JP5564049B2 - 抗cd147抗体、方法及び使用 - Google Patents
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Description
本願は、2008年9月29日出願の米国特許出願第61/100,848号の優先権を主張するものであり、出願の全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、抗CD147抗体及び治療薬としてのその使用に関する。
Gln Gln Xaa1 Tyr Ser Xaa2 Pro Xaa3Thr
(I)
(式中、Xaa1は、Tyr又はAspであり;Xaa2は、Tyr又はSerであり;Xaa3は、Phe又はTyr又は非存在であり;Xaa4は、Thr又はPheである)に示されるような軽鎖CDR3(Lc−CDR3);並びにそれぞれSEQ ID NO:9及び11に示されるような配列から選択される軽鎖CDR1(Lc−CDR1)及び軽鎖CDR2(Lc−CDR2)アミノ酸配列と、を有する、単離された抗体である。
(1)ヒト化重鎖可変領域は、マウス2H3、4A5、5F6又は2C8重鎖からの3つの相補性決定領域(CDRS)と、場合により1つ以上のヒトフレームワーク残基置換を有する、ヒトアクセプター抗体重鎖からのフレームワークと、を含み、
(2)ヒト化軽鎖可変領域は、マウス2H3、4A5、5F6又は2C8軽鎖からの3つの相補性決定領域と、場合により1つ以上のヒトフレームワーク残基置換を有する、ヒトアクセプター抗体軽鎖からのフレームワークと、を含み、ヒト化抗体は、ヒトCD147に特異的に結合する。
CDR−相補性決定領域、HC−重鎖、GvHD移植片対宿主病、LC−軽鎖、IFN−インターフェロン(a、α;b、β)、Ig−免疫グロブリン、Mab−モノクローナル抗体、MMP−マトリックスメタロプロテイナーゼ、NHLF−正常ヒト肺線維芽細胞、NHDF−正常ヒト皮膚線維芽細胞線、VEGF−血管内皮増殖因子、VL−可変部軽鎖、VH−可変部重鎖
本明細書で使用されるとき、「抗体」は、抗体全体、及びその任意の抗原結合断片又は短鎖を含む。したがって、抗体は、本発明の抗体の中に取り込むことのできる、少なくとも1つの重鎖若しくは軽鎖の相補性決定領域(CDR)若しくはそのリガンド結合部、重鎖若しくは軽鎖可変領域、重鎖若しくは軽鎖定常領域、フレームワーク(FR)領域若しくはその任意の部分、又は結合タンパク質の少なくとも一部分などであるが、これらに限定されない免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む、任意のタンパク質又はペプチド含有分子を含む。用語「抗体」は、更に、抗体、その消化断片、特定部分及び変異体を包含することを意図し、これには抗体模倣薬が挙げられ、又は抗体の構造及び/若しくは機能を模倣する抗体の部分若しくはその特定断片若しくは一部を含み、単鎖抗体及びその断片が挙げられる。機能的断片は、予め選択された標的に対する抗原結合断片を含む。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例は、(i)Fab断片、VL、VH、CL及びCH、ドメインからなる一価断片;(ii)F(ab’)2断片、ヒンジ領域にてジスルフィド架橋により結合された2つのFab断片を含む二価断片;(iii)VH及びCH、ドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単腕(single arm)のVL及びVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al.,(1989)Nature 341:544〜546);並びに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)を含む。更に、Fv断片の2つのドメイン、VL及びVHは別個の遺伝子によりコードされているが、それらは組み換え方法を使用して、合成リンカーにより連結されることができ、前記合成リンカーは、VL及びVH領域が組み合わされて一価分子を形成している単一タンパク質鎖(単鎖Fv(scFv)として既知、例えば、Bird et al.(1988)Science 242:423〜426、及びHuston et al.(1988)Proc.Natl.Acad Sci.USA 85:5879〜5883参照)として作製されることを可能にする。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。これらの抗体断片は、当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、これらの断片はインタクト抗体と同一の方法で、有用性に関してスクリーニングされる。逆に、scFvコンストラクトのライブラリを使用して抗原結合能力に関してスクリーニングした後、従来の技術を使用して、ヒト生殖系列遺伝子配列をコードする他のDNAにスプライスしてもよい。そのようなライブラリの1つの例は、「HuCAL:ヒトコンビナトリアル抗体ライブラリ」(Knappik,A.et al.J Mol Biol(2000)296(1):57〜86)である。
