SK279933B6

SK279933B6 - Polypeptid, jeho subsekvencie a ich použitie

Info

Publication number: SK279933B6
Application number: SK6352-90A
Authority: SK
Inventors: Lata Ramanathan; Gail F. Seelig; Paul P. Tratta
Original assignee: Schering Corporation
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1990-12-18
Publication date: 1999-06-11
Also published as: EP0506826A1; HU215245B; JPH0730116B2; FI104180B; WO1991009059A1; FI104180B1; AU639754B2; PT96230B; IE74708B1; IE904589A1; FI922847A; DK0506826T3; TW221675B; MX9203401A; ES2085983T3; DE69026627D1; CZ635290A3; DE69026627T2; GR3020325T3; OA09704A

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka polypcptidu, jeho subsekvencií a ich použitia na prípravu polyklonálnej a/alebo monoklonálnej protilátky, ktorá sa špecificky viaže na ľudský IL-4.

Doterajší stav techniky

Interleukín-4 (IL-4) je proteín (bielkovina) ovplyvňujúci široké spektrum hematopoetických (krvotvorných) buniek [Strober et al.: Pediatr. Res. 24:549 (1988)]. IL-4 zvyšuje niektoré činnosti, vrátane funkcie makrofágov, tvorby IgG a IgE a bujnenie (novotvorenie tkanív) imunoglobulín-stimulovaných B buniek, antigén-stimulovaných T buniek a erytropoietín-stimulovaných predchodcov červených krviniek. Taktiež rovnako zvyšuje bujnenie IL-4-stimulovaných žírnych buniek.

Spolu s IgG zohrávajú žírne bunky ústrednú úlohu v alergických reakciách. Žírne bunky sú bunky spojivového tkaniva, obsahujúceho granuly; tieto bunky sú umiestnené čo najbližšie k vlásočniciam všade v tele a zvlášť vo vysokých koncentráciách sú v pľúcach, koži a gastrointenstinálnom a močopohlavnom trakte. Pri nasledujúcom vystavení žírnych buniek látke, vyvolávajúcej tvorbu protilátok (antigénu), podliehajú degranulácii a uvoľňujú chemické mediátory, ako je histamín, serotonín (5-hydroxytryptamín), heparín, prostaglandíny atď., pôsobiace na vyvolanie alergickej reakcie.

Kvôli stimulačným účinkom IL-4 na tvorbu IgE a bujnenie žírnych buniek môže byť antagonista IL-4 užitočný na liečbu alergií tým, že prichádza k poklesu rastu žírnych buniek a tvorby IgE.

Niektorí bádatelia používali protilátky na antagonistické pôsobenie na biologickú aktivitu IL-4. Napr. Finkelman so spolupracovníkmi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9675 (1986)] použili monoklonálnu protilátku proti BSF-1 (teraz nazývaný IL-4) na inhibovanie IL-4 indukovanej tvorby IgE pri myši, infikovaných nematode parazitom Nippostrongylus brasiliensis alebo pri myšiach, ktoré dostali injekciu rafinovanej (čistenej) kozej protilátky na IgD pri myšiach. O obidvoch liečbach bolo známe, že stimulujú tvorbu IgE; podľa neskoršej liečby potom tiež bolo známe, že stimuluje vylučovanie IL-4.

Nedávno uverejnil Chrentien so spolupracovníkmi [J. Immunol. Meth. 117:67 (1989)], že polyklonálne králičie antisérum k čiastočne čistenému rekombinantnému ľudskému IL-4 neutralizuje niektoré z biologických aktivít IL-4 in vitro. Monoklonálne protilátky proti syntetickým polypeptidom, majúcim poradie, alebo tiež sekvenciu (pozri ďalšia str.) aminokyselín, zodpovedajúce zvyškom 3 až 18, 31 až 46, 52 až 65 a 112 až 127 zrelého ľudského IL-4, však nestačí na neutralizovanie bioaktivity IL-4, hoci sa viažu na proteín.

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje polypeptidy, obsahujúce približne od 5 do 26 aminokyselinových zvyškov, ktoré majú poradie alebo tiež sekvenciu (pozri ďalšia str.) aminokyselín, zodpovedajúce poradiu, alebo tiež sekvencii (pozri ďalšia str.) aminokyselinových zvyškov 61 až 82 alebo 104 až 129 ľudského IL-4, alebo z toho nasledujúce poradie, alebo tiež sekvenciu (pozri ďalšia str.) - subporadie (subsekvenciu). Výhodné polypeptidy majú poradie aminokyselín: Lys-Asp-Thr-Arg-Cys,

Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His,

Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-Arg-Phe,

Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-Met-Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser.

Tento predložený vynález ďalej poskytuje protilátky, ktoré majú inhibičný účinok na väzbu ľudského IL-4 na bunkové receptory a špecificky sa viažu na taký IL-4 a na polypeptidy, obsahujúce približne od 5 do približne 26 aminokyselinových zvyškov a majúce poradie alebo tiež sekvenciu (pozri ďalšia str.) aminokyselín, zodpovedajúce poradiu alebo tiež sekvencii (pozri ďalšia str.) aminokyselinových zvyškov 61 až 82 alebo 104 až 129 ľudského IL-4, alebo z toho nasledujúce poradie, alebo tiež sekvenciu (pozri ďalšia str.) - subporadie (subsekvenciu), ktoré protilátky inhibujú väzbu ľudského IL-4 na bunkové receptory.

Tento vynález ďalej ešte poskytuje spôsoby, ako umožniť tvorbu protilátok, ktoré sa špecificky viažu a inhibujú väzbovosť ľudských IL-4 na bunkové receptory, ďalej zahrnuje spôsob podávania primeraného množstva polypeptidu živým organizmom (pokusným zvieratám), pričom tento polypeptid obsahuje približne od 5 do približne 26 aminokyselinových zvyškov a majúci sekvenciu aminokyselín, zodpovedajúcu sekvencii aminokyselinových zvyškov 61 až 82 alebo 104 až 129 ľudského IL-4 alebo jej subsekvencií (t.j. sekvenciu menšiu rozsahom, ale obsiahnutú v pôvodnej väčšej sekvencii, napr. ak je sekvencia ABCDE, subsekvencia môže byť ABC, BCD atď.), čím sa spôsobí, že tento živočích produkuje protilátky proti tomuto polypeptidu, ktorý sa špecificky viaže na ľudský IL-4 a inhibuje väzbovosť ľudského IL-4 na bunkové receptory.

Tento vynález ďalej ešte poskytuje anti-idiotypové protilátky proti uvedeným protilátkam. Tieto protilátky majú veľmi pravdepodobne antagonistický účinok na biologickú aktivitu IL-4, konkurujúcu s IL-4, ak ide o väzbovosť na bunkové receptory.

Tento vynález ešte ďalej poskytuje spôsob inhibičnej väzbovosti ľudského IL-4 na bunkové receptory, zahrnujúci kontaktovanie ľudského IL-4 s protilátkou, ktorá sa špecificky viaže na ľudský IL-4 a na polypeptid, obsahujúci približne od 5 do približne 26 aminokyselinových zvyškov a majúci sekvenciu aminokyselín, zodpovedajúcu sekvencii aminokyselinových zvyškov 61 až 82 alebo 104 až 129 ľudského IL-4 alebo jej subsekvencií, ktorá protilátka inhibuje väzbovosť ľudského IL-4 na bunkové receptory.

Tento vynález ďalej ešte poskytuje spôsob inhibičnej väzbovosti ľudského IL-4 na bunkové receptory, zahrnujúci kontaktovanie buniek, nesúcich receptory pre ľudský IL-4, s anti-idiotypovými protilátkami proti protilátkam, ktoré sa špecificky viažu na ľudský IL-4 a na polypeptid, obsahujúci približne od 5 do 26 aminokyselinových zvyškov a majúci sekvenciu aminokyselín, korešpondujúcu sekvencii aminokyselinových zvyškov 61 až 82 alebo 104 až 129 ľudského IL-4 alebo jej subsekvencií, ktorá anti-idiotypová protilátka inhibuje väzbovosť ľudského IL-4 na bunkové receptory.

Antagonistické protilátky podľa tohto vynálezu sú užitočné pri štúdiu väzbovosti in vitro receptora na určovanie mechanizmu pôsobenia IL-4 a/alebo identifikáciu agonistov alebo iných antagonistov IL-4. Ako už bolo skôr poznamenané, môžu byť tiež užitočné na liečbu alergií tým, že dochádza k poklesu bujnenia IL-4-stimulovaných žírnych buniek a tvorby IgE.

Tento vynález môže byť zrozumiteľnejší pri odvolaní sa na sprievodné obrázky, ktorých vysvetlenie nasleduje:

Obrázok 1 ukazuje poradie aminokyselín dospelého (zrelého) IL-4, od amino- do karboxyl-koncov (reťazcov atómov).

Obrázok 2 je grafické znázornenie väzbovosti IL-4 (dolná krivka) a polypeptidu č. 7 (horná krivka - pozri Tabuľka 1) na králičiu IgG frakciu proti polypeptidu pri analyzovaní priamym spôsobom ELISA. Množstvo viazaného proteínu/polypeptidu v pikomoloch je znázornené ako funkcia absorbancie pri 414 nm.

Obrázok 3 ukazuje grafické znázornenie inhibície špecifickej väzbovosti 125[_il_4 _na bunky Daudi na králičiu frakciu proti polypeptidu č. 7, ukazujúce percentuálnu špecificky viazanú rádioaktivitu ako funkciu nárastu koncentrácie IgG.

Obrázok 4 ukazuje grafické znázornenie inhibície špecifickej väzbovosti L 251_[ [ _4 _na bunky Daudi na anti-idiotypické antisérum 1448, ukazujúce inhibíciu špecificky viazanej rádioaktivity (v percentách) ako funkciu poklesu koncentrácie antiséra.

