JP2633807B2 - 抗イデイオタイプ抗体を産生するイモータルリンパ球 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、抗原、特に腫瘍やウ
イルスに対する免疫学的反応を誘発することに関するも
のである。さらに詳細には、この発明は、このような免
疫学的反応の誘発に対するアンチイデイオタイプ抗体の
使用、並びに、抗体およびこれを産生するセルラインに
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】免疫グロブリン（Ｉｇ）のＨ鎖（Ｖ_H）
およびＬ鎖（Ｖ_L）の可変領域中のアミノ酸配列は、抗
原結合部位（すなわちパロトープ）中に、特異的な抗原
と上記抗体とを相互作用させるコンホメーシヨンを形成
する。異種の受容体動物に免疫グロブリンを注射する
と、抗ゼノタイプ（種に特異的な）、抗アイソタイプ
（免疫グロブリンのクラスに特異的な）および抗イデイ
オタイプ（抗体の可変領域に特異的な）抗体を作ること
になる。抗イデイオタイプの抗体には２種の機能的クラ
スが存在することができ、その１つはパロトープに作用
するものであり、他の１つはＨ鎖および／またはＬ鎖の
フレームワークに作用するもの（フレームワーク決定
基）である。一般的に、ジエーハ、ニユー・イングラン
ド・ジヤーナル・オブ・メデイシン（N. Engl. J. Me
d.）３０５巻２５−２８頁（１９８１年）、ジエーン、
アナレス・デ・イミノロジー（Ann. Immunol.）１２５
巻Ｃ、３７３−３８９頁（１９７４年）参照。

【０００３】

【発明の構成】この発明は、腫瘍、特に固形腫瘍のよう
な腫瘍や狂犬病ウイルスのようなウイルスに対する免疫
学的応答を誘発させる方法を提供することを目的とする
ものである。この発明は、上記のような免疫学的応答の
生起に抗イデオタイプ抗体を使用することをも目的とし
ている。さらに他のこの発明の目的は、腫瘍特に固形腫
瘍や狂犬病ウイルスのようなウイルスに対し、免疫学的
応答を誘導するのに有用なモノクローナル抗イデイオタ
イプ抗体および上記抗体のためのイモータル（不死）Ｂ
リンパ球源を提供することにある。そして、本発明にお
ける上述および他の目的は、１あるいはそれ以上の後述
の実施態様によって達成される。

【０００４】実施態様の１つとして、この発明は、腫瘍
またはウイルスから選択した抗原に対する免疫学的応答
を誘発する方法において、(a)抗イデイオタイプ抗体を
もたらし、上記抗イデイオタイプ抗体によって同定され
るエピトープは抗腫瘍または抗ウイルス抗体のパトロー
プであり、(b)上記抗イデイオタイプ抗体をひとに投与
することにより腫瘍細胞またはウイルス粒子上のエイト
ープを同定する抗（抗イデイオタイプ）抗体の産生を患
者に促すことからなる方法を提供するものである。

【０００５】この発明は、ポリクローナル抗イデイオタ
イプ抗体であって、上記抗イデイオタイプ抗体によって
同定されるエピトープが実質的に抗アイソタイプ抗体を
含まない抗腫瘍および抗ウイルス抗体のパロトープであ
るものをも提供するものである。他の実施態様として
は、この発明は、抗イデイオタイプ抗体であって上記抗
イデイオタイプ抗体によって同定されるエピトープが抗
腫瘍および抗ウイルス抗体のパロトープである抗体を産
生するイモータルＢリンパ球を提供するものである。こ
の発明はまた、上記イモータルＢリンパ球が産生し実質
的に他の抗体を含まないモノクローナル抗体を提供する
ものである。

【０００６】適当な腫瘍は、固形消火器系腫瘍のような
固形腫瘍である。適当なウイルスは、インフルエンザ、
単純性ヘルペス、肝炎、および特に狂犬病ウイルスであ
る。この発明にしたがって抗イデイオタイプ抗体を投与
すると、対象、特に哺乳類、さらにひとを刺激して、腫
瘍細胞またはウイルス粒子上のエピトープを同定する抗
（抗イデイオタイプ）抗体を産生させる。

【０００７】

【発明の詳細な記載】本発明は、がん療法およびウイル
ス免疫に対して独特な方策を提供する。従来、腫瘍療法
における方策は、腫瘍を破壊しようと意図する患者に対
し抗腫瘍抗体（すなわち、固形腫瘍細胞上のエピトープ
を同定する抗体）を投与することを意味した。従来、抗
ウイルス療法は調製ワクチンによる免疫を意味した。し
かしながら、本出願人は、腫瘍またはウイルス抗原を認
識する抗体に対して抗イデイオタイプな抗体によって、
患者自身の腫瘍あるいはウイルスに対する免疫応答を引
き起こさせうることを発見した。この免疫応答を誘導す
るのは、治療法として有益であり、少なくともウイルス
の場合には、予防法として有益である。

【０００８】出願人は、実施に関するいかなる特定の理
論とも結びつくことを望まないが、本発明によって達成
される上記免疫応答は、抗イデイオタイプ抗体分子と患
者の免疫系との間の相互作用のため起こると思われる。
抗イデイオタイプ抗体分子のイデイオタイプ（すなわち
可変）領域は、患者によって抗原と見なされる抗原決定
基（エピトープ）を含む。これは、患者に抗（抗イデイ
オタイプ）抗体の産生を誘発させる。抗（抗イデイオタ
イプ）抗体のセツトの中には、抗イデイオタイプ抗体の
パロトープに対して直接相補的なものがある。抗−イデ
イオタイプ抗体のパロトープは、イデイオタイプ抗体に
よって同定した（すなわち選択的に結合した）腫瘍細胞
またはウイルスのエピトープの「内部の」イメージを現
出させ、したがって、抗（抗イデイオタイプ）抗体は、
腫瘍またはウイルスの抗原にも結合すると考えられる。
実際、本方法は、患者の産生する抗体の一部に腫瘍また
はウイルス抗原と本質的に区別がつかない抗原（抗イデ
イオタイプ抗体のパロタイプ）を出現させることによ
り、腫瘍およびウイルスに対する免疫応答を誘発する。

【０００９】意外にも、上記方法は、腫瘍成長を抑制
し、または、ウイルスに対する免疫応答を誘発するため
の効果的方法である。さらに、多くの従来方法に対して
いくつかの長所を持っている。第１に、ほとんどの外来
抗原を患者に投与する必要がない。第２に、患者の抗イ
デイオタイプ応答が、目的とする効果に対して有利であ
り、決定的である。第３に、患者自身の抗体が抗腫瘍ま
たは抗ウイルス抗体であり、したがって、外因性抗腫瘍
抗体を繰り返し投与する必要性が除かれる。他の利点は
当業者に容易に理解される。

