TW202228768A - 用於治療疼痛之化合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露提供了用於在治療或預防疼痛中使用之新型方法和劑量方案，其中該結合分子包含NGF拮抗劑結構域和TNFɑ拮抗劑結構域，其中該NGF拮抗劑結構域係抗NGF抗體或其抗原結合片段，並且其中該TNFα拮抗劑結構域包含TNFR的可溶性TNFɑ結合片段。

Description

用於治療疼痛之化合物及方法
疼痛係尋求醫療幫助的最常見症狀之一，並且是所有去看醫師的患者中一半患者的主訴。儘管已有許多疼痛藥物存在並被廣泛使用，但是疼痛尤其是慢性疼痛的消除一直沒有取得成功。因此，社會負擔仍然很高。各種研究估計，疼痛導致每年損失5000萬個工作日和損失612億美元的生產力。對於慢性疼痛患者，只有約一半的人能夠藉由現有的處方治療選擇來控制疼痛。此外，處方疼痛藥物市場總額每年大約為250億美元。
疼痛係骨關節炎之主要症狀，而骨關節炎係老年人殘疾的主要原因和社會成本之來源。隨著人口的老齡化和日益肥胖，這種綜合症比過去幾十年變得更加普遍（Hunter和Bierma-Zeinstra Lancet [柳葉刀], 393: 1745-59 (2019)）。目前骨關節炎疼痛的治療包括口服低劑量NSAID。然而，由於NSAID與心血管事件導致的死亡率增加有關，NSAID的使用較佳的是僅限於短期使用（Kolasinski等人, Arthritis Care & Research [關節炎護理與研究], 72 (2) 149-162 (2020)）。正如該等數據所表明的那樣，對安全且有效的新型鎮痛藥仍然有很大需求。
降低分泌的神經生長因子（NGF或β-NGF）的組織水平或抑制分泌的神經生長因子（NGF或β-NGF）的作用的治療劑正有可能成為此類新型鎮痛藥。NGF在神經系統的發育中起著眾所周知的關鍵作用；然而，NGF也是一個經充分驗證的疼痛靶點，因為它會導致動物和人之疼痛。在成年人中，NGF尤其促進一部分中樞和外周神經元的健康和存活（Huang和Reichardt, Ann. Rev. Neurosci. [神經科學年評] 24: 677-736 (2001)）。NGF還有助於調節該等神經元之功能特徵，並對稱為傷害感受器的疼痛感覺受體的敏感性或興奮性進行強直控制（Priestley等人, Can. J. Physiol. Pharmacol. [加拿大生理藥理學雜誌] 80: 495-505 (2002)；Bennett, Neuroscientist [神經科學家] 7: 13-17 (2001)）。傷害感受器感知各種引起疼痛感知（傷害感受）之有害刺激並將其傳輸到中樞神經系統。NGF受體位於傷害感受器上。在受傷和發炎的組織中NGF之表現增加，並且在處於人的疼痛狀態時，NGF之表現上調。因此，由於NGF在傷害感受中的作用，降低NGF水平的NGF結合劑具有作為鎮痛治療劑之效用。
腫瘤壞死因子-α（TNFα），也稱為惡病質素，係一種多效性細胞介素，具有廣泛的生物活性，包括細胞毒性、免疫細胞增殖、炎症、腫瘤發生和病毒複製。Kim等人, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 374, 1374 (2007)。TNFα首先作為跨膜蛋白（tm TNFα）產生，然後被金屬蛋白酶切割成可溶性形式（sTNFα）。Wallis, Lancet Infect. Dis. [柳葉刀傳染病] 8 (10): 601 (2008)。TNFα（約17 kDa）作為剛性同源三聚體分子存在，與細胞表面TNF受體1或TNF受體2結合，誘導了受體寡聚化和訊息傳遞。已知炎性細胞介素（和特別是TNFα）在痛覺過敏的產生中起作用。Leung, L. 和Cahill, CM., J. Neuroinflammation[神經炎症雜誌] 7: 27 (2010)。一些初步數據示出，TNFα抑制劑可能有助於控制神經性疼痛。參見例如，Sommer C等人, J . Peripher. Nerv. Syst.[周圍神經系統雜誌] 6: 67-72 (2001)，Cohen等人, A & A [A & A雜誌] 2013年2月, 116, 2, 455-462，Genevay等人, Ann Rheum Dis [風濕病年鑒] 2004, 63, 1120-1123。測試TNFα抑制劑作為治療神經性疼痛的單一療法的臨床研究結果仍無定論。參見Leung和Cahill (2010)。
先前揭露的包含抗NGF抗原結合片段和可溶性TNFR-2部分的結合分子被示出係NGF和TNFα的有效抑制劑。此外，這種結合分子在疼痛的動物模型中顯示出了在減輕疼痛症狀方面具有治療效果。參見例如，美國專利案號9,884,911，將其藉由引用以其全文併入。鑒於該等結合分子的明確治療效用，需要用於結合分子的改善的劑量方案用於治療例如減輕或預防有需要的受試者的疼痛（例如，骨關節炎疼痛）。
本揭露提供了用於治療受試者的疼痛（例如用於減輕或預防疼痛）的新型方法和劑量方案，該等方法和劑量方案包括向該受試者投與皮下固定劑量的結合分子，其中該結合分子包含NGF拮抗劑部分和TNFα拮抗劑部分。在一些實施方式中，該投與比單獨投與當量的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑更有效地控制受試者之疼痛。
在一些實施方式中，本揭露提供用於減輕或預防有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向該受試者投與皮下固定劑量的結合分子，其中該結合分子包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域，其中該NGF拮抗劑結構域係抗NGF抗體或其抗原結合片段，其中該TNFα拮抗劑結構域包含TNFR的可溶性TNFα結合片段，並且其中該方法減輕或預防受試者的疼痛。在一些實施方式中，該結合分子的皮下固定劑量係5-200 mg。在一些實施方式中，該結合分子的皮下固定劑量係7.5-150 mg。在一些實施方式中，該結合分子的皮下固定劑量係7.5 mg、25 mg、75 mg或150 mg。在一些實施方式中，該皮下固定劑量相當於30 mg該結合分子的靜脈內固定劑量。在一些實施方式中，至少每兩週一次投與該固定劑量。在一些實施方式中，將該固定劑量投與至少12週。在一些實施方式中，該疼痛包含慢性疼痛。在一些實施方式中，該疼痛包含骨關節炎疼痛。在一些實施方式中，該疼痛包含膝關節的骨關節炎疼痛。
在一些實施方式中，在投與該結合分子之前，該受試者已經患有疼痛3個月或更長的時間。在一些實施方式中，該疼痛與關節炎症相關。在一些實施方式中，該受試者患有骨關節炎。在一些實施方式中，該受試者患有單側膝關節的骨關節炎。在一些實施方式中，根據中心讀取器的評估，該受試者在0至4級的Kellgren-Lawrence（KL）分級量表中具有2級膝關節骨關節炎。
在一些實施方式中，在向該受試者投與該結合分子之前，該方法包括：a. 向該受試者投與NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合，和b. 確定i) NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合不減輕或預防受試者的疼痛，和/或ii) 確定該受試者不耐受NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合。在一些實施方式中，投與NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合至少2週。在一些實施方式中，在投與該結合分子之前，向該受試者投與NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合至少2週。在一些實施方式中，該受試者不耐受NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚（對乙醯胺基酚）或其組合。
在一些實施方式中，該方法包括在投與固定劑量的結合分子之前，測試受試者的SARS-CoV2感染。在一些實施方式中，測試受試者的SARS-CoV2感染包括在投與固定劑量的結合分子之前，測試受試者的SARS-CoV2基因材料。在一些實施方式中，在基線時，該受試者沒有感染SARS-CoV2。
在一些實施方式中，在基線時，如在疼痛數值評定量表（NRS）上所測量的，該受試者在一個關節中具有至少為5的平均疼痛強度得分。在一些實施方式中，該方法相對於基線降低了受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值。在一些實施方式中，每2週一次投與該固定劑量，持續投與12週，並且其中該方法相對於基線在至少第12週降低了受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值。在一些實施方式中，該方法使受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值相對於基線降低了至少30%。在一些實施方式中，該方法使受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值相對於基線降低了至少50%。
在一些實施方式中，在基線時，如使用WOMAC指數的疼痛分量表所測量的，該受試者在一個關節中具有至少為5的平均西安大略大學和麥克馬斯特大學骨關節炎（WOMAC）疼痛得分。在一些實施方式中，該方法相對於基線降低了受試者的WOMAC疼痛分量表得分。在一些實施方式中，每2週一次投與該固定劑量，持續投與12週，並且該方法相對於基線在至少第12週降低了受試者的每日WOMAC疼痛得分的週平均值。在一些實施方式中，該方法使受試者的WOMAC疼痛分量表得分相對於基線降低了至少30%。在一些實施方式中，該方法使受試者的WOMAC疼痛分量表得分相對於基線降低了至少50%。在一些實施方式中，該方法使受試者的WOMAC生理分量表得分相對於基線降低了至少30%。在一些實施方式中，該方法使受試者的WOMAC生理分量表得分相對於基線降低了至少50%。
在一些實施方式中，該方法相對於基線改善了骨關節炎的患者整體評估（PGA）。在一些實施方式中，每2週一次投與該固定劑量，持續投與12週，並且其中方法相對於基線在至少第12週降低了骨關節炎的PGA。在一些實施方式中，該方法使骨關節炎的PGA改善了至少2個得分。
在一些實施方式中，在受試者中單劑量投與該結合分子之後，觀察到了疼痛減輕。在一些實施方式中，該方法包括向該受試者投與NSAID。在一些實施方式中，該方法包括向該受試者投與類鴉片。在一些實施方式中，該方法包括向該受試者投與對乙醯胺基酚。在一些實施方式中，該方法包括向該受試者投與COX-2抑制劑。
在一些實施方式中，該抗NGF抗體或其片段可抑制NGF與TrkA、p75NRT、或TrkA和P75NRT二者的結合。在一些實施方式中，該抗NGF抗體或其片段，相比阻斷NGF與p75NRT的結合，優先阻斷NGF與TrkA的結合。在一些實施方式中，該抗NGF抗體或其片段以約0.25-0.44 nM的親和力結合人NGF。在一些實施方式中，該抗NGF抗體或其片段包含含有一組CDR HCDR1、CDR HCDR2、CDR HCDR3的抗體VH結構域和含有一組CDR LCDR1、CDR LCDR2和CDR LCDR3的抗體VL結構域，其中該HCDR1具有SEQ ID NO: 4或具有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 4的胺基酸序列，該HCDR2具有SEQ ID NO: 5或具有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 5的胺基酸序列，該HCDR3具有SEQ ID NO: 6或具有有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 6的胺基酸序列、SSRIYDFNSALISYYDMDV（SEQ ID NO: 11）或SSRIYDMISSLQPYYDMDV（SEQ ID NO: 12），該LCDR1具有SEQ ID NO: 8或具有有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 8的胺基酸序列，該LCDR2具有SEQ ID NO: 9或具有有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 9的胺基酸序列，並且該LCDR3具有SEQ ID NO: 10或具有有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 10的胺基酸序列。在一些實施方式中，該抗NGF抗體或其片段包含含有一組CDR HCDR1、CDR HCDR2、CDR HCDR3的抗體VH結構域和含有一組CDR LCDR1、CDR LCDR2和CDR LCDR3的抗體VL結構域，其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列，該HCDR3包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列、SSRIYDFNSALISYYDMDV（SEQ ID NO: 11）或SSRIYDMISSLQPYYDMDV（SEQ ID NO: 12），該LCDR1包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列；並且該LCDR3包含SEQ ID NO: 10的胺基酸序列。在一些實施方式中，該抗NGF抗體或其片段包含具有與SEQ ID NO: 3或94的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VH。在一些實施方式中，該抗NGF抗體或其片段包含具有與SEQ ID NO: 7或95的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VL。在一些實施方式中，該抗NGF抗體或其片段係全H 2L 2抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab) 2片段或單鏈Fv（scFv）片段。在一些實施方式中，該抗NGF抗體或其片段係人源化的、嵌合的、靈長類動物化的或全人的。在一些實施方式中，該抗NGF scFv片段從N-末端到C-末端包含含有與SEQ ID NO: 3的胺基酸至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VH，15個胺基酸的連接子（linker）序列(GGGGS) 3（SEQ ID NO: 15），和含有與SEQ ID NO: 7的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VL。在一些實施方式中，該抗NGF scFv片段從N-末端到C-末端包含含有與SEQ ID NO: 94的胺基酸至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VH，20個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 4（SEQ ID NO: 19），和含有與SEQ ID NO: 95的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VL。
在一些實施方式中，該TNFR係TNFR-2。在一些實施方式中，該TNFR-2片段融合至免疫球蛋白Fc結構域。在一些實施方式中，該免疫球蛋白Fc結構域係人IgG1 Fc結構域。在一些實施方式中，該TNFα拮抗劑結構域包含與SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列，或其功能片段。
在一些實施方式中，該結合分子包含融合蛋白，該融合蛋白包含藉由連接子與TNFα拮抗劑融合的NGF拮抗劑。在一些實施方式中，該結合分子包含該融合蛋白的同源二聚體。在一些實施方式中，該結合分子包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體從N-末端到C-末端包含TNFR-2的TNFα結合片段，其包含與對應於SEQ ID NO: 13的胺基酸1-235的序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列；人IgG1Fc結構域；10個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 2（SEQ ID NO: 98）；包含與SEQ ID NO 3或94的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VH；15個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 3（SEQ ID NO: 15）；和包含與SEQ ID NO: 7或95的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VL。在一些實施方式中，該結合分子包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體包含與SEQ ID NO: 14的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施方式中，該結合分子包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體從N-末端到C-末端包含TNFR-2的TNFα結合75 kD片段，其包含SEQ ID NO: 13的胺基酸序列；10個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 2（SEQ ID NO: 98）；包含SEQ ID NO: 94的胺基酸序列的VH；20個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 4（SEQ ID NO: 19）；和包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的VL。在一些實施方式中，在與SEQ ID NO: 7的位置102、103或104相對應的胺基酸位置處的甘胺酸殘基被修飾為半胱胺酸殘基，並且其中在與SEQ ID NO: 3的位置44相對應的胺基酸位置處的甘胺酸殘基被修飾為半胱胺酸殘基。在一些實施方式中，該結合分子包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。在一些實施方式中，該結合分子包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體包含與SEQ ID NO: 17的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%或99%相同的胺基酸序列。
本揭露提供了用於在減輕或預防有需要的受試者的疼痛之方法中使用的結合分子，該方法包括向該受試者投與皮下固定劑量的結合分子，其中該結合分子包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域，其中該NGF拮抗劑結構域係抗NGF抗體或其抗原結合片段，其中該TNFα拮抗劑結構域包含TNFR的可溶性TNFα結合片段，並且其中該方法減輕或預防受試者的疼痛。
定義
應當注意，術語「一個/種（a或an）」實體係指一個/種或多個/種所述實體。因此，術語「一個/種（a或an）」、「一個/種或多個/種」和「至少一個/種」在本文中可互換地使用。
此外，在本文中使用時「和/或」應當理解為在有或沒有另一者的情況下，兩個指定的特徵或組分中的每一者的特定揭露。因此，如在本文中在諸如「A和/或B」的短語中使用的術語「和/或」旨在包括「A和B」、「A或B」、「A」（單獨）、以及「B」（單獨）。同樣，如在諸如「A、B和/或C」的短語中使用的術語「和/或」旨在涵蓋以下方面中的每一個：A、B、和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A（單獨）；B（單獨）；和C（單獨）。
應當理解，無論在什麼情況下在本文中用語言「包含」描述方面時，還提供了關於「由……組成」和/或「主要由……組成」描述的其他類似方面。
術語「約」或「大約」意指在如由熟悉該項技術者所確定的特定值的可接受誤差範圍內，這將部分取決於如何測量或確定該值，即，測量系統的局限性。例如，根據本領域的實踐，「約」可以意指在一個或大於一個標準差內。可替代地，「約」可以意指高於或低於給定值多達20%、多達15%、多達10%、多達5%或多達1%的範圍。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有如本揭露所涉及領域的普通技術人員通常理解的相同含義。例如，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology [簡明生物醫學和分子生物學詞典], Juo, Pei-Show, 第2版, 2002, CRC Press [CRC出版社]；Dictionary of Cell and Molecular Biology [細胞和分子生物學詞典], 第3版, 1999, Academic Press [學術出版社]；以及Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology [生物化學和分子生物學牛津詞典], 修訂版, 2000, Oxford University Press [牛津大學出版社]為技術人員提供在本揭露中使用的術語中的許多術語的通用詞典注釋。
單位、前綴和符號係以它們的國際單位系統（Système International de Unites）（SI）接受的形式表示。數值範圍包括限定該範圍的數字。除非另外說明，否則胺基酸序列係以胺基至羧基取向從左向右書寫。本文所提供的小標題不是本揭露之各個方面的限制，可以藉由作為一個整體參考本說明書來獲得該等方面。因此，藉由以其全文參考說明書，更充分地定義了緊接著在下文中定義的術語。
如本文所用，術語「結合分子」在其最廣泛含義上係指特異性結合抗原決定簇（例如抗原）的分子。結合分子的非限制性實例包括抗體或其片段、可溶性受體融合蛋白或其片段、非免疫球蛋白骨架或其片段，其各自保留了抗原特異性結合。以下提供了示例性可溶性受體融合蛋白和抗體。在某些實施方式中，可以將該結合分子工程化以包含此類抗體或其片段、可溶性受體融合蛋白或其片段以及非基於免疫球蛋白的骨架或其片段的組合。
該結合分子或該結合分子的識別抗原的任何部分在本文中被稱為「結合結構域」。除非確切地提及全尺寸的結合分子如天然存在的抗體，否則術語「結合分子」涵蓋但不限於全尺寸的抗體或其他非抗體結合分子，以及這類結合分子的抗原結合片段、變體、類似物或衍生物，例如天然存在的抗體或免疫球蛋白分子或工程化的結合分子或以與全尺寸的結合分子類似的方式結合抗原的片段。
在某些實施方式中，本揭露提供了某些多特異性結合分子（例如，雙特異性結合分子、三特異性結合分子、四特異性結合分子等）或其抗原結合片段、變體或衍生物。如本文所用，多特異性結合分子可以包括一個或多個抗體結合結構域、一個或多個非抗體結合結構域或其組合。
如本文所用，術語「神經生長因子」（「NGF」）（在文獻中也稱為β-神經生長因子）係指在各種神經元的生長和存活中起作用的分泌蛋白。人NGF呈現為基因庫登錄號NP_002497.2，並且在此處呈現為SEQ ID NO: 1。如本文所用，術語NGF不限於人NGF，並且包括人NGF的所有物種直系同源物。術語「NGF」涵蓋NGF的響應形式（響應NGF）、全長NGF以及細胞內加工而產生的任何形式的NGF。該術語還涵蓋天然存在的NGF的變體，例如，剪接變體、等位基因變體和同種型。NGF可結合兩種受體：p75神經營養因子受體（p75（NTR））和TrkA（跨膜酪胺酸激酶）。NGF係一個經充分驗證的疼痛靶點，它已知會介導傷害感受器的敏化。
NGF介導的疼痛尤其適合用如本文所示的結合分子進行安全和有效的治療，因為外周中的NGF水平響應於有害刺激而增加並且抗體具有低血腦屏障滲透性。可以在本文所述之療法和組成物中使用的許多抗NGF抗體及其抗原結合片段可見於文獻中，參見例如，PCT公開案號WO 02/096458和WO 04/032870。
術語「MEDI-578」係指特異性結合NGF的抗體，其係國際申請號PCT/GB 2006/000238和美國專利申請公開案號2008/0107658 A1的主題，這兩篇文獻藉由引用以其全文併入本文。MEDI-578重鏈和輕鏈序列分別示出於SEQ ID NO: 3和7中。
術語NGF-NG係指特異性結合NGF的抗體。NGF-NG重鏈和輕鏈序列分別示出於SEQ ID NO: 24和26中。
如本文所用，術語「腫瘤壞死因子α」（「TNFα」）（在文獻中也稱為惡病質素；APC1蛋白；腫瘤壞死因子；TNF；或腫瘤壞死因子配位基超家族成員2）係指特定TNFα蛋白並且不是TNF配位基的超家族。人TNFα呈現為基因庫登錄號NP_000585.2，並且呈現為SEQ ID NO: 2。如本文所用，術語TNFα不限於人TNF，並且包括人TNFα的所有物種直系同源物。術語「TNFα」涵蓋TNFα的響應形式（響應TNFα）、全長TNFα以及細胞內加工而產生的任何形式的TNFα。該術語還涵蓋天然存在的和非天然存在的TNFα的變體，例如，剪接變體、等位基因變體和同種型。TNFα可結合兩種受體，TNFR1（TNF受體1型；CD120a；p55/60）和TNFR2（TNF受體2型；CD120b；p75/80）。TNFα作為促炎性細胞介素起作用，例如，在神經炎症中起作用。例如，TNFα被認為在功能上參與神經性疼痛的產生（Leung, L. 和Cahill, CM., J. Neuroinflammation[神經炎症雜誌] 7: 27 (2010)）。
「分離的」結合分子、多肽、抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或組成物係指處於非天然存在的形式的結合分子、多肽、抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或組成物。分離的結合分子、多肽、抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或組成物包括已經被改變、調整、組合、重排、工程化或以其他方式操縱至它們不再處於自然界中發現的形式的程度的那些。在一些方面中，分離的結合分子、抗體、多核苷酸、載體、宿主細胞或組成物係「重組的」。
如本文所用，術語「多功能多肽」和「雙功能多肽」係指被設計以靶向兩個或更多個抗原的非天然存在的結合分子。本文所述之示例性多功能多肽係包含抗NGF抗原結合片段或抗體部分和可溶性TNFR2部分的多功能結合分子。
術語「抗體」意指藉由免疫球蛋白分子的可變區中的至少一個抗原識別位點識別並特異性結合靶標（諸如蛋白質、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂質或前述的組合）的免疫球蛋白分子。如本文所用，術語「抗體」涵蓋完整多株抗體，完整單株抗體，抗體片段（如Fab、Fab'、F(ab') 2、以及Fv片段），單鏈Fv（scFv）突變體，產生自至少兩個完整抗體的多特異性抗體（如雙特異性抗體、三特異性抗體、四特異性抗體等），嵌合抗體，人源化抗體，人抗體，包含抗體的抗原決定部分的融合蛋白，以及包含抗原酶識別位點的任何其他修飾的免疫球蛋白分子，只要該等抗體展現出所希望的生物活性。抗體可以是以下五大類免疫球蛋白中的任一種：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亞類（同種型）（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2），基於它們的重鏈恒定結構域的特性分別被稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類別的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亞基結構和三維構型。
在一些實施方式中，「阻斷性」結合分子，例如，阻斷性抗體或「拮抗劑」結合分子（例如像拮抗劑抗體或融合蛋白）係抑制或降低與其結合的抗原（例如NGF或TNFα）的生物活性的「阻斷性」結合分子。在某些方面中，阻斷性抗體或拮抗劑結合分子基本上或完全地抑制抗原的生物活性。例如，生物活性可以降低0.01%、0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、95%或甚至100%。
如本文所用，「拮抗劑」和「拮抗劑結構域」包括結合其靶標（例如，TNFα或NGF）從而阻斷或抑制靶標與受體的相互作用的多肽或其他的分子。因此，NGF和/或TNFα拮抗劑包括阻斷或抑制NGF與trkA或p75神經營養因子相互作用、或TNFα與TNFR-1或TNFR-2相互作用的分子。NGF和/或TNFα拮抗劑還包括降低p38磷酸化和/或ERK磷酸化的分子。示例性拮抗劑包括但不限於抗NGF抗體或其抗原結合片段，和靶標特異性、可溶性、非信號傳導的TNF-α受體肽（「誘餌受體」或其配位基結合片段）。
術語「抗體片段」係指完整抗體的一部分並且是指完整抗體的抗原決定可變區。抗體片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab') 2、以及Fv片段、線性抗體、單鏈抗體以及由抗體片段形成的多特異性抗體。本揭露還提供了本文其他地方所述之非抗體結合分子的抗原結合片段。
「單株抗體」係指參與單一抗原決定簇或表位的高度特異性識別和結合的同源抗體群。這與典型地包括針對不同抗原決定簇的不同抗體的多株抗體相反。術語「單株抗體」涵蓋完整和全長單株抗體以及抗體片段（如Fab、Fab'、F(ab') 2、Fv）、單鏈（scFv）突變體、包含抗體部分的融合蛋白和包含抗原識別位點的任何其他修飾的免疫球蛋白分子。此外，「單株抗體」係指以任何數目的方式（包括但不限於藉由雜交瘤、噬菌體選擇、重組表現和轉基因動物）製備的此類抗體。
術語「人源化抗體」係指非人（例如鼠）抗體的形式，該等形式係含有最少的非人（例如，鼠）序列的特異性免疫球蛋白鏈、嵌合免疫球蛋白或其片段。典型地，人源化抗體係人免疫球蛋白，其中來自互補決定區（CDR）的殘基被來自非人物種（例如，小鼠、大鼠、兔子或倉鼠）的CDR的具有所希望的特異性、親和力和能力的殘基替代（Jone等人, 1986, Nature[自然], 321: 522-525；Riechmann等人, 1988, Nature[自然], 332: 323-327；Verhoeyen等人, 1988, Science[科學], 239: 1534-1536）。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區（FR或FW）殘基被來自非人物種的具有所希望的特異性、親和力和能力的抗體中的相應殘基替代。人源化抗體可以藉由在Fv框架區和/或替代的非人殘基內的另外的殘基的取代來進一步修飾，以改進和優化抗體特異性、親和力和/或能力。通常，人源化抗體將包含基本上所有至少一個（並且典型地兩個或三個）可變結構域，該可變結構域包含對應於非人免疫球蛋白的所有或基本上所有CDR區，而所有或基本上所有FR區係人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體還可以包含免疫球蛋白恒定區或結構域（Fc）的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白的恒定區或結構域。用於產生人源化抗體之方法的實例描述於美國專利5,225,539或5,639,641中。
抗體的「可變區」指單獨的抗體輕鏈的可變區或抗體重鏈的可變區或它們的組合。重鏈和輕鏈的該等可變區各自由藉由三個互補決定區（CDR，又稱為高變區）連接的四個框架區（FR或FW）組成。每條鏈中的CDR由FR緊密靠近地保持在一起，並且與來自另一條鏈的CDR促成了抗體的抗原結合位點的形成。存在至少兩種用於確定CDR的技術：(1) 一種基於跨物種序列變異性之方法（即，Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學上感興趣的蛋白質序列], (第5版, 1991, National Institutes of Health [美國國家衛生研究院], 馬里蘭州貝塞斯達（Bethesda Md.）)）；和 (2) 一種基於抗原抗體複合物的晶體學研究之方法（Al-lazikani等人 (1997) J. Molec. Biol.[分子生物學雜誌] 273: 927-948）。另外，本領域有時使用這兩種方法的組合來確定CDR。
當提及可變結構域中的殘基（大約輕鏈的殘基1-107和重鏈的殘基1-113）時，通常使用Kabat編號系統（例如，Kabat等人, Sequences of Immunological Interest [免疫學上感興趣的序列], 第5版Public Health Service [公共衛生服務], National Institutes of Health [美國國家衛生研究院], 馬里蘭州貝塞斯達 (1991)）。
在Kabat中的胺基酸位置編號係指在Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學上感興趣的蛋白質序列], 第5版 Public Health Service [公共衛生服務], National Institutes of Health [美國國家衛生研究院], 馬里蘭州貝塞斯達 (1991) 中用於抗體編譯的重鏈可變結構域或輕鏈可變結構域的編號系統。使用這個編號系統，實際的線性胺基酸序列可以含有更少或另外的胺基酸，其對應於可變結構域的FR或CDR的截短或插入。例如，重鏈可變結構域可以包括在H2的殘基52之後的單個胺基酸插入（根據卡巴特（Kabat）的殘基52a）和在重鏈FR殘基82之後的插入的殘基（例如，根據卡巴特的殘基82a、82b和82c等）。可以藉由在抗體序列與「標準」卡巴特編號序列的同源性區域進行比對來確定給定抗體的殘基的卡巴特編號。相反，喬西亞（Chothia）係指結構環的位置（Chothia和Lesk J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 196: 901-917 (1987)）。喬西亞CDR-H1環的末端在利用卡巴特編號慣例編號時在H32與H34之間變化，這取決於環的長度（這係因為卡巴特編號方案將插入放在H35A和H35B處；如果35A和35B都不存在，那麼環端點在32；如果只存在35A，那麼環端點在33；如果35A和35B都存在，那麼環端點在34）。AbM高變區表示卡巴特CDR和喬西亞結構環之間的折衷，並且被牛津分子公司（Oxford Molecular）的AbM抗體建模軟體使用。下表1中提供了比較。 [表1]：抗體編號系統的比較
Figure 02_image001
術語「人抗體」意指天然人抗體或具有與使用本領域已知的任何技術製備的與天然人抗體相對應的胺基酸序列的抗體。人抗體的這種定義包括完整或全長抗體、其片段、和/或包含至少一個人重鏈和/或輕鏈多肽的抗體，例如像包含鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。
術語「嵌合抗體」係指其中免疫球蛋白分子的胺基酸序列衍生自兩種或更多種物種的抗體。典型地，輕鏈和重鏈的可變區對應於衍生自具有所希望的特異性、親和力和能力的一種哺乳動物（例如小鼠、大鼠、兔等）物種的抗體的可變區，而恒定區同源於衍生自另一種（通常為人）的抗體中的序列，以避免在該物種中引起免疫反應。多特異性結合分子（例如包括一個或多個抗體結合結構域、一個或多個非抗體結合結構域或其組合，例如本文所提供的TNFα拮抗劑和/或NGF拮抗劑）可以包含抗體恒定區（例如，Fc區），其中一個或多個恒定區結構域的至少一部分已被缺失或以其他方式改變，以便提供所希望的生物化學特徵，如當與包含天然或未改變的恒定區的具有大約相同免疫原性的抗體相比時增加的腫瘤定位或降低的血清半衰期。本文所提供的經修飾的恒定區可以包含對三個重鏈恒定結構域（CH1、CH2或CH3）中的一個或多個和/或對輕鏈恒定結構域（CL）的改變或修飾。在一些方面中，一個或多個恒定結構域可以被部分或全部缺失。在一些方面中，該整個CH2結構域可以被缺失（ΔCH2構建體）。參見例如，Oganesyan V等人, 2008 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.[晶體學報D卷生物晶體學] 64: 700-4；Oganesyan V等人, Mol Immunol.[分子免疫學] 46: 1750-5；Dall’Acqua, W.F. 等人, 2006. J. Biol. Chem.[生物化學雜誌] 281: 23514-23524；和Dall’Acqua等人 ., 2002. J. Immunol.[免疫學雜誌] 169: 5171-5180。
術語「表位」或「抗原決定簇」在本文中可互換地使用並且是指能夠被特定抗體識別並特異性結合的抗原部分。當抗原係多肽時，表位可以由連續胺基酸和藉由蛋白的三級折疊而並置的非連續胺基酸二者來形成。從連續胺基酸形成的表位典型地在蛋白變性時保留，而由三級折疊形成的表位典型地在蛋白變性時喪失。表位典型地包括處於獨特的空間構象中的至少3個和更常見的至少5個、或8-10個胺基酸。如本文所述之表位不需要定義至形成表位的特定胺基酸。在一些方面中，可以藉由檢查與多肽抗原的肽亞基的結合，或藉由檢查一組抗原特異性抗體對抗原的結合競爭來鑒定表位。
「受試者」或「個體」或「動物」或「患者」或「哺乳動物」意指希望進行診斷、預後或治療的任何受試者，尤其是哺乳動物受試者。哺乳動物受試者包括人、家畜、農畜、體育動物和動物園動物，包括例如人、非人靈長類、狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、熊等。
術語「組成物」和「藥物組成物」係指如下製劑，該製劑處於使得活性成分的生物活性係有效的形式，並且該製劑不含對將投與該組成物的受試者具有不可接受的毒性的另外的組分。此類組成物可以是無菌的。
如本文所用，術語「有效量」和「治療有效量」係指一種或多種有效治療或控制受試者的疼痛的治療組成物的量。術語「治療疼痛」、「控制疼痛」和語法等效詞在本文中用於描述對需要疼痛控制的受試者的任何有益或期望之作用。例如，本文所述之一種或多種治療組成物的有效量可以例如在受試者中預防疼痛、維持疼痛的可耐受水平、改善疼痛、減輕疼痛、最小化疼痛和/或消除疼痛。特別地，術語「治療疼痛」、「控制疼痛」和語法等效詞在本文中用於描述減輕疼痛和/或預防疼痛。
如本文所用，術語「投與」係指向受試者投與本文所述之一種或多種治療組成物，例如包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域的雙功能多肽。術語「共同投與」係指向受試者投與兩種或更多種治療組成物。如本文所用，共同投與包括但不要求向受試者同時投與兩種或更多種治療組成物。可以向受試者順序地，例如相隔三十分鐘、相隔一小時、相隔兩小時、相隔三小時、相隔四小時或相隔五小時或更多個小時投與兩種或更多種治療組成物。如本文所述之共同投與的順序和時間可以是固定的，或者可以基於醫療保健專業人員的判斷而改變。
術語「多核苷酸」和「核酸」係指由共價連接的核苷酸殘基組成的聚合化合物。多核苷酸可以是DNA、cDNA、RNA、單股或雙股載體、質體、噬菌體或病毒。
術語「載體」意指構建體，其能夠在宿主細胞中遞送和表現一個或多個目的基因或序列。載體的實例包括但不限於：病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏接質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑締合的DNA或RNA表現載體、包封在脂質體中的DNA或RNA表現載體，以及某些真核細胞（如生產細胞）。
可在本文中互換使用的術語「多肽」、「肽」、和「蛋白質」係指具有任何長度的胺基酸的聚合物。該聚合物可以是線性或支化的，它可以包含修飾的胺基酸，並且它可以被非胺基酸中斷。該等術語還涵蓋已經被天然修飾或藉由干預修飾的胺基酸聚合物；例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操縱或修飾，諸如與標記組分軛合。該定義還包括例如含有一種或多種胺基酸類似物（包括例如，非天然胺基酸等）以及本領域已知的其他修飾的多肽。
「保守的胺基酸取代」係一個胺基酸殘基被具有類似側鏈的另一個胺基酸殘基替代的胺基酸取代。在本領域中已經定義了具有類似側鏈的胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、酸性側鏈（例如，天門冬胺酸、麩胺酸），不帶電荷的極性側鏈（例如，天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸）、非極性的側鏈（例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸）、β-分支側鏈（例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸）以及芳香族側鏈（例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。例如，苯丙胺酸對於酪胺酸的取代係保守取代。在某些方面中，本文所提供的多肽和抗體的序列中的保守取代沒有消除含有該胺基酸序列的多肽的結合或其他功能活性。鑒定不影響功能的核苷酸和胺基酸保守取代之方法係本領域所熟知的（參見例如，Brummell等人, Biochem.[生物化學] 32: 1180-1 187 (1993)；Kobayashi等人 Protein Eng.[蛋白質工程] 12: 879-884 (1999)；和Burks等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA[美國國家科學院院刊] 94: 412-417 (1997)）。 包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域的結合分子
本揭露提供了包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域的雙功能多肽，用於在本文所揭露之方法中的任一者（例如，根據本文所揭露的劑量方案中的任一者）中使用。在某些方面中，在有需要的受試者中投與有效量的本文所提供的雙功能多肽比單獨投與當量的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑可以更有效控制疼痛。本文所提供的雙功能多肽可以包括處於任何順序、結構或構象的NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域。任何合適的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑可以是本文所提供的雙功能多肽的一部分。在本揭露中描述了示例性的NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑。
在某些方面中，該NGF拮抗劑係抗NGF抗體或其抗原結合片段。在某些方面中，用於在本文所提供的雙功能分子（例如多特異性結合分子）中使用的抗NGF拮抗劑（例如，拮抗劑抗體或其片段），相比於阻斷NGF與p75NRT的結合，可以優先阻斷NGF與TrkA的結合。