Obrázok 5 ukazuje grafické znázornenie výsledkov epitope analýzy robenej na králičom antisére proti polypeptidu č. 7. Je ukázaná ELISA absorbancia, získaná väzbovosťou tohto antiséra na rad oktapeptidov, použitá v tejto analýze. Počet oktapeptidov zodpovedá počtu uvedenému v tabuľke 3.

Obrázok 6 ukazuje grafické znázornenie výsledkov epitope analýzy, robenej na králičom antisére proti polypeptidu č. 6. Je ukázaná ELISA absorbancia, získaná väzbovosťou tohto antiséra na rad oktapeptidov, použitá v tejto analýze. Antisérum, použité na získanie výsledkov, ukázaných na grafickej tabuľke A, ktoré boli zhromaždené na začiatku priebehu imunizácie na králičom antisére a nedochádzalo k inhibovaniu väzbovosti na 125i_il-4 bunky Daudi. Antisérum, použité v druhej grafickej tabuľke B, bolo získané neskôr a bolo silne inhibované, ak ide o väzbovosť označeného IL-4. Počet oktapeptidov zodpovedá počtu uvedenému v tabuľke 4.

Všetky citované odkazy sú pričlenené v súhrnnej referencii. Poradie alebo tiež sekvencia aminokyselín polypeptidov ukazuje, že sú v štandardnej forme, označovanej ako štandardná jednopísmenová alebo štandardná trojpísmenová forma [Lehninger: Principles of Biochemistry, 1982, Worth Publishers Inc., New York, p. 96].

Predložený vynález poskytuje protilátky, ktoré pôsobia antagonistický na väzbovosť ľudského IL-4 na bunkové receptory pomocou:

(a) spojovania s oblasťou, ktorá je zrejme zahrnutá v interakciách s receptormi alebo (b) simulovania samotného IL-4 a tým konkurujúce, ak ide o väzbovosť na bunkové receptory.

Pretože IL-4 stimuluje tvorbu IgE protilátok a bujnenie žírnych buniek - dva efektory alergických reakcií - sú antagonistické protilátky podľa tohto vynálezu užitočné na liečbu alergií. Sú užitočné tiež pre in vitro systémy väzbovosťou receptorov, ďalej na objasnenie mechanizmu pôso benia IL-4 alebo na tienenie pre iné IL-4 antagonisty alebo agonisty.

Ľudským IL-4 sa tu rozumie proteín, ktorý:

(a) má poradie alebo tiež sekvenciu aminokyselín v podstate identické s poradím alebo tiež sekvenciou dospelého ľudského IL-4 ukázaného na obrázku 1 a (b) má biologickú aktivitu takú, aká je bežná pri prirodzenom (pôvodnom) IL-4.

V podstate zhodnou identitou poradia alebo tiež sekvencie aminokyselín sa mieni, že poradie alebo tiež sekvencia iného IL-4 je pri porovnaní s poradím na obrázku 1 identické alebo sa líši jednou alebo viacerými zmenami aminokyselín (vymiznutím, pridaním, substitúciou), ktoré podstatne nezmenšia biologickú aktivitu.

Samozrejme poradia alebo tiež sekvencie aminokyselín v oblastiach IL-4, ktoré boli uvedené, sa môžu líšiť v prípade v podstate identického IL-4s.

Výskumy so syntetickými polypeptidmi opísané v ďalšom texte ukazujú, že v molekule ľudského IL-4 sú dve oblasti, o ktorých sa ukazuje, že sú zahrnuté do väzbovosti receptora. Ak ide o vhodné (odporučené) referencie, poradie alebo tiež sekvencia aminokyselín týchto polypeptidov bude definované polohami aminokyselinových zvyškov v poradí alebo tiež sekvencii aminokyselín dospelého IL-4, ukázanom na obrázku 1, keď polohu označenú číslom 1 má aminokoncový zvyšok histidín a polohu označenú číslom 129 má karboxykoncový zvyšok serín.

Ako výsledok týchto výskumov bolo nájdené, že syntetické polypeptidy majúce poradie alebo tiež sekvenciu aminokyselín, zodpovedajúce poradiu alebo tiež sekvencii zvyškov 52 až 82 a 104 až 129 alebo subsekvencii ľudského IL-4, sa môžu použiť ako antigény na vyvolanie tvorby protilátok vo zvieratách; tieto protilátky sa môžu viazať na polypeptidy a na ľudský IL-4. Na ich schopnosť viazať sa na také špecifické oblasti IL-4, inhibujú protilátky podľa tohto vynálezu aspoň 60 % špecifickej väzbovosti 125j_il-4 na bunky nesúce receptory pre IL-4.

Najväčšie z predchádzajúcich oblastí väzbovosti IL-4 (zvyšky 52 až 82) obsahujú približne okolo 30 aminokyselinových zvyškov. Je veľmi dobre známe vo vede, že antigénne determinanty (epitopy) všeobecne obsahujú aspoň približne okolo 5 aminokyselinových zvyškov [Ohno et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:2945 (1985)]. Teda polypeptidy podľa tohto vynálezu obsahujú približne od 5 do približne 30 aminokyselinových zvyškov a majú poradie aminokyselín ako už bolo uvedené. Či daný polypeptid patrí do oblasti podľa tohto vynálezu, možno ľahko rozhodnúť obvyklým experimentálnym postupom s použitím spôsobov, ktoré budú opísané.

Tieto polypeptidy sa syntetizujú vhodným spôsobom, ako syntézou vylučovania pevnej fázy, metódami parciálnej (čiastočnej) pevnej fázy, fragmentovou kondenzáciou alebo klasickými roztokovými (rozpúšťacími) syntézami. Tieto polypeptidy sa výhodne pripravujú syntézou peptidov v pevnej fáze, ako je opísaná podľa Merrifielda - Merrificld: J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963). Táto syntéza sa robí s aminokyselinami a tie sú chránené na alfa-aminokonci reťazca. Trojfunkčné aminokyseliny s labilnými vedľajšími reťazcami sú tiež chránené vhodnými skupinami na preventívne zamedzenie nežiaducim chemickým reakciám, ku ktorým môže dochádzať v priebehu zostavovania polypeptidov. Príslušné alfa-amino chrániace skupiny sa selektívne odstraňujú tak, aby sa nasledujúcej reakcii umožnilo, aby prebehla na aminokonci reťazca.

Podmienky na odstraňovanie alfa-amino chrániacich skupín sú také, aby nedochádzalo k odstraňovaniu chrániacich skupín vedľajších reťazcov.

Tieto alfa-amino chrániace skupiny sú také, aké sú známe na použitie vo vedeckej práci z postupnej syntézy polypeptidov. Sú tu zahrnuté acylové typy chrániacich skupín (napríklad formylová, trifluoracetylová, acetylová), chrániace skupiny typu aromatického uretánu (napríklad benzyloxykarbonylová (Cbz), substituovaná benzyloxykarbonylová a 9-fluorenylmetoxyoxykarbonylová (Fmoc)), chrániace skupiny typu alifatického uretánu (napríklad terc, butyloxykarbonylová (Boe), izopropyloxykarbonylová, cyklohexyloxykarbonylová) a chrániace skupiny alkylového typu (napríklad benzylová, trifenylmetylová). Výhodná chrániaca skupina je Boe. Medzi chrániace skupiny vedľajšieho reťazca pre Tyr je zahrnutý tetrahydropyranyl, terc, butyl, trifenylmetyl, benzyl Cbz, 4-Br-Cbz a 2,6-dichlórbenzyl. Výhodnou chrániacou skupinou pre Tyr je

2.6- dichlórbenzyl. Medzi chrániace skupiny vedľajšieho reťazca pre Asp je zahrnutý benzyl, 2,6-dichlórbenzyl, metyl, etyl a cyklohexyl. Výhodnou chrániacou skupinou pre vedľajší reťazec je pre Asp cyklohexyl. Medzi chrániace skupiny vedľajšieho reťazca pre Thr a Ser je zahrnutý acetyl, benzoyl, trifenylmetyl, tetrahydropyranyl, benzyl,

2.6- dichlórbenzyl a Cbz. Výhodnou chrániacou skupinou pre Thr a Ser je benzyl. Medzi chrániace skupiny vedľajšieho reťazca pre Arg je zahrnutá nitroskupina, Tos, Cbz, adamantyloxykarbonylová a Boe. Výhodná chrániaca skupina pre Arg je Tos. Vedľajší reťazec aminoskupiny v Lys môže byť chránený pomocou Cbz, 2-Cl-Cbz, Tos alebo Boe. Skupina 2-Cl-Cbz je výhodnou chrániacou skupinou pre Lys.

Vybrané chrániace skupiny vedľajších reťazcov musia zostať nedotknuté (neporušené) v priebehu spojovania a nesmú sa odstraňovať v priebehu snímania chrániacich skupín aminokoncového reťazca alebo v priebehu uplatňovania podmienok, pri ktorých dochádza k spájaniu. Chrániace skupiny vedľajších reťazcov musia byť tiež odstrániteľné pri ukončení syntézy, pri použití reakčných podmienok, ktoré sú také, aby nedochádzalo k premieňaniu dokončeného (syntézou získaného) polypeptidu.

Syntéza na nerozpustnom nosiči sa obvykle vykonáva podľa karboxylkoncových reťazcov spojovaním alfa-amino chránených (chránené vedľajšie reťazce) aminokyselín na vhodnom pevnom nosiči. Esterové reťazenie (spojenie, väzba) sa tvorí vtedy, ak sa pripájanie robí na chlórmetylovej, alebo hydroxymetylovej živici a výsledný polypeptid bude mať na karboxylkoncovom reťazci - na karboxylovom ukončení - voľnú karboxylovú skupinu. Ak sa alternatívne použije benzhydrylamínová alebo p-metylbenzhydrylamínová živica, tvorí sa amidová väzba a výsledný polypeptid bude mať na karboxylovom konci reťazca karboxyamidovú skupinu. Tieto živice sú komerčne dostupné a ich prípravu opisuje Stewart et al.: Solid Phase Peptide Synthesis (2nd Edition), Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984.