【００１０】抗体のイデイオタイプは、抗体分子の可変
領域またはイデイオタイプ領域における個々の明白な抗
原決定基によって定義される。これらのイデイオタイプ
抗原決定基の一部は抗体のパロトープ上またはその近接
位にあり、他のものは可変領域のフレームワーク中にあ
る。各々の抗体がそれ自身のイデイオタイプを持つが、
以下、特定の抗体は下記の用語によって示す。「イデイ
オタイプ抗体」または「Ｉｄ Ａｂ」は、抗腫瘍または
抗ウイルス抗体（すなわち、イデイオタイプ抗体によっ
て同定されるエピトープは腫瘍細胞またはウイルス粒子
上に存在する）を意味する。「抗イデイオタイプ抗体」
または「抗Ｉｄ Ａｂ」は、イデイオタイプ抗体の可変
領域上のエピトープを同定する抗体を意味する。そのよ
うな抗体の一部は、イデイオタイプ抗体のパロトープで
あるエピトープを同定し、従って、イデイオタイプ抗体
によって同定される腫瘍細胞上のエピトープの「内部」
イメージを現す。「抗（抗イデイオタイプ）抗体」また
は「抗（抗Ｉｄ）Ａｂ」は、抗イデイオタイプ抗体の可
変領域上のエピトープを同定する抗体である。抗（抗イ
デイオタイプ）抗体の一部は、(i)抗イデイオタイプ抗
体のパロトープおよび(ii)腫瘍細胞上のエピトープに対
応するエピトープを同定する。

【００１１】後記のように、この発明の方法は、宿主生
物に抗イデイオタイプ抗体を投与することを企図してい
る。抗イデイオタイプ抗体は生理学上適切な任意の担体
（例えば、滅菌した発熱性物質不含の生理食塩水）中に
入れて宿主に投与し、その製剤は当業界で公知である。
担体の選択は、限定的なものではなく、抗体は、これを
循環系に投入する任意の方法（例えば静脈内、筋肉内ま
たは皮下注射）によって投与することができる。

【００１２】宿主生物は、どんな動物でもよいが、最も
一般にはひとであり、ウイルスの場合ねこまたはいぬも
加わる。宿主に投与する大低の抗体の量は、例えば用い
られる個々の抗体および接種される患者によって、広範
囲に変化する。患者の免疫系によって抗（抗イデイオタ
イプ）抗体が産生されるのを刺激するのに十分な量の抗
イデイオタイプ抗体を投与することのみが必要条件であ
る。しかしながら、免疫反応を誘発するにはほんの少量
の抗体しか必要としないので、用いる抗体の総量は極め
て多い必要はない。多くの場合、抗体の投与量は、数マ
イクログラムから数ミリグラム（例えば約５０−２００
μgから約１−５mg）の範囲内で十分である。適当な投
与量の決定は当業者により容易になしうる。１つの実施
態様として、この発明は、ひとに抗イデイオタイプ抗体
含有製剤を投与して、腫瘍、例えば固形腫瘍（すなわ
ち、白血病のような分散性循環性悪性細胞ではなく、が
ん、肉腫、メラノーマ等によって生ずる悪性細胞の固形
塊）に対する免疫応答を起すことを意図している。好ま
しい実施態様では、腫瘍は胃腸の腫瘍である。

【００１３】上記のように抗イデイオタイプ抗体のサブ
クラスは、抗腫瘍抗体のパロトープ（イデイオタイプ抗
体）と選択的に結合（すなわち同定）する。抗イデイオ
タイプ抗体を含む製剤は、抗イデイオタイプ抗体のパロ
トープがウイルス抗原の内部イメージである宿主に投与
することができる。このような抗体は、対応するイデイ
オタイプ抗体のパロトープであるエピトープを認識す
る。腫瘍またはウイルス抗体の内部イメージを現す抗イ
デイオタイプ抗体は、数種の方法のうち任意のものによ
ってイデイオタイプ抗体の可変領域におけるフレームワ
ーク決定基を認識する抗イデイオタイプ抗体と識別する
ことができる。希望する抗イデイオタイプ抗体を同定す
る方法の１つには、腫瘍またはウイルス抗原（または入
手可能であれば、ハプテン）、イデイオタイプ抗体、お
よび抗イデイオタイプ抗体との間の競合結合分析があ
る。もし抗原がイデイオタイプ抗体に対する抗イデイオ
タイプ抗体の結合を妨害するなら、抗イデイオタイプ抗
体で同定されるエピトープは、イデイオタイプ抗体のパ
ロトープと近い関係にある。別の試験方法は、抗イデイ
オタイプ抗体に対する抗血清が抗腫瘍またはウイルス抗
体でもあるかどうかを決定するものである。適当な抗イ
デイオタイプ抗体を同定する上記および他の方法は、当
業者に公知の範囲内にある。宿主に投与する製剤は、フ
レームワーク決定基に対する抗−イデイオタイプ抗体と
共に、イデイオタイプ抗体のパロトープに対するサブク
ラスを包含することができる。製剤が、イデイオタイプ
抗体のパロトープに対するサブクラスを包含することだ
けが必要である。

【００１４】用いられた抗イデイオタイプ抗体は、宿主
に対し同種または異種抗体であってよい。しかしなが
ら、ひとにとって好ましい抗体は、抗体分子のＣ領域に
対する免疫反応が最小であるひと抗体である。しかし、
この発明においては比較的少量の抗イデイオタイプ抗体
しか必要としないので、異種抗体（例えば、マウス、ラ
ツト、やぎ、家兎など）を用いてよい。また、異種抗イ
デイオタイプ抗体に対して重要な反応がない場合には、
このような抗体は製造の容易さおよびコストの点から好
ましい場合がある。さらに、モノクローナル抗イデイオ
タイプ抗体と同様に、ポリクローナル抗イデイオタイプ
抗体を用いることができる。

【００１５】ポリクローナル抗イデイオタイプ抗体は、
当業界で知られた従来法によって製造できる。例えば、
ポリクローナル抗Ｉｄ Ａｂは、動物をモノクローナル
抗腫瘍またはウイルス抗体（例えば、Ｉｄ Ａｂ）で免
疫することによって産生できる。免疫した動物は、抗Ｉ
ｄ Ａｂを産生する。この抗血清中の抗イデイオタイプ
抗体のサブクラスは、抗腫瘍またはウイルス抗体のパロ
トープであるエピトープを同定する。例えば、動物から
採取した抗血清は、(i)抗血清から抗アイソタイプ抗体
を除去するための、モノクローナルＩｄ Ａｂとしては
同じアイソタイプであるが、別のイデイオタイプの固定
化抗体、および、(ii)そのサブクラスが腫瘍およびウイ
ルス抗原の内部イメージを現す抗Ｉｄ Ａｂを除去する
ための、固定化モノクローナルＩｄ Ａｂを用いた、系
列吸収によって精製できる。次いで、抗Ｉｄ Ａｂを結
合モノクローナル抗腫瘍およびウイルス抗体から溶離し
て抗アイソタイプ抗体を実質的に含まない溶液を得る。
この溶液は、Ｉｄ Ａｂのパロトープを同定する抗Ｉｄ
Ａｂの存否を分析することができる。

