ES2444012T3

ES2444012T3 - Composiciones y metodos relacionados con anticuerpos de receptores de glucagón

Info

Publication number: ES2444012T3
Application number: ES07852417.0T
Authority: ES
Inventors: Hai Yan; Shaw-Fen Sylvia Hu; Thomas C. Boone; Richard A. Lindberg
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2006-09-20
Filing date: 2007-09-19
Publication date: 2014-02-21
Anticipated expiration: 2027-09-19
Also published as: WO2008036341A2; CR10736A; CN101589062B; NO20091534L; AU2007297652B2; EA200970262A1; CA2662613A1; CL2007002668A1; KR20090059161A; US8158759B2; US20110223160A1; WO2008036341A3; CN101589062A; BRPI0715017A8; MX2009003093A; TW200820985A; AR062895A1; MX353319B; IL197241A0; EP2074149B1

Abstract

Una proteína de unión a antígeno que comprende: a. un dominio variable de cadena ligera que comprende: i. una secuencia CDR1 de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 14; ii. una secuencia CDR2 de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 45 o la SEC ID Nº: 50; iii. una secuencia CDR3 de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 74, y b. un dominio variable de cadena pesada que comprende: i. una secuencia CDR1 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 102; ii. una secuencia CDR2 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 128; iii. una secuencia CDR3 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 169, y en donde la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

Description

Composiciones y métodos relacionados con anticuerpos de receptores de glucagón

5 Campo de la invención

El campo de la presente invención se refiere a composiciones y a métodos relacionados con anticuerpos de receptores de glucagón.

10 Antecedentes de la invención

El glucagón es una hormona de 29 aminoácidos procesada a partir de su proforma en las células alfa pancreáticas por expresión específica celular de la prohormona convertasa 2 (Furuta et al., J. Biol. Chem. 276: 27197-27202 (2001)). Durante el ayuno, la secreción de glucagón aumenta en respuesta a la disminución de los niveles de

15 glucosa. El aumento de la secreción de glucagón estimula la producción de glucosa promoviendo la gluconeogénesis y la glucogenólisis hepática. Por lo tanto el glucagón contrarresta los efectos de la insulina manteniendo normales los niveles normales glucosa en animales.

El receptor de glucagón (GCGR) es un miembro de la subfamilia (familia B) de receptores acoplados a la proteína G

20 (GCGR) de la secretina. La estructura del receptor de glucagón humano se conoce en la técnica anterior al igual que los anticuerpos específicos que se unen al receptor (véase Buggy J. et al., “Human glucagon receptor monoclonal antibodies: Antagonism of glucagon action and use in receptor characterization”. Homone and Metabolic Research vol. 28, nº 5, a996 págs. 215-219; Wright L. M. et al., “Structure of Fab hGR-2 F6, a competitive antagonist of the glucagon receptor”. Acta Crystallograpica Section D, Biologial Crystallography vol 56, nº Pt, 5 de mayo 2000 (2000

25 5), págs. 573-580; documento EP 1 514 932; documento WO 2006/005469)

El receptor de glucagón se expresa predominantemente en el hígado, donde se regula la producción de glucosa hepática y en el riñón, de ahí su función en la gluconeogénesis. La activación de los receptores de glucagón en el hígado estimula la actividad de la adenil ciclasa y la renovación de fosfoinositol que posteriormente dará como

30 resultado la expresión aumentada de enzimas gluconeogénicas incluyendo la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK), la fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPase-1) y la glucosa-6-fosfatasa (G-6-Pase). Además, la señalización del glucagón activa a la glucógeno fosforilasa e inhibe a la glucógeno sintasa.

Estudios realizados han demostrado que niveles más altos de glucagón basal y la falta de supresión de la secreción

35 de glucagón postprandial contribuyen a afecciones diabéticas en seres humanos (Muller et al, N Eng J Med 283:. 109-115 (1970)). El direccionamiento de la producción o función del glucagón puede ser un método de control y disminución de glucemia. Existe una necesidad permanente de proporcionar tratamientos eficaces para la diabetes de tipo 2. La presente invención aborda esta necesidad proporcionando nuevas composiciones y métodos para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 y enfermedades relacionadas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona, entre otras cosas, una proteína de unión a antígeno que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende: una secuencia CDR1 de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 14,

45 una secuencia CDR2 de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 45 o la SEC ID Nº: 50, y una secuencia CDR3 de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 74; y un dominio variable de cadena pesada que comprende: una secuencia CDR1 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 102, una secuencia CDR2 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 128 y una secuencia CD3 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 169, y en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

50 En un aspecto, la proteína de unión a antígeno comprende adicionalmente un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 90 % con la SEC ID Nº: 217, 219 o 229, un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 90 % con la SEC ID Nº: 263, 265 o 275, y una

55 combinación de un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en el cual el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada se seleccionan del grupo de combinaciones que consiste en: un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia que tiene una identidad de al menos 90 % con la SEC ID Nº: 217 y un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia con una identidad de al menos 90 % con la SEC ID Nº: 263; un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia con una identidad

60 de al menos 90 % con la SEC ID Nº: 219 y un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia con una identidad de al menos 90 % con la SEC ID Nº: 265; y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia con una identidad de al menos 90 % con la SEC ID Nº: 229, y un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia con una identidad de al menos 90 % con la SEC ID Nº: 275, en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

65 Específicamente, el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada de la proteína de unión a antígeno puede seleccionarse del grupo de combinaciones que consiste en: un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 217 y un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 263; un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 219 y un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 265; y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 229, y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia como se indica en SEC ID Nº: 275, en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

Esta proteína de unión a antígeno puede comprender adicionalmente la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 305; la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 307; la secuencia constante de cadena pesada de la SEC ID Nº: 309; la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 305 y la secuencia constante de cadena pesada de la SEC ID Nº: 309, o la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 307 y la secuencia constante de cadena pesada de la SEC ID Nº: 309.

La proteína de unión a antígeno de la invención puede seleccionarse del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, un anticuerpo monocatenario, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un fragmento de Fab, un fragmento F (fa')x, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de IgD, un anticuerpo de IgE, un anticuerpo de IgM, un anticuerpo de IgG1, un anticuerpo de lgG2 , un anticuerpo de IgG3, un anticuerpo de IgG4 y un anticuerpo de IgG4 que tiene al menos una mutación en la región bisagra.

Específicamente, la proteína de unión a antígeno de la invención descrita anteriormente puede ser un anticuerpo humano. Este anticuerpo humano puede comprender una cadena ligera que tiene la SEC ID Nº: 312 y una cadena pesada que tiene la SEC ID Nº: 311; o una cadena ligera que tiene la SEC ID Nº: 310 y una cadena pesada que tiene la SEC ID Nº: 311. En la invención también se incluye un hibridoma capaz de producir el anticuerpo humano de la invención.

Cuando la proteína de unión a antígeno de la invención se une al receptor de glucagón humano, también puede unirse al receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma Kd que un anticuerpo de referencia, inhibir la estimulación de glucagón del receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma CI50 que dicho anticuerpo de referencia, o competir en cruzado por la unión con dicho anticuerpo de referencia en el receptor de glucagón humano, en el cual dicho anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 217 y un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 263; un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 219 y un dominio variable de cadena pesada que tiene un secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 265; y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 229, y un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia como se indica en SEC ID Nº: 275.

La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígeno de la invención en mezcla con un transportador farmacéuticamente aceptable del mismo.

También se incluye un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena pesada, o ambos, de la proteína de unión a antígeno de la invención. El polinucleótido que codifica este ácido nucleico puede incluir la secuencia de cadena ligera seleccionada de la SEC ID Nº: 216, 218 y 228; y la secuencia de cadena pesada seleccionada de la SEC ID Nº: 262, 264 y 274. También se incluye un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico descrito anteriormente y una célula hospedadora que comprende este vector.

La invención también proporciona un método para producir una proteína de unión a antígeno que se une específicamente al receptor de glucagón humano que comprende incubar la célula hospedadora descrita anteriormente en condiciones que permitan que esta exprese la proteína de unión a antígeno.

La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígeno de la invención en mezcla con un transportador farmacéuticamente aceptable del mismo. La proteína de unión a antígeno de la invención o la composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígeno puede usarse para disminuir la glucosa en sangre, mejorar la tolerancia a glucosa, o prevenir o tratar la diabetes tipo 2 o un trastorno relacionado en un sujeto que necesite dicho tratamiento. El trastorno relacionado puede ser hiperglucemia, glucemia basal alterada, tolerancia alterada a glucosa, dislipidemia, o síndrome metabólico.

La invención también proporciona un kit para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 que comprende la composición farmacéutica descrita anteriormente.

También se describe una proteína de unión a antígeno aislada que comprende cualquiera de: a. una CDR3 de cadena ligera que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: i. una secuencia CDR3 de cadena ligera que difiere en no más de un total de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias CDR3 de cadena ligera de L1-L23, SEC ID Nos : 72; 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 100; ii. L Q X21 N S X22 P L T (SEC ID Nº: 208), iii. Q A W D S X23 T V X24 (SEC ID Nº: 209); y b. una secuencia CDR3 de cadena pesada que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: i. una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en no más de un total de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste en las secuencias CDR3 de cadena pesada de H1-H23, SEC ID Nº: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199; ii. E X25 X26 X27 YD I L T G Y X28 X29 Y Y G X30 D V (SEC ID Nº: 210) iii. X31, G G G F D Y (SEC ID Nº: 211); o c. la secuencia CDR3 de cadena ligera de (a) y la secuencia CDR3 de cadena pesada de (b); en la cual, X21 es un resto de histidina, o un resto de glutamina, X22 es un resto de asparagina, un resto de aspartato, o un resto de tirosina, X23 es un resto de asparagina o un resto de serina, X24 es un resto de isoleucina o un resto de valina, X25 es un resto de lisina, un resto de glutamato, o un resto de prolina, X26 es un resto de aspartato, un resto de treonina, un resto de glutamina, o un resto de prolina, X27 es un resto de histidina o un resto de tirosina, X28 es un resto de asparagina, un resto de histidina, un resto de aspartato o un resto de fenilalanina, X29 es un resto de tirosina, un resto de histidina, o un resto de asparagina, X30 es un resto de leucina

o un resto de metionina, X31 es un resto de leucina o un resto de metionina, en la cual dicha proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En otro aspecto, la proteína de unión aislada comprende adicionalmente una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: i. una CDR1 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L23, SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 41, ii. RSX1, Q SLDX2 X3D G T Y TL D (SECID Nº: 200); iii. RASQ X4IRND X5G (SECID Nº: 201); yiv. SG DKL G DKYX6 C (SEC ID Nº: 202); en la cual X1 es un resto de serina o un resto de treonina, X2 es un resto de arginina o un resto de serina, X3 es un resto de aspartato o un resto de alanina, X4 es un resto de glicina o un resto de aspartato, X5 es un resto de leucina o un resto de fenilalanina, X6 es un resto de valina o un resto de alanina, b. una secuencia CDR2 de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: i. una CDR2 de cadena ligera que difiere en no más de dos adiciones de sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de LI-L23, SEC ID Nos: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70; ii. A A S D L X9 S (SEC ID Nº: 204); y iii. Q X10 X11 K R P S (SEC ID Nº: 205); en la cual X9 es un resto de glutamina o un resto de glutamato, X10 es un resto de serina o un resto treonina, X11 es un resto de treonina, o un resto de serina; c. una secuencia CDR1 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: i. una CDR1 de cadena pesada que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H23, SEC ID Nos: 102, 104, 106, 108 , 111, 113, 115, 117, 118, 120 y 122, ii. X7 Y X8 M H (SEC ID Nº: 203) en la cual X7 es un resto de serina o un resto treonina, X8 es un resto de glicina o un resto de aspartato; y d. una CDR2 de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: i. una secuencia pesada que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H23, SEC ID Nos: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; ii. X12 IW X13 D G S X14 K Y Y X15 D S V K G (SECID Nº: 206); y iii. X16IS X17D G S X18 KY X19 X20 D S V KG (SEC ID Nº: 207); en la cual X12 es un resto de serina, un resto de fenilalanina, un resto de valina o un resto de glutamato, X13 es un resto de tirosina o un resto de asparagina, X14 es un resto de asparagina o un resto de glutamato, X15 es un resto de valina o un resto de alanina X16 es un resto de valina o un resto de fenilalanina, X17 es un resto de histidina, o un resto de aspartato, o un resto de tirosina, X18 es un resto de aspartato, un resto de asparagina, o un resto de histidina, X19 es un resto de tirosina, o un resto de serina, X20 es un resto de alanina o un resto de glicina; en la cual dicha proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En un aspecto adicional, la proteína de unión aislada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L23, SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 41; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que difiere en no más de una adición, sustitución y/o deleción de aminoácido de una secuencia CDR2 de L1-L23, SEC ID Nos: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L23, SEC ID Nos: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 y 100; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que difiere en no más de una adición, sustitución y/o deleción de aminoácido de una secuencia CDR1 de H1-H23, SEC ID Nos 102 , 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 y 122; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H23, SEC ID Nos: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H23, SEC ID Nos: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 y 199, en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En un aspecto adicional, la proteína de unión aislada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que difiere en no más de una adición, sustitución y/o deleción de aminoácido de una secuencia CDR1 de L1-L23, SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 41; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera de L1-L23, SEC ID Nº: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que difiere en no más de una adición, sustitución y/o deleción de aminoácido de una secuencia CDR3 de L1-L23, SEC ID Nos : 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 y 100; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada de H1-H23, SEC ID Nos: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 y 122; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere en no más de una adición , sustitución y/o deleción de aminoácido de una secuencia CDR2 de H1-H23, SEC ID Nos: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H23, SEC ID Nos: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 y 199, en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano

En un aspecto adicional, la proteína de unión aislada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera de L1-L23, SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 41; b. una secuencia CDR3 de cadena ligera de L1-L23, SEC ID Nos: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 y 100; c. una secuencia CDR2 de cadena pesada de H1-H23, SEC ID Nos: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; y d. una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en no más de una adición, sustitución y/o deleción de aminoácido de una secuencia CDR3 de H1-H23, SEC ID Nos: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 y 199, en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En otro aspecto adicional, la proteína de unión aislada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: una secuencia CDR3 de cadena pesada de H1-H23, SEC ID Nos: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 y 199, en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En otro aspecto, la proteína de unión aislada comprende dos secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L23, SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 41; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L23, SEC ID Nos: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L23, SEC ID Nos: 72 , 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 y 100; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H23, SEC ID Nos: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 y 122; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H23, SEC ID Nos: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163, y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en no más de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H23, SEC ID Nos: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 y 199, en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En otro aspecto, la proteína de unión aislada comprende tres secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L23, SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 41; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L23, SEC ID Nos: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L23, SEC ID Nos: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 y 100; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H23, SEC ID Nos: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 y 122; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H23, SEC ID Nos: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en no más de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H23, SEC ID Nos: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 y 199; en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En otro aspecto, la proteína de unión aislada comprende cuatro secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L23, SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 41; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L23, SEC ID Nos: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L23, SEC ID Nos: 72, 74, 76, 78, 80 , 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 y 100; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H23, SEC ID Nos: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 y 122; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de una aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H23, SEC ID Nos: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en no más de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H23, SEC ID Nos: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 y 199, en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano. En otro aspecto, la proteína de unión aislada comprende cinco secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L23, SEC ID Nos: 10, 12, 14,16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 41; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L23, SEC ID Nos: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L23, SEC ID Nos: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 y 100; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H23, SEC ID Nos: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117 , 118, 120 y 122; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H23, SEC ID Nos: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en no más de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H23, SEC ID Nos: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, y 199 en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En otro aspecto, la proteína de unión aislada comprende: a. una secuencia CDR1 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de L1-L23, SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 41; b. una secuencia CDR2 de cadena ligera que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones y/o deleciones aminoácidos de una secuencia CDR2 de L1-L23, SEC ID Nos: 43, 45 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70; c. una secuencia CDR3 de cadena ligera que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de L1-L23, SEC ID Nos: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 y 100; d. una secuencia CDR1 de cadena pesada que difiere en no más de dos adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR1 de H1-H23, SEC ID Nos: 102, 104, 106, 108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 y 122; e. una secuencia CDR2 de cadena pesada que difiere en no más de tres adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR2 de H1-H23, SEC ID Nos: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; y f. una secuencia CDR3 de cadena pesada que difiere en no más de cuatro adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR3 de H1-H23, SEC ID Nos: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197 y 199, en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno aislada comprende cualquiera de: a. un dominio variable de cadena ligera que comprende i. una secuencia CDR1 de cadena ligera seleccionada de la SEC ID Nos: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 y 41; ii. una secuencia CDR2 de cadena ligera seleccionada de la SEC ID Nos: 43, 45, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68 y 70, y iii. una secuencia CDR3 de cadena ligera seleccionada de la SEC ID Nos: 72, 74, 76, 78, 80, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97 y 100; b. un dominio variable de cadena pesada que comprende: i. una secuencia CDR1 de cadena pesada seleccionada de la SEC ID Nos: 102, 104, 106,108, 111, 113, 115, 117, 118, 120 y 122; ii. una secuencia CDR2 de cadena pesada seleccionada de la SEC ID Nos: 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 y 163; y iii. una secuencia CDR3 de cadena pesada seleccionada de la SEC ID Nos: 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187 189, 191, 193, 195, 197 y 199; o c. el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b), en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En otro aspecto, la proteína de unión a antígeno aislada comprende cualquiera de: a. una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: i. aminoácidos que tienen una secuencia al menos 80 % idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada de L1-L23, SEC ID Nos: 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255 y 257;

ii. una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótidos que es al menos 80 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de dominio variable de cadena ligera de L1-L23, SEC ID Nos: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254 y 256; iii. una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótidos que se hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con el complemento de un polinucleótido que consiste en una secuencia de dominio variable de cadena ligera de L1-L23 de la SEC ID Nos: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254 y 256; b. una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en: i. una secuencia de aminoácidos que es al menos 80 % idéntica a una secuencia de dominio variable de cadena pesada de H1-H23 de la SEC ID Nos: 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301 y 303; ii. una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótidos que es al menos 80 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de dominio variable de cadena pesada de H1-H23, SEC ID Nos: 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300 y 302; iii. una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de polinucleótidos que se hibrida en condiciones moderadamente rigurosas con el complemento de un polinucleótido que consiste en una secuencia de dominio variable de cadena pesada de H1-H23, SEC ID Nos: 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300 y 302; o c. el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b), en la cual dicha proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.

En una realización, la proteína de unión a antígeno aislada comprende cualquiera de: a. una secuencia de dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en: L1-L23 de la SEC ID Nos: 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255 y 257; b. una secuencia de dominio variable de cadena pesada seleccionada el grupo que consiste en: H1-H23 de la SEC ID Nos: 259, 261, 263, 265 , 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297 299, 301 y 303; o c. el dominio variable de cadena ligera de (a) y el dominio variable de cadena pesada de (b) en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al glucagón humano.

En otra realización, la proteína de unión a antígeno aislada comprende una combinación de un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo de combinaciones que consiste en: L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 y L23H23, en la cual la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano. En una realización, la proteína de unión a antígeno aislada comprende adicionalmente: la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 305; la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 307; la secuencia constante de cadena pesada de la SEC ID Nº: 309; la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 305 y la secuencia constante de cadena pesada de la SEC ID Nº: 309; o la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 307 y la secuencia constante de cadena pesada de la SEC ID Nº: 309.

En un aspecto, la proteína de unión a antígeno aislada se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un policlonal, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo de unión a antígeno, un anticuerpo monocatenario, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un fragmento Fab, un fragmento F(fa')x, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de IgD, un anticuerpo de IgE, un anticuerpo de IgM, un anticuerpo de IgG1, un anticuerpo de IgG2, un anticuerpo de IgG3, un anticuerpo de IgG4 y un anticuerpo de IgG4 que tiene al menos una mutación en la región bisagra que atenúa una tendencia a formar enlaces disulfuro intracatenarios-H. En una realización, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo humano.

En otro aspecto, cuando la proteína de unión a antígeno aislada se une al receptor de glucagón humano: a. se une al receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma Kd que un anticuerpo de referencia; b. inhibe la estimulación de glucagón del receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma CI50 que dicho anticuerpo de referencia, o c. compite por la unión con dicho anticuerpo de referencia, en la cual dicho anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L11H11, L12H12, L13H13, L15H15, L21H21 y L22H22.

En otro aspecto, se describe un anticuerpo humano aislado que, cuando se une al receptor de glucagón humano: a. se une al receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma Kd que un anticuerpo de referencia; b. inhibe la estimulación de glucagón del receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma CI50 que dicho anticuerpo de referencia, o c. compite por la unión con dicho anticuerpo de referencia, en el cual dicho anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, A-7, A-8, A-9, A-11, A-12, A-13, A-15, A-21 y A-22.

En otro aspecto, se describe un anticuerpo humano aislado que, cuando se une al receptor de glucagón humano: a. se une específicamente de Ser80 a Ser119 del receptor de glucagón humano; b. reduce la señalización de glucagón con un valor CI50 de 90 nM o menor; c. disminuye la glucosa en sangre en un modelo animal; d. tanto a y b, o e, tanto a, b y c. En una realización, el modelo animal es el modelo animal ob/ob.

En otro aspecto, se describe una composición farmacéutica que comprende las proteínas de unión a antígeno en mezcla con un transportador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo humano aislado en mezcla con un transportador farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, se describe una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica el dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena pesada, o ambos, de una proteína de unión a antígeno de la invención. En una realización, el polinucleótido comprende una secuencia de polinucleótidos de dominio variable de cadena ligera L1-L23, SEC ID Nos: 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254 y 256, una secuencia de polinucleótidos de dominio variable de cadena pesada H1-H23, SEC ID Nos: 258, 260, 262, 264, 266, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302 o ambas.

También se describen vectores que comprenden los polinucleótidos descritos. En una realización, el vector es un vector de expresión. También se describe una célula hospedadora que comprende el vector. También se describe un hibridoma capaz de producir la proteína de unión a antígeno de la invención. Adicionalmente se describe un método para fabricar la proteína de unión a antígeno de la presente invención que comprende cultivar la célula hospedadora en condiciones que permitan que la célula exprese la proteína de unión a antígeno de la invención.

También se describe un método de disminución de glucosa en sangre en un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones farmacéuticas. También se describe un método para mejorar la tolerancia a la glucosa en un sujeto que lo necesite que comprende administrar al sujeto una dosificación terapéuticamente eficaz de las composiciones farmacéuticas. También se describe un método para prevenir o tratar la diabetes de tipo 2 o trastornos relacionados en un sujeto que lo necesite administrando al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de las composiciones farmacéuticas. En una realización, el sujeto es un sujeto humano. En otra realización, el trastorno relacionado se selecciona de hiperglucemia, glucosa basal alterada, tolerancia alterada a glucosa, dislipidemia y síndrome metabólico. También se describe el uso de las composiciones farmacéuticas desveladas en la preparación de un medicamento útil para la disminución de la glucosa en sangre, prevención o tratamiento de la diabetes tipo 2 y trastornos relacionados incluyendo hiperglucemia, glucosa basal alterada, tolerancia alterada a glucosa, dislipidemia y síndrome metabólico.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra niveles de glucosa en sangre de ratones ob/ob macho de 14 semanas de vida después de una sola inyección de anticuerpo A-3 o anticuerpo A-4 en comparación con tampón, a una dosis de 1 o 3 mg/kg (n = 10 animales/grupo). La glucosa en sangre se midió en el momento 0 y 24, 48, 96, 120, 144, 192 y 240 horas después de la inyección.

La Figura 2 muestra niveles de glucosa en sangre de ratones ob/ob macho de 14 semanas de vida después de una sola inyección de anticuerpo A-3, o anticuerpo A-9 en comparación con tampón a una dosis de 1 o 3 mg/kg, (n = 10 animales/grupo). La glucosa en sangre se midió en el momento 0 y 24, 72, 120, 192 y 240 horas después de la inyección.

La Figura 3 muestra los resultados de un ensayo de tolerancia a glucosa oral (GTT, Glucose Tolerance Test) mostrando los niveles bajo la curva (ABC) de glucosa antes de (GTT1 y GTT2) y después (GTT3, 4 y 5) de una sola inyección subcutánea de vehículo o anticuerpo 9 (A9).

La Figura 4 muestra anticuerpos no marcados capaces de competir por la unión con el anticuerpo A-3 marcado (anticuerpos superables).

La Figura 5 muestra anticuerpos no marcados capaces de competir parcialmente por la unión con el anticuerpo A-3 marcado (anticuerpos parcialmente superables).

La Figura 6 muestra anticuerpos no marcados incapaces de competir por la unión con el anticuerpo A-3 marcado (anticuerpos insuperables).

La Figura 7 muestra los resultados de los estudios de unión de cuatro anticuerpos anti-GCGR contra receptores quiméricos construidos a partir del GCGR y de receptores de GLP-1 humano, como se indica.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígeno tales como anticuerpos que se unen específicamente al receptor de glucagón humano (GCGR). Estas incluyen proteínas de unión a antígeno que inhiben o bloquea la unión de glucagón al GCGR humano, y reducen la señalización de glucagón a través del receptor. En una realización, se proporcionan anticuerpos humanos que incluyen anticuerpos antagonistas capaces de disminuir la glucosa en sangre en modelos animales. Las proteínas de unión a antígeno son útiles para el tratamiento de la diabetes y de enfermedades relacionadas.

