JPH04506359A - ヒトインターロイキン―４の抗体アンタゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインターロイキン−４の抗体アンタゴニストユ盟Ω茸屋 インターロイキン−４（ＩＬ−４＞は、造血細胞の広範なスペクトルに影響を及 ぼすタンパク質である［ストロバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒ。

Ｒｅｓ、２４　：　５４９　（１９８８）］、ＩＬ−４は、マクロファージＩＩ 能、ＩｇＧおよびＩｇＥ産生、並びに免疫グロブリンに刺激されたＢ＃胞、抗原 に刺激されたＴ細胞およびエリトロボイエチンに刺激された赤血球前駆１Ｍｌｌ １１の増殖を含む多数の活性を増大させる。更に、それは、ＩＬ−３に刺激され た肥満細胞の増殖を増大させる。

ＩｇＢと一緒に、肥満細胞はアレルギー反応において中心的役割を果たしている 。肥満細胞は、全身の毛細血管付近に位置している顆粒含有結合組繊細胞であり 、特に、肺、皮膚並びに胃腸管および尿生殖器管に高度に集中している。抗原物 質に暴露後に、肥満細胞は脱顆粒し且つ化学的媒介物質、例えば、ヒスタミン、 セロトニン、ヘパリン、プロスタグランジン等を放出してアレルギー反応を生じ させる。

ＩｇＥ産生および肥満細胞増殖に対するＩＬ−４の刺激作用ゆえに、Ｉ　Ｌ−４ のアンタゴニストは、肥満細胞増殖およびｆｇＥ産生を減少させることによって アレルギーを治療するのに有用であることができる。

多くの研究者が、ＩＬ−４の生物活性に拮抗させるのに抗体を用いてきた０例え ば、フィンゲルマン（ＦｉｎｋｅＩｍａｎ）ら［Ｐｒｏｃ、ＮａｔＩ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、旦３：９６７５　（１９８６）コは、ＢＳＦ−１（ ここでは、ＩＬ−４と称する）に対する単クローン性抗体を用いて、ニツボスト ロンギルス・ブラシリエンシス（Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓｂｒａｓｉｌ ｌｅｎｓｌｓ）に感染させたまたはマウスＩｇＤに対する精製ヤギ抗体を注射し たマウスでのＩＬ−４に誘発されたＩｇＥの産生を阻害した。双方の処置はＩｇ Ｂ産生を刺激することが知られており；後者の処置は、更に、ＩＬ−４分泌を刺 激することが知られていた。

もっと最近では、フレティアン（Ｃｈｒｅｔｉｅｎ）ら［Ｊ、Ｉｍｍｕ、ｎｏｌ 。

Ｍｅｔｈ、Ｌｉ２：６７　（１９８６）コは、不完全に精製された組換え体ヒト ■Ｌ−４に対する多クローン性ウサギ抗血清が、インビトロでのＩＬ−４の若干 の生物活性を中和することを報告しな、しかしながら、成熟しトＩＬ−４の残基 ３〜１８．３１〜４６．５２〜６５および１１２〜１２７に対応するアミノ酸配 列を有する合成ポリペプチドに対する単クローン性抗体は、ＩＬ−４の生物活性 を中和することができないが、それらはタンパク質に対して結合した。

患盟Ｏ！致 本発明は、約５個〜約２６個のアミノ［１２ｆｉ基を含み且つヒトｆＬ−４のア ミノ酸残基６１〜８２または１０４〜１２９の配列に対応するアミノ酸配列また はその部分配列を有するポリペプチドを提供する。好ましいポリペプチドは、ア ミノ酸配列、 Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｃｙａ。

Ｔｈｒ−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉ　ｓ−Ａｒｇ−Ｈｔ　ｓ 、Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ −Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｎ−Ｐｈｅ−Ｈｌ　ｓ−Ａｒｇ−Ｈｉ　ｓ　−Ｌ ｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−Ａｒｇ−ＰｈｅおよびＡｌ　ａ−Ａｓｎ−Ｇ ｌ　ｎ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｎ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａ ｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｒ　１ｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ −Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ一本発明は、更に、＃１ｌｉ８！レセグター に対するヒトエし−４の結合を阻害し、そしてこの種のＩＬ−４に対して、並び に約５個〜約２６ｇＭのアミノ酸残基を含み且つヒトＩＬ−４のアミノ酸残基６ １〜８２または１０４〜１２９の配列に対応するアミノ酸配列またはその部分配 列を有するポリペプチドに対して特異的に結合する抗体であって、細胞レセプタ ーに対するヒトｌ−４の結合を阻害する前記の抗体を提供する。

本発明は、また更に、動物に対して、約５個〜約２６個のアミノ酸残基を含み且 つヒトＩＬ−４のアミノ酸残基６１〜８２または１０４〜１２９の配列に対応す るアミノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドの十分な量を投与し。

それによって、動物が、ヒトＩＬ−４に特異的に結合し且っ細胞レセプターに対 するヒトＩＬ−４の結合を阻害するポリペプチドに対する抗体を産生することを 含む、ヒトＩＬ−４に特異的に結合し且つ細胞レセプターに対するヒトＩ　Ｌ− ４の結合を阻害する抗体を製造する方法を提供する。

また更に、本発明は、前述の抗体に対する抗イデイオタイプ抗体を提供する。

これらの抗体は、おそらく、ＩＬ−４が細胞レセプターに結合する場合にそれと 競合することによってＩＬ−４の生物活性を拮抗する。

本発明は、まな更に、ヒトＩＬ−４に対して、並びに約５個〜約２６個のアミノ 酸残基を含み且つヒトＩＬ−４のアミノ＃残基６１〜８２または１０４〜１２９ の配列に対応するアミノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドに対し て特異的に結合する抗体であって、細胞レセプターに対するヒトＩＬ−４の結合 を阻害する前記の抗体とヒトＩＬ−４とを接触させることを含む、細胞レセプタ ーに対するヒトＩＬ−４の結合を阻害する方法を提供する。

更にまた、本発明は、ヒトＩＬ−４に対して、並びに約５個〜約２６個のアミノ 酸残基を含み且つヒトＩＬ−４のアミノ酸残基６１〜８２または１０４〜１２９ の配列に対応するアミノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドに対し て特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイ１抗体であって、細胞レセプタ ーに対するヒトＩＬ−４の結合を阻害する前記の抗イデイオタイプ抗体と、ヒト ＩＬ−４のためのレセプターを有する細胞とを接触させることを含む、細胞レセ プターに対するヒトＩＬ−４の結合を阻害する方法を提供する。

本発明の抗体アンタゴニストは、インビトロのレセプター結合性の研究において 、ＩＬ−４の作用機序を決定するおよび／またはＩＬ−４のアゴニストまたは他 のアンタゴニストを同定するのに有用である。前述のように、それらは、ＩＬ− ４にＩＩＪ激された肥満細胞増殖およびＩｇＢ産生を減少させることによってア レルギーを治療するのにも有用であることができる。

囚厘Ω厘患久諷剪 本発明は、添付の図面を参照することにより一層容易に理解することができる。

図１は、アミノ末端からカルボキシル末端までの成熟しトＩＬ−４のアミノ酸配 列を示す。

図２は、ＩＬ−４（下方の曲線）および第７番のポリペプチド（上方の曲線：表 １を参照されたい）の結合を、直接エライザ分析におけるポリペプチドに対する ウサギＩｇＧ画分によって示すグラフである。結合したタンパク質／ポリペプチ ドのピコモルでの量を、４１４ｎｍでの吸光度の関数として示す。

図３は、ダウデ４　（Ｄａｕｄｉ）細胞に対する１２５Ｉ−ＩＬ−４の特異的結 合の阻害を第７番のポリペプチドに対するウサギＩｇＧ画分によって示すグラフ であり、特異的に結合した放射能％を増加するＩｇＧ濃度の関数として示す。

図４は、ダウディ細胞に対する１２５１−ＩＬ−４の特異的結合の阻害を抗イデ イオタイプ抗血清１４４８によって示すグラフであり、特異的に結合した放射能 の阻害％を減少する抗血清濃度の関数として示す。

