酸，少于约12个氨基酸，少于约11个氨基酸，少于约10个氨基酸，少于约9个氨基酸，少于约8个氨基酸，少于约7个氨基酸，少于约6个氨基酸，少于约5个氨基酸，少于约4个氨基酸，少于约3个氨基酸，少于约2个氨基酸，或少于约1个氨基酸。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链，所述重链的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221或241具有至少约90%同一性，和/或所述抗体或其功能片段具有轻链，所述轻链的氨基酸序列与SEQID NO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225或245具有至少约70%同一性。在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链和/或轻链，所述重链的氨基酸序列与SEQ ID NO:1、21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221或241的不同在于少于约46个氨基酸，所述轻链的氨基酸序列与SEQ ID NO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225或245的不同在于少于约24个氨基酸。
在另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链和/或轻链，所述重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、21、41、61、81、101、121、141、161、181、201、221或241，所述轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:5、25、45、65、85、105、125、145、165、185、205、225或245。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或功能片段具有由与SEQ IDNO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249具有至少约70%同一性的多核苷酸编码的重链(和/或由与 SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239或259具有至少约 70%同一性的多核苷酸编码的重链可变区)，诸如(但不限于)由与SEQ IDNO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249和/或SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239或259具有至少约 75%同一性、至少约 80%同一性、至少约 85%同一性、至少约 90%同一性、至少约 91%同一性、至少约 92%同一性、至少约 93%同一性、至少约 94%同一性、至少约 95%同一性、至少约 96%同一性、至少约 97%同一性、至少约 98%同一性或至少约 99%同一性的多核苷酸编码的重链和/或重链可变区。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，并且可替代地和/或除了上述实施方案以外，所述抗体或功能片段具有由与SEQ ID NO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233或253具有至少约70%同一性的多核苷酸编码的轻链(和/或由与 SEQ ID NO:20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240或260具有至少约 70%同一性的多核苷酸编码的轻链可变区)，诸如(但不限于)由与SEQ ID NO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233或253和/或SEQ ID NO:20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240或260具有至少约 75%同一性、至少约 80%同一性、至少约 85%同一性、至少约 90%同一性、至少约 91%同一性、至少约 92%同一性、至少约 93%同一性、至少约 94%同一性、至少约95%同一性、至少约 96%同一性、至少约 97%同一性、至少约 98%同一性或至少约 99%同一性的多核苷酸编码的轻链和/或轻链可变区。
在又一个进一步具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或功能片段具有重链，所述重链由与SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249具有至少约70%同一性的多核苷酸编码，和/或所述抗体或功能片段具有轻链，所述轻链由与SEQ IDNO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233或253具有至少约70%同一性的多核苷酸编码。
在又一个进一步具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或功能片段具有重链可变区，所述重链可变区由与SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239或259具有至少约70%同一性的多核苷酸编码，和/或所述抗体或功能片段具有轻链可变区，所述轻链可变区由与SEQ ID NO:20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240或260具有至少约70%同一性的多核苷酸编码。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链(和/或重链可变区)，编码重链的序列与SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249的不同在于(和/或编码重链可变区的序列与SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239或259的不同在于)少于约100个核苷酸，少于约90个核苷酸，少于约80个核苷酸，少于约75个核苷酸，少于约70个核苷酸，少于约60个核苷酸，少于约50个核苷酸，少于约45个核苷酸，少于约40个核苷酸，少于约35个核苷酸，少于约30个核苷酸，少于约25个核苷酸，少于约20个核苷酸，少于约15个核苷酸，少于约10个核苷酸，少于约9个核苷酸，少于约8个核苷酸，少于约7个核苷酸，少于约6个核苷酸，少于约5个核苷酸，少于约4个核苷酸，少于约3个核苷酸，少于约2个核苷酸，或少于约1个核苷酸。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，并且可替代地和/或除了上述实施方案以外，所述抗体或其功能片段具有轻链(和/或轻链可变区)，编码轻链的序列与SEQ IDNO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249的不同在于(和/或编码轻链可变区的序列与SEQ ID NO:20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240或260的不同在于)少于约100个核苷酸，少于约90个核苷酸，少于约80个核苷酸，少于约75个核苷酸，少于约70个核苷酸，少于约60个核苷酸，少于约50个核苷酸，少于约45个核苷酸，少于约40个核苷酸，少于约35个核苷酸，少于约30个核苷酸，少于约25个核苷酸，少于约20个核苷酸，少于约15个核苷酸，少于约10个核苷酸，少于约9个核苷酸，少于约8个核苷酸，少于约7个核苷酸，少于约6个核苷酸，少于约5个核苷酸，少于约4个核苷酸，少于约3个核苷酸，少于约2个核苷酸，或少于约1个核苷酸。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链和/或轻链，编码重链的序列与SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249的不同在于少于约100个核苷酸，编码轻链的序列与SEQ ID NO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233或253的不同在于少于约70个核苷酸。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段具有重链可变区和/或轻链可变区，编码重链可变区的序列与SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239或259的不同在于少于约35个核苷酸，编码轻链可变区的序列与SEQ IDNO:20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240或260的不同在于少于约34个核苷酸。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳曲酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:10的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:11的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:12的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:14的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:15 的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:16的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳曲酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:30的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:31的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:32的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:34的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:35 的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:36的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳曲酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:50的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:51的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:52的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:54的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:55 的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:56的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳曲酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:70的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:71的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:72的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:74的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:75 的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:76的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳曲酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:90的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:91的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:92的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:94的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:95 