JPH10179186A - 抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体 - Google Patents
抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体Info
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- JPH10179186A JPH10179186A JP8343165A JP34316596A JPH10179186A JP H10179186 A JPH10179186 A JP H10179186A JP 8343165 A JP8343165 A JP 8343165A JP 34316596 A JP34316596 A JP 34316596A JP H10179186 A JPH10179186 A JP H10179186A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトカルシトニンに高い親和性を有するモノ
クローナル抗体、特にサンドイッチ検定法に適するモノ
クローナル抗体、ならびに、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞株を提供する。 【解決手段】 ヒトカルシトニンを抗原として動物を免
疫し、該動物より得た抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合させてハイブリドーマ細胞株を調製し、ヒトカル
シトニンに高い親和性を有するモノクローナル抗体、特
にサンドイッチ検定法に適するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞株を選択し、該ハイブリドー
マ細胞株を培養し、該モノクローナル抗体を回収する。
クローナル抗体、特にサンドイッチ検定法に適するモノ
クローナル抗体、ならびに、該モノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞株を提供する。 【解決手段】 ヒトカルシトニンを抗原として動物を免
疫し、該動物より得た抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合させてハイブリドーマ細胞株を調製し、ヒトカル
シトニンに高い親和性を有するモノクローナル抗体、特
にサンドイッチ検定法に適するモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマ細胞株を選択し、該ハイブリドー
マ細胞株を培養し、該モノクローナル抗体を回収する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトカルシトニン
に高い親和性を有するモノクローナル抗体、特にサンド
イッチ検定法に適するモノクローナル抗体に関する。該
モノクローナル抗体を使用することによって、血清中に
産生されるヒトカルシトニン量を高感度に定量すること
ができ、治療や診断におけるヒトカルシトニンの動態を
的確に判断することができる。
に高い親和性を有するモノクローナル抗体、特にサンド
イッチ検定法に適するモノクローナル抗体に関する。該
モノクローナル抗体を使用することによって、血清中に
産生されるヒトカルシトニン量を高感度に定量すること
ができ、治療や診断におけるヒトカルシトニンの動態を
的確に判断することができる。
【０００２】
【従来の技術】カルシトニン(ＣＴ)は、３２個のアミノ
酸からなるペプチドホルモンであり、哺乳類においては
甲状腺Ｃ細胞から分泌される。その生理作用は、骨に対
する骨吸収抑制による血中カルシウム低下や腎臓に対す
る尿中無機リンの排泄促進による血清リン低下などが知
られているが、未だ不明な点も多い。
酸からなるペプチドホルモンであり、哺乳類においては
甲状腺Ｃ細胞から分泌される。その生理作用は、骨に対
する骨吸収抑制による血中カルシウム低下や腎臓に対す
る尿中無機リンの排泄促進による血清リン低下などが知
られているが、未だ不明な点も多い。
【０００３】現在、血中ヒトカルシトニン(ｈＣＴ)の測
定にはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)法が用いられてお
り、甲状腺髄様癌の診断、治療経過の観察、家族性甲状
腺髄様癌のスクリーニングに、あるいは異所性ｈＣＴ産
生腫瘍の診断に利用されている。しかし、市販されてい
るＲＩＡキットは、抗ｈＣＴポリクローナル抗体を用い
たものであり、種々のエピトープに対する抗体の混合物
であるため、血中ではモノマーｈＣＴ以外の分解物も測
定している可能性がある。従って、このようなポリクロ
ーナル抗体を用いたＲＩＡ法による測定では、正確に血
中ｈＣＴを測定することはできないと考えられる。ま
た、感度も３０pg／ml程度と低く、正常人の血中ｈＣＴ
濃度を正確に測定することができない。
定にはラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)法が用いられてお
り、甲状腺髄様癌の診断、治療経過の観察、家族性甲状
腺髄様癌のスクリーニングに、あるいは異所性ｈＣＴ産
生腫瘍の診断に利用されている。しかし、市販されてい
るＲＩＡキットは、抗ｈＣＴポリクローナル抗体を用い
たものであり、種々のエピトープに対する抗体の混合物
であるため、血中ではモノマーｈＣＴ以外の分解物も測
定している可能性がある。従って、このようなポリクロ
ーナル抗体を用いたＲＩＡ法による測定では、正確に血
中ｈＣＴを測定することはできないと考えられる。ま
た、感度も３０pg／ml程度と低く、正常人の血中ｈＣＴ
濃度を正確に測定することができない。
【０００４】一方、ｈＣＴと特異的に結合するモノクロ
ーナル抗体は、ｈＣＴのある特定部分(エピトープ)のみ
を認識して結合するため、特異的かつ高感度な測定シス
テムを構築することができる。特に、ｈＣＴの互いに異
なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体
を用いたサンドイッチ法を構築すれば、分解物などの干
渉を受けずにモノマーｈＣＴのみを特異的に測定できる
と考えられる。
ーナル抗体は、ｈＣＴのある特定部分(エピトープ)のみ
を認識して結合するため、特異的かつ高感度な測定シス
テムを構築することができる。特に、ｈＣＴの互いに異
なるエピトープを認識する２種類のモノクローナル抗体
を用いたサンドイッチ法を構築すれば、分解物などの干
渉を受けずにモノマーｈＣＴのみを特異的に測定できる
と考えられる。
【０００５】サンドイッチ法は、エピトープの異なる２
種類のモノクローナル抗体を用いる測定法である。一方
のモノクローナル抗体を固相に固定し、次に試料を反応
させることにより、試料中の抗原はモノクローナル抗体
を介して固相に固定される。さらに、もう一方の標識し
たモノクローナル抗体を反応させることにより、固定さ
れた抗原を介して標識したモノクローナル抗体が固定さ
れる。最終的に固定された標識物質を検出することによ
り、抗原量を測定することができる。
種類のモノクローナル抗体を用いる測定法である。一方
のモノクローナル抗体を固相に固定し、次に試料を反応
させることにより、試料中の抗原はモノクローナル抗体