図５は、第７番のポリペプチドに対するウサギ抗血清について行ったエピトープ 分析の結果を示すグラフである０分析で用いた一連のオクタペプチドに対する抗 血清の結合によって生じたエライザの吸光度を示す、オクタペプチドの番号は表 ３での番号に対応する。

図６は、第６番のポリペプチドに対するウサギ抗血清について行ったエピトープ 分析の結果を示すグラフである０分析で用いた一連のオクタペプチドに対する抗 血清の結合によって生じたエライザの吸光度を示す、パネルＡで示した結果を得 るのに用いた抗血清は、ウサギの免疫化の進行中の初期に集められたものであり 、ダウディ細胞に対する１２５１−ＩＬ−４の結合を阻害しなかった。パネルＢ において用いた抗血清は後期に集められたものであり、標識ＩＬ−４の結合の強 力な阻害剤であった。オクタペプチドの番号は表４での番号に対応する。

魚哩Ω説明 本明細書中で引用した参考文献はいずれも、全て参考文献として後述される。

示されたポリペプチドのアミノ酸配列は、標準的な一文字表記または三文字表記 である［レーニンジャ−（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）、Ｐｒ１ｎｃｅｐｌｅｓ　ｏｆ Ｂｌｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８２．ワース・パブリッシャーズ・インコーホ レーテッド（Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ、）、ニューヨーク。

って、細胞レセプターに対するヒトＩＬ−４の結合と拮抗し、それよって細胞し において、ＩＬ−４の作用機序を解明するのにまたは他のＩＬ−４アンタゴニス ４のアミノ酸配列と実質的に同一である配列を有し且つ（ｂ）本来のＩＬ−４に 列が、生物活性を実質的に損なわない１種類以上のアミノ酸変化（欠失、付加、 シル末端のセリン残基である。

これらの研究の結果として、ヒトＩＬ−４の残基５２〜８２および１０４〜１２ ９のアミノ酸配列に対応する配列またはそれらの部分配列を有する合成ポリペプ チドを抗原として用いて、ポリペプチドおよびヒトＩＬ−４に結合することがで きる抗体の動物における産生を誘発することができる。ＩＬ−４のこのようなく とも５個のアミノ酸残基を含むということは周知である［オーツ（Ｏｈｎｏ）ら 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　旦２：２９４５＜１９８５ ＞］、したかって、本発明のポリペ１チドは、約５個〜約３０個のアミノ酸残基 を含み且つ前述のアミノ酸配列を有する。ある与えられたポリペプチドが本発明 の範囲内であるか否かということは、下記に記載した方法を用いる日常的な実験 によって容易に決定することができる。

ポリペプチドは、適当な方法、例えば、排他的固相合成法、部分固相法、フラグ メント縮合または古典的溶液合成法によって合成される。好ましくは、ポリペじ るのを可能にする。α−アミノ保護基を除去するための条件では、（［１１ｇ１ ！Ｍ基トリフルオロアセチル、アセチル）、芳誉族ウレタン型保護基［例えば、 ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、置換ベンジルオキシカルボニルおよび９ −フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）］、脂肪族ウレタン保護基 ［例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、イソプロピルオキシカルボ ニル、シクロへキシルオキシカルボニル］並びにアルキル型保護基（例えば、ベ ンジル。

ロヘキシルがある。Ａｓｐに好ましい１ＰｌＩＩＦ保護基はシクロヘキシルであ る。Ｔｈミノ基は、Ｃｂｚ、２−ＣＩ−Ｃｂｚ、ＴｏｓまたはＢｏｃで保護され ることが端にカルボキサミド基を有する。これらの樹脂は商業的に入手可能であ り、それらの製法は、ステユワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、「固相ペプチド合成 法（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（第２ 版）ピアス・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 ）、イリノイ州、ロックフォード、１９８４に記載された。

必要な場合に＠鎖が、そしてα−アミノ基が保護されたＣ末端アミノ酸を、種々 の活性化剤、例えば、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　、Ｎ、Ｎ’ −ジイソプロピルカルボジイミドおよびカルボニルジイミダゾールを用いてベン ズヒドリルアミン樹脂に結合させる。樹脂支持体に対して結合させた後、トリフ 先後、残存する保護されたアミノ酸を、所望の配列を得るのに必要な順序で段階 と−緒に用いて、開裂の際に生成した陽イオンがポリペプチド中に存在するアミ ノｗＲ残基をアルキル化しないようにする。ポリペプチド−樹脂は、所望ならば 、開裂する前にＴＦＡ／ジチオエタンを用いて脱保護してよい。

面体支持体上のｌＩＩ鎖対側対側鎖化は、酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ）およ び塩基性アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）のＩＩＩＩＩＩＩＩ！Ｉ能の選択的開裂を 可能にする直交保護スキームを用いることを必要とする。Ａｓｐの側鎖のための ９−フルオレニルメチル（Ｆｍ）保護基およびＬｙｓの側鎖のための９−フルオ レニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基は、この目的に用いることが できる。これらの場合、Ｂｏｃに保護されたポリペプチド樹脂のＳ鎖保護基は、 ＤＭＦ中のピペリジンによって選択的に除去される。環化は、ＤＣＣ，ＤＣＣ／ ＨＯＢｔまたはＢＯＰなどの種々の活性化剤を用いて固体支持体上で達成される 。ＨＦ反応は、前記に記載したように、環化されたポリペプチド樹脂上で行われ る。

更に、組換えＤＮＡ方法論を用いてポリペプチドを製造することができる。所望 ならば、ある与えられた宿主生物での更に有効な発現に好ましい既知のコドンに よって製造された既知の遺伝暗号を用いて、所望のアミノ酸配列をコードするオ リゴヌクレオチドを合成することができる。マシューシ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ） ら［Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１０３：　３１８５　（１９８１）］のホス ホルアミダイト固体支持体法または他の既知の方法をこのような合成に用いるこ とができる。得られたオリゴヌクレオチドは、適当なベクター中に挿入し且つ適 合した宿主生物で発現させることができる。

本発明のポリペプチドは、高速液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換 および分配クロマトグラフィー、向流分配または他の周知の方法を用いて精製す ることができる。

抗体は、標準法を用いて本発明のポリペプチドに対して製造することができる。

本明細書中で用いる「抗体」という用語は、多クローン性抗体および単クローン 性抗体双方を意味する。更に、それには全免疫グロブリンおよびそれらの抗原結 合性断片が含まれる。

多クローン性抗体は、宿主動物、例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、マウ ス等に１種類のポリペプチドで免疫することによって生じることができる。好ま しくは、１回以上のブースター注射を最初の注射後に行って、抗体力価を増大さ せる１次に、血液を動物から採取し、血清を標準法、例えば、ポリペプチドを抗 原として用いるエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（エライザ）によ って調製し且つ選別する。

好ましくは１．ポリペプチドの免疫原性は、アジュバントとの組合せによってお よび／または免疫する前に更に高分子に変換することによって増大される。

動物のワクチン注射に適当なアジュバントとしては、制限されないが、アジュバ ント６５（ビーナツツ油、マンニドモノオレエートおよびモノステアリン酸アル ミニウムを含む）；完全または不完全７０インドアジュバント；ミネラルゲル、 例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウバン；界面活性 剤、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、臭化ジ メチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’　、Ｎ’− ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセ ロールおよびプルロニックポリオール；ポリアニオン、例えば、ピラン、［６デ キストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸およびカルボポル：ペプチド、例えば、 ムラミルジペプチド、ジメチルグリジンおよびタフトシン；並びに油エマルジョ ンがある。ポリペプチドは、更に、リポソームまたは他の微粒子担体中に混入後 に投与することができる。

ポリペプチドの免疫原性は、更に、免疫原性担体分子（すなわち、宿主動物にお いて免疫学的反応を独立して誘発する性質を有する巨大分子であって、本発明の ポリペプチドが共有結合によって結合することができるもの）に対する架橋によ ってまたはカップリングによって増大させることができる。低分子のポリペプチ ドはハプテン（抗体に対して特異的に結合することができるが、抗体産生を誘発 することができない分子、すなわち、それらは免疫原性ではない）として作用す ることが多いので、担体分子に対する架橋または共役が必要であることがある。