K-koncová aminokyselina, chránená, ak je to nevyhnutné, na vedľajšom reťazci a na alfa-aminoskupine, sa pripája na benzhydrylamínovej živici pri použití rozmanitých aktivačných činidiel, zahrnujúcich dicyklohexylkarbodiimid (DCC), N, N'-diizopropylkarbodiimid a karbonyldiimidazol. Po pripojení na povrch živice sa alfa-amino chrániaca skupina odstraňuje s použitím trifluóroctovej kyseliny (TFA) alebo HC1 v dioxánc pri teplote medzi 0 °C a °C. Dimetylsulfid sa pridáva k tejto TFA po zavedení metionínu (Met) na potlačenie možnosti S-alkylácie. Po odstránení alfa-amino chrániacej skupiny sa zvyšné chránené aminokyseliny pridávajú (pripájajú) postupne v požadovanom poradí tak, aby sa získalo želané poradie.

Na kondenzačné reakcie na vytvorenie peptidovej väzby sa používajú rozmanité aktivačné činidlá, zahrnujúce DCC, N, N'-diizopropylkarbodiimid, benzotriazol-l-yl-oxy-tris(dimetylamino)-fosfóniumhexafluórfosfát (BOP) a DCC-hydrobenzotriazol (HOBt). Každá chránená aminokyselina sa použije v prebytku (>2,0 ekvivalentov) a spojovanie sa obvykle robí v N-metylpyrolidóne (NMP) alebo v DMF, CH2CI2 alebo v ich zmesiach. Rozsah pripájania pri tejto kondenzačnej reakcii na vytvorenie peptidovej väzby sa kontroluje v každom stupni, napríklad pomocou ninhydrínovej reakcie, ako ju opisuje Kaiser et al.: Anál. Biochem. 34: 595 (1970). V prípade, že sa zistí neúplné spojovanie, táto kondenzačná reakcia sa opakuje. Kondenzačné reakcie sa môžu vykonávať automatizovane pomocou komerčne dostupných prístrojov.

Po úplnom zostavení celého žiadaného polypeptidu sa systém polypeptid-živica štiepi pomocou činidla, ako je kvapalný HF, počas jednej až dvoch hodín pri teplote 0 °C, ktoré oddelí polypeptid od živice a odstráni všetky chrániace skupiny vedľajších reťazcov. Obyčajne sa používa kolektor (látka zachycujúca prechodne vznikajúce medziprodukty alebo vedľajšie produkty) ako anizol s kvapalným HF na prevenciu tvorby katiónov počas štiepenia z alkylačných aminokyselinových zvyškov prítomných v polypeptide. Systém polypeptid-živica sa môže podrobiť sňatiu chrániacej skupiny pôsobením TFA/ditioetán pred štiepením, ak je to žiaduce.

Cyklizácia vedľajšieho reťazca na vedľajší reťazec na pevnom nosiči vyžaduje použiť ortogonálne usporiadanie chránenia, ktoré umožňuje selektívne štiepenie vedľajšieho reťazca spôsobujúceho kyslosť aminokyselín (napríklad Asp) a zásadité aminokyseliny (napr. Lys). 9-Fluorenylmetyl (Fm) chrániaca skupina pre vedľajší reťazec Asp a 9-fluorenyloxylkarbonyl (Fmoc) chrániaca skupina pre vedľajší reťazec Lys sa môže použiť na tento účel. V týchto prípadoch sa vedľajšie reťazce chrániacej skupiny Boe chránený polypeptid-živica - selektívne odstraňujú pomocou piperidinu v DMF. Cyklizácia sa dosahuje na pevných nosičoch s použitím rozličných aktivačných činidiel, zahrnujúcich DCC, DCC/HOBt alebo BOP. Reakcia HF sa robí na cyklizovaný polypeptid-živicu, ako už bolo uvedené.

Na prípravu polypeptidov možno tiež použiť rekombinantnú DNA metodológiu. Známy genetický kód, prispôsobený ak je to potrebné známym výhodným kodónom na účinnejšie vyjadrenie v danom hostiteľskom organizme, môže byť použitý na syntézu oligonukleotidov na kódovanie požadovaného poradia aminokyselín. Fosforamiditovú metódu pevného nosiča podľa Matteucci et. al. [J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)] alebo inú známu metódu možno použiť na takéto syntézy. Výsledné oligonukleotidy možno vložiť do primeraného vektora a vyjadriť v kompatibilnom hostiteľskom organizme.

Polypeptidy podľa tohto vynálezu možno čistiť s použitím HPLC, gélovej filtrácie, výmenou iónov a rozdeľovacej chromatografie, roztrepávania alebo iných dobre známych metód a spôsobov.

Protilátky sa môžu pripraviť proti polypeptidom podľa predloženého vynálezu použitím štandardných metód. Tak, ako sa tu používa, sa slovo protilátka týka tak polyklo nálnych, ako aj monoklonálnych protilátok. Zahrnuje tiež všetky imunoglobulíny a ich antigén-väzbové fragmenty.

Polyklonálne protilátky sa môžu tvoriť imunizáciou živočíšneho hostiteľa, ako sú králik, potkan, koza, ovca, myš, atd'., s jedným z polypeptidov. Je výhodné, ak sa po počiatočnej (úvodnej) injekcii dá jedna alebo viac posilovacích injekčných dávok na zlepšenie protilátky (titru). Zo živočícha sa potom odoberie krv a pripraví sa sérum a vykoná sa depistáž štandardnými metódami, ako je viazaný enzým imunosorpčné stanovenie (ELISA), ktorý používa polypeptid ako antigén.

Výhodne sa imunogenetickosť polypeptidov zvyšuje spojením pomocnou látkou a/alebo konverziou na rozsiahlejšiu formu pred imunizáciou.

Vhodné pomocné látky na očkovanie živočíchov zahrnujú tieto látky ale neobmedzujú sa iba na ne: Adjuvant 65 (obsahujúci arašidový olej, mannidmonoleat a alumíniummonostearát (monostearát hlinitý)); úplné Freundovo adjuvans alebo neúplné adjuvans, minerálne gély, ako sú hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a kamenec; povrchovo aktívne látky ako sú hexadecylamín, oktadecylamín, lyzolecitín, dimetyldioktadecylamóniumbromid, N,N-dioktadecyl-N',N'-bis(2-hydroxymetyl)propándiamín, metoxyhexadecylglycerol a pluronické polyoly; polyanióny, ako sú pyrán, dextránsulfát, poly IC, polyakrylová kyselina a karbopol; peptidy ako sú muratnyldipeptid, dimetylglycín a tuftsín; a olejové emulzie. Peptidy sa môžu podávať tiež nasledujúcim včlenením do lipozómov alebo iných mikronosičov (zrejme ide o nosiče s veľmi jemnou štruktúrou mikroštruktúrou).

Imunogenetickosť polypeptidov možno tiež zvýšiť zosieťovaním alebo spájaním na imunogénnu molekulu nosiča vlastností (t.j. makromolekulu, ktorá má vlastnosť nezávisle vyvolávať imunologickú odozvu v živočíšnom hostiteľovi, ku ktorému sa polypeptidy podľa tohto vynálezu kovalentne viažu). Sieťovanie alebo konjugácia na molekulu nosiča sa môže požadovať preto, lebo malé polypeptidy niekedy pôsobia ako haptény (molekuly, ktoré sú schopné špecifickej väzbovosti na protilátku, ale nie sú schopné vyvolávať tvorbu protilátky, t.j. nie sú imunogénne). Konjugácia takých polypeptidov na imunogénnu molekulu nosiča vlastností sa umožňuje prostredníctvom imunogénnych fragmentov, čo je spoločne známe ako nosičový efekt.

Vhodné molekuly nosičov zahrnujú napríklad protcíny a prírodné alebo syntetické polymérové zlúčeniny, ako sú polypeptidy, polysacharidy, lipopolysacharidy atď. Užitočný nosič je glykozid nazývaný Quil A, ktorý opísal Morein at al., Náture 308: 457 (1984). Zvlášť výhodné sú molekuly nosiča proteíny, zahrnujúce, ale neobmedzujúce, hemokyanínové a cicavčie proteínové séra, ako sú ľudský alebo hovädzí gamaglobulín, ľudský, hovädzí alebo králičí sérumalbumín alebo metylované, alebo iné deriváty takých proteínov. Iné proteínové nosiče budú zrejmé podľa odborných vedeckých postupov. Výhodné, nie však nevyhnutné, je, aby bol proteínový nosič cudzí živočíšnemu hostiteľovi, v tele ktorého sa vyvolávajú protilátky proti polypeptidom.

Kovalentná väzba na molekulu nosiča sa môže robiť použitím metód, ktoré sú vo vedeckých postupoch veľmi dobre známe, pričom presná voľba bude diktovaná povahou použitej molekuly nosiča. Ak je imunogénna molekula nosiča proteín, môžu sa pripájať polypeptidy podľa tohto vynálezu, napríklad s použitím karbodiimidov rozpustných vo vode, ako sú dicyklohexylkarbodiimid alebo glutaralaldehyd.

Činidlá na spojovanie sa môžu použiť tiež na vlastné zosieťovanie polypeptidov bez použitia samostatnej molekuly nosiča. Také zosieťovanie do agregátov (zhlukov) môže tiež zvyšovať imugenocitu.

