RU2758092C1 - АНТИТЕЛО К IL-4Rα И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

АНТИТЕЛО К IL-4Rα И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
RU2758092C1
RU2758092C1 RU2020127107A RU2020127107A RU2758092C1 RU 2758092 C1 RU2758092 C1 RU 2758092C1 RU 2020127107 A RU2020127107 A RU 2020127107A RU 2020127107 A RU2020127107 A RU 2020127107A RU 2758092 C1 RU2758092 C1 RU 2758092C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
gly
ala
thr
ser
leu
Prior art date
Application number
RU2020127107A
Other languages
English (en)
Inventor
Чжэн СЮЙ
Сян Ли
Жуй СУН
Original Assignee
Бэйцзин Кавин Текнолоджи Шеа-Холдинг Ко., Лтд.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бэйцзин Кавин Текнолоджи Шеа-Холдинг Ко., Лтд. filed Critical Бэйцзин Кавин Текнолоджи Шеа-Холдинг Ко., Лтд.
Application granted granted Critical
Publication of RU2758092C1 publication Critical patent/RU2758092C1/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфично связывается с человеческим рецептором интерлейкина-4 α (hIL-4Rα), способу его получения, а также к содержащей его композиции и набору. Также раскрыта выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вышеуказанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, а также содержащие указанную молекулу вектор и клетка-хозяин. Изобретение позволяет эффективно осуществлять предупреждение или лечение заболевания или расстройства, связанного с IL-4/IL-4Rα сигнализацией в организме человека. 7 н. и 8 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 5 пр.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к технической области антител и относится к гуманизированному антителу к IL-4R и применению данного антитела в лечении заболевания, связанного с IL-4/IL-4Rα сигнализацией.
Предшествующий уровень техники
Аллергические заболевания (такие как аллергический ринит) можно хорошо лечить посредством антигистаминных препаратов и специфичных иммунных лекарственных средств. Однако, некоторые более серьезные аллергические заболевания (такие как атопический дерматит и астма) не имеют специфичных способов лечения, и неспецифичная иммунодепрессия все еще является основным способом лечения.
В мире существует более 235 миллионов пациентов с астмой, и примерно 10-20% пациентов нельзя эффективно контролировать существующими лекарственными средствами (а именно, происходит ухудшение астмы), и затраты на лечение данных пациентов составляют 80% от всех расходов на лечение астмы. Атопический дерматит поражает 10-20% детей и 3-10% взрослых, среди них примерно 20% пациентов представляют собой пациентов с атопическим дерматитом от средней степени тяжести до тяжелой формы, и в настоящее время отсутствует эффективное терапевтическое лекарственное средство.
Пероральное введение/внутривенная инъекция иммунодепрессантов широкого спектра действия (таких как стероиды, циклоспорин A, метотрексат, азатиоприн и микофенолата мофетил) может эффективно облегчать симптомы заболевания. Активность данных иммунодепрессантов главным образом происходит от расположенных ниже регуляторных факторов (таких как факторы транскрипции), которые нацелены на воспаление: например, стероиды связываются с глюкокортикоидными рецепторами и затем ингибируют экспрессию ключевых факторов транскрипции, которые управляют воспалением (как например, NF-kB); циклоспорин A представляет собой ингибитор кальций-зависимой фосфатазы, который может препятствовать экспрессии IL-2 (IL - интерлейкин 2), требующейся для активации и пролиферации T-клеток, через фактор транскрипции, а именно, ядерный фактор активированных Т-клеток (NFAT).
Систематичное введение иммунодепрессантов широкого спектра действия часто приводит к целому ряду побочных эффектов из-за их многократного воздействия, таких как задержка жидкости, нарушение толерантности к глюкозе, гипертензия, мышечная слабость, остеопороз, подавление гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси и повышенный риск инфицирования. Несмотря на то, что местное применение (такое как ингаляции, местные капли, спреи для кожи, мази и т.д.) может уменьшать побочные эффекты системного введения, сложно эффективно лечить тяжелые аллергические заболевания. Например, нестероидный ингибитор PDE4 (фосфодиэстераза 4-го типа) Eucrisa, одобренный Pfizer в прошлом декабре, является эффективным только для пациентов с атопическим дерматитом легкой - средней степени тяжести.
В виду высокой заболеваемости аллергическими заболеваниями, особенно атопическим дерматитом и астмой, и ограничения (безопасность и эффективность) иммунодепрессивной терапии широкого спектра действия, особенно для некоторых тяжелых пациентов, существуют неудовлетворенные клинические потребности, и существует необходимость в более безопасных и эффективных специфичных терапевтических лекарственных средствах.
Воспалительный путь типа 2 описывает воспалительный путь, в котором клетки Th2 играют ключевую роль. Клетки Th2 играют ключевую роль в воспалительном пути типа 2 за счет секреции цитокинов типа 2, а именно IL-4, IL-5 и IL-13. IL-4 может стимулировать дифференциацию клеток Th в клетки Th2 и пролиферацию. Клетки Th2 дополнительно продуцируют IL-4, IL-5 и IL-13. IL-5 может стимулировать дифференциацию эозинофилов в костном мозге; IL-4, IL-5 и IL-13 могут стимулировать превращение эозинофилов в специфичные ткани; IL-4 и IL-13 могут также вызывать превращение серотипа B-клеток и затем продуцировать IgE; и IL-13 также играет важную роль в секреции слизи, пролиферации бокаловидных клеток, сокращении гладких мышц и продукции коллагена.
Типичными признаками активации воспалительного пути 2 типа являются повышенный уровень IgE, эозинофилов и TARC (регулируемый тимусом и активацией хемокин). Если иммунный ответ типа 2 сверхактивирован, будут возникать тяжелые аллергические заболевания с разными проявлениями заболевания в разных тканях, в зависимости от места возникновения заболевания можно разделить на атопический дерматит, хронический синусит, полипы носа и астму.
IL-4 и IL-13 представляют собой возможные регуляторы иммунного ответа типа 2 и демонстрируют соответствующие функции в зависимости от разных связывающих рецепторов. Несмотря на то, что IL-4 и IL-13 обладают только 25%-ной гомологией аминокислот, их рецепторные комплексы (рецептор типа I и рецептор типа II) имеют общий компонент, а именно IL-4Rα, который играет разные роли, в зависимости от разных клеток, в которых он экспрессируется и распространяется IL-4 может функционировать через рецепторы типа I и типа II, в то время как IL-13 может только функционировать через рецепторы типа II. IL-4 связывается с IL-4Rα с высокой аффинностью и не зависит от γ-цепи или IL-13Rα1, в то время как IL-4Rα может повышать аффинность IL-13 в отношении связывания 13Rα1.
Прямым проявлением тяжелых аллергических заболеваний является наличие высоких концентраций IgE и эозинофилов. Таким образом, на ранней стадии мишенью антитела в случае воспалительного пути типа 2 является IgE, но в недавних исследованиях обнаружено, что нацеливание на IgE не является универсальным для лечения тяжелых аллергических заболеваний. При более глубоком понимании воспалительного пути типа 2 ключевые движущие факторы воспалительного пути типа 2, а именно IL-4 и IL-13, стали популярными объектами исследований для нового поколения лекарственных средств на основе антител для лечения тяжелых аллергических заболеваний.
Биологическая активность IL-4 опосредована специфичными рецепторами IL-4 клеточной поверхности. Антитело к человеческому рецептору IL-4α (hIL-4Rα) описано в патентах США №5,717,072 и №7,186,809. Способы использования антитела к hIL-4R описаны в патентах США №5,714,146, №5,985,280 и №6,716,587. WO 2005047331 относится к рекомбинантному белку IL-4Rα Альтракинцепт, разработанному Immunex, который конкурентно связывается с IL-4 посредством введения распылением и затем ингибирует связывание IL-4 с IL-4Rα клеточной поверхности in vivo; В US 6358509 раскрыто антитело к IL-4 Пасколизумаб, разработанное GSK, которое предотвращает связывание IL-4 с IL-4Rα. Несмотря на то, что данные два ингибитора IL-4 показали хорошую эффективность в ранних исследованиях (доклиническая фаза I клинического испытания), они не продемонстрировали эффективность в крупных клинических испытаниях на поздних стадиях, и их разработка была прекращена. В US8679487 раскрыто, что компания Amgen также ранее разработала антитело к рецептору IL-4α AMG-317, которое представляет собой полностью человеческое антитело к IL-4Rα, ингибирующее активность IL-4 и IL-13, но оно оказалось неудачным на фазе II клинического испытания в отношении лечения астмы, и разработка была прекращена.
Примеры молекул антител к IL-13 включают: CAT-354, раскрытое в US 07/0128192 или WO 2005007699; TNX-650, раскрытое в WO 2005062967 и WO 2005062972, и NTC00441818, раскрытое в Clinical Trails Gov. Identifier; QAX-576 (NTC532233), раскрытое в Clinical Trails Gov. Identifier; антитело к IL-13, раскрытое в US 20060140948 или WO 2006055638, поданных от имени Abgenix, US 6468528 Amgen; WO 2005091856 Centocor, Inc. в качестве заявителя; и как раскрыто в WO 2007080174, поданной от имени Glaxo, и в WO 2007045477, поданной от имени Novartis.
Как обычно, например, антитело к IL-13 Тралокинумаб, разработанное AstraZeneca, как ожидают, получит результаты фазы III клинических исследований в отношении лечения астмы тяжелой формы во второй половине 2017 года, и, как ожидают, станет первым в мире антителом к IL-13, поступившим в продажу. В то же время, AstraZeneca и Abbott совместно разработали комплексный способ диагностики на основе биомаркеров периостин и DPP4. Кроме того, также была завершена фаза IIb клинических испытаний Тралокинумаба в отношении лечения атопического дерматита.
Что качается Лебрикизумаба, лекарственного средства на основе антитела к IL-13, разработанного Roche, данные фазы III двух клинических испытаний были раскрыты в конце февраля 2016 года, и результаты представляли собой одну победу и одно поражение. В LavoltaI результаты показали, что Лебрикизумаб значимо снижал степень ухудшения при астме, в то время как в LavoltaII не получали похожих результатов. В соответствии с информацией, раскрытой на встрече JP Morgan 2017 года, Roche остановила разработку лекарственных средств от симптомов астмы, и множество клинических испытаний, фаза II, проводится в отношении COPD (хроническая обструктивная болезнь легких), атопического дерматита и идиопатического легочного фиброза.
После столкновения со многими проблемами при разработке на ранних этапах монофункциональных ингибиторов IL-4 или IL-13 (в настоящее время в продаже отсутствуют продукты), считается, что блокирование IL-4 и IL-13 одновременно может быть осуществимым путем. По меньшей мере существует два пути одновременного блокирования IL-4 и IL-13: одним является антитело к IL-4Rα; другим является биспецифичное антитело к IL-4 и IL-13.
SAR156597 Sanofi, лекарственное средство, нацеленное как на IL-4, так и на IL-13, находится в процессе разработки и раскрыто в WO 2009052081, данное лекарственное средство представляет собой биспецифичное антитело с двойным вариабельным доменом Ig (DVD-Ig) для лечения системной склеродермии и идиопатического легочного фиброза и в настоящее время подвергается фазе II клинических испытаний.
WO 2005023860 относится к Питракинре, мутантной форме IL-4, разработанной Aerovance, которая может связываться с IL-4Rα с высокой аффинностью, представляет собой двойной антагонист IL-4 и IL-13, и может значимо улучшать FEV1 (объем форсированного выдоха за одну секунду) пациента с астмой. PEG-модифицированная Питракинра (Aeroderm) представляет собой первый двойной блокатор, подвергаемый клиническим испытаниям в отношении атопического дерматита. Несмотря на то, что она демонстрирует определенное улучшение в симптомах, улучшение конечной точки заболевания не является статистически значимым.