免疫原性担体分子に対するこのようなポリペプチドの共役は、「担体効果」とし て一般的に知られていることによって断片を免疫原性にする。

適当な担体分子としては、例えば、タンパク質および天然のまたは合成の高分子 化合物、例えば、ポリペプチド、多糖、リボ多糖等がある。有用な担体は、モレ イン（Ｍｏｒｅｉｎ）らによって、Ｎａｔｕｒｅ　３０旦：４５７　（１９８４ ）に記載されたキル（Ｑｕｉｌ）Ａと称されるグリコシドである。タンパク質担 体分子が特に好適であり、制限されないが、カサガイのヘモシアニンおよび哺乳 動物血清タンパク質、例えば、ヒト若しくはウシのガンマグロブリン、ヒト、ウ シ若しくはウサギの血清アルブミン、またはこのようなタンパク質のメチル化誘 導体若しくは他の誘導体が挙げられる。他のタンパク質担体は当業者に明らかで ある。好ましくは、不可欠ではないが、タンパク賀担体は、ポリペプチドに対す る抗体を誘発する宿主動物とは無関係である。

担体分子に対する共有結合カップリングは、当該技術分野で周知の方法を用いて 行うことができ、その厳密な選択は、用いられる担体分子の性質によって指示さ れる。免疫原性担体分子がタンパク質である場合、本発明のポリペプチドは−例 えば、水溶性カルボジイミド、例えば、ジシクロへキシルカルボジイミドまたは グルタルアルテヒドを用いて結合させることができる。

これらのようなカップリング剤を用いて、ポリペプチドをそれらだけで、別個の 担体分子を用いることなく架橋することができる。凝集体にするこのような架橋 は、免疫原性を更に増大させることができる。

このように免疫された動物から生じた血清は、そのまま用いることができる。

或いは、ＩｇＧ画分を、プラズマフオレシスまたは固定化タンパク質ＡなどのＩ ｇＧ特異的吸収剤を用いる吸着クロマトグラフィーのような標準法を用いて血清 から分離することができる。

単クローン性抗体は、例えば、コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）ら［Ｎａｔｕｒｅ。

２５６：４９５　（１９７５）；Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６：５１１＜１ ９７６）Ｅによって記載されたように、標準法を用いて製造することができる０ 本質的には、動物を前記に記載したように免疫して抗体分泌体ｌｌ１ｌｌ胞を生 じさせる０次に、これらの細胞を、ミエローマ細胞に融合させるために免疫した 動物から取り出す。

抗体を生じる可能性を有する＃細胞、特に、ＢＡＩＩＩ胞は、ミエローマ細胞系 と融合するのに適している。これらの体細胞は、感作動物のリンパ節、膵臓およ び末梢血液から誘導することができる０本発明の代表的な実線態様ではマウスの 膵臓細胞を用い、その理由は、一つには、これらの細胞がマウスミエローマ細胞 との安定な融合を比較的高い百分率で生じるからである。しかしながら、ラット 、ウサギ、カエルまたは他の代りの細胞を用いることも可能であろう。

特殊化されたミエローマ細胞系は、ハイブリドーマ産生融合法［コーラ−および ミルスタイン＜Ｍｆ　Ｉ　５ｔｅｉｎ）　、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６： ５１１　（１９７６）：シュルマン（Ｓｈｕｌｍａｎ、）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２ ヱ旦＝２６９　（１９７８）ニアｔルク（Ｖｏｌｋｌら、Ｊ、Ｖｔ　ｒｏ　１． ４２　：　２２０（１９８２）］で用いるために、リンパ球腫瘍から生じさせた 。これらの細胞系は少なくとも三つの理由で生じた。第一は、融合ハイブリドー マを、非融合で且つ同様に無制限に自己増殖性のミエローマ細胞から選択するの が容易であることによる。一般的には、これは、ハイブリドーマの増殖を支持す るある種の選択培地中でミエローマを増殖させることができないように酵素が欠 失したミエローマを用いて達成される。第二の理由は、りンバ球腫瘍細胞がそれ ら自身の抗体を産生ずる固有の能力によるものである。単クローンの技術を用い る目的は、ハイブリドーマの体ｍ胞成分の遺伝子制御下で所望の単一抗体を生じ る無制限の寿命を有する融合ハイブリッド細胞系を得ることである。ハイブリド ーマによる腫瘍細胞抗体の産生を排除するために、免疫グロブリンＬ鎖およびＨ ｌａを生じることができないかまたは抗体分泌機構を欠失したミエローマ細胞系 を用いる。これらの細胞系を選択する第三の理由は、融合に対するそれらの適合 性および効率のためである。

多数のミエローマ細胞系を融合細胞ハイブリッド産生用に用いることができ、例 えば、Ｐ３Ｘ６０−Ａｇ８、Ｐ３／ＮＳｌ−Ａｇ４−１　（ＭＳ−１＞　、Ｓｐ ２１０−Ａｇ１４および５１９４１５．ＸＸＯ，Ｂｕ、１が挙げられる。Ｐ３Ｘ ６０−Ａｇ８およびＮＳ−Ｎ５−１ｉ胞系は、コーラ−およびミルスタインによ って記載された［Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６；５１１　（１９７６）］、 シュルマンら［Ｎａｔｕｒｅ、２ヱ６：２６９　＜１９７８）］は、］Ｓｐ２１ ０−Ａｇ１４ミエローマ細胞を開発した。５１９４１５．ＸＸＯ，Ｂｕ、１系！ 、ｔ、ドローフリ・アジ（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ）によって報告された［Ｊ、Ｅ ｘ　、Ｍｅｄ。

１ユ旦：３１３　（１９７９）］。

抗体を産生ずる牌臓まなはリンパ節の細胞およびミエローマ細胞のハイブリッド を生じるための方法は、連木、＃＃１ｌｌＩ！とミエローマ細胞とを１０：１の 比率で（しかしながら、その比率は約２０：１〜約１：１に変化することができ る）、それぞれ、細胞膜の融合を促進する１種類または複数種類の（化学的、ウ ィルス性または電気的）物質の存在下で混合することを行う、融合法は、コーラ −およびミルスタイン、上記、シェフター（Ｇｅｆｔｅｒ）ら［Ｓｏｍａｔ　ｆ 　ｃΩ至ユ」−３トロＬ艷見エユ：２３１　（１９７７）］およびフォルクら［ Ｊ、Ｖｉｒｏｔ、４２：２２０　（１９８２＞］に記載された。これらの研究者 によって用いられた融合促進剤は、センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウィルスおよびポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）であった０本発明の実施例の融合法ではＰＥＧ を用いる。

融合法は、生長し得るハイブリッドを極めて低頻度で生じる（例えば、ＩＩＩＩ ＩＩＩを体細胞源として用いる場合、約Ｉ×１０５個の胛Ｈ＃ｌ胞毎に１個のハ イブリッドだけが得られる）ので、融合細胞ハイブリッドを残存する非融合細胞 、特に、非融合ミエローマ細胞から選択する手段を有することが不可欠である。

更に、所望の抗体産生ハイブリドーマを他の得られた融合細胞ハイブリッドがら 検出する手段が必要である。

概して、融合細胞ハイブリッドの選択は、ハイブリドーマの増殖を支持するが、 非融合ミエローマ細胞の増殖を妨げ、一般的には、不明確に分割を続けると考え られる培地中で細胞を培養することによって達成される。ｉｔ合で用いられる体 細胞は、インビトロの培養では長期間生存率を維持しないので、問題は起こらな い。

本発明の実施例では、ヒボキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠い ている（ＨＰＲＴ−陰性）ミエローマｌ１ＭＩ！胞を用いた。これらの細胞に対 する選択は、融合細胞ハイブリッドが牌臓細胞のＨＰＲＴ−陽性遺伝子型のため に生存している培地である、ヒボキサンチン／アミノベテラン／チミジン（ＨＡ Ｔ）培地中で行われる。更に、遺伝子型によるコンピテントハイブリッドの増殖 を支持すｉ　る培地に対抗して選択することができる遺伝子欠失（薬削感受性等 ）の興なるミエローマ細胞を用いることは可能である。

