KR20230084199A

KR20230084199A - 통증 치료를 위한 화합물 및 방법

Info

Publication number: KR20230084199A
Application number: KR1020237014327A
Authority: KR
Inventors: 프레이저 웰시; 타라니 체셀; 키스 탠; 토르 오스텐펠트; 리처드 젠킨스
Original assignee: 메디뮨 리미티드
Priority date: 2020-09-28
Filing date: 2021-09-27
Publication date: 2023-06-12
Also published as: BR112023004840A2; AU2021350424A1; IL301548A; WO2022064043A1; CN117279942A; TW202228768A; JP2023543005A; EP4217388A1; US20240026036A1; CA3195380A1

Abstract

본 개시내용은 통증 치료 또는 예방에 사용하기 위한 신규한 방법 및 투약 요법을 제공하며, 여기서 결합 분자는 NGF 길항제 도메인 및 TNF 길항제 도메인을 포함하고, NGF 길항제 도메인은 항-NGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, TNFα 길항제 도메인은 TNFR의 가용성 TNFα 결합 단편을 포함한다.

Description

통증 치료를 위한 화합물 및 방법

통증은 의학적 도움을 받는 가장 흔한 증상 중 하나이며, 의사를 찾는 환자의 절반이 주로 호소하는 증상이다. 수많은 진통제가 존재하고 광범위하게 사용되고 있음에도, 통증, 특히 만성 통증을 제거하는 것은 성공적이지 못했다. 따라서, 사회에 대한 부담은 여전히 높다. 각종 연구 결과, 통증으로 인해, 매년 5천만 일의 노동 일수가 손실되고 612억 달러의 생산 비용이 손실된다. 만성 통증 환자의 경우에는, 처방된 이용 가능한 치료 옵션을 이용해서는 대략 절반만이 통증을 관리할 수 있다. 그리고, 총 처방 진통제 시장은 매년 대략 250억 달러이다.

통증은 골관절염의 주요 증상이며, 이는 노인의 장애 및 사회적 비용의 주요 원인이다. 인구가 고령화되고 비만이 증가함에 따라 이 증후군은 이전 수십 년보다 훨씬 더 널리 퍼지고 있다(Hunter & Bierma-Zeinstra Lancet, 393:1745-59 (2019)). 골관절염의 통증에 대한 현재 치료법에는 저용량의 경구 NSAID가 포함된다. 그러나 심혈관 사건으로 인한 사망률 증가와의 연관성으로 인해 NSAID 사용은 바람직하게는 단기 사용으로 제한된다(Kolasinski et al., Arthritis Care & Research, 72(2) 149-162 (2020)). 이러한 데이터가 시사하는 바와 같이, 안전하고 효과적인 신규 진통제에 대한 필요성은 여전히 크다.

조직 수준을 감소시키거나 또는 분비된 신경 성장 인자(NGF 또는 베타-NGF)의 효과를 억제하는 치료제가 이러한 신규 진통제가 될 가능성이 있다. NGF는 신경계의 발달에서 잘 알려진 중추적 역할을 하지만, NGF는 또한, 통증에 대한 널리 검증된 표적인데, 이는 NGF가 동물과 인간에게서 통증을 유발하기 때문이다. 성인에서, NGF는 특히, 중추 및 말초 신경세포의 하위 집합의 건강과 생존을 촉진한다(Huang & Reichardt, Ann. Rev. Neurosci. 24:677-736 (2001)). NGF는 또한 이들 신경세포의 기능적 특징의 조절에 기여하고, 통각수용기(nociceptor)로 불리는 감각 통증 수용체의 감수성 또는 흥분성 전반에 걸쳐 강직성 제어를 발휘한다(Priestley et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 80:495-505 (2002); Bennett, Neuroscientist 7:13-17 (2001)). 통각수용기는 통증의 지각(통각)을 유발하는 다양한 유해 자극을 감지하고, 이를 중추 신경계에 전달한다. NGF 수용체는 통각수용기 상에 위치한다. NGF의 발현은 손상되고 염증이 생긴 조직에서 증가되고, 인간 통증 상태에서 상향 조절된다. 따라서, 통각에 있어서의 NGF의 역할 때문에, NGF의 수준을 감소시키는 NGF 결합제는 진통제로서 유용성을 갖는다.

카켁틴(cachectin)이라고도 하는 종양 괴사 인자-알파(TNFα)는 세포독성, 면역 세포 증식, 염증, 종양형성 및 바이러스 복제를 포함한 광범위한 생물학적 활성을 지닌 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인이다. Kim et al., J. Mol. Biol. 374, 1374 (2007). TNFα는 막관통 단백질(tm TNFα)로서 처음 생성되고, 이어서 메탈로프로테이나제에 의해 절단되어 가용성 형태(sTNFα)로 된다. Wallis, Lancet Infect. Dis. 8(10): 601 (2008). TNFα(약 17 kDa)는 단단한 동종삼량체성 분자로서 존재하는데, 이는 세포-표면 TNF 수용체 1 또는 TNF 수용체 2와 결합하여, 수용체 올리고머화 및 신호 전달을 유도한다. 염증성 사이토카인, 특히 TNFα는 통각과민 발생에 역할을 하는 것으로 알려져 있다. Leung, L., and Cahill, CM., J. Neuroinflammation 7:27 (2010). 일부 예비 데이터는 TNFα 억제제가 신경병성 통증의 조절에 유용할 수 있음을 보여주었다. 예를 들어, Sommer C, et al., J. Peripher. Nerv. Syst. 6:67-72 (2001), Cohen et al, A&A Feb 2013, 116, 2, 455-462, Genevay et al., Ann Rheum Dis 2004, 63, 1120-1123 참조. TNFα 억제제를 신경병성 통증 치료의 단일 요법으로서 시험하는 임상 연구로부터의 결과는 여전히 결론에 이르지 못하고 있다. Leung and Cahill (2010) 참조.

이전에 개시된, 항-NGF 항원 결합 단편 및 가용성 TNFR-2 부분을 포함하는 결합 분자는 NGF 및 TNFα의 강력한 억제제인 것으로 나타났다. 또한, 이 결합 분자는 동물 통증 모델에서 통증 징후를 감소시키는 데 치료적으로 유효한 것으로 나타났다. 예를 들어, 전체가 참조로 포함되는 미국 특허 제9,884,911호 참조. 이들 결합 분자의 명확한 치료적 유용성의 관점에서, 통증의 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증(예를 들어, 골관절염 통증)을 감소시키거나 예방하는 것과 같은 치료를 위한 결합 분자에 대한 개선된 투약 요법이 필요하다.

본 개시내용은 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하기 위한 것과 같이 통증을 치료하기 위한 신규한 방법 및 투약 요법을 제공하며, 이는 대상체에게 피하 고정 용량의 결합 분자를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 결합 분자는 NGF 길항제 부분 및 TNFα 길항제 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 단독으로 투여된 동등량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 더 효과적으로 대상체의 통증을 조절한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 감소 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하는 방법을 제공하며, 이는 대상체에게 피하 고정 용량의 결합 분자를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 결합 분자는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하고, NGF 길항제 도메인은 항-NGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, TNFα 길항제 도메인은 TNFR의 가용성 TNFα 결합 단편을 포함하고, 방법은 대상체의 통증을 감소시키거나 예방한다. 일부 구현예에서, 결합 분자의 피하 고정 용량은 5~200 mg이다. 일부 구현예에서, 결합 분자의 피하 고정 용량은 7.5~150 mg이다. 일부 구현예에서, 결합 분자의 피하 고정 용량은 7.5, 25, 75, 또는 150 mg이다. 일부 구현예에서, 피하 고정 용량은 결합 분자 30 mg의 정맥내 고정 용량과 동등하다. 일부 구현예에서, 고정 용량은 적어도 2주마다 투여된다. 일부 구현예에서, 고정 용량은 적어도 12주 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 통증은 만성 통증을 포함한다. 일부 구현예에서, 통증은 골관절염 통증을 포함한다. 일부 구현예에서, 통증은 무릎의 골관절염 통증을 포함한다.

일부 구현예에서, 대상체는 결합 분자의 투여 전에 3개월 이상 동안 통증을 겪었다. 일부 구현예에서, 통증은 관절 염증과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 골관절염을 앓는다. 일부 구현예에서, 대상체는 무릎의 일측성 골관절염을 앓는다. 일부 구현예에서, 대상체는 중심 독자 평가(central reader evaluation)에 따라 0 내지 4의 켈그렌-로렌스(Kellgren-Lawrence, KL) 등급 척도에서 무릎 관절의 2등급 골관절염을 앓는다.

일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 결합 분자를 투여하기 전에 다음을 포함한다: a. 대상체에게 NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합을 투여하는 단계, 및 b. i) NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합이 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하지 않는지 결정하고/하거나, ii) 대상체가 NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합에 불내성인지 결정하는 단계. 일부 구현예에서, NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합은 적어도 2주 동안 투여된다. 일부 구현예에서, NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합은 결합 분자의 투여 전에 적어도 2주 동안 대상체에게 투여되었다. 일부 구현예에서, 대상체는 NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜(파라세타몰) 또는 이들의 조합에 불내성이다.

일부 구현예에서, 방법은 고정 용량의 결합 분자의 투여 전에 SARS-CoV2 감염에 대해 대상체를 테스트하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서 SARS-CoV2 감염에 대해 대상체를 테스트하는 단계는 고정 용량의 결합 분자의 투여 전에 SAR-CoV2 유전 물질에 대해 대상체를 테스트하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 기준선에서 SARS-CoV2에 감염되지 않았다.

일부 구현예에서, 대상체는 기준선에서 통증 수치 등급 척도(NRS)로 측정 시 관절에서 적어도 5의 평균 통증 강도 점수를 갖는다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 기준선으로부터 감소시킨다. 일부 구현예에서, 고정 용량은 12주 동안 2주마다 투여되고, 방법은 적어도 12주까지 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 기준선으로부터 감소시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 기준선으로부터 적어도 30%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 기준선으로부터 적어도 50%만큼 감소시킨다.

일부 구현예에서, 대상체는 기준선에서 웨스턴 온타리오 및 맥마스터 대학교 골관절염(Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis, WOMAC) 지수의 통증 하위 척도를 사용하여 측정 시 관절에서 적어도 5의 평균 WOMAC 통증 점수를 갖는다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 기준선으로부터 감소시킨다. 일부 구현예에서, 고정 용량은 12주 동안 2주마다 투여되고, 방법은 적어도 12주까지 대상체의 일일 WOMAC 통증 점수의 주간 평균을 기준선으로부터 감소시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 기준선으로부터 적어도 30%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 기준선으로부터 적어도 50%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 WOMAC 신체 하위 척도 점수를 기준선으로부터 적어도 30%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체의 WOMAC 신체 하위 척도 점수를 기준선으로부터 적어도 50%만큼 감소시킨다.

일부 구현예에서, 방법은 골관절염의 환자 종합 평가(PGA)를 기준선으로부터 개선한다. 일부 구현예에서, 고정 용량은 12주 동안 2주마다 투여되고, 방법은 적어도 12주까지 골관절염의 PGA를 기준선으로부터 감소시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 골관절염의 PGA를 적어도 2점만큼 개선한다.

일부 구현예에서, 대상체에서 결합 분자의 단일 용량 투여 후 통증 감소가 관찰된다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 NSAID를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 오피오이드를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 파라세타몰을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 COX-2 억제제를 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 TrkA, p75NRT, 또는 TrkA 및 P75NRT에 대한 NGF 결합을 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 p75NRT에 대한 NGF 결합보다 TrkA에 대한 NGF 결합을 우선적으로 차단한다. 일부 구현예에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 약 0.25~0.44 nM의 친화도로 인간 NGF와 결합한다. 일부 구현예에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 CDR 세트인 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및 CDR 세트인 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함하고, HCDR1은 서열번호 4 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열번호 5 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3은 서열번호 6 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 6의 아미노산 서열, SSRIYDFNSALISYYDMDV(서열번호 11), 또는 SSRIYDMISSLQPYYDMDV(서열번호 12)를 갖고, LCDR1은 서열번호 8 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2는 서열번호 9 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3은 서열번호 10 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 CDR 세트인 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및 CDR 세트인 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함하고, HCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, HCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열, SSRIYDFNSALISYYDMDV(서열번호 11), 또는 SSRIYDMISSLQPYYDMDV(서열번호 12)를 포함하고, LCDR1은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR2는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, LCDR3은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 3 또는 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 7 또는 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 전체 H₂L₂ 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)₂ 단편 또는 단일 사슬 Fv(scFv) 단편이다. 일부 구현예에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 인간화, 키메라, 영장류화 또는 완전 인간형이다. 일부 구현예에서, 항-NGF scFv 단편은 N-말단으로부터 C-말단까지, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₃(서열번호 15) 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-NGF scFv 단편은 N-말단으로부터 C-말단까지, 서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₄(서열번호 19) 및 서열번호 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.

일부 구현예에서, TNFR은 TNFR-2이다. 일부 구현예에서, TNFR-2 단편은 면역글로불린 Fc 도메인에 융합된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 일부 구현예에서, TNFα 길항제 도메인은 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함한다.

일부 구현예에서, 결합 분자는 링커를 통해 TNFα 길항제에 융합된 NGF 길항제를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 융합 단백질의 동종이량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 N-말단으로부터 C-말단까지, 서열번호 13의 아미노산 1~235에 상응하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TNFR-2의 TNFα 결합 단편, 인간 IgG1Fc 도메인, 10개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₂(서열번호 98), 서열번호 3 또는 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₃(서열번호 15) 및 서열번호 7 또는 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 N-말단으로부터 C-말단까지, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 TNFR-2의 TNFα 결합 75 kD 단편, 10개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₂(서열번호 98), 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₄(서열번호 19), 및 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 7의 위치 102, 103 또는 104에 상응하는 아미노산 위치의 글리신 잔기는 시스테인 잔기로 변형되고, 서열번호 3의 위치 44에 상응하는 아미노산 위치의 글리신 잔기는 시스테인 잔기로 변형된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다.

본 개시내용은 통증 감소 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하는 방법에 사용하기 위한 결합 분자를 제공하며, 방법은 대상체에게 피하 고정 용량의 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 결합 분자는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하고, NGF 길항제 도메인은 항-NGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, TNFα 길항제 도메인은 TNFR의 가용성 TNFα 결합 단편을 포함하고, 방법은 대상체의 통증을 감소시키거나 예방한다.

도 1: TNFR2-Fc 융합 단백질(패널 A) 및 항-NGF scFv 도메인에 융합된 TNFR2-Fc 도메인을 포함하는 예시적인 다중특이적 결합 분자인 TNFR2-Fc_VH#4(패널 B)의 개략도.
도 2의 A는 정제된 TNFR2-Fc_VH#4의 배치 내의 응집체, 단량체 및 단백질 단편화의 수준의 SEC-HPLC 분석 결과를 보여준다.
도 2의 B는 환원 및 비환원 조건 하의 정제된 TNFR2-Fc_VH#4 및 정제된 TNFR2-Fc 단백질의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 겔 로딩 순서: 1. TNFR2-Fc_VH#4, 2. TNFR2-Fc_VL-VH(역 가변 도메인 유전자 배향을 갖는 항-NGF scFv에 융합된 TNFR2-Fc), 3. TNFR2-Fc 무관 scFv 1, 4. TNFR2-Fc, 5. TNFR2-Fc 무관 scFv 2.
도 3의 A는 단백질 A 컬럼 정제 후 TNFR2-Fc_VH#4의 순도를 보여준다. 도 3의 B는 SP 세파로스 컬럼에서 제2 정제 단계 후 TNFR2-Fc_VH#4의 순도를 보여준다.
도 4는 시차 주사 열량계를 사용한 TNFR2-Fc_VH#4의 안정성 분석을 보여준다.
도 5는 ELISA에 의해 결정한, TNFα 및 NGF 단독에 대한 및 TNFα 및 NGF 둘 다에 대한 TNFR2-Fc_VH#4의 결합을 보여준다. 도 5의 A는 NGF에 대한 결합을 보여주고, 도 5의 B는 TNFα에 대한 결합을 보여주고, 도 5의 C는 TNFα 및 NGF에 대한 동시 결합을 보여준다.
도 6은 TNFR2-Fc_VH#4에 대한 표면 플라즈몬 공명 결합 분석의 센서그램을 보여준다. TNFR2-Fc_VH#4 다중특이적 항체의 동시 항원 결합은 BIAcore 2000을 사용하여 수행하였다. 동시 항원 결합은 센서 표면에 결합된 TNFR2-Fc_VH#4에 걸쳐 TNFα 및 NGF를 연속적으로 결합시켜 평가하였다. 센서그램의 첫 번째 부분은 다중특이적 항체에 대한 포화량의 TNFα의 결합을 보여주고, 센서그램의 두 번째 부분은 제2 항원을 적용한 경우의 결합을 보여주는데, TNFα를 다시 적용하거나(이는 표면이 포화되었음을 보여줌), 또는 TNFα와 NGF의 등몰 혼합물을 적용하였다. 공명 단위의 증가는 다중특이적 분자에 대한 NGF의 결합 및 이에 따른 동시 항원 개입에 해당되었다. 분석은 또한 항원을 역 순서로 부가하면서 수행하여 이들 데이터를 확인하였다.
도 7은 TF-1 세포의 NGF 매개 증식의 억제를 보여준다. a. 첨가된 NGF 길항제의 부재 하에서의 NGF 매개 증식. b. TNFR2-Fc_VH#4에 의한 인간 NGF 반응의 억제. c. TNFR2-Fc_VH#4에 의한 뮤린 NGF 반응의 억제. NGF의 활성은 정상적으로는 RLU(상대적 발광 단위)로서 표시되고, NGF 매개 증식의 %는 다음 식을 이용하여 NGF 리간드 단독에 대한 반응 %로서 계산된다: 100 * (웰 RLU - 배경 RLU)/(총 RLU - 배경 RLU) (여기서, 배경 RLU = 배지 대조군의 평균, 총 RLU = 리간드 단독 대조군의 평균). d. TNFR2-Fc_VarB 및 엔디맙(ndimab) VarB에 의한 인간 NGF 반응의 억제. e. TNFR2-Fc_VarB 및 엔디맙 VarB에 의한 뮤린 NGF 반응의 억제.
도 8은 U937 세포에서 TNFα 유도 카스파제 3 활성의 억제를 보여준다. a. 첨가된 TNFα 길항제의 부재 하에서의 U937 세포에서 TNFα 유도 카스파제 3 활성. b. 첨가된 길항제의 부재 하에서의 반응의 퍼센트로서 제시된, U937 세포에서 TNFα 유도 카스파제 3 활성의 억제. TNF의 활성은 정상적으로는 RFU(상대적 형광 단위)로서 표시되고, TNF 매개 카스파제 3 방출의 %는 위의 도 7c에 기재된 바와 같은 식을 이용하여 TNF 리간드 단독에 대한 반응 %로서 계산되었다. c. 관련 분자 TNFR2-Fc_varB 및 엔디맙 VarB에 대해 제시된 유사한 결과.
도 9는 부분 좌골 신경 결찰에 의해 유발된 기계적 통각과민에 대한 에타너셉트 및 MEDI-578의 병용 치료의 효과를 보여준다. 결과는 동측/대측 비율로 제시되어 있다. 군당 N=9~10. 종속 요인으로서 시간 및 처치를 이용하는 2원 ANOVA 분석을 이용하여 데이터를 분석하였다. 이후의 통계적 유의성을 본페로니 사후 검정을 이용하여 획득하였다. *** Op + CAT-251 대조군에 대한 p<0.001.
도 10a는 부분 좌골 신경 결찰에 의해 유발된 기계적 통각과민에 대한 TNFR2-Fc_VH#4의 효과를 보여준다. 결과는 동측/대측 비율로 제시되어 있다. 군당 N=10. 종속 요인으로서 시간 및 처치를 이용하는 2원 ANOVA 분석을 이용하여 데이터를 분석하였다. 이후의 통계적 유의성을 본페로니 사후 검정을 이용하여 획득하였다. *** 이중특이적 이소형 대조군과 비교한 p<0.001. 도 10b는 관련 분자 TNFR2-Fc_varB와 유사한 결과를 보여준다.
도 11은 기계적 과민증의 관절 통증 모델에서 통증 감소에 대한 MEDI-578과 에타너셉트의 공동 투여의 효과를 보여준다. 군당 N=9~10. 2원 ANOVA 분석을 사용하여 데이터를 분석하였다. 이후의 통계적 유의성을 본페로니 사후 검정을 이용하여 획득하였다. CAT-251 대비 * P>0.05; *** P<0.001.
도 12는 기계적 과민증의 관절 통증 모델에서 통증 감소에 대한 TNFR2-Fc_VH#4의 효과를 보여준다. 군당 N=9~10. 2원 ANOVA 분석을 사용하여 데이터를 분석하였다. 이후의 통계적 유의성을 본페로니 사후 검정을 이용하여 획득하였다. *** 이중특이적 이소형 대조군과 비교한 P<0.001.
도 13은 랫트 모델에서 CFA-유도 통각과민에 대한 TNFR2-Fc_varB의 5가지 상이한 용량의 효과를 보여준다.
도 14: 포스포-p38 반응으로부터의 HTRF 비를 보여주는 열 지도.
도 15: p38 인산화에 대한 TNFα, NGF, 또는 TNFα와 NGF의 조합의 효과를 보여주는 용량 반응 곡선.
도 16: 포스포-ERK 반응의 HTRF 비를 보여주는 열 지도.
도 17: ERK 인산화에 대한 TNFα, NGF, 또는 TNFα와 NGF의 조합의 효과를 보여주는 용량 반응 곡선.
도 18a는 인터리빙된(interleaved) 단일 상승 용량(Single Ascending Dose, SAD) 및 다중 상승 용량(Multiple Ascending Dose, MAD) 연구의 단순화된 다이어그램을 보여준다. 도 18b는 각 코호트에 대한 연구 설계를 표 형식으로 보여준다. "RoA"는 투여 경로, "IV"는 정맥내, "SC"는 피하이다. 예측된 평균 NGF 억제 퍼센트도 제공된다.
도 19a는 채점된 평균 일일 통증에 대한 TNFR2-Fc_varB의 단일 정맥내 용량의 효과가 시간(용량 후 일)에 대해 플롯팅된 그래프를 보여준다. 상단의 수평 적색선은 용량 전 모든 대상체에 대한 평균 일일 통증 점수이다. 하단의 수평 적색선은 위약을 투여받은 모든 대상체에 대한 평균 일일 통증 점수이다. 도 19b는 열거된 용량에서 예측된 평균 NGF 억제 백분율 및 위약(PBO) 대비 최고 NRS 변화를 나타내는 표이다.
도 20a는 TNFR2-Fc_varB 투여 후 기준선 조정된 평균 통증 WOMAC의 그래프이다. 대상체는 특히 통증(걷는 동안, 계단 오르기, 야간, 휴식 시 및 체중 부하)에 초점을 맞춘 5가지 질문에 답한다. 각 질문에는 5점 척도(0~4)로 점수가 부여되며, 0은 "없음", 4는 "극심"이다. 점수가 높을수록 해당 활동을 수행하는 동안 경험한 통증이 더 심하다(또는 지각된 기능적 결함이 더 크다). 5가지 통증 질문 모두에 답하는 대상체는 최대 20점을 받을 수 있으며, 여기서는 통증 NRS 점수와 비교할 수 있도록 10으로 축소된다. 대상체는 기준선(투약 1일 전)과 8일, 15일, 22일, 29일에(그리고 코호트 250 및 1000 μg/kg의 경우 43일과 56일에만) 클리닉에서 설문지를 작성하도록 요청받았다. 도 20b는 SAD 연구에서 위약 대 상이한 TNFR2-Fc_varB 용량의 WOMAC 점수 비교를 위한 p값을 제공하는 표이다.
도 21은 TNFR2-Fc_varB의 3가지 통계적으로 유의한 단일 용량, 최고점에서 측정된 % NGF 억제 및 용량 후 2주에 걸친 평균을 보여주는 표이고, 괄호 안은 예측된 NGF 억제 수준이 제시되어 있다. 위약 대비 최고점 WOMAC 통증 하위 척도 변화도 이 세 가지 용량 각각에 대해 제시된다. 최고 효과는 각각 50 및 250 μg/kg의 용량에서 46~55%의 유리 NGF의 억제 측정값과 일치함을 주목한다.
도 22는 단일 용량의 TNFR2-Fc_varB의 투여 결과로서 혈장 유리 NGF의 억제를 보여준다. 간략하게는, 다음 시점에 각 대상체로부터 혈액 샘플을 채취했다: 용량 전, 용량 후 1, 8 및 24시간, 8, 15, 22, 29일(2개의 가장 높은 용량에 대해서만 43일 및 56일). 혈장 샘플을 준비하고 Singulex, Erenna 기술을 사용하여 분석했다. 유리 NGF의 억제를 계산하고 각 농도에서 용량 후 14일 동안 평균 억제를 계산했다. 14일 동안 유리 NGF의 평균 억제 범위는 0(kg당 0.3 μg) 내지 약 65%(kg당 1000 μg)이다.
도 23은 SAD 코호트 1~4(0.3~50 μg/kg)에서 각각의 대상체에 대한 NGF 수준의 증가를 플롯팅한 일련의 그래프이다.
도 24는 시간 대비 각 코호트에 대한 기준선으로부터의 CXCL-13 수준의 평균 변화 퍼센트를 플롯팅한 그래프이다.
도 25는 0.3 내지 1000 μg/kg 범위의 단일 정맥내 용량 및 50 μg/kg의 단일 피하 용량에서 TNFR2-Fc_varB(MEDI7352로 표시됨)의 기하 평균 혈청 약동학 프로파일을 보여준다. 도 25는 로그 스케일로 데이터를 표시한다. 최대 50 μg/kg 용량의 경우, 샘플을 용량 후 29일까지 수집했다. 250 및 1000 μg/kg 용량의 경우 용량 후 43일 및 56일까지 샘플링을 연장하였다. 250 μg/kg에 대한 데이터는 29일 이후에 표시되지 않았는데, 이는 코호트의 모든 대상체에 대한 값이 43일 및 56일에 정량화의 하한 미만이었기 때문이다. 1000 μg/kg의 경우 값은 43일에 3명의 대상체 및 56일에 1명의 대상체의 경우에만 정량화의 하한을 초과했다. LLOQ = 정량화의 하한.
도 26은 1 내지 450 μg/kg 범위의 반복 정맥내 용량에서 TNFR2-Fc_varB(MEDI7352로 표시됨)의 기하 평균 혈청 약동학 프로파일을 보여준다. 도 26의 A는 선형 스케일로 데이터를 나타낸다. 도 26의 B는 로그 스케일로 데이터를 표시한다. 1 μg/kg에 대한 데이터는 용량 후 57일 이후에 표시되지 않았는데, 이는 코호트의 모든 대상체에 대한 값이 64일, 71일 및 84일에 정량화의 하한 미만이었기 때문이다. 50 μg/kg에 대한 데이터는 84일에 대해 표시되지 않았는데, 이는 모든 대상체가 정량화의 하한 미만의 농도를 가졌기 때문이다. 450 μg/kg의 경우, 57일 이후에는 농도 데이터가 없다.
도 27은 용량 후 43일에 TNFR2-Fc_varB의 최대 관찰된 혈청 농도(C_max; 위의 그래프) 및 1 내지 450 μg/kg 범위의 TNFR2-Fc_varB의 반복된 정맥내 용량 후 기준선으로부터의 WOMAC 통증 점수의 관련 변화(아래 그래프)를 보여준다.
도 28은 TNFR2-Fc_varB의 반복 용량 후 통증 수준을 보여준다. 도 28a는 위약, 150 μg/kg 또는 450 μg/kg TNFR2-Fc_varB를 투여받은 환자에서 0 내지 84일로부터 NRS 통증의 기준선으로부터의 변화를 보여준다. 도 28b는 2.5 mg 타네주맙, 5 mg 타네주맙, 40 mg 옥시코돈 또는 위약과 TNFR2-Fc_varB의 반복 용량의 효과를 비교한 것이다. 도 28c는 상이한 용량의 파시누맙, 풀라누맙, TNFR2-Fc_varB(MEDI7352로 표시됨) 및 타네주맙에 의해 유도된, 기준선으로부터의 WOMAC 통증 하위 척도의 변화에 의해 결정된, 통증 감소를 보여준다.
도 29는 WOMAC 통증 하위 척도(위의 그래프) 또는 NRS 통증 하위 척도(아래 그래프)의 변화에 의해 결정된, TNFR2-Fc_varB(MEDI7352로 표시됨) 농도 및 통증 완화에 대한 ADA 역가의 효과를 보여준다.
도 30은 ADA 역가의 수준에 의해 분류된 0.3 내지 1000 μg/kg 범위의 단일 정맥내 용량 및 1 내지 450 μg/kg 범위의 반복 정맥내 용량에서 TNFR2-Fc_varB의 기하 평균 혈청 약동학 프로파일을 보여준다.
도 31은 4회의 주 2회 용량 후 체중에 대한 TNFR2-Fc_varB 청소율의 산점도이다. 범례는 MAD 코호트 수와 TNFR2-Fc_varB 용량을 나타낸다. 비구획 분석으로부터 청소율 데이터를 얻었다. 플롯은 95% 신뢰 한계(파선)가 있는 선형 회귀 분석(실선)을 보여준다. 0.61의 p값은 청소율과 체중 간에 유의한 연관성이 없음을 나타낸다.
도 32는 피하 고정 용량 연구의 단순화된 다이어그램을 보여준다.