La presente invención proporciona adicionalmente composiciones, kits y métodos relacionados con las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente al receptor de glucagón humano. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico, y derivados y fragmentos de los mismos, que comprenden una secuencia de polinucleótidos que codifican todo o parte de un polipéptido que se une al receptor de glucagón, tal como un ácido nucleico que codifica todo o parte de un anticuerpo anti-receptor de glucagón, un fragmento de anticuerpo, o un derivado de anticuerpo. La presente invención proporciona adicionalmente vectores y plásmidos que comprenden dichos ácidos nucleicos y células o líneas de celulares que comprenden dichos ácidos nucleicos y/o vectores y plásmidos. Los métodos proporcionados incluyen, por ejemplo, métodos para fabricar, identificar o aislar proteínas de unión a antígeno que se unen al GCGR humano, tales como anticuerpos anti-GCGR, métodos para determinar si una proteína de unión a antígeno se une al GCGR, métodos para fabricar composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden una proteína de unión a antígeno que se une al GCGR humano, y métodos para administrar a un sujeto una proteína de unión a antígeno que se une al GCGR, por ejemplo, métodos para tratar una afección mediada por GCGR, y para modular una actividad biológica asociada con la señalización de glucagón in vivo o in vitro.

Definiciones

Las secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos se indican usando abreviaturas convencionales de una o tres letras. A menos que se indique otra cosa, las secuencias de polipéptidos tienen sus extremos amino a la izquierda y sus extremo carboxilo a la derecha, y las secuencias de ácido nucleico monocatenario, y la cadena superior de las secuencias de ácido nucleico bicatenario, tienen sus extremos 5’ a la izquierda y sus extremos 3’ a la derecha. Una sección particular de un polipéptido puede denominarse por el número de resto de aminoácido tal como aminoácidos 80 a 119, o por el resto real en ese sitio tal como de Ser80 a Ser119. Una secuencia de polipéptidos o de polinucleótidos también puede describirse explicando cómo se diferencia de una secuencia de referencia. Las secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos de dominios variables de cadena pesada y ligera particular se denominan L1 (“dominio variable de cadena ligera 1”), H1 (“dominio variable de cadena pesada 1”). Las proteínas de unión a antígeno o los anticuerpos que comprenden una cadena ligera y una cadena pesada se indican combinando el nombre de los dominios variables de la cadena ligera y el nombre de los dominios variables de la cadena pesada. Por ejemplo, “L4H7”, indica un anticuerpo que comprende el dominio variable de cadena ligera de L4 y el dominio variable de cadena pesada de H7.

A menos que se defina de otra manera en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados normalmente comprendidos por los expertos habituales en la materia. Adicionalmente, a menos que lo requiera el contexto de otra manera, los términos en singular incluirán el plural y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y de ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y normalmente usadas en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente invención se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, como normalmente se realizan en la técnica o como se describe en el presente documento. La terminología usada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritos en el presente documento son los bien conocidos y normalmente usados en la técnica. Pueden usarse técnicas convencionales para la síntesis química, el análisis químico, las preparaciones farmacéuticas, formulación, administración y tratamiento de pacientes.

A menos que se indique otra cosa, se entenderá que las siguientes expresiones tienen los siguientes significados: la expresión “molécula aislada” (en la cual la molécula es, por ejemplo, un polipéptido, un polinucleótido o un anticuerpo) es una molécula que, en virtud de su origen o fuente de procedencia (1) no está asociada con componentes naturalmente asociados que la acompañan en su estado nativo, (2) está sustancialmente libre de otras moléculas de la misma especie (3) se expresa por una célula de diferente especie, o (4) no se produce en la naturaleza. Por tanto, una molécula que se sintetiza químicamente, o que se expresa en un sistema celular diferente al de la célula de la que se origina naturalmente, estará “aislada” de sus componentes naturalmente asociados. Mediante aislamiento, una molécula también puede liberarse sustancialmente de componentes con los que está asociada de manera natural, usando técnicas de purificación bien conocidas en la materia. La pureza u homogeneidad de una molécula puede ensayarse mediante diversos medios bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la pureza de una muestra polipeptídica puede ensayarse usando electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción del gel para visualizar el polipéptido usando técnicas bien conocidas en la materia. Para determinados fines, puede proporcionarse mayor resolución usando HPLC u otros medios de purificación bien conocidos en la materia.

Los términos “inhibidor de glucagón” y “antagonistas de glucagón” se usan indistintamente. Cada uno es una molécula que inhibe de manera detectable la señalización de glucagón. La inhibición producida por un inhibidor no necesita ser completa siempre que sea detectable usando un ensayo. Por ejemplo, el ensayo basado en células descrito más adelante en el Ejemplo 4 demuestra un ensayo útil para determinar la inhibición de la señalización de glucagón.

Cada uno de los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” se refiere a una molécula que comprende dos o más restos de aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Estos términos incluyen, por ejemplo, proteínas, fragmentos de proteínas y análogos de polipéptidos (tales como muteínas, variantes y proteínas de fusión) naturales y artificiales de una secuencia de proteína, así como proteínas modificadas postraduccionalmente, o de otro modo, de manera covalente o no covalente. Un péptido, un polipéptido o una proteína puede ser monomérico(a) o polimérico(a)

La expresión “fragmento polipeptídico” como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxi-terminal en comparación con una proteína correspondiente de longitud completa. Los fragmentos pueden tener, por ejemplo, una longitud de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150 o 200 aminoácidos. Los fragmentos, también pueden tener una longitud de, por ejemplo, a lo sumo 1000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11 o 10 aminoácidos. Además, un fragmento puede comprender, en cualquiera de sus extremos o en ambos extremos, uno

o más aminoácidos adicionales, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de una proteína diferente de origen natural (por ejemplo, un dominio de cremallera de leucina o Fc) o una secuencia de aminoácidos artificial (por ejemplo, una secuencia conectora artificial).

Los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos que se han modificado de cualquier manera y por cualquier razón, por ejemplo, para: (1) reducir la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducir la susceptibilidad a la oxidación, (3) alterar la afinidad de unión para formar complejos de proteínas, (4) alterar las afinidades de unión y (4) conferir modificar otras propiedades fisicoquímicas o funcionales. Los análogos incluyen muteínas de un polipéptido. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones sencillas o múltiples de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (por ejemplo, en la parte del polipéptido fuera del dominio (o dominios) que forma contactos intermoleculares). Una “sustitución de aminoácido conservativa” es una que no cambia sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un reemplazo de aminoácido no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia parental, o a desestabilizar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia parental o que son necesarios para su funcionalidad). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W.H. Freeman and Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds, Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y en Thornton et al. Nature 354:105 (1991).

La presente invención también proporciona análogos no peptídicos de proteínas de unión a antígeno de GCGR. Normalmente los análogos no peptídicos se usan para proporcionar fármacos con propiedades análogas a las del péptido molde. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan “miméticos peptídicos” o “peptidomiméticos”. Fauchere, J. Adv. Drug. Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger TINS pág. 392 (1985) y Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Los miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden usarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (por ejemplo, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o una actividad farmacológica deseada), tal como un anticuerpo humano, pero que tiene uno o más enlaces peptídicos opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste en: --CH2NH--, -CH2S--, --CH2--CH2--,--CH=CH-(cis y trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2--y --CH2SO--, por métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso con un Daminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) también puede usarse para generar péptidos más estables. Además, pueden generarse péptidos limitados que comprenden una secuencia consenso o una secuencia consenso sustancialmente idéntica por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), por ejemplo, añadiendo restos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.

Una “variante” de un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en la cual uno o más restos de aminoácidos están insertados en, delecionados de y/o sustituidos en, la secuencia de aminoácidos con respecto a otra secuencia polipeptídica. Las variantes de la invención incluyen proteínas de fusión.

Un “derivado” de un polipéptido es un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que se ha sido modificado químicamente, por ejemplo, mediante conjugación con otro resto químico tal como, por ejemplo, polietilenglicol, albúmina (por ejemplo, seroalbúmina humana), fosforilación y glucosilación. A menos que se indique de otra manera, el término “anticuerpo” incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y muteínas de los mismos, cuyos ejemplos se describen más adelante.

Una “proteína de unión a antígeno” es una proteína que comprende una parte que se une a un antígeno y, opcionalmente, una parte armazón o región marco conservada que permite que la parte de unión a antígeno adopte una conformación que promueve la unión de la proteína de unión a antígeno con el antígeno. Los ejemplos de proteínas de unión a antígeno incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, una parte de unión a antígeno de un anticuerpo), derivados de anticuerpos y análogos de anticuerpos. La proteína de unión a antígeno puede comprender, por ejemplo, un armazón de proteína alternativo o un armazón artificial con las CDR o derivados de las CDR injertados. Dichos armazones incluyen, pero sin limitación, armazones derivados de anticuerpos que comprenden mutaciones introducidas para, por ejemplo, estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de unión a antígeno, así como armazones completamente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible. Véase, por ejemplo, Korndorfer et al, 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Publicación 1:121-129; Roque et al, 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Además, pueden usarse miméticos de anticuerpos peptídicos (“MAP”), así como armazones basados en miméticos de anticuerpos usando componentes fibroconectores como un armazón.

Una proteína de unión a antígeno puede tener, por ejemplo, la estructura de una inmunoglobulina de origen natural. Una “inmunoglobulina” es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” (de aproximadamente 50-70 kDa). La parte amino -terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 aminoácidos o más, principalmente responsables del reconocimiento antigénico. La parte carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de funciones efectoras. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variables y constantes se unen mediante una región “J” de aproximadamente 12 aminoácidos o más, incluyendo también la cadena pesada una región “D” de aproximadamente 10 aminoácidos más. Véase, en líneas generales, Fundamental Immunology Cp. 7 (Paul, W., ed., 2ª ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo de tal manera que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión.

Las cadenas de inmunoglobulina de origen natural presentan la misma estructura general de regiones marco (FR, Framework Regions) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Desde el extremo N al extremo C, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FR1, CDR1 FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio se realiza de acuerdo con las definiciones de Kabat et al. en Sequences of Protein of Immunological Interest 5ª Ed., US Dep.. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicación Nº 91-3242, 1991.

Un “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una parte de unión a antígeno de la misma que compite con el anticuerpo intacto por la unión específica, salvo que se especifique de otra manera. Las partes de unión a antígeno pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las partes de unión a antígeno incluyen, entre otros, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio (dAb), fragmentos que incluyen regiones determinantes de la complementariedad (CDR), anticuerpos monocatenarios (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y polipéptidos que contienen al menos una parte de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir la unión a antígeno específica al polipéptido.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd tiene los dominios VH y CH1; un fragmento Fv tiene los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb tiene un dominio VH, un dominio VL, o un fragmento de unión a antígeno de un dominio VH o VL (Patente de Estados Unidos, Nº 6.846.634 y 6.696.245, Solicitud de Estados Unidos Publicada Nº 05/ 0202512, 04/0202995, 04/0038291, 04/0009507, 03/0039958, Ward et al., Nature 341:544-546, 1989).

Un anticuerpo monocatenario (scFv) es un anticuerpo en el cual una región VL y una región VH están unidas mediante un engarce (por ejemplo, una secuencia sintética de restos de aminoácidos) para formar una cadena de proteína continua en la cual el engarce es lo suficientemente largo como para permitir que la cadena de proteína se pliegue hacia atrás sobre sí misma y forme un sitio de unión a antígeno monovalente (véase, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242:423-26 y Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83). Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada cadena polipeptídica dominios VH y VL unidos por un engarce que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios de la misma cadena, permitiendo de esta manera que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otra cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci.. USA 90:6444-48, y Poljak et al., 1994, Structure 2:1121-23). Si las dos cadenas polipeptídicas de un diacuerpo son idénticas, entonces un diacuerpo resultante de su emparejamiento tendrá dos sitios de unión a antígeno idénticos. Pueden usarse cadenas polipeptídicas que tienen secuencias diferentes para preparar un diacuerpo con dos sitios de unión a antígeno diferentes. De manera similar, los triacuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes.

Las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y las regiones marco (FR) de un anticuerpo determinado puede identificarse usando el sistema descrito por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., Dep. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publicación Nº 91-3242, 1991. Pueden incorporarse una o más CDR en una molécula de manera covalente o no covalente para preparar una proteína de unión a antígeno. Una proteína de unión a antígeno puede incorporar la CDR (o las CDR) como parte de una cadena polipeptídica más larga, puede unir covalentemente la CDR (o las CDR) a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar la CDR (o las CDRs) de manera no covalente. Las CDR permiten que la proteína de unión a antígeno se una específicamente a un antígeno de interés particular.

Una proteína de unión a antígeno puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos o diferentes entre sí. Por ejemplo, una inmunoglobulina humana de origen natural típicamente tiene dos sitios de unión idénticos, mientras que un anticuerpo “biespecífico” o “bifuncional” tiene dos sitios de unión diferentes.

La expresión “anticuerpo humano” incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana. En una realización, todos los dominios constantes y variables derivan de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo completamente humano). Estos anticuerpos pueden prepararse de diversos modos, más adelante se describen ejemplos de estos, incluyendo a través de inmunización con un antígeno de interés de un ratón que está modificado genéticamente para expresar anticuerpos derivados de genes que codifican la cadena pesada y/o ligera humana.

Un anticuerpo humanizado tiene una secuencia que difiere de la secuencia de un anticuerpo derivado de una especie no humana en una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos, de tal manera que es menos probable que el anticuerpo humanizado induzca una respuesta inmunitaria y/o induzca una respuesta inmunitaria menos grave, en comparación con el anticuerpo de especies no humanas, cuando se administra a un sujeto humano. En una realización, determinados aminoácidos en la región marco y en los dominios constantes de las cadenas pesadas y/o ligeras del anticuerpo de especies no humanas están mutados para producir el anticuerpo humanizado. En otra realización, el dominio (o dominios) constante de un anticuerpo humano se fusiona con el dominio (o dominios) variable de una especie no humana. En otra realización, uno o más restos de aminoácidos en una o más secuencias CDR de un anticuerpo no humano se cambian para reducir la posible inmunogenicidad del anticuerpo no humano cuando se administra a un sujeto humano, en el cual cualquiera de los restos de aminoácidos cambiados no son críticos para la unión inmunoespecífica del anticuerpo con su antígeno, o los cambios que se realizan en la secuencia de aminoácidos son cambios conservativos, de tal manera que la unión del anticuerpo humanizado con el antígeno no es significativamente peor que la unión del anticuerpo no humano con el antígeno. Pueden encontrarse ejemplos de cómo preparar anticuerpos humanizados en las patentes de Estados Unidos Nos 6.054.297, 5.886.152 y 5.877.293.

La expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno u más anticuerpos distintos. En una realización, una o más de las CDR derivan de un anticuerpo anti-GCGR humano. En otra realización, todas las CDR derivan de un anticuerpo anti-GCGR humano. En otra realización, las CDR de más de un anticuerpo anti-GCGR humano se mezclan y se emparejan con un anticuerpo quimérico. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede comprender una CDR1 de la cadena ligera de un primer anticuerpo anti-GCGR humano, una CDR2 y una CDR3 de la cadena ligera de un segundo anticuerpo anti-GCGR humano, y las CDR de la cadena pesada de un tercer anticuerpo anti-GCGR. Adicionalmente, las regiones marco pueden derivar de uno de los mismos anticuerpos anti-GCGR, de uno o más anticuerpos diferentes, tal como un anticuerpo humano, o de un anticuerpo humanizado. En un ejemplo de un anticuerpo quimérico, una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica a, homóloga a, o deriva de, un anticuerpo de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase particular, mientras que el resto de la cadena (o cadenas) es idéntico a, homólogo a, o derivado de un anticuerpo o anticuerpos de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. También se incluyen fragmentos de dichos anticuerpos que presentan la actividad biológica deseada (es decir, la capacidad de unirse específicamente al receptor de glucagón humano).

Un “anticuerpo neutralizante” o “anticuerpo inhibidor” se refiere a un anticuerpo que inhibe la unión del glucagón al receptor de glucagón humano, y/o inhibe o reduce la señalización de glucagón, como se determina, por ejemplo, mediante el ensayo basado en células descrito más adelante en el Ejemplo 4. No es preciso que la inhibición sea completa y, en una realización, puede reducir la unión o la señalización al menos un 20 %. En otras realizaciones, la reducción en la unión o señalización es de al menos 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % y 99,9 %.

Un experto habitual en la materia puede preparar fácilmente fragmentos o análogos de anticuerpos siguiendo las enseñanzas de esta memoria descriptiva y usando técnicas bien conocidas en la materia. Los extremos amino y carboxilo preferidos de fragmentos o análogos se producen cerca de los límites de dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales pueden identificarse por comparación de los datos de las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos con las bases de datos de secuencias públicas o de patente. Pueden usarse métodos de comparación informatizados para identificar motivos de secuencias o dominios de conformación de proteína previstos que se producen en otras proteínas de estructura y/o función conocidas. Se conocen métodos para identificar secuencias de proteínas que se pliegan en una estructura tridimensional conocida. Véase, por ejemplo, Bowie et al., 1991, Science 253:164.

Un “anticuerpo con CDR injertada” es un anticuerpo que comprende una o más CDR derivadas de un anticuerpo de una especie o isotipo particular y la región marco de otro anticuerpo de la misma o diferente especie o isotipo.

Un “anticuerpo multiespecífico” es un anticuerpo que reconoce más de un epítopo en uno o más antígenos. Una subclase de este tipo de anticuerpo es un “anticuerpo biespecífico” que reconoce dos epítopos distintos en el mismo antígeno o en diferentes antígenos.

Una proteína de unión a antígeno, incluyendo un anticuerpo, “se une específicamente” a un antígeno, tal como el receptor de glucagón humano, si éste se une al antígeno con una alta afinidad de unión, como se determina por un valor de la constante de disociación (Kd , o correspondiente Kb, como se define más adelante) de 10-7 M o menor (100 nM o menor). Una proteína de unión a antígeno que se une específicamente al receptor de glucagón humano puede unirse a receptores de glucagón de otras especies también con la misma afinidad o con diferente afinidad.

Un “dominio de unión a antígeno”, una “región de unión a antígeno”, o un “sitio de unión a antígeno” es una parte de una proteína de unión a antígeno que contiene restos de aminoácidos (u otras fracciones) que interacciona con un antígeno y que contribuye a la especificidad de la proteína de unión a antígeno y afinidad por el antígeno. Para un anticuerpo que se une específicamente con su antígeno, esto incluirá al menos parte de al menos uno de sus dominios CDR.

Un “epítopo” es la parte de una molécula que está unida por una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, por un anticuerpo). Un epítopo puede comprender partes no contiguas de la molécula (por ejemplo, en un polipéptido, restos de aminoácidos que no son contiguos en la secuencia primaria del polipéptido pero que, en el contexto de la estructura terciaria y cuaternaria del polipéptido, están lo suficiente cerca entre sí para unirse mediante una proteína de unión a antígeno).

El “porcentaje de identidad” de dos polinucleótidos o de dos secuencias de polipéptidos se determina comparando las secuencias usando el programa informático GAP (una parte del paquete GCG Wisconsin, versión 10.3 (Accelrys, San Diego, CA)) usando sus parámetros por defecto.

Los términos “polinucleótido”, “oligonucleótido” y “ácido nucleico” se usan siempre indistintamente e incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNC o ADN genómico), moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm), análogos del ADN o ARN generados usando análogos nucleotídicos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos y análogos nucleotídicos de origen no natural), y sus híbridos. La molécula de ácido nucleico puede ser bi-o mono-catenaria. En una realización, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden una pauta abierta de lectura contigua que codifica un anticuerpo, o un fragmento, un derivado, una muteína, o una variante de los mismos de la invención.

Dos polinucleótidos monocatenarios son “el complemento” del otro si sus secuencias pueden alinearse en una orientación antiparalela, de tal manera que cada nucleótido en un polinucleótido es opuesto a su nucleótido complementario en el otro polinucleótido, sin la introducción de huecos y sin nucleótidos desparejados en el extremo 5' o en el extremo 3' de cualquier secuencia. Un polinucleótido es “complementario” a otro polinucleótido si los dos polinucleótidos pueden hibridarse entre sí en condiciones moderadamente rigurosas. Por tanto, un polinucleótido puede ser complementario a otro polinucleótido sin ser su complemento.

Un “vector” es un ácido nucleico que puede usarse para introducir en una célula otro ácido nucleico ligado a él. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a una molécula de ADN bicatenario, lineal o circular, en la cual pueden ligarse segmentos adicionales de ácido nucleico. Otro tipo de vector es un vector viral (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y adenovirus asociados), en el cual pueden introducirse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores pueden replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que comprenden un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales vectores episomales de mamíferos) se integran en el genoma de una célula hospedadora después de la introducción en la célula hospedadora y por lo tanto se replican junto con el genoma del hospedador. Un “vector de expresión” es un tipo de vector que puede dirigir la expresión de un polinucleótido seleccionado.

Una secuencia de nucleótidos está “unida operativamente” a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora influye en la expresión (por ejemplo, en el nivel, en la sincronización, o en la localización de la expresión) de la secuencia de nucleótidos. Una “secuencia reguladora” es un ácido nucleico que influye en la expresión (por ejemplo, en el nivel, en la sincronización o en la localización de la expresión) de un ácido nucleico al cual está unido operativamente. La secuencia reguladora puede, por ejemplo, ejercer sus efectos directamente en el ácido nucleico regulado, o a través de la acción de una o más moléculas distintas (por ejemplo, polipéptidos que se unen a la secuencia reguladora y/o al ácido nucleico). Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Otros ejemplos de secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA y Baron et al, 1995, Nucleic Acids Res. 23: 3605-06.

Una “célula hospedadora” es una célula que puede usarse para expresar un ácido nucleico, por ejemplo, un ácido nucleico de la invención. Una célula hospedadora puede ser un procariota, por ejemplo, E. coli, o puede ser un eucariota, por ejemplo, un eucariota unicelular (por ejemplo, una levadura u otros hongos), una célula vegetal (por ejemplo, una célula vegetal de tabaco o de tomate), una célula animal (por ejemplo, una célula humana, una célula de mono, una célula de hámster, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de insecto) o un hibridoma. Típicamente, una célula hospedadora es una célula cultivada que puede transformarse o transfectarse con un ácido nucleico que codifica un polipéptido, que después puede expresarse en la célula hospedadora. La frase “célula hospedadora recombinante” puede usarse para indicar una célula hospedadora que se ha transformado o transfectado con un ácido nucleico a expresar. Una célula hospedadora también puede ser una célula que comprende el ácido nucleico pero que no lo expresa a un nivel deseado, salvo que introduzca una secuencia reguladora en la célula hospedadora, de tal manera que comience a unirse operativamente con el ácido nucleico. Se entiende que la expresión célula hospedadora se refiere no sólo a la célula del sujeto particular sino a la progenie o posible progenie de dicha célula. Dado que en generaciones sucesivas pueden producirse ciertas modificaciones, debido, por ejemplo, a mutación o influencia ambiental, dicha progenie puede no ser, en realidad, idéntica a la célula parental, pero aún se incluye dentro del ámbito del término, tal y como se usa en el presente documento.

Receptores de glucagón

Los receptores de glucagón (GCGR) pertenecen a la familia de receptores de 7 dominios transmembrana que están acoplados a una o más rutas de señalización intracelular mediante proteínas (proteínas G) heterodiméricas de unión a nucleótidos de guanina (Jelinek et al, Science 259: 1614-1616 (1993), Segre et al., Trends Endocrinol. Metab 4:309-314 (1993)). Como se usa en el presente documento, las expresiones “receptor de glucagón” y “GCGR” se usan indistintamente. Otros miembros de este grupo incluyen receptores de secretina, péptido similar a glucagón (GLP-1), proteína intestinal vasoactiva (VIP), y factor de liberación de la hormona del crecimiento. Estos receptores tienen características estructurales muy homólogas que incluyen un dominio N-terminal extracelular relativamente grande y una serie de dominios transmembrana, intracelulares y extracelulares.

En una realización, los agentes de unión a antígeno de la presente invención pueden seleccionarse para unirse a receptores de glucagón unidos a membrana, expresados en las células, y para inhibir o bloquear el glucagón o bloquear la señalización del glucagón a través del receptor de glucagón. En una realización, los agentes de unión a antígeno de la presente invención se unen específicamente al receptor de glucagón humano. En una realización adicional, las proteínas de unión a antígeno que se unen al receptor de glucagón humano también pueden unirse a los receptores de glucagón de otras especies. Los siguientes ejemplos proporcionan un método para generar anticuerpos completamente humanos que se unen a receptores de glucagón humanos unidos a membrana, y en una realización adicional, se unen a receptores de glucagón de otras especies.

Se conocen las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de diversas especies de receptores de glucagón. La Tabla 1 presenta secuencias de ser humano, ratón y rata. En el presente documento se identifican las secuencias del receptor de glucagón del mono cinomolgo y se presentan a continuación.

Tabla 1: Receptores de glucagón

Aminoácidos de rata (Rattus norvegicus) (SEC ID Nº: 6) 489 aa, Nº de registro NM 172092

Polinucleótidos de mono cinomolgo (Macaca fascicularis) (SEC ID Nº: 7) > cino-20042028417-contig1 (32pb -1465pb, directo) 1434pb

Proteínas de unión a antígeno

En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos,

5 fragmentos de anticuerpos, derivados de anticuerpos, muteínas de anticuerpos, y variantes de anticuerpos), que se unen específicamente al receptor de glucagón humano. En una realización, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo humano.