本発明のCD147抗体は、インビトロ、インサイチュ及び/又はインビボで、少なくとも1つのCD147の活性若しくは結合、又はCD147の活性若しくは結合を、阻害し、又は遮断し、又は妨害する抗体である。好適な抗CD147抗体、特異的部分、又は変異体はまた、場合により、RNA、DNA、又はタンパク質合成、タンパク質放出、CD147受容体シグナル伝達、CD147切断、CD147活性、CD147生成及び/又は合成などであるがこれらに限定されない、少なくとも1つのCD147活性又は機能に影響を及ぼすことができる。
ELISAにおいてヒトCD147に結合し、
MDA−MB−231乳癌細胞に対するヒトCD147の結合を阻害し、
NHLFからのヒトCD147媒介性のMMP−1放出を、Fab 5F6のIC50以下のIC50で阻害し、
ヒト線維芽細胞からの腫瘍細胞媒介性のMMP−2の放出を阻害し、
ヒトCD147媒介性のVEGF放出刺激を阻害し、
100nM(10-7M)未満のKdでヒトCD147に結合し、
100nM未満の、より好ましくは10nM未満のKDでカニクイザルCD147に結合し、
SEQ ID NO:1の残基64〜75(DALPGQKTEF)により包含されるヒトCD147アイソフォーム2上のエピトープに結合する。
本発明の抗CD147抗体は、場合により、Kohler and Milstein(1975)Nature 256:495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術(ハイブリドーマ法)を含む、多様な技術により生成されてもよい。ハイブリドーマ法では、マウス、又はハムスター若しくはマカクザルなどの他の適切な宿主動物を本明細書に記載するように免疫化して、免疫化に使用したタンパク質に特異的に結合する抗体を生成する又は生成できるリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球はインビトロで免疫化されてもよい。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59〜103(Academic Press,1986))。
体の単離が提供される(Lonberg,N.et al.,US5569825,US6300129 and 1994,Nature 368:856〜9;Green,L.et al.,1994,Nature Genet.7:13〜21;Green,L.& Jakobovits,1998,Exp.Med.188:483〜95;Lonberg,N and Huszar,D.,1995,Int.Rev.Immunol.13:65〜93;Kucherlapati,et al.US6713610;Bruggemann,M.et al.,1991,Eur.J.Immunol.21:1323〜1326;Fishwild,D.et al.,1996,Nat.Biotechnol.14:845〜851;Mendez,M.et al.,1997,Nat.Genet.15:146〜156;Green,L.,1999,J.Immunol.Methods 231:11〜23;Yang,X.et al.,1999,Cancer Res.59:1236〜1243;Bruggemann,M.and Taussig,M J.,Curr.Opin.Biotechnol.8:455〜458,1997;Tomizuka et al.WO02043478)。このようなマウスの内因性免疫グロブリン遺伝子座を分断又は欠失させ、内因性遺伝子によりコードされた、抗体を産生する動物の能力を除去することができる。加えて、Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)及びMedarex(San Jose,Calif.)などの会社は、上述したような技術を使用して、選択された抗原に対して指向されるヒト抗体を提供するよう従事し得る。
本発明は更に、ヒトCD147に結合するヒト化免疫グロブリン(又は抗体)を提供する。免疫グロブリンのヒト化形態は、実質的にヒト免疫グロブリンからの可変フレームワーク領域(1つ以上)(アクセプター免疫グロブリンと呼ばれる)と、実質的にCD147に特異的に結合する非ヒトMabからのCDRと、を有する。存在する場合、定常領域(1つ以上)も、実質的にヒト免疫グロブリンからである。ヒト化抗体は、少なくとも約10^−6M(1マイクロM)、約10^−7M(100nM)又はそれ未満のCD147に対するKDを示す。ヒト化抗体の結合親和性は、そのヒト化抗体が由来するマウス抗体の結合親和性を上回り、又は下回り得る。CD147に対するヒト化抗体の親和性を変化させ、また親和性を改善するために、CDR残基又はヒト残基のいずれかに置換を行ってもよい。
以下に詳細に記載するように、本発明者らは、単離されたモノクローナル抗体の3つ(2H3、4A5、5F6)がCD147上の重複エピトープに結合し、インビトロ及び/又はインビボでのCD147阻害活性を有する。有意には、MAbの反応性は、MMP及びVEGFの産生を低下させ、血管新生を阻害する能力を含む。