用於在雙功能多肽（例如，本文所揭露的多特異性結合分子）中使用的示例性抗體或其片段可獲得於美國申請公開案號2008/0107658，將其藉由引用以其全文併入本文。在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段與抗NGF抗體MEDI-578結合相同的表位，可以競爭性抑制抗NGF抗體MEDI-578或可以以比抗NGF抗體MEDI-578更大的親和力結合NGF。在某些實施方式中，該抗NGF抗體或其片段以等於或小於1、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.2 nM的親和力結合人NGF和/或大鼠NGF。例如，該抗NGF抗體或其片段可以以約0.2-0.8、0.2-0.7、0.2-0.6、0.2-0.5和/或0.25-0.44 nM的親和力結合人NGF並且可以以約0.2-0.9、0.2-0.8和/或0.25-0.70 nM的親和力結合大鼠NGF。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段係MEDI-578。在美國申請公開案號2008/0107658中MEDI-578被揭露為選殖1252A5。在其他方面，該抗NGF抗體或其片段係他尼珠單抗（tanezumab，RN-624），一種人源化的抗NGF mAb（輝瑞公司（Pfizer）；描述於Kivitz等人, (2013) PAIN [疼痛], 154, 9, 1603-161）；福拉奴單抗（fulranumab），一種全人的抗NGF mAb（安進公司（Amgen）；描述於Sanga等人, PAIN [疼痛], 第154卷, 第10期, 2013年10月, 第1910頁-第1919頁）；REGN475/SAR164877，一種全人的抗NGF mAb（再生元公司（Regeneron）/賽諾菲-安內特（Sanafi-Aventis））；ABT-110（PG110），一種人源化的抗NGF mAb（雅培公司（Abbott Laboratories））；法希奴單抗（fasinumab），一種人抗NGF mAb（再生元公司（Regeneron），在美國申請公開案號2009/0041717中揭露為植株REGN475）。雙功能多肽（例如，本文所提供的多特異性結合分子）中包括的抗NGF抗體或其片段可以是例如人源化的、嵌合的、靈長類動物化的或全人的。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VH結構域，該抗體VH結構域包含MEDI-578的HCDR1、HCDR2和HCDR3結構域，具有多達一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸取代（例如，保守的胺基酸取代）的MEDI-578重鏈CDR的變體。例如，該抗NGF抗體或其片段可以包含HCDR1，該HCDR1具有SEQ ID NO: 4的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 4的胺基酸序列。類似地，該抗NGF抗體或其片段可以包含HCDR2，該HCDR2具有SEQ ID NO: 5的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 5的胺基酸序列。同樣，該抗NGF抗體或其片段可以包含HCDR3，該HCDR3具有SEQ ID NO: 6的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 6的胺基酸序列。在某些方面中，該HCDR3可以包含胺基酸序列SSRIYDFNSALISYYDMDV（SEQ ID NO: 11）或SSRIYDMISSLQPYYDMDV（SEQ ID NO: 12）。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VL結構域，該抗體VL結構域包含MEDI-578的LCDR1、LCDR2和LCDR3結構域，具有多達一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸取代（例如，保守的胺基酸取代）的MEDI-578輕鏈CDR的變體。在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段可以包含LCDR1，該LCDR1具有SEQ ID NO: 8的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 8的胺基酸序列。類似地，該抗NGF抗體或其片段可以包含LCDR2，該LCDR2具有SEQ ID NO: 9的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 9的胺基酸序列。同樣，該抗NGF抗體或其片段可以包含LCDR3，該LCDR3具有SEQ ID NO: 10的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 10的胺基酸序列。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VH結構域，該抗體VH結構域包含與SEQ ID NO: 3的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VH胺基酸序列。在一些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含含有SEQ ID NO: 3的VH胺基酸序列的抗體VH結構域。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VL結構域，該抗體VL結構域包含與SEQ ID NO: 7的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VL胺基酸序列。在一些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含含有SEQ ID NO: 7的VL胺基酸序列的抗體VL結構域。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VH結構域，該抗體VH結構域包含與SEQ ID NO: 94的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VH胺基酸序列。在一些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含含有SEQ ID NO: 94的VH胺基酸序列的抗體VH結構域。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VL結構域，該抗體VL結構域包含與SEQ ID NO: 95的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VL胺基酸序列。在一些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含含有SEQ ID NO: 95的VL胺基酸序列的抗體VL結構域。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VH結構域，該抗體VH結構域包含SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86和96中的任一者的HCDR1、HCDR2和HCDR3結構域或具有多達一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸取代（例如，保守的胺基酸取代）的其變體。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VL結構域，該抗體VL結構域包含SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87和97中的任一者的LCDR1、LCDR2和LCDR3結構域或具有多達一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸取代（例如，保守的胺基酸取代）的其變體。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VH結構域，該抗體VH結構包含與SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86和96中任一者的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VH胺基酸序列。在一些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VH結構域，該抗體VH結構域包含SEQ ID NO: 30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86和96中任一者的VH胺基酸序列。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VL結構域，該抗體VL結構域包含與SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87和97中任一者的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VL胺基酸序列。在一些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VL結構域，該抗體VL結構域包含SEQ ID NO: 31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87和97中任一者的VL胺基酸序列。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VH結構域，該抗體VH結構域包含NGF-NG的HCDR1、HCDR2和HCDR3結構域，具有多達一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸取代（例如，保守的胺基酸取代）的NGF-NG重鏈CDR的變體。例如，該抗NGF抗體或其片段可以包含HCDR1，該HCDR1具有SEQ ID NO: 88的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 88的胺基酸序列。類似地，該抗NGF抗體或其片段可以包含HCDR2，該HCDR2具有SEQ ID NO: 89的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 89的胺基酸序列。同樣，該抗NGF抗體或其片段可以包含HCDR3，該HCDR3具有SEQ ID NO: 90的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 90的胺基酸序列。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VL結構域，該抗體VL結構域包含NGF-NG的LCDR1、LCDR2和LCDR3結構域，具有多達一個、兩個、三個、四個、五個或更多個胺基酸取代（例如，保守的胺基酸取代）的NGF-NG輕鏈CDR的變體。在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段可以包含LCDR1，該LCDR1具有SEQ ID NO: 91的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 91的胺基酸序列。類似地，該抗NGF抗體或其片段可以包含LCDR2，該LCDR2具有SEQ ID NO: 92的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 92的胺基酸序列。同樣，該抗NGF抗體或其片段可以包含LCDR3，該LCDR3具有SEQ ID NO: 93的確切胺基酸序列，或具有有一個或多個（例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個）胺基酸取代的SEQ ID NO: 93的胺基酸序列。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VH結構域，該抗體VH結構域包含與SEQ ID NO: 24的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VH胺基酸序列。在一些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含含有SEQ ID NO: 24的VH胺基酸序列的抗體VH結構域。
在某些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含抗體VL結構域，該抗體VL結構域包含與SEQ ID NO: 26的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的VL胺基酸序列。在一些方面中，該抗NGF抗體或其片段包含含有SEQ ID NO: 26的VL胺基酸序列的抗體VL結構域。
如本揭露所提供的多功能多肽（例如，多特異性結合分子）可以包含完整的抗NGF抗體，即，包含處於H 2L 2形式的兩條完整重鏈和兩條完整輕鏈的抗體。在抗NGF抗體係完整抗體的情況下，一個或多個TNFα拮抗劑結構域可以融合至抗NGF抗體的一條或多條重鏈的N-末端或C-末端或至抗NGF抗體的一條或多條輕鏈的N-末端或C-末端。可替代地，如本揭露所提供的多功能多肽（例如，多特異性結合分子）可以包含抗NGF抗體的抗原結合片段。在某些方面中，抗NGF抗體片段可以包含抗體的恒定結構域的任何部分或者可以僅僅包含可變結構域。用於包含在雙功能多肽（例如，多特異性結合分子）中的示例性抗NGF抗體片段包括但不限於Fab片段、Fab'片段、F(ab) 2片段或單鏈Fv（scFv）片段。
在本文所提供的某些示例性組成物中，該抗NGF抗體係scFv片段，例如MEDI-578的scFv片段，或其NGF結合變體。在本文所提供的某些示例性組成物中，該抗NGF抗體係scFv片段，例如NGF-NG的scFv片段，或其NGF結合變體。抗NGF scFv多肽可以以任何順序包含VH和VL結構域，N-VH-VL-C或N-VL-VH-C。ScFv分子典型地被工程化，使得VH和VL結構域經由柔性連接子連接。示例性scFv結構（包括各種連接子）可見於Dimasi, N. 等人, J Mol Biol.[分子生物學雜誌] 393: 672-92 (2009) 和PCT公開案號WO 2013/070565，這兩篇文獻藉由引用以其全文併入本文。如熟悉該項技術者所理解的，scFv抗體片段相對於標準Fab構象中存在的可變結構域可以具有降低的穩定性。在一些方面中，scFv可以藉由引入穩定性突變或藉由引入一個或多個鏈間二硫鍵（例如，SS穩定性的）而在結構上被穩定化。然而，穩定性突變和/或引入的鏈間二硫鍵係不要求的，並且在某些方面中，係不存在的。許多本領域公認之方法可用於穩定化scFv多肽。
連接子可用於連接本文所提供的雙功能多肽的結構域/區域。連接子可用於連接雙功能分子的NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域，並且還可用於互連scFv的可變重鏈和輕鏈。連接子的示例性非限制性實例係包含至少4個殘基的多肽鏈。此類連接子中的部分可以是柔性的、親水的並且具有很少或沒有它們自身（連接子部分或柔性連接子部分）的二級結構。在雙功能多肽分子組裝後，至少4個胺基酸的連接子可用於連接位置彼此靠近的結構域和/或區域。還可以使用更長的連接子。因此，連接子可以是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個殘基。連接子還可以是例如從約100-175個殘基。當多個連接子用於互連雙功能多肽分子的部分時，該等連接子可以是相同或不同的（例如，相同或不同的長度和/或胺基酸序列）。
雙功能多肽分子中的一個或多個連接子有助於形成所希望的結構。連接子可以包含(Gly-Ser) n殘基（其中n係至少一、二和多達例如3、4、5、6、10、20、50、100或更多的整數），整體分散有一些Glu或Lys殘基以增加溶解度。可替代地，某些連接子不包含任何絲胺酸殘基，例如在連接子經受O-連接的糖基化的情況下。在一些方面，連接子可以含有半胱胺酸殘基，例如，如果連接子的二聚化用於使雙功能多肽的結構域進入其正確折疊的構型。在一些方面中，雙功能多肽可以包含至少一個、兩個、三個、四個或更多個連接多肽的結構域的多肽連接子。
在一些方面中，多肽連接子可以包含1-50個殘基、1-25個殘基、25-50個殘基、或30-50個殘基。在一些方面，該多肽連接子可以包含Fc部分的一部分。例如，在一些方面中，該多肽連接子可以包含IgGl、IgG2、IgG3和/或IgG4抗體或其變體的免疫球蛋白鉸鏈結構域的一部分。
在一些方面中，多肽連接子可以包含gly-ser連接子或由gly-ser連接子組成。如本文所用，術語「gly-ser連接子」係指由甘胺酸和絲胺酸殘基組成的肽。示例性gly-ser連接子包含式(Gly 4Ser)n的胺基酸序列，其中n係至少一、二和多達例如3、4、5、6、10、20、50、100或更多的整數。在一些方面中，多肽連接子可以包含鉸鏈區（例如，衍生自IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4分子）的至少一部分和一系列gly-ser胺基酸殘基（例如，gly-ser連接子，例如(Gly 4Ser)n）。
當多功能多肽（例如，多特異性結合分子）包含scFv時，柔性連接子可以連接scFv的重鏈和輕鏈。這種柔性連接子通常不包括鉸鏈部分，而是gly-ser連接子或其他柔性連接子。互連scFv的結構域的柔性連接子的長度和胺基酸序列可以容易地選擇並且優化。
在某些方面中，多功能多肽（例如，多特異性結合分子）可以包含抗NGF scFv片段，該抗NGF scFv片段從N-末端到C-末端包含VH、15個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 3和VL。在某些實施方式中，連接scFv的VH和VL的連接子係20個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 4。在某些方面中，該VH包含SEQ ID NO 3的胺基酸序列。在某些方面中，該VL包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列。在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO: 24、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、94和96中的任一者的胺基酸序列。在某些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO: 26、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、95和97中的任一者的胺基酸序列。在某些方面中，該VH結構域包含與SEQ ID NO: 3、24、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、94和96中的任一者的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。在某些方面中，該VL結構域包含與SEQ ID NO: 7、26、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、95和97中的任一者的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在其他方面，該多肽的穩定性可以藉由將VH和VL結構域內的某些殘基修飾為半胱胺酸殘基以在VH結構域和VL結構域之間添加鏈間二硫鍵來改善。參見例如，Michaelson, J. S. 等人 (2009) MAbs[單株抗體雜誌] 1, 128-41；Brinkmann, U. 等人, (1993) Proc Natl Acad Sci USA[美國國家科學院院刊] 90, 7538-42；Young, N. M. 等人, (1995) FEBS Lett[歐洲生化學會聯合會快報] 377, 135-9。例如，在該VL（例如，SEQ ID NO: 7）的位置102、103或104處的甘胺酸殘基可以被修飾為半胱胺酸殘基並且在該VH（例如，SEQ ID NO: 3）的位置44處的甘胺酸殘基可以被修飾為半胱胺酸殘基。在一些實施方式中，在與SEQ ID NO: 7的位置102、103或104相對應的胺基酸位置處的甘胺酸殘基被修飾為半胱胺酸殘基。在一些實施方式中，在與SEQ ID NO: 3的位置44相對應的胺基酸位置處的甘胺酸殘基被修飾為半胱胺酸殘基。
如本文所提供的多功能多肽（例如，多特異性結合分子）包括TNFα拮抗劑結構域。在某些方面中，TNFα拮抗劑結構域可以抑制TNFα與TNF受體（TNFR）在細胞表面上結合，從而阻斷TNF活性。
在某些方面中，該TNFα拮抗劑係TNF受體（例如，TNFR-1或TNFR-2）的TNFα結合可溶性片段，或其變體或其可溶性片段。在某些方面中，TNFR-1的可溶性片段係55 kD片段。在某些實施方式中，TNFR-2的可溶性片段係75 kD片段。在某些方面中，該TNF受體片段融合至異源多肽，例如免疫球蛋白Fc片段，例如，IgG1 Fc結構域。在某些方面中，該TNFα拮抗劑包含SEQ ID NO: 13所示的胺基酸或其TNFα結合片段。該TNFR-2部分包含SEQ ID NO: 13的胺基酸1至235。在某些方面中，TNFR-2的TNFα結合可溶性片段的變體包含與SEQ ID NO: 13的胺基酸1至235至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在某些方面中，TNFR-2的TNFα結合可溶性片段的變體包含SEQ ID NO: 13的胺基酸1至235，只是有例如1、2、3、4、5、10、20、20、40或50個胺基酸的插入、取代或缺失。該IgG1 Fc部分包含SEQ ID NO: 13的胺基酸236至467。在某些方面中，TNFR-2的TNFα結合可溶性片段可以融合至任何人或非人抗體的Fc部分，或融合至會提供穩定性的任何其他的蛋白質或非蛋白質物質，例如白蛋白或聚乙二醇。在某些方面中，TNFR-2的TNFα結合可溶性片段的變體包含與SEQ ID NO: 13的胺基酸236至467至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在某些方面中，TNFR-2的TNFα結合可溶性片段的變體包含SEQ ID NO: 13的胺基酸236至467，只是有例如1、2、3、4、5、10、20、20、40或50個胺基酸的插入、取代或缺失。在某些方面中，TNFR-2的TNFα結合可溶性片段的變體包含與SEQ ID NO: 13至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同的胺基酸序列。在某些方面中，TNFR-2的TNFα結合可溶性片段的變體包含SEQ ID NO: 13，只是有例如1、2、3、4、5、10、20、20、40或50個胺基酸的插入、取代或缺失。
在某些方面中，TNFR-2的TNFα結合可溶性片段係單鏈融合蛋白。在某些方面中，TNFR-2的TNFα結合可溶性片段係兩個融合蛋白例如藉由兩個Fc結構域之間的二硫鍵締和的二聚體。
如本文所提供的多功能多肽（例如，多特異性結合分子）可以具有各種不同的結構和構象。在一方面中，如本文所提供的多功能多肽包含融合蛋白，其中如上文所述之NGF拮抗劑結構域藉由柔性連接子融合至如上文所述之TNFα拮抗劑結構域。連接子的實例描述於本文中的其他部分。在某些方面中，該多功能多肽包含融合蛋白的同源二聚體。
在示例性方面中，提供了多功能多肽，其中NGF拮抗劑係衍生自例如MEDI-578的抗NGF scFv結構域，並且TNFα拮抗劑係TNFR-2的可溶性的、TNFα結合片段，該TNFR-2的可溶性的、TNFα結合片段在其羧基末端處與免疫球蛋白Fc結構域融合。在一些方面中，該抗NGF scFv可以經由連接子融合至免疫球蛋白Fc結構域的羧基末端。在某些方面中，這種多功能多肽的單體與每個亞基形成同源二聚體，該同源二聚體從N-末端到C-末端包含TNFR-2的TNFα結合75 kD片段、人IgG1Fc結構域、10個胺基酸的連接子(GGGGS) 2（SEQ ID NO: 98）、包含SEQ ID NO 3的胺基酸序列的抗NGF VH、15個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 3（SEQ ID NO: 15）和包含SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的抗NGF VL。在一方面中，該多功能多肽係TNFR2-Fc_VH#4，該TNFR2-Fc_VH#4包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體包含SEQ ID NO: 14的胺基酸序列。在一些方面中，該多功能多肽包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體包含與SEQ ID NO: 14至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列。
在另一示例性方面中，該多功能多肽從N-末端到C-末端包含TNFR-2的TNFα結合75 kD片段、人IgG1Fc結構域、10個胺基酸的連接子(GGGGS) 2（SEQ ID NO: 98）、包含SEQ ID NO 94的胺基酸序列的抗NGF VH、20個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 4（SEQ ID NO: 19）和包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的抗NGF VL。在一些實施方式中，該結合分子從N-末端到C-末端包含TNFR-2的TNFα結合75 kD片段，其包含與SEQ ID NO: 13至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列；人IgG1Fc結構域；10個胺基酸的連接子(GGGGS) 2（SEQ ID NO: 98）；包含與SEQ ID NO 94的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的抗NGF VH；20個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 4（SEQ ID NO: 19）；和包含與SEQ ID NO: 95的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的胺基酸序列的抗NGF VL。在一些方面中，該多功能多肽係TNFR2-Fc_varB，該TNFR2-Fc_varB包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。在一些方面中，該多功能多肽包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體包含與SEQ ID NO: 17至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%相同的胺基酸序列。 多核苷酸、載體和宿主細胞
本揭露提供了包含編碼本文所揭露的結合分子中的任一者的多核苷酸的核酸分子，用於在本文所揭露之方法（例如，和本文所揭露的劑量方案）中的任一者中使用。本揭露進一步提供了包含編碼單個多肽的多核苷酸的核酸分子，該等單個多肽分別地包含NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑。在某些方面中，此類多核苷酸編碼特異性結合NGF或其片段並且還結合TNFα或其片段的肽結構域。例如，本揭露提供了多核苷酸，該多核苷酸編碼包含抗NGF抗體或其抗原結合片段的多肽結構域和包含TNFα拮抗劑（例如抗TNFα抗體或其抗原結合片段）或TNF受體（例如，TNFR2）的可溶性TNFα結合部分的多肽結構域。多核苷酸可以處於RNA形式或處於DNA形式。DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA；並且可以是雙股的或單股的，並且如果係單股的話，可以是編碼股或非編碼（反義）股。
在一些實施方式中，編碼本文所述之多功能多肽的分離的多核苷酸包含SEQ ID NO: 16、18或99的核苷酸序列或其片段、或與SEQ ID NO: 16、18或99至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列或其片段。
本文所述之該等分離的多肽可以藉由本領域已知的任何合適之方法產生。此類方法範圍為從直接蛋白質合成方法到構建編碼分離的多肽序列的DNA序列並在合適的轉化宿主中表現該等序列。在一些方面中，使用重組技術藉由分離或合成編碼包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域的多功能多肽、或分別地包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域的單個多肽的DNA序列來構建DNA序列。因此，本揭露提供了編碼如上文詳細所述之雙功能多肽的分離的多核苷酸，該雙功能多肽包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域。進一步提供了編碼單個多肽的分離的多核苷酸，該單個多肽分別地包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域。
在一些方面中，可以使用寡核苷酸合成儀，藉由化學合成構建DNA序列，該DNA序列編碼多功能多肽（例如，目的多特異性結合分子）或分別地包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域的單個多肽。此類寡核苷酸可以是基於所希望的多功能多肽的胺基酸序列並且基於選擇在宿主細胞（其中將產生目的重組多肽）中偏愛的那些密碼子來設計。可以應用標準方法來合成編碼目的多功能多肽的分離的多核苷酸序列。例如，完整胺基酸序列可以用於構建回譯基因。此外，可以合成含有對特定的多功能多肽或單個多肽進行編碼的核苷酸序列的DNA寡聚體。例如，可以合成幾個編碼所希望的多肽的部分的小寡核苷酸並且然後將其連接。單個寡核苷酸典型地含有用於互補組裝的5'或3'突出端。
在某些方面中，本文所提供的多核苷酸可以包含在相同閱讀框中融合至允許例如純化編碼的多肽的標記物序列的成熟多肽的編碼序列。例如，在細菌宿主的情況下，該標記物序列可以是由pQE-9載體供給的六聚組胺酸標籤以便提供對融合至該標記物的成熟多肽的純化，或者當使用哺乳動物宿主（例如，COS-7細胞）時，該標記物序列可以是來源於流感病毒血凝素蛋白的血球凝集素（HA）標籤。
本文所提供的多核苷酸可以在編碼區、非編碼區或兩者中進一步含有改變。在一些方面中，該等多核苷酸變體含有產生緘默取代、添加、或缺失而不改變編碼的多肽的特性或活性的改變。在一些方面中，核苷酸變體由歸因於遺傳密碼的簡並性的緘默取代產生。多核苷酸變體可以因為各種原因而產生，例如，為了優化特定宿主的密碼子表現（將人mRNA中的密碼子改變成細菌宿主如大腸桿菌較佳的那些密碼子）。
還提供了包含本文所述之多核苷酸的載體和細胞。一旦組裝（藉由合成、定點誘變或另一種方法），編碼特定的目的分離多肽的多核苷酸序列可以被插入至表現載體中並且可操作地連接至適於蛋白質在所希望的宿主中的表現的表現控制序列。本揭露提供了此類載體。可以藉由核苷酸定序、限制酶切作圖以及在合適的宿主中表現生物活性多肽來確認適當的組裝。如本領域中所熟知的，為了在宿主中獲得高表現水平的轉染基因，該基因必須可操作地連接至在選擇表現宿主中起作用的轉錄和翻譯表現控制序列。
在某些方面中，重組表現載體可以用於擴增和表現DNA，該DNA編碼包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域的多功能多肽（例如，多特異性結合分子）、或分別地包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域的單個多肽。重組表現載體係可複製的DNA構建體，該等DNA構建體具有編碼多功能多肽或分別地包含NGF拮抗劑結構域和TNFα拮抗劑結構域的單個多肽的合成的或cDNA衍生的DNA片段，該等DNA片段可操作地連接至來源於哺乳動物、微生物、病毒或昆蟲基因的合適的轉錄和翻譯調控元件。轉錄單位通常包含以下元件：(1) 基因表現中具有調控作用的一個或多個遺傳元件，例如轉錄啟動子或增強子，(2) 轉錄成mRNA並翻譯成蛋白質的結構序列或編碼序列，以及 (3) 適當的轉錄和翻譯啟動和終止序列，如下文詳細描述的。此類調控元件可以包括控制轉錄的操縱子序列。可以另外摻入通常賦予在宿主中進行複製的能力的複製起點以及有助於識別轉化體的選擇基因。當DNA區域在功能上彼此相關時，將它們可操作地連接。例如，將訊息肽（分泌性前導子）表現為參與多肽的分泌的響應的話，則該訊息肽（分泌性前導子）的DNA可操作地連接至多肽的DNA；如果啟動子控制編碼序列的轉錄，則該啟動子可操作地連接至該編碼序列；或如果核糖體結合位點被定位以允許翻譯，則該核糖體結合位點可操作地連接至編碼序列。旨在用於在酵母表現系統中使用的結構元件包括前導子序列，它使得宿主細胞可以將翻譯的蛋白質分泌到胞外。可替代地，在無需前導子或轉運序列表現重組蛋白的情況下，它可以包括N-端甲硫胺酸殘基。隨後，此殘基可以視需要從表現的重組蛋白上裂解下來，以提供終產物。
表現控制序列和表現載體的選擇將依賴於宿主的選擇。可以採用多種多樣的表現宿主/載體組合。對於真核宿主有用的表現載體包括例如包含來自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、以及巨細胞病毒的表現控制序列的載體。對於細菌宿主有用的表現載體包括已知細菌質體，諸如來自大腸桿菌的質體，包括pCR 1、pBR322、pMB9以及其衍生物，更廣泛的宿主範圍質體，諸如M13和絲狀單股DNA噬菌體。
本揭露進一步提供了宿主細胞，該等宿主細胞包含編碼本文所提供的多肽的多核苷酸。用於表現本文所提供的多肽的合適的宿主細胞包括在適當的啟動子控制下的原核細胞、酵母、昆蟲、或高等真核細胞。原核細胞包括革蘭陰性或革蘭陽性生物體，例如大腸桿菌或桿菌。高等真核細胞包括如下文所述之哺乳動物起源的已建立的細胞系。還可以採用無細胞翻譯系統。用於細菌、真菌、酵母菌、以及哺乳動物細胞宿主的適當的選殖和表現載體由Pouwels等人（Cloning Vectors: A Laboratory Manual [選殖載體：實驗室手冊], Elsevier [愛思唯爾公司], 紐約, 1985）描述，該文獻的相關揭露藉由引用特此併入。關於蛋白質產生（包括抗體產生）方法的另外的資訊可見於例如美國專利公開案號2008/0187954、美國專利案號6,413,746和6,660,501、以及國際專利公開案號WO 04009823，該等專利各自藉由引用以其全文特此併入本文。
還可以有利地採用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現重組蛋白。可以在哺乳動物細胞中進行重組蛋白的表現，因為此類蛋白質通常被正確地折疊，適當地修飾並且完全起作用。合適的哺乳動物宿主細胞系的實例包括HEK-293和HEK-293T、由Gluzman（Cell [細胞] 23: 175, 1981）描述的猴腎細胞的COS-7系、以及包括例如L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢（CHO）、HeLa以及BHK細胞系的其他細胞系。哺乳動物表現載體可以包括非轉錄元件（如複製起點）、連接至待表現的基因上的合適的啟動子和增強子以及其他5'或3'側翼非轉錄序列和5'或3'非翻譯序列，如必要的核糖體結合位點、聚腺苷酸化位點、剪接供體和受體位點以及轉錄終止序列。用於產生昆蟲細胞中的異源蛋白質的杆狀病毒系統由Luckow和Summers, Bio/Technology [生物/技術] 6: 47 (1988) 進行了綜述。
本揭露進一步提供了用於產生如本文所述之多功能多肽、或用於產生分別地包含NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑的單個多肽之方法。該方法需要在促進多功能多肽或單個多肽的表現的條件下培養如上文所述之宿主細胞，並且回收該多功能多肽或單個多肽。
為了長期、高產率的產生重組蛋白，穩定表現係適當的。例如，可以工程化穩定表現多功能多肽的細胞系。代替使用含有病毒複製起點的表現載體，宿主細胞可以使用由適當表現控制元件（例如啟動子、增強子、序列、轉錄終止子、多聚腺苷酸化位點等）和可選擇標記物來控制的DNA來轉化。在引入外源DNA後，可以允許工程化的細胞在富集的培養基中生長1-2天，並且然後切換至選擇性培養基。在重組質體中的可選擇標記物賦予對選擇的抗性，並且允許細胞將質體穩定地整合進它們的染色體中並且生長以形成轉化灶（foci），進而可以將該轉化灶選殖並且擴充成細胞系。這種方法可以用於將表現多功能多肽的細胞系工程化。
在某些實施方式中，在本文中呈現的多功能多肽被表現於具有多功能多肽的瞬時表現的細胞系中。瞬時轉染係引入細胞中的核酸不會整合到該細胞的基因組或染色體DNA中但是在該細胞中維持為染色體外元件例如作為附加體的一個過程。附加體的核酸的轉錄過程不受影響，並且產生由附加體的核酸編碼的蛋白質。
穩定或瞬時轉染的細胞系被維持在本領域中已知的導致多肽的表現和產生的細胞培養基和條件中。在某些實施方式中，哺乳動物細胞培養基係基於可商購的培養基配製物，包括例如DMEM或Ham's F12。在一些實施方式中，將細胞培養基進行改良以支持細胞生長和生物蛋白表現兩者的增長。如本文所用，術語「細胞培養基」、「培養基」、以及「培養基配製物」係指在一個多細胞生物體或組織以外的一個人工體外環境中用於細胞的維持、生長、繁殖、或擴增的營養液。可以將細胞培養基優化以用於特定的細胞培養用途，包括例如，被配製來促進細胞生長的細胞培養物生長培養基，或者被配製來促進重組蛋白產生的細胞培養物生產培養基。術語營養素、成分、以及組分（component）可以互換使用以指組成細胞培養基的組分（constituent）。
在不同的實施方式中，使用補料分批法維持細胞系。如本文所用，「補料分批法」係指在首先用基礎培養基孵育之後，用另外的營養素供應給補料分批細胞培養物之方法。例如，一種補料分批法可以包括根據一個所確定的補料時間表在一個給定時期內添加補充培養基。因此，「補料分批細胞培養」係指這樣一種細胞培養：其中最初將細胞（典型地為哺乳動物）和培養基供應至培養容器，並且在培養期間，連續地或以不連續增量方式將另外的培養營養素饋送至培養物，在培養終止之前有或沒有定期的細胞和/或產物的收穫。
在一些實施方式中，細胞培養基包含基礎培養基以及產生改良的基礎培養基的至少一種水解產物，例如基於大豆的水解產物、基於酵母的水解產物、或這兩種類型的水解產物的組合。另外的營養素有時可以僅包括一種基礎培養基如一種濃縮的基礎培養基，或者可以僅包含水解產物、或濃縮的水解產物。合適的基礎培養基包括但不限於杜爾貝科氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM）、DME/F12、最低必需培養基（MEM）、伊格爾基礎培養基（BME）、RPMI 1640、F-10、F-12、α-最低必需培養基（α-MEM）、格拉斯哥最低必需培養基（Glasgow's Minimal Essential Medium，G-MEM）、PF CHO（參見例如，CHO無蛋白質培養基（西格瑪公司（Sigma））或用於無蛋白質的CHO細胞的EX-CELL.TM. 325 PF CHO無血清培養基（SAFC生物科學公司（SAFC Bioscience）））、以及伊斯科夫改良的杜爾貝科氏培養基（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）。可以用於本文中的技術的基礎培養基的其他實例包括BME基礎培養基（吉布-英傑公司（Gibco-Invitrogen）；杜爾貝科氏改良伊格爾培養基（DMEM，粉末）（吉布-英傑公司（#31600））。
在某些實施方式中，基礎培養基可以是無血清的，意指該培養基不含血清（例如，胎牛血清（FBS）、馬血清、山羊血清、或熟悉該項技術者已知的任何其他動物源的血清），或沒有動物蛋白的培養基或化學上限定的培養基。
可以改良基礎培養基以便除去在標準基礎培養基中發現的某些非營養組分，如各種無機和有機緩衝液、一種或多種表面活性劑、以及氯化鈉。這類組分從基礎細胞培養基的除去允許剩餘營養組分的濃度增加，並且可以改善總體的細胞生長和蛋白質表現。另外，可以根據細胞培養條件的要求，將省去的組分添加回至含有改良的基礎細胞培養基的細胞培養基中。在某些實施方式中，細胞培養基包含改良的基礎細胞培養基以及至少一種以下營養素：鐵源、重組生長因子；緩衝液；表面活性劑；滲透性調節劑；能量源；以及非動物水解產物。另外，改良的基礎細胞培養基可以視需要含有胺基酸、維生素、或胺基酸和維生素兩者的組合。在一些培養基中，改良的基礎培養基進一步含有麩醯胺酸，例如L-麩醯胺酸和/或胺甲蝶呤。
在一些實施方式中，藉由使用本領域已知的補料分批、分批、灌注的生物反應器製程或連續進料生物反應器方法而大量地進行蛋白質產生。大規模生物反應器具有至少50升的容量，有時約大於500升或1,000至100,000升的容量。該等生物反應器可以使用攪拌葉輪來分佈氧和營養素。小規模生物反應器通常是指在不大於大約100升的體積容量中的細胞培養，並且範圍可以是從約1升至約100升。可替代地，一次性生物反應器（SUB）可以用於大規模或小規模培養。
溫度、pH、攪拌、曝氣以及接種密度可以取決於所使用的宿主細胞以及有待表現的重組蛋白而不同。例如，重組蛋白細胞培養可以被維持在30°C與45°C之間的一個溫度下。可以在培養過程期間監測培養基的pH，以使得pH保持在最佳水平，對於某些宿主細胞來說，該最佳水平可以是在6.0至8.0的pH範圍內。葉輪驅動的混合可以用於此類培養方法以用於攪拌。葉輪的轉速可以大約係50至200 cm/秒的端速，但可以取決於所培養的宿主細胞的類型而使用本領域中已知的其他氣升或其他混合/曝氣系統。提供充足的曝氣以便在培養物中維持大約20%至80%空氣飽和度的溶解氧濃度，這再次取決於所培養的所選擇的宿主細胞。可替代地，生物反應器可以直接將空氣或氧氣噴射至培養基之中。存在其他供氧方法，包括採用中空纖維膜曝氣器的無泡曝氣系統。 蛋白質純化
在一些實施方式中，本揭露提供了純化用於在本文所揭露之方法中的任一種（例如，本文所揭露的劑量方案中的任一者）中使用的本文所揭露的結合分子中的任一者之方法。可以根據任何合適之方法對由如上文所述之轉化宿主產生的蛋白質進行純化。此類標準方法包括層析法（例如，離子交換層析、親和層析以及尺寸分級柱層析）、離心、差別溶解度，或者藉由用於蛋白質純化的任何其他標準技術。親和標籤如六組胺酸、麥芽糖結合結構域、流感外殼序列以及麩胱甘肽-S-轉移酶可以附接至蛋白質，以便允許蛋白質藉由適當的親和柱後較容易地得到純化。還可以使用如蛋白質水解、核磁共振和x射線結晶等此類技術來在物理上表徵分離的蛋白質。
例如，可以首先使用可商購的蛋白濃縮過濾器例如艾美康恩（Amicon）或密理博皮裡康恩（Millipore Pellicon）超濾單元濃縮來自將重組蛋白分泌到培養基中的系統的上清液。濃縮步驟之後，濃縮物可以應用到合適的純化基質上。可替代地，可以採用陰離子交換樹脂，例如具有側接的二乙胺基乙基（DEAE）基團的基質或底物。基質可以是丙烯醯胺、瓊脂糖、右旋糖酐、纖維素或在蛋白質純化中常用的其他類型。可替代地，可以採用陽離子交換步驟。合適的陽離子交換劑包括含有磺丙基或羧甲基基團的各種不可溶基質。最後，可以使用採用疏水性RP-HPLC介質（例如，具有側接甲基或其他脂族基團的矽膠）的一個或多個反相高效液相層析（RP-HPLC）步驟，以便進一步純化NGF結合劑。還可以採用不同組合的一些或所有前述純化步驟以提供均質的重組蛋白。
可以例如藉由最初從細胞沈澱中提取，隨後進行一次或多次濃縮、鹽析、水性離子交換或尺寸排阻層析步驟來分離在細菌培養物中產生的重組蛋白。可以採用高效液相層析（HPLC）進行最終純化步驟。用於重組蛋白表現的微生物細胞可以藉由任何常規方法來破壞，該等方法包括凍融循環、超音波處理、機械破壞或使用細胞溶解劑。
用於純化重組多肽的本領域已知之方法還包括，例如在美國專利公開案號2008/0312425、2008/0177048以及2009/0187005中描述的那些，該等專利各自藉由引用以其全文特此併入本文。 使用方法和藥物組成物
本揭露提供了用於控制或治療受試者的疼痛（例如減輕和/或預防受試者的疼痛）之方法，該等方法包括投與治療有效量的如本文所提供的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽（例如，多特異性結合分子）或包括共同投與TNFα拮抗劑和NGF拮抗劑。在某些方面中，該受試者係人。
本揭露進一步提供了包含本文所述之結合分子中的任一者的藥物組成物。在某些方面中，該等藥物組成物進一步包含藥學上可接受的媒介物。該等藥物組成物可用於治療例如減輕或預防疼痛，例如，神經性和炎性（例如，骨關節炎或類風濕性關節炎）疼痛。
包含本文所提供的NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑的多功能多肽和組成物可用於各種應用中，該等應用包括但不限於控制或治療（例如，減輕和/或預防）疼痛，例如神經性疼痛。該等使用方法可以是體外、離體或體內方法。
在某些方面中，用NGF結合劑（例如，抗體或多肽）治療的疾病、障礙或病症與疼痛相關。在某些方面中，該疼痛與慢性傷害性疼痛、慢性下腰痛、神經性疼痛、癌性疼痛、皰疹後神經痛（PHN）性疼痛或內臟痛病症相關。在某些方面中，該疼痛與關節炎症（例如，膝關節或髖關節炎症）相關。
本揭露提供了用於控制（例如減輕或預防）受試者的疼痛之方法，該方法包括向需要疼痛控制的受試者投與有效量的神經生長因子（NGF）拮抗劑和腫瘤壞死因子（TNFα）拮抗劑，其中該投與比單獨投與當量的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑可以更有效地控制（例如，減輕或預防）受試者的疼痛。
所謂比單獨投與該等組分「更有效地」控制疼痛係指，該組合治療在控制疼痛方面比單個地投與當量的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑更有效。在某些方面中，並且如下文更詳細描述，本文所提供的控制（例如，減輕或預防）疼痛之方法可以提供協同功效，例如，NGF拮抗劑和TNFα拮抗劑二者的投與的作用可以提供大於累加的作用，或者在單個的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑無效的情況下可以是有效的。在某些方面中，該組合可以允許劑量節省，例如，當共同投與時，單獨的組分的有效劑量可以小於任一組分單獨投與時的有效劑量。
在某些方面中，本文所提供的控制（例如，減輕或預防）疼痛之方法在控制（例如，減輕或預防）受試者的疼痛方面比單獨投與當量的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑更有效至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在某些方面中，向受試者共同投與的單個的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑的劑量或者在投與本文所提供的雙功能多肽時提供的相對劑量的NGF拮抗劑或TNFα拮抗劑的劑量可以比單獨投與該等組分所需要的劑量低，例如低5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
在一些實施方式中，本揭露提供了以特定劑量方案向受試者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以0.04-0.25 mg/kg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以0.04-0.15 mg/kg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以0.04-0.1 mg/kg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以0.04-0.075 mg/kg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以0.04-0.06 mg/kg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以約0.05 mg/kg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以約0.1 mg/kg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以約0.15 mg/kg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以約0.2 mg/kg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，靜脈內投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者靜脈內投與0.04-0.275 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與0.04-0.25 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與0.04-0.2 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與0.04-0.15 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與0.04-0.1 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與0.04-0.08 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與0.1-0.275 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與0.1-0.25 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與0.1-0.2 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與0.15-0.25 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與約0.05 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與約0.1 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與約0.15 mg/kg該結合分子。在一些實施方式中，該方法包括向受試者靜脈內投與約0.2 mg/kg該結合分子。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與0.1-1.2 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與0.1-1.0 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與0.1-0.8 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與0.1-0.6 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與0.1-0.4 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與0.1-0.25 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與0.4-1.0 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與0.6-1.0 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與0.8-1.0 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與0.8-1.2 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與約0.2 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與約0.4 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與約0.6 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與約0.8 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，減輕或預防）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向受試者皮下投與約1 mg/kg本文所揭露的結合分子中的任一者。