Las proteínas de unión a antígeno de acuerdo con la presente invención incluyen proteínas de unión a antígeno que

10 se unen específicamente al receptor de glucagón humano e inhiben la señalización de glucagón a través del receptor de glucagón. En una realización, el valor de CI50 de la proteína de unión a antígeno es de 90 nM o menor. En un aspecto, las proteínas de unión a antígeno se unen específicamente al receptor de glucagón, inhiben la señalización y presentan efectos biológicos terapéuticos, tales como, disminución de glucosa en sangre en modelos animales, o mejora de la eliminación de glucosa (tolerancia) en modelos animales. En una realización, las

15 proteínas de unión a antígeno son anticuerpos humanos que se unen específicamente al receptor de glucagón e inhiben la señalización a través del receptor de glucagón. En otra realización, las proteínas de unión a antígeno son anticuerpos humanos que se unen específicamente al receptor de glucagón, inhiben la señalización a través del receptor de glucagón y son capaces de disminuir la glucosa en sangre o mejorar la eliminación de glucosa (tolerancia) en modelos animales.

También se describe una proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo) que comprende secuencias que difieren cada una independientemente en 5, 4, 3, 2, 1 o 0 adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos sencillos de una secuencia CDR de A1-A23 mostrada en la siguiente Tabla 2. Como se usa en el presente documento, una secuencia CDR que difiere en no más de un total de, por ejemplo, cuatro adiciones, sustituciones

25 y/o deleciones de aminoácidos de una secuencia CDR mostrada en la siguiente Tabla 2 se refiere a una secuencia con 4, 3, 2, 1 o 0 adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos sencillos en comparación con las secuencias mostradas en la Tabla 2.

También se describe una proteína de unión a antígeno que comprende una o más secuencias consenso CDR mostradas más adelante. Se proporcionan secuencias consenso para la CDR1, CDR2, CDR3 de cadena ligera y para la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada, mostradas más adelante.

5 Las CDR de cadena ligera de las proteínas de unión a antígeno (anticuerpos) A1-A23 y las CDR de cadena pesada de proteínas de unión a antígeno ejemplares (anticuerpos) A1-A23 se muestran a continuación en la Tabla 2. A1 a A23 se corresponden con L1 a L23 mostradas más adelante y con H1 a H23 mostradas más adelante. También se muestran secuencias de polinucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos de las CDR.

10 TABLA 2 CADENAS LIGERAS L1 a L23

Ab: CDR1 CDR2 CDR3

A-1 NA: aggtctagtcagagcctcttggatagag atgatggagacacctatttggac (SEC ID Nº: 9) acgctttcctatcgggcctct (SEC ID Nº: 42) atgcaacgtatagagtttc cattcact (SEC ID Nº: 71)

AA: RSSQSLLDRDDGDTYLD (SEC ID Nº: 10) TLSYRAS (SEC ID Nº: 43) MQRIEFPFT (SEC ID Nº: 72)

A-2 NA: aggtctagtcagagcctcttggatagtgc tgatggagacacctatttggac (SEC ID Nº: 11) acgctttcctatcgggcctct (SEC ID Nº: 42) atgcaacgtatagagtttc cattcact (SEC ID Nº: 71)

AA: RSSQSLLDSADGDTYLD (SEC ID Nº: 12) TLSYRAS (SEC ID Nº: 43) MQRIEFPFT (SEC ID Nº: 72)

A-3 NA: cgggcaagtcagggcattagaaatgatt taggc (SEC ID Nº: 13) gctgcatccagtttgcaaagt (SEC ID Nº: 44) ctacagcataatagtaacc ctctcact (SEC ID Nº: 73)

AA: RASQGIRNDLG (SEC ID Nº: 14) AASSLQS (SEC ID Nº: 45) LQHNSNPLT (SEQ ID NO: 74)

A-4 NA: cgggcaagtcagggcattagaaatgatt taggc (SEC ID Nº: 13) gctgcatccagtttgcaaagt (SEC ID Nº: 44) ctacagcataatagtaacc ctctcact (SEC ID Nº: 73)

AA: RASQGIRNDLG (SEC ID Nº: 14) AASSLQS (SEC ID Nº: 45) LQHNSNPLT (SEC ID Nº: 74)

A-5 NA: cgggcaagtcagggcattagaaatgatt taggc (SEC ID Nº: 13) gctgcctccagtttgcaaagt (SEC ID Nº: 46) ctacagcataatagtgacc cgctcacc (SEC ID Nº: 75)

AA: RASQGIRNDLG (SEC ID Nº: 14) AASSLQS (SEC ID Nº: 45) LQHNSDPLT (SEC ID Nº: 76)

A-6 NA: agggccagtcagagtgttagcagcaac tacttagcc (SEC ID Nº: 15) ggtgcatccagcagggccact (SEC ID Nº: 47) caacaatatggtaactcac cattcact (SEC ID Nº: 77)

AA: RASQSVSSNYLA (SEC ID Nº: 16) GASSRAT (SEC ID Nº: 48) QQYGNSPFT (SEC ID Nº: 78)

A-7 NA: cgggcaagtcaggacattagaaatgatt ttggc (SEC ID Nº: 17) gctgcatccagtttacaaagt (SEC ID Nº: 44) ctacagcaaaatagttacc cgctcact (SEC ID Nº: 79)

AA: RASQDIRNDFG (SEC ID Nº: 18) AASSLQS (SEC ID Nº: 45) LQQNSYPLT (SEC ID Nº: 80)

A-8 NA: gggtctactcagagcctcttggatagtga tgatggagacacctatttggac (SEC ID Nº: 19) acgctttcctatcgggcctct (SEC ID Nº: 42) atgcaacgtatagagtttc cattcact (SEC ID Nº: 71)

AA: RSTQSLLDSDDGDTYLD (SEC ID Nº: 20) TLSYRAS (SEC ID Nº: 43) MQRIEFPFT (SEC ID Nº: 72)

Ab: CDR1 CDR2 CDR3

A-9 NA: cgggcaagtcagggcattagaaatgatt taggc (SEC ID Nº: 13) gctgcatccagtttggaaagt (SEC ID Nº: 49) ctacagcataatagtaacc ctctcact (SEC ID Nº: 73)

AA: RASQGIRNDLG (SEC ID Nº: 14) AASSLES (SEC ID Nº: 50) LQHNSNPLT (SEC ID Nº: 74)

A-10 NA: caggcgagtcaggacattagtaagtattt aaat (SEC ID Nº: 21) gatgcatccaatttggaaaca (SEC ID Nº: 51) caacagtatggtaatctcc cgatcacc (SEC ID Nº: 75)

AA: QASQDISKYLN (SEC ID Nº: 22) DASNLET (SEC ID Nº: 52) QQYGNLPIT (SEC ID Nº: 76)

A-11 NA: tctggagataaattgggggataaatatgt ttgc (SEC ID Nº: 23) caaacttccaagcggccctca (SEC ID Nº: 53) caggcgtgggacagcaa cactgtgatt (SEC ID Nº: 77)

AA: SGDKLGDKYVC (SEC ID Nº: 24) QTSKRPS (SEC ID Nº: 54) QAWDSNTVI (SEC ID Nº: 78)

A-12 NA: tctggagataaattgggggataaatatgt ttgc (SEC ID Nº: 23) caaacttccaagcggccctca (SEC ID Nº: 53) caggcgtgggacagcag cactgtggtt (SEC ID Nº: 79)

AA: SGDKLGDKYVC (SEC ID Nº: 24) QTSKRPS (SEC ID Nº: 54) QAWDSSTVV (SEC ID Nº: 80)

A-13 NA: tctggagataaattgggggataaatatgc ttgc (SEC ID Nº: 25) caatctaccaagcggccctca (SEC ID Nº: 55) caggcgtgggacagcag cactgtggta (SEC ID Nº: 81)

AA: SGDKLGDKYAC (SEC ID Nº: 26) QSTKRPS (SEC ID Nº: 56) QAWDSSTVV (SEC ID Nº: 80)

A-14 NA: acccgcagcagtggcagcattgtcagc aactttgtgcaa (SEC ID Nº: 27) gaggataaccaaagaccctct (SEC ID Nº: 57) cagtcttatgataccagca atcaggtg (SEC ID Nº: 82)

AA: TRSSGSIVSNFVQ (SEC ID Nº: 28) EDNQRPS (SEC ID Nº: 58) QSYDTSNQV (SEC ID Nº: 83)

A-15 NA: actggaatcacctccaacatcggaagca atactgtacac (SEC ID Nº: 29) agtaataatcagcggccctca (SEC ID Nº: 59) gcagcatgggatgacag cctgaatggtccggtg (SEC ID Nº: 84)

AA: TGITSNIGSNTVH (SEC ID Nº: 30) SNNQRPS (SEC ID Nº: 60) AAWDDSLNGPV (SEC ID Nº: 85)

A-16 NA: tctggaagcaggtccaacatcggaagta attatgtatac (SEC ID Nº: 31) aggaataatcagcggccctca (SEC ID Nº: 61) gcagcatgggatgacag cctgagtaggccggta (SEC ID Nº: 86)

AA: SGSRSNIGSNYVY (SEC ID Nº: 32) RNNQRPS (SEC ID Nº: 62) AAWDDSLSRPV (SEC ID Nº: 87)

A-17 NA: actgggagcagctccaacatcggggca ggttatgctgtacac (SEC ID Nº: 33) gataacaacaatcggccctca (SEC ID Nº: 63) cagtcctatgacagcagc ctgagtgctata (SEC ID Nº: 88)

AA: TGSSSNIGAGYAVH (SEC ID Nº: 34) DNNNRP (SEC ID Nº: 64) QSYDSSLSAI (SEC ID Nº: 89)

A-18 NA: aagtctagtcagagcctcctgcatagtg atggaaagaactatttgttt (SEC ID Nº: 35) gaagtttcctaccggttctct (SEC ID Nº: 65) atgcaaaatatacagcctc ctctcacc (SEC ID Nº: 90)

AA: KSSQSLLHSDGKNYLF (SEC ID Nº: 36) EVSYRFS (SEC ID Nº: 66) MQNIQPPLT (SEC ID Nº: 91)

Ab: CDR1 CDR2 CDR3

A-19 NA: aggtctagtcagagcctcctgcatagta atggatacaactatttggat (SEC ID Nº: 37) ttgggttctaatcgggcctcc (SEC ID Nº: 67) atggaagctcttcaaacta tgtgcagt (SEC ID Nº: 92)

AA: RSSQSLLHSNGYNYLD (SEC ID Nº: 38) LGSNRAS (SEC ID Nº: 68) MEALQTMCS (SEC ID Nº: 93)

A-20 NA: cgggcaagtcagggcattagaaatgatt taggc (SEC ID Nº: 39) gctgcatccagtttgcaaagt (SEC ID Nº: 44) ctacagcataatagttacc ctcgcagt (SEC ID Nº: 94)

AA: RASQGIRNDLG (SEC ID Nº: 14) AASSLQS (SEC ID Nº: 45) LQHNSYPRS (SEC ID Nº: 95)

A-21 NA: cgggcgagtcagggtattagcagctgg ttagcc (SEC ID Nº: 40) gctgcatccagtttgcaaagt (SEC ID Nº: 44) caacaggctaacagtttcc cgctcact (SEC ID Nº: 96)

AA: RASQGISSWLA (SEC ID Nº: 41) AASSLQS (SEC ID Nº: 45) QQANSFPLT (SEC ID Nº: 97)

A-22 NA: aggtctagtcagagcctcttggatagag atgatggagacacctatttggac (SEC ID Nº: 9) acgctttcctatcgggcctct (SEC ID Nº: 42) atgcaacgtatagagtttc cattcactt (SEC ID Nº: 98)

AA: RSSQSLLDRDDGDTYLD (SEC ID Nº: 10) TLSYRAS (SEC ID Nº: 43) MQRTEFPFT (SEC ID Nº: 72)

A-23 NA: cgggcgagtcagggtattagcagctgg ttagcc (SEC ID Nº: 40) actgcatccactttgcaaagt (SEC ID Nº: 69) caacagtctaacagtttcc cgctcact (SEC ID Nº: 99)

AA: RASQGISSWLA (SEC ID Nº: 41) TASTLQS (SEC ID Nº: 70) QQSNSFPLT (SEC ID Nº: 100)

CADENAS PESADAS H1 a H23

Ab: CDR1 CDR2 CDR3

A-1 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 101) tctatatggtatgatggaagtaataaatatt atgtagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 123) cttggtggtggttttgactac (SEC ID Nº: 164)

AA: SYGMH (SEC ID Nº: 102) SIWYDGSNKYYVDSVKG (SEC ID Nº: 124) LGGGFDY (SEC ID Nº: 165)

A-2 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 101) tttatatggtatgatggaagtgaaaaatat tatgtagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 125) atgggaggcggctttgactac (SEC ID Nº: 166)

AA: SYGMH (SEC ID Nº: 102) FIWYDGSEKYYVDSVKG (SEC ID Nº: 126) MGGGFDY (SEC ID Nº: 167)

A-3 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 101) gttatgtggtatgatggaagtaataaaga ctatgtagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 127) gaaaaagatcattacgacattttgactggttata actactactacggtctggacgtc (SEC ID Nº: 168)

AA: SYGMH (SEC ID Nº: 102) VMWYDGSNKDYVDSVKG (SEC ID Nº: 128) EKDHYD1LTGYNYYYGLDV (SEC ID Nº: 169)

A-4 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 101) gttatgtggtatgatggaagtaataaaga ctatgtagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 127) gaaaaagatcattacgacattttgactggttata actactactacggtctggacgtc (SEC ID Nº: 168)

AA: SYGMH (SEC ID Nº: 102) VMWYDGSNKDYVDSVKG (SEC ID Nº: 128) EKDHYDILTGYNYYYGLDV (SEC ID Nº: 169)

Ab: CDR1 CDR2 CDR3

A-5 NA: acctatgggatgcac (SEC ID Nº: 103) gttatatcagatgatggaagtcataaata ctctgcagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 129) gaggagacgtattacgatattttgactggctat catcactactacggtatggacgtc (SEC ID Nº: 170)

AA: TYGMH (SEC ID Nº: 104) VISDDGSHKYSADSVKG (SEC ID Nº: 130) EETYYDILTGYHHYYGMDV (SEC ID Nº: 171)

A-6 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 101) gaaatatggaatgatggaagtaataaata ctatgcagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 131) gagcctcagtattacgatattttgactggttatg ataactactacggtatggacgtc (SEC ID Nº: 172)

AA: SYGMH (SEC ID Nº: 102) EIWNDGSNKYYADSVKG (SEC ID Nº: 132) EPQYYDILTGYDNYYGMDV (SEC ID Nº: 173)

A-7 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 105) gtgatatcacatgatggaagtgataaata ctatgcagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 133) gaaaaaccgtattacgatattttgactggttattt ctactactatggtatggacgtc (SEC ID Nº: 174)

AA: SYDMH (SEC ID Nº: 106) VISHDGSDKYYADSVKG (SEC ID Nº: 134) EKPYYDILTGYFYYYGMDV (SEC ID Nº: 175)

A-8 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 101) ggtatatggtatgatggaaggaataaata ctatgtagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 135) ttagcagtggcctttgactac (SEC ID Nº: 176)

AA: SYGMH (SEC ID Nº: 102) GIWYDGRNKYYVDSVKG (SEC ID Nº: 136) LAVAFDY (SEC ID Nº: 177)

A-9 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 101) gttatgtggtatgatggaagtaataaaga ctatgtagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 127) gaaaaagatcattacgacattttgactggttata actactactacggtctggacgtc (SEC ID Nº: 168)

A-10 NA: agcaactatgctgcttgga ac (SEC ID Nº: 107) aggacatactacaggtccaagtggtata atgattatgcagtatctgtgagaagt (SEC ID Nº: 137) gaagatggcagtggctggtacggtgcttttga catc (SEC ID Nº: 178)

AA: SNYAAWN (SEC ID Nº: 108) RTYYRSKWYNDYAVSVRS (SEC ID Nº: 138) EDGSGWYGAFDI (SEC ID Nº: 179)

A-11 NA: agctatgacatgcac (SEC ID Nº: 109) tttatatcagatgatggaagtaataaatac tatggagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 139) gatcaatacgatattttgactggttattcttctgat gcttttgatatc (SEC ID Nº: 180)

AA: SYDMH (SEC ID Nº: 106) FISDDGSNKYYGDSVKG (SEC ID Nº: 140) DQYDILTGYSSDAFDI (SEC ID Nº: 181)

A-12 NA: agctatgacatgcac (SEC ID Nº: 109) tttatatcagatgatggaagtaataaatatt atggagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 141) gatcaatacgatattttgactggttattcttctgat gcttttgatatc (SEC ID Nº: 180)

A-13 NA: agctatgacatgcac (SEC ID Nº: 109) gttatatcatatgatggaagtaataaatac tatggagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 142) gatcaatacgatattttgactggttattcttctgat gcttttgatatc (SEC ID Nº: 180)

AA: SYDMH (SEC ID Nº: 106) VISYDGSNKYYGDSVKG (SEC ID Nº: 143) DQYDILTGYSSDAFDI (SEC ID Nº: 181)

A-14 NA: aactatggcatgcac (SEC ID Nº: 110) gttatatggtatgatggaagtaataaatac tatgcagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 144) gcctattacgatattttgactgattacccccagt atgactactactacggtatggacgtc (SEC ID Nº: 182)

Ab: CDR1 CDR2 CDR3

AA: NYGMH (SEC ID Nº: 111) VIWYDGSNKYYADSVKG (SEC ID Nº: 145) AYYDILTDYPQYDYYYGMDV (SEC ID Nº: 183)

A-15 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 101) cttatatcatttgatggaagtaataaatact atgcagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 146) gatgggtattacgatattttgactggttatgagg atgatgcttttgatatc (SEC ID Nº: 184)

AA: SYGMH (SEC ID Nº: 102) LISFDGSNKYYADSVKG (SEC ID Nº: 147) DGYYDILTGYEDDAFDI (SEC ID Nº: 185)

A-16 NA: ggctactatttgcac (SEC ID Nº: 112) tggatcatccctgacagtggtggcacaa agtatgcacagaagtttcagggc (SEC ID Nº: 148) gaagggtttcattacgatattttgactggttccta cttctactactacggtatggacgtc (SEC ID Nº: 186)

AA: GYYLH (SEC ID Nº: 113) WIIPDSGGTKYAQKFQG (SEC ID Nº: 149) EGFHYDILTGSYFYYYGMDV (SEC ID Nº: 187)

A-17 NA: agctatggtatcagt (SEC ID Nº: 114) tggatcggcgtttacaatggtcacacaaa atatgcacagaagttccagggc (SEC ID Nº: 150) agggtagcagtggctgggtactttgactac (SEC ID Nº: 188)

AA: SYGIS (SEC ID Nº: 115) WIGVYNGHTKYAQKFQG (SEC ID Nº: 151) RVAVAGYFDY (SEC ID Nº: 189)

A-18 NA: aagtctagtcagagcctcc tgcatagtgatggaaaga actatttgttt (SEC ID Nº: 116) gaagtttcctaccggttctct (SEC ID Nº: 152) atgcaaaatatacagcctcctctcacc (SEC ID Nº: 190)

AA: KSSQSLLHSDGK NYLF (SEC ID Nº: 117) VIWYDGSHKYYEDSVKG (SEC ID Nº: 153) VGYGSGWYEYYYHYGMDV (SEC ID Nº: 191)

A-19 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 101) attatatggtctgatggaattaacaaatac tatgcagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 154) gagagaggcctctacgatattttgactggttatt ataactactacggtattgacgtc (SEC ID Nº: 192)

AA: SYGMH (SEC ID Nº: 102) HWSDGINKYYADSVKG (SEC ID Nº: 155) ERGLYDILTGYYNYYGIDV (SEC ID Nº: 193)

A-20 NA: ggctataccttgaac (SEC ID Nº: 117) aacattaatagtaggagtagtctcatatac tacacagactctgtgaagggc (SEC ID Nº: 156) gatcagtataactggaactactactacggtatg gacgtc (SEC ID Nº: 194)

AA: GYTLN (SEC ID Nº: 118) NINSRSSLIYYTDSVKG (SEC ID Nº: 157) DQYNWNYYYGMDV (SEC ID Nº: 195)

A-21 NA.: agctatgccatgaac (SEC ID Nº: 119) tacattggtagtagtagtagtgccatatac tacggagactctgtgaagggc (SEC ID Nº: 158) tatagaagtggctggtcccccctctttgacttc (SEC ID Nº: 196)

AA: SYAMN (SEC ID Nº: 120) YIGSSSSAIYYGDSVKG (SEC ID Nº: 159) YRSGWSPLFDF (SEC ID Nº: 197)

A-22 NA: agctatggcatgcac (SEC ID Nº: 101) tctatatggtatgatggaagtaataaatatt atgtagactccgtgaagggc (SEC ID Nº: 160) cttggtggtggttttgactac (SEC ID Nº: 164)

AA: SYGMH (SEC ID Nº: 102) SIWYDGSNKYYVDSVKG (SEC ID Nº: 161) LGGGFDY (SEC ID Nº: 165)

A-23 NA: agatatgccatgaac (SEC ID Nº: 121) tacattggtagtagtagtagtgccatatac tacgcagactctgtgaagggc (SEC ID Nº: 162) tatagcagtggctggtcccccctctttgactac (SEC ID Nº: 198)

AA: RYAMN (SEC ID Nº: 122) YIGSSSSAIYYADSVKG (SEC ID Nº: 163) YSSGWSPLFDY (SEC ID Nº: 199)

Secuencias consenso CDR Cadena ligera CDR1 Grupo 1 RSSQSLLDRDDGDTYLD (SEC ID Nº: 10)

5 RSSQSLLDSADGDTYLD (SEC ID Nº: 12)

X1 es un resto de serina o un resto de treonina, X2 es un resto de arginina o un resto de serina, 10 X3 es un resto de aspartato o un resto de alanina,

Grupo 2

RASQDIRNDFG (SEC ID Nº: 18)

X4 es un resto de glicina o un resto de aspartato, X5 es un resto de leucina o un resto de fenilalanina.

20 Grupo 3 SGDKLGDKYVC (SEC ID Nº: 24)

25 X6 es un resto de valina o un resto de alanina

Cadena Pesada CDR1

Grupo 1

30 TYGMH-(SEC ID Nº: 104) SYGMH-(SEC ID Nº: 102) SYDMH-(SEC ID Nº: 106)

X7: X8

S: Y G M H

T: D

X7 es un resto de serina o un resto de treonina, X8 es un resto de glicina, o un residuo de aspartato,

Cadena ligera CDR2

40 Grupo 1 AASSLQS (SEC ID Nº: 45) AASSLES (SEC ID Nº: 50) X9 es un resto de glutamina o un resto de glutamato,

Grupo 2 5 QTSKRPS (SEC ID Nº: 54)

X10 es un resto de serina o un resto de treonina, X11 es un resto de treonina o un resto de serina,

10 Cadena pesada CDR2 Grupo 1 SIWYDGSNKYYVDSVKG (SEC ID Nº: 124) FIWYDGSEKYYVDSVKG (SEC ID Nº: 126)

15 VIWYDGSNKYYADSVKG (SEC ID Nº: 145) EIWNDGSNKYYADSVKG (SEC ID Nº: 132)

20 X12 es un resto de serina, un resto de fenilalanina, un resto de valina, o un resto de glutamato, X13 es un resto de tirosina, un resto de asparagina, X14 es un resto de asparagina o un resto de glutamato, X15 es un resto de valina o un resto de alanina,

25 Grupo 2 VISHDGSDKYYADSVKG (SEC ID Nº: 134) FISDDGSNKY YGDSVKG (SEC ID Nº: 140) VISYDGSNKY YGDSVKG (SEC ID Nº: 143) VISDDGSHKY SADSVKG (SEC ID Nº: 130)

X16 es un resto de valina o un resto de fenilalanina, X17 es un resto de histidina, un resto de aspartato, o un resto de tirosina, X18 es un resto de aspartato, un resto de asparagina o un resto de histidina,

35 X19 es un resto de tirosina, un resto de serina, X20 es un resto de alanina o un resto de glicina,

Cadena ligera CDR3

Grupo 1

5 LQHNSDPLT (SEC ID Nº: 76) LQQNSYPLT (SEC ID Nº: 80) LQHNSNPLT (SEC ID Nº: 74)

10 X21 es un resto de histidina o un resto de glutamina, X22 es un resto de asparagina, un resto de aspartato o un resto de tirosina,

Grupo 2 QAWDSNTVI (SEC ID Nº: 78)

X23 es un resto de asparagina o un resto de serina, 20 X24 es un resto de isoleucina o un resto de valina,

Cadena pesada CDR3

Grupo 1

EKDHYDILTGYNYYYGLDV (SEC ID Nº: 169) 25 EETYYDILTGYHHYYGMDV (SEC ID Nº: 171)

EPQYYDILTG YDNYYGMDV (SEC ID Nº: 173)

30 X25 es un resto de lisina, un resto de glutamato, o un resto de prolina, X26 es un resto de aspartato, un resto de treonina, un resto de glutamina o un resto de prolina, X27 es un resto de histidina, o un resto de tirosina, X28 es un resto de asparagina, un resto de histidina, un resto de aspartato o un resto de fenilalanina, X29 es un resto de tirosina, un resto de histidina, o un resto de asparagina,

35 X30 es un resto de leucina, o un resto de metionina,

Grupo 2 LGGGFDY (SEC ID Nº: 165) MGGGFDY (SEC ID Nº: 167)

X31 es un resto de leucina o un resto de metionina.