Sérum, získané zo zvierat takto imunizovaných, sa môže použiť priamo. Alternatívne sa môže separovať IgG frakcia zo séra s použitím štandardných metód, ako je plazmoforéza alebo adsorpčná chromatografia, používajúca IgG špecifické adsorbenty, ako sú imobilizovaný Proteín A.

Monoklonálne protilátky sa môžu pripraviť s použitím štandardných metód, napríklad ako opisuje Kohler et al.: Náture 256:495 (1975); Eur. J. Immunol. 6:511 (1976). V podstate sa živočíchy imunizujú tak, ako bolo už napísané, aby mohlo dôjsť k tvorbe somatických (telových) buniek vylučujúcich protilátky. Tieto bunky sa potom odoberajú z imunizovaného živočícha na spojenie s bunkami myelómu (nádoru kostnej drene).

Somatické bunky so schopnosťou vytvárať protilátky, najmä B-bunky, sú vhodné na spojenie (väzbu) s líniou bunky myelómu. Tieto somatické bunky sa môžu odvodiť od miechových uzlín, sleziny a obvodovej krvi primáme imunizovaných živočíchov. V príkladovej časti tohto vynálezu boli použité bunky sleziny myši, pretože tieto bunky produkujú čiastočne vysoké percento, ktoré sa stabilne spojuje s líniou myelómu myší. Je však možné použiť miesto toho aj bunky potkana, králika, žaby, alebo iné.

Špecializované línie buniek myelómu môžu byť vyvinuté z lymfocytných nádorov na použitie v metódach hybridómy-produkujúcich spojeniach (syntézach) [Kohler a Milstein: Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Shulman et al.: Náture 276: 269 (1978); Volk et al.: J. Virol. 42:220 (1982)]. Línie týchto buniek možno vyvíjať aspoň z troch dôvodov. Prvý je uľahčenie výberu spájajúcich sa hybridómov z nespojovaných a podobne nedefinovateľných samomnožiacich sa buniek myelómu. Obyčajne sa to dosiahne použitím myelómov s deficitným enzýmom, čo spôsobí neschopnosť rastu v určitých selektívnych médiách a ovplyvní kladne rast hybridomás. Druhý dôvod vzniká z vrodenej schopnosti lymfocitných nádorových buniek produkovať svoje vlastné protilátky. Účelom použitia monoklonálnych techník je získať spojované (fúzované) líniové bunkové hybridy s neobmedzenou životnosťou, ktorí produkujú žiadanú jednotlivú protilátku s genetickou reguláciou zložky hybridómu telovej bunky. Na elimináciu produkcie protilátok nádorových buniek pomocou hybridomás sa používajú línie buniek myelómu, ktoré nie sú schopné produkovať ťažké alebo ľahké (zložité alebo malé) imunoglobulínové reťazce alebo nedostatočné v protilátkovom vylučovacom mechanizme. Tretí dôvod na výber línií týchto buniek spočíva v ich vhodnosti a účinnosti na spojovanie (fúziu).

Na produkovanie spojovaných (fúzovaných) bunkových hybridov možno použiť mnohé línie buniek myclómu, zahrnujúce napríklad P3X63-Ag8, P3/NSl-Ag4-l (NS-1), Sp/O-Agl4 a S194/5.XXO.Bu.l. Bunkové línie P3X63-Ag8 a NS-1 opísali Kohler a Milstein: Eur. J. Immunol. 6:511 (1976). Shulman et al.: Náture 276:269 (1978) vyvinul líniu myelómu Sp2/O-Agl4. Línie S194/5.XXO.Bu.l opísal vo svojej práci Trowbridge: J. Exp. Med. 148: 313 (1979).

Spôsoby na generovanie (vytváranie) hybridov produkujúcich protilátku, a to hybridov buniek sleziny alebo miazgových uzlín a myelóma buniek, obyčajne zahrnujú zmiešavanie telových buniek s myleóma bunkami v pomere 10 : 1 (hoci pomer môže veľmi kolísať od pomeru približne 20 : 1 do približne 1 : 1), čo sa uvádza ako príklad, pri prítomnosti niektorého činidla alebo činidiel (chemických, vírusových alebo elektrických), ktoré podporujú fúzovanie bunkových membrán. Spôsoby fúzovania opísali Kohler a Milstein, supra, Gefter et al.: Somatic Celí Genet. 3:231 (1977) a Volk et al.: J. Virol. 4:220 (1982). Činidlami, podporujúcimi fúzovanie, boli podľa týchto bádateľov Sendai vírus a polyetylénglykol (PEG). Postup fúzovania podľa príkladu v predloženom vynáleze použil PEG.

Pretože postupy fúzovania produkujú životaschopné hybridy vo veľmi nízkej početnosti (napríklad keď sa použijú ako zdroj - miesto vzniku - telové bunky sleziny, získa sa iba jeden hybrid z približne každých 1 x 1(Ú buniek sleziny), je nevyhnutné mať prostriedky, ako vybrať fúzované bunkové hybridy (lepšie ako oddeliť, vytriediť, bunkové hybridy) zo zvyšných nesfúzovaných buniek, najmä nefúzované myelóma bunky. Taktiež sú nevyhnutne prostriedky na detekciu (zisťovanie) žiadaných protilátky produkujúcich hybridomás medzi inými výslednými fúzovanými bunkovými hybridmi.

Všeobecne sa výber fúzovaných bunkových hybridov dosahuje kultiváciou buniek v prostredí podporujúcom rast hybridomás, ale zabraňujúcemu rastu nefúzovaných myelóma buniek, ktoré by normálne pokračovalo nedefinovaným delením. Telové bunky, použité na fúzovanie, nemajú dlhodobo uchovateľnú životaschopnosť v in vitro kultúre, a preto nerobia problémy. V príklade podľa predloženého vynálezu boli použité myelóma bunky bez hypoxantínfosforibosyltransferázy (HPRT-negativny). Selekcia proti týmto bunkám sa robí v prostredí hypoxantin/aminopterín/tymidín (HAT), prostredí, v ktorom fúzované bunkové hybridy prežívajú primerane k HPRT-pozitívnemu genotypu buniek sleziny. Použité myelóma bunky s odlišnými genetickými nedostatočnosťami (citlivosť na lieky atď.) sa tak môžu vytriediť proti genotypicky súťažiacim hybridom, ktorých rast je v tomto prostredí, ktoré rast podporuje, tiež možný.

Na selektívnu kultiváciu fúzovaných bunkových hybridov sa vyžaduje niekoľko týždňov. Na začiatku tohto časového obdobia je nevyhnutné identifikovať tie hybridy, ktoré produkujú žiadanú protilátku, tak, aby sa mohli následne klonovať a množiť. Všeobecne platí, že okolo 10 % získaného hybridu produkuje žiadanú protilátku, pričom nie je neobvyklé, že sa rozmedzie pohybuje približne od 1 do približne 30 %. Detekcia protilátky produkujúcich hybridov sa môže robiť niektorou z rôznych štandardných metód stanovenia, zahrnujúcich techniky imunologického stanovenia viazaného enzýmu a techniky rádioimunologického stanovenia, čo je opísané v literatúre [pozri napríklad Kennet et al. (editors): Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, pp. 376-384, Plénum Press, New York (1980)].

Raz získané žiadané fúzované bunkové hybridy boli vybrané a klonované do individuálnych protilátky produkujúcich bunkových línii, každá línia buniek sa môže množiť jedným z dvoch štandardných postupov. Suspenzia buniek hybridómu môže byť injektovaná do histokompatibilného živočícha. Živočích, ktorý dostal takú injekciu, bude potom vyvíjať nádory a tie budú vylučovať špecifickú mo noklonálnu protilátku produkovanú fúzovaným bunkovým hybridom. Telové tekutiny živočíchov, ako sú sérum alebo tekutina ascited (tekutina pri vodnatieľke brušnej), sa môžu odsávať dutou ihlou (punkcia) a tak poskytnú monoklonálne protilátky vo vysokej koncentrácii. Alternatívne možno individuálne bunkové línie množiť in vitro v laboratórnych kultivačných nádobách. Kultivačná pôda, obsahujúca Jednorazovú) jednotlivú špecifickú monoklonálnu protilátku vo vysokých koncentráciách, sa môže získavať dekantáciou, filtráciou alebo centrifugáciou.

Či sú anti-polypeptidové protilátky vyrobené tak, ako bolo opísané, vhodné na použitie v tomto vynáleze, sa určí pomocou vyšetrovacej metódy, zloženej z dvoch častí, ktoré zahrnujú:

(a) ELISA-test, čo je analýza, používajúca imunizovaný polypeptid a ľudský IL-4 ako antigény (v tomto prípade) a (b) rádioligandovú receptorovú väzbovú analýzu, v ktorej sa meria inhibícia špecifickej väzbovosti 125]_jl-4 na bunkové receptory.

Rekombinantný ľudský IL-4 na použitie v týchto stanoveniach je komerčný výrobok, dostupný napríklad z Genzymc Corporation, Boston, MA. Alternatívne môže byť produkovaný s použitím známej nukleotidovej sekvencie IL-4 génu [Yokoto et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5894 (1986)] a štandardnými rekombinantnými metódami DNA [pozri napríklad Intemational Patent Application Publication No. WO 87/02990; Kimmenade et al.: Eur. Biochem. 173 :109 (1988)].

Analýza ELISA sa robí štandardnými metódami, ako je metóda Chrentiena a kol.: J. Immunol. Meth. 117: 67 (1989), používajúca polypeptid alebo IL-4 adsorbovaný na mikrotitračnej doštičke. Prítomnosť protilátok, viazaných na imobilizovaný polypeptid alebo proteín, sa deteguje označenou anti-IgG druhou protilátkou.