融合細胞ハイブリッドを選択的に培養するのには数３１Ｉ間を要する。この期間 の最初に、所望の抗体を産生ずるこれらのハイブリッドを確認する必要があるの で、それらを引き続きクローン化し且つ増殖させてよい、概して、得られたハイ ブリッドの約１０％が所望の抗体を産生ずるが、約１〜約３０％の範囲では原著 ではない、抗体産生ハイブリッドの検出はいくつかの標準検定法の内のいずれか 一つで達成することができ、文献に記載されたエンザイムリンクドイムノアッセ イおよびラジオイムノアッセイが挙げられる［例えば、ゲネット（Ｋｅｎｎｅｔ ）ら（監修）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄＨｂｒｉ ｄｏｍｏａｓ：Ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ　１ｎＢｆｏｌｏ　１ｃａｌ　 Ａｎａｌ　ｓｅｓ、３７６＋−３８４頁、プレナム・プレス（Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐ ｒｅｓｓ）、ニューヨーク（１９８０）を参照されたいコ。

所望の融合細胞ハイブリッドが選択され且つ個々の抗体産生細胞系にクローン化 されたならば、各細胞系を２種類の標準法のいずれかで増殖させることができる 。ハイブリドーマ細胞の懸濁液は、組織適合性動物に注射することができる。

次に、注射された動物では、融合細胞ハイブリッドによって生じた特異釣車クロ ーン性抗体を分泌する腫瘍が発生する。動物の体液、例えば、血清または腹水液 を取り、高濃度の単クローン性抗体を提供することができる。或いは、個々の細 胞系をインビトロの実験室の培養容器中で増殖させてもよい、単一の特異釣車ク ローン性抗体を高濃度で含んでいる培地を、傾瀉、濾過または遠心分離によって 採取することができる。

前記に記載したように製造された抗ポリベグチド抗体が本発明で用いるのに適Ｉ Ｌ−４の特異的結合の阻害を測定する放射リガンドレセ７ター結合分析を含む三 部分スクリーニング法によって決定される。

このような検定で用いるための組換え体ヒトＩＬ−４は、例えば、ジェンザイム °コーポレーション（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、？サチュー セッツ州、ボストンから入手可能な商品である。或いは、そ五は、ＩＬ−４遺伝 子の既知のヌクレオチド配列しヨコト（Ｙｏｋｏｔｏ）ら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　旦旦：　５８９４　（１９８６）］およ び標準組換えＤＮＡ法Ｃ例えば、国際特許出願第ＷＯ３７１０２９９０号明細書 ：キメネイド（Ｋｉｍｍｅｎａｄｅ）ら、Ｅｕｒ、Ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７３ ：１０９　（１９８８）を参照されたい］を用いて製造することができる。

エライザ分析は、フレティアンら［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈ、１１７：６ ７　（１９８９）］の方法などの＠準法によって、微量滴定プレートに吸着させ たポリペプチドまたはＩＬ−４を用いて行われる。固定化ポリペプチドまたはタ ンパク質に結合した抗体の存在は、ｌｌ識された抗１ｇＧ第二抗体によって検出 される。このような第二抗体は、好ましくは、ペルオキシダーゼ、グルコースオ キシダーゼ、ｂ−ガラクトシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼなどの酵素 で標識される。ホースラディツシュペルオキシダーゼは、ピロガロール、０−フ 二二レンジアミンまたは２．２′−アジノービス（３−エチル−ベンズチアゾリ ン−６−スルホン酸）などの基質に対するその活性についての吸光分光分析によ って検出することができる。

免疫化ポリペプチドおよびＩＬ−４双方に特異的に結合することが見出された抗 体は、更に、適当な標的細胞上のレセプターに対する標識ＩＬ−４の特異的結合 を阻害する能力について評価される０本発明の抗ポリペプチド抗体は、このよう な結合を少なくとも６０％阻害する能力を特徴とする。

ＩＬ−４レセプターを有する任意の細胞、例えば、ジジョイ（ＪｉＪｏｙｅ）、 Ｕ−９３７、ＣＣＲＦ−ＣＥＭおよびＣＥＭ−ＣＭ３細胞を用いて、結合検定を 行うことができるが、ダウディ細胞は便利で且つ容易に入手可能である。ダウデ ィ細胞は、バーキットリンパ腫患者由来の十分に特徴化されなりリンパ芽球ｍ胞 系であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から寄託番号ＡＴＣＣＣＣ Ｌ　２１３として購入することができる。検定で用いるための１２５Ｉ−■Ｌ− ４は、例えば、ラクトペルオキシダーゼ法［デビット（Ｄａｖｉｄ）ら、Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｓｔｒ　１３：１０１４（１９７４）コまなはポルトン（Ｂｏｌｔｏ ｎ）ら［Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１３３：５２９　（１９７３）コの方法を用いて ＩＬ−４をヨウ素−１２５で標識することによって製造することができる。グリ コジル化組換え体ヒトＩＬ−４は、例えば、ジェンザイム、コーポレーション、 マサチューセッツ州、ボストンから購入可能な商品である。

本発明の抗イデイオタイプ抗体は、本発明のポリペ１チド中に存在するＩＬ−４ 抗原決定基に特異的な抗体に対して向けられている。このような抗イデイオタイ プ抗体は、元の抗原決定基のようにｆＩｉ態し且つ作用する［例えば、リーガン （Ｒｅａｇａｎ）らの米国特許第４．７３１，２３７号明細書を参照されたい］ 。

ＩＬ−４それ自体と同様に、これらの抗体は、ＩＬ−４レセプターに対して特異 的に且つ直接結合すると考えられる。しかしながら、抗イデイオタイプ抗体は■ Ｌ−４の生物活性を有していない。

このような抗イデイオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドに対する抗体く多ク ローン性または単クローン性）を動物にワクチン注射することによって製造され る。それらは、前記に記載したように、全多クローン性抗血清として若しくはそ れらのＴｇＧ画分としてまたはクローン化したハイブリドーマによって生じた単 クローン性抗体として回収することができる。

本発明の１種類以上の抗体の有効量および生理的に許容し得る担体を含む薬剤組 成物を製造することができる。この種の担体は当業者に周知である。抗体は、ア レルギーまたはＩＬ−４によって媒介された他の症状を治療するなめに、ヒトの 患者に対して直接または組成物の形態で投与することができる。薬剤組成物は、 生理的に許容し得る担体と有効量の１種類以上の抗体とを混合することによって で増加される０便宜上、全日用量を分割してよいし、所望ならば、−日の間に少 量ずつ投与してもよい。

本発明の抗体の投与量および投与頻度は、担当医師の判断にしながって調節され 、患者の年齢、状態および体格並びに治療される１種類または複数種類の症状の 苛酷さなどの要因が考慮される。

大施泗 特に断らない限り、固体混合物中固体、液体中液体および液体中固体について下 記に与えられた百分率は、それぞれ、重量／重量、容量／容量および重量／容量 に基づく。

タンパク質の決定は、ローリイ（Ｌｏｗｒｙ）ら［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

１９３：２６５　（１９５１）］の方法によって、ウシ血清アルブミンをＳ準と して用いて行った。ＩＬ−４の生物検定は、モスマン（Ｍｏｓｓｍａｎ）［Ｊ工 Ｉｍｍｕｎｏ　１．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５：　５５　（１９８３）コに記載され たように行って、ＰＨＡに刺激されたヒト末梢血液リンパ球でのＭＴＴ（３−［ ４，５−ジメチルチアゾルー２−イル］−２．５−ジフェニルテトラゾリウム臭 化物）の取込みとして細胞増殖の刺激を測定した。１単位のＩＬ−４活性は、検 定において２Ｘ１０５個の細胞で最大刺激の２分の１を引き起こすｌ−４の量で ある。