Кроме того, Roche также использовала технологическую платформу «выступ-во-впадину» для создания биспецифичного антитела, нацеленного на IL-4 и IL-13, и данное антитело модифицировано на основе лебрикизумаба, но на сегодняшний день не сообщается об успехах в клинических испытаниях. Слитый белок Regeneron IL-4Rα и IL-13Rα, полученный посредством технологии Dual Trap, достиг хороших результатов на ранних этапах клинического исследования (уменьшение биомаркеров), но данное исследование остановлено из-за недостатка средств.
WO 2010053751 относится к антителу к IL-4Rα, разработанному Regeneron, которое может блокировать как IL-4, так и IL-13, для регуляции иммунитета 2 типа. Антитело в данной патентной заявке включает 6 областей, определяющих комплементарность, со следующими последовательностями:
HCDR1 представляет собой: Gly-Phe-Thr-Phe-X5-X6-Tyr-X8, где X5 представляет собой Asp или Arg (предпочтительно Arg), X6 представляет собой Asp или Ser (предпочтительно Asp), X8 представляет собой Ala или Gly (предпочтительно Ala)
HCDR2 представляет собой X1-Ser-X3-X4-X5-X6-X7-X8, где X1 представляет собой Ile или Leu (предпочтительно Ile), X3 представляет собой Gly, Tyr или Arg, X4 представляет собой Ser, Asp или Thr, X5 представляет собой Gly или Ser (предпочтительно Gly), X6 представляет собой Gly, Ser или Val, X7 представляет собой Ser или Asn (предпочтительно Asn), и X8 представляет собой Thr, Lys или Ile
HCDR3 представляет собой Ala-Lys- X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18, где X3 представляет собой Asp, Glu или Trp, X4 представляет собой Gly или Arg, X5 представляет собой Leu, Thr или Arg, X6 представляет собой Gly, Arg или Ser, X7 представляет собой Ile или Gly, X8 представляет собой Thr, Phe или Tyr, X9 представляет собой Ile, Asp или Phe, X10 представляет собой Arg, Tyr или Asp, X11 представляет собой Pro, Tyr или делецию, X12 представляет собой Arg или делецию, X13 представляет собой Tyr или делецию, X14 представляет собой Tyr или делецию, X15 представляет собой Gly или делецию, X16 представляет собой Leu или делецию, X17 представляет собой Asp или делецию, и X18 представляет собой Val или делецию.
LCDR1 представляет собой Gln-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11, где X2 представляет собой Asp, Ser или Val, X3 представляет собой Ile или Leu, X4 представляет собой Ser, Leu или Asn, X5 представляет собой Asn, Tyr или Ile, X6 представляет собой Trp, Ser или Tyr, X7 представляет собой Ile или делецию, X8 представляет собой Gly или делецию, X9 представляет собой Tyr или делецию, X10 представляет собой Asn или делецию, X11 представляет собой Tyr или делецию.
LCDR2 представляет собой X1-X2-Ser, где X1 представляет собой Leu, Ala или Val, X2 представляет собой Ala или Gly
LCDR3 представляет собой X1-Gln-X3-X4-X5-X6-Pro-X8-Thr, где X1 представляет собой Gln или Met, X3 представляет собой Ala или Tyr, X4 представляет собой Leu или Asn, X5 представляет собой Gln или Ser, X6 представляет собой Thr, Phe или His, X8 представляет собой Tyr, Ile или Trp.
В качестве белкового лекарственного средства аминокислотная последовательность в виде первичной структуры белка является основой пространственной структуры белка, и пространственная структура непосредственно определяет его функцию. Небольшие изменения в аминокислотной последовательности могут вызывать огромное изменение в пространственной структуре, приводя, таким образом, к изменениям в функции. Вариабельная область антитела включает 6 областей, определяющих комплементарность (CDR), а именно HCDR1, HCDR2, HCDR3 тяжелой цепи и LCDR1, LCDR2, LCDR3 легкой цепи, где HCDR3 является наиболее высоко вариабельной по структуре и последовательности и также является ключевой областью, которая отражает разнообразие и специфичность связывания антитела. Определяющие комплементарность области антитела являются ключевыми областями в отношении сохранения активности антитела; во многих случаях даже замена одной из аминокислот в них на аминокислоту похожей природы будет серьезно влиять на связывание целого антитела с антигеном, влияя, таким образом, на его биологическую активность. Сложно предсказать, какие изменения в активности антитела будут вызваны в результате модификации любой из его CDR областей.
Авторами настоящего изобретения неожиданно обнаружено, что когда R в положении 108 в HCDR3 антитела дупилумаб меняется на A или E, способность связывания антитела с антигеном может быть повышена (EC50 (полумаксимальная эффективная концентрация) повышается более чем на 50%), и когда R в положении 108 меняется на другие репрезентативные аминокислоты, такие как Y, L или Q, активность связывания снижается более чем на 50%. Аналогично, когда R меняют на A или E, особенно когда R в положении 106 меняют на A или E, активность связывания (EC50) снижается в 5-10 раз. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложено новое антитело к IL-4Rα с активностью связывания, которая значимо лучше активности связывания допилумаба; данное антитело регулирует иммунитет типа 2 посредством связывания с IL-4Rα при одновременном блокировании IL-4 и IL-13.
На основе информации ВОЗ (Всемирная организация здравоохранения) о лекарствах, т. 26, №4, 2012 аминокислотная последовательность дупилумаба представляет собой:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи:
EVQLVESGGGLEQPGGSLRLSCAGSGFTFRDYAMTWVRQAPGKGLEWVSSISGSGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRLSITIRPRYYGLDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG.
Аминокислотная последовательность легкой цепи:
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSIGYNYLDWYLQKSGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGFYYCMQALQTPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
Краткое описание изобретения
Одной из целей настоящего изобретения является предложение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфично связывается с человеческим IL-4Rα. По сравнению с существующим антителом дупилумаб, аффинность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в отношении связывания IL-4R дополнительно улучшена. По сравнению с дупилумабом, данный вариант дупилумаба содержит следующие аминокислотные замены: аминокислота Arg в положении 24 LVR мутирована до Ala, или аминокислота Ser в положении 28 мутирована до Arg, или аминокислота Ser в положении 32 мутирована до Arg или Lys; Arg в положении 100 HVR мутирована до Ala, или Arg в положении 106 мутирована до Ala или Glu, или Arg в положении 108 мутирована до Ala, Glu, Gln, Tyr или Leu.
В частности, один аспект настоящего изобретения относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которое специфично связывается с человеческим рецептором интерлейкина-4α (hIL-4Rα), которое включает вариабельную область тяжелой цепи (HVR) и вариабельную область легкой цепи (LVR), где вариабельная область тяжелой цепи содержит: CDR1 (HCDR1) с аминокислотной последовательностью Gly-Phe-Thr-Phe-Arg-Asp-Tyr-Ala; CDR2 (HCDR2) с аминокислотной последовательностью Ile-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Asn-Thr; и CDR3 (HCDR3) с аминокислотной последовательностью Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val, где Xaa1 представляет собой Arg или Ala, Xaa2 представляет собой Arg, Ala или Glu, и Xaa3 представляет собой Arg, Ala или Glu;
вариабельная область легкой цепи содержит: CDR1 (LCDR1) с аминокислотной последовательностью Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr, где Xaa4 представляет собой Ser или Arg, и Xaa5 представляет собой Ser, Arg, или Lys; CDR2 (LCDR2) с аминокислотной последовательностью Leu-Gly-Ser; и CDR3 (LCDR3) с аминокислотной последовательностью Met-Gln-Ala-Leu-Gln-Thr-Pro-Tyr-Thr.
В предпочтительном воплощении аминокислотные последовательности HCDR3 и LCDR1 выглядят следующим образом: (а) HCDR3: Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val, где Xaa1 представляет собой Arg, Xaa2 представляет собой Arg, и Xaa3 представляет собой Ala или Glu; и LCDR1: Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr, где Xaa4 представляет собой Ser, и Xaa5 представляет собой Ser; (б) HCDR3: Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val, где Xaa1 представляет собой Arg, Xaa2 представляет собой Ala или Glu, и Xaa3 представляет собой Arg; и LCDR1: Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr, где Xaa4 представляет собой Ser, и Xaa5 представляет собой Ser; (в) HCDR3: Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val, где Xaa1 представляет собой Ala, Xaa2 представляет собой Arg, и Xaa3 представляет собой Arg; и LCDR1: Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr, где Xaa4 представляет собой Ser, и Xaa5 представляет собой Ser; (г) HCDR3: Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val, где Xaa1 представляет собой Arg, Xaa2 представляет собой Arg, и Xaa3 представляет собой Arg; и LCDR1: Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr, где Xaa4 представляет собой Arg, и Xaa5 представляет собой Ser; (д) HCDR3: Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val, где Xaa1 представляет собой Arg, Xaa2 представляет собой Arg, и Xaa3 представляет собой Arg; и LCDR1: Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr, где Xaa4 представляет собой Ser, и Xaa5 представляет собой Arg или Lys.
В предпочтительном воплощении аминокислотная последовательность HVR представляет собой SEQ ID NO: 1. В предпочтительном воплощении аминокислотная последовательность LVR представляет собой SEQ ID NO: 2. В предпочтительном воплощении аминокислотная последовательность LVR выбрана из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9. В предпочтительном воплощении аминокислотная последовательность HVR выбрана из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19. SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 25.
В предпочтительном воплощении HVR и LVR выбраны из следующих комбинаций аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 2; или SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 2.
В наиболее предпочтительном воплощении HVR и LVR выбраны из следующих комбинаций аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 2; или SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 2.
В другом аспекте изобретение также относится к фармацевтической композиции, которая содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Между тем, изобретение также относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению; экспрессионному вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты согласно изобретению; и клетке-хозяину, содержащей экспрессионный вектор согласно изобретению, предпочтительно клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфично связывается с человеческим IL-4R, причем способ включает: экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению в условиях, способствующих экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно изобретению, и выделение экспрессированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
В другом аспекте изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в получении лекарственного средства для предупреждения или лечения заболевания или расстройства, связанного с IL-4/IL-4Rα сигнализацией в организме человека. В предпочтительном воплощении заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из: астмы, аллергического дерматита, артрита, герпеса, хронической первичной крапивницы, склеродермии, гипертрофического рубца, болезни Уиппла, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, COPD, атопического дерматита, идиопатического легочного фиброза, аллергической реакции, синдрома Кавасаки, серповидно-клеточной анемии, синдрома Черджа-Стросса, болезни Грейвса, преэклампсии, синдрома Шегрена, аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома, аутоиммунной гемолитической анемии, пищевода Барретта, аутоиммунного увеита, туберкулеза или заболевания почки.
В другом аспекте изобретение относится к способу предупреждения или лечения заболевания или расстройства, связанного с IL-4/IL-4Rα сигнализацией в организме человека, включающему: введение субъекту антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8. В предпочтительном воплощении заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из: астмы, аллергического дерматита, артрита, герпеса, хронической первичной крапивницы, склеродермии, гипертрофического рубца, болезни Уиппла, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, COPD, атопического дерматита, идиопатического легочного фиброза, аллергической реакции, синдрома Кавасаки, серповидно-клеточной анемии, синдрома Черджа-Стросса, болезни Грейвса, преэклампсии, синдрома Шегрена, аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома, аутоиммунной гемолитической анемии, пищевода Барретта, аутоиммунного увеита, туберкулеза или заболевания почки. В предпочтительном воплощении заболевание или расстройство представляет собой аллергический дерматит или астму. В предпочтительном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используют в сочетании с другими лекарственными средствами для лечения аутоиммунного заболевания. В предпочтительном воплощении антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используют в сочетании с гормональными лекарственными средствами, иммунодепрессантами или антигистаминными лекарственными средствами.