的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:96的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳曲酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:110的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:111的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:112的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:114的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:115的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:116的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳曲酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:130的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:131的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:132的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:134的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:135的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:136的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳曲酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:150的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:151的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:152的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:154的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:155的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:156的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳洛酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:170的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:171的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:172的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:174的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:175的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:176的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳洛酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:190的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:191的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:192的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:194的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:195的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:196的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳洛酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:210的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:211的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:212的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:214的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:215的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:216的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳洛酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:230的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:231的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:232的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:234的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:235的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:236的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
本公开的某些非限制性实施方案涉及抗体或其功能片段，其特异性结合纳洛酮(和在某些具体(但非限制性)实施方案中，式III的缀合物，其中R2是环丙基)，其中所述抗体包含以下中的一个或多个：(i)由SEQ ID NO:250的序列编码的重链可变区CDR1；(ii)由SEQ ID NO:251的序列编码的重链可变区CDR2；(iii)由SEQ ID NO:252的序列编码的重链可变区CDR3；(iv)由SEQ ID NO:254的序列编码的轻链可变区CDR1；(v)由 SEQ ID NO:255的序列编码的轻链可变区 CDR2；和(vi)由SEQ ID NO:256的序列编码的轻链可变区CDR3。在一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的两个、三个、四个或五个。在另一个具体非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段包含以上(i)-(vi)中的全部。
所述抗体或其功能片段可以是单克隆抗体或其功能片段。或者，所述抗体或其功能片段可以是多克隆抗体或其功能片段。
在某些非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段被进一步定义为选自全长免疫球蛋白分子、scFv、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2、 Fv、二硫化物连接的Fv及其组合。
在某些非限制性实施方案中，所述抗体或其功能片段是分离的。在具体(但非限制性)实施方案中，所述抗体或其功能片段是纯化的。
本公开还涉及抗体或其功能片段，其与上文所述的任何抗体或功能片段结合相同的表位。
本公开的某些非限制性实施方案还涉及产生可以特异性结合纳洛酮和/或纳曲酮的抗体或其功能片段的方法。所述方法包括用抗原性化合物免疫非人动物，所述抗原性化合物包含与纳洛酮和/或纳曲酮附接的载体蛋白的缀合物；和从所述非人动物的血浆回收所述抗体或其功能片段。
本公开的某些非限制性实施方案还涉及产生可以特异性结合纳洛酮和/或纳曲酮的抗体或其功能片段的方法。所述方法包括用抗原性化合物免疫非人动物，所述抗原性化合物包含与纳洛酮和/或纳曲酮附接的载体蛋白的缀合物，由此诱导 B-细胞产生结合所述缀合物的抗体；和获得由所述B-细胞产生的抗体或其功能片段。所述抗体或其功能片段可以通过本领域中已知的各种方式(诸如(但不限于)经由杂交瘤技术或通过B-细胞PCR技术)获得。所述方法可以进一步包括基于与纳洛酮和/或纳曲酮的结合进一步选择抗体或其功能片段的任选步骤。
本公开的某些非限制性实施方案涉及产生上文所述的任何抗体或其功能片段的杂交瘤。
本公开的某些非限制性实施方案涉及产生可以特异性结合纳洛酮和/或纳曲酮的抗体或其功能片段的方法。在该方法中，培养能够产生本文描述或以其他方式考虑的任何抗体或其功能片段的杂交瘤以产生上文所述的任何抗体或其功能片段。在至少某些非限制性实施方案中，回收所述抗体或其功能片段。
本公开的某些非限制性实施方案还涉及缀合物，其包含与可检测标记物附接的本文公开或以其他方式考虑的任何抗体或其功能片段。可以根据本公开利用的可检测标记物的非限制性实例包括酶标记物、放射性标记物、荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物和微粒标记物以及其任何组合。此外，所述可检测标记物可以经由直接或间接缀合附接至所述抗体或功能片段。
本公开的某些非限制性实施方案还涉及缀合物，其包含与固体支持物附接的本文公开或以其他方式考虑的任何抗体或其功能片段。所述抗体/功能片段与固体支持物(经由直接或间接缀合)的附接产生亲和纯化色谱基质，诸如例如柱。
本公开的某些非限制性实施方案涉及编码本文公开或以其他方式考虑的任何抗体或其功能片段的多核苷酸。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，编码所述抗体或其功能片段的重链的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249具有至少约70%同一性(和/或编码所述抗体或其功能片段的重链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239或259具有至少约70%同一性)，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249和/或SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239或259具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，并且可替代地和/或除了上述实施方案以外，编码所述抗体或其功能片段的轻链的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233或253具有至少约70%同一性(和/或编码所述抗体或其功能片段的轻链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240或260具有至少约70%同一性)，诸如(但不限于)与SEQ ID NO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233或253和/或SEQ ID NO:20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240或260具有至少约75%同一性、至少约80%同一性、至少约85%同一性、至少约90%同一性、至少约91%同一性、至少约92%同一性、至少约93%同一性、至少约94%同一性、至少约95%同一性、至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，编码所述抗体或其功能片段的重链的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249具有至少约90%同一性，和/或编码所述抗体或其功能片段的轻链的多核苷酸的一部分与SEQID NO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233或253具有至少约90%同一性。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，编码所述抗体或其功能片段的重链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239或259具有至少约90%同一性，和/或编码所述抗体或其功能片段的轻链可变区的多核苷酸的一部分与SEQ ID NO:20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240或260具有至少约90%同一性。