１マイクログラムの純粋なヒトＩＬ−４の検定での活性は、約２０，０００単位 である。

虱すび」１基 多数のポリペプチドを合成し、そのアミノ酸配列は、全体的には、完全な成熟し トＩＬ−４タンパク質のアミノ酸配列に対応した。

ポリペプチドは、メリフィールドの固相法［Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。

旦旦：　２１４９　（１９６３）］およびアプライド・バイオシステムズ（Ａｐ ｐｌｉｅｄ　ＢｉＯｓｙｓｔＢ１０５ｙｓｔｅ型合成機を用いて合成した。

ｔ型合子機オキシカルボニルアミノ保護基および対称性無水物を用いた。保護基 を除去した後、ポリペプチドをフヅ化水素によって樹脂から開裂させた。

ポリペプチドの精製は、レイニン・ダイナマクス（Ｒａ　Ｌ　ｎ　ｉ　ｎＤｙｎ ａｍａｘ）１８ＩＣ−８カラムを０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル の勾配によって展開させて用いる逆相高速液体クロマトグラフィーによって行っ た。溶出液は、２１４ｎｍでの紫外線吸光度によって監視された。精製ポリペプ チドの同一性は、標準法を用いて、アミノ酸配列順序および質量スペクトル分析 によって確認された。

生じたポリペプチド、それらのアミノ酸配列およびそのポリペプチド配列が対応 する成熟しトＩＬ４の残基を表１に示す。

ン、１ぺ　’　Ｉ　ｌ、−ユ土残基− １ＨＫＣＣ）ｍＬｏεＩＩＫｎＪＪＳＬＴａＯＫＴＬＣＴＥ　１−２６ｇ　ｃｏ ｍ、０日ＩＫＴＬＮｓＬＴ　３−ＩＢ３　丁ＥＯＫＴＬ装置ＭＤ　１８−３１４ 　ＤＩＦＡＡｓＫＭｒｒＥｘＥｒＦｃ３１−４８１０　ＣＰＶＫＥＡＩＩＪＯ５ ＴＬＥＮ　９９−１１１１ヒトｌ−４の４６位のシスティン残基かポリペプチド のセリン残基で置き換えられたことを除き、ヒトＩＬ−４の残基４３〜５７に対 応する第５番のポリペプチドのアミノ酸配列。

ホップ（Ｈｏｐｐ）ら［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、ＵＳＡ７８： 　３８２４　（１９８１）］によって行われたヒトＩＬ−４の親水性分析により 、第７番のポリペプチドに対応する領域は、ＴＬ−４のα−へリックス領域をお そらく形成する二次構造モデルによって指示される親水性残基および疎水性残基 双方を含むことが示される。

ポ１ベプ　ド　の　お ヒトＩＬ−４の残基６１〜８２に対応する第７番のポリペプチド（表１）２ｍｇ を、０．５モルのトリス−ＭＣＩ、ＰＨ６，８が０．４ｍｌおよび百日咳ワクチ ン（Ｒ５１８３３４薗株、加熱殺菌、２０単位／ｍｌ、チメルサール稀釈度１／ １０．０００）Ｏ，１ｍｌ中に溶解させた。完全フロインドアジュバント（０， ５ｍ１）を加え、試料をシリンジ中で均一化した。二ニー・シーラントシロウサ ギにそれぞれ、０−１ｍｌ　（ポリペプチド２００μｇ）の皮肉注射によって試 料１ｍｌを用いて免疫した。

約４か月の期間の後、続いて周期的に、ブースター注射を前記のように行った。

血液を、ウサギの耳または大腿静脈から周期的に取り且つ凝固させた。

Ｉ　ｇＧｉＩ分は、１種類のウサギの血清から、１．５モルグリシン緩衝液、Ｐ Ｈ８，９で平衡させたプロティンＡ−セファロース■カラム［ファーマシア（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）　、ニューシャーシー州、ビス力タウェイ］上に同一種類を 吸着させることによって単離された。クロマトグラフィーは、フォートン・バイ オケム・カンパニー（Ｆｏｒｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃｏ、）による標準法を 用いて行った。精製された物質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動［レ ムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　）　、Ｎａｔｕｒｅ、２２ヱ：　６８０　（１９７０ ）］に　−よって約９８％純度のＩｇＧであると判断された。この物質は抗血清 ３４３−６ＩｇＧ画分を示した。

同様の方法を用いて、表１に示した他のポリペプチドに対する抗血清のＩｇＧ画 分を更に製造した。

エライザは、単離されたＩｇＧ画分について、９６ウ工ル微量滴定プレート［ベ クトン・ディキンマン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）］に、トリス緩衝 食塩水（ＴＢＳ；　５０ミリモルトリス、０．１５モルＮａＣＬ　ｐＨ７，０＞ ５０μｌ中の各種ポリペプチドの１種類約０．２５ｇｇを用いて室温で１時間コ ーティングすることによって行った。このインキュベーション後、ウェルを、０ ．１％のトクウイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０　（ポリオキシエチレンソルビタンモ ノラウレート）を含むＴＢＳで５回洗浄した。

洗浄したウェルを、ＴＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて室温で １時間ブロックし、ＴＢＳで５回洗浄し、ＴＢＳ中０．１％非特異的ＩｇＧを用 いて室温で２時間ブロックし、そして前記に記載したように５回洗浄した０次に 、ＩｇＧ画分のＴＢＳ中各種稀釈度の一部分５０μｌをウェルに加え、そのプレ ートを室温で１時間インキュベートした後、前と同様に洗浄した。

各ウェルに対して、ホースラディツシュペルオキシダーゼで標識したヤギ抗ウサ ギＩｇＧ２．５ｎｇを含むＴＢＳ５０μｇを加え、そのプレートを室温で１時間 インキュベートした。上記のように洗浄した後、ウェルを、過酸化水素および２ ．２−アジノージ−（３−エチル−ベンズチアゾリンスルホネート）で展開させ た。

３Ｎ類の検定成分（すなわち、抗原、抗体または標識第二抗体）の一つを欠いた 対照ウェルも展開させた。試料は、ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）６５０型分 光光度計で読み取られた。

第７番のポリペ１チド（表１）およびヒトＩＬ−４を抗原として用いて抗血清３ ４３−６１ｇＧ画分について行ったこのような分析の結果を図２に示す、抗原結 合性の尺度としての４１４ｎｍでの吸光度が、ウェル当りのポリペプチドまたは ＩＬ−４の量の間数として示される場合、抗体が双方の抗原に結合したことが分 かる。これらの結果を生じるために、抗血清３４３−６ＩｇＧ画分を１：２００ に稀釈した後、一部分５０μｌをウェルにコーティングした。

抗ポリペプチドＩｇＧ画分の抗体が、ヒトＩＬ−４に対して特異的に結合するこ とによって、細胞レセプターに対するＩＬ−４の結合を阻害することができるか 否かを決定するために、放射リガンド結合分析を行った。

ＣＨＯＡ［胞で発現された精製組換え体ヒトＩＬ−４［レー（Ｌｅ）ら、二Ｂｉ ｏ１．Ｃｈｅｍ、２６３：１０８１７　（１９８８）］を、ポルトンら［Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、Ｊ、１３３：５２９　（１９７３）］の方法の変法によって、デュポ ン（ＤｕＰｏｎｔ）−ＮＥＮ、マサチューセッツ州、ボストンからのポルトン・ ハンター（Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ）試薬を用いてヨウ素−１２５で標識し た。簡潔には、ポルトン・ハンター試薬２ｍＣ１を、５０ミリモルのリン酸ナト リウムＷＩＩｒ液、ｐＨ８，０の１００μｌ中、＄１１製ＩＬ−４の５．０ｕｇ と２２℃で２時閏反応させた０反応を、１．０モルグリシンを等量加えることに よって１時間急冷した。

