TW202409089A - １型大麻素受體結合蛋白及其用途 - Google Patents

１型大麻素受體結合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本文描述了抗CB1（例如，huCB1）抗體和抗原結合片段、包含其的組成物以及它們用於治療各種障礙或疾病例如肥胖症和其合併症、慢性腎病、肝病（例如NAFLD）和NASH之用途。

Description

1型大麻素受體結合蛋白及其用途
本揭露關於大麻素1型受體（CB1）結合蛋白及其用於治療疾病或障礙之用途。 藉由引用併入以電子方式提交的材料
藉由引用以其全文併入本文的係與本文同時提交的胺基酸序列表，並且其標識如下：7027千位元組的XML文件，名為「10129-WO01-SEC Sequence Listing.xml」，創建於2023年7月20日。 相關申請的交叉引用
本申請要求於2022年7月28日提交的美國臨時申請案號63/392,891的權益。
大麻素受體1（CB1）係一種G蛋白偶合受體（GPCR），其在中樞神經系統（CNS）和周圍器官（如肝臟、骨骼肌、脂肪組織和內分泌胰臟）中表現。（Cinar R.等人, Pharmacology & Therapeutics [藥理學和治療學] 208 (2020) 107477.）與CNS相比，CB1受體在周圍器官中的表現水平較低，並且受體參與調節兩個系統的代謝穩態。由於其在能量穩態中的作用，長期以來人們一直致力於開發CB1受體拮抗劑和/或反向促效劑來治療肥胖症及其合併症。（參見，例如Cinar R.等人, Pharmacology & Therapeutics [藥理學和治療學] 208 (2020) 107477；Thomas Murphy和Bernard Le Foll, Biomolecules [生物分子] 2020, 10, 855.）
在臨床試驗中，小分子CB1受體拮抗劑/反向促效劑利莫那班（也稱為SR141716）可降低超重的人的體重，並顯著改善多種心臟代謝參數，如腰圍、血紅素A1c、HDL、血漿膽固醇和三酸甘油酯。利莫那班於2006年在歐洲被批准為抗肥胖藥物。然而，利莫那班的CNS穿透性也會引起嚴重的精神副作用，如焦慮、抑鬱和自殺傾向，這導致該藥於2008年撤市。在開發周圍限制性小分子CB1受體拮抗劑方面已經做出了額外的努力（例如，Tam等人, J. Clin. Invest.[臨床研究雜誌]（2010）120:2953-66; US 2011/0144157），但該領域的成功仍有待觀察。
由於抗體不會明顯穿過血腦屏障並穿透CNS，科學家們假設具有利莫那班樣效力的CB1拮抗劑抗體可能會對新陳代謝產生有益的影響（例如，治療肥胖症及其合併症），而不會產生與CNS相關的副作用。然而，CB1的有效抗體拮抗劑的發現和工程改造在該領域已被證明係困難的。例如，本領域描述的拮抗劑CB1抗體的效力在兩位數或三位數奈米莫耳範圍內（參見例如WO 2014/210025、WO 2015/148948和WO 2019/211665）；相比之下，利莫那班的效力在個位數奈米莫耳範圍內。（參見，例如Congy C.等人, FEBS Letters [歐洲生化學會聯合會快報] 350 (1994) 240-244；Bauer M.等人, The Journal of Biological Chemistry [生物化學雜誌], 287(44) (2016) 36944 -36967）。此外，該等抗體對CB1（例如huCB1）的結合親和力低於利莫那班。
有幾個因素被認為是導致這一困難的原因。通常很難通過免疫接種產生針對具有小胞外環（例如CB1）的GPCR的抗體（參見例如Jo Migyeong和Jung Sang Take, Experimental & Molecular Medicine [實驗與分子醫學] (2016) 48, e207）。此外，許多在動物實驗活動中產生的CB1抗體往往沒有功能。此外，從動物實驗活動中分離的拮抗劑抗體的效力和/或親和力通常不足以高到滿足效力和/或親和力要求（例如，與利莫那班相當或更好）。儘管親和力成熟可用於提高拮抗劑抗體的效力，但由於缺乏構形相關的CB1蛋白的穩定且高品質的製劑，將這種策略用於CB1抗體具有挑戰性。
本領域仍然需要鑒定具有利莫那班樣效力和親和力的CB1拮抗劑抗體，其可以實現治療效果，同時避免CNS相關的副作用。
本申請關於具有高效力（例如，與利莫那班相當或更好的效力）的拮抗劑或反向促效劑抗CB1（例如，huCB1）抗體和抗原結合片段。與先前已知的抗CB1抗體相比，本文揭露的抗體具有高得多的效力，並且適合安全有效地治療各種疾病，例如肥胖症和其合併症、慢性腎病、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。基於本文提供的揭露內容，熟悉該項技術者將認知到或者僅使用常規實驗就能夠確定本文所述之本發明的特定實施方式的許多等同物。此類等同物旨在由以下實施方式（E）所涵蓋。
E1：一種結合huCB1的分離的抗體，該抗體包含HV和LV，其中a) 該HV包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A、S或G；HCDR2包含胺基酸序列HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10（SEQ ID NO: 531），其中X2係I或V；X3係H、Y或Q；X4係E、T或S；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；並且HCDR3包含胺基酸序列X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV（SEQ ID NO: 532），其中X11係D、E或N；X12係A、I、P、T或V；X13係F、L或V；X14係S或T；並且X15係H、N或Y；並且 b) 該LV屬於VK1/O2/JK4、VK2/A19/JK1或VK3/A27/JK1種系。
E2    如E1所述之抗體，其中a) HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A或S；HCDR2包含胺基酸序列HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10（SEQ ID NO: 531），其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係E、T或S；X5係S或Q；X6係A或K；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；並且HCDR3包含胺基酸序列X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV（SEQ ID NO: 532），其中X11係D、E或N；X12係A、I、P或V；X13係L或V；X14係S或T；並且X15係H或Y；並且 b) 該LV屬於VK2/A19/JK1種系。
E3    如E2所述之抗體，其中X4係T，X15係Y。
E4    如E1-E3中任一項所述之抗體，其中b) 該LV包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且其中LCDR1包含胺基酸序列RSSQSLLX16SX17GX18NYX19D（SEQ ID NO: 533），其中X16係H、S或T；X17係S、T或Y；X18係A、N、I或Y；並且X19係L或V；LCDR2包含胺基酸序列X20GSNRA（SEQ ID NO: 534），其中X20係L或Q；並且LCDR3包含胺基酸序列X21QAX22X23X24PRT（SEQ ID NO: 535），其中X21係M或R；X22係L、I、R或V；X23係Q、E、T、A或G；並且X24係T、I、L或Q。
E5    如E4所述之抗體，其中X24係L。
E6.   如E1所述之抗體，其中a) HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A、G或S；HCDR2包含胺基酸序列HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10（SEQ ID NO: 531），其中X2係I或V；X3係H、Y或Q；X4係T或S；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；並且HCDR3包含胺基酸序列X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV（SEQ ID NO: 532），其中X11係D或N；X12係A、I或T；X13係F、L或V；X14係S或T；並且X15係H、N或Y；並且b) 該LV屬於VK1/O2/JK4或VK3/A27/JK1種系。
E7.   如請求項E6所述之抗體，其中a) X1係A或G；X3係Q或Y，X4係T，X8係F，X14係T；並且X15係Y。
E8.   如E6或E7所述之抗體，其中b) 該LV屬於VK1/O2/JK4種系。
E9.   如E6或E7所述之抗體，其中b) 該LV屬於VK1/O2/JK4種系並且包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且其中LCDR1包含胺基酸序列RASQSISNYLN（SEQ ID NO: 132）、RASQSIISYLN（SEQ ID NO: 150）或RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 186）；LCDR2包含胺基酸序列AASSLHS（SEQ ID NO: 133）或AASSLRS（SEQ ID NO: 151）；並且LCDR3包含胺基酸序列QQYQSYPLT（SEQ ID NO: 134）或QQYSNYPLT（SEQ ID NO: 152）；或 b) 該LV屬於VK3/A27/JK1種系並且包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且其中LCDR1包含胺基酸序列RASQSVSSYLG（SEQ ID NO: 168）；LCDR2包含胺基酸序列GASSRAT（SEQ ID NO: 169）；並且LCDR3包含胺基酸序列QQYGSSPRT（SEQ ID NO: 170）。
E10. E9的抗體，其中LCDR1包含胺基酸序列RASQSISNYLN（SEQ ID NO: 132），LCDR2包含胺基酸序列AASSLHS（SEQ ID NO: 133），並且LCDR3包含胺基酸序列QQYQSYPLT（SEQ ID NO: 134）。
E11. E6的抗體，其中a) HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A或G，HCDR2包含胺基酸序列HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10（SEQ ID NO: 531），其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係T；X5係S；X6係K或N；X7係S或R；X8係F；X9係K；並且X10係G或D；並且HCDR3包含胺基酸序列X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV（SEQ ID NO: 532），其中X11係N；X12係T；X13係L或V；X14係T；並且X15係Y，並且 b) 該LV屬於VK1/O2/JK4種系。
E12. 如E11所述之抗體，其中a) HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWA（SEQ ID NO: 414）或RGGDYWG（SEQ ID NO: 408）；HCDR2包含胺基酸序列HVYYTGSTKYNPSFKD（SEQ ID NO: 427）、HVYYTGSTNYNPRFKD（SEQ ID NO: 445）、HIYQTGSTNYNPRFKG（SEQ ID NO: 415）或HVYQTGSTKYNPSFKD（SEQ ID NO: 409）；並且HCDR3包含胺基酸序列NYDTLTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 410）或NYDTVTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 446）。
E13. 如E11或E12所述之抗體，其中b) 該LV包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且其中LCDR1包含序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 405）；LCDR2包含序列X39ARX40LX41S（SEQ ID NO: 536），其中X39係N、S、K或G；X40係R、K、L或A；並且X41係A、G或S；並且LCDR3包含序列QQX42X43X44X45PX46T（SEQ ID NO: 537），其中X42係Y或F，X43係R、A、S、G或Y；X44係S、K、R或H；X45係S、L、F、Y、P或M；並且X46係L、I或V。
E14. 如E13所述之抗體，其中X42係Y。
E15. 一種結合huCB1的分離的抗體，該抗體包含HV和LV，其中 a) HV包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中CDRH1包含胺基酸序列RGGDYWS（SEQ ID NO: 1）；CDRH2包含胺基酸序列HX25YX26X27GX28TX29YNPX3 0X31X32X33（SEQ ID NO: 538），其中X25係I或V；X26係Y或Q；X27係A、E、K或T；X28係S或Q；X29係A、E、K或T；X30係N或S；X31係F或L，X32係K或R；並且X33係G、S或N；並且CDRH3包含胺基酸序列X34YDX35X36X37GYSYYYYGX38DV（SEQ ID NO: 539），其中X34係D或G；X35係A、I、T或V；X36係L或不存在；X37係S或T；並且X38係M或L；並且 b) 該LV屬於VK2/A19/JK1種系。
E16. 如E15所述之抗體，其中a) X26係Y，X34係G，X36不存在，並且X37係S。
E17. 如E15或E16所述之抗體，其中b) 該LV包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含胺基酸序列RSSQSLLHRSGYNYLD（SEQ ID NO: 257）；LCDR2包含胺基酸序列LGSNRAS（SEQ ID NO: 258）或QGSNRAS（SEQ ID NO: 264）；並且LCDR3包含胺基酸序列MQSLQTPRT（SEQ ID NO: 259）、RQSVALPRT（SEQ ID NO: 271）或RQARALPRT（SEQ ID NO: 265）。
E18. 如E1-E14所述之抗體，其中該抗體包含LIBC523596-1、LIBC523603-1、LIBC523661-1、LIBC523670-1、LIBC523748-1、LIBC523760-1、LIBC523797-1、LIBC523813-1、LIBC523815-1、LIBC523844-1、LIBC523857-1、LIBC523862-1、LIBC523868-1、LIBC523969-1、LIBC524049-1、LIBC527906-1、LIBC527814-1、LIBC527997-1、LIBC528141-1、LIBC527912-1、LIBC528116-1、LIBC527879-1、LIBC527919-1、LIBC527984-1、LIBC527968-1、LIBC528169-1、LIBC528131-1、LIBC527827-1、LIBC527869-1、和LIBC528148-1、LIBC680562-1、LIBC680574-1、LIBC680773-1、LIBC680800-1、LIBC680812-1、LIBC681593-1、LIBC681594-1、和LIBC681737-1中任一項的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、或LCDR3，或HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3的組。
E19. 如E15-E17所述之抗體，其中該抗體包含LIBC673948-1、LIBC673952-1、LIBC673965-1、LIBC673982-1、LIBC673972-1、LIBC674024-1、LIBC674035-1、LIBC674043-1、LIBC674090-1、LIBC674002-1、LIBC674153-1、LIBC674200-1、LIBC674214-1、LIBC674216-1、LIBC674229-1、LIBC674235-1、LIBC674257-1、和LIBC674276-1中任一項的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、或LCDR3，或HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3的組。
E20. 如E18或E19所述之抗體，其中該抗體包含LIBC680574、LIBC528116、LIBC673952、LIBC523797、LIBC527814、LIBC527997、LIBC527919、LIBC523661和LIBC524049中任一項的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、或LCDR3，或HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、和LCDR3的組。
E21. 如E1-E20中任一項所述之抗體，其中該HV的位置83處的胺基酸係N並且該HV的位置85處的胺基酸係Y。
E22. 如E21所述之抗體，其中該LV的位置94處的胺基酸係S。
E23. 如E19所述之抗體，其中該HV的位置83處的胺基酸係N，該HV的位置85處的胺基酸係Y，並且該HV的位置79處的胺基酸係R。
E24. 如E23所述之抗體，該LV的位置94處的胺基酸係S，位置76處的胺基酸係D。
E25. 如E1-E24中任一項所述之抗體，其中與HVYYTGSTNYNPRFKD（SEQ ID NO: 136）相比，該抗體的HCDR2包含5個或更少的突變，或者3個或更少的突變。
E26. 如E1-E24中任一項所述之抗體，其中與HVYYTGSTKYNPNFKG（SEQ ID NO: 8）相比，該抗體的HCDR2包含5個或更少的突變，並且視需要，與DYDILTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 9）相比，該抗體的HCDR3包含4個或更少的突變。
E27. 如E1-E26中任一項所述之抗體，其中該抗體包含LIBC523596-1、LIBC523603-1、LIBC523661-1、LIBC523670-1、LIBC523748-1、LIBC523760-1、LIBC523797-1、LIBC523813-1、LIBC523815-1、LIBC523844-1、LIBC523857-1、LIBC523862-1、LIBC523868-1、LIBC523969-1、LIBC524049-1、LIBC527906-1、LIBC527814-1、LIBC527997-1、LIBC528141-1、LIBC527912-1、LIBC528116-1、LIBC527879-1、LIBC527919-1、LIBC527984-1、LIBC527968-1、LIBC528169-1、LIBC528131-1、LIBC527827-1、LIBC527869-1、和LIBC528148-1、LIBC680562-1、LIBC680574-1、LIBC680773-1、LIBC680800-1、LIBC680812-1、LIBC681593-1、LIBC681594-1、LIBC681737-1、LIBC673948-1、LIBC673952-1、LIBC673965-1、LIBC673982-1、LIBC673972-1、LIBC674024-1、LIBC674035-1、LIBC674043-1、LIBC674090-1、LIBC674002-1、LIBC674153-1、LIBC674200-1、LIBC674214-1、LIBC674216-1、LIBC674229-1、LIBC674235-1、LIBC674257-1、和LIBC674276-1中任一項的HV和/或LV。
E28. 如E27所述之抗體，其中該抗體包含LIBC680574、LIBC528116、LIBC673952、LIBC523797、LIBC527814、LIBC527997、LIBC527919、LIBC523661和LIBC524049中任一項的HV和/或LV。
E29. 一種分離的抗體，其結合huCB1並包含LIBC529593、LIBC560340、或LIBC560657的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3，或HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的組。
E30. 如E29所述之抗體，其中該抗體包含LIBC529593、LIBC560340、或LIBC560657的HV和/或LV。
E31. 如E1-E30中任一項所述之抗體，其中該抗體係單株抗體，視需要，該單株抗體係嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
E32. 如E31所述之單株抗體，其中該抗體係huCB1的拮抗劑和/或反向促效劑抗體。
E33. 如E31或E32所述之抗體，其中該抗體對huCB1的結合親和力比10D10N35Y高至少3倍。
E34. 如E32或E33所述之抗體，其中該抗體具有10 nM或更低，例如5 nM或更低、3 nM或更低或1 nM或更低的IC50，如使用基於細胞的cAMP測定所確定的。
E35. 一種結合huCB1的分離的單株抗體，其中該抗體係huCB1的拮抗劑和/或反向促效劑抗體並且具有10 nM或更低、或8 nM或更低的IC50，如使用基於細胞的cAMP測定所確定的。
E36. 如E35所述之抗體，其中該抗體結合至huCB1的胞外環2或結合至huCB1的胞外環2內包含的區域。
E37. 如E34-E36中任一項所述之抗體，其中該基於細胞的cAMP測定係使用CP55,940的基於細胞的cAMP測定。
E38. 如E31-E37中任一項所述之抗體，其中該單株抗體係人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體，較佳的是人IgG1抗體。
E39. 如E38所述之抗體，其中該抗體在其重鏈中包含根據EU編號的胺基酸位置N297處的突變，例如N297G。
E40. 如E39所述之抗體，其中該抗體在其重鏈中進一步包含根據EU編號的R292C和V302C突變。
E41. 如E37-E40中任一項所述之抗體，其中該抗體在其重鏈中包含根據EU編號的胺基酸位置M252、S254和T256、較佳的是M252Y、S254T和T256E處的突變。
E42. 一種用於治療需要拮抗或反向激動CB1受體的受試者之方法，該方法包括向該受試者投與如E1-E41中任一項所述之抗體。
E43. 一種用於治療對拮抗或反向激動CB1受體有響應的受試者中的疾病或障礙之方法，該方法包括向該受試者投與如E1-E41中任一項所述之抗體。
E44. 如E42或E43所述之方法，其中該投與導致體重減輕、食慾降低、代謝參數改善、血糖水平降低、胰島素水平降低、三酸甘油酯水平降低、腎損傷減少、腎纖維化減少、腎炎症減輕和腎功能改善中的一或多種。
E45. 如E43所述之方法，其中該疾病或障礙選自肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝性疾病、肝病、纖維化、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、原發性膽汁性肝硬化、腎臟疾病、腎纖維化、慢性腎病、IgA腎病、骨質疏鬆症、動脈粥樣硬化、心血管疾病、癌症和炎性疾病。
E46. 如E1-E41中任一項所述之抗體，用於治療受試者的疾病或障礙，其中該疾病或障礙選自肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝性疾病、肝病、纖維化、NASH、原發性膽汁性肝硬化、腎臟疾病、腎纖維化、慢性腎病、IgA腎病、骨質疏鬆症、動脈粥樣硬化、心血管疾病、癌症和炎性疾病。
E47. 如E46所述之抗體，其中該使用導致體重減輕、食慾降低、代謝參數改善、血糖水平降低、胰島素水平降低、三酸甘油酯水平降低、腎損傷減少、腎纖維化減少、腎炎症減輕和腎功能改善中的一或多種。
E48. 如E45所述之方法或如E46所述之抗體，其中該疾病或障礙係肥胖症，視需要，該受試者具有至少27 kg/m 2或的BMI，或該受試者具有至少27 kg/m 2的BMI。
E49. 如E42-45任一項所述之方法或如E47或E48所述之抗體，其中該受試者係人。
E50. 一種分離的多核苷酸，其編碼如E1-E41中任一項所述之抗體。
E51. 一種表現載體，其包含如E50所述之多核苷酸。
E52. 一種宿主細胞，其包含如E51所述之表現載體。E53.       如E5或E15所述之抗體，其中該重鏈中根據AHo編號的位置32處的胺基酸係R。
大麻素受體1（CB1）係內源性大麻素（例如2-花生四烯醯甘油（2-AG））的G蛋白偶合受體，該受體介導許多大麻素誘導的作用（例如食物攝入）。受體的激活導致胞內環狀AMP（cAMP）濃度降低和促分裂原激活蛋白激酶（MAP激酶）濃度增加。（Gerard C.等人, Biochem. J.[生物化學雜誌] 279:129-134(1991)）。人CB1（huCB1）受體係具有472個胺基酸的多肽（UniProtKB/Swiss-Prot: P21554），並且由CNR1基因編碼。下面列出了huCB1的胺基酸序列（SEQ ID NO: 559）。huCB1係具有四個胞外區（SEQ ID NO: 559的胺基酸殘基1-116、176-187、256-273和366-377）、四個胞質區（SEQ ID NO: 559的胺基酸殘基143-154、213-232、300-344、和400-472）和七個跨膜結構域（SEQ ID NO: 559的胺基酸殘基117-142、155-175、188-212、233-255、274-299、345-365、和378-399）的膜蛋白。 MKSILDGLAD TTFRTITTDL LYVGSNDIQY EDIKGDMASK LGYFPQKFPL           60         70         80         90        100  TSFRGSPFQE KMTAGDNPQL VPADQVNITE FYNKSLSSFK ENEENIQCGE          110        120        130        140        150  NFMDIECFMV LNPSQQLAIA VLSLTLGTFT VLENLLVLCV ILHSRSLRCR          160        170        180        190        200  PSYHFIGSLA VADLLGSVIF VYSFIDFHVF HRKDSRNVFL FKLGGVTASF          210        220        230        240        250  TASVGSLFLT AIDRYISIHR PLAYKRIVTR PKAVVAFCLM WTIAIVIAVL          260        270        280        290        300  PLLGWNCEKL QSVCSDIFPH IDETYLMFWI GVTSVLLLFI VYAYMYILWK          310        320        330        340        350  AHSHAVRMIQ RGTQKSIIIH TSEDGKVQVT RPDQARMDIR LAKTLVLILV          360        370        380        390        400  VLIICWGPLL AIMVYDVFGK MNKLIKTVFA FCSMLCLLNS TVNPIIYALR          410        420        430        440        450  SKDLRHAFRS MFPSCEGTAQ PLDNSMGDSD CLHKHANNAA SVHRAAESCI          460        470   KSTVKIAKVT MSVSTDTSAE AL