在另一个具体(但非限制性)实施方案中，对应于所述抗体或其功能片段的重链的序列的一部分和/或对应于所述抗体或其功能片段的轻链的序列的一部分分别与SEQ IDNO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249或SEQ ID NO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233或253的不同在于(和/或对应于所述抗体或其功能片段的重链可变区的序列的一部分和/或对应于所述抗体或其功能片段的轻链可变区的序列的一部分分别与SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239或259或SEQ IDNO:20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240或260的不同在于)，少于约100个核苷酸，少于约90个核苷酸，少于约80个核苷酸，少于约75个核苷酸，少于约70个核苷酸，少于约60个核苷酸，少于约50个核苷酸，少于约45个核苷酸，少于约40个核苷酸，少于约35个核苷酸，少于约30个核苷酸，少于约25个核苷酸，少于约20个核苷酸，少于约15个核苷酸，少于约10个核苷酸，少于约9个核苷酸，少于约8个核苷酸，少于约7个核苷酸，少于约6个核苷酸，少于约5个核苷酸，少于约4个核苷酸，少于约3个核苷酸，少于约2个核苷酸，或少于约1个核苷酸。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，对应于所述抗体或其功能片段的重链的序列的一部分与SEQ ID NO:9、29、49、69、89、109、129、149、169、189、209、229或249的不同在于少于约100个核苷酸，和/或对应于所述抗体或其功能片段的轻链的序列的一部分与SEQ ID NO:13、33、53、73、93、113、133、153、173、193、213、233或253的不同在于少于约70个核苷酸。
在又另一个具体(但非限制性)实施方案中，对应于所述抗体或其功能片段的重链可变区的序列的一部分与SEQ ID NO:19、39、59、79、99、119、139、159、179、199、219、239或259的不同在于少于约35个核苷酸，和/或对应于所述抗体或其功能片段的轻链可变区的序列的一部分与SEQ ID NO:20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240或260的不同在于少于约34个核苷酸。
本公开的某些非限制性实施方案涉及载体，其包含编码本文描述或以其他方式考虑的抗体或其功能片段的任何多核苷酸。
本公开的某些非限制性实施方案涉及重组宿主细胞，其包含编码本文描述或以其他方式考虑的抗体或其功能片段的任何多核苷酸。本公开的某些非限制性实施方案涉及重组宿主细胞，其包含本文描述或以其他方式考虑的任何载体。
本公开的某些非限制性实施方案涉及产生可以特异性结合纳洛酮和/或纳曲酮的抗体或其功能片段的方法。所述方法包括：(a)在允许表达由多核苷酸编码的抗体或其功能片段的条件下，在细胞培养物中培养本文描述或以其他方式考虑的任何重组宿主细胞；和(b)从所述细胞培养物分离所述抗体或其功能片段。
本公开的某些非限制性实施方案涉及检测生物样品中存在的纳洛酮和/或纳曲酮的方法。所述方法包括：如果样品中分别存在纳洛酮和/或纳曲酮，则在由此形成抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物的条件下使生物样品与本文公开或以其他方式考虑的任何抗体或其功能片段接触；和检测形成的任何抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物，其中形成的抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物的量分别与样品中存在的纳洛酮和/或纳曲酮的量成正比。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，将如上文所述的标记物附接至抗体/功能片段以用于检测抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物。
本公开的某些非限制性实施方案涉及从生物样品的阿片剂测定基本上减少(或基本上除去)纳洛酮和/或纳曲酮干扰的方法。所述方法包括：如果样品中分别存在纳洛酮和/或纳曲酮，则在由此形成抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物的条件下使生物样品与本文公开或以其他方式考虑的任何抗体或其功能片段中的一种或多种接触；除去形成的任何抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物；和对其中已经基本上减少/除去纳洛酮和/或纳曲酮的生物样品进行阿片剂测定。该方法可以与任何阿片剂的测定以及任何阿片剂测定形式一起使用。例如(但不通过限制的方式)，待测定的阿片剂可以是可待因、氢可酮、氢吗啡酮、吗啡、羟考酮、羟吗啡酮、海洛因(6-乙酰吗啡)、其组合等。阿片剂测定形式的非限制性实例包括ELISA、芯片测定、LC/MS/MS、免疫测定、酶免疫测定、酶倍增免疫测定、荧光偏振免疫测定、其组合等。各种类型的阿片剂测定是本领域中众所周知和充分使用的。因此，对于允许本领域普通技术人员进行本文公开的方法而言，其进一步描述被认为是不必要的。
在一个具体(但非限制性)实施方案中，在从阿片剂测定基本上减少(或基本上除去)纳洛酮和/或纳曲酮干扰的方法中使用的至少一种抗体或其功能片段包括至少两种抗体或其功能片段：(1)至少一种特异性结合纳洛酮的抗体或其功能片段，和(2)至少一种特异性结合纳曲酮的抗体或其功能片段。
本公开的某些非限制性实施方案还包括试剂盒，其含有本文公开或以其他方式考虑的任何抗体/功能片段和/或组合物(诸如包含附接至可检测标记物或固体支持物的抗体/功能片段的组合物)，以及可用于本文所述的测定/方法中的任何其他试剂。例如(但不通过限制的方式)，所述试剂盒可以进一步包括上文所述的阿片剂测定的一种或多种组分。例如(但不通过限制的方式)，所述试剂盒可以包括本文描述或以其他方式考虑的结合任何阿片剂的抗体或其功能片段，其用于阿片剂免疫测定中。
所述组合物/试剂盒/方法的测定组分/试剂可以以允许它们根据本公开发挥功能的任何形式提供。例如，但不通过限制的方式，每种试剂可以以液体形式提供并且以散装和/或单等分试样形式布置在试剂盒内。或者，在一个具体(但非限制性)实施方案中，所述试剂中的一种或多种可以以单等分试样冻干试剂的形式布置在试剂盒中。微流体装置中干燥试剂的使用详细描述于美国专利号9,244,085 (Samproni)，其全部内容在此明确地通过引用并入本文。
除了上文详细描述的测定组分/试剂以外，所述试剂盒可以进一步含有用于进行本文描述或以其他方式考虑的任何具体测定的其他试剂。这些额外试剂的性质将取决于具体测定形式，并且其鉴定完全在本领域普通技术人员的技术内；因此，认为不必进行其进一步的描述。此外，试剂盒中存在的组分/试剂可以各自在分开的容器/隔室中，或者各种组分/试剂可以被组合于一个或多个容器/隔室中，这取决于所述组分/试剂的交叉反应性和稳定性。此外，所述试剂盒可包括其中布置有组分/试剂的微流体装置。
所述试剂盒中的各种组分/试剂的相对量可以大幅变化，以提供这样的组分/试剂的浓度，其显著优化测定方法期间需要发生的反应，并进一步显著优化测定的灵敏度。在适当情况下，试剂盒中的一种或多种组分/试剂可以作为干燥粉末(诸如冻干粉末)提供，并且所述试剂盒可进一步包括用于溶解干燥试剂的赋形剂；以该方式，从这些组分可获得具有用于进行根据本公开的方法或测定的适当浓度的试剂溶液。试剂盒中还可包括阳性和/或阴性对照。此外，所述试剂盒可进一步包括解释如何使用试剂盒的一组书面说明。具有该性质的试剂盒可用于本文描述或以其他方式考虑的任何方法中。
实施例
下文提供了实施例。然而，应理解，本公开，其应用不限于本文公开的具体实验、结果和实验室程序。相反，实施例仅作为各个实施方案之一提供，并且意在是示例性的，而非穷举性的。
实施例1：包含纳洛酮和纳曲酮缀合物的免疫原的产生
本实施例举例说明了通过多个C-位连接产生含有纳洛酮或纳曲酮的各种缀合物。
材料和设备：在配备有二氧化硅-键-C18反相柱的Shimadzu HPLC系统上纯化化合物。使用来自Analtech Inc. (Newark, DE)的硅胶板通过TLC(薄层色谱法)监测化学反应。使用UV短波(254 nm)显现硅胶板。所有化学品都获得自Sigma Aldrich (St. Louis, MO)，Fluka (Waltham, MA)，Thermo Scientific (Waltham, MA)和VWR (Radnor, PA)，并按原样使用。在Bruker ULTRASHIELD™ 600 MHz光谱仪(Bruker, Billerica, MA)上记录1HNMR。化学位移以百万分之几(ppm，δ)报告，并且与四甲基硅烷相关或以氘化溶剂作为内部参考。使用的NMR缩写是：s (单峰)、br s (宽单峰)、d (双峰)、t (三重峰)、q (四重峰)、dd(双二重峰)、dt (双三重峰)、td (三二重峰)、ddd (双重双重双重峰)、J (耦合常数)、Hz(赫兹)。在Siemens Healthineers分析设施(Newark, DE)在配备有6130质量检测器的Agilent HPLC 1290单四极杆系统上记录ESI-MS光谱。UV：Carry 60用于OD280和BCA浓度测量。
以下缩写具有下面阐述的含义：
BCA测定 - 二辛可宁酸测定
eq. - 摩尔当量
g - 克
mg - 毫克
mmol，mM - 毫摩尔
nm - 纳米
CV - 柱体积
cm2 - 平方厘米
DCM - 二氯甲烷
MeOH - 甲醇
MeOD-d 4 - 具有4个氘原子的氘化甲醇(用于NMR光谱)
DMF - N,N-二甲基甲酰胺
SuOH - N-羟基琥珀酰亚胺
NaOAc - 乙酸钠
AcOH - 乙酸
AcO- - 乙酸盐
EDAC∙HCl – N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐
TFA - 三氟乙酸
TLC - 薄层色谱
Rf - TLC分析中的保留因子
UV - 紫外线
v/v - 体积比
ESI-MS - 电喷雾电离质谱
m/z - 质荷比
NMR - 核磁共振
MHz - 兆赫兹
nG6PDH - 天然葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
β-NADH - 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
G6PDNa2 - 葡萄糖-6-磷酸二钠盐
OVA - 从鸡蛋白分离的卵清蛋白
mcKLH - 海水养殖钥孔
血蓝蛋白(ThermoFisher Scientific)
TRIS - 三(羟甲基)氨基甲烷
KU - nG6PDH的二聚蛋白复合物
RPM - 每分钟转数
CFA - 完全弗氏佐剂
IFA - 不完全弗氏佐剂
ELISA - 酶联免疫吸附测定
EIA - 酶免疫测定
PBS - 磷酸盐缓冲盐水
HRP - 辣根过氧化物酶
TMB - 3,3',5,5'-四甲基联苯胺
µL - 微升
µg - 微克
VH - 可变重链
VL - 可变轻链
CH – 恒定重链
CL - 恒定轻链
NAD+ - 氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
NADH - 还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
图2示意性地描绘了通过C-3位置连接的纳曲酮半抗原、KLH免疫原和G6PDH缀合物的合成，如下文中进一步详细描述。
化合物(2)的制备：在配备磁力搅拌棒的烘箱干燥的50 mL圆底烧瓶中，将盐酸纳曲酮(1)(330 mg, 0.87 mmol)添加至烧瓶中，随后添加DMF (5 mL)、丙酮(5 mL)和碳酸钾(575 mg, 4.16 mmol, 4.78 eq.)。将所得反应混合物在氮气流下在室温(rt.)下搅拌5分钟；然后，将乙基-5-溴戊酸(375 µL, 495 mg, 2.36 mmol, ~2.71 eq.)添加至混合物中。将所得反应混合物置于油浴中，并将冷凝器附接至圆底烧瓶。将反应混合物在搅拌下在60℃下加热，并且在4小时后通过TLC [(DCM/MeOH 8/2 v/v) Rf(1) = 0.36, Rf(2) = 0.80]完成反应。在旋转蒸发器上除去溶剂，以得到白色沉淀物，将所述白色沉淀物悬浮于乙腈(2 x10 mL)中并滤出。有机萃取物在旋转蒸发器上浓缩并在油泵上进一步干燥过夜(16h)以除去痕量挥发物。将产物悬浮于乙腈/水(30/70 v/v，含有0.1%乙酸)中，并注入ShimadzuHPLC系统用于纯化。合并含有期望产物的级分，在旋转蒸发器上浓缩，并冻干过夜(16-20小时)，以便以93%产率得到474.8 mg作为无色粉末的化合物(2)。化合物(2)：ESI-MS m/z：[C27H36NO6]+的计算值470.3，实测值[M+H]+ = 470.3; 1H NMR (600 MHz, MeOD-d 4 ) δ:6.86 (d, J = 8.28 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 8.28 Hz, 1H), 4.97 (br s, 1H), 4.90(s, 1H), 4.18-4.16 (m, 2H), 4.11 (q, J = 7.14 Hz, 3H), 3.45 (d, J = 19.74 Hz,1H), 3.40 (dd, J = 13.62; 7.20 Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 12.69, 4.35 Hz, 1H),3.19 (dd, J = 19.77, 6.27 Hz, 1H), 3.08 – 3.01 (m, 2H), 2.84 (td, J = 13.28,4.68 Hz, 1H), 2.74 (td, J = 12.93, 3.86 Hz, 1H), 2.41 – 2.38 (m, 2H), 2.25(dt, J = 14.64, 3.00 Hz, 1H), 2.12 – 2.09 (m, 1H), 1.78 – 1.74 (m, 4H), 1.72– 1.68 (m, 2H), 1.24 (t, J = 7.14 Hz, 3H), 1.18 – 1.15 (m, 1H), 0.86 – 0.83(m, 1H), 0.79 – 0.75 (m, 1H), 0.59 – 0.50 (m, 2H)。