ヨウ素化タンパク質は、５０ミリモルリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４中０．２％ ゼラチンで平衡させたＰＤ−１カラム（ファーマシア、ニューシャーシー州、ビ ス力タウェイ）中のゲル濾過によって単離された。カラムから空隙率で溶離する 放射性物質を集め且つ分析しな、ＩＩＩＩＩＬ−４の特異的放射能は、カルボ（ Ｃａｌｖｏ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２１２：２５９　（１９８３）］の自己 置換法によって決定されたように１５００Ｃ１／ミリモルであり、モル取込み比 率はタンパク質１モル当りヨウ素０．６８モルであった。

各種抗ポリペプチドｒｇＧ′＃１分の結合培地［１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２） 含有ＲＰＭ１１６４０］中連続稀釈の１０分の１ミリリツトル容量を、結合培地 １．０ｍｌ中の一定量の　Ｉ−ＩＬ−４’（約２Ｘ１０　ＣＰｍ）と−緒に、１ ．５ｍｌ試験管中、４℃で１８時間インキュベートした後、結合検定を実施しな 、このブレインキュベーションの後、試験管の内容物を２Ｘ１０６個のダウディ 細胞と混合し、その混合物を４℃で２時間インキュベートした。

インキュベーション後、＃胞を８００または１２．ＯＯＯＸｇでの遠心分離を４ ℃で３０秒間行うことによってペレットにし、上澄みを捨てた。４１胞を、ｍ１ ｓＩＬ−４含まない新しい結合培地０．１ｍｌ中に４℃で再懸濁し、上記のよう にペレットにし、検定ｉ地１００μｌに再懸濁し、そしてフタル酸ジブチルおよ びフタル酸ジオクチル（１：　１）１００μｌの上に置いた。細胞を、１３．０ ００×ｇで２分間ベレットに′し、液体窒素中で冷凍した後、ガンマカウンター で計数した。非特異的結合は、非標識ヒトＩＬ−４を１．０ｍｇ含む！ｉｃ＃で 平行して決定された。　′　□　゛　・ 前述の分析の結果を表２に示す。

尭２ ポＩペプ　ド■　Ｇ　の 抗原として用いた　抗体反応性ｂ　１２５ｔ　ＩＬ　４１に示される。

５抗体反応性の決定において、士は、対照ウェルの吸光度を差し引いた後の４１ ４ｎｍでの吸光度が０．０５を越えること意味する。

表２のデータは、ヒトＩＬ−４の残基５２〜６５（第６番ポリペプチド）、６１ 〜８２（第７番ポリペプチド）および１０４〜１２９（第１１番ポリペ１チド） に対応するポリペ１チドに対して生じた抗体が、ダウディ４１１３１１に対する １２５Ｉ−ＩＬ−４の結合の強力な阻害剤であったことを示している。これらの 抗体は免疫化ポリペプチドおよびＩＬ−４の双方に対して結合したが、予備免疫 血清はどちらにも結合しなかったし、レセプター結合に対する作用もなかった。

表２に更に示したように、ポリペプチド６および７に対する抗体は、標！ＩＩＩ Ｌ−４の結合を阻害するのに同等に強力である０表１は、これらのポリペプチド が共通のア゛ミノ酸部分鹸列ＫＤＴＲＣを共有していることを示している。この ように組み合わせ先根拠により、この部分配列は重要なエピトープを構成し且つ ５個程度の少ないアミノ酸’ａｘを含んでいるらしい本発明のポリペプチドを支 持することができるということが示唆される。

第６番のポリペプチドに対する多クローン性抗−によって生じた結合阻害は特に 興味深い、前述のように、フレティアンらは、同ポリペプチドに対して生じた単 クローン性抗体がＩ’Ｌ−４の生物活性を中和しないことを発見した。しかしな がら、以下に記載した引ぎ続きのエピトープ分析では、その抗体は、おそらく、 ポリペプチドのアミノ末端方向の残基に対して向けられていて、カルボキシル末 端の部分配列Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ　Ｃｙｓに対するのではないこと が示された。おそらくは、この実施例の多クローン性抗血清がＩＬ−４を阻害し たのは、その若干の抗体がこの特異的部分配列を含むエピトープに対して向けら れていたことによるものである。

第７番のポリペプチドに対する抗血清３４３−６ＩｇＧ画分について得られた結 果を図３にグラフで示し、２Ｘ１０６個のダウディ細胞を、５０ピコモルの１２ ５１−ＩＬ−４および指示した抗＃濃度について４℃で２時間インキュベートし たものである。抗体不在での特異的結合は３．３４７ｃｐｍであった。観察され た強力な結合阻害と、抗体が第７番のポリペプチドおよびＩＬ−４に対して特異 的に結合したという事実を組合わせることにより、抗体が向けられているアミノ 酸残基はＩＬ−４の表面上に晒されているらしいことが示唆される。

クローン　ボ１べ１　ド 単クローン性抗体を、本質的にはコーラ−およびミルスタイン［Ｎａｔｕｒｅ。

Ｂａ１ｂ／ｃマウス［チャールズ・リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）］に 、］２，６．１０．１４−テトラメチルペンタデカンプリスタン（Ｐｒｉｓｔａ ｎｅ）］５００μｌを腹腔内に（１，ｐ、）投与することによって免疫学的に感 作した。約４日後に、第７番のポリペプチド（表１；ヒトＩＬ−４の残基６１〜 ８２に対応する）２５０Ｉｇをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）２５０μｍ容量に溶解 させ、完全７０インドアジユバントの一部分２５０μｍを加え、そして混合物を 均一化し且つ各マウスに腹腔内投与した。約１か月後に、不完全フロインドアジ ュバントで１＝１に稀釈したポリペプチド１２５μｇを含むブースター注射を腹 腔内に投与した。

３または４週間後に、ＰＢＳ中の第７番のポリペプチド２５０μｇの最終層腔内 注射を投与した。免疫化の進行中、周期的に、尾静脈から試験採血を行い且つ前 記に記載したようにエライザによって分析した。Ｒ後の免疫化の４日後に、被験 動物を層殺し且つそれらの膵臓を取り出した。

膵臓は、２枚のスライドの間でストレプトマイシン１００μｇ／ｍ、およびペニ シリン１００単位／ｍｌを含む新しいＲＰＭ１１６４０培地（ＲＰＭＩｐｅｎ／ 　ｓ　ｔ　ｒ　ｅ　ｐ培地）中に浸軟させた後、大型試験管に移した。破片を１ 分間沈降させた後、試験管上層の細胞を５ｍｌ試験管に移した。ＲＰＭＩｐｅｎ ／５ｔｒｅｐ培地５ｍｌを加え、細胞を培地５甘ｌ後、約３００Ｘｇで８分間遠 心分離することによって沈降させた。

５：１の比率の肺臓細胞対Ｎ５−１マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣＴｌＢ１８ ）を調製し、ＲＰＭＩｐｅｎ／５ｔｒｅｐ培地で１回洗浄した。前記のように細 胞をペレットにした後、培地を捨て、分子量が約１５００ダルトンのＰＥＧ（７ ５ミリモルＨＥＰＢＳ＊衝液中、２ｇ／リットル）０．５ｍｌを、２０秒毎に静 かに撹拌しながら３７℃で１分間にわたって滴加した。ＰＥＧの添加は、ＰＥＧ 溶液を最初に０．５ｍｌ、次に１゜Ｏｍｌで繰り返した。

融合の後、細胞を沈降させ、そしてＲＰＭＩｐｅｎ／５ｔｒｅｐ培地０．５．１ ．０．２．０．４．０．８．０．１６．０および３２．Ｏｍｌを用いて１分間周 期で洗浄した。融合細胞を前記のように沈降させ、培地を捨てた後、無経験マウ スからの約Ｉ×１０５個の肺臓細胞を支持（ｆｅｅｄｅｒ）細胞として、グルタ ミン０．２９３３ｍｇ／ｍｌおよび１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＲＰＭ Ｉｐｅｎ／５ｔｒｅｐ培地に加え、そして細胞を混合した後、前記のように沈降 させた。マウスから単離後、その前日に、支持肺臓細胞は、グルタミンおよびＦ ｅ２を含むＲＰＭＩｐｅｎ／５ｔｒｅｐ墳地中、３７℃で一晩中インキユベート された。