を介して固相に固定される。さらに、もう一方の標識し
たモノクローナル抗体を反応させることにより、固定さ
れた抗原を介して標識したモノクローナル抗体が固定さ
れる。最終的に固定された標識物質を検出することによ
り、抗原量を測定することができる。
【０００６】高感度のサンドイッチ法を構築するために
は、サンドイッチ法に適したモノクローナル抗体の組合
せを見い出すことが必要である。このようなモノクロー
ナル抗体の最適組合せを見い出すためには、入手可能な
モノクローナル抗体の全ての組合せを用いてサンドイッ
チ法を構築し、最も高い感度を発現するモノクローナル
抗体の組合せを選択することが必要である。
は、サンドイッチ法に適したモノクローナル抗体の組合
せを見い出すことが必要である。このようなモノクロー
ナル抗体の最適組合せを見い出すためには、入手可能な
モノクローナル抗体の全ての組合せを用いてサンドイッ
チ法を構築し、最も高い感度を発現するモノクローナル
抗体の組合せを選択することが必要である。
【０００７】既に、血中ｈＣＴを測定するサンドイッチ
法についてはいくつかの報告があり、感度および精度と
もにＲＩＡ法より優れていることが確認されている。し
かし、その感度は、正常人の血中ヒトカルシトニンレベ
ルを測定するには未だ不十分である。
法についてはいくつかの報告があり、感度および精度と
もにＲＩＡ法より優れていることが確認されている。し
かし、その感度は、正常人の血中ヒトカルシトニンレベ
ルを測定するには未だ不十分である。
【０００８】本発明者らは、甲状髄様癌および他の臓器
の悪性腫瘍に特異的に感応して血中のヒトカルシトニン
量が上昇するという公知の事実に鑑み、甲状髄様癌およ
び他の臓器の悪性腫瘍においてその動態を的確かつ簡便
に判断するために、既にヒトカルシトニンに特異的に反
応するモノクローナル抗体を作製し、特許出願をしてい
る(特開平０５−１０３６８９号)。しかし、これらのモ
ノクローナル抗体をサンドイッチ法に用いた場合、どの
組合せを用いても感度の点でなお不十分であることがわ
かった。
の悪性腫瘍に特異的に感応して血中のヒトカルシトニン
量が上昇するという公知の事実に鑑み、甲状髄様癌およ
び他の臓器の悪性腫瘍においてその動態を的確かつ簡便
に判断するために、既にヒトカルシトニンに特異的に反
応するモノクローナル抗体を作製し、特許出願をしてい
る(特開平０５−１０３６８９号)。しかし、これらのモ
ノクローナル抗体をサンドイッチ法に用いた場合、どの
組合せを用いても感度の点でなお不十分であることがわ
かった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明はヒトカルシト
ニンのサンドイッチ法による免疫測定法において、正常
人の血中ヒトカルシトニン濃度を高感度に測定できる高
感度なモノクローナル抗体を提供するものである。ま
た、本発明は該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、
該抗体の製造方法、および該抗体を用いるヒトカルシト
ニンの高感度かつ迅速な測定法を提供するものである。
ニンのサンドイッチ法による免疫測定法において、正常
人の血中ヒトカルシトニン濃度を高感度に測定できる高
感度なモノクローナル抗体を提供するものである。ま
た、本発明は該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株、
該抗体の製造方法、および該抗体を用いるヒトカルシト
ニンの高感度かつ迅速な測定法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、今回新た
に、抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞株を細胞融合法によって樹立し、得
られたモノクローナル抗体の最適組合せを検討すること
により、サンドイッチ法による高感度なヒトカルシトニ
ン検出法を実現するモノクローナル抗体を選択した。こ
の結果、後記実施例に示す特定のモノクローナル抗体の
組合せが、特にサンドイッチ法において高感度を与える
ことを見い出した。上記目的のためには、ハイブリドー
マＨＣＴ-Ｍ-０２、ＨＣＴ-Ｃ-０８、ＨＣＴ-Ｎ-１１、
ＨＣＴ-Ｃ-１５、ＨＣＴ-Ｍ-１６およびＨＣＴ-Ｃ-１８
からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株によっ
て産生されるモノクローナル抗体が特に適していること
を見い出した。
に、抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞株を細胞融合法によって樹立し、得
られたモノクローナル抗体の最適組合せを検討すること
により、サンドイッチ法による高感度なヒトカルシトニ
ン検出法を実現するモノクローナル抗体を選択した。こ
の結果、後記実施例に示す特定のモノクローナル抗体の
組合せが、特にサンドイッチ法において高感度を与える
ことを見い出した。上記目的のためには、ハイブリドー
マＨＣＴ-Ｍ-０２、ＨＣＴ-Ｃ-０８、ＨＣＴ-Ｎ-１１、
ＨＣＴ-Ｃ-１５、ＨＣＴ-Ｍ-１６およびＨＣＴ-Ｃ-１８
からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株によっ
て産生されるモノクローナル抗体が特に適していること
を見い出した。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体は細
胞融合法によって得ることができる。即ち、抗体産生細
胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドーマを形成
させ、該ハイブリドーマをクローン化し、ヒトカルシト
ニンに特異性を示すクローンを選択し、該クローンを培
養し、産生されたモノクローナル抗体を回収することに
よって目的の抗体を得ることができる。
胞融合法によって得ることができる。即ち、抗体産生細
胞とミエローマ細胞を融合させてハイブリドーマを形成
させ、該ハイブリドーマをクローン化し、ヒトカルシト
ニンに特異性を示すクローンを選択し、該クローンを培
養し、産生されたモノクローナル抗体を回収することに
よって目的の抗体を得ることができる。
【００１２】抗体産生細胞は、例えば、ヒトカルシトニ
ンまたは所望により担体タンパク質と結合させたヒトカ
ルシトニンコンジュゲートを適当なアジュバントと混合
し、この混合物を用いて免疫した動物の脾臓細胞または
リンパ節由来のＢ細胞などであってよい。免疫する動物
としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどを用いる
ことができる。
ンまたは所望により担体タンパク質と結合させたヒトカ
ルシトニンコンジュゲートを適当なアジュバントと混合
し、この混合物を用いて免疫した動物の脾臓細胞または
リンパ節由来のＢ細胞などであってよい。免疫する動物
としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギなどを用いる
ことができる。
【００１３】抗原となるヒトカルシトニンは化学的に合
成することができる。ヒトカルシトニンコンジュゲート
を調製する際の担体タンパク質としては、例えばオボア
ルブミンを挙げることができ、また、架橋試薬として