CB1受體在CNS和周邊系統中表現並且參與調節能量穩態。該受體已成為開發肥胖症及其合併症治療方法的靶標。鑒於利莫那班的經驗，該領域已集中於開發周圍作用CB1受體拮抗劑或反向促效劑，以賦予新陳代謝有益的作用，而不產生CNS相關的副作用。
針對CB1受體的抗體可用作周圍作用拮抗劑或反向促效劑，因為它們不會明顯滲透CNS。已經做出努力來鑒定具有利莫那班樣效力的拮抗劑或反向促效劑抗CB1抗體，以實現治療效果而沒有副作用。10D10抗體係從Xenomouse抗體實驗活動中分離出來的先導性拮抗劑抗CB1抗體，但其效力明顯低於利莫那班。（WO 2014/210205，該文獻的揭露藉由援引以其全文併入本文）。進行多輪親和力成熟以提高抗體的效力。儘管從早期親和力成熟實驗活動中分離出的幾個10D10親和力成熟變體與10D10相比具有提高的效力，但沒有一個變體達到利莫那班樣效力的設計目標。據信，缺乏穩定、高品質的構形相關CB1蛋白製劑導致無法分離具有利莫那班樣效力的抗CB1抗體。此外，10D10抗體及其早期親和力成熟的變體的可製造性欠佳（例如，低表現水平和不穩定）。
生產高品質、可溶性複雜膜蛋白製劑的技術熟練性不斷發展，使得最終能夠將huCB1配製為奈米盤（ND）或苯乙烯順丁烯二酸脂質顆粒（SMALP）（Luna V.等人, European Polymer Journal [歐洲聚合物雜誌] 109 (2018) 483-488；Lavington S.和Watts A, Biophysical Reviews [生物物理評論], 第12卷 (2020)1287-1302）。與從表現huCB1的細胞製備的去污劑溶解的細胞裂解物相比，CB1-ND和-SMALP均為純化試劑，在多次冷凍/解凍循環後保持穩定，並且適合長期儲存。此外，它們可以添加到用戶定義的huCB1濃度的結合實驗中。CB1-ND和-SMALP的可用性使得能夠分離本文揭露的高效拮抗劑或反向促效劑抗CB1抗體。
本申請關於拮抗劑或反向促效劑抗CB1抗體和抗原結合片段，特別是抗huCB1抗體和抗原結合片段，其效力與利莫那班相當或更好。抑制CB1的抗體會導致cAMP增加，這可以使用體外cAMP測定（例如基於細胞的cAMP測定）進行測量。如實例中所例證的，本文揭露的抗體和抗原結合片段的效力在個位數奈米莫耳範圍內，例如，它們在基於細胞的cAMP測定中具有小於約10 nM的IC50（參見實例5、8和9）。如實例中所示，本文揭露的高效力抗體和抗原結合片段降低了肥胖動物模型中的體重、食物攝入和多種代謝參數（例如，降低了體脂肪、胰島素水平和肝臟三酸甘油酯水平，實例7），並且增加了動物模型中的能量消耗、脂質氧化和胰島素敏感性，同時具有最小的腦暴露，表明它們可以安全有效地治療各種疾病和障礙（例如肥胖症和其合併症、慢性腎病、NAFLD、NASH）。相反，效力值低於利莫那班的拮抗劑或反向促效劑抗體被認為不足以用於此類治療目的。此外，本文揭露的抗CB1抗體和抗原結合片段係穩定的並且對於製造目的表現良好。本文描述並舉例說明了該等高效抗CB1抗體和抗原結合片段。
定義
本發明提供了針對人CB1的拮抗劑或反向促效劑抗體。「抗體」係包含特異性結合抗原的抗原結合片段和使抗原結合片段呈現促進抗體與抗原結合的構形的支架或框架部分的蛋白質。如本文所用，術語「抗體」通常係指包含兩個輕鏈多肽（各自約25 kDa）和兩個重鏈多肽（各自約50-70 kDa）的四聚體免疫球蛋白。術語「輕鏈」或「免疫球蛋白輕鏈」係指從胺基末端至羧基末端包含單個免疫球蛋白輕鏈可變區（VL或LV）和單個免疫球蛋白輕鏈恒定結構域（CL或LC）的多肽。免疫球蛋白輕鏈恒定結構域（CL）可為人κ（k）或人lambda（λ）恒定結構域。術語「重鏈」或「免疫球蛋白重鏈」係指從胺基末端至羧基末端包含單個免疫球蛋白重鏈可變區（VH或HV）、免疫球蛋白重鏈恒定結構域1（CH1）、免疫球蛋白鉸鏈區、免疫球蛋白重鏈恒定結構域2（CH2）、免疫球蛋白重鏈恒定結構域3（CH3）和視需要免疫球蛋白重鏈恒定結構域4（CH4）的多肽。重鏈分類為mu（μ）、delta（Δ）、gamma（γ）、alpha（α）和epsilon（ε）鏈，並且其分別將抗體同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG類別和IgA類別的抗體進一步細分為數個亞類，即分別為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及IgA1和IgA2。IgG、IgA和IgD抗體中的重鏈具有三個結構域（CH1、CH2和CH3），而IgM和IgE抗體中的重鏈具有四個結構域（CH1、CH2、CH3和CH4）。免疫球蛋白重鏈恒定結構域可以來自任何免疫球蛋白同種型，包括亞型。抗體鏈係經由在CL結構域與CH1結構域之間（即在輕鏈與重鏈之間）和在這兩條抗體重鏈的鉸鏈區之間的多肽間二硫鍵連接在一起的。
在人抗體中，CH1意指在EU索引或EU編號系統的位置118至215處具有胺基酸序列的區域，該EU索引或EU編號系統基於定序的第一個人IgG1（即「EU抗體」）的序列編號（Edelman等人, Proc Natl Acad Sci USA [美國國家科學院院刊], 63(1): 78-85 (1969)）。稱為「鉸鏈區」的高度柔性胺基酸區在CH1與CH2之間存在。CH2表示在EU索引的位置231至340處具有胺基酸序列的區域，並且CH3表示在EU索引的位置341至446處具有胺基酸序列的區域。
「CL」表示輕鏈的恒定區。在人抗體的κ鏈的情況下，CL表示在EU索引的位置108至214處具有胺基酸序列的區域。在λ鏈中，CL表示在位置108至215處具有胺基酸序列的區域。
「可變結構域」係指抗體輕鏈（VL或LV）的可變區域或抗體重鏈（VH或HV）的可變區域，無論是單獨的還是組合的。如本領域所知，重鏈和輕鏈的可變區各自由被三個互補決定區（CDR）連接的四個框架區（FR）組成，並且有助於抗體的抗原結合位點的形成。從N末端至C末端，天然存在的輕鏈和重鏈可變區二者均典型地遵循該等元件的以下順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。
可以根據Kabat、Chothia、Kabat和Chothia兩者的累積、AbM、contact、North和/或構形定義或本領域眾所周知的任何CDR測定方法來定義抗體的「互補決定區」（CDR）。參見，例如，Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest [免疫學目的蛋白的序列], 第5版 (hypervariable regions [高變區])；Chothia等人, 1989, Nature [自然] 342:877-883 (structural loop structures [結構環結構])。CDR的AbM定義係Kabat和Chothia之間的折衷方案，並使用了牛津大學分子公司（Oxfbrd Molecular）的AbM抗體建模軟體（Accelerys®）。可以使用本領域眾所周知的方法來確定構成CDR的特定抗體中胺基酸殘基的特性。
術語「抗原結合片段」係指衍生自抗體並保留特異性結合抗原的能力（較佳的是具有基本上相同的結合親和力）的分子。抗原結合片段之實例包括 (i) Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii) F(ab')2片段，其係包含由二硫橋在鉸鏈區處連接的兩個Fab片段的雙價片段；(iii) 由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv) 由抗體單臂的VL和VH結構域組成的Fv片段，以及 (v) dAb片段（Ward等人, 1989 Nature [自然] 341:544-546），其由VH結構域組成。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH係由單獨的基因編碼的，但是可以使用重組方法將這兩個結構域藉由使它們能夠形成為單一蛋白鏈的合成連接子來連接，其中VL區和VH區配對形成單價分子（被稱為單鏈Fv（scFv）；參見例如，Bird等人 Science [科學] 242:423- 426 (1988) 和Huston等人, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 85:5879-5883。
「約」或「大約」與可測量的數值變量結合使用時，係指變量的指示值和變量的在指示值的實驗誤差範圍內（例如，在平均值的95%信賴區間內）或指示值的±10%的所有值，以較大者為準。數字範圍包括定義該範圍的數字。
術語「經分離分子」（在該分子係例如多肽、多核苷酸、抗體或抗原結合片段的情況下）係這樣一種分子，根據其起源或衍生來源，其 (1) 不與在其天然狀態下伴隨其的天然相關的組分相連；(2) 基本上不含來自相同物種的其他分子；(3) 由不同物種的細胞表現；或 (4) 不存在於自然界中。因此，分子（其係化學合成的或在與作為其天然來源的細胞不同的細胞系統中表現）將與其天然相關的組分「分離」。還可使用本領域中熟知的純化技術，藉由分離使分子基本上不含天然相關的組分。分子純度或均質性可以藉由本領域中熟知的多種方式測定。例如，多肽樣本的純度可以使用聚丙烯醯胺凝膠電泳並使用本領域中熟知的技術對該凝膠染色以顯現該多肽進行測定。出於某些目的，可以使用HPLC或本領域中熟知的其他純化方式提供更高解析度。
除非另有說明，在整個本說明書和申請專利範圍中，免疫球蛋白重鏈或輕鏈中的胺基酸殘基的編號係根據Honegger和Pluckthun, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌] 309(3):657-670; 2001中描述的AHo編號方案。在一些實施方式中，當提及免疫球蛋白恒定區的胺基酸位置時，EU編號方案如Edelman等人, Proc. Natl. Acad. USA[美國國家科學院院刊],第63卷: 78-85 (1969)中所描述使用。兩種編號方案在本領域中均為眾所周知的。
「拮抗劑」係指與蛋白質（例如受體）結合並且尤其是部分或完全抑制、阻斷、減少、預防、延遲、失活、脫敏或下調蛋白質（例如受體促效劑）配體的傳訊活性的藥劑。反向促效劑係引起促效劑相反作用的藥物，例如，它降低受體的基礎活性。
抗CB1抗體和抗原結合片段
本文揭露了針對huCB1（SEQ ID NO: 559）的抗體和抗原結合片段並且係huCB1的拮抗劑和/或反向促效劑。抗體和抗原結合片段的效力與利莫那班相當或更好，這使得它們能夠實現治療效果（例如治療肥胖症、慢性腎病、肝病），而沒有CNS相關的副作用。在一些實施方式中，抗體和抗原結合片段具有藉由基於細胞的cAMP測定而測量的個位數奈米莫耳範圍內的IC50。例如，在一些實施方式中，藉由基於細胞的cAMP測定而測量，抗體和抗原結合片段的IC50小於約10 nM。在一些實施方式中，藉由基於細胞的cAMP測定而測量，抗體和抗原結合片段的IC50小於約5 nM。在一些實施方式中，藉由基於細胞的cAMP測定而測量，抗體和抗原結合片段的IC50小於約3 nM或小於約1 nM。
本文揭露的抗CB1抗體和抗原結合片段係從10D10的親和力成熟鑒定的（例如，實例1-4和9）。10D10抗體係從之前的抗體實驗活動（WO 2014/210205）中分離出來的，並且10D10的重鏈和輕鏈CDR序列以及重鏈和輕鏈可變區序列列於表7和表8中。用於親和力成熟的酵母展示文庫設計以下一代定序為指導，其中優化了10D10的特定HV和LV位置的胺基酸，以提高結合親和力和效力。10D10 LC屬於VK2種系，並且如本文所揭露的，僅抗體的HC結合CB1受體（實例1和14）。還分離了LC交換親和力成熟抗體（即，用具有改善的可製造性的VK1或VK3種系輕鏈交換10D10 LC）。親和力成熟抗體和抗原結合片段的重鏈和輕鏈共有CDR序列總結於表35中。因此，一方面，本文揭露了結合huCB1並包含重鏈可變區（HV）和輕鏈可變區（LV）的抗體或其抗原結合片段，其中 a) 該HV包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A、S或G；HCDR2包含胺基酸序列HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10（SEQ ID NO: 531），其中X2係I或V；X3係H、Y或Q；X4係E、T或S；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；並且HCDR3包含胺基酸序列X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV（SEQ ID NO: 532），其中X11係D、E或N；X12係A、I、P、T或V；X13係F、L或V；X14係S或T；並且X15係H、N或Y；並且 b) 該LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4、VK2/A19/JK1或VK3/A27/JK1種系。
如本文所用，「種系的」或「衍生自種系」的可變區序列（例如可變區或CDR胺基酸序列）指具有特定種系而非另一種系的結構特徵的序列。為了使宿主生物體產生與抗原結合的抗體，重排的免疫球蛋白種系基因（宿主生物體的B細胞的重排的免疫球蛋白種系基因）必須首先編碼具有能夠與抗原相互反應的三維結構和生化特性的初始抗體。每個宿主生物體都有確定的免疫球蛋白種系基因庫，其可以重新排列以產生初始抗體。通過體細胞超突變過程，宿主生物體可以選擇編碼抗體的基因中的突變或突變集合，從而進一步增強其與抗原的相互作用。因此，特定種系「的」或「衍生自」特定種系的抗體序列可以具有包含與該種系相比的差異的可變區序列。然而，抗體序列將包含結構特徵，例如特定種系的特定胺基酸、CDR長度和/或構形特徵，表明特定種系係與該序列關聯的最接近的種系。這種相互作用可以模擬為一隻手（抗原）戴上手套（種系抗體）。由種系基因定義的初始結構必須足以讓手套首先適合手，然後可以進行定制以更精確地貼合。由於編碼抗體的重排免疫球蛋白種系基因的特定組合必須具有特定的抗原（手）相互作用的三維結構（手套），因此抗體的種系身份將被理解為定義與抗原相互作用的互補位的結構特徵。由於本文揭露的CB1抗體的輕鏈不與抗原直接接觸，因此輕鏈種系身份將被理解為定義用於與重鏈配對以與抗原進行互補位相互作用的輕鏈的結構特徵。
通常用於產生抗體的種系基因庫，包括智人和家鼷鼠，係序列，並且係已知的並且可以例如從IMGT/GENE-DB（Giudicelli V.,等人 「IMGT/GENE-DB: a comprehensive database for human and mouse immunoglobulin and T cell receptor genes.[IMGT/GENE-DB:人和小鼠免疫球蛋白和T細胞受體基因的綜合數據庫]」 Nucleic Acids Res.[核酸研究], 33: D256 - D261 (2005)）獲得。可以例如在預設設置下使用諸如基本局部比對搜索工具（BLAST）的演算法將抗體的序列與種系基因庫進行比對，以確定該抗體屬於哪個宿主生物體種系基因區段（或多個區段）。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A或S；HCDR2，其包含序列HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10（SEQ ID NO: 531），其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係E、T或S；X5係S或Q；X6係A或K；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N，以及HCDR3，其包含序列X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV（SEQ ID NO: 532），其中X11係D、E或N；X12係A、I、P或V；X13係L或V；X14係S或T；並且X15係H或Y。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或S；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係E、T或S；X5係S或Q；X6係A或K；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N，以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D、E或N；X12係A、I、P或V；X13係L或V；X14係T；並且X15係Y。在多個實施方式中，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3包含上文定義的序列，LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4、VK2/A19/JK1或VK3/A27/JK1種系。在一些實施方式中，LV屬於或衍生自VK2/A19/JK1種系。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或S；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係E、T或S；X5係S或Q；X6係A或K；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N，以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D、E或N；X12係A、I、P或V；X13係L或V；X14係S或T；並且X15係H或Y，並且b) 該LV包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含胺基酸序列RSSQSLLX16SX17GX18NYX19D（SEQ ID NO: 533），其中X16係H、S或T；X17係S、T或Y；X18係A、N、I或Y；並且X19係L或V；LCDR2包含胺基酸序列X20GSNRA（SEQ ID NO: 534），其中X20係L或Q；並且LCDR3包含胺基酸序列X21QAX22X23X24PRT（SEQ ID NO: 535），其中X21係M或R；X22係L、I、R或V；X23係Q、E、T、A或G；並且X24係T、I、L或Q。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或S；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係E、T或S；X5係S或Q；X6係A或K；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N，以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D、E或N；X12係A、I、P或V；X13係L或V；X14係T；並且X15係Y，並且b) LCDR1包含序列SEQ ID NO: 533，其中X16係H、S或T；X17係S、T或Y；X18係A、N、I或Y；並且X19係L或V；LCDR2包含序列SEQ ID NO: 534，其中X20係L或Q；並且LCDR3包含序列SEQ ID NO: 535，其中X21係M或R；X22係L、I、R或V；X23係Q、E、T、A或G；並且X24係T、I、L或Q。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或S；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係E、T或S；X5係S或Q；X6係A或K；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N，以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D、E或N；X12係A、I、P或V；X13係L或V；X14係S或T；並且X15係H或Y，並且b) LCDR1包含序列SEQ ID NO: 533，其中X16係H、S或T；X17係S、T或Y；X18係A、N、I或Y；並且X19係L或V；LCDR2包含序列SEQ ID NO: 534，其中X20係L或Q；並且LCDR3包含序列SEQ ID NO: 535，其中X21係M或R；X22係L、I、R或V；X23係Q、E、T、A或G；並且X24係L。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或S；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係E、T或S；X5係S或Q；X6係A或K；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N，以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D、E或N；X12係A、I、P或V；X13係L或V；X14係T；並且X15係Y，並且b) LCDR1包含胺基酸序列SEQ ID NO: 533，其中X16係H、S或T；X17係S、T或Y；X18係A、N、I或Y；並且X19係L或V；LCDR2包含胺基酸序列SEQ ID NO: 534，其中X20係L或Q；並且LCDR3包含胺基酸序列SEQ ID NO: 535，其中X21係M或R；X22係L、I、R或V；X23係Q、E、T、A或G；並且X24係L。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A、G或S；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係H、Y或Q；X4係T或S；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D或N；X12係A、I或T；X13係F、L或V；X14係S或T；並且X15係H、N或Y。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或G；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係T；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D或N；X12係A、I或T；X13係F、L或V；X14係T；並且X15係Y。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或G；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係T；X5係S；X6係K或N；X7係S或R；X8係F；X9係K；並且X10係G或D；以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係N；X12係T；X13係L或V；X14係T；並且X15係Y。在多個實施方式中，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3包含上文定義的序列，LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4或VK3/A27/JK1種系。在一些實施方式中，LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4種系。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A、G或S；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係H、Y或Q；X4係T或S；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D或N；X12係A、I或T；X13係F、L或V；X14係S或T；並且X15係H、N或Y，並且b) LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4或VK3/A27/JK1種系，較佳的是，LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4種系。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或G；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係T；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D或N；X12係A、I或T；X13係F、L或V；X14係T；並且X15係Y，並且b) LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4種系。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A、G或S；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係H、Y或Q；X4係T或S；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D或N；X12係A、I或T；X13係F、L或V；X14係S或T；並且X15係H、N或Y，並且b) LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4並且包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含胺基酸序列RASQSISNYLN（SEQ ID NO: 132）、RASQSIISYLN（SEQ ID NO: 150）或RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 186）；LCDR2包含胺基酸序列AASSLHS（SEQ ID NO: 133）或AASSLRS（SEQ ID NO: 151）；並且LCDR3包含胺基酸序列QQYQSYPLT（SEQ ID NO: 134）或QQYSNYPLT（SEQ ID NO: 152）；或者，VL屬於VK3/A27/JK1種系並且包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且其中LCDR1包含胺基酸序列RASQSVSSYLG（SEQ ID NO: 168）；LCDR2包含胺基酸序列GASSRAT（SEQ ID NO: 169）；並且LCDR3包含胺基酸序列QQYGSSPRT（SEQ ID NO: 170）。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A、G或S；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係H、Y或Q；X4係T或S；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D或N；X12係A、I或T；X13係F、L或V；X14係S或T；並且X15係H、N或Y，以及b) LCDR1，其包含序列RASQSISNYLN（SEQ ID NO: 132）、RASQSIISYLN（SEQ ID NO: 150）或RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 186）；LCDR2，其包含序列AASSLHS（SEQ ID NO: 133）或AASSLRS（SEQ ID NO: 151）；以及LCDR3，其包含序列QQYQSYPLT（SEQ ID NO: 134）或QQYSNYPLT（SEQ ID NO: 152）；較佳的是，b) LCDR1，其包含序列RASQSISNYLN（SEQ ID NO: 132）；LCDR2，其包含序列AASSLHS（SEQ ID NO: 133）；以及LCDR3，其包含序列QQYQSYPLT（SEQ ID NO: 134）。