在一些實施方式中，本揭露提供了藉由以固定的劑量方案向有需要的受試者投與本文所揭露的結合分子中的任一者來治療（例如，減輕或預防）該受試者的疼痛之方法。如本文所用，固定的劑量方案意指給予每個受試者的劑量係固定的並且不取決於該受試者的體重或其他特徵。在一些實施方式中，以5-200 mg的固定劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以7.5-150 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以25-150 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以75-150 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以5 mg、7.5 mg、25 mg、75 mg、150 mg或200 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以7.5、25、75或150的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以5 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以7.5 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以25 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以75 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以150 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以200 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以相當於結合分子的靜脈內劑量的固定劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，相當於靜脈內劑量的固定劑量係如下固定劑量，該固定劑量提供了與該靜脈內劑量基本上相同、或相同的血清藥物動力學曲線。在一些實施方式中，相當於靜脈內劑量的固定劑量係如下固定劑量，該固定劑量提供了與該靜脈內劑量基本上相同、或相同的藥物動力學曲線圖中的曲線下幾何平均面積。在一些實施方式中，以相當於結合分子的靜脈內固定劑量的固定劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以相當於30 mg結合分子的固定靜脈內劑量的固定劑量向本文所揭露的受試者中的任一者投與本文所揭露的結合分子中的任一者。
在一些實施方式中，靜脈內投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，向本文所揭露的受試者中的任一者靜脈內投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以固定劑量靜脈內投與本文所揭露的結合分子中的任一者。
在一些實施方式中，皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，向本文所揭露的受試者中的任一者皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以固定劑量皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以本文所揭露的固定劑量中的任一個皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。
在一些實施方式中，本揭露提供了用於治療（例如，預防或減輕）有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向該受試者投與皮下固定劑量的本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，該方法包括皮下投與5-200 mg固定劑量的本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，該方法包括皮下投與7.5-150 mg固定劑量的本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，該方法包括皮下投與25-150 mg固定劑量的本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，該方法包括皮下投與75-150 mg固定劑量的本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，該方法包括皮下投與5、7.5、25、75、150或200 mg固定劑量的本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，該方法包括皮下投與7.5、25、75或150 mg固定劑量的本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以5 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以7.5 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以25 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以75 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以150 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，以200 mg的劑量向本文所揭露的受試者中的任一者皮下投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，該方法包括皮下投與相當於靜脈內固定劑量的結合分子的固定劑量。在一些實施方式中，該方法包括皮下投與相當於30 mg固定靜脈內劑量的結合分子的固定劑量。
在一些實施方式中，治療（例如，預防或減輕）疼痛之方法包括根據劑量時間表投與本文所揭露的結合分子中的任一者。在一些實施方式中，向該受試者投與該結合分子一次。在一些實施方式中，向該受試者投與該結合分子多次。在一些實施方式中，向該受試者投與固定劑量的結合分子多次。在一些實施方式中，向該受試者投與相同固定劑量的結合分子多次。在一些實施方式中，至少每週一次、不多於每週一次、至少每兩週一次、不多於每兩週一次、至少每三週一次、不多於每三週一次、至少每個月一次、不多於每個月一次、至少每個月兩次、不多於每個月兩次、至少每個月三次、不多於每個月三次、至少每六個週一次、或不多於每六個週一次向該受試者投與該結合分子（例如，固定劑量的結合分子）。在一些實施方式中，至少每兩週一次向該受試者投與該結合分子（例如，固定劑量的結合分子）。在一些實施方式中，不多於每兩週一次向該受試者投與該結合分子（例如，固定劑量的結合分子）。在一些實施方式中，每兩週一次向該受試者投與該結合分子（例如，固定劑量的結合分子）。在一些實施方式中，至少每三週一次向該受試者投與該結合分子（例如，固定劑量的結合分子）。在一些實施方式中，不多於每三週一次向該受試者投與該結合分子。在一些實施方式中，每三週一次向該受試者投與該結合分子（例如，固定劑量的結合分子）。在一些實施方式中，至少每個月一次向該受試者投與該結合分子（例如，固定劑量的結合分子）。在一些實施方式中，不多於每個月一次向該受試者投與該結合分子（例如，固定劑量的結合分子）。在一些實施方式中，每個月一次向該受試者投與該結合分子（例如，固定劑量的結合分子）。
本揭露提供了治療（例如，預防或減輕）疼痛之方法，其中用於投與本文所揭露的結合分子中的任一者的劑量時間表持續設定的時間段。例如，可以至少每2週一次投與固定劑量的結合分子至少12週。在一些實施方式中，投與該結合分子至少4週、至少8週、至少12週或至少16週。在一些實施方式中，投與該結合分子至少4週。在一些實施方式中，投與該結合分子至少8週。在一些實施方式中，投與該結合分子至少12週。在一些實施方式中，投與該結合分子至少16週。在一些實施方式中，投與該結合分子12週。在一些實施方式中，至少每2週一次投與該結合分子至少12週。在一些實施方式中，每2週一次投與該結合分子至少12週。在一些實施方式中，每2週一次投與該結合分子，持續投與12週。
本文所揭露的結合分子中的任一者可以與另外的疼痛治療組合用於減輕或預防疼痛。另外的疼痛治療可以與本文所揭露的結合分子中的任一者同時投與或者獨立於本文所揭露的結合分子中的任一者投與。因此，本揭露提供了減輕或預防有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括投與本文所揭露的結合分子中的任一者並且進一步包括投與另外的疼痛治療。在一些實施方式中，預防或減輕疼痛之方法進一步包括向該受試者投與NSAID。在一些實施方式中，該方法進一步包括向該受試者投與類鴉片。在一些實施方式中，該方法進一步包括向該受試者投與乙醯胺酚。在一些實施方式中，該方法進一步包括向該受試者投與對乙醯胺基酚。在一些實施方式中，該方法進一步包括向該受試者投與COX-2抑制劑。
需要治療疼痛的受試者在投與本文所揭露的結合分子中的任一者之前，可能已經患有疼痛一段時間。在預防或減輕疼痛之方法的一些實施方式中，該受試者在投與該結合分子之前，已經患有疼痛1個月或更長的時間。在一些實施方式中，在投與該結合分子之前，該受試者已經患有疼痛3個月或更長的時間。在一些實施方式中，在投與該結合分子之前，該受試者已經患有疼痛6個月或更長的時間。
在開始用本文所揭露的結合分子中的任一者治療之前，可能已經向該受試者投與了疼痛的替代性治療。在一些實施方式中，預防或減輕疼痛之方法包括在投與本文所揭露的結合分子中的任一者之前，向該受試者投與疼痛的替代性治療，和確定該疼痛的替代性治療不減輕或預防該受試者的疼痛和/或該受試者不耐受該疼痛的替代性治療。在一些實施方式中，疼痛的替代性治療係NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合。在一些實施方式中，在向該受試者投與該結合分子之前，該方法包括以下步驟：a. 向該受試者投與NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合，和b. 確定i) NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合不減輕或預防受試者的疼痛，和/或ii) 確定該受試者不耐受NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合。在一些實施方式中，投與NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合至少1週、至少2週、至少3週或至少4週。在一些實施方式中，投與NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX抑制劑、乙醯胺酚或其組合至少2週。在一些實施方式中，在投與本文所揭露的結合分子中的任一者之前，向該受試者投與NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合至少1週、至少2週、至少3週或至少4週。在一些實施方式中，在投與本文所揭露的結合分子中的任一者之前，向該受試者投與NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合至少2週。在一些實施方式中，該受試者不耐受NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合。
在開始用本文所揭露的結合分子中的任一者治療之前，可以測試該受試者是否存在感染。在一些實施方式中，預防或減輕疼痛之方法包括在投與本文所揭露的結合分子中的任一者之前，測試受試者的SARS-CoV2感染。在一些實施方式中，該方法包括在向該受試者投與固定劑量的結合分子之前，測試受試者的SARS-CoV2感染。在一些實施方式中，測試受試者的SARS-CoV2感染包括在向該受試者投與固定劑量的結合分子之前，測試受試者的SARS-CoV2基因材料。在一些實施方式中，在基線時，該受試者沒有感染SARS-CoV2。如藉由PCR所測試的，在基線時，該受試者可能是SARS-CoV2核糖核酸（RNA）陰性的。該受試者可能沒有表現出與COVID-19感染或急性病毒性呼吸道疾患一致的臨床體征或症狀，例如，發燒、咳嗽、呼吸困難、咽喉痛和/或味覺/嗅覺喪失。該受試者可能是SARS-CoV2陰性的，可能是COVID-19抗體陰性的。
本發明提供了用於控制或治療（例如，減輕或預防）疼痛之方法。在某些方面中，該疼痛選自慢性傷害性疼痛、慢性下腰痛、神經性疼痛、癌性疼痛、皰疹後神經痛（PHN）性疼痛或內臟痛病症。在某些方面中，該疼痛與關節炎症（例如，膝關節或髖關節炎症）相關。
本文所揭露的結合分子尤其可以用於減輕或預防與關節炎相關的疼痛。在預防或減輕疼痛之方法的一些實施方式中，該受試者患有骨關節炎。在一些實施方式中，該受試者患有單側膝關節的骨關節炎。在一些實施方式中，根據中心讀取器的評估，該受試者在0至4級的Kellgren-Lawrence（KL）分級量表中具有至少2級膝關節骨關節炎。在一些實施方式中，根據中心讀取器的評估，該受試者在0至4級的KL分級量表中具有2級膝關節骨關節炎（Kohn等人 (2016) Clin Orthop Relat Res [臨床骨科及相關研究] 474: 1886-1893和Altman等人 (1986) Arthritis Rheum. [關節炎與風濕病]; 29 (8): 1039-49）。該KL分級系統係基於膝關節的放射照相評估，其中0級的特徵在於沒有骨關節炎的放射照相特徵，因此表示不存在OA；1級的特徵在於可疑的關節間隙變窄；2級的特徵在於可能的關節間隙變窄和存在骨贅；3級的特徵在於明確的關節間隙變窄和多個骨贅；而4級的特徵在於明顯的關節間隙變窄、嚴重的硬化和大骨贅，從而表示嚴重的OA。
疼痛控制的功效可以藉由要求患者根據許多不同的量表對所經歷的疼痛的特性和強度進行評級來測量。語言疼痛量表使用詞語來描述從無疼痛、輕度疼痛、中度疼痛和重度疼痛的範圍，對每個指定的評分為0-3。可替代地，可以要求患者根據從0（無疼痛）到10（可能最嚴重的疼痛）的數字疼痛量表對他們的疼痛進行評級。在視覺模擬量表（VAS）上，垂直或水平線上具有用來描述從無疼痛到可能最嚴重的疼痛的疼痛的詞語，並要求患者在表示他們當前疼痛水平的點上標記該線。麥吉爾疼痛問卷表（McGill pain index）使患者能夠藉由從一系列短列表中選擇最能描述他們的疼痛的詞語（例如，重擊、灼燒、掐捏）來描述疼痛的特性和強度二者。使用VAS或數字量表時遇到困難的成年人可以使用其他疼痛量表，例如FACES或者非語言患者可以使用，例如行為評級量表（Behavioural rating scale）。功能活動得分涉及當要求患者進行一項與疼痛區域相關的任務時患者的疼痛對他們的阻礙程度。使用該等類型的量表獲得的疼痛得分的改善可能說明鎮痛藥的功效有所改善。
可以在向該受試者投與本文所揭露的結合分子中的任一者之前確定受試者患有的疼痛的基線水平。在一些實施方式中，在基線時，如使用WOMAC指數的疼痛分量表所測量的，該受試者在一個關節中具有至少為5的平均西安大略大學和麥克馬斯特大學骨關節炎指數（WOMAC）疼痛得分。
WOMAC多尺度指數用於評估患有膝關節或髖關節OA的受試者的疼痛、僵硬和關節功能。該WOMAC疼痛分量表係一種廣泛使用的、患者報告的結果測量工具，用於評估患有膝關節OA的參與者（Lundgren-Nilsson等人Patient-reported outcome measures in osteoarthritis: a systematic search and review of their use and psychometric properties [患者報告的骨關節炎結果測量：對其使用和心理測量特性的系統搜索和審查]. RMD Open [風濕和肌肉骨骼疾病開放獲取期刊]. 2018年12月16日; 4 (2): e000715），並且由用於評估受試者因靶膝關節中的OA引起的疼痛的5個問題組成。每個問題都按照NRS量表從0到10來進行評分，並且WOMAC疼痛分量表得分計算為所有5個問題的平均得分，其中得分越高表示疼痛程度越高。WOMAC生理功能分量表由17個問題組成，該等問題用於評估受試者因靶膝關節中的OA引起的進行日常生活活動的難度。每個問題都按照NRS量表從0到10來進行評分，並且WOMAC疼痛分量表得分計算為所有17個問題的平均得分，其中得分越高表示功能越差。WOMAC僵硬功能分量表由2個問題組成，這2個問題用於評估由靶膝關節中的OA引起的僵硬。僵硬被定義為靶膝關節中活動容易程度降低的感覺。每個問題都按照NRS量表從0到10來進行評分，並且WOMAC疼痛分量表得分計算為2個問題的平均得分，其中得分越高表示僵硬程度越高。如本文所用，基線WOMAC得分被定義為投與結合劑當天的WOMAC得分。
在一些實施方式中，在基線時，如在疼痛數值評級（NRS）量表上所測量的，該受試者在一個關節中具有至少為5的平均疼痛強度得分。NRS係一種用於評估疼痛的11分李克特量表（11-point Likert scale），其中要求受試者藉由確定從0 = 「無疼痛」到10 = 「過去24小時內可以想像的最嚴重的疼痛」中的一個數字描述他們在指標膝關節中的平均疼痛（參見Alghadir等人Test-retest reliability, validity, and minimum detectable change of visual analog, numerical rating, and verbal rating scales for measurement of osteoarthritic knee pain [用於測量骨關節炎膝關節疼痛的視覺模擬、數字評級和語言評級量表的重複試驗信度、效度和最小可檢測變化]. J Pain Res. [疼痛研究雜誌] 2018年4月26日; 11: 851-6）。如本文所用，基線NRS得分定義為在開始用本文所揭露的結合分子中的任一者治療之前從第-7天到第-1天（含該天）記錄的每日NRS疼痛得分的平均值。
疼痛減輕或預防的功效可以藉由比較投與了本文所揭露的結合分子中的任一者的受試者的疼痛水平的變化與未投與本文所揭露的結合分子中的任一者的對照受試者的疼痛水平的變化來確定。在一些實施方式中，如與未投與結合分子的對照受試者（例如，投與了安慰劑的對照受試者）中的西安大略大學和麥克馬斯特大學骨關節炎指數（WOMAC）得分相比，在WOMAC量表（如果以1-10的量表來評分的話）上，本文所揭露的任一方法或劑量方案使疼痛減輕了至少1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6分。在一些實施方式中，如與未投與結合分子的對照受試者（例如，投與了安慰劑的對照受試者）中的WOMAC得分相比，在WOMAC量表（如果以0-4的量表來評分的話）上，本文所揭露的任一方法或劑量方案使疼痛減輕了至少1、1.5、2、2.5、3、3.5或4分。
在一些實施方式中，如與未投與結合分子的對照受試者中的NRS得分相比，在疼痛數值評定量表（NRS）（如果以1-10的量表來評分的話）上，本文所揭露的任一方法或劑量方案使疼痛減輕了至少1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5或6分。在一些實施方式中，在向受試者單劑量投與該結合分子之後，觀察到了疼痛減輕。
疼痛減輕或預防的功效可以藉由比較投與了本文所揭露的結合分子中的任一者的受試者的疼痛水平的變化與基線時受試者的疼痛水平來確定。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的WOMAC疼痛分量表相對於基線降低了。在一些實施方式中，以固定劑量每2週一次投與本文所揭露的結合分子中的任一者，持續投與12週，並且在第一次投與本文所揭露的結合分子中的任一者之後，該方法使受試者的WOMAC疼痛分量表得分相比於基線降低了至少12週。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的WOMAC疼痛分量表得分相對於基線降低了至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的WOMAC疼痛分量表得分相對於基線降低了至少30%。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的WOMAC疼痛分量表得分相對於基線降低了至少50%。
在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的WOMAC生理分量表得分相對於基線降低了。在一些實施方式中，以固定劑量每2週一次投與本文所揭露的結合分子中的任一者，持續投與12週，並且在第一次投與本文所揭露的結合分子中的任一者之後，該方法使受試者的WOMAC生理分量表得分相比於基線降低了至少12週。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的WOMAC生理分量表得分相對於基線降低了至少20%、至少30%、至少40%、或至少50%。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的WOMAC生理分量表得分相對於基線降低了至少30%。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的WOMAC生理分量表得分相對於基線降低了至少50%。
在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值相對於基線降低了。在一些實施方式中，以固定劑量每2週一次投與本文所揭露的結合分子中的任一者，持續投與12週，並且該方法使受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值相對於基線降低了至少12週。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值相對於基線降低了至少20%、至少30%、至少40%或至少50%。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值相對於基線降低了至少30%。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值相對於基線降低了至少50%。
在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使骨關節炎的患者整體評估（PGA）相對於基線得到改善。如本文所用，基線PGA被定義為投與結合劑當天的PGA得分。PGA係一種用於評估由於膝關節的OA引起的症狀和活動障礙的5分李克特量表（參見，例如Nikiphorou等人 (2016) Arthritis Res Ther [關節炎研究與治療] 18: 251）。要求患者基於如下問題「考慮到膝關節的OA對您的所有影響，您今天感覺怎麼樣？」，在從1 = 非常好（無症狀並且正常活動不受限制）到5 = 非常差（難以忍受的非常嚴重的症狀並且不能進行所有正常活動）之間確定一個數字。在一些實施方式中，以固定劑量每2週一次投與本文所揭露的結合分子中的任一者，持續投與12週，並且該方法使骨關節炎的PGA相對於基線改善了至少12週。在一些實施方式中，本文所揭露的任一方法或劑量方案使骨關節炎的PGA改善了至少2分。
疼痛減輕或預防的功效可以藉由測量受試者中的生物標誌物水平的變化來確定。在一些實施方式中，如與未投與該結合分子的對照受試者（例如，投與了安慰劑的對照受試者）的NGF活性相比，該預防或減輕疼痛之方法使受試者的NGF活性抑制了至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施方式中，如與未投與該結合分子的對照受試者的NGF活性相比，該方法使受試者的NGF活性抑制了至少40%。在一些實施方式中，在向受試者單劑量投與該結合分子之後，觀察到了NGF抑制。在一些實施方式中，在向受試者投與多次劑量的該結合分子之後，觀察到了NGF抑制。
在一些實施方式中，如與未投與該結合分子的對照受試者（例如，投與了安慰劑的對照受試者）的CXCL-13水平相比，該預防或減輕疼痛之方法使受試者的CXCL-13水平抑制了至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在一些實施方式中，在向受試者單劑量投與該結合分子之後，觀察到了CXCL-13抑制。在一些實施方式中，在向受試者投與多次劑量的該結合分子之後，觀察到了CXCL-13抑制。
在某些方面中，藉由將如本文所提供的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽（例如，多特異性結合分子）與藥學上可接受的媒介物（例如，載劑、賦形劑）組合來製備用於儲存和使用的配製物（Remington, The Science and Practice of Pharmacy [雷明頓，藥學科學和實踐] 第20版Mack Publishing [馬克出版公司], 2000）。合適的藥學上可接受的媒介物包括但不限於：非毒性緩衝液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；鹽類，例如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑（例如，十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨；氯化本索寧；苯酚，丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；以及間甲酚）；低分子量多肽（例如，小於約10個胺基酸殘基）；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；碳水化合物，例如單糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖類，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，例如鈉；金屬複合物（例如，鋅-蛋白複合物）；以及非離子表面活性劑，例如TWEEN或聚乙二醇（PEG）。
本揭露之多功能多肽可以配製成液體、半固體或固體形式，這取決於分子的物理化學特性和遞送途徑。配製物可以包括賦形劑、或賦形劑的組合，該等賦形劑例如：糖類、胺基酸以及表面活性劑。液體配製物可以包括廣泛範圍的多肽濃度和pH。固體配製物可以藉由例如冷凍乾燥、噴霧乾燥或藉由超臨界流體技術乾燥來生產。在一些實施方式中，本文所述之配製物中的任一者係凍乾的配製物。
本文所提供的藥物組成物可以以任何數目的用於局部或全身治療的方式投與。投與可以是局部投與（例如至黏膜，包括陰道和直腸遞送），例如透皮貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末；肺部施用（例如，藉由吸入或吹入粉末或氣霧劑，包括藉由霧化器；氣管內、鼻內、表皮和透皮）；口服施用；或腸胃外施用，包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內注射或輸注；或顱內（例如鞘內或腦室內）投與。
如本文所提供的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽可以在藥物組合配製物中或作為組合療法的給藥方案中與具有抗傷害感受特性的第二（或第三）化合物進一步組合。
對於疼痛的治療，如本文所提供的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽（例如，多特異性結合分子）的適當劑量取決於待治療的疼痛類型、疼痛的嚴重程度和病程、疼痛的反應性、多功能多肽係出於治療目的還是預防目的投與、先前的治療、患者的臨床病史等（所有項都由治療醫師決斷）。多功能多肽可以投與一次或在持續幾天至幾個月的一系列治療中投與以維持有效的疼痛控制。最佳給藥時間表可以根據患者體內藥物積累的測量來計算，並且將根據單獨抗體或多肽的相對效價而變化。投與醫師可以很容易地確定最佳劑量、給藥方法和重複率。
如本文所提供的多功能多肽（例如，多特異性結合分子）的投與可以提供「協同作用」並且證明係「協同的」，即，當該等活性成分一起使用時所實現的作用大於分開使用該等化合物產生的作用的總和。當活性成分作為單一的多功能融合多肽投與時，可以獲得協同作用。 疼痛
在最廣泛的用法中，「疼痛」係指一種體驗現象，對經歷它的個體具有高度主觀性，並受個體心理狀態（包括環境和文化背景）的影響。「生理」疼痛通常與對第三方可感知的刺激有關，該刺激係造成實際或潛在組織損傷的原因。從這個意義上講，根據國際疼痛研究協會（IASP），疼痛可以被視為「與實際或潛在的組織損傷相關的或根據這種損傷進行描述的感覺和情感體驗」。然而，疼痛的一些實例沒有可感知的原因。例如，精神性疼痛，包括在患有心理障礙的人中由精神性因素導致的先前存在的生理疼痛的急性發作，或有時持續性、感知性疼痛的綜合症，但是對於疼痛原因沒有任何可感知的證據。在本發明的上下文中的「疼痛」可以是或可以包括本文所揭露的疼痛類型中的任一者。 疼痛的類型
在本發明的上下文中，疼痛包括傷害性疼痛、神經性/神經源性疼痛、爆發性疼痛、異常性疼痛、痛覺過敏、感覺過敏、感覺遲鈍、感覺異常、痛覺過度、幻肢痛、精神性疼痛、痛性感覺缺失、神經痛、神經炎。其他分類包括惡性疼痛、心絞痛和/或特發性疼痛、複雜性局部疼痛綜合症I、複雜性局部疼痛綜合症II。疼痛的類型和症狀不需要係互相排斥的。該等術語旨在由IASP定義。
傷害性疼痛係由周圍神經中專門化的感覺傷害感受器響應於有害刺激引發的，感覺傷害感受器將有害刺激編碼為動作電位。傷害感受器（通常位於Aδ纖維和（多覺型）C纖維上）係自由神經末梢，終止於皮膚下方、肌腱、關節和身體器官中。背根神經節（DRG）神經元提供了周圍和脊髓之間的交流位點。信號藉由脊髓處理到腦幹和丘腦位點，並且最後到達大腦皮層，在那裡它通常（但不總是）引起痛覺。傷害性疼痛可由多種多樣的化學、熱、生物（例如炎症）或機械事件引起，該等事件有可能刺激或損傷身體組織，該等事件通常高於在傷害感受器中引起傷害性活性所需的某個最小強度閾值。
神經性疼痛通常是周圍或中樞神經系統功能異常的結果，分別引起周圍或中樞神經性疼痛。IASP將神經性疼痛定義為由神經系統中的原發性病變或功能障礙引發或引起的疼痛。神經性疼痛常常涉及（尤其是在慢性病例中）對神經系統的實際損傷。炎性傷害性疼痛通常是由組織損傷和由此產生的炎症過程導致的。神經性疼痛可以持續到任何可觀察到的組織損傷的明顯癒合（例如，幾個月或幾年）後。
在神經性疼痛的情況下，來自受影響區域的感覺處理可能會變得異常，並且正常情況下不會引起疼痛的無害刺激（例如，熱、觸摸/壓力）可能會引起疼痛（即，異常性疼痛），或者響應於正常的疼痛刺激，有害刺激可能會引起對疼痛的誇大感知（即痛覺過敏）。另外，正常刺激可能會引發類似於電刺痛或電擊或「針刺」的感覺（即感覺異常）和/或具有令人不快的特性（即感覺遲鈍）的感覺。爆發性疼痛係先前存在的慢性疼痛的加劇。痛覺過度係由對刺激的異常疼痛反應引起的疼痛綜合症。在大多數情況下，該刺激係重複的，而疼痛閾值不斷增加，疼痛閾值可以被認為係患者可以識別為疼痛的最低疼痛體驗。
神經性疼痛的實例包括觸覺異常性疼痛型（例如，神經損傷後誘導的）神經痛（例如，皰疹後（或帶狀皰疹後）神經痛、三叉神經的神經痛）、反射交感性神經營養不良/灼性神經痛（神經損傷）、各種癌性疼痛（例如，由於癌症本身或相關病症例如炎症引起的疼痛，或由於治療例如化療、手術或放療引起的疼痛）、幻肢痛、神經嵌壓症（例如，腕管綜合症）、和神經病例如周圍神經病（例如，由於糖尿病、HIV、慢性酒精施用、暴露於其他毒素（包括多種化療）、維生素缺乏症和各種各樣的其他醫學病症引起的）。神經性疼痛包括由於各種原因例如，外科手術、受傷、帶狀皰疹、糖尿病性神經病、腿或手臂的截肢、癌症等引起的神經損傷之後神經系統的病理操作的表現所引起的疼痛。與神經性疼痛相關的醫學病症包括創傷性神經損傷、腦卒中、多發性硬化、脊髓空洞症、脊髓損傷和癌症。
引起疼痛的刺激常常會引起炎症反應，而炎症反應本身會導致疼痛體驗。在一些病症中，疼痛似乎係由傷害性因素和神經性因素的複雜混合引起的。例如，慢性疼痛常常包含炎性傷害性疼痛或神經性疼痛，或二者的混合。最初的神經系統功能障礙或損傷可能引發炎症介質的神經釋放和隨後的神經性炎症。例如，偏頭痛可以表示神經性疼痛和傷害性疼痛的混合。此外，肌筋膜疼痛可能繼發於肌肉的傷害性輸入，但異常肌肉活動可能是神經性病症的結果。
根據本文所提供的控制疼痛（例如，減輕或預防疼痛）之方法，本文所揭露的結合分子中的任一者的投與足以在需要疼痛控制的受試者中控制疼痛（例如，減輕或預防疼痛）。在一些實施方式中，在向受試者單劑量投與本文所揭露的結合分子中的任一者後，觀察到了疼痛減輕。在一些實施方式中，在向受試者投與多次劑量的本文所揭露的結合分子中的任一者之後，觀察到了疼痛減輕。在特定的實施方式中，本揭露提供了用於減輕或預防與骨關節炎相關的疼痛之方法或劑量方案。在一些實施方式中，該與骨關節炎相關的疼痛係與骨關節炎相關的膝關節疼痛。
在預防或減輕疼痛之方法的一些實施方式中，該疼痛係急性疼痛、短期疼痛、持續性或慢性傷害性疼痛、或持續性或慢性神經性疼痛。在一些實施方式中，該疼痛包含慢性疼痛。在一些實施方式中，該疼痛與關節炎症，例如膝關節或髖關節的炎症相關。在一些實施方式中，該疼痛包含骨關節炎疼痛。在一些實施方式中，該疼痛包含膝關節的骨關節炎疼痛。 包含 TNFα 和 NGF 拮抗劑的套組
本揭露提供了包含如本文所提供的TNFα和NGF拮抗劑多功能多肽（例如，多特異性結合分子）的套組（kit），該等套組可以用於進行本文所述之方法。在某些方面中，套組至少包含在一個或多個容器中的包含TNFα拮抗劑和NGF拮抗劑的多功能融合多肽，例如，包含SEQ ID NO: 14或17的胺基酸序列的多肽。熟悉該項技術者將易於認識到，本文所提供的揭露TNFα和NGF拮抗劑可易於與本領域中熟知的已建立的藥盒形式中的任一者相結合。 實例
藉由參考以下實例將更容易理解現在在總體上描述的本揭露，該等實例僅被包括用於說明本揭露之某些方面和實施方式的目的，並不旨在限制本揭露。 實例1 - 抗NGF scFv/TNFR2-Fc多特異性結合分子的構建和表徵
如下產生多功能分子，具體地，包含抗NGF抗體結構域和TNFR2-Fc結構域的多特異性結合分子。根據於Dimasi, N. 等人, J Mol Biol.[分子生物學雜誌] 393: 672-92 (2009) 和於PCT公開案號WO 2013/070565中描述的Bs3Ab形式，將抗NGF抗體scFv片段經由重鏈CH3結構域融合至TNFR2-Fc融合蛋白（SEQ ID NO: 13）的C-末端。圖1示出了結構圖解。編碼TNFR2-Fc多肽和多特異性結合分子的DNA構建體由GeneArt（英傑公司（Invitrogen））合成。對於多特異性結合分子，構建了抗NGF scFv，該抗NGF scFv包含經由15個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 3（SEQ ID NO: 15）連接在一起的MEDI-578的VH（SEQ ID NO: 3）和VL（SEQ ID NO: 7）結構域。將scFv的N-末端經由10個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 2融合至SEQ ID NO: 13的C-末端。這種多特異性結合分子在本文中被稱為TNFR2-Fc_VH#4。將編碼多特異性結合分子的DNA構建體工程化以在3′端含有終止密碼子和EcoRI限制性位點用於選殖到Bs3Ab表現載體中。將編碼TNFR2-Fc_VH#4的DNA序列表示為SEQ ID NO: 16並且將其胺基酸序列表示為SEQ ID NO: 14。
藉由在多特異性結合分子的MEDI-578 scFv部分的VH和VL結構域之間添加鏈間二硫鍵，改善了TNF-NGF多特異性結合分子的熱穩定性。這藉由在VH結構域（SEQ ID NO: 94）的胺基酸44處和VL結構域（SEQ ID NO: 95）的胺基酸103處引入G-＞C突變來完成。這一單株被命名為TNFR2-Fc_varB。TNFR2-Fc_varB的胺基酸序列被表示為SEQ ID NO: 17。編碼TNFR2-Fc_varB的DNA序列被表示為SEQ ID NO: 18。編碼TNFR2-Fc_varB的經密碼子優化的DNA序列被表示為SEQ ID NO: 99。TNFR2-Fc_varB與TNFR2-Fc_VH#4的進一步的區別在於連接scFv部分的VH和VL的15個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 3被20個胺基酸的連接子(GGGGS) 4（SEQ ID NO: 19）替代。使用了差示掃描螢光法（DSF）來測量TNFR2-Fc_VH#4和TNFR2-Fc_varB的Tm。該方法測量螢光染料Sypro Orange（英傑公司（Invitrogen））的結合，該染料與暴露於高溫時蛋白質結構域解折疊期間露出的疏水表面結合。在DSF測定中，TNFR2-Fc_VH#4的Tm係62°C，而TNFR2-Fc_varB的Tm係66°C。因此，在多特異性分子的MEDI-578 scFv部分中添加鏈間二硫鍵使該分子的熱穩定性改善了4°C。
使用聚乙烯亞胺（PEI）（波利塞斯公司（Polysciences））作為轉染試劑，將TNFR2-Fc蛋白和TNFR2-Fc_VH#4在CHO懸浮細胞中瞬時表現。將細胞維持在CD-CHO培養基（生命科技公司（Life Technologies））中。根據製造商的方案（通用電氣醫療集團（GE Healthcare）），使用1 ml HiTrap MabSelect SuRe™親和層析純化小規模轉染的培養收穫物，並且隨後在1%蔗糖、100 mM NaCl、25 mM L-精胺酸鹽酸鹽和25 mM磷酸鈉（pH 6.3）中進行緩衝液交換。在還原條件下使用SDS-PAGE並使用分析性尺寸排阻層析分析重組蛋白的純度（見下文方法），並藉由使用理論上確定的消光係數讀取280 nm處的吸光度來確定濃度。
TNFR2-Fc融合蛋白和TNF-NGF多特異性構建體TNFR2-Fc_VH#4的小規模瞬時表現和蛋白A柱純化分別產生了36.6和79.9 mg L -1的產率。
如下產生了較大批次的TNFR2-Fc_VH#4。使用深度過濾將來自大規模轉染的粗培養收穫物（多達6 L）過濾，並且載入到用緩衝液A（磷酸鹽緩衝鹽水，pH 7.2）預平衡的1.6 x 20 cm蛋白A瓊脂糖柱（通用電氣醫療集團（GE Healthcare））上。然後用緩衝液A洗滌柱並且將產物在緩衝液B（50 mM醋酸鈉，pH ＜ 4.0）的分級梯度中洗脫。將產物藉由載入到在緩衝液C（50 mM醋酸鈉緩衝液，pH ＜ 5.5）中預平衡的1.6 x 20 cm Poros HS 50柱（應用生物系統公司（Applied Biosystems））上進一步純化，在緩衝液C中洗滌，並且然後將產物隨後在50 mM醋酸鈉緩衝液（pH ＜ 5.5）中的從0到1 M NaCl的線性梯度中洗脫。藉由尺寸排阻HPLC分析所得的洗脫物。藉由A280光譜、以Beckman DU520分光光度計、使用計算的消光係數1.36來確定蛋白質濃度。 用於表徵 TNFR2-Fc_VH#4 之方法
使用標準方案進行蛋白質印跡分析。根據製造商的說明，使用Xcell SureLock™系統（英傑公司（Invitrogen）），將蛋白質轉移到聚偏氟乙烯膜（生命科技公司（Life Technologies））上。將膜用在磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）中的3%（w/v）脫脂奶粉在室溫下封閉1小時。使用標準方案，以HRP軛合的抗人IgG Fc特異性抗體（西格瑪公司（Sigma））產生蛋白質印跡。
使用Gilson HPLC系統（等度泵-307，UV/Vis-151檢測器，液體處理器-215和注射模組-819），以Phenomenex BioSep-SEC-S3000（300 x 7.8 mm）柱（流動相：D-PBS（生命科技公司（Life Technologies）），流速：1 ml/min）進行尺寸排阻HPLC。將25 µL樣本注射到柱上並在A280 nm處監測蛋白質種類的分離。
根據製造商的方案，使用EDGLY套組（西格瑪奧德里奇公司（Sigma Aldrich）），對小規模純化的TNFR2-Fc_VH#4進行酶法去糖基化。在變性的和天然的兩種條件下對蛋白質進行去糖基化。對於變性的蛋白質，將30 µg蛋白質在37°C下用肽N-糖苷酶F（PNGase F）、O-糖苷酶和α-(2→3, 6, 8, 9)-神經胺酸酶、β-N-乙醯葡糖胺糖苷酶和β-(1→4)-半乳糖苷酶去糖基化3小時。在天然條件下，將35 µg蛋白質用如上相同的酶組在37°C下去糖基化3天。藉由考馬斯（coomassie）染色的SDS-PAGE和蛋白質印跡使用標準測定方案來分析去糖基化的蛋白質。
TNFR2-Fc_VH#4的N-端胺基酸定序如下進行。使用標準方案在SDS-PAGE凝膠上運行大約2 µg的TNFR2-Fc_VH#4。根據製造商的說明，使用Xcell SureLock™系統（英傑公司（Invitrogen）），將蛋白質轉移到PVDF膜上。將膜在軌道振盪平臺上用0.1%（w/v）醯胺黑染色大約15分鐘，然後用dH 2O洗滌以減少PVDF膜的背景染色。在N-端定序之前將膜風乾。切下目的條帶，並在Applied Biosystems 494 HT定序儀（應用生物系統公司（Applied Biosystems），美國加利福尼亞州三藩市）上，使用Applied Biosystems 140A微型HPLC，以線上乙內醯苯硫脲分析對多特異性結合分子的N-末端進行序列測定。 表徵結果
藉由SEC-HPLC表徵了純化的TNFR2-Fc_VH#4和TNFR2-Fc蛋白的聚集體、單體和蛋白質片段化水平（圖2A和2B）。包含單體的主峰構成存在的總蛋白的大約90%，剩餘的大約10%的蛋白質量具有較低的柱保留時間，這說明存在更高級的種類或聚集體。然而，來自SEC-HPLC的單體峰有兩個明顯的峰肩，這說明這一峰內的蛋白質不是單一種類。使用考馬斯染色的SDS-PAGE分析示出TNFR2-Fc_VH#4的兩條不同條帶（在大約100和75 kD）和類似地，在還原條件下TNFR2-Fc融合蛋白的兩條不同條帶（在大約70和45 kD）（圖2B）。在非還原條件下，TNFR2-Fc_VH#4存在三個主要條帶（在150和250 kD之間），而TNFR2-Fc融合蛋白分別地在大約150和120 kD存在一個主要條帶和一個次要條帶。由於在還原條件下兩個條帶之間的分子量差大約相當於scFv片段的大小（約26.5 kD），因此為了瞭解生成的多特異性結合分子所處的形式進行了進一步分析。天然條件下的質譜分析證實了SDS-PAGE數據，對於兩個單獨的純化蛋白質製劑，純化的TNFR2-Fc_VH#4製劑中存在三個分子量，大約為125、152和176 kD（圖2C）。
如果藉由SDS-PAGE凝膠觀察到的條帶模式係由於TNFR2-Fc_VH#4的不同糖基化，那麼在去糖基化後，這將消退為單一條帶。然而，當TNFR2-Fc_VH#4作為天然蛋白質或變性蛋白質去糖基化時，在還原和非還原的兩種條件下條帶模式均維持（數據未示出）。用多株抗人IgG Fc特異性抗體對糖基化和去糖基化的TNFR2-Fc_VH#4二者進行蛋白質印跡染色示出，全長預期的條帶和較低分子量條帶二者均與抗Fc特異性抗體反應（數據未示出）。
截短的產物的最終鑒定係藉由蛋白質的N-端胺基酸定序進行的。這顯示了截短的蛋白質的N-端的前8個胺基酸係SMAPGAVH，該等胺基酸對應於TNFR2-Fc_VH#4序列（SEQ ID NO: 14）的胺基酸176至183。這表示在TNFR2-Fc_VH#4的N-端有175個胺基酸的截短，僅留下TNFR2結構域的42個胺基酸。這使我們能夠準確地解釋來自SDS-PAGE、質譜和SEC-HPLC分析的質量數據。存在三種可能的TNFR2-Fc_VH#4二聚體組合，並且所有組合都存在於純化的蛋白質製劑中：(1) 全長同源二聚體，(2) 全長和截短的種類的異源二聚體，和 (3) 截短的種類的同源二聚體。為了準確測量體外和體內生物活性二者，藉由兩步柱層析法產生了全長同源二聚體製劑。在第一步驟中，蛋白A純化後，產物含有80.5%的單體（圖3A），並且在第二個柱純化步驟（SP瓊脂糖凝膠）後，單體百分比為97.8%（圖3B）。在整個過程中的產率係7.3%。 實例2 - 藉由差示掃描量熱法（DSC）進行的熱穩定性分析
使用自動MicroCal VP-Capillary DSC（通用電氣醫療集團（GE Healthcare）, 美國）進行量熱測量。在25 mM組胺酸/組胺酸-HCl緩衝液（pH 6.0）中，以1 mg/mL測試蛋白質樣本。使蛋白質樣本和緩衝液以每小時95°C的速率進行從25°C至100°C的線性升溫。使用Origin 7軟體，從蛋白質樣本中減去作為參考的緩衝液，並確定熱轉變。
TNFR2-Fc_VH#4的熱譜圖（圖4）示出了三個不同的解折疊轉變，變性溫度（Tm）分別為64°C、67°C和84°C。我們推斷64°C的Tm對應於TNFR2結構域和抗NGF scFv結構域二者的變性，其中67°C和84°C的Tm分別是IgG1 CH2和CH3結構域的典型變性Tm（例如，Dimasi, N. 等人, J Mol Biol.[分子生物學雜誌] 393: 672-92 (2009)，和PCT公開案號WO 2013/070565）。儘管不希望受理論束縛，scFv通常比其他抗體結構域具有更低的變性溫度，並且它們的解折疊特徵在於單一轉變事件（Roberge等人, 2006，Jung等人, 1999，Tischenko等人, 1998）。 實例3 - 抗原與TNFR2-Fc_VH#4結合的確認 A. 單一和雙抗原結合的 ELISA