В другом аспекте изобретение относится к препарату или набору, содержащему контейнер и листок-вкладыш, где контейнер содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению или фармацевтическую композицию согласно изобретению, и листок-вкладыш содержит инструкции по применению лекарственного средства. В предпочтительном воплощении препарат или набор дополнительно содержит один или более контейнеров, содержащих одно или более других лекарственных средств для предупреждения или лечения заболевания или расстройства, связанного с IL-4/IL-4Rα сигнализацией в организме человека. В предпочтительном воплощении другие лекарственные средства представляют собой гормональные лекарственные средства, иммунодепрессанты или антигистаминные лекарственные средства.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой диаграмму SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) вариантов дупилумаба D1-D9: дорожка 1 представляет собой маркер молекулярного веса, дорожка 2 представляет собой D1, дорожка 3 представляет собой D2, дорожка 4 представляет собой D3 и дорожка 5 представляет собой D4, дорожка 6 представляет собой D5, дорожка 7 представляет собой D6, дорожка 8 представляет собой D7, дорожка 9 представляет собой D8 и дорожка 10 представляет собой D9.
Фиг. 2 представляет собой график детектирования SEC (эксклюзионная хроматография) варианта дупилумаба D8.
Фиг. 3 представляет собой график, показывающий биологическое действие дупилумаба и вариантов дупилумаба D5, D7, D8 и D9 в нейтрализации IL-4 in vitro, где дупилумаб ингибирует рост клеток только на 92%, в то время как D8 и D9 оказывают лучшее ингибирующее действие со степенью ингибирования 98%, которая очевидно лучше, чем степень ингибирования дупилумаба.
На Фиг. 4A-4H показаны результаты сравнения стабильности дупилумаба и вариантов дупилумаба в разных условиях хранения, таких как условия высокой температуры, сильное освещение светом, повторного замораживания-оттаивания и сильных кислот. Фиг. 4A представляет собой график результатов SEC трех образцов при 50°C, и Фиг. 4B представляет собой график результатов ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) трех образцов при 50°C. Фиг. 4C представляет собой график результатов SEC трех образцов в условиях повторного замораживания-оттаивания и Фиг. 4D представляет собой график результатов ELISA трех образцов в условиях повторного замораживания - оттаивания. Фиг. 4E представляет собой график результатов SEC трех образцов в условиях освещенности 4500 лк и фиг. 4F представляет собой график результатов ELISA трех образцов в условиях освещения 4500 лк. Фиг. 4G представляет собой график результатов SEC трех образцов в условиях сильной кислоты и Фиг. 4H представляет собой график результатов ELISA трех образцов в условиях сильной кислоты. Фиг.
Подробное описание изобретения
1. Определение:
«IL-4R» (а именно, CD124) представляет собой мембранопроникающий гликопротеин типа I, состоящий из 825 аминокислот (25 доменов сигнального пептида, 207 внеклеточных доменов, 24 мембранопроникающих части и 569 внутриклеточных доменов). Внеклеточный домен имеет один домен CKR-SF и один домен фибрина типа III, и существует шесть N-связывающих сайтов адгезии углеводной цепи, распространенных в T-клетках, B-клетках, NK-клетках, моноцитах/макрофагах, нейтрофилах, кроветворных клетках-предшественниках, тучных клетках, эндотелиальных клетках, фибробластах, кератиноцитах и т.д. Цепи α IL-4R и IL-13R являются эквивалентными и связывание цепи α с IL-4 может вызывать фосфорилирование нескольких внутриклеточных белков посредством тирозина.
Фраза «заболевание, связанное с IL-4/IL-4Rα сигнализацией» означает заболевание, в которое вовлечена биологическая функция, опосредованная IL-4/IL-4Rα сигнализацией. Примеры заболеваний, связанных с IL-4/IL-4Rα сигнализацией, включают, например, воспалительные заболевания или расстройства, такие как астма, атопический дерматит, хроническая обструктивная болезнь легких (COPD), воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, артрит, аллергический ринит, эозинофильный эзофагит и псориаз.
В некоторых воплощениях заболевание, связанное с IL-4/IL-4Rα сигнализацией, представляет собой воспаление дыхательных путей. В некоторых воплощениях заболевание, связанное с IL-4/IL-4Rα сигнализацией, представляет собой воспаление кожи или атопический дерматит.
«Аллергические реакции», «аллергические заболевания» или «аллергические расстройства» считаются воспалительными заболеваниями, вызванными взаимодействием генетических факторов и факторов окружающей среды. Молекулярные и клеточные механизмы иммунной системы, участвующие в возникновении аллергических заболеваний, включают множество факторов, таких как изменения в экспрессии молекул в области T-клеточного иммуноглобулина и муцина, вызываемые ослабленными естественными стимулами иммунной системы, изменения в соотношении T-хэлперных клеток типа 1 и типа 2, и изменения в соотношении регуляторных T-клеток. Среди аллергических заболеваний атопический дерматит, астма и аллергический ринит являются наиболее распространенными воспалительными состояниями у пациентов с аллергической реакцией; данные пациенты часто страдают от начала множественных клинических симптомов. Патогенез аллергической реакции связан с ненормальным иммунным ответом на чужеродные антигены (Mueller et al. (2002) Structure, binding, and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor, system, Biochim Biophys Acta 1592: 237-250). Чрезмерное продуцирование антиген-специфичного IgE является необходимым фактором для стимуляции аллергического воспаления. Поляризация атипичных T-хэлперных клеток типа 2 (Th2) способствует повышенному IgE ответу. Интерлейкин-4 (IL-4) и интерлейкин-13 (IL-13), продуцируемые активированными T-клетками, являются основными цитокинами Th2, которые стимулируют и поддерживают иммунные и воспалительные ответы при аллергической реакции.
IL-4 и IL-13 сигнализация опосредована двумя разными рецепторными комплексами с общей субъединицей рецептора IL-4 α (IL-4Rα) и она может способствовать перекрыванию биологического ответа у данных двух цитокинов. IL-4Rα образует два разных гетеродимерных рецепторных комплекса, которые опосредуют биологические функции IL-4 и IL-13 ткане- и ответ-специфичным образом. Дупилумаб представляет собой моноклональное антитело-антагонист к человеческому IL-4Rα, и он ингибирует биологическую активность, индуцируемую IL-4 и IL-13. Дупилумаб блокирует IL-4 сигнализацию посредством предотвращения связывания IL-4 с рецепторными субъединицами, и ингибирующее действие на IL-13 сигнализацию может быть опосредовано воспрепятствованием взаимодействию димерных рецепторов.
Дупилумаб в виде полноразмерного человеческого моноклонального антитела к общей субъединице IL-4Rα разработан Regeneron Pharmaceuticals, Inc. и в настоящее время подвергается клиническим испытаниям в отношении лечения астмы от средней степени тяжести до тяжелой формы и лечения атопического дерматита от средней степени тяжести до тяжелой формы.
«Антитело», описанное в данном документе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, состоящую из четырех пептидных цепей, а именно двух тяжелых цепей (H) и двух легких цепей (L), соединенных между собой дисульфидными связями; каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (HVR или VH) и константную область тяжелой цепи, где константная область тяжелой цепи содержит три домена CH1, CH2 и CH3; и каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (LVR или VL) и константную область легкой цепи, где константная область легкой цепи содержит домен (CL1). VH и VL области можно дополнительно разделить на гипервариабельные области, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), в которых разбросаны более консервативные области, называемые каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, и они расположены в следующем порядке от N-конца к C-концу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В данном документе, константная область тяжелой цепи может быть выбрана из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно IgG4, и константная область легкой цепи выбрана из κ или λ.
Термин «вариабельная область» используется в данном документе для описания области, в которой определенные части антитела отличаются между последовательностями антитела и относятся к связыванию и специфичности специфичного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако, вариабельность обычно не равномерно распределяется по вариабельной области антитела. Обычно она сфокусирована на трех сегментах, называемых областями, определяющими комплементарность (CDR), или гипервариабельными областями, в вариабельных областях легкой цепи и тяжелой цепи. Относительно более консервативная часть вариабельной области называется каркасной областью (FR). Каждая из вариабельных областей природных тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR, большинство из них принимают конфигурацию β-листа и соединены тремя CDR, которые образуют кольцевую связь и в некоторых случаях образуют часть структуры β-листа. CDR в каждой цепи близко удерживаются вместе посредством FR, и вместе с CDR другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антитела. Константная область непосредственно не участвует в связывании антитела с антигеном, а демонстрируют разные эффекторные функции, такие как участие антитела в антителозависимой цитотоксичности.
Термины «область, определяющая комплементарность», «гипервариабельная область» и «CDR» относятся к одной или более гипервариабельным областям или областям, определяющим комплементарность (CDR), находящимся в вариабельной области легкой или тяжелой цепи антитела (см., Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Данные термины включают гипервариабельную область, определенную Kabat et al. («Sequences of Proteins of Immunological Interest,» Kabat E., et al., USDept. of Health and Human Services, 1983), или гипервариабельные петли в трехмерной структуре антител (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196901-917 (1987)). CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости за счет каркасных областей, и вместе с CDR от других цепей способствуют образованию антигенсвязывающих сайтов.
Термины «каркасная область» и «FR» относятся к одной или более каркасным областям в пределах вариабельных областей легкой и тяжелой цепей антитела (см., Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987)). Данные термины включают те аминокислотные последовательности, которые расположены между N-концом и первой CDR, аминокислотные последовательности между CDR и те аминокислотные последовательности, которые расположены между третьей CDR и началом константной области в легкой и тяжелой цепях антитела.
Остатки CDR и FR могут быть определены в соответствии со стандартными определениями последовательностей (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1987)) и структурными определениями (Chothia and Lesk, J. Mot. Biol. 196:901-217 (1987)).
Как отмечено в данном документе, ссылка дана на схемы нумерации Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)). Kabat использует способ присвоения номеров остатков каждой аминокислоте в перечисленной последовательности, и данный способ присвоения номеров остатков стал стандартом в данной области. Когда ясно указывается, что используется нумерация Kabat, в данном описании следуют схеме нумерации Kabat. Когда нумерация Kabat не указана, используются последовательные номера аминокислотных последовательностей (а именно, аминокислоты в последовательности нумеруются последовательными целыми числами (такими как, 1, 2, 3 и т.д.) слева направо в направлении от N-конца к C-концу.
«Аффинность» антитела в отношении антигена или эпитопа является термином, широко распространенным в данной области, и указывает на степень или силу связывания антитела с эпитопом. Аффинность может быть измерена и/или выражена разными путями, известными в данной области, включая, но, не ограничиваясь константой диссоциации равновесия (KD или Kd, которая может быть определена, как отношение скорости диссоциации антитела к скорости связывания, а именно Koff/Kon), константой диссоциации кажущегося равновесия (KD' или Kd') и IC50 (количество, требующееся для достижения 50%-ного ингибирования в конкурентном анализе); относительную аффинность гуманизированных антител можно также определять, например, посредством сравнения с родственными мышиными или химерными антителами. В целях настоящего изобретения аффинность представляет собой среднюю аффинность популяции специфичных антител, которая связывает антиген или эпитоп. Аффинность антитела можно измерять посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) или анализа на основе сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS - Fluorescent Activated Cell Sorting). Способ ELISA используется в примерах в данном документе для определения аффинности антитела по изобретению в отношении IL-4R, см. раздел Примеры.