También se describen proteínas de unión a antígeno que comprenden una región variable de cadena ligera

5 seleccionada del grupo que consiste en L1-L23 o una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en H1-H23, y fragmentos, derivados, muteínas y sus variantes. Dicha proteína de unión a antígeno puede representarse usando la nomenclatura “LxHy”, en la cual “x” corresponde al número de la región variable de cadena ligera e “y” corresponde al número de la región variable de cadena pesada. Por ejemplo, L2H1 se refiere a una proteína de unión a antígeno con una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos

10 de L2 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de H1 como se muestra en la Tabla 3 más adelante. Las CDR y regiones marco conservadas de cada una de estas secuencias de dominio variable también se identifican en la Tabla 3 más adelante. Las proteínas de unión a antígeno de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos que tienen una combinación de dominios variables de cadena ligera y cadena pesada seleccionados del grupo de combinaciones que consisten en L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7,

15 L8H8, L9H9, L10H10, L11D11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, H17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 y L23H23. En una realización, los anticuerpos son anticuerpos humanos.

La siguiente Tabla 3 también proporciona las secuencias de polinucleótidos (ADN) que codifican las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada para anticuerpos GCGR ejemplares. 20 TABLA 3 Secuencias de polinucleótidos y secuencias de aminoácidos de la región variable anti-GCGR

Secuencias de polinucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera 25

L1 (A-2)

L3 (A-3)

L4 (A-4)

L5 (A-5)

10 L6 (A-6) L7 (A-7)

L8 (A-8)

L9 (A-9)

L10 (A-10)

L11 (A-11)

L12 (A-12)

L13 (A-13)

10 L14 (A-14) L15 (A-15)

L16 (A-16)

L17 (A-17)

L18 (A-18)

L19 (A-19)

L20 (A-20)

L21 (A-21)

10 L22 (A-22)

L23 (A-23)

Secuencias de polinucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada

H1 (A-1)

H2 (A-2)

H3 (A-3)

H4 (A-4)

H5 (A-5)

H6 (A-6)

10 H7 (A-7) H8 (A-8)

H9 (A-9)

H10 (A-10)

10 H11 (A-11) H12 (A-12)

H13 (A-13)

H14 (A-14)

10 H15 (A-15) H16 (A-16)

H17 (A-17)

H18 (A-18)

10 H19 (A-19)

H20 (A-20)

H21 (A-21)

H22 (A-22)

10 H23 (A-23)

En el presente documento se describen realizaciones particulares de las proteínas de unión a antígeno que comprenden una o más secuencias de aminoácidos que son idénticas a las secuencias de aminoácidos de una o 15 más de las CDR y/o FR (regiones marco conservadas) ilustradas anteriormente. En una realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR1 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la

proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR2 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR3 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR1 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR2 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia CDR3 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR1 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR2 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR3 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR4 de cadena ligera ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR1 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR2 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR3 de cadena pesada ilustrada anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende una secuencia FR4 de cadena pesada ilustrada anteriormente.

En otra realización, al menos una de las secuencias CDR3 de la proteína de unión a antígeno difiere en no más de 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos sencillos de una secuencia CDR3 de A1-A23, como se muestra en las Tablas 2 y 3 anteriores. En otra realización, la secuencia CDR3 de cadena ligera de la proteína de unión a antígeno difiere en no más de 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos sencillos de una secuencia CDR3 de cadena ligera de A1-A23 como se muestra anteriormente y la secuencia CDR3 de cadena pesada de la proteína de unión a antígeno difiere en no más de 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos sencillos de una secuencia CDR3 de cadena pesada de A1-A23 como se muestra anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende adicionalmente 1, 2, 3, 4 o 5 secuencias CDR cada una de ellas diferenciadas independiente por 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 adiciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos sencillos de una secuencia CDR de A1-A23. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende las CDR de la región variable de cadena ligera y las CDR de la región variable de cadena pesada expuestas anteriormente. En otra realización, la proteína de unión a antígeno comprende 1, 2, 3, 4, 5 y/o 6 secuencias CDR consenso mostradas anteriormente. En una realización adicional, la proteína de unión a antígeno comprende las CDR de cualquiera de L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 y L23H23. En una realización, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo humano.

En una realización, la proteína de unión a antígeno (tal como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo) comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la secuencia de un dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en L1 a L23 sólo en los restos 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0, en la cual cada una de dicha diferencia de secuencia es independientemente cualquiera de una deleción, inserción o sustitución de un resto de aminoácido. En otra realización, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % idéntica a la secuencia de un dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en L1-L23. En otra realización, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos L1-L23 indicada más adelante. En otra realización, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que, en condiciones moderadamente rigurosas, se hibrida con el complemento de un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en L1-L23. En otra realización, el dominio variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que, en condiciones rigurosas, se hibrida con el complemento de un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en L1-L23.

En otra realización, una proteína de unión a antígeno comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que se diferencia de la secuencia de un dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en H1-H23 sólo en los restos 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0, en la cual cada una de dicha diferencia de secuencia es independientemente cualquiera de una deleción, inserción o sustitución de un resto de aminoácido. En otra realización se describe el dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99% idéntica a la secuencia de un dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en H1-H23. En otra realización, en el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en H1-H23. En otra realización, el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que, en condiciones moderadamente rigurosas, se hibrida con el complemento de un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena pesada seleccionada entre el grupo que consiste H1-H23. En otra realización, el dominio variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que está codificada por un polinucleótido que, en condiciones rigurosas, se hibrida con el complemento de un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en H1-H23.

Realizaciones adicionales incluyen proteínas de unión a antígeno que comprenden las combinaciones L1H1, L2H2, 5 L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 y L23H23.

Las proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y derivados de anticuerpos) de la invención pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. La región constante de 10 cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda, por ejemplo, una región constante de cadena ligera de tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de tipo alfa-, delta-, épsilon-, gamma-, o mu-, por ejemplo, una región constante de cadena pesada de tipo alfa-, delta-, épsilon-, gamma-, o mu-humana. En una realización, la región constante de cadena ligera o pesada es un fragmento, un derivado, una variante o una muteína

15 de una región constante de origen natural.

Se conocen técnicas para obtener un anticuerpo de una subclase o de un isotipo diferente de un anticuerpo de interés, es decir, cambiando la subclase. Por tanto, anticuerpos de IgG pueden proceder de un anticuerpo de IgM, por ejemplo, y viceversa. Dichas técnicas permiten la preparación de nuevos anticuerpos que poseen las

20 propiedades de unión a antígeno de un anticuerpo determinado (el anticuerpo parental), pero que también presentan las propiedades biológicas asociadas con un isotipo o subclase de anticuerpo diferente del anticuerpo parental. Pueden emplearse técnicas de ADN recombinante. En dichos procedimientos puede emplearse ADN clonado que codifica polipéptidos de anticuerpos particulares, por ejemplo, ADN que codifica el dominio constante de un anticuerpo del isotipo deseado. Véase también Lanitto et al., Methods Mol. Biol. 178:303-16 (2002).

25 En una realización, una proteína de unión a antígeno de la invención comprende adicionalmente los dominios lambda o kappa de cadena ligera constante o un fragmento de éstos. En la siguiente Tabla 4 se proporcionan las secuencias de las regiones constantes de cadena ligera y polinucleótidos que las codifican. En otra realización, una proteína de unión a antígeno de la invención comprende adicionalmente un dominio constante de cadena pesada, o

30 su fragmento, tal como la región constante de cadena pesada de IgG2 proporcionada en la Tabla 4.

En una realización, en las SEC ID Nos: 310, 311, 312 y 311, mostradas más adelante, se presenta una forma de IgG2 de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y cadena pesada humana para el anticuerpo A-9 y A-3.

35 TABLA 4 Región constante de cadena ligera

aminoácidos (kappa)

polinucleótidos (lambda)

45 aminoácidos (lambda)

Región constante de cadena pesada polinucleótidos

5 Aminoácidos

Forma de IgG2 de cadena ligera para A-9

Forma de IgG2 de cadena pesada para A-9

15 Forma de IgG2 de cadena ligera para A-3

Forma de IgG2 de cadena pesada para A-3

Las proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos) descritas incluyen las que comprenden, por ejemplo, las combinaciones de dominios variables L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, L11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22 y L23H23 que tienen un isotipo deseado (por ejemplo, IgA, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE e IgD), así como sus fragmentos Fab o F(ab')2. Además, si se desea una IgG4, también puede desearse introducir una mutación puntual en la región bisagra como describen Bloom et al., 1997, en Protein Science 6:407, para atenuar la tendencia a formar enlaces disulfuro intracatenarios-H que pueden conducir a la heterogeneidad en los anticuerpos de IgG4.

Anticuerpos y fragmentos de anticuerpos

En una realización las proteínas de unión a antígeno son anticuerpos. El término “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto, o a un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe ampliamente en el apartado Definiciones. Un anticuerpo puede comprender una molécula completa de anticuerpo (incluyendo versiones policlonales, monoclonales y quiméricas, humanizadas o humanas que tienen cadenas ligeras y/o pesadas de longitud completa) o comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos F(ab')2 Fab, Fab' Fv, Fc y Fd y pueden incorporarse en anticuerpos de dominio sencillo, anticuerpos monocatenarios, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). También se incluyen polipéptidos de anticuerpos, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 6.703.199, incluyendo monocuerpos polipeptídicos de fibronectina. En la publicación de Patente de Estados Unidos 2005/0238646 se desvelan otros polipéptidos de anticuerpos, que son polipéptidos monocatenarios. En una realización, los anticuerpos de la presente invención comprenden al menos una CDR o CDR consenso expuesta en la Tabla 2 anterior.

Los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos humanizados se definen en el apartado Definiciones y pueden prepararse mediante técnicas conocidas. En una realización, un anticuerpo monoclonal humanizado comprende el dominio variable de un anticuerpo murino (o todo o parte del sitio de unión a antígeno del mismo) y un dominio constante derivado de un anticuerpo humano. Alternativamente, un fragmento de anticuerpo humanizado puede comprender el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal murino y un fragmento de dominio variable (que carece del sitio de unión a antígeno) derivado de un anticuerpo humano. Los procedimientos para la producción de anticuerpos monoclonales modificados por ingeniería genética incluyen los descritos en Riechmann et al., 1988, Nature 332:323, Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 84: 3439, Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7: 934, y Winter et al., 1993, TIPS 14:139. En una realización, el anticuerpo quimérico es un anticuerpo con injerto de CDR. Se describen técnicas para la humanización de anticuerpos, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos 5.869.619; 5.225.539; 5.821.337; 5.859.205; 6.881.557, Padlan et al, 1995, FASEB J. 9: 133-39, Tamura et al, 2000, J. Immunol. 164:1432-41, Zhang, W., et al., Molecular Immunology 42(12): 1445-1451, 2005; Hwang W. et al., Methods. 36 (1):35-42, 2005; Dall'Acqua WF, et al., Methods 36 (1):43-60, 2005, y Clark, M., Immunology Today. 21 (8):397-402, 2000.

Un anticuerpo de la presente invención también puede ser un anticuerpo monoclonal completamente humano. Los anticuerpos monoclonales completamente humanos pueden generarse mediante diversas técnicas con las que estarán familiarizados los expertos habituales en la materia. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, transformación de células sanguíneas periféricas humanas (por ejemplo, que contienen linfocitos B) con el virus de Epstein Barr (VEB), inmunización in vitro de células B humanas, fusión de esplenocitos de ratones transgénicos inmunizados portadores de genes insertados de inmunoglobulina humana, aislamiento de fagotecas de la región V de inmunoglobulina humana, u otros procedimientos conocidos en la técnica y basados en la descripción del presente documento.

Se han desarrollado procedimientos para generar anticuerpos monoclonales humanos en animales no humanos. Por ejemplo, se han generado ratones en los que se han inactivado uno o más genes endógenos de inmunoglobulina por diversos medios. Para reemplazar los genes de ratón inactivados se han introducido genes de inmunoglobulina humana en los ratones. En esta técnica, se introducen elementos de los locus de cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivadas de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones diana de los locus endógenos de cadena pesada y cadena ligera (véase también Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58 (1997)). Por ejemplo, transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser construcciones mini-genéticas, o translocus en cromosomas artificiales de levaduras, que se someten a reordenación e hipermutación de ADN específico de células B en el tejido linfoide de ratón.

Los anticuerpos producidos en el animal incorporan cadenas polipeptídicas de inmunoglobulina humana codificadas por el material genético humano introducido en el animal. En una realización, un animal no humano, tal como un ratón transgénico, se inmuniza con un inmunógeno GCGR adecuado. Un ejemplo de un inmunógeno GCGR adecuado son fracciones de membrana celular ricas en receptores, tal como se describe en los Ejemplos más adelante. Otro ejemplo es el dominio extracelular de la SEC ID Nº: 2.

Se describen ejemplos de técnicas para la producción y uso de animales transgénicos para la producción de anticuerpos humanos o parcialmente humanos en las Patentes de Estados Unidos 5.814.318, 5.569.825 y 5.545.806, David et al., Production of human antibodies from transgenic mice en Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and protocols, Human Press, NJ: 191-200 (2003), Kellermann et al, 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97, Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:1820-26, Gallo et al., 2000, Eur. J. Immun.30:534-40, Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25, Geen, 1999, J Immunol Methods. 231: 11-23, Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42, Green et al, 1998, J Exp Med. 188:483-95, Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14, Tsuda et al., 1997, Genomics. 42:413-21, Méndez et al., 1997, Nat. Genet. 15:146-56, Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63, Arbones et al., 1994, Immunity. 1: 247-60, Green et al., 1994, Nat. Genet. 7:13-21, Jakobovits et al., 1993, Nature. 362:255-58, Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci U.S.A. 90:2551-55. Chen, J., M. Trounstine, F.W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. ”Immunoglobulin gene rearrangerment in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus”. Internacional Immunology 5 (1993): 647-656, Choi et al., 1993, Nature Genetics 4:117-23, Fishwild et al, 1996, Nature Biotechnology 14: 845-51, Harding et al, 1995, Annals of the New Cork Academy of Sciences, Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-59, Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113:. 49-101, Lonberg et al, 1995, Internal Review of Immunology 13: 65-93, Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826, Taylor et al, 1992, Nucleic Acids Research 20:. 6287-95, Taylor et al, 1994, Internacional Immunology 6: 579-91, Tomizuka et al, 1997, Nature Genetics 16: 133-43, Tomizuka et al, 2000, Proccedings of the Nacional Academy of Sciences USA. 97:.. 722-27, Tuaillon et al, 1993, Proceedings of the Nacional Academy of Sciences USA 90: 3720-24, y Tuaillon et al, 1994, Journal of Immunology 152: 2912-20; Lonberg et al., Nature 368:856, 1994; Taylor et al, Int. Immun. 6:579, 1994; Patente de Estados Unidos Nº 5.877.397; Bruggemann et al, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits et al, 1995 Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:525-35. Además, se describen protocolos en los que participa el ratón XenoMouse® (Abgenix, ahora Amgen, Inc.), por ejemplo, en los documentos US 05/0118643, WO 05/694879, WO 98/24838, WO 00/76310, y en la patente de Estados Unidos 7.064.244.

Las células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados se fusionan con células de mieloma, por ejemplo, para producir hibridomas. Preferentemente, para su uso en procedimientos de fusión productores de hibridomas, las células de mieloma no producen anticuerpos, tienen alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que hacen que no sean capaces de crecer en determinados medios selectivos que solo mantienen el crecimiento de las células fusionadas deseadas (hibridomas). Como ejemplos de líneas celulares adecuadas para su uso en dichas fusiones se incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/1.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC-L 1-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; como ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata se incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.

Pueden combinarse células linfoides (por ejemplo, esplenocitos) y células de mieloma durante algunos minutos con un agente promotor de fusión de membranas, tal como polietilenglicol o un detergente no iónico, y después sembrarse en placa a baja densidad en un medio selectivo que mantenga el crecimiento de las células de hibridoma pero no el de las células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, normalmente alrededor de una a dos semanas, se observan colonias de células. Las colonias individuales se aíslan y los anticuerpos producidos por las células pueden someterse a ensayo con respecto a la actividad de unión al GCGR humano usando cualquiera de los diversos inmunoensayos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Los hibridomas se clonan (por ejemplo, por clonación en dilución limitada o por aislamiento en placas con agar suave) y los clones positivos que producen un anticuerpo específico contra el GCGR humano se seleccionan y se cultivan. Los anticuerpos monoclonales procedentes de los cultivos de hibridoma pueden aislarse de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma.

Otro método para generar los anticuerpos humanos de la invención incluye la inmortalización de células de sangre periférica humana por transformación con el VEB. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº

4.464.456. Dicha línea de células B inmortalizada (o línea celular linfoblastoide) que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente al GCGR humano puede identificarse por métodos de inmunodetección como los proporcionados en el presente documento, por ejemplo, un ELISA, y después puede aislarse mediante técnicas de clonación convencionales. La estabilidad de la línea celular linfoblastoide que produce un anticuerpo anti-GCGR puede mejorarse fusionando la línea celular transformada con un mieloma murino para producir una línea celular híbrida de ser humano-ratón de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)). Aún otro método para generar anticuerpos monoclonales humanos es la inmunización in vitro, que incluye el cebado de células B esplénicas humanas con GCGR humano, seguido de fusión de células B cebadas con un compañero de fusión heterohíbrido. Véase, por ejemplo, Boerner et al., 1991, J. Immunol.147:86-95.

En determinadas realizaciones, se selecciona una célula B que es productora de un anticuerpo anti-GCGR humano y las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada se clonan a partir de la célula B de acuerdo con técnicas de biología molecular conocidas en la materia (documento WO 92/02551; patente de Estados Unidos 5.627.052;. Babcook et al, Proc Natl Acad Sci USA 93:7843-48 (1996)) y descritas en el presente documento. Las células B de un animal inmunizado pueden aislarse de muestras de bazo, ganglios linfáticos o de sangre periférica seleccionando una célula que sea productora de un anticuerpo que se una específicamente al GCGR. Las células B también pueden aislarse de seres humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. En la técnica se conocen bien métodos para detectar células B individuales que sean productoras de un anticuerpo con la especificidad deseada, por ejemplo, formación de placas, separación de células activadas por fluorescencia, estimulación in vitro seguido de detección de anticuerpos específicos y similares. Como métodos para la selección de células B productoras de anticuerpos específicos se incluyen, por ejemplo, preparar una suspensión celular individual de células B en agar suave que contenga GCGR humano. La unión al antígeno, del anticuerpo específico producido por la célula B, da lugar a la formación de un complejo, que puede observarse como un inmunoprecipitado. Después de seleccionar las células B productoras del anticuerpo deseado, los genes de los anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento.

Un método adicional para obtener los anticuerpos de la invención es por presentación de fagos. Véanse, por ejemplo, Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al, 1994 Adv. Immunol. 57:191-280. Pueden crearse genotecas combinatorias de la región variable de inmunoglobulina humana o murina en vectores de fagos que pueden explorarse para seleccionar fragmentos (Fab, Fv o sFv o multímeros de los mismos) de Ig que se unen específicamente a la proteína de unión TGF-beta o a una variante o a un fragmento de la misma. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 5.223.409; Huse et al, 1989 Science 246:1275-1281; Sasrry et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:5728-32 (1989); Alting-Mees et al, Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990); Kang et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:4363-66; Hoogenboom et al, 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch et al, 1997 Hybridoma 16:47-52 y referencias citadas en los mismos. Por ejemplo, en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una variante del mismo, puede insertarse una biblioteca que contenga una pluralidad de secuencias de polinucleótidos que codifiquen fragmentos de la región variable de Ig, en fase con la secuencia que codifica una proteína de cubierta de fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de cubierta con el dominio de la región variable de cadena ligera y/o con el dominio de la región variable de cadena pesada. De acuerdo con determinadas realizaciones, los fragmentos Fab de inmunoglobulina también pueden presentarse en una partícula de fago (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.698.426).

También pueden prepararse bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en el fago lambda, usando, por ejemplo, los vectores !lmmunoZap™ (H) y !ImmunoZap™ (L) (Stratagene, La Jolla, California). Resumiendo, se aísla ARNm de una población de células B, y se usa para crear bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los vectores !lmmunoZap™ (H) y !ImmunoZap™ (L). Estos vectores pueden explorarse individualmente o co-expresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse et al., citado anteriormente; véase también Sastry et al, citado anteriormente). Posteriormente, las placas positivas pueden convertirse en un plásmido no lítico que permite un alto nivel de expresión de fragmentos de anticuerpos monoclonales a partir de E. coli.

En una realización, las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal de interés se amplifican en un hibridoma usando cebadores nucleotídicos. Un experto habitual en la materia puede sintetizar estos cebadores, o pueden adquirirse en fuentes comercialmente disponibles (Véase, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California), que comercializa cebadores para regiones variables de ratón y de ser humano incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones VHa, VHb VHc , VHd, CHI, VL y CL). Estos cebadores pueden usarse para amplificar regiones variables de cadena pesada o ligera, que después pueden insertarse en vectores tales como ImmunoZAP™ H o ImmunoZAP™ L (Stratagene), respectivamente. Después, para la expresión, estos vectores pueden introducirse en sistemas basados en E. coli, levaduras o mamíferos. Usando estos métodos pueden producirse grandes cantidades de una proteína monocatenaria que contenga una fusión de los dominios VH y VL (véase Bird et al., Science 242:423-426, 1988).

Una vez que se han obtenido las células productoras de anticuerpos de acuerdo con la invención, usando cualquiera de las técnicas de inmunización descritas anteriormente y otras técnicas, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm de los mismos de acuerdo con procedimientos convencionales como se describe en el presente documento. Los anticuerpos producidos a partir de estos pueden secuenciarse y las CDR pueden identificarse y el ADN que codifica las CDR puede tratarse como se ha descrito anteriormente para generar otros anticuerpos de acuerdo con la invención.

Las proteínas de unión a antígeno de la presente invención modulan preferentemente la señalización de glucagón en el ensayo basado en células descrito en el presente documento y/o en el ensayo in vivo descrito en el presente documento y/o bloqueo cruzado de la unión de uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud y/o bloqueo en cruzado de la unión de GCGR mediante uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud. Por consiguiente dichos agentes de unión pueden identificarse usando los ensayos descritos en el presente documento.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos se generan identificando en primer lugar anticuerpos que se unen a células que sobreexpresan los GCGR y/o se neutralizan en los ensayos in vivo y/o basados en células descritos en el presente documento y/o bloquean en cruzado los anticuerpos descritos en esta solicitud y/o se bloquean en cruzado a partir de la unión de los GCGR mediante uno de los anticuerpos descritos en esta solicitud.

Un experto en la materia entenderá que, algunas proteínas, tales como anticuerpos, pueden sufrir diversas modificaciones postraduccionales. El tipo y grado de estas modificaciones a menudo depende de la línea celular hospedadora utilizada para expresar la proteína, así como de las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en la glucosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperazina, isomerización de aspartato y/o desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un resto básico carboxiterminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, R.J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995).

Un método alternativo para la producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singénico, por ejemplo, un ratón que se ha tratado (por ejemplo, sensibilizado con pristano) para promover la formación de líquido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse mediante diversas técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína A Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., “Purification of Immunoglobulin G (IgG)”, en Methods in Molecular Biology, vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Los anticuerpos monoclonales pueden purificarse por cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado basándose en propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Como ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado sobre un soporte sólido, se incluyen Proteína A, proteína G, un anticuerpo anti-región constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo anti-idiotipo, y una proteína de unión TGF-beta, o un fragmento o una variante de los mismos.

La evolución molecular de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en el centro del sitio de unión del anticuerpo también se ha usado para aislar anticuerpos con afinidad aumentada, por ejemplo, anticuerpos que tienen afinidad aumentada por c-erbB-2, como describen Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551. Por consiguiente, dichas técnicas son útiles en la preparación de anticuerpos contra el receptor de glucagón humano.

Las proteínas de unión a antígeno dirigidas contra el receptor de glucagón humano pueden usarse, por ejemplo, en ensayos para detectar la presencia del receptor de glucagón, in vitro o in vivo.

Aunque los anticuerpos humanos, parcialmente humanos, o humanizados serán adecuados en muchas aplicaciones, particularmente las que implican la administración del anticuerpo a un sujeto humano, otros tipos de proteínas de unión a antígeno serán adecuadas para determinadas aplicaciones. Los anticuerpos no humanos de la presente invención pueden derivar, por ejemplo, de cualquier de cualquier animal productor de anticuerpos, tal como ratón, rata, conejo, cabra, burro, o un primate no humano (por ejemplo, mono, tal como, mono cinomolgo o mono rhesus) o un simio (por ejemplo, chimpancé)). Los anticuerpos no humanos de la invención pueden usarse, por ejemplo, en aplicaciones in vitro y en aplicaciones basadas en cultivos celulares, o en cualquier otra aplicación en la que no se produzca una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo de la invención, que no sea significativa, que pueda prevenirse, que no sea un problema, o que se dese. El Ejemplo 2, más adelante, describe la generación de un anticuerpo de ratón. En una realización, un anticuerpo no humano de la invención se administra a un sujeto no humano. En otra realización, el anticuerpo no humano no provoca una respuesta inmunitaria en el sujeto no humano. En otra realización, el anticuerpo no humano es de la misma especie que la del sujeto no humano, por ejemplo, un anticuerpo de ratón de la invención se administra a un ratón. Un anticuerpo de una especie particular puede generarse, por ejemplo, inmunizando a un animal de esa especie con el inmunógeno deseado o usando el sistema artificial para generar anticuerpos de esa especie (por ejemplo, un sistema basado en bacterias o en presentación de fagos para la generación de anticuerpos de una especie particular), o convirtiendo un anticuerpo de una especie en un anticuerpo de otra especie reemplazando, por ejemplo, la región constante del anticuerpo con una región constante de la otra especie, o reemplazando uno o más restos de aminoácidos del anticuerpo de tal manera que se parezca más fielmente a la secuencia de un anticuerpo de la otra especie. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende secuencias de aminoácidos derivadas de anticuerpos de dos

o más especies diferentes.