將Nunc Maxisorp孔在4°C下用在PBS（pH 7.4）中稀釋至5 µg ml -1的50 µl的TNFα（R & D系統公司（R & D Systems））包被過夜。第二天除去包被溶液，並在室溫下用150 µl的封閉緩衝液[3% 脫脂乳-PBS]封閉孔1小時。在添加50 µl的在封閉緩衝液中製備的TNFR2-Fc_VH#4的稀釋系列之前，將孔在PBS中沖洗三次。在室溫下1小時後，將孔在PBS-吐溫20（0.1% v/v；PBS-T）中洗滌三次。然後將五十微升的生物素化的NGF添加到孔中，並在室溫下再孵育一個小時，然後如上進行洗滌並添加50 µl的鏈黴親和素-HRP（1 : 100）。在室溫下1小時後，用PBS-T洗滌孔，添加50 µl的3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺底物並顯色。藉由添加1M H 2SO 4來終止反應，並使用微量滴定板讀取器測量450 nm處的吸光度。使用Prism 5軟體（GraphPad公司，加利福尼亞州聖地牙哥）分析所得數據。對於單一抗原結合ELISA，如上將孔用TNFα或NGF-生物素包被，並用抗人IgG Fc特異性HRP軛合抗體（1 : 5000）檢測抗體結合，並如上進行顯色。
圖5示出了ELISA結果。TNFR2-Fc_VH#4被設計為結合TNFα和NGF抗原二者。藉由首先將一種抗原固定在96孔微量滴定板上，然後添加TNFR2-Fc_VH#4的連續稀釋液來進行單一抗原結合。藉由使用辣根過氧化物酶（HRP）軛合的抗IgG Fc特異性抗體檢測特異性結合。對於雙抗原結合ELISA，將第一抗原TNFα固定在ELISA板上，並且然後添加TNFR2-Fc_VH#4的連續稀釋液，然後添加固定濃度的第二生物素化的抗原NGF。然後使用HRP軛合的鏈黴親和素檢測特異性結合。在單一抗原結合ELISA中，TNFR2-Fc_VH#4與TNFα和NGF結合（圖5A和圖5B）。在雙抗原結合ELISA中，TNFR2-Fc_VH#4同時與TNFα和NGF二者結合（圖5C）。 B. 同時抗原結合的表面電漿共振
同時抗原結合實驗主要如Dimasi, N. 等人, J Mol Biol.[分子生物學雜誌] 393: 672-92 (2009) 所述，使用BIAcore 2000儀器（通用電氣醫療集團（GE Healthcare））進行。簡言之，CM5感測器晶片用於在100 nM下固定大約1500個共振單位的TNFR2-Fc_VH#4。然後將感測器晶片表面用於並行結合TNFα和NGF。在HBS-EP緩衝液[10 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM NaCl、3 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、0.005% P20]中製備抗原。在所有結合測量中使用30 μl/min的流速。為了確定多特異性抗體與TNFα和NGF的同時結合，將1 µM的TNFα（分子量，17.5 kD）注射到感測器晶片表面，並且在注射完成後，然後注射TNFα和NGF（分子量，13.5 kD）（兩者均為1 µM）的混合物。將TNFα包括在與NGF的混合物中以防止在NGF結合階段由於TNFα解離而導致信號損失。作為對照，進行了類似的結合程式，並且在最後一次注射時僅添加了TNFα，這一注射的共振單位沒有進一步增加說明TNFα以飽和水平結合。進行了類似的結合和對照實驗，其中將TNFα和NGF的注射順序顛倒。
TNFR2-Fc_VH#4的同時抗原結合藉由表面電漿共振來表徵。按順序方式對結合事件進行定性分析。用胺軛合化學，將TNFR2-Fc_VH#4共價固定在感測器晶片表面上。隨後，注射第一抗原以給出與TNFR2-Fc_VH#4結合的飽和水平，然後將第二抗原作為與抗原1的等莫耳混合物注射。結合傳感圖清楚地示出TNFR2-Fc_VH#4同時與TNFα和NGF結合（圖6）。無論抗原注射順序如何，兩種抗原都會同時結合。 實例4 - NGF誘導的TF-1細胞增殖的抑制
將TF-1細胞（ECACC目錄號93022307）以1.5 x 10 4個細胞/孔接種在96孔組織培養板（康寧科斯塔公司（Corning Costar））中的50 µl的無血清培養基中，並在37°C下用5% CO 2孵育18小時。將重組人（西格瑪公司（Sigma））或小鼠NGF（R & D系統公司（R & D Systems））與TNFR2-Fc_VH#4、MEDI-578 IgG1 TM YTE（MEDI-578的一種非結合IgG1 TM YTE同種型對照）、或非結合雙特異性同種型對照R347 Bs3Ab的稀釋液在96孔圓底板（格瑞納公司（Greiner））中在37°C下預孵育30分鐘。然後將五十微升的每種樣本添加到細胞板並在37°C下孵育48小時。孵育期後，添加100 µl的細胞TITRE GLO®測定緩衝液（普洛麥格（Promega）），並將板在37°C下用5% CO 2孵育10分鐘。然後使用標準發光方案測量發光。在沒有抗體的情況下，標準NGF誘導的TF-1增殖如圖7A所示。
使用NGF誘導的TF-1增殖來確定TNFR2-Fc_VH#4的功能活性。TNFR2-Fc_VH#4能夠完全抑制人和鼠二者NGF誘導的增殖（分別為圖7B和7C）。圖7B：TF-1細胞用對應於EC 80濃度的重組人NGF進行刺激。將細胞與配位基使用抗體的稀釋系列一起孵育48小時，然後藉由用細胞TITRE GLO®測定緩衝液（普洛麥格（Promega））培養10分鐘來量化細胞增殖。圖7C：將TF-1細胞用對應於EC 80濃度的重組鼠NGF刺激。將細胞與配位基使用抗體的稀釋系列一起孵育48小時，然後藉由用細胞TITRE GLO®測定緩衝液（普洛麥格（Promega））培養10分鐘來量化細胞增殖。該等數據表明，TNFR2-Fc_VH#4的NGF抑制部分具有生物活性並抑制NGF誘導的增殖，與作為IgG1TM的MEDI-578具有類似的效力。在TNFR2-Fc_varB和另一種TNF-NGF多特異性結合分子ndimab var B中也觀察到了類似的數據（圖7D和圖7E）。ndimab varB包含完整的抗TNFα抗體，即，包含處於H 2L 2形式的兩條完整重鏈和兩條完整輕鏈的抗體，其中MEDI-578 scFv融合到抗TNFα抗體重鏈的C-末端。ndimab varB的輕鏈在SEQ ID NO: 20中描述，並且ndimab varB的重鏈在SEQ ID NO: 22中描述。 實例5 - TNFα誘導的U937細胞凋亡的抑制
將U937細胞（ECACC目錄號85011440）以8 x 10 5個細胞/孔的濃度接種在黑色壁96孔組織培養板（康寧科斯塔公司（Corning Costar））中的50 µl培養基中。U937細胞用對應於EC 80濃度的重組人TNFα刺激。將細胞與配位基使用抗體的稀釋系列一起孵育2小時，然後藉由用半胱天冬酶3測定反應緩衝液培養2小時來量化半胱天冬酶3的活性。TNFR2-Fc_VH#4、非結合雙特異性同種型對照R347 Bs3Ab和依那西普與細胞在37°C下預孵育30分鐘。然後添加50 µl重組人TNFα（R & D系統公司（R & D Systems））以獲得20 ng/ml的最終測定濃度，並且隨後在37°C下孵育2小時。孵育期後，添加50 µl的半胱天冬酶3測定反應緩衝液（0.2% w/v CHAPS、0.5% v/v Igepal CA-630、200 mM NaCl、50 mM HEPES、20 µM DEVD-R110底物（（英傑公司（Invitrogen））），並將細胞在37°C下孵育2.5小時。藉由在475 nm處激發並在512 nm處發射來測量螢光。圖8A示出了不存在TNFα拮抗劑時的半胱天冬酶活性。
使用TNFα誘導的半胱天冬酶3活性測定來確定TNFR2-Fc_VH#4在U937細胞中的功能活性。TNFR2-Fc_VH#4與依那西普一樣完全抑制了TNFα誘導的半胱天冬酶3活性（圖8B）。這清楚地說明了TNFR2-Fc_VH#4的TNFα抑制部分具有生物活性並且具有與依那西普類似的效力。對於TNFR2-Fc_varB和ndimab varB，也觀察到了類似的數據（見圖8C）。 實例6 - 體內測定
所有體內程式都按照英國內政部動物（科學程式）法案（UK Home Office Animals Act）（1986年）進行並得到當地倫理委員會的批准。整個過程使用雌性C57Bl/6小鼠（查理斯河公司（Charles River），英國）。將小鼠以每籠5/6隻為一組，在12小時光/暗週期（07:00-19:00開燈）下，飼養在單獨通風的籠（IVC）中（可自由獲取食物和水）。將飼養室和操作室維持在24°C下，並藉由常規無線電臺的方式維持恒定的背景雜音。在每次研究開始前至少5天，出於鑒定目的，所有小鼠都在麻醉（氧氣中的3%異氟醚）下接受轉調器的插入。 A. 神經性疼痛的 Seltzer 模型
使用analgysemeter（烏戈巴西萊公司（Ugo Basile））確定機械痛覺過敏（Randall LO, Selitto JJ, Arch Int Pharmacodyn Ther. [國際藥效學與治療文獻] 111: 409-19 (1957)）。對每個後爪的背側面輪流應用逐漸增加的力直至觀察到縮回反應。在這個點上停止力的應用，並記錄以克計的重量。對於同側和對側爪子，將數據表示為以克計的縮回閾值。在建立基線讀數後，將小鼠分成2組，同側/對側比率大約相等並接受手術。將小鼠用3%異氟烷麻醉。在此之後，藉由在大腿中部水平切開由鈍性分離暴露大約1 cm左側坐骨神經。然後，將手術縫合線（10/0維珍絲線（Virgin Silk），愛惜康公司（Ethicon））穿過背部第三神經並綁緊。使用黏合劑閉合切口，並在測試開始之前允許小鼠恢復至少七天。假手術小鼠經歷相同的方案，但是在神經暴露後將傷口黏合併允許其恢復。在手術後7天和10天，測試小鼠的痛覺過敏。在第10天測試後，將手術小鼠進一步細分成組，各組分別接受CAT251 IgG1同種型對照（0.03 mg/kg s.c.）、依那西普（0.01 mg/kg s.c.）、MEDI-578（0.03 mg/kg s.c.）或依那西普（0.01 mg/kg s.c.）和MEDI-578（0.03 mg/kg s.c.）的組合。假手術小鼠都接受CAT251（0.03 mg/kg s.c.）。在給藥後4小時、1、2、3、4和7天，測量機械痛覺過敏。
在機械痛覺過敏模型中共同投與依那西普和MEDI-578表現為，與假手術對照相比時，在手術後第10天同側/對側比率顯著的降低（圖9）。投與單劑量的依那西普（0.01 mg/kg s.c.）或MEDI-578（0.03 mg/kg s.c.）未能顯著地逆轉這種痛覺過敏。共同投與依那西普（0.01 mg/kg s.c.）與MEDI-578（0.03 mg/kg s.c.）顯著地逆轉了給藥後4小時的機械痛覺過敏，並且該作用維持至給藥後7天。
在第二項研究中，評估了TNFR2-Fc_VH#4之作用。在建立機械痛覺過敏後，在手術後第13天，向小鼠給藥R347 Bs3Ab同種型對照（0.03 mg/kg s.c.）、依那西普（0.01 mg/kg s.c.）、MEDI-578（0.03 mg/kg s.c.）或TNFR2-Fc_VH#4（0.01 mg/kg或0.03 mg/kg s.c.）。假準備的動物接受R347 Bs3Ab同種型對照（0.03 mg/kg s.c.）。如上所述，在給藥後4小時和給藥後第1、2、4和7天測試小鼠的機械痛覺過敏。
與假手術對照相比時，投與TNFR2-Fc_VH#4在手術後第10天產生了同側/對側比率的顯著降低（圖10A）。投與依那西普（0.01 mg/kg s.c.）或MEDI-578（0.03 mg/kg s.c.）未能顯著地逆轉該機械痛覺過敏。然而，投與TNFR2-Fc_VH#4（0.01和0.03 mg/kg s.c.）在給藥後4小時產生了機械痛覺過敏的顯著逆轉，這種作用維持到給藥後6天。投與R347對照Bs3Ab後未見作用。當投與TNFR2-Fc_varB時，觀察到了類似的數據（見圖10B）。該等數據表明TNFR2-Fc_VH#4可以在非常低的劑量下顯著逆轉疼痛，而相當的劑量的單獨的MEDI-578或依那西普已顯示出無效或最低限度有效。 B. 慢性關節疼痛模型
使用小鼠失能測試儀（林頓儀器公司（Linton Instrumentation））確定機械超敏反應。將小鼠置於儀器中，將它們的後爪放在分開的感測器上，並在4秒的時間內計算體重分佈。數據表示為以克為單位的同側和對側負重的比率。
在建立基線讀數後，將小鼠分成2組，其同側/對側比率大約相等。使用以下技術進行關節內注射：使用氧氣中的3%異氟醚將動物麻醉，並將左膝剃毛和清潔。使用安裝在100 μl的Hamilton注射器上的25號針頭，向每隻小鼠的膝關節注射10 µl的弗氏完全佐劑（FCA）（10 mg/ml）或媒介物（輕質礦物油）。注射液直接進入膝關節的滑膜空間。如上所述，使小鼠恢復並在注射後第7天和第10天重新測試機械超敏反應的變化。在第10天測試後，將FCA處理的小鼠進一步隨機分組，並在第13天，向小鼠給藥依那西普（0.01 mg/kg i.p.）或媒介物，然後該等小鼠接受一劑量的MEDI-578（0.03 mg/kg i.v.）或CAT251同種型對照（0.03 mg/kg i.v.）。如上所述，在給藥後4小時和給藥後第1、2、4和7天測試小鼠的機械超敏反應。
使用炎性疼痛的關節內FCA模型，評估共同投與依那西普和MEDI-578之作用。關節內投與FCA引起機械超敏反應，該機械超敏反應表現為，與媒介物對照相比，在第7天和第10天同側/對側比率顯著的降低（圖11）。與治療前基線水平相比，在假治療組中未觀察到同側/對側比率的降低。投與依那西普（0.01 mg/kg i.p.）+ CAT251（0.03 mg/kg i.v.）或PBS（10 ml/kg i.p.）+ MEDI-578（0.03 mg/kg i.v.）在給藥後4小時和第1、2、4和7天導致FCA誘導的機械超敏反應的輕微逆轉，但未能達到統計學顯著性。然而，投與依那西普（0.01 mg/kg i.p.）+ MEDI-578（0.03 mg/kg i.v.）在給藥後測試的所有時間都導致FCA誘導的機械超敏反應的顯著逆轉。
在第二項研究中，評估了TNFR2-Fc_VH#4之作用。在建立FCA誘導的機械超敏反應後，在FCA後第13天對小鼠給藥：R347 Bs3Ab同種型對照（0.01 mg/kg s.c.）、依那西普（0.01 mg/kg s.c.）、MEDI-578（0.01 mg/kg s.c.）或TNFR2-Fc_VH#4（0.003 mg/kg或0.01 mg/kg s.c.）。如上所述，在給藥後4小時和給藥後第1、2、4和7天，再次測試小鼠的機械超敏反應。
圖12中示出了與單獨的依那西普和MEDI-578的作用相比的TNFR2-Fc_VH#4（「雙特異性」）之作用。在給藥後的任何時間點，依那西普（0.01 mg/kg s.c.）和MEDI-578（0.01 mg/kg s.c.）均未顯著地逆轉FCA誘導的機械超敏反應。然而，投與TNFR2-Fc_VH#4導致FCA誘導的機械超敏反應的顯著逆轉。較高劑量的TNFR2-Fc_VH#4（0.01 mg/kg s.c.）在研究期間示出了顯著的活性，而較低劑量（0.003 mg/kg s.c.）在給藥後第1天達到顯著的水平並且在研究期間維持與較高劑量相似的水平。 C. 在大鼠中建立的 FCA 誘導的機械超敏反應模型
足底注射弗氏完全佐劑（FCA）引起炎性反應，該炎性反應導致超敏反應和水腫，並模擬臨床炎性疼痛的某些方面。藉由使用設備來測量負重可以研究該等作用。使用負重方法，評估TNFR2-Fc_VH#4在FCA誘導的超敏反應中的潛在的抗痛覺過敏特性。初試大鼠在兩隻後爪之間平均分配位基重。然而，當注射的（左）後爪發炎和/或疼痛時，重量被重新分配，使得受影響的爪的負重更小（受傷的爪的負重降低）。使用大鼠失能測試儀（林頓儀器公司（Linton Instruments），英國）測量了藉由每個後肢的負重。將大鼠置於失能測試儀中，將其後爪放在分開的感測器上，並在4秒的時間內記錄兩個後肢施加的平均力。
針對本研究，使初試大鼠（雄性，斯普拉格-道利大鼠（Sprague Dawley Rats）（哈倫（Harlan），英國），198-258 g）適應它們生活的籠中的操作室，可自由獲取食物和水。在幾天的時間裡，對失能測試儀進行了熟悉。在誘導損傷之前，進行基線負重記錄。藉由足底注射FCA（可從西格瑪公司（Sigma）獲得，100 μl的1 mg/ml溶液）到左後爪來誘導炎性超敏反應。在FCA後23小時，進行治療前負重測量以評估超敏反應。
然後將動物進行排序並且根據拉丁方設計中的負重FCA窗口隨機分配到治療組。在FCA注射後24小時，將動物用以下來治療：TNFR2-Fc_VH#4（「雙特異性」）（i.v.給予，0.003、0.01、0.03、0.3和3 mg/kg），陰性對照抗體NIP228（針對結合半抗原硝基苯酚產生的抗體）（i.v.給予，3 mg/kg），媒介物（1%甲基纖維素）（p.o.給予，2 ml/kg）或吲哚美辛（10 mg/kg，p.o.給予）。
在抗體/藥物治療後4和24小時，評估負重。在每個時間點上藉由將治療組與媒介物對照組進行比較來分析數據。統計分析包括重複量度ANOVA，隨後使用InVivoStat（invivostat.co.uk）進行計畫比較測試，（p ＜ 0.05認為係顯著的）。結果示出於圖13中。使用吲哚美辛（10 mg/kg）在4小時和24小時觀察到了超敏反應的顯著逆轉。以0.3和3 mg/kg給藥的TNFR2-Fc_VH#4在4小時和24小時均示出了超敏反應的顯著逆轉，以0.003和0.03 mg/kg給藥的TNFR2-Fc_VH#4也示出了超敏反應的顯著逆轉，但僅在24小時處係如此。同種型對照NIP228在任何時間點對FCA反應都沒有顯著之作用。 實例7 - 藉由TNFα和NGF進行的p38磷酸化
文獻表明，p38磷酸化在神經性疼痛的發展中起著重要作用。例如，p38抑制劑治療已示出可以預防保留神經損傷模型（Wen YR等人, Anesthesiology [麻醉學] 2007, 107: 312-321）和坐骨炎性神經病模型（Milligan ED等人, J Neurosci [神經科學雜誌] 2003, 23: 1026-1040）中神經性疼痛症狀的發展。在本實驗中，在細胞培養測定中研究了TNFα、NGF以及TNFα和NGF的組合對p38磷酸化之作用。簡言之，將Neuroscreen-1細胞（PC-12大鼠神經內分泌細胞的亞選殖）與增加量的TNFα、NGF或TNFα和NGF的組合一起孵育。在20分鐘的孵育期後，使用均相時間分辨螢光（HTRF）測定（Cisbio公司（Cisbio））對磷酸化-p38進行量化。
HTRF 測定：在用TNFα、NGF或TNFα和NGF的組合刺激後，快速除去細胞上清液並在裂解緩衝液中裂解細胞。使用兩種不同的特異性抗體（與銪穴狀化合物（供體螢光團）軛合的抗磷酸化-p38抗體和與d2（受體螢光團）軛合的抗p38（總）抗體），以夾心測定形式，在裂解物中檢測磷酸化-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）。抗體與細胞裂解物一起孵育，並且根據在665 nm和620 nm處的螢光測量（使用EnVision多標記板讀取器（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer）進行）計算HTRF比率。
數據表示為HTRF比率，該比率計算為665 nm處的發射與620 nm處的發射之間的比率。圖14示出了熱圖，該熱圖示出了來自磷酸化-p38反應的HTRF比率。圖15示出了劑量反應曲線，該劑量反應曲線示出TNFα、NGF或TNFα和NGF的組合之作用。如從圖15可以看出，較高濃度的TNFα和NGF對磷酸化-p38的組合作用大於由任一因子單獨誘導的磷酸化-p38信號的預測總和。該等數據表明，TNFα和NGF可能共同作用以誘導p38磷酸化，並且這兩種途徑可能與導致疼痛的分子信號傳導有關。 實例8 - 藉由TNFα和NGF進行的ERK磷酸化
和p38一樣，在神經性疼痛的發展期間，ERK也被活化（Zhuang ZY等人, Pain [疼痛] 2005, 114: 149-159）。在本實驗中，在細胞培養測定中研究了TNFα、NGF以及TNFα和NGF的組合對ERK磷酸化之作用。簡言之，將Neuroscreen-1細胞（PC-12大鼠神經內分泌細胞的亞選殖）與增加量的TNFα、NGF或TNFα和NGF的組合一起孵育。在20分鐘的孵育期後，使用HTRF測定（Cisbio公司（Cisbio））對磷酸化-ERK進行量化。
HTRF 測定：刺激後，將細胞上清液迅速除去並且將細胞在裂解緩衝液中裂解。使用兩種不同的特異性抗體（與銪穴狀化合物（供體螢光團）軛合的抗磷酸化-ERK抗體和與d2（受體螢光團）軛合的抗ERK（總）抗體），以夾心測定形式，在裂解物中檢測磷酸化-ERK MAPK（Thr202/Tyr204）。抗體與細胞裂解物一起孵育，並且根據在665 nm和620 nm處的螢光測量（使用EnVision多標記板讀取器（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer）進行）計算HTRF比率。
數據表示為HTRF比率，該比率計算為665 nm處的發射與620 nm處的發射之間的比率。圖16示出了熱圖，該熱圖示出了來自磷酸化-ERK反應的HTRF比率。圖17示出了劑量反應曲線，該劑量反應曲線示出TNFα、NGF或TNFα和NGF的組合之作用。如從圖17中可以看出，低量的單獨的TNFα不會誘導磷酸化-ERK，但是更高的量增強了NGF誘導的磷酸化-ERK。該等數據表明，TNFα和NGF可能共同作用以誘導p38磷酸化，並且這兩種途徑可能與導致疼痛的分子信號傳導有關。 實例9 - 不同劑量的TNFR2-Fc_varB在患有膝關節的疼痛性骨關節炎的人中的作用
針對18至80歲的患有膝關節的疼痛性骨關節炎的受試者，設計了一項多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的、單次遞增劑量（SAD）和多次遞增劑量（MAD）交錯的研究。SAD佇列1包括三名接受TNFR2-Fc_varB的患者和2名接受安慰劑的患者。SAD佇列2-7各包括8名患者，每個佇列中有六名患者接受TNFR2-Fc_varB並且每個佇列中有2名患者接受安慰劑。MAD佇列8和9各包括18名患者，每個佇列中有12名患者接受TNFR2-Fc_varB並且每個佇列中有6名患者接受安慰劑。MAD佇列10和11各包括12名患者，每個佇列中有9名患者接受TNFR2-Fc_varB並且每個佇列中有3名患者接受安慰劑。圖18A和圖18B中提供了研究設計的簡化佈局。
SAD佇列中的受試者以雙盲方式接受TNFR2-Fc_varB或安慰劑的單次輸注。出院後，受試者被指示在每天早上的大約同一時間在11分NRS（0-10）上記錄疼痛，以反映24小時的回憶，直到跟蹤期結束。
令人驚訝的是，相比於安慰劑，劑量範圍為2至1000 µg/kg的單次靜脈內劑量的TNFR2-Fc_varB似乎使每日平均疼痛得分（在峰值作用處）逆轉了0.69至3.45分（圖19A-圖19B）。在50、250和1000 µg/kg的劑量下，這種作用係統計學顯著的（p ≤ 0.01）。與TNFR2-Fc_varB的半衰期（3-4天）相比，這種作用的持續時間令人驚訝地持續了10天以上。那些接受安慰劑的受試者的疼痛得分的降低似乎係大約0.5分。這種安慰劑作用相對較低並且似乎係穩定的。
西安大略大學和麥克馬斯特大學骨關節炎指數（WOMAC）係一種基於問卷的工具，用於測量患有OA的受試者因慢性疼痛而導致的功能障礙。令人驚訝的是，以0.3至1000 µg/kg的劑量範圍單次投與TNFR2-Fc_varB，在10+天的時間段內，使平均WOMAC疼痛分量表得分顯著降低了多達約3分（圖20A-圖20B）。在50、250和1000 µg/kg的劑量下，疼痛分量表得分的峰值逆轉範圍為2.0-2.9，並且是統計學顯著的，p值為0.06或更小。如與疼痛NRS終點一樣，單次給藥後作用持續時間（約10+天）比對半衰期為3-4天的分子所預期的更長。峰值作用對應於分別在50和250 µg/kg的劑量下測量的游離NGF的46%-55%的抑制（圖21）。
使用Singulex公司的Erenna測定來確定TNFR2-Fc_varB對外周中的游離NGF水平之作用。簡言之，在給藥前，給藥後1、8和24小時，第8、15、22、29天（第43天和第56天僅針對兩個最高劑量）的時間點，從每個受試者採集血樣。按照以下步驟製備和測定血漿樣本：(1) 將樣本與抗NGF mAb包被的磁珠混合，(2) 將捕獲的NGF磁珠複合物與螢光標記的抗人NGF抗體混合，(3) 將珠複合物洗脫以釋放螢光標記，(4) 在Erenna螢光讀取器中讀取螢光信號。計算了游離NGF的抑制，並且對在TNFR2-Fc_varB的每個濃度下給藥後14天的時間內的平均抑制進行計算並作圖（圖22）。在14天內的游離NGF的平均抑制的範圍為0（0.3 µg/kg）至約65%（1000 µg/kg）。
使用由Q2 Solutions公司開發的LC-MS/MS測定來確定TNFR2-Fc_varB對外周中的總NGF水平之作用。簡言之，在給藥前，給藥後1、8和24小時，第8、15、22、29天（第43天和第56天僅針對兩個最高劑量）的時間點，從每個受試者採集血樣。以在Neubert等人, 2013, Anal. Chem. [分析化學], 85: 1719-1726中描述的類似方式製備和測定血清樣本。對SAD佇列1-4（0.3-50 µg/kg）中每個受試者的總NGF水平的增加進行計算並作圖，並計算了佇列1-7中的每一個佇列的平均總NGF水平。在增加劑量的TNFR2-Fc_varB單次投與後，觀察到了總NGF水平的明顯增加（圖23；表2）。不希望受理論束縛，該增加可能是由於NGF的半衰期與它當前結合的TNFR2-Fc_varB的半衰期同步增加。 [ 表 2] ：用TNFR2-Fc_varB治療後，外周中的總NGF的平均水平
佇列 N RoA 劑量（ μg/kg ） 觀察到的平均 %NGF 抑制 平均總 NGF （ pg/mL ）
1 3 IV 0.3 3 65.2
2 6 IV 2 27 98.1
3 6 IV 10 29 228.0
4 6 IV 50 35 334.0
5 6 IV 250 59 539.0
6 6 IV 1000 68 199.0*
7 6 SC 50 37 206.0
*只有1名受試者的數據可用。RoA投與途徑，IV = 靜脈內，SC = 皮下
應該注意的是，對於每個佇列中的兩名受試者，總NGF沒有明顯增加。由於該研究在本申請提交時仍處於盲態，因此預測該等係安慰劑樣本。對於佇列3和4，觀察到了抗藥物抗體對總NGF水平的明顯作用。這種作用可能是由於TNFR2-Fc_varB暴露的減少和作用持續時間的相應縮短所致。
作為測量TNFα水平的代替物，可以使用Simoa平臺技術測量CXCL-13水平。CXCL-13基因表現受淋巴毒素α途徑調控。TNFR2-Fc_varB結合TNFα和淋巴毒素α，並且因此假設對CXCL-13表現水平有作用。在給藥前，給藥後1、8和24小時，第8、15、22、29天（第43天和第56天僅針對兩個最高劑量）的時間點，從每個受試者採集血樣。製備血清樣本並且然後在Simoa CXCL-13測定中進行測定。在投與增加的單劑量TNFR2-Fc_varB後，觀察到了明顯的劑量反應，觀察到增加的CXCL-13水平抑制（圖24）。
在單次遞增劑量後，以不同時間間隔測定靜脈內投與的TNFR2-Fc_varB的血清水平。觀察到的TNFR2-Fc_varB的血清藥物動力學說明，所有佇列都有暴露，並且暴露平均地以劑量依賴性方式增加（圖25）。圖25示出皮下投與提供了超過10天的相對穩定的TNFR2-Fc_varB血清水平。
如表3所示，藉由比較TNFR2-Fc_varB的50 μg/kg單劑量皮下投與相比於50 μg/kg靜脈內投與的曲線下面積（AUC）的幾何平均值（n = 6），計算經由皮下投與的絕對生體可用率。發現皮下投與TNFR2-Fc_varB的生體可用率令人驚訝地低並且估計為21%。如表3a所示，估計的絕對生體可用率值的90%置信區間為0.1627至0.2781。 [ 表 3] ：TNFR2-Fc_varB靜脈內和皮下投與的藥物動力學初步分析
參數（單位） 統計資訊 TNFR2-Fc_varB 劑量（途徑）
50 µg/kg （ iv ） 50 µg/kg （ sc ）
C max（ng/mL） N 6 6
幾何平均值 1082 78.53
CV（%） 14.04 32.1
t max（天） N 6 6
中值 0.04 7.07
最小，最大 0.04，0.04 7.01，8.09
t 最終（天） N 6 6
   中值 10.473 17.622
   最小，最大 6.95，27.90 14.01，29.10
AUC 最終（天.ng/mL） N 6 6
幾何平均值 3766 801
CV（%） 26.87 25.16
AUC 0-∞（天.ng/mL） N 6 1
幾何平均值 4267 NC
CV（%） 17.89 NC
t 1/2（天） N 6 1
算術平均值 3.304 NC
SD 0.5104 NC
V ss（L） a N 6 1
算術平均值 4.473 NC
SD 0.3705 NC
CL（L/天） a N 6 1
算術平均值 0.9649 NC
SD 0.1582 NC
如果N ＜ 3，則不計算匯總統計資訊。 AUC 0-∞從零到無窮大的濃度時間曲線下面積；AUC 最終從零到最後一個可量化時間點的濃度-時間曲線下面積；CL清除率；C max最大觀察濃度；CV變異係數（幾何）；iv靜脈內；Max最大值；min最小值；N受試者數；sc皮下；NC不可計算；SD標準差；t 1/2半衰期；t 最終最後觀察到的可量化濃度的時間；t max到C max的時間；V ss穩態分佈容積。 [ 表 3a] ：經由皮下投與的TNFR2-Fc_varB的絕對生體可用率分析
參數（單位） 投與的劑量和途徑 n 幾何 LS 平均值 SC 和 IV 投與的比較（幾何 LS 平均值的比率）
比率（ SC : IV ） 90% CI
C max（ng/mL） 50 μg/kg SC 6 78.53 0.0725 0.0563，0.0935
50 μg/kg IV 6 1082.47
AUC 最終（天.ng/mL） 50 μg/kg SC 6 801.17 0.2127 0.1627，0.2781
50 μg/kg IV 6 3766.28
AUC 最終從零到最後一個可量化時間點的濃度-時間曲線下面積；C max最大觀察濃度；IV靜脈內；LS最小二乘；n分析中包括的受試者數；PK藥物動力學；SC皮下。
MAD佇列中的受試者每2週一次以雙盲方式接受範圍為1至450 μg/kg的TNFR2-Fc_varB重複靜脈內輸注（總共4次劑量）或安慰劑。觀察到的TNFR2-Fc_varB的血清藥物動力學說明，所有佇列都有暴露，並且暴露平均地以劑量依賴性方式增加（圖26）。暴露-反應分析表明，在150-450 μg/kg靜脈內劑量範圍內達到了最大疼痛減輕功效（圖27；表4）。 [ 表 4] ：用TNFR2-Fc_varB治療的受試者的NGF和疼痛反應
佇列 N RoA 劑量（ μg/kg ） 觀察到的平均 %NGF 抑制 在第 8 週時的 WOMAC （ CFB ） 在第 8 週時的 WOMAC （ CFP ）
8 12 IV 1 16 0.2 1.3
9 11 IV 5 18 -0.8 0.4
10 9 IV 50 33 -1.4 -0.3
11 11 IV 150 37 -2.4 -1.2
12 7 IV 450 47 -2.3 -1.1
RoA投與途徑；相對於基線的變化（CFB）；相對於安慰劑的變化（CFP）。
出院後，受試者被指示在每天早上的大約同一時間在11分NRS（0-10）上記錄疼痛，以反映24小時的回憶，直到跟蹤期結束。與安慰劑治療的對照相比，重複注射150 μg/kg TNFR2-Fc_varB或450 μg/kg TNFR2-Fc_varB使疼痛明顯減輕（圖28A）。相比於40 mg劑量的類鴉片羥考酮、2.5 mg劑量的抗NGF抗體他尼珠單抗或5 mg他尼珠單抗，這兩種劑量也導致疼痛的更大程度的減輕（圖28B）並且相比於法希奴單抗、福拉奴單抗或他尼珠單抗所實現的疼痛減輕的最大值，這兩種劑量在減輕疼痛方面更有效（圖28C）。
藉由免疫原性評估測量了抗藥抗體（ADA）水平（Food and Drug Administration [美國食品藥品管理局]. Guidance for industry [行業指南]. Immunogenicity assessment for therapeutic protein products [治療性蛋白質產品的免疫原性評估]. 2014年8月. 可獲得自：http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm338856.pdf. 2018年7月27日訪問）。總體而言，接受重複劑量的TNFR2-Fc_varB的受試者的ADA檢出率為70%（50名受試者中的35名）。ADA檢出率定義為在任何時間（基線和/或基線後）ADA陽性受試者的比例。TNFR2-Fc_varB劑量水平與ADA檢出率之間沒有明顯關係，儘管一小部分患者具有高ADA滴定度，如下表5所示。為了確定高ADA滴定度是否影響對TNFR2-Fc_varB的暴露和功效，在用150 μg/kg TNFR2-Fc_varB治療的個體受試者中測量了對TNFR2-Fc_varB的暴露、ADA滴定度和疼痛減輕。令人驚訝的是，儘管ADA滴定度高，還是觀察到了顯著的對TNFR2-Fc_varB的暴露並且疼痛減輕功效維持 ＞ 50天（圖29）。另外，在具有較低ADA滴定度的受試者中，TNFR2-Fc-varB的半衰期更長，並且用450 μg/kg TNFR2-Fc_varB治療的患者中沒有一個具有高ADA滴定度（圖30）。重要的是，ADA與不良事件之間沒有關聯。 [ 表 5] ：初步分析後劑量組間ADA的檢出率。
劑量 %ADA+ （治療的受試者） 最大滴定度 （最小 - 中位數 - 最大） ＜ 1000 1000-10,000 ＞ 10,000
1 μg/kg iv 41.7%（5/12） 120-960-3840 3 （60%） 2 （40%） 0 （0%）
5 μg/kg iv 72.7%（8/11） 120-1920-15360 3（37.5%） 4 （50%） 1 （12.5%）
50 μg/kg iv 88.9%（8/9） 480-3840-61440 2 （25%） 5 （62.5%） 1 （12.5%）
150 μg/kg iv 81.8%（9/11） 60-1920-30720 2（22.2%） 5 （55.6%） 2 （22.2%）
450 μg/kg iv 71.4%（5/7） 30-480-1920 4 （80%） 1 （20%） 0 （0%）
總計 70.0%（35/50） 30-1920-61440 14 （40%） 17 （48.6%） 4 （11.4%）
令人驚訝的是，使用來自試驗的MAD階段的數據，諸位發明人還發現體重不是暴露的臨床顯著協變數（p = 0.61；圖31）。 實例10 - 固定皮下劑量的TNFR2-Fc_varB在患有膝關節的疼痛性骨關節炎的人中的作用
基於體重不是暴露於TNFR2-Fc_varB的臨床顯著協變數的發現，諸位發明人假設TNFR2-Fc_varB的固定給藥策略對治療人類疼痛有效。因此，針對18至80歲的患有膝關節的疼痛性骨關節炎的受試者設計了一項多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的臨床試驗。大約300名符合條件的受試者將被隨機分配到TNFR2-Fc_varB治療組或安慰劑組，以確保大約255名受試者完成治療期。受試者將在12週期間內每2週一次（Q2W）接受TNFR2-Fc_varB的4個固定皮下劑量（7.5 mg、25 mg、75 mg和150 mg）中的一個或安慰劑。預測該等固定皮下劑量的TNFR2-Fc_varB提供分別與靜脈內劑量15、50、150和300 μg/kg的TNFR2-Fc_varB類似的作用，並根據對皮下投與TNFR2-Fc_varB觀察到的生體可用率和OA患者的體重分佈進行計算。在治療期中，每位受試者總共將接受6次劑量的TNFR2-Fc_varB或安慰劑。圖32中提供了研究設計的簡化佈局。
在開始治療前14天開始，將指導受試者在每天早上的大約同一時間在11分NRS（0-10）上記錄疼痛，以反映24小時的回憶，直到最後一次投與TNFR2-Fc_varB或安慰劑後至少6週。
將指導受試者在特定時間點完成WOMAC問卷，從治療開始前開始，並且在最後一次投與TNFR2-Fc_varB或安慰劑後至少6週時結束。
將指導受試者在特定時間點完成患者整體評估（PGA），從治療開始前開始，並且在最後一次投與TNFR2-Fc_varB或安慰劑後至少6週時結束。PGA係一種用於評估由於膝關節的OA引起的症狀和活動障礙的5分李克特量表。要求患者基於如下問題「考慮到膝關節的OA對您的所有影響，您今天感覺怎麼樣？」，在從1 = 非常好（無症狀並且正常活動不受限制）到5 = 非常差（難以忍受的非常嚴重的症狀並且不能進行所有正常活動）之間確定一個數字。
可以測量TNFR2-Fc_varB對外周中的游離NGF水平之作用。例如，可以在投與後1天開始每週一次測量外週中的游離NGF，直至第12週，並且然後在第18週和第28週再次測量。
可以測量TNFR2-Fc_varB對外周中的總NGF水平之作用。例如，可以在投與後1天開始每週一次測量外週中的總NGF直至第12週，並且然後在第18週和第28週再次測量。
作為測量TNFα水平的代替物，可以測量CXCL-13水平。例如，可以在投與後1天開始每週一次測量CXCL-13水平直至第12週，並且然後在第18週和第28週再次測量。 序列表 SEQ ID NO: 1 NP_002497.2|β-神經生長因子響應[智人]
Figure 02_image003
SEQ ID NO: 2 NP_000585.2|腫瘤壞死因子[智人]
Figure 02_image005
SEQ ID NO: 3 MEDI-578 VH（1256A5 VH）
Figure 02_image007
SEQ ID NO: 4 MEDI-578 VHCDR1 1 TYGIS SEQ ID NO: 5 MEDI-578 VHCDR2 1 GIIPIFDTGN SAQSFQG SEQ ID NO: 6 MEDI-578 VHCDR3 1 SSRIYDLNPS LTAYYDMDV SEQ ID NO: 7 MEDI-578 VL（1256A5 VL）
Figure 02_image009
SEQ ID NO: 8 MEDI-578 VLCDR1 1 SGSSSNIGNN YVS SEQ ID NO: 9 MEDI-578 VLCDR2 1 DNNKRPS SEQ ID NO: 10 MEDI-578 VLCDR3 1 GTWDSSLSAW V SEQ ID NO: 11 1 SSRIYDFNSA LISYYDMDV SEQ ID NO: 12 1 SSRIYDMISS LQPYYDMDV SEQ ID NO: 13可溶性TNFR2胺基酸序列
Figure 02_image011
Figure 02_image013
SEQ ID NO: 14 TNFR2-Fc_VH#4 - 胺基酸序列
Figure 02_image015
SEQ ID NO: 15 (Gly 4Ser) 315aa連接子序列 1 GGGGSGGGGS GGGGS SEQ ID NO: 16 TNFR2-Fc_VH#4 - 核苷酸序列
Figure 02_image017
Figure 02_image019
SEQ ID NO: 17 - TNFR2-Fc_varB - 胺基酸序列
Figure 02_image021
SEQ ID NO: 18 - TNFR2-Fc_varB - 核苷酸序列
Figure 02_image023
SEQ ID NO: 19 - (Gly 4Ser) 420aa連接子序列 1 GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 20 - ndimab varB - L鏈胺基酸序列
Figure 02_image025
SEQ ID NO: 21 - ndimab varB - L鏈核苷酸序列
Figure 02_image027
SEQ ID NO: 22 - ndimab varB - H鏈胺基酸序列
Figure 02_image029
SEQ ID NO: 23 - ndimab varB - H鏈核苷酸序列
Figure 02_image031
Figure 02_image033
SEQ ID NO: 24 - NGF-NG VH胺基酸序列
Figure 02_image035
SEQ ID NO: 25 - NGF-NG VH核苷酸序列
Figure 02_image037
SEQ ID NO: 26 - NGF-NG VL胺基酸序列
Figure 02_image039
SEQ ID NO: 27 - NGF-NG VL核苷酸序列
Figure 02_image041
SEQ ID NO: 28 - ndimab VH胺基酸序列
Figure 02_image043
SEQ ID NO: 29 - ndimab VL胺基酸序列
Figure 02_image045
SEQ ID NO: 30 - 1126F1 VH胺基酸序列
Figure 02_image047
SEQ ID NO: 31 - 1126F1 VL胺基酸序列
Figure 02_image049
SEQ ID NO: 32 - 1126G5 VH胺基酸序列
Figure 02_image051
SEQ ID NO: 33 - 1126G5 VL胺基酸序列
Figure 02_image053
SEQ ID NO: 34 - 1126H5 VH胺基酸序列
Figure 02_image055
SEQ ID NO: 35 - 1126H5 VL胺基酸序列
Figure 02_image057
SEQ ID NO: 36 - 1127D9 VH胺基酸序列
Figure 02_image059
SEQ ID NO: 37 - 1127D9 VL胺基酸序列
Figure 02_image061
SEQ ID NO: 38 - 1127F9 VH胺基酸序列
Figure 02_image063
SEQ ID NO: 39 - 1127F9 VL胺基酸序列
Figure 02_image065
SEQ ID NO: 40 - 1131D7 VH胺基酸序列
Figure 02_image067
SEQ ID NO: 41 - 1131D7 VL胺基酸序列
Figure 02_image069
SEQ ID NO: 42 - 1131H2 VH胺基酸序列
Figure 02_image071
SEQ ID NO: 43 - 1131H2 VL胺基酸序列
Figure 02_image073
SEQ ID NO: 44 - 132A9 VH 胺基酸序列
Figure 02_image075
SEQ ID NO: 45 - 132A9 VL胺基酸序列
Figure 02_image077
SEQ ID NO: 46 - 1132H9 VH胺基酸序列
Figure 02_image079
SEQ ID NO: 47 - 1132H9 VL胺基酸序列
Figure 02_image081
SEQ ID NO: 48 - 1133C11 VH胺基酸序列
Figure 02_image083
SEQ ID NO: 49 - 1133C11 VL胺基酸序列
Figure 02_image085
SEQ ID NO: 50 - 1134D9 VH胺基酸序列
Figure 02_image087
SEQ ID NO: 51 - 1134D9 VL胺基酸序列
Figure 02_image089
SEQ ID NO: 52 - 1145D1 VH胺基酸序列
Figure 02_image091
SEQ ID NO: 53 - 1145D1 VL胺基酸序列
Figure 02_image093
SEQ ID NO: 54 - 1146D7 VH胺基酸序列
Figure 02_image095
SEQ ID NO: 55 - 1146D7 VL胺基酸序列
Figure 02_image097
SEQ ID NO: 56 - 1147D2 VH胺基酸序列
Figure 02_image099
SEQ ID NO: 57 - 1147D2 VL胺基酸序列
Figure 02_image101
SEQ ID NO: 58 - 1147G9 VH胺基酸序列
Figure 02_image103
SEQ ID NO: 59 - 1147G9 VL胺基酸序列
Figure 02_image105
SEQ ID NO: 60 - 1150F1 VH胺基酸序列
Figure 02_image107
SEQ ID NO: 61 - 1150F1 VL胺基酸序列
Figure 02_image109
SEQ ID NO: 62 - 1152H5 VH胺基酸序列
Figure 02_image111
SEQ ID NO: 63 - 1152H5 VL胺基酸序列
Figure 02_image113
SEQ ID NO: 64 - 1155H1 VH胺基酸序列
Figure 02_image115
SEQ ID NO: 65 - 1155H1 VL胺基酸序列
Figure 02_image117
SEQ ID NO: 66 - 1158A1 VH胺基酸序列
Figure 02_image119
SEQ ID NO: 67 - 1158A1 VL胺基酸序列
Figure 02_image121
SEQ ID NO: 68 - 1160E3 VH胺基酸序列
Figure 02_image123
SEQ ID NO: 69 - 1160E3 VL胺基酸序列
Figure 02_image125
SEQ ID NO: 70 - 1165D4 VH胺基酸序列
Figure 02_image127
SEQ ID NO: 71 - 1165D4 VL胺基酸序列
Figure 02_image129
SEQ ID NO: 72 - 1175H8 VH胺基酸序列
Figure 02_image131
SEQ ID NO: 73 - 1175H8 VL胺基酸序列
Figure 02_image133
SEQ ID NO: 74 - 1211G10 VH胺基酸序列
Figure 02_image135
SEQ ID NO: 75 - 1211G10 VL胺基酸序列
Figure 02_image137
SEQ ID NO: 76 - 1214A1 VH胺基酸序列
Figure 02_image139
SEQ ID NO: 77 - 1214A1 VL胺基酸序列
Figure 02_image141
SEQ ID NO: 78 - 1214D10 VH胺基酸序列
Figure 02_image143
SEQ ID NO: 79 - 1214D10 VL胺基酸序列
Figure 02_image145
SEQ ID NO: 80 - 1218H5 VH胺基酸序列
Figure 02_image147
SEQ ID NO: 81 - 1218H5 VL胺基酸序列
Figure 02_image149
SEQ ID NO: 82 - 1230H7 VH胺基酸序列
Figure 02_image151
SEQ ID NO: 83 - 1230H7 VL胺基酸序列
Figure 02_image153
SEQ ID NO: 84 - 1083H4 VH胺基酸序列
Figure 02_image155
SEQ ID NO: 85 - 1083H4 VL胺基酸序列
Figure 02_image157
SEQ ID NO: 86 - 1227H8 VH胺基酸序列
Figure 02_image159
SEQ ID NO: 87 - 1227H8 VL胺基酸序列
Figure 02_image161
SEQ ID NO: 88 - NGF-NG HCDR1 FGAFT SEQ ID NO: 89 - NGF-NG HCDR2 GIIPIFGLTNLAQNFQG SEQ ID NO: 90 - NGF-NG HCDR3 SSRIYDLNPSLTAYYDMDV SEQ ID NO: 91 - NGF-NG LCDR1 SGSSSDIGNNYVS SEQ ID NO: 92 - NGF-NG LCDR2 DNNKRPS SEQ ID NO: 93 - NGF-NG LCDR3 GTWDSSLSAWV SEQ ID NO: 94 - 具有G-＞C的MEDI-578 VH胺基酸序列
Figure 02_image163
SEQ ID NO: 95 - 具有G-＞C的MEDI-578 VL胺基酸序列