は、例えば１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロ
ピル)カルボジイミドを挙げることができる。免疫は、
例えば、ヒトカルシトニンコンジュゲート４〜４０mgを
動物の腹腔内に２〜３週間の間隔で３〜４回投与するこ
とにより行ってよい。追加免疫の３日後に免疫動物より
抗体産生細胞を回収する。
成することができる。ヒトカルシトニンコンジュゲート
を調製する際の担体タンパク質としては、例えばオボア
ルブミンを挙げることができ、また、架橋試薬として
は、例えば１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロ
ピル)カルボジイミドを挙げることができる。免疫は、
例えば、ヒトカルシトニンコンジュゲート４〜４０mgを
動物の腹腔内に２〜３週間の間隔で３〜４回投与するこ
とにより行ってよい。追加免疫の３日後に免疫動物より
抗体産生細胞を回収する。
【００１４】抗体産生細胞とミエローマ細胞の融合は常
法に従って行ってよい。ミエローマ細胞としてはマウ
ス、ラット、ヒトのものを使用することができる。細胞
融合法としてはポリエチレングリコール法、電気的融合
法などが挙げられる。
法に従って行ってよい。ミエローマ細胞としてはマウ
ス、ラット、ヒトのものを使用することができる。細胞
融合法としてはポリエチレングリコール法、電気的融合
法などが挙げられる。
【００１５】細胞融合によって得られたハイブリドーマ
の選択は、例えば、ラジオイムノアッセイ、あるいは酵
素標識抗体法(ＥＬＩＳＡ)、蛍光標識抗体法等によって
行う。即ち、ヒトカルシトニンとハイブリドーマ培養上
清を反応させ、ヒトカルシトニンに特異性を示す抗体を
産生しているハイブリドーマを選択し、限界希釈法によ
ってクローニングを行う。
の選択は、例えば、ラジオイムノアッセイ、あるいは酵
素標識抗体法(ＥＬＩＳＡ)、蛍光標識抗体法等によって
行う。即ち、ヒトカルシトニンとハイブリドーマ培養上
清を反応させ、ヒトカルシトニンに特異性を示す抗体を
産生しているハイブリドーマを選択し、限界希釈法によ
ってクローニングを行う。
【００１６】モノクローナル抗体の回収は、例えば次の
ようにして行うことができる。選択したクローンを、例
えば、予めプリスタン(２,６,１０,１４−テトラメチル
ペンタデカン)を投与したマウスの腹腔に移植し、１０
〜１４日後にモノクローナル抗体を含む腹水を回収す
る。腹水からの抗体の回収は硫安分画法、イオン交換ク
ロマトグラフ法あるいはアフィニティークロマトグラフ
ィー等により容易に達成される。
ようにして行うことができる。選択したクローンを、例
えば、予めプリスタン(２,６,１０,１４−テトラメチル
ペンタデカン)を投与したマウスの腹腔に移植し、１０
〜１４日後にモノクローナル抗体を含む腹水を回収す
る。腹水からの抗体の回収は硫安分画法、イオン交換ク
ロマトグラフ法あるいはアフィニティークロマトグラフ
ィー等により容易に達成される。
【００１７】サンドイッチ法に最適なモノクローナル抗
体の組合せの探索は、通常、作製したモノクローナル抗
体の全てを組合せたサンドイッチ法を検討し、最も高い
感度を発現するモノクローナル抗体の組合せを見い出す
ことにより行う。
体の組合せの探索は、通常、作製したモノクローナル抗
体の全てを組合せたサンドイッチ法を検討し、最も高い
感度を発現するモノクローナル抗体の組合せを見い出す
ことにより行う。
【００１８】得られたモノクローナル抗体を用いて、生
体中、例えば血清あるいは血漿中のヒトカルシトニンを
特異的かつ高感度に測定することができる。測定のため
に抗体を酵素、蛍光物質あるいは放射性同位体等で標識
することができ、常法に従ってサンドイッチ酵素イムノ
アッセイ、蛍光イムノアッセイあるいはラジオイムノア
ッセイ等の免疫学的測定法を行うことができる。
体中、例えば血清あるいは血漿中のヒトカルシトニンを
特異的かつ高感度に測定することができる。測定のため
に抗体を酵素、蛍光物質あるいは放射性同位体等で標識
することができ、常法に従ってサンドイッチ酵素イムノ
アッセイ、蛍光イムノアッセイあるいはラジオイムノア
ッセイ等の免疫学的測定法を行うことができる。
【００１９】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。実施例１ 抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体の作
製 (１)抗原の調製 後記の表５に示す３２個のアミノ酸からなるヒトカルシ
トニンペプチドを、通常のペプチド合成法により合成し
た。このペプチド抗原の免疫原性を高めるため、架橋試
薬を用いて担体タンパク質に結合させた。即ち、２５mg
／mlヒトカルシトニン水溶液(２２.４μl)に、１０mg／
mlオボアルブミン水溶液(１６.８μl)と１００mg／mlの
１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド(１６.８μl)を添加し、一晩反応させた。この
反応液を蒸留水に対して透析し、１０mg／mlのヒトカル
シトニンを含むヒトカルシトニンコンジュゲート溶液と
した。
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。実施例１ 抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体の作
製 (１)抗原の調製 後記の表５に示す３２個のアミノ酸からなるヒトカルシ
トニンペプチドを、通常のペプチド合成法により合成し
た。このペプチド抗原の免疫原性を高めるため、架橋試
薬を用いて担体タンパク質に結合させた。即ち、２５mg
／mlヒトカルシトニン水溶液(２２.４μl)に、１０mg／
mlオボアルブミン水溶液(１６.８μl)と１００mg／mlの
１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボ
ジイミド(１６.８μl)を添加し、一晩反応させた。この
反応液を蒸留水に対して透析し、１０mg／mlのヒトカル
シトニンを含むヒトカルシトニンコンジュゲート溶液と
した。
【００２０】(２)マウスの免疫 １０mg／mlのヒトカルシトニンを含むヒトカルシトニン
コンジュゲート溶液(１００μl)をフロイントの完全ア
ジュバント(１００μl)と混合した。この混合液(２００
μl)を、２〜３週間の間隔で３〜４回、ＢＡＬＢ／cマ
ウスの腹腔内に投与して免疫した。
コンジュゲート溶液(１００μl)をフロイントの完全ア
ジュバント(１００μl)と混合した。この混合液(２００
μl)を、２〜３週間の間隔で３〜４回、ＢＡＬＢ／cマ
ウスの腹腔内に投与して免疫した。
【００２１】(３)細胞融合 最終免疫より２０〜４０日経過後に１０mg／mlのヒトカ
ルシトニン(１００μl)を３日間連続して投与し、さら
にその３日後に脾臓をマウスより摘出して脾臓細胞を回
収した。マウスミエローマ細胞(Ｐ３Ｘ６３Ａg８Ｕ１)
は、１５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ溶液で予め３７℃
のＣＯ2インキュベーター内で培養した。０.５〜１×１
０8個の脾細胞と２×１０7個のミエローマ細胞を５０ml
の遠心管に入れ、十分に混合した。混合した細胞に０.