También pueden prepararse anticuerpos mediante cualquiera de las diversas técnicas convencionales. Por ejemplo, pueden purificarse de células que los expresan de forma natural (por ejemplo, un anticuerpo puede purificarse de un hibridoma que lo produzca), o pueden producirse en sistemas de expresión recombinante, usando cualquier técnica conocida en la materia. Véase, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analices, Kennet et al. (Eds.), Plenum Press, Nueva York (1980), y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Esto se comenta más adelante en el apartado Ácidos Nucleicos.

Mediante cualquiera de las diversas técnicas conocidas pueden prepararse proteínas de unión a antígeno, y explorarse con respecto a propiedades deseadas. Algunas de las técnicas implican el aislamiento de un ácido nucleico que codifica una cadena polipeptídica (o parte de la misma) de una proteína de unión a antígeno de interés (por ejemplo, un anticuerpo anti-receptor de glucagón) y el tratamiento del ácido nucleico a través de tecnología de ADN recombinante. El ácido nucleico puede fusionarse con otro ácido nucleico de interés, o modificarse (por ejemplo, por mutagénesis u otras técnicas convencionales) para añadir, delecionar o sustituir uno o más restos de aminoácidos, por ejemplo.

Cuando se desea mejorar la afinidad de los anticuerpos de acuerdo con la invención que contienen una o más de las CDR mencionadas anteriormente, puede obtenerse mediante diversos los protocolos de maduración por afinidad incluyendo el mantenimiento de las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995) redistribución de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutación de E. coli. (Low et al., J. Mol. Biol.., 250, 350-368, 1996), redistribución de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), presentación de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) y técnicas de PCR adicionales (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998) analizan todos estos métodos de maduración por afinidad.

Fragmentos de anticuerpos

En otro aspecto, la presente invención proporciona fragmentos de un anticuerpo anti-receptor de glucagón de la invención. Dichos fragmentos pueden consistir completamente en secuencias derivadas de anticuerpos o pueden comprender secuencias adicionales. Como ejemplos de fragmentos de unión a antígeno se incluyen los fragmentos Fab, F(ab')2, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y anticuerpos de dominio. En Lunde et al., 2002, Biochem. Soc. Trans. 30:500–06 se proporcionan otros ejemplos.

Pueden formarse anticuerpos monocatenarios por ligamiento de fragmentos (región Fv) de dominio variable de cadena pesada y ligera mediante un puente de aminoácidos (conector peptídico corto), dando como resultando una cadena polipeptídica sencilla. Dichos Fv monocatenarios (scFv, single chain Fv) se han preparado fusionando ADN que codifica un conector peptídico entre los ADN que codifican los dos polipéptidos de dominio variable (VL y VH). Los polipéptidos resultantes pueden volver a plegarse sobre ellos mismos para formar monómeros de unión a antígeno, o pueden formar multímeros (por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros), dependiendo de la longitud del conector flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al, 2001, Biomol Eng 18:95-108). Combinando diferentes polipéptidos que comprendan VL y VH, pueden formarse los scFv multiméricos que se unen a diferentes epítopos (Kriangkum et al, 2001, Biomol Eng 18:31-40). Como técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos monocatenarios se incluyen las descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85:5879, Ward et al, 1989, Nature 334:544, de Graaf et al, 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87. Los anticuerpos monocatenarios derivados de anticuerpos proporcionados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, los scFv que comprenden las combinaciones de dominio variable L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L10H10, l11H11, L12H12, L13H13, L14H14, L15H15, L16H16, L17H17, L18H18, L19H19, L20H20, L21H21, L22H22, y L23H23.

También pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno derivados de un anticuerpo, por ejemplo, por hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos de acuerdo con métodos convencionales. Como ejemplo, pueden producirse fragmentos de anticuerpos por escisión enzimática de los anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor tiol para producir fragmentos 3.5S Fab’ monovalentes. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de enlaces disulfuro. Como una alternativa, una escisión enzimática usando papaína produce directamente dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc. Estos métodos los describe, por ejemplo, Goldenberg, Patente de Estados Unidos Nº 4.331.647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman et al, en Methods in Enzymology 1: 422 (Academic Press 1967) y por Andrews, S.M. y Titus, J.A. en Current Protocols in Immunology, (Coligan J.E., et al, eds) John Wiley & Sons, Nueva York (2003), páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10A.1-2.10A.5. También pueden usarse otros métodos para la escisión de anticuerpos, tales como separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena pesada-ligera monovalentes (Fd), escisión de fragmentos adicionales, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que reconoce el anticuerpo intacto.

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Las CDR pueden obtenerse construyendo polinucleótidos que codifican la CDR de interés. Dichos polinucleótidos se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable usando, como molde, ARNm de células productoras de anticuerpos (véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991; Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), pág. 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), pág. 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)). Adicionalmente, el fragmento de anticuerpo puede comprender al menos un dominio de región variable de un anticuerpo descrito en el presente documento. Por tanto, por ejemplo, el dominio de la región V puede ser monomérico y ser un dominio VH o VL, que es capaz de unirse independientemente al receptor de glucagón humano con una afinidad al menos igual a 1 x 10-7 M o menor como se describe más adelante.

El dominio de región variable puede ser cualquier dominio variable de origen natural o una versión del mismo modificada por ingeniería genética. Por versión modificada por ingeniería genética se entiende un dominio de región variable que se ha creado usando técnicas de modificación por ingeniería genética de ADN recombinante. Dichas versiones modificadas por ingeniería genética incluyen las creadas, por ejemplo, a partir de una región variable de anticuerpo específica por inserciones, deleciones o cambios en o para las secuencias de aminoácidos del anticuerpo específico. Como ejemplos particulares se incluyen dominios de región variable modificados por ingeniería genética que contienen al menos una CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos armazón de un primer anticuerpo y el restante dominio de región variable de un segundo anticuerpo.

El dominio de región variable puede unirse por enlace covalente en un aminoácido C-terminal con al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. Por tanto, por ejemplo, un dominio VH que está presente en el dominio de región variable puede unirse a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o a un fragmento del mismo. De manera similar un dominio VL puede unirse a un dominio CK o a un fragmento del mismo. De esta manera, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab en el cual el dominio de unión a antígeno contiene dominios VH y VL asociados, unidos por enlace covalente, en su extremo C a un dominio CH1 y Cκ, respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con aminoácidos adicionales, por ejemplo, para proporcionar una región bisagra o una parte de un dominio de región bisagra como se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tales como dominios CH2 y CH3 de anticuerpo.

Derivados y variantes de proteínas de unión a antígeno

Las secuencias de nucleótidos de L1-L23 y H1-H23, que codifican las secuencias de aminoácidos correspondientes de A1-A23, pueden modificarse, por ejemplo, por mutagénesis al azar o por mutagénesis dirigida a sitio (por ejemplo, mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos) para crear un polinucleótido modificado que comprenda una o más sustituciones, deleciones o inserciones de nucleótidos particulares en comparación con el polinucleótido no mutado. En Walder et al, 1986, Gene 42:133; Bauer et al. 1985, Gene 37:73; Craik, BioTechniques, enero de 1985, 12-19; Smith et al, 1981, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, y en las patentes de Estados Unidos Nos 4.518.584 y 4.737.462 se describen ejemplos de técnicas para realizar dichas modificaciones. Estos métodos, y otros, pueden usarse para preparar, por ejemplo, derivados de anticuerpos antireceptores de glucagón que tengan una propiedad deseada, por ejemplo, afinidad, avidez, o especificidad aumentadas por el receptor de glucagón, actividad o estabilidad aumentadas in vivo o in vitro o efectos secundarios in vivo reducidos en comparación con el anticuerpo no derivatizado.

Otros derivados de anticuerpos anti-receptor de glucagón dentro del ámbito de la presente invención incluyen conjugados covalentes o agregados de anticuerpos anti-receptor de glucagón, o fragmentos de los mismos, con otras proteínas o polipéptidos, tales como por expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados con los extremos N o C de un polipéptido de anticuerpo anti-receptor de glucagón. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido señal (o líder) heterólogo, por ejemplo, el líder del factor alfa de levaduras, o un péptido tal como una etiqueta epitópica. Las proteínas de fusión que contienen proteínas de unión a antígeno pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, poli-His). Una proteína de unión a antígeno también puede estar ligada al péptido FLAG, como se describe en Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988, y en la patente de Estados Unidos

5.011.912. El péptido FLAG es muy antigénico y proporciona un epítopo unido reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico (mAb), que permite realizar ensayos rápidos y facilitar la purificación de la proteína recombinante expresada. Los reactivos útiles para preparar las proteínas de fusión en las que el péptido FLAG se fusiona con un péptido determinado se encuentran disponibles en el comercio (Sigma, St. Louis, MO). En otra realización, como antagonistas del receptor de glucagón pueden emplearse oligómeros que contienen una o más proteínas de unión a antígeno. Los oligómeros pueden estar en forma de dímeros, trímeros u oligómeros superiores unidos por enlace covalente o no covalente. Los oligómeros que comprenden dos o más proteínas de unión a antígeno se contemplan para su uso, siendo un ejemplo un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.

Una realización se refiere a oligómeros que comprenden proteínas de unión a antígeno múltiples unidas mediante interacciones covalentes o no covalentes entre restos peptídicos fusionados con las proteínas de unión a antígeno. Dichos péptidos pueden ser conectores (espaciadores) peptídicos, o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Las cremalleras de leucina y determinados polipéptidos derivados de anticuerpos se encuentran entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de las proteínas de unión a antígeno en relación con esto, como se describe más adelante con más detalle.

En realizaciones particulares, los oligómeros comprenden de dos a cuatro proteínas de unión a antígeno. Las proteínas de unión a antígeno del oligómero pueden tener cualquier forma, tal como cualquiera de las formas descritas anteriormente, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferentemente, los oligómeros comprenden proteínas de unión a antígeno que tienen actividad de unión al receptor de glucagón.

En una realización, se prepara un oligómero usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. Por ejemplo, en Ashkenazi et al, 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn et al, 1990, Nature 344:677; y en Hollenbaugh et al, 1992 “Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”, en Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1

19.10.11 se ha descrito la preparación de proteínas de fusión que comprenden determinados polipéptidos heterólogos fusionados con diversas partes de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc). Una realización de la presente invención se refiere a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas fusionando un fragmento de unión al receptor de glucagón de un anticuerpo anti-receptor de glucagón con la región Fc de un anticuerpo. El dímero puede prepararse, por ejemplo, insertando, en un vector de expresión apropiado, una fusión génica que codifica la proteína de fusión, expresando la fusión génica en células hospedadoras transformadas con el vector de expresión recombinante y dejando que la proteína de fusión expresada se ensamble al igual que moléculas de anticuerpo, después de lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los restos Fc para producir el dímero.

La expresión “polipéptido Fc”, como se usa en el presente documento, incluye formas nativas y muteínas de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen formas truncadas de dichos polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve la dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden restos Fc (y oligómeros formados a partir de los mismos) ofrecen la ventaja de purificación fácil por cromatografía de afinidad sobre columnas de Proteína A o Proteína G.

Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la solicitud PCT WO 93/10151, es un polipéptido monocatenario que se extiende desde la región bisagra N-terminal hasta el extremo C nativo de la región Fc de un anticuerpo de IgG1 humano. Otro polipéptido Fc útil es la muteína de Fc descrita en la Patente de Estados Unidos 5.457.035 y en Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia de Fc nativa presentada en el documento WO 93/10151, con la excepción de que el aminoácido 19 se ha reemplazado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha reemplazado de Leu a Glu y el aminoácido 22 se ha reemplazado de Gly a Ala. La muteína presenta afinidad reducida por receptores de Fc. En otras realizaciones, la parte variable de las cadenas pesada y/o ligera de un anticuerpo anti-receptor de glucagón puede sustituirse por la parte variable de una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo

Alternativamente, el oligómero es una proteína de fusión que comprende proteínas de unión a antígeno múltiples, con o sin conectores peptídicos (péptidos espaciadores). Entre los conectores peptídicos adecuados se encuentran los descritos en las patentes de Estados Unidos 4.751.180 y 4.935.233.

Otro método para la preparación de proteínas de unión a antígeno oligoméricas implica el uso de una cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que promueven la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Las cremalleras de leucina se identificaron originalmente en diversas proteínas de unión a ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se han encontrado en diversas proteínas diferentes. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran los péptidos de origen natural y derivados de los mismos que forman dímeros o trímeros. Se describen ejemplos de dominios de cremallera de leucina adecuados para la producción de proteínas oligoméricas solubles en la solicitud PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína D tensioactiva pulmonar (SPD) descrita en Hoppe et al, 1994, FEBS Letters 344: 191. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada con la misma se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6: 267-78. En una estrategia, proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento de anticuerpo anti-receptor de glucagón o un derivado fusionado con un péptido de cremallera de leucina se expresan en células hospedadoras adecuadas, y los fragmentos o derivados de anticuerpo anti-receptor de glucagón oligoméricos solubles se recuperan del sobrenadante del cultivo.

En otra realización, los derivados de anticuerpo pueden comprender al menos una de las CDR descritas en el presente documento. Por ejemplo, en regiones marco conservadas de anticuerpos conocidos (IgG1, IgG2, etc.) puede incorporarse una o más CDR, o conjugarse con un vehículo adecuado para potenciar su semivida. Los vehículos adecuados incluyen, aunque sin limitarse a Fc, albúmina, transferrina y similar. En la técnica se conocen estos y otros vehículos adecuados. Dichos péptidos conjugados con CDR pueden estar en forma monomérica, dimérica, tetramérica u otra forma. En una realización, uno o más polímeros solubles en agua están unidos a una o más posiciones específicas, por ejemplo, en el extremo amino, de un agente aglutinante. En un ejemplo, un derivado de anticuerpo comprende una o más uniones de polímeros solubles en agua, incluyendo, aunque sin limitación, polietilenglicol, polioxietilenglicol o propilenglicol. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos: 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 y 4.179.337. En determinadas realizaciones, un derivado comprende uno o más de monometoxi-polietilenglicol, dextrano, glucosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de dichos polímeros. En determinadas realizaciones, uno o más polímeros solubles en agua están unidos al azar a una o más cadenas laterales. En determinadas realizaciones, el PEG puede actuar para mejorar la capacidad terapéutica de un agente aglutinante, tal como un anticuerpo. Algunos de estos métodos se comentan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 6.133.426.

Se apreciará que un anticuerpo de la presente invención puede tener al menos una sustitución de aminoácido, siempre que el anticuerpo conserve especificidad de unión. Por lo tanto, las modificaciones de las estructuras de los anticuerpos se incluyen dentro del ámbito de la invención. Estas pueden incluir sustituciones de aminoácidos, que pueden ser conservativas o no conservativas, que no destruyan la capacidad de unión de un anticuerpo al receptor de glucagón humano. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden incluir restos de aminoácidos de origen no natural, que típicamente se incorporan por síntesis química peptídica en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Estas incluyen peptidomiméticos y otras formas inversas o invertidas de restos de aminoácidos. Una sustitución de aminoácido conservativa también puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido nativo con un resto normativo, de tal manera que en esa posición hay escaso o ningún efecto sobre la polaridad o carga del resto de aminoácido. Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una clase de aminoácido o mimético de aminoácido por un miembro de otra clase con propiedades físicas diferentes (por ejemplo, tamaño, polaridad, hidrofobicidad, carga). Dichos restos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo humano que son homólogas a las de anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.

Por otra parte, un experto en la materia puede generar variantes de ensayo que contengan una sola sustitución de aminoácido en cada resto de aminoácido deseado. Después, las variantes pueden explorarse usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la materia. Dichas variantes podrían usarse para recopilar información sobre variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio de un resto de aminoácido particular da como resultado una actividad destruida, reducida indeseablemente o inadecuada, pueden evitarse variantes con dicho cambio. En otras palabras, en base a la información recopilada de dichos experimentos rutinarios, un experto en la materia puede determinar fácilmente los aminoácidos en los que deben impedirse sustituciones adicionales, tanto en solitario como en combinación, con otras mutaciones.

Un experto en la materia podrá determinar variantes adecuadas del polipéptido, como se expone en el presente documento, usando técnicas bien conocidas. En determinadas realizaciones, un experto en la materia puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad por regiones diana que se piensa que no son importantes para la actividad. En determinadas realizaciones, pueden identificarse restos y partes de las moléculas que están conservados entre polipéptidos similares. En determinadas realizaciones, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de modo adverso a la estructura del polipéptido. Adicionalmente, un experto en la materia puede revisar estudios de función-estructura identificando restos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. A la vista de dicha comparación, se puede predecir la importancia de los restos de aminoácidos en una proteína que se corresponde con restos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la materia puede optar por realizar sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos restos de aminoácidos importantes previstos.

Un experto en la materia también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con la estructura en polipéptidos similares. A la vista de dicha información, un experto en la materia puede predecir el alineamiento de restos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. En determinadas realizaciones, un experto en la materia puede decidir no efectuar cambios radicales en restos de aminoácidos previstos que están en la superficie de la proteína, dado que dichos restos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Se han dedicado diversas publicaciones científicas con respecto a la predicción de estructuras secundarias. Véanse Moult J., Curr. Op. in Biotech, 7 (4): 422-427 (1996), Chou et al, Biochemistry, 13 (2):222-245 (1974); Chou et al, Biochemistry, 113 (2):211-222 (1974);. Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Además, actualmente se dispone de programas informáticos que ayudan a predecir estructuras secundarias. Un método para predecir estructuras secundarias se basa en la realización de modelos de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor del 30 %, o una similitud mayor del 40 %, a menudo tienen topologías estructurales similares. El reciente desarrollo de las bases de datos estructurales de las proteínas (PDB) ha proporcionado la posibilidad de predecir mejor la estructura secundaria, incluyendo el posible número de plegamientos dentro de una estructura polipeptídica o proteica. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res, 27 (1): 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7 (3): 369376 (1997)) que en un polipéptido o en una proteína determinado(a), hay un número limitado de plegamientos y que una vez que se han resuelto diversas estructuras críticas, la predicción estructural llegará a ser enormemente más exacta.

Como métodos adicionales de predicción de la estructura secundaria se incluyen “encadenamiento” (Jones, D., Curr Opin Struct Biol., 7 (3): 377-87 (1997); Sippl et al, Structure, 4 (1): 15 -19 (1996)), “análisis de perfiles” (Bowie et al, Science, 253:164-170 (1991.); Gribskov et al, Meth Enzym, 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13):4355-4358 (1987)), y “ligamiento evolutivo” (Véase Holm, citado anteriormente (1999), y Brenner, citado anteriormente (1997)). En determinadas realizaciones, las variantes de anticuerpos incluyen variantes de glucosilación en las cuales el número y/o tipo de sitio de glucosilación se ha modificado en comparación con las secuencias de aminoácidos de un polipéptido parental. En determinadas realizaciones, las variantes comprenden un mayor o un menor número de sitios de N-glucosilación en comparación con la proteína nativa. Alternativamente, sustituciones que eliminan esta secuencia retirarán una cadena existente de carbohidratos unida a N. También se proporciona un reordenamiento de cadenas de carbohidrato unidas a N en las que uno o más sitios de glucosilación unidos a N (típicamente los que son de origen natural) están eliminados y en las que se crean uno o más sitios nuevos unidos a N. Las variantes de anticuerpo adicionales preferidas incluyen variantes de cisteína en las que uno

o más restos de cisteína están delecionados de o sustituidos por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa, tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína generalmente tienen menos restos de cisteína que la proteína nativa y típicamente tienen un número constante para minimizar interacciones resultantes de cisteínas no emparejadas.

Los expertos en la materia pueden determinar sustituciones de aminoácidos deseadas (tanto conservativas como no conservativas) en el momento en que dichas sustituciones se deseen. En determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar restos relevantes de anticuerpos contra el receptor de glucagón humano, o para aumentar o disminuir la afinidad de los anticuerpos contra el receptor de glucagón humano descrito en el presente documento.

De acuerdo con determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión y/o (5) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales sobre dichos polipéptidos. De acuerdo con determinadas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos sencillas o múltiples (en determinadas realizaciones sustituciones de aminoácidos conservativas) pueden realizarse en la secuencia de origen natural (en determinadas realizaciones, en la parte del polipéptido fuera del dominio (o dominios) que forman contactos intermoleculares). En determinadas realizaciones, típicamente, una sustitución de aminoácido conservativa no puede cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un reemplazo de aminoácido no debe tender a romper una hélice que se produce en la secuencia parental o a desestabilizar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). En Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., WH Freeman and Company, Nueva York (1984).); Introduction to Protein Strcuture (C. Branden y J. Tooze, eds, Garland Publishing, Nueva York, NY (1991)); y Thornton et al. Nature 354: 105 (1991) se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden unirse químicamente con polímeros, lípidos u otros grupos.

Los agentes de unión a antígeno pueden comprender al menos una de las CDR descritas en el presente documento incorporadas en una estructura armazón biocompatible. En un ejemplo, la estructura armazón biocompatible comprende un polipéptido, o una parte del mismo, que es suficiente para formar un soporte estructural, o armazón o esqueleto, conformacionalmente estable, que puede presentar una o más secuencias de aminoácidos que se unen a un antígeno (por ejemplo, las CDR, una región variable, etc.) en una región localizada en la superficie. Dichas estructuras pueden ser un polipéptido de origen natural o un polipéptido “plegado” (un motivo estructural), o pueden tener una o más modificaciones, tales como adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, con respecto a un polipéptido de origen natural o plegado. Estas estructuras pueden derivar de un polipéptido de cualquier especie (o de más de una especie), tal como de un ser humano, otro mamífero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o virus.

Típicamente las estructuras armazón biocompatibles están basadas en estructuras o esqueletos de proteína que no son dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden usarse las que se basan en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarcinostatina, citocromo b, dedo de cinc CP1 PST1, superenrollamiento, LACI-D1, dominio Z y dominios de Tendamistat (Véase, por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463469).

Adicionalmente, un experto en la materia reconocerá que los agentes de unión adecuados incluyen partes de estos anticuerpos, tales como una o más de las CDR1, CDR2, CDR3 de cadena pesada, CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera, como se describe específicamente en el presente documento. Al menos una de las regiones CDR1, CDR2, CDR3 de cadena pesada y CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera puede tener al menos una sustitución de aminoácidos, siempre que el anticuerpo conserve la especificidad de unión de la CDR no sustituida. La parte no CDR del anticuerpo puede ser una molécula no proteica, en la cual el agente de unión bloquea en cruzado la unión de un anticuerpo descrito en el presente documento con el GCGR humano y/o inhibe la actividad de la señalización de glucagón a través del receptor. La parte no CDR del anticuerpo puede ser una molécula no proteica en la cual el anticuerpo presenta un modelo de unión similar con los péptidos del GCGR humano en un ensayo de unión competitiva, como se muestra en al menos uno de los anticuerpos A1-A23, y/o neutraliza la actividad del glucagón. La parte no CDR del anticuerpo puede estar compuesta por aminoácidos, en la cual el anticuerpo es una proteína de unión recombinante o un péptido sintético, y la proteína de unión recombinante bloquea en cruzado la unión de un anticuerpo descrito en el presente documento con el GCGR humano y/o neutraliza la actividad de glucagón in vitro o in vivo. La parte no CDR del anticuerpo puede estar compuesta por aminoácidos, en la cual el anticuerpo es un anticuerpo recombinante, y el anticuerpo recombinante presenta un modelo de unión similar con los péptidos del GCGR humano en un ensayo de unión competitiva como se muestra en al menos uno de los anticuerpos A1-A23, y/o neutraliza la señalización del glucagón.

Ácidos nucleicos

En un aspecto, la presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos comprenden, por ejemplo, polinucleótidos que codifican toda o parte de una proteína de unión a antígeno, por ejemplo, una o las dos cadenas de un anticuerpo de la invención, o un fragmento, derivado, muteína, o variante de los mismos, polinucleótidos suficientes para su uso como sondas de hibridación, cebadores PCR o cebadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido, ácidos nucleicos antisentido para inhibir la expresión de un polinucleótido y secuencias complementarias de lo anterior. Los ácidos nucleicos pueden tener cualquier longitud. Pueden tener, por ejemplo, una longitud de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000 o más nucleótidos y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras y/o formar parte de un ácido nucleico más grande, por ejemplo, un vector. Los ácidos nucleicos pueden ser mono-o bicatenarios y pueden comprender nucleótidos de ARN y/o ADN, y variantes artificiales de los mismos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de anticuerpos (por ejemplo, cadena pesada o ligera, sólo dominios variables, o de longitud completa) pueden aislarse de células B de ratones que se han inmunizado con el antígeno GCGR. El ácido nucleico puede aislarse por procedimientos convencionales tales como reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de la cadena pesada y cadena ligera se han mostrado anteriormente. Los expertos en la materia apreciarán que, debido a la degeneración del código genético, cada una de las secuencias polipeptídicas descritas en el presente documento está codificada por una gran cantidad de secuencias distintas de ácidos nucleicos. La presente invención proporciona cada secuencia de nucleótidos degenerada que codifica cada proteína de unión a antígeno de la invención.