Figure 02_image165
SEQ ID NO: 96 - 1230D8 VH胺基酸序列
Figure 02_image167
SEQ ID NO: 97 - 1230D8 VL胺基酸序列
Figure 02_image169
SEQ ID NO: 98 GGGGSGGGGS SEQ ID NO: 99 - TNFR2-Fc_varB - 經密碼子優化的核苷酸序列
Figure 02_image171
Figure 02_image173
***
本揭露範圍不受所描述的具體方面之限制，該等方面旨在作為本揭露之單獨方面之簡單說明，並且在功能上等效的任何組成物或方法均處於本揭露之範圍內。事實上，除了本文示出和描述的那些修改以外，本揭露之各種修改藉由前述說明書和附圖對於熟悉該項技術者來說將變得清楚。此類修改旨在落入所附申請專利範圍之範圍內。
本說明書中所提及的所有公開和專利申請均藉由引用併入本文，達到如同每一個單獨的公開或專利申請被專門地並且單獨地指示藉由引用併入的相同之程度。
無
[圖1]：TNFR2-Fc融合蛋白（小圖A）、和包含與抗NGF scFv結構域融合的TNFR2-Fc結構域的示例性多特異性結合分子TNFR2-Fc_VH#4（小圖B）之示意圖。
[圖2A]示出了在一批純化的TNFR2-Fc_VH#4中的聚集體、單體和蛋白質片段化水平之SEC-HPLC分析結果。
[圖2B]示出了在還原和非還原條件下純化的TNFR2-Fc_VH#4和純化的TNFR2-Fc蛋白之SDS-PAGE分析。凝膠載入順序：1. TNFR2-Fc_VH#4，2. TNFR2-Fc_VL-VH（TNFR2-Fc以相反的可變結構域基因取向融合至抗NGF scFv），3. TNFR2-Fc不相關scFv 1，4. TNFR2-Fc，5. TNFR2-Fc不相關scFv 2。
[圖3A]示出蛋白A柱純化後TNFR2-Fc_VH#4之純度。圖3B示出了在SP瓊脂糖凝膠柱上進行第二次純化步驟後TNFR2-Fc_VH#4之純度。
[圖4]示出了使用差示掃描量熱法對TNFR2-Fc_VH#4進行之穩定性分析。
[圖5]示出了TNFR2-Fc_VH#4與TNFα和NGF（單獨地或一起）結合，如藉由ELISA所確定的。圖5A示出了與NGF的結合，圖5B示出了與TNFα的結合，並且圖5C示出了與TNFα和NGF的同時結合。
[圖6]示出了TNFR2-Fc_VH#4的表面電漿共振結合測定之傳感圖。使用BIAcore 2000進行了TNFR2-Fc_VH#4多特異性抗體的並行抗原結合。藉由在結合到感測器表面的TNFR2-Fc_VH#4上連續結合TNFα和NGF來評估同時抗原結合。傳感圖的第一部分示出了飽和量的TNFα與多特異性抗體的結合，傳感圖的第二部分示出了當應用第二抗原時的結合，該第二抗原要麼係示出表面已飽和的TNFα，要麼係TNFα和NGF的等莫耳混合物。共振單位的增加等同於NGF與多特異性分子的結合，並且因此意味著同時抗原參與。還以相反的順序添加抗原進行了測定，從而證實了該等數據。
[圖7]示出了對NGF介導的TF-1細胞增殖之抑制。A. 在不添加NGF拮抗劑的情況下NGF介導的增殖。B. TNFR2-Fc_VH#4對人NGF反應的抑制。C. TNFR2-Fc_VH#4對鼠NGF反應的抑制。NGF活性通常表示為RLU -相對螢光單位，並且使用以下公式，將NGF介導的增殖%計算為對單獨的NGF配位基的反應%：100 * (孔RLU - 背景RLU)/(總RLU - 背景RLU)，其中背景RLU = 培養基對照的平均值，並且總RLU = 僅有配位基的對照的平均值。D. TNFR2-Fc_VarB和ndimab VarB對人NGF反應的抑制。E. TNFR2-Fc_VarB和ndimab VarB對鼠NGF反應的抑制。
[圖8]示出了對U937細胞中TNFα誘導的半胱天冬酶3活性之抑制。A. 在不添加TNFα拮抗劑的情況下，在U937細胞中TNFα誘導的半胱天冬酶3活性。B. U937細胞中TNFα誘導的半胱天冬酶3活性的抑制，示出為在不添加拮抗劑的情況下的反應百分比。TNF活性通常表示為RFU -相對螢光單位，並且使用圖7C中的上述公式將TNF介導的半胱天冬酶3釋放%計算為對單獨的TNF配位基的反應%。C. 相關分子TNFR2-Fc_varB和ndimab VarB示出了類似的結果。
[圖9]示出了依那西普和MEDI-578組合治療對部分坐骨神經結紮誘導的機械性痛覺過敏之作用。結果示出為同側/對側比率。N = 9-10隻/組。使用雙向ANOVA分析來分析數據，其中時間和治療作為依賴性因素。採用邦弗倫尼事後檢驗法（Bonferroni’s Post Hoc test）獲得後續的統計學顯著性。與Op + CAT-251對照相比，***p ＜ 0.001。
[圖10A]示出了TNFR2-Fc_VH#4對部分坐骨神經結紮誘導的機械性痛覺過敏之作用。結果示出為同側/對側比率。N = 10隻/組。使用雙向ANOVA分析來分析數據，其中時間和治療作為依賴性因素。採用邦弗倫尼事後檢驗法（Bonferroni’s Post Hoc test）獲得後續的統計學顯著性。相比於雙特異性同種型對照，***p ＜ 0.001。圖10B示出了相關分子TNFR2-Fc_varB的類似結果。
[圖11]示出了MEDI-578和依那西普的共同投與對機械性超敏反應的關節疼痛模型中的疼痛減輕之作用。N = 9-10隻/組。使用雙向ANOVA分析來分析數據。採用邦弗倫尼事後檢驗法（Bonferroni’s Post Hoc test）獲得後續的統計學顯著性。*P ＞ 0.05；相比於CAT-251，***P ＜ 0.001。
[圖12]示出了TNFR2-Fc_VH#4對機械性超敏反應的關節疼痛模型中的疼痛減輕之作用。N = 9-10隻/組。使用雙向ANOVA分析來分析數據。採用邦弗倫尼事後檢驗法（Bonferroni’s Post Hoc test）獲得後續的統計學顯著性。相比於雙特異性同種型對照，***P ＜ 0.001。
[圖13]示出五種不同劑量的TNFR2-Fc_varB對大鼠模型中CFA誘導的痛覺過敏之作用。
[圖14]：示出了來自磷酸化-p38反應的HTRF比率之熱圖。
[圖15]：示出了TNFα、NGF或TNFα和NGF的組合對p38磷酸化的作用之劑量反應曲線。
[圖16]：示出了來自磷酸化-ERK反應的HTRF比率之熱圖。
[圖17]：示出了TNFα、NGF或TNFα和NGF的組合對ERK磷酸化的作用之劑量反應曲線。
[圖18A]示出了單次遞增劑量（SAD）和多次遞增劑量（MAD）交錯研究之簡化圖解。圖18B以表格形式示出了每個佇列的研究設計。「RoA」係投與途徑，「IV」係靜脈內，「SC」係皮下。還提供了預測的平均NGF抑制百分比。
[圖19A]示出了一個圖，在該圖中將TNFR2-Fc_varB的單次靜脈內劑量對平均每日疼痛得分的作用相對於時間（給藥後天數）進行作圖。上方的水平紅線係所有受試者給藥前的平均每日疼痛得分。下方的水平紅線係所有接受安慰劑的受試者的平均每日疼痛得分。圖19B係一個表格，該表格說明在所列劑量下預測的平均NGF抑制百分比和相對於安慰劑（PBO）的峰值NRS變化。
[圖20A]係投與TNFR2-Fc_varB後基線調整的平均疼痛WOMAC之圖。受試者回答五個特異性針對疼痛的問題（行走時、爬樓梯時、夜間、靜息時和負重時）。在5分量表（0-4）上，對每個問題給出一個得分，0代表「沒有」而4代表「非常」。得分越高，進行該活動所經歷的疼痛越嚴重（或感知到的功能缺陷越大）。回答所有五個疼痛問題的受試者可以有20的最高得分，將該得分按比例縮小至10，以便能與疼痛NRS得分相比較。臨床要求受試者在基線時（給藥前1天）和第8、15、22、29天（第43和56天僅針對250和1000 µg/kg的佇列）完成問卷。圖20B係一個表格，該表格提供了SAD研究中安慰劑相比於不同的TNFR2-Fc_varB劑量的WOMAC得分的比較的p值。
[圖21]係一個表格，該表格示出了三個統計學顯著的單劑量TNFR2-Fc_varB、在給藥後2週內測得的峰值和平均值的%NGF抑制，而括弧中是預測的NGF抑制水平。對於這三種劑量中的每一種，還呈現了與安慰劑相比的峰值WOMAC疼痛分量表變化。請注意，峰值作用對應於分別在50和250 µg/kg的劑量下測量的游離NGF的46%-55%的抑制。
[圖22]示出了由於投與單劑量的TNFR2-Fc_varB而導致的血漿游離NGF的抑制。簡要地說，在以下時間點從每個受試者採集血樣：在給藥前，給藥後1、8和24小時，第8、15、22、29天（第43天和第56天僅針對兩個最高劑量）。使用Singulex公司的Erenna技術製備和測定血漿樣本。計算了游離NGF的抑制並且對在每個濃度下給藥後14天的時間內的平均抑制進行了計算。在14天內的游離NGF的平均抑制的範圍為0（0.3 µg/kg）至約65%（1000 µg/kg）。
[圖23]係一系列圖，該等圖繪製了SAD佇列1-4（0.3-50 µg/kg）中每個受試者的NGF水平之增加。
[圖24]係一個圖，該圖繪製了每個佇列的CXCL-13水平從基線相對於時間之百分比平均變化。
[圖25]示出了TNFR2-Fc_varB（表示為MEDI7352）在範圍為0.3至1000 µg/kg的單次靜脈內劑量和50 μg/kg的單次皮下劑量下的幾何平均血清藥物動力學曲線。圖25按對數標度展示數據。對於多達50 μg/kg的劑量，收集樣本直至給藥後第29天。對於250和1000 μg/kg的劑量，採樣延長至給藥後第43天和第56天。250 μg/kg的數據在第29天後未示出，因為佇列中所有受試者的值低於第43天和第56天的定量下限。對於1000 μg/kg，在第43天，僅3名受試者的值高於定量下限，而在第56天，1名受試者的值高於定量下限。LLOQ = 定量下限。
[圖26]示出了TNFR2-Fc_varB（表示為MEDI7352）在範圍為1至450 μg/kg的重複靜脈內劑量下之幾何平均血清藥物動力學曲線。圖26A按線性標度呈現數據。圖26B按對數標度展示數據。1 μg/kg的數據在給藥後第57天後未示出，因為佇列中所有受試者的值低於第64天、第71天和第84天的定量下限。在第84天沒有示出50 μg/kg的數據，因為所有受試者具有的濃度都低於定量下限。對於450 μg/kg，在第57天之後沒有可用的濃度數據。
[圖27]示出了在給藥後第43天觀察到的TNFR2-Fc_varB之最大血清濃度（C max；上圖）以及在範圍為1至450 μg/kg的TNFR2-Fc_varB的重複靜脈內劑量後WOMAC疼痛得分相對於基線之相關變化（下圖）。
[圖28]示出了重複劑量的TNFR2-Fc_varB之後之疼痛水平。圖28A示出了在接受安慰劑、150 μg/kg或450 μg/kg TNFR2-Fc_varB的患者中從第0天至第84天的NRS疼痛相對於基線的變化。圖28B對重複劑量的TNFR2-Fc_varB與2.5 mg他尼珠單抗（tanezumab）、5 mg他尼珠單抗、40 mg羥考酮或安慰劑的作用進行了比較。圖28C示出了由不同劑量的法希奴單抗（fasinumab）、福拉奴單抗、TNFR2-Fc_varB（表示為MEDI7352）和他尼珠單抗誘導的WOMAC疼痛分量表相對於基線的變化確定的疼痛減輕。
[圖29]示出了ADA滴定度對TNFR2-Fc_varB（表示為MEDI7352）濃度和疼痛緩解之作用，該作用由WOMAC疼痛分量表（上圖）或NRS疼痛分量表（下圖）之變化確定。
[圖30]示出了TNFR2-Fc_varB在範圍為0.3至1000 μg/kg的單次靜脈內劑量和範圍為1至450 μg/kg的重複靜脈內劑量下的幾何平均血清藥物動力學曲線，並按ADA滴定度水平進行了分類。
[圖31]係在4次（每週兩次）劑量後TNFR2-Fc_varB清除率相比於體重的散點圖。圖例說明了MAD佇列編號和TNFR2-Fc_varB劑量。從非隔室分析獲得了清除率數據。該圖示出了具有95%置信界限（虛線）的線性回歸分析（實線）。p值為0.61說明清除率和重量之間沒有顯著的關聯。
[圖32]示出了皮下固定劑量研究之簡化圖解。
無
 

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          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> SEQ ID NO: 11]]>
          <![CDATA[<400> 11]]>
          Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Phe Asn Ser Ala Leu Ile Ser Tyr Tyr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Asp Val 
          <![CDATA[<210> 12]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> SEQ ID NO: 12]]>
          <![CDATA[<400> 12]]>
          Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Met Ile Ser Ser Leu Gln Pro Tyr Tyr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Asp Val 
          <![CDATA[<210> 13]]>
          <![CDATA[<211> 467]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 可溶性TNFR2胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 13]]>
          Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 
                      20                  25                  30          
          Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 
                  35                  40                  45              
          Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 
              50                  55                  60                  
          Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 
                      100                 105                 110         
          Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 
                  115                 120                 125             
          Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 
              130                 135                 140                 
          Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 
                      180                 185                 190         
          His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 
              210                 215                 220                 
          Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      260                 265                 270         
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                  275                 280                 285             
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              290                 295                 300                 
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          325                 330                 335     
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                      340                 345                 350         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
              370                 375                 380                 
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
          385                 390                 395                 400 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                          405                 410                 415     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                      420                 425                 430         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  435                 440                 445             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              450                 455                 460                 
          Pro Gly Lys 
          465         
          <![CDATA[<210> 14]]>
          <![CDATA[<211> 731]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> TNFR2-Fc_VH#4 - 胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 14]]>
          Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 
                      20                  25                  30          
          Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 
                  35                  40                  45              
          Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 
              50                  55                  60                  
          Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 
                      100                 105                 110         
          Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 
                  115                 120                 125             
          Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 
              130                 135                 140                 
          Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 
                      180                 185                 190         
          His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 
              210                 215                 220                 
          Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      260                 265                 270         
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                  275                 280                 285             
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              290                 295                 300                 
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          325                 330                 335     
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                      340                 345                 350         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
              370                 375                 380                 
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
          385                 390                 395                 400 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                          405                 410                 415     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                      420                 425                 430         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  435                 440                 445             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              450                 455                 460                 
          Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys 
                          485                 490                 495     
          Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Ile Ser 
                      500                 505                 510         
          Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile 
                  515                 520                 525             
          Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe Gln Gly Arg 
              530                 535                 540                 
          Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 
                          565                 570                 575     
          Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr Tyr Asp Met 
                      580                 585                 590         
          Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 
                  595                 600                 605             
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gln Ser Val 
              610                 615                 620                 
          Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr 
          625                 630                 635                 640 
          Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 
                          645                 650                 655     
          Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp 
                      660                 665                 670         
          Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys 
                  675                 680                 685             
          Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp 
              690                 695                 700                 
          Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp 
          705                 710                 715                 720 
          Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                          725                 730     
          <![CDATA[<210> 15]]>
          <![CDATA[<211> 15]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> (Gly4Ser)3 15 aa連接子序列]]>
          <![CDATA[<400> 15]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210> 16]]>
          <![CDATA[<211> 2193]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> TNFR2-Fc_VH#4 - 核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 16]]>
          Cys Thr Gly Cys Cys Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Cys Cys Thr Thr Thr Ala Cys Cys Cys Cys Thr Thr Ala Thr Gly Cys 
                      20                  25                  30          
          Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys 
                  35                  40                  45              
          Ala Cys Cys Thr Gly Thr Cys Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Ala Gly 
              50                  55                  60                  
          Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Cys Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Gly Cys Ala Ala Gly Thr Gly Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly 
                      100                 105                 110         
          Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr 
                  115                 120                 125             
          Gly Thr Thr Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys 
              130                 135                 140                 
          Ala Gly Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Gly Cys Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly 
                          165                 170                 175     
          Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly 
                      180                 185                 190         
          Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly Gly Gly Thr Gly Cys Cys Cys Gly 
                  195                 200                 205             
          Ala Gly Thr Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys Gly Gly 
              210                 215                 220                 
          Cys Ala Gly Cys Ala Gly Ala Thr Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Cys Cys Cys 
                          245                 250                 255     
          Ala Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala 
                      260                 265                 270         
          Gly Cys Ala Gly Ala Ala Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys 
                  275                 280                 285             
          Ala Cys Cys Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Cys Cys Gly Gly Cys Thr 
              290                 295                 300                 
          Gly Gly Thr Ala Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Gly Ala Ala Gly Gly Cys Thr Gly Cys 
                          325                 330                 335     
          Ala Gly Ala Cys Thr Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys 
                      340                 345                 350         
          Thr Gly Cys Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys 
                  355                 360                 365             
          Cys Gly Gly Cys Thr Thr Thr Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys Cys 
              370                 375                 380                 
          Ala Gly Ala Cys Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala Gly Ala 
          385                 390                 395                 400 
          Cys Ala Ala Gly Cys Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Thr Cys Thr Gly 
                          405                 410                 415     
          Thr Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Gly Cys Thr Cys Cys Thr 
                      420                 425                 430         
          Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala 
                  435                 440                 445             
          Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Ala 
              450                 455                 460                 
          Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Cys Cys Ala Cys 
          465                 470                 475                 480 
          Cys Ala Gly Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Gly 
                          485                 490                 495     
          Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala 
                      500                 505                 510         
          Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly Cys Cys 
                  515                 520                 525             
          Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Ala Cys Thr Ala 
              530                 535                 540                 
          Gly Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala Thr 
          545                 550                 555                 560 
          Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly 
                          565                 570                 575     
          Cys Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly 
                      580                 585                 590         
          Thr Gly Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys Cys Ala 
                  595                 600                 605             
          Gly Cys Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Ala Cys Cys 
              610                 615                 620                 
          Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly 
          625                 630                 635                 640 
          Cys Cys Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr 
                          645                 650                 655     
          Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Ala Thr Gly Gly Gly Cys 
                      660                 665                 670         
          Cys Cys Thr Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Cys Cys Gly 
                  675                 680                 685             
          Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Cys Gly Ala 
              690                 695                 700                 
          Cys Gly Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Thr Gly Cys 
          705                 710                 715                 720 
          Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr 
                          725                 730                 735     
          Gly Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys 
                      740                 745                 750         
          Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Gly Cys 
                  755                 760                 765             
          Gly Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Cys 
              770                 775                 780                 
          Thr Gly Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala Gly Cys Cys 
          785                 790                 795                 800 
          Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Gly 
                          805                 810                 815     