【００１６】実質的に他の抗体を含まないモノクローナ
ル抗イデイオタイプ抗体は、イモータルＢリンパ球を実
質的に純粋培養した上清から単離される。「イモータル
Ｂリンパ球」の語は、ハイブリドーマ（体細胞が、正常
および悪性リンパ球と交雑したもの）および、ウイルス
（例えば、エプスタイン・パール・ウイルス）または発
癌性ＤＮＡによって形質転換された正常リンパ球のよう
な、数ケ月間（好ましくは無限に）培養物中に維持され
うる比較的安定した連続抗体産生細胞を包含する。抗イ
デイオタイプ抗体を産生する正常Ｂリンパ球からイモー
タルＢリンパ球を産生する技術は当業界で公知である。
「モノクローナル・アンテイボデイーズ」（アール・エ
イチ・ケネツト、テイ・ジエイ・マクリーンおよびケイ
・ビー・ビートル編，１９８０年）；エム・シユライヤ
ーら著、「ハイブリドーマ・テクニツク」（コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー，１９８０年）；
「モノクローナル・アンテイボデーズ・アンド・テイー
セル・ハイブリドーマズ（ジー・ジエイ・ハーマーリン
グ、ユー・ハーマーリングおよびジエイ・エフ・キーネ
イ，１９８１年）；ユズバーら著、プロシーデイング・
オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス（ア
メリカ、１９８２年）７９巻６６５１−６６５５頁；ジ
ヨナら著、「ハイブリ−ドーマ」（１９８３年）２巻１
２４頁；「モノクローナル・アンテイボデイズ・アンド
・フアンクシヨナル・セル・ラインズ」（アール・エツ
チ・ケネツト、ケー・ビー・ビートルおよびテイ・ジエ
イ・マツキーン編，１９８３年）；コズバーら著、「イ
ムノロジー・ツデイ」（１９８３年）４巻７２−７９頁
を参照。

【００１７】抗Ｉｄ Ａｂを産生し、イモータルＢリン
パ球の産生に適している正常Ｂリンパ球は、当業界で公
知な方法の変法で提供される。例えば、ラツトまたはマ
ウスのような動物をモノクローナル抗腫瘍または抗ウイ
ルス抗体で免疫し、抗ＩｄＡｂを産生するＢリンパ球を
動物の脾臓から採取することができる。抗Ｉｄ Ａｂを
産生するひとＢリンパ球は、モノクローナル抗腫瘍また
はウイルス抗体を用いて患者を免疫することによって得
られる。患者から末梢血リンパ球を採取し、モノクロー
ナル抗腫瘍またはウイルス抗体によって培養物を刺激し
て抗−ＩｄＡｂを産生するＢリンパ球のインビトロでの
生育を誘導する。デフレイテスら著、プロシーデイング
・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（アメリカ，１９８２年）７９巻，６６４６−６６５０
頁参照。従って、抗Ｉｄ Ａｂを産生する、動物または
ひとのＢリンパ球は、当業界で公知の方法により採取し
固定することができる。もちろん、腫瘍細胞またはウイ
ルス抗原の内部イメージを現出する抗Ｉｄ Ａｂを産生
するこれらのリンパ球は、イデイオタイプ領域上のフレ
ームワーク決定基に対する抗Ｉｄ Ａｂを産生するＢリ
ンパ球と区別されることが必要である。

【００１８】腫瘍に適用するこの発明の方法はまた、ア
メリカ特許第４１０８９８３号に記述されるウイルス性
腫瘍細胞破壊ワクチンの様な、腫瘍に対する免疫反応を
誘発する他の方法と共に実施することができる。ウイル
スに関しては、ウイルスの場合、所望により、宿主哺乳
類でおこる免疫応答は上述と同様に抗Ｉｄ Ａｂを投与
することに加えて公知のウイルスワクチンで免疫するこ
とによっていっそうさかんになる。抗（抗Ｉｄ Ａｂ）
の産生が抗Ｉｄ Ａｂを投与することによって宿主哺乳
類に誘発された後（例えば投与後約２週間）、宿主に当
業界で公知の従来技術を用いてウイルス・ワクチンの１
回接種を行う（例えば、ＨＤＣ狂犬病ワクチンのような
不活性化ウイルスワクチン）。プロツキンら著、アメリ
カン・ジヤーナル・オブ・エピデミオロジー（１９７６
年）１０３巻，７５−８０頁；ウイクターら著、ラビー
ズ・ワクシン・フオー・ヒユーマン・ユース，４０号３
−９頁（１９７８年）参照。投与におけるワクチンの型
および実験方法はこの分野の技術で公知である。次に示
す例は、本発明の説明であり、発明の範囲を限定するも
のではない。

【００１９】実施例１ 腫瘍抗体 （モノクローナルイデイオタイプ抗体）次に示す実験で
は、ひと消化器系癌細胞と結合するマウス・モノクロー
ナル抗体１７−１Ａ、Ｃ₄２０３２およびＣ₄１４７２を
使用した。これらは、ハーリンら著、プロシーデイング
・オブ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（アメリカ、１９７９年）７６巻１４３８−１４４２頁
およびコプロフスキー著、モノクローナル・アンテイボ
デイ・イン・キヤンサーの中で「生体内でのモノクロー
ナル抗体」として；プロシーデイング・オブ・ザ・フオ
ース・アーマンド・ハーマー・キヤンサー・シンポジウ
ム（ビー・ボス、アール・ラングマン、アイ・トロウブ
リツジおよびダルベツコ編、１９８３年）に記述されて
いる。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、Ｃ₄２０３２は
Ｍr１８０、１６０、５０および４０Ｋの結腸直腸癌腫
（ＣＲＣ）結合抗体に対する特異性を有している。ＭＡ
ｂ Ｃ₄１４７２（ＩgＧ２a）は、ＣＲＣ結合抗原Ｍr５
０Ｋに対する特異性を有している。肝炎ウイルスに対す
るＭＡｂ Ａ５Ｃ３も用いられるが、これについてはバ
ンズら著、プロシーデイング・オブ・ナシヨナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス（アメリカ、１９８１年）７
８巻、１２１４−１２１８頁で記述されている。ＭＡｂ
１７−１Ａ（ＩgＧ２Ａ、κＬ鎖）およびＣ₄２０３２
（ＩgＧ２a、κＬ鎖）は、アイら著、イムノケミストリ
ー（１９７８年）１５巻、４２９−４３６頁で記述され
ているようにプロテインＡ・セフアロース・カラム（フ
アルマシア、ピスカトアウエイ、ニユージヤージー）で
アフイニテイークロマトグラフイーにかけることによっ
て、ハイブリドーマ担持マウスから得た腹水から精製さ
れる。