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或G；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係T；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係D或N；X12係A、I或T；X13係F、L或V；X14係T；並且X15係Y，以及b) LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4種系並且包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含胺基酸序列RASQSISNYLN（SEQ ID NO: 132）、RASQSIISYLN（ SEQ ID NO: 150），或RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 186）；LCDR2包含胺基酸序列AASSLHS（SEQ ID NO: 133）或AASSLRS（SEQ ID NO: 151）；並且LCDR3包含胺基酸序列QQYQSYPLT（SEQ ID NO: 134）或QQYSNYPLT（SEQ ID NO: 152）；較佳的是，b) LCDR1，其包含序列RASQSISNYLN（SEQ ID NO: 132）；LCDR2，其包含序列AASSLHS（SEQ ID NO: 133）；以及LCDR3，其包含序列QQYQSYPLT（SEQ ID NO: 134）。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或G；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係T；X5係S；X6係K或N；X7係S或R；X8係F；X9係K；並且X10係G或D；以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係N；X12係T；X13係L或V；X14係T；並且X15係Y，並且b) LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4種系。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含胺基酸序列RGGDYWA（SEQ ID NO: 414）或RGGDYWG（SEQ ID NO: 408）；HCDR2，其包含胺基酸序列HVYYTGSTKYNPSFKD（SEQ ID NO: 427）、HVYYTGSTNYNPRFKD（SEQ ID NO: 445）、HIYQTGSTNYNPRFKG（SEQ ID NO: 415）或HVYQTGSTKYNPSFKD（SEQ ID NO: 409）；以及HCDR3，其包含胺基酸序列NYDTLTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 410）或NYDTVTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 446），以及b) LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4種系。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含序列SEQ ID NO: 530，其中X1係A或G；HCDR2，其包含序列SEQ ID NO: 531，其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係T；X5係S；X6係K或N；X7係S或R；X8係F；X9係K；並且X10係G或D；以及HCDR3，其包含序列SEQ ID NO: 532，其中X11係N；X12係T；X13係L或V；X14係T；並且X15係Y，以及 b) LV屬於或衍生自包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的VK1/O2/JK4種系，其中LCDR1包含序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 405）；LCDR2包含序列X39ARX40LX41S（SEQ ID NO: 536），其中X39係N、S、K或G；X40係R、K、L或A；並且X41係A、G或S；並且LCDR3包含序列QQX42X43X44X45PX46T（SEQ ID NO: 537），其中X42係Y或F，X43係R、A、S、G或Y；X44係S、K、R或H；X45係S、L、F、Y、P或M；並且X46係L、I或V。在一些實施方式中，X42係Y並且X1-X15、X39-X41和X43-X44如上文所定義。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含胺基酸序列RGGDYWA（SEQ ID NO: 414）或RGGDYWG（SEQ ID NO: 408）；HCDR2，其包含胺基酸序列HVYYTGSTKYNPSFKD（SEQ ID NO: 427）、HVYYTGSTNYNPRFKD（SEQ ID NO: 445）、HIYQTGSTNYNPRFKG（SEQ ID NO: 415）或HVYQTGSTKYNPSFKD（SEQ ID NO: 409）；以及HCDR3，其包含胺基酸序列NYDTLTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 410）或NYDTVTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 446），以及b) LCDR1包含序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 405）；LCDR2包含序列X39ARX40LX41S（SEQ ID NO: 536），其中X39係N、S、K或G；X40係R、K、L或A；並且X41係A、G或S；並且LCDR3包含序列QQX42X43X44X45PX46T（SEQ ID NO: 537），其中X42係Y或F，X43係R、A、S、G或Y；X44係S、K、R或H；X45係S、L、F、Y、P或M；並且X46係L、I或V。在一些實施方式中，X42係Y並且X39-X41和X43-X44如上文所定義。
在某些實施方式中，本文揭露的抗CB1抗體或抗原結合片段包含來自本文描述的CB1抗體的任一個的重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。因此，在一些實施方式中，本文描述的係包含LIBC523596-1、LIBC527906-1、LIBC523603-1、LIBC527814-1、LIBC523661-1、LIBC527997-1、LIBC523670-1、LIBC528141-1、LIBC523748-1、LIBC527912-1、LIBC523760-1、LIBC528116-1、LIBC523797-1、LIBC527879-1、LIBC523813-1、LIBC527919-1、LIBC523815-1、LIBC527984-1、LIBC523844-1、LIBC527968-1、LIBC523857-1、LIBC528169-1、LIBC523862-1、LIBC528131-1、LIBC523868-1、LIBC527827-1、LIBC523969-1、LIBC527869-1、LIBC524049-1、LIBC528148-1、LIBC680562-1、LIBC680574-1、LIBC680773-1、LIBC680800-1、LIBC680812-1、LIBC681593-1、LIBC681594-1、和LIBC681737-1中任一項的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3的抗CB1抗體或其抗原結合片段。在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含該等抗體中任一個的HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及LCDR1、LCDR2和LCDR3。在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC523661-1、LIBC523797-1、LIBC524049-1、LIBC527814-1、LIBC527997-1、LIBC528116、LIBC527919-1、和LIBC680574-1中任一項的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3。該等抗體的HV和LV CDR序列列於表7、10和26中。
在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC523596-1、LIBC527906-1、LIBC523603-1、LIBC527814-1、LIBC523661-1、LIBC527997-1、LIBC523670-1、LIBC528141-1、LIBC523748-1、LIBC527912-1、LIBC523760-1、LIBC528116-1、LIBC523797-1、LIBC527879-1、LIBC523813-1、LIBC527919-1、LIBC523815-1、LIBC527984-1、LIBC523844-1、LIBC527968-1、LIBC523857-1、LIBC528169-1、LIBC523862-1、LIBC528131-1、LIBC523868-1、LIBC527827-1、LIBC523969-1、LIBC527869-1、LIBC524049-1、LIBC528148-1、LIBC680562-1、LIBC680574-1、LIBC680773-1、LIBC680800-1、LIBC680812-1、LIBC681593-1、LIBC681594-1、和LIBC681737-1中任一項的HV或LV。在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC523596-1、LIBC527906-1、LIBC523603-1、LIBC527814-1、LIBC523661-1、LIBC527997-1、LIBC523670-1、LIBC528141-1、LIBC523748-1、LIBC527912-1、LIBC523760-1、LIBC528116-1、LIBC523797-1、LIBC527879-1、LIBC523813-1、LIBC527919-1、LIBC523815-1、LIBC527984-1、LIBC523844-1、LIBC527968-1、LIBC523857-1、LIBC528169-1、LIBC523862-1、LIBC528131-1、LIBC523868-1、LIBC527827-1、LIBC523969-1、LIBC527869-1、LIBC524049-1、LIBC528148-1、LIBC680562-1、LIBC680574-1、LIBC680773-1、LIBC680800-1、LIBC680812-1、LIBC681593-1、LIBC681594-1、和LIBC681737-1中任一項的HV和LV。該等抗體的HV和LV序列列於表8、11和27中。
在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC523661-1、LIBC523797-1、LIBC524049-1、LIBC527814-1、LIBC527997-1、LIBC528116、LIBC527919-1、和LIBC680574-1中任一項的HV或LV。在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC523661-1、LIBC523797-1、LIBC524049-1、LIBC527814-1、LIBC527997-1、LIBC528116、LIBC527919-1、和LIBC680574-1中任一項的HV和LV。
親和力成熟文庫設計中包括了與CB1結合增強相關的10D10的HC_FR3 de-環中的某些突變（實例1）。此外，親和力成熟後鑒定的所有測試序列包括LC FR3非共有突變的R94S種系回復（實例2和3）。此外，與HCDR1相鄰的R32（AHo編號）也參與表位相互作用。因此，在上述抗體和抗原結合片段的一些實施方式中，HV位置83（AHo編號方案）處的胺基酸係N並且HV位置85（AHo編號方案）處的胺基酸係Y。在上述抗體和抗原結合片段的一些實施方式中，HV位置83處的胺基酸係N，HV位置85處的胺基酸係Y，並且LV位置94處的胺基酸係S。在一些實施方式中，在上述抗體和抗原結合片段中，HV位置32處的胺基酸係R。
在各種實施方式中，本文揭露的抗體和抗原結合片段係huCB1的拮抗劑和/或反向促效劑，例如，抗體和結合片段抑制huCB1的傳訊。抗體和抗原結合片段的效力在奈米莫耳或亞奈米莫耳範圍內，例如，抗體和抗原結合片段具有小於約10 nM、小於約5 nM、小於約3 nM或小於約1 nM的IC50，如在基於細胞的cAMP測定中測量。在一些實施方式中，本文揭露的抗體和抗原結合片段的效力與利莫那班的效力相當或更好（例如，比利莫那班好至少兩倍、三倍、五倍、八倍或十倍）。
另一方面，本文揭露了結合huCB1並包含重鏈可變區（HV）和輕鏈可變區（LV）的抗體或其抗原結合片段，其中 a) 該VH包含HCDR1、HCDH2和HCDR3，其中CDRH1包含胺基酸序列RGGDYWS（SEQ ID NO: 1）；CDRH2包含序列HX25YX26X27GX28TX29YNPX 30X31X32X33（SEQ ID NO: 538），其中X25係I或V；X26係Y或Q；X27係A、E、K或T；X28係S或Q；X29係A、E、K或T；X30係N或S；X31係F或L，X32係K或R；並且X33係G、S或N；並且CDRH3包含序列X34YDX35X36X37 GYSYYYYGX38DV（SEQ ID NO: 539），其中X34係D或G；X35係A、I、T或V；X36係L或不存在；X37係S或T；並且X38係M或L；並且 b) 該VL屬於或衍生自VK2/A19/JK1種系。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) CDRH1，其包含序列RGGDYWS（SEQ ID NO: 1）；CDRH2，其包含序列HX25YX26X27GX28 TX29YNPX30X31X32X33（SEQ ID NO: 538），其中X25係I或V；X26係Y；X27係A、E、K或T；X28係S或Q；X29係A、E、K或T；X30係N或S；X31係F或L，X32係K或R；並且X33係G、S或N；以及CDRH3，其包含序列X34YDX35X36X37GYSYYYYGX38DV（SEQ ID NO: 539），其中X34係G；X35係A、I、T或V；X36不存在；X37係S；並且X38係M或L，以及b) 該VL屬於或衍生自VK2/A19/JK1種系。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) CDRH1，其包含序列RGGDYWS（SEQ ID NO: 1）；CDRH2，其包含序列HX25YX26X27GX28T X29YNPX30X31X32X33（SEQ ID NO: 538），其中X25係I或V；X26係Y或Q；X27係A、E、K或T；X28係S或Q；X29係A、E、K或T；X30係N或S；X31係F或L，X32係K或R；並且X33係G、S或N；以及CDRH3，其包含序列X34YDX35X36X37GYSYYYYGX38DV（SEQ ID NO: 539），其中X34係D或G；X35係A、I、T或V；X36係L或不存在；X37係S或T；並且X38係M或L，以及且b) 該VL屬於或衍生自VK2/A19/JK1種系並且包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含序列RSSQSLLHRSGYNYLD（SEQ ID NO: 257）；LCDR2包含序列X20GSNRA（SEQ ID NO: 534），其中X20係L或Q；並且LCDR3包含X47QX48X49X50X51PRT（SEQ ID NO: 540），其中X47係M或R；X48係A或S；X49係L、R或V；X50係Q或A；並且X51係T或L。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) CDRH1，其包含序列RGGDYWS（SEQ ID NO: 1）；CDRH2，其包含序列HX25YX26X27GX28 TX29YNPX30X31X32X33（SEQ ID NO: 538），其中X25係I或V；X26係Y；X27係A、E、K或T；X28係S或Q；X29係A、E、K或T；X30係N或S；X31係F或L，X32係K或R；並且X33係G、S或N；以及CDRH3，其包含序列X34YDX35X36X37GYSYYYYGX38DV（SEQ ID NO: 539），其中X34係G；X35係A、I、T或V；X36不存在；X37係S；並且X38係M或L，以及b) LCDR1，其包含序列RSSQSLLHRSGYNYLD（SEQ ID NO: 257）；LCDR2，其包含序列X20GSNRA（SEQ ID NO: 534），其中X20係L或Q；以及LCDR3，其包含X47QX48X49X50X51PRT（SEQ ID NO: 540），其中X47係M或R；X48係A或S；X49係L、R或V；X50係Q或A；並且X51係T或L。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) CDRH1，其包含序列RGGDYWS（SEQ ID NO: 1）；CDRH2，其包含序列HX25YX26X27GX28 TX29YNPX30X31X32X33（SEQ ID NO: 538），其中X25係I或V；X26係Y或Q；X27係A、E、K或T；X28係S或Q；X29係A、E、K或T；X30係N或S；X31係F或L，X32係K或R；並且X33係G、S或N；以及CDRH3，其包含序列X34YDX35X36X37GYSYYYYGX38DV（SEQ ID NO: 539），其中X34係D或G；X35係A、I、T或V；X36係L或不存在；X37係S或T；並且X38係M或L，以及b) LCDR1，其包含胺基酸序列RSSQSLLHRSGYNYLD（SEQ ID NO: 257）；LCDR2，其包含胺基酸序列LGSNRAS（SEQ ID NO: 258）或QGSNRAS（SEQ ID NO: 264）；以及LCDR3，其包含胺基酸序列MQSLQTPRT（SEQ ID NO: 259）、RQSVALPRT（SEQ ID NO: 271）或RQARALPRT（SEQ ID NO: 265）。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) CDRH1，其包含序列RGGDYWS（SEQ ID NO: 1）；CDRH2，其包含序列HX25YX26X27GX28 TX29YNPX30X31X32X33（SEQ ID NO: 538），其中X25係I或V；X26係Y；X27係A、E、K或T；X28係S或Q；X29係A、E、K或T；X30係N或S；X31係F或L，X32係K或R；並且X33係G、S或N；以及CDRH3，其包含序列X34YDX35X36X37GYSYYYYGX38DV（SEQ ID NO: 539），其中X34係G；X35係A、I、T或V；X36不存在；X37係S；並且X38係M或L，以及b) LCDR1，其包含胺基酸序列RSSQSLLHRSGYNYLD（SEQ ID NO: 257）；LCDR2，其包含胺基酸序列LGSNRAS（SEQ ID NO: 258）或QGSNRAS（SEQ ID NO: 264）；以及LCDR3，其包含胺基酸序列MQSLQTPRT（SEQ ID NO: 259）、RQSVALPRT（SEQ ID NO: 271）或RQARALPRT（SEQ ID NO: 265）。
在某些實施方式中，本文揭露的抗CB1抗體或抗原結合片段包含來自本文描述的CB1抗體的任一個的重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含LCDR1、LCDR2和LCDR3。例如，在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC673948-1、LIBC673952-1、LIBC673965-1、LIBC673982-1、LIBC673972-1、LIBC674024-1、LIBC674035-1、LIBC674043-1、LIBC674090-1、LIBC674002-1、LIBC674153-1、LIBC674200-1、LIBC674214-1、LIBC674216-1、LIBC674229-1、LIBC674235-1、LIBC674257-1、和LIBC674276-1中任一項的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3。在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC673948-1、LIBC673952-1、LIBC673965-1、LIBC673982-1、LIBC673972-1、LIBC674024-1、LIBC674035-1、LIBC674043-1、LIBC674090-1、LIBC674002-1、LIBC674153-1、LIBC674200-1、LIBC674214-1、LIBC674216-1、LIBC674229-1、LIBC674235-1、LIBC674257-1、和LIBC674276-1中任一項的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3。該等抗體的HV和LV CDR序列列於表30中。
在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC673948-1、LIBC673952-1、LIBC673965-1、LIBC673982-1、LIBC673972-1、LIBC674024-1、LIBC674035-1、LIBC674043-1、LIBC674090-1、LIBC674002-1、LIBC674153-1、LIBC674200-1、LIBC674214-1、LIBC674216-1、LIBC674229-1、LIBC674235-1、LIBC674257-1、和LIBC674276-1中任一項的HV或LV。在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC673948-1、LIBC673952-1、LIBC673965-1、LIBC673982-1、LIBC673972-1、LIBC674024-1、LIBC674035-1、LIBC674043-1、LIBC674090-1、LIBC674002-1、LIBC674153-1、LIBC674200-1、LIBC674214-1、LIBC674216-1、LIBC674229-1、LIBC674235-1、LIBC674257-1、和LIBC674276-1中任一項的HV和LV。該等抗體的HV和LV序列列於表31中。
在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC529593-1、LIBC560340-1和LIBC560657-1中任一項的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3。在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC529593-1、LIBC560340-1和LIBC560657-1中任一項的HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3。抗體的HV和LV CDR序列列於表19中。例如，抗體或其抗原結合片段包含a) HCDR1，其包含胺基酸序列RGGDYWS（SEQ ID NO: 474）或RGGDYWN（SEQ ID NO: 480）；HCDR2，其包含胺基酸序列HIYYSGSTNYNPSLRS（SEQ ID NO: 475）、HIYYSGS KNYNPSLKS（SEQ ID NO: 481）、或HIYYTGTKYYNPSLKS（SEQ ID NO: 487），以及HCDR3，其包含胺基酸序列DYDILYGYSYYYYGLDV（SEQ ID NO: 476）、或GYDSSGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 475），以及b) LCDR1，其包含胺基酸序列RSSQSLLHRSGYNYLD（SEQ ID NO: 471）、RSSQSLLYSNGHNFLD（SEQ ID NO: 477）、或RSSQSLLYSNGHNYLD（SEQ ID NO: 483），LCDR2，其包含胺基酸序列LGSNRAS（SEQ ID NO: 472）或LGSNRAP（SEQ ID NO: 484），以及LCDR3，其包含胺基酸序列MQSLQTPRT（SEQ ID NO: 473）或MQALQTPRT（SEQ ID NO: 479）。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含LIBC529593-1、LIBC560340-1和LIBC560657-1中任一項的HV或LV。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含LIBC529593-1、LIBC560340-1和LIBC560657-1中任一項的HV和LV。抗體的HV和LV序列列於表20中。