化合物(3)的制备：将化合物(2) (474.8 mg, 0.81 mmol)溶解于MeOH (5 mL)中；然后，添加氢氧化钠10N溶液(0.53 mL)，并所得反应混合物在室温下搅拌2小时。通过TLC[(DCM/MeOH 8/2 v/v), Rf(2) = 0.80 Rf(3) = 0.20]检查来证实反应完成。在冰浴上用HCl(12N, 0.5 mL)酸化反应混合物。在旋转蒸发器上除去溶剂。将所得白色滤饼悬浮于乙腈(2mL)中并滤出。将滤液在旋转蒸发器上浓缩。然后添加含有0.1% TFA的水，并将所得样品冻干过夜(16-20小时)。冻干后，以100%产率获得作为无色粉末的471 mg标题化合物。化合物(3)：ESI-MS m/z：[C25H32NO6]+的计算值442.2，实测值[M+H]+ = 442.2; 1H NMR (600 MHz,MeOD-d 4 ) δ: 6.85 (d, J = 8.28 Hz, 1H), 6.78 (d, J = 8.28 Hz, 1H), 4.86 (s,1H), 4.20 – 4.18 (m, 2H), 3.91 (d, J = 6.06 Hz, 1H), 3.37 (d, J = 19.54 Hz,1H), 3.19 (dd, J = 13.32, 7.08 Hz, 1H), 3.11 (dd, J = 12.66, 4.74 Hz, 1H),3.07 – 3.06 (m, 1H), 3.02 (dd, J = 14.55, 5.13 Hz, 1H), 2.89 (dd, J = 13.38,7.32 Hz, 1H), 2.76 (td, J = 13.16, 4.90 Hz, 1H), 2.61 (td, J = 12.82, 4.00Hz, 1H), 2.34 – 2.32 (m, 2H), 2.26 (dt, J = 14.61, 3.14 Hz, 1H), 2.04 – 2.02(m, 1H), 1.81 – 1.76 (m, 4H), 1.70 (td, J = 14.31, 3.52 Hz, 1H), 1.65 (dd, J= 13.44, 3.00 Hz, 1H), 1.28 – 1.10 (m, 1H), 0.81 – 0.78 (m, 1H), 0.75 – 0.71(m, 1H), 0.51 – 0.44 (m, 2H)。
化合物(4)的制备：将化合物(3) (10.6 mg, 0.019 mmol)溶解于脱气的DMF(1.06 mL)中以制备10 mg/mL半抗原-DMF溶液；然后，添加H-羟基琥珀酰亚胺(6.58 mg,0.057 mmol, 3 eq.)。将所得反应混合物搅拌直至均匀，且然后添加EDAC∙HCl (7.30 mg,0.038 mmol, 2 eq.)。将所得反应混合物在室温下搅拌20小时并通过TLC [(DCM/MeOH 8/2v/v), Rf(3) = 0.80, Rf(4) = 0.20)]监测。化合物(4)的形成通过TLC和MS直接回路证实：ESI m/z：[C29H35N2O8]+的计算值 = 539.2，实测值[M+H]+ = 539.3和[M+Na]+ = 561.3。该化合物(4)不经任何进一步纯化即用于下一反应。
纳曲酮OVA (5)的制备：将OVA, (12 mg, 2.81x10-4 mmol)溶解于50 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.41 (2mL)中。将所得蛋白溶液轻轻涡旋，直至均匀；然后，使用冰浴将其冷却至0- 4℃。将先前制备的化合物(4) - DMF溶液(0.501 mL, 40 eq.)在轻轻涡旋下逐滴添加至蛋白溶液中。将所得反应混合物在4℃下摇动20小时(过夜)，然后在G-25M SEPHADEX®柱(GE Healthcare, Chicago, IL) (CV = 70 cm3，用2 CV的 50 mM磷酸盐缓冲液 pH 7.00预平衡)上纯化。在OD280处监测缀合物洗脱。含有期望的纳曲酮OVA缀合物的尖峰在间隔67-90 mL内被洗脱。收集并浓缩纳曲酮OVA (5)。缀合物的浓度通过OD280确定为0.89 mg/ml。以75%产率获得总共9 mg的OVA缀合物(5)。
纳曲酮KLH免疫原(6)的制备：使用与制备纳曲酮OVA (5)所述相同的方案制备纳曲酮KLH免疫原(6)。在这种情况下，使用20 mg mcKLH，其用化合物(4) - DMF溶液(0.488mL, 7 x 10-3 mmol)处理。纯化后，缀合物的浓度通过BCA测定确定为0.96 mg/ml。以76.8%产率获得15.35 mg的KLH免疫原(6)。
用于生物缀合的天然G6PDH的制备：将天然G6PDH酶乳液(5.5 mL, 5.5 KU, 64.35mg)在4℃下以18,000 RPM离心30分钟。弃去所得澄清水层，并将剩余的白色滤饼悬浮于55mM TRIS缓冲液pH 8.00 (2.00 mL)中。将悬浮液轻轻涡旋，直至溶解；然后，将其装载至具有55mM TRIS缓冲液pH 8.00的预平衡的G-25M Sephadex柱(CV = 196mL)上。酶在间隔75– 116 mL内洗脱。使用Amicon搅拌细胞浓缩器(30,000 MW截止值)将酶的浓度调节至5 mg/mL；然后，使用冰浴将其冷却至0-4℃。然后添加葡萄糖-6-磷酸二钠盐[G6PDNa2] 240 mg。将所得反应混合物轻轻涡旋至1分钟；然后，添加β-NADH (120mg)，并将所得反应混合物再次搅拌1分钟。将该酶溶液等分至三个塑料管上(1.90 mL对应于每管9.50 mg的酶)。将含有天然G6PDH的管1-3储存在冰浴上并准备用于化合物(4)添加。
用于生物缀合的化合物(4)的制备：将化合物(3) (9.71 mg, 0.017 mmol)溶解在脱气的DMF (0.242 mL)中以制备40 mg/mL半抗原-DMF溶液；然后，添加N-羟基琥珀酰亚胺(6.20 mg, 0.054 mmol, ~3 eq.)。将所得反应混合物搅拌直至均匀，且然后添加EDAC∙HCl(7.30 mg, 0.038 mmol, 2 eq.)。将所得反应混合物在室温下搅拌22小时并通过TLC[(DCM/MeOH 8/2 v/v), Rf(4) = 0.80, Rf(3) = 0.20]监测。形成化合物(4)后，添加脱气的DMF (0.242 μL)以制备20 mg/mL化合物(4) - DMF溶液。ESI m/z：[C29H35N2O8]+的计算值 =539.3，实测值[M+H]+ = 539.3, [M+Na]+ = 561.3；该化合物(4)不经任何进一步纯化即用于生物缀合。
纳曲酮nG6PDH酶(7a-c)的制备：在管1中，添加化合物(4)(243 μL - DMF溶液)[化合物(4)对nG6PDH 10倍摩尔过量]。将反应混合物在 2-8℃下摇动1 小时；然后，其用 L-赖氨酸[1M 溶液，9 µL，L-赖氨酸对化合物(4) 10 倍摩尔过量]淬灭。然后将反应混合物在室温下摇动20分钟。该缀合物通过用55 mM TRIS缓冲液pH 7.00 (2 CV)预平衡的G-50MSEPHADEX®柱(CV = 67 cm2)纯化。缀合物在间隔45 – 60 mL内作为尖峰洗脱。收集并浓缩含有期望缀合物的所有级分。缀合物的浓度通过OD280确定为1.16 mg/mL。G6PDH缀合物(7a)以7.93 mg获得，其中产率为83%。
在管2中，添加化合物(4)(485 μL - DMF溶液)(化合物(4)对nG6PDH 10倍摩尔过量)；将反应混合物在 2-8℃下摇动1小时；然后，其用 L-赖氨酸[1M 溶液，18 µL，L-赖氨酸对化合物(4) 10 倍摩尔过量]淬灭。然后将反应混合物在室温下摇动20分钟。该缀合物通过用55mM TRIS缓冲液pH 7.00 (2 CV)预平衡的G-50M SEPHADEX®柱(CV = 67 cm2)纯化。缀合物在间隔45 – 60 mL内作为尖峰洗脱。收集并浓缩含有期望缀合物的所有级分。缀合物的浓度通过OD280确定为1.25 mg/mL。G6PDH缀合物(7b)以8.09 mg获得，其中产率为85%。
在管3中，添加化合物(4)(729 μL - DMF溶液)[化合物(4)对nG6PDH 30倍摩尔过量]。将反应混合物在 2-8℃下摇动1 小时；然后，其用 L-赖氨酸[1M 溶液，27 µL，L-赖氨酸对化合物(4) 10 倍摩尔过量]淬灭。然后将反应混合物在室温下摇动20分钟。该缀合物通过用55 mM TRIS缓冲液pH 7.00 (2 CV)预平衡的G-50M SEPHADEX®柱(CV = 67 cm2)纯化。缀合物在间隔45 – 60 mL内作为尖峰洗脱。收集并浓缩含有期望缀合物的所有级分。缀合物的浓度通过OD280确定为1.28 mg/mL。G6PDH缀合物(7c)以8.27 mg获得，其中产率为87%。
图3示意性地描绘了通过C-3位置连接的纳洛酮半抗原、KLH免疫原和G6PDH缀合物的合成，如下文中进一步详细描述。
化合物(9)的制备：该化合物使用与制备化合物(2)所述相同的合成方法制备。冻干后，以99%产率获得作为无色粉末的化合物(9) (465.5 mg)。化合物(9)：ESI-MS m/z：[C26H34NO6]+的计算值 456.2，实测值[M+H]+ = 456.2; 1H NMR (600 MHz, MeOD-d 4 ) δ:6.87 (d, J = 8.28 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 8.28 Hz, 1H), 6.03 – 5.96 (m, 1H),5.71 (d, J = 16.98 Hz, 1H), 5.64 (d, J = 10.26 Hz, 1H), 4.90 (s, 1H), 4.20 –4.16 (m, 2H), 4.11 (q, J = 7.14 Hz, 2H), 3.98 (dd, J = 13.59, 8.62 Hz, 1H),3.89 (dd, J = 13.62, 5.64 Hz, 1H), 3.78 (d, J = 6.00 Hz, 1H), 3.48 (d, J =19.80 Hz, 1H), 3.31 – 3.28 (m, 1H), 3.10 ( dd, J = 19.80, 6.18 Hz, 1H), 3.03(td, J = 14.65, 4.97 Hz, 1H), 2.87 – 2.75 (m, 2H), 2.40 (m, 2H), 2.24 (dt, J= 14.70, 3.00 Hz, 1H), 2.06 – 2.02 (m, 1H), 1.78 – 1.76 (m, 4H), 1.73 – 1.66(m, 2H), 1.25 (t, J = 7.14 Hz, 3H)。
化合物(10)的制备：该化合物使用与制备化合物(3)所述相同的合成方法制备。冻干后，以几乎100%的产率获得作为无色粉末的化合物(10) (447 mg)。化合物(10)：ESI-MSm/z：[C24H30NO6]+的计算值= 428.2，实测值[M+H]+ = 428.2; 1H NMR (600 MHz, MeOD-d 4 )δ: 6.82 (d, J = 8.22 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 8.22 Hz, 1H), 5.99 – 5.91 (m, 1H),5.48 (dd, J = 17.13, 1.17 Hz, 1H), 5.43 – 5.41 (m, 2H), 4.82 (s 1H), 4.18 –4.16 (m, 2H), 3.60 (dd, J = 13.60, 7.53 Hz, 1H), 3.55 (dd, J = 13.59, 6.03Hz, 1H), 3.42 (d, J = 5.88 Hz, 1H), 3.30 (s, 1H), 3.03 (td, J = 14.55, 5.10Hz, 1H), 2.96 (dd, J = 12.48, 4.80 Hz, 1H), 2.85 (dd, J = 19.32, 6.06 Hz,1H), 2.65 (td, J = 12.99, 5.04 Hz, 1H), 2.46 (td, J = 12.63, 3.92 Hz, 1H),2.36 – 2.33 (m, 2H), 2.22 (dt, J = 14.52, 3.12 Hz, 1H), 1.97 – 1.94 (m, 1H),1.80 – 1.76 (m, 4H), 1.65 (dd, J = 14.25, 3.45 Hz, 1H), 1.61 – 1.58 (m, 1H)。