本発明の抗CD147抗体、抗原結合断片、又はその特定の変異体を使用して、細胞、組織、器官又は動物(哺乳動物及びヒトを含む)内で測定し又は効果をもたらして、CD147により仲介、影響又は調節される状態の発生を診断し、監視し、調節し、処置し、軽減し、発生の予防を補助し、又は状態の症候を軽減することができる。そのような状態は、例えば組織再増殖、新生物疾病、転移性疾病、及び線維化状態におけるような細胞遊走及び組織リモデリングにより仲介される疾病又は状態から選択されるが、これらに限定されない。そのような疾病又は状態には、特に悪性及び神経系の疾患若しくは疾病、又は他の既知の若しくは特定のCD147関連の状態が挙げられ、CD147関連の状態には、炎症性又は自己免疫疾患若しくは疾病、心血管疾患若しくは疾病、又は感染症が不随し得る。特に、抗体は、血管形成が関与する疾病、例えば眼疾患及び腫瘍性疾患、再狭窄などの組織再形成及びある種の細胞型の増殖、特に上皮及び扁平上皮細胞癌の治療に有用である。特定の適応症としては、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、癌転移、関節リウマチ、糖尿病性網膜症及び黄斑変性症の治療における使用が含まれる。本発明の中和抗体は更に、例えば骨粗鬆症において見られる、又は一部の腫瘍によるPTHrP過剰発現の結果生じる、望ましくない骨吸収又は骨分解の予防又は治療にも有用である。抗体はまた、特発性肺線維症、糖尿病性腎症、肝炎、及び肝硬変といったさまざまな線維症の治療においても有用であり得る。
本発明は更に、肺炎;肺膿瘍;粉塵、ガス又は飛沫の形をした作用物質を原因とする職業性肺疾患;喘息、閉塞性繊維性細気管支炎、呼吸不全、過敏性肺炎(外因性アレルギー性肺胞炎)、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、及び薬物反応を含む肺の過敏性疾患;成人呼吸窮迫症候群(ARDS)、グッドパスチャー症候群、慢性閉塞性気道疾患(COPD)、特発性間質性肺疾患、例えば特発性肺線維症及びサルコイドーシス、剥離性間質性肺炎、急性間質性肺炎、呼吸細気管支炎関連間質性肺疾患、気質性肺炎を伴う特発性閉塞性細気管支炎、リンパ球性間質性肺炎、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、特発性肺ヘモジデリン沈着症;急性気管支炎、肺胞タンパク症、気管支拡張症、胸膜疾患、無気肺、嚢胞性線維症、肺腫瘍、及び肺栓塞症のうちの少なくとも1つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における肺又は胸膜疾病を調節又は治療するための方法をも提供している。
本発明はまた、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、B細胞、T細胞又はFAB ALL、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ球性白血病(CLL)、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群(MDS)、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、原疾患又は転移性疾患のような固形腫瘍、カポジ肉腫、直腸結腸癌、膵臓癌、腎細胞癌、中皮腫を含む肺癌、乳癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、悪性の腫瘍随伴症候群/高カルシウム血症、腺癌、扁平上皮細胞癌、肉腫、悪性黒色腫、特に転移性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、及び癌関連骨痛などのうちの少なくとも1つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における悪性疾患を調節又は治療するための方法をも提供している。
本発明は、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身型若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎(ankylosing spondilitis)、胃潰瘍、血清反応陰性関節症、変形性関節症、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎/ブドウ膜炎/視神経炎、突発性肺線維症、全身性血管炎/ウェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、精巣炎/精管復元術(vasectomy reversal procedure)、アレルギー性/アトピー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、過敏性肺炎、移植片、器官移植拒絶、移植片対宿主病、全身性炎症性応答症候群、敗血症症候群、グラム陽性菌敗血症、グラム陰性菌敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷/出血、やけど、電離放射線暴露、急性膵炎、成人呼吸窮迫症候群、関節リウマチ、アルコール性肝炎、慢性炎症性病態、サルコイドーシス、クローン病(Crohn’s pathology)、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、過敏反応、アレルギー性鼻炎、花粉症(hay