在一些實施方式中，與參考抗體相比，抗CB1抗體或其抗原結合片段在HV CDR中包含胺基酸突變。例如，在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) 包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的HV，其中與HVYYTGSTNYNPRFKD（SEQ ID NO: 136）相比，抗體的HCDR2包含5個或更少的突變。在一些實施方式中，與HVYYTGSTNYNPRFKD（SEQ ID NO: 136）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR2包含4個或更少的突變。在一些實施方式中，與HVYYTGSTNYNPRFKD（SEQ ID NO: 136）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR2包含5個或更少的突變，以及與NYDTVTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 137）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR3包含3個或更少的突變。在一些實施方式中，與HVYYTGSTNYNPRFKD（SEQ ID NO: 136）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR2包含4個或更少的突變，以及與NYDTVTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 137）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR3包含3個或更少的突變。在此類實施方式中，HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A、S或G，較佳的是A或S，並且抗體或其抗原結合片段的LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4、VK2/A19/JK1或VK3/A27/JK1種系。較佳的是，LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4或VK2/A19/JK1種系，更較佳的是VK1/O2/JK4種系。種系的或衍生自種系的LV序列的示例性序列在上文和表8、11、27和31中進行了描述。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含a) 包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的HV，其中與HVYYTGSTKYNPNFKG（SEQ ID NO: 8）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR2包含5個或更少的突變。在一些實施方式中，與HVYYTGSTKYNPNFKG（SEQ ID NO: 8）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR2包含4個或更少的突變。在一些實施方式中，與HVYYTGSTKYNPNFKG（SEQ ID NO: 8）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR2包含5個或更少的突變，以及與DYDILTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 9）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR3包含3個或更少的突變。在一些實施方式中，與HVYYTGSTKYNPNFKG（SEQ ID NO: 8）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR2包含4個或更少的突變，以及與DYDILTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 9）相比，抗體或其抗原結合片段的HCDR3包含3個或更少的突變。在此類實施方式中，HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A、S或G，較佳的是A或S，並且抗體或其抗原結合片段的LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4或VK2/A19/JK1種系，較佳的是VK2/A19/JK1種系。種系的或衍生自種系的LV序列的示例性序列在上文和表8、11、20、27和31中描述。
在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 228的序列具有至少90%同一性、或至少95%同一性（例如，至少96%、至少97%、或至少98%同一性）的序列。抗體或其抗原結合片段的LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4、VK2/A19/JK1、或VK3/A27/JK1種系。較佳的是，LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4或VK2/A19/JK1種系，更較佳的是VK1/O2/JK4種系。在一些實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO: 100的序列具有至少90%同一性、或至少95%同一性（例如，至少96%、至少97%、或至少98%同一性）的序列。抗體或其抗原結合片段的LV屬於或衍生自VK1/O2/JK4或VK2/A19/JK1種系，較佳的是VK2/A19/JK1種系。種系的或衍生自種系的LV序列的示例性序列在上文和表8、11、20、27和31中描述。
如本文所用，術語「同一性」係指如藉由比對並比較兩個或更多個多肽分子或者兩個或更多個核酸分子的序列所確定的該等序列之間的關係。如本文所用，「同一性百分比」意指在所比較的分子中胺基酸或核苷酸之間相同殘基的百分比，並且基於所比較的最小分子的大小計算。對於該等計算，必須藉由特定的數學模型或電腦程式（即，「演算法」）解決比對中的空位（如果有的話）。可用於計算比對的核酸或多肽的同一性之方法包括以下中描述的那些方法：Computational Molecular Biology [計算分子生物學], (Lesk, A. M.編), 1988, 紐約: 牛津大學出版社（Oxford University Press）；Biocomputing Informatics and Genome Projects [生物計算資訊學和基因組計畫], （Smith, D. W.編）, 1993, 紐約: Academic Press [學術出版社]；Computer Analysis of Sequence Data [序列數據的電腦分析], 第I部分, （Griffin, A. M.及Griffin, H. G.編）, 1994, 新澤西州: Humana Press [胡馬納出版社]；von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology [分子生物學序列分析], 紐約: Academic Press [學術出版社]；Sequence Analysis Primer [序列分析入門], （Gribskov, M.及Devereux, J.編）, 1991, 紐約: M. Stockton Press [米斯托克頓出版社]；及Carillo等人, 1988, SIAM J.[美國工業和應用數學學會雜誌] Applied Math.[應用數學] 48:1073。例如，可以藉由常用於比較兩個多肽的胺基酸位置相似性的標準方法確定序列同一性。使用電腦程式，諸如BLAST或FASTA，將兩個多肽或兩個多核苷酸序列比對以實現其各自殘基的最佳匹配（沿一個或兩個序列的全長，或沿一個或兩個序列的預定部分）。該等程式提供預設開放罰分和默認空位罰分，和評分矩陣，例如PAM 250（Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure [蛋白質序列和結構圖集]，第5卷，第3增刊, 1978），或者可以將BLOSUM62（Henikoff等人，1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.[美國國家科學院院刊] 89:10915-10919）與計算器程式結合使用。例如，然後同一性百分比可以計算為：相同匹配的總數乘以100，然後除以匹配範圍內較長序列的長度與引入較長序列中以便比對這兩個序列的空位數量的總和。在計算同一性百分比時，以實現序列之間最大匹配的方式比對所比較的序列。
GCG程式包係可以用於測定一致性百分比的計算器程式，該程式包包括GAP（Devereux等人，1984, Nucl. Acid Res.[核酸研究] 12:387；Genetics Computer Group [遺傳學電腦組], University of Wisconsin [威斯康辛大學], Madison [麥迪森], WI [威斯康辛洲]）。使用電腦演算法GAP來比對待確定序列同一性百分比的兩個多肽或兩個多核苷酸。將序列比對以實現其各自胺基酸或核苷酸的最佳匹配（如藉由演算法確定的「匹配範圍」）。將空位開放罰分（其計算為3x 對角線平均值，其中「對角線平均值」係所使用的比較矩陣的對角線的平均值；「對角線」係由特定比較矩陣分配給每個完全胺基酸匹配的得分或數值）和空位延伸罰分（其通常是1/10×空位開放罰分）以及比較矩陣（諸如PAM 250或BLOSUM 62）與該演算法聯合使用。在某些實施方式中，該演算法還使用標準比較矩陣（關於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure [蛋白質序列和結構圖集] 5:345-352；關於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. [美國國家科學院院刊] 89:10915-10919）。
使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列的一致性百分比的推薦參數包括以下： 演算法：Needleman等人 1970, J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 48:443-453； 比較矩陣：來自Henikoff等人，1992, 同上文的BLOSUM 62； 空位罰分：12（但是末端空位無罰分） 空位長度罰分：4 相似性閾值：0
用於比對兩個胺基酸序列的某些比對方案可以使這兩個序列的僅較短區域匹配，並且此較小比對區可以具有極高序列同一性，即使這兩個全長序列之間並無明顯關係。因此，如果需要，可以調整所選擇的比對方法（GAP程式）以在靶多肽的至少50個連續胺基酸範圍內進行比對。
如上所述，與10D10相比，本文揭露的抗CB1抗體或其抗原結合片段可以在HC_FR3區中含有突變。對於包含SEQ ID NO: 1的HCDR1、SEQ ID NO: 538的HCDR2和SEQ ID NO: 539的HCDR3的抗體或其抗原結合片段，除了HV位置83和/或85處的突變之外，位於HV位置79可為R。在一些實施方式中，抗體的HV位置83處的胺基酸係N並且抗體的HV位置85處的胺基酸係Y。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段的位置79處的胺基酸係R，抗體或其抗原結合片段的HV位置83處的胺基酸係N，並且抗體或其抗原結合片段的HV位置85處的胺基酸係Y。在抗體的一些實施方式中如上所述，抗體或其抗原結合片段的HV位置83處的胺基酸係N，抗體或其抗原結合片段的HV位置85處的胺基酸係Y，並且抗體的LV位置94處的胺基酸係S。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段的位置79處的胺基酸係R，抗體或其抗原結合片段的HV位置83處的胺基酸係N並且胺基酸抗體或其抗原結合片段的HV位置85處的胺基酸係Y，並且抗體或其抗原結合片段的LV位置94處的胺基酸係S。
在某些較佳的實施方式中，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含LIBC528116-1、LIBC680574-1、LIBC673952-1、LIBC523797-1、LIBC527814-1、LIBC527997-1、LIBC527919-1、LIBC523661-1和LIBC524049-1中任一項的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3。例如，抗CB1抗體或其抗原結合片段包含以下任一項中的一組重鏈和輕鏈CDR： (a) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 135-137，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 138-140； (b) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 426-428，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 423-425； (c) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 266-268，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 263-235 (d) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 129-131，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 132-134； (e) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 159-161，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 162-164； (f) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 207-209，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 210-212； (g) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1-3，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4-6；並且 (h) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 55-57，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 58-60。
在一些較佳的實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含含有選自SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 460、SEQ ID NO: 368、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 252、SEQ ID NO: 98、和SEQ ID NO: 116的胺基酸序列的HV。在一些較佳的實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含含有選自SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 459、SEQ ID NO: 367、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 97、和SEQ ID NO: 115的胺基酸序列的LV。在一些較佳的實施方式中，抗體或其抗原結合片段包含選自以下任一項中的HV和LV：i) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 228的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 227的LV；ii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 459的LV；iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 368的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 367的LV；iv) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 100的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 99的LV；v) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 236的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 235的LV；vi) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 226的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 225的LV；vii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 252的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 251的LV；viii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 98的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 97的LV；以及ix) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 115的LV。
在各種實施方式中，與10D10 LC N35Y（即，在LC胺基酸位置35處含有N至Y取代的10D10）相比，本文揭露的抗體或其抗原結合片段對CB1（例如，huCB1）具有更高的結合親和力。在一些實施方式中，抗體或其抗原結合片段對CB1的結合親和力比10D10 LC N35Y高至少三倍。在一些實施方式中，與10D10 LC N35Y相比，抗體或其抗原結合片段對CB1的結合親和力高至少五倍（例如，高至少八倍、高至少十倍、高至少十二倍、高至少十五倍、或高至少二十倍）。
使用多種技術確定親和力，其中一個實例係親和力ELISA測定。在各種實施方式中，藉由表面電漿子共振測定（例如基於BIAcore®的測定）確定親和力。使用此方法，可以測量締合速率常數（k a，以M -1s -1表示）和解離速率常數（k d，以s -1表示）。然後可以由動力學速率常數的比率（k d/k a）計算平衡解離常數（K D，以M表示）。在一些實施方式中，藉由動力學方法諸如如Rathanaswami等人 Analytical Biochemistry [分析生物化學], 第373卷:52-60, 2008中描述的動力學排除測定（KinExA）確定親和力。使用KinExA測定，可以測量平衡解離常數（K D，以M表示）和締合速率常數（k a，以M -1s -1表示）。解離速率常數（k d，以s -1表示）可以由該等值計算（K Dx k a）。在其他實施方式中，藉由生物膜層干涉法諸如Kumaraswamy等人, Methods Mol. Biol. [分子生物學方法], 第1278卷:165-82, 2015中描述且用於Octet ®系統（佛特比奧公司（Pall ForteBio））中的方法確定親和力。動力學常數（k a和k d）和親和力常數（K D）可以使用生物膜層干涉法即時計算。可以使用該等技術和抗原源（例如，表現CB1-ND、CB1-SMALP或CB1的細胞（例如，293T細胞））測量與CB1（例如，huCB1）的結合。
特異性結合抗原的抗體或抗原結合片段的平衡解離常數（K D）≤ 1 x 10 -6M。當K D≤ 3 x 10 -8M時，抗體或抗原結合片段以「高親和力」特異性結合抗原。在一些實施方式中，抗CB1抗體或抗原結合片段結合靶抗原（例如，huCB1），K D≤ 100 nM（例如，小於約90 nM、70 nM、50 nM、30 nM、20 nM、10 nM，或由前述值中的任意兩個定義的範圍）。在一些實施方式中，抗CB1抗體或結合片段以小於約70 nM-10 nM（例如，約60 nM-20 nM，或約40 nM-10 nM）的解離常數（K D）結合CB1（例如，huCB1，諸如huCB1-ND），如使用Octet ®系統和huCB1-ND所確定的。在一些實施方式中，抗體或抗原結合片段以≤ 1 x 10 -8M（例如，≤ 1 x 10 -9M，≤ 5 x 10 -10M，或≤ 1 x 10 -10M）的KD結合CB1（例如，hu-CB1），如使用KinExA測定和表現huCB1-SMAP或CB1的細胞所確定的。
在各種實施方式中，本文揭露的抗CB1抗體和抗原結合片段係拮抗劑和/或反向促效劑抗huCB1抗體和抗原結合片段，例如，它們抑制huCB1的傳訊。抗體和抗原結合片段的效力在個位數奈米莫耳範圍或亞奈米莫耳範圍內，例如，它們具有小於約10 nM、小於約5 nM、小於約3 nM或小於約1 nM的IC50，如在基於細胞的cAMP測定中（例如，在CP 55,940存在的情況下進行基於細胞的cAMP測定）中測量的。在一些實施方式中，本文揭露的抗CB1抗體和抗原結合片段具有與利莫那班相當的效力。在一些實施方式中，本文揭露的抗CB1抗體和抗原結合片段的效力大於利莫那班的效力（例如，比利莫那班大至少兩倍、三倍、五倍、八倍或十倍）。在各種實施方式中，可以使用基於細胞的cMAP測定來測量效力。
10D10抗體結合huCB1的胞外環2區（即SEQ ID NO: 559的胺基酸殘基256至273）（WO 2014210205）。本文揭露的抗CB1抗體和抗原結合片段結合huCB1上的相同區域，因為它們係10D10抗體的親和力成熟變體。因此，在一些實施方式中，本文揭露的抗CB1抗體和抗原結合片段結合huCB1的胞外環2區並且具有小於約10 nM、小於約5 nM、小於約3 nM或小於約1 nM的IC50，如在基於細胞的cAMP測定（例如，在CP 55,940存在下的基於細胞的cAMP測定）中測量的。
本發明之抗CB1抗體可包含任何免疫球蛋白恒定區。本文中可與「恒定結構域」互換使用的術語「恒定區」係指抗體中除可變區外的所有結構域。恒定區不直接參與抗原的結合，但表現出多種效應子功能。如上所述，抗體取決於其重鏈恒定區的胺基酸序列而分為特定同種型（IgA、IgD、IgE、IgG和IgM）和亞型（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）。輕鏈恒定區可為例如存在於所有五種抗體同種型中的κ型或λ型輕鏈恒定區，例如人κ型或λ型輕鏈恒定區。人免疫球蛋白輕鏈恒定區序列之實例如表1所示：
[表1].示例性人免疫球蛋白輕鏈恒定區
名稱 SEQ ID NO: CL 結構域胺基酸序列
人λv1 513 GQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
人λv2 514 GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
人λv3 515 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
人λv4 516 GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHKSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
人λv5 517 GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS
人κv1 518 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
人κv2 519 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
本發明之抗CB1抗體的重鏈恒定區可以為例如α、Δ、ε、γ或μ型重鏈恒定區，例如人α、Δ、ε、γ或μ型重鏈恒定區。在一些實施方式中，抗CB1抗體包含來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的重鏈恒定區。在一個實施方式中，抗CB1抗體包含來自人IgG1免疫球蛋白的重鏈恒定區。在此類實施方式中，人IgG1免疫球蛋白恒定區可包含一或多個防止抗體的糖基化和/或延長抗體的半衰期的突變，本文將更詳細地描述。在另一個實施方式中，抗CB1抗體包含來自人IgG2免疫球蛋白的重鏈恒定區。在又一實施方式中，抗CB1抗體包含來自人IgG4免疫球蛋白的重鏈恒定區。人IgG1、IgG2和IgG4重鏈恒定區序列之實例顯示於下表2中。
[表2].示例性人免疫球蛋白重鏈恒定區
Ig 同種型 SEQ ID NO: 重鏈恒定區胺基酸序列
人IgG1z 520 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1za 521 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1f 522 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1fa 523 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1z無糖基化v1 524 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1z無糖基化v2 525 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1z無糖基化v2_半衰期延長 526 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPCEEQYGSTYRCVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
huIgG1z_半衰期延長 527 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2 528 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG4 529 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
本文揭露的輕鏈可變區中的每一個和重鏈可變區中的每一個（表8、11、20、27和31）可以分別附接至以上輕鏈恒定區（表1）和重鏈恒定區（表2）以形成完整抗體輕鏈和重鏈。在一些實施方式中，表8、11、20、27和31中揭露的每個輕鏈可變區和每個重鏈可變區附接至SEQ ID NO: 518或519和SEQ ID NO: 525、526或527以分別形成完整的抗體輕鏈和重鏈。在一些實施方式中，表8、11、20、27和31中揭露的每個輕鏈可變區和每個重鏈可變區附接至SEQ ID NO: 518和SEQ ID NO: 525、526或527以分別形成完整的抗體輕鏈和重鏈。在一些實施方式中，表8、11、20、27和31中揭露的每個輕鏈可變區和每個重鏈可變區附接SEQ ID NO: 518和SEQ ID NO: 525以分別形成完整的抗體輕鏈和重鏈。在一些實施方式中，單株抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 562的重鏈和具有胺基酸序列SEQ ID NO: 563的輕鏈。在一些實施方式中，單株抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 562且C末端的胺基酸殘基K被缺失的重鏈和具有胺基酸序列SEQ ID NO: 563的輕鏈。此外，由此產生的重鏈和輕鏈序列各自可以組合形成完整抗體結構。應理解，本文所提供的重鏈和輕鏈可變區還可附接至具有與以上所列示例性序列不同的序列的其他恒定結構域。
本發明之抗CB1抗體或抗原結合片段可為單株抗體、多株抗體、重組抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體或多特異性抗體或其抗原結合片段。在某些實施方式中，抗CB1抗體係單株抗體。在此類實施方式中，抗CB1抗體可以為嵌合抗體、人源化抗體或具有人免疫球蛋白恒定結構域的完全人抗體。在該等和其他實施方式中，抗CB1抗體係人IgG1（例如，IgG1z）、IgG2、IgG3或IgG4抗體。因此，在一些實施方式中，抗CB1抗體可以具有人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定結構域。在一個實施方式中，抗CB1抗體係單株人IgG1抗體，較佳的是單株人IgG1z抗體。在另一個實施方式中，抗CB1抗體係單株人IgG2抗體。在又一個實施方式中，抗CB1抗體係單株人IgG4抗體。