          Ala Thr Cys Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Cys Cys Cys Cys Cys Gly 
                      820                 825                 830         
          Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Gly Gly Thr 
                  835                 840                 845             
          Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys Cys Ala Cys 
              850                 855                 860                 
          Gly Ala Gly Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala 
          865                 870                 875                 880 
          Ala Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr Thr Gly Gly Thr Ala Cys Gly Thr 
                          885                 890                 895     
          Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala Gly Thr Gly 
                      900                 905                 910         
          Cys Ala Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala 
                  915                 920                 925             
          Ala Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Cys Ala 
              930                 935                 940                 
          Gly Thr Ala Cys Ala Ala Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys 
          945                 950                 955                 960 
          Cys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Cys 
                          965                 970                 975     
          Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Cys Ala 
                      980                 985                 990         
          Gly Gly Ala Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys 
                  995                 1000                1005            
          Ala Ala Ala Gly Ala Gly Thr Ala Cys Ala Ala Gly Thr Gly Cys Ala 
              1010                1015                1020                
          Ala Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys 
          1025                1030                1035                1040
          Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys 
                          1045                1050                1055    
          Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala 
                      1060                1065                1070        
          Ala Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys 
                  1075                1080                1085            
          Cys Cys Gly Cys Gly Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Gly 
              1090                1095                1100                
          Thr Ala Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Ala 
          1105                1110                1115                1120
          Gly Cys Cys Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys 
                          1125                1130                1135    
          Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys 
                      1140                1145                1150        
          Cys Thr Gly Ala Cys Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala 
                  1155                1160                1165            
          Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Thr Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly 
              1170                1175                1180                
          Cys Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Gly Ala Ala 
          1185                1190                1195                1200
          Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Cys 
                          1205                1210                1215    
          Ala Gly Cys Cys Cys Gly Ala Gly Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Ala 
                      1220                1225                1230        
          Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr 
                  1235                1240                1245            
          Gly Thr Gly Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Cys Gly Ala Cys Gly 
              1250                1255                1260                
          Gly Cys Thr Cys Ala Thr Thr Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Thr Ala 
          1265                1270                1275                1280
          Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly 
                          1285                1290                1295    
          Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Gly Gly Thr Gly Gly Cys 
                      1300                1305                1310        
          Ala Gly Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Thr Gly Thr Thr 
                  1315                1320                1325            
          Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Thr Gly 
              1330                1335                1340                
          Cys Ala Cys Gly Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Ala 
          1345                1350                1355                1360
          Ala Cys Cys Ala Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala 
                          1365                1370                1375    
          Gly Thr Cys Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys 
                      1380                1385                1390        
          Cys Cys Cys Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly 
                  1395                1400                1405            
          Gly Cys Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly 
              1410                1415                1420                
          Gly Gly Gly Ala Thr Cys Thr Cys Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly 
          1425                1430                1435                1440
          Cys Thr Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly 
                          1445                1450                1455    
          Cys Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys 
                      1460                1465                1470        
          Cys Gly Gly Cys Thr Cys Thr Ala Gly Cys Gly Thr Gly Ala Ala Gly 
                  1475                1480                1485            
          Gly Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Ala 
              1490                1495                1500                
          Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 
          1505                1510                1515                1520
          Cys Ala Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys 
                          1525                1530                1535    
          Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Cys Cys 
                      1540                1545                1550        
          Cys Thr Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Gly Ala 
                  1555                1560                1565            
          Ala Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys 
              1570                1575                1580                
          Ala Thr Cys Cys Cys Cys Ala Thr Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Ala 
          1585                1590                1595                1600
          Cys Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Ala Gly Cys Gly Cys Cys Cys Ala 
                          1605                1610                1615    
          Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Ala 
                      1620                1625                1630        
          Gly Thr Gly Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly 
                  1635                1640                1645            
          Ala Cys Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys 
              1650                1655                1660                
          Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys Ala Thr Gly Gly Ala Ala Cys Thr Gly 
          1665                1670                1675                1680
          Ala Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Cys Gly Gly Ala Gly Cys Gly 
                          1685                1690                1695    
          Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Ala 
                      1700                1705                1710        
          Cys Thr Ala Cys Thr Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Cys 
                  1715                1720                1725            
          Ala Gly Cys Cys Gly Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Cys 
              1730                1735                1740                
          Thr Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Cys 
          1745                1750                1755                1760
          Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly 
                          1765                1770                1775    
          Gly Ala Cys Gly Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Gly 
                      1780                1785                1790        
          Gly Cys Ala Cys Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Ala Gly Thr 
                  1795                1800                1805            
          Gly Thr Cys Thr Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Cys 
              1810                1815                1820                
          Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly 
          1825                1830                1835                1840
          Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly 
                          1845                1850                1855    
          Ala Thr Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Gly Cys Gly Thr Gly 
                      1860                1865                1870        
          Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Cys Thr Thr 
                  1875                1880                1885            
          Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Cys 
              1890                1895                1900                
          Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala Cys Cys 
          1905                1910                1915                1920
          Ala Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala 
                          1925                1930                1935    
          Gly Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Gly Gly 
                      1940                1945                1950        
          Cys Ala Ala Cys Ala Ala Cys Thr Ala Cys Gly Thr Gly Thr Cys Cys 
                  1955                1960                1965            
          Thr Gly Gly Thr Ala Thr Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys 
              1970                1975                1980                
          Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Gly Cys Cys Cys Cys Thr Ala Ala 
          1985                1990                1995                2000
          Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Thr Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys 
                          2005                2010                2015    
          Ala Ala Cys Ala Ala Cys Ala Ala Gly Cys Gly Gly Cys Cys Cys Ala 
                      2020                2025                2030        
          Gly Cys Gly Gly Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly 
                  2035                2040                2045            
          Gly Thr Thr Thr Ala Gly Cys Gly Gly Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly 
              2050                2055                2060                
          Ala Gly Cys Gly Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Ala 
          2065                2070                2075                2080
          Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Ala Gly Gly 
                          2085                2090                2095    
          Cys Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys 
                      2100                2105                2110        
          Gly Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Ala Cys Thr 
                  2115                2120                2125            
          Gly Cys Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly 
              2130                2135                2140                
          Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Cys Gly Cys Thr Thr Gly Gly 
          2145                2150                2155                2160
          Gly Thr Gly Thr Thr Cys Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala 
                          2165                2170                2175    
          Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Thr 
                      2180                2185                2190        
          Gly 
          <![CDATA[<210> 17]]>
          <![CDATA[<211> 735]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> TNFR2-Fc_varB - 胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 17]]>
          Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 
                      20                  25                  30          
          Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 
                  35                  40                  45              
          Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 
              50                  55                  60                  
          Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 
                      100                 105                 110         
          Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 
                  115                 120                 125             
          Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 
              130                 135                 140                 
          Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala 
                          165                 170                 175     
          Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 
                      180                 185                 190         
          His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 
                  195                 200                 205             
          Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 
              210                 215                 220                 
          Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      260                 265                 270         
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                  275                 280                 285             
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              290                 295                 300                 
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
          305                 310                 315                 320 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          325                 330                 335     
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                      340                 345                 350         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 
              370                 375                 380                 
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
          385                 390                 395                 400 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                          405                 410                 415     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                      420                 425                 430         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  435                 440                 445             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              450                 455                 460                 
          Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys 
                          485                 490                 495     
          Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Gly Ile Ser 
                      500                 505                 510         
          Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile 
                  515                 520                 525             
          Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe Gln Gly Arg 
              530                 535                 540                 
          Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 
                          565                 570                 575     
          Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr Tyr Asp Met 
                      580                 585                 590         
          Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 
                  595                 600                 605             
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
              610                 615                 620                 
          Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly 
          625                 630                 635                 640 
          Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn 
                          645                 650                 655     
          Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 
                      660                 665                 670         
          Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe 
                  675                 680                 685             
          Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu 
              690                 695                 700                 
          Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser 
          705                 710                 715                 720 
          Leu Ser Ala Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                          725                 730                 735 
          <![CDATA[<210> 18]]>
          <![CDATA[<211> 2205]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> TNFR2-Fc_varB - 核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 18]]>
          ctgcccgccc aggtggcctt taccccttat gcccccgagc ccggcagcac ctgtcggctg      60
          agagagtact acgaccagac cgcccagatg tgctgcagca agtgctctcc tggccagcat     120
          gccaaggtgt tctgcaccaa gaccagcgac accgtgtgcg acagctgcga ggacagcacc     180
          tacacccagc tgtggaactg ggtgcccgag tgcctgagct gcggcagcag atgcagcagc     240
          gaccaggtgg aaacccaggc ctgcaccaga gagcagaacc ggatctgcac ctgtagaccc     300
          ggctggtact gcgccctgag caagcaggaa ggctgcagac tctgcgcccc tctgcggaag     360
          tgcagacccg gctttggcgt ggccagaccc ggcaccgaga caagcgacgt ggtctgcaag     420
          ccctgcgctc ctggcacctt cagcaacacc accagcagca ccgacatctg cagaccccac     480
          cagatctgca acgtggtggc catccccggc aacgccagca tggatgccgt gtgcaccagc     540
          accagcccca ccagaagtat ggcccctggc gccgtgcatc tgccccagcc tgtgtccacc     600
          agaagccagc acacccagcc cacccctgag cctagcaccg ccccctccac cagctttctg     660
          ctgcctatgg gccctagccc tccagccgag ggaagcacag gcgacgagcc caagagctgc     720
          gacaagaccc acacctgtcc cccctgccct gcccctgaac tgctgggcgg acccagcgtg     780
          ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc     840
          tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac     900
          ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagtacaa ctccacctac     960
          cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag    1020
          tgcaaagtct ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaga aaaccatcag caaggccaag    1080
          ggccagcccc gcgagcctca ggtgtacaca ctgcccccca gccgggaaga gatgaccaag    1140
          aaccaggtgt ccctgacctg cctggtcaaa ggcttctacc ccagcgatat cgccgtggaa    1200
          tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc    1260
          gacggctcat tcttcctgta cagcaagctg accgtggaca agagccggtg gcagcagggc    1320
          aatgtcttca gctgtagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc    1380
          ctgagcctga gccccggaaa gggcggaggc ggatccggag gtgggggatc tcaggtgcag    1440
          ctggtgcagt ctggcgccga agtgaagaaa cccggctcta gcgtgaaggt gtcctgcaag    1500
          gccagcggcg gcaccttctc cacctacggc atcagctggg tccgccaggc ccctggacag    1560
          tgtctggaat ggatgggcgg catcatcccc atcttcgaca ccggcaacag cgcccagagc    1620