2. Способы получения антитела согласно настоящему изобретению
Антитело согласно настоящему изобретению можно получать доступным способом, таким как технология рекомбинантной экспрессии. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепей, функционально связанные с константной областью, можно вставлять в экспрессионный вектор. Легкая и тяжелая цепи могут быть клонированы в один и тот же или разные экспрессионные векторы. Сегмент ДНК, кодирующий цепь иммуноглобулина, может быть функционально связан с контрольной последовательностью экспрессионного вектора, которая обеспечивает экспрессию полипептида иммуноглобулина. Последовательности контроля экспрессии включают промоторы (например, естественным образом связанные или гетерологичные промоторы), сигнальные последовательности, энхансерные элементы и последовательности терминации транскрипции, но не ограничиваются ими. В одном воплощении последовательность контроля экспрессии представляет собой прокариотическую систему промоторов в векторе, способном к трансформации или трансфекции эукариотической клетки-хозяина. Как только вектор вводят в соответствующего хозяина, хозяин поддерживается в условиях, подходящих для экспрессии нуклеотидной последовательности на высоком уровне и сбора и очистки антител.
Экспрессионный вектор может быть реплицируемым в любом организме-хозяине в виде эписомы или в виде интегрированной части хромосомной ДНК хозяина. В одном воплощении экспрессионный вектор содержит селективный маркер (например, устойчивость к ампициллину, устойчивость к гигромицину, устойчивость к тетрациклину или устойчивость к неомицину) для обеспечения выявления клеток, трансформированных ожидаемой ДНК-последовательностью.
Экспрессионные векторы можно использовать для экспрессии антитела согласно изобретению из любой клетки-хозяина, включая прокариотические клетки-хозяева (например, E. coli), дрожжевые клетки-хозяева, клетки-хозяева млекопитающего, растительные клетки-хозяева и клетки-хозяева насекомого.
В одном воплощении E. coli используют для получения антитела по изобретению. Другие прокариотические хозяева, подходящие для данного применения, включают Bacteriaceae, как например, Bacillus, и другие Enterobacteriaceae, такие как Salmonella, Serratia и разные виды Pseudomonas. В данных прокариотических хозяевах экспрессионные векторы могут быть также получены, и экспрессионный вектор обычно содержит последовательности контроля экспрессии (например, точку начала репликации), совместимые с клеткой-хозяином. Кроме того, будет иметь место любое число разных известных промоторов, таких как система лактозных промоторов, система триптофановых (trp) промоторов, система β-лактамазных промоторов или система промоторов из λ-бактериофага. Возможно, промотор обычно контролирует экспрессию вместе с последовательностью оператора и имеет последовательность сайта связывания рибосомы и тому подобное для инициации и завершения транскрипции и трансляции.
Другие микроорганизмы, такие как дрожжи, могут быть также использованы для экспрессии антитела по изобретению. Например, Saccharomyces могут быть использованы в качестве дрожжевого хозяина с подходящим промотором, содержащим последовательность контроля экспрессии (например, промотор), точку начала репликации, последовательность терминации и, при желании, другие последовательности. Промоторы, используемые в технологии экспрессии дрожжей, включают промоторы 3-фосфоглицераткиназы и других гликолитических ферментов. Индуцибельные промоторы дрожжей включают промоторы от алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома C и ферментов, ответственных за использование мальтозы и галактозы, но не ограничиваются ими.
В другом воплощении культуры клеток тканей млекопитающих можно использовать для экспрессии и продукции антитела по изобретению. Для таких способов можно использовать любые клетки тканей млекопитающих, и многие подходящие линии клеток-хозяев, способные секретировать гетерологичные белки (такие как интактные иммуноглобулины), были разработаны в данной области, включая линии клеток млекопитающих BHK (почка новорожденного хомяка) или CHO (яичник китайского хомяка), разные линии клеток Cos (клетки почки обезьяны, трансформированные SV40), линии клеток HeLa, предпочтительно линии клеток миеломы, или трансформированные B-клетки или гибридомы. В одном воплощении клетка представляет собой клетку, не являющуюся человеческой. Экспрессионный вектор клетки млекопитающего может включать последовательности контроля экспрессии, например, точку начала репликации, промоторы и энхансеры, а также необходимые сайты обработки сигнала, такие как сайты связывания рибосомы, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательность-терминатор транскрипции. В одном воплощении последовательность контроля экспрессии представляет собой промотор, происходящий из генов иммуноглобулина, SV40, аденовируса, вируса папилломы крупного рогатого скота, цитомегаловируса и т.п.
Векторы, содержащие исследуемые полинуклеотидные последовательности (такие как последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепи, и последовательности контроля экспрессии) могут быть перенесены в клетки-хозяев хорошо известными способами, которые варьируют в соответствии с типом клетки-хозяина. Например, трансфекция хлоридом кальция обычно используется для прокариотических клеток, в то время как обработка фосфатом кальция, электропорация, липофекция, биобаллистика или вирусная трансфекция могут использоваться для других клеток-хозяев. Другие способы трансформации клеток млекопитающего включают применение полибрена, слияние протопластов, липосомы, электропорацию и микроинъекцию. Для получения трансгенных животных можно осуществлять микроинъекцию трансгена в оплодотворенные яйца, или его можно вводить в геном эмбриональных стволовых клеток, и ядра таких клеток переносят в безъядерные ооциты.
Когда молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую и легкую цепи, клонируют в отдельный экспрессионный вектор, можно осуществлять совместную трансфекцию данным вектором таким образом, чтобы осуществлялась экспрессия и сборка интактных иммуноглобулинов. После экспрессии, интактные антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или другие иммуноглобулиновые формы антител можно очищать в соответствии со стандартными способами в данной области, включая осаждение сульфатом аммония, колонки для аффинной хроматографии, колоночную хроматографию, очистку на основе ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), гель-электрофорез и т.д. По существу чистый иммуноглобулин с по меньшей мере примерно 90-95%-ной гомогенностью может быть получен для фармацевтического применения. В другом воплощении по существу чистое гуманизированное антитело с по меньшей мере примерно 98-99%-ной или большей гомогенностью может быть получено для фармацевтической композиции и способов.
Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен способ экспрессирования антитела согласно настоящему изобретению, включающий: (a) трансформацию клетки-хозяина молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело, описанное в данном документе, и (б) культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, делающих возможной экспрессию антитела. Известные методики включения в вектор селективного маркера можно использовать таким образом, чтобы можно было легко осуществить селекцию меченой клетки-хозяина, экспрессирующей антитело.
Термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела или «антигенсвязывающая часть» антитела относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (таким как hIL-4R). Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть достигнута определенными фрагментами полноразмерного антитела. Примеры «антигенсвязывающих фрагментов» антитела включают: (i) фрагмент Fab (антигенсвязывающий фрагмент), а именно одновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL1 и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, а именно двухвалентный фрагмент, состоящий из двух фрагментов F(ab'), соединенных дисульфидными связями в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из одноплечевых доменов VL и VH антитела; (v) фрагмент dAb, состоящий из домена VH; и (vi) CDR, но не ограничиваются ими. Кроме того, несмотря на то, что два домена VL и VH фрагмента Fv кодируются разными генами, они могут быть соединены синтетическим линкером с образованием одной связной цепи рекомбинантного способа, где области VL и VH составляют пару с образованием одновалентной молекулы (называемой одноцепочечным Fv, scFv (одноцепочечный вариабельный фрагмент)). Такие одноцепочечные антитела также охвачены термином «антигенсвязывающие фрагменты» антител.
Антитело по настоящему изобретению может быть получено способом, который включает культивирование клетки-хозяина, содержащей последовательность ДНК, кодирующую антитело, и способной экспрессировать антитело в условиях, делающих возможной экспрессию антитела, и затем выделение полученного антитела из культуры.
Среда, используемая для культивирования клеток, может представлять собой любую традиционную среду, используемую для культивирования клеток-хозяев, такую как базовая среда или комплексная среда с подходящими добавками. Подходящая среда может быть получена на коммерческом рынке или подходящая среда может быть получена в соответствии с раскрытым способом получения. Затем, полипептиды, продуцируемые клетками, могут быть выделены из среды традиционными способами, которые включают отделение клеток-хозяев от среды посредством центрифугирования или фильтрации, и осаждение белковых компонентов в супернатанте или фильтрате солями, такими как сульфат аммония, затем очистку разными хроматографическими способами, такими как ионообменная хроматография, эксклюзионная хроматография, аффинная хроматография и т.д. в зависимости от типа целевого пептида.
3. Способы и агенты лечения
Согласно настоящему изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая антитело к IL-4Rα или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению. Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению будут вводить вместе с соответствующими носителями, эксципиентами и другими препаратами. Данные препараты включены в композицию для улучшения доставки и переносимости и т.д. Большое количество подходящих композиций можно обнаружить в фармакопее, известной всем химикам-фармацевтам: Remington's Pharmaceuticals, Mack Publishing, Easton, PA.
Дозировку подбирают в соответствии с разницей в возрасте и размере тела субъекта, заболеванием-мишенью, симптомами, способом введения и т.д. Когда антитело по настоящему изобретению используется для лечения разных IL-4R-связанных расстройств и заболеваний у взрослых, антитело по настоящему изобретению можно вводить внутривенно, обычно однократную дозу примерно 0,01-20 мг/кг массы тела, более предпочтительно примерно 0,1-15, примерно 1-10 или примерно 3-10 мг/кг массы тела. В зависимости от тяжести расстройства, можно регулировать частоту и продолжительность лечения.
Разные виды известных систем доставки лекарственного средства можно использовать для введения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, например, инкапсуляцию в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать мутантные вирусы, и рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например,Wu et al. (1987), J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Способы введения лекарственного средства включают, но не ограничиваются следующими: внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, интраназальный, дуральный и пероральный способы. Фармацевтическая композиция может быть введена любым общепринятым способом, как например, посредством инфузии или внутривенной болюсной инъекции, поглощения слоем эпителия или слизистой оболочки (такой как слизистая оболочка полости рта, слизистая оболочка прямой кишки и тонкой кишки), и может быть введена вместе с другими биоактивными агентами. Способ введения может представлять собой системное или местное применение.
Фармацевтическая композиция может быть доставлена посредством пузырьков, особенно пузырьков липосом (см. Langer (1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in The Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler (Eds.), Liss, New York, pages 353-365; Lopez-Berestein, выше, сс. 317-327).
В некоторых случаях фармацевтическая композиция может быть доставлена в системе контролируемого высвобождения. В одном воплощении можно использовать насос (см. Langer, выше; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201). В другом воплощении можно использовать полимерные материалы (см. Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (Eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). Для обсуждения других систем контролируемого высвобождения см. Langer (1990) Science 249:1527-1533.