【００２０】（患者）患者は全て転移性で再発性の結腸
直腸腺癌を持っていて、シアーズら著、ランセツト（１
９８２年）７６２−７６５頁で発表されている方法を用
いて、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの腹水から濃縮したＭＡｂ
１７−１Ａの精製された発熱性物質不含の滅菌製品を１
回の投与で全身的に注射した。Ｍａｂ１７−１Ａ １９
２mg以下を注入した９患者のうち７患者は抗マウスグロ
ブリン抗体を発生した。モノクローナル抗体２００−１
０００mgを受けた２０患者のうち、３患者が抗マウスグ
ロブリン抗体を発生した。抗マウスグロブリン分子を発
生した最初のグループの３患者（患者番号０７、０８お
よび０９）の血清および２番目のグループの２患者（番
号１４および２３）の血清を、抗イデイオタイプ抗体を
単離するために選択または処理した。患者番号０７、０
８および２３から抗イデイオタイプ抗体を単離するため
に用いた血清は、３患者すべてが高濃度の抗マウスグロ
ブリン抗体を示した時に得られた。患者番号０８は、最
初の注射の後２０ケ月目にモノクローナル抗体１３０mg
の２回目の注射を受け２回目の注射の後得られた血清を
抗イデイオタイプ抗体の存否を調べるスクリーニングテ
ストに用いた。

【００２１】（ポリクローナル抗−イデイオタイプ抗体
の製造）精製したＭＡｂ １７−１Ａ ３００μgをフロ
イント混合アジユバントで乳化したものを、ニユージラ
ンド白うさぎの多部位に皮下注射し、３０日後モノクロ
ーナル抗体１００μgを筋肉注射で増強した。二度目の
反応の１０日後血清を採取した。抗血清を固定化ＭＡｂ
Ｃ₄２０３２およびＭＡｂ １７−１Ａで吸収させた。
精製モノクローナル抗体（各々３０mg）を、アフイ・ゲ
ル１０〔バイオ−ラツド・ラボラトリーズ、リツチモン
ド、カリフオルニア（Bio-Rad Laboratories, Richmon
d, CA）〕２mlと結合させた。ついで、抗血清を、抗ア
イソタイプおよび抗イデイオタイプ抗体をそれぞれ取り
除くために免疫吸着剤ＭＡｂ Ｃ₄２０３２およびＭＡ
ｂ １７−１Ａに連続吸収させた。吸収した抗体を、
０.１Ｍグリシン緩衝液（pＨ２.８）で溶出し、直ちに
燐酸緩衝液で中和し、燐酸緩衝生理食塩水で透析し、蛋
白質を２８０nm（Ｅ_-280 ^1%＝１４）の吸光度で定量し
た。

【００２２】ＭＡｂ １７−１Ａを１回注射した後患者
から得られた抗血清も、上で述べたと同様にして精製し
た。それぞれＭＡｂ １７−１Ａを７５０mgを投与した
患者番号２３およびＭＡｂ １７−１Ａを１３３および
１２５mg投与した患者番号０８およびＮo.０７由来の血
清は、抗体を最初に注射した後、種々の時期に採取し
た。ラジオイムノアツセイ法によって抗ムリンＩgＧ抗
体を含有していることが分かった試料を、それぞれ上述
と同様に抗アイソタイプおよび抗イデイオタイプ抗体を
除去するために、免疫吸着剤ＭＡｂ Ｃ₄２０３２およ
びＭＡｂ １７−１Ａで十分に吸収させた。血清から分
離した抗イデイオタイプ抗体は、¹²⁵Ｉでラベルした抗
ひとＦ（ab′)₂フラグメントに結合することにより免疫
グロブリンであることを示した。血清試料から得た抗イ
デイオタイプ蛋白の収量はそれぞれ異なって、Ｎo.０８
より１３μg／ml、Ｎo.０７より８.９μg／ml、および
Ｎo.２３より４３μg／mlであった。最も高い水準の抗
マウス免疫グロブリン抗体を示した血清Ｎo.２３から最
も多くの量が得られた。

【００２３】（抗イデイオタイプ抗体の存否を調べるた
めの血清スクリーニング法）血清試料について抗イデイ
オタイプ抗体の存否を調べるために、競合分析を、¹²⁵
ＩでラベルしたＭＡｂ １７−１Ａと予備インキュベー
トした４種のひと血清と家兎抗イデイオタイプ抗体を用
いて行った。４分の１インチ（６.３５mm）粒径のポリ
スチレン・ビーズ〔プレシジヨン・プラステツク・ボー
ル・コーポレイシヨン、シカゴ、イリノイ（Precision
Plastic Ball Co., Chicago, IL）〕を９５％エタノー
ルで３回洗浄した。風乾したビーズを、０.０２Ｍテト
ラほう酸ナトリウム（pＨ８.２）で希釈した家兎または
ひとの抗イデイオタイプ抗体と共にインキュベートし
た。緩やかに振とうしながら４℃で一夜培養した後、ビ
ーズを燐酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、２％うし血清
アルブミンおよび０.０４％ＮaＮ₃を含有する燐酸緩衝
生理食塩水を用いて、室温で少なくとも３時間インキュ
ベートした。ついで、ビーズをひと抗イデイオタイプ抗
体源と予備インキュベートしたイデイオタイプの基準と
して¹²⁵ＩでラベルしたＭＡｂ １７−１Ａに露した。
すなわち、ひと血清をＣa²⁺およびＭg²⁺を含まない燐酸
緩衝生理食塩水で２５％の濃度に希釈し、２％うし血清
アルブミンおよび０.０４％ＮaＮ₃を補った。さらに一
夜培養を続けた後、ビーズを洗浄し、ガンマー線測定器
で結合放射能を測定した。

【００２４】モノクローナル抗体（番号２３、０９また
は１４）１回注射後に得られた血清中３つは、モノクロ
ーナル抗体注射前より高いＭＡｂ １７−１Ａに対する
結合阻害を示した。患者番号１４のモノクローナル抗体
注射後血清が得た結合阻害値は、他の２種の血清に比べ
て低いが、同じ患者の血清が示すモノクローナル抗体投
与前の値よりも高かった。モノクローナル抗体を２回目
に注射して７日後の患者番号０８から得た血清の阻害値
は、既に高かった。

【００２５】（抗イデイオタイプ検出の競合分析）モノ
クローナル抗体Ｃ₄２０３２、Ｃ₄１４７２およびＡ５Ｃ
３に対してと同様にＭＡｂ １７−１Ａに対して、分離
した抗イデイオタイプ抗体の結合を測定するために上述
と同様な方法で競合分析を行った。結果は、３種の血清
（番号０８、０７および２３）由来の抗イデイオタイプ
抗体のＭＡｂ １７−１Ａに対する結合性は、他の３種
のモノクローナル抗体に対するより顕著に高いことを示
し、他の２種のモノクローナル抗体（Ｃ₄２０３２およ
びＣ₄１４７２）も、結腸直腸の癌腫細胞上の抗原部位
を検出した。しかし、これらの部位はＮＡｂ １７−１
Ａ認識部位と異なっていた。ＭＡｂ １７−１Ａにさら
す前に３人の患者すべての血清から分離した免疫グロブ
リンを約２.５μg／mlに濃縮し、ポリスチレン・ビーズ
に結合した。しかしながら、上記製品は試験したどのモ
ノクローナル抗体とも結合せず、処理前の血清中に抗イ
デイオタイプ抗体が存在しないことを示した。