Takéto druhé protilátky sa výhodne označujú niektorým enzýmom, ako sú peroxidáza, glukózooxidáza, -galaktozidáza alebo alkali-fosfatáza (alkalická fosfatáza). Chrenová peroxidáza sa môže detegovať spektrofotometrickou analýzou svojej aktivity na substráte, ako sú pyrogalol, o-fenyléndiamín alebo 2,2'-azinobis (3-etyl-bcnzotiazolín-6-sulfónová kyselina).

Protilátky, v ktorých sa našlo, že sa špecificky viažu tak na imunizovaný polypeptid, ako na IL-4, sa ďalej vyhodnocujú podľa schopnosti inhibovať špecifickú väzbovosť označeného IL-4 na receptory na vhodných terčovitých bunkách. Antipolypeptidové protilátky podľa tohto vynálezu sú charakterizované schopnosťou inhibovať aspoň 60 % tejto väzbovosti.

Na stanovenie väzbovosti možno použiť niektoré nesúce bunky IL-4 receptorov, ako je Jijoye, U-937, CCRF-CEM a CEM-CM3 bunky, ale bunky Daudi sú vhodné a ľahko dostupné. Bunky Daudi sú dobre charakterizované B lymľooblasťou bunkovej línie odvodenej od chorých na Burkittov lymfóm, ktoré možno získať z Američan Type Culture Collection pod Accesion No. ATCC CCL 213. 125ml-4 na použitie na stanovenie (test) sa môžu pripraviť značkovaním IL-4 pomocou jódu-125, napríklad laktoperoxidázovou metódou [Dávid et al.: Biochemistry 13 : 1014 (1974)] alebo metódou Boltona et al.: Biochem. J. 133:529 (1973). Glykozylovaný rekombinantný ľudský IL-4 je komerčný výrobok, ktorý možno získať napríklad od Genzyme Corporation, Boston, MA.

Anti-idiotypové protilátky podľa tohto vynálezu sú priame oproti protilátkam, špecifickým pre IL-4 antigénové determinanty, prítomné v polypetidoch podľa tohto vynálezu. Také anti-idiotypové protilátky napodobňujú alebo sa správajú ako pôvodné antigénové determinanty (pozri napríklad U.S.Patent No. 4, 731, 237 Reagana et al.). Podobne ako pri samotnom IL-4 , dá sa o týchto látkach predpokladať, že sa špecificky a priamo viažu na IL-4 receptory. No anti-idiotypové protilátky nemajú biologickú aktivitu IL-4.

Také anti-idiotypové protilátky sa pripravujú očkovaním živočíchov protilátkou (polyklonálnou alebo monoklonálnou) proti polypeptidom podľa tohto vynálezu. Môžu sa získavať (izolovať) ako celé polyklonálne antisérum alebo ako jeho IgG frakcia, alebo ako monoklonálne protilátky, produkované klonovanim hybridomás, ako bolo uvedené.

Môžu sa pripraviť farmaceutické prostriedky s takým zložením, aby obsahovali účinné množstvo jednej alebo viacerých protilátok podľa tohto vynálezu a fyziologicky prijateľné nosiče. Takéto nosiče sú veľmi dobre známe z odborných postupov vo vedeckej práci. Protilátky sa môžu podávať priamo alebo vo forme farmaceutického prostriedku (kompozície) ľudskému pacientovi na liečenie alergii alebo iných stavov, sprostredkovaných IL-4. Farmaceutické prostriedky sa vyrábajú primiešavaním fyziologicky prijateľného nosiča k účinnému množstvu jednej alebo viacerých protilátok.

Určenie správneho dávkovania protilátky podľa tohto vynálezu pri zvláštnych stavoch záleží na vedeckej odbornosti. Všeobecne sa liečba začína menšími dávkami, ako je optimum. Potom sa po malých prídavkoch zvyšuje až po dosiahnutie optimálneho účinku podľa okolností. Ak je to žiaduce, býva výhodné rozdeliť celkovú dennú dávku na niekoľko podielov, ktoré sa podávajú postupne v priebehu dňa.

Množstvo a frekvencia (častosť) podávania protilátok podľa vynálezu možno regulovať podľa posudku klinického ošetrovania, zahrnujúce také faktory, ako sú vek, stav a veľkosť pacienta a prudkosť (naliehavosť) symptómov (symptómu), ktoré sa majú ošetrovať.

Ďalej budú uvedené príklady vykonania vynálezu. Ak nebude uvcdcnc inak, ďalej uvedené percentá pevných látok v pevných zmesiach, kvapaliny v kvapalinách a pevných látok v kvapalinách sa udávajú ako hmotnosť/hmotnosť, objem/objem a hmotnosť/objem.

Proteín bol určovaný spôsobom používajúcim metódu podľa Lowry et al.: J. Biol. Chem. 193: 265 (1951), s použitím hovädzieho sérumalbumínu ako štandardu. Biologická skúška IL-4 bola robená tak, ako ju opisuje Mossman: J. Immunol. Methods 65: 55 (1983), meranie stimulácie bunkového bujnenia ako MTT (3-[4,5-Dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazóliumbromid) príjem v PHA-stimulovaných ľudských periférnych lymfocytoch. Jedna jednotka IL-4 aktivity je množstvo IL-4, ktoré je vyvolané polovicou maximálnej stimulácie v 2 x 1 (Ú bunkách pri teste. Jeden mikrogram čistého ľudského IL-4 má okolo 20,000 jednotiek aktivity pri teste.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Syntéza polypeptidu

Bol syntetizovaný celý rad polypeptidov, ktorých sekvencia aminokyselín spolu zodpovedá sekvencii aminokyselín celého dospelého ľudského IL-4 proteínu.

Polypeptidy boli syntetizované použitím tzv. sytézy v tuhej fáze, ktorú do chémie peptidov zaviedol Merrifield [J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963)] a bol pri nej použitý systém Applied Biosystems Model 430A. Ako amino-chrániaca skupina bol použitý terc, butylkarbonyl a symetrické anhydridy. Nasledovalo (po syntéze) odstránenie chrániacich skupín a polypeptidy boli odštiepené zo živice (nosiča) pomocou fluorovodíka.

Polypeptidy sa čistia chromatografiou s obrátenými fázami; HPLC s reverznými fázami (stacionárna fáza je nepoláma) s použitím Rainin DynamaxW C-8 kolóny vyvinutej s gradientom acetonitrilu v 0,1 % kyseliny trifluóroctovej, Eluát bol sledovaný ultrafialovou absorbanciou pri 214 nm. Totožnosti čistených polypeptidov boli potvrdené sekvenovaním aminokyselín a hmotnostnou spektrálnou analýzou pri použití štandardných metód.

Takto vyrobené polypeptidy, ich sekvencie aminokyselín a tie zvyšky ľudského IL-4 (t.j. bez signálneho peptidu; pozri obrázok č. 1), ktorým zodpovedajú sekvencie polypetidu, ukazuje tabuľka 1.

Tabuľka 1: Štruktúry syntetických polypeptidov

PolypepLid číslo	Sekvencia	Zodpovedajúce IL-4 zvyšky
1	HKCDITLQBIIKTLNSLTEOKTLCTE	1-26
2	CDITLQEIIKTLNSLT	3-18
3	TEOKTLCTBLTVTD	18-31
4	DIFAASKNTTEKBTFC	31-46
5	ETFSRAATVLRQFYS’	43-57
6	LRQFYSHHBKDTRC	S2-65
7	KDTRCLGATAQQFHRHKQLIRF	61-82
a	LKRLDRNLWGLAGLNSCPVK	03-102
9	AQQFHRHKQLIRFLKRLDRNLWG	70-92
10	CPVKEANQSRLEN	99-111
11	ANQSTLBNFLERLKTIMREKYSKCSS	104-129
12	FLERLKTIMREKYSKC	112-127

Sekvencia aminokyselín polypeptidu č. 5 zodpovedá zvyškom 43-57 s výnimkou, že zvyšok cyscein v polohe 46 ľudského IL-4 bol v polypeptide nahradený zvyškom serínu.

Analýza hydrofility ľudského IL-4 sa vykonáva podľa Hoppa et al: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824 (1981) a ukazuje, že oblasť zodpovedajúca polypetidu č. 7 obsahuje tak hydroftlné, ako aj hydrofóbne zvyšky, ktoré sú predpovedané podľa modelov sekundárnej štruktúry možnej formy oblasti skrutkovice (-helix, -špirálovej štruktúry) v IL-4.

Príklad 2

Príprava a charakterizácia antipolypeptidových protilátok

Dva miligramy polypeptidu č. 7 (tabuľka 1), zodpovedajúceho aminokyselinovýcm zvyškom 61-82 ľudského IL-4, sa rozpustí v 0,4 ml 0,5M-Tris-HCl, pH 6,8 a 0,1 ml očkovacej látky proti čiernemu kašľu (pôvod, kmeň 18334, umŕtvenej teplom, 20 jednotiek/ml, 1/10,000 zriedenie thimersal). Pridá sa úplné Freundovo adjuvans (0,5 ml) a vzorka sa homogenizuje v injekčnej striekačke. Imunizujú sa novozélandské biele králiky; každý dostáva 1 ml vzorky po 0,1 ml (200 pg polypeptidu) vnútrokožnými injekciami.

Počas obdobia približne štyroch mesiacov a potom periodicky sa dávajú posilňovacie injekcie, ako je uvedené. Periodicky sa odoberala krv z ucha alebo stehennej žily králikov a poskytovala sa na zrážanie.

Zo séra jedného z králikov sa izoluje IgG frakcia adsorbovaním séra na Proteín A-Sepharose(R) kolóne (Pharmacia, Piscataway, NJJ, uvedenej do rovnováhy tlmivým roztokom l,5M-glycinu, pH 8,9. Chromatografia sa robí štandardnými metódami podľa Fortona Biochem. Co. Podľa posúdenia má čistená látka asi okolo 98 % čistého IgG podľa SDS polyakrylamidovej gélovej elektroforézy - Laemmli: Náture 227: 680 (1970). Táto látka sa označuje ako antisérum 343-6 IgG frakcie.