          ttccagggca gagtgaccat caccgccgac gagagcacct ccaccgccta catggaactg    1680
          agcagcctgc ggagcgagga caccgccgtg tactactgcg ccagaagcag ccggatctac    1740
          gacctgaacc ccagcctgac cgcctactac gacatggacg tgtggggcca gggcaccatg    1800
          gtcacagtgt ctagcggagg cggaggcagc ggaggtggtg gatctggtgg cggaggaagt    1860
          ggcggcggag gctctcagag cgtgctgacc cagccccctt ctgtgtctgc cgcccctggc    1920
          cagaaagtga ccatctcctg cagcggcagc agcagcaaca tcggcaacaa ctacgtgtcc    1980
          tggtatcagc agctgcccgg caccgcccct aagctgctga tctacgacaa caacaagcgg    2040
          cccagcggca tccccgaccg gtttagcggc agcaagagcg ggacttctgc tacactgggc    2100
          atcacaggcc tgcagaccgg cgacgaggcc gactactact gcggcacctg ggacagcagc    2160
          ctgagcgctt gggtgttcgg ctgcggcacc aagctgacag tgctg                    2205
          <![CDATA[<210> 19]]>
          <![CDATA[<211> 20]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> (Gly4Ser)4 20aa連接子序列]]>
          <![CDATA[<400> 19]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser 
                      20  
          <![CDATA[<210> 20]]>
          <![CDATA[<211> 215]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> ndimab varB - L鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 20]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ile Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala 
                      100                 105                 110         
          Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 
                      180                 185                 190         
          Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 
                  195                 200                 205             
          Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215 
          <![CDATA[<210> 21]]>
          <![CDATA[<211> 645]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> ndimab varB - L鏈核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 21]]>
          gaaatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc      60
          ctgagctgca gagccagcca gagcgtgtac tcctacctgg cttggtatca gcagaagccc     120
          ggccaggccc ccagactgct gatctacgac gccagcaacc gggccatcgg catccctgcc     180
          agattttctg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctggaaccc     240
          gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag cggagcaact ggcccccctt caccttcggc     300
          cctggcacca aggtggacat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg     360
          ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc     420
          tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc     480
          caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg     540
          acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag     600
          ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt                     645
          <![CDATA[<210> 22]]>
          <![CDATA[<211> 724]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> ndimab varB - H鏈胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 22]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ser Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 
                      100                 105                 110         
          Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 
                  115                 120                 125             
          Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 
              130                 135                 140                 
          Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 
                          165                 170                 175     
          His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 
                      180                 185                 190         
          Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 
                  195                 200                 205             
          Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val 
              210                 215                 220                 
          Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 
                          245                 250                 255     
          Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 
                      260                 265                 270         
          Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 
                  275                 280                 285             
          Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 
              290                 295                 300                 
          Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 
                          325                 330                 335     
          Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 
                      340                 345                 350         
          Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 
                  355                 360                 365             
          Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 
              370                 375                 380                 
          Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 
                          405                 410                 415     
          Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 
                      420                 425                 430         
          Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 
                  435                 440                 445             
          Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
              450                 455                 460                 
          Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser 
                          485                 490                 495     
          Thr Tyr Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu 
                      500                 505                 510         
          Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln 
                  515                 520                 525             
          Ser Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr 
              530                 535                 540                 
          Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
          545                 550                 555                 560 
          Tyr Cys Ala Arg Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr 
                          565                 570                 575     
          Ala Tyr Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val 
                      580                 585                 590         
          Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                  595                 600                 605             
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val 
              610                 615                 620                 
          Ser Ala Ala Pro Gly Gln Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser 
          625                 630                 635                 640 
          Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly 
                          645                 650                 655     
          Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly 
                      660                 665                 670         
          Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu 
                  675                 680                 685             
          Gly Ile Thr Gly Leu Gln Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly 
              690                 695                 700                 
          Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys 
          705                 710                 715                 720 
          Leu Thr Val Leu 
          <![CDATA[<210> 23]]>
          <![CDATA[<211> 2172]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> ndimab varB - H鏈核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 23]]>
          caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ccggcagaag cctgagactg      60
          agctgcgctg ccagcggctt catcttcagc agctacgcca tgcactgggt ccgccaggcc     120
          cctggcaacg gactggaatg ggtggccttc atgagctacg acggcagcaa caagaagtac     180
          gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac     240
          ctgcagatga acagcctgcg ggctgaggac accgccgtgt actactgcgc cagagaccga     300
          ggcatcagtg ctggcggcaa ctactactac tacggcatgg acgtgtgggg ccagggcacc     360
          accgtgaccg tgtctagcgc gtcgaccaag ggcccatccg tcttccccct ggcaccctcc     420
          tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc     480
          gaaccggtga cggtgtcctg gaactcaggc gctctgacca gcggcgtgca caccttcccg     540
          gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc     600
          agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg     660
          gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca     720
          cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc     780
          atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct     840
          gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg     900
          cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag     960
          gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc    1020
          atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt ctacaccctg    1080
          cccccatccc gggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc    1140
          ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac    1200
          aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctatag caagctcacc    1260
          gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct    1320
          ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaagg cggaggggga    1380
          tccggcggag ggggctctca ggtgcagctg gtgcagtctg gcgccgaagt gaagaaaccc    1440
          ggctctagcg tgaaggtgtc ctgcaaggcc agcggcggca ccttctccac ctacggcatc    1500
          agctgggtcc gccaggcccc tggacagtgt ctggaatgga tgggcggcat catccccatc    1560
          ttcgacaccg gcaacagcgc ccagagcttc cagggcagag tgaccatcac cgccgacgag    1620
          agcacctcca ccgcctacat ggaactgagc agcctgcgga gcgaggacac cgccgtgtac    1680
          tactgcgcca gaagcagccg gatctacgac ctgaacccca gcctgaccgc ctactacgac    1740
          atggacgtgt ggggccaggg caccatggtc acagtgtcta gcggaggcgg aggcagcgga    1800
          ggtggtggat ctggtggcgg aggaagtggc ggcggaggct ctcagagcgt gctgacccag    1860
          cccccttctg tgtctgccgc ccctggccag aaagtgacca tctcctgcag cggcagcagc    1920
          agcaacatcg gcaacaacta cgtgtcctgg tatcagcagc tgcccggcac cgcccctaag    1980
          ctgctgatct acgacaacaa caagcggccc agcggcatcc ccgaccggtt tagcggcagc    2040
          aagagcggga cttctgctac actgggcatc acaggcctgc agaccggcga cgaggccgac    2100
          tactactgcg gcacctggga cagcagcctg agcgcttggg tgttcggctg cggcaccaag    2160
          ctgacagtgc tg                                                        2172
          <![CDATA[<210> 24]]>
          <![CDATA[<211> 128]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> NGF-NG VH胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 24]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Trp Phe Gly 
                      20                  25                  30          
          Ala Phe Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Leu Thr Asn Leu Ala Gln Asn Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210> 25]]>
          <![CDATA[<211> 384]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> NGF-NG VH核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 25]]>
          caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc      60
          tcctgcaagg cctctggagg caccttctgg ttcggcgcgt tcacctgggt gcgacaggcc     120
          cctggacaag gacttgagtg gatgggaggg attattccta tcttcgggtt gacgaacttg     180
          gcacagaact tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagtctac     240
          atggagctga gcagcttgag atctgaagac acggccgtat attattgtgc acgttcaagt     300
          cgtatctacg atctgaaccc gtccctgacc gcctactacg atatggatgt ctggggccag     360
          gggacaatgg tcaccgtctc gagt                                            384
          <![CDATA[<210> 26]]>
          <![CDATA[<211> 110]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> NGF-NG VL胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 26]]>
          Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210> 27]]>
          <![CDATA[<211> 330]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> NGF-NG VL核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 27]]>
          cagtctgtgc tgactcagcc gccatcagtg tctgcggccc caggacagaa ggtcaccatc      60
          tcctgctctg gaagcagctc cgacattggg aataattatg tatcgtggta ccagcagctc     120
          ccaggaacag cccccaaact cctcatttat gacaataata agcgaccctc agggattcct     180
          gaccgattct ctggctccaa gtctggcacg tcagccaccc tgggcatcac cggactccag     240
          actggggacg aggccgatta ttactgcgga acatgggata gcagcctgag tgcttgggtg     300
          ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta                                      330
          <![CDATA[<210> 28]]>
          <![CDATA[<211> 126]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> ndimab VH胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 28]]>
          Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Lys Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Arg Gly Ile Ser Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 
                      100                 105                 110         
          Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125     
          <![CDATA[<210> 29]]>
          <![CDATA[<211> 108]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> ndimab VL胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 29]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Tyr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ile Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210> 30]]>
          <![CDATA[<211> 128]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 1126F1 VH胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 30]]>
          Glu Val Gln Leu Val Gln Thr Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Ala Asn Arg Gln Ala Val Pro Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210> 31]]>
          <![CDATA[<211> 110]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 1126F1 VL胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 31]]>
          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Met Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210> 32]]>
          <![CDATA[<211> 128]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 1126G5 VH胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 32]]>
          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Phe Thr Ser Gly Leu Ala Pro Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210> 33]]>
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          <![CDATA[<400> 33]]>
          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110 
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
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          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Ala Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala His 
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          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
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          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
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          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
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          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
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          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
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          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
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                      100                 105                 110         
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
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          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
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                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Thr Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
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          <![CDATA[<400> 44]]>
          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Phe Glu Pro Ser Leu Ile Tyr Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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                          85                  90                  95      
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          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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                  115                 120                 125             
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
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                          85                  90                  95      
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ser Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Phe Arg Thr Leu Tyr Ser Thr Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
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          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Ser Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
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                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
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                      20                  25                  30          
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                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
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                      100                 105                 110         
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
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          Glu Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Thr Asn Ile Gly Asn Asn 
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                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
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          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Val Gly Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly His Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Val Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
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          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
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          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Phe His Leu Ala Asn Lys Gly Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
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          Lys Ala Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
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          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
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          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
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          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Gly Ser Leu 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110 
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Ala Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          <![CDATA[<211> 109]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
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          <![CDATA[<400> 69]]>
          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 
                      100                 105                 
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
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          <![CDATA[<400> 70]]>
          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
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          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          <![CDATA[<400> 71]]>
          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Glu Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
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          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
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          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          <![CDATA[<220> ]]>