fever)、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、蕁麻疹、全身アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少症、任意の器官又は組織の移植片拒絶、腎臓移植拒絶、心臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植(BMT)拒絶、移植皮膚拒絶、軟骨移植拒絶、骨移植片拒絶、小腸移植拒絶、胎児胸腺移植拒絶、副甲状腺移植拒絶、任意の器官又は組織の異種移植拒絶、同種移植片拒絶、抗受容体過敏反応、グレーブス病、レイノー病、B型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体介在細胞毒性、III型過敏反応、全身性エリテマトーデス、POEMS症候群(多発ニューロパチー、臓器肥大、内分泌疾患、単クローン性γグロブリン血症、及び皮膚変化症候群)、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合性結合組織病、特発性アジソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変(primary billiary cirrhosis)、白斑、血管炎、MI心臓切開術後症候群(post-MI cardiotomy syndrome)、IV型過敏症、接触性皮膚炎、過敏性肺炎、同種移植片拒絶、細胞内微生物による肉芽腫、薬物感受性、代謝性/突発性、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス(hemachromatosis)、α−1−抗トリプシン欠乏症、糖尿病性網膜症、橋本甲状腺炎、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価(hypothalamic-pituitary-adrenal axis evaluation)、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢胞性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、家族性食血細胞性リンパ組織球症(familial hematophagocytic lymphohistiocytosis)、皮膚科学的状態、乾癬、脱毛症、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒症、毒性、子癇前症、OKT3療法、抗CD3療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法(例えば喘息、貧血、悪液質などを含むがこれらに限定されない)、慢性サリチル酸塩中毒などのうちの少なくとも1つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における免疫関連の疾病を調節又は処置するための方法も提供する。例えば、Merck Manual,12th〜17th Editions,Merck & Company,Rahway,NJ(1972,1977,1982,1987,1992,1999),Pharmacotherapy Handbook,Wells et al.編、Second Edition,Appleton and Lange,Stamford,Conn.(1998,2000)を参照し、それぞれ参照によりその全体が組み込まれる。
本発明は、心機能不全症候群(cardiac stun syndrome)、心筋梗塞、うっ血性心不全、卒中、虚血発作、出血、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、糖尿病性動脈硬化性疾患(diabetic ateriosclerotic disease)、高血圧、動脈性高血圧、腎血管性高血圧、失神、ショック、心血管系の梅毒、心不全、肺性心、原発性肺高血圧、不整脈、心房異所性拍動、心房粗動、心房細動(持続性又は発作性)、還流後症候群、心肺バイパス炎症応答、無秩序型又は多源性心房頻脈、規則的狭QRS頻脈(regular narrow QRS tachycardia)、固有不整脈(specific arrythmias)、心室細動、ヒス束不整脈(His bundle arrythmias)、房室ブロック、脚ブロック、心筋虚血性疾患、冠動脈疾病、狭心症、心筋梗塞、心筋症、拡張型うっ血性心筋症、拘束型心筋症、心臓弁膜症、心内膜炎、心膜疾患、心臓腫瘍、大動脈瘤又は末梢動脈瘤、大動脈切開、大動脈の炎症、腹部大動脈及びその分岐の閉塞、末梢血管疾患、閉塞性動脈疾患、末梢アテローム硬化性疾患、閉塞性血栓性血管炎、機能性末梢動脈疾患、レイノー現象及び疾患、先端チアノーゼ、紅痛症、静脈性疾患、静脈血栓症、静脈瘤、動静脈瘻、リンパ浮腫(lymphederma)、脂肪性浮腫、不安定狭心症、再灌流傷害、ポンプ後症候群(post pump syndrome)、虚血再灌流障害などのうちの少なくとも1つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における心血管疾病の調節又は処置のための方法も提供する。