정의

용어 단수형("a" 또는 "an") 엔티티는 해당 엔티티 중 하나 이상을 지칭한다는 점에 유의해야 한다. 이와 같이, 용어 단수형("a" 또는 "an"), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.

또한, 본원에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2개의 특정된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 "A 및 B," "A 또는 B," "A"(단독) 및 "B"(단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용된 용어 "및/또는"은 하기 양태 각각을 포괄하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).

본원에 "포함하는"이라는 어구와 함께 양태가 기재되어 있는 경우에, "~으로 구성된" 및/또는 "~으로 본질적으로 구성된"에 관해 기재된 다른 유사한 양태도 제공된다는 것이 이해된다.

용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 측정 또는 결정되는 방식, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 해당 분야의 관행에 따라 하나 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값보다 최대 20%, 최대 15%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1% 높거나 낮은 범위를 의미할 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용과 관련된 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, 문헌[the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본 개시내용에서 사용되는 여러 용어의 일반 사전을 당업자에게 제공한다.

단위, 접두어, 및 기호는 이의 국제 단위 체계(SI) 허용 형태로 표시된다. 수치 범위는 범위를 정의하는 수치의 경계를 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 배향으로 좌측에서 우측으로 기재되어 있다. 본원에서 제공되는 제목은 개시내용의 다양한 양태를 제한하지 않으며, 전체로서 명세서에 대한 참조로 제공될 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 전체 명세서를 참조하여 보다 완전히 정의된다.

본원에서 사용되는 용어 "결합 분자"는 가장 넓은 의미에서 항원 결정기, 예를 들어 항원에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 결합 분자의 비제한적 예는 각각 항원 특이적 결합을 보유하는 항체 또는 이의 단편, 가용성 수용체 융합 단백질 또는 이의 단편, 비면역글로불린 스캐폴드 또는 이의 단편을 포함한다. 예시적인 가용성 수용체 융합 단백질 및 항체가 아래에 제공된다. 특정 구현예에서, 결합 분자는 이러한 항체 또는 이의 단편, 가용성 수용체 융합 단백질 또는 이의 단편, 및 비면역글로불린 기반 스캐폴드 또는 이의 단편의 조합을 포함하도록 조작될 수 있다.

결합 분자, 또는 항원을 인식하는 결합 분자의 임의의 부분은 본원에서 "결합 도메인"으로 지칭된다. 자연 발생 항체와 같은 전체 크기의 결합 분자를 구체적으로 언급하지 않는 한, 용어 "결합 분자"는 제한 없이 전체 크기의 항체 또는 기타 비항체 결합 분자뿐만 아니라, 항원 결합 단편, 변이체, 유사체, 또는 이러한 결합 분자의 유도체, 예를 들어, 자연 발생 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 전체 크기 결합 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하는 조작된 결합 분자 또는 단편을 포함한다.

특정 구현예에서, 본 개시내용은 특정 다중특이적 결합 분자, 예를 들어 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 등의 결합 분자, 또는 이의 항원 결합 단편, 변이체 또는 유도체를 제공한다. 본원에서 사용되는 다중특이적 결합 분자는 하나 이상의 항체 결합 도메인, 하나 이상의 비항체 결합 도메인 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

문헌에서 베타-신경 성장 인자로도 지칭되는 용어 "신경 성장 인자"("NGF")는 본원에서 사용되는 바와 같이 다양한 신경세포의 성장 및 생존에서 기능하는 분비된 단백질을 의미한다. 인간 NGF는 Genbank 수탁번호 NP_002497.2로 제시되고 본원에서 서열번호 1로 제시된다. 본원에서 사용되는 용어 NGF는 인간 NGF에 한정되지 않고, 인간 NGF의 모든 종 오르소로그를 포함한다. 용어 "NGF"는 NGF의 프로-형태, 프로-NGF, 전장 NGF 뿐만 아니라 세포 내 처리로부터 생성되는 임의의 형태의 NGF를 포함한다. 용어는 또한 NGF의 자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체, 대립형질 변이체 및 이소형을 포함한다. NGF는 다음의 두 가지 수용체에 결합할 수 있다: p75 뉴로트로핀 수용체(p75(NTR)) 및 막관통 티로신 키나제인 TrkA. NGF는 통각수용기의 감작을 매개하는 것으로 알려진 통증에 대한 잘 검증된 표적이다.

NGF 매개 통증은 NGF 수준이 유해 자극에 대한 반응으로 말초에서 증가하고 항체가 혈액-뇌 장벽 투과성이 낮기 때문에 본원에 기재된 바와 같은 결합 분자를 사용한 안전하고 효과적인 치료에 특히 매우 적합하다. 본원에 기재된 치료법 및 조성물에서 사용될 수 있는 다수의 항-NGF 항체 및 이의 항원 결합 단편은 문헌에서 찾을 수 있으며, 예를 들어 PCT 공개 번호 WO02/096458 및 WO04/032870을 참조한다.

용어 "MEDI-578"은 NGF에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭하며, 이는 국제 출원 번호 PCT/GB2006/000238 및 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0107658 A1의 대상으로서, 이러한 문헌은 전체가 본원에 참조로 포함된다. MEDI-578 중쇄 및 경쇄 서열은 각각 서열번호 3 및 7에 제시되어 있다.

용어 NGF-NG는 NGF에 특이적으로 결합하는 항체를 지칭한다. NGF-NG 중쇄 및 경쇄 서열은 각각 서열번호 24 및 26에 제시되어 있다.

문헌에서 카켁틴, APC1 단백질; 종양괴사인자; TNF; 또는 종양 괴사 인자 리간드 수퍼패밀리 구성원 2로도 지칭되는 용어 "종양 괴사 인자 알파"("TNFα")는 본원에서 사용되는 바와 같이 특정 TNFα 단백질을 지칭하며, TNF 리간드의 수퍼패밀리가 아니다. 인간 TNFα는 Genbank 수탁번호 NP_000585.2로 제시되고 서열번호 2로 제시된다. 본원에서 사용되는 용어 TNFα는 인간 TNF에 한정되지 않고, 인간 TNFα의 모든 종 오르소로그를 포함한다. 용어 "TNFα"는 TNFα의 프로-형태, 프로-TNFα, 전장 TNFα 뿐만 아니라 세포 내 처리로부터 생성되는 임의의 형태의 TNFα를 포함한다. 용어는 또한 TNFα의 자연 발생 및 비자연 발생 변이체, 예를 들어 스플라이스 변이체, 대립형질 변이체 및 이소형을 포함한다. TNFα는 TNFR1(TNF 수용체 유형 1; CD120a; p55/60) 및 TNFR2(TNF 수용체 유형 2; CD120b; p75/80)의 두 수용체에 결합할 수 있다. TNFα는 예를 들어 신경염증에서 기능하는 전염증성 사이토카인으로서 기능한다. 예를 들어, TNFα는 신경병성 통증의 생성에 기능적으로 관여하는 것으로 생각된다(Leung, L., and Cahill, CM., J. Neuroinflammation 7:27 (2010)).

"단리된" 결합 분자, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 비자연 발생 형태인 결합 분자, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물을 지칭한다. 단리된 결합 분자, 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 이들이 자연에서 발견된 형태로는 더 이상 존재하지 않을 정도까지 변경, 개조, 조합, 재배열, 조작 또는 다르게는 처리된 것들을 포함한다. 일부 양태에서 단리된 결합 분자, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포 또는 조성물은 "재조합형"이다.

본원에서 사용되는 용어 "다기능성 폴리펩티드" 및 "이기능성 폴리펩티드"는 2개 이상의 항원을 표적으로 하도록 설계된 비자연 발생 결합 분자를 의미한다. 본원에 기재된 예시적인 다기능성 폴리펩티드는 항-NGF 항원 결합 단편 또는 항체 부분 및 가용성 TNFR2 부분을 포함하는 다기능성 결합 분자이다.

용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 전술한 것들의 조합과 같은 표적을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 온전한 다클론성 항체, 온전한 단일클론성 항체, 항체 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv(scFv) 돌연변이체, 다중특이적 항체, 예컨대 적어도 2개의 온전한 항체들로부터 생성된 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 등의 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항원 인식 자리를 포함하는 임의의 기타 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로 지칭되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 독자성을 기반으로 하는, 5가지 주요 면역글로불린 클래스 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이의 하위 클래스(이소형)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린은 상이하면서도 잘 알려져 있는 서브유닛 구조 및 3차원 배열을 갖는다.

일부 구현예에서, "차단" 결합 분자, 예를 들어 차단 항체 또는 "길항제" 결합 분자, 예를 들어 길항제 항체 또는 융합 단백질은 NGF 또는 TNFα와 같은, 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 것이다. 특정 양태에서, 차단 항체 또는 길항제 결합 분자는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다. 예를 들어, 생물학적 활성은 0.01%, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 100%만큼 감소될 수 있다.

본원에서 사용되는 "길항제" 및 "길항제 도메인"은 이들의 표적(예를 들어, TNFα 또는 NGF)에 결합하여 표적이 수용체와 상호작용하는 것을 차단하거나 억제하는 폴리펩티드 또는 기타 분자를 포함한다. 따라서 NGF 및/또는 TNFα 길항제는 trkA 또는 p75 뉴로트로핀과의 NGF 상호작용, 또는 TNFR-1 또는 TNFR-2와의 TNFα 상호작용을 차단하거나 억제하는 분자를 포함한다. NGF 및/또는 TNFα 길항제는 또한 p38 인산화 및/또는 ERK 인산화를 감소시키는 분자를 포함한다. 예시적인 길항제는 항-NGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 표적 특이적, 가용성, 비신호전달 TNF-알파 수용체 펩티드("유인 수용체" 또는 이의 리간드 결합 단편)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 일부를 말하고, 온전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 말한다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일쇄 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 본원의 다른 곳에 기재된 비항체 결합 분자의 항원 결합 단편도 본 개시내용에 의해 제공된다.

"단클론 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동종 항체 집단을 지칭한다. 이는 전형적으로 상이한 항원 결정기들에 대한 상이한 항체들을 포함하는 다클론성 항체와 대조된다. 용어 "단클론 항체"는 온전한 단클론 항체와 전장 단클론 항체뿐만 아니라 항체 단편들(예컨대 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단쇄(scFv) 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 기타 변형된 면역글로불린 분자를 포괄한다. 나아가, "단클론 항체"는 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 및 형질전환 동물에 의한 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 다수의 방식으로 제조된 이러한 항체를 지칭한다.

용어 "인간화 항체"는 최소 비인간(예를 들어, 뮤린) 서열을 포함하는 특정 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린 또는 이의 단편인 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비인간 종(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다(Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR 또는 FW) 잔기는 원하는 특이성, 친화도, 및 능력을 갖는 비인간 종으로부터의 항체 내 상응하는 잔기로 대체된다. 이러한 인간화 항체는 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비인간 잔기 내에서 추가적인 잔기들의 치환에 의해 더 변형되어 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 개선하고 최적할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역의 전체 또는 실질적으로 전체를 포함하는 적어도 하나, 그리고 전형적으로는 2 또는 3 가변 도메인의 실질적으로 전체를 포함할 것이고, 한편 FR 영역의 전체 또는 실질적으로 전체는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 적어도 면역글로불린 불변 부위 또는 도메인(Fc)의 일부분, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 일부분을 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하는 데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호 또는 제5,639,641호에 기재되어 있다.

항체의 "가변 부위"는 항체 경쇄의 가변 부위 또는 항체 중쇄의 가변 부위를, 단독으로 또는 조합하여, 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 부위는 각각이 과가변 부위로도 알려진 3개의 상보적 결정 부위(CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역(FR 또는 FW)으로 구성된다. 각 쇄에서의 CDR은 FR에 의해 가까운 인근에서 함께 유지되며, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 적어도 2가지 기술이 있다: (1) 교차-종 서열 가변성에 기초한 접근법(즉, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법(Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). 또한, 이들 두 접근법의 조합이 당해 분야에서 CDR을 결정하는 데 사용되기도 한다.

카밧(Kabat) 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인의 잔기(대략적으로 경쇄의 잔기 1~107 및 중쇄의 잔기 1~113)를 지칭할 때 사용된다(예컨대, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

카밧에서와 같은 아미노산 위치 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)에서 항체들의 편집물의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대하여 사용된 넘버링 시스템을 지칭한다. 이러한 넘버링 시스템을 이용하면, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 단축 또는 가변 도메인의 FR 또는 CDR 내로의 삽입에 상응하는 더 적은 아미노산 또는 추가적인 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 이후에 단일 아미노산 삽입물(카밧에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 이후에 삽입된 잔기(예를 들어, 카밧에 따른 잔기 82a, 82b, 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카밧 넘버링은 주어진 항체에 대해 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준적인" 카밧 넘버링된 서열과 정렬시킴으로써 결정할 수 있다. 코티아(Chothia)는 대신 구조적 루프의 위치를 지칭한다(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 카밧 넘버링 관례를 이용하여 넘버링했을 때 코티아 CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 따라 H32와 H34 사이에서 다르다(이는 카밧 넘버링 시스템이 H35A와 H35B에 삽입물을 위치시키기 때문이다; 만일 35A와 35B가 존재하지 않는다면, 이러한 루프는 32에서 끝난다; 35A만 존재한다면, 이러한 루프는 33에서 끝난다; 35A와 35B 모두가 존재할 경우, 이러한 루프는 34에서 끝난다). AbM 과가변 부위는 카밧 CDR들과 코티아 구조적 루프 사이의 절충물을 나타내며, Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. 비교가 아래 표 1에 제공된다.

[표 1]

항체 넘버링 시스템의 비교

용어 "인간 항체"는 자연 인간 항체, 또는 당해 분야에서 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조된, 자연 인간 항체에 상응하는 아미노산 서열을 가진 항체를 의미한다. 인간 항체의 이 정의는 온전한 항체 또는 전장 항체, 이의 단편, 및/또는 적어도 하나의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예를 들면, 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.

용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 둘 이상의 종으로부터 유래된 항체를 의미한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 한 종의 포유동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼 등)로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 반면, 불변 영역은 다른 종(일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이어서 종에서 면역 반응을 유도하는 것을 피한다. 예를 들어, 하나 이상의 항체 결합 도메인, 하나 이상의 비항체 결합 도메인, 또는 이들의 조합을 포함한 다중특이적 결합 분자, 예를 들어, 본원에서 제공되는 TNFα 길항제 및/또는 NGF 길항제는, 자연 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략적으로 동일한 면역원성의 항체와 비교한 경우에, 원하는 생화학적 특징, 예컨대 증가된 종양 국소화 또는 감소된 혈청 반감기를 제공하도록, 불변 영역 도메인 중 하나 이상의 적어도 특정 분획을 결실시켰거나 또는 달리 변경시킨 항체 불변 영역 (예를 들어, Fc 영역)을 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 불변 영역은 3개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인(CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 하나 이상의 불변 도메인은 부분적으로 또는 전체적으로 결실될 수 있다. 일부 양태에서, 전체 CH2 도메인이 결실될 수 있다(ΔCH2 구축물). 예를 들어, Oganesyan V, et al., 2008 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64:700-4; Oganesyan V, et al., Mol Immunol. 46:1750-5; Dall’Acqua, W.F., et al., 2006. J. Biol. Chem. 281:23514-23524; 및 Dall’Acqua, et al., 2002. J. Immunol. 169:5171-5180 참조.

용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 인접한 아미노산 및 단백질의 3차 폴딩에 의해 나란히 놓인 인접하지 않은 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 단백질 변성 시 전형적으로 유지되지만, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 단백질 변성 시 전형적으로 소실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간적 입체형태 내에 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8~10개의 아미노산을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 에피토프는 에피토프를 형성하는 특정 아미노산까지 정의될 필요가 없다. 일부 양태에서, 에피토프는 폴리펩티드 항원의 펩티드 서브유닛에 대한 결합을 조사하거나 항원 특이적 항체 그룹에 의한 항원에 대한 결합 경쟁을 조사함으로써 확인할 수 있다.

"대상체" 또는 "개체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후 또는 치료가 요구되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 예를 들어 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 기니 피그, 토끼, 랫트, 마우스, 말, 소, 곰 등을 포함하는, 인간, 가축, 농장 동물, 스포츠 동물 및 동물원 동물을 포함한다.

용어 "조성물" 및 "제약 조성물"은, 활성 성분의 생물학적 활성을 효과적이게 하는 형태이며, 조성물이 투여될 대상체에게 허용 불가능한 독성을 제공하는 부가적인 구성성분들을 함유하지 않는 조제물을 지칭한다. 이러한 조성물은 살균 조성물일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "유효량" 및 "치료적 유효량"은 대상체의 통증을 치료하거나 조절하는 데 효과적인 하나 이상의 치료적 조성물의 양을 의미한다. 용어 "통증을 치료하다", "통증을 조절하다" 및 문법적 등가물은 본원에서 통증 조절을 필요로 하는 대상체에서 임의의 유익하거나 바람직한 효과를 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 치료적 조성물의 유효량은, 예를 들어 대상체에서 통증을 예방하고/하거나, 통증의 허용 가능한 수준을 유지하고/하거나, 통증을 완화하고/하거나, 통증을 감소시키고/시키거나, 통증을 최소화하고/하거나 제거할 수 있다. 특히, 용어 "통증을 치료하다", "통증을 조절하다" 및 문법적 등가물은 본원에서 통증의 감소 및/또는 통증의 예방을 설명하기 위해 사용된다.

본원에서 사용되는 용어 "투여"는 본원에 기재된 하나 이상의 치료적 조성물, 예를 들어 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 이기능성 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 의미한다. 용어 "공동 투여"는 2 이상의 치료적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 공동 투여는 2 이상의 치료적 조성물이 대상체에게 동시에 투여되는 것을 포함하지만, 이를 필요로 하는 것은 아니다. 2 이상의 치료적 조성물은 순차적으로, 예를 들어 30분 간격, 1시간 간격, 2시간 간격, 3시간 간격, 4시간 간격 또는 5시간 간격으로 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 공동 투여의 순서 및 시기는 고정될 수 있거나 의료 전문가의 판단에 따라 달라질 수 있다.

용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 공유 결합된 뉴클레오티드 잔기로 구성된 중합체 화합물을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, cDNA, RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥, 벡터, 플라스미드, 파지 또는 바이러스일 수 있다.

용어 "벡터"는 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 관심 서열(들)을 숙주 세포에 전달할 수 있고 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예로는 바이러스 벡터, 어느 것도 연결되지 않은(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵세포들, 예컨대, 생산자 세포가 있으나 이에 한정되지 않는다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 비아미노산은 이를 단절할 수 있다. 이러한 용어들은 자연적으로 또는 조작, 예를 들면, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 기타 조작 또는 변형, 예컨대, 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체도 포괄한다. 예를 들어, (예를 들어, 비자연 아미노산 등을 포함하는) 아미노산의 하나 이상의 유사체뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 변형도 함유하는 폴리펩티드도 이러한 정의 내에 포함된다.

"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 비슷한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들면, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들면, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄(예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함하는, 비슷한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 패밀리들이 당해 분야에 정의되어 있다. 예를 들어, 티로신 대신 페닐알라닌으로의 치환은 보존적 치환이다. 특정 양태에서, 본원에서 제공되는 폴리펩티드 및 항체의 서열에서 보존적 치환은 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드의 결합 또는 기타 기능적 활성을 저해하지 않는다. 기능에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12:879-884 (1999); 및 Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997) 참조).

NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 결합 분자

본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 방법(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 투약 요법에 따름)에 사용하기 위한 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 이기능성 폴리펩티드를 제공한다. 특정 양태에서, 유효량의, 본원에서 제공되는 이기능성 폴리펩티드의 투여는 이를 필요로 하는 대상체에서 단독으로 투여된 동등량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 더 효과적으로 통증을 조절할 수 있다. 본원에서 제공되는 이기능성 폴리펩티드는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 임의의 순서, 구조 또는 입체형태로 포함할 수 있다. 임의의 적합한 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제는 본원에서 제공되는 이기능성 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 예시적인 NGF 길항제 및 TNFα 길항제가 본 개시내용에 기재되어 있다.

특정 양태에서, NGF 길항제는 항-NGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특정 양태에서, 항-NGF 길항제, 예를 들어, 본원에서 제공되는 이기능성 분자, 예를 들어 다중특이적 결합 분자에 사용하기 위한 길항제 항체 또는 이의 단편은 p75NRT에 대한 NGF 결합보다 TrkA에 대한 NGF 결합을 우선적으로 차단할 수 있다.

이기능성 폴리펩티드, 예를 들어 본원에 개시된 다중특이적 결합 분자에 사용하기 위한 예시적인 항체 또는 이의 단편은 미국 출원 공개 번호 2008/0107658에서 이용 가능하고, 이 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다. 특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 항-NGF 항체 MEDI-578과 동일한 에피토프에 결합하거나, 이를 경쟁적으로 억제할 수 있거나, 이보다 더 큰 친화도로 NGF에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 1, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 또는 0.2 nM 이하의 친화도로 인간 NGF 및/또는 랫트 NGF와 결합한다. 예를 들어, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 약 0.2~0.8, 0.2~0.7, 0.2~0.6, 0.2~0.5 및/또는 0.25~0.44 nM의 친화도로 인간 NGF와 결합할 수 있고, 약 0.2~0.9, 0.2~0.8 및/또는 0.25~0.70 nM의 친화도로 랫트 NGF와 결합할 수 있다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 MEDI-578이다. MEDI-578은 미국 출원 공개 번호 2008/0107658에 클론 1252A5로 개시되어 있다. 다른 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 인간화 항-NGF mAb인 타네주맙(RN-624)(Pfizer; 문헌[Kivitz et al., (2013) PAIN, 154, 9, 1603-161]에 기재됨); 완전한 인간 항-NGF mAb인 풀라누맙(fulranumab)(Amgen; 문헌[Sanga et al., PAIN, Volume 154, Issue 10, October 2013, Pages 1910-1919]에 기재됨); 완전한 인간 항-NGF mAb인 REGN475/SAR164877(Regeneron/Sanafi-Aventis); 인간화 항-NGF mAb인 ABT-110(Abbott Laboratories); 인간 항-NGF mAb인 파시누맙(fasinumab)(Regeneron, 미국 출원 공개 번호 2009/0041717에 클론 REGN475로 개시됨)이다. 본원에서 제공되는 이기능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합 분자 내에 포함된 항-NGF 항체 또는 이의 단편은, 예를 들어, 인간화, 키메라, 영장류화, 또는 완전한 인간형일 수 있다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 MEDI-578의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 도메인, 최대 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 MEDI-578 중쇄 CDR의 변이체를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 예를 들어, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 4의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1을 포함할 수 있다. 유사하게, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 5의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 6의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, HCDR3은 아미노산 서열 SSRIYDFNSALISYYDMDV(서열번호 11), 또는 SSRIYDMISSLQPYYDMDV(서열번호 12)을 포함할 수 있다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 MEDI-578의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 도메인, 최대 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 MEDI-578 경쇄 CDR의 변이체를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 8의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1을 포함할 수 있다. 유사하게, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 9의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 10의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함할 수 있다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 일부 양태에서 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 3의 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 일부 양태에서 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 7의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 일부 양태에서 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 94의 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 일부 양태에서 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 95의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 및 96 중 임의의 하나의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 도메인, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 이의 변이체를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 및 97 중 임의의 하나의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 도메인, 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 이의 변이체를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 및 96 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 일부 양태에서 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 및 96 중 임의의 하나의 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 및 97 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 일부 양태에서 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87 및 97 중 임의의 하나의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 NGF-NG의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 도메인, 최대 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 NGF-NG 중쇄 CDR의 변이체를 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 예를 들어, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 88의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 88의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1을 포함할 수 있다. 유사하게, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 89의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 90의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 90의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함할 수 있다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 NGF-NG의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 도메인, 최대 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 수반한 NGF-NG 경쇄 CDR의 변이체를 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 91의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1을 포함할 수 있다. 유사하게, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 92의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 93의 정확한 아미노산 서열을 갖거나, 또는 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산 치환을 수반한 서열번호 93의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함할 수 있다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 24의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다. 일부 양태에서 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 24의 VH 아미노산 서열을 포함하는 항체 VH 도메인을 포함한다.

특정 양태에서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 26의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다. 일부 양태에서 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 26의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함한다.

다기능성 폴리펩티드, 예를 들어 본 개시내용에 의해 제공되는 다중특이적 결합 분자는 완전한 항-NGF 항체, 즉 H₂L₂ 형식으로 2개의 완전한 중쇄 및 2개의 완전한 경쇄를 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 항-NGF 항체가 완전한 항체인 경우, 하나 이상의 TNFα 길항제 도메인은 항-NGF 항체의 하나 이상의 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 또는 항-NGF 항체의 하나 이상의 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 대안적으로, 다기능성 폴리펩티드, 예를 들어 본 개시내용에 의해 제공되는 다중특이적 결합 분자는 항-NGF 항체의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 특정 양태에서 항-NGF 항체 단편은 항체의 불변 도메인의 임의의 부분을 포함할 수 있거나 가변 도메인만을 포함할 수 있다. 이기능성 폴리펩티드, 예를 들어 다중특이적 결합 분자에 포함시키기 위한 예시적인 항-NGF 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)₂ 단편 또는 단쇄 Fv(scFv) 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에서 제공되는 특정한 예시적 조성물에서, 항-NGF 항체는 scFv 단편, 예를 들어, MEDI-578의 scFv 단편, 또는 이의 NGF 결합 변이체이다. 본원에서 제공되는 특정한 예시적 조성물에서, 항-NGF 항체는 scFv 단편, 예를 들어, NGF-NG의 scFv 단편, 또는 이의 NGF 결합 변이체이다. 항-NGF scFv 폴리펩티드는 N-VH-VL-C 또는 N-VL-VH-C의 임의의 순서로 VH 및 VL 도메인을 포함할 수 있다. scFv 분자는 일반적으로 VH 및 VL 도메인이 가요성 링커를 통해 연결되도록 조작된다. 다양한 링커를 포함하는 예시적인 scFv 구조는 Dimasi, N., et al., J Mol Biol. 393:672-92 (2009) 및 PCT 공개 번호 WO 2013/070565(이들은 전체가 본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다. 당업자가 이해하는 바와 같이, scFv 항체 단편은 표준 Fab 입체형태에 존재하는 가변 도메인에 비해 감소된 안정성을 가질 수 있다. 일부 양태에서 scFv는 안정화 돌연변이를 도입함으로써 또는 사슬간 이황화 결합(들)을 도입함으로써 구조적으로 안정화될 수 있다(예를 들어, SS-안정화됨). 그러나 안정화 돌연변이 및/또는 도입된 사슬간 이황화 결합은 요구되는 것은 아니며, 특정 양태에서는 존재하지 않는다. scFv 폴리펩티드를 안정화시키기 위해 다수의 당해 분야에서 인정된 방법이 이용 가능하다.

링커는 본원에서 제공되는 이기능성 폴리펩티드의 도메인/영역을 연결하는 데 사용될 수 있다. 링커는 이기능성 분자의 NGF 길항제 도메인과 TNFα 길항제 도메인을 연결하는 데 사용될 수 있고, scFv의 가변 중쇄 및 경쇄를 상호연결하는 데 사용될 수도 있다. 링커의 예시적인 비제한적인 예는 적어도 4개의 잔기를 포함하는 폴리펩티드 사슬이다. 이러한 링커의 일부는 가요성이고, 친수성일 수 있고, 그들 자신(링커 부분 또는 가요성 링커 부분)의 2차 구조를 거의 또는 전혀 갖지 않을 수 있다. 적어도 4개의 아미노산의 링커는 이기능성 폴리펩티드 분자가 조립된 후에 서로 가까이에 위치한 도메인 및/또는 영역을 연결하는 데 사용될 수 있다. 더 긴 링커가 또한 사용될 수 있다. 따라서, 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 잔기일 수 있다. 링커는 예를 들어, 약 100~175개 잔기일 수도 있다. 다수의 링커가 이기능성 폴리펩티드 분자의 일부를 상호연결하는 데 사용되는 경우, 링커는 동일하거나 상이할 수 있다(예를 들어, 동일하거나 상이한 길이 및/또는 아미노산 서열).

이기능성 폴리펩티드 내의 링커(들)는 원하는 구조의 형성을 용이하게 한다. 링커는 (Gly-Ser)_n(여기서 n은 적어도 1, 2, 및 최대, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100 이상의 정수임) 잔기를 포함할 수 있고, 일부 Glu 또는 Lys 잔기가 용해도를 증가시키기 위해 전반적으로 분산되어 있다. 대안적으로, 특정 링커는 임의의 세린 잔기를 포함하지 않으며, 예를 들어 링커는 O-연결된 글리코실화를 거친다. 일부 양태에서, 예를 들어, 링커의 이량체화가 이기능성 폴리펩티드의 도메인을 적절히 폴딩된 구성으로 가져오는 데 사용되는 경우, 링커는 시스테인 잔기를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 이기능성 폴리펩티드는 폴리펩티드의 도메인을 연결하는 적어도 1, 2, 3, 4개 이상의 폴리펩티드 링커를 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 폴리펩티드 링커는 1~50개의 잔기, 1~25개의 잔기, 25~50개의 잔기, 또는 30~50개의 잔기를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 폴리펩티드 링커는 Fc 모이어티의 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, 폴리펩티드 링커는 IgGl, IgG2, IgG3 및/또는 IgG4 항체의 면역글로불린 힌지 도메인의 일부 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 폴리펩티드 링커는 gly-ser 링커를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "gly-ser 링커"는 글리신 및 세린 잔기로 구성된 펩티드를 지칭한다. 예시적인 gly-ser 링커는 화학식 (Gly₄Ser)_n의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 n은 적어도 1, 2 및 최대, 예를 들어, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 100 이상의 정수이다. 일부 양태에서, 폴리펩티드 링커는 힌지 영역(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 분자로부터 유래됨)의 적어도 일부 및 일련의 gly-ser 아미노산 잔기(예를 들어, (Gly₄Ser)_n과 같은 gly-ser 링커)를 포함할 수 있다.