如本文所用，術語「單株抗體」（或「mAb」）係指從基本上同源的抗體群獲得的一種抗體，即，構成該群體的個別抗體除以微量存在的可能天然存在的突變外係相同的。相對於典型地包括針對不同表位的不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體針對個別抗原位點或表位具有高度特異性。單株抗體可以使用本領域中已知的任何技術，例如藉由在完成免疫接種方案後，使自動物收集的脾細胞永生化來產生。可以使用本領域中已知的任何技術，例如藉由使脾細胞與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤來使脾細胞永生化。參見例如，Antibodies [抗體]; Harlow和Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press [冷泉港實驗室出版社], 第1版，例如來自1988年版，或第2版，例如來自2014年版。用於產生融合瘤的融合程序中的骨髓瘤細胞較佳的是不產生抗體，具有高融合效率且具有使其無法在僅支持所需融合細胞（融合瘤）生長的某些選擇性培養基中生長的酶缺陷。適用於與小鼠細胞融合的細胞系之實例包括但不限於，Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XXO Bul。適用於與大鼠細胞融合的細胞系之實例包括但不限於，R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F和4B210。可用於細胞融合的其他細胞系係U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。用於分離單株抗體的另外的示例性方法包括在免疫接種計畫完成後從動物中篩選血漿B細胞。（參見例如Pedrioli A.和Oxenius A., Trends in Immunology [免疫學趨勢], 2021, 42(12):1148-1158）。藉由該等方法分離的單株抗體的特性可以使用體外親和力成熟技術例如本領域已知的基於酵母展示的親和力成熟來優化（例如，以改善結合）。（參見例如Cherf, G. M.和Cochran, J. R., Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications.[酵母表面顯示:方法、方案和應用] 2015, 155-175）。
在一些實施方式中，本發明之抗CB1抗體或抗原結合片段係基於本文所述抗體的CDR和可變區序列的嵌合或人源化抗體或其抗原結合片段。嵌合抗體係由來自不同抗體的蛋白質區段共價接合以產生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或結合片段構成的抗體。一般而言，重鏈和/或輕鏈的一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體種類或亞類的抗體中的相應序列一致或同源，而該（等）鏈的其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體種類或亞類的抗體中的相應序列一致或同源。有關涉及嵌合抗體之方法，參見例如美國專利4,816,567；以及Morrison等人，1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊] 81:6851-6855，都藉由引用以其全文特此併入。
一般而言，製備嵌合抗體之目的係產生嵌合體，其中使來自預定物種的胺基酸數量最大。一個實例係「CDR移植」的抗體，其中該抗體包含一或多個來自特定物種或屬於特定抗體類別或亞類的CDR，而該（等）抗體鏈的其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列一致或同源。CDR移植描述於例如美國專利案號6,180,370、5,693,762、5,693,761、5,585,089和5,530,101中。對用於人，通常將來自齧齒動物或兔抗體的可變區或選擇的CDR移植至人抗體中，替代人抗體的天然存在的可變區或CDR。
嵌合抗體的一種有用類型係「人源化」抗體。一般而言，人源化抗體係由最初在非人動物，例如齧齒動物或兔中產生的單株抗體製備。該單株抗體中的某些胺基酸殘基，典型地來自抗體的非抗原識別部分的胺基酸殘基經修飾成與相應同種型的人抗體中的相應殘基同源。人源化可以例如使用各種方法，藉由用至少一部分齧齒動物或兔可變區取代人抗體的相應區域來進行（參見例如，美國專利案號5,585,089和5,693,762；Jones等人，1986, Nature [自然] 321:522-525；Riechmann等人，1988, Nature [自然] 332:323-27；Verhoeyen等人，1988, Science [科學] 239:1534-1536）。
在一個方面中，將本文所提供的抗體的輕鏈和重鏈可變區（參見表7、10、19、26和30）的CDR移植至來自相同或不同系統發生物種的抗體的構架區（FR）。例如，表7、10、19、26和30中所列重鏈和輕鏈可變區的CDR可以移植至共有人FR中。為了產生共有人FR，可以比對來自幾種人重鏈或輕鏈胺基酸序列的FR以鑒定共有胺基酸序列。可替代地，可以將來自一條重鏈或輕鏈的經移植可變區與不同於本文所揭露的特定重鏈或輕鏈的恒定區的恒定區一起使用。
在某些實施方式中，本發明之抗CB1抗體或抗原結合片段係完全人抗體或其抗原結合片段。「完全人抗體」係包含來源於或指示人生殖系免疫球蛋白序列的可變區和恒定區的抗體。提供的用於產生完全人抗體的一種特定方式係小鼠體液免疫系統的「人源化」。將人免疫球蛋白（Ig）基因座引入內源性Ig基因失活的小鼠中係在小鼠中產生完全人單株抗體（mAb）的一種方式，小鼠係可以免疫接種任何所需抗原的動物。使用完全人抗體可以使免疫原性和過敏性響應減到最少，該等響應有時是由向人投與小鼠或小鼠源性mAb作為治療劑而引起。
以上所述之轉基因小鼠稱為「HuMab」小鼠，含有編碼未重排人重鏈（μ和γ）和κ輕鏈免疫球蛋白序列以及使內源μ和κ鏈基因座失活的靶突變的人免疫球蛋白基因微型基因座（Lonberg等人，1994, Nature [自然] 368:856-859）。因此，小鼠展現較低的小鼠IgM和κ表現且對免疫起反應，引入的人重鏈和輕鏈轉基因經歷類別轉換和體細胞突變以產生高親和力人IgG κ單株抗體（Lonberg和Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol.[國際免疫學綜述] 13: 65-93；Harding和Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci.[紐約科學院年鑒] 764:536-546）。HuMab小鼠的製備詳細描述於以下中：Taylor等人，1992, Nucleic Acids Research [核酸研究] 20:6287-6295；Chen等人, 1993, International Immunology [國際免疫學] 5:647-656；Tuaillon等人, 1994, J. Immunol .[免疫學雜誌] 152:2912-2920；Lonberg等人, 1994, Nature [自然] 368:856-859；Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology [實驗藥理學手冊] 113:49-101；Taylor等人, 1994, International Immunology [國際免疫學] 6:579-591；Lonberg和Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol.[國際免疫學綜述] 13:65-93；Harding和Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci.[紐約科學院年鑒] 764:536-546；Fishwild等人，1996, Nature Biotechnology [自然生物技術] 14:845-851；上述參考文獻藉由引用以其全文特此併入。適於產生完全人抗CB1抗體的一種特定轉基因小鼠系係XenoMouse ®轉基因小鼠，描述於美國專利案號6,114,598、6,162,963、6,833,268、7,049,426、7,064,244；Green等人, 1994, Nature Genetics [自然遺傳學] 7:13-21；Mendez 等人, 1997, Nature Genetics [自然遺傳學] 15:146-156；Green和Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med [實驗醫學雜誌], 188:483-495；Green, 1999, Journal of Immunological Methods [免疫法雜誌] 231:11-23；Kellerman和Green, 2002, Current Opinion in Biotechnology[生物技術新觀點] 13, 593-597，所有文獻都藉由引用以其全文特此併入。人來源的抗體還可使用噬菌體展示技術產生。噬菌體展示描述於例如Dower等人，WO 91/17271；McCafferty等人，WO 92/01047；以及Caton和Koprowski, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊], 87:6450-6454中，其各自藉由援引以其全文併入本文。
在某些實施方式中，本發明之抗CB1抗體和抗原結合片段可包含恒定區的一或多個突變或修飾。例如，抗CB1抗體的重鏈恒定區或Fc區可包含影響抗體的糖基化、效應子功能和/或Fcγ受體結合的一或多個胺基酸取代。術語「Fc區」係指免疫球蛋白重鏈的C-末端區，該末端區可以藉由木瓜蛋白酶消化完整抗體而產生。免疫球蛋白的Fc區一般包含兩個恒定結構域，即CH2結構域和CH3結構域，且視需要包含CH4結構域。在某些實施方式中，Fc區係來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的Fc區。在一些實施方式中，Fc區包含來自人IgG1或人IgG2免疫球蛋白的CH2和CH3結構域。Fc區可以保持效應子功能，例如C1q結合、補體依賴性細胞毒性（CDC）、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）和吞噬作用。在其他實施方式中，Fc區可以被修飾成降低或消除效應子功能和/或改善半衰期，如以下更詳細地描述。
在一些實施方式中，本發明之抗CB1抗體在Fc區中包含一或多個降低效應子功能的胺基酸取代。胺基酸序列中的胺基酸取代在本文中典型地以特定位置中胺基酸殘基的單字母縮寫，後接相對於感興趣的原始序列的胺基酸位置編號，再接取代的胺基酸殘基的單字母縮寫命名。例如，「C220S」以符號表示相對於目的原始序列在胺基酸位置220處的半胱胺酸殘基經絲胺酸殘基取代。可以降低效應子功能的示例性胺基酸取代（根據EU編號方案）包括但不限於，C220S、C226S、C229S、E233P、L234A、L234V、V234A、L234F、L235A、L235E、G237A、P238S、S267E、H268Q、N297A、N297G、V309L、E318A、L328F、A330S、A331S、P331S或前述任一種的組合。
糖基化可以促進抗體，特別是IgG1抗體的效應子功能。因此，在一些實施方式中，本發明之抗CB1抗體可以包含影響抗體糖基化水平或類型的一或多個胺基酸取代。多肽的糖基化典型地是N-連接或O-連接的。N-連接係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基的側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸和天冬醯胺-X-蘇胺酸（其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸）係將碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈的識別序列。因此，在多肽中該等三肽序列中的任一個的存在產生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化係指將糖N-乙醯半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一種連接至羥基胺基酸，最常見的是絲胺酸或蘇胺酸，儘管也可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
在一些實施方式中，藉由例如從抗體的Fc區移除一或多個糖基化位點來減少或消除本文所述之抗CB1抗體的糖基化。在一些實施方式中，抗CB1抗體係無糖基化的人單株抗體，例如無糖基化的人IgG1單株抗體。消除或改變N-連接的糖基化位點的胺基酸取代可以減少或消除抗體的N-連接的糖基化。在某些實施方式中，本文所述之抗CB1抗體包含在位置N297（根據EU編號方案）處的重鏈突變，例如N297Q、N297A、或N297G。在一些實施方式中，本發明之抗CB1抗體包含來自人IgG1抗體的在位置N297處具有突變的Fc區。在一個特定實施方式中，本發明之抗CB1抗體包含來自人IgG1抗體的具有N297G突變的Fc區。例如，在一些實施方式中，本發明之抗CB1抗體包含含有序列SEQ ID NO: 524的重鏈恒定區。
為了改善包含N297突變的分子的穩定性，可以進一步工程改造抗CB1抗體的Fc區。例如，在一些實施方式中，Fc區中的一或多個胺基酸經半胱胺酸取代以促進二聚體狀態下二硫鍵的形成。對應於IgG1 Fc區的V259、A287、R292、V302、L306、V323或I332（根據EU編號方案）的殘基因此可以經半胱胺酸取代。較佳的是，將特定的殘基對用半胱胺酸取代，使得它們優先彼此形成二硫鍵，從而限制或防止二硫鍵爭奪。較佳的是對包括但不限於，A287C與L306C、V259C與L306C、R292C與V302C，以及V323C與I332C。在某些實施方式中，本文所述之抗CB1抗體包含來自人IgG1抗體的具有R292C和V302C突變的Fc區。在此類實施方式中，Fc區還可包含N297突變，例如N297G突變。在一些實施方式中，本發明之抗CB1抗體包含含有序列SEQ ID NO: 525的重鏈恒定區。
還可能需要對本發明之抗CB1抗體進行修飾以增加血清半衰期（例如，體內半衰期）。實現增加的血清半衰期的一種方法係藉由恒定結構域中某些位置的胺基酸突變，例如WO 2002060919中描述的那些。此類突變增加了抗體對FcRn的親和力及其血清半衰期。在一些實施方式中，本文所述之抗CB1抗體包含來自人IgG1抗體的Fc區，其在胺基酸位置251-256（根據EU編號方案）處具有一或多個突變。在一些實施方式中，Fc區在位置252、254和256處包含一或多個突變。在一些實施方式中，Fc區包含M252Y、S254T和T256E（根據EU編號方案）。在一些實施方式中，本發明之抗CB1抗體包含含有序列SEQ ID NO: 527的重鏈恒定區。
在一些實施方式中，本文所述之抗CB1抗體的Fc區可以包含改變抗體的糖基化、穩定性和血清半衰期的修飾。例如，在一些實施方式中，本文所述之抗CB1抗體包含來自人IgG1抗體的具有突變R292C和V302C、N297突變（例如N297G突變）（根據EU編號方案）的Fc區，並且還可以包含位置252、254和256處的一或多個突變，例如M252Y、S254T和T256E（根據EU編號方案）。在一些實施方式中，本發明之抗CB1抗體包含含有序列SEQ ID NO: 526的重鏈恒定區。
預期本文所述之抗CB1抗體和抗原結合片段不與人2型大麻素受體（CB2）交叉反應（即，基本上不識別或不結合）。人CB2係來自大麻素受體家族的G蛋白偶合受體，由CNR2基因編碼。人CB2含有360個胺基酸（UniProtKB-P34972，SEQ ID NO: 560）並且與huCB1具有約44%的序列相似性。本文所述之抗CB1抗體和抗原結合片段也不與小鼠CB1蛋白（UniProtKB-P47746，SEQ ID NO: 561）交叉反應。
本發明包括編碼本文所述之抗CB1抗體或抗原結合片段的一或多種多核苷酸或核酸。此外，本發明涵蓋包含該等核酸的載體、包含該等核酸的宿主細胞或細胞系、以及製備本發明之抗CB1抗體和抗原結合片段之方法。該等核酸包含例如編碼抗體或抗原結合片段的全部或一部分，例如本發明抗體的一條或兩條鏈，或其片段、衍生物或變體的多核苷酸；用於對編碼多肽的多核苷酸進行鑒別、分析、突變或擴增的PCR引物或定序引物；用於抑制多核苷酸表現的反義寡核苷酸；以及前述的互補序列。適當時，該等核酸可以為任何長度以用於所希望的用途或功能，且可包含一或多個另外的序列，例如調控序列，和/或作為較長核酸，例如載體的一部分。本發明之核酸分子包括呈單股和雙股形式的DNA和RNA，以及相應互補序列。DNA包括例如cDNA、基因組DNA、化學合成的DNA、藉由PCR擴增的DNA及其組合。本發明之核酸分子包括全長基因或cDNA分子，以及其片段組合。本發明之核酸可以來源於人來源以及非人物種。
來自免疫球蛋白或其區域（例如可變區、Fc區等）的相關胺基酸序列或感興趣的多肽可以藉由直接蛋白質定序確定，且適合編碼核苷酸序列可以根據通用密碼子表設計。可替代地，可以使用常規程序（例如，藉由使用能夠與編碼單株抗體的重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針）從產生此類抗體的細胞中分離編碼本發明單株抗體或其結合片段的基因組或cDNA並進行定序。
本發明還包括包含編碼本發明之抗體或抗原結合片段的一或多個組分（例如，可變區、輕鏈和重鏈）的一或多個核酸的載體。術語「載體」係指用於將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中的任何分子或實體（例如，核酸、質體、噬菌體或病毒）。載體之實例包括但不限於質體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體和表現載體（例如，重組表現載體）。如本文所用的，術語「表現載體」或「表現構建體」係指含有所需編碼序列和用於在特定宿主細胞中表現可操作地連接的編碼序列所必需的適合的核酸控制序列的重組DNA分子。表現載體可以包括但不限於這樣的序列，該等序列影響或控制轉錄、翻譯以及（如果存在內含子的話）影響與其可操作地連接的編碼區的RNA剪接。用於在原核生物中表現所必需的核酸序列包括啟動子、視需要操縱子序列、核糖體結合位點和可能的其他序列。已知真核細胞利用啟動子、強化子以及終止和聚腺苷酸化訊息。
分泌型訊息肽序列也可以視需要由與目的編碼序列可操作地連接的表現載體編碼，使得所表現的多肽可以由重組宿主細胞分泌（如果需要的話），以便更容易地從細胞中分離目的多肽。例如，在一些實施方式中，訊息肽序列可以與表8、11、20、27和31中所列可變區多肽序列中的任一個的胺基末端附接/融合。在某些實施方式中，具有胺基酸序列MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC（SEQ ID NO: 541）的訊息肽與表8、11、20、27和31中的可變區多肽序列中的任一個的胺基末端融合。在其他實施方式中，具有胺基酸序列MAWALLLLTLLTQGTGSWA（SEQ ID NO: 542）的訊息肽與表8、11、20、27和31中的可變區多肽序列中的任一個的胺基末端融合。在又其他實施方式中，具有胺基酸序列MTCSPLLLTLLIHCTGSWA（SEQ ID NO: 543）的訊息肽與表8、11、20、27和31中的可變區多肽序列中的任一個的胺基末端融合。可以與本文所描述的可變區多肽序列中的任一個的胺基末端融合的其他適合訊息肽序列包括：MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG（SEQ ID NO: 544）、MEWTWR VLFLVAAATGAHS（SEQ ID NO: 545）、METPAQLLFLLLLWLPDTTG（SEQ ID NO: 546）、METPAQLLFLLLLWLPDTTG（SEQ ID NO: 547）、MKHLWFF LLLVAAPRWVLS（SEQ ID NO: 548）、MEWSWVFLFFLSVTTGVHS（SEQ ID NO: 549）、MDIRAPTQLLGLLLLWLPGAKC（SEQ ID NO: 550）、MDIRAPTQLLGLLLLWLPGARC（SEQ ID NO: 551）、MDTRAPTQ LLGLLLLWLPGATF（SEQ ID NO: 552）、MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARC（SEQ ID NO: 553）、METGLRWLLLVAVLKGVQC（SEQ ID NO: 554）、METGLR WLLLVAVLKGVQCQE（SEQ ID NO: 555）、MDMRAPTQLLGLLLLWLPGARC（SEQ ID NO: 556）、MKILILGIFLFLCSTPAWA（SEQ ID NO: 557）、和MRTLA ILAAILLVALQAQA（SEQ ID NO: 558）。其他訊息或分泌肽係熟悉該項技術者已知的且可以與表8、11、20、27和31中所列可變區多肽鏈中的任一個融合，例如以促進或優化在特定宿主細胞中的表現。
通常，在宿主細胞中用於產生本發明之抗CB1抗體和抗原結合片段的表現載體將含有用於質體維持和用於選殖和表現編碼抗體和抗原結合片段的組分的外源核苷酸序列的序列。在某些實施方式中，此類序列（統稱為「側接序列」）典型地將包括以下核苷酸序列中的一或多個：啟動子（例如，適合宿主細胞的啟動子）、一或多個強化子序列（例如，病毒強化子序列）、複製起點（例如，細菌的質體起點或哺乳動物系統的病毒起點）、轉錄終止序列、含有供體和受體剪接位點的完整內含子序列、編碼用於多肽分泌的訊息序列的序列、核糖體結合位點（例如Shine-Dalgarno序列（原核生物）或科紮克序列（真核生物））、多聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現的多肽的核酸的多聚連接子區、以及選擇性標誌物元件（例如，編碼賦予抗生素抗性或補充宿主細胞營養缺陷型缺陷的蛋白質的序列）。側接序列和載體係本領域眾所周知的。例如，表現載體係可商購的。此外，可對可商購的表現載體進行所期望的修飾或使用本領域已知的序列構建。編碼抗CB1抗體或結合片段（例如HV和/或LV）的不同組分的核酸可以插入相同載體或不同載體的適當位點以在宿主細胞中表現。
「宿主細胞」係指已經用核酸轉化或能夠用核酸轉化並且由此表現目的基因的細胞。該術語包括親本細胞的後代，無論後代與原始親本細胞在形態或遺傳構成方面是否相同，只要存在目的基因即可。包含本發明之分離核酸較佳的是可操作地連接到至少一個表現控制序列（例如啟動子或強化子）的宿主細胞係「重組宿主細胞」。將載體轉化或轉染到宿主細胞中之方法係本領域眾所周知的。
適合的宿主細胞包括原核細胞或真核細胞，並且還包括但不限於細菌、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞和動物細胞，如昆蟲細胞和哺乳動物細胞，例如鼠、大鼠、獼猴或人。
原核宿主細胞包括真細菌，如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如腸桿菌科（ Enterobacteriaceae）如艾氏菌屬（ Escherichia），例如大腸桿菌（ E. coli）、腸桿菌屬（ Enterobacter）、伊文氏桿菌屬（ Erwinia）、克留氏菌屬（ Klebsiella）、變形桿菌屬（ Proteus）、沙氏桿菌屬（ Salmonella），例如鼠傷寒沙氏桿菌（ Salmonella typhimurium）、沙雷氏菌屬（ Serratia），例如黏質沙雷氏菌（ Serratia marcescans）、和志賀氏桿菌（ Shigella）、還有芽孢桿菌屬（ Bacillus），例如枯草桿菌（ B. subtilis）和地衣芽孢桿菌（ B. licheniformis）、假單胞菌屬（ Pseudomonas）、和鏈黴菌屬（ Streptomyces）。真核微生物（如絲狀真菌或酵母）係用於重組多肽的合適的選殖或表現宿主。釀酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae）或普通麵包酵母係低等真核宿主微生物中最常用的。不過，多種其他屬、種和菌株係常用的且可用於本文中，例如畢赤酵母屬（ Pichia），例如巴斯德畢赤酵母（ P. pastoris）、粟酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces pombe）；克魯維酵母屬（ Kluyveromyces），耶氏酵母屬（ Yarrowia）；念珠菌屬（ Candida）；瑞氏木黴（ Trichoderma reesia）；粗糙脈孢菌；許旺酵母屬（ Schwanniomyces），例如西方許旺酵母（ Schwanniomyces occidentalis）；和絲狀真菌，如，例如脈孢菌屬（ Neurospora）、青黴菌屬（ Penicillium）、木黴菌屬（ Tolypocladium）和麴菌屬（ Aspergillus）宿主，例如小巢狀麴菌（ A. nidulans）和黑麴菌（ A. niger）。
用於表現糖基化抗體和抗原結合片段的宿主細胞可以衍生自多細胞生物體。無脊椎動物細胞之實例包括植物細胞和昆蟲細胞。已經鑒定了許多桿狀病毒株和變體以及來自以下宿主的相應的許可性昆蟲宿主細胞，例如草地貪夜蛾（ Spodoptera frugiperda）（毛蟲），埃及伊蚊（ Aedes aegypti）（蚊子），白紋伊蚊（ Aedes albopictus）（蚊子），黑腹果蠅（ Drosophila melanogaster）（果蠅）和家蠶（ Bombyx mori）。用於轉染此類細胞的多種病毒株係公開可獲得的，例如，苜蓿銀紋夜蛾（ Autographa californica）NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5株。
脊椎動物宿主細胞亦為合適的宿主，並且從此類細胞重組生產抗體和抗原結合片段已成為常規程序。可用作表現的宿主的哺乳動物細胞系係本領域熟知的，並且包括但不限於可從美國種質保存中心（ATCC）獲得的永生化細胞系，包括但不限於中國倉鼠卵巢（CHO）細胞，包括CHOK1細胞（ATCC CCL61）、DXB-11、DG-44和中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR（CHO，Urlaub等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA [美國國家科學院院刊]77: 4216, 1980）；由SV40轉化的猴腎CV1系（COS-7，ATCC CRL 1651）；人胎腎細胞系（293或亞選殖用於以懸浮培養方式生長的293細胞（Graham等人，J. Gen Virol.[普通病毒學雜誌] 36: 59, 1977）；幼倉鼠腎臟細胞（BHK，ATCC CCL 10）；小鼠塞托利細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod.[生殖生物學] 23: 243-251, 1980）；猴腎細胞（CV1、ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎臟細胞（VERO-76, ATCC CRL-1587）；人子宮頸癌細胞（HELA，ATCC CCL 2）；犬腎臟細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；布法羅大鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人肝癌細胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51）；TRI細胞（Mather等人, Annals N.Y Acad. Sci. [紐約科學院年報] 383: 44-68, 1982）；MRC 5細胞或FS4細胞；哺乳動物骨髓瘤細胞，以及許多其他的細胞系。在一些實施方式中，CHO細胞係表現本發明之抗CB1抗體和抗原結合片段的較佳的是宿主細胞。
用上述核酸或載體轉化或轉染宿主細胞以產生抗CB1抗體或抗原結合片段，並在適當改進用於誘導啟動子、選擇轉化子、或擴增編碼所需序列的基因的常規營養培養基中培養。因此，本發明還提供了產生本文所述之抗CB1抗體或抗原結合片段之方法，該方法包括在允許由本文所述之一或多種表現載體編碼的抗體或抗原結合片段表現的條件下，在培養基中培養包含該一或多種表現載體的宿主細胞；從該培養基或宿主細胞中回收該抗體或抗原結合片段。