【００２６】（ひと抗イデイオタイプ抗体同志の交叉反
応性 ひと抗イデイオタイプ抗体同志の交叉反応があるか否か
を決定するために競合分析を行った。競合分析の結果
は、下に示すように、患者番号０７および２３の抗イデ
イオタイプ血清間で顕著な交叉反応を示し、患者番号０
８および２３の抗イデイオタイプ抗体間の交叉反応は少
し弱い（しかし、それでも重要である）。同様の交叉反
応が、患者番号０８から得たモノクローナル抗体処理前
血清と患者番号０７の抗イデイオタイプ血清との間に見
られた（結果は示さない）。上述の結果は、他の患者が
産生した抗イデイオタイプ抗体が、同じ抗原部位に向け
られることを示している。

【００２７】

【表１】 １回目の抗体 ２回目の抗体の血清 結合cmp ＭＡb 17−1Ａ結合阻害％ なし ４２９７ 抗−Ｉd ２３ ０７ 前 ４５９５ ０ 後 １２３１ ７１ ０８ 前 ４０９７ ５ 後 ２５８５ ４０

【００２８】（抗イデイオタイプ抗体によって検出され
たエピトープ）ＭＡｂ １７−１Ａに対するひと抗イデ
イオタイプ抗体の結合のパプテン阻害は、抗イデイオタ
イプ抗体がイデイオタイプ抗体のパロトープに対するも
のであることを示すために行った。結腸直腸の癌から得
た細胞株、ＳＷ １２２２の３ＭＫＣl抽出物を、ハーリ
ンら著、〔ジヤーナル・オブ・クリニカル・イムノロジ
ー（J. Clin. Immunol.）２巻１３５−１４０頁〕で述
べられているのと同様に調製した。この製剤はＭＡｂ
１７−１Ａに結合し、この材料が可溶性の抗原を含有す
ることを示した。¹²⁵ＩでラベルしたＭＡｂ １７−１
ＡをＣＲＣ細胞抽出物およびＭＡｂ １７−１Ａに結合
しないメラノーマの３Ｍ ＫＣl抽出物とインキュベー
トした。それから、抗体抗原混合物を、患者番号２３か
ら得た抗イデイオタイプ抗体で被覆したビーズに加え、
その結合を放射性同位元素で標識したモノクローナル抗
体のみの結合と比較した。これらの実験は、少量の競合
ハプテンによる結合の変化を検出するために、非飽和量
のよう化モノクローナルを用いて行った。対照として、
よう化ＭＡｂ １７−１ＡをＭＡｂ １７−１Ａとは結
合しないことが知られているメラノーマ由来の抽出物と
混合した。濃度０.１または０.５mg／mlのＣＲＣ細胞抽
出物は、それぞれ３９％および６８％で、患者番号２３
由来の抗イデイオタイプ抗体がよう化ＭＡｂ １７−１
Ａと結合するのを阻害することが分かった。メラノーマ
由来の抽出物は、０.５mg／ml以下の濃度では、顕著に
はモノクローナル抗体結合に効果を表さない この結合反応のハプテン阻害は、抗イデイオタイプ抗体
上のＣＲＣエピトープの「内部イメージ」の現出を示
す。このことは、ＣＲＣ細胞抽出物が抗イデイオタイプ
抗体と結合しないが、予想したようにＭＡｂ １７−１
Ａに結合することによっても確認された。

【００２９】（ひとＢリンパ球による抗イデイオタイプ
および抗（抗イデイオタイプ）抗体の産生）ＭＡｂ １
７−１Ａを注射後、各々１２および６か月目の患者番号
０８および２３から軟膜細胞を得た。デフレイタスら
著、プロシーデイング・オブ・ナシヨナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（アメリカ、１９８２年）７９巻６
６４６−６６５０頁に述べられているように１７−１Ａ
の１０ng／ml Ｆ（ab′)₂フラグメントで細胞を刺激し
た。続く７日間、細胞の一定量を２−アミノエチルイソ
ウロニウムブロミドで処理したひつじ赤血球でロゼツト
化することによってＴおよびＢ細胞ポピユレーシヨンに
分離した。〔ペロリーノら著、クリニカル・イムノロジ
ー・アンド・イムノパスオロジー（１９７５年）３巻３
２４−３３３頁を参照。〕どちらの細胞ポピユレーシヨ
ンも１７−１ＡのＦ（ab′)₂フラグメントまたは抗−イ
ンフルエンザ・モノクローナル抗体およびやぎ抗マウス
Ｉg−ＦＩＴＣで着色された。ついで細胞ポピユレーシ
ヨンをシトフルオログラフで分析した。さらに、同一患
者由来の末梢血単核細胞を１７−１ＡのＦ（ab′)₂フラ
グメントまたは抗インフルエンザ・モノクローナル抗体
でデフレイタスら著（上述の文献）に述べられている特
異的ひとＩgを産生修飾ミツシエル−ダツトン培養基中
で９日間刺激した。これらの培養物から得た上清を特異
的ひとＩgＧに対する固相酵素結合免疫吸収分析で分析
した。〔ケイ・ピー・エル・ラボラトリーズ、ゲテルス
ブルグ、エム・デイ（KPL Laboratories, Gaithersbur
g, MD）〕

【００３０】患者番号０８の１７−１Ａ Ｆ（ab′)₂に
初めに結合するリンパ球の比率は１.２％であり患者番
号２３のリンパ球は０.２％であった。ＭＡｂ １７−
１Ａとインキユベートした７日間で１７−１ＡのＦ（a
b′)₂と特異的に結合する患者番号２３のリンパ球の比
率は、０.２％から１３％に増加した。１７−１Ａと結
合する細胞すべては、Ｂ細胞ポピユレーシヨン中に存在
した。さらに９日後、ひと抗−ＭＡｂ １７−１Ａ Ｉ
gＧが検出された。同条件下で抗インフルエンザ・モノ
クローナル抗体を用いて同じ患者由来のリンパ球をイン
キユベートしてもＭＡｂ １７−１Ａまたは抗インフル
エンザ・モノクローナル抗体に対する検出可能なひとＩ
gを全く産生しなかった。別の実験で、抗（抗イデイオ
タイプ）抗体を産出するためにひとＢリンパ球を刺激し
た。Ｂリンパ球を集め、イデイオタイプ抗体ではなく自
家性抗イデイオタイプ抗体で刺激した点を除いて、上述
の方法を用いてインビトロで刺激した。刺激したＢリン
パ球によって抗（抗イデイオタイプ）抗体を産生し、こ
れらの抗（抗Ｉｄ）ＡｂはＣＲＣ細胞抽出物および全細
胞上にあるエピトープを同定することが示された。こう
して、ひと免疫系は抗イデイオタイプ抗体で刺激するの
に応答して抗腫瘍抗体を産出する。