化合物(11)的制备：该化合物使用与制备化合物(4)所述相同的合成方法制备。
纳洛酮OVA (12)的制备：该缀合物使用与制备OVA缀合物(5)所述相同的合成方法制备。
纳洛酮KLH免疫原(13)的制备：该免疫原使用与制备KLH免疫原(6)所述相同的合成方法制备。
纳洛酮nG6PDH [14(a-c)]的制备：这些nG6PDH缀合物使用与制备nG6PDHs [7(a-c)]所述相同的合成方法制备。
图4示意性地描绘了通过C-6位置连接的纳曲酮半抗原、KLH免疫原和G6PDH缀合物的合成，如下文中详细描述。
化合物(15)的制备：将盐酸纳曲酮(1) (118 mg, 0.31 mmol)溶解于MeOH (7 mL)中；然后，添加NaOAc (292 mg, 2.24 mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌5分钟；然后，将O-(羧基甲基)羟胺半盐酸盐(210.7 mg, 1.92 mmol)添加至混合物中。将所得反应混合物在室温下搅拌过夜(20小时)。反应混合物的TLC分析显示反应完成[(DCM/MeOH 8/2 v/v)Rf(1) = 0.4, Rf(15) = 0.02]。在旋转蒸发器上除去溶剂，以得到白色悬浮液。然后，添加含有0.1% AcOH的水/乙腈(1.4 mL/0.6 mL v/v)。然后将粗反应混合物注入制备型ShimadzuHPLC系统中用于纯化。将含有期望产物的级分合并在一起，在旋转蒸发器上浓缩，并冻干过夜(16-20 小时)。这以75%产率得到作为无色粉末的化合物(15) (124mg)。化合物(15)：ESI-MS m/z：[C22H27NO6]+的计算值415.2，实测值[M+H]+ = 415.2，和[M+Na]+ = 429.2; 1HNMR (600 MHz, MeOD-d 4 ) δ: 6.76 (d, J = 8.10 Hz, 1H), 6.72 (d, J = 8.22 Hz,1H), 5.06 (s, 1H), 4.66 (s, 2H), 3.99 (d, J = 6.60 Hz, 1H), 3.42 (d, J =19.74 Hz, 1H), 3.38 (dd, J = 13.32, 7.03 Hz, 1H), 3.17 (dd, J =12.99, 5.01Hz, 1H), 3.12 (dd, J = 19.86, 6.84 Hz, 1H), 2.97 (dd, J = 13.62, 7.50 Hz,1H), 2.91 (td, J = 13.05, 4.04 Hz, 1H), 2.82 (ddd, J = 17.76, 6.54, 1.86 Hz,1H), 2.68 (td, J = 13.43, 5.00 Hz, 1H), 2.65 – 2.59 (m, 1H), 1.80 – 1.76 (m,2H), 1.51 (ddd, J = 14.25, 12.09, 6.54 Hz, 1H), 1.17 – 1.10 (m, 1H), 0.88 –0.84 (m, 1H), 0.80 – 0.75 (m, 1H), 0.57 – 0.50 (m, 2H)。
化合物(16)的制备：该化合物使用与制备化合物(4)所述相同的合成方法制备。
纳曲酮OVA (17)的制备：该缀合物使用与制备OVA缀合物(5)所述相同的合成方法制备。
纳曲酮KLH免疫原(18)的制备：该免疫原使用与制备KLH免疫原(6)所述相同的合成方法制备。
纳曲酮nG6PDH [19(a-c)]的制备：这些nG6PDH缀合物使用与制备nG6PDHs [7(a-c)]所述相同的合成方法制备。
图5示意性地描绘了通过C-6位置连接的纳洛酮半抗原、KLH免疫原和G6PDH缀合物的合成，如下文中详细描述。
化合物(20)的制备：将盐酸纳洛酮(8) (110 mg, 0.27 mmol)溶解于MeOH (7 mL)中；然后，添加NaOAc (260 mg, 2.00 mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌5分钟；然后，添加O-(羧基甲基)羟胺半盐酸盐(186 mg, 1.69 mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC分析显示反应完成(DCM/MeOH 8/2 v/v Rf(1) = 0.40, Rf(20) = 0.02)。反应混合物形成白色沉淀物。反应混合物在旋转蒸发仪上浓缩以得到白色悬浮液，将其溶解于含有0.1% AcOH的水中并注入Shimadzu HPLC用于纯化。将含有期望产物的级分合并在一起，在旋转蒸发器上浓缩，并冻干过夜(16-20 小时)。这以87%产率得到化合物(20) (125 mg)。化合物(20)：ESI-MS m/z：[C21H25NO6]+的计算值401.2，实测值[M+H]+ = 401.2, [M+Na]+ =423.2; 1H NMR (600 MHz, MeOD-d 4 ) δ: 6.74 (d, J = 8.17 Hz, 1H), 6.70 (d, J =8.22 Hz, 1H), 5.98 – 5.90 (m, 1H), 5.68 (d, J = 17.16 Hz, 1H), 5.64 (d, J =10.38 Hz, 1H), 5.04 (s, 1H), 4.64 (s, 2H), 3.95 (dd, J = 13.65, 8.67 Hz, 1H),3.81 (dd, J = 13.68, 5.58 Hz, 1H), 3.63 (d, J = 6.54 Hz, 1H), 3.43 (d, J =19.74 Hz, 1H), 3.22 (dd, J = 12.93, 4.95 Hz, 1H), 3.02 (dd, J = 19.80, 6.60Hz, 1H), 2.92 (td, J = 13.13, 4.10 Hz, 1H), 2.80 (ddd, J = 17.73, 6.39, 1.89Hz, 1H), 2.65 (td, J = 13.47, 5.04 Hz, 1H), 2.61 – 2.54 (m, 1H), 1.77 (dd, J= 13.68, 3.30 Hz, 1H), 1.71 (ddd, J = 14.26, 6.67, 2.38 Hz, 1H), 1.45 (ddd, J= 14.26, 12.20, 6.43 Hz, 1H)。
化合物(21)的制备：该化合物使用与制备化合物(4)所述相同的合成方法制备。
纳洛酮OVA (22)的制备：该缀合物使用与制备OVA缀合物(5)所述相同的合成方法制备。
纳洛酮KLH免疫原(23)的制备：该免疫原使用与制备KLH免疫原(6)所述相同的合成方法制备。
纳洛酮nG6PDH [24(a-c)]的制备：这些nG6PDH缀合物使用与制备nG6PDHs [7(a-c)]所述相同的合成方法制备。
实施例 2：抗纳洛酮和抗纳曲酮单克隆抗体的产生
本实施例举例说明了针对纳洛酮和纳曲酮的特异性单克隆抗体的产生。这些单克隆抗体可分别用于纳洛酮和纳曲酮特异性测定中。
此外，这些单克隆抗体可用作阿片剂测定(诸如但不限于氢可酮测定)中的阻断剂抗体。通常观察到，各种阿片剂测定为经历纳洛酮/纳曲酮治疗的患者提供假阳性结果。在此类情况下，可以使用本文公开的纳洛酮/纳曲酮特异性测定来筛选患者以排除任何假阳性。此外(和/或替代地)，各种阿片剂测定中利用的生物样品可以用这些纳洛酮/纳曲酮特异性单克隆抗体进行预处理步骤，以除去样品中存在的任何纳洛酮/纳曲酮，且因此防止或基本上减少定量临床阿片剂测定中观察到的任何纳洛酮/纳曲酮干扰。
在本实施例中，制备了包含在各个位置附接至KLH的纳洛酮或纳曲酮的各种免疫原，并将其用作免疫原以腹膜内免疫小鼠(例如BALB/c小鼠、Swiss Webster小鼠或小鼠的AJ品系)。小鼠被免疫三次或更多次以生成高滴度免疫应答。使用佐剂如CFA(使用CFA乳化的免疫原)进行初始免疫，随后使用佐剂如IFA进行后续加强免疫。免疫后，给小鼠放血，并使用离心技术分离血清样品。使用纳洛酮和/或纳曲酮与卵清蛋白的缀合物(卵清蛋白缀合物)针对抗纳洛酮和抗纳曲酮抗体测试来自这些小鼠的血清样品。采用微量滴定板ELISA，并使用抑制ELISA检查抗体与卵清蛋白缀合物的结合以及随后与游离药物分子的结合。图6显示使用八种重要的阿片样物质药物的抑制ELISA结果。用于获得图6中显示的小鼠出血的免疫原如下。顶行，从左至右：纳曲酮3-KLH (式III，其中R2是环丙基)；纳曲酮6-KLH (式VI，其中R2是环丙基)；纳洛酮3-KLH(式III，其中R2是烯丙基)；和纳洛酮3-KLH。底行，从左至右：纳曲酮3-KLH；纳曲酮6-KLH；纳洛酮6-KLH (式VI，其中R2是烯丙基)；和纳洛酮6-KLH。
选择在ELISA抑制测定中具有良好抗药物抗体滴度和与游离药物的结合的小鼠以进行单克隆抗体的生成，其方式类似于美国专利号9,815,907(在2017年11月14日授予Sharma等人)中描述的方式。具体而言，具有最高滴度和最佳特异性的小鼠在融合前三天进行加强。在融合当天，从这些小鼠收获脾细胞，并使用PEG-辅助融合方案将其与骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653融合。在约十天后，使用板ELISA(针对特异性的直接结合和抑制ELISA)针对抗纳洛酮和抗纳曲酮抗体筛选杂交瘤上清液。进一步扩增和亚克隆阳性克隆，并使用蛋白A SEPHAROSE® (GE Healthcare, Chicago, IL)柱纯化上清液。使用ELISA针对与免疫原(即，药物-载体蛋白的缀合物)和游离阿片样物质的结合测试纯化的抗体样品。
表1列出针对纳洛酮和纳曲酮药物分子生成的选定杂交瘤克隆中的一些的名称，如本文所述。
表 1：针对纳洛酮-和纳曲酮-KLH缀合物生成的单克隆抗体的列表
| mAb名称 | 药物 |
| 179B 9G1.1 | 纳洛酮 |
| 179B 9E12 | 纳洛酮 |
| 179B 10A7 | 纳洛酮 |
| 179A 6H6 | 纳洛酮 |
| 179B 9E7 | 纳洛酮 |
| 180A 3D3 | 纳曲酮 |
| 180B 13F7 | 纳曲酮 |
| 180C 1F8 | 纳曲酮 |
| 180C 7G8 | 纳曲酮 |
| 180C 8A10 | 纳曲酮 |
| 180C 9D5 | 纳曲酮 |
| 180C 9G8 | 纳曲酮 |
| 180C 2A12 | 纳曲酮 |
根据以下方案使用抑制ELISA程序筛选抗体溶液(免疫小鼠出血或杂交瘤克隆上清液或纯化的抗体)。将板用磷酸盐缓冲盐水中的1 µg/mL的纳洛酮3-卵清蛋白、纳洛酮6-卵清蛋白、纳曲酮3-卵清蛋白或纳曲酮6-卵清蛋白进行包被，每孔50 µL。板包被在室温下进行1小时或更长时间或在约2℃至8℃下进行过夜。然后将板拍干并用每孔200µL的封闭缓冲溶液(含有0.05% TWEEN® 20表面活性剂的PBS中的0.5%酪蛋白溶液(CrodaInternational PLC, Snaith, United Kingdom)封闭。通过在室温下在板振荡下孵育30分钟或更长时间来进行板封闭。使用具有板堆叠器的洗板机(BioTek®, Winooski, VT)洗涤板，其中洗涤缓冲液为含有0.05% TWEEN® 20的MILLIQ®水(Millipore Corporation,Billerica, MA)。然后将待筛选的单克隆抗体与游离药物一起添加至每孔中，如下：每孔25µL适当稀释的培养上清液(或抗体溶液)，并添加25 µL 20 µg/mL游离药物。在室温下在板振荡下进行孵育约1小时。洗涤板。添加酶缀合物(封闭缓冲液中稀释的与HRP偶联的山羊抗小鼠IgG，稀释至1:3000)，每孔50 µL。在室温下在振荡下进行孵育约1小时。然后洗涤板，并以每孔100 µL的体积添加显色溶液(来自Moss Substrates, Pasadena MD的TMB)。如果杂交瘤上清液中存在期望抗体，则与不含游离药物的孔相比，观察到光密度的降低。使用ELISA读板器(Molecular Devices, San Jose, CA)在650 nm波长处读板。注意：抗体溶液的适当稀释度通过进行滴定ELISA来确定。选择抗体稀释度，其中观察到约1.0光密度。
如图7中所示，使用纳洛酮-3-Val-mcKLH (式III，其中R2是烯丙基)生成命名为179B 9G1.1、179B 9E12、179B 10A7、179A 6H6和179B 9E7的单克隆抗体，并且具有的对纳洛酮的特异性好于抑制ELISA测定中测试的八种其他关键的阿片样物质。如图8中所示，使用纳曲酮-3-Val-mcKLH (式III，其中R2是环丙基)生成命名为180B 13F7、180C 1F8、180C7G8、180C 8A10、180C 9D5、180C 9G8、180C 2A12和180A 3D3的单克隆抗体，并且具有的对纳曲酮的特异性好于抑制ELISA测定中测试的八种其他关键的阿片样物质。基于这些结果，然后将单克隆抗体用于纳洛酮/纳曲酮特异性免疫测定以及防止或基本上减少其他阿片剂测定中的纳洛酮/纳曲酮干扰的方法中，如下文进一步详细描述。
实施例3：单克隆抗体测序
如实施例2中产生的杂交瘤细胞用于对各种单克隆抗体的重链和轻链进行测序。对不同克隆的序列进行比对，并提供共有序列。对于每种单克隆抗体获得的各种序列显示于下表2-14中。
表 2：抗纳曲酮单克隆抗体180C 2A12的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 1 | 9 |
| 重链CDR1 | 2 | 10 |
| 重链CDR2 | 3 | 11 |
| 重链CDR3 | 4 | 12 |
| 轻链 | 5 | 13 |