本発明は、神経変性疾患、多発性硬化症、片頭痛、AIDS認知症症候群、多発性硬化症及び急性横断性脊髄炎(acute transverse myelitis)などの脱髄性疾患;皮質脊髄系の病変などの錐体外路及び小脳の疾患;基底核の疾患又は小脳疾患;ハンチントン舞踏病及び老人性舞踏病などの運動過剰障害;CNSドーパミン受容体を遮断する薬物により誘導されるものなどの薬剤性運動異常症;パーキンソン病などの運動低下障害;進行性核上性麻痺;小脳の器質的病変;脊髄性運動失調、フリードライヒ失調症、脊髄小脳変性症、多系統変性症(multiple systems degenerations)(Mencel、Dejerine−Thomas、Shi−Drager,and Machado−Joseph)などの脊髄小脳変性症;全身疾患(レフサム病、無βリポタンパク質血症、運動失調、毛細血管拡張症及びミトコンドリア多系疾患(mitochondrial multi. system disorder));多発性硬化症、急性横断性脊髄炎などの脱髄コア疾患(demyelinating core disorders);神経性筋萎縮(筋萎縮性側索硬化症、乳児脊髄性筋萎縮症及び若年性脊髄性筋萎縮症などの前角細胞変性)などの運動単位の疾患;アルツハイマー病;中年におけるダウン症候群;びまん性レビー小体病;レビー小体型の老年認知症;ウェルニッケ・コルサコフ症候群;慢性アルコール症;クロイツフェルト・ヤコブ病;亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン−スパッツ病(Hallerrorden-Spatz disease);並びに拳闘家認知症などのうちの少なくとも1つを含むがこれらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、又は患者における心血管疾病の調節又は処置のための方法も提供する。所望により、少なくとも1つのTNF抗体又は特定部分又は変異体を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、このような調節、治療又は療法を必要としている細胞、組織、器官、動物、又は患者に対し投与する工程を含むことができる。例えば、Merck Manual,16th Edition,Merck & Company,Rahway,NJ(1992)を参照のこと。
上述の疾患及び疾病に加えて、本発明はまた、肝臓線維症(アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、自己免疫性肝炎を含むがこれらに限定されない);肺線維症(強皮症、特発性肺線維症を含むがこれらに限定されない);腎臓線維症(強皮症、糖尿病性腎炎、糸球体腎炎、ループス腎炎を含むがこれらに限定されない);皮膚線維症(強皮症、肥厚性及びケロイド瘢痕、火傷を含むがこれらに限定されない);骨髄線維症;神経線維腫症;線維腫;腸線維症;及び外科手術の結果としての線維化付着といったようなさまざまな病因の線維性疾患を調節又は処置するための方法をも提供している。
抗CD147モノクローナル抗体を生成及び試験するために、CD147の細胞外ドメインの全部又は一部を表す所定のタンパク質コンストラクトを生成した。CD147ポリペプチドと、CD147の変異型、切断型若しくは削除型、又は融合タンパク質は、様々な使用のために調製することができ、その使用には、抗体の生成、診断アッセイにおける試薬として、例えばHIV−1感染症、AIDS、RA及び癌の処置又は予防に使用できる治療的化合物のスクリーニングのためのアッセイにおける試薬として、例えばHIV−1感染症、AIDS及びAIDS関連の疾患、RA及び癌の処置に有用な薬剤的試薬として、が挙げられるが、これらに限定されない。
発現ベクター3364を生成するために、内因性シグナルペプチド及びヒトCD147の細胞外ドメイン(ECD1〜192)を含む、アミノ酸1〜192をコードするヌクレオチド配列を、C−末端にFLAG−タグ付けされた(3364)バージョンとして発現ベクターp3XFLAG−CMV−14(Sigma)内にサブクローン化した。ポリペプチドモノマーは、C−末端FLAG−タグ付けタンパク質としてヒトCD147 ECD、FLAGペプチドに融合したアミノ酸Met1〜Gly 192を含むであろう(Brizzard et al.Biotechniques.1994 Apr;16(4):730〜5)。
発現ベクター3128ヌクレオチド配列を生成するために、内因性シグナルペプチド及びヒトCD147の第1 Ig様領域(N−ドメイン)を含む、アミノ酸1〜117をコードするヌクレオチド配列を、Ig1.FC.for、5’TCGAGGTACCGCCACCATGGCGGC 3’(SEQ ID NO:2)及び
Ig1.FC.rev、5’TGCAGCGGCCGCCGTTGATGTGTTCTGACG 3’(SEQ ID NO:3)
を使用して、C−末端Fc−融合物(3128)として、pcDNA3.1(+)内にサブクローン化した。ER内で成熟され分泌された際、N−末端はAsp 19として見出され、これはAをコードするリーダーコドン内の突然変異を表す。Fc−融合コンストラクトAsp19−Asn117−IgG1−Fcに加えて、CD147 N−ドメインAsp19−Asn119は、更にタグ付け及びAsp19−Asn117−hexahis種を構築するのに使用された。