５mlの５０％ポリエチレングリコール１５００を含む７
５mＭ ＨＥＰＥＳ溶液を加え、穏やかに混合して脾臓細
胞とミエローマ細胞を融合させた。次に、この細胞混合
液にＤＭＥＭ溶液(４０ml)を穏やかに混合しながら約１
０分間以内に加え、さらに、１５％牛胎児血清を含むＤ
ＭＥＭ溶液(３０ml)を穏やかに混合しながら約１０分間
以内に加えた。この細胞融合操作は３７℃で行った。融
合細胞を含む溶液(７０ml)を９６ウエルのプレート２枚
に分注し、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で一晩培
養した。未融合のミエローマ細胞と融合細胞は、ＨＡＴ
培地で選別した。即ち、一晩培養した培養液の半量(０.
１ml)を、１０μＭヒポキサンチン、０.４μＭアミノプ
テリン、１６μＭチミジンおよび１５％牛胎児血清を含
むＤＭＥＭ溶液(ＨＡＴ培地)と交換し、３７℃のＣＯ2
インキュベーター内で培養を継続して、未融合のミエロ
ーマ細胞を死滅させた。
ルシトニン(１００μl)を３日間連続して投与し、さら
にその３日後に脾臓をマウスより摘出して脾臓細胞を回
収した。マウスミエローマ細胞(Ｐ３Ｘ６３Ａg８Ｕ１)
は、１５％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ溶液で予め３７℃
のＣＯ2インキュベーター内で培養した。０.５〜１×１
０8個の脾細胞と２×１０7個のミエローマ細胞を５０ml
の遠心管に入れ、十分に混合した。混合した細胞に０.
５mlの５０％ポリエチレングリコール１５００を含む７
５mＭ ＨＥＰＥＳ溶液を加え、穏やかに混合して脾臓細
胞とミエローマ細胞を融合させた。次に、この細胞混合
液にＤＭＥＭ溶液(４０ml)を穏やかに混合しながら約１
０分間以内に加え、さらに、１５％牛胎児血清を含むＤ
ＭＥＭ溶液(３０ml)を穏やかに混合しながら約１０分間
以内に加えた。この細胞融合操作は３７℃で行った。融
合細胞を含む溶液(７０ml)を９６ウエルのプレート２枚
に分注し、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で一晩培
養した。未融合のミエローマ細胞と融合細胞は、ＨＡＴ
培地で選別した。即ち、一晩培養した培養液の半量(０.
１ml)を、１０μＭヒポキサンチン、０.４μＭアミノプ
テリン、１６μＭチミジンおよび１５％牛胎児血清を含
むＤＭＥＭ溶液(ＨＡＴ培地)と交換し、３７℃のＣＯ2
インキュベーター内で培養を継続して、未融合のミエロ
ーマ細胞を死滅させた。
【００２２】(４)抗体産生ハイブリドーマのスクリーニ
ングおよびクローニング ハイブリドーマのスクリーニングはラジオイムノアッセ
イ法により行った。増殖が認められたウエルの培養上清
(１００μl)を採取し、これに125Ｉで標識したヒトカル
シトニン(１００μl)および未標識ヒトカルシトニン(１
００μl)を加えて反応させた。次いで、５０％ポリエチ
レングリコール６０００(１００μl)を反応系に添加し
て沈澱させ、その放射活性を測定した。抗体産生が確認
できたウエル中のハイブリドーマを限界希釈法によって
クローニングした。ハイブリドーマは１５％牛胎児血清
を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。以上の方法
で１８種類のクローンを樹立した。
ングおよびクローニング ハイブリドーマのスクリーニングはラジオイムノアッセ
イ法により行った。増殖が認められたウエルの培養上清
(１００μl)を採取し、これに125Ｉで標識したヒトカル
シトニン(１００μl)および未標識ヒトカルシトニン(１
００μl)を加えて反応させた。次いで、５０％ポリエチ
レングリコール６０００(１００μl)を反応系に添加し
て沈澱させ、その放射活性を測定した。抗体産生が確認
できたウエル中のハイブリドーマを限界希釈法によって
クローニングした。ハイブリドーマは１５％牛胎児血清
を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。以上の方法
で１８種類のクローンを樹立した。
【００２３】(５)モノクローナル抗体の大量調製と精製 マウスの腹腔内へ、プリスタン[２,６,１０,１４−テト
ラメチルペンタデカン(和光純薬)](０.５ml)を注射し、
２週間以上マウスを飼育した。予め増殖させていたモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を回収し、ＤＭ
ＥＭで細胞数が約４×１０6個／mlになるように希釈し
た。この細胞液(０.５ml)をマウスに腹腔内注射し、１
〜３週間後に腹部を切開し、パスツールピペットで腹水
を回収した。採取した腹水は、等量の溶血液と混合した
のち、２０００rpmで１０分間遠心し、得られた上清を
モノクローナル抗体溶液とした。このモノクローナル抗
体溶液から、マウスＩgＧ精製キット[アフィゲルプロテ
インＡ ＭＡＰＳ−II、バイオラッド(BIO-RAD)社]を用
いたプロテインＡカラムクロマトグラフィーによって、
モノクローナル抗体を精製した。
ラメチルペンタデカン(和光純薬)](０.５ml)を注射し、
２週間以上マウスを飼育した。予め増殖させていたモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を回収し、ＤＭ
ＥＭで細胞数が約４×１０6個／mlになるように希釈し
た。この細胞液(０.５ml)をマウスに腹腔内注射し、１
〜３週間後に腹部を切開し、パスツールピペットで腹水
を回収した。採取した腹水は、等量の溶血液と混合した
のち、２０００rpmで１０分間遠心し、得られた上清を
モノクローナル抗体溶液とした。このモノクローナル抗
体溶液から、マウスＩgＧ精製キット[アフィゲルプロテ
インＡ ＭＡＰＳ−II、バイオラッド(BIO-RAD)社]を用
いたプロテインＡカラムクロマトグラフィーによって、
モノクローナル抗体を精製した。
【００２４】実施例２ サンドイッチ法に最適なモノク
ローナル抗体の選択 実施例１で得られたモノクローナル抗体を用いてサンド
イッチ法を実施することにより、サンドイッチ法に最適