| 轻链CDR1 | 6 | 14 |
| 轻链CDR2 | 7 | 15 |
| 轻链CDR3 | 8 | 16 |
| 重链可变区 | 17 | 19 |
| 轻链可变区 | 18 | 20 |
表 3：抗纳曲酮单克隆抗体180A 3D3的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 21 | 29 |
| 重链CDR1 | 22 | 30 |
| 重链CDR2 | 23 | 31 |
| 重链CDR3 | 24 | 32 |
| 轻链 | 25 | 33 |
| 轻链CDR1 | 26 | 34 |
| 轻链CDR2 | 27 | 35 |
| 轻链CDR3 | 28 | 36 |
| 重链可变区 | 37 | 39 |
| 轻链可变区 | 38 | 40 |
表 4：抗纳曲酮单克隆抗体180B13F7的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 41 | 49 |
| 重链CDR1 | 42 | 50 |
| 重链CDR2 | 43 | 51 |
| 重链CDR3 | 44 | 52 |
| 轻链 | 45 | 53 |
| 轻链CDR1 | 46 | 54 |
| 轻链CDR2 | 47 | 55 |
| 轻链CDR3 | 48 | 56 |
| 重链可变区 | 57 | 59 |
| 轻链可变区 | 58 | 60 |
表 5：抗纳曲酮单克隆抗体180C 1F8的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 61 | 69 |
| 重链CDR1 | 62 | 70 |
| 重链CDR2 | 63 | 71 |
| 重链CDR3 | 64 | 72 |
| 轻链 | 65 | 73 |
| 轻链CDR1 | 66 | 74 |
| 轻链CDR2 | 67 | 75 |
| 轻链CDR3 | 68 | 76 |
| 重链可变区 | 77 | 79 |
| 轻链可变区 | 78 | 80 |
表 6：抗纳曲酮单克隆抗体180C 7G8的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 81 | 89 |
| 重链CDR1 | 82 | 90 |
| 重链CDR2 | 83 | 91 |
| 重链CDR3 | 84 | 92 |
| 轻链 | 85 | 93 |
| 轻链CDR1 | 86 | 94 |
| 轻链CDR2 | 87 | 95 |
| 轻链CDR3 | 88 | 96 |
| 重链可变区 | 97 | 99 |
| 轻链可变区 | 98 | 100 |
表 7：抗纳曲酮单克隆抗体180C 8A10的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 101 | 109 |
| 重链CDR1 | 102 | 110 |
| 重链CDR2 | 103 | 111 |
| 重链CDR3 | 104 | 112 |
| 轻链 | 105 | 113 |
| 轻链CDR1 | 106 | 114 |
| 轻链CDR2 | 107 | 115 |
| 轻链CDR3 | 108 | 116 |
| 重链可变区 | 117 | 119 |
| 轻链可变区 | 118 | 120 |
表 8：抗纳曲酮单克隆抗体180C 9D5的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 121 | 129 |
| 重链CDR1 | 122 | 130 |
| 重链CDR2 | 123 | 131 |
| 重链CDR3 | 124 | 132 |
| 轻链 | 125 | 133 |
| 轻链CDR1 | 126 | 134 |
| 轻链CDR2 | 127 | 135 |
| 轻链CDR3 | 128 | 136 |
| 重链可变区 | 137 | 139 |
| 轻链可变区 | 138 | 140 |
表 9：抗纳曲酮单克隆抗体180C 9G8的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 141 | 149 |
| 重链CDR1 | 142 | 150 |
| 重链CDR2 | 143 | 151 |
| 重链CDR3 | 144 | 152 |
| 轻链 | 145 | 153 |
| 轻链CDR1 | 146 | 154 |
| 轻链CDR2 | 147 | 155 |
| 轻链CDR3 | 148 | 156 |
| 重链可变区 | 157 | 159 |
| 轻链可变区 | 158 | 160 |
表 10：抗纳洛酮单克隆抗体179B 9G1.1的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 161 | 169 |
| 重链CDR1 | 162 | 170 |
| 重链CDR2 | 163 | 171 |
| 重链CDR3 | 164 | 172 |
| 轻链 | 165 | 173 |
| 轻链CDR1 | 166 | 174 |
| 轻链CDR2 | 167 | 175 |
| 轻链CDR3 | 168 | 176 |
| 重链可变区 | 177 | 179 |
| 轻链可变区 | 178 | 180 |
表 11：抗纳洛酮单克隆抗体179B 9E12的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 181 | 189 |
| 重链CDR1 | 182 | 190 |
| 重链CDR2 | 183 | 191 |
| 重链CDR3 | 184 | 192 |
| 轻链 | 185 | 193 |
| 轻链CDR1 | 186 | 194 |
| 轻链CDR2 | 187 | 195 |
| 轻链CDR3 | 188 | 196 |
| 重链可变区 | 197 | 199 |
| 轻链可变区 | 198 | 200 |
表 12：抗纳洛酮单克隆抗体179B 10A7的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 201 | 209 |
| 重链CDR1 | 202 | 210 |
| 重链CDR2 | 203 | 211 |
| 重链CDR3 | 204 | 212 |
| 轻链 | 205 | 213 |
| 轻链CDR1 | 206 | 214 |
| 轻链CDR2 | 207 | 215 |
| 轻链CDR3 | 208 | 216 |
| 重链可变区 | 217 | 219 |
| 轻链可变区 | 218 | 220 |
表 13：抗纳洛酮单克隆抗体179A 6H6的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 221 | 229 |
| 重链CDR1 | 222 | 230 |
| 重链CDR2 | 223 | 231 |
| 重链CDR3 | 224 | 232 |
| 轻链 | 225 | 233 |
| 轻链CDR1 | 226 | 234 |
| 轻链CDR2 | 227 | 235 |
| 轻链CDR3 | 228 | 236 |
| 重链可变区 | 237 | 239 |
| 轻链可变区 | 238 | 240 |
表 14：抗纳洛酮单克隆抗体179B 9E7的各种序列的序列标识符
| 序列 | 氨基酸序列的SEQ ID NO: | DNA序列的SEQ ID NO: |
| 重链 | 241 | 249 |
| 重链CDR1 | 242 | 250 |
| 重链CDR2 | 243 | 251 |
| 重链CDR3 | 244 | 252 |
| 轻链 | 245 | 253 |
| 轻链CDR1 | 246 | 254 |
| 轻链CDR2 | 247 | 255 |
| 轻链CDR3 | 248 | 256 |
| 重链可变区 | 257 | 259 |
| 轻链可变区 | 258 | 260 |
实施例 4：单克隆抗体在纳洛酮和纳曲酮-特异性测定中的用途
在本实施例中，实施例2中产生的单克隆抗体用于纳洛酮-和纳曲酮-特异性免疫测定中以表明这些单克隆抗体在临床免疫测定中检测一种或两种药物的能力。
图9图示描绘了使用抗纳洛酮单克隆抗体179A 6H6的纳洛酮和纳曲酮特异性测定。如可见，抗纳洛酮单克隆抗体以基本上相同的特异性检测纳洛酮和纳曲酮两者。用抗纳洛酮单克隆抗体179B 10A7、179B 9G1、179B 9E12和179B 9E7也获得类似的结果。因此，这些抗体可用于一种或两种药物的临床检测免疫测定中。
图10图示描绘了使用抗纳曲酮单克隆抗体180C 2A12的纳洛酮和纳曲酮特异性测定。除了纳曲酮之外，这种抗纳曲酮单克隆抗体还能够检测纳洛酮，尽管与纳曲酮相比特异性较低。然而，该抗体仍可用于任一或两种药物的临床检测免疫测定中。
基于这些结果，这些抗体可以用于如下测定结构中。EMIT® II (酶倍增免疫测定,Siemens Healthineers, Newark, DE)加纳洛酮和/或纳曲酮测定是一种均相酶免疫测定技术，其用于分析人尿中的特定化合物。该测定基于样本中的药物和用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(rG6PDH)标记的药物之间对于抗体结合位点的竞争。与抗体结合后，酶活性降低，因此可以在酶活性的方面来测量样本中的药物浓度。在葡萄糖-6-磷酸(G6P)存在的情况下，活性酶将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)转化为NADH，导致吸光度变化，其通过分光光度法测量。内源性血清G6PDH不干扰，因为辅酶NAD仅与测定中采用的细菌(肠系膜明串珠菌)酶一起发挥功能。
EMIT®测定形式包括抗体/底物试剂，称为试剂1。该试剂包括抗体以及用于测定的缓冲剂、防腐剂和稳定剂。EMIT®测定形式还包括酶试剂，称为试剂 2。该试剂包括缀合物以及用于测定的缓冲剂、防腐剂和稳定剂。
实施例5：减少阿片样物质测定中的纳洛酮/纳曲酮干扰
在本实施例中，实施例2中产生的单克隆抗体用于阿片剂酶倍增免疫测定中以表明减少这些测定中的纳洛酮/纳曲酮干扰的能力。
图11表明，在纳曲酮抗体阻断剂3D3存在的情况下，纳洛酮和纳曲酮的交叉反应性从对截止值(300 ng/mL)的阳性应答变为阴性应答。类似地，图12表明，在纳洛酮抗体阻断剂6H6存在的情况下，纳洛酮的交叉反应性从对截止值(300 ng/mL)的阳性应答变为阴性应答，仅在低得多的浓度下。
在图13中，抗纳曲酮单克隆抗体2A12在氢可酮测定中用作阻断剂以增加对截止值(300 ng/ml)产生阴性应答的纳洛酮和纳曲酮的量。
因此，根据本公开，已经提供了完全满足上文所述的目的和优点的组合物及其生产和使用方法。尽管已经结合上文阐述的具体附图、实验、结果和语言描述了本公开，但显然，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，意欲涵盖落入本公开的精神和广泛范围内的所有此类替代、修改和变化。
Claims (30)
1.可以特异性结合纳洛酮和/或纳曲酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体或功能片段通过用式III-VIII中的任一种的结构免疫非人动物而产生：
其中，在式III中：A是选自-O-、-N-或-S-的杂原子；B是选自-CO-、低级烷基(C0至C10)、-CONH-、-SO2-、-PO4-的官能团；C是载体蛋白；且R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基；
其中，在式IV中：D是选自O–、S–、CO–或CH2–的杂原子；E是低级烷基、CO2-、CONH-、SO2-或PO4-；F是载体蛋白；R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基；且R1是H或CH3；
其中，在式V中：D是选自O–、S–、CO–或CH2–的杂原子；E是低级烷基、CO2-、CONH-、SO2-或PO4-；F是载体蛋白；R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基；且R1是H或CH3；
其中，在式VI中：G是连接基团，其包括以下中的至少两个：低级烷基链、CO2-、CONH-、SO2-和PO2-；H是载体蛋白；R1是H或CH3；且R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基；
其中，在式VII中：I是选自O–、S–、CO–或CH2–的杂原子；J是低级烷基链、CO2-、CONH-、SO2-或PO4-；K是载体蛋白；R1是H或CH3；且R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基；和
其中，在式VII中：L是选自O、S、CO或CH2的杂原子；M是低级烷基链、CO2-、CONH-、SO2-或PO4-；N是载体蛋白；R1是H或CH3；且R2是H、烷基、烯丙基或亚甲基环丙基。
2.可以特异性结合纳洛酮和/或纳曲酮的抗体或其功能片段，其中所述抗体包含：