Инъецируемые препараты могут включать лекарственные формы для внутривенной, подкожной, внутрикожной и внутримышечной инъекции, капельной инфузии и т.п. Данные инъекционные препараты могут быть получены посредством раскрытых способов. Например, инъекционные препараты могут быть получены посредством растворения, суспендирования или эмульгирования антитела или его соли в стерильной водной среде или масляной среде, обычно используемой для инъекции. Водные среды для инъекции включают, например, физиологический раствор, изотонические растворы, содержащие глюкозу и другие адъюванты и т.д. Они могут быть использованы в комбинации с подходящими солюбилизаторами, такими как спирты (например, этанол), многоатомные спирты (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионные поверхностно-активные вещества [например, полисорбат 80, HCO-50 (полиоксиэтиленовый (50 моль) аддукт гидрогенизированного касторового масла) и т.п. Используемая масляная среда представляет собой кунжутное масло или соевое масло и т.д. Они могут быть использованы в комбинации с солюбилизаторами, такими как бензилбензоат и бензиловый спирт. Полученная таким образом инъекция предпочтительно упакована в подходящую ампулу.
Монотерапия и комбинированная терапия на основе антитела или его фрагмента согласно настоящему изобретению полезны для лечения заболеваний и расстройств, которые могут быть улучшены, подавлены или устранены в результате снижения активности IL-4. Данные заболевания включают заболевания, характеризующиеся аномальной экспрессией или сверхэкспрессией IL-4 или ненормальным ответом хозяина на продукцию IL-4. Заболевания, связанные с IL-4, подлежащие лечению антителом или его фрагментом согласно настоящему изобретению, включают, например, артрит (включая септический артрит), герпес, хроническую первичную крапивницу, склеродермию, гипертрофические рубцы, болезнь Уиппла, доброкачественную гиперплазию предстательной железы, заболевание легкого, такое как астма (легкая астма, астма средней тяжести и тяжелая форма астмы), воспалительные заболевания, такие как воспалительное заболевание кишечника, аллергическая реакция, Синдром Кавасаки, серповидно-клеточную анемию, синдром Черджа-Стросса, болезнь Грейвса, преэклампсию, синдром Шегрена, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную гемолитическую анемию, пищевод Барретта, аутоиммунный увеит, туберкулез (заболевание), атопический дерматит, язвенный колит, фиброз и заболевание почки (см. Патент США 7,186,809).
Настоящее изобретение охватывает комбинированную терапию, в которой антитело к IL-4Rα или его фрагмент вводят в комбинации с одним или более терапевтическими агентами (или называемым вторым терапевтическим агентом). Совместное введение и комбинированная терапия не ограничиваются одновременным ведением, а также включают схему лечения, при которой антитело к IL-4Rα или его фрагмент вводят по меньшей мере один раз на протяжении курса лечения, включающего введение пациенту по меньшей мере одного терапевтического агента. Второй терапевтический агент может представлять собой другой антагонист IL-4, такой как другое антитело/его фрагмент или растворимый рецептор к цитокину, антагонист IgE, лекарственное средство против астмы, которые можно вводить посредством ингаляции или других соответствующих способов (например, кортикостероидное, нестероидное лекарственное средство, β-агонист, лейкотриен, антагонист, ксантин, флутиказон, сальметерол, альбутерол). В конкретном воплощении антитело к IL-4R или его фрагмент согласно настоящему изобретению можно вводить вместе с антагонистом IL-1, таким как рилонацепт, или антагонистом IL-13. Второй агент может включать один или более антагонистов рецепторов лейкотриена, таким образом, чтобы лечить заболевания, такие как аллергическое воспаление, например, астму и аллергии. Примеры антагонистов рецепторов лейкотриена включают монтелукаст, пранлукаст и зафирлукаст, но не ограничиваются ими. Второй агент может включать ингибитор цитокинов, такой как один или более антагонистов TNF (фактор некроза опухоли) (этанерцепт, ENBRELTM), IL-9, IL-5 или IL-17.
Настоящее изобретение также включает применение любого антитела к IL-4Rα или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в данном документе, в получении лекарственного средства для лечения заболевания или симптома, где заболевание или симптом улучшены, утрачены или ингибированы в результате устранения, ингибирования или снижения активности человеческого интерлейкина-4 (hIL-4). Примеры таких заболеваний или симптомов включают, например, артрит, герпес, хроническую первичную крапивницу, склеродермию, гипертрофический рубец, болезнь Уиппла, доброкачественную гиперплазию предстательной железы, заболевание легкого, астму, воспалительное заболевание, аллергическую реакцию, синдром Кавасаки, серповидно-клеточную анемию, синдром Черджа-Стросса, болезнь Грейвса, преэклампсию, синдром Шегрена, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную гемолитическую анемию, пищевод Барретта, аутоиммунный увеит, туберкулез (заболевание), заболевание почки, атопический дерматит и астму.
В одном аспекте настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, которая содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающееся с человеческим IL-4R согласно настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель.
В данной заявке, если отсутствует противоречие или конкретное описание, лекарственное средство, фармацевтическую композицию и фармацевтический препарат (агент) можно использовать взаимозаменяемо. В данном контексте, фармацевтически приемлемые эксципиенты относятся к нетоксичным наполнителям, стабилизаторам, разбавителям, носителям, растворителям или другим эксципиентам состава. Например, разбавители, эксципиенты, такие как микрокристаллическая целлюлоза, маннит и т.д.; наполнители, такие как крахмал, сахароза и т.д.; связующие вещества, такие как крахмал, производные целлюлозы, альгинат, желатин и/или полиэтиленпирролидон; разрыхлители, такие как карбонат кальция и/или бикарбонат натрия; усилители поглощения, такие как соединения четвертичного аммония; поверхностно-активные вещества, такие как гексадеканол; носители, растворители, такие как вода, физиологический раствор, каолин, бентонит и т.п.; смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция/магния, полиэтиленгликоль и т.д. Кроме того, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно представляет собой инъекцию.
В некоторых воплощениях изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции согласно изобретению находится в концентрации 1-1000 мг/мл, предпочтительно в концентрации 10-1000 мг/мл, более предпочтительно в концентрации 50-500 мг/мл, еще более предпочтительно в концентрации 100-300 мг/мл.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно имеет pH 3,0-9,0, где она может дополнительно включать буферную систему, консервант, агент, изменяющий поверхностное натяжение, хелатирующий агент, стабилизатор и поверхностно-активное вещество. В одном воплощении изобретения фармацевтическая композиция согласно изобретению представляет собой водный препарат. Такой препарат обычно представляет собой раствор или суспензию. В конкретном воплощении изобретения фармацевтическая композиция представляет собой стабильный водный раствор. В другом конкретном воплощении настоящего изобретения фармацевтическая композиция представляет собой лиофилизированный препарат, и растворитель и/или разбавитель добавляет лечащий врач или пациент для растворения лиофилизированного препарата перед применением.
Пример 1: Конструирование экспрессионных векторов вариантов дупилумаба
Сайт расщепления HindIII (AAGCCT), последовательность KoZAK (GCCGCCACC), ATG, ген сигнального пептида ATGGAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT и ген, кодирующий тяжелую цепь дупилумаба (SEQ ID NO: 35, включающая ген, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID ID NO: 27, и ген, кодирующий константную область IgG4), код терминации TAATAATAA и EcoRI-кодирующий ген GAATCC последовательно сливают в последовательность, и фрагменты гена получают посредством химического синтеза. Через сайты EcoRI и HindIII, указанные выше фрагменты вставляют в эукариотическую экспрессионную плазмиду pCDNA 3.1(+), и осуществляют проверку на основе секвенирования с получением экспрессионной плазмиды PCDNA3.1(+)-DH для тяжелой цепи дупилумаба.
Сайт расщепления HindIII (AAGCCT), последовательность KoZAK (GCCGCCACC), ATG, ген сигнального пептида ATGGAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT и ген, кодирующий легкую цепь дупилумаба (SEQ ID: NO: 38, включающая ген, кодирующий вариабельную область легкой цепи SEQ ID ID NO: 28, и ген, кодирующий константную область κ), код терминации TAATAATAA и EcoRI-кодирующий ген GAATCC последовательно сливают в последовательность, и фрагменты гена получают посредством химического синтеза. Через сайты EcoRI и HindIII указанные выше фрагменты вставляют в эукариотическую экспрессионную плазмиду pCDNA 3.1(+), и осуществляют проверку на основе секвенирования с получением экспрессионной плазмиды PCDNA3.1(+)-DL для легкой цепи дупилумаба.
В соответствии с таким же способом, как указан выше, получают целый ряд экспрессионных плазмид вариантов дупилумаба, и они соответственно названы pCDNA 3.1(+)-D1L, pCDNA 3.1(+)-D2L, pCDNA 3.1(+)-D3L, pCDNA 3.1(+)-D4L, pCDNA3.1(+)-D5H, pCDNA3.1(+)-D6H, pCDNA3.1(+)-D7H, pCDNA3.1(+)-D8H, pCDNA3.1(+)-D9H, pCDNA3.1( +)-D10H, pCDNA 3.1(+)-D11H, pCDNA 3.1(+)-D12H, pCDNA 3.1(+)-DH и pCDNA 3.1(+)-DL.
В отношении варианта D1, осуществляют мутацию аминокислоты Arg в положении 24 LVR дупилумаба до Ala, и последовательность гена LVR, кодирующая D1, представляет собой SEQ ID NO: 4; в отношении варианта D2, осуществляют мутацию аминокислоты Ser в положении 28 LVR дупилумаба до Arg, и последовательность гена LVR, кодирующая D2, представляет собой SEQ ID NO: 6; в отношении варианта D3 или D4, осуществляют мутацию аминокислоты Ser в положении 32 LVR дупилумаба соответственно до Arg или Lys, и последовательности генов LVR, кодирующие D3 и D4, соответственно представляют собой SEQ ID NO: 8 и 10; в отношении варианта D5, осуществляют мутацию Arg в положении 100 HVR дупилумаба до Ala, и последовательность гена HVR, кодирующая D5, представляет собой SEQ ID NO: 12; в отношении варианта D6 или D7, осуществляют мутацию аминокислоты Arg в положении 106 HVR дупилумаба соответственно до Ala или Glu, и последовательности генов HVR, кодирующие D6 и D7, представляют собой соответственно SEQ ID NO: 14 и 16; в отношении вариантов D8-D12, осуществляют мутацию аминокислоты Arg в положении 108 HVR дупилумаба соответственно до Ala, Glu, Gln, Tyr или Leu, и последовательности генов HVR, кодирующие D8-D12, представляют собой соответственно 18, 20, 22, 24 и 26. Константная область тяжелой цепи каждого варианта представляет собой IgG4, и константная область легкой цепи представляет собой κ.
Пример 2: Экспрессия и очистка Дупилумаба и его вариантов
Посредством ДНК-конструкции, описанной в Примере 1, эукариотические клетки системы экспрессии FreeStyle™ 293-F (Invitrogen Corporation, R790-07) используют для экспрессии исследуемого антитела. В соответствии с инструкцией по эксплуатации системы экспрессии FreeStyle™ 293, плотность клеток доводят до 1×106 клеток/мл за сутки перед трансфекцией плазмидой. В день трансфекции плазмидой плазмиды объединяют в соответствии со следующей таблицей и смешивают с реагентом для трансфекции, затем добавляя к среде клеточной культуры; после непрерывного культивирования при 37°C, 8% CO2 на протяжении 5-7 суток супернатант клеточной культуры собирают для очистки антитела.