なモノクローナル抗体を選択した。精製したモノクロー
ナル抗体を、ビオチン化キット[アマーシャム(Amersha
m)]を用いてビオチン標識した。精製したモノクローナ
ル抗体を、ＮＡＰ−２５カラムで脱塩処理し、定量した
のち、モノクローナル抗体(１mg)を分注し、凍結乾燥し
た。凍結乾燥試料を５０mＭホウ酸ナトリウム緩衝液(p
Ｈ８.６)(１ml)に溶解し、ビオチン化試薬(４０μl)を
加え、室温で振盪しながら１時間反応させた。ＮＡＰ−
２５カラムで未反応試薬を除去し、１００mＭ ＮaＮ
3(１８０μl)を加え、ビオチンラベル化モノクローナル
抗体とした。
ローナル抗体の選択 実施例１で得られたモノクローナル抗体を用いてサンド
イッチ法を実施することにより、サンドイッチ法に最適
なモノクローナル抗体を選択した。精製したモノクロー
ナル抗体を、ビオチン化キット[アマーシャム(Amersha
m)]を用いてビオチン標識した。精製したモノクローナ
ル抗体を、ＮＡＰ−２５カラムで脱塩処理し、定量した
のち、モノクローナル抗体(１mg)を分注し、凍結乾燥し
た。凍結乾燥試料を５０mＭホウ酸ナトリウム緩衝液(p
Ｈ８.６)(１ml)に溶解し、ビオチン化試薬(４０μl)を
加え、室温で振盪しながら１時間反応させた。ＮＡＰ−
２５カラムで未反応試薬を除去し、１００mＭ ＮaＮ
3(１８０μl)を加え、ビオチンラベル化モノクローナル
抗体とした。
【００２５】固定化抗体１８種類、二次抗体１８種類の
全ての組合せについてサンドイッチ法を実施した。マイ
クロタイタープレート[コースター(Costar)社]の各ウエ
ルに固定化抗体[１０μg／mlの精製抗体を含む５０mＭ
炭酸緩衝液(pＨ９.６)]を５０μlずつ満たし、４℃で一
晩放置した。次いで、固定化抗体を除き、ＰＢＳで洗浄
したのち、ブロック液[４倍希釈のブロックエース(雪印
乳業)]を２００μlずつ満たし、室温で１時間放置し
た。次いで、ブロック液を除き、ＰＢＳ−Ｔweenで洗浄
したのち、抗原溶液(５ng／mlのｈＣＴを含む１０倍希
釈のブロックエース溶液)を５０μlずつ満たし、室温で
２時間放置した。次いで、抗原溶液を除き、ＰＢＳ−Ｔ
weenで洗浄したのち、二次抗体(１００倍希釈のビオチ
ンラベル化抗体を含む１０倍希釈のブロックエース溶
液)を５０μlずつ満たし、室温で２時間放置した。次い
で、二次抗体を除き、ＰＢＳ−Ｔweenで洗浄したのち、
酵素溶液[５００倍希釈のＨＲＰ−ストレプトアビジン
(アマーシャム)を含む１０倍希釈のブロックエース溶
液]を５０μlずつ満たし、室温で２時間放置した。次い
で、酵素溶液を除き、ＰＢＳ−Ｔweenで洗浄したのち、
基質溶液(１２mg／mlのｏ-フェニレンジアミンを含む１
００mＭクエン酸緩衝液(pＨ４.５)]を２００μlずつ満
たし、室温で１５分間反応させた。６Ｎ Ｈ2ＳＯ4(５０
μl)を加えて反応を停止させ、４９０nmでの吸光度を測
定した。
全ての組合せについてサンドイッチ法を実施した。マイ
クロタイタープレート[コースター(Costar)社]の各ウエ
ルに固定化抗体[１０μg／mlの精製抗体を含む５０mＭ
炭酸緩衝液(pＨ９.６)]を５０μlずつ満たし、４℃で一
晩放置した。次いで、固定化抗体を除き、ＰＢＳで洗浄
したのち、ブロック液[４倍希釈のブロックエース(雪印
乳業)]を２００μlずつ満たし、室温で１時間放置し
た。次いで、ブロック液を除き、ＰＢＳ−Ｔweenで洗浄
したのち、抗原溶液(５ng／mlのｈＣＴを含む１０倍希
釈のブロックエース溶液)を５０μlずつ満たし、室温で
２時間放置した。次いで、抗原溶液を除き、ＰＢＳ−Ｔ
weenで洗浄したのち、二次抗体(１００倍希釈のビオチ
ンラベル化抗体を含む１０倍希釈のブロックエース溶
液)を５０μlずつ満たし、室温で２時間放置した。次い
で、二次抗体を除き、ＰＢＳ−Ｔweenで洗浄したのち、
酵素溶液[５００倍希釈のＨＲＰ−ストレプトアビジン
(アマーシャム)を含む１０倍希釈のブロックエース溶
液]を５０μlずつ満たし、室温で２時間放置した。次い
で、酵素溶液を除き、ＰＢＳ−Ｔweenで洗浄したのち、
基質溶液(１２mg／mlのｏ-フェニレンジアミンを含む１
００mＭクエン酸緩衝液(pＨ４.５)]を２００μlずつ満
たし、室温で１５分間反応させた。６Ｎ Ｈ2ＳＯ4(５０
μl)を加えて反応を停止させ、４９０nmでの吸光度を測
定した。
【００２６】１８種類のモノクローナル抗体の全ての組
合せについて、サンドイッチ法によりヒトカルシトニン
の測定を試みた結果を以下の表１に示す。
合せについて、サンドイッチ法によりヒトカルシトニン
の測定を試みた結果を以下の表１に示す。
【表１】
【００２７】この結果、以下の表２に示す(a)〜(e)のモ
ノクローナル抗体の組合せを用いたサンドイッチ法によ
り、ヒトカルシトニンを高感度に測定することが可能で
あることがわかった。
ノクローナル抗体の組合せを用いたサンドイッチ法によ
り、ヒトカルシトニンを高感度に測定することが可能で
あることがわかった。
【表２】 表２．サンドイッチ法におけるモノクローナル抗体の最適組合せ 固定化抗体 二次抗体 (a) Ｎo.２ (HCT-M-02) Ｎo.８ (HCT-C-08) (b) Ｎo.１６(HCT-M-16) Ｎo.１１(HCT-N-11) (c) Ｎo.８ (HCT-C-08) Ｎo.１１(HCT-N-11) (d) Ｎo.１５(HCT-C-15) Ｎo.１６(HCT-M-16) (e) Ｎo.１８(HCT-C-18) Ｎo.２ (HCT-M-02)
【００２８】表２に挙げた６種類のモノクローナル抗体
Ｎo.２、Ｎo.８、Ｎo.１１、Ｎo.１５、Ｎo.１６および
Ｎo.１８をそれぞれ産生する６種類のハイブリドーマＨ
ＣＴ-Ｍ-０２、ＨＣＴ-Ｃ-０８、ＨＣＴ-Ｎ-１１、ＨＣ
Ｔ-Ｃ-１５、ＨＣＴ-Ｍ-１６およびＨＣＴ-Ｃ-１８は、
平成８年(１９９６)１１月２１日に工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託され、受託番号として、それぞれ
ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５０、ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５２、
ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４９、ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５３、
ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５１およびＦＥＲＭ ＢＰ−５７５
４を取得している。
Ｎo.２、Ｎo.８、Ｎo.１１、Ｎo.１５、Ｎo.１６および
Ｎo.１８をそれぞれ産生する６種類のハイブリドーマＨ
ＣＴ-Ｍ-０２、ＨＣＴ-Ｃ-０８、ＨＣＴ-Ｎ-１１、ＨＣ
Ｔ-Ｃ-１５、ＨＣＴ-Ｍ-１６およびＨＣＴ-Ｃ-１８は、
平成８年(１９９６)１１月２１日に工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託され、受託番号として、それぞれ
ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５０、ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５２、
ＦＥＲＭ ＢＰ−５７４９、ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５３、
ＦＥＲＭ ＢＰ−５７５１およびＦＥＲＭ ＢＰ−５７５
４を取得している。
【００２９】実施例３ モノクローナル抗体の特性化 次に、上記表２の組合せを構成する６種類のモノクロー
ナル抗体の性質について検討した。 (１)アイソタイプの分析 選択した６種類のモノクローナル抗体について、アイソ
タイプを分析した。０.２５ng／mlのヒト合成カルシト
ニン(５０μl)をＥＬＩＳＡプレート(コースター社)の
各ウエルに加え、３７℃で１時間反応させて固相化抗原
とした。ブロッキング剤(３００μl)を加えて３７℃で
２時間静置したのち、各精製抗体(５〜５０ng)を添加
し、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、マウ
スタイパーサブアイソタイピングパネル(バイオラッド
社)添付の各アイソタイプに対する抗体(５０μl)を加え
て、３７℃で１時間反応させた。次いで、パーオキシダ
ーゼ標識抗体(５０μl)を添加し、室温で１時間静置し
た。ウエルを十分に洗浄したのち、２Ｍ硫酸を加えて反
応を停止させ、測定波長:４９０nm、対照波長:６５５nm
における吸光度を測定した。
ナル抗体の性質について検討した。 (１)アイソタイプの分析 選択した６種類のモノクローナル抗体について、アイソ
タイプを分析した。０.２５ng／mlのヒト合成カルシト
ニン(５０μl)をＥＬＩＳＡプレート(コースター社)の
各ウエルに加え、３７℃で１時間反応させて固相化抗原
とした。ブロッキング剤(３００μl)を加えて３７℃で
２時間静置したのち、各精製抗体(５〜５０ng)を添加
し、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、マウ
スタイパーサブアイソタイピングパネル(バイオラッド
社)添付の各アイソタイプに対する抗体(５０μl)を加え
て、３７℃で１時間反応させた。次いで、パーオキシダ
ーゼ標識抗体(５０μl)を添加し、室温で１時間静置し
た。ウエルを十分に洗浄したのち、２Ｍ硫酸を加えて反
応を停止させ、測定波長:４９０nm、対照波長:６５５nm
における吸光度を測定した。
【００３０】表３に示したように、ＨＣＴ-Ｃ-１５およ
びＨＣＴ-Ｍ-１６はＩgＧ２a、その他のクローンはＩg
Ｇ１であり、Ｌ鎖はいずれもκであった。これらの結果
を表４にまとめた。
びＨＣＴ-Ｍ-１６はＩgＧ２a、その他のクローンはＩg
Ｇ１であり、Ｌ鎖はいずれもκであった。これらの結果
を表４にまとめた。
【表３】 表３．ＥＬＩＳＡによるアイソタイプの分析 クローン名 IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA κ λ HCT-M-02 2.413 0.374 0.165 0.172 0.056 0.064 3.000 0.097 HCT-C-08 2.512 0.121 0.082 0.042 0.088 0.102 1.625 0.050 HCT-N-11 1.674 0.056 0.019 0.084 0.049 0.000 0.556 0.000 HCT-C-15 0.383 1.936 0.159 0.162 0.093 0.153 1.405 0.142 HCT-M-16 0.030 1.971 0.103 0.040 0.018 0.024 1.099 0.019 HCT-C-18 2.217 0.353 0.611 0.103 0.063 0.035 1.894 0.028
【表４】 表４．抗カルシトニン抗体産生クローンのアイソタイプ クローン名 アイソタイプ ＨＣＴ−Ｍ−０２ ＩgＧ１ ＨＣＴ−Ｃ−０８ ＩgＧ１ ＨＣＴ−Ｎ−１１ ＩgＧ１ ＨＣＴ−Ｃ−１５ ＩgＧ２a ＨＣＴ−Ｍ−１６ ＩgＧ２aＨＣＴ−Ｃ−１８ ＩgＧ１
【００３１】(２)エピトープ部位の解析 合成ヒトカルシトニンペプチド(３.４×１０-11モル)を
ＥＬＩＳＡプレート(コースター社)に加え、３７℃で１
時間反応させて固相化抗原とした。ウエルを洗浄したの
ち、ブロッキング剤(３００μl)を加えて３７℃で２時
間静置した。次いで、各精製抗体(５〜５０ng)を添加
し、３７℃で１時間反応させた。３０００倍希釈したパ
ーオキシダーゼ標識抗マウスＩgＧ(γ鎖認識)抗体(５０
μl)を添加して室温で１時間反応させたのち、０.１５
％Ｈ2Ｏ2含有０.１％ｏ-フェニレンジアミン溶液(５０
μl)を加えて室温で１０分間反応させた。２Ｍ硫酸を加
えて反応を停止させ、測定波長:４９０nm、対照波長:６
５５nmにおける吸光度を測定した。
ＥＬＩＳＡプレート(コースター社)に加え、３７℃で１
時間反応させて固相化抗原とした。ウエルを洗浄したの