(1)分别具有SEQ ID NO:2、3和4的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:6、7 和 8的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(2)分别具有SEQ ID NO:22、23和24的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:26、27 和 28的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(3)分别具有SEQ ID NO:42、43和44的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:46、47 和 48的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(4)分别具有SEQ ID NO:62、63和64的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:66、67 和 68的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(5)分别具有SEQ ID NO:82、83和84的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:86、87 和 88的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(6)分别具有SEQ ID NO:102、103和104的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:106、107 和 108的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(7)分别具有SEQ ID NO:122、123和124的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:126、127 和 128的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(8)分别具有SEQ ID NO:142、143和144的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:146、147 和 148的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(9)分别具有SEQ ID NO:162、163和164的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:166、167 和 168的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(10)分别具有SEQ ID NO:182、183和184的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:186、187 和 188的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(11)分别具有SEQ ID NO:202、203和204的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:206、207 和 208的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；
(12)分别具有SEQ ID NO:222、223和224的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:226、227 和 228的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3；或
(13)分别具有SEQ ID NO:242、243和244的氨基酸序列的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3，以及分别具有SEQ ID NO:246、247 和 248的氨基酸序列的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3。
3.权利要求2的抗体或其功能片段，其被进一步定义为单克隆抗体或其功能片段。
4.权利要求2的抗体或其功能片段，其中：
(1)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:17 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:18具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(2)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:37 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:38具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(3)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:57 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:58具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(4)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:77 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:78具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(5)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:97 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:98具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(6)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:117 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:118具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(7)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:137 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:138具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(8)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:157 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:158具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(9)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:177 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:178具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(10)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:197 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:198具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(11)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:217 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:218具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(12)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:237 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:238具有至少约90%同一性的氨基酸序列；或
(13)所述抗体或其功能片段的重链可变区具有与 SEQ ID NO:257 具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链可变区具有与SEQ ID NO:258具有至少约90%同一性的氨基酸序列。
5.权利要求2的抗体或其功能片段，其中：
(1)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:17和18的氨基酸序列；
(2)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:37和38的氨基酸序列；
(3)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:57和58的氨基酸序列；
(4)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:77和78的氨基酸序列；
(5)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:97和98的氨基酸序列；
(6)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:117和118的氨基酸序列；
(7)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:137和138的氨基酸序列；
(8)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:157和158的氨基酸序列；
(9)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:177和178的氨基酸序列；
(10)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:197和198的氨基酸序列；
(11)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:217和218的氨基酸序列；
(12)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:237和238的氨基酸序列；或
(13)所述抗体或其功能片段的重链和轻链可变区分别具有SEQ ID NO:257和258的氨基酸序列。
6.权利要求2的抗体或其功能片段，其中：
(1)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:1具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:5具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(2)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:21具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:25具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(3)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:41具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:45具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(4)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:61具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:65具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(5)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:81具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:85具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(6)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:101具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:105具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(7)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:121具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:125具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(8)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:141具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:145具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(9)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:161具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:165具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(10)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:181具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:185具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(11)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:201具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:205具有至少约90%同一性的氨基酸序列；