La invención proporciona adicionalmente ácidos nucleicos que se hibridan con otros ácidos nucleicos (por ejemplo, ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos de cualquiera de A1-A14) en condiciones de hibridación particulares. En la técnica se conocen bien métodos de hibridación de ácidos nucleicos. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como se define en el presente documento, por ejemplo, una condición de hibridación moderadamente rigurosa utiliza una solución de prelavado que contiene cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) 5X, SDS al 0,5 %, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de formamida al 50 % aproximadamente, SSC 6X, y una temperatura de hibridación de 55 ºC (u otras soluciones de hibridación similares, tal como una que contiene formamida al 50 % aproximadamente, con una temperatura de hibridación de 42 °C) y condiciones de lavado de 60 °C, en SSC 0,5X, SDS al 0,1 %. Una condición de hibridación rigurosa hibrida en SSC 6X a 45 ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,1 X, SDS al 0,2 % a 68 ºC. Adicionalmente, un experto en la materia puede controlar las condiciones de hibridación y/o de lavado para aumentar o disminuir la rigurosidad de la hibridación de tal manera que los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que tienen entre sí al menos una identidad de 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99 % típicamente permanecen hibridadas entre sí. Los parámetros básicos que influyen en la elección de las condiciones de hibridación y una orientación para diseñar condiciones adecuadas se exponen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch, y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., capítulos 9 y 11; y en Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al, eds, John Wiley & Sons, Inc., apartados 2.10 y 6.3 a 6.4), y los expertos habituales en la materia pueden determinarlas fácilmente basándose, por ejemplo, en la longitud y/o composición de bases del ADN. Pueden introducirse cambios por mutación en un ácido nucleico, conduciendo por lo tanto a cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno) que ésta codifica. Pueden introducirse mutaciones usando cualquier técnica conocida en la materia. En una realización, uno o más restos de aminoácidos particulares se cambian usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis dirigida a sitio. En otra realización, se cambian uno o más restos seleccionados al azar, usando, por ejemplo, un protocolo de mutagénesis al azar. Sin embargo, aunque se haga esto, para determinar una propiedad deseada puede expresarse y explorarse un polipéptido mutante.

En un ácido nucleico pueden introducirse mutaciones sin alterar significativamente la actividad biológica de un polipéptido que codifica. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en restos de aminoácidos no esenciales. En una realización, una secuencia de nucleótidos proporcionada en el presente documento para L-1-L-23 y H-1 a H-23, o un fragmento, variante o derivado deseado del mismo, está mutado de tal manera que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende una o más deleciones o sustituciones de restos de aminoácidos, mostrados en el presente documento para L-1 a L-23 y H-1 a H-23 con respecto a restos en los que dos o más secuencias son diferentes. En otra realización, la mutagénesis inserta un aminoácido adyacente en uno o más restos de aminoácidos mostrados en el presente documento para L1 a L-23 y H-1 a H-23 con respecto a restos en los que dos o más secuencias son diferentes. Alternativamente en un ácido nucleico pueden introducirse una o más mutaciones que cambian, de manera selectiva, la actividad biológica (por ejemplo, la unión al GCGR) de un polipéptido que codifica. Por ejemplo, la mutación puede cambiar cuantitativa o cualitativamente la actividad biológica. Son ejemplos de cambios cuantitativos los que incluyen aumentar, reducir o eliminar la actividad. Son ejemplos de cambios cualitativos los que incluyen cambiar la especificidad antigénica de una proteína de unión a antígeno.

También se describen moléculas de ácido nucleico que son adecuadas para uso como cebadores o sondas de hibridación para la detección de secuencias de ácido nucleico de la invención. Una molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solo una parte de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de longitud completa de la invención, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como una sonda o un cebador o un fragmento que codifica una parte activa (por ejemplo, una parte de unión a GCGR) de un polipéptido de la invención.

Pueden usarse sondas basadas en la secuencia de un ácido nucleico de la invención para detectar el ácido nucleico

o los ácidos nucleicos similares, por ejemplo, transcritos que codifican un polipéptido de la invención. La sonda puede comprender un grupo marcador, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Dichas sondas pueden usarse para identificar una célula que exprese el polipéptido.

En otro aspecto, la presente invención proporciona vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención o una parte del mismo. Ejemplos de vectores incluyen, pero sin limitación, plásmidos, vectores virales, vectores de mamífero no episomales y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinantes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión de un ácido nucleico en una célula hospedadora. Los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas en base a las células hospedadoras a usar para la expresión, que están unidas operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Las moléculas reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras (por ejemplo, el potenciador del gen temprano del SV40, el promotor del virus de sarcoma de Rous y el promotor de citomegalovirus), aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido, véase Voss et al, 1986, Trends Biochem Sci. 11:287, Maniatis et al, 1987, Science 236: 1237), y aquellas que dirigen la expresión inducible de una secuencia de nucleótidos en respuesta a un tratamiento o afección particular (por ejemplo, el promotor de metalotionina en células de mamífero y el promotor sensible a estreptomicina y/o sensible a tet en sistemas tanto procariotas como eucariotas (véase id.). Los expertos en la materia apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir de esta manera proteínas o péptidos, que incluyen proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, la presente invención proporciona células hospedadoras en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Las células hospedadoras procariotas incluem organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo

E. coli o bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen células de insecto, células de levadura, y líneas celulares establecidas de origen mamífero. Como ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamífero se incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) o sus derivados, tales como, CHO de Veggie y líneas celulares relacionadas, que crecen en medios aséricos (véase Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31) o la cepa DXB11 de CHO, que carece de DHFR (véase Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216-20). Líneas celulares CHO adicionales incluyen CHO-K1 (ATCC Nº CCL-61), EM9 (ATCC Nº CRL-1861) y UV20 (ATCC Nº CRL1862). Células hospedadoras adicionales incluyen la línea COS-7 de células renales de mono (ATCC CRL 1651) (véase Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células AM-1/D (descritas en la Patente de Estados Unidos N º 6.210.924), células HeLa, líneas celulares BHK (ATCC CRL 10), la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular renal de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) (véase McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821), células renales embrionarias humanas tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, otras líneas celulares de primate transformadas, células diploides normales, cepas de células derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HL-60, U937, HaK o Jurkat. Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, 1985) describen vectores de clonación y de expresión apropiados para su uso con hospedadores celulares de bacterias, hongos, levaduras y mamíferos.

Puede introducirse ADN vectorial en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o de transfección convencionales. Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizados, sólo una pequeña fracción de células puede integrar en su genoma el ADN extraño. Para identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador de selección (por ejemplo, de resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores de selección preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Entre otros métodos, pueden identificarse células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido por selección con fármacos (por ejemplo, las células que tienen incorporado el gen marcador de selección sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Las células transformadas pueden cultivarse en condiciones que promuevan la expresión del polipéptido, y el polipéptido puede recuperarse por procedimientos convencionales de purificación de proteínas. Un procedimiento de purificación de este tipo se describe más adelante en los Ejemplos. Los polipéptidos contemplados para su uso en el presente documento incluyen sustancialmente polipéptidos de anticuerpos anti-receptor de glucagón recombinantes homogéneos sustancialmente libres de materiales endógenos contaminantes.

Actividad de las proteínas de unión a antígeno

En un aspecto, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno, en particular, anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos, que se unen específicamente al receptor de glucagón humano. Dichos anticuerpos incluyen anticuerpos antagonistas o neutralizantes capaces de reducir o neutralizar la señalización del glucagón, como se determina, por ejemplo, mediante el ensayo funcional basado en células descrito en el Ejemplo

4. En una realización, las proteínas de unión a antígeno, tales como los anticuerpos humanos de la presente invención, tienen un valor de CI50 de 90 nM o menor, en otra realización tienen un valor de CI50 de 80 nM o menor, en otra realización el valor es de 70 nM o menor, en otra realización es de 60 nM o menor, en otra realización es de 50 nM o menor, en otra realización es de 40 nM o menor, en otra realización el valor es de 30 nM o menor, en otra realización de 25 nM o menor. En otra realización, las proteínas de unión de antígeno, tales como los anticuerpos humanos de la presente invención, pueden unirse específicamente al receptor de glucagón humano, y tienen un valor de CI50 que es sustancialmente similar al de un anticuerpo de referencia. En otra realización, las proteínas de unión a antígeno tienen una Kb (o Kd), medida por el ensayo descrito en los Ejemplos más adelante (o ensayos similares), que es sustancialmente similar a la de un anticuerpo de referencia. Como se usa en el presente documento, la expresión “sustancialmente similar” significa comparable a, o aproximadamente 100 %, 99 %, 98 %, 97 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 % o 50 % idéntica al valor de CI50 o Kb (o Kd) del anticuerpo de referencia. Como anticuerpos de referencia se incluyen, por ejemplo, anticuerpos que tienen una combinación de cadena pesada y cadena ligera L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L11H11, L12H12, L13H13, L15H15, L21H21 y L22H22. En una realización, los anticuerpos de referencia incluyen A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, A-7, A-8, A-9, A-10, A-12, A-13, A-15, A-21 y A-22. En otra realización, las proteínas de unión a antígeno, tales como los anticuerpos humanos de la presente invención, pueden unirse específicamente al receptor de glucagón humano, y disminuir la glucosa en sangre en un modelo animal. En una realización, la glucosa en sangre disminuye un 2% en comparación con animales no tratados, en otra realización la glucosa en sangre disminuye un 5 % en comparación con animales no tratados, en otra realización, la glucosa en sangre disminuye un 10 % en comparación con animales no tratados, en otra realización, la glucosa en sangre disminuye un 15 %, en otra realización un 20 %, en otra realización un 25 % o más, en comparación con animales no tratados. La cantidad de reducción de glucosa en sangre se controla por dosificación. Una dosificación terapéuticamente eficaz es la dosificación necesaria para reducir la glucosa en sangre dentro de un intervalo normal para el paciente humano o animal. Un modelo animal ejemplar es el ratón ob/ob, como se describe, en el Ejemplo 6 más adelante. En otra realización, los anticuerpos humanos de la presente invención pueden unirse específicamente al receptor de glucagón humano y mejorar la eliminación de glucosa en un modelo animal. Un modelo animal ejemplar es el mono cinomolgo, como se describe en el Ejemplo 7 más adelante. Una mejora de la eliminación de glucosa se refiere a la cantidad de tiempo que tarda en reducirse la glucosa en sangre después de una exposición a glucosa oral proporcionada al paciente humano o al animal, y es una medición de la tolerancia a la glucosa. Esto se mide mediante ensayos convencionales, tales como el ensayo de tolerancia a la glucosa oral (ETGO), como se describe en el ejemplo más adelante. Las proteínas de unión a antígeno de la presente invención puede mejorar la tolerancia a la glucosa en un modelo animal. Además, las proteínas de unión a antígeno pueden mejorar otros indicadores in vivo asociados con la diabetes de tipo 2 y la hiperglucemia, incluyendo, pero sin limitación, tolerancia alterada a glucosa, dislipidemia y síndrome metabólico.

Unión al receptor de glucagón humano

En una realización, la presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno que compiten en cruzado por la unión con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L11H11, L12H12, L13H13, L15H15, L17H17, L21H21 y L22H22. En otra realización, la presente invención proporciona anticuerpos humanos que compiten en cruzado por la unión con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia es A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, A-7, A-8, A-9, A-11l, A-12, A-13, A-15, A-21 y A-22. En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos humanos que se unen a la región de Ser80 a Ser119 del receptor de glucagón humano. En otra realización, la presente invención proporciona anticuerpos humanos que competen en cruzado por la unión con un anticuerpo de referencia, en el que el anticuerpo de referencia se une a la región de Ser80 a Ser119 del receptor de glucagón humano. En otra realización, la presente invención proporciona anticuerpos humanos que se unen a la región de Ser80 a Ser119 del receptor de glucagón y que tienen un valor de CI50 de 90 nM o menor, en otra realización de 80 nM o menor, en otra realización de 70 nM o menor, en otra realización de 60 nM o menor, en otra realización de 50 nM o menor, en otra realización de 40 nM o menor, en otra realización de 30 nM o menor, en otra realización de 25 nM o menor, como se determina, por ejemplo, en el ensayo indicado en el Ejemplo 4. En otra realización, la presente invención proporciona anticuerpos humanos que compiten en cruzado por la unión al receptor de glucagón humano con un anticuerpo de referencia, siendo A-3 el anticuerpo de referencia. En una realización adicional, cuando las proteínas de unión a antígeno se unen al receptor de glucagón humano, se unen al receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma Kd que la de un anticuerpo de referencia; inhiben la estimulación de glucagón del receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma CI50 que la de dicho anticuerpo de referencia; y/o compiten en cruzado por la unión con dicho anticuerpo de referencia sobre el receptor de glucagón humano, en el cual dicho anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en L1H1, L2H2, L3H3, L4H4, L5H5, L6H6, L7H7, L8H8, L9H9, L11H11, L12H12, L13H13, L15H15, L21H21 y L22H22.

En una realización adicional, se proporciona un anticuerpo humano aislado que, cuando se une al receptor de glucagón humano: se une al receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma Kd que la del anticuerpo de referencia; inhibe la estimulación de glucagón del receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma CI50 que la de dicho anticuerpo de referencia; y/o compite en cruzado por la unión con dicho anticuerpo de referencia sobre el receptor de glucagón humano, en el cual dicho anticuerpo de referencia se selecciona del grupo que consiste en A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, A-7, A-8, A-9, A-11, A-12, A-13, A-15, A-21 y A-22.

En una realización adicional, se proporciona un anticuerpo humano aislado que, cuando se une al receptor de glucagón humano: a. se une específicamente a la parte del aminoácido Ser80 a Ser119 del receptor de glucagón humano; b. reduce la señalización de glucagón con un valor CI50 de 90 nM o menor; c. disminuye la glucosa en sangre en un modelo animal; o (a) y (b), o (a), (b) y (c).

La capacidad para competir en cruzado con un anticuerpo se determina de la siguiente manera. El Ejemplo 8, más adelante, describe un ensayo de unión competitiva ejemplar usando A-3 como el anticuerpo de referencia. Los anticuerpos ensayados eran anticuerpos superables, que podían competir por la unión con A-3, parcialmente superables, que podían competir solo parcialmente para la unión con A-3, y anticuerpos no superables, que no podían competir por la unión con A-3. Los resultados se muestran en las Figuras 4-6.

Además, el sitio de unión del anticuerpo A-3 humano y de otros anticuerpos humanos se determinó por la construcción de receptores quiméricos de GCGR humano y receptores de GLP-1 humanos, como se describe en el Ejemplo 9 a continuación. Usando los receptores quiméricos, como se describe más adelante, y como se muestra en la Figura 7, se determinó que para el anticuerpo A-3, la región de los aminoácidos Ser80 a Ser117 del receptor de glucagón humano era necesaria y suficiente para la unión. Además, el GCGR humano contiene 3 pares de cisteínas. Para la unión del anticuerpo A-3, fueron necesarios el segundo y tercer pares de cisteínas, pero no el primer par. Esto contrastaba con los anticuerpos A-18, A-21 y A-10, que solo se unían cuando estaban intactos los 3 pares de cisteínas.

Indicaciones

La diabetes, en particular la diabetes de tipo 2, y sus complicaciones, son un problema cada vez mayor en la población mundial. Generalmente, esta enfermedad es el resultado de una producción de insulina alterada de las células ∀ pancreáticas. En la diabetes de tipo 2, la forma más común de la enfermedad, se piensa que una combinación de factores genéticos y ambientales produce insuficiencia de las células∀, dando como resultado una secreción y actividad de insulina alterada, y en muchos individuos resistencia a insulina. La obesidad es una afección que se piensa que contribuye a aumentar la diabetes de tipo 2 en adultos e incluso en niños. También se sabe que la dislipidemia, o HDL (lipoproteína de alta densidad) anómala y la LDL (lipoproteína de baja densidad) están relacionadas con la diabetes de tipo 2.

La diabetes tipo 2 se caracteriza por la insuficiencia de los músculos y otros órganos a responder a concentraciones normales de insulina en circulación. A esto le sigue un aumento en la secreción de insulina de las células beta pancreáticas, una afección conocida como hiperinsulinemia. Finalmente, las células beta ya no pueden equilibrarse, lo que conduce a tolerancia alterada a glucosa, a niveles alterados de glucosa en ayunas, a hiperglucemia crónica y a daño tisular. Además, se sabe que la pre-diabetes de tipo 2 está relacionada con dislipidemia, o HDL (lipoproteína de alta densidad) anómala, y LDL (lipoproteína de baja densidad). Tanto la dislipidemia como la hiperglucemia están presentes en pacientes que padecen síndrome metabólico.

La presente invención proporciona proteínas de unión a antígeno, en particular, anticuerpos humanos que pueden unirse al receptor de glucagón in vivo y reducen los niveles de glucemia en modelos animales. Las proteínas de unión a antígeno también pueden mejorar la tolerancia a la glucosa. En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos completamente humanos que tienen eficacia in vivo. El efecto de una sola inyección de anticuerpos en ratones ob/ob, por ejemplo, disminuye la glucosa en sangre varios días después de la inyección, proporcionando un tratamiento eficaz, de larga duración, para la hiperglucemia, diabetes de tipo 2 y trastornos relacionados. Una sola inyección de anticuerpos también mejora la eliminación de la glucosa (tolerancia a glucosa mejorada) de la sangre en ensayos de tolerancia a glucosa (ETG) realizados en monos cinomolgos como se describe más adelante. Las proteínas de unión a antígeno, y en particular los anticuerpos humanos de la presente invención, son útiles para disminuir la glucosa en sangre o suero, mejorar la tolerancia alterada a glucosa, mejorar los niveles de glucosa en ayunas y mejorar la dislipidemia. Por tanto, las proteínas de unión a antígeno, en particular los anticuerpos humanos de la presente invención, son útiles para el tratamiento de hiperglucemia, diabetes de tipo 2, síndrome metabólico y otras afecciones relacionadas, incluyendo dislipidemia. Además, se ha observado que la disminución de glucosa en sangre es útil en algunas circunstancias en la prevención y tratamiento de determinados cánceres, tales como cánceres colorrectales, como se indica en Richardson et al, Nature Clin Pract Oncol 2: 48-53 (2005), Giovannucci et al. Gastroenterology 132: 2208-2225 (2007), Krone et al, Integrative Cancer Ther 4 (1): 25-31 (2005), Chang et al, Diabetologia 46 (5): 595-607 (2003), Jee et al, Yonsei Med. J 46 (4): 449-55 (2005).

Métodos de tratamiento

En otro aspecto, se proporciona un método de tratamiento de un sujeto, que comprende administrar una dosificación terapéutica de las proteínas de unión a antígeno de la presente invención. En una realización, las proteínas de unión a antígeno son anticuerpos humanos. Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a un mamífero, incluyendo seres humanos, y se usa indistintamente con el término “paciente”. Los anticuerpos humanos, pueden usarse para tratar, controlar o prevenir un trastorno o una afección que se caracteriza por niveles excesivos de glucagón y/o glucosa en sangre en un sujeto, y mejorar la tolerancia a la glucosa. Estos trastornos incluyen hiperglucemia, síndrome metabólico y diabetes de tipo 2. El término “tratamiento” incluye el alivio o la prevención de al menos un síntoma u otro aspecto de un trastorno, o la reducción de la gravedad de una enfermedad y similar. No es necesario que una proteína de unión a antígeno, en particular un anticuerpo humano de acuerdo con la presente invención, efectúe una curación completa, o erradique cada síntoma o manifestación de una enfermedad, para constituir un agente terapéutico viable. Como se reconoce en el campo en cuestión, los fármacos empleados como agentes terapéuticos pueden reducir la gravedad de una patología determinada, pero no necesariamente anular cada manifestación de la enfermedad para considerarse como agentes terapéuticos útiles. De manera similar, un tratamiento administrado profilácticamente no necesita ser completamente eficaz en la prevención de la aparición de una afección para constituir un agente profiláctico viable. Simplemente basta con reducir el impacto de una enfermedad (por ejemplo, reduciendo el número o la gravedad de sus síntomas, o aumentando la eficacia de otro tratamiento, o produciendo otro efecto beneficioso), o reducir la probabilidad de que se produzca la enfermedad o el empeoramiento en un sujeto. Una realización de la invención se refiere a un método que comprende administrar a un paciente una proteína de unión a antígeno, tal como un anticuerpo humano, en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora prolongada sobre la línea basal de un indicador que refleja la gravedad del trastorno particular.

Como se entiende en el campo en cuestión, las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de unión a antígeno de la invención se administran a un sujeto de una manera apropiada a la indicación. En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenden los anticuerpos humanos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo, pero sin limitación, la vía parenteral, tópica o por inhalación. Si se inyecta, la composición farmacéutica puede administrarse, por ejemplo, por vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea, por inyección en embolada, o infusión continua. Se contempla la administración localizada, por ejemplo, en un lugar de enfermedad o lesión, al igual que la administración transdérmica y la liberación sostenida de implantes. La administración por inhalación incluye, por ejemplo, inhalación oral o nasal, el uso de un nebulizador, inhalación de la proteína de unión a antígeno en forma de aerosol y similar. Otras alternativas incluyen preparaciones orales que incluyen píldoras, jarabes o pastillas para chupar.

Ventajosamente, las proteínas de unión a antígeno de la invención, se administran en forma de una composición que comprende uno o más componentes adicionales tales como un vehículo, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Opcionalmente, la composición comprende adicionalmente uno o más agentes fisiológicamente activos, por ejemplo, como se describe más adelante. En diversas realizaciones particulares, la composición comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis agentes fisiológicamente activos además de una o más proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpos humanos) de la presente invención.

En una realización, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo humano de la invención junto con una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en un tampón adecuado para anticuerpos a un pH adecuado, un antioxidante, tal como ácido ascórbico, un polipéptido de bajo peso molecular (como aquellos que tienen menos de 10 aminoácidos), una proteína, un aminoácido, un carbohidrato tal como dextrina, un agente quelante tal como EDTA, glutatión, un estabilizante, y un excipiente. De acuerdo con normas de industria apropiadas, también pueden añadirse conservantes. La composición puede formularse como un liofilizado usando soluciones de excipientes apropiadas como diluyentes. Los componentes adecuados son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Ejemplos adicionales de componentes que pueden emplearse en formulaciones farmacéuticas se presentan en Remington’s Pharmaceutical Sciences de, 16ª Ed. (1980) y 20ª Ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PA.

Se proporcionan kits para el uso de expertos médicos que incluyen una o más proteínas de unión a antígeno de la invención y una etiqueta u otras instrucciones para su uso en el tratamiento de cualquiera de las afecciones comentadas en el presente documento. En una realización, el kit incluye una preparación estéril de uno o más anticuerpos humanos, que pueden estar en forma de una composición como se ha descrito anteriormente, y puede estar en uno o más viales.

Las dosificaciones y la frecuencia de la administración pueden variar de acuerdo con factores tales como la vía de administración, los anticuerpos particulares empleados, la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratar, de si la afección es aguda o crónica, y la estatura y el estado general del sujeto. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse mediante procedimientos conocidos en la técnica en cuestión, por ejemplo, en pruebas clínicas que pueden implicar estudios de aumento escalonado de la dosis.

Una proteína de unión a antígeno, en particular, los anticuerpos humanos de la invención, puede administrarse, por ejemplo, una o más veces, por ejemplo, a intervalos regulares durante un período de tiempo. En realizaciones particulares, un anticuerpo humano se administra durante un período de al menos una vez al mes o más, por ejemplo, durante uno, dos, o tres meses o incluso indefinidamente. Para el tratamiento de afecciones crónicas, el tratamiento prolongado es generalmente el más eficaz. Sin embargo, para el tratamiento de afecciones agudas, la administración durante períodos más cortos, por ejemplo de una a seis semanas, puede ser suficiente. En general, el anticuerpo humano se administra hasta que el paciente manifieste un grado de mejoría médicamente importante sobre la línea basal del indicador o indicadores seleccionados.

Un ejemplo de regímenes terapéuticos proporcionado en el presente documento comprende inyección subcutánea de una proteína de unión a antígeno, tal como un anticuerpo humano, una vez a la semana, a una dosis apropiada, para tratar una afección en la que los niveles de glucosa en sangre desempeñan una función. En el presente documento se proporcionan ejemplos de dichas afecciones e incluyen, por ejemplo, hiperglucemia, diabetes de tipo 2, tolerancia alterada a glucosa en ayunas, tolerancia alterada a glucosa y dislipidemia. La administración semanal o mensual de la proteína de unión a antígeno puede continuar hasta que se consiga un resultado deseado, por ejemplo, disminuir los síntomas del sujeto. Si fuera necesario, el tratamiento se puede reanudar, o, alternativamente, pueden administrarse dosis de mantenimiento.

Los niveles de glucosa en sangre de un sujeto pueden controlarse antes, durante y/o después del tratamiento con una proteína de unión a antígeno, tal como un anticuerpo humano, para detectar cambios, si hubiese, en sus niveles. Para algunos trastornos, la frecuencia elevada de glucosa en sangre puede variar de acuerdo con factores tales como la fase de la enfermedad. Para medir los niveles de glucosa pueden emplearse técnicas conocidas. Los niveles de glucagón también pueden medirse en la sangre del paciente usando técnicas conocidas, por ejemplo, ELISA.

Realizaciones particulares de la invención implican el uso de una proteína de unión a antígeno, tal como un anticuerpo humano y uno o más antagonistas de glucagón, por ejemplo, dos o más proteínas de unión a antígeno de la invención, o una proteína de unión a antígeno de la invención y uno o más antagonistas de glucagón distintos. En realizaciones adicionales, la proteína de unión a antígeno se administra en solitario o en combinación con otros agentes útiles para el tratamiento de la afección que padece el paciente. Como ejemplos de dichos agentes se incluyen fármacos proteináceos y no proteináceos. Cuando se administran agentes terapéuticos múltiples, las dosificaciones pueden ajustarse de manera consecuente, como se reconoce en la técnica en cuestión. La ”coadministración” y terapia de combinación no se limitan a la administración simultánea, sino que también incluyen regímenes de tratamiento en los que una proteína de unión a antígeno se administra al menos una vez durante el tratamiento, lo que implica administrar al paciente al menos otro agente terapéutico.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de preparación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes de tipo 2, hiperglucemia, síndrome metabólico, dislipidemia y trastornos relacionados, que comprende una mezcla de una proteína de unión a antígeno de la presente invención, por ejemplo, un anticuerpo humano, en un excipiente farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 y trastornos relacionados. Anteriormente se han descrito métodos de preparación de medicamentos.