ち、ブロッキング剤(３００μl)を加えて３７℃で２時
間静置した。次いで、各精製抗体(５〜５０ng)を添加
し、３７℃で１時間反応させた。３０００倍希釈したパ
ーオキシダーゼ標識抗マウスＩgＧ(γ鎖認識)抗体(５０
μl)を添加して室温で１時間反応させたのち、０.１５
％Ｈ2Ｏ2含有０.１％ｏ-フェニレンジアミン溶液(５０
μl)を加えて室温で１０分間反応させた。２Ｍ硫酸を加
えて反応を停止させ、測定波長:４９０nm、対照波長:６
５５nmにおける吸光度を測定した。
【００３２】解析に用いた合成ヒトカルシトニンペプチ
ドの配列は、以下の表５に示した通りである。
ドの配列は、以下の表５に示した通りである。
【表５】 表５．使用した合成ヒトカルシトニンペプチド hCT( 1−32): CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP−NH2 hCT( 1−10): CGNLSTCMLG hCT(11−20): TYTQDFNKFH hCT(21−32): TFPQTAIGVGAP−NH2 hCT( 1−20): CGNLSTCMLGTYTQDFNKFH hCT(11−32): TYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP−NH2
【００３３】エピトープ部位の解析結果を以下の表６に
示す。抗カルシトニンモノクローナル抗体産生クローン
は、表７にまとめたように、それぞれヒトカルシトニン
のＮ末端側、中央部分、またはＣ末端側を認識した。
示す。抗カルシトニンモノクローナル抗体産生クローン
は、表７にまとめたように、それぞれヒトカルシトニン
のＮ末端側、中央部分、またはＣ末端側を認識した。
【表６】 表６．ＥＬＩＳＡによるエピトープ部位の解析 クローン名 ペプチド hCT1-32 hCT1-10 hCT11-20 hCT21-32 hCT1-20 hCT11-32 HCT-M-02 3.000 0.030 2.628 0.818 2.882 2.763 HCT-C-08 3.000 0.110 0.045 3.000 0.415 3.000 HCT-N-11 0.783 0.057 0.036 0.054 0.486 0.024 HCT-C-15 3.000 0.025 0.143 0.840 0.117 3.000 HCT-M-16 2.181 0.027 0.493 0.017 1.692 2.115 HCT-C-18 3.000 0.026 0.030 3.000 0.150 3.000
【表７】表７．抗カルシトニン抗体のエピトープ部位 クローン名 エピトープ部位 ＨＣＴ−Ｍ−０２ 中央部分 ＨＣＴ−Ｃ−０８ Ｃ末端側 ＨＣＴ−Ｎ−１１ Ｎ末端側 ＨＣＴ−Ｃ−１５ Ｃ末端側 ＨＣＴ−Ｍ−１６ 中央部分ＨＣＴ−Ｃ−１８ Ｃ末端側
【００３４】(３)抗体価(親和性)の測定 ０.２５ng／mlのヒト合成カルシトニン(５０μl)をＥＬ
ＩＳＡプレート(コースター社)の各ウエルに加え、３７
℃で１時間反応させて固相化抗原とした。ブロッキング
剤(３００μl)を加えて３７℃で２時間静置した。次い
で、ウエルを十分に洗浄し、各精製抗体を０.０１ng／m
l〜１０００ng／mlの濃度に調整し、５０μlずつ添加し
た。３７℃で１時間反応させたのち、パーオキシダーゼ
標識抗体抗マウスＩgＧ(Ｈ＋Ｌ鎖認識)(５０μl)を添加
し、室温で１時間静置した。ウエルを十分に洗浄したの
ち、０.４２％Ｈ2Ｏ2含有４０％Ｏ−フェニレンジアミ
ン溶液(２００μl)を加えて室温で１５分間反応させ
た。次いで、３Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、測定波
長:４９０nm、対照波長:６５５nmにおける吸光度を測定
した。
ＩＳＡプレート(コースター社)の各ウエルに加え、３７
℃で１時間反応させて固相化抗原とした。ブロッキング
剤(３００μl)を加えて３７℃で２時間静置した。次い
で、ウエルを十分に洗浄し、各精製抗体を０.０１ng／m
l〜１０００ng／mlの濃度に調整し、５０μlずつ添加し
た。３７℃で１時間反応させたのち、パーオキシダーゼ
標識抗体抗マウスＩgＧ(Ｈ＋Ｌ鎖認識)(５０μl)を添加
し、室温で１時間静置した。ウエルを十分に洗浄したの
ち、０.４２％Ｈ2Ｏ2含有４０％Ｏ−フェニレンジアミ
ン溶液(２００μl)を加えて室温で１５分間反応させ
た。次いで、３Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、測定波
長:４９０nm、対照波長:６５５nmにおける吸光度を測定
した。
【００３５】抗体量−反応性曲線を作成し(図１)、本条
件下、ＯＤ４９０／ＯＤ６５５が１.０である抗体濃度
(Ｍ)の逆数を抗体価とした。表８に示すように、得られ
たモノクローナル抗体はヒトカルシトニンに高い特異性
を示した。
件下、ＯＤ４９０／ＯＤ６５５が１.０である抗体濃度
(Ｍ)の逆数を抗体価とした。表８に示すように、得られ
たモノクローナル抗体はヒトカルシトニンに高い特異性
を示した。
【表８】表８．抗カルシトニン抗体の抗体価(親和性) クローン名 抗体価(１／モル) ＨＣＴ−Ｍ−０２ １.１６×１０10 ＨＣＴ−Ｃ−０８ ６.４７×１０10 ＨＣＴ−Ｎ−１１ ８.０５×１０8 ＨＣＴ−Ｃ−１５ １.８０×１０10 ＨＣＴ−Ｍ−１６ ３.６６×１０9 ＨＣＴ−Ｃ−１８ １.２９×１０11
【００３６】
【発明の効果】本発明により、ヒトカルシトニンに対し
て高親和性を有するモノクローナル抗体が提供された。
本発明のモノクローナル抗体を利用することにより、ヒ
トカルシトニンのための高感度かつ高精度のサンドイッ
チ法による免疫測定法を構築することが可能となる。
て高親和性を有するモノクローナル抗体が提供された。
本発明のモノクローナル抗体を利用することにより、ヒ
トカルシトニンのための高感度かつ高精度のサンドイッ
チ法による免疫測定法を構築することが可能となる。
【図１】 本発明のモノクローナル抗体について、抗体
の濃度−抗原との反応性の関係を調べた結果を示すグラ
フである。