Použitím podobných metód sa získajú IgG frakcie antiséra proti ostatným polypeptidom uvedeným v tabuľke 1. EL1SA test sa robí na izolovaných IgG frakciách nanášaním na 96-jamkové mikrotitračné doštičky (Becton-Dickinson), približne 0,25 pg (mikrogramu) jedného z rozmanitých polypeptidov v 50 pl (mikrolitroch) Tris-pufrovaného fyziologického roztoku (TBS - Tris-buffered saline; 50 nM Tris, 0,15 NaCl, pH 7,0) počas jednej hodiny pri teplote miestnosti). Nasleduje inkubácia, jamky sa päťkrát premyjú roztokom TBS, obsahujúcim 0,1 % Twen 20 (polyoxyetylénsorbitan monolaurát).

Premyté jamky sa blokujú 1 % hovädzím sérumalbuminom (BSA - bovine sérum albumín) v TBS počas jednej hodiny pri teplote miestnosti, päťkrát sa premyjú TBS, blokujú 0,1 % nešpecifického IgG v TBS počas dvoch hodín pri teplote miestnosti, a päťkrát sa premyjú tak, ako je opísané. Do jamiek sa potom pridávajú päťdesiatmikrolitrové podiely rozličných zriedení IgG frakcií v TBS a doštičky sa podrobia inkubácii pri teplote miestnosti počas jednej hodiny, a potom sa premývajú rovnakým spôsobom, ako je uvedené.

Ku každej jamke sa pridá 50 pl (mikrolitrov) TBS, obsahujúceho 2,5 ng kozieho antikráličieho IgG, značeného chrenovou peroxidázou, a doštičky sa podrobia inkubácii počas jednej hodiny pri teplote miestnosti. Po premývaní tak, ako je opísané, sa jamky vyvíjajú s peroxidom vodíka a 2,2-azinodi (3-etylbenzotiazolínsulfonátom).

Porovnávacie jamky sa vyvíjajú rovnako, ale jedna z určovaných zložiek (t.j. antigén, protilátka alebo značená druhá (druhotná, sekundárna) protilátka) sa vynecháva. Vzorky sa merajú v spektrofotometri Dynatech Model 650.

Výsledky takej analýzy, robenej na antisére 343-6 IgG frakcii s použitím polypeptidu č. 7 (tabuľka 1) a ľudského IL-4 ako antigénov, ukazuje obrázok 2. Tam, kde sa absorbancia pri 414 nm ako miera väzbovosti antigénu ukazuje ako funkcia množstva polypeptidu alebo ľudského IL-4 na jamku, sa môže zdať, že sa protilátky viažu na obidva antigény. Na získanie týchto výsledkov sa antisérum 343-6 IgG frakcie riedi v pomere 1 : 200 pred nanášaním 50 μΐ (mikrolitrov) do jamiek.

Na určenie, ktorá z protilátok v antipolypeptidovej IgG frakcii, špecificky sa viažucej na ľudský IL-4, by mohla takto inhibovať väzbovosť IL-4 na bunkové receptory, sa používa analýza väzbovosti rádioligandov.

Čistený rekombinantný ľudský IL-4 vyjadrený v CHO bunkách [Le et al.: J. Biol. Chem. 263: 10817 (1988)] bol značkovaný pomocou jódu-125 modifikáciou metódy Boltona et al.: Biochem. J. 133: 529 (1973), používajúcej činidlo Bolton-Hunter firmy DuPont-NEN, Boston, MA. Stručne možno uviesť, že pri tejto metóde reaguje 2 mCi, t.j. s rádioaktivitou 7,4 . 1θ7 Bq, Boltonovo-Hunterovo činidlo s 5,0 ug (mikrogramov) čisteného IL-4 v 100 μΐ (mikrolitroch) tlmivého roztoku 50-mM fosforečnanu sodného, pH 8,0, počas dvoch hodín pri teplote 22 C. Reakčný systém sa potom na jednu hodinu prudko ochladí (zmrazí) pridaním primeraného objemu 0,lM-2-aminoetánovej kyseliny (glycínu).

Jódovaný proteín sa izoluje gélovou filtráciou na PD-1 kolóne (Pharmacia, Piscataway, NJ), ekvilibrovanej (uvedenej do rovnováhy) 0,2 % želatíny v 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7,4. Rádioaktívna elučná látka z kolóny v medzerovom objeme sa zachytáva a analyzuje. Špecifická rádioaktivita značeného IL-4 bola 1500 Ci/nmol (t.j. 5,55 . 1013 Bq) určená samovytesňovacou metódou podľa Calvo et al.: Biochem. J. 212: 259 (1983) a molámy pomer zavedenia do molekuly bol 0,68 molu jódu na jeden mol proteínu.

Postupne zrieďované rozmanité antipolypeptidové IgG frakcie vo väzbovom médiu (RPMI 1640 s 10 % plodového séra teľaťa - fetal calf sérum - FCS) s objemom desatina mililitra v každej vzorke, sa podrobí inkubácii s konštantným množstvom 125i_jl-4 (približne 2 x 10-5 cpm) v 1,0 ml väzbového média v skúmavkách s objemom 1,5 ml počas 18 hodín pri teplote 4 °C, pred vykonaním testov na väzbovosť. Nasleduje preinkubácia, objemy skúmaviek sa spoja s 2 x 1θ6 Daudi bunkami a zmesi sa inkubujú počas dvoch hodín pri teplote 4 °C.

Nasleduje inkubácia, bunky sa peletujú pri 800 alebo 12 000 x g počas 30 sekúnd pri teplote 4 °C a potom sa odstránia jednotlivé podiely kvapaliny nad usadeninou (supematant). Bunky sa resuspendujú v 0,1 ml čerstvého väzbového média bez označeného IL-4 pri teplote 4 °C, peletujú sa, ako je opísané, resuspendujú v 100 μΐ (mikrolitroch) skúšobného média a pokryjú sa vrstvou 100 μΐ (mikrolitrov) dibutylftalátu a dioktylftalátu (1 : 1). Tieto bunky sa peletujú pri 13 000 x g počas dvoch minút, zmrazia sa v kvapalnom dusíku, a potom sa stanovuje počet impulzov v detektore (počítadle) žiarenia gama. Nešpecifická väzbovosť sa určuje v paralelných vzorkách, obsahujúcich 1,0 mg neznačeného ľudského IL-4.

Výsledky predchádzajúcich analýz ukazuje tabuľka 2.

Tabuľka 2: Analýza antipolypeptidových IgG frakcií

Polypeptid použitý ako antigén’	Reaktivita protilátky s'” poiypeptiúom 11.-4	i inhibície ^iael-lL-4 väzbovosti
1	₊	0
2	+ +	0
3		2,4
4	₊ ♦	0
5		8,7
6	₊ »	76
7	+ +	78
e		7,5
9	+ 4-	39
10	₊ *	26
11	+ +	60
12	⁺ *	0
'Sekvencie aminokyselín polypeptidov a zodpovedajúcej oblasti
v molekule íudského IL-4 5ú ukázané v Tabulke 1.
Pri určovaní reaktivity protilátky, + značí abaorbanciu pri
414 nm 0,05	po odpočítaní absorbancie porovnávacích jamiek.

Údaje, uvedené v tabuľke 2, ukazujú, že protilátky produkované proti polypeptidom, korešpondujúcim aminokyselinovým zvyškom 52 - 65 (polypeptid č. 6), ďalej 61-82 (polypeptid č. 7) a 104 - 129 (polypeptid č. 11) ľudského IL-4, sú veľmi silné inhibítory väzbovosti 125). -IL-4 na Daudi bunky. Tieto protilátky sa špecificky viažu tak na imunizované polypeptidy, ako aj na IL-4, hoci preimunitné sérum sa neviaže na žiadny a nemá žiadny vplyv na väzbovosť receptora.

Ako ďalej ukazuje tabuľka 2, protilátky proti polypeptidom 6 a 7 majú rovnako silný inhibičný účinok na väz.bovosť značeného IL-4. Tabuľka 1 ukazuje, že tieto polypeptidy majú spoločnú subsekvenciu KDTRC. Takýto kombi novaný dôkaz navrhuje túto subsekvenciu, ktorá môže konštituovať dôležitý epitop, aby poskytla podporu peptidom podľa tohto vynálezu, ktoré môžu obsahovať až 5 aminokyselinových zvyškov.

Zvlášť zaujímavá je inhibícia väzbovosti, ktorú preukazujú polyklonálne protilátky proti polypeptidu č. 6. Ako už bolo uvedené, Chrentien a jeho spolupracovníci našli, že monoklonálna protilátka, produkovaná proti niektorému polypeptidu, nepôsobí neutralizačné na bioaktivitu IL-4. Nasledujúca epitopová analýza, ktorá bude opísaná, ale ukázala, že táto protilátka je pravdepodobne zameraná proti aminokyselinovým zvyškom aminokoncového zvyšku polypeptidu, nie proti Lys-Asp-Thr-Arg-Cys subsekvencíi karboxykoncového zvyšku. Polyklonálne antisérum podľa tohto príkladu pravdepodobne inhibuje IL-4 väzbovosť, pretože niektorá z protilátok v ňom bola zameraná proti epitopu, obsahujúcemu túto špecifickú subsekvenciu.