【００３１】（抗イデイオタイプ抗体を産生するイモー
タルＢリンパ球）モノクローナル抗体を分泌するイモー
タルＢリンパ球を産生する多くの方法は既知技術であ
る。コズバーら著、〔イムノロジー・ツデイ（Immunolo
gy Today）４巻７２−７９頁〕を参照。したがって、上
述のように末梢血リンパ球から得た抗（抗イデイオタイ
プ）抗体を分泌するひとＢリンパ球は、既知技術の１つ
によりイモータル化することができる。容易に使用でき
る方法の１つは、ＥＢウイルス（ＥＢＶ）を用いてイモ
ータル化することである。この方法によると、上述の正
常リンパ球をインビトロでＥＢＶに感染させ、イモータ
ル細胞株が、例えば栄養層上で限界希釈することによっ
て確立される。コジバーら著、〔上述の文献（１９８３
年）〕を参照、およびその中で引用された参照文５１−
６０頁を参照。

【００３２】別の方策としては、ひとプラズマサイトー
マまたはリンポブラストイド融合パートナーと、上述の
抗−Ｉｄ Ａｂ分泌リンパ球またはＥＢＶ形質転換リン
パ球のどちらかを融合するものがある。例えば、抗−Ｉ
ｄ Ａｂを分泌するＥＢＶ−形質転換Ｂリンパ球は、ひ
とリンポブラストイドセルラインＫＲ−４などと結合で
きる。ついで目的とするハイブリドーマが親の細胞を除
外するウアバイン含有ハイポキサンチン−アミノプテリ
ン−チミジン培地中で選択される。ハイブリドーマの特
異的抗体産生を試験する。そして陽性ハイブリドーマを
免疫抑制した哺乳動物（例えば、ヌード・マウス）の腹
腔または大量の培地中でクローン化、再クローン化およ
び増殖する。コツバーら著、プロシーデイング・オブ・
ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス（１９８２
年）７９巻６６５１−６６５５頁を参照。

【００３３】実施例２ウイルス抗体 （抗イデイオタイプ抗体の製造）狂犬病ウイルスグリコ
プロテイン（Ｇ）のエピトープを再構成するために種々
のモノクローナル抗体（mＡb）に対応して作られた抗イ
デイオタイプ抗体（抗−Ｉｄ Ａｂ）の能力を研究し
た。このＧは、ウイルス中和抗体（ＶＮＡ）を誘発する
ことを含めて、多数の狂犬病ウイルスの重要な生物学的
特性に応答する。Ｇのどの部分が上記の機能に応答する
かということについては現在では正確には知られていな
い。ラーフンら、ジャーナル・オブ・ゼネラル・バイラ
ロジー（１９８３年）６４巻８４３−８５１頁は、タイ
プ特異性ＶＮＡに対し少なくとも３つの主な抗原部位の
存在を示唆する、狂犬病ウイルスＧのチャレンジ・ウイ
ルス・スタンダード（ＣＶＳ）株に対する機能性エピト
ープマットを記載している。

【００３４】機能的エピトープマツトにより定義される
狂犬病ウイルス上の結合部位およびアイソタイプ（プロ
テインＡ・セフアロース・クロマトグラフィーによって
精製可能）に基づいて大パネルのハイブリドーマの中か
ら５つの抗ＧmＡbを選び出した。抗狂犬病ウイルスＧm
Ａbの５０９−６、１０１−１、５０７−１および７１
９−３はすでに記載されている。ラーフンら著；〔上述
の文献〕、およびウイクターら著〔ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン（１９８０年）１５２
巻：９９−１１２頁参照。狂犬病ウイルスの感染を強力
に中和するこれらのmＡbは、以下に示す性質を有してい
る。：５０９−６（エピトープマップ部位Ｉ；ＩgＧ２
a）、１０１−１（エピトープマツプ部位IIb；ＩgＧ２
a）。

【００３５】５０７−１（エピトープマップ部位IIIb；
ＩgＧ１）および７１９−３（エピトープマツプ部位II
c；ＩgＧ２a）抗ＧmＡb １１０４−２（ＩgＧ１）はＰ
３×６３Ａｇ８マウスミエローマ細胞の変異株６５３と
狂犬病ウイルスで免疫したＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾
臓細胞を付加的に融合して得られた。ウイクターら著；
〔プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（アメリカ、１９７８年）７５巻３９
３８−３９４２頁によるカーネイら著；〔ジャーナル・
オブ・イムノロジー（１９７９年）１２３巻：１５４８
−１５５０頁〕。抗Ｇ分泌ハイブリドーマ細胞を選択
し、限界希釈およびウイクターら著；（上述の文献）
（１９７８年）にすでに記述されている様に調製した腹
水でクローン化する。１１０４−２ ｍＡｂはＥＲＡウ
イルスと非常によい結合性を示すが中和性に乏しいので
選ばれた。抗狂犬病ウイルスのヌクレオカプシド ｍＡ
ｂ ５１５−３（ＩｇＧ２ａ）および３８９−１（Ｉｇ
Ｇ１）を、同様の技術でケルブのウイルスで免疫したＢ
ＡＬ Ｂ／ｃマウスから分離した。用いた狂犬病ウイル
スのＥＲＡまたはＣＶＳ株のストックは標準方法により
ＢＨＫ−２１中で増殖させた。ウイクターら著、ラボラ
トリー・テクノロジー・イン・ラビーズ１０１−１２３
頁（エム・キヤプラン・アンド・エイチ・コプロスキー
（第３版編集、１９７３年）を参照。狂犬病抗原変異株
であるＥＲＡ ＲＶ１９４−２およびＲＶ５０９−６は
それぞれ抗−ＧｍＡｂ１９４−２および５０９−６によ
る中和に耐性であるウイルスを表すものとして報告され
ている。デイーツスコルドら著、プロシーデイング・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（アメ
リカ、１９８３年）８０巻７０−７４頁を参照。狂犬病
グリコプロテイン（Ｇｓ）は、デイーツスコルドらがバ
イオロジー（１９８３年）１２４巻３３０−３３７頁に
記載しているように免疫吸収クロマトグラフィーを用い
てウイルス粒子涸渇培地から精製した。

【００３６】抗ＧｍＡｂは全て腹水から精製した。アイ
ソタイプＩｇＧ２ａの抗体はブリトン−ロビンソン緩衝
液（ｐＨ.８.０）で約３０分の１に希釈した。ゲルハー
ドら著、モノクローナル・アンテイボデイ３１７−３３
３頁、（アール．ケネツト・テイ．マツキーン・アンド
・ケイ．ベツチトル編（１９８０年）を参照。ＢＲＢ中
のｍＡｂはナエイルジン０.４５μ濾紙を通し、プロテ
インＡをセフアロース４Ｂ吸着カラム〔フアルマシア・
ピスカトアウエイ，ニユージヤージー（Pharmacia，Pis
cataway，N.J.)にかけた。抗体をｐＨ３.０でＢＲＢに
溶出する前にＢＲＢ（ｐＨ８.０）３０mlでカラムを洗
浄した。最初にアイソタイプＩｇＧ１の抗ＧｍＡｂを最
終濃度１８％（重量比）になるまで硫酸で沈殿させた。
Ｉｇ分画を溶解し、ＢＲＢ（ｐＨ８.０）で透析し、前
と同様にプロテインＡセフアロース・カラムに通した。
カラムから溶出したＩｇを、抗原としてＥＲＡウイルス
を使うラジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）によって検出し
た。デイツスコールドら著〔ジヤーナル・オブ・バイラ
ロジー（１９８２年）４４巻５９５−６０２頁〕を参
照。抗体を燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），（ｐＨ７.
４）で真空透析して濃縮した。蛋白濃縮物は基準として
うし血清アルブミンを用いて定量した。ブラムホールら
著、アナリテイカル・バイオケミストリ（１９６９年）
３１巻１４６−１４８頁参照。