発現ベクター3129を生成するために、ヒト成長ホルモンシグナルペプチドと、ヒトCD147の第2Ig様領域(C−ドメイン)を含むアミノ酸95〜203とをコードするヌクレオチド配列を、5’CAAGAGGGATCCGCCGGCACGGCC 3’;Ig2.FC.(SEQ ID NO:4)をフォワードプライマーとして、5’TGCAGCGGCCGCTGCGCACGCGG 3’(SEQ ID NO:5)をリバースプライマーとして使用して、C−末端Fc−融合物Ig2.FC.としてpcDNA3.1(+)内にサブクローン化した。哺乳動物宿主細胞内で発現され、ER内で成熟され分泌された際、分泌されたタンパク質は、アミノ酸残基gly 95〜ser204融合ヒトFc−足場(IgG1のヒンジ、CH2及びCH3ドメイン)を表すホモ二量体を形成するであろう(コンストラクト# 3129)。Fc−融合コンストラクトに加えて、gly 95〜ser204を更に使用して、タグ付け及びhexahis種を構築した。
CD147 ECD又はサブドメインに対する直接結合
酵素−免疫アッセイ(EIAs)を用いて、抗ヒトCD147 Mabの存在についてハイブリドーマ細胞上清を試験した。簡略的には、プレート(Nunc−Maxisorp)を、PBS中1mg/mLのヒトCD147(ECD、N & C−ドメインタンパク質)で一晩被覆した。0.02%(w/v)Tween 20を含有する0.15M生理食塩水で洗浄した後、ウェルをPBS中の1%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)にて37℃で1時間ブロックした。未希釈ハイブリドーマ上清を、被覆プレート上にて37℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、1% BSA/PBS中で1:10,000に希釈したHRP−標識ヤギ抗マウスIgG、Fc特異的(Sigma)と共に37℃で30分間インキュベートした。プレートを再度洗浄した後、100mL/ウェルのクエン酸−リン酸基質液(0.1Mクエン酸及び0.2Mリン酸ナトリウム、0.01%過酸化水素、並びに1mg/mL O−フェニレンジアミン二塩酸塩)と共にRTで15分間インキュベートした。4N硫酸を25mL/ウェルにて加えて基質展開を停止し、自動化プレート分光光度計により490nmで吸収を測定した。
試験全体においてヒト乳癌細胞ラインMDA−MB−231(ATCC HTB−26)をCD147陽性細胞として使用した。簡略的には、MDA−MB−231細胞を96ウェルプレート上にウェル当たり50,000で蒔いた。一晩増殖後、細胞を200μlの氷冷DMEMで穏やかに3回洗浄し、200μlの10%FBS−DMEMを用いて室温で30分間インキュベートしてブロックした。プレートを洗浄した後、100μlの未希釈抗体上清を加え、室温で1時間インキュベートし、プレートを再度洗浄した。二次的なHRPコンジュゲート抗体を1:5000希釈にて加えた後、室温で1時間インキュベートし、洗浄し、50μl/ウェルの展開バッファを室温で15分間で加えた。4N硫酸を25μl/ウェルにて加えて基質展開を停止し、自動化プレート分光光度計により490nmで吸収を測定した。
ヒト線維芽細胞が、ヒトCD147タンパク質との接触により様々なマトリックス型のメタロプロテアーゼ(MMP)を分泌することは十分確立されている(Kataoka,H.,et al.,1993 Cancer Res 53,3154〜3158;Sameshima,T.,et al.,2000 Cancer Lett 157,177〜184;Guo,H.,et al.,1997 J Biol Chem 272,24〜27)。実施例1で生成した組み換えヒトCD147コンストラクト:ヒトCD147のECD、N−ドメイン及びC−ドメインを使用してヒト線維芽細胞を刺激した。異なる量の組み換えCD147タンパク質で処理した線維芽細胞によりコンディショニングした血清フリー培地中のMMP−1活性を、MMP−1活性アッセイを用いて、製品マニュアルに従って定量的に測定した(R&D Systems,Minneapolis,MN)。実施の際、アッセイは、150μlの標準物質又は試料中に含まれるMMP−1を測定した。MMP−1をアッセイウェルの底部に不動化した抗MMP−1抗体により捕捉した。続いて、捕捉したMMP−1を4−アミノフェニル水銀アセテート(APMA)により活性化した。各ウェル内に加えられたMMP基質は活性化MMP−1により切断され、得られた蛍光をSpectraFluor Plus Plate Reader(TECAN,Research Triangle Park,NC)を使用して、320nmでの励起及び405nmでの発光を用いて測定した。
MDA−MB−231細胞を、10% FBSを含有するDMEM中にて、10% CO2で補充した加湿細胞培養インキュベーター内で培養した。NHDF細胞を、供給者により推奨される条件下で培養した。簡略的には、1ug/mLのhFGF、5μg/mLのインスリン、0μg/mLのゲンタマイシン、及び50μg/mLのアンホテリシンを含有する線維芽細胞増殖培地中で細胞を培養した。サブコンフルエンスにおいて、MDA−MB−231細胞及びNHDF細胞を別々にトリプシン処理し、新しい培養培地(10% FBSを含有するDMEM)中に懸濁させた。100,000のNHDF細胞を100,000のMDA−MB−231乳癌細胞と共に、6ウェルプレート内で24時間共培養した。細胞共培養物をPBSで穏やかに濯ぎ、増殖培地を新鮮な血清フリーDMEM培地で置き換え、100μlの試験抗体上清を加えた。3日後、培養培地を1.5mLの血清フリーDMEM培地と、同一量の抗体上清とで再度置き換えた。2日後、条件培地を収集して、活性を分析した。