(12)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:221具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:225具有至少约90%同一性的氨基酸序列；或
(13)所述抗体或其功能片段的重链具有与 SEQ ID NO:241具有至少约90%同一性的氨基酸序列，和/或所述抗体或其功能片段的轻链具有与SEQ ID NO:245具有至少约90%同一性的氨基酸序列。
7.权利要求2的抗体或其功能片段，其中：
(1)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:1和5的氨基酸序列；
(2)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:21和25的氨基酸序列；
(3)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:41和45的氨基酸序列；
(4)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:61和65的氨基酸序列；
(5)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:81和85的氨基酸序列；
(6)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:101和105的氨基酸序列；
(7)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:121和125的氨基酸序列；
(8)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:141和145的氨基酸序列；
(9)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:161和165的氨基酸序列；
(10)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:181和185的氨基酸序列；
(11)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:201和205的氨基酸序列；
(12)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:221和225的氨基酸序列；或
(13)所述抗体或其功能片段的重链和轻链分别具有SEQ ID NO:241和245的氨基酸序列。
8.权利要求2的抗体或其功能片段，其被进一步定义为选自全长免疫球蛋白分子、scFv、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2、 Fv、二硫化物连接的Fv及其组合。
9.权利要求2的抗体或功能片段，其中：
(1)所述重链由与SEQ ID NO:9具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:13具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(2)所述重链由与SEQ ID NO:29具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:33具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(3)所述重链由与SEQ ID NO:49具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:53具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(4)所述重链由与SEQ ID NO:69具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:73具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(5)所述重链由与SEQ ID NO:89具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:93具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(6)所述重链由与SEQ ID NO:109具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:113具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(7)所述重链由与SEQ ID NO:129具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:133具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(8)所述重链由与SEQ ID NO:149具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:153具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(9)所述重链由与SEQ ID NO:169具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:173具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(10)所述重链由与SEQ ID NO:189具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:193具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(11)所述重链由与SEQ ID NO:209具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:213具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；
(12)所述重链由与SEQ ID NO:229具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:233具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码；或
(13)所述重链由与SEQ ID NO:249具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码，和/或所述轻链由与SEQ ID NO:253具有至少约 90%同一性的多核苷酸序列编码。
10.权利要求2的抗体或其功能片段，其被进一步定义为纯化的抗体或其功能片段。
11.产生可以特异性结合纳洛酮的抗体或其功能片段的方法，所述方法包括以下步骤：
用包含与载体蛋白附接的纳洛酮的缀合物免疫非人动物，由此诱导 B-细胞产生结合所述缀合物的抗体；和
获得由所述B-细胞产生的抗体或其功能片段。
12.权利要求11的方法，其中所述载体蛋白选自KLH(钥孔
血蓝蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)、卵清蛋白、BTG(牛甲状腺球蛋白)和BGG(牛γ球蛋白)及其组合。
13.权利要求11的方法，其中所述载体蛋白附接至纳洛酮的1-碳、2-碳、3-碳、6-碳、7-碳或8-碳位置。
14.产生可以特异性结合纳曲酮的抗体或其功能片段的方法，所述方法包括以下步骤：
用包含与载体蛋白附接的纳曲酮的缀合物免疫非人动物，由此诱导 B-细胞产生结合所述缀合物的抗体；和
获得由所述B-细胞产生的抗体或其功能片段。
15.权利要求14的方法，其中所述载体蛋白选自KLH(钥孔
血蓝蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)、卵清蛋白、BTG(牛甲状腺球蛋白)和BGG(牛γ球蛋白)及其组合。
16.权利要求14的方法，其中所述载体蛋白附接至纳曲酮的1-碳、2-碳、3-碳、6-碳、7-碳或8-碳位置。
17.产生权利要求1-10中任一项的抗体或其功能片段的杂交瘤。
18.产生可以特异性结合纳洛酮和/或纳曲酮的抗体或其功能片段的方法，所述方法包括：
培养根据权利要求17所述的杂交瘤以产生所述抗体或其功能片段；和
回收所述抗体或其功能片段。
19.组合物，其包含：
至少一种权利要求1-10中任一项的抗体或其功能片段；和
与所述至少一种抗体或其功能片段附接的可检测标记物。
20.组合物，其包含：
固体支持物；和
与所述固体支持物结合的至少一种权利要求1-10中任一项的抗体或其功能片段。
21.多核苷酸，其编码权利要求1-10中任一项的抗体或其功能片段。
22.载体，其包含编码权利要求1-10中任一项的抗体或其功能片段的多核苷酸。
23.重组宿主细胞，其包含编码权利要求1-10中任一项的抗体或其功能片段的多核苷酸。
24.产生可以特异性结合纳洛酮和/或纳曲酮的抗体或其功能片段的方法，所述方法包括：
(a) 在允许表达由多核苷酸编码的抗体或其功能片段的条件下，在细胞培养物中培养权利要求23的重组宿主细胞；和
(b) 从所述细胞培养物分离所述抗体或其功能片段。
25.检测生物样品中存在的纳洛酮和/或纳曲酮的方法，所述方法包括以下步骤：
如果所述生物样品中分别存在纳洛酮和/或纳曲酮，则在由此形成抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物的条件下使所述生物样品与权利要求1-10中任一项的抗体或其功能片段接触；和
检测形成的任何抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物，其中形成的抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物的量与所述生物样品中存在的纳洛酮和/或纳曲酮的量成正比。
26.权利要求25的方法，其中所述抗体或其功能片段具有与其附接的标记物，所述标记物用于检测所述抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物。
27.从生物样品的至少一种阿片剂测定基本上减少纳洛酮和/或纳曲酮干扰的方法，所述方法包括以下步骤：
如果所述样品中分别存在纳洛酮和/或纳曲酮，则在由此形成抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物的条件下使所述生物样品与至少一种权利要求1-10中任一项的抗体或其功能片段接触；
除去形成的任何抗体/纳洛酮和/或抗体/纳曲酮复合物；和
对其中已经基本上减少纳洛酮和/或纳曲酮的生物样品进行至少一种阿片剂测定。
28.权利要求27的方法，其中待测定的阿片剂选自可待因、氢可酮、氢吗啡酮、吗啡、羟考酮、羟吗啡酮、海洛因(6-乙酰吗啡)及其组合。
29.权利要求27的方法，其中所述阿片剂测定选自ELISA、芯片测定、LC/MS/MS、免疫测定、酶免疫测定、酶倍增免疫测定、荧光偏振免疫测定及其组合。
30.权利要求27的方法，其中所述至少一种抗体或其功能片段包含至少一种特异性结合纳洛酮的抗体或其功能片段和至少一种特异性结合纳曲酮的抗体或其功能片段。
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