№ Антитела Плазмиды
1 D1 R24A-L pCDNA 3.1(+)-D1L
pCDNA 3.1(+)-DH
2 D2 S28R-L pCDNA 3.1(+)-D2L
pCDNA 3.1(+)-DH
3 D3 S32R-L pCDNA 3.1(+)-D3L
pCDNA 3.1(+)-DH
4 D4 S32K-L pCDNA 3.1(+)-D4L
pCDNA 3.1(+)-DH
5 D5 R100A-H pCDNA 3.1(+)-DL
pCDNA 3.1(+)-D5H
6 D6 R106A-H pCDNA 3.1(+)-DL
pCDNA 3.1(+)-D6H
7 D7 R106E-H pCDNA 3.1(+)-DL
pCDNA 3.1(+)-D7H
8 D8 R108A-H pCDNA 3.1(+)-DL
pCDNA 3.1(+)-D8H
9 D9 R108E-H pCDNA 3.1(+)-DL
pCDNA 3.1(+)-D9H
10 D10 R108Q-H pCDNA 3.1(+)-DL
pCDNA 3.1(+)-D10H
11 D11 R108Y-H pCDNA 3.1(+)-DL
pCDNA 3.1(+)-D11H
12 D12 R108L-H pCDNA 3.1(+)-DL
pCDNA 3.1(+)-D12H
13 Дупилумаб pCDNA 3.1(+)-DL
pCDNA 3.1(+)-DH
Супернатант с экспрессированными антителами фильтруют посредством мембранного фильтра 0,22 мкМ, и осуществляют захват экспрессированных антител из супернатанта с экспрессионными антителами посредством использования колонки для аффинной хроматографии Mabpurix (приобретенной у Sepax, 65008), а именно после уравновешивания хроматографической колонки уравновешивающим буфером (120 мМ Tris плюс 100 мМ NaCl, pH 7,5), фильтрат загружают для пропускания через колонку для аффинной хроматографии, элюируя элюирующим буфером (0,15 M ледяная уксусная кислота, pH 2,8). Очищенные антитела выявляют посредством SDS-PAGE, SEC, и чистота составляет выше 95%.
Пример 3: Определение аффинности связывания с антигеном
Очищенные антитела, описанные в Примере 2, используют для определения аффинности in vitro. Микропланшет покрывают IL-4R (R&D, 7700-4R-050) в количестве 2 мкг/мл, 100 мкл/лунка, и присоединяют мембрану планшета, помещая на 4°C на ночь и на следующий день промывая планшет 3 раза промывочным раствором. Затем 10%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина готовят с использованием промывочного раствора, добавляя к планшету ELISA в количестве 200 мкл/лунка, помещая на 37°C на 2 часа, промывая планшет 3 раза промывочным раствором; добавляя 100 мкл/лунка раствора градиентно разведенного антитела, помещая на 37°C на 2 часа, промывая планшет 3 раза промывочным раствором; HRP (пероксидаза хрена)-меченное вторичное антитело (каталог: ab6858, продукт от компании Abcam) разводят в соотношении 1/5000 разбавителем (2%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина готовят с помощью промывочного раствора), добавляя в микропланшет в количестве 100 мкл/лунка, при 37°C в течение 1 часа; промывая планшет 5 раз промывочным раствором; добавляя жидкость с TMB (тетраметилбензидин) для развития окраски в количестве 100 мкл/лунка, помещая в темноту для протекания реакции при комнатной температуре в течение 5-10 минут и останавливая реакцию добавлением 50 мкл/лунка останавливающего раствора. Поглощение измеряют при длине волны 450 нм.
Антитела IC50 (нМ)
D1 R24A-L 3,89
D2 S28R-L 4,98
D3 S32R-L 6,87
D4 S32K-L 4,19
D5 R100A-H 3,94
D6 R106A-H 5,38
D7 R106E-H 18,48
D8 R108A-H 1,98
D9 R108E-H 3,20
D10 R108Q-H 12,01
D11 R108Y-H 14,23
D12 R108L-H 13,05
Дупилумаб 3,31
Результаты показывают, что D8 и D9 улучшили EC50 относительно дупилумаба, и они соответственно составляют 3,200 нМ и 1,997 нМ; особенно в случае D8, EC50 составляет примерно 60% дупилумаба.
Пример 4: Биологическое действие на нейтрализацию IL-4 in vitro
Очищенные антитела, описанные в Примере 2, используют для определения биологического действия на нейтрализацию IL-4 in vitro. С помощью базовой среды RPMI1640 (C22400500BT, от компании GIBCO) клетки TF-1 культивируют в условиях голодания при 37°C и 5% диоксида углерода в течение 24 часов. На следующее утро клетки TF-1 собирают, три раза промывая средой RPMI1640 и ресуспендируя в полной среде (базовая среда RPMI1640, содержащая фетальную телячью сыворотку 10%) с концентрацией клеток 4,0×105 клеток/мл. Суспензии клеток, градиентные разведения образца антител и IL-4 соответственно добавляют в 96-луночный планшет для клеточной культуры, хорошо перемешивая и инкубируя при 37°C, 5% диоксида углерода в течение 2 суток. В соответствии с инструкцией по эксплуатации CCK-8 (CK04, продукт от компании Dojindo), добавляют разбавитель CCK-8, инкубируя при 37°C, 5% диоксида углерода в течение 2,5 ч; выявляя посредством микропланшет-ридера, поглощение измеряют с использованием референсной длины волны при 630 нм и длины волны определения при 450 нм, и выявляют жизнеспособность клеток.
Результаты на Фиг. 3 показывают, что дупилумаб ингибирует рост клеток на 92%, в то время как D8 и D9 оказывают лучшее ингибирующее действие со степенью ингибирования 98%, и они значимо лучше, чем дупилумаб.
Пример 5: Стабильность вариантов Дупилумаба
Для дополнительного исследования свойства мутантного антитела изменение в стабильности и активности мутантного антитела относительно первичного антитела дупилумаб сравнивают посредством разработки разных условий хранения, выявляя чистоту главного пика антитела после хранения способом SEC-ВЭЖХ (сокращенно SEC), и выявляя относительную активность антитела после хранения способом ELISA.
Очищенные антитела по настоящему изобретению и дупилумаб соответственно добавляют к буферному раствору 12,5 мМ ацетата натрия (pH 6,15) с конечной концентрацией примерно 2,7 мг/мл. В соответствии с экспериментальными результатами предварительного эксперимента 35,1 мкл 0,2M трис-основания добавляют к 1,5 мл образца с созданием pH 9,0, фильтруя и разделяя по 200 мкл/часть, каждый из фильтратов делят на 7 частей; 288 мкл 0,2 M лимонной кислоты добавляют к 2,5 мл образца для подкисления с pH примерно 3,0, фильтруя и разделяя по 200 мкл/часть, каждый из фильтратов делят на 12 частей; последние оставшиеся образцы фильтруют и стерилизуют, 200 мкл/ часть, каждый из фильтратов делят на 30 частей. Все образцы хранят в чистых и стерилизованных флаконах, закрывая стерилизованными резиновыми пробками, герметично закрывая алюминиевыми колпачками для хранения.
Анализ SEC-ВЭЖХ: вещества с разными молекулярными массами разделяют посредством эксклюзионной хроматографии таким образом, чтобы количественно оценить чистоту образцов. Колонка представляет собой TSK G3000SWXL, подвижная фаза: 0,2 моль/л калий фосфатный буфер, 0,25 моль/л хлорид калия (pH 6,2±0,1); скорость потока составляет 0,5 мл/мин, и время промывки составляет 30 мин.
Способ ELISA (выявление посредством микропланшет-ридера): микропланшет, покрытый 2 мкг/мл IL-4R, 500 нг/мл в качестве исходной концентрации тестируемого образца, и его разводят в 5 раз с получением 8 градиентов концентрации, затем перенося в микропланшет для объединения с IL-4R, добавляя вторичное антитело козы против человеческого сегмента Fab (продукт от компании Jackson Immuno), осуществляя развитие окраски и считывая показания с планшета, и рассчитывая относительную активность антитела согласно настоящему изобретению (под относительной активностью подразумевается: относительная активность антитела по настоящему изобретению, когда активность дупилумаба на образце того же планшета в каждый момент времени тестирования принимается за 1).
Условия хранения включают высокую температуру, сильное освещение светом, повторное замораживание и оттаивание и сильную кислоту. Конкретные операции, моменты времени тестирования и предметы тестирования показаны в нижеследующей таблице:
Содержание проверки Условия Конкретные действия Моменты времени тестирования Предметы тестирования Примечания
Высокая температура 50±2°C Образцы помещают в термостатический инкубатор на 50°C на 20 суток Сутки 0, 5, 10, 15 и 20 SEC, активность связывания
Повторное замораживание-оттаивание Замораживание при минус 70±10°C, и оттаивание при 25±2°C, повторное замораживание и оттаивание 5 раз Один цикл замораживания-оттаивания: замораживание на протяжении одних суток и затем оттаивание на протяжении одних суток Сутки 0, 3, и 5 SEC, активность связывания
Сильная кислота pH 3,0, 25±2°C pH доводят до 3,0 лимонной кислотой 0,2 M, затем образцы помещают в термостатический инкубатор при 25 °C на 3 суток Сутки 0, 3, и 5 SEC, активность связывания Образец, подвергаемый воздействию кислотой, используют в качестве контроля 0-момента времени
Освещение 4500±500 лк, 25±2°C Образцы помещают в камеру для анализа стабильности лекарственного средства при 25°C, интенсивности света 4500 лк, на 10 суток Сутки 0, 5 и 10 SEC, активность связывания Образец, стабильный при 25±2°C, используют в качестве освещаемого контроля
25±2°C Образцы помещают в термостатический инкубатор на 25°C на 10 суток
Тестирование условий высокой температуры: Образцы помещают в термостатический инкубатор на 50°C на 20 суток и тестируют в сутки 0, 5, 10, 15 и 20. Результаты показаны на Фиг. 4A и Фиг. 4B, и результаты экспериментов SEC-ВЭЖХ показывают, что тенденция к изменению стабильности тестируемого образца согласуется с тенденцией к изменению стабильности дупилумаба. Чистота образца дупилумаба выше, чем чистота образца антитела по настоящему изобретению в 0-момент времени. При продлении периода хранения при высокой температуре, снижение чистоты менее чем на 5% происходит в случае обоих из них, и отсутствует значимое различие в термостабильности. Аномальные результаты (вторая точка HC-108A на Фиг. 4B) результатов ELISA не учитываются, активность антитела по настоящему изобретению всегда выше активности дупилумаба, и разница становится больше с продлением периода хранения при высокой температуре, что указывает на то, что термостабильность активности связывания антитела согласно настоящему изобретению лучше, чем термостабильность дупилумаба.
Повторные циклы замораживания-оттаивания: повторные циклы замораживания-оттаивания осуществляют 3 или 5 раз при минус 80°C, комнатной температуре, таким образом, чтобы выявить изменения в антителе согласно настоящему изобретению и дупилумабе, и данные результаты показаны на Фиг. 4C и Фиг. 4D. По результатам SEC-ВЭЖХ можно видеть, что с увеличением количества циклов замораживания-оттаивания, чистота дупилумаба не изменилась, и она близка к 100%. Чистота антитела согласно настоящему изобретению в 0-момент времени меньше, чем чистота дупилумаба, и имеет место только 5%-ное уменьшение чистоты главного пика после повторных циклов замораживания-оттаивания. Однако, в отношении воздействия на активность после повторного замораживания и оттаивания, ELISA демонстрирует, что антитело по настоящему изобретению превосходит дупилумаб по предотвращению снижения активности, вызываемого повторным замораживанием и оттаиванием. Антитело по настоящему изобретению обладает более высокой относительной активностью после повторного замораживания и оттаивания в тех же условиях.