다기능성 폴리펩티드, 예를 들어 다중특이적 결합 분자가 scFv를 포함하는 경우, 가요성 링커는 scFv의 중쇄 및 경쇄를 연결할 수 있다. 가요성 링커는 일반적으로 힌지 부분을 포함하지 않지만, gly-ser 링커 또는 기타 가요성 링커이다. scFv의 도메인을 연결하는 가요성 링커의 길이와 아미노산 서열은 용이하게 선택되고 최적화될 수 있다.

특정 양태에서, 다기능성 폴리펩티드, 예를 들어 다중특이적 결합 분자는 N-말단으로부터 C-말단까지 VH, 15개 아미노산 링커 서열(GGGGS)₃, 및 VL을 포함하는 항-NGF scFv 단편을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, scFv의 VH 및 VL을 연결하는 링커는 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₄이다.특정 양태에서 VH는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서 VL은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VH는 서열번호 24, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 94 및 96 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, VL은 서열번호 26, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 95 및 97 중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, VH 도메인은 서열번호 3, 24, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 94 및 96 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, VL 도메인은 서열번호 7, 26, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 95 및 97 중 임의의 하나의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

다른 양태에서, 폴리펩티드의 안정성은 VH 및 VL 도메인 내의 특정 잔기를 시스테인 잔기로 변형시킴으로써 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 사슬간 이황화 결합을 첨가함으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, Michaelson, J. S., et al. (2009) MAbs 1, 128-41; Brinkmann, U., et al., (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90, 7538-42; Young, N. M., et al., (1995) FEBS Lett 377, 135-9 참조. 예를 들어, VL(예를 들어, 서열번호 7)의 위치 102, 103 또는 104의 글리신 잔기는 시스테인 잔기로 변형될 수 있고, VH(예를 들어, 서열번호 3)의 위치 44의 글리신 잔기는 시스테인 잔기로 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 7의 위치 102, 103 또는 104에 상응하는 아미노산 위치의 글리신 잔기는 시스테인 잔기로 변형된다. 일부 구현예에서, 서열번호 3의 위치 44에 상응하는 아미노산 위치의 글리신 잔기는 시스테인 잔기로 변형된다.

다기능성 폴리펩티드, 예를 들어 본원에서 제공되는 다중특이적 결합 분자는 TNFα 길항제 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, TNFα 길항제 도메인은 세포 표면 상의 TNF 수용체(TNFR)에 대한 TNFα의 결합을 억제함으로써 TNF 활성을 차단할 수 있다.

특정 양태에서, TNFα 길항제는 TNF 수용체, 예를 들어 TNFR-1 또는 TNFR-2의 TNFα 결합 가용성 단편, 또는 이의 변이체 또는 이의 가용성 단편이다. 특정 양태에서, TNFR-1의 가용성 단편은 55 kD 단편이다. 특정 구현예에서, TNFR-2의 가용성 단편은 75 kD 단편이다. 특정 양태에서 TNF 수용체 단편은 이종 폴리펩티드, 예를 들어 면역글로불린 Fc 단편, 예를 들어 IgG1 Fc 도메인에 융합된다. 특정 양태에서, TNFα 길항제는 서열번호 13에 기재된 아미노산 또는 이의 TNFα 결합 단편을 포함한다. TNFR-2 부분은 서열번호 13의 아미노산 1 내지 235를 포함한다. 특정 양태에서, TNFR-2의 TNFα 결합 가용성 단편의 변이체는 서열번호 13의 아미노산 1 내지 235와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, TNFR-2의 TNFα 결합 가용성 단편의 변이체는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40, 또는 50개 아미노산 삽입, 치환, 또는 결실을 제외한, 서열번호 13의 아미노산 1 내지 235를 포함한다. IgG1 Fc 부분은 서열번호 13의 아미노산 236 내지 467을 포함한다. 특정 양태에서, TNFR-2의 TNFα 결합 가용성 단편은 임의의 인간 또는 비인간 항체의 Fc 부분, 또는 안정성을 제공할 임의의 기타 단백질 또는 비단백질 물질, 예를 들어 알부민 또는 폴리에틸렌 글리콜에 융합될 수 있다. 특정 양태에서, TNFR-2의 TNFα 결합 가용성 단편의 변이체는 서열번호 13의 아미노산 236 내지 467과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, TNFR-2의 TNFα 결합 가용성 단편의 변이체는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40, 또는 50개 아미노산 삽입, 치환, 또는 결실을 제외한, 서열번호 13의 아미노산 236 내지 467을 포함한다. 특정 양태에서, TNFR-2의 TNFα 결합 가용성 단편의 변이체는 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, TNFR-2의 TNFα 결합 가용성 단편의 변이체는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 20, 40, 또는 50개 아미노산 삽입, 치환, 또는 결실을 제외한, 서열번호 13을 포함한다.

특정 양태에서, TNFR-2의 TNFα 결합 가용성 단편은 단일 사슬 융합 단백질이다. 특정 양태에서 TNFR-2의 TNFα 결합 가용성 단편은 예를 들어 2개의 Fc 도메인 사이의 이황화 결합을 통해, 회합된 2개의 융합 단백질의 이량체이다.

본원에서 제공되는 다기능성 폴리펩티드, 예를 들어 다중특이적 결합 분자는 다양한 상이한 구조 및 입체형태를 가질 수 있다. 일 양태에서, 본원에서 제공되는 다기능성 폴리펩티드는 융합 단백질을 포함하고, 여기서 전술한 바와 같은 NGF 길항제 도메인은 가요성 링커를 통해, 전술한 바와 같은 TNFα 길항제 도메인에 융합된다. 링커의 예는 본원의 다른 곳에 설명되어 있다. 특정 양태에서, 다기능성 폴리펩티드는 융합 단백질의 동종이량체를 포함한다.

예시적인 양태에서, NGF 길항제가 예를 들어 MEDI-578로부터 유래된 항-NGF scFv 도메인이고 TNFα 길항제가 면역글로불린 Fc 도메인의 카복시 말단에서 융합된 TNFR-2의 가용성 TNFα 결합 단편인 다기능성 폴리펩티드가 제공된다. 항-NGF scFv는 일부 양태에서 링커를 통해 면역글로불린 Fc 도메인의 카복시 말단에 융합될 수 있다. 특정 양태에서, 이 다기능성 폴리펩티드의 단량체는 각각의 서브유닛이 N-말단으로부터 C-말단까지 TNFR-2의 TNFα 결합 75 kD 단편, 인간 IgG1Fc 도메인, 10개 아미노산 링커 (GGGGS)₂(서열번호 98), 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 항-NGF VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₃(서열번호 15) 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 항-NGF VL을 포함하는 동종이량체를 형성한다. 일 양태에서, 다기능성 폴리펩티드는 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 TNFR2-Fc_VH#4이다. 일부 양태에서, 다기능성 폴리펩티드는 서열번호 14와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다.

또 다른 예시적인 양태에서, 다기능성 폴리펩티드는 N-말단으로부터 C-말단까지 TNFR-2의 TNFα 결합 75 kD 단편, 인간 IgG1Fc 도메인, 10개 아미노산 링커 (GGGGS)₂(서열번호 98), 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 항-NGF VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₄(서열번호 19) 및 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 항-NGF VL을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 N-말단으로부터 C-말단까지, 서열번호 13과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TNFR-2의 TNFα 결합 75 kD 단편, 10개 아미노산 링커 (GGGGS)₂(서열번호 98), 서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-NGF VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₄(서열번호 19) 및 서열번호 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-NGF VL을 포함한다. 일부 양태에서, 다기능성 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 TNFR2-Fc_varB이다. 일부 양태에서, 다기능성 폴리펩티드는 서열번호 17과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함한다.

폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포

본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 방법(예를 들어, 및 본원에 개시된 투약 요법)에서 사용하기 위한 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 개시내용은 각각 NGF 길항제 및 TNFα 길항제를 포함하는 개별 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 분자를 추가로 제공한다. 특정 양태에서 이러한 폴리뉴클레오티드는 NGF 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하고 또한 TNFα 또는 이의 단편에 결합하는 펩티드 도메인을 암호화한다. 예를 들어, 본 개시내용은 항-NGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드 도메인, 및 항-TNFα 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 같은 TNFα 길항제, 또는 TNF 수용체, 예를 들어 TNFR2의 가용성 TNFα 결합 부분을 포함하는 폴리펩티드 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하고, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우 암호화 가닥 또는 비암호화(안티센스) 가닥일 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 다기능성 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16, 18 또는 99의 뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편, 또는 서열번호 16, 18 또는 99와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열 또는 이의 단편을 포함한다.

본원에 기재된 단리된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서부터, 단리된 폴리펩티드 서열을 암호화하는 DNA 서열을 구축하고 적합한 형질전환된 숙주에서 이들 서열을 발현시키는 것까지 다양하다. 일부 양태에서, DNA 서열은 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 다기능성 폴리펩티드, 또는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 각각 포함하는 개별 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 단리하거나 합성함으로써 재조합 기술을 사용하여 구축된다. 따라서, 본 개시내용은 위에서 상세하게 기재된 바와 같이 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 이기능성 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 각각 포함하는 개별 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 추가로 제공된다.

일부 양태에서 다기능성 폴리펩티드, 예를 들어 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 각각 포함하는 관심 다중특이적 결합 분자 또는 개별 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용한 화학적 합성에 의해 구축될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 원하는 다기능성 폴리펩티드의 아미노산 서열, 및 관심 재조합 폴리펩티드가 생성될 숙주 세포에서 유리한 이러한 코돈의 선택을 기초로 설계될 수 있다. 표준 방법을 적용하여 관심 다기능성 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성할 수 있다. 예를 들면, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된(back-translated) 유전자를 구축할 수 있다. 나아가, 특정 다기능성 폴리펩티드 또는 개별 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들면, 원하는 폴리펩티드의 일부를 암호화하는 여러 작은 올리고뉴클레오티드들을 합성한 후 라이게이션시킬 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 오버행(overhang)을 함유한다.

특정 양태에서, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 암호화된 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 대해 동일한 판독 프레임에서 융합된 성숙한 폴리펩티드에 대한 암호화 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 마커 서열은 세균 숙주의 경우 마커에 융합된 성숙 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위하여 pQE-9 벡터에 의해 공급되는 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 마커 서열은 포유류 숙주(예를 들어, COS-7 세포)가 사용될 경우 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 헤마글루티닌(HA) 태그일 수 있다.

본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드는 암호화 영역, 비암호화 영역 또는 둘 다에 변경을 추가로 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵 치환, 부가 또는 결실을 생성하나, 암호화된 폴리펩티드의 성질 또는 활성을 변경시키지 않는 변경을 함유한다. 일부 양태에서, 뉴클레오티드 변이체는 유전 코드의 축퇴성으로 인한 침묵 치환에 의해 생성된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 이유들로, 예컨대, 특정 숙주를 위한 코돈 발현을 최적화하기 위해 (인간 mRNA 내의 코돈을 대장균과 같은 세균 숙주에 의해 선호되는 코돈으로 바꾸기 위해) 생성될 수 있다.

본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포도 제공된다. 일단 조립되면(합성, 부위-지정 돌연변이화 또는 또 다른 방법에 의해), 특정한 관심 단리 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 내로 삽입되고 원하는 숙주에서 단백질 발현에 적절한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 결합될 수 있다. 본 개시내용은 이러한 벡터를 제공한다. 뉴클레오티드 서열 결정, 제한 매핑 및 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현은 적절한 조립을 확인할 수 있다. 당해 분야에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 얻기 위해, 이러한 유전자는 선택된 발현 숙주에서 작용하는 전사 및 번역 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어야 한다.

특정 양태에서, 재조합 발현 벡터는 다기능성 폴리펩티드, 예를 들어 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자, 또는 각각 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하는 개별 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 증폭 및 발현시키는 데 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 다기능성 폴리펩티드 또는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 각각 포함하는 개별 폴리펩티드를 암호화하는 합성 또는 cDNA 유래 DNA 단편을 갖는 복제 가능한 DNA 구축물이다. 전사 유닛은 일반적으로 아래에 상세히 기재된 바와 같이 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 수행하는 유전적 요소 또는 요소들, 예를 들면, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조적 또는 암호화 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 조립체를 포함한다. 이러한 조절 요소는 전사를 조절하기 위한 작동유전자 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로 복제기점에 의해 부여된, 숙주에서 복제하는 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하기 위한 선별 유전자가 추가로 도입될 수 있다. DNA 영역들은 서로 기능적으로 관련되어 있을 때 작동 가능하게 연결된다. 예를 들면, 신호 펩티드(분비 리더)에 대한 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되어 있거나; 프로모터가 서열의 전사를 조절하는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결되어 있거나; 리보좀 결합 자리가 번역을 허용하도록 위치되는 경우 암호화 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 효모 발현 시스템에서 사용되기 위한 구조적 요소는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포 외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 대안적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 이 재조합 단백질은 N 말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 발현된 재조합 단백질로부터 선택적으로 나중에 절단되어 최종 생성물을 제공할 수 있다.

발현 조절 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 의존할 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합들이 사용될 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 거대세포바이러스로부터의 발현 조절 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 세균 숙주에 유용한 발현 벡터는 pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 포함하는 공지된 세균 플라스미드, 예컨대, 대장균으로부터의 플라스미드, 보다 더 넓은 숙주 범위 플라스미드, 예컨대, M13 및 사상 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.

본 개시내용은 본원에서 제공되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 본원에서 제공되는 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 적절한 프로모터의 제어 하에 있는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들면, 대장균 또는 바실러스를 포함한다. 고등 진핵 세포에는 후술되는 바와 같은 포유동물 기원의 확립된 세포주가 포함된다. 세포 비함유 번역 시스템도 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유류 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)에 기재되어 있으며, 이의 관련 개시내용은 본원에 참조로 포함된다. 항체 생산을 포함한 단백질 생산 방법에 관한 추가적인 정보는 예컨대, 미국 특허 공개 번호 2008/0187954, 미국 특허 번호 6,413,746 및 6,660,501, 및 국제 특허 공개 번호 WO 04009823(이들 각각은 전체가 참조로 본원에 포함됨)에서 볼 수 있다.

다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템들도 재조합 단백질을 발현하는 데에 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고, 적절하게 변형되고, 완전히 기능성이므로, 포유동물 세포에서 재조합 단백질의 발현이 수행될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예에는 HEK-293 및 HEK-293T, Gluzman(Cell 23:175, 1981)에 의해 기재된, COS-7 원숭이 신장 세포주, 및 예를 들어, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소(CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 포함하는 다른 세포주가 포함된다. 포유동물 발현 벡터는 비전사 요소, 예컨대, 복제기점, 발현될 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 기타 5' 또는 3' 플랭킹 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대, 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질의 생산을 위한 배큘로바이러스 시스템은 Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)에 의해 검토되었다.

본 개시내용은 본원에 기재된 다기능성 폴리펩티드를 생산하는 방법, 또는 각각 NGF 길항제 및 TNFα 길항제를 포함하는 개별 폴리펩티드를 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 방법은 다기능성 폴리펩티드 또는 개별 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 조건 하에서 전술한 바와 같이 숙주 세포를 배양하고 다기능성 폴리펩티드 또는 개별 폴리펩티드를 회수하는 단계를 수반한다.

재조합 단백질의 장기간 고수율 생산을 위해서는 안정적인 발현이 적절하다. 예를 들어, 다기능성 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 이용하는 것보다, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예로, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택 마커에 의해 제어되는 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 이후, 조작 세포가 농축된 배지 중에서 1~2일 동안 성장하도록 둔 후, 선택 배지로 전환될 수 있다. 재조합 플라스미드에서의 선택 마커는 선택에 대한 내성을 부여하며, 세포가 이의 염색체 내로 플라스미드를 안정적으로 통합하고 성장하도록 하여, 다시 클로닝되어 세포주로 증식될 수 있는 초점부위를 형성한다. 이 방법은 다기능성 폴리펩티드를 발현하는 세포주를 조작하는데 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 본원에 제시된 다기능성 폴리펩티드는 다기능성 폴리펩티드의 일시적인 발현과 함께 세포주에서 발현된다. 일시적인 형질감염은 세포 내로 도입된 핵산이 해당 세포의 게놈 또는 염색체 DNA 내로 통합되지 않고 세포에서 염색체외 요소, 예를 들어 에피좀으로 유지되는 과정이다. 에피좀 중 핵산의 전사 과정은 영향받지 않으며, 에피좀 핵산에 의해 암호화된 단백질이 제조된다.

안정적으로 형질감염되었거나 일시적으로 형질감염된 세포주는 폴리펩티드의 발현 및 생산을 초래하는, 당업계에 공지된 조건 하에서 세포 배양 배지 중에 유지된다. 특정 구현예에서, 포유류 세포 배양 배지는, 예를 들어 DMEM 또는 Ham의 F12를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 배지 제형에 기반한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 세포 성장 및 생물학적 단백질 발현 모두의 증가를 뒷받침하기 위해 변형된다. 본원에서 사용되는 용어 "세포 배양 배지", "배양 배지" 및 "배지 제형"은 다세포 유기체 또는 조직 외부의 인공적인 시험관내 환경에서 세포의 유지, 성장, 전파 또는 확장을 위한 영양액을 지칭한다. 세포 배양 배지는 특정의 세포 배양액의 용도에 대해 최적화될 수 있는데, 예를 들어 세포 성장을 촉진하기 위해 제형화된 세포 배양 성장 배지, 또는 재조합 단백질 생산을 촉진하기 위해 제형화된 세포 배양 생산 배지를 포함한다. 용어 영양소, 성분 및 구성성분은 세포 배양 배지를 구성하는 구성분을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다.

다양한 구현예에서, 세포주는 유가식 방법을 사용하여 유지된다. 본원에서 사용되는 "유가식 방법"은 기본 배지로 최초 인큐베이션된 후 유가식 세포 배양물에 추가적인 영양소가 공급되는 방법을 나타낸다. 예를 들어, 유가식 방법은 주어진 기간 내에 결정된 공급 일정에 따라 보충 배지를 추가하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, "유가식 세포 배양"은, 처음에 세포, 전형적으로 포유류, 및 배양 배지를 배양 용기에 공급하고, 배양 동안 추가의 배양 영양소를 연속적으로 또는 별개의 증분으로 배양물에 공급하되, 배양 종결 전에 세포 및/또는 생성물을 주기적으로 수합하거나 수합하지 않는 세포 배양을 지칭한다.

일부 구현예에서, 세포 배양 배지는 기본 배지 및 적어도 하나의 가수분해물, 예컨대 대두 기반 가수분해물, 효모 기반 가수분해물, 또는 변형된 기본 배지를 생성하는 2가지 유형의 가수분해물의 조합을 포함한다. 추가 영양소는 때로는 기본 배지, 예컨대 농축된 기본 배지만 포함할 수 있거나, 가수분해물 또는 농축된 가수분해물만 포함할 수 있다. 적합한 기본 배지는 DMEM(둘베코 변형 이글(Dulbecco's Modified Eagle's) 배지), DME/F12, MEM(최소 필수(Minimal Essential) 배지), BME(기초 배지 이글(Basal Medium Eagle)), RPMI 1640, F-10, F-12, .알파.-MEM(.알파.-최소 필수 배지), G-MEM(글라스고우(Glasgow's) 최소 필수 배지), PF CHO(예컨대, CHO 단백질 비함유 배지(Sigma) 또는 CHO 세포 단백질 비함유 EX-CELL.TM. 325 PF CHO 혈청 비함유 배지(SAFC Bioscience) 참고) 및 이스코브(Iscove's) 변형 둘베코 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본원의 기술에 사용될 수 있는 기본 배지의 다른 예는 BME 기본 배지(Gibco-Invitrogen; 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, 분말)(Gibco-Invitrogen (#31600))를 포함한다.

특정 구현예에서, 기본 배지는 혈청 비함유일 수 있다. 즉 배지는 혈청(예컨대, 우태 혈청(FBS), 말 혈청, 염소 혈청, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 동물 유래 혈청)을 함유하지 않거나 동물 단백질 비함유 배지 또는 화학적으로 한정된 배지임을 의미한다.

기본 배지는 표준 기본 배지에서 확인되는 특정 비영양 구성성분, 예컨대 다양한 무기 및 유기 완충제, 계면활성제(들) 및 소듐 클로라이드를 제거하기 위해 변형될 수 있다. 기본 세포 배지로부터 이러한 성분의 제거는 잔여 영양 성분의 농도 증가를 허용하며, 전반적인 세포 성장 및 단백질 발현을 개선할 수 있다. 추가로, 생략된 성분은 세포 배양 조건의 요건에 따라 변형된 기본 세포 배지를 함유하는 세포 배양 배지에 다시 첨가될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 배양 배지는 변형된 기본 세포 배지 및 다음 영양소, 철 공급원, 재조합 성장 인자; 완충액; 계면활성제; 삼투압 조절제; 에너지원; 및 비동물 가수분해물 중 적어도 하나를 함유한다. 추가로, 변형된 기본 세포 배지는 선택적으로 아미노산, 비타민 또는 아미노산 및 비타민 둘 다의 조합을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 기본 배지는 글루타민, 예컨대 L-글루타민 및/또는 메토트렉세이트를 추가로 함유한다.

일부 구현예에서, 단백질 생산은 당업계에 공지된 유가식, 배치식, 관류 또는 연속 공급 생물반응기 방법을 이용하여 생물반응기 공정에 의해 대량으로 수행된다. 대규모 생물반응기는 적어도 50리터의 용량을 가지며, 종종 약 500리터 초과 또는 1,000 내지 100,000리터의 용량을 갖는다. 이들 생물반응기는 산소 및 영양소를 분배하기 위한 진탕 임펠러를 사용할 수 있다. 소규모 생물반응기는 일반적으로 대략 100리터 이하 부피 용량의 세포 배양을 나타내며, 약 1리터 내지 약 100리터 범위일 수 있다. 대안적으로, 일회용 생물반응기(SUB)가 대규모 또는 소규모 배양을 위해 사용될 수 있다.

온도, pH, 진탕, 통기 및 접종물 밀도는 사용되는 숙주 세포 및 발현될 재조합 단백질에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 재조합 단백질 세포 배양은 30℃ 내지 45℃의 온도에서 유지될 수 있다. 배양 배지의 pH는 pH가 최적 수준으로 유지되도록 배양 공정 동안 모니터링될 수 있고, 이는 특정 숙주 세포에 있어서 6.0 내지 8.0의 pH 범위 내일 수 있다. 진탕을 위한 이러한 배양 방법을 위해 임펠러 구동된 혼합을 사용할 수 있다. 임펠러의 회전 속도는 대략 50 내지 200 cm/sec 팁 속도일 수 있지만, 배양되는 숙주 세포의 유형에 따라, 당업계에 공지된 다른 에어리프트 또는 다른 혼합/통기 시스템을 사용할 수 있다. 또한 배양되는 선택된 숙주 세포에 따라, 배양물 중의 대략 20% 내지 80% 공기 포화도의 용존 산소 농도를 유지하기에 충분한 통기를 제공한다. 대안적으로, 생물반응기는 공기 또는 산소를 배양 배지 내로 직접 살포할 수 있다. 중공 섬유 막 통풍기를 이용하는 거품 없는 통기 시스템을 포함한, 산소 공급의 다른 방법이 존재한다.

단백질 정제

일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 방법(예를 들어, 본원에 개시된 임의의 투약 요법)에서 사용하기 위해 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 정제하는 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이 형질전환된 숙주에 의해 생성된 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. 이러한 표준 방법은 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 크기배제 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별 용해도(differential solubility), 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의한 것을 포함한다. 친화도 태그, 예컨대 헥사 히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 단백질에 부착시켜 적절한 친화성 컬럼에서의 통과에 의한 용이한 정제를 허용할 수 있다. 단리된 단백질은 또한, 단백질 분해, 핵 자기 공명 및 x선 결정학과 같은 기법을 이용하여 물리적으로 특성화될 수 있다.

예를 들면, 재조합 단백질을 배양 배지 내로 분비하는 시스템으로부터의 상층액을, 상업적으로 입수 가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면, 아미콘(AMICON) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 이용하여 먼저 농축할 수 있다. 농축 단계 후, 농축액을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 대안적으로, 음이온 교환 수지, 예를 들면, 펜던트 디에틸아미노에틸(DEAE) 기를 가진 매트릭스 또는 기질이 사용될 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에서 일반적으로 채용되는 다른 유형일 수 있다. 대안적으로, 양이온 교환 단계가 사용될 수 있다. 적합한 양이온 교환제는 설포프로필 또는 카복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스들을 포함한다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들면, 펜던트 메틸 또는 기타 지방족 기를 가진 실리카 겔을 사용한 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 단계를 사용하여 NGF 결합 분자를 추가로 정제할 수 있다. 다양한 조합들에서, 전술한 정제 단계들의 일부 또는 전부를 이용하여 균질한 재조합 단백질을 제공할 수도 있다.

박테리아 배양에서 생성된 재조합 단백질은 예를 들면, 세포 펠렛으로부터의 초기 추출에 이은 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. 최종 정제 단계를 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용할 수 있다. 재조합 단백질의 발현에서 사용된 미생물 세포는 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해 파괴할 수 있다.

당해 분야에 공지된 재조합 폴리펩티드를 정제하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 공개 번호 2008/0312425, 2008/0177048 및 2009/0187005(이들 각각은 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법들도 포함한다.

사용 방법 및 제약 조성물

본 개시내용은 대상체의 통증을 감소시키고/감소시키거나 예방하는 것과 같이 대상체의 통증을 조절 또는 치료하는 방법을 제공하며, 이는 치료적 유효량의, 본원에서 제공되는 바와 같은, TNFα 및 NGF 길항제 다기능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합 분자를 투여하는 것을 포함하거나, 또는 TNFα 길항제와 NGF 길항제를 공동 투여하는 것을 포함한다. 특정 양태에서, 대상체는 인간이다.

본 개시내용은 추가로 본원에 기재된 임의의 결합 분자를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 비히클을 추가로 포함한다. 이들 제약 조성물은 통증, 예를 들어, 신경병성 및 염증성(예를 들어, 골관절염 또는 류미티스성 관절염) 통증을 치료하는 데, 예컨대, 감소시키거나 예방하는 데 유용하다.

본원에서 제공되는 NGF 길항제 및 TNFα 길항제를 포함하는 다기능성 폴리펩티드 및 조성물은 통증, 예를 들어, 신경병성 통증의 조절 또는 치료(예를 들어, 감소 및/또는 예방)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 각종 적용에 유용할 수 있다. 사용 방법은 시험관내, 생체외, 또는 생체내 방법일 수 있다.

특정 양태에서, NGF 결합제(예를 들어, 항체 또는 폴리펩티드)를 이용하여 치료되는 질환, 장애, 또는 병태는 통증과 관련이 있다. 특정 양태에서, 통증은 만성 통각수용성 통증, 만성 하부 요통, 신경병성 통증, 암 통증, 포진 후 신경통(PHN), 또는 내장통 병태와 관련이 있다. 특정 양태에서, 통증은 무릎 또는 엉덩이의 염증과 같은 관절 염증과 관련이 있다.

본 개시내용은 통증 조절을 필요로 하는 대상체에서 통증을 조절, 예컨대, 감소 또는 예방하는 방법으로서, 통증 조절을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 신경 성장 인자(NGF) 길항제 및 종양 괴사 인자(TNFα) 길항제를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 투여는 단독으로 투여된 동등량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 더 효과적으로 대상체에서 통증을 조절할 수 있는 방법을 제공한다.

단독으로 투여되는 성분보다 "더 효과적으로" 통증을 조절한다는 것은 병용 치료가 동등량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제를 개별적으로 투여하는 것보다 통증을 조절하는 데 더 효과적임을 의미한다. 특정 양태에서, 그리고 아래에 상세히 기재된 바와 같이, 본원에서 제공되는 통증 조절(예를 들어, 감소 또는 예방) 방법은 상승적 효능을 제공할 수 있으며, 예를 들어, NGF 길항제 및 TNFα 길항제 둘 다의 투여 효과는 상가적 효과를 초과하는 효과를 제공할 수 있거나, 또는 NGF 길항제도 TNFα 길항제도 개별적으로 효과적이지 않은 경우에 효과적일 수 있다. 특정 양태에서, 조합은 용량 절약을 가능하게 할 수 있으며, 예를 들어 공동 투여될 때 개별 성분의 유효 투여량은 개별 성분의 유효 투여량보다 적을 수 있다.