Výsledky, získané s antisérom 343-6 IgG frakciou proti polypeptidu č. 7, sú graficky znázornené na obrázku 3, keď sa 2x 1 ()ť> buniek Daudi inkubuje s 50 pM 12ÔI-IL-4 a indikuje sa koncentrácia stanovenej protilátky po 2 hodinách pri teplote 4 °C. Špecifická väzbovosť pri neprítomnosti protilátky je 3,347 cpm. Bola pozorovaná silná inhibícia väzbovosti, spojená so skutočnosťou, že sa protilátky špecificky viažu na polypeptid č. 7 a na IL-4; treba však pripomenúť, že aminokyselinové zvyšky, proti ktorým pôsobia, môžu byť exponované na povrchu IL-4.

Príklad 3

Monoklonálne antipolypeptidové protilátky

Monoklonálne protilátky sa pripravujú v podstate tak, ako opisuje Kohler a Milstein: Náture 256: 495 (1975). Všetky inkubácie sa vykonávali pri teplote 37 °C v 5 % CO2 v inkubátore.

Balb/c (Charles River) myši sa imunologický scitlivie podávaním 500 μΐ (mikrolitrov) 2,6,10,14-tetrametylpentadekánu (Pristane) intraperitonálne (i.p.). Asi o štyri dni neskôr sa 250 pg (mikrogramov) polypeptidu č. 7 (tabuľka 1; zodpovedajúca aminokyselinovým zvyškom 61-82 ľudského IL-4) rozpustí v 250 ul (mikro-1) objemoch fosforečnanového pufrovaného fyziologického roztoku (phosphate buffered saline - PBS), 250 ug (mikro-g) podielov úplného Freundovho adjavans sa potom pridá, zmesi sa homogenizujú a každá z nich sa podáva i.p. každej z myší. Asi o jeden mesiac neskôr sa podávajú i.p. posilňovacie injekcie, obsahujúce 125 ug (mikro-g) polypeptidu v pomere 1 : 1 rozpustené v neúplnom Fruendovom adjuvans.

Asi o tri alebo štyri mesiace neskôr sa podávajú záverečné i.p. injekcie z 250 ug polypeptidu č. 7 v PBS. V priebehu imunizácie sa periodicky vykonávajú krvné skúšky z krvi odoberanej z chvostových tepien a analýza sa robí už opísaným postupom EL1SA,. Štyri dni po záverečných imunizáciách sa zvieratá obetujú (usmrtia) a odstránia sa im sleziny.

Tieto sleziny sa macerujú medzi dvoma podložnými sklíčkami v čerstvom médiu RPMI 1640, obsahujúcom 100 ug/ml streptomycínu a 100 jednotiek/ml penicilínu (RPMI pen/sttep médium), a potom sa prenesú do veľkej skúmavky. Po usadení prípadných zvyškov, po jednej minúte, sa bunky vo vrchnej vrstve skúmavky prenesú do inej skúmavky s objemom 5 ml. Pridajú sa štyri mililitre média RPMI pen/strep, bunky sa suspendujú a potom sedimentujú centrifugáciou pri 300 x g počas 8 minút.

Pri pomere 5 : 1 buniek sleziny k NS-1 myšacím myelóma bunkám (ATCC TIB 18) sa bunky preparujú a raz premývajú médiom RPMI pen/strep. Po peletizácii buniek a odstránení média sa po kvapkách pridá 0,5 ml PEG (2 g na liter v 75 mM HEPES tlmivého roztoku), majúceho molekulovú hmotnosť približne 1500 daltons po období cez jednu minútu pri teplote 37 °C, za mierneho pretrasenia každých 20 sekúnd. Prídavok PEG sa opakuje, najskôr s 0,5 ml, a potom 1,0 ml roztoku PEG.

Nasleduje fúzovanie, bunky sedimentujú a premývajú sa postupne vždy počas dobu minúty 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml, 16,0 ml a 32,0 ml média RPMI pen/strep. Fúzované bunky opäť sedimentujú tak, ako už bolo uvedené, potom sa odstráni médium, potom sa pridá približne 1 x 10$ buniek sleziny z nedotknutých myší (ktoré nedostávali injekcie) ako zásobovač buniek v médiu RPMI pen/strep obsahujúcom 0,2933 mg/ml glutamínu a 10 % teľacieho plodového séra (fetal calf sérum - FCS), a bunky sa miešajú a potom sedimentujú, ako už bolo opísané. Po izolácii z myší deň predtým sa tieto zásobné bunky inkubujú cez noc pri teplote 37 °C v médiu RPMI pen/strep obsahujúcom glutamín a FCS.

Fúzované a zásobné bunky potom rastú spoločne počas siedmich dni v médiu RPMI pen/strep obsahujúcom 0,2933 mg/ml glutamínu, 10 % FCS, 1 x 10’2 hypoxantínu, 4 x 10'5 aminopterínu a 1,6 x lO'^M-timidínu (HAT médium) na mikrotitračných doštičkách po 96-tich jamkách s plochým dnom (COSTAR), 150 μΐ na jednu jamku. Po tomto inkubačnom období sa médium v každej jamke nahradilo HT médiom (HAT médium s nedostatkom aminopterínu) a v inkubácii sa ďalej pokračuje.

Po niekoľkých dňoch sa vykoná ELISA na hybridóma supematanoch, ako už bolo opísané, s tou výnimkou, že sa použije značená antimyšacia IgG protilátka. Hybridomas v jamkách testované pozitívne boli klonované limitným riedením v HT médiu.

Týmto spôsobom sa produkuje súčet 382 klonovaných hybridomas, všetky, ktoré produkovali monoklonálne protilátky. Po triedení týchto hybridomás pomocou ELISA s použitím polypeptidu č. 7 ako antigénu, sa identifikovalo 12 pozitívnych bunkových línií. Z nich potom bolo nájdených 10 pozitívnych pomocou triedenia ELISA proti IL-4.

Ďalším triedením ôsmich z pozitívnych klonov robených na agare štandardnými metódami s imunoglubulín-špecifickými antisérami sa preukázalo, že šesť z týchto klonov produkuje IgGl, jeden produkuje IgG2 a jeden produkuje IgM protilátky.

Príklad 4

Príprava anti-idiotypových protilátok

Na prípravu anti-idiotypových protilátok sa pridá 1,5 mg antiséra 343-6 IgG frakcie, opísanej v predchádzajúcom texte, v 0,5 ml fosforečnanového tlmivého (pufrovaného) fyziologického roztoku sa pridá k úplnému Freundovmu adjuvans a dokonale sa premieša, aby sa vytvorila emulzia. Vzorka sa aplikuje ako podkožná injekcia ovci (Dorset kríženec). Posilňovacie očkovanie sa podáva v niekoľkotýždňových intervaloch potom rovnakým spôsobom s tou výnimkou, že sa použije neúplné Freundovo adjuvans.

Vzorky krvi, odoberané v priebehu imunizácie náhodným výberom, sa analyzujú analýzou ELISA s použitím antiséra 343-6 IgG frakcie ako antigénu, ako už bolo opísané, s tou výnimkou, že sa vynechá blokovanie s imu9 kyselinových zvyškov preklenujú v súčte zodpovedajúce aminokyselinové zvyšky 47 - 70 dospelého ľudského IL-4.

Aminokyselinové sekvencie týchto oktapeptidov ukazuje tabuľka 4.

noglobulínom a ako druhá (sekundárna) protilátka sa použije 5,0 ng chrenovou peroxidázou značený oslí anti-ovčí IgG. V takto získanom ovčom antisére (označeného ako antisérum 1448) bolo zistené, že sa špecificky viaže na králičie antisérum 343-6 IgG frakciu, nie však na IL-4 alebo na polypeptid č. 7.

Na zistenie, či ovčie antisérum 1448 skutočne obsahuje anti-idiotypové protilátky, sa antisérum postupne zrieďuje a podrobuje rádioligandovej receptorovej väzbovej analýze s použitím 125i_il-4 a buniek Daudi tak, ako už bolo opísané, s výsledkami, ktoré ukazuje obrázok 4. Každá vzorka pri určovaní obsahovala 2 x 10^ buniek a 50 pM *25|_jl_4 (2 x 10⁵ cpm). Špecifická väzbovosť pri neprítomnosti antiséra bola 5,931 cpm.

Ako ukazuje obrázok 4, ovčie antisérum 1448 je silný kompetitívny inhibítor väzbovosti značeného IL-4 na bunky, ruší viac ako 80 % špecifickej väzbovosti pri nižších zriedeniach. Naopak, ovčie pre-imúnne sérum nemá žiadny vplyv na väzbovosť na IL-4.

Príklad 5

Analýza epitopu

Na určenie, ktoré aminokyselinové zvyšky v polypeptidoch č. 6 a č. 7 sú rozhodujúce pri produkovaní protilátok, ktoré môžu inhibovať väzbovosť IL-4 na bunkové receptory, sa robila analýza v podstate tak, ako opisuje Geysen et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998 (1984).

Metóda podľa Geysena so spolupracovníkmi dovoľuje rýchlu konkurenčnú syntézu na pevných nosičoch stovkám malých polypeptidov s dostatočnou čistotou a v dostatočnom množstve na vykonanie ELISA, ale polypeptidy sú stále pripútané k pevným nosičom, na ktorých prebieha syntéza. V princípe sa ELISA vykonáva na takých polypeptidových užívaných protilátkach, ktoré by mohli byť pripravené proti väčším polypeptidom alebo proteínu, ktorý má sekvenciu aminokyselín takú, aby v nej bola zahrnutá sekvencia malých polypeptidov. Ak protilátky sú špecifické pre niektorý epitop okrem väčšieho imunogénu, a ten je obklopený malými syntetickými polypeptidmi, budú sa tieto protilátky viazať na polypeptidy a môžu teda byť dctcgované metódou ELISA.