【００３７】抗Ｉｄ Ａｂは、スタウトら著、ジヤーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メデイシン（１９８３
年）１５７巻６８７−７０４頁で述べられている様に調
製した。簡単に言えば、雌ニユージーランド白兎を、フ
ロイントの完全アジユバンド（ＦＣＡ）で乳化させたプ
ロテインＡセフアロース精製ｍＡｂ ３００μgで、乳
房鎖にそって多数の部位に皮下注射した。ＰＢＳ中の抗
体１００μgで２回の追加抗原を７および３０日筋肉内
投与し、血清はその１０日後採取した。抗アイソタイプ
Ａｂを除去するためにｍＡｂ ５１５−３（ＩｇＧ２
ａ）または３８９−１（ＩｇＧ１）のいずれかと結合さ
せたセフアロース４Ｂカラムにかけて、各々の抗イデイ
オタイプ抗血清をイデイオタイプ領域に対して特異的に
させた。上記カラムから得た溶出物はイデイオタイプ決
定基に対し反応性のある抗体を含有していた。一定領域
に対する抗体を、０.１Ｍジエチルアミン（ｐＨ１１.
５）でｍＡｂ ５１５−３および３８９−１免疫吸収カ
ラムから溶出した。各々の抗ＩｄＡｂ由来のＩｇＧを上
述と同じ様にプロテインＡセフアロース・クロマトグラ
フィーによって分離した。カラム流出液の非イデイオタ
イプ決定基に対する反応性は無視できるものであった。

【００３８】（抗イデイオタイプ抗体の確認）上で調製
した抗ＩｄＡｂの特異性および種々の抗ＧｍＡｂの中で
のイデイオタイプ交叉反応の存在は、ＲＩＡで各抗Ｉｄ
Ａｂ製品について測定した。固相ＲＩＡを固定ＭＡｂに
対する抗ＩｄＡｂの結合を測定するために使用した。個
々のｍＡｂを次に示すように炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液
（ｐＨ８.９）中で腹水濃度に応じて希釈した。５０９
−６（１：３０００），１０１−１（１：６０００），
７１９−３（１：６０００），５０７−１（１：６００
０），１１０４−２（１：１６０００）。ついで、各２
５μlずつポリビニル微量滴定平板（ダイナテク・ラボ
ラトリーズ製）のウェルに加えた。これらの抗体は３７
℃で一夜インキュベートしウェルに乾かした。ウェル上
の遊離結合部位は少なくとも１時間０.０８％アジ化ナ
トリウムを添加した燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＮ）中
で１０％無ガンマ・うま血清（ギブコ・ラボラトリーズ
製）でブロックした。抗ＩｄＡｂの希釈液２５μlを加
え、室温で１時間後プレートを充分洗浄した。結合した
抗ＩｄＡｂは、よう素化法で標識した¹²⁵Ｉやぎ抗家兎
ＩｇＧ（カツペル・ラボラトリーズ製）を２５μg（３
００００カウント／分）加えることによって検出し、室
温でさらに１時間インキュベートした。Markwellら著、
〔バイオケミストリー（Biochemistry、１９７８）１７
巻：４８００−４８１７頁参照。抗ＩｄＡｂ希釈液また
は放射能標識したプローベの全てをＰＢＳＮ中に１０％
無ガンマ・うま血清で作った。非結合プローベがなくな
るまでプレートを洗い、それぞれのウェルに結合した放
射能をガンマ線カウンターで測定した。

【００３９】同種および異種ｍＡｂで各々の抗ＩｄＡｂ
製品を滴定した結果各抗ＩｄＡｂが同種ＩｄｍＡｂに対
して特異的であることがわかった。

【００４０】（イデイオタイプ抗体のパロトープに対す
る抗イデイオタイプ抗体の定量）競合ＲＩＡ法を、Ｉｄ
Ａｂおよび抗ＩｄＡｂ間の相互作用に対する狂犬病ウイ
ルスＧの阻害能を試験するために考案した。Chaflinら
著、ジヤーナル・オブ・イムノロジー（J．Immunol．、
１９７４年）１１２巻：１７４７−１７５６頁、およ
び、Sherら著、ジヤーナル・オブ・イムノロジー（J．I
mmunol．、１９７２年）１０９巻：１７６−１７８頁参
照。

【００４１】狂犬病Ｇｓを競合抗原として用いた。標準
抗ＩｄＡｂ希釈液を添加する前に、Ｇｓの２倍系列希釈
液と共に予備滴定レベルのｍＡｂを１時間インキュベー
トした。結合抗血清の量を¹²⁵Ｉで標識したやぎ抗家兎
抗体を結合させることによって定量した。対応する抗Ｇ
ｍＡｂ（５０９−６、５０７−１、および１１０４−
２）に対する５種中３種の抗ＩｄＡｂの結合をＧｓが阻
害した。最大阻害は、６μg／mlＧｓの量で２０〜５０
％に変化するが、僅か０.７５μg／mlＧｓ程度でも少な
くとも１５％の減少が観察された。抗ＩｄＡｂの結合を
全面的に阻害するのが不可能なことは、フレームワーク
とパロトープ部位の両特異性が３種のポリクローナル抗
Ｉｄ血清に存在することを示す。このことは、還元また
は非還元状態でドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離
したｍＡｂと抗ＩｄＡｂの反応性を測るウエスタン・ブ
ロツト測定法によって確認された。抗原結合部位はｍＡ
ｂの還元によって除去されるので、還元ｍＡｂに対する
抗ＩｄＡｂの反応性はフレームワーク決定基に対する特
異性を示したことになる。Ｇｓによる抗Ｉｄ１０１−１
Ａｂまたは抗Ｉｄ７１９−３Ａｂの有意な結合阻害が存
在しないことは、上記血清におけるパロトープ特異性ポ
ピュレーションが微弱あるいは欠如していることを示唆
している。

【００４２】（抗（抗イデイオタイプ）抗体の製造）次
に示す例は、抗ＧｍＡｂの抗原結合部位に対して反応性
を有する抗ＩｄＡｂが上述の抗ＧｍＡｂに認識されたウ
イルスのエピトープをまねたサブポピュレーションを含
有し、Ｇに対する免疫応答を誘発しうることを示してい
る。