특정 양태에서, 본원에서 제공되는 통증 조절(예를 들어, 감소 또는 예방) 방법은 단독으로 투여된 동등량의 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제보다 대상체의 통증을 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 더 효과적이다. 특정 양태에서, 대상체에게 동시 투여되는 개별 NGF 길항제 또는 TNF α 길항제의 투여량 또는 본원에서 제공되는 이기능성 폴리펩티드의 투여 시 제공되는 NGF 길항제 또는 TNFα 길항제의 상대적 용량의 용량은 더 낮을 수 있으며, 예를 들어, 단독으로 투여된 성분에 필요한 투여량보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 낮다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 특정 투약 요법으로 대상체에게 투여하는 것을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 0.04~0.25 mg/kg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 0.04~0.15 mg/kg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 0.04~0.1 mg/kg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 0.04~0.075 mg/kg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 0.04~0.06 mg/kg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 약 0.05 mg/kg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 약 0.1 mg/kg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 약 0.15 mg/kg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 약 0.2 mg/kg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 피하로 투여된다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.04 내지 0.275 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 0.04~0.25 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 0.04~0.2 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 0.04~0.15 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 0.04~0.1 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 0.04~0.08 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 0.1~0.275 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 0.1~0.25 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 0.1~0.2 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 0.15~0.25 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 약 0.05 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 약 0.1 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 약 0.15 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 약 0.2 mg/kg의 결합 분자를 정맥내 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.1 내지 1.2 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.1 내지 1.0 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.1 내지 0.8 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.1 내지 0.6 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.1 내지 0.4 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.1 내지 0.25 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.4 내지 1.0 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.6 내지 1.0 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.8 내지 1.0 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 0.8 내지 1.2 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 약 0.2 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 약 0.4 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 약 0.6 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 약 0.8 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법으로서, 대상체에게 약 1 mg/kg의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 필요로 하는 대상체에게 고정 투약 요법으로 투여함으로써 대상체에서 통증을 치료, 예를 들어, 감소 또는 예방하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 고정 투약 요법은 각각의 대상체에게 주어진 투여량이 고정되고 대상체의 체중 또는 기타 특성에 의존하지 않는다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 5~200 mg의 고정 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 7.5~150 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 25~150 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 75~150 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 5, 7.5, 25, 75, 150 또는 200 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 7.5, 25, 75 또는 150 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 5 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 7.5 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 25 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 75 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 150 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 200 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 정맥내 용량의 결합 분자와 동등한 고정 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 정맥내 용량과 동등한 고정 용량은 정맥내 용량과 실질적으로 동일하거나 동일한 혈청 약동학적 프로파일을 제공하는 고정 용량이다. 일부 구현예에서, 정맥내 용량과 동등한 고정 용량은 약동학적 프로파일 플롯에서 곡선 아래의 기하 평균 면적을 정맥내 용량과 실질적으로 동일하거나 동일하게 제공하는 고정 용량이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 정맥내 고정 용량의 결합 분자와 동등한 고정 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 30 mg의 고정 정맥내 용량의 결합 분자와 동등한 고정 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 투여된다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 본원에 개시된 임의의 대상체에게 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 고정 용량으로 정맥내로 투여된다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 피하로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 본원에 개시된 임의의 대상체에게 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 고정 용량으로 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 본원에 개시된 임의의 고정 용량으로 피하 투여된다.

일부 구현예에서, 본 개시내용은 통증 치료를 필요로 하는 대상체에서 통증을 치료(예를 들어, 예방 또는 감소)하는 방법으로서, 대상체에게 피하 고정 용량의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 5~200 mg의 고정 용량의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 7.5~150 mg의 고정 용량의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 25~150 mg의 고정 용량의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 75~150 mg의 고정 용량의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 5, 7.5, 25, 75, 150, 또는 200 mg의 고정 용량의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 7.5, 25, 75 또는 150 mg의 고정 용량의 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 5 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 7.5 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 25 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 75 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 150 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 200 mg의 용량으로 본원에 개시된 임의의 대상체에게 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 결합 분자의 정맥내 고정 용량과 동등한 고정 용량을 피하 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 30 mg의 고정 정맥내 용량의 결합 분자와 동등한 고정 용량을 피하 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 통증을 치료(예를 들어 예방 또는 감소)하는 방법은 투약 일정에 따라 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 대상체에게 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 대상체에게 여러 번 투여된다. 일부 구현예에서, 고정 용량의 결합 분자가 대상체에게 여러 번 투여된다. 일부 구현예에서, 동일한 고정 용량의 결합 분자가 대상체에게 여러 번 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자(예를 들어, 고정 용량의 결합 분자)는 1주에 적어도 1회, 1주에 1회 이하, 2주마다 적어도 1회, 2주마다 1회 이하, 3주마다 적어도 1회, 3주마다 1회 이하, 1개월에 적어도 1회, 1개월에 1회 이하, 1개월에 적어도 2회, 1개월에 2회 이하, 1개월에 적어도 3회, 1개월에 3회 이하, 6주마다 적어도 1회, 또는 6주마다 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자(예를 들어, 고정 용량의 결합 분자)는 2주마다 적어도 1회 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자(예를 들어, 고정 용량의 결합 분자)는 2주마다 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자(예를 들어, 고정 용량의 결합 분자)는 2주마다 1회 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자(예를 들어, 고정 용량의 결합 분자)는 3주마다 적어도 1회 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 3주마다 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자(예를 들어, 고정 용량의 결합 분자)는 3주마다 1회 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자(예를 들어, 고정 용량의 결합 분자)는 1개월에 적어도 1회 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자(예를 들어, 고정 용량의 결합 분자)는 1개월에 1회 이하로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자(예를 들어, 고정 용량의 결합 분자)는 1개월에 1회 대상체에게 투여된다.

본 개시내용은 통증을 치료, 예를 들어 예방 또는 감소시키는 방법으로서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 투여하기 위한 투약 일정은 정해진 기간 동안 지속되는 방법을 제공한다. 예를 들어, 고정 용량의 결합 분자는 적어도 12주 동안 2주마다 적어도 1회 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 적어도 4주, 적어도 8주, 적어도 12주 또는 적어도 16주 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 적어도 4주 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 적어도 8주 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 적어도 12주 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 적어도 16주 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 12주 동안 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 적어도 12주 동안 2주마다 적어도 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 적어도 12주 동안 2주마다 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 12주 동안 2주마다 1회 투여된다.

본원에 개시된 임의의 결합 분자는 추가적인 통증 치료와 조합하여 통증의 감소 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 추가적인 통증 치료는 본원에 개시된 임의의 결합 분자와 동시에 또는 본원에 개시된 임의의 결합 분자와 독립적으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 통증 감소 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 통증을 감소 또는 예방하는 방법으로서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하고 추가의 통증 치료를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 통증을 예방 또는 감소시키는 방법은 대상체에게 NSAID를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 오피오이드를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 아세트아미노펜을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 파라세타몰을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 COX-2 억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

통증 치료를 필요로 하는 대상체는 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 투여받기 전에 얼마 동안 통증을 겪었을 수 있다. 통증을 예방하거나 감소시키는 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 결합 분자의 투여 전 1개월 이상 동안 통증을 겪었다. 일부 구현예에서, 대상체는 결합 분자의 투여 전에 3개월 이상 동안 통증을 겪었다. 일부 구현예에서, 대상체는 결합 분자의 투여 전에 6개월 이상 동안 통증을 겪었다.

본원에 개시된 임의의 결합 분자를 이용한 치료 개시 전에, 대상체는 통증에 대한 대체 치료를 이미 투여받았을 수 있다. 일부 구현예에서, 통증을 예방 또는 감소시키는 방법은 본원에 개시된 임의의 결합 분자의 투여 전에 통증에 대한 대체 치료를 대상체에게 투여하고 통증에 대한 대체 치료가 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하지 않는지 결정하고/하거나 대상체가 통증에 대한 대체 치료에 불내성인지 결정하는 단계를 투여한다. 일부 구현예에서, 통증에 대한 대체 치료는 NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합이다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 결합 분자를 투여하기 전에 다음의 단계를 포함한다: a. 대상체에게 NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합을 투여하는 단계, 및 b. i) NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합이 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하지 않는지 결정하고/하거나, ii) 대상체가 NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합에 불내성인지 결정하는 단계. . 일부 구현예에서, NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 또는 적어도 4주 동안 투여된다. 일부 구현예에서, NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합은 적어도 2주 동안 투여된다. 일부 구현예에서, NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합은 본원에 개시된 임의의 결합 분자의 투여 전에 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 또는 적어도 4주 동안 대상체에게 투여되었다. 일부 구현예에서, NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합은 본원에 개시된 임의의 결합 분자의 투여 전에 적어도 2주 동안 대상체에게 투여되었다. 일부 구현예에서, 대상체는 NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합에 불내성이다.

본원에 개시된 임의의 결합 분자를 이용한 치료 개시 전에, 대상체는 감염의 존재에 대해 테스트될 수 있다. 일부 구현예에서, 통증을 예방 또는 감소시키는 방법은 본원에 개시된 임의의 결합 분자의 투여 전에 SARS-CoV2 감염에 대해 대상체를 테스트하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 대상체에게 고정 용량의 결합 분자를 투여하기 전에 SARS-CoV2 감염에 대해 대상체를 테스트하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서 SARS-CoV2 감염에 대해 대상체를 테스트하는 단계는 대상체에게 고정 용량의 결합 분자를 투여하기 전에 SARS-CoV2 유전 물질에 대해 대상체를 테스트하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 기준선에서 SARS-CoV2에 감염되지 않았다. 대상체는 PCR로 테스트 시 기준선에서 SARS-CoV2 리보핵산(RNA)에 대해 음성일 수 있다. 대상체는 COVID-19 감염 또는 급성 바이러스성 호흡기 질환, 예를 들어, 발열, 기침, 호흡곤란, 인후통 및/또는 미각/후각 상실과 일치하는 임상 징후나 증상을 보이지 않을 수 있다. 대상체는 SARS-CoV2에 대해 음성일 수 있으며 COVID-19 항체에 대해 음성일 수 있다.

본 발명은 통증을 조절 또는 치료(예를 들어, 감소 또는 예방)하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 통증은 만성 통각수용성 통증, 만성 하부 요통, 신경병성 통증, 암 통증, 포진 후 신경통(PHN), 또는 내장통 병태로부터 선택된다. 특정 양태에서, 통증은 무릎 또는 엉덩이의 염증과 같은 관절 염증과 관련이 있다.

본원에 개시된 결합 분자는 관절염과 관련된 통증을 감소시키거나 예방하는 데 특히 유용할 수 있다. 통증을 예방하거나 감소시키는 방법의 일부 구현예에서, 대상체는 골관절염을 앓는다. 일부 구현예에서, 대상체는 무릎의 일측성 골관절염을 앓는다. 일부 구현예에서, 대상체는 중심 독자 평가(central reader evaluation)에 따라 0 내지 4의 켈그렌-로렌스(Kellgren-Lawrence, KL) 등급 척도에서 무릎 관절의 적어도 2등급의 골관절염을 앓는다. 일부 구현예에서, 대상체는 중심 독자 평가에 따라 0 내지 4의 KL 등급 척도에서 무릎 관절의 2등급 골관절염을 앓는다(Kohn et al (2016) Clin Orthop Relat Res 474: 1886-1893 and Altman et al. (1986) Arthritis Rheum.;29(8):1039-49). KL 분류 시스템은 골관절염의 방사선학적 특징이 없어 OA가 없음을 의미하는 것을 특징으로 하는 0등급; 의심스러운 관절 공간 협소를 특징으로 하는 1등급; 가능한 관절 공간 협소 및 골증식체의 존재를 특징으로 하는 2등급; 명확한 관절 공간 협소 및 다수의 골증식체를 특징으로 하는 3등급; 및 현저한 관절 공간 협소, 중증 경화증 및 큰 골증식체에 의해 중증 OA를 의미하는 것을 특징으로 하는 4등급의 무릎 관절의 방사선학적 평가를 기반으로 한다.

통증 조절의 효능은 환자에게 다양한 척도에 따라 경험한 통증의 질과 강도를 평가하도록 요청하여 측정할 수 있다. 언어적 통증 척도는 단어를 사용하여 무통증, 경미한 통증, 중등도 통증 및 중증 통증의 범위를 설명하며 각각에 0~3점을 부여한다. 대안적으로 환자는 0(무통증)에서 10(가장 심한 통증)까지의 수치 통증 척도에 따라 통증을 평가하도록 요청받을 수 있다. 시각적 아날로그 척도(VAS)에서 수직선 또는 수평선에는 무통증에서 가장 심한 통증까지 통증을 설명하는 단어가 있으며 환자는 현재의 통증 수준을 나타내는 지점에 선을 표시하도록 요청받는다. McGill 통증 지수를 통해 환자는 일련의 짧은 목록에서 통증을 가장 잘 설명하는 단어, 예를 들어, 지끈거림, 작열통, 격통을 선택하여 통증의 질과 강도를 모두 설명할 수 있다. VAS 또는 수치 척도를 사용하는 데 어려움을 겪는 성인의 경우 다른 통증 척도, 예를 들어, FACES를, 또는 비언어적 환자의 경우, 예를 들어, 행동적 평가 척도를 사용할 수 있다. 기능적 활동 점수는 통증 부위와 관련된 과업을 수행하도록 요청함으로써 환자가 통증으로 인해 얼마나 방해를 받는지와 관련이 있다. 이러한 유형의 척도를 사용한 통증 점수의 개선은 잠재적으로 진통제의 효능 개선을 나타낼 것이다.

대상체가 겪는 통증의 기준선 수준은 본원에 개시된 임의의 결합 분자가 대상체에게 투여되기 전에 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 기준선에서 웨스턴 온타리오 및 맥마스터 대학교 골관절염(Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis, WOMAC) 지수의 통증 하위 척도를 사용하여 측정 시 관절에서 적어도 5의 평균 WOMAC 통증 점수를 갖는다.

WOMAC 다중척도 지수는 무릎 또는 고관절의 OA가 있는 대상체의 통증, 경직 및 관절 기능을 평가하는 데 사용된다. WOMAC 통증 하위 척도는 무릎 OA가 있는 참가자를 평가하기 위해 널리 사용되는 환자 보고 결과 측정 도구이다(Lundgren-Nilsson et al. Patient-reported outcome measures in osteoarthritis: a systematic search and review of their use and psychometric properties. RMD Open. 2018 Dec 16;4(2):e000715). 대상 무릎의 OA로 인한 대상체의 통증을 평가하는 5개의 질문으로 구성된다. 각 질문은 0에서 10까지의 NRS 척도로 점수가 매겨지며 WOMAC 통증 하위 척도 점수는 5개 질문 모두의 평균 점수로 계산되며, 더 높은 점수는 더 높은 통증을 나타낸다. WOMAC 신체 기능 하위 척도는 대상 무릎의 OA로 인해 일상 생활 활동을 수행하는 데 있어 대상체의 어려움을 평가하는 17개의 질문으로 구성된다. 각 질문은 0에서 10까지의 NRS 척도로 점수가 매겨지며 WOMAC 통증 하위 척도 점수는 17개 질문 모두의 평균 점수로 계산되며, 더 높은 점수는 더 나쁜 기능을 나타낸다. WOMAC 경직 기능 하위 척도는 대상 무릎의 OA로 인한 경직을 평가하는 2개의 질문으로 구성된다. 경직은 대상 무릎에서 움직임의 편안함이 감소된 느낌으로 정의된다. 각 질문은 0에서 10까지의 NRS 척도로 점수가 매겨지며 WOMAC 통증 하위 척도 점수는 2개 질문의 평균 점수로 계산되며, 더 높은 점수는 더 높은 경직을 나타낸다. 본원에서 사용되는 기준선 WOMAC 점수는 결합제의 투여일의 WOMAC 점수로 정의된다.

일부 구현예에서, 대상체는 기준선에서 통증 수치 등급 척도(NRS)로 측정 시 관절에서 적어도 5의 평균 통증 강도 점수를 갖는다. NRS는 통증을 평가하는 데 사용되는 11점의 Likert 척도이며, 대상체는 0 = "무통증"에서 10 = "이전 24시간에 비해 상상할 수 있는 가장 심한 통증"의 숫자를 식별하여 인덱스 무릎(index knee)의 평균 통증을 설명하도록 요청받는다(Alghadir et al. Test-retest reliability, validity, and minimum detectable change of visual analog, numerical rating, and verbal rating scales for measurement of osteoarthritic knee pain. J Pain Res. 2018 Apr 26;11:851-6 참조). 본원에서 사용되는 바와 같이, 기준선 NRS 점수는 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 이용한 치료 개시 전 -7일부터 -1일까지 기록된 일일 NRS 통증 점수의 평균으로 정의된다.

통증 감소 또는 예방의 효능은 본원에 개시된 임의의 결합 분자가 투여된 대상체의 통증 수준의 변화를 본원에 개시된 임의의 결합 분자가 투여되지 않은 대조군 대상체의 통증 수준의 변화와 비교함으로써 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 결합 분자가 투여되지 않은 대조군 대상체(예를 들어, 위약이 투여된 대조군 대상체)의 웨스턴 온타리오 및 맥마스터 대학교 골관절염(Western Ontario and McMaster Universities Osteoarthritis, WOMAC) 점수와 비교 시 WOMAC 척도(1~10의 척도로 척도화되는 경우)에서 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 또는 6점만큼 통증을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 결합 분자가 투여되지 않은 대조군 대상체(예를 들어, 위약이 투여된 대조군 대상체)의 WOMAC 점수와 비교 시 WOMAC 척도(0~4의 척도로 척도화되는 경우)에서 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 또는 4점만큼 통증을 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 결합 분자가 투여되지 않은 대조군 대상체의 통증 수치 등급 척도(NRS) 점수와 비교 시 NRS(1~10의 척도로 척도화되는 경우)에서 적어도 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5 또는 6점만큼 통증을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 대상체에게 결합 분자의 단일 용량 투여 후 통증 감소가 관찰된다.

통증 감소 또는 예방의 효능은 본원에 개시된 임의의 결합 분자가 투여된 대상체의 통증 수준의 변화를 기준선에서의 대상체의 통증 수준과 비교함으로써 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 12주 동안 2주마다 고정 용량으로 투여되고, 방법은 본원에 개시된 임의의 결합 분자의 최초 투여 후 적어도 12주까지 기준선으로부터 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 적어도 30%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 적어도 50%만큼 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 WOMAC 신체 하위 척도 점수를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 12주 동안 2주마다 고정 용량으로 투여되고, 방법은 본원에 개시된 임의의 결합 분자의 최초 투여 후 적어도 12주까지 기준선으로부터 대상체의 WOMAC 신체 하위 척도 점수를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 WOMAC 신체 하위 척도 점수를 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 WOMAC 신체 하위 척도 점수를 적어도 30%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 WOMAC 신체 하위 척도 점수를 적어도 50%만큼 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 12주 동안 2주마다 고정 용량으로 투여되고, 방법은 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 기준선으로부터 적어도 12주만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 적어도 50%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 적어도 30%만큼 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 적어도 50%만큼 감소시킨다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 기준선으로부터 골관절염의 환자 종합 평가(PGA)를 개선한다. 본원에서 사용되는 기준선 PGA는 결합제의 투여일의 PGA 점수로 정의된다. PGA는 무릎의 OA로 인한 증상 및 활동 장애를 평가하는 데 사용되는 5점 Likert 척도이다(예를 들어, Nikiphorou et al (2016) Arthritis Res Ther 18:251 참조). 대상체들은 "무릎의 OA가 당신에게 영향을 미치는 모든 방식을 고려할 때 오늘 기분은 어떻습니까?"라는 질문에 기초하여 1 = 매우 좋음(무증상 및 정상적인 활동의 제한 없음)에서 5 = 매우 나쁨(참을 수 없는 매우 심한 증상 및 모든 정상적인 활동을 수행할 수 없음)까지의 숫자를 식별하도록 요청받는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자는 12주 동안 2주마다 고정 용량으로 투여되며, 방법은 골관절염의 PGA를 기준선으로부터 적어도 12주만큼 개선한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 방법 또는 투약 요법은 골관절염의 PGA를 적어도 2점만큼 개선한다.

통증 감소 또는 예방의 효능은 대상체에서 바이오마커 수준의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, 통증을 예방하거나 감소시키는 방법은 결합 분자가 투여되지 않은 대조군 대상체(예를 들어, 위약이 투여된 대조군 대상체)의 NGF 활성과 비교 시 대상체의 NGF 활성을 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 억제한다. 일부 구현예에서, 방법은 결합 분자가 투여되지 않은 대조군 대상체의 NGF 활성과 비교 시 대상체의 NGF 활성을 적어도 40%만큼 억제한다. 일부 구현예에서, 대상체에게 결합 분자의 단일 용량 투여 후 NGF 억제가 관찰된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 결합 분자의 다중 용량 투여 후 NGF 억제가 관찰된다.

일부 구현예에서, 통증을 예방하거나 감소시키는 방법은 결합 분자가 투여되지 않은 대조군 대상체(예를 들어, 위약이 투여된 대조군 대상체)의 CXCL-13 수준과 비교 시 대상체의 CXCL-13 수준을 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 억제한다. 일부 구현예에서, 대상체에게 결합 분자의 단일 용량 투여 후 CXCL-13 억제가 관찰된다. 일부 구현예에서, 대상체에게 결합 분자의 다중 용량 투여 후 CXCL-13 억제가 관찰된다.

특정 양태에서, 제형은 TNFα 및 NGF 길항제 다기능성 폴리펩티드, 예를 들어 본원에서 제공되는 다중특이적 결합 분자를 제약상 허용되는 비히클(예를 들어, 담체, 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000). 적합한 제약상 허용되는 비히클은 인산염, 시트르산염, 및 다른 유기산과 같은 비독성 완충액; 소듐 클로라이드와 같은 염; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3'-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 폴리펩티드(예를 들어, 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 탄수화물, 예컨대, 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당류, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스, 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온, 예를 들어 소듐; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 착물); 및 비이온 계면활성제, 예를 들어 TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 개시내용의 항체는 다기능성 폴리펩티드는 분자의 물리화학적 특성 및 전달 경로에 따라 액체, 반고체 또는 고체 형태로 제형화될 수 있다. 제형은 부형제, 또는 부형제의 조합, 예를 들어, 당, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액체 제형은 광범위한 폴리펩티드 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고체 제형은 동결건조, 분무 건조, 또는 예를 들어, 초임계 유체법에 의한 건조에 의해 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 제형은 동결건조 제형이다.

본원에 제공된 제약 조성물은 국소적 또는 전신적 처치를 위한 임의의 수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말과 같은 국소(질 및 직장 전달을 포함하는 점막에 대한 것과 같은); 폐(예를 들어, 분무기에 의한 것을 포함하는 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해; 기관내, 비강내, 표피 및 경피); 경구; 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입을 포함하는 비경구; 또는 두개내(예를 들어, 척수강내 또는 심실내) 투여일 수 있다.

본원에서 제공되는 TNFα 및 NGF 길항제 다기능성 폴리펩티드는 제약 조합 제형 또는 병용 요법으로서의 투약 요법에서 항통각 특성을 갖는 제2(또는 제3) 화합물과 추가로 조합될 수 있다.

통증 치료를 위해 TNFα 및 NGF 길항제 다기능성 폴리펩티드, 예를 들어 본원에서 제공되는 다중특이적 결합 분자의 적절한 투여량은 치료할 통증의 유형, 통증의 중증도 및 경과, 통증의 반응성, 다기능성 폴리펩티드가 치료 또는 예방 목적으로 투여되는지, 이전 요법, 환자의 임상 병력 등에 따라 다르며, 이들 모두는 치료 의사의 재량에 따른다. 다기능성 폴리펩티드는 효과적인 통증 조절을 유지하기 위해 1회 또는 수일에서 수개월 지속되는 일련의 치료에 걸쳐 투여될 수 있다. 최적 투약 일정은 환자의 신체에서 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있고 각각의 항체 또는 폴리펩티드의 상대적 효능에 따라 달라질 것이다. 투여하는 의사는 최적 투여량, 투약 방법론 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다.

본원에서 제공되는 다기능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합 분자의 투여는 "상승작용"을 제공할 수 있고, "상승적" 인 것으로, 즉 활성 성분이 함께 이용되는 경우 달성되는 효과가 화합물을 개별적으로 이용하여 생성되는 효과의 합보다 큰 것으로 증명될 수 있다. 활성 성분이 단일 다기능성 융합 폴리펩티드로 투여될 때 상승적 효과가 얻어질 수 있다.

통증

가장 광범위한 활용에서, "통증"은 이를 경험하는 개체에 대해 고도로 주관적이고, 환경 및 문화적 배경을 포함한 개체의 정신적 상태에 의해 영향을 받는 경험적 현상을 지칭한다. "신체적" 통증은 통상적으로 실제적 또는 잠재적 조직 손상의 원인인, 제3자에게 지각될 수 있는 자극과 연관될 수 있다. 이러한 의미에서, 통증은 국제통증연구협회(IASP)에 따라서 "실제적 또는 잠재적 조직 손상과 연관되거나, 또는 이러한 손상 면에서 언급된 감각 및 정서적 경험"으로 간주될 수 있다. 그러나 통증의 일부 경우는 지각 가능한 원인이 없다. 예를 들어, 심인성 요인에 의해 이미 존재하는 신체적 통증의 악화를 포함하는 심인성 통증 또는 인지할 수 있는 통증 원인의 증거 없이 심리적 장애가 있는 사람에서 때때로 지속적이고 인지되는 통증의 증후군. 본 발명의 맥락에서 "통증"은 본원에 개시된 임의의 유형의 통증일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.

통증의 유형

본 발명의 맥락에서, 통증은 통각수용성 통증, 신경병성/신경성 통증, 돌발 통증, 이질통증, 통각과민(hyperalgesia), 감각과민, 감각장애, 감각이상, 통각과민(hyperpathia), 환상 사지 통증, 심인성 통증, 무감각부위 통증, 신경통, 신경염을 포함한다. 기타 범주화는 악성 통증, 협심증성 통증, 및/또는 특발성 통증, 복합 부위 통증 증후군 I, 복합 부위 통증 증후군 II를 포함한다. 통증의 유형과 증상이 상호 배타적일 필요는 없다. 이들 용어는 IASP에 의해 정의된 바와 같이 의도된다.

통각수용성 통증은 유해 자극에 반응하여 말초 신경 내의 특수 감각 통각수용기에 의해 개시되어, 유해 자극을 활동 전위로 암호화한다. 일반적으로, Aδ 섬유 및 (다모드) C 섬유 상의 통각수용기는 피부 바로 아래, 힘줄, 관절 및 신체 기관에서 종결되는 자유신경종말이다. 배근 신경절(DRG) 신경세포는 말초부와 척수 간의 소통 부위를 제공한다. 신호가 척수를 통해 뇌간 및 시상 부위로 처리되고, 최종적으로는 대뇌 피질로 처리되는데, 여기서 이는 통상적으로 (항상은 아님) 통증의 감각을 유발한다. 통각수용성 통증은 일반적으로 통각수용기에서 통각수용성 활동을 유발하는 데 필요한 강도의 특정 최소 한계치 이상인, 신체 조직을 자극하거나 또는 손상을 입힐 잠재력을 지닌 광범위한 화학적, 열적, 생물학적 (예를 들어, 염증성) 또는 기계적 사건으로부터 비롯될 수 있다.

신경병성 통증은 일반적으로 말초 또는 중추 신경병성 통증을 각각 유발하는, 말초 또는 중추 신경계 내의 비정상적인 기능에 따른 결과이다. 신경병성 통증은 IASP에 의해, 신경계 내에서의 원발성 병변 또는 기능이상에 의해 개시되거나 또는 유발되는 통증으로 정의된다. 신경병성 통증은 종종 특히 만성 사례에서 신경계에 대한 실제적 손상을 수반한다. 염증성 통각수용성 통증은 일반적으로 조직 손상의 결과이고, 이에 따른 염증성 과정이다. 신경병성 통증은 조직에 대해 관찰 가능한 임의의 손상을 명백히 치유한 후에도 (예를 들어, 수개월 또는 수년) 상당히 지속될 수 있다.

신경병성 통증의 사례에서는, 병든 영역으로부터의 감각 처리가 비정상적으로 될 수 있고, 정상적으로는 통증을 유발하지 않는 무해한 자극(예를 들어, 열, 접촉/압박)이 통증을 유발할 수 있거나(즉, 이질통증) 또는 유해 자극이 정상적으로는 고통스러운 자극에 반응하여 과장된 통증 지각(즉, 통각과민증)을 유발할 수 있다. 또한, 전기적 따끔거림 또는 쇼크 또는 "핀과 바늘"과 유사한 감각(즉, 감각이상) 및/또는 불쾌한 특성을 갖는 감각(즉, 감각장애)이 정상적인 자극에 의해 유발될 수 있다. 돌발 통증은 기존의 만성 통증의 악화이다. 통각과민은 자극에 대한 비정상적으로 고통스러운 반응으로부터 비롯되는 고통스러운 증후군이다. 대부분의 사례에 있어서의 자극은 환자가 통증으로서 인식할 수 있는 최소한의 통증 경험으로서 간주될 수 있는 통증 한계치를 증가시키면서 반복적이다.

신경병성 통증의 예는 촉각 이질통증(예를 들어, 신경 손상 후 유도됨), 신경통(예를 들어, 포진 후 (또는 대상포진 후) 신경통, 삼차 신경통), 반사 교감신경 이상증/작열통(신경 외상), 암 통증의 구성요소(예를 들어, 암 그 자체 또는 관련 병태, 예컨대 염증으로 인한 통증, 또는 화학요법, 수술 또는 방사선 요법과 같은 치료로 인한 통증), 환상 사지 통증, 포착성 신경병증(예를 들어, 손목 터널 증후군), 및 신경병증, 예컨대 말초 신경병증(예를 들어, 당뇨병, HIV, 만성 음주, 기타 독소에 대한 노출(많은 화학요법 포함), 비타민 결핍 및 다양한 기타 의학적 병태에 기인함)을 포함한다. 신경병성 통증은 각종 원인, 예를 들어 외과적 수술, 상처, 대상포진, 당뇨병성 신경병증, 다리 또는 팔의 절단, 암 등에 기인한 신경 손상 후 신경계의 병리학적 수술의 표출에 의해 유도된 통증을 포함한다. 신경병성 통증과 연관된 의학적 병태는 외상성 신경 손상, 뇌졸중, 다발성 경화증, 척수구멍증, 척수 손상 및 암을 포함한다.