SDS基質酵素電気泳動を、以前に記載された方法に基づいて、変更を加えて行った(Tang,Y.,et al.,Mol Cancer Res 2,73〜80,2004;Tang,Y.,et al.,Cancer Res 65,3193〜3199,2005)。20mgのタンパク質を含有する条件培地の試料を、非還元SDS試料バッファと混合し、0.1%ゼラチンを含有する10%ポリアクリルアミドゲル上で分離した。電気泳動後、ゲルを2.5% Triton X−100で30分間洗浄した。基質消化は、5mM CaCl2、1mM ZnCl2、1%Triton X−100及び0.02%NaN3を含有する50mM Tris−HCl(pH7.6)中でゲルを37℃で24時間インキュベートして行った。ゲルを0.1%クマシーブリリアントブルーR250で染色し、ゼラチン分解活性の位置を、均一な青色染色の背景内の明瞭なバンドとして検出した。MMP標準物質を使用して、ゼラチナーゼ活性を有するバンドの位置を同定した。
VEGF産生を経芽細胞内で組み換えCD147により刺激した。組み換えCD147が神経芽細胞内でVEGF産生を刺激できることは以前に確立された(Tang,et al.Mol.Cancer Res.2006 4:371〜377)。実施例1の3つの異なるCD147−コンストラクト(CD147のN−若しくはC−末端ドメイン、又は完全長ECD)により刺激されるVEGF分泌を比較した。
CD147はPI−3K−Aktシグナル伝達経路を介してMMP−1及びVEGFの産生を刺激し得る。線維芽細胞内のAktリン酸化を、CD147シグナル伝達測定の基礎として使用した。Aktはタンパク質キナーゼBとしても既知のキナーゼである。Aktによりリン酸化されたタンパク質は、一般に細胞生存を促進する。組み換えCD147は、線維芽細胞内でAktリン酸化を刺激し得る(Tang et al.,2006,Mol.Cancer Res.4(2006),pp.371〜377)。完全長ECD(ECD−FL)の代わりに切断型ECDドメイン、N−ドメイン又はC−ドメインを使用した実験は、活性のほとんどがN−ドメインが使用された場合に生じ、C−ドメイン含有試薬タンパク質のみの存在下では比較的少ないシグナル伝達が行われたことを示した。
Kohler及びMilsteinのハイブリドーマ法により、マウス抗ヒトCD147を生成した。加えて、マウスCD147に対する代替抗体も生成した。
ハイブリドーマ上清を、固相(EIA)アッセイフォーマットにおいて、CD147に対する結合に関してスクリーニングした。このスクリーニングにより、52の陽性クローンを得た。
実施例2に記載したスクリーニングにより同定した7つのMABを、CD147の細胞外ドメイン内での結合特異性及び親和性に関して分析した。N−ドメイン(SEQ ID NO:1のAsp19〜Asp117)又はC−ドメイン(Glu95〜Ser204)のいずれかをコードするタンパク質を使用したデータは、7つの全部がN−ドメインに特異的に結合するが、C−ドメインに結合しないことを示した。
2H3、2C8、5F6及び4A5の重鎖及び軽鎖に関するV−領域核酸配列をハイブリドーマからクローン化した。アミノ酸配列を下記に示し、CDRを注解する。
マウス抗体からの結合ドメインが、新生物組織増殖及び転移拡散などの病理に関連したCD147の所定の生物活性を遮断する能力を、マウスmAb(mIgG1)として発現された完全抗体、又は、インビボでのアッセイにて抗体エフェクター機能に寄与するヒトIgG1若しくはマウスIgG2a定常領域のいずれかを有するV−領域キメラのいずれかを用いて評価した。そのようなキメラの構築方法は、当該技術分野において周知である。いくつかのアッセイでは、市販のCD147中和抗体、RDI−CD147(R&D Systems)を比較器として使用した。
アッセイは、実施例4に記載のように実施した。抗CD147抗体の阻害活性を測定するために、細胞を組み換えCD147(ECD19−205−Fcコンストラクト)で15分間刺激した後、細胞培養物にMab 2H3(mIgG2a)及び5F6(hIgG1)を1、5、10及び20ug/mLにて加えた。データ(表3)は、神経芽細胞によるCD147刺激MMP−1産生が、組み換え抗CD147 Mab 2H3(mIgG2a)及び5F6(hIgG1)により用量依存的に阻害されたことを示した。
実施例4に記載したように、MDA−MB−231及びNHDFの共培養アッセイを用いて、2つの組み換え抗CD147抗体:5F6(hIgG1)及び4A5(mIgG2a)の存在下及び不在下でアッセイを行った。両方の抗体が、MDA−MB−231及びNHDFによるMMP−2産生を用量依存的に阻害した(図8)。
抗CD147抗体の阻害活性を測定するために、抗体をNHLF細胞培養物に加え、細胞を組み換えCD147で15分間刺激した。条件培地を48時間後に収集した。データ(図9)は、2H3(mIgG2a)及び5F6(hIgG1)Mabsの両方が、10μg/mLの組み換えCD147で48時間刺激された正常なヒト肺線維芽細胞(NHLF)によるVEGF産生を阻害できたことを示す。
血管新生の阻害