在培養宿主細胞後，抗體或抗原結合片段可以在胞內、周質間隙中產生，或者直接分泌到培養基中。如果抗體或抗原結合片段在胞內產生，則作為第一個步驟，例如藉由離心或超濾來移除宿主細胞或溶解片段的顆粒狀碎片。抗體或抗原結合片段可以使用本領域已知的方法使用例如羥磷灰石層析法、陽離子或陰離子交換層析法、或較佳的是親和層析法、使用一或多種目的抗原或蛋白A或蛋白G作為親和配體來純化。蛋白A可用於純化包括基於人γ1、γ2或γ4重鏈的多肽的蛋白質（Lindmark等人, J. Immunol. Meth.[免疫學方法雜誌] 62: 1-13, 1983）。對於所有小鼠同型和對於人γ3推薦蛋白G（Guss等人, EMBO J.[歐洲分子生物學學會雜誌] 5: 1567-1575, 1986）。親和配體所連接的基質最常為瓊脂糖，但其他基質亦為可用的。相較於用瓊脂糖，機械穩定的基質，例如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可以提高流動速率並縮短加工時間。在蛋白質包含CH3結構域的情況下，Bakerbond ABX™樹脂（J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.[新澤西州菲力浦斯堡]）可用於純化。根據要回收的特定抗體或抗原結合片段，其他用於蛋白質純化的技術例如乙醇沈澱、逆相HPLC、層析聚焦、SDS-PAGE和硫酸銨沈澱亦為可能的。
組成物
本文還揭露了包含抗CB1抗體或抗原結合片段的組成物。合適的組成物包括包含本文描述和示例的抗CB1抗體或抗原結合片段以及一或多種藥學上可接受的賦形劑的那些。「藥學上可接受的」係指在所採用的劑量和濃度下對人接受者無毒和/或當向人投與時不產生過敏或不良反應的分子和化合物。本發明之藥物組成物包括但不限於液體、冷凍和凍乾組成物。
在一些實施方式中，藥物組成物可包含用於改變、維持或保持例如組成物的pH、莫耳滲透壓濃度、黏度、澄清度、顏色，等滲性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透的材料。在此類實施方式中，合適的配製物材料包括但不限於緩衝液（例如乙酸鹽緩衝液、Tris-HCl、檸檬酸鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液或含有其他有機酸的緩衝液）；增積劑或填充劑，例如單糖；二糖（例如蔗糖）；和其他碳水化合物；蛋白質（如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）；胺基酸（例如甘胺酸、穀醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸）、著色劑和稀釋劑；乳化劑；親水聚合物（如聚乙烯吡咯啶酮）；螯合劑（如乙二胺四乙酸（EDTA））；錯合劑（如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精）；低分子量多肽；成鹽抗衡離子（如鈉）；防腐劑（如殺藻銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、洛赫西定、山梨酸或過氧化氫）；溶劑（如甘油、丙二醇或聚乙二醇）；懸浮劑；界面活性劑或潤濕劑（如普朗尼克類（pluronic）、PEG、脫水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯（如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80）、曲通（triton）、胺丁三醇、卵磷脂、膽固醇、泰洛沙泊（tyloxapal））；穩定性增強劑（諸如蔗糖或山梨糖醇）；張力增強劑（如鹼金屬鹵化物、較佳的是氯化鈉或氯化鉀，甘露糖醇，山梨糖醇）；遞送媒介物；稀釋劑；賦形劑和/或藥用佐劑。用以配製用於治療用途的分子之方法和合適的材料係製藥領域已知的，並且描述於例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明頓藥物科學], 第18版, (A.R. Genrmo編輯), 1990, 馬克出版公司（Mack Publishing Company）中。
在一些實施方式中，本文揭露的組成物係液體組成物，例如水溶液。在一些實施方式中，組成物包含緩衝劑、張力劑或增積劑、界面活性劑，並且具有約4.5至約7.5範圍內的pH。視需要，該組成物進一步包含鹽和/或防腐劑。
在一些實施方式中，組成物的pH在約4.5至約7.0的範圍內，例如約4.5至約6.5，或約4.8至約5.5，或視需要約5.0。適於在此範圍內的pH值的緩衝劑之實例包括乙酸鹽（例如乙酸鈉）、琥珀酸鹽（例如琥珀酸鈉）、葡糖酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽及其他有機酸緩衝劑。取決於例如緩衝劑和所需組成物等滲性，緩衝劑濃度可以為約1 mM至約200 mM，或約10 mM至約60 mM。
組成物中可包含張力劑，其還可使抗體或抗原結合片段穩定。示例性的張力劑包括多元醇，例如蔗糖、甘露糖醇或海藻糖。較佳的是，水性配製物係等滲的，不過高滲或低滲溶液還可為適合的。配製物中多元醇的示例性濃度可以在約1%至約15% w/v範圍內。
還可以將界面活性劑添加到配製物中以減少配製的抗體或抗原結合片段的聚集和/或最小化配製物中顆粒的形成和/或減少吸附。示例性界面活性劑包括非離子型界面活性劑，例如聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80）或泊洛沙姆（poloxamer）（例如泊洛沙姆188）。界面活性劑的示例性濃度可以在約0.001%至約0.5%，或約0.005%至約0.2%，或可替代地約0.004%至約0.01% w/v的範圍內。
在一個實施方式中，組成物含有以上鑒定的藥劑（即，抗體或抗原結合片段、緩衝液、多元醇和界面活性劑）且基本上不含一或多種防腐劑，例如苯甲醇、苯酚、間甲酚、氯丁醇和氯化苯索寧。在另一實施方式中，配製物中可包括例如濃度在約0.1%至約2%，或可替代地約0.5%至約1%範圍內的防腐劑。在一個實施方式中，組成物可進一步包含鹽例如氯化鈉或一或多種其他藥學上可接受的賦形劑。配製物中可包括一或多種藥學上可接受的運載體、賦形劑或穩定劑，例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明頓的藥物科學]，第18版，（A.R. Genrmo編輯），1990, Mack Publishing Company [馬克出版公司] 中所描述的那些，只要其不會不利地影響所需配製物特徵即可。
待用於體內投與的配製物必須為無菌的。本發明之組成物可以藉由常規、熟知的滅菌技術來滅菌。例如，滅菌易於藉由濾過無菌過濾膜實現。所得溶液可包裝待用或在無菌條件下過濾並凍乾，凍乾製劑將在投與之前與無菌溶液組合。
在一些實施方式中，包含抗CB1抗體或抗原結合片段和一或多種藥學上可接受的賦形劑的組成物係固體組成物，例如凍乾餅。通常採用凍乾方法使多肽穩定較長儲存期，特別是當該多肽在液體組成物中相對不穩定時。凍乾循環通常由三個步驟構成：冷凍、初次乾燥和二次乾燥（參見Williams和Polli, Journal of Parenteral Science and Technology [腸外科學與技術雜誌]，第38卷，第2期，第48-59頁, 1984）。在冷凍步驟中，將溶液冷卻直至其充分冷凍。在此階段，溶液中的整體水形成冰。冰在初次乾燥階段昇華，該初次乾燥階段係藉由使用真空將腔室壓力降低至小於冰的蒸汽壓來進行。最後，在二次乾燥階段，在降低的腔室壓力和升高的貨架溫度下，吸收或結合的水經移除。該過程產生稱為凍乾餅的物質。之後，該餅可以在使用前復原。有關凍乾物質的標準復原實踐係加回一定體積純水（典型地等於在凍乾期間移除的體積），不過在製備供腸胃外投與的藥物時，有時會使用抗細菌劑的稀溶液（參見Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy [藥物開發與工業製藥]，第18卷：1311-1354, 1992）。
已注意到，在一些情況下，賦形劑充當冷凍乾燥的產物的穩定劑（參見Carpenter等人，第74卷：225-239, 1991）。例如，已知的賦形劑包括多元醇（包括甘露糖醇、山梨糖醇和甘油）；糖（包括葡萄糖和蔗糖）；和胺基酸（包括丙胺酸、甘胺酸和麩胺酸）。此外，通常還使用多元醇和糖保護多肽免受冷凍和乾燥誘導的損害且增強在以乾燥狀態儲存期間的穩定性。一般而言，糖，尤其雙糖在冷凍乾燥過程中和儲存期間有效。另據報導，其他類別的分子，包括單糖和雙糖以及例如PVP之類聚合物可作為凍乾產物的穩定劑。
如本文所述，本發明之配製物可以設計成短效、快速釋放、長效或持續釋放的。因此，藥物配製物還可配製用於控制釋放或緩慢釋放。持續釋放製劑的合適實例包括含有抗體或抗原結合片段的固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠（例如聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚(乙烯醇)）、聚丙交酯（美國專利案號3,773,919）、L-麩胺酸與L-麩胺酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如Lupron Depot™（由乳酸-乙醇酸共聚物與乙酸亮丙瑞林（leuprolide acetate）構成的可注射微球體）和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。雖然聚合物（如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸）能夠釋放分子超過100天，但某些水凝膠釋放蛋白質持續的時間更短。當囊封的多肽在體內保持較長時間，其可能由於在37°C下暴露於水分而變性或聚集，由此導致生物活性喪失和可能的免疫原性變化。可以根據所涉及的機制設計合理的策略以實現穩定。例如，如果發現聚集機理係通過硫代-二硫化物交換形成分子間S-S鍵，則可以藉由修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制水分含量、使用適當的添加劑並且開發特定的聚合物基質組成物來實現穩定化。用於製備持續釋放組成物的賦形劑和方法描述於例如REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES [雷明頓藥物科學], 第18版, (A.R. Genrmo, 編輯), 1990。
包含抗CB1抗體或抗原結合片段和一或多種上述藥學上可接受的賦形劑的組成物可以藉由任何合適的方式投與，包括腸胃外投與。腸胃外投與包括靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮內或皮下投與。較佳的是，藉由注射給予劑量，最較佳的是皮下、肌內或靜脈內注射。涵蓋其他投與方法，包括表面，特別是經皮、經黏膜、直腸、經口或例如經由置放於希望部位附近的導管局部投與。
用途
本文揭露的內容還包括抗CB1抗體或抗原結合片段或包含其的組成物用於抑制、減少或中和CB1受體（例如，huCB1）的量、活性或傳訊的用途。本發明之抗體和抗原結合片段可用於治療、預防和/或改善與CB1表現或活性相關或由CB1表現或活性介導的任何疾病或障礙，或者藉由阻斷CB1和CB1配體（例如大麻素）之間的相互作用或以其他方式抑制CB1活性和/或傳訊和/或促進受體內化和/或減少細胞表面受體數量可治療的任何疾病或障礙。在各種實施方式中，CB1係周圍CB1。
可以藉由本文所述之抗CB1抗體或抗原結合片段治療的示例性障礙、疾病和病症包括肥胖症和合併症，例如綜合症性肥胖症，包括普威二氏症候群（Prader-Willi syndrome）、阿爾斯特雷姆綜合症（Alstrom syndrome）、巴德特-比德爾綜合症（Bardet-Biedel syndrome，BBS）、奧爾布賴特遺傳性骨營養不良（AHO）和SIM1缺失綜合症；糖尿病和相關併發症（例如血漿葡萄糖、胰島素和/或抵抗素水平異常）；血脂異常（例如，HDL、血漿膽固醇和/或三酸甘油酯水平異常）；肝病，例如非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和原發性膽汁性肝硬化；纖維化，例如腎纖維化；慢性腎病（CKD），例如由代謝紊亂引起的CKD；IgA腎病；腎臟疾病；代謝性疾病、骨質疏鬆症、動脈粥樣硬化、炎症性疾病、心血管疾病、癌症、疼痛、系統性硬化症、多發性硬化症痙攣、青光眼和尼古丁成癮。
肥胖症係指可能損害個體健康的異常或過多的脂肪積累，並且可以藉由身體質量指數（BMI）來測量或分類。BMI定義為一個人的體重（例如，公斤）除以其身高（以米為單位）的平方（例如，kg/m 2）。
因此，一方面，本文揭露的係治療對拮抗或反向激動CB1受體（例如huCB1）有響應的受試者中的疾病或障礙之方法，或治療需要拮抗或反向激動CB1受體的受試者中的疾病或障礙之方法，該方法包括投與上述抗體或抗原結合片段。在一些實施方式中，抗體或抗原結合片段係CB1受體的有效拮抗劑和/或反向促效劑，例如，在基於細胞的cAMP測定中測量，它們具有小於約10 nM的效力（IC50）（例如，小於約8 nM、小於約5 nM、小於約3 nM、或小於約1 nM）。在一些實施方式中，抗體或抗原結合片段具有小於約10 nM（例如，小於約5 nM、小於約3 nM、或小於約1 nM）的IC50，如在基於細胞的cAMP測定（例如，在CP 55,940存在下的基於細胞的cAMP測定）中測量的。在一些實施方式中，抗體或抗原結合片段包含如上所述之重鏈和/或輕鏈CDR。各種示例性抗體的CDR序列列於表7、10、19、26和30中。在一些實施方式中，抗體或抗原結合片段包含如上所述之重鏈和/或輕鏈可變區。在其他實施方式中，抗體包含如上所述之重鏈和/或輕鏈。示例性抗體的重鏈和輕鏈可變區序列列於表8、11、20、27和31中。示例性重鏈和輕鏈恒定區序列列於表1和2中。在各種實施方式中，以有效量投與抗體或抗原結合片段以治療障礙或疾病（例如，引起潛在益處或治療效果）。在各種實施方式中，CB1受體係周圍CB1受體。
術語「有需要的受試者」或「需要治療」的受試者包括患有障礙或疾病的受試者，以及臨床上尚未表現出障礙或疾病的受試者。「受試者」包括接受預防性或治療性治療的人和其他哺乳動物受試者。在較佳的實施方式中，受試者係人。
在一些實施方式中，障礙或疾病係肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝性疾病、纖維化、肝病如非酒精性脂肪性肝炎（NASH）或NAFLD、原發性膽汁性肝硬化、腎臟疾病、腎纖維化、慢性腎病（例如，由代謝紊亂引起的慢性腎病）、IgA腎病、骨質疏鬆症、動脈粥樣硬化、心血管疾病、癌症或炎性疾病。在一些實施方式中，障礙或疾病係肥胖症。在一些實施方式中，所治療的受試者患有慢性腎病，例如由代謝紊亂或腎損傷驅動的慢性腎病。在一些實施方式中，所治療的受試者患有BMI為27 kg/m 2或更高的肥胖症。在一些實施方式中，所治療的受試者患有BMI為30 kg/m 2或更高的肥胖症。在其他實施方式中，障礙或疾病係肝病（例如，NASH）。
在一些實施方式中，投與或治療導致受試者出現以下一或多種：體重減輕、食慾降低、代謝參數改善、血糖水平降低（例如空腹血糖水平降低）、胰島素水平降低、HbA1c水平降低、血脂水平降低（例如HDL、膽固醇和/或三酸甘油酯水平降低）、腎損傷減少、纖維化、炎症、腎功能改善。
套組
在一些實施方式中，本文揭露的係包含組成物的套組（kit），該等組成物包含抗CB1抗體或抗原結合片段以及一或多種上述藥學上可接受的賦形劑。例如，這樣的套組包括包含本文所述之抗CB1抗體或抗原結合片段的組成物，例如上述水性組成物或凍乾組成物，其包裝在容器例如密封瓶、器皿、單次使用或多次使用小瓶、預充式注射器或預充式注射裝置中。可以為凍乾組成物提供合適的媒劑或載劑，例如注射用水或生理鹽水溶液。還可以包括腸胃外投與配製物中常見的其他材料。在一個方面，該組成物被包裝為一個單位劑型。該套組可以進一步包括適於根據特定的投與途徑投與該配製物的裝置。較佳的是，套組進一步含有描述抗體或抗原結合片段或包含其的組成物之用途的標籤。
本文引用的所有參考文獻（包括專利、專利申請、文獻出版物等）藉由引用以其全文特此併入。
給出以下實例僅用於說明本發明，而不以任何方式限制其範圍。 實例
實例1.深度突變掃描和親和力成熟文庫的設計
材料與方法： CB1-ND 製備。對於奈米盤製備，Tian H.等人, Cell [細胞], 167(3) (2016) 750-762中描述的CB1構建體在Sf9細胞中帶組胺酸純化標籤表現，並使用親和力和粒徑排阻層析法在HEPES緩衝液中進行純化，該緩衝液含有0.05% DDM；0.01% CHS和10 uM配體-1981202#5。POPC脂質在100 mM膽酸鈉的幫助下溶解，並以480 : 8 : 1的莫耳比與MSP1D1支架蛋白和CB1混合。奈米盤的形成係藉由在4°C下與SM2 BioBeads一起孵育1小時來實現的。
與 CB1-ND 和空 -ND 結合。Luna V.等人（Luna V.等人, European Polymer Journal [歐洲聚合物雜誌] 109 (2018) 483-488）描述了展示用於結合實驗的抗體的酵母細胞的增殖和誘導。取出至少2 x 10 5個展示IgG的酵母細胞，並用補充有5 mg/mL牛血清白蛋白（PBS-B）的1x磷酸鹽緩衝鹽水（無Mg2+，無Ca2+）清洗。將帶有His標籤的huCB1-ND或空-ND添加至所需濃度，並與酵母細胞在25°C孵育1小時。用PBS-B洗滌細胞，然後與別藻藍蛋白（APC）軛合的抗His抗體一起孵育以檢測結合，並與藻紅素（PE）軛合的抗huFc抗體一起孵育以檢測IgG表面展示。在使用FACS-Canto（BD生物科學公司（BD Biosciences））進行流式細胞術分析之前，用PBS-B洗滌細胞。記錄APC和PE中值螢光強度（MFI）。
FACS 文庫分選。如上所述，將至少10 7個細胞與抗原一起孵育。螢光抗體染色後，使用FACS Aria（BD生物科學公司）使用適當的別藻藍蛋白和藻紅素檢測設置對細胞進行分選。
抗CB1抗體10D10先前是藉由用表現人CB1的HEK293細胞免疫Xenomouse產生的。（參見WO 2014210205）。儘管親和力成熟係用於改善拮抗劑抗體效力的常用策略，但先前對10D10進行親和力成熟的努力未能產生具有足夠產生期望的治療效果（例如，減輕體重）的效力（例如，在基於細胞的cAMP測定中在個位數nM範圍內的效力）而沒有CNS相關的副作用的抗體。缺乏高品質、可溶的複合膜蛋白（例如CB1）製劑被認為是先前失敗的主要原因。CB1奈米盤（ND）和CB1苯乙烯順丁烯二酸脂質顆粒（SMALP）的開發極大地提高了CB1可溶性製劑的品質。（Luna V.等人, European Polymer Journal [歐洲聚合物雜誌] 109 (2018) 483-488）。CB1-ND和-SMALP均為純化試劑，在多次冷凍/解凍循環後保持穩定，並且適合長期儲存。此外，該等試劑可以添加到用戶定義的huCB1濃度的結合實驗中。該等試劑的可用性使得另外的親和力成熟工作成為可能。
對抗體進行深度突變掃描，為親和力成熟庫的設計提供資訊。深度突變掃描需要生成全面的點突變文庫，在不同條件下進行結合選擇，並評估高通量定序選擇後突變頻率的變化。（參見例如，Araya, C. L.和Fowler, D. M., Trends Biotechnol.[生物技術趨勢] 2011年9月; 29(9): 435-442）。與改進的和特異性的huCB1結合相關的突變子集的鑒定使得能夠在無需高解析度抗體-抗原共晶結構的助益下針對親和力成熟進行集中的組合文庫設計。
分別選擇10D10重鏈（HC）和輕鏈（LC）內的五十三和三十七二個位置進行單位點飽和誘變。生成點突變IgG-酵母文庫，其中重鏈和輕鏈CDR以及重鏈（HC）和輕鏈FR3 de-環中的10D10點突變的綜合集被分成四個文庫（重鏈和輕鏈各2個）。使用FACS對每個文庫進行表面表現分類，並分別針對兩種不同嚴格度下的huCB1-ND和針對空-ND來評估非特異性結合。較低嚴格性的huCB1-ND結合門控收集了所有表現出至少10D10樣結合的細胞（占群體的10-20%），而較高嚴格性門控僅收集了靠前的結合者（占群體的1.5-6%）。FACS後，使用Zymoprep II套組（梓墨公司（Zymo Research））從分選的池中收穫質體，並藉由回收的質體的最小PCR擴增產生擴增子。
Illumina MiSeq用於藉由綜合評估分選門控內的突變頻率相比於表現分選的參考池內的起始頻率（freq）的變化，對1710個點突變進行排名。基於NGS分析並使用表現分選池作為參考樣本計算每個突變的結合富集（EF）因子（EF = freq 結合/freq 參考（表現））。然後使用富集因子為CDR和FR3 de環中的每個突變生成序列結合適合度圖。與10D10抗體相比，導致與CB1結合更好、相當和更差的突變分別被稱為有益、中性和有害突變。根據適應度圖，HCDR1和HCDR3內的許多變化係有害的，這表明該等區域似乎已經得到了很好的優化，並且可能具有較少的優化需求和/或潛力。HCDR2和HC_FR3 de環中的許多突變似乎促進了結合的改善。來自包含LCDR1和LCDR2突變的文庫的數據表明該等區域中缺乏有益的突變。總體而言，結合適合度圖表明該等HCDR係更有希望針對親和力成熟進行多樣化以改善結合的區域。
根據經驗，針對親和力成熟進行多樣化的理想位置通常包含有害和有益突變的變化。為了鑒定單個位置上最有希望包含在組合文庫設計中的突變，還評估了針對huCB1-ND結合的每個中性或有益突變與空-ND的結合。最有希望的突變富集huCB1-ND結合，而缺乏空ND結合（相對於10D10親本）。針對huCB1-ND和空-ND表現出正富集因子的突變在文庫設計的考慮中被丟棄。
設計並構建了兩個NGS引導的HC酵母文庫用於親和力成熟。每個文庫都被設計為探索單獨的CDR環區域，並保持組合理論多樣性可藉由常規酵母文庫轉化進行覆蓋管理。下面的表3-4總結了HC文庫的多樣化策略。藉由在文庫基因合成過程中引入多個簡並密碼子，在10D10 HC的離散區域內充分探索所需突變的組合，以構建與10D10親本LC配對的兩個酵母展示IgG HC變體文庫的初始組。選擇特定位置的每個簡並密碼子以最大化編碼的理論多樣性中所需突變的代表性
[表3]. 10D10 H1H3文庫的設計1*
10D10 殘基 位置 多樣化策略
S30 延伸的HCDR1 S、N
R32 延伸的HCDR1 R、K
S42 延伸的HCDR1 S、A、G、T
D109 HCDR3 D、E、N、K
I112 HCDR3 I、T、V、P、Q、A
L113 HCDR3 L、F、V
T114 HCDR3 T、S
Y116 HCDR3 Y、H、N
*理論組合多樣性：6.9E3（與10D10 LC配對）
[表4]. 10D10 H2/de環文庫的設計2*
10D10 殘基 位置 多樣化策略
Y57 HCDR2 Y、H
I58 HCDR2 I、V
Y60 HCDR2 Y、H、Q、終止
S65 HCDR2 S、E、T、A、K、終止
S67 HCDR2 S、Q
N69 HCDR2 N、A、K
S73 HCDR2 S、K、N、R
L74 HCDR2 L、F
K75 HCDR2 K、E
S76 HCDR2 S、G、N、D
D83 de環（HC_FR3） D、K、E、N
D85 de環（HC_FR3） S、Y
*理論組合多樣性：3.0E5（與10D10 LC配對）
設計並構建了一個NGS引導的酵母文庫，用於LC優化，以改善10D10的可製造性。據認為，長HCDR3和LCDR1可能導致早期10D10突變體的表現和聚集傾向較差，並且LC文庫的設計納入了改善該等特性的策略（例如，降低LCDR1中關鍵溶劑暴露的LC殘基的疏水性）。由於LC突變的適應度圖顯示缺乏有益突變，因此LC文庫設計包括對CB1-ND表現出10D10樣結合富集和對空ND表現出缺乏的突變。下面的表5總結了LC優化文庫的多樣化策略。藉由在文庫基因合成過程中引入多個簡並密碼子，在10D10 LC的離散區域內充分探索所需突變的組合，以構建與親本10D10 HC配對的酵母展示IgG LC變體文庫。選擇特定位置的每個簡並密碼子以最大化編碼的理論多樣性中所需突變組的代表性。該文庫用於下述的同源親和力成熟（實例2）。
[表5]. 10D10 LC優化文庫的設計**
10D10 殘基 位置 多樣化策略
H33 LCDR1 H、S、T
N35 LCDR1 N、S*、T*、Y#
Y38 LCDR1 Y、A*、E*、I*、N*、F
L41 LCDR1 L、V
L58 LCDR2 L、Q*
R94 LC FR3 R、S
M107 LCDR3 M、R
L110 LCDR3 L、F、I、R、V、C、G、S
Q111 LCDR3 Q、E、K、R、T、A、G、P
T135 LCDR3 T、I、L、Q、K、P
*與相應的10D10殘基相比，疏水性降低的胺基酸 **理論組合多樣性：5.0E5（與10D10 HC配對）
10D10 LC屬於VK2種系。本領域已知種系例如VK1或VK3的LC賦予更好的生物物理特性和更好的可製造性（參見，例如Ewert S.等人, J. Mol. Biol.[分子生物學雜誌], (2003)325(3):531-53）。在LC優化的第二種策略中，探索了用預計具有更有利的生物物理特性的不同種系（例如VK1或VK3）的LC交換10D10 LC。mAb/抗原複合物的低解析度X射線和CryoEM結構均表明，只有10D10的HC環與CB1受體相互作用。該等結果表明，確實可以將10D10 VK2 LC交換為屬於預計具有優異的生物物理特性的種系（例如VK1或VK3）的另一種LC以提高可製造性。為此，將10D10 HC與多樣化的人LC文庫配對，篩選和分選保留與10D10等效結合的結合物。接下來，從陽性殖株中去除那些具有與上述10D10 LC優化設計相關的LC的殖株。該過程產生的酵母殖株表現出與10D10等效的CB1結合，但包含來自VK1和VK3種系的LC，這證明了LC交換策略的可行性。從LC交換獲得的前6個殖株列於下表6。然後將六個LC擴展為一組22個LC，以修復四個殖株的FR區域內的種系衍生。
[表6].六種新LC可以替代10D10 LC，而不影響CB1結合
名稱 SEQ NO. LCDR1 SEQ NO. LCDR2 SEQ NO. LCDR3 LC 種系
LIBC488095-1 495 RASQSVSSSYLA 496 GASSRAT 497 QQGYSNPRT VK3|A27/JK3
LIBC488333-1 498 RASQSIISYLN 499 AASSLRS 500 QQYSNYPLT VK1|O2/JK4
LIBC488370-1 501 RASQSVSNYLA 502 DASNRAT 503 QQYGSLPRT VK3|L6/JK2
LIBC488554-1 504 RASQSVSSYLG 505 GASSRAT 506 QQYGSSPRT VK3|A27/JK1
LIBC488452-1 507 RASQSVSSYLA 508 DASNRAT 509 QQYGSLPRT VK3|A11/JK2
LIBC488537-1 510 RASQSISNYLN 511 AASSLHS 512 QQYQSYPLT VK1|O2/JK4
10D10 94 RSSQSLLHSNGYNYLD 95 LGSNRAS 96 MQALQTPRT VK2|A19/JK1
實例2. 同源親和力成熟
材料與方法：GFP融合的huCB1-SMALP按照Luna V.等人, European Polymer Journal [歐洲聚合物雜誌] 109 (2018) 483-488中所述製備。
用於結合實驗的酵母細胞的製備以及藉由流式細胞術測量與GFP融合的huCB1-SMALP的結合按照Luna V.等人, European Polymer Journal [歐洲聚合物雜誌] 109 (2018) 483-488中所述進行，除了使用AlexaFluor647-軛合的抗huFab抗體來檢測IgG表面展示。記錄GFP（結合）和AlexaFluor647（顯示）的中值螢光強度（MFI）。
對於奈米盤結合實驗，藉由將APC MFI除以PE MFI來計算每個測試的酵母殖株的結合/展示比率。每個殖株的結合/展示比率進一步針對10D10 LC N35Y對照的結合/展示比率進行歸一化，以計算「相對結合倍數變化」比率，從而能夠比較酵母殖株。藉由將huCB1-ND結合/展示比率除以空-ND結合/展示比率來評估對huCB1-ND相對於空-ND的特異性結合。對於SMALP結合實驗，將扣除背景後每個殖株的GFP MFI針對10D10 LC N35Y對照的GFP MFI進行歸一化，以比較酵母殖株的結合。