Terapias de combinación

En otro aspecto, en el presente documento se describe un método de tratamiento de un sujeto para la diabetes con una proteína de unión a antígeno terapéutica de la presente invención, tal como los anticuerpos terapéuticos completamente humanos, junto con uno o más tratamientos distintos.

En una realización, dicha terapia de combinación consigue un efecto sinérgico. Las proteínas de unión a antígeno pueden estar en combinación con uno o más de los siguientes tratamientos actualmente disponibles para la diabetes de tipo 2. Estos incluyen biguanida (metaformina) y sulfonilureas (tales como gliburida, glipizida). Tratamientos adicionales dirigidos al mantenimiento de la homeostasis de la glucosa incluyen antagonistas de PPAR gamma (pioglitazona, rosiglitazona); e inhibidores de alfa glucosidasa (acarbosa, voglibosa). Tratamientos adicionales incluyen tratamientos inyectables tales como Exenatide® (péptido similar a glucagón), y Symlin® (pramlintida).

Habiendo descrito la invención, se ofrecen los siguientes ejemplos a modo ilustrativo y no limitativo.

Ejemplos

Ejemplo 1: preparación de antígeno

El ADNc del GCGR humano que codifica el receptor de glucagón de longitud completa de 477 aminoácidos (SEC ID Nº: 2) se subclonó en el vector de expresión pDC312 y se transfectó en células AM1D. Después de la selección y clonación de células sencillas, se seleccionó un solo clon (clon 1004) para caracterización posterior en base a la expresión del receptor en la superficie. El nivel de expresión del receptor (Bmax), determinado por análisis de unión de saturación, fue de 11,4 pmol de receptor de glucagón/mg de proteína de membrana.

Adicionalmente, una secuencia de ADNc que codificaba un GCGR N-terminal (del aminoácido 1 al 142 de la SEC ID Nº: 2) se fusionó en fase con el ADNc del Fc de la IgG1 humana y se subclonó en el vector pDsRa21 (descrito en el documento US 2005/0118643). Después de la transfección en células AM1D se seleccionó un conjunto estable de células. El Fc N-terminal del GCGR se purificó del medio acondicionado concentrado mediante una columna Fast flow de Proteína A recombinante (GE Healthcare) y después mediante una columna de intercambio aniónico Source 30Q (GE Healthcare).

Ejemplo 2: Generación de hibridomas anti-ser humano de ratón

Como antígeno, se usaron fracciones de membrana celular en crudo del clon 1004, como se ha descrito anteriormente, para inmunización convencional e IRMSI (Inmunización Rápida con Múltiples Sitios de Inyección) de ratones C57BL/6 o DBFl (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Después de diversas rondas de inmunización, los linfocitos se liberaron de los ganglios linfáticos (inmunización IRMSI) o del bazo (inmunización convencional) y se fusionaron con células de mieloma de ratón, Sp2/0-Ag14 (ATCC) por electrofusión. Las células fusionadas se sembraron en placas de 96 pocillos a la densidad de 2x104 células/pocillo en 100 #l de medio BD complementado con SBF al 10 %, Factor de Clonación de Origen al 5 % (BioVeris™), Penicilina-Estreptomicina-Glutamina 1x (Gibco) y OPI (oxaloacetato, piruvato e insulina, Sigma) 1x. Después de 24 horas en cultivo, a cada pocillo se añadieron 100 #l de HAT (hipoxantina 0,1 mM, timidina 0,16 mM, aminopterina 4 mM, Sigma) 2x. El medio se cambió a los 7 y 10 días posteriores a la fusión, respectivamente y los medios acondicionados se recogieron dos días después del cambio del 2º medio y se envió para exploración primaria como se describe más adelante.

Los sobrenadantes de hibridoma se sometieron a ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) basado en células o a FMAT (Tecnología de Ensayo por Microvolumen Fluorométrico) con células 1004 y en paralelo con células AM1D parentales. Los clones de hibridoma que contenían anticuerpos específicos contra GCGR se seleccionaron en base a la unión específica a las células 1004 pero no a las células AM1D.

Los anticuerpos monoclonales se purificaron parcialmente de los cultivos de hibridoma expandidos, como se describe más adelante, y se ensayaron usando ambos ensayos de unión basados en células y funcional (ELISA o FMAT) para la neutralización de la producción de AMPc inducido por glucagón, como se describe más adelante. Los clones positivos se expandieron, se clonaron células sencillas y adicionalmente se confirmaron por ensayos múltiples

Ejemplo 3: Generación de anticuerpos completamente humanos acuerdo con protocolos descritos, por ejemplo, en los documentos US 05/0118643, WO 05/694879, WO 98/24838, WO 00/76310 y en la patente de Estados Unidos Nº 7.064.244. Se realizó un total de dos campañas. Después de la inmunización inicial, se administraron rondas de inmunizaciones de refuerzo posteriores hasta conseguir la titulación de anticuerpos deseada. Se identificaron los animales que presentaban una titulación adecuada y los linfocitos se obtuvieron por drenaje de los ganglios linfáticos y, en caso de ser necesario, se agruparon para cada cohorte. En algunos casos, los linfocitos se disociaron del tejido linfoide triturando con un medio adecuado (por ejemplo, DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) para liberar las células del tejido. Se seleccionaron células B y se fusionaron con compañeros de fusión adecuados, tales como, por ejemplo, células no secretoras de mieloma P3X63Ag8.653 (Colección Americana de Cultivos Tipo CRL 1580, Kerney et al, J. Immunol. 123, 1548-1550 (1979)), como se describe en las referencias anteriores. Otros compañeros de fusión adecuados incluyen células Sp2/0-Ag14 (ATCC). Las células fusionadas se sedimentaron y se resuspendieron en medios de selección (típicamente, DMEM que contenía azaserina e hipozantina y otros materiales complementarios), se incubaron durante 20-30 minutos y después se resuspendieron en medio de selección y se cultivaron antes de realizar siembra en placa. Después, las células se distribuyeron en pocillos para maximizar la clonalidad y se cultivaron usando técnicas convencionales. Después del cultivo, los sobrenadantes de hibridoma se exploraron frente al clon celular del receptor de glucagón enriquecido 1004 y las líneas celulares parentales AM1D usando FMAT. Los aglutinantes específicos de GCGR se confirmaron posteriormente por análisis FACS con anticuerpo anti-IgG humana marcado con FITC (conjugado con isotiocianato de fluorosceína). Los clones de hibridoma que contenían los anticuerpos monoclonales específicos de receptores se expandieron de acuerdo con los protocolos descritos en el documento US 2005/0118643 y otras referencias indicadas anteriormente. Los sobrenadantes se ensayaron para determinar la inhibición de la producción de AMPc inducida por glucagón como se describe más adelante. Los clones de hibridoma que contenían el anticuerpo antagonista se clonaron en células sencillas y se expandieron para ensayo posterior. Después, los anticuerpos se purificaron como se describe más adelante y los anticuerpos purificados de estos clones sencillos se ensayaron de nuevo después para determinar la actividad neutralizante.

Los anticuerpos se purificaron de los medios de los hibridomas acondicionados usando resina Mab Select (GE Healthcare). Se añadieron 100 #l de una suspensión de resina Mab Select 1:2 equilibrada en PBS a entre 7 y 10 ml de medio acondicionado (MA). Los tubos se colocaron en rotadores a 4-8 ºC durante una noche. Los tubos se centrifugaron a 1.000 Xg durante 5 minutos y la fracción no unida se decantó. La resina se lavó con 5 ml de PBS, se centrifugó y se decantó, como se ha indicado anteriormente. La resina se transfirió después a un tubo SPIN-X, 0,45 #m, 2 ml. La resina se lavó dos veces más con 0,5 ml de PBS y se centrifugó. Los anticuerpos monoclonales se eluyeron con 0,2 ml de ácido acético 0,1 M incubando a temperatura ambiente con mezclado ocasional durante 10 minutos. Los tubos se centrifugaron y al eluato se añadieron 30 #l de tampón Tris 1 M, pH 8,0. Los anticuerpos purificados se conservaron a 4-8 ºC.

Ejemplo 4: Caracterización in vitro de anticuerpos

Ensayos de unión de anticuerpo/receptor: ELISA basado en células completas

Células CHO que sobreexpresaban GCGR (clon 1004) y células parentales (AM1D) se sembraron en microplacas hasta una confluencia del 90 %. Las células se bloquearon con BSA y se incubaron con los sobrenadantes de hibridomas a 4 ºC durante 90 minutos. Después de un lavado intensivo, las células se incubaron con anticuerpo de detección anti-Fc de IgG murino de cabra conjugado con HRP (Pierce) y se lavaron tres veces. Se añadieron 50 #l/pocillo de sustrato TMB (KPL) y se dejó incubar a TA durante 5-10 minutos. La reacción se detuvo con la adición de 50 #l de H2SO4 0,5 N y la placa se leyó a 450 nm en un Spectramax (Molecular Devices). Los sueros de ratones inmunizados con membranas GCGR se usaron como controles positivos y los medios en solitario como control de fondo.

Ensayos de unión anticuerpo/receptor: FMAT

Células CHO que sobreexpresaban GCGR (clon 1 004) se sembraron en micoplacas de 96 pocillos, de paredes negras y fondo transparente (Applied Biosystems) a una densidad de sub-confluencia (50-60 %) y se incubaron con los sobrenadantes de hibridoma a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se registraron las imágenes celulares y las cantidades de fluorescencia de unión a células después de incubar con anticuerpo secundario marcado con azul FMAT (anti-IgG humana de cabra, Applied Biosystems) usando el sistema de detección celular 8200 (Applied Biosystems).

Ensayo funcional basado en células

Los anticuerpos anti-receptor de glucagón se ensayaron para determinar su actividad neutralizante en un ensayo funcional basado en células usando líneas celulares funcionales estables. Se transfectaron construcciones de expresión (pcDNA3.1, Invitrogen) que contenían los ADNc de GCGR de ser humano, ratón, rata, mono cinomolgo o rata (los ADNc que codifican las SEC ID Nos: 2, 4, 6, 8 respectivamente) en células CHO K1 respectivamente estableciendo líneas celulares estables. Las líneas celulares funcionales finales que expresaban GCGR de las

especies anteriormente mencionadas eran células sencillas clonadas de los grupos transfectados y se ensayaron para determinar la producción de AMPc estimulada por glucagón. Basándose en la CE50 de cada línea individual, se seleccionaron líneas celulares de ensayo final y se depositaron en un banco para usos futuros.

5 Se usó el siguiente protocolo para determinar la Kb, o la constante de disociación de la unión de anticuerpo, calculada mediante análisis de Schild en base al cambio de una curva de respuesta a la dosis en presencia de un antagonista, en un ensayo de unión competitiva. El uso del análisis de Schild se describe por Lazaeno et al, Br. J. Pharmacol. 109 (4): L 110-9 (1993). Este ensayo está adaptado a partir del uso de pequeñas moléculas para usar con anticuerpos en el presente documento. Tanto el sobrenadante de hibridoma como los anticuerpos purificados se

10 ensayaron usando el siguiente protocolo.

Se usó el kit HTRF (Fluorescencia Homogénea Resuelta en Tiempo)-AMPc Dinamic de Cisbio para el ensayo funcional. Primero se exploraron los sobrenadantes de hibridoma de los clones que mostraban unión específica al GCGR humano en el ensayo de unión usando un ensayo funcional. Después los anticuerpos se purificaron del

15 medio acondicionado con hibridoma y volvieron a ensayarse para determinar los valores Kb y CI50. Los anticuerpos que eran antagonistas de glucagón, capaces de inhibir la producción de AMPc después de la estimulación con glucagón podían identificarse usando este proceso.

La línea celular funcional estable seleccionada como se ha descrito anteriormente se sembró en placas de 96 semi

20 pocillos. El anticuerpo GCGR se añadió en los pocillos y se incubó a 37 ºC durante 20 minutos seguido por la adición de glucagón (Calbiochem) e incubación a 37 ºC durante 15 minutos más. Después de añadir el conjugado-AMPc en tampón de lisis y después anti-AMPc-criptato (anticuerpo contra AMPc conjugado con criptato) en los pocillos, la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora antes de leer con RubyStar (lector de microplaca fluorescente de BMG Labtech).

25 Los anticuerpos purificados se ensayaron inicialmente a una concentración de 2 #M con la línea celular GCGR humana funcional. Las células se estimularon con glucagón 50 pM y los anticuerpos que mostraron fuerte actividad inhibidora se seleccionaron para la determinación de CI50, que se define como la concentración de anticuerpo necesaria para inhibir la mitad de la respuesta máxima sobre la línea basal. Los anticuerpos se ensayaron a partir de

30 una concentración 1 #M y seguido de una dilución secuencial en serie secuencial con factor 2. La curva de respuesta a la dosis se representó gráficamente y la CI50 se determinó usando el programa informático GraphPad Prism. Se seleccionaron anticuerpos con el valor de CI50 bajo para el GCGR humano y adicionalmente se ensayaron para determinar actividades de receptores de especies cruzadas usando las líneas celulares apropiadas.

35 CI50 de anticuerpos humanos en ensayos funcionales

CI50 (nM)

Anticuerpo: Ser humano Mono cinomolgo Murino Rata

A-3: 9,1 22,5 4,9 13,5

A-4: 18,1 52,1 10,1 17,2

A-9: 7,4 26,6 4,1 9,9

Para determinar la fuerza relativa de los anticuerpos anti-GCGR humanos través de diferentes especies, se realizó

análisis de Schild para cada uno de los anticuerpos seleccionados. Resumiendo, los anticuerpos se ensayaron a 40 diferentes concentraciones, de 100 nM a 10 fM, en presencia de una dilución en serie de glucagones. Las curvas de

respuesta a la dosis de glucagón a diferentes concentraciones de anticuerpos se representaron gráficamente

usando el programa informático GraphPad Prism. Se calculó el valor de pA2, que es el logaritmo negativo de la

concentración de anticuerpo necesaria para producir un desplazamiento a la derecha de 2 veces de la curva de

respuesta a la dosis de glucagón, para el anticuerpo. Cuando la pendiente de Schild equivale a 1, pA2 equivale a 45 pKb, la constante de disociación del anticuerpo de unión. Entonces, Kb derivaba del anti-log de pKb y puede usarse

directamente para comparar la fuerza relativa de los anticuerpos individuales a través de las especies.

Se ensayaron anticuerpos adicionales para determinar su actividad contra el GCGR humano.

Anticuerpo: CI50 (nM)

A-1: 15,0

A-2: 10,1

A-5: 13,3

Anticuerpo: CI50 (nM)

A-6: 32,2

A-7: 8,8

A-8: 10,4

A-10: Sin actividad

A-11: 16,7

A-12: 21,3

A-13: 72,6

A-14: 457,5

A-15: 11,3

A-16: Sin actividad

A-17: Sin actividad

A-18: 203,7

A-19: Sin actividad

A-20: Sin actividad

A-21: 47,2

A-22: 7,2

A-23: Sin actividad

Valores Kb determinados por análisis Schild

Kb (nM)

Ser humano: Mono cinomolgo Murino Rata

A-3: 1,6 5,0 0,5 3,2

A-4: 1,76 5,7 0,88 ND

5 Ejemplo 5: Expresión recombinante y purificación de anticuerpos

Desarrollo de anticuerpos que expresan líneas celulares estables

Se diseñaron cebadores PCR para capturar la pauta abierta de lectura de la cadena ligera completa y el péptido

10 señal y la región variable de la pauta abierta de lectura de la cadena pesada basándose en las secuencias de ADN de cada anticuerpo proporcionado por Abgenix. La cadena ligera completa y el péptido de señal de cadena pesada y la región variable más la región constante de IgG2 humana se ligaron en los vectores de expresión pDC323 y pDC324 respectivamente.

15 Como ejemplo de los grupos de cebadores de la PCR; el cebador de la cadena ligera de A-9 en posición 5’ fue 4337-12 (5'-AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG ATG GAC AGG GTC CCC GCT CAG CTC CTG-3') (SEC ID Nº: 313) que contiene el sitio de restricción enzimática SalI, un codón de terminación en fase, la secuencia Kozak y codifica los aminoácidos MDMRVPAQLL (SEC ID Nº: 314) y el cebador en posición 3' 3250-80 (5'-AAC CGT TTA AAC GCG CCG TCG CAA CAC TCT CCC CTG TTG AA-3') (SEC ID Nº: 315) que contiene el sitio de

20 restricción enzimática NotI, el codón de terminación y codifica los aminoácidos FNRGEC (SEC ID Nº: 316). El cebador de la cadena pesada de A-9 en posición 5’ fue 3444-34 (5'-AAG CTC GAG GTC GAC TAG ACC ACC ATG GAG TTT GGG CTG CAG TGG GTT TTC-3') (SEC ID Nº: 317) que contiene el sitio de restricción enzimática Sall, un codón de terminación en fase, la secuencia Kozak y codifica los aminoácidos MEFGLSWVF (SEC ID Nº: 318), el cebador del punto de unión de la región variable de cadena pesada de A-9/cadena IgG2 (+) 4341-29 (5'-GAC CAC

25 CAC CGT GGT CTC CTC AGC CTC CAC CAA CCC GGG ATC GGT CTT-3') (SEC ID Nº: 319) y su cebador de cadena complementaria (-) 4341-30 (5'-AAG ACC GAT GGG CCC TTG GTG GAG GCT GAG GAG ACG GTG ACC GTG GTC-3') (SEC ID Nº: 320) que codifica los aminoácidos GTTVTVSSASTKGPSVF (SEC ID Nº: 321) y el cebador en posición 3' 3250-79 (5'-AAC CGT TTA AAC GCG CCG TCG CAT TTA CCC GGA GAC AGG GA-3') (SEC ID Nº: 322) que contiene el sitio de restricción enzimática NotI, el codón de terminación y codifica los

30 aminoácidos SLSPGK (SEQ ID Nº: 323).

Las células hospedadoras CHO usadas para la transfección del plásmido (o plásmidos) de expresión anti-GCGR son una línea celular CHO derivada de células DXB-11 (Urlaub et al, PNAS US 77:4126-4220, (1980)) mediante adaptación a medio asérico (Rasmussen et al, Cytotechnology 28:31-42, 1998).

Se crearon líneas celulares anti-GCGR transfectando células hospedadoras con los plásmidos de expresión pDC323-anti-GCGR kappa y pDC324-[anti-GCGR-IgG2] usando un procedimiento de electroporación convencional. Después de la transfección de la línea celular hospedadora con los plásmidos de expresión las células se cultivaron en medio de selección (sin GHT) que contenía suero bovino fetal dializado al 4 % (ds o dfFBS) durante 2-3 semanas para permitir la selección del plásmido y recuperar las células. Después se retiró el suero del medio y las células se cultivaron en medio selectivo con GHT hasta conseguir una viabilidad > 85 %. Este grupo de células transfectadas se cultivó después en medio que contenía 150 nM de MTX.

Clonación de línea celular

Se preparó un banco de células de clones seleccionados de acuerdo con el siguiente procedimiento. La etapa de clonación garantizó que las poblaciones clonales y los bancos celulares se generasen permitiendo un rendimiento reproducible en la elaboración comercial. Un grupo amplificado de células que expresaban anticuerpos se sembró a dilución limitante en placas de 96 pocillos, y en estudios realizados a pequeña escala se evaluó el crecimiento y el rendimiento productivo de los clones candidatos.

Ejemplo 6: Actividad in vivo en ratones ob/ob

Ratones ob/ob macho de 12 semanas de vida (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) recibieron una inyección IP de tampón o de anticuerpo 3 o 4 a la dosis de 1 o 3 mg/kg (n = 8-10/grupo). La glucosa en sangre se midió al momento 0 y 24, 48, 72, 96, 120, 144, 192 y 240 horas después de una sola inyección de anticuerpo. La glucosa en sangre disminuyó con el anticuerpo 3 durante 8 días a una dosis de 3 mg/kg de anticuerpo como se muestra en la Figura 1.

De manera similar, ratones ob/ob macho 12 semanas de vida (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) recibieron una inyección IP de tampón o de anticuerpo 3 o 9 a la dosis de 1 o 3 mg/kg (n = 8-10/grupo). La glucosa en sangre se midió el momento 0 y 24, 72, 120, 192 y 240 horas después de una sola inyección de anticuerpo. La glucosa en sangre disminuyó con el anticuerpo 3 y 9 durante 8 días a una dosis de 3 mg/kg de anticuerpo como se muestra en la Figura 2. . Ejemplo 7: Eficacia in vivo en monos cinomolgo macho normales

Se evaluó la eficacia de una sola dosis subcutánea (SC) del anticuerpo A-9 en monos cinomolgo macho en el Yunnan Primate Center (Yunnan, China). Se realizaron ensayos de tolerancia a glucosa (GTT, Glucose Tolerance Test) en los monos ensayando la eliminación de glucosa de la sangre después de exponerlos a una dosis de glucosa oral. Como se observa en la Figura 3, los datos GTT se presentan como ABC (área bajo la curva), representando la eliminación de la glucosa midiendo la cantidad de glucosa en sangre a los 0, 30 y 90 minutos después de la exposición. Como se muestra en la Figura 3, la dosis previa GTT1 se administró de manera escalonada comenzando 24 días antes de la administración del anticuerpo, la dosis previa GTT2 se administró de manera escalonada comenzando 17 días antes de una sola dosis. El anticuerpo se administró a 30 monos cinomolgo macho en forma de una sola inyección subcutánea (SC) de un total de 3 o 30 mg/kg de anticuerpo A-9 o un control. GTT3 se administró a los monos 3 días después de la inyección, GTT4 se administró 8 días después de la inyección, y GTT5 se administró 17 días después de la inyección. Los resultados, mostrados en la Figura 3, fueron que, una sola inyección SC de 3 o 30 mg/kg del anticuerpo 9 mejoraba la eliminación de glucosa durante un ensayo de tolerancia a glucosa.

Ejemplo 8: Ensayos de unión competitiva

Varios de los anticuerpos de la presente invención se clasificaron usando un ensayo de unión competitiva para determinar cuáles eran los anticuerpos que competían en cruzado por la unión con un anticuerpo anti-GCGR de referencia marcado. Como un rastreador, el anticuerpo A-3 se marcó con colorante fluorescente Alexa (Molecular Probes/Invitrogen, Carlsbad, CA) preparado siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada anticuerpo se ensayó a través de un intervalo de dosis para determinar su capacidad de competir con el anticuerpo A-3 marcado, fijado a una concentración 1 nM, por la unión al receptor GCGR humano expresado en células CHO (como se ha descrito anteriormente). La intensidad de fluorescencia se midió por FMAT, como se describe en el Ejemplo 4, y se calculó el grado de inhibición de unión de A-3, marcado con Alexa, al receptor. En base a estos análisis se establecieron tres categorías de grupos de anticuerpos: anticuerpos superables, parcialmente superables y no superables, cuando competían con A-3 marcado con Alexa. Los anticuerpos superables podían competir por la unión con A-3, mientras que los anticuerpos no superables no podían competir en cruzado y parecían tener diferentes sitios de unión en el GCGR humano. Los anticuerpos parcialmente superables tenían cierto solapamiento del sitio de unión con A-3. Esto se muestra en las Figuras 4-6. Los anticuerpos ensayados y que se encontró que podían competir por la unión con

A-3 marcado con Alexa (superables) fueron A-11, A-2, A-7, A-12, A-17, A-6, A-8, A-15 y A-5. Los anticuerpos ensayados y que se encontró que solo podían competir parcialmente por la unión con A-3 marcado con Alexa (parcialmente superables) fueron A-16, A-14, A-20 y A-23. Los anticuerpos ensayados y que se encontró que no podían competir por la unión con A-3 marcado con Alexa fueron A-19 y A-10. Se observó que todos o la mayor parte de los anticuerpos superables mostraban actividad inhibidora en el ensayo basado en células (CI50) mientras que los anticuerpos parcialmente superables y no superables no mostraban actividad usando este ensayo.