マトリゲル(商標)は、細胞マトリックスタンパク質に富んだ腫瘍であるEngel−Holm−Swarm(EHS)マウス肉腫から抽出した、可溶化基底膜調製品である。主な成分はラミニンであるが、マトリゲルは、微量の線維芽細胞増殖因子、TGF−β、組織プラスミノーゲン活性化因子、及びEHS腫瘍内に天然に存在する他の増殖因子も含有する。マトリゲルは、数種の腫瘍細胞浸潤アッセイの基礎であり、血管新生の試験に必要な基質を提供する。マトリゲルは、マウス又はラットに皮下注射された際に柔らかいゲルプラグを形成し、血管新生因子を補充された際に強力な血管応答を支持する。
マトリゲルプラグアッセイを用いて、ハイブリドーマ上清から精製された抗CD147抗体組み換え2H3、5F6、及び4D12、並びにラット抗マウスCD147抗体(C947)の抗血管新生効果を評価した。試験1日目、50匹のヌードマウスを、以下に示すように10個のグループ(n=5/グループ)に無作為化した。マウスを秤量し、ケタミン/キシラジン(90/10mg/kg、i.p.)で麻酔した。マウスの2つの部位に、各側につき0.5mLのマトリゲル(0.50万細胞/mLマトリゲルで)を注射した。試験物質はi.p.で1日目及び4日目に治療当たり10mg/kgで注射された。1日目に治療薬を、下記の表4に規定したように、マトリゲルプラグの移植から3時間前に注射した。抗CD147抗体2H3(mIgG2a)、5F6(hIgG1)、4D12(mIgG1)、C947(ラットIgG1)及びcVam(対照として使用した非特異性Mab)を適切な濃度に希釈して、体重20gm当たり総容積0.5mLの各mAbのI.P.投与を可能にした。示した薬剤は、注射前に互いに混合(1:1)された。
PANC−1癌細胞由来のCD147により刺激された血管新生に対する抗CD147Mab(4A5、5F6)の阻害効果を評価及び比較するために、雌のSCIDマウス内のマトリゲルプラグにPANC−1癌細胞を埋め込んだ。
腫瘍進行に対する抗CD147機能遮断抗体の抗癌効果を測定するために、MDA−MB−231ヒト乳癌細胞を移植したSCIDベージュマウスをE+4A5(MuIgG2a)又はE+5F6(MuIgG2a)で処理した。
腫瘍体積に関しては、反復測定モデルを、一次自己相関共分散構造を仮定したデータに適合させた。時間プロファイルにおける傾向の曲率をモデリングするために、自然スプラインを使用した。各時間点でグループ間における一対比較を行った。計算は、Rソフトウェア環境を用いて実施した。
ヒトCD147上の4A5及び5F6 MABに関する結合部位は、抗体競合的結合アッセイ、H/D交換、及び単一点変異誘発の組み合わせにより規定され、ヒトEMMPRIN断片の公表かつ内部的に生成された構造の状況から解釈された。結果は、抗体がCD147の細胞外ドメイン内の類似したエピトープに結合することを示す。
Claims (5)
- 配列番号10からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Hc−CDR1、Hc−CDR2及びHc−CDR3に該当する部分のアミノ酸配列と、 配列番号9からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Lc−CDR1 Lc−CDR2及びLc−CDR3に該当する部分のアミノ酸配列と、を有する単離された抗CD147抗体。
- 配列番号12からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Hc−CDR1、Hc−CDR2及びHc−CDR3に該当する部分のアミノ酸配列と、 配列番号11からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Lc−CDR1 Lc−CDR2及びLc−CDR3に該当する部分のアミノ酸配列と、を有する単離された抗CD147抗体。
- 配列番号14からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Hc−CDR1、Hc−CDR2及びHc−CDR3に該当する部分のアミノ酸配列と、 配列番号13からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Lc−CDR1 Lc−CDR2及びLc−CDR3に該当する部分のアミノ酸配列と、を有する単離された抗CD147抗体。
- 配列番号16からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Hc−CDR1、Hc−CDR2及びHc−CDR3に該当する部分のアミノ酸配列と、 配列番号15からなるアミノ酸配列の相補性決定領域Lc−CDR1 Lc−CDR2及びLc−CDR3に該当する部分のアミノ酸配列と、を有する単離された抗CD147抗体。
- ヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含むヒト化抗体であって、
a)前記ヒト化重鎖可変領域が、マウスモノクロナール抗体4A5重鎖の配列番号12に示されるアミノ酸配列からの3つの相補性決定領域(CDRs)と、ヒトアクセプター抗体重鎖からのフレームワークと、を含み、
b)前記ヒト化軽鎖可変領域が、マウスモノクロナール抗体4A5軽鎖の配列番号11に示されるアミノ酸配列からの3つの相補性決定領域と、ヒトアクセプター抗体軽鎖からのフレームワークと、を含み、
c)前記ヒト化抗体が、MDA−MB−231細胞表面上のCD147抗原と特異的に結合する、ヒト化抗体。
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