の濃度−抗原との反応性の関係を調べた結果を示すグラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 15/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/574 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 片岡 千和 京都府京都市下京区中堂寺南町17 株式会 社関西新技術研究所内 (72)発明者 坂木 純子 京都府京都市下京区中堂寺南町17 株式会 社関西新技術研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 ヒトカルシトニンを特異的に認識するモ
ノクローナル抗体であって、ハイブリドーマＨＣＴ-Ｍ-
０２、ＨＣＴ-Ｃ-０８、ＨＣＴ-Ｎ-１１、ＨＣＴ-Ｃ-１
５、ＨＣＴ-Ｍ-１６およびＨＣＴ-Ｃ-１８からなる群か
ら選択されるハイブリドーマ細胞株によって産生される
モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 下記の性質： (a)抗原に対する親和性：８.０５×１０8〜１.２９×１
０11；および (b)ＩgＧクラス：ＩgＧ１あるいはＩgＧ２a；を有する
抗体である請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ヒトカルシトニンを抗原としてマウスを
免疫し、該マウスより得た抗体産生能を有する脾臓細胞
とマウスミエローマ細胞とを融合させて得られる、ヒト
カルシトニンを特異的に認識するモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ細胞株であって、ハイブリドー
マＨＣＴ-Ｍ-０２、ＨＣＴ-Ｃ-０８、ＨＣＴ-Ｎ-１１、
ＨＣＴ-Ｃ-１５、ＨＣＴ-Ｍ-１６およびＨＣＴ-Ｃ-１８
からなる群から選択されるハイブリドーマ細胞株。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34316596A JP4037933B2 (ja) | 1996-12-24 | 1996-12-24 | 抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体 |
| US08/997,479 US6133427A (en) | 1996-12-24 | 1997-12-23 | Anti-human calcitonin monoclonal antibodies and an immunoassay utilizing said antibodies |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34316596A JP4037933B2 (ja) | 1996-12-24 | 1996-12-24 | 抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10179186A true JPH10179186A (ja) | 1998-07-07 |
| JP4037933B2 JP4037933B2 (ja) | 2008-01-23 |
Family
ID=18359421
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34316596A Expired - Lifetime JP4037933B2 (ja) | 1996-12-24 | 1996-12-24 | 抗ヒトカルシトニンモノクローナル抗体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6133427A (ja) |
| JP (1) | JP4037933B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
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| FR2943788B1 (fr) | 2009-03-24 | 2016-12-30 | Hopitaux Paris Assist Publique | Procede de prediction d'un reflux vesico ureteral de haut grade chez les enfants avec une premiere infection urinaire febrile |
| CN102643332B (zh) * | 2011-09-15 | 2014-12-31 | 重庆业为基生物科技有限公司 | 人pct的b细胞表位肽段及其单克隆抗体的应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US4689220A (en) * | 1984-02-16 | 1987-08-25 | Unigene Laboratories, Inc. | Immunization by immunogenic implant |
| JP2955082B2 (ja) * | 1991-10-11 | 1999-10-04 | 大阪瓦斯株式会社 | ヒトカルシトニンのｎ末端部分を特異的に認識するモノクローナル抗体 |
-
1996
- 1996-12-24 JP JP34316596A patent/JP4037933B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-12-23 US US08/997,479 patent/US6133427A/en not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
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| JP4037933B2 (ja) | 2008-01-23 |
| US6133427A (en) | 2000-10-17 |
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