よび１．６Ｘ１０−３モルのチミジンを含むＲＰＭＩｐｅｎ／５ｔｒｅｐ培地（ ＨＡＴ培地）中、１５０μｌ／ウエルの９６ウ工ル平底微量滴定プレート（ＣＯ ３ＴＡＲ）で７日間−緒に増殖させた。このインキュベージジン期間の後、各ウ ェル中の培地をＨＴ培地（アミノプテリンを欠いなＨＡＴ培地）で１き換え、イ ンキュベーションを続けた。

数日後、エライザを、ＩＩＩＩＩｌ抗マウスＩｇＧ抗体を用いることを除き、前 記に記載したようにバイプリドーマ上澄みについて行った。試験で陽性のウェル のハイプリドーマをＨＴ培地で限界稀釈することによってクローン化した。

クローン化したハイブリドーマ３８２全部をこの方法で製造し、その全部が単ク ローン性抗体を生じた。これらのハイブリドーマを、抗原として第７番のポリペ １チドを用いるエライザによってスクリーニングした後、１２種類の陽性細胞系 を同定した。これらの内１０種類は、ＩＬ−４に対するエライザスクリーニング によって陽性であることが分かった。

ＩｇＧ１抗体を生じ、１種類がＩｇＧ２ａ抗体を生じ、そして１種類がＩｇＭ抗 体を生じることが示された。

イーイオタイブ　の ント０．５ｍｌに加え、完全に混合してエマルジョンを生成した。試料をヒツジ ［ドーセット（Ｄｏｒｓｅ七）交配種］に皮下注射した。以後、ブースターワク チン注射を、不完全フロインドアジュバントを用いることを除き、同一の方法で 数週間間隔で投与しな。

符表平４−・・５０６３５９　（８） 免疫化の進行中に採取された不定期の血液試料について、免疫グロブリンによる ブロッキングを省略し且つホースラディ・ｙシュペルオキシダーゼで標識したロ バ抗ヒツジＩｇＧ５．Ｏｎｇを第二抗体として用いる。−とを除き、前記に記載 したように抗原として抗血清３４３−６ＩｇＧ画分を用いてエライザ分析を行っ た。

このようにして得られたヒツジ抗血清く抗血清１４４８で示された）は−ウサギ 抗血清３４３−６ＩｇＧ画分に対して特異的に結合するが、■し−４または第７ 番のポリペプチドに対して結合しないことが分かった。

モルの　Ｉ−ＩＬ−４＜２ｘｌＯ５ｅｐｍ）を含んでいた。抗血清不在での特異 的結合は５．９３１ｃｐｒｎであった。

図４で示したように、ヒツジ抗血清１４４８は、ｉＭＩＩ胞に対する標識ＩＬ− ４の結合の強力な拮抗阻ＩＦｉｌｑであり、一層低い稀釈度での８０％を上回る 特異的結合を無効にした。対照的に、ヒツジ予備免疫血清は、ＩＬ−４の結合に 対して作用しなかった。

五竺五二Ｚ分近 第６番および第７番のポリペプチドのアミノ酸残基が、細胞レセプターに対する ＩＬ−４の結合を阻害することができる抗体の産生に対して臨界的であったこと を決定するために、エピドーグ分析を、本質的には、ガイセン（Ｇｅｙｓｅｎ） ら［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υＳＡ　８１：３９９８（１９８ ４）］によって記載されたように行った。

ガイセンらの方法は、エライザを行うのに十分な純度および十分な量の多数の低 分子ポリペプチドの固体支持体上での急速な同時合成を可能にし、ポリペプチド は、それらを合成した固体支持体になお結合している。原則として、エライザは 、このようなポリペプチドについて、低分子ポリペプチドの配列を含むアミノ酸 配列を有する一層高分子のポリペプチドまたはタンパク質に対して製造された抗 体を用いて行われる。抗体が一層高分子の免疫原向のエピトープに特異的である 場合、すなわち、低分子の合成ポリペプチドに包含される場合、その抗体はポリ ペプチドに結合し且つエライザによって検出することができる。

ガイセンらの上記の方法を用いて、一連の１５種類のオクタペプチドをポリエチ レンビン［ゲンブリッジ・リサーチ・バイオケミカルズ・インコーホレーテッド （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｅａｌＳ。

Ｉｎｃ、）ニューヨーク州、バリー・ストリーム］上で合成し、その１１集体で のアミノ酸配列は、第７番のポリペプチド（成熟しトＩＬ−４の残１６１〜８２ に対応する）の残基金部を補った。これらのオクタペプチドの配列を表３に示す 。

皇ユ ｔ　ｌ０ＴＲＣＬＧＡ　ａ１４　ａｓ ２　ＤＴＲＣＬＱＡＴ　８２−６９　６１８３　ＴＲＣＬＱＡＴＡ　１１３−７ ０　６１７４　ｑｃＬＧＡｖＡｏ　１１４−７ｊ　ａａ５　ＣＬＧＡＴＡＯＯａ ５−７２　６９６　ＬＣ３ＡＴＡＯＯＦ　Ｎ−７３７０７ＧＡＴＡＱＱＦ）１　 ８７−７４　７１１５　ＲＨＫＯＬＩＲＦ　７５４２　７９同様に、成熟しトＩ Ｌ−４の残基４７〜７０に対応する残基全部を互いに補うた一連の１７ビン固定 化オクタベ１チドを製造した。これらのオクタペプチドのアミノ酸配列を表４に 示す。

表土 １オクタペプチドの中心残基は、便宜上、各オクタペプチドのＮ末＃ｌ残基が対 ティングする代わりにウェル中でピンを用いることｅＭき、本質的には前記に記 載したように、抗血清１２９−８８について行った。タイターチク（Ｔｉｔｅｒ ｔｅｃ）ＭＣＣ３４０エライザグレートリーダーを用いて色の展開を読み取る前 に、ピンを壁から除去した。

この分析結果を図５に示し、４Ｌ４ｎｍでの吸光度を各オクタペプチドについて 示している１図５に示したオクタペプチドの番号は、表３の番号に対応する。

オクタペプチド５〜１２に対する抗体の強力な結合は図５から分かる０表３を参 照することにより、これらのオクタペプチドのおよその中心は、成熟しトＩＬ− ４の残基６９〜７６に対応することが分かる。これらのデータと、抗血清１２９ −８８が細胞レセプターに対する標１ｉＩＬ−４の結合を阻害したという事実と を組み合わせることにより、成熟ヒトＩＬ−４の残基６９〜７６は、１種類また は複数種類のエピトー１を含み、それに対する抗体は、細胞レセプターに対する し）ＩＬ−４の結合を阻害するということが示唆される。

同様に、表４に示した固定化オクタペプチドを用いて、第６番のポリペプチドに 対して生じたウサギ抗血清を分析した。３４２−６で示したこの抗血清は、ダウ ディ細胞に対する１２５Ｉ−ＩＬ−４の結合を阻害する能力について２回評価さ れた。免疫化進行中の初期に調製された血清試料（初期抗血清３４２−６　）は 、１１１１Ｌ−４を阻害しなかったが；後期に調製された試料（後期抗血清３４ ２−６）は強力に阻害した。これらの分析の結果を、初期および後期抗血清につ いて、それぞれ図６ＡおよびＢに示す０図６で示したオクタペプチドの番号は表 ４の番号に対応する。

図６Ａで示したように、第６番のポリペプチドに対する非阻害初期抗血清３４２ −６は、オクタペプチド３〜７および９〜１３と反応性の抗体を含んでいた。

表４を参照することにより、これらのオクタペプチドの中心は、成熟しトＩｔ− ４の残基５３〜５７および５９〜６３それぞれにほぼ対応することが分かる。

後期の阻害抗血清３４２−６は、それが、オクタペプチド１１〜１６に対して更 に強力に結合することを示した抗体を更に含んでいたことを除き、同様の結合パ ターンを生じ（図６Ｂ）、その中心はヒトＩＬ−４の残基６１〜６６に対応した ６図６のパネルＡおよびＢのデータを総合することにより、成熟しトＩＬ−４の 残基６１〜６６はエビドーグを含み、それに対する抗体は＃ｌＪｔ！レセグター に対するヒトＩＬ−４の結合を阻害することが示唆される。