Действие сильной кислоты: pH образца доводят до 3,0 лимонной кислотой, помещая образец на 25°C на 3 суток, наблюдая и тестируя в 0-момент времени, сутки 1 и сутки 3, соответственно. По результатам SEC-экспериментов на Фиг. 4E можно видеть, что чистота трех тестируемых образцов снизилась примерно на 10%, начиная с 0-момента времени. После исключения аномальной точки выявления в случае HC-R108E в сутки 1 на Фиг. 4G, чистота всех образцов лишь незначительно уменьшилась еще за трое суток. По SEC-хроматограмме можно сделать предположение о том, что обработка сильной кислотой будет разрушать образец с 0-момента времени с частичной полимеризацией и частичной деградацией. По Фиг. 4H можно видеть, что активность связывания антитела согласно настоящему изобретению после обработки сильной кислотой значимо выше, чем активность связывания дупилумаба в тех же условиях. Можно сделать предположение о том, что изоэлектрическая точка понижается после модификации структуры тестируемого образца, и, вследствие этого, он становится более кислотоустойчивым.
Воздействие освещения: образцы помещают в камеру для тестирования стабильности лекарственного средства при 25°C, интенсивности света 4500 лк, на 10 суток, тестируя в 0-момент времени, сутки 5 и сутки 10, соответственно. Результаты показаны на Фиг. 4E и Фиг. 4F. По результатам SEC может быть видно, что чистота целевого пика для дупилумаба и антитела согласно настоящему изобретению меняется очень незначительно. Результат ELISA показывает, что активность антитела согласно настоящему изобретению не уменьшается с увеличением продолжительности освещения, что указывает на то, что стабильность антитела согласно настоящему изобретению на свету несколько лучше, чем стабильность на свету дупилумаба.
На основе приведенных выше результатов экспериментов по высокой температуре, сильной кислоте, освещению и повторному замораживанию-оттаиванию, можно видеть, что воздействие разных факторов на стабильность антитела сильно не различается; но в отношении активности, антитело согласно настоящему изобретению имеет лучшую устойчивость относительно дупилумаба, и данное антитело является более полезным в процессе более длительного хранения и выпуска.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> БЭЙЦЗИН КАВИН ТЕКНОЛОДЖИ ШЕА-ХОЛДИНГ КО., ЛТД.
<120> АНТИТЕЛО К IL-4Rα И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130> FA00011PCT
<140> PCT/CN2018/074890
<141> 2018-02-01
<160> 36
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 124
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 1
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu
100 105 110
Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 2
<211> 112
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 2
Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Leu Thr Ser
20 25 30
Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile
65 70 75 80
Ser Ala Val Gly Ala Gly Ala Val Gly Pro Thr Thr Cys Met Gly Ala
85 90 95
Leu Gly Thr Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu
100 105 110
<210> 3
<211> 112
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 3
Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Leu Thr Ser
20 25 30
Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile
65 70 75 80
Ser Ala Val Gly Ala Gly Ala Val Gly Pro Thr Thr Cys Met Gly Ala
85 90 95
Leu Gly Thr Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu
100 105 110
<210> 4
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 4
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 60
atcagctgca ggagcagcca gagcctgctg tacaggatcg gctacaacta cctggactgg 120
tacctgcaga agagcggcca gagcccccag ctgctgatct acctgggcag caacagggcc 180
agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga cgtgggcttc tactactgca tgcaggccct gcagaccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 5
<211> 112
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 5
Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Leu Thr Ser
20 25 30
Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile
65 70 75 80
Ser Ala Val Gly Ala Gly Ala Val Gly Pro Thr Thr Cys Met Gly Ala
85 90 95
Leu Gly Thr Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu
100 105 110
<210> 6
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 6
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 60
atcagctgca ggagcagcca gagcctgctg tacaagatcg gctacaacta cctggactgg 120
tacctgcaga agagcggcca gagcccccag ctgctgatct acctgggcag caacagggcc 180
agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga cgtgggcttc tactactgca tgcaggccct gcagaccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 7
<211> 112
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 7
Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Leu Thr Ser
20 25 30
Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile
65 70 75 80
Ser Ala Val Gly Ala Gly Ala Val Gly Pro Thr Thr Cys Met Gly Ala
85 90 95
Leu Gly Thr Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu
100 105 110
<210> 8
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 8
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 60
atcagctgcg ccagcagcca gagcctgctg tacagcatcg gctacaacta cctggactgg 120
tacctgcaga agagcggcca gagcccccag ctgctgatct acctgggcag caacagggcc 180
agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga cgtgggcttc tactactgca tgcaggccct gcagaccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 9
<211> 112
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 9
Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Leu Thr Ser
20 25 30
Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile
65 70 75 80
Ser Ala Val Gly Ala Gly Ala Val Gly Pro Thr Thr Cys Met Gly Ala
85 90 95
Leu Gly Thr Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu
100 105 110
<210> 10
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 10
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 60
atcagctgca ggagcagcca gaggctgctg tacagcatcg gctacaacta cctggactgg 120
tacctgcaga agagcggcca gagcccccag ctgctgatct acctgggcag caacagggcc 180
agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga cgtgggcttc tactactgca tgcaggccct gcagaccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 11
<211> 124
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 11
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu
100 105 110
Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 12
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 12
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttcagg gactacgcca tgacctgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacagg 300
ctgagcatca ccatcaggcc cgagtactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gc 372
<210> 13
<211> 124
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 13
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu
100 105 110
Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 14
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 14
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttcagg gactacgcca tgacctgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacgcc 300
ctgagcatca ccatcaggcc caggtactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gc 372
<210> 15
<211> 124
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 15
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu
100 105 110
Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 16
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 16
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttcagg gactacgcca tgacctgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacagg 300
ctgagcatca ccatcgcccc caggtactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gc 372
<210> 17
<211> 124
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 17
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu
100 105 110
Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 18
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 18
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttcagg gactacgcca tgacctgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacagg 300
ctgagcatca ccatcaggcc cgcctactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gc 372
<210> 19
<211> 124
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 19
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu
100 105 110
Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 20
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 20
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttcagg gactacgcca tgacctgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacagg 300
ctgagcatca ccatcgagcc caggtactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gc 372
<210> 21
<211> 124
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 21
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu
100 105 110
Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 22
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 22
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttccgc gactacgcca tgacctgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggaccgc 300
ctgagcatca ccatccgccc ccagtactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gc 372
<210> 23
<211> 124
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 23
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu
100 105 110
Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 24
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 24
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttccgc gactacgcca tgacctgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggaccgc 300
ctgagcatca ccatccgccc ctactactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gc 372
<210> 25
<211> 124
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 25
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu
100 105 110
Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 26
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 26
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgcgcctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttccgc gactacgcca tgacctgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg cttcaccatc agccgcgaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggaccgc 300
ctgagcatca ccatccgccc cctgtactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gc 372
<210> 27
<211> 372
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 27
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttcagg gactacgcca tgacctgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacagg 300
ctgagcatca ccatcaggcc caggtactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gc 372
<210> 28
<211> 336
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 28
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 60
atcagctgca ggagcagcca gagcctgctg tacagcatcg gctacaacta cctggactgg 120
tacctgcaga agagcggcca gagcccccag ctgctgatct acctgggcag caacagggcc 180
agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga cgtgggcttc tactactgca tgcaggccct gcagaccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaag 336
<210> 29
<211> 8
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 29
Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr Ala
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 30
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr
1 5
<210> 31
<211> 4
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 31
Leu Gly Ser Gly
1
<210> 32
<211> 9
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 32
Met Gly Ala Leu Gly Thr Pro Thr Thr
1 5
<210> 33
<211> 451
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 33
Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Ala Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Pro Thr Pro Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Met Thr Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gly Thr Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ser Val
50 55 60
Leu Gly Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala Ser Leu Ala Thr Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gly Met Ala Ser Leu Ala Ala Gly Ala Thr Ala Val Thr Thr Cys
85 90 95
Ala Leu Ala Ala Leu Ser Ile Thr Ile Ala Pro Ala Thr Thr Gly Leu
100 105 110
Ala Val Thr Gly Gly Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Leu Gly Pro Ser Val Pro Pro Leu Ala Pro Cys Ser Ala Ser Thr Ser
130 135 140
Gly Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Leu Ala Thr Pro Pro Gly
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Thr Ala Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Pro Pro Ala Val Leu Gly Ser Ser Gly Leu Thr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Leu Thr Thr Thr Cys
195 200 205
Ala Val Ala His Leu Pro Ser Ala Thr Leu Val Ala Leu Ala Val Gly
210 215 220
Ser Leu Thr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Gly Pro Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Pro Leu Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ala Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Ala Thr Pro Gly Val Thr Cys Val Val Val Ala Val Ser
260 265 270
Gly Gly Ala Pro Gly Val Gly Pro Ala Thr Thr Val Ala Gly Val Gly
275 280 285
Val His Ala Ala Leu Thr Leu Pro Ala Gly Gly Gly Pro Ala Ser Thr
290 295 300
Thr Ala Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gly Ala Thr Leu Ala
305 310 315 320
Gly Leu Gly Thr Leu Cys Leu Val Ser Ala Leu Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
Ile Gly Leu Thr Ile Ser Leu Ala Leu Gly Gly Pro Ala Gly Pro Gly
340 345 350
Val Thr Thr Leu Pro Pro Ser Gly Gly Gly Met Thr Leu Ala Gly Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Leu Gly Pro Thr Pro Ser Ala Ile Ala Val
370 375 380
Gly Thr Gly Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ala Ala Thr Leu Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Ala Ser Ala Gly Ser Pro Pro Leu Thr Ser Ala Leu Thr
405 410 415
Val Ala Leu Ser Ala Thr Gly Gly Gly Ala Val Pro Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Gly Ala Leu His Ala His Thr Thr Gly Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Gly
450
<210> 34
<211> 219
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 34
Ala Ile Val Met Thr Gly Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ala Ser Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Ser Leu Leu Thr Ser
20 25 30
Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ala Thr Thr Leu Gly Leu Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Pro Gly Leu Leu Ile Thr Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Leu Ile
65 70 75 80
Ser Ala Val Gly Ala Gly Ala Val Gly Pro Thr Thr Cys Met Gly Ala
85 90 95
Leu Gly Thr Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu
100 105 110
Ala Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Pro Ile Pro Pro Pro Ser Ala Gly
115 120 125
Gly Leu Leu Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Ala Ala Pro
130 135 140
Thr Pro Ala Gly Ala Leu Val Gly Thr Leu Val Ala Ala Ala Leu Gly
145 150 155 160
Ser Gly Ala Ser Gly Gly Ser Val Thr Gly Gly Ala Ser Leu Ala Ser
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Leu Ala Ala Thr Gly
180 185 190
Leu His Leu Val Thr Ala Cys Gly Val Thr His Gly Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Leu Ser Pro Ala Ala Gly Gly Cys
210 215
<210> 35
<211> 1353
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 35
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcggc ctggagcagc ccggcggcag cctgaggctg 60
agctgcgccg gcagcggctt caccttcagg gactacgcca tgacctgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgagcagc atcagcggca gcggcggcaa cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caaggacagg 300
ctgagcatca ccatcaggcc caggtactac ggcctggacg tgtggggcca gggcaccacc 360
gtgaccgtga gcagcgccag caccaagggc cccagcgtgt tccccctggc cccctgcagc 420
aggagcacca gcgagagcac cgccgccctg ggctgcctgg tgaaggacta cttccccgag 480
cccgtgaccg tgagctggaa cagcggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttccccgcc 540
gtgctgcaga gcagcggcct gtacagcctg agcagcgtgg tgaccgtgcc cagcagcagc 600
ctgggcacca agacctacac ctgcaacgtg gaccacaagc ccagcaacac caaggtggac 660
aagagggtgg agagcaagta cggccccccc tgccccccct gccccgcccc cgagttcctg 720
ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagcagg 780
acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccagg aggaccccga ggtgcagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcccag ggaggagcag 900
ttcaacagca cctacagggt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aagggcctgc ccagcagcat cgagaagacc 1020
atcagcaagg ccaagggcca gcccagggag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccag 1080
gaggagatga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1200
cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca ggctgaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagg agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1320
tacacccaga agagcctgag cctgagcctg ggc 1353
<210> 36
<211> 657
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Искусственно синтезированная последовательность
<400> 36
gacatcgtga tgacccagag ccccctgagc ctgcccgtga cccccggcga gcccgccagc 60
atcagctgca ggagcagcca gagcctgctg tacagcatcg gctacaacta cctggactgg 120
tacctgcaga agagcggcca gagcccccag ctgctgatct acctgggcag caacagggcc 180
agcggcgtgc ccgacaggtt cagcggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaagatc 240
agcagggtgg aggccgagga cgtgggcttc tactactgca tgcaggccct gcagaccccc 300
tacaccttcg gccagggcac caagctggag atcaagagga ccgtggccgc ccccagcgtg 360
ttcatcttcc cccccagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420
ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
agcggcaaca gccaggagag cgtgaccgag caggacagca aggacagcac ctacagcctg 540
agcagcaccc tgaccctgag caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 600
gtgacccacc agggcctgag cagccccgtg accaagagct tcaacagggg cgagtgc 657
<---

Claims (22)

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфично связывается с человеческим рецептором интерлейкина-4 α (hIL-4Rα), включающее вариабельную область тяжелой цепи (HVR) и вариабельную область легкой цепи (LVR), где вариабельная область тяжелой цепи содержит:
CDR1 (HCDR1) (CDR – область, определяющая комплементарность, HCDR – область тяжелой цепи, определяющая комплементарность) с аминокислотной последовательностью Gly-Phe-Thr-Phe-Arg-Asp-Tyr-Ala;
CDR2 (HCDR2) с аминокислотной последовательностью Ile-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Asn-Thr; и
CDR3 (HCDR3) с аминокислотной последовательностью Ala-Lys-Asp-Xaa1-Leu-Ser-Ile-Thr-Ile-Xaa2-Pro-Xaa3-Tyr-Tyr-Gly-Leu-Asp-Val, где Xaa1 представляет собой Arg, Xaa2 представляет собой Arg, и Xaa3 представляет собой Ala или Glu, и
вариабельная область легкой цепи содержит:
CDR1 (LCDR1) (LCDR – область легкой цепи, определяющая комплементарность) с аминокислотной последовательностью Gln-Xaa4-Leu-Leu-Tyr-Xaa5-Ile-Gly-Tyr-Asn-Tyr, где Xaa4 представляет собой Ser, и Xaa5 представляет собой Ser, Xaa4 представляет собой Ser, и Xaa5 представляет собой Arg, Xaa4 представляет собой Ser, и Xaa5 представляет собой Lys, или Xaa4 представляет собой Arg, и Xaa5 представляет собой Ser;
CDR2 (LCDR2) с аминокислотной последовательностью Leu-Gly-Ser; и
CDR3 (LCDR3) с аминокислотной последовательностью Met-Gln-Ala-Leu-Gln-Thr-Pro-Tyr-Thr.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, которое является вариантом дупилумаба, где Arg в положении 108 HVR дупилумаба мутирован до Ala или Glu.
3. Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения заболевания или расстройства, связанного с IL-4/IL-4Rα сигнализацией в организме человека, содержащая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2 и фармацевтически приемлемый носитель.
4. Фармацевтическая композиция по п. 3, где заболевание или расстройство выбрано из группы, состоящей из: астмы, аллергического дерматита, артрита, герпеса, хронической первичной крапивницы, склеродермии, гипертрофического рубца, болезни Уиппла, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, COPD (хроническое обструктивное заболевание легких), атопического дерматита, идиопатического легочного фиброза, аллергической реакции, синдрома Кавасаки, серповидно-клеточной анемии, синдрома Черджа-Стросса, болезни Грейвса, преэклампсии, синдрома Шегрена, аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома, аутоиммунной гемолитической анемии, пищевода Барретта, аутоиммунного увеита, туберкулеза и заболевания почки.
5. Фармацевтическая композиция по п. 4, где заболевание или расстройство представляет собой аллергический дерматит или астму.
6. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 3-5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используется в комбинации с другими лекарственными средствами для лечения аутоиммунного заболевания.
7. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 3-6, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент используется в комбинации с гормональными лекарственными средствами, иммунодепрессантами или антигистаминными лекарственными средствами.
8. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2.
9. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 8.
10. Клетка-хозяин для экспрессии антитела или его фрагмента по п. 1 или 2, содержащая экспрессионный вектор по п. 9.
11. Клетка-хозяин по п. 10, представляющая собой эукариотическую клетку.
12. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которое специфично связывается с человеческим IL-4R, включающий: экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты по п. 8 в условиях, способствующих экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по п. 1 или 2, и выделение экспрессированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
13. Набор, содержащий контейнер и листок-вкладыш для предупреждения или лечения заболевания или расстройства, связанного с IL-4/IL-4Rα сигнализацией в организме человека, где контейнер содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2 или фармацевтическую композицию по любому из пп. 3-7, и листок-вкладыш содержит инструкции по применению лекарственного средства.
14. Набор по п. 13, дополнительно содержащий один или более контейнеров, содержащих одно или более других лекарственных средств для предупреждения или лечения заболевания или расстройства, связанного с IL-4/IL-4Rα сигнализацией в организме человека.
15 Набор по п. 14, где другие лекарственные средства представляют собой гормональные лекарственные средства, иммунодепрессанты или антигистаминные лекарственные средства.
RU2020127107A 2018-02-01 2018-02-01 АНТИТЕЛО К IL-4Rα И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ RU2758092C1 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2018/074890 WO2019148405A1 (zh) 2018-02-01 2018-02-01 IL-4Rα抗体及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2758092C1 true RU2758092C1 (ru) 2021-10-26

Family

ID=67479957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020127107A RU2758092C1 (ru) 2018-02-01 2018-02-01 АНТИТЕЛО К IL-4Rα И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Country Status (4)

Country Link
KR (1) KR102652133B1 (ru)
RU (1) RU2758092C1 (ru)
WO (1) WO2019148405A1 (ru)
ZA (1) ZA202004861B (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2808563C2 (ru) * 2021-11-11 2023-11-29 Акционерное общество "БИОКАД" МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ, КОТОРОЕ СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЕТСЯ С IL-4Rα, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
US12090201B2 (en) 2019-08-05 2024-09-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating atopic dermatitis by administering an IL-4R antagonist antibody

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210403580A1 (en) * 2018-11-09 2021-12-30 Ajou University Industry-Academic Cooperation Foundation Human antibody having high affinity to human il-4 receptor alpha, and use thereof
CN114605539B (zh) * 2020-12-09 2024-01-02 南京融捷康生物科技有限公司 人源化的抗IL-4Rα单域抗体及其应用
WO2023085978A1 (en) * 2021-11-11 2023-05-19 Joint Stock Company «Biocad» Monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to il-4ra, and use thereof

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6358509B1 (en) * 1989-12-20 2002-03-19 Schering Corporation Antibody antagonists of human interleukin-4
RU2242515C2 (ru) * 1997-07-02 2004-12-20 Джинентех, Инк. Улучшенное анти-ige антитело (варианты) и способ улучшения полипептидов
WO2005023860A2 (en) * 2003-08-29 2005-03-17 Bayer Pharmaceuticals Corporation Modified il-4 mutein receptor antagonists
WO2005047331A2 (en) * 2003-11-07 2005-05-26 Immunex Corporation Antibodies that bind interleukin-4 receptor
US7608693B2 (en) * 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2245064B1 (en) * 2007-12-21 2014-07-23 Medimmune Limited BINDING MEMBERS FOR INTERLEUKIN-4 RECEPTOR ALPHA (IL-4Ralpha)
TWI697334B (zh) * 2013-06-04 2020-07-01 美商再生元醫藥公司 藉由投與ｉｌ-４ｒ抑制劑以治療過敏及增強過敏原-特異之免疫療法的方法
TWI682781B (zh) * 2013-07-11 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 藉由投與ｉｌ－４ｒ抑制劑治療嗜酸性食道炎的方法
CN107474134B (zh) * 2016-06-08 2021-07-27 苏州康乃德生物医药有限公司 用于结合白细胞介素4受体的抗体

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6358509B1 (en) * 1989-12-20 2002-03-19 Schering Corporation Antibody antagonists of human interleukin-4
RU2242515C2 (ru) * 1997-07-02 2004-12-20 Джинентех, Инк. Улучшенное анти-ige антитело (варианты) и способ улучшения полипептидов
WO2005023860A2 (en) * 2003-08-29 2005-03-17 Bayer Pharmaceuticals Corporation Modified il-4 mutein receptor antagonists
WO2005047331A2 (en) * 2003-11-07 2005-05-26 Immunex Corporation Antibodies that bind interleukin-4 receptor
US7608693B2 (en) * 2006-10-02 2009-10-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human IL-4 receptor

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12090201B2 (en) 2019-08-05 2024-09-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating atopic dermatitis by administering an IL-4R antagonist antibody
RU2828020C2 (ru) * 2019-08-05 2024-10-07 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Способы лечения атопического дерматита посредством введения антагониста il-4r
RU2808563C2 (ru) * 2021-11-11 2023-11-29 Акционерное общество "БИОКАД" МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ИЛИ ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ, КОТОРОЕ СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЕТСЯ С IL-4Rα, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200116967A (ko) 2020-10-13
WO2019148405A1 (zh) 2019-08-08
ZA202004861B (en) 2021-08-25
KR102652133B1 (ko) 2024-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7538721B2 (ja) 抗インターロイキン１７ａ抗体、医薬組成物、およびその使用
CN113150146B (zh) IL-4Rα抗体及其用途
RU2710730C2 (ru) Конструкции мультиспецифичных антител
RU2758092C1 (ru) АНТИТЕЛО К IL-4Rα И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
US11402383B2 (en) Nucleic acid encoding PCSK9 antibody
TW201412774A (zh) 能結合胸腺基質淋巴細胞生成素之抗原結合蛋白
JP2023126929A (ja) ヒトｉｌ４ｒａに対する抗体及びその使用
JP7454882B2 (ja) 抗ヒトインターロイキン－４受容体α抗体及びその調製方法並びに使用
KR20180089514A (ko) Tnf-알파, il-17a 및 il-17f에 대해 특이성을 갖는 다중특이적 항체 분자
CN116761821B (zh) 抗par-2抗体及其使用方法
WO2020034941A1 (zh) 抗IL-1β的抗体、其药物组合物及其用途
JP2023549150A (ja) 抗ヒト胸腺間質性リンパ球新生因子抗体及びその製造方法と使用
US20240294655A1 (en) Antigen binding molecules that bind light
WO2013103783A1 (en) Murine il-13 antibodies
RU2807060C1 (ru) Антитело к альфа-рецептору интерлейкина-4 человека, способ его получения и его применение
RU2825460C1 (ru) Антитела к TSLP человека и их применение
KR20230084199A (ko) 통증 치료를 위한 화합물 및 방법
RU2788122C2 (ru) Химерный белок, составленный из домена антагониста NGF и домена антагониста TNFα
KR20240022546A (ko) 항il-36r 항체 및 그의 사용