Ejemplo 9: Construcción de receptores quiméricos

El GCGR humano es más homólogo al receptor de GLP-1 humano y ambos pertenecen a la familia B de GPCR (receptores acoplados a proteína G) con 3 pares de cisteínas en la sección N terminal de los receptores. Para determinar la región o el sitio sobre el GCGR humano al cual se unirán los anticuerpos humanos sometidos a ensayo y determinar la importancia de conformación mantenida por los tres pares de cisteínas que forman enlaces disulfuro entre sí, se generaron construcciones de receptores quiméricos múltiples entre el GCGR humano y el GLP1R humano (GLP-1R, número de registro NP_002053) y se expresaron en células. Esto se muestra en la Figura

7. Las secuencias de la quimera del GCGR humano se indican en la Figura 7. Por ejemplo, en la quimera 4 mostrada en la parte superior de la figura, los aminoácidos 1-142 son del GCGR humano y los restantes del receptor de GLP-1. La quimera 4 contiene los tres pares de cisteínas intactos. En la quimera 4 se introdujeron mutaciones puntuales en cisteínas emparejadas (Cys 1-3, Cys 2-5 o Cys 4-6) de tal manera que cada una de las tres quimeras posteriores, quimera-4 1CA, 3CA; 4 2CA, 5CA, y 4 4CA, 6CA tenía uno de los pares de cisteína alterado. La quimera 7 tiene los aminoácidos 1-79 del GCGR humano; la quimera 8 tiene los aminoácidos 80-477 del GCGR humano; la quimera 10 tiene los aminoácidos 80-142 del GCGR humano; la quimera 15 tiene los aminoácidos 80-119 del GCGR humano; la quimera 19 tiene los aminoácidos 1-119 y 143-477 del GCGR humano. La expresión de receptor de superficie celular se controló mediante fusión C terminal en fase de la proteína fluorescente. La unión del anticuerpo con el receptor quimérico específico se midió directamente por FMAT con el anticuerpo A-3 de referencia marcado con Alexa. Como se muestra en la Figura 7, todos los anticuerpos ensayados en el presente documento requieren el extremo N del GCGR humano (aminoácido 1-142) para la unión. Los anticuerpos A-18, A-21 y A-10 se comportan de manera similar ya que solo presentan unión en la quimera 4 con los tres pares de cisteínas intactos. Esto indica un epítopo conformacional para estos anticuerpos. Para el anticuerpo A-3, la secuencia de los aminoácidos 80 a 119 del GCGR humano, es necesaria y lo bastante suficiente para la unión de anticuerpos. Además, se demostró que los aminoácidos 120-142 del GCGR humano no eran necesarios para la unión de A-3. Por otro lado, para el anticuerpo A-3, la conformación se mantenía por el 2º y 3er par (Cys 2-5, Cys 4-6), pero no por el 1er par de cisteínas. Por lo tanto, el área del receptor con la que el anticuerpo A-3, y todos los anticuerpos que reaccionan en cruzado con A-3, se une al GCGR humano, está dentro de los aminoácidos Ser80 a Ser119 del GCGR humano.

El ámbito de la presente invención no debe limitarse a las realizaciones específicas descritas en el presente documento, que solo pretenden ser ilustraciones de aspectos individuales de la invención e incluir métodos funcionalmente equivalentes y componentes de la invención. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en el presente documento, serán obvias para los expertos en la materia a partir de la anterior descripción y dibujos acompañantes. Dichas modificaciones pretenden incluirse dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> AMGEN INC. YAN, HAI HU, SHAW-FEN SYLVIA BOONE, THOMAS C. LINDBERG, RICHARD A.

<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS RELACIONADOS CON ANTICUERPOS DEL RECEPTOR DE GLUCAGÓN

<130> A-1133-WO-PCT

<140> A asignar

<141>

<150> 60/846.202

<151>

<150> 60/968.977

<151>

<160> 324

<170> Patentln versión 3.3

<210> 1 5 <211> 1519

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<210 > 2

<211> 477 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211>: 1880 5 <212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 3

<210> 4

<211>: 485 5 <212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

<210> 5

<211>: 1875 5 <212> ADN

<213> Rattus norvegicus

<400> 5

<210 > 6

<211>: 485 5 <212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 6

<210> 7

<211>: 1434 5 <212> ADN

<213> Macaca fascicularis

<400> 7

<210> 8

<211>: 477 5 <212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 8

<210> 9

<211> 51 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9

aggtctagtc agagcctctt ggatagagat gatggagaca cctatttgga c 51 10

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 10

<210> 11 20 <211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11 25 aggtctagtc agagcctctt ggatagtgct gatggagaca cctatttgga c 51

<210> 12

<211> 17

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 13 cgggcaagtc agggcattag aaatgattta ggc 33

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 36

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15 agggccagtc agagtgttag cagcaactac ttagcc 36

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17 cgggcaagtc aggacattag aaatgatttt ggc 33

<210> 18

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 19 gggtctactc agagcctctt ggatagtgat gatggagaca cctatttgga c 51

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21 5 <211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 21 caggcgagtc aggacattag taagtattta aat 33

<210> 22

<211> 11

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

25 <400> 23 tctggagata aattggggga taaatatgtt tgc

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25 tctggagata aattggggga taaatatgct tgc

<210> 26 45 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 39

<212> ADN 55 <213> Homo sapiens

<400> 27 acccgcagca gtggcagcat tgtcagcaac tttgtgcaa

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 39

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29 actggaatca cctccaacat cggaagcaat actgtacac

<210> 30

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 39

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 31 tctggaagca ggtccaacat cggaagtaat tatgtatac

<210> 32

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 42

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33 actgggagca gctccaacat cggggcaggt tatgctgtac ac

<210> 34

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 48

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 35 aagtctagtc agagcctcct gcatagtgat ggaaagaact atttgttt

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 48

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 37 aggtctagtc agagcctcct gcatagtaat ggatacaact atttggat

<210> 38

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 39 cgggcaagtc agggcattag aaatgattta ggc

<210> 40

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 40 cgggcgagtc agggtattag cagctggtta gcc

<210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<210> 42

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<400> 43

<210> 44

<211> 21

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<211> 7

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<211> 21

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<211> 21

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<211> 7

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<211> 21

<212> ADN

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<211> 21

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<211> 21

<212> ADN

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<211> 21

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<400> 59 agtaataatc agcggccctc a

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<210> 61

<211> 21

<212> ADN

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<400> 61 aggaataatc agcggccctc a

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<210> 63

<211> 21

<212> ADN

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<211> 21

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<211> 7

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<210> 71

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<210> 79

<211> 27

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<211> 27

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<213> Homo sapiens

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<212> ADN

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<212> PRT

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<211> 27

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<213> Homo sapiens

<400> 94

ctacagcata atagttaccc tcgcagt

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<213> Homo sapiens

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<211> 27

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<210> 99

<211> 27

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<210> 100

<211> 9

<212> PRT

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<210> 101

<211> 15

<212> ADN

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<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<211> 5

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<400> 104

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<211> 5

<212> PRT

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<211> 21

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<212> PRT

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agctatgaca tgcac: 15

<210> 110

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aactatggca tgcac: 15

<210> 111

<211> 5

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<213> Homo sapiens

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<210> 112

<211> 15

<212> ADN

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<210> 113

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 113

<210> 114

<211> 15

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<210> 116

<211> 48

<212> ADN

<213> Homo sapiens

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<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 117

<210> 118

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<211> 15

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<210> 120

<211> 5

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<213> Homo sapiens

<400> 120

<210> 121

<211> 15

<212> ADN

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<210> 122

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<210> 123

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 123 tctatatggt atgatggaag taataaatat tatgtagact ccgtgaaggg c

<210> 124

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 124

<210> 125

<211> 51 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 125

tttatatggt atgatggaag tgaaaaatat tatgtagact ccgtgaaggg c 51 10

<210> 126

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 126

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<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 127 25 gttatgtggt atgatggaag taataaagac tatgtagact ccgtgaaggg c 51

<210> 128

<211> 17

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 128

35 <210> 129

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

40 <400> 129 gttatatcag atgatggaag tcataaatac tctgcagact ccgtgaaggg c

<210> 130

<211>: 17 45 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 130

<210> 131

<211>: 51 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 131

gaaatatgga atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51 10

<210> 132

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 132

<210> 133 20 <211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 133 25 gtgatatcac atgatggaag tgataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51

<210> 134

<211> 17

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 134

35 <210> 135

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

40 <400> 135 ggtatatggt atgatggaag gaataaatac tatgtagact ccgtgaaggg c

<210> 136

<211>: 17 45 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 136

<210> 137

<211>: 54 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 137 aggacatact acaggtccaa gtggtataat gattatgcag tatctgtgag aagt 54

<210> 138

<211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 138

<210> 139

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

25 <400> 139 tttatatcag atgatggaag taataaatac tatggagact ccgtgaaggg c

<210> 140

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 140

<210> 141

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 141 tttatatcag atgatggaag taataaatat tatggagact ccgtgaaggg c 51

45 <210> 142

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 142

gttatatcat atgatggaag taataaatac tatggagact ccgtgaaggg c

<210> 143

<211> 17 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 143

<210> 144

<211> 51

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 144 gttatatggt atgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51

20 <210> 145

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 145

<210> 146

<211> 51 30 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 146

cttatatcat ttgatggaag taataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51 35

<210> 147

<211> 17 <212>. PRT

<213> Homo sapiens 40

<400> 147

<210> 148 45 <211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 148 50 tggatcatcc ctgacagtgg tggcacaaag tatgcacaga agtttcaggg c 51

<210> 149

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 149

<210> 150

<211> 51 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 150

tggatcggcg tttacaatgg tcacacaaaa tatgcacaga agttccaggg c 51 15

<210> 151

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20

<400> 151

<210> 152 25 <211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 152 30 gaagtttcct accggttctc t

<210> 153

<211> 17

<212> PRT 35 <213> Homo sapiens

<400> 153

<210> 154

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens 45

<400> 154 attatatggt ctgatggaat taacaaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51

<210> 155 50 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 155

<210> 156

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens 10

<400> 156 aacattaata gtaggagtag tctcatatac tacacagact ctgtgaaggg c 51

<210> 157 15 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 157

<210> 158

<211> 51

<212> ADN 25 <213> Homo sapiens

<400> 158 tacattggta gtagtagtag tgccatatac tacggagact ctgtgaaggg c 51

30 <210> 159

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

35 <400> 159

<210> 160 40 <211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 160 45 tctatatggt atgatggaag taataaatat tatgtagact ccgtgaaggg c 51

<210> 161

<211> 17

<212> PRT 50 <213> Homo sapiens

<400> 161

<210> 162

<211> 51 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 162 tacattggta gtagtagtag tgccatatac tacgcagact ctgtgaaggg c 51

<210> 163

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 163

<210> 164

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

25 <400> 164 cttggtggtg gttttgacta c

<210> 165

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 165

<210> 166

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 166 atgggaggcg gctttgacta c

<210> 167 45 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 167

<210> 168

<211> 57

<212> ADN

<213> Homo sapiens

5 <400> 168 gaaaaagatc attacgacat tttgactggt tataactact actacggtct ggacgtc

<210> 169

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 169

<210> 170

<211> 57

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 170 gaggagacgt attacgatat tttgactggc tatcatcact actacggtat ggacgtc 57

<210> 171 25 <211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 171

<210> 172

<211> 57

<212> ADN 35 <213> Homo sapiens

<400> 172 gagcctcagt attacgatat tttgactggt tatgataact actacggtat ggacgtc

<210> 173

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

45 <400> 173

<210> 174

<211> 57

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 174

gaaaaaccgt attacgatat tttgactggt tatttctact actatggtat ggacgtc 57 5

<210> 175

<211> 19

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 175

<210> 176 15 <211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 176 ttagcagtgg cctttgacta c

<210> 177

<211> 7

<212> PRT 25 <213> Homo sapiens

<400> 177

<210> 178

<211> 36

<212> ADN

<213> Homo sapiens

35 <400> 178 gaagatggca gtggctggta cggtgctttt gacatc

<210> 179

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 179

<210> 180

<211> 48

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 180 gatcaatacg atattttgac tggttattct tctgatgctt ttgatatc 48

<210>: 181 55 <211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 181

<210>: 182 5 <211> 60

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 182 gcctattacg atattttgac tgattacccc cagtatgact actactacgg tatggacgtc

<210> 183

<211> 20

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 183

<210> 184

<211> 51

<212> ADN

<213> Homo sapiens 25

<400> 184 gatgggtatt acgatatttt gactggttat gaggatgatg cttttgatat c 51

<210> 185

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 185

<210> 186

<211> 60

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 186 gaagggtttc attacgatat tttgactggt tcctacttct actactacgg tatggacgtc 60

45 <210> 187

<211> 20

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 187

<210> 188

<211> 30 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 188

agggtagcag tggctgggta ctttgactac 10

<210> 189

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 189

<210> 190 20 <211> 27

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 190 25 atgcaaaata tacagcctcc tctcacc

<210> 191

<211> 18

<212> PRT 30 <213> Homo sapiens

<400> 191

35 <210> 192

<211> 57

<212> ADN

<213> Homo sapiens

40 <400> 192 gagagaggcc tctacgatat tttgactggt tattataact actacggtat tgacgtc

<210> 193

<211> 19 45 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 193

<210> 194

<211> 39 '

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 194 gatcagtata actggaacta ctactacggt atggacgtc

<210> 195

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 195

<210> 196

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 196 tatagaagtg gctggtcccc cctctttgac ttc

<210> 197'

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 197

<210> 198

<211> 33

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 198 tatagcagtg gctggtcccc cctctttgac tac

<210> 199

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 199

<210> 200

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223>: Ser o Thr 5

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Arg o Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223>: Asp o Ala 15

<400> 200

<210> 201

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

25 <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220> '

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Gly o Asp

<220>

<221> MOD_RES 35 <222> (10)..(10)

<223> Leu o Phe

<400> 201

<210> 202

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 45

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220>

<221> MOD_RES

<222> (10)..(10)

<223> Val o Ala

<400> 202 55

<210> 203

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Ser o Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Gly o Asp

<400> 203

<210> 204

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Glu o Gin

<400> 204

<210> 205

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220>

<221> MOD_RES

<222> (2)..(2)

<223> Ser o Thr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Thr o Ser

<400> 205

<210> 206

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 5 <223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Ser, Phe, Val o Gln

<220>

<221> MOD_RES

<222>: (4). .(4) 15 <223> Tyr o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8). .(8)

<223> Asn o Gln

<220>

<221> MOD_RES

<222>: (12). .(12) 25 <223> Val o Ala

<400> 206

<210> 207

<211> 17

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

35 <220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Val o Phe

<220>

<221>: MOD_RES 45 <222> (4)..(4)

<223> His, Asp o Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (8)..(8)

<223> Asp, Asn o His

<220>

<221>: MOD_RES 55 <222> (11)..(11)

<223> Tyr o Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223> Ala o Gly 108

<400> 207

<210> 208 5 <211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3) 15 <223> His o Gin

<220>

<221> MOD_RES

<222> (6)..(6)

<223> Asn, Asp o Tyr

<400> 208

25 <210> 209

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220>

<221> MOD_RES 35 <222> (6) .. (6)

<223> Asn o Ser

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9) .. (9)

<223> He o Val

<400> 209

<210> 210

<211> 19

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220> 55 <221> MOD_RES

<222> (2) .. (2)

<223> Lys, Glu o Pro

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223>: Asp, Thr, Gin o Pro 5

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> His o Tyr

<220>

<221> MOD_RES

<222> (12)..(12)

<223>: Asn, His, Asp o Phe 15

<220>

<221> MOD_RES

<222> (13)..(13)

<223> Tyr, His o Asn

<220>

<221> MOD_RES

<222> (17)..(17)

<223>: Leu o Met 25

<400> 210

<210> 211

<211> 7

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Descripción de secuencia artificial: Secuencia consenso sintética

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Leu o Met

<400> 211

45 <210> 212

<211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 212

<210> 213

<211> 113 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 213

<210> 214

<211> 323

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 214

<210> 215

<211> 113 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 215

<210> 216

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 216

<210> 217

<211> 107 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 217

<210> 218

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 218

<210> 219 20 <211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

25 <400> 219

<210> 220

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 220

<210> 221

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 221

<210> 222

<211> 324 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 222

<210> 223

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 223

<210> 224

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 224

<210> 225

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 225

<210> 226 20 <211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 226

<210> 227

<211> 113 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 227

<210> 228

<211> 321

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 228

<210> 229

<211> 107 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 229

<210> 230

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 230

<210> 231 20 <211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 231

<210> 232

<211> 318 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 232

<210> 233

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 233

<210> 234

<211> 318 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 234

<210> 235

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 235

<210> 236

<211> 318 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 236

<210> 237

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 237

<210> 238 20 <211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 238

<210> 239

<211> 110 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 239

<210> 240

<211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 240

<210> 241

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 241

<210> 242 10 <211> 330

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 242

<210> 243

<211> 110

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 243

<210> 244

<211> 330 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 244

10 <210> 245

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

15 <400> 245

<210> 246

<211> 336 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 246

<210> 247

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 247

<210> 248

<211> 336 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 248

<210> 249

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 249

<210>: 250 20 <211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 250

<210>: 251 5 <211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 251

<210> 252

<211> 321

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<400> 252

<210> 253

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 253

<210> 254 10 <211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 254

<210> 255

<211> 113

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 255

<210> 256

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 256

<210> 257

<211> 107

<212> PRT 15 <213> Homo sapiens

<400> 257

<210> 258

<211> 348 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 258

<210> 259

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 259

<210> 260

<211> 348 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 260

<210> 261

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 261

<210> 262

<211> 384 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 262

<210> 263

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 263

<210> 264 20 <211> 467

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 264

<210> 265

<211> 128

<212> PRT

<213> Homo sapiens 10

<400> 265

15 <210> 266

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

20 <400> 266

<210> 267

<211> 128 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 267

<210> 268

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 268

<210> 269

<211> 128 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 269

<210> 270

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 270

<210> 271

<211> 128 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 271

<210> 272

<211> 348

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 272

<210> 273

<211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 273

<210> 274 10 <211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 274

<210> 275

<211> 128

<212> PRT 20 <213> Homo sapiens

<400> 275

<210> 276

<211> 372" 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 276

<210> 277

<211> 124

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 277

<210> 278

<211> 374 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 278

<210> 279

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 279

<210> 280

<211> 375 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 280

<210> 281

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 281

<210> 282

<211> 375 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 282

<210> 283

<211> 125

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 283

<210> 284

<211> 387 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 284

<210> 285

<211> 129

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 285

<210> 286

<211> 378 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 286

<210> 287

<211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 287

<210> 288

<211> 387 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 288

<210> 289

<211> 129

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 289

<210> 290

<211> 357 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 290

<210> 291

<211> 119

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 291

<210> 292 20 <211> 381

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 292

<210> 293

<211> 127

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 293

15 <210> 294

<211> 384

<212> ADN

<213> Homo sapiens

20 <400> 294

<210> 295

<211> 128 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 295

<210> 296

<211> 366

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 296

<210> 297

<211> 122 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 297

<210> 298

<211> 360

<212> ADN

<213> Homo sapiens 15

<400> 298

<210> 299

<211> 120

<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<400> 299

10 <210> 300

<211> 348

<212> ADN

<213> Homo sapiens

15 <400> 300

<210> 301

<211>: 116 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 301

<210> 302

<211>: 360 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 302

<210> 303

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 303

<210> 304

<211> 321 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 304

<210> 305

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 305

<210> 306

<211> 318 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 306

<210> 307

<211> 106

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 307

<210> 308

<211> 978 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 308

<210> 309

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15

<400> 309

<210> 310

<211> 236

5 <212> PRT 213> Homo sapiens

<400> 310

<210> 311

<211> 473 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 311

<210> 312

<211> 236 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 312

<210> 313

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

<400> 313 aagctcgagg tcgactagac caccatggac atgagggtcc ccgctcagct cctg

<210> 314

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 314

<210> 315

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

<400> 315 aaccgtttaa acgcggccgc tcaacactct cccctgttga a

<210> 316

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 316

<210> 317

<211> 51

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

<400> 317 5 aagctcgagg tcgactagac caccatggag tttgggctga gctgggtttt c 51

<210> 318

<211> 9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

15 <400> 318

<210> 319 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> 25 <223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

<400> 319 gaccacggtc accgtctcct cagcctccac caagggccca tcggtctt: 48

<210> 320 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia artificial

35 <220> <223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

<400> 320 aagaccgatg ggcccttggt ggaggctgag gagacggtga ccgtggtc: 48

<210> 321 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia artificial 45 <220> <223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 321

<210> 322

<211> 41

<212> ADN 55 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Cebador sintético

<400> 322 aaccgtttaa acgcggccgc tcatttaccc ggagacaggg a

<210> 323

<211> 6

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: Péptido sintético

<400> 323

<210> 324

<211> 15

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 324 ggctatacct tgaac

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión a antígeno que comprende:

a.

un dominio variable de cadena ligera que comprende:

i.

una secuencia CDR1 de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 14;

ii. una secuencia CDR2 de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 45 o la SEC ID Nº: 50;

iii.

una secuencia CDR3 de cadena ligera que comprende la SEC ID Nº: 74, y

b.

un dominio variable de cadena pesada que comprende:

i.

una secuencia CDR1 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 102;

ii. una secuencia CDR2 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 128;

iii. una secuencia CDR3 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 169, y

en donde la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.
2. La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 1 que comprende:

(a)

un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a la SEC ID Nº: 217, 219 ó 229;

(b)

un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos al menos un 90 % idéntica a la SEC ID Nº: 263, 265 ó 275; o

(c)

una combinación de un dominio variable de cadena ligera y un dominio variable de cadena pesada, en la cual el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada se seleccionan del grupo de combinaciones que consisten en: un dominio variable de cadena ligera que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº: 217 y un dominio variable de cadena pesada que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº: 263; un dominio variable de cadena ligera que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº: 219 y un dominio variable de cadena pesada que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº: 265; y un dominio variable de cadena ligera que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº: 229, y un dominio variable de cadena pesada que tiene una identidad de secuencia de al menos un 90 % con la SEC ID Nº: 275,

en donde la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.
3.

La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 2, en la cual el dominio variable de cadena ligera y el dominio variable de cadena pesada se seleccionan del grupo de combinaciones que consiste en: un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 217 y un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 263; un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 219 y un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 265; y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 229 y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 275,

en donde la proteína de unión a antígeno se une específicamente al receptor de glucagón humano.
4.

La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 3, que adicionalmente comprende:

a.

la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 305;

b.

la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 307;

c.

la secuencia constante de cadena pesada de la SEC ID Nº: 309;

d.

la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 305 y la secuencia constante de cadena pesada de la SEC ID Nº: 309, o

e.

la secuencia constante de cadena ligera de la SEC ID Nº: 307 y la secuencia constante de cadena pesada de la SEC ID Nº: 309.
5.

La proteína de unión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la cual la proteína de unión a antígeno se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo que se une a antígeno, un anticuerpo monocatenario, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un fragmento Fab, un fragmento F(Fa')x, un anticuerpo de dominio, un anticuerpo de IgD, un anticuerpo de IgE, un anticuerpo de IgM, un anticuerpo de IgG1, un anticuerpo de lgG2, un anticuerpo de IgG3, un anticuerpo IgG4 y un anticuerpo de IgG4 que tiene al menos una mutación en la región bisagra.
6.

La proteína de unión a antígeno de la reivindicación 5, en la cual la proteína de unión es un anticuerpo humano.
7.

El anticuerpo humano de la reivindicación 6, en donde el anticuerpo comprende:

a.

una cadena ligera que tiene la SEC ID Nº: 312 y una cadena pesada que tiene la SEC ID Nº: 311; o

b.

una cadena ligera que tiene la SEC ID Nº 310 y una cadena pesada que tiene la SEC ID Nº: 311.
8.

La proteína de unión a antígeno de las reivindicaciones 1 ó 2 que, cuando se une al receptor de glucagón humano:

a.

se une al receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma Kd que la de un anticuerpo de referencia;

b.

inhibe la estimulación de glucagón del receptor de glucagón humano sustancialmente con la misma IC50 que la de dicho anticuerpo de referencia; o

c.

compite en cruzado por la unión con dicho anticuerpo de referencia sobre el receptor de glucagón humano,

en el cual dicho anticuerpo de referencia comprende una combinación de secuencias de dominio variable de cadena ligera y cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 217 y un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 263; un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 219 y un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 265; y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia como se indica en la SEC ID Nº: 229, y un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia como se indica en SEC ID Nº: 275.
9.

Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión a antígeno de las reivindicaciones 1 a 8 mezclada con un portador farmacéuticamente aceptable de la misma.
10.

Un ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos, que codifica el dominio variable de cadena ligera, el dominio variable de cadena pesada, o ambos, del agente de unión a antígeno de las reivindicaciones 1 ó 2.
11.

El ácido nucleico de la reivindicación 10, en el cual el polinucleótido que codifica la secuencia de cadena ligera se selecciona de las SEC ID Nos: 216, 218 y 288; y el polinucleótido que codifica la secuencia de cadena pesada se seleccionada de las SEC ID Nos: 262, 264 y 278.
12.

Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 10 u 11.
13.

Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 12.
14.

Un hibridoma capaz de producir el anticuerpo de la reivindicación 6 ó 7.
15.

Un método de producción de una proteína de unión a antígeno que se une específicamente al receptor de glucagón humano que comprende incubar la célula hospedadora de la reivindicación 13 en condiciones que permiten que esta exprese la proteína de unión a antígeno.
16.

La proteína de unión a antígeno de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición de la reivindicación 9 para su uso para

(i)

disminuir la glucosa en sangre;

(ii)

mejorar la tolerancia a glucosa; o

(iii) prevenir o tratar la diabetes de tipo 2 o un trastorno relacionado

en un sujeto que necesite dicho tratamiento.
17.

La proteína de unión a antígeno, el anticuerpo humano o el compuesto de la reivindicación 16 para el uso especificado en la misma, en el cual el trastorno relacionado es hiperglucemia, glucemia basal alterada, tolerancia alterada a glucosa, dislipidemia y síndrome metabólico.
18.

Un kit para el tratamiento de la diabetes de tipo 2 que comprende la composición de la reivindicación 9.
19.

El uso de la proteína de unión a antígeno de las reivindicaciones 1 a 8, o la composición farmacéutica de la reivindicación 9 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos que se benefician de la reducción de glucosa en sangre.
20.

El uso de la reivindicación 19 en el cual los trastornos se seleccionan de diabetes de tipo 2, hiperglucemia, glucemia basal alterada, tolerancia alterada a glucosa, dislipidemia y síndrome metabólico.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden 5 excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción

Literatura diferente de patentes citadas en la descripción