將實例1中設計和構建的兩個HC文庫和一個LC優化文庫用於10D10的同源親和力成熟。按照已建立的方法，相對於10D10藉由FACS分別富集兩個HC文庫中的改善的結合物（參見例如Boder, E.T. 和K.D. Wittrup, Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability.[酵母表面顯示用於蛋白質表現、親和力和穩定性的定向進化] Methods Enzymol [酶學方法], 2000. 328: p. 430-44；和Chao, G.,等人, Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display.[利用酵母表面顯示技術分離和工程化人抗體] Nat Protoc[自然實驗手冊], 2006. 1(2):第755-68頁）。LC優化文庫針對表現出10D10樣結合訊息的細胞進行了富集。藉由zymoprep和PCR從酵母池中回收富集後繼續存在的HC和LC突變，並在酵母轉化過程中按設計混合HC和LC的池，以構建一組新的改組HC/LC文庫（mutH1H3/mutLC、mutH2/mutLC和mutH1H2H3/mutLC）。利用連續較低濃度的huCB1-ND對鏈改組文庫進行更嚴格的FACS富集。對來自富集的改組文庫的殖株進行兩輪篩選，以選擇靠前的殖株。在第一輪中，從三個文庫中篩選了大約600個殖株，尋找與huCB1-ND結合優於10D10 LC N35Y對照（LC中帶有N35Y的10D10）的殖株。
在第二輪篩選中，重新測試第一輪中的200個最佳結合殖株與200 pM huCB1-ND、100 nM GFP標記的huCB1-SMALP的更嚴格結合以及針對空ND的非特異性結合。藉由CB1特異性結合對陽性殖株進行排序後，去除具有N連接糖基化和未配對的Cys Tier 1熱點的殖株，並取消具有除DT之外的預測Tier 1.5脫醯胺和異構化位點的殖株的優先順序。此外，具有針對LC FR3共有序列破壞的R94S修復的陽性殖株被優先考慮。具有HC D83K FR3突變（被認為與增強的抗CB1功能相關）的陽性殖株如果滿足結合改善的最低閾值，也將被優先考慮。此外，優先考慮LCDR1和LCDR2中關鍵殘基疏水性降低的殖株。下面的表7和表8總結了前15個同源親和力成熟的10D10變體的序列資訊。圖1A和1B顯示了15種變體的流式細胞術結合譜；變體的結合數據顯示在下表9中。所有靠前的殖株都表現出與huCB1-ND和huCB1-SMALP的結合顯著改善，同時保持與空-ND的最小結合（表9）。此外，在所有靠前的殖株中均觀察到HCDR2內的Y57H以及HC FR3 de環內的D83N和S85Y（圖3A）。前15個結合物均不包含預測的熱點，該等熱點在治療性抗體製造和儲存過程中造成化學修飾的風險最高。
[表7].前15個親和力成熟的同源10D10變體的CDR序列
名稱 Seq No. CDR1 Seq No. CDR2 Seq No. CDR3
LIBC523661-1_HC huCB1 HV 1 RGGDYWS 2 HIYYEGSTKYNPSFKG 3 DYDPVTGHSYYYYGMDV
LIBC523661-1_LC huCB1 LV 4 RSSQSLLTSSGYNYVD 5 QGSNRAS 6 RQARAIPRT
LIBC523797-1_HC huCB1 HV 7 RGGDYWS 8 HVYYTGSTKYNPNFKG 9 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC523797-1_LC huCB1 LV 10 RSSQSLLTSYGINYVD 11 QGSNRAS 12 RQAVGLPRT
LIBC523969-1_HC huCB1 HV 13 RGGDYWS 14 HIYQTGQTKYNPNLKG 15 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC523969-1_LC huCB1 LV 16 RSSQSLLSSTGANYLD 17 QGSNRAS 18 RQAVGLPRT
LIBC523748-1_HC huCB1 HV 19 RGGDYWS 20 HVYYTGSTKYNPSFEG 21 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC523748-1_LC huCB1 LV 22 RSSQSLLHSYGANYLD 23 LGSNRAS 24 RQARALPRT
LIBC523857-1_HC huCB1 HV 25 RGGDYWS 26 HIYQTGQTAYNPRLEG 27 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC523857-1_LC huCB1 LV 28 RSSQSLLSSTGANYLD 29 LGSNRAS 30 RQAVELPRT
LIBC523868-1_HC huCB1 HV 31 RGGDYWS 32 HVYYEGSTAYNPSFED 33 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC523868-1_LC huCB1 LV 34 RSSQSLLTSYGINYVD 35 LGSNRAS 36 MQARQIPRT
LIBC523844-1_HC huCB1 HV 37 RGGDYWS 38 HVYYTGSTKYNPSFKD 39 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC523844-1_LC huCB1 LV 40 RSSQSLLSSSGANYVD 41 QGSNRAS 42 RQARALPRT
LIBC523760-1_HC huCB1 HV 43 RGGDYWS 44 HVYQTGSTKYNPKFKG 45 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC523760-1_LC huCB1 LV 46 RSSQSLLTSSGANYVD 47 LGSNRAS 48 RQAVGTPRT
LIBC523862-1_HC huCB1 HV 49 RGGDYWS 50 HIYQTGSTAYNPSLKG 51 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC523862-1_LC huCB1 LV 52 RSSQSLLHSTGANYVD 53 LGSNRAS 54 RQAIALPRT
LIBC524049-1_HC huCB1 HV 55 RGGDYWS 56 HIYYTGSTAYNPSLKS 57 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC524049-1_LC huCB1 LV 58 RSSQSLLHSYGANYLD 59 LGSNRAS 60 RQARTLPRT
LIBC523813-1 +VK2種系修復_HC huCB1 HV 61 RGGDYWS 62 HVYYTGQTAYNPKFKD 63 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC523813-1 +VK2種系修復_LC huCB1 LV 64 RSSQSLLSSSGANYVD 65 LGSNRAS 66 MQARGIPRT
LIBC523815-1_HC huCB1 HV 67 RGGDYWS 68 HIYQSGQTKYNPSLKD 69 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC523815-1_LC huCB1 LV 70 RSSQSLLTSSGANYVD 71 LGSNRAS 72 RQAREQPRT
LIBC523603-1_HC huCB1 HV 73 RGGDYWA 74 HVYQSGQTAYNPNFEN 75 DYDAVSGYSYYYYGMDV
LIBC523603-1_LC huCB1 LV 76 RSSQSLLSSYGNNYVD 77 QGSNRAS 78 RQAVGLPRT
LIBC523596-1_ HV 79 RGGDYWS 80 HVYQSGQTAYNPNFED 81 EYDVVSGYSYYYYGMDV
LIBC523596-1_ LV 82 RSSQSLLTSSGYNYVD 83 QGSNRAS 84 MQAVKIPRT
LIBC523670-1 +VK2種系修復_ HV 85 RGGDYWA 86 HVYQTGQTAYNPNLES 87 NYDVLSGYSYYYYGMDV
LIBC523670-1 +VK2種系修復_ LV 88 RSSQSLLTSYGANYLD 89 QGSNRAS 90 MQALQIPRT
10D10 HV 91 RGGDYWS 92 YIYYSGSTNYNPSLKS 93 DYDILTGYSYYYYGMDV
10D10 LV 94 RSSQSLLHSNGYNYLD 95 LGSNRAS 96 MQALQTPRT
[表8].前15個同源親和力成熟的10D10變體的可變區序列
名稱 Seq No. LC LV Seq No. HC HV
LIBC523661-1 97 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLTSSGYNYVDWYLQKPGQSPQLLIYQGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQARAIPRTFGQGTKVEIKR 98 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYEGSTKYNPSFKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDPVTGHSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523797-1 99 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLTSYGINYVDWYLQKPGQSPQLLIYQGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQAVGLPRTFGQGTKVEIKR 100 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGSTKYNPNFKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523969-1 101 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLSSTGANYLDWYLQKPGQSPQLLIYQGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQAVGLPRTFGQGTKVEIKR 102 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGQTKYNPNLKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523748-1 103 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSYGANYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQARALPRTFGQGTKVEIKR 104 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGSTKYNPSFEGRATISVKTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523857-1 105 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLSSTGANYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQAVELPRTFGQGTKVEIKR 106 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGQTAYNPRLEGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523868-1 107 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLTSYGINYVDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQIPRTFGQGTKVEIKR 108 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYEGSTAYNPSFEDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523844-1 109 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLSSSGANYVDWYLQKPGQSPQLLIYQGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQARALPRTFGQGTKVEIKR 110 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGSTKYNPSFKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523760-1 111 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLTSSGANYVDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQAVGTPRTFGQGTKVEIKR 112 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYQTGSTKYNPKFKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523862-1 113 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSTGANYVDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQAIALPRTFGQGTKVEIKR 114 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGSTAYNPSLKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC524049-1 115 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSYGANYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQARTLPRTFGQGTKVEIKR 116 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYTGSTAYNPSLKSRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523813-1 +VK2種系修復 117 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLSSSGANYVDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARGIPRTFGQGTKVEIKR 118 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGQTAYNPKFKDRATISVKTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523815-1 119 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLTSSGANYVDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQAREQPRTFGQGTKVEIKR 120 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYQSGQTKYNPSLKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523603-1 121 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLSSYGNNYVDWYLQKPGQSPQLLIYQGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQAVGLPRTFGQGTKVEIKR 122 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHVYQSGQTAYNPNFENRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDAVSGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523596-1 123 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLTSSGYNYVDWYLQKPGQSPQLLIYQGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQAVKIPRTFGQGTKVEIKR 124 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYQSGQTAYNPNFEDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREYDVVSGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC523670-1 +VK2種系修復 125 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLTSYGANYLDWYLQKPGQSPQLLIYQGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQIPRTFGQGTKVEIKR 126 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHVYQTGQTAYNPNLESRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDVLSGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
10D10 127 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKR 128 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRATISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
[表9].前15個親和力成熟的同源10D10變體：結合資訊
名稱 0.2 nM-huCB1-ND（相對於10D10N35Y） 100 nM-huCB1-SMALP結合（針對10D10歸一化） 特異性huCB1結合（CB1 ND/空ND比率） 名稱 0.2 nM-huCB1-ND（相對於10D10N35Y） 100 nM-huCB1-SMALP結合（針對10D10歸一化） 特異性huCB1結合（CB1 ND/空ND比率）
10D10 0.83 1.00 1.32 LIBC523760-1 4.19 5.70 7.21
N35Y基準 1.00 0.95 1.35 LIBC523862-1 5.07 3.97 13.55
LIBC523661-1 4.03 8.00 9.32 LIBC524049-1 5.01 5.51 9.50
LIBC523797-1 8.49 7.01 24.45 LIBC523813-1 3.38 6.32 5.79
LIBC523969-1 4.53 5.69 12.81 LIBC523815-1 6.15 4.55 14.78
LIBC523748-1 4.41 6.12 5.33 LIBC523603-1 6.05 4.05 19.35
LIBC523857-1 4.05 4.71 13.91 LIBC523596-1 4.92 4.19 20.63
LIBC523868-1 6.28 4.21 13.26 LIBC523670-1 7.46 5.42 23.04
LIBC523844-1 3.78 6.69 8.58            
實例3.輕鏈交換親和力成熟
在親和力成熟的平行組中，用從酵母細胞中提取的10D10突變體HC基因或基因片段轉化實例1中獲得的22個VK1和VK3 LC，該等酵母細胞在H1H3和H2/de-環文庫的FACS富集後獲得展示改進的結合變體（實例2）。使用更嚴格的FACS富集，對用於親和力成熟的三個LC交換文庫（mutH1H3/VK LC、mutH2/VK LC和mutH1H2H3/VK LC）進行了富集，以獲得最改進的結合物。從LC交換文庫分離的殖株進行兩輪篩選，以選擇靠前的殖株。LC交換的10D10親和力成熟變體的篩選和選擇標準與實例2中描述的同源親和力成熟的篩選和選擇標準相同，除了不使用LCDR1和LCDR2中疏水性降低的序列的優先順序。共有600個陽性殖株進入第一輪篩選，200個陽性殖株進入第二輪篩選。然後對200個陽性殖株進行CB1特異性結合排名，以獲得最終15個靠前的LC交換結合物。前15個經LC交換親和力成熟的10D10變體的CDR和可變區序列顯示在下面的表10和11中。下面的表12總結了前15個經LC交換親和力成熟的10D10變體的結合數據。圖2A和2B顯示了該等變體的流式細胞術結合譜。與同源親和力成熟變體類似，與10D10 LC N35Y相比，所有LC交換的靠前殖株表現出與huCB1-ND和huCB1-SMALP顯著改善的結合，同時保持與空-ND的最小結合（表12）。此外，在前15個LC交換10D10親和力成熟變體中觀察到HCDR2內的Y57H以及HC FR3 de環內的D83N和S85Y突變（圖4A）。此外，VK1 LC在靠前的LC交換10D10變體中占很大比例，只有一個變體具有VK3 LC（表13）。如果原始序列中不存在R94S種系回復，則會在靠前的變體的所有VK LC序列中施加R94S種系回復。
[表10].前15個親和力成熟的LC交換10D10變體的CDR序列
名稱 Seq No. CDR1 Seq No. CDR2 Seq No. CDR3
LIBC527997-1_HC huCB1 HV 129 RGGDYWA 130 HIYQTGSTNYNPRFKG 131 NYDTLTGYSYYYYGMDV
LIBC527997-1_LC huCB1 LV 132 RASQSISNYLN 133 AASSLHS 134 QQYQSYPLT
LIBC528116-1 +一或多個VK1種系修復_HC huCB1 HV 135 RGGDYWA 136 HVYYTGSTNYNPRFKD 137 NYDTVTGYSYYYYGMDV
LIBC528116-1 +一或多個VK1種系修復_LC huCB1 LV 138 RASQSISNYLN 139 AASSLHS 140 QQYQSYPLT
LIBC528169-1 +一或多個VK1種系修復_HC huCB1 HV 141 RGGDYWS 142 HIYQSGSTKYNPSFED 143 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC528169-1 +一或多個VK1種系修復_LC huCB1 LV 144 RASQSISNYLN 145 AASSLHS 146 QQYQSYPLT
LIBC527879-1_HC huCB1 HV 147 RGGDYWG 148 HIYQSGSTNYNPKLKS 149 DYDIFTGYSYYYYGMDV
LIBC527879-1_LC huCB1 LV 150 RASQSIISYLN 151 AASSLRS 152 QQYSNYPLT
LIBC528141-1_HC huCB1 HV 153 RGGDYWS 154 HVYQTGSTKYNPRFKG 155 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC528141-1_LC huCB1 LV 156 RASQSISNYLN 157 AASSLHS 158 QQYQSYPLT
LIBC527814-1_HC huCB1 HV 159 RGGDYWG 160 HVYQTGSTKYNPSFKD 161 NYDTLTGYSYYYYGMDV
LIBC527814-1_LC huCB1 LV 162 RASQSISNYLN 163 AASSLHS 164 QQYQSYPLT
LIBC528131-1_HC huCB1 HV 165 RGGDYWS 166 HIYQTGQTAYNPNLEG 167 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC528131-1_LC huCB1 LV 168 RASQSVSSYLG 169 GASSRAT 170 QQYGSSPRT
LIBC527984-1 +一或多個VK1種系修復_HC huCB1 HV 171 RGGDYWS 172 HIYQTGKTNYNPNFKS 173 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC527984-1 +一或多個VK1種系修復_LC huCB1 LV 174 RASQSISNYLN 175 AASSLHS 176 QQYQSYPLT
LIBC527906-1 +一或多個VK1種系修復_HC huCB1 HV 177 RGGDYWG 178 HIYQTGSTNYNPNFKD 179 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC527906-1 +一或多個VK1種系修復_LC huCB1 LV 180 RASQSISNYLN 181 AASSLHS 182 QQYQSYPLT
LIBC527912-1_HC huCB1 HV 183 RGGDYWS 184 YIYQTGQTKYNPNFEG 185 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC527912-1_LC huCB1 LV 186 RASQSISSYLN 187 AASSLRS 188 QQYSNYPLT
LIBC528148-1 +一或多個VK1種系修復_HC huCB1 HV 189 RGGDYWS 190 HIYQSGQTKYNPKLKG 191 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC528148-1 +一或多個VK1種系修復_LC huCB1 LV 192 RASQSISNYLN 193 AASSLHS 194 QQYQSYPLT
LIBC527968-1 +一或多個VK1種系修復_HC huCB1 HV 195 RGGDYWS 196 HIYQSGSTKYNPSFKD 197 DYDILTGYSYYYYGMDV
LIBC527968-1 +一或多個VK1種系修復_LC huCB1 LV 198 RASQSISNYLN 199 AASSLHS 200 QQYQSYPLT
LIBC527869-1 +一或多個VK1種系修復_HC huCB1 HV 201 RGGDYWA 202 HIYHTGKTNYNPSFKG 203 NYDTLSGNSYYYYGMDV
LIBC527869-1 +一或多個VK1種系修復_LC huCB1 LV 204 RASQSISNYLN 205 AASSLHS 206 QQYQSYPLT
LIBC527919-1_HC huCB1 HV 207 RGGDYWA 208 HVYQTGSTAYNPNFKD 209 NYDALSGYSYYYYGMDV