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          <![CDATA[<400> 73]]>
          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110 
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          <![CDATA[<220> ]]>
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
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              50                  55                  60                  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
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          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110 
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
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                      20                  25                  30          
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          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Ala His Leu Gln Ala Tyr Tyr Asp 
                      100                 105                 110         
          Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125     
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Arg Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Ala Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Ala Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Ala His Leu Asn His His Gly Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
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          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
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          Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Val Val Lys Lys Pro Gly Ser 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
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                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Thr Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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          Glu Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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          Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
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          Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Thr Pro Pro Gly Gln 
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          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
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              50                  55                  60                  
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                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 
                      100                 105                 
          <![CDATA[<210> 84]]>
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          <![CDATA[<212> PRT]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 1083H4 VH胺基酸序列]]>
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          Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Tyr His 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
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          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
          Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
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          Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Thr Val Asn Trp Tyr Gln Arg Leu Pro Gly Ala Ala Pro Gln Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asn Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Gly Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Asn Gly Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210> 86]]>
          <![CDATA[<211> 125]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 1227H8 VH胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 86]]>
          Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly His Thr Phe Ala Tyr His 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ala Asp Tyr Ala Trp Glu Ser Tyr Gln Pro Pro Gln Ile Asn 
                      100                 105                 110         
          Gly Val Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
          <![CDATA[<210> 87]]>
          <![CDATA[<211> 110]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 1227H8 VL胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 87]]>
          Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Asp Ile Ser Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Phe Phe Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210> 88]]>
          <![CDATA[<211> 5]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> NGF-NG HCDR1]]>
          <![CDATA[<400> 88]]>
          Phe Gly Ala Phe Thr 
          1               5   
          <![CDATA[<210> 89]]>
          <![CDATA[<211> 17]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> NGF-NG HCDR2]]>
          <![CDATA[<400> 89]]>
          Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Leu Thr Asn Leu Ala Gln Asn Phe Gln 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210> 90]]>
          <![CDATA[<211> 19]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> NGF-NG HCDR3]]>
          <![CDATA[<400> 90]]>
          Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr Tyr Asp 
          1               5                   10                  15      
          Met Asp Val 
          <![CDATA[<210> 91]]>
          <![CDATA[<211> 13]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> NGF-NG LCDR1]]>
          <![CDATA[<400> 91]]>
          Ser Gly Ser Ser Ser Asp Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210> 92]]>
          <![CDATA[<211> 7]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> NGF-NG LCDR2]]>
          <![CDATA[<400> 92]]>
          Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210> 93]]>
          <![CDATA[<211> 11]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> NGF-NG LCDR3]]>
          <![CDATA[<400> 93]]>
          Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Ala Trp Val 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210> 94]]>
          <![CDATA[<211> 128]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 具有G->C的MEDI-578 VH胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 94]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Gly Asn Ser Ala Gln Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Ser Ser Arg Ile Tyr Asp Leu Asn Pro Ser Leu Thr Ala Tyr 
                      100                 105                 110         
          Tyr Asp Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          <![CDATA[<210> 95]]>
          <![CDATA[<211> 110]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 具有G->C的MEDI-578 VL胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 95]]>
          Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Ala Trp Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210> 96]]>
          <![CDATA[<211> 125]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 1230D8 VH胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 96]]>
          Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Thr Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Pro Tyr His 
                      20                  25                  30          
          Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Phe Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ala Asp Tyr Val Trp Glu Ser Tyr His Pro Ala Thr Ser Leu 
                      100                 105                 110         
          Ser Leu Trp Gly Arg Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
          <![CDATA[<210> 97]]>
          <![CDATA[<211> 110]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 1230D8 VL胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 97]]>
          Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 
          1               5                   10                  15      
          Lys Val Thr Ile Ser Cys Pro Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Asn Asn 
                      20                  25                  30          
          Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Lys Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Asp Ile Ser Glu Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Glu Phe Leu Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210> 98]]>
          <![CDATA[<211> 10]]>
          <![CDATA[<212> PRT]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 連接子]]>
          <![CDATA[<400> 98]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210> 99]]>
          <![CDATA[<211> 2205]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> TNFR2-Fc_varB ?經密碼子優化的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400> 99]]>
          ctgcccgccc aggtggcctt taccccttat gctcctgagc ccggctctac ctgccggctg      60
          agagagtact acgaccagac cgcccagatg tgctgctcca agtgctctcc tggccagcac     120
          gccaaggtgt tctgcaccaa gacctccgat accgtgtgcg actcctgcga ggactccacc     180
          tacacccagc tgtggaactg ggtgcccgag tgcctgtcct gcggctccag atgttcctcc     240
          gaccaggtgg aaacccaggc ctgcaccaga gagcagaacc ggatctgcac ctgtcggcct     300
          ggctggtact gcgccctgtc taagcaggaa ggctgcagac tgtgcgcccc tctgcggaag     360
          tgtagacctg gctttggcgt ggccagaccc ggcaccgaga catctgatgt cgtgtgcaag     420
          ccttgcgccc ctggcacctt ctccaacacc acctcctcca ccgacatctg ccggcctcac     480
          cagatctgca acgtggtggc catccctggc aacgcctcta tggacgccgt gtgcacctct     540
          acctccccca ccagaagtat ggcccctggc gctgtgcatc tgccccagcc tgtgtctacc     600
          agatcccagc acacccagcc cacccctgag ccttctaccg ccccttctac cagcttcctg     660
          ctgcctatgg gccctagccc tcctgctgag ggatctacag gcgacgagcc caagtcctgc     720
          gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgaac tgctgggcgg accttccgtg     780
          ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc tgaagtgacc     840
          tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggat cccgaagtga agttcaattg gtacgtggac     900
          ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagtacaa ctccacctac     960
          cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggattggc tgaacggcaa agagtacaag    1020
          tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaaa agaccatctc caaggccaag    1080
          ggccagcccc gggaacccca ggtgtacaca ctgcccccta gccgggaaga gatgaccaag    1140
          aaccaggtgt ccctgacctg tctcgtgaag ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa    1200
          tgggagtcca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggactcc    1260
          gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc    1320
          aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc    1380
          ctgtccctga gccctggaaa aggcggcgga ggatctggcg gaggcggatc tcaggtgcag    1440
          ctggtgcagt ctggcgctga agtgaagaaa cccggctcct ccgtgaaggt gtcctgcaag    1500
          gcttctggcg gcaccttctc tacctacggc atctcctggg tgcgacaggc ccctggccag    1560
          tgcctggaat ggatgggcgg catcatcccc atcttcgaca ccggcaactc cgcccagagc    1620
          ttccagggca gagtgaccat caccgccgac gagtctacct ccaccgccta catggaactg    1680
          tcctccctgc ggagcgagga caccgccgtg tactactgcg cccggtcctc tcggatctac    1740
          gacctgaacc cttccctgac cgcctactac gacatggacg tgtggggcca gggcacaatg    1800
          gtcaccgtgt catctggtgg tggcggctct ggtggcggag gaagtggggg agggggttct    1860
          ggggggggag gatctcagtc tgtgctgacc cagcctcctt ccgtgtctgc tgccccaggc    1920
          cagaaagtga caatctcctg cagcggctcc agctccaaca tcggcaacaa ctacgtgtcc    1980
          tggtatcagc agctgcccgg caccgctccc aaactgctga tctacgataa caacaagcgg    2040
          ccctccggca tccccgacag attctccggc tctaagtccg gcacctctgc caccctgggc    2100
          atcaccggac tgcagacagg cgacgaggcc gactactact gtggcacctg ggactcctcc    2160
          ctgtccgctt gggtgttcgg ctgcggcacc aaactgactg tgctg                    2205
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Claims (67)

  1. 一種減輕或預防有需要的受試者的疼痛之方法，該方法包括向該受試者投與皮下固定劑量的結合分子，其中該結合分子包含NGF拮抗劑結構域和TNFɑ拮抗劑結構域，其中該NGF拮抗劑結構域係抗NGF抗體或其抗原結合片段，其中該TNFα拮抗劑結構域包含TNFR的可溶性TNFɑ結合片段，並且其中該方法減輕或預防受試者的疼痛。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該結合分子的皮下固定劑量係約5 mg至200 mg。
  3. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該結合分子的皮下固定劑量係約7.5 mg至150 mg。
  4. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該結合分子的皮下固定劑量係約7.5 mg、約25 mg、約75 mg或約150 mg。
  5. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該皮下固定劑量相當於30 mg該結合分子的靜脈內固定劑量。
  6. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中至少每兩週一次投與該固定劑量。
  7. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中將該固定劑量投與至少12週。
  8. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該疼痛包含慢性疼痛。
  9. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該疼痛包含骨關節炎疼痛。
  10. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該疼痛包含膝關節的骨關節炎疼痛。
  11. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在投與該結合分子之前，該受試者已經患有該疼痛3個月或更長的時間。
  12. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該疼痛與關節炎症相關。
  13. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該受試者患有骨關節炎。
  14. 如請求項13所述之方法，其中該受試者患有單側膝關節的骨關節炎。
  15. 如請求項13或14所述之方法，其中根據中心讀取器的評估，該受試者在0至4級的Kellgren-Lawrence（KL）分級量表中具有至少2級膝關節的骨關節炎。
  16. 如前述請求項中任一項所述之方法，該方法包括在向該受試者投與該結合分子之前的以下步驟： a.      向該受試者投與NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合，和 b.     確定i) NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合不減輕或預防受試者的疼痛，和/或ii) 確定該受試者不耐受NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合。
  17. 如請求項16所述之方法，其中投與該NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合至少2週。
  18. 如請求項16所述之方法，其中在投與該結合分子之前，向該受試者投與該NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合至少2週。
  19. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該受試者不耐受NSAID、強類鴉片、弱類鴉片、COX-2抑制劑、乙醯胺酚或其組合。
  20. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法包括在投與該固定劑量的結合分子之前，測試該受試者的SARS-CoV2感染。
  21. 如請求項20所述之方法，其中測試該受試者的SARS-CoV2感染包括在投與該固定劑量的結合分子之前，測試該受試者的SARS-CoV2基因材料。
  22. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在基線時，該受試者沒有感染SARS-CoV2。
  23. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在基線時，如使用WOMAC指數的疼痛分量表所測量的，該受試者在一個關節中具有至少為5的平均西安大略大學和麥克馬斯特大學骨關節炎（WOMAC）疼痛得分。
  24. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在基線時，如在疼痛數值評定量表（NRS）上所測量的，該受試者在一個關節中具有至少為5的平均疼痛強度得分。
  25. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法相對於基線降低了該受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值。
  26. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中每2週一次投與該固定劑量，持續投與12週，並且其中該方法相對於基線在至少第12週降低了該受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值。
  27. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法使該受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值相對於基線降低了至少30%。
  28. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法使該受試者的每日NRS疼痛得分的週平均值相對於基線降低了至少50%。
  29. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法相對於基線降低了該受試者的WOMAC疼痛分量表得分。
  30. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中每2週一次投與該固定劑量，持續投與12週，並且其中該方法相對於基線在至少第12週降低了該受試者的WOMAC疼痛分量表得分。
  31. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法使受試者的WOMAC疼痛分量表得分相對於基線降低了至少30%。
  32. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法使受試者的WOMAC疼痛分量表得分相對於基線降低了至少50%。
  33. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法使受試者的WOMAC生理分量表得分相對於基線降低了至少30%。
  34. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法使受試者的WOMAC生理分量表得分相對於基線降低了至少50%。
  35. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法相對於基線改善了骨關節炎的患者整體評估（PGA）。
  36. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中每2週一次投與該固定劑量，持續投與12週，並且其中方法相對於基線在至少第12週改善了骨關節炎的PGA。
  37. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法使骨關節炎的PGA改善了至少2個得分。
  38. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在受試者中單劑量投與該結合分子之後，觀察到了疼痛減輕。
  39. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法包括向該受試者投與NSAID。
  40. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法包括向該受試者投與類鴉片。
  41. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法包括向該受試者投與乙醯胺酚。
  42. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該方法包括向該受試者投與COX-2抑制劑。
  43. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該抗NGF抗體或其片段可抑制NGF與TrkA、p75NRT、或TrkA和P75NRT二者的結合。
  44. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中相比阻斷NGF與p75NRT的結合，該抗NGF抗體或其片段優先阻斷NGF與TrkA的結合。
  45. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該抗NGF抗體或其片段以約0.25-0.44 nM的親和力結合人NGF。
  46. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該抗NGF抗體或其片段包含含有一組CDR HCDR1、CDR HCDR2、CDR HCDR3的抗體VH結構域和含有一組CDR LCDR1、CDR LCDR2和CDR LCDR3的抗體VL結構域，其中該HCDR1具有SEQ ID NO: 4或具有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 4的胺基酸序列，該HCDR2具有SEQ ID NO: 5或具有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 5的胺基酸序列，該HCDR3具有SEQ ID NO: 6或具有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 6的胺基酸序列、SSRIYDFNSALISYYDMDV（SEQ ID NO: 11）或SSRIYDMISSLQPYYDMDV（SEQ ID NO: 12），該LCDR1具有SEQ ID NO: 8或具有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 8的胺基酸序列，該LCDR2具有SEQ ID NO: 9或具有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 9的胺基酸序列，並且該LCDR3具有SEQ ID NO: 10或具有多達兩個胺基酸取代的SEQ ID NO: 10的胺基酸序列。
  47. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該抗NGF抗體或其片段包含含有一組CDR HCDR1、CDR HCDR2、CDR HCDR3的抗體VH結構域和含有一組CDR LCDR1、CDR LCDR2和CDR LCDR3的抗體VL結構域， 其中該HCDR1包含SEQ ID NO: 4的胺基酸序列， 該HCDR2包含SEQ ID NO: 5的胺基酸序列， 該HCDR3包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列、SSRIYDFNSALISYYDMDV（SEQ ID NO: 11）或SSRIYDMISSLQPYYDMDV（SEQ ID NO: 12）， 該LCDR1包含SEQ ID NO: 8的胺基酸序列， 該LCDR2包含SEQ ID NO: 9的胺基酸序列；並且 該LCDR3包含SEQ ID NO: 10的胺基酸序列。
  48. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該抗NGF抗體或其片段包含具有與SEQ ID NO: 3或94的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VH。
  49. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該抗NGF抗體或其片段包含具有與SEQ ID NO: 7或95的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VL。
  50. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該抗NGF抗體或其片段係全H 2L 2抗體、Fab片段、Fab'片段、F(ab) 2片段或單鏈Fv（scFv）片段。
  51. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該抗NGF抗體或其片段係人源化的、嵌合的、靈長類動物化的或全人的。
  52. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該抗NGF scFv片段從N-末端到C-末端包含含有與SEQ ID NO: 3的胺基酸至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VH，15個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 3（SEQ ID NO: 15），和含有與SEQ ID NO: 7的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VL。
  53. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該抗NGF scFv片段從N-末端到C-末端包含含有與SEQ ID NO: 94的胺基酸至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VH，20個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 4（SEQ ID NO: 19），和含有與SEQ ID NO: 95的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VL。
  54. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該TNFR係TNFR-2。
  55. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該TNFR-2片段融合至免疫球蛋白Fc結構域。
  56. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該免疫球蛋白Fc結構域係人IgG1 Fc結構域。
  57. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該TNFα拮抗劑包含與SEQ ID NO: 13所示的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列，或其功能片段。
  58. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該結合分子包含融合蛋白，該融合蛋白包含藉由連接子與TNFα拮抗劑融合的NGF拮抗劑。
  59. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該結合分子包含該融合蛋白的同源二聚體。
  60. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該結合分子包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體從N-末端到C-末端包含TNFR-2的TNFα結合片段，其包含與對應於SEQ ID NO: 13的胺基酸1-235的序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列；人IgG1Fc結構域；10個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 2（SEQ ID NO: 98）；包含與SEQ ID NO 3或94的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VH；15個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 3（SEQ ID NO: 15）；和包含與SEQ ID NO: 7或95的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列的VL。
  61. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該結合分子包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體包含與SEQ ID NO: 14的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或100%相同的胺基酸序列。
  62. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該結合分子包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體從N-末端到C-末端包含TNFR-2的TNFα結合75 kD片段，其包含SEQ ID NO: 13的胺基酸序列；10個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 2（SEQ ID NO: 98）；包含SEQ ID NO: 94的胺基酸序列的VH；20個胺基酸的連接子序列(GGGGS) 4（SEQ ID NO: 19）；和包含SEQ ID NO: 95的胺基酸序列的VL。
  63. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中在與SEQ ID NO: 7的位置102、103或104相對應的胺基酸位置處的甘胺酸殘基被修飾為半胱胺酸殘基，並且其中在與SEQ ID NO: 3的位置44相對應的胺基酸位置處的甘胺酸殘基被修飾為半胱胺酸殘基。
  64. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該結合分子包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體包含SEQ ID NO: 17的胺基酸序列。
  65. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中該結合分子包含融合多肽的同源二聚體，該同源二聚體包含與SEQ ID NO: 17的胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%或99%相同的胺基酸序列。
  66. 一種結合分子，該結合分子用於在減輕或預防有需要的受試者的疼痛之方法中使用，該方法包括向該受試者投與皮下固定劑量的結合分子，其中該結合分子包含NGF拮抗劑結構域和TNFɑ拮抗劑結構域，其中該NGF拮抗劑結構域係抗NGF抗體或其抗原結合片段，其中該TNFα拮抗劑結構域包含TNFR的可溶性TNFɑ結合片段，並且其中該方法減輕或預防受試者的疼痛。
  67. 一種結合分子，該結合分子用於在如請求項1-65中任一項所述之方法中使用。
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