この示唆は、前記に記載したように、第６番および第７番のポリペプチド並びに 第７番のポリペプチドに対する単クローン性抗体の１種類を用いて行ったエライ ザの研究によって強調される。この抗体は双方のポリペプチドに対して強力に結 合した。更に、それは、ダウディ細胞に対する１２５Ｉ−ＩＬ−４の結合を強力 に阻害した。ポリペプチド中の唯一の共通の部分配列はＫＤＴＲＣであり、成熟 しトＩＬ−４の残基６１〜６５に対応している。当然の結果として、阻害単クロ ーン性抗体はこの部分配列に対して向けられていなければならないし、そして部 分配列は重要なエピトープを含んでいなければならないということになる。

本発明の多くの修正および変更は、当業者に明らかになるように、その精神およ び範囲から逸脱することなく行うことができる２本明細書中に記載した具体的な 実施態様は例としてのみ与えられ、発明は添付の請求の範囲の条項によってのみ 制限されるものである。

Ｆ／″ｆ／ Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−人５ｐ−ｒｌｅ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｇｌｕ− １１ｅ−工１ｅ−Ｌｙｓ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−丁ｈｒ− Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ− Ｔｈｒ−’Ｖａｌ−τｈｒ−人ｓｐ−工１ｅ−Ｐｈｅ−人１＆−人１ａ−５ａｒ −Ｌｙｓ−人５ｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ −Ｃｙｓ−人ｒｇ−人１＆−人１ａ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｌｌ−人ｒｇ−Ｇｌ ｎ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−ＧＬｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈ ｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−人１２Ｌ−〇Ｉｎ−Ｇ ｌｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−工１ｅ−Ａ ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｌ ｅｕ−τｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−人１ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−人５ｎ−５ｅｒ−Ｃ ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−人１＆−人５ｎ−Ｇｌｎ−５ｅｒ−Ｔ ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−人５ｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−人ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌ ｙｓ−Ｔｈｒ−工１ｅ−Ｍｅｔ−Ｆ７ｇ、２ 勺３ Ｉ釣濃度　（ｍｇ／ｍｌ） Ｒ９・５ 士クタペプ＋Ｆ寄テ Ｆｉｇ、６Ａ りオワ夕ベプ−ＰＦ番号 Ｆｉｇ、５Ｂ キクダペプーＦ−Ｉｒ：香門苧 要約書 細胞レセプターへのヒトＩＬ−４結合に対する２種類の抗体アンタゴニストが本 発明によって提供される。い（つかのアンタゴニストは、ｒＬ−４とそのレセプ ターとの間の相互作用に含まれると信じられているＩＬ−４の特異的領域へ結合 する。ＩＬ−４に対するアンタゴニストのこの特異的結合のために、レセプター に対するＩＬ−４の結合が実質的に阻害される。本発明の他のアンタゴニストは 、ＩＬ−４活性を欠いているものの、ＩＬ−４を模倣して細胞レセプターへの結 合のためにＩＬ−４と直接競うと考えられる、抗イデイオタイプの抗体である。

細胞レセプターに対するＩＬ−４の結合を阻害するアンタゴニストを使用する方 法と共に、抗体アンタゴニストを作るために用いられるポリペプチドもまた提供 される。

手続補正帯 平成　４年　６月２２日 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９０１０７２８９ ２、発明の名称 ヒトインターロイキン−４の抗体アンタゴニスト３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所 名　称　シエリング・コーポレーション４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 ５、補正の対象 請求の範囲 （別紙） （１）請求の範囲を以下の通り補正する。

ｒｌ、約５個〜約２６個のアミノ酸残基を含み且つヒトＩＬ−４のアミノ酸残基 ６１〜８２配列若しくはそれらの部分配列またはヒトＩＬ−４のアミノ酸残基１ ０４〜１２９の配列に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド。

１、アミノ酸配列、 Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ。

Ｔｈｒ７ＡＩａ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−）（ｉｓ、 Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｌｅ　ｕ　−Ｇ　Ｉ　ｙ　−Ａ　１ 　ａ−Ｔｈ　ｒ　−Ａ　１　ａ　−Ｇｌ　ｎ−Ｇ１　ｎ−Ｐｈｅ−Ｈｉ　ｓ−Ａ ｒｇ　−Ｈｉ　５−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｉ　Ｉｅ　−Ａｒｇ−Ｐｈｅま たは Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　１　ｎ−３ｅ　ｒ−Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ− Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉ　ｌ 　ｅ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｕ−Ｌｙｓ　−Ｔｙｒ−８ｅ　ｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙ ｓ−３ｅ　ｒ−ｅｒ を有する精求心１に記載のポリペプチド。

旦、ヒトＩＬ−４に対して、並びに約５個〜約２６個のアミノ酸残基を含み且つ ヒトＩＬ−４のアミノ酸残基６１〜８２または１０４〜１２９の配列に対応する アミノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドに対して特異的に結合す る抗体であって、細胞レセプターに対するヒトＩＬ−４の結合を阻害する前記の 抗体。

丘、ヒトＩＬ−４に対して、並びに約５個〜約２６個のアミノ酸残基を含み且つ ヒトＩＬ−４のアミノ＃残基６１〜８２まなは１０４〜１２９の配列に対応する アミノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドに対して特異的に結合す る抗体に対する抗イデイオタイプ抗体であって、細胞レセプターに対するヒトＩ Ｌ−４の結合を阻害する前記の抗体、」 以　上 １際調査報告 ｌＡｌｅｎｍｌａＭａｌＡ１％＋ｅｍ、ｎｕ、ＰＣＴハＩｓ９０１０７２８９

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．約５個〜約２６個のアミノ酸残基を含み且つヒトＩＬ−４のアミノ酸残基６ １〜８２または１０４〜１２９の配列に対応するアミノ酸配列またはその部分配 列を有するポリペプチド。
2. ２．担体分子に対して共有結合によって結合している請求項１に記載のポリペプ チド。
3. ３．アミノ酸配列、 【配列があります】 を有する請求項１に記載のポリペプチド。
4. ４．ヒトＩＬ−４に対して、並びに約５個〜約２６個のアミノ酸残基を含み且つ ヒトＩＬ−４のアミノ酸残基６１〜８２または１０４〜１２９の配列に対応する アミノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドに対して特異的に結合す る抗体であって、細胞レセプターに対するヒトＩＬ−４の結合を阻害する前記の 抗体。
5. ５．ヒトＩＬ−４に対して、並びに約５個〜約２６個のアミノ酸残基を含み且つ ヒトＩＬ−４のアミノ酸残基６１〜８２または１０４〜１２９の配列に対応する アミノ酸配列またはその部分配列を有するポリペプチドに対して特異的に結合す る抗体に対する抗イディオタイプ抗体であって、細胞レセプターに対するヒトＩ Ｌ−４の結合を阻害する前記の抗体。
6. ６．ヒトＩＬ−４を請求項４に記載の抗体と接触させることを含む、細胞レセプ ターに対するヒトＩＬ−４の結合を阻害する方法。
7. ７．ヒトＩＬ−４のためのレセプターを有する細胞を、請求項５に記載の抗イデ ィオタイプ抗体と接触させることを含む、細胞レセプターに対するヒトＩＬ−４ の結合を阻害する方法。
8. ８．生理的に許容し得る担体および有効量の請求項４に記載の１種類以上の抗体 を含む、アレルギーまたはＩＬ−４によって媒介された他の症状を治療するため の薬剤組成物。
9. ９．生理的に許容し得る担体および有効量の請求項５に記載の１種類以上の抗イ ディオタイプ抗体を含む、アレルギーまたはＩＬ−４によって媒介された他の症 状を治療するための薬剤組成物。
10. １０．生理的に許容し得る担体および請求項４または５のいずれか１項に記載の 有効量の１種類以上の抗体を含む、アレルギーまたはＩＬ−４によって媒介され た他の症状を治療するための薬剤組成物を製造する方法。