Pri použití metódy Geysena so spolupracovníkmi, supra, sa syntetizuje rad 15 oktapeptidov na polyetylénových (špendlíkoch) čiastočkách drviny (Cambridge Research Biochemicals, Inc., Valley Stream, N. Y.), ktorých sekvencia aminokyselín v celkovom súčte preklenuje všetky aminokyselinové zvyšky v polypetide č. 7 (zodpovedajúce aminokyselinovým zvyškom 61-82 dospelého ľudského IL-4).Sekvencie týchto oktapeptidov ukazuje tabuľka 3.

Tabuľka 3: Oktapeptidy založené na aminokyselinových zvyškoch 61-82 ľudského dospelého IL-4

Polypeptid čialo	Sekvencia	Zodpovedajúce	Stredový* 2vyäok
IL-4 zvyžky
j	KDTBCLGA	«1-«β	65
2	DTRCLGAT	62-69	66
3	TRCLGATA	«3-70	67
4	RCLGATAQ	64-71	£8
S	CLGATAQQ	6S 72
6	LGATÄQQF	66-73	70
7	GATAQQFR	«7-74	71
β	ATAQQFHR	6B-75	72
9	TAQQFHRH	«9-7«	73
10	AQQFHRHK	70-77	74
11	QOFHRHKQ	71-78	75
12	OFHRKKQL	72-79	76
13	JHRKJtQLI	73-80	77
14	HRHKQLIR	74-81	78
1S	RHKQLIRP	75-82	79
Stredové zvyäky oktapeptidov eú ľubovoľne označené pridaním
čísla Štyri k polohe aminokyselinového zvyíku v dospelom
ľudákom IL-4. ku ktorému korešponduje atninckoncový ivyäok každého oktapeptidu.

Podobným spôsobom sa pripraví rad 17 oktapeptidov rovnako imobilizovaných, ktoré svojou sekvenciou aminoTabuľka 4: Oktapeptidy založené na aminokyselinových zvyškoch 47 - 70 dospelého ľudského IL-4

Polypeptid číslo	Sekvencia	Zodpovedajúce IL-4 zvyšky	Stredový’ zvyšok
1	RÄATVLRQ	47-54	51
2	AATVLRQF	48-55	52
3	ATVLRQFY	49-56	53
4	TVLRQFYS	50-57	54
5	VLRQFYSH	51-58	55
6	LRQFYSHH	52-59	56
7	LQRYSHHE	S3-60	57
8	QRYSHHEK	54-61	58
9	RYSHHEKD	55-52	59
10	YSHHEKDT	56-63	60
11	SHHBKDTR	57-64	61
12	HHEKDTRC	58-65	62
13	HEKDTRCL	59-66	63
14	EKDTRCLG	60-67	64
15	KDTRCLGA	61-68	65
16	DTRCLGAT	62-59	66
17	TRCLGATA	63-70	67
Stredové zvyáky oktapeptidov sú ľubovolne označené pridaním
čísla štyri k polohe arainokyselinového zvyšku v dospelom
ludskom IL-4, ku ktorému korešponduje aminokoncový každého oktapeptidu.

Na vykonanie epitopovej analýzy na polyeptide č. 7 bolo podrobené antisérum, označené 129-88 z imunizovaného králika s polyeptidom, analýze ELISA tak, ako už bolo opísané. Pri tejto analýze ELISA sa použijú imobilizované oktapeptidy, ukázané v tabuľke 3, ako antigény. Podľa výsledku toto antisérum silno inhibuje väzbovosť 125i_[l~4 na bunky Daudi, a to pri určení urobenom tak, ako už bolo opísané. ELISA sa vykonáva na antisére 129-88 v podstate tak, ako už bolo opísané, na 96-jamkových mikrotitračných doštičkách s výnimkou, že sa do jamiek použijú ihličky namiesto nanášania voľného antigénu do jamiek. Skôr, ako sa zaznamená farba vyvíjania pri použití Titertek MCC 340 ELISA plate reader doskového snímača záznamu, odstránia sa ihličky z jamiek.

Výsledky tejto analýzy ukazuje obrázok 5, kde je ukázaná absorbancia pri 414 nm pre každý z oktapeptidov. Čísla oktapeptidov uvedených na obrázku 5 korešpondujú s číslami uvedenými v tabuľke 3. Z obrázku 5 vidno silnú väzbovosť protilátok na oktapeptidy č. 5 až č. 12. S odvolaním sa na tabuľku 3 je zjavné, že aproximatívne stredy týchto oktapeptidov korešpondujú s aminokyselinovými zvyškami 69 - 76 dospelého ľudského IL-4. Podľa týchto údajov, spolu so skutočnosťou, že antisérum 129-88 inhibuje väzbovosť značeného IL-4 na bunkové receptory, možno sa domnievať, že aminokyselinové zvyšky 69 - 76 dospelého IL-4 tvoria epitop (epitopy), protilátky proti inhibovaniu väzbovosti ľudského IL-4 na bunkové receptory.

Podobným spôsobom vytvorené imobilizované oktapeptidy, uvedené v tabuľke 4, sa použijú na analýzu králičieho antiséra, produkovaného proti polypeptidu č. 6. Toto antisérum, označené 342-6, sa vyhodnocuje dvakrát na schopnosť inhibovať väzbovosť 125i_il_4 _na bunky Daudi. Vzorky séra, pripravené na začiatku priebehu imunizácie (skoré antisérum 342-6) nepreukazovali inhibovanie väzbovosti značeného IL-4; vzorky pripravené neskôr v priebehu imunizácie (neskoršie antisérum 342-6) boli silné inhibítory. Výsledky týchto analýz ukazuje obrázok 6A a 6B pre skoré a pre neskoršie antisérum. Čísla oktapeptidov, ukázaných na obrázku 6, korešpondujú s číslami oktapeptidov, uvedených v tabuľke 4.

Ako ukazuje obrázok 6A, neinhibujúce skoré antisérum 342-6 proti polypeptidu č. 6 obsahuje protilátky, reaktívne s oktapeptidmi č. 3 až č. 7 a č. 9 až č. 13. S odvolaním sa na tabuľku 4 je zjavné, že stredy týchto oktapeptidov korešpondujú aproximatívne s aminokyselinovými zvyškami 53 - 57, resp. 59 - 63 dospelého ľudského IL-4.

Ďalej potom inhibičné antisérum 342-6 tvorí podobnú vzorku väzbovosti (obrázok 6B), okrem toho tiež obsahuje protilátky, ktoré preukazujú silnejšiu väzbovosť proti oktapeptidom 11-16, ktorých stredy korešpondujú s aminokyselinovými zvyškami 61-66 ľudského IL-4. Podľa údajov na paneloch A a B na obrázku 6, je možné sa domnievať, že aminokyselinové zvyšky 61-66 dospelého ľudského IL-4 tvoria epitop (epitopy), protilátky proti inhibovaniu väzbovosti ľudského IL-4 na bunkové receptory.

Túto domnienku posilňujú štúdie pomocou ELISA, robené tak, ako už bolo opísané, s použitím polypeptidov č. 6 a č. 7 a jednej z monoklonálnych protilátok proti peptidu č. 7., a jednej z monoklonálnych protilátok proti polypeptidu č. Ί. Táto protilátka sa silne viaže na oba polypeptidy. Tiež silne inhibuje väzbovosť 125|.[p_4 _na bunky Daudi. Spoločná subsekvencia v týchto polypeptidoch je iba KDTRC, ktorá korešponduje s aminokyselinovými zvyškami 61-65 dospelého ľudského IL-4. Z toho vyplýva, že táto inhibičná monoklonálna protilátka musí pôsobiť práve proti tejto subsekvencii a (teda) táto subsekvencia musí tvoriť (nejaký) dôležitý epitop.

Pri tomto vynáleze sa dá urobiť veľa modifikácií a variantov bez toho, aby pritom došlo k odchýleniu od jeho základnej myšlienky (predmetu vynálezu) a rozsahu, ako je zjavné odborníkom v tomto vednom odbore. Špecifické prípady, ktoré sa opisujú, sú iba ponúknuté možnosti príkladov, ako využiť pôvodnú myšlienku, a tento vynález je limitovaný iba podmienkami uvedenými v pripojených patentových nárokoch.

Priemyselná využiteľnosť

Vynález sa týka antagonistických protilátok, ktoré sú použiteľné na liečbu alergií alebo podobných stavov. Je využiteľný z farmaceutického hľadiska, lebo poskytuje spôsoby na tvorbu farmaceutických prostriedkov a ich zloženia.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-Arg-Rhe-Leu-Lys-Arg-Leu-Asp-Arg-Asn-Leu-Trp-Gly-Leu-Ala-Gly-Leu-Asn-Ser-Cys-Pro-Val-Lys-Glu-Ala-Asn-GIn-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-.Met-Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser alebo jeho subsekvencie.
2. Polypeptid podľa nároku 1, ktorý je kovalentne viazaný na molekulu nosiča.
3. Polypeptid podľa nároku 1, ktorý má sekvenciu aminokyselín Lys-Asp-Thr-Arg-Cys-Leu-Gly-Ala-Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His-Lys-Gln-Leu-Ile-Arg-Rhe.
4. Polypeptid podľa nároku 1, ktorý má sekvenciu aminokyselín Ala-Asn-Gln-Ser-Thr-Leu-Glu-Asn-Phe-Leu-Glu-Arg-Leu-Lys-Thr-Ile-met-Arg-Glu-Lys-Tyr-Ser-Lys-Cys-Ser-Ser.
5. Subsekvencia polypeptidu podľa nároku 1, ktorá má sekvenciu aminokyselín Lys-Asp-Thr-Arg-Cys.
6. Subsekvencia polypeptidu podľa nároku 1, ktorá má sekvenciu aminokyselín Thr-Ala-Gln-Gln-Phe-His-Arg-His.
7. Použitie polypeptidu alebo subsekvencie podľa nárokov 1 až 6 na prípravu polyklonálnej a/alebo monoklonálnej protilátky, ktorá sa špecificky viaže na ľudský IL-4.