통증 유발성 자극은 종종 염증 반응을 유발하는데, 이는 그 자체가 통증 경험의 원인일 수 있다. 일부 병태에서는, 통증이 통각수용성 인자와 신경병성 인자의 복합적 혼합에 의해 유발되는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 만성 통증은 종종 염증성 통각수용성 통증 또는 신경병성 통증, 또는 둘 다의 혼합을 포함한다. 초기 신경계 기능이상 또는 손상은 염증성 매개인자의 신경 방출 및 후속 신경병성 염증을 촉발할 수 있다. 예를 들어, 편두통은 신경병성 통증과 통각수용성 통증의 혼합을 나타낼 수 있다. 또한, 근막 통증은 아마도 근육으로부터의 통각수용성 유입에 이차적이지만, 비정상적인 근육 활동은 신경병성 병태의 결과일 수 있다.

본원에서 제공되는 통증 조절(예를 들어, 통증 감소 또는 예방) 방법에 따르면, 본원에 개시된 임의의 결합 분자의 투여는 통증 조절을 필요로 하는 대상체에서 통증을 조절(예를 들어, 통증 감소 또는 예방)하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 대상체에게 단일 용량 투여한 후 통증 감소가 관찰된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 임의의 결합 분자를 대상체에게 다중 용량 투여한 후 통증 감소가 관찰된다. 특정 구현예에서, 본 개시내용은 골관절염과 관련된 통증을 감소시키거나 예방하기 위한 방법 또는 투약 요법을 제공한다. 일부 구현예에서, 골관절염과 관련된 통증은 골관절염과 관련된 무릎 통증이다.

통증을 예방하거나 감소시키는 방법의 일부 구현예에서, 통증은 급성 통증, 단기 통증, 지속성 또는 만성 통각수용성 통증, 또는 지속성 또는 만성 신경병성 통증이다. 일부 구현예에서, 통증은 만성 통증을 포함한다. 일부 구현예에서, 통증은 무릎 또는 엉덩이의 염증과 같은 관절 염증과 관련이 있다. 일부 구현예에서, 통증은 골관절염 통증을 포함한다. 일부 구현예에서, 통증은 무릎의 골관절염 통증을 포함한다.

TNFα 및 NGF 길항제를 포함하는 키트

본 개시내용은 본원에 기재된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는, 본원에서 제공되는 바와 같은 TNFα 및 NGF 길항제 다기능성 폴리펩티드, 예를 들어, 다중특이적 결합 분자를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 양태에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에, TNFα 길항제 및 NGF 길항제를 포함하는 적어도 다기능성 융합 폴리펩티드, 예를 들어 서열번호 14 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 당업자는 본원에서 제공되는 개시된 TNFα 길항제 및 NGF 길항제가 당업계에 널리 공지된 확립된 키트 포맷 중 하나로 쉽게 포함될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.

실시예

이제 일반적으로 기재되는 본 개시내용은 다음 실시예를 참조로 보다 용이하게 이해될 것이고, 이러한 실시예는 단지 본 개시내용의 특정 양태 및 구현예의 예시의 목적으로 포함되며, 본 개시내용을 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1 - 항 NGF scFv/TNFR2-Fc 다중특이적 결합 분자의 구축 및 특성화

다기능성 분자, 구체적으로, 항 NGF 항체 도메인 및 TNFR2-Fc 도메인을 포함하는 다중특이적 결합 분자를 다음과 같이 생성하였다. 항-NGF 항체 scFv 단편을 Dimasi, N., et al., J Mol Biol. 393:672-92 (2009) 및 PCT 공개 번호 WO 2013/070565에 기재된 Bs3Ab 포맷에 따라, 중쇄 CH3 도메인을 통해 TNFR2-Fc 융합 단백질(서열번호 13)의 C-말단에 융합시켰다. 이 구조의 다이어그램이 도 1에 도시되어 있다. TNFR2-Fc 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 구축물 및 다중특이적 결합 분자를 암호화하는 DNA 구축물을 GeneArt(Invitrogen)에 의해 합성하였다. 다중특이적 결합 분자의 경우, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₃(서열번호 15)을 통해 함께 연결된 MEDI-578의 VH(서열번호 3) 및 VL(서열번호 7) 도메인을 포함하는 항-NGF scFv를 구축하였다. 이러한 scFv의 N-말단을, 10개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₂을 통해 서열번호 13의 C-말단에 융합시켰다. 이 다중특이적 결합 분자가 본원에서 TNFR2-Fc_VH#4로 지칭된다. 다중특이적 결합 분자를 암호화하는 DNA 구축물을, Bs3Ab 발현 벡터 내로 클로닝하기 위하여 3' 말단에 EcoRI 제한 부위 및 중지 코돈을 함유하도록 조작하였다. TNFR2-Fc_VH#4를 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 16으로 제시되고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 14로 제시된다.

TNF-NGF 다중특이적 결합 분자의 열안정성은 다중특이적 결합 분자의 MEDI-578 scFv 부분의 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 사슬간 이황화 결합을 첨가함으로써 개선시켰다. 이는 VH 도메인의 아미노산 44에 G->C 돌연변이를 도입하고(서열번호 94), VL 도메인의 아미노산 103에 G->C 돌연변이를 도입함으로써(서열번호 95) 수행되었다. 이 클론은 TNFR2-Fc_varB로 지정되었다. TNFR2-Fc_varB의 아미노산 서열은 서열번호 17로서 제시된다. TNFR2-Fc_varB를 암호화하는 DNA 서열은 서열번호 18로서 제시된다. TNFR2-Fc_varB를 암호화하는 코돈 최적화 DNA 서열은 서열번호 99로서 제시된다. TNFR2-Fc_varB는 scFv 부분의 VH와 VL을 연결하는 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₃을 20개 아미노산 링커 (GGGGS)₄(서열번호 19)로 대체한다는 점에서 TNFR2-Fc_VH#4와 더 상이하다. 시차 주사 열량측정법(DSF)을 이용하여 TNFR2-Fc_VH#4 및 TNFR2-Fc_varB의 Tm을 측정하였다. 이 방법은 상승 온도에 대한 노출 시 단백질 도메인 풀림 동안 드러난 소수성 표면에 결합하는 형광성 염료인 Sypro Orange(Invitrogen)의 혼입량을 측정한다. DSF 분석에서, TNFR2-Fc_VH#4의 Tm은 62℃인 반면, TNFR2-Fc_varB의 Tm은 66℃였다. 따라서, 다중특이적 분자의 MEDI-578 scFv 부분에 사슬간 이황화 결합을 부가하는 것이 분자의 열안정성을 4℃만큼 개선시켰다.

TNFR2-Fc 단백질 및 TNFR2-Fc_VH#4를 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민(PEI)(Polysciences)을 이용하여 현탁 CHO 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 세포를 CD-CHO 배지(Life Technologies)에서 유지시켰다. 소규모 형질감염으로부터의 배양 수확물을 제조업체의 프로토콜(GE Healthcare)에 따라 1 ml HiTrap MabSelect SuRe™ 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제하고, 연속해서 1% 수크로스, 100 mM NaCl, 25 mM L-아르기닌 하이드로클로라이드 및 25 mM 인산나트륨 (pH 6.3)에서 완충제 교환하였다. 재조합 단백질의 순도는 환원 조건 하에 SDS-PAGE를 이용하고 분석적 크기-배제 크로마토그래피(하기 방법 참조)를 이용하여 분석하였고, 이론적으로 결정된 흡광 계수를 이용하여 280 nm 하에서의 흡광도를 판독함으로써 농도를 결정하였다.

TNFR2-Fc 융합 단백질 및 TNF-NGF 다중특이적 구축물인 TNFR2-Fc_VH#4를 소규모로 일시적 발현시키고 단백질 A 컬럼 정제하여 각각 36.6 및 79.9 mg L^-1의 산출량을 얻었다.

보다 큰 배치의 TNFR2-Fc_VH#4를 다음과 같이 생성하였다. 대규모 형질감염(최대 6 L)으로부터의 조 배양 수확물을 심층 여과를 이용하여 여과하였고, 이를 완충제 A(인산염 완충 식염수 pH 7.2)로 미리 평형화한 1.6 x 20 cm 단백질 A 아가로스 컬럼(GE Healthcare)에 로딩하였다. 이어서, 컬럼을 완충제 A로 세척하고, 생성물을 완충제 B (50 mM 소듐 아세테이트 pH <4.0)의 단계 구배로 용출시켰다. 생성물을 완충제 C(50 mM 소듐 아세테이트 완충제 pH<5.5)에서 미리 평형화한 1.6 x 20 cm Poros HS 50 컬럼(Applied Biosystems)에 로딩함으로써 추가로 정제하고, 완충제 C에서 세척한 다음, 후속적으로 생성물을 50 mM 소듐 아세테이트 완충제 pH <5.5에서 0 내지 1 M NaCl의 선형 구배로 용출시켰다. 생성된 용출액을 크기 배제 HPLC에 의해 분석하였다. 1.36의 계산된 흡광 계수를 이용하여 Beckman DU520 분광광도계로 A280 분광분석함으로써 단백질 농도를 결정하였다.

TNFR2-Fc_VH#4의 특성화 방법

표준 프로토콜을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 제조업체의 지시에 따라 Xcell SureLock™ 시스템(Invitrogen)을 이용하여 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(Life Technologies) 상으로 옮겼다. 이 막을 실온에서 1시간 동안 인산염 완충 식염수(PBS)에서 3% (w/v) 탈지 분유로 차단시켰다. HRP 접합된 항-인간 IgG Fc-특이적 항체(Sigma)를 이용하는 표준 프로토콜을 사용하여 웨스턴 블롯을 전개하였다.

1 ml/min의 유속으로 D-PBS(life Technologies)의 이동상을 수반한 Phenomenex BioSep-SEC-S3000(300 x 7.8 mm) 컬럼이 장착된 Gilson HPLC 시스템(동용매 펌프-307, UV/Vis-151 검출기, 액체 핸들러-215 및 주사 모듈-819)을 이용하여 크기 배제 HPLC를 수행하였다. 25 μL의 샘플을 컬럼 상으로 주사하고, 단백질 종의 분리를 A280 nm 하에 모니터링하였다.

소규모로 정제된 TNFR2-Fc_VH#4의 효소적 탈글리코실화를 제조업체의 프로토콜에 따라 EDGLY 키트(Sigma Aldrich)를 이용하여 수행하였다. 단백질을 변성 조건과 자연 조건 둘 다 하에 탈글리코실화하였다. 변성 단백질의 경우, 30 μg의 단백질을 37℃에서 3시간 동안 PNGase F, O-글리코시다제 및 α-(2→3, 6, 8, 9)-뉴라미니다제, β-N-아세틸글루코사미니다제 및 β-(1→4)-갈락토시다제로 탈글리코실화하였다. 자연 조건 하에서는, 35 μg의 단백질을 37℃에서 3일 동안 상기와 동일한 세트의 효소를 이용하여 탈글리코실화하였다. 탈글리코실화된 단백질을 쿠마시 염색된 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 표준 분석 프로토콜을 이용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.

TNFR2-Fc_VH#4의 N-말단 아미노산 서열 분석을 다음과 같이 수행하였다. 대략 2 μg의 TNFR2-Fc_VH#4를 표준 프로토콜을 이용하여 SDS-PAGE 겔 상에서 전개하였다. 제조업체의 지시에 따라 Xcell SureLock™ 시스템(Invitrogen)을 이용하여 단백질을 PVDF 막 상으로 옮겼다. 이 막을 오비탈 진탕 플랫폼 상에서 대략 15분 동안 0.1% (w/v) 아미도블랙으로 염색한 다음 dH₂O로 세척하여, PVDF 막의 배경 염색을 감소시켰다. 막을 N-말단 서열 분석 전에 공기 건조시켰다. 관심 밴드를 커팅하고, 다중특이적 결합 분자의 N-말단의 서열 결정을 Applied Biosystems 140A 마이크로 HPLC를 이용하여 온라인 페닐티오히단토인 분석과 함께 Applied Biosystems 494 HT 서열 분석기(Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코) 상에서 수행하였다.

특성화 결과

정제된 TNFR2-Fc_VH#4 및 TNFR2-Fc 단백질을 응집체, 단량체 및 단백질 단편화의 수준에 대해 SEC-HPLC에 의해 프로파일링하였다(도 2의 A 및 B). 전체 단백질의 약 90%를 구성하는 단량체를 포함하는 주요 피크는 고차 종 또는 응집체의 존재를 나타내는 더 낮은 컬럼 체류 시간을 갖는 단백질 질량의 나머지 약 10%와 함께 존재한다. 그러나 SEC-HPLC로부터의 단량체 피크에는 이러한 피크 내의 단백질이 단일 종이 아님을 나타내는 2개의 확연한 어깨 모양이 있었다. 쿠마시 염색을 이용한 SDS-PAGE 분석 결과, 환원 조건 하에 (대략 100 및 75 kD에서) TNFR2-Fc_VH#4에 대한 2개의 별개의 밴드가 나타났고, 유사하게 (대략 70 및 45 kD에서) TNFR2-Fc 융합 단백질에 대한 2개의 별개의 밴드가 또한 나타났다(도 2의 B). 비환원 조건 하에서, TNFR2-Fc_VH#4에 대한 3개의 주요 밴드가 (150 kD와 250 kD 사이에) 존재하였고, TNFR2-Fc 융합 단백질에 대해서는 1개의 주요 밴드와 1개의 작은 밴드가 각각 대략 150 kD와 120 kD에 존재하였다. 환원 조건 하에 두 밴드 간의 분자 질량 차이가 scFv 단편의 크기(대략 26.5 kD)와 대략 동일했기 때문에, 다중특이적 결합 분자가 생성되는 형태를 이해하기 위해 추가 분석을 수행하였다. 자연 조건 하의 질량 분광 분석은 SDS-PAGE 데이터를 확인했으며, 두 개의 분리된 정제 단백질 제제에 대해 약 125, 152 및 176 kD에서 정제된 TNFR2-Fc_VH#4 제제에 존재하는 3개의 분자 질량이 있음을 확인했다(도 2의 C).

SDS-PAGE 겔에 의해 관찰된 밴딩 패턴이 TNFR2-Fc_VH#4의 차등적인 글리코실화로 인한 것인 경우, 탈글리코실화 시 이것은 다시 단일 밴드로 분해될 것이다. 그러나 TNFR2-Fc_VH#4가 자연 단백질로서 또는 변성 단백질로서 탈글리코실된 경우, 환원 조건 및 비환원 조건 하에서 밴딩 패턴은 유지되었다(데이터는 제시되지 않음). 글리코실화 TNFR2-Fc_VH#4와 탈글리코실화 TNFR2-Fc_VH#4를 다클론성 항-인간 IgG Fc 특이적 항체로 웨스턴 블롯 염색한 결과, 전장의 예상 밴드와 보다 낮은 분자 질량의 밴드가 항-Fc 특이적 항체와 반응성인 것으로 나타났다(데이터는 제시되지 않음).

단백질의 N-말단 아미노산을 서열 분석함으로써, 절단된 생성물을 최종 확인하였다. 그 결과, 절단된 단백질의 N-말단의 처음 8개 아미노산이 TNFR2-Fc_VH#4 서열(서열번호 14)의 아미노산 176 내지 183에 상응하는 SMAPGAVH인 것으로 밝혀졌다. 이는 TNFR2-Fc_VH#4의 N-말단의 175개 아미노산 절단물을 나타냈는데, TNFR2 도메인의 42개 아미노산만이 남게 되었다. 이로써, 본 발명자들은 SDS-PAGE, 질량 분광분석법 및 SEC-HPLC 분석으로부터 질량 데이터를 정확하게 해석할 수 있었다. TNFR2-Fc_VH#4 이량체의 3가지 가능한 조합이 있었고, 이들 모두는 정제된 단백질 제제에 존재하였다: (1) 전장의 동종이량체, (2) 전장 종과 절단된 종의 이종이량체 및 (3) 절단된 종의 동종이량체. 시험관내 및 생체내에서의 생물학적 활성을 정확하게 측정하기 위해, 전장 동종이량체의 제제를 2단계 컬럼 크로마토그래피 공정에 의해 생성하였다. 첫 번째 단계에서, 단백질 A 정제 후, 생성물은 80.5%의 단량체를 함유하였고(도 3a), 두 번째 컬럼 정제 단계(SP 세파로스) 후에는 단량체 비율이 97.8%였다(도 3b). 전체 공정에 걸친 수율은 7.3%였다.

실시예 2 - 시차 주사 열량측정법(DSC)에 의한 열 안정성 분석

자동화 MicroCal VP-모세관 DSC(GE Healthcare, 미국)를 열량 측정에 사용하였다. 단백질 샘플을 25 mM 히스티딘/히스티딘-HCl 완충제 pH 6.0에서 1 mg/mL으로 테스트하였다. 단백질 샘플과 완충제에 시간당 95℃의 속도로 25℃에서 100℃까지의 선형 열 램프를 적용하였다. Origin 7 소프트웨어를 이용하여 완충제를 단백질 샘플로부터 참조물질로서 공제하고, 열 전이를 결정하였다.

TNFR2-Fc_VH#4에 대한 써모그램(도 4)은 64, 67, 및 84℃의 변성 온도(Tm)를 이용한 3개의 뚜렷한 풀림 전이를 보여준다. 본 발명자들은 64℃의 Tm이 TNFR2 도메인과 항-NGF scFv 도메인 둘 다의 변성에 상응하고, 67℃ 및 84℃의 Tm은 각각 IgG1 CH2 및 CH3 도메인에 대한 전형적인 변성 Tm이라고 추론하였다(예를 들어, Dimasi, N., et al., J Mol Biol. 393:672-92 (2009) 및 PCT 공개 번호 WO 2013/070565). 이론에 구애됨을 바라지 않지만, scFv는 일반적으로, 다른 항체 도메인보다 더 낮은 변성 온도를 가지며, 이들의 풀림은 단일 전이 사건을 특징으로 한다(Roberge et al., 2006, Jung et al., 1999, Tischenko et al., 1998).

실시예 3 - TNFR2-Fc_VH#4에 대한 항원 결합의 확인

A. ELISA에 의한 단일 및 이중 항원 결합

Nunc Maxisorp 웰을 4℃에서 밤새 PBS(pH 7.4) 중 5 μg ml^-1까지 희석된 TNFα(R&D Systems) 50 μl로 코팅하였다. 다음 날, 코팅 용액을 제거하고, 웰을 실온에서 1시간 동안 150 μl의 차단 완충제[3% 탈지유-PBS]로 차단시켰다. 웰을 PBS에서 3회 헹군 후, 차단 완충제에서 제조한 TNFR2-Fc_VH#4의 희석 계열 50 μl를 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 웰을 PBS-트윈(Tween) 20(0.1% v/v; PBS-T)에서 3회 세척하였다. 이어서, 50마이크로리터의 비오틴 부착된 NGF를 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 더 인큐베이션한 후, 위와 같이 세척하고 50 μl의 스트렙타비딘-HRP(1:100)를 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 웰을 PBS-T로 세척하고, 50 μl의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질을 첨가하고, 발색시켰다. 1M H₂SO₄를 첨가하여 반응을 중지시키고, 미세역가 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 생성된 데이터를 Prism 5 소프트웨어(GraphPad, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 이용하여 분석하였다. 단일 항원 결합 ELISA의 경우, 웰을 위와 같이 TNFα 또는 NGF-비오틴으로 코팅하고, 항-인간 IgG Fc 특이적 HRP 접합된 항체(1:5000)를 이용하여 항체 결합을 검출하였으며, 위와 같이 발색시켰다.

ELISA 결과는 도 5에 도시되어 있다. TNFR2-Fc_VH#4를 TNFα 항원과 NGF 항원 둘 다에 결합하도록 설계하였다. 단일 항원 결합은 먼저 하나의 항원을 96웰 미세역가 플레이트에 고정시킨 다음, TNFR2-Fc_VH#4의 일련의 희석물을 첨가하여 수행하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합된 항-IgG Fc 특이적 항체를 이용하여 특이적 결합을 검출하였다. 이중 항원 결합 ELISA의 경우, 첫 번째 항원인 TNFα를 ELISA 플레이트에 고정시킨 다음, TNFR2-Fc_VH#4의 일련의 희석물을 첨가한 후, 두 번째 비오틴 부착된 항원인 NGF를 고정된 농도로 첨가하였다. 이어서, HRP 접합된 스트렙타비딘을 이용하여 특이적 결합을 검출하였다. TNFR2-Fc_VH#4는 단일 항원 결합 ELISA에서 TNFα 및 NGF와 결합하였다(도 5의 A 및 B). 이중 항원 결합 ELISA에서, TNFR2-Fc_VH#4는 TNFα와 NGF 둘 다와 동시에 결합하였다(도 5의 C).

B. 표면 플라스몬 공명에 의한 동시 항원 결합

BIAcore 2000 기기(GE Healthcare)를 이용하여 본질적으로 Dimasi, N., et al., J Mol Biol. 393:672-92 (2009)에 기재된 바와 같이 동시 항원 결합 실험을 수행하였다. 간략하게 언급하면, CM5 센서 칩을 이용하여, 100 nM에서 대략 1,500 공명 단위의 TNFR2-Fc_VH#4를 고정시켰다. 이어서, TNFα와 NGF에 대한 병행 결합을 위해 상기 센서 칩 표면을 사용하였다. 항원은 HBS-EP 완충제[10 mM HEPES(pH 7.4), 150 mM NaCl, 3 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.005% P20]에서 제조하였다. 30 μl/min의 유속을 모든 결합 측정에 사용하였다. TNFα 및 NGF에 대한 다중특이적 항체의 동시 결합을 결정하기 위하여, 1 μM의 TNFα(분자 질량, 17.5 kD)를 센서 칩 표면 상에 주사하였고, 주사를 완료하면, TNFα와 NGF(분자 질량, 13.5 kD)의 혼합물을 둘 다 1 μM로 주사하였다. TNFα가 NGF와의 혼합물에 포함되어 NGF 결합 단계 중에 TNFα 해리로 인한 신호 손실을 방지하였다. 대조군으로서, 유사한 결합 과정을 수행하였고, 마지막 주사에서는 TNFα 만을 첨가하였는데, 이 주사에 대한 공명 단위의 추가적인 증가가 없었다는 것은 TNFα가 포화 수준으로 결합되었음을 나타낸 것이다. TNFα와 NGF의 주사 순서를 역전시킨 유사한 결합 및 대조군 실험을 수행하였다.

TNFR2-Fc_VH#4의 동시 항원 결합을 표면 플라스몬 공명으로 특성화하였다. 이러한 결합 사건을 순차적 방식으로 정성적으로 분석하였다. TNFR2-Fc_VH#4를 아민 커플링 화학을 이용하여 센서 칩 표면 상에 공유적으로 고정시켰다. 이어서, 첫 번째 항원을 주사하여 TNFR2-Fc_VH#4에 대한 포화 수준의 결합을 제공한 다음, 두 번째 항원을 항원 1과 등몰 혼합물로서 주사하였다. 결합 센서그램은 TNFR2-Fc_VH#4가 TNFα 및 NGF와 동시에 결합하였다는 사실을 명백하게 보여주었다(도 6). 두 항원의 동시 결합은 항원 주사 순서에 관계 없이 일어났다.

실시예 4 - NGF에 의해 유도된 TF-1 세포 증식의 억제

TF-1 세포(ECACC 카탈로그 번호 93022307)를 96웰 조직 배양 플레이트(Corning Costar) 내의 50 μl 혈청 비함유 배양 배지에서 1.5 x10⁴개 세포/웰로 시딩하고, 37℃ 및 5% CO₂ 하에 18시간 동안 인큐베이션하였다. 재조합 인간(Sigma) 또는 마우스 NGF(R&D Systems)를 96웰 둥근 바닥 플레이트(Greiner)에서 37℃에서 30분 동안 TNFR2-Fc_VH#4, MEDI-578 IgG1 TM YTE, MEDI-578에 대한 비결합 IgG1 TM YTE 이소형 대조군, 또는 비결합 이중특이적 이소형 대조군 R347 Bs3Ab의 희석물과 미리 인큐베이션하였다. 이어서, 50마이크로리터의 각 샘플을 세포 플레이트에 첨가하고, 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, 100 μl의 세포 TITRE GLO® 분석 완충제(Promega)를 첨가하고, 플레이트를 37℃ 및 5% CO₂에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 표준 발광 프로토콜을 이용하여 발광을 측정하였다. 항체의 부재 하에서의 표준 NGF 유도된 TF-1 증식이 도 7a에 도시되어 있다.

NGF 유도된 TF-1 증식을 이용하여 TNFR2-Fc_VH#4의 기능적 활성을 결정하였다. TNFR2-Fc_VH#4는 인간 및 뮤린 NGF 유도된 증식을 완전히 억제할 수 있었다(각각 도 7b 및 7c). 도 7b: TF-1 세포를 EC₈₀ 농도에 상응하는 재조합 인간 NGF로 자극하였다. 세포를 48시간 동안 일련의 항체 희석물을 수반한 리간드와 함께 인큐베이션한 후, 세포 TITRE GLO® 분석 완충제(Promega)와 함께 10분 동안 배양하여 세포 증식을 정량화하였다. 도 7c: TF-1 세포를 EC₈₀ 농도에 상응하는 재조합 뮤린 NGF로 자극하였다. 세포를 48시간 동안 일련의 항체 희석물을 수반한 리간드와 함께 인큐베이션한 후, 세포 TITRE GLO® 분석 완충제(Promega)와 함께 10분 동안 배양하여 세포 증식을 정량화하였다. 이들 데이터는 TNFR2-Fc_VH#4의 NGF 억제성 부분이 생물학적으로 활성이고, IgG1TM으로서의 MEDI-578과 유사한 효능으로 NGF 유도된 증식을 억제함을 입증한다. 유사한 데이터가 또한 TNFR2-Fc_varB 및 또 다른 TNF-NGF 다중특이적 결합 분자 엔디맙 var B에 대해 관찰되었다(도 7d 및 7e). 엔디맙 varB는 완전한 항-TNFα 항체, 즉 2개의 완전한 중쇄와 2개의 완전한 경쇄를 H₂L₂ 포맷으로 포함하는 항체를 포함하고, MEDI-578 scFv는 항-TNFα 항체의 중쇄의 C-말단과 융합된다. 엔디맙 varB의 경쇄는 서열번호 20에 제시되어 있고, 엔디맙 varB의 중쇄는 서열번호 22에 제시되어 있다.

실시예 5 - TNFα에 의해 유도된 U937 세포 아폽토시스의 억제

U937 세포(ECACC 카탈로그 번호 85011440)를 50 μl 배양 배지에서 8x10⁵개 세포/웰의 농도로 검은색 벽으로 된 96웰 조직 배양 플레이트(Corning Costar)에 플레이팅하였다. U937 세포를 EC₈₀ 농도에 상응하는 재조합 인간 TNFα로 자극하였다. 세포를 2시간 동안 일련의 항체 희석물을 수반한 리간드와 함께 인큐베이션한 후, 카스파제 3 분석 반응 완충제와 함께 2시간 동안 배양하여 카스파제 3 활성을 정량화하였다. TNFR2-Fc_VH#4, 비결합 이중특이적 이소형 대조군, R347 Bs3Ab 및 에타너셉트를 37℃에서 30분 동안 세포와 미리 인큐베이션하였다. 이어서, 50 μl 재조합 인간 TNFα(R&D Systems)를 첨가하여 20 ng/ml의 최종 분석 농도를 수득하였고, 이어서 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, 50 μl의 카스파제 3 분석 반응 완충제(0.2% w/v CHAPS, 0.5% v/v Igepal CA-630, 200 mM NaCl, 50 mM HEPES, 20 μM DEVD-R110 기질(Invitrogen))를 첨가하고, 세포를 37℃에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 475 nm 하에서의 여기 및 512 nm 하에서의 발광에 의해 형광을 측정하였다. TNFα 길항제의 부재 하에서의 카스파제 활성이 도 8a에 도시되어 있다.

U937 세포에서 TNFα 유도된 카스파제 3 활성 분석을 이용하여, TNFR2-Fc_VH#4의 기능적 활성을 결정하였다. TNFR2-Fc_VH#4는 에타너셉트와 마찬가지로 TNFα 유도된 카스파제 3 활성을 완전히 억제하였다(도 8b). 이는 TNFR2-Fc_VH#4의 TNFα 억제성 부분이 생물학적으로 활성이고 에타너셉트와 유사한 효능을 지니고 있음을 명백하게 예시한다. 유사한 데이터가 또한 TNFR2-Fc_varB 및 엔디맙 varB에 대해 관찰되었다(도 8c 참조).

실시예 6 - 생체내 분석

모든 생체내 과정을 영국 내무성 동물 (과학적 절차) 법률 (1986)에 따라 수행하였고, 이는 지역윤리위원회에 의해 승인되었다. 암컷 C57Bl/6 마우스(Charles River, 영국)를 내내 사용하였다. 마우스를 12시간 명/암 주기(07:00~19:00에 명) 하에 먹이와 물에 자유롭게 접근할 수 있는 개별 환기 케이지(IVC)에 케이지당 5/6마리씩 무리지어 사육하였다. 사육실과 처치실을 24℃로 유지시키고, 종래의 무선국을 통해 일정한 배경 소음을 유지시켰다. 각 연구의 시작하기 적어도 5일 전에 식별 목적으로 모든 마우스에게 마취(산소 중 3% 이소플루란) 하에 트랜스폰더의 삽입을 진행하였다.