【００４３】４つのグループに分けたＩＣＲマウスの皮
下にＦＣＡで乳化したプロテインＡセフアロース精製抗
ＩｄＩｇＧを１匹当り４０μgずつ接種した。追加抗原
刺激皮下接種は７日目と３２日目とにそれぞれフロイン
ト完全アジュバント中に４０μgの抗ＩｄＩｇＧを入れ
て行った。最後の追加抗原刺激接種に続く５日間眼窩後
方叢より採血し、集めた血清について狂犬病ウイルス中
和抗体（ＶＮＡ）を調べた。対照として別のグループの
マウスには、プロテインＡ・セフアロースで精製した正
常家兎ＩｇＧで免疫した。

【００４４】免疫したマウスにおけるＶＮＡの濃度を迅
速蛍光フォーカス阻害試験法の変法によって測定した。
スミスら著ラボラトリー・テクニツクス・イン・ラビー
ス（Laboratory Techniques in Rabies Ｍ．カプランお
よびＨ．コプロフスキ、ら編、第３版、１９７３年）：
３５４−３５７頁参照。マウス血清を二倍系列希釈物を
マイクロタイターII平板（フアルコン・プラスチツクス
製）（５０μl／ウェル）で作り、１０⁴ＰＦＵ／５０μ
lを含有する、同量のウイルスを用いて３７℃で１時間
インキュベートした。インキュベーション後、新たにト
リプシン処理したＢＨＫ−２１細胞（２×１０⁶個／μ
l）５０μlをそれぞれのウェルに加え、混合した。そし
て血清・ウイルス・細胞混合物の１０μlづつをテラサ
キ平板（フアルコン・プラスチツクス製）のウェルに
（２回に分けて）移した。２０時間インキュベーション
後平板を最初、ＰＢＳで次いで蒸留水中８０％（容量
比）アセトンで洗い、室温において８０％アセトン中で
３０分間固定処理した。平板を乾燥し、蛍光コンジュゲ
ート家兎由来抗狂犬病ヌクレオカプシド抗体５μl／ウ
ェルと３７℃で３０分間細胞を染色した。ウイクトル著
シンポジウム・オン・シリーズ・イムノバイオロジカル
・スタンダード（Symp．Series Immunobiol．Standar
d）２１巻１０２−１１８頁を参照。対照ウェル（ウイ
ルスを含むが抗体を含まない）は狂犬病ウイルス特異性
内容物を包含する細胞をほぼ４０％示した。ウイルス中
和の終点は、狂犬病ウイルスに感染した細胞数を５０％
減少しうる最大血清希釈レシプロカルとして定義した。

【００４５】迅速蛍光フォーカス阻害試験の結果は以下
の表に示す。抗Ｉｄ ５０９−６ Ａｂおよび抗Ｉｄ １
１０４−２ Ａｂで免疫したマウスにＥＲＡ株狂犬病ウ
イルスに対する顕著なＶＮＡ力価を生じた。他の３種の
抗（抗Ｉｄ）ＡｂはＥＲＡウイルスを中和しなかった。
対照の実験は、免疫するのに用いた抗Ｉｄ Ａｂと同様
にマウス抗（正常家兎ＩｇＧ）Ａｂが狂犬病ウイルス中
和活性を持っていないことを示した。さらに、抗Ｉｄ
５０９−６ Ａｂと共に抗（抗Ｉｄ ５０９−６）血清を
予備インキュベートすると中和活性を失った。しかし正
常家兎血清で予備インキュベートしても活性を失わなか
った。

【００４６】生じたＶＮＡの特異性を試験するために、
他の狂犬病ウイルスを中和測定に用いた。狂犬病のＣＶ
Ｓ株はｍＡｂ５０９−６および１１０４−２の両方と結
合した（ここではデータは示さない）、そして表は、Ｃ
ＶＳが抗（抗Ｉｄ５０９−６）血清および抗（抗Ｉｄ１
１０４−２）血清の両方によって中和されることを示し
ている。

【００４７】他方、ＥＲＡウイルスの変異株であるＲＶ
５０９−６は、５０９−６エピトープが変異した結果ｍ
Ａｂ５０９−６による結合および中和活性を失っている
が（ラトンら著ジヤーナル・オブ・ゼネラル・バイロロ
ジー（J．Gen．Virol．１９８３）６４巻：８４３−８
５１頁参照）、そのウイルスは抗（抗Ｉｄ５０９−６）
血清によって中和されなかった。別の中和耐性変異株Ｒ
Ｖ１９４−２は、抗（抗Ｉｄ５０９−６）血清によって
中和された。先の結果は、抗ＧｍＡｂ５０９−６および
１９４−２に認識される抗原部位が完全に独立している
ことを示す。ラトン等、前掲参照。このデータは、抗
（抗Ｉｄ５０９−６）血清が抗ＧｍＡｂ５０９−６に認
識されたエピトープとのみ反応し、したがって上記エピ
トープは抗Ｉｄ５０９−６Ａｂにまねられたのであるこ
とを示す。

【００４８】

【表２】 抗（抗Ｉｄ）血清による狂犬病ウイルスの中和＊ マウス抗血清の相手 ＥＲＡ ＣＶＳ 親株 ＲＶ５０９−６ ＲＶ１９４−２ 親株 正常 家兎ＩｇＧ ４ ４ ４ ４ 抗-Ｉｄ ５０９−６ ３２ ４ ６４ ６４ 抗-Ｉｄ １０１−１ ４ ＮＤ** ＮＤ ＮＤ 抗-Ｉｄ １７９−３ ４ ＮＤ ＮＤ ＮＤ 抗-Ｉｄ ５０７−１ ４ ＮＤ ＮＤ ＮＤ 抗-Ｉｄ １１０４−２ １２８ ４ １２８ ６４ ＲＩＧ*** １６ １６ ３２ ３２ * 感染細胞数を５０％減少させうる最高血清希釈レシ
プロカル ** 実施せず *** ヒト抗狂犬病Ｉｇを０.２国際単位／１mlに希釈し
２倍系列希釈物を狂犬病ウイルスと共にインキュベート
した。

【００４９】上記実験は説明の目的のみで表されたので
あってこの発明を限定するものではなく、この発明は請
求の範囲のみによって定義されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヒラリー・コプロフスキー アメリカ合衆国ペンシルベニア19096、 ウインウッド、フェアーヒル・ロード 334番 (72)発明者 カルバン・リーガン アメリカ合衆国デラウェアー19809、ウ イクリフ、サウス・クリフ・ドライブ21 番 (72)発明者 タデウツ・ビクター アメリカ合衆国ペンシルベニア19096、 ウインウッド、ダウンズ・サークル９番

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 固形腫瘍細胞に存在するエピトープのイ
   ンターナルイメージを有し、当該固形腫瘍細胞のエピト
   ープに対して特異的であるモノクローナル抗体のパラト
   ープに特異的に結合する抗イデイオタイプ抗体を産生す
   る、イモータルＢリンパ球。
2. 【請求項２】 ハイブリドーマである、請求項１記載の
   イモータルＢリンパ球。
3. 【請求項３】 産生する抗イデイオタイプ抗体が生体内
   で腫瘍に対する免疫レスポンスを誘発することが出来る
   ものである、請求項１または２記載のイモータルＢリン
   パ球。