A. 신경병성 통증의 Seltzer 모델

아날지세미터(analgysemeter)를 이용하여 기계적 통각과민증을 결정하였다(Randall LO, Selitto JJ, Arch Int Pharmacodyn Ther. 111:409-19 (1957)) (Ugo Basile). 철수 반응이 관찰될 때까지 차례로 각 뒷발의 등면에 증가하는 힘을 가하였다. 이 시점에서 힘을 더이상 가하지 않고, 중량(그램)을 기록하였다. 동측 및 대측 발에 대한 데이터를 철수 임계값(그램)으로 표시하였다. 기준선 판독치의 확립 후, 마우스를 대략적으로 동등한 동측/대측 비율을 갖는 2개 군으로 나누고 수술을 진행하였다. 마우스를 3% 이소플루란으로 마취시켰다. 그 후, 왼쪽 좌골 신경의 대략 1 cm를 허벅지 중간 정도의 절개를 통해 평활하게 해부하여 노출시켰다. 그런 다음, 봉합사(10/0 Virgin Silk: Ethicon)를 제3 등 신경을 통과시키고 단단히 묶었다. 접착제를 사용하여 절개를 밀봉하고, 마우스를 시험 개시 전에 적어도 7일 동안 회복시켰다. 샴 수술 마우스도 동일한 프로토콜을 거쳤지만 신경의 노출 후 상처를 접촉하고 회복시켰다. 마우스를 수술 후 7일 및 10일째에 통각과민에 대해 시험하였다. 10일째 시험한 후, 수술한 마우스를 추가로 여러 군으로 세분하였는데, 이들 군에게는 CAT251 IgG1 이소형 대조군(0.03 mg/kg s.c.), 에타너셉트(0.01 mg/kg s.c.), MEDI-578(0.03 mg/kg s.c.) 또는 에타너셉트(0.01 mg/kg s.c.)와 MEDI-578(0.03 mg/kg s.c.)의 조합물을 투여하였다. 샴 수술 마우스 모두에게 CAT251(0.03 mg/kg s.c.)을 투여하였다. 투여 후 4시간, 1일, 2일, 3일, 4일 및 7일에 기계적 통각과민증을 측정하였다.

기계적 통각과민증 모델에서 에타너셉트와 MEDI-578을 공동 투여하자 샴 수술한 대조군과 비교하여 수술 후 10일에 동측/대측 비율이 상당히 감소한 것으로 나타났다(도 9). 단일 용량의 에타너셉트(0.01 mg/kg s.c.) 또는 MEDI-578(0.03 mg/kg s.c.)의 투여는 이러한 통각과민증을 상당히 역전시키지 못하였다. 에타너셉트(0.01 mg/kg s.c.)를 MEDI-578(0.03 mg/kg s.c.)과 함께 공동 투여하자 용량 후 4시간에서 기계적 통각과민증이 상당히 역전되었고, 그 효과는 용량 후 7일까지 지속적으로 유지되었다.

두 번째 연구에서는, TNFR2-Fc_VH#4의 효과를 평가하였다. 기계적 통각과민증을 확립한 후, 수술 후 13일째에 마우스에게 R347 Bs3Ab 이소형 대조군(0.03 mg/kg s.c.), 에타너셉트(0.01 mg/kg s.c.), MEDI-578(0.03 mg/kg s.c.) 또는 TNFR2-Fc_VH#4(0.01 mg/kg 또는 0.03 mg/kg s.c.)를 투여하였다. 샴 제조된 동물에게는 R347 Bs3Ab 이소형 대조군(0.03 mg/kg s.c.)을 투여하였다. 마우스를 대상으로 하여 전술한 바와 같이 투여 후 4시간 및 용량 후 1, 2, 4 및 7일째에 기계적 통각과민증에 대해 시험하였다.

TNFR2-Fc_VH#4를 투여하자 샴 수술 대조군과 비교하여 수술 후 10일째에 동측/대측 비율이 상당히 감소되었다(도 10a). 에타너셉트(0.01 mg/kg s.c.) 또는 MEDI-578(0.03 mg/kg s.c.)의 투여는 기계적 통각과민증을 상당히 역전시키지 못하였다. 그러나 TNFR2-Fc_VH#4(0.01 및 0.03 mg/kg s.c.)의 투여로 용량 후 4시간에서 기계적 통각과민증이 상당히 역전되었고, 그 효과는 용량 후 6일까지 지속적으로 유지되었다. R347 대조군 Bs3Ab를 투여한 후에는 어떠한 효과도 관찰되지 않았다. TNFR2-Fc_varB를 투여한 경우에 유사한 데이터가 관찰되었다(도 10b 참조). 이러한 데이터는 TNFR2-Fc_VH#4가 극히 낮은 용량에서 통증을 상당히 역전시킬 수 있음을 시사하는데, MEDI-578 또는 에타너셉트 단독을 이용한 경우에는 동등한 용량이 효과가 없거나 또는 최소한으로 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.

B. 만성 관절 통증 모델

마우스 무능력 시험기(Linton Instrumentation)를 이용하여 기계적 과민증을 결정하였다. 마우스의 뒷발을 장치 내의 별도의 센서에 올려놓고, 4초에 걸쳐 체중 분포도를 계산하였다. 데이터는 동측 및 대측 체중 부하(그램)의 비율로서 표시하였다.

기준선 판독치의 확립 후, 마우스를 대략적으로 동등한 동측/대측 비율을 갖는 2개 군으로 나누었다. 다음 기술을 이용하여 관절내 주사를 수행하였다: 산소 중 3% 이소플루란을 이용하여 동물을 마취시키고, 왼쪽 무릎을 면도한 다음 깨끗하게 하였다. 100 μl 해밀톤 주사기에 장착된 25게이지 바늘을 이용하여 각 마우스의 무릎 관절에 10 μl의 프로인트 완전 아주반트(FCA)(10 mg/ml) 또는 비히클(경질 미네랄 오일)을 주사하였다. 주사는 무릎 관절의 활막 공간 내로 직접 수행하였다. 마우스를 회복시킨 다음, 전술한 바와 같이 주사 후 7일 및 10일째에 기계적 과민증의 변화에 대해 시험하였다. 10일째 시험한 후, FCA 처리된 마우스를 추가로 무작위로 여러 군으로 배정하였고, 13일째에 마우스에게 에타너셉트(0.01 mg/kg i.p.) 또는 비히클을 투여한 후, 일정 용량의 MEDI-578(0.03 mg/kg i.v.) 또는 CAT251 이소형 대조군(0.03 mg/kg i.v.)을 투여하였다. 마우스를 대상으로 하여 전술한 바와 같이 투여 후 4시간 및 용량 후 1, 2, 4 및 7일째에 기계적 과민증에 대해 시험하였다.

염증성 통증의 관절내 FCA 모델을 이용하여 에타너셉트와 MEDI-578의 공동 투여 효과를 평가하였다. FCA를 관절내 투여하자 기계적 과민증이 유발되었는데, 이는 비히클 대조군과 비교하여 7일 및 10일째에 동측/대측 비율의 상당한 감소로써 분명히 나타났다(도 11). 전처리 기준선 수준과 비교하여 샴 처리군에서는 동측/대측 비율상의 감소가 전혀 관찰되지 않았다. 에타너셉트(0.01 mg/kg i.p.) + CAT251(0.03 mg/kg i.v.) 또는 PBS(10 ml/kg i.p.) + MEDI-578(0.03 mg/kg i.v.)를 투여하자 용량 후 4시간 및 용량 후 1, 2, 4 및 7일째에 FCA 유도된 기계적 과민증이 약간 역전되었지만, 통계상 유의적 수준에 도달하지는 못하였다. 그러나 에타너셉트(0.01 mg/kg i.p.) + MEDI-578(0.03 mg/kg i.v.)을 투여하자 용량 후 모든 시험 시간에서 FCA 유도된 기계적 과민증이 상당히 역전되었다.

두 번째 연구에서는, TNFR2-Fc_VH#4의 효과를 평가하였다. FCA 유도된 기계적 과민증을 확립한 후, FCA 투여 후 13일째에 마우스에게 R347 Bs3Ab 이소형 대조군(0.01 mg/kg s.c.), 에타너셉트(0.01 mg/kg s.c.), MEDI-578(0.01 mg/kg s.c.) 또는 TNFR2-Fc_VH#4(0.003 mg/kg 또는 0.01 mg/kg s.c.)를 투여하였다. 다시 마우스를 대상으로 하여 전술한 바와 같이 투여 후 4시간 및 용량 후 1, 2, 4 및 7일째에 기계적 과민증에 대해 시험하였다.

에타너셉트 및 MEDI-578의 개별적인 효과와 비교한 TNFR2-Fc_VH#4 ("이중특이적")의 효과가 도 12에 도시되어 있다. 에타너셉트(0.01 mg/kg s.c.) 또는 MEDI-578(0.01 mg/kg s.c.) 중 어느 것도 용량 후 임의의 시점에서 FCA 유도된 기계적 과민증을 상당히 역전시키지 못하였다. 그러나 TNFR2-Fc_VH#4를 투여하자 FCA 유도된 기계적 과민증이 상당히 역전되었다. 더 높은 용량의 TNFR2-Fc_VH#4(0.01 mg/kg s.c)는 연구 기간 동안 상당한 활성을 나타낸 반면, 더 낮은 용량(0.003 mg/kg s.c.)은 용량 후 1일째에 유의적 수준에 도달하였고, 연구 기간 동안 더 높은 용량과 유사한 수준을 유지하였다.

C. 랫트에서 기계적 과민증의 확립된 FCA 유도된 모델

프로인트 완전 아주반트(FCA)의 발바닥내 주사는 과민증과 부종을 유도하는 염증성 반응을 유발하고, 임상 염증성 통증의 일부 양태를 모방한 것이다. 체중 부하를 측정하는 장치를 이용하여 이러한 효과를 조사할 수 있다. 체중 부하 방법을 이용한 FCA 유도된 과민증에 대한 TNFR2-Fc_VH#4의 잠재적 항-통각과민 특성의 평가. 나이브 랫트는 두 뒷발 사이에 체중을 균등하게 분배한다. 그러나 주사된(왼쪽) 뒷발에 염증이 있고/있거나 통증이 있는 경우, 발병한 발에 적은 중량이 가해지도록(손상된 발의 중량 부하를 저하시키기 위함) 중량을 재분배한다. 각 뒷다리를 통한 중량 부하를 랫트 무능력 시험기(Linton Instruments, UK)를 사용하여 측정한다. 무능력 시험기에서 랫트의 뒷발을 별도의 센서에 배치하고, 두 뒷다리 모두에 의해 가해지는 평균 힘을 4초에 걸쳐 기록한다.

이 연구를 위해, 나이브 랫트(수컷, Sprague Dawley 랫트(할런(Harlan), 영국 소재), 198 내지 258 g)를 자신의 홈 케이지 내에 있는 처치실에 순응시켰다(먹이와 물은 무제한으로 이용 가능함). 수 일에 걸쳐 무능력 시험기에 대한 습관화를 수행하였다. 상처를 유도하기 전에, 기준선 체중 부하를 기록하였다. 왼쪽 뒷발 내로 FCA(Sigma로부터 입수 가능함, 100 μl의 1 mg/ml 용액)를 발바닥내 주사하여 염증성 과민증을 유도하였다. FCA 후 23시간째에 과민증을 평가하기 위하여 전처리 체중 부하를 측정하였다.

이어서, 라틴 정방 설계에서 체중 부하 FCA 창에 따라 동물의 등급을 매기고 처리군으로 무작위 배정하였다. FCA 주사 후 24시간째에, 동물에게 TNFR2-Fc_VH#4("이중특이적")를 0.003, 0.01, 0.03, 0.3, 및 3 mg/kg으로 정맥내 투여하거나, 음성 대조군 항체인 NIP228(합텐 니트로페놀과 결합하기 위해 생성된 항체)을 3 mg/kg으로 정맥내 투여하거나, 비히클(1% 메틸셀룰로스)을 2 ml/kg으로 경구 투여하거나, 또는 인도메타신을 10 mg/kg으로 경구 투여하였다.

항체/약물 처리 후 4 및 24시간째에 체중 부하를 평가하였다. 각 시점에서 처리군을 비히클 대조군과 비교하여 데이터를 분석하였다. 통계 분석은 반복 측정 ANOVA에 이어, InVivoStat(invivostat.co.uk)를 사용하여 계획된 비교 검정을 포함하였다(p<0.05는 유의한 것으로 간주). 결과는 표 13에 제시되어 있다. 4시간 및 24시간째에 인도메타신(10 mg/kg)을 이용한 경우에 과민증의 상당한 역전이 관찰되었다. 0.3 및 3 mg/kg으로 투여된 TNFR2-Fc_VH#4는 4시간 및 24시간에서 과민증의 상당한 역전을 나타냈고, 0.003 및 0.03 mg/kg으로 투여된 TNFR2-Fc_VH#4는 또한 과민증의 상당한 역전을 나타냈지만, 그 효과는 24시간에서만 나타났다. 이소형 대조군인 NIP228은 어떠한 시점에서도 FCA 반응에 대한 유의한 효과를 나타내지 않았다.

실시예 7 - TNFα 및 NGF에 의한 p38 인산화

문헌은 p38 인산화가 신경병성 통증의 발달에 중요한 역할을 한다고 제안한다. 예를 들어, p38 억제제를 이용한 치료는 보존된 신경 손상 모델(Wen YR et al., Anesthesiology 2007, 107:312-321) 및 좌골 염증성 신경병증 모델에서 신경병성 통증 증상의 발달을 예방하는 것으로 나타났다. 본 실험에서는, p38 인산화에 대한 TNFα, NGF 및 TNFα와 NGF의 조합물의 역할을 세포 배양 분석에서 조사하였다. 간략하게 언급하면, 뉴로스크린-1 세포(PC-12 랫트 신경내분비 세포의 서브클론)를 증가량의 TNFα, NGF 또는 TNFα와 NGF의 조합물과 함께 인큐베이션하였다. 20분의 인큐베이션 기간 후, 균질한 시간 분해 형광(HTRF) 분석(Cisbio)을 이용하여 포스포-p38을 정량화하였다.

HTRF 분석: TNFα, NGF, 또는 TNFα와 NGF의 조합물로 자극한 후, 세포 상층액을 신속하게 제거하고 세포를 용해 완충액에 용해시켰다. 다음의 2가지 상이한 특이적 항체를 이용하여 샌드위치 분석 포맷으로 용해물에서 포스포-p38 MAPK(Thr180/Tyr182)를 검출하였다: 유로퓸 크립테이트(공여자 형광단)와 접합된 항-포스포-p38 항체 및 d2(수용자 형광단)와 접합된 항-p38(전체) 항체. 항체를 세포 용해물과 함께 인큐베이션하고, EnVision Multilabel 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 이루어진 665 nm 및 620 nm에서의 형광 측정치로부터 HTRF 비율을 계산하였다.

데이터는 665 nm에서의 발광과 620 nm에서의 발광 사이의 비율로서 계산되는 HTRF 비율로서 제시된다. 포스포-p38 반응으로부터의 HTRF 비율을 나타내는 열 지도가 도 14에 도시되어 있다. TNFα, NGF 또는 TNFα와 NGF의 조합물의 효과를 보여주는 용량 반응 곡선이 도 15에 도시되어 있다. 도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 포스포-p38에 대한 더 높은 농도의 TNFα와 NGF의 조합 효과는 어느 하나의 인자 단독에 의해 유도된 포스포-p38 신호의 예측되는 합보다 더 크다. 이들 데이터는 TNFα와 NGF가 함께 작용하여 p38 인산화를 유도할 수 있으며 두 가지 경로가 통증을 유도하는 분자 신호전달에 연루될 수 있다는 점을 시사한다.

실시예 8 - TNFα 및 NGF에 의한 ERK 인산화

p38과 마찬가지로, ERK 또한 신경병성 통증 발생 동안 활성화된다(Zhuang ZY et al., Pain 2005, 114:149-159). 본 실험에서는, ERK 인산화에 대한 TNFα, NGF 및 TNFα와 NGF의 조합물의 역할을 세포 배양 분석에서 조사하였다. 간략하게 언급하면, 뉴로스크린-1 세포(PC-12 랫트 신경내분비 세포의 서브클론)를 증가량의 TNFα, NGF 또는 TNFα와 NGF의 조합물과 함께 인큐베이션하였다. 20분의 인큐베이션 기간 후, HTRF 분석(Cisbio)을 이용하여 포스포-ERK를 정량화하였다.

HTRF 분석: 자극 후, 세포 상층액을 신속하게 제거하고 세포를 용해 완충액에 용해시켰다. 다음의 2가지 상이한 특이적 항체를 이용하여 샌드위치 분석 포맷으로 용해물에서 포스포-ERK MAPK(Thr202/Tyr204)를 검출하였다: 유로퓸 크립테이트(공여자 형광단)와 접합된 항-포스포-ERK 항체 및 d2(수용자 형광단)와 접합된 항-ERK(전체) 항체. 항체를 세포 용해물과 함께 인큐베이션하고, EnVision Multilabel 플레이트 판독기(Perkin Elmer)를 이용하여 이루어진 665 nm 및 620 nm에서의 형광 측정치로부터 HTRF 비율을 계산하였다.

데이터는 665 nm에서의 발광과 620 nm에서의 발광 사이의 비율로서 계산되는 HTRF 비율로서 제시된다. 포스포-ERK 반응으로부터의 HTRF 비율을 나타내는 열 지도가 도 16에 도시되어 있다. TNFα, NGF 또는 TNFα와 NGF의 조합물의 효과를 보여주는 용량 반응 곡선이 도 17에 도시되어 있다. 도 17에서 알 수 있는 바와 같이, 낮은 양의 TNFα 단독은 포스포-ERK를 유도하지 않았지만, 더 높은 양은 NGF 유도된 포스포-ERK를 증진시켰다. 이들 데이터는 TNFα와 NGF가 함께 작용하여 p38 인산화를 유도할 수 있으며 두 가지 경로가 통증을 유도하는 분자 신호전달에 연루될 수 있다는 점을 시사한다.

실시예 9 - 통증성 무릎 골관절염이 있는 인간에서 TNFR2-Fc_varB의 상이한 용량의 효과

다기관, 무작위, 이중 맹검, 위약 대조, 인터리빙된 단일 상승 용량(SAD) 및 다중 상승 용량(MAD) 연구가 통증성 무릎 골관절염이 있는 18~80세의 대상체를 대상으로 설계되었다. SAD 코호트 1에는 TNFR2-Fc_varB를 투여받는 3명의 환자와 위약을 투여받는 2명의 환자가 포함되었다. SAD 코호트 2~7은 각각 8명의 환자를 포함하였는데, 각 코호트에서 6명은 TNFR2-Fc_varB를 투여받았고 각 코호트에서 2명은 위약을 투여받았다. MAD 코호트 8 및 9은 각각 18명의 환자를 포함하였는데, 각 코호트에서 12명은 TNFR2-Fc_varB를 투여받았고 각 코호트에서 6명은 위약을 투여받았다. MAD 코호트 10 및 11은 각각 12명의 환자를 포함하였는데, 각 코호트에서 9명은 TNFR2-Fc_varB를 투여받았고 각 코호트에서 3명은 위약을 투여받았다. 연구 설계의 단순화된 레이아웃이 도 18a 및 18b에 제공된다.

SAD 코호트의 대상체는 이중 맹검 방식으로 TNFR2-Fc_varB 또는 위약의 단일 주입을 받았다. 퇴원 후 대상체는 추적 기간이 끝날 때까지 24시간의 회상을 반영하기 위해 매일 아침 거의 같은 시간에 11점 NRS(0~10)로 통증을 기록하도록 지시받았다.

놀랍게도, 2 내지 1000 μg/kg 용량 범위의 TNFR2-Fc_varB의 단일 정맥내 용량은 위약에 비해 0.69 내지 3.45점만큼 일일 평균 통증 점수를 (최고 효과에서) 역전시키는 것으로 나타났다(도 19a~19b). 이 효과는 50, 250 및 1000 μg/kg 용량에서 통계적으로 유의하다(p< 0.01). 이 효과의 지속시간은 놀랍게도 TNFR2-Fc_varB의 반감기(3~4일)에 비해 10일 넘게 지속되었다. 위약을 투여받은 대상체의 통증 점수 감소는 약 0.5점인 것으로 보인다. 이 위약 효과는 상대적으로 낮고 안정적으로 나타난다.

웨스턴 온타리오 및 맥마스터 대학교 골관절염 지수(WOMAC)는 OA 대상체의 만성 통증으로 인한 기능 손상을 측정하기 위한 설문지 기반 도구이다. 놀랍게도, 0.3 내지 1000 μg/kg 범위의 용량에서 TNFR2-Fc_varB의 단일 투여는 10+일의 기간에 걸쳐 평균 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 약 3점까지 상당히 감소시켰다(도 20a~20b). 50, 250 및 1000 μg/kg 용량에서 통증 하위 척도 점수의 최대 역전은 2.0~2.9 범위이며 p 값이 0.06 이하로 통계적으로 유의하다. 통증 NRS 종점과 마찬가지로, 단일 용량 후 효과 지속기간(약 10+일)은 반감기가 3~4일인 분자에 대해 예측된 것보다 길었다. 최고 효과는 각각 50 및 250 μg/kg의 용량에서 46~55%의 유리 NGF의 측정된 억제에 상응하였다(도 21).

말초에서 유리 NGF 수준에 대한 TNFR2-Fc_varB의 효과는 Singulex Erenna 분석을 사용하여 결정하였다. 간략하게는, 용량 전, 용량 후 1, 8 및 24시간, 8, 15, 22, 29일(2개의 가장 높은 용량에 대해서만 43일 및 56일) 시점에 각 대상체로부터 혈액 샘플을 채취했다. 다음 단계에 따라 혈장 샘플을 준비하고 분석했다: (1) 샘플을 항 NGF mAb 코팅된 자기 비드와 혼합, (2) 포획된 NGF 자기 비드 복합체를 형광 표지된 항-인간 NGF 항체와 혼합, (3) 형광 표지를 방출하기 위한 비드 복합체의 용출, (4) Erenna 형광 판독기에서 형광 신호 판독. 유리 NGF의 억제를 계산하고, TNFR2-Fc_varB의 각각의 농도에서 용량 후 14일의 기간에 걸친 평균 억제를 계산하고 플롯팅하였다(도 22). 14일 동안 유리 NGF의 평균 억제 범위는 0(0.3 μg/kg) 내지 약 65%(1000 μg/kg)였다.

말초에서 총 NGF 수준에 대한 TNFR2-Fc_varB의 효과는 Q2 Solutions에서 개발한 LC-MS/MS 분석을 사용하여 결정하였다. 간략하게는, 용량 전, 용량 후 1, 8 및 24시간, 8, 15, 22, 29일(2개의 가장 높은 용량에 대해서만 43일 및 56일) 시점에 각 대상체로부터 혈액 샘플을 채취했다. Neubert et al., 2013, Anal. Chem., 85:1719-1726에 기재된 것과 유사한 방식으로 혈액 샘플을 제조하고 분석하였다. SAD 코호트 1~4(0.3~50 μg/kg)의 각 대상체에 대해 총 NGF 수준의 증가를 계산하고 플로팅하였으며, 코호트 1~7 각각에 대해 평균 총 NGF 수준을 계산하였다. TNFR2-Fc_varB의 단일 투여의 증가된 용량 후 총 NGF 수준의 명확한 증가가 관찰되었다(도 23; 표 2). 이론에 구애됨을 바라지 않지만, 증가는 NGF의 반감기가 현재 결합된 TNFR2-Fc_varB의 반감기와 일치하게 증가하기 때문일 수 있다.

[표 2]

TNFR2-Fc_varB을 이용한 치료 후 말초에서 총 NGF의 평균 수준

각 코호트에서 2명의 대상체에 대한 총 NGF의 명백한 증가가 없었다는 점에 유의해야 한다. 이 출원의 제출 당시 연구가 맹검 상태로 남아 있기 때문에, 이들이 위약 샘플이라는 예측이 있다. 코호트 3 및 4의 경우, 항약물 항체의 총 NGF 수준에 대한 명백한 효과가 관찰되었다. 이 효과는 TNFR2-Fc_varB 노출 감소와 이에 따른 효과 지속시간 단축으로 인한 것 같았다.

TNFα 수준의 수준 측정을 위한 대용물로서, CXCL-13 수준은 Simoa 플랫폼 기술을 이용하여 측정할 수 있다. CXCL-13 유전자 발현은 림프독소 알파 경로에 의해 조절된다. TNFR2-Fc_varB는 TNFα 및 림포톡신 알파에 결합하며, 따라서 CXCL-13 발현 수준에 영향을 미치는 것으로 가정되었다. 용량 전, 용량 후 1, 8 및 24시간, 8, 15, 22, 29일(2개의 가장 높은 용량에 대해서만 43일 및 56일) 시점에 각 대상체로부터 혈액 샘플을 채취했다. 혈청 샘플을 준비한 다음 Simoa CXCL-13 분석에서 분석했다. 증가하는 단일 용량의 TNFR2-Fc_varB를 투여한 후 관찰된 CXCL-13 수준의 억제 증가로 명확한 용량 반응이 관찰되었다(도 24).

정맥내로 투여된 TNFR2-Fc_varB의 혈청 수준은 단일 상승 용량 후 다양한 시간 간격으로 결정되었다. TNFR2-Fc_varB의 관찰된 혈청 약동학은 모든 코호트가 노출되었고, 평균적으로 용량 의존적 방식으로 노출이 증가했음을 나타냈다(도 25). 도 25는 피하 투여가 10일 이상 동안 비교적 안정적인 혈청 수준의 TNFR2-Fc_varB를 제공했음을 보여준다.

피하 투여를 통한 절대 생체이용률은 표 3에 제시된 바와 같이 TNFR2-Fc_varB의 50 μg/kg 정맥내 투여 대비 단일 용량의 50 μg/kg 피하 투여로부터의 곡선 아래 면적(AUC)의 기하 평균값(n=6)을 비교하여 계산하였다. TNFR2-Fc_varB의 피하 투여의 생체이용률은 놀랍게도 낮은 것으로 밝혀졌으며 21%로 추정되었다. 표 3a에 제시된 바와 같이, 추정된 절대 생체이용률 값에 대한 90% 신뢰 구간은 0.1627 내지 0.2781이었다.

[표 3]

TNFR2-Fc_varB의 정맥내 및 피하 투여의 약동학 예비 분석

N < 3인 경우, 요약 통계는 계산되지 않았다.

AUC_0-∞ 0에서 무한대까지의 농도-시간 곡선 아래 면적; AUC_last 0에서 정량화할 수 있는 마지막 시점까지의 농도-시간 곡선 아래 면적; CL 청소율; C_max 최대 관찰 농도; CV 변동 계수(기하학적); iv 정맥내; Max 최대값; min 최소값; N 대상체 수; sc 피하; NC 계산할 수 없음; SD 표준 편차; t_1/2 반감기; t_last 마지막으로 관찰된 정량화 가능한 농도의 시간; t_max C_max까지의 시간; V_ss 정상 상태에서의 분포 부피.

[표 3a]

피하 투여를 통한 TNFR2-Fc_varB의 절대 생체이용률 분석

AUC_last 0에서 정량화할 수 있는 마지막 시점까지의 농도-시간 곡선 아래 면적; C_max 최대 관찰 농도; IV 정맥내; LS 최소 제곱; n 분석에 포함된 대상체 수; PK 약동학; SC 피하.

MAD 코호트의 대상체는 2주마다 1~450 μg/kg 범위의 TNFR2-Fc_varB(총 4회 용량) 또는 위약을 이중 맹검 방식으로 반복 정맥내 주입을 받았다. TNFR2-Fc_varB의 관찰된 혈청 약동학은 모든 코호트가 노출되었고, 평균적으로 용량 의존적 방식으로 노출이 증가했음을 나타냈다(도 26). 노출-반응 분석은 최대 통증 감소 효능이 150~450 μg/kg 정맥내 용량 범위에서 도달되었음을 시사한다(도 27; 표 4).

[표 4]

TNFR2-Fc_varB로 치료받은 대상체의 NGF 및 통증 반응

RoA 투여 경로; 기준선으로부터의 변화(CFB); 위약으로부터의 변화(CFP).

퇴원 후 대상체는 추적 기간이 끝날 때까지 24시간의 회상을 반영하기 위해 매일 아침 거의 같은 시간에 11점 NRS(0~10)로 통증을 기록하도록 지시받았다. 150 μg/kg의 TNFR2-Fc_varB 및 450 μg/kg의 TNFR2-Fc_varB의 반복 주사는 위약 처리 대조군과 비교하여 통증을 분명히 감소시켰다(도 28a). 이러한 용량 모두 오피오이드 옥시코돈 40 mg 용량, 항-NGF 항체 타네주맙 2.5 mg 용량 또는 타네주맙 5 mg에 비해 통증 감소가 더 컸고(도 28b), 파시누맙, 풀라누맙 또는 타네주맙으로 달성된 최대 통증 감소와 비교하여 통증 감소에 더 효과적이었다(도 28c).

항-약물 항체(ADA) 수준을 면역원성 평가(미국 식품의약국. 업계 지침. 치료 단백질 제품의 면역원성 평가. 2014년 8월. http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm338856.pdf에서 이용 가능함. 2018년 7월 27일 평가)에 의해 측정하였다. 전반적으로, TNFR2-Fc_varB의 반복 용량을 받은 대상체의 ADA 유병률은 70%(50명의 대상체 중 35명)였다. ADA 유병률은 언제든지(기준선 및/또는 기준선 이후) ADA 양성인 대상체의 비율로 정의되었다. TNFR2-Fc_varB 용량 수준과 ADA 유병률 사이에는 명백한 관계가 없었지만, 아래 표 5에 제시된 바와 같이 환자의 일부가 높은 ADA 역가를 가졌다. 높은 ADA 역가가 TNFR2-Fc_varB에 대한 노출 및 효능에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, TNFR2-Fc_varB에 대한 노출, ADA 역가 및 통증 감소를 150 μg/kg TNFR2-Fc_varB로 처리된 개별 대상체에서 측정하였다. 놀랍게도, 높은 ADA 역가에도 불구하고 TNFR2-Fc_varB에 대한 상당한 노출이 관찰되었고 통증 감소 효능이 >50일 동안 유지되었다(도 29). 또한, TNFR2-Fc-varB의 반감기는 더 낮은 ADA 역가를 갖는 대상체에서 더 높았고, 450 μg/kg TNFR2-Fc_varB로 치료받은 환자는 ADA 역가가 높지 않았다(도 30). 중요한 것은 ADA와 유해 사건 사이에 연관성이 없었다는 것이다.

[표 5]

예비 분석 후 용량군 간 ADA의 유병률.

놀랍게도, 시험의 MAD 단계로부터의 데이터를 사용하여, 본 발명자들은 또한 체중이 노출에 대해 임상적으로 유의한 공변량이 아님을 발견하였다(p = 0.61; 도 31).

실시예 10 - 통증성 무릎 골관절염이 있는 인간에서 TNFR2-Fc_varB의 고정된 피하 용량의 효과

체중이 TNFR2-Fc_varB에 대한 노출에 대해 임상적으로 유의한 공변량이 아니라는 발견에 기초하여, 본 발명자들은 TNFR2-Fc_varB의 고정 투약 전략이 인간의 통증 치료에 효과적일 것이라는 가설을 세웠다. 따라서, 통증성 무릎 골관절염이 있는 18세 내지 80세의 대상체를 대상으로 다기관, 무작위, 이중 맹검, 위약 대조 임상 시험을 설계하였다. 약 300명의 적격 대상체가 TNFR2-Fc_varB 치료 또는 위약에 무작위로 배정되어 약 255명의 대상체가 치료 기간을 완료하도록 할 것이다. 대상체는 TNFR2-Fc_varB(7.5 mg, 25 mg, 75 mg 및 150 mg)의 4가지 고정 피하 용량 중 하나 또는 위약을 12주 동안 2주마다(Q2W) 받게 될 것이다. TNFR2-Fc_varB의 이러한 고정 피하 용량은 각각 15, 50, 150 및 300 μg/kg TNFR2-Fc_varB의 정맥내 용량과 유사한 효과를 제공할 것으로 예상되며, 피하 투여된 TNFR2-Fc_varB에 대해 관찰된 생체이용률 및 OA 환자의 체중 분포를 기반으로 계산되었다. 전체적으로 각 대상체는 치료 기간 동안 6회 용량의 TNFR2-Fc_varB 또는 위약을 받게 될 것이다. 연구 설계의 단순화된 레이아웃이 도 32에 제공된다.

치료를 시작하기 14일 전부터 대상체는 TNFR2-Fc_varB 또는 위약의 마지막 투여 후 적어도 6주까지 24시간의 회상을 반영하기 위해 매일 아침 거의 같은 시간에 11점 NRS(0~10)로 통증을 기록하도록 지시받을 것이다.

대상체는 치료 시작 전에 시작하여 TNFR2-Fc_varB 또는 위약의 마지막 투여 후 적어도 6주 후에 끝나는 특정 시점에 WOMAC 설문지를 작성하도록 지시받을 것이다.

대상체는 치료 시작 전에 시작하여 TNFR2-Fc_varB 또는 위약의 마지막 투여 후 적어도 6주 후에 끝나는 특정 시점에 환자 종합 평가(PGA)를 작성하도록 지시받을 것이다. PGA는 무릎의 OA로 인한 증상 및 활동 장애를 평가하는 데 사용되는 5점 Likert 척도이다. 대상체들은 "무릎의 OA가 당신에게 영향을 미치는 모든 방식을 고려할 때 오늘 기분은 어떻습니까?"라는 질문에 기초하여 1 = 매우 좋음(무증상 및 정상적인 활동의 제한 없음)에서 5 = 매우 나쁨(참을 수 없는 매우 심한 증상 및 모든 정상적인 활동을 수행할 수 없음)까지의 숫자를 식별하도록 요청받는다.

말초에서 유리 NGF 수준에 대한 TNFR2-Fc_varB의 효과가 측정될 수 있다. 예를 들어, 말초의 유리 NGF는 투여 후 1일부터 시작하여 12주까지 매주 측정한 다음 18주 및 28주에 다시 측정할 수 있다.

말초에서 총 NGF 수준에 대한 TNFR2-Fc_varB의 효과가 측정될 수 있다. 예를 들어, 말초의 총 NGF는 투여 후 1일부터 시작하여 12주까지 매주 측정한 다음 18주 및 28주에 다시 측정할 수 있다.

TNFα 수준의 수준 측정을 위한 대용물로서, CXCL-13 수준은 측정할 수 있다. 예를 들어, CXCL-13 수준은 투여 후 1일부터 시작하여 12주까지 매주 측정한 다음 18주 및 28주에 다시 측정할 수 있다.

서열 목록

서열번호 1 NP_002497.2| 베타-신경 성장 인자 전구체 [호모 사피엔스]

1 MSMLFYTLIT AFLIGIQAEP HSESNVPAGH TIPQAHWTKL QHSLDTALRR ARSAPAAAIA

61 ARVAGQTRNI TVDPRLFKKR RLRSPRVLFS TQPPREAADT QDLDFEVGGA APFNRTHRSK

121 RSSSHPIFHR GEFSVCDSVS VWVGDKTTAT DIKGKEVMVL GEVNINNSVF KQYFFETKCR

181 DPNPVDSGCR GIDSKHWNSY CTTTHTFVKA LTMDGKQAAW RFIRIDTACV CVLSRKAVRR

241 A

서열번호 2 NP_000585.2| 종양 괴사 인자 [호모 사피엔스]

1 MSTESMIRDV ELAEEALPKK TGGPQGSRRC LFLSLFSFLI VAGATTLFCL LHFGVIGPQR

61 EEFPRDLSLI SPLAQAVRSS SRTPSDKPVA HVVANPQAEG QLQWLNRRAN ALLANGVELR

121 DNQLVVPSEG LYLIYSQVLF KGQGCPSTHV LLTHTISRIA VSYQTKVNLL SAIKSPCQRE

181 TPEGAEAKPW YEPIYLGGVF QLEKGDRLSA EINRPDYLDF AESGQVYFGI IAL

서열번호 3 MEDI-578 VH (1256A5 VH)

1 QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS TYGISWVRQA PGQGLEWMGG IIPIFDTGNS

61 AQSFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSS RIYDLNPSLT AYYDMDVWGQ

121 GTMVTVSS

서열번호 4 MEDI-578 VHCDR1

1 TYGIS

서열번호 5 MEDI-578 VHCDR2

1 GIIPIFDTGN SAQSFQG

서열번호 6 MEDI-578 VHCDR3

1 SSRIYDLNPS LTAYYDMDV

서열번호 7 MEDI-578 VL (1256A5 VL)

1 QSVLTQPPSV SAAPGQKVTI SCSGSSSNIG NNYVSWYQQL PGTAPKLLIY DNNKRPSGIP

61 DRFSGSKSGT SATLGITGLQ TGDEADYYCG TWDSSLSAWV FGGGTKLTVL

서열번호 8 MEDI-578 VLCDR1

1 SGSSSNIGNN YVS

서열번호 9 MEDI-578 VLCDR2

1 DNNKRPS

서열번호 10 MEDI-578 VLCDR3

1 GTWDSSLSAW V

서열번호 11

1 SSRIYDFNSA LISYYDMDV

서열번호 12

1 SSRIYDMISS LQPYYDMDV

서열번호 13 가용성 TNFR2 아미노산 서열

1 LPAQVAFTPY APEPGSTCRL REYYDQTAQM CCSKCSPGQH AKVFCTKTSD TVCDSCEDST

61 YTQLWNWVPE CLSCGSRCSS DQVETQACTR EQNRICTCRP GWYCALSKQE GCRLCAPLRK

121 CRPGFGVARP GTETSDVVCK PCAPGTFSNT TSSTDICRPH QICNVVAIPG NASMDAVCTS

181 TSPTRSMAPG AVHLPQPVST RSQHTQPTPE PSTAPSTSFL LPMGPSPPAE GSTGDEPKSC

241 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD

301 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK

361 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS

421 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK

서열번호 14 TNFR2-Fc_VH#4 - 아미노산 서열

1 LPAQVAFTPY APEPGSTCRL REYYDQTAQM CCSKCSPGQH AKVFCTKTSD TVCDSCEDST

61 YTQLWNWVPE CLSCGSRCSS DQVETQACTR EQNRICTCRP GWYCALSKQE GCRLCAPLRK

121 CRPGFGVARP GTETSDVVCK PCAPGTFSNT TSSTDICRPH QICNVVAIPG NASMDAVCTS

181 TSPTRSMAPG AVHLPQPVST RSQHTQPTPE PSTAPSTSFL LPMGPSPPAE GSTGDEPKSC

241 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD

301 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK

361 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS

421 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKGGG GSGGGGSQVQ

481 LVQSGAEVKK PGSSVKVSCK ASGGTFSTYG ISWVRQAPGQ GLEWMGGIIP IFDTGNSAQS

541 FQGRVTITAD ESTSTAYMEL SSLRSEDTAV YYCARSSRIY DLNPSLTAYY DMDVWGQGTM

601 VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS AQSVLTQPPS VSAAPGQKVT ISCSGSSSNI GNNYVSWYQQ

661 LPGTAPKLLI YDNNKRPSGI PDRFSGSKSG TSATLGITGL QTGDEADYYC GTWDSSLSAW

721 VFGGGTKLTV L

서열번호 15 (Gly₄Ser)₃ 15 aa 링커 서열

1 GGGGSGGGGS GGGGS

서열번호 16 TNFR2-Fc_VH#4 - 뉴클레오티드 서열

1 CTGCCCGCCC AGGTGGCCTT TACCCCTTAT GCCCCCGAGC CCGGCAGCAC CTGTCGGCTG

61 AGAGAGTACT ACGACCAGAC CGCCCAGATG TGCTGCAGCA AGTGCTCTCC TGGCCAGCAT

121 GCCAAGGTGT TCTGCACCAA GACCAGCGAC ACCGTGTGCG ACAGCTGCGA GGACAGCACC

181 TACACCCAGC TGTGGAACTG GGTGCCCGAG TGCCTGAGCT GCGGCAGCAG ATGCAGCAGC

241 GACCAGGTGG AAACCCAGGC CTGCACCAGA GAGCAGAACC GGATCTGCAC CTGTAGACCC

301 GGCTGGTACT GCGCCCTGAG CAAGCAGGAA GGCTGCAGAC TCTGCGCCCC TCTGCGGAAG

361 TGCAGACCCG GCTTTGGCGT GGCCAGACCC GGCACCGAGA CAAGCGACGT GGTCTGTAAG

421 CCCTGCGCTC CTGGCACCTT CAGCAACACC ACCAGCAGCA CCGACATCTG CAGACCCCAC

481 CAGATCTGCA ACGTGGTGGC CATCCCCGGC AACGCCAGCA TGGATGCCGT CTGCACCAGC

541 ACTAGCCCCA CCAGAAGTAT GGCCCCTGGC GCCGTGCATC TGCCCCAGCC TGTGTCCACC

601 AGAAGCCAGC ACACCCAGCC CACCCCTGAG CCTAGCACCG CCCCCTCCAC CAGCTTTCTG

661 CTGCCTATGG GCCCTAGCCC TCCAGCCGAG GGAAGCACAG GCGACGAGCC CAAGAGCTGC

721 GACAAGACCC ACACCTGTCC CCCCTGCCCT GCCCCTGAAC TGCTGGGCGG ACCCAGCGTG

781 TTCCTGTTCC CCCCAAAGCC CAAGGACACC CTGATGATCA GCCGGACCCC CGAAGTGACC

841 TGCGTGGTGG TGGACGTGTC CCACGAGGAC CCTGAAGTGA AGTTCAATTG GTACGTGGAC

901 GGCGTGGAAG TGCACAACGC CAAGACCAAG CCCAGAGAGG AACAGTACAA CTCCACCTAC

961 CGGGTGGTGT CCGTGCTGAC CGTGCTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA AGAGTACAAG

1021 TGCAAGGTCT CCAACAAGGC CCTGCCTGCC CCCATCGAGA AAACCATCAG CAAGGCCAAG

1081 GGCCAGCCCC GCGAGCCTCA GGTGTACACA CTGCCCCCCA GCCGGGAAGA GATGACCAAG

1141 AACCAGGTGT CCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGATAT CGCCGTGGAA

1201 TGGGAGAGCA ATGGCCAGCC CGAGAACAAC TACAAGACCA CCCCCCCTGT GCTGGACAGC

1261 GACGGCTCAT TCTTCCTGTA CAGCAAGCTG ACCGTGGACA AGAGCCGGTG GCAGCAGGGC

1321 AACGTGTTCA GCTGCAGCGT GATGCACGAG GCCCTGCACA ACCACTACAC CCAGAAGTCC

1381 CTGAGCCTGA GCCCCGGAAA GGGCGGTGGC GGATCCGGAG GTGGGGGATC TCAGGTGCAG

1441 CTGGTGCAGT CTGGCGCCGA AGTGAAGAAA CCCGGCTCTA GCGTGAAGGT GTCCTGCAAG

1501 GCCAGCGGCG GCACCTTCTC CACCTACGGC ATCAGCTGGG TCCGCCAGGC CCCTGGACAG

1561 GGCCTGGAAT GGATGGGCGG CATCATCCCC ATCTTCGACA CCGGCAACAG CGCCCAGAGC

1621 TTCCAGGGCA GAGTGACCAT CACCGCCGAC GAGAGCACCT CCACCGCCTA CATGGAACTG

1681 AGCAGCCTGC GGAGCGAGGA CACCGCCGTG TACTACTGCG CCAGAAGCAG CCGGATCTAC

1741 GACCTGAACC CCAGCCTGAC CGCCTACTAC GACATGGACG TGTGGGGCCA GGGCACCATG

1801 GTCACAGTGT CTAGCGGAGG CGGCGGATCT GGCGGCGGAG GAAGTGGCGG GGGAGGATCT

1861 GCCCAGAGCG TGCTGACCCA GCCCCCTTCT GTGTCTGCCG CCCCTGGCCA GAAAGTGACC

1921 ATCTCCTGCA GCGGCAGCAG CAGCAACATC GGCAACAACT ACGTGTCCTG GTATCAGCAG

1981 CTGCCCGGCA CCGCCCCTAA GCTGCTGATC TACGACAACA ACAAGCGGCC CAGCGGCATC

2041 CCCGACCGGT TTAGCGGCAG CAAGAGCGGG ACTTCTGCTA CACTGGGCAT CACAGGCCTG

2101 CAGACCGGCG ACGAGGCCGA CTACTACTGC GGCACCTGGG ACAGCAGCCT GAGCGCTTGG

2161 GTGTTCGGCG GAGGCACCAA GCTGACAGTG CTG

서열번호 17 - TNFR2-Fc_varB - 아미노산 서열

1 LPAQVAFTPY APEPGSTCRL REYYDQTAQM CCSKCSPGQH AKVFCTKTSD TVCDSCEDST

61 YTQLWNWVPE CLSCGSRCSS DQVETQACTR EQNRICTCRP GWYCALSKQE GCRLCAPLRK

121 CRPGFGVARP GTETSDVVCK PCAPGTFSNT TSSTDICRPH QICNVVAIPG NASMDAVCTS

181 TSPTRSMAPG AVHLPQPVST RSQHTQPTPE PSTAPSTSFL LPMGPSPPAE GSTGDEPKSC

241 DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD

301 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK

361 GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS

421 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGKGGG GSGGGGSQVQ

481 LVQSGAEVKK PGSSVKVSCK ASGGTFSTYG ISWVRQAPGQ CLEWMGGIIP IFDTGNSAQS

541 FQGRVTITAD ESTSTAYMEL SSLRSEDTAV YYCARSSRIY DLNPSLTAYY DMDVWGQGTM

601 VTVSSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSQSVLT QPPSVSAAPG QKVTISCSGS SSNIGNNYVS

661 WYQQLPGTAP KLLIYDNNKR PSGIPDRFSG SKSGTSATLG ITGLQTGDEA DYYCGTWDSS

721 LSAWVFGCGT KLTVL

서열번호 18 - TNFR2-Fc_varB - 뉴클레오티드 서열

1 CTGCCCGCCC AGGTGGCCTT TACCCCTTAT GCCCCCGAGC CCGGCAGCAC CTGTCGGCTG

61 AGAGAGTACT ACGACCAGAC CGCCCAGATG TGCTGCAGCA AGTGCTCTCC TGGCCAGCAT

121 GCCAAGGTGT TCTGCACCAA GACCAGCGAC ACCGTGTGCG ACAGCTGCGA GGACAGCACC

181 TACACCCAGC TGTGGAACTG GGTGCCCGAG TGCCTGAGCT GCGGCAGCAG ATGCAGCAGC

241 GACCAGGTGG AAACCCAGGC CTGCACCAGA GAGCAGAACC GGATCTGCAC CTGTAGACCC

301 GGCTGGTACT GCGCCCTGAG CAAGCAGGAA GGCTGCAGAC TCTGCGCCCC TCTGCGGAAG

361 TGCAGACCCG GCTTTGGCGT GGCCAGACCC GGCACCGAGA CAAGCGACGT GGTCTGCAAG

421 CCCTGCGCTC CTGGCACCTT CAGCAACACC ACCAGCAGCA CCGACATCTG CAGACCCCAC

481 CAGATCTGCA ACGTGGTGGC CATCCCCGGC AACGCCAGCA TGGATGCCGT GTGCACCAGC

541 ACCAGCCCCA CCAGAAGTAT GGCCCCTGGC GCCGTGCATC TGCCCCAGCC TGTGTCCACC

601 AGAAGCCAGC ACACCCAGCC CACCCCTGAG CCTAGCACCG CCCCCTCCAC CAGCTTTCTG

661 CTGCCTATGG GCCCTAGCCC TCCAGCCGAG GGAAGCACAG GCGACGAGCC CAAGAGCTGC

721 GACAAGACCC ACACCTGTCC CCCCTGCCCT GCCCCTGAAC TGCTGGGCGG ACCCAGCGTG

781 TTCCTGTTCC CCCCAAAGCC CAAGGACACC CTGATGATCA GCCGGACCCC CGAAGTGACC

841 TGCGTGGTGG TGGACGTGTC CCACGAGGAC CCTGAAGTGA AGTTCAATTG GTACGTGGAC

901 GGCGTGGAAG TGCACAACGC CAAGACCAAG CCCAGAGAGG AACAGTACAA CTCCACCTAC

961 CGGGTGGTGT CCGTGCTGAC CGTGCTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA AGAGTACAAG

1021 TGCAAAGTCT CCAACAAGGC CCTGCCTGCC CCCATCGAGA AAACCATCAG CAAGGCCAAG

1081 GGCCAGCCCC GCGAGCCTCA gGTGTACACA CTGCCCCCCA GCCGGGAAGA GATGACCAAG

1141 AACCAGGTGT CCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGATAT CGCCGTGGAA

1201 TGGGAGAGCA ACGGCCAGCC CGAGAACAAC TACAAGACCA CCCCCCCTGT GCTGGACAGC

1261 GACGGCTCAT TCTTCCTGTA CAGCAAGCTG ACCGTGGACA AGAGCCGGTG GCAGCAGGGC

1321 AATGTCTTCA GCTGTAGCGT GATGCACGAG GCCCTGCACA ACCACTACAC CCAGAAGTCC

1381 CTGAGCCTGA GCCCCGGAAA GGGCGGAGGC GGATCCGGAG GTGGGGGATC TCAGGTGCAG

1441 CTGGTGCAGT CTGGCGCCGA AGTGAAGAAA CCCGGCTCTA GCGTGAAGGT GTCCTGCAAG

1501 GCCAGCGGCG GCACCTTCTC CACCTACGGC ATCAGCTGGG TCCGCCAGGC CCCTGGACAG

1561 TGTCTGGAAT GGATGGGCGG CATCATCCCC ATCTTCGACA CCGGCAACAG CGCCCAGAGC

1621 TTCCAGGGCA GAGTGACCAT CACCGCCGAC GAGAGCACCT CCACCGCCTA CATGGAACTG

1681 AGCAGCCTGC GGAGCGAGGA CACCGCCGTG TACTACTGCG CCAGAAGCAG CCGGATCTAC

1741 GACCTGAACC CCAGCCTGAC CGCCTACTAC GACATGGACG TGTGGGGCCA GGGCACCATG

1801 GTCACAGTGT CTAGCGGAGG CGGAGGCAGC GGAGGTGGTG GATCTGGTGG CGGAGGAAGT

1861 GGCGGCGGAG GCTCTCAGAG CGTGCTGACC CAGCCCCCTT CTGTGTCTGC CGCCCCTGGC

1921 CAGAAAGTGA CCATCTCCTG CAGCGGCAGC AGCAGCAACA TCGGCAACAA CTACGTGTCC

1981 TGGTATCAGC AGCTGCCCGG CACCGCCCCT AAGCTGCTGA TCTACGACAA CAACAAGCGG

2041 CCCAGCGGCA TCCCCGACCG GTTTAGCGGC AGCAAGAGCG GGACTTCTGC TACACTGGGC

2101 ATCACAGGCC TGCAGACCGG CGACGAGGCC GACTACTACT GCGGCACCTG GGACAGCAGC

2161 CTGAGCGCTT GGGTGTTCGG CTGCGGCACC AAGCTGACAG TGCTG

서열번호 19 - (Gly₄Ser)₄ 20 aa 링커 서열

1 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS

서열번호 20 - 엔디맙 varB - L 사슬 아미노산 서열

1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVY SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRAIGIPA

61 RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPFTFG PGTKVDIKRT VAAPSVFIFP

121 PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL

181 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC

서열번호 21 - 엔디맙 varB - L 사슬 뉴클레오티드 서열

1 GAAATCGTGC TGACCCAGAG CCCCGCCACC CTGTCTCTGA GCCCTGGCGA GAGAGCCACC

61 CTGAGCTGCA GAGCCAGCCA GAGCGTGTAC TCCTACCTGG CTTGGTATCA GCAGAAGCCC

121 GGCCAGGCCC CCAGACTGCT GATCTACGAC GCCAGCAACC GGGCCATCGG CATCCCTGCC

181 AGATTTTCTG GCAGCGGCAG CGGCACCGAC TTCACCCTGA CCATCAGCAG CCTGGAACCC

241 GAGGACTTCG CCGTGTACTA CTGCCAGCAG CGGAGCAACT GGCCCCCCTT CACCTTCGGC

301 CCTGGCACCA AGGTGGACAT CAAGCGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT CATCTTCCCG

361 CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC

421 TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC

481 CAGGAGAGTG TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG

541 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG

601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT

서열번호 22 - 엔디맙 varB - H 사슬 아미노산 서열

1 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFIFS SYAMHWVRQA PGNGLEWVAF MSYDGSNKKY

61 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDR GISAGGNYYY YGMDVWGQGT

121 TVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKSTSGGTAA LGCLVKDYFP EPVTVSWNSG ALTSGVHTFP

181 AVLQSSGLYS LSSVVTVPSS SLGTQTYICN VNHKPSNTKV DKRVEPKSCD KTHTCPPCPA

241 PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP

301 REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL

361 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT

421 VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGKGGGG SGGGGSQVQL VQSGAEVKKP

481 GSSVKVSCKA SGGTFSTYGI SWVRQAPGQC LEWMGGIIPI FDTGNSAQSF QGRVTITADE

541 STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCARSSRIYD LNPSLTAYYD MDVWGQGTMV TVSSGGGGSG

601 GGGSGGGGSG GGGSQSVLTQ PPSVSAAPGQ KVTISCSGSS SNIGNNYVSW YQQLPGTAPK

661 LLIYDNNKRP SGIPDRFSGS KSGTSATLGI TGLQTGDEAD YYCGTWDSSL SAWVFGCGTK

721 LTVL

서열번호 23 - 엔디맙 varB - H 사슬 뉴클레오티드 서열

1 CAGGTGCAGC TGGTGGAAAG CGGCGGAGGC GTGGTGCAGC CCGGCAGAAG CCTGAGACTG

61 AGCTGCGCTG CCAGCGGCTT CATCTTCAGC AGCTACGCCA TGCACTGGGT CCGCCAGGCC

121 CCTGGCAACG GACTGGAATG GGTGGCCTTC ATGAGCTACG ACGGCAGCAA CAAGAAGTAC

181 GCCGACAGCG TGAAGGGCCG GTTCACCATC AGCCGGGACA ACAGCAAGAA CACCCTGTAC

241 CTGCAGATGA ACAGCCTGCG GGCTGAGGAC ACCGCCGTGT ACTACTGCGC CAGAGACCGA

301 GGCATCAGTG CTGGCGGCAA CTACTACTAC TACGGCATGG ACGTGTGGGG CCAGGGCACC

361 ACCGTGACCG TGTCTAGCGC GTCGACCAAG GGCCCATCCG TCTTCCCCCT GGCACCCTCC

421 TCCAAGAGCA CCTCTGGGGG CACAGCGGCC CTGGGCTGCC TGGTCAAGGA CTACTTCCCC

481 GAACCGGTGA CGGTGTCCTG GAACTCAGGC GCTCTGACCA GCGGCGTGCA CACCTTCCCG

541 GCTGTCCTAC AGTCCTCAGG ACTCTACTCC CTCAGCAGCG TGGTGACCGT GCCCTCCAGC

601 AGCTTGGGCA CCCAGACCTA CATCTGCAAC GTGAATCACA AGCCCAGCAA CACCAAGGTG

661 GACAAGAGAG TTGAGCCCAA ATCTTGTGAC AAAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCA

721 CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC

781 ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT

841 GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG

901 CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG

961 GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC

1021 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT CTACACCCTG

1081 CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC

1141 TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC

1201 AAGACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTATAG CAAGCTCACC

1261 GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT

1321 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAAGG CGGAGGGGGA

1381 TCCGGCGGAG GGGGCTCTCA GGTGCAGCTG GTGCAGTCTG GCGCCGAAGT GAAGAAACCC

1441 GGCTCTAGCG TGAAGGTGTC CTGCAAGGCC AGCGGCGGCA CCTTCTCCAC CTACGGCATC

1501 AGCTGGGTCC GCCAGGCCCC TGGACAGTGT CTGGAATGGA TGGGCGGCAT CATCCCCATC

1561 TTCGACACCG GCAACAGCGC CCAGAGCTTC CAGGGCAGAG TGACCATCAC CGCCGACGAG

1621 AGCACCTCCA CCGCCTACAT GGAACTGAGC AGCCTGCGGA GCGAGGACAC CGCCGTGTAC

1681 TACTGCGCCA GAAGCAGCCG GATCTACGAC CTGAACCCCA GCCTGACCGC CTACTACGAC

1741 ATGGACGTGT GGGGCCAGGG CACCATGGTC ACAGTGTCTA GCGGAGGCGG AGGCAGCGGA

1801 GGTGGTGGAT CTGGTGGCGG AGGAAGTGGC GGCGGAGGCT CTCAGAGCGT GCTGACCCAG

1861 CCCCCTTCTG TGTCTGCCGC CCCTGGCCAG AAAGTGACCA TCTCCTGCAG CGGCAGCAGC

1921 AGCAACATCG GCAACAACTA CGTGTCCTGG TATCAGCAGC TGCCCGGCAC CGCCCCTAAG

1981 CTGCTGATCT ACGACAACAA CAAGCGGCCC AGCGGCATCC CCGACCGGTT TAGCGGCAGC

2041 AAGAGCGGGA CTTCTGCTAC ACTGGGCATC ACAGGCCTGC AGACCGGCGA CGAGGCCGAC

2101 TACTACTGCG GCACCTGGGA CAGCAGCCTG AGCGCTTGGG TGTTCGGCTG CGGCACCAAG

2161 CTGACAGTGC TG

서열번호 24 - NGF-NG VH 아미노산 서열

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFWFGAFTWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGLTNLAQNFQGRVTITADESTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 25 - NGF-NG VH 뉴클레오티드 서열

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cctctggagg caccttctgg ttcggcgcgt tcacctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag gacttgagtg gatgggaggg attattccta tcttcgggtt gacgaacttg 180

gcacagaact tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcttgag atctgaagac acggccgtat attattgtgc acgttcaagt 300

cgtatctacg atctgaaccc gtccctgacc gcctactacg atatggatgt ctggggccag 360

gggacaatgg tcaccgtctc gagt 384

서열번호 26 - NGF-NG VL 아미노산 서열

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 27 - NGF-NG VL 뉴클레오티드 서열

cagtctgtgc tgactcagcc gccatcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60

tcctgctctg gaagcagctc cgacattggg aataattatg tatcgtggta ccagcagctc 120

ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct 180

gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag 240

actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttgggtg 300

ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330

서열번호 28 - 엔디맙 VH 아미노산 서열

1 QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCAASGFIFS SYAMHWVRQA PGNGLEWVAF MSYDGSNKKY

61 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDR GISAGGNYYY YGMDVWGQGT

121 TVTVSS

서열번호 29 - 엔디맙 VL 아미노산 서열

1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVY SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRAIGIPA

61 RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPFTFG PGTKVDIK

서열번호 30 - 1126F1 VH 아미노산 서열

EVQLVQTGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDANRQAVPYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 31 - 1126F1 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQMVTISCSGSSSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 32 - 1126G5 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFTSGLAPYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 33 - 1126G5 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSTWVFGGGTKLTVL

서열번호 34 - 1126H5 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDAGNSAQSFQGRVTITADESTSTAHMEVSSLRSEDTAVYYCASSSRIYDHHIQKGGYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 35 - 1126H5 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 36 - 1127D9 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDYHTIAYYD

서열번호 37 - 1127D9 VL 아미노산 서열

서열번호 38 - 1127F9 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMKVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDYIPGMRPYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 39 - 1127F9 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGNSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSRSGTLATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 40 - 1131D7 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFNSSLIAYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 41 - 1131D7 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDETDYYCGTWDSSLSAWVFSGGTKLTVL

서열번호 42 - 1131H2 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSTVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 43 - 1131H2 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGTSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 44 - 132A9 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFGTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFEPSLIYYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 45 - 132A9 VL 아미노산 서열

서열번호 46 - 1132H9 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 47 - 1132H9 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSDIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPTGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 48 - 1133C11 VH 아미노산 서열

서열번호 49 - 1133C11 VL 아미노산 서열

서열번호 50 - 1134D9 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVAITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 51 - 1134D9 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSGLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 52 - 1145D1 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTSNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFRTLYSTYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 53 - 1145D1 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGISDRFSGSKSGTSATLGIAGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 54 - 1146D7 VH 아미노산 서열

서열번호 55 - 1146D7 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQEVTISCSGSSTNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 56 - 1147D2 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVRISCKASGGTFSTYGVSWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 57 - 1147D2 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 58 - 1147G9 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSAYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFNTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTV

서열번호 59 - 1147G9 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTVSCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 60 - 1150F1 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQDRVTITADESTSTAYMEVGSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGHGTMVTVSS

서열번호 61 - 1150F1 VL 아미노산 서열

서열번호 62 - 1152H5 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLVWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDMISSLQPYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 63 - 1152H5 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKATISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 64 - 1155H1 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFHLANKGYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 65 - 1155H1 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKATISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLDITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 66 - 1158A1 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFGTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDHHNHVGGYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 67 - 1158A1 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYASWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDGSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 68 - 1160E3 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSAKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 69 - 1160E3 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSNSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTV

서열번호 70 - 1165D4 VH 아미노산 서열

서열번호 71 - 1165D4 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIENNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 72 - 1175H8 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQRLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDATTGLTPYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 73 - 1175H8 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLRTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 74 - 1211G10 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVRKPGSSVKVSCKAYGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWVGGIIPIFDTRNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDMVSTLIPYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 75 - 1211G10 VL 아미노산 서열

서열번호 76 - 1214A1 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEVKKPGSSVRVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDAHLQAYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 77 - 1214A1 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTRDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 78 - 1214D10 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAEAKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGRGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVAITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDAHLNHHGYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 79 - 1214D10 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQAGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 80 - 1218H5 VH 아미노산 서열

EVQLVQSGAVVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGSSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDLNPSLTAYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 81 - 1218H5 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNTGNNYVSWYQQLSGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTVL

서열번호 82 - 1230H7 VH 아미노산 서열

EMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSTYGISWVRQAPGQGLEWIGGIIPIFDTGNSAQSFQGRVTITADESTSTAYMEVSSLRSDDTAVYYCASSSRIYDFNSALISYYDMDVWGQGTMVTVSS

서열번호 83 - 1230H7 VL 아미노산 서열

QAVLTQPSSVSTPPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAWVFGGGTKLTV

서열번호 84 - 1083H4 VH 아미노산 서열

QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFAYHYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQRFQDRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASADYVWGSYRPDWYFDLWGRGTMVTVSS

서열번호 85 - 1083H4 VL 아미노산 서열

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQRLPGAAPQLLIYNNDQRPSGIPDRFSGSKSGTSGSLVISGLQSEDEADYYCASWDDSLNGRVFGGGTKLTVL

서열번호 86 - 1227H8 VH 아미노산 서열

QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGHTFAYHYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQRFQDRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASADYAWESYQPPQINGVWGRGTMVTVSS

서열번호 87 - 1227H8 VL 아미노산 서열

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTITCSGSTSNIGNNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISGLQSEDEADYYCAAWDDSLSEFFFGTGTKLTVL

서열번호 88 - NGF-NG HCDR1

FGAFT

서열번호 89 - NGF-NG HCDR2

GIIPIFGLTNLAQNFQG

서열번호 90 - NGF-NG HCDR3

SSRIYDLNPSLTAYYDMDV

서열번호 91 - NGF-NG LCDR1

SGSSSDIGNNYVS

서열번호 92 - NGF-NG LCDR2

DNNKRPS

서열번호 93 - NGF-NG LCDR3

GTWDSSLSAWV

서열번호 94 - G->C의 MEDI-578 VH 아미노산 서열

QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS TYGISWVRQA PGQCLEWMGG IIPIFDTGNS

AQSFQGRVTI TADESTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSS RIYDLNPSLT AYYDMDVWGQ

GTMVTVSS

서열번호 95 - G->C의 MEDI-578 VL 아미노산 서열

QSVLTQPPSV SAAPGQKVTI SCSGSSSNIG NNYVSWYQQL PGTAPKLLIY DNNKRPSGIP

DRFSGSKSGT SATLGITGLQ TGDEADYYCG TWDSSLSAWV FGCGTKLTVL

서열번호 96 - 1230D8 VH 아미노산 서열

QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFPYHYLHWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTNYAQRFQDRVTITADESTSTAYMEFSSLRSEDTAVYYCASADYVWESYHPATSLSLWGRGTMVTVSS

서열번호 97 - 1230D8 VL 아미노산 서열

QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCPGSTSNIGNNYVSWYQQRPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNSASLDISELQSEDEADYYCAAWDDSLSEFLFGTGTKLTVL

서열번호 98

GGGGSGGGGS

서열번호 99 - TNFR2-Fc_varB - 코돈 최적화된 뉴클레오티드 서열

1 CTGCCCGCCC AGGTGGCCTT TACCCCTTAT GCTCCTGAGC CCGGCTCTAC CTGCCGGCTG

61 AGAGAGTACT ACGACCAGAC CGCCCAGATG TGCTGCTCCA AGTGCTCTCC TGGCCAGCAC

121 GCCAAGGTGT TCTGCACCAA GACCTCCGAT ACCGTGTGCG ACTCCTGCGA GGACTCCACC

181 TACACCCAGC TGTGGAACTG GGTGCCCGAG TGCCTGTCCT GCGGCTCCAG ATGTTCCTCC

241 GACCAGGTGG AAACCCAGGC CTGCACCAGA GAGCAGAACC GGATCTGCAC CTGTCGGCCT

301 GGCTGGTACT GCGCCCTGTC TAAGCAGGAA GGCTGCAGAC TGTGCGCCCC TCTGCGGAAG

361 TGTAGACCTG GCTTTGGCGT GGCCAGACCC GGCACCGAGA CATCTGATGT CGTGTGCAAG

421 CCTTGCGCCC CTGGCACCTT CTCCAACACC ACCTCCTCCA CCGACATCTG CCGGCCTCAC

481 CAGATCTGCA ACGTGGTGGC CATCCCTGGC AACGCCTCTA TGGACGCCGT GTGCACCTCT

541 ACCTCCCCCA CCAGAAGTAT GGCCCCTGGC GCTGTGCATC TGCCCCAGCC TGTGTCTACC

601 AGATCCCAGC ACACCCAGCC CACCCCTGAG CCTTCTACCG CCCCTTCTAC CAGCTTCCTG

661 CTGCCTATGG GCCCTAGCCC TCCTGCTGAG GGATCTACAG GCGACGAGCC CAAGTCCTGC

721 GACAAGACCC ACACCTGTCC CCCTTGTCCT GCCCCTGAAC TGCTGGGCGG ACCTTCCGTG

781 TTCCTGTTCC CCCCAAAGCC CAAGGACACC CTGATGATCA GCCGGACCCC TGAAGTGACC

841 TGCGTGGTGG TGGATGTGTC CCACGAGGAT CCCGAAGTGA AGTTCAATTG GTACGTGGAC

901 GGCGTGGAAG TGCACAACGC CAAGACCAAG CCCAGAGAGG AACAGTACAA CTCCACCTAC

961 CGGGTGGTGT CCGTGCTGAC CGTGCTGCAC CAGGATTGGC TGAACGGCAA AGAGTACAAG

1021 TGCAAGGTGT CCAACAAGGC CCTGCCTGCC CCCATCGAAA AGACCATCTC CAAGGCCAAG

1081 GGCCAGCCCC GGGAACCCCA GGTGTACACA CTGCCCCCTA GCCGGGAAGA GATGACCAAG

1141 AACCAGGTGT CCCTGACCTG TCTCGTGAAG GGCTTCTACC CCTCCGATAT CGCCGTGGAA

1201 TGGGAGTCCA ACGGCCAGCC TGAGAACAAC TACAAGACCA CCCCCCCTGT GCTGGACTCC

1261 GACGGCTCAT TCTTCCTGTA CTCCAAGCTG ACAGTGGACA AGTCCCGGTG GCAGCAGGGC

1321 AACGTGTTCT CCTGCTCCGT GATGCACGAG GCCCTGCACA ACCACTACAC CCAGAAGTCC

1381 CTGTCCCTGA GCCCTGGAAA AGGCGGCGGA GGATCTGGCG GAGGCGGATC TCAGGTGCAG

1441 CTGGTGCAGT CTGGCGCTGA AGTGAAGAAA CCCGGCTCCT CCGTGAAGGT GTCCTGCAAG

1501 GCTTCTGGCG GCACCTTCTC TACCTACGGC ATCTCCTGGG TGCGACAGGC CCCTGGCCAG

1561 TGCCTGGAAT GGATGGGCGG CATCATCCCC ATCTTCGACA CCGGCAACTC CGCCCAGAGC

1621 TTCCAGGGCA GAGTGACCAT CACCGCCGAC GAGTCTACCT CCACCGCCTA CATGGAACTG

1681 TCCTCCCTGC GGAGCGAGGA CACCGCCGTG TACTACTGCG CCCGGTCCTC TCGGATCTAC

1741 GACCTGAACC CTTCCCTGAC CGCCTACTAC GACATGGACG TGTGGGGCCA GGGCACAATG

1801 GTCACCGTGT CATCTGGTGG TGGCGGCTCT GGTGGCGGAG GAAGTGGGGG AGGGGGTTCT

1861 GGGGGGGGAG GATCTCAGTC TGTGCTGACC CAGCCTCCTT CCGTGTCTGC TGCCCCAGGC

1921 CAGAAAGTGA CAATCTCCTG CAGCGGCTCC AGCTCCAACA TCGGCAACAA CTACGTGTCC

1981 TGGTATCAGC AGCTGCCCGG CACCGCTCCC AAACTGCTGA TCTACGATAA CAACAAGCGG

2041 CCCTCCGGCA TCCCCGACAG ATTCTCCGGC TCTAAGTCCG GCACCTCTGC CACCCTGGGC

2101 ATCACCGGAC TGCAGACAGG CGACGAGGCC GACTACTACT GTGGCACCTG GGACTCCTCC

2161 CTGTCCGCTT GGGTGTTCGG CTGCGGCACC AAACTGACTG TGCTG

***

본 개시내용은 본 개시내용의 개별 양태의 일례로서 의도되는 기재된 특정 양태에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 임의의 조성물 또는 방법은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 실제로, 본원에 나타내고 기재된 것들에 부가하여 본 개시내용의 다양한 변형이 상기 기재 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 자명해질 것이다. 이러한 변형은 첨부되는 청구범위의 범위 내에 속하도록 의도된다.

본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 참조로 포함됨을 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 같은 정도로 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> MEDIMMUNE LIMITED <120> Compounds and methods for treating pain <130> NGFTNF-360 <150> US63/084358 <151> 2020-09-28 <160> 99 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NP_002497.2 <400> 1 Met Ser Met Leu Phe Tyr Thr Leu Ile Thr Ala Phe Leu Ile Gly Ile 1 5 10 15 Gln Ala Glu Pro His Ser Glu Ser Asn Val Pro Ala Gly His Thr Ile 20 25 30 Pro Gln Ala His Trp Thr Lys Leu Gln His Ser Leu Asp Thr Ala Leu 35 40 45 Arg Arg Ala Arg Ser Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ala Arg Val Ala 50 55 60 Gly Gln Thr Arg Asn Ile Thr Val Asp Pro Arg Leu Phe Lys Lys Arg 65 70 75 80 Arg Leu Arg Ser Pro Arg Val Leu Phe Ser Thr Gln Pro Pro Arg Glu 85 90 95 Ala Ala Asp Thr Gln Asp Leu Asp Phe Glu Val Gly Gly Ala Ala Pro 100 105 110 Phe Asn Arg Thr His Arg Ser Lys Arg Ser Ser Ser His Pro Ile Phe 115 120 125 His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp Ser Val Ser Val Trp Val Gly 130 135 140 Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys Gly Lys Glu Val Met Val Leu 145 150 155 160 Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu 165 170 175 Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile 180 185 190 Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val 195 200 205 Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg 210 215 220 Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg 225 230 235 240 Ala <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NP_000585.2 <400> 2 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro 50 55 60 Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 115 120 125 Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly 130 135 140 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 145 150 155 160 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 165 170 175 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 210 215 220 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 225 230 <210> 3 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEDI-578 VH <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110 Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEDI-578 VHCDR1 <400> 4 Thr Tyr Gly Ile Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEDI-578 VHCDR2 <400> 5 Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEDI-578 VHCDR3 <400> 6 Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr Tyr Asp 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 7 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEDI-578 VL (1256A5 VL) <400> 7 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr 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Ala 165 170 175 Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 180 185 190 His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 195 200 205 Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 210 215 220 Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 14 <211> 731 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFR2-Fc_VH#4 - amino acid sequence <400> 14 Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 20 25 30 Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 50 55 60 Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 85 90 95 Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys 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Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile 515 520 525 Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe Gln Gly Arg 530 535 540 Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 545 550 555 560 Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 565 570 575 Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr Tyr Asp Met 580 585 590 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 595 600 605 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Val 610 615 620 Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr 625 630 635 640 Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 645 650 655 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp 660 665 670 Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 675 680 685 Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp 690 695 700 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp 705 710 715 720 Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 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ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1080 ggccagcccc gcgagcctca ggtgtacaca ctgcccccca gccgggaaga gatgaccaag 1140 aaccaggtgt ccctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgatat cgccgtggaa 1200 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1260 gacggctcat tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagccggtg gcagcagggc 1320 aatgtcttca gctgtagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1380 ctgagcctga gccccggaaa gggcggaggc ggatccggag gtgggggatc tcaggtgcag 1440 ctggtgcagt ctggcgccga agtgaagaaa cccggctcta gcgtgaaggt gtcctgcaag 1500 gccagcggcg gcaccttctc cacctacggc atcagctggg tccgccaggc ccctggacag 1560 tgtctggaat ggatgggcgg catcatcccc atcttcgaca ccggcaacag cgcccagagc 1620 ttccagggca gagtgaccat caccgccgac gagagcacct ccaccgccta catggaactg 1680 agcagcctgc ggagcgagga caccgccgtg tactactgcg ccagaagcag ccggatctac 1740 gacctgaacc ccagcctgac cgcctactac gacatggacg tgtggggcca gggcaccatg 1800 gtcacagtgt ctagcggagg cggaggcagc ggaggtggtg gatctggtgg cggaggaagt 1860 ggcggcggag gctctcagag cgtgctgacc cagccccctt ctgtgtctgc cgcccctggc 1920 cagaaagtga ccatctcctg cagcggcagc agcagcaaca tcggcaacaa ctacgtgtcc 1980 tggtatcagc agctgcccgg caccgcccct aagctgctga tctacgacaa caacaagcgg 2040 cccagcggca tccccgaccg gtttagcggc agcaagagcg ggacttctgc tacactgggc 2100 atcacaggcc tgcagaccgg cgacgaggcc gactactact gcggcacctg ggacagcagc 2160 ctgagcgctt gggtgttcgg ctgcggcacc aagctgacag tgctg 2205 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> (Gly4Ser)4 20 aa linker sequence <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 20 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ndimab varB - L chain amino acid sequence <400> 20 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ile Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 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1440 ggctctagcg tgaaggtgtc ctgcaaggcc agcggcggca ccttctccac ctacggcatc 1500 agctgggtcc gccaggcccc tggacagtgt ctggaatgga tgggcggcat catccccatc 1560 ttcgacaccg gcaacagcgc ccagagcttc cagggcagag tgaccatcac cgccgacgag 1620 agcacctcca ccgcctacat ggaactgagc agcctgcgga gcgaggacac cgccgtgtac 1680 tactgcgcca gaagcagccg gatctacgac ctgaacccca gcctgaccgc ctactacgac 1740 atggacgtgt ggggccaggg caccatggtc acagtgtcta gcggaggcgg aggcagcgga 1800 ggtggtggat ctggtggcgg aggaagtggc ggcggaggct ctcagagcgt gctgacccag 1860 cccccttctg tgtctgccgc ccctggccag aaagtgacca tctcctgcag cggcagcagc 1920 agcaacatcg gcaacaacta cgtgtcctgg tatcagcagc tgcccggcac cgcccctaag 1980 ctgctgatct acgacaacaa caagcggccc agcggcatcc ccgaccggtt tagcggcagc 2040 aagagcggga cttctgctac actgggcatc acaggcctgc agaccggcga cgaggccgac 2100 tactactgcg gcacctggga cagcagcctg agcgcttggg tgttcggctg cggcaccaag 2160 ctgacagtgc tg 2172 <210> 24 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NGF-NG VH amino acid sequence <400> 24 Gln Val Gln Leu 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acggccgtat attattgtgc acgttcaagt 300 cgtatctacg atctgaaccc gtccctgacc gcctactacg atatggatgt ctggggccag 360 gggacaatgg tcaccgtctc gagt 384 <210> 26 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NGF-NG VL amino acid sequence <400> 26 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 27 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGF-NG VL nucleotide sequence <400> 27 cagtctgtgc tgactcagcc gccatcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc 60 tcctgctctg gaagcagctc cgacattggg aataattatg tatcgtggta ccagcagctc 120 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Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 81 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1218H5 VL amino acid sequence <400> 81 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Thr Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Ser Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 82 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1230H7 VH amino acid sequence <400> 82 Glu Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu 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Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 100 105 110 Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 95 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MEDI-578 VL amino acid sequence with G->C <400> 95 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 96 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1230D8 VH amino acid sequence <400> 96 Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val 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acctccccca ccagaagtat ggcccctggc gctgtgcatc tgccccagcc tgtgtctacc 600 agatcccagc acacccagcc cacccctgag ccttctaccg ccccttctac cagcttcctg 660 ctgcctatgg gccctagccc tcctgctgag ggatctacag gcgacgagcc caagtcctgc 720 gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaac tgctgggcgg accttccgtg 780 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc tgaagtgacc 840 tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggat cccgaagtga agttcaattg gtacgtggac 900 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagtacaa ctccacctac 960 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag 1020 tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaaa agaccatctc caaggccaag 1080 ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcccccta gccgggaaga gatgaccaag 1140 aaccaggtgt ccctgacctg tctcgtgaag ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1200 tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc 1260 gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc 1320 aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1380 ctgtccctga gccctggaaa aggcggcgga ggatctggcg gaggcggatc tcaggtgcag 1440 ctggtgcagt ctggcgctga agtgaagaaa cccggctcct ccgtgaaggt gtcctgcaag 1500 gcttctggcg gcaccttctc tacctacggc atctcctggg tgcgacaggc ccctggccag 1560 tgcctggaat ggatgggcgg catcatcccc atcttcgaca ccggcaactc cgcccagagc 1620 ttccagggca gagtgaccat caccgccgac gagtctacct ccaccgccta catggaactg 1680 tcctccctgc ggagcgagga caccgccgtg tactactgcg cccggtcctc tcggatctac 1740 gacctgaacc cttccctgac cgcctactac gacatggacg tgtggggcca gggcacaatg 1800 gtcaccgtgt catctggtgg tggcggctct ggtggcggag gaagtggggg agggggttct 1860 ggggggggag gatctcagtc tgtgctgacc cagcctcctt ccgtgtctgc tgccccaggc 1920 cagaaagtga caatctcctg cagcggctcc agctccaaca tcggcaacaa ctacgtgtcc 1980 tggtatcagc agctgcccgg caccgctccc aaactgctga tctacgataa caacaagcgg 2040 ccctccggca tccccgacag attctccggc tctaagtccg gcacctctgc caccctgggc 2100 atcaccggac tgcagacagg cgacgaggcc gactactact gtggcacctg ggactcctcc 2160 ctgtccgctt gggtgttcgg ctgcggcacc aaactgactg tgctg 2205

Claims

통증 감소 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하는 방법으로서, 대상체에게 피하 고정 용량의 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 결합 분자는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하고, NGF 길항제 도메인은 항-NGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, TNFα 길항제 도메인은 TNFR의 가용성 TNFα 결합 단편을 포함하고, 방법은 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하는 것인, 방법.
제1항에 있어서, 결합 분자의 피하 고정 용량은 약 5~200 mg인, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 결합 분자의 피하 고정 용량은 약 7.5~150 mg인, 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자의 피하 고정 용량은 약 7.5 mg, 약 25 mg, 약 75 mg 또는 약 150 mg인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 피하 고정 용량은 결합 분자 30 mg의 정맥내 고정 용량과 동등한 것인, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 용량은 2주마다 적어도 1회 투여되는 것인, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 용량은 적어도 12주 동안 투여되는 것인, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 통증은 만성 통증을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 통증은 골관절염 통증을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 통증은 무릎의 골관절염 통증을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 결합 분자의 투여 전에 3개월 이상 동안 통증을 겪은 대상체인, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 통증은 관절 염증과 관련이 있는 것인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 골관절염을 앓는 대상체인, 방법.
제13항에 있어서, 대상체는 무릎의 일측성 골관절염을 앓는 대상체인, 방법.
제13항 또는 제14항에 있어서, 대상체는 중심 독자 평가(central reader evaluation)에 따라 0 내지 4의 켈그렌-로렌스(Kellgren-Lawrence, KL) 등급 척도에서 무릎 관절의 적어도 2등급의 골관절염을 앓는 대상체인, 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 결합 분자를 투여하기 전에 다음의 단계를 포함하는 방법:
a. 대상체에게 NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합을 투여하는 단계, 및
b. i) NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합이 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하지 않는지 결정하고/하거나, ii) 대상체가 NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합에 불내성인지 결정하는 단계.
제16항에 있어서, NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합은 적어도 2주 동안 투여되는 것인, 방법.
제16항에 있어서, NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합은 결합 분자의 투여 전에 적어도 2주 동안 대상체에게 투여되었던 것인, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 NSAID, 강한 오피오이드, 약한 오피오이드, COX-2 억제제, 아세트아미노펜 또는 이들의 조합에 불내성인 대상체인, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 용량의 결합 분자의 투여 전에 SARS-CoV2 감염에 대해 대상체를 테스트하는 단계를 포함하는 방법.
제20항에 있어서, SARS-CoV2 감염에 대해 대상체를 테스트하는 단계는 고정 용량의 결합 분자의 투여 전에 SARS-CoV2 유전 물질에 대해 대상체를 테스트하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 기준선에서 SARS-CoV2에 감염되지 않은 대상체인, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 기준선에서 웨스턴 온타리오 및 맥마스터 대학교 골관절염(WOMAC) 지수의 통증 하위 척도를 사용하여 측정 시 관절에서 적어도 5의 평균 WOMAC 통증 점수를 갖는 대상체인, 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 기준선에서 통증 수치 등급 척도(NRS)로 측정 시 관절에서 적어도 5의 평균 통증 강도 점수를 갖는 대상체인, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 기준선으로부터 감소시키는 것인, 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 용량은 12주 동안 2주마다 투여되고, 방법은 적어도 12주까지 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 기준선으로부터 감소시키는 것인, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 기준선으로부터 적어도 30%만큼 감소시키는 것인, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 일일 NRS 통증 점수의 주간 평균을 기준선으로부터 적어도 50%만큼 감소시키는 것인, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 기준선으로부터 감소시키는 것인, 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 용량은 12주 동안 2주마다 투여되고, 방법은 적어도 12주까지 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 기준선으로부터 감소시키는 것인, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 기준선으로부터 적어도 30%만큼 감소시키는 것인, 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 WOMAC 통증 하위 척도 점수를 기준선으로부터 적어도 50%만큼 감소시키는 것인, 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 WOMAC 신체 하위 척도 점수를 기준선으로부터 적어도 30%만큼 감소시키는 것인, 방법.
제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 WOMAC 신체 하위 척도 점수를 기준선으로부터 적어도 50%만큼 감소시키는 것인, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 골관절염의 환자 종합 평가(PGA)를 기준선으로부터 개선하는 것인, 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 고정 용량은 12주 동안 2주마다 투여되고, 방법은 적어도 12주까지 골관절염의 PGA를 기준선으로부터 개선하는 것인, 방법.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 골관절염의 PGA를 적어도 2점만큼 개선하는 것인, 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 결합 분자의 단일 용량 투여 후 통증 감소가 관찰되는 것인, 방법.
제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 NSAID를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 오피오이드를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 아세트아미노펜을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 COX-2 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 TrkA, p75NRT, 또는 TrkA 및 P75NRT에 대한 NGF 결합을 억제할 수 있는 것인, 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 p75NRT에 대한 NGF 결합보다 TrkA에 대한 NGF 결합을 우선적으로 차단하는 것인, 방법.
제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 약 0.25~0.44 nM의 친화도로 인간 NGF와 결합하는 것인, 방법.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 CDR 세트인 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및 CDR 세트인 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함하고, HCDR1은 서열번호 4 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖고, HCDR2는 서열번호 5 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖고, HCDR3은 서열번호 6 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 6의 아미노산 서열, SSRIYDFNSALISYYDMDV(서열번호 11), 또는 SSRIYDMISSLQPYYDMDV(서열번호 12)를 갖고, LCDR1은 서열번호 8 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖고, LCDR2는 서열번호 9 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖고, LCDR3은 서열번호 10 또는 최대 2개 아미노산 치환이 있는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 것인, 방법.
제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 CDR 세트인 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및 CDR 세트인 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 VL 도메인을 포함하고,
HCDR1은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하고,
HCDR2는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하고,
HCDR3은 서열번호 6의 아미노산 서열, SSRIYDFNSALISYYDMDV(서열번호 11), 또는 SSRIYDMISSLQPYYDMDV(서열번호 12)를 포함하고,
LCDR1은 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고,
LCDR2는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고,
LCDR3은 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 3 또는 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VH를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 서열번호 7 또는 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 VL을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 전체 H₂L₂ 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)₂ 단편 또는 단일 사슬 Fv(scFv) 단편인, 방법.
제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF 항체 또는 이의 단편은 인간화, 키메라, 영장류화 또는 완전 인간형인, 방법.
제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF scFv 단편은 N-말단으로부터 C-말단까지, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₃(서열번호 15) 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 항-NGF scFv 단편은 N-말단으로부터 C-말단까지, 서열번호 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₄(서열번호 19) 및 서열번호 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, TNFR은 TNFR-2인, 방법.
제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, TNFR-2 단편은 면역글로불린 Fc 도메인에 융합되는 것인, 방법.
제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 Fc 도메인은 인간 IgG1 Fc 도메인인, 방법.
제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, TNFα 길항제는 서열번호 13에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열, 또는 이의 기능적 단편을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 링커를 통해 TNFα 길항제에 융합된 NGF 길항제를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 융합 단백질의 동종이량체를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 N-말단으로부터 C-말단까지, 서열번호 13의 아미노산 1~235에 상응하는 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 TNFR-2의 TNFα 결합 단편, 인간 IgG1Fc 도메인, 10개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₂(서열번호 98), 서열번호 3 또는 94의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VH, 15개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₃(서열번호 15) 및 서열번호 7 또는 95의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 서열번호 14의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 N-말단으로부터 C-말단까지, 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 TNFR-2의 TNFα 결합 75 kD 단편, 10개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₂(서열번호 98), 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 VH, 20개 아미노산 링커 서열 (GGGGS)₄(서열번호 19), 및 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 7의 위치 102, 103 또는 104에 상응하는 아미노산 위치의 글리신 잔기는 시스테인 잔기로 변형되고, 서열번호 3의 위치 44에 상응하는 아미노산 위치의 글리신 잔기는 시스테인 잔기로 변형되는 것인, 방법.
제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 것인, 방법.
제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 분자는 서열번호 17의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 융합 폴리펩티드의 동종이량체를 포함하는 것인, 방법.
통증 감소 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하는 방법에 사용하기 위한 결합 분자로서, 방법은 대상체에게 피하 고정 용량의 결합 분자를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 결합 분자는 NGF 길항제 도메인 및 TNFα 길항제 도메인을 포함하고, NGF 길항제 도메인은 항-NGF 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, TNFα 길항제 도메인은 TNFR의 가용성 TNFα 결합 단편을 포함하고, 방법은 대상체의 통증을 감소시키거나 예방하는 것인, 사용하기 위한 결합 분자.
제1항 내지 제65항 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한 결합 분자.