LIBC527919-1_LC huCB1 LV 210 RASQSIISYLN 211 AASSLRS 212 QQYSNYPLT
LIBC527827-1 +一或多個VK1種系修復_HC huCB1 HV 213 RGGDYWG 214 HVYQSGQTAYNPKFEN 215 NYDTLTGHSYYYYGMDV
LIBC527827-1 +一或多個VK1種系修復_LC huCB1 LV 216 RASQSISNYLN 217 AASSLHS 218 QQYQSYPLT
10D10 HV 91 RGGDYWS 92 YIYYSGSTNYNPSLKS 93 DYDILTGYSYYYYGMDV
10D10 LV 94 RSSQSLLHSNGYNYLD 95 LGSNRAS 96 MQALQTPRT
10D10N35Y HV 219 RGGDYWS 220 YIYYSGSTNYNPSLKS 221 DYDILTGYSYYYYGMDV
20D10N35Y LV 222 RSSQSLLHSYGYNYLD 223 LGSNRAS 224 MQALQTPRT
[表11]前15個LC交換10D10變體的可變區序列
名稱 Seq No. LC LV Seq No. HC HV
LIBC527997-1 225 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 226 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGSTNYNPRFKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTLTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC528116-1 +一或多個VK1種系修復 227 DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 228 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGSTNYNPRFKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTVTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC528169-1 +一或多個VK1種系修復 229 DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 230 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYQSGSTKYNPSFEDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC527879-1 231 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIISYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSNYPLTFGGGTRVEIKR 232 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWGWIRQHPGKGLEWIGHIYQSGSTNYNPKLKSRATISVDTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDIFTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC528141-1 233 DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 234 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYQTGSTKYNPRFKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC527814-1 235 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 236 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWGWIRQHPGKGLEWIGHVYQTGSTKYNPSFKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTLTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC528131-1 237 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLGWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIKR 238 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGQTAYNPNLEGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC527984-1 +一或多個VK1種系修復 239 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 240 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGKTNYNPNFKSRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC527906-1 +一或多個VK1種系修復 241 DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 242 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWGWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGSTNYNPNFKDRATISVDTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC527912-1 243 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSNYPLTFGGGTRVEIKR 244 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYQTGQTKYNPNFEGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC528148-1 +一或多個VK1種系修復 245 DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 246 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYQSGQTKYNPKLKGRATISVDTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC527968-1 +一或多個VK1種系修復 247 DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 248 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYQSGSTKYNPSFKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC527869-1 +一或多個VK1種系修復 249 DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 250 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGNIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHIYHTGKTNYNPSFKGRATISVKTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTLSGNSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC527919-1 251 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIISYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSNYPLTFGGGTRVEIKR 252 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHVYQTGSTAYNPNFKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDALSGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC527827-1 +一或多個VK1種系修復 253 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQYQSYPLTFGQGTKVEIKR 254 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWGWIRQHPGKGLEWIGHVYQSGQTAYNPKFENRATISVKTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTLTGHSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
10D10 127 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKR 128 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRATISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
10D10 N35Y 255 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSYGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKR 256 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRATISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
[表12].前15個LC交換10D10變體：結合資訊
名稱 100 nM-huCB1-GFP-SMALP結合（針對10D10N35Y歸一化） 0.200 nM-huCB1-奈米盤（相對於10D10N35Y） 50.0 nM-空奈米盤（相對於10D10N35Y）
10D10 1.00 0.68 0.81
10D10 N35Y 1.00 1.00 1.00
LIBC527906-1 3.79 8.02 0.51
LIBC527814-1 6.44 6.49 0.61
LIBC527997-1 6.63 6.38 0.44
LIBC528141-1 8.31 6.20 0.49
LIBC527912-1 4.32 5.95 0.51
LIBC528116-1 5.80 5.91 0.77
LIBC527879-1 3.24 5.75 0.73
LIBC527919-1 4.15 5.22 0.64
LIBC527984-1 4.85 5.21 0.61
LIBC527968-1 4.65 4.86 0.64
LIBC528169-1 4.58 4.82 0.68
LIBC528131-1 3.68 4.47 0.63
LIBC527827-1 4.99 4.31 1.16
LIBC527869-1 3.61 4.15 0.97
LIBC528148-1 3.38 5.80 0.27
[表13].前15個LC交換10D10變體種系資訊
名稱 VH 種系 VL 種系
10D10 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK2|A19/JK1
10D10 N35Y VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK2|A19/JK1
LIBC527906-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
LIBC527814-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
LIBC527997-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
LIBC528141-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
LIBC527912-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
LIBC528116-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
LIBC527879-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
LIBC527919-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
LIBC527984-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
LIBC527968-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
LIBC528169-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
LIBC528131-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK3|A27/JK1
LIBC527827-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
LIBC527869-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
LIBC528148-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK1
實例4 親和力成熟抗體的交叉反應性和特異性
10D10抗體不結合小鼠CB1（muCB1）或人CB2（huCB2）蛋白（WO 2014/210205）。因為實例2和3中分離的所有抗體均為10D10的變體，所以預期它們不會結合huCB1或muCB1。針對muCB1和huCB2的示例性抗體的結合活性證實了針對這兩種蛋白質不存在交叉反應性（表14）。
[表14].針對muCB1和huCB2沒有交叉反應
名稱 相對於模擬的倍數
   huCB2 muCB1
LIBC527814-1 0.9 1.2
LIBC527919-1 0.9 1.0
LIBC527997-1 0.8 1.0
LIBC528116-1 0.9 0.8
LIBC523661-1 0.8 0.7
LIBC523797-1 0.9 0.8
LIBC524049-1 1.0 0.8
10D10 HC D83K/LC N35Y（26970-1） 0.7 0.7
10D10 0.9 0.9
陽性對照 16.5 7.9
陰性對照 1.1 1.1
實例5 親和力成熟變體的表徵
從上述實例2和3中分離出的靠前的殖株被選殖並表現為IgG1 SEFL2 mAb，然後在cAMP功能測定中進行測試以測量拮抗劑活性或反向促效劑活性。
拮抗劑和反向促效劑活性
拮抗劑活性 。穩定轉染的CB1 CHO細胞在37°C/5%CO 2下並使用含有0.5% FBS、25 mM HEPES的DMEM（西格瑪公司（Sigma）Cat# D5671）進行血清饑餓過夜。測定當天，使用含有0.1% BSA（來自PE套組）、25 mM HEPES的DMEM（西格瑪公司Cat# D5671）以4倍於最終濃度以1 : 4滴定CB1抗體和利莫那班，將滴定的抗體以體積7.5 µL/孔轉移至384孔測定板。使用Accutase（西格瑪公司）收穫細胞並用含有0.5% FBS、25 mM HEPES的DMEM（西格瑪公司Cat# D5671）中和。使用含有0.1% BSA（來自PE套組）、25 mM HEPES的DMEM（西格瑪公司Cat# D5671）將該等細胞沈澱並重懸浮至1.33 x 10 6個細胞/mL。將來自Lance Ultra cAMP檢測套組（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer）；TRF0263）的抗cAMP抗體以抗體比細胞體積1比150的比例添加到細胞中，還將3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX；西格瑪公司）以1 mM的最終濃度加入到細胞中。將細胞以每孔15 µL或每孔20 000個細胞的體積轉移至測定板。使用含有0.1% BSA（來自PE套組）、25 mM HEPES的DMEM（西格瑪公司Cat# D5671）將毛喉素和CP55,940混合物稀釋至4倍於最終濃度，並以每孔7.5 µL的體積轉移至測定板。將測定板在37°C/5% CO 2下孵育½小時，然後將EU-cAMP示蹤劑（珀金埃爾默公司；TRF0263）添加到每個孔中，並在室溫避光下進一步孵育1小時。最終孵育後，使用帶有EU615和APC 665發射過濾器的Envision讀板器讀取測定板。使用以下計算分析數據：TR-FRET（665 nm/615 nm）x 10 000。較低的值（較低的FRET）被解釋為對CB1的更強的抑制並且該數據用於計算IC50 。從實例2和3獲得的殖株的拮抗活性示於表15A（n = 1和n = 2）和表15B（n = 3）中。
[表15A].同源和LC交換親和力成熟變體的IC50值
殖株 源 n = 1 IC50（nM） n = 1 IC50，與Rimo相比的倍數（＜ 1係所需的） n = 2 IC50（nM） n = 2 IC50，與Rimo相比的倍數（＜ 1係所需的） 平均IC50（nM） 平均IC50，與Rimo相比的倍數（＜ 1係所需的）
LIBC528116-1 LC交換 3.93 0.93 0.88 0.49 2.40 0.80
LIBC527814-1 LC交換 4.72 1.12 1.22 0.68 2.97 0.99
LIBC527984-1 LC交換 7.24 1.72 1.27 0.71 4.25 1.42
LIBC527997-1 LC交換 4.37 1.04 1.57 0.88 2.97 0.99
LIBC527879-1 LC交換 6.12 1.45 1.78 0.99 3.95 1.32
LIBC527919-1 LC交換 5.09 1.21 1.80 1.00 3.44 1.15
LIBC528131-1 LC交換 6.63 1.57 1.83 1.02 4.23 1.41
LIBC528141-1 LC交換 6.26 1.49 1.84 1.03 4.05 1.35
LIBC527968-1 LC交換 6.10 1.45 1.95 1.09 4.03 1.34
LIBC527912-1 LC交換 5.91 1.40 1.99 1.11 3.95 1.32
LIBC527906-1 LC交換 7.66 1.82 2.64 1.48 5.15 1.72
LIBC528148-1 LC交換 9.10 2.16 2.80 1.56 5.95 1.98
LIBC528169-1 LC交換 12.30 2.92 3.31 1.85 7.81 2.60
LIBC527827-1 LC交換 32.03 7.60 15.29 8.54 23.66 7.89
LIBC527869-1 LC交換 57.82 13.73 36.16 20.20 46.99 15.66
LIBC524049-1 同源 4.41 1.05 1.34 0.75 2.87 0.96
LIBC523797-1 同源 4.70 1.12 1.44 0.80 3.07 1.02
LIBC523661-1 同源 5.24 1.24 1.35 0.75 3.30 1.10
LIBC523844-1 同源 6.20 1.47 1.46 0.82 3.83 1.28
LIBC523969-1 同源 6.45 1.53 1.26 0.70 3.86 1.29
LIBC523760-1 同源 6.12 1.45 2.44 1.36 4.28 1.43
LIBC523603-1 同源 7.29 1.73 2.16 1.20 4.72 1.57
LIBC523813-1 同源 8.96 2.13 2.94 1.64 5.95 1.98
LIBC523670-1 同源 8.72 2.07 3.52 1.97 6.12 2.04
LIBC523748-1 同源 9.57 2.27 4.43 2.48 7.00 2.33
LIBC523862-1 同源 11.20 2.66 3.42 1.91 7.31 2.44
LIBC523868-1 同源 11.86 2.81 3.32 1.86 7.59 2.53
LIBC523857-1 同源 13.40 3.18 2.48 1.39 7.94 2.65
LIBC523596-1 同源 13.98 3.32 4.00 2.23 8.99 3.00
10D10 HC D83K/LC N35Y（26970-1） 對照（之前的基準） 10.86 2.58 9.81 5.48 10.33 3.44
10D10 對照 118.11 28.04 43.44 24.27 80.77 26.92
利莫那班 對照 4.21 1.00 1.79 1.00 3.00 1.00
[表15B].示例性10D10變體的IC50值
名稱 平均IC50（nM，n = 3）
LIBC528116-1 1.77
LIBC527814-1 2.07
LIBC527997-1 2.54
LIBC527919-1 3.01
LIBC523797-1 3.42
LIBC524049-1 3.71
LIBC523661-1 3.88
10D10 HC D83K/LC N35Y（26970-1） 14.07
10D10 120.28
利莫那班 2.83
另外，在內源huCB1配體花生四烯酸乙醇胺和2-花生四烯醯甘油（2-AG）存在下測量示例性10D10變體和基準抗CB1抗體的拮抗劑活性。具體而言，將CHOK1人CB1受體細胞在96孔白色平底板（科斯塔公司（Costar），目錄號3917）以每孔20,000個細胞的密度在含有0.5% FBS、P/S麩醯胺酸、25 mM HEPES、NEAA、丙酮酸鈉和400 μg/ml G418（英傑公司（Invitrogen））的DMEM中接種過夜並置於保持在37°C、5% CO2的濕潤培養箱中。細胞依次用抗體的響應劑量處理，然後用濃度為100 nM WIN 55,212、10 μM大麻素或500 nM 2-AG（西格瑪個公司）的CB1受體配體處理，最後用在含有0.1% BSA的DMEM的測定緩衝液中的35 μM毛喉素（西格瑪個公司）處理。孵育30分鐘後，添加d2-cAMP和Eu3+-穴狀化合物-cAMP抗體（浠思公司（Cisbio），目錄#62AM4PEC），然後在室溫孵育1小時。使用EnVisionn多標記讀取儀上測量665 nm和620 nm下的波長，並且計算665/620。藉由針對cAMP水平的兩個重複的平均值（665/620比率），在x軸上繪製CB1抗體的濃度曲線，以產生圖。然後使用GraphPad Prism 7.04中的對數（促效劑）相比於響應、可變斜率（4個參數）對數據點進行擬合，以獲得IC50值。結果示於表15C和15D以及圖5A中。
反向促效劑活性。還測量了示例性10D10變體的反向促效劑活性。將CHOK1人CB1受體細胞在96孔白色平底板以每孔20,000個細胞的密度在含有0.5% FBS、P/S麩醯胺酸、25 mM HEPES、NEAA、丙酮酸鈉和400 ug/ml G418（英傑公司）的DMEM中接種過夜並置於保持在37°C、5% CO2的濕潤培養箱中。細胞依次用抗體的響應劑量處理，然後用在含0.1% BSA的DMEM測定緩衝液中的2 μM毛喉素處理。孵育30分鐘後，添加d2-cAMP和Eu3+-穴狀化合物-cAMP抗體，然後在室溫孵育1小時。使用EnVisionn多標記讀取儀上測量665 nm和620 nm下的波長，並且計算665/620。藉由針對cAMP水平的兩個重複的平均值（665/620比率），在x軸上繪製CB1抗體的濃度曲線，以產生圖。然後使用GraphPad Prism 7.04中的對數（促效劑）相比於響應、可變斜率（4個參數）對數據點進行擬合，以獲得IC50值。結果示於表15C和圖5B中。
[表15C].拮抗劑和反向促效劑測定中示例性變體的IC50值
名稱 拮抗劑測定IC50（nM） 反向促效劑測定IC50（nM）
CP 55,940 2-AG 大麻素 -
利莫那班 2.8 2.6 62.5 44.2
10D10 120.3 177.8 6044.0 294.9
LIBC528116-1 1.8 7.2 17.0 31.7
LIBC523797-1 3.4 2.9 10.4 14.1
[表15D].示例性變體和基準抗體拮抗劑測定的IC50
名稱 IC50（nM）
LIBC527814-1 3.8
LIBC528116-1 3.4
10D10 143.8
基準mAb* 95.8
*臨床基準mAb
使用體外cAMP測定法分析親和力成熟抗體（同源和LC交換親和力成熟抗體）的效力，結果總結於表15A-15D以及圖5A和5B中。來自親和力成熟的大多數變體比26970-1更有效，26970-1係在之前的工作中獲得的10D10變體，並用作測定中的基準（表15A和15B）。26970-1包含HC D83K/LC N35Y取代，並且係最可用的基準抗體。在多次運行的功能測定中，一些親和力成熟變體表現出與利莫那班相似或稍更好的效力。最有效的抗體分別比10D10和26970-1有效約30-66x和3.6-8x（表15A）。LIBC528116-1抗體始終是CP 55,940測定中最好的拮抗劑（表15A-15C），而LIBC523797-1抗體在內源CB1受體促效劑2-AG和大麻素存在的情況下的測定運行中係最有效的（表15C）。此外，LIBC523797-1抗體係最優異的反向促效劑（表15C），其效力在2-AG測定中與利莫那班相當，並且在大麻素和反向促效劑測定中效力高3-4x（表15C）。最後，當抗體並行測試時，最有效的10D10變體顯示比臨床上基準抗CB1抗體的效力強約30x（表15D）。效力結果表明，親和力成熟工作實現了獲得效力在個位數nM範圍內的抗體的崇高設計目標，這一目標多年來一直難以實現。
結合親和力
使用 Octet 進行親和力測定。Octet® HTX（賽多利斯公司（Sartorius），德國）儀器用於測定抗CB1抗體的親和力。實驗之前，將鏈黴親和素（SA）生物感測器（佛特比奧公司（ForteBio），#18-5021）在含有10 mM Tris（飛世爾公司（Fisher），#BP152-1）、150 mM NaCl（飛世爾公司，#S271-10）、1 mM CaCl2（飛世爾公司，#BP510-500）、0.1 mg/mL BSA（生物店公司（BioShop），#ALB001.1）和0.1% Triton-X 100（卡爾生物化學公司（Calbiochem），#9410-OP）的Octet測定緩衝液（pH7.4）中預水合10分鐘。SA生物感測器加載生物素化抗人Fc抗體（英傑公司，#A18827），然後在Octet測定緩衝液中的一個60秒的基線步驟。抗CB1抗體在Octet測定緩衝液中製備，並被抗人Fc抗體捕獲，然後浸入含有不同濃度CB1-奈米盤（#CB1-008，內部）的孔中5分鐘，然後解離10分鐘。CB1-奈米盤以1比2從400 nM滴定至6.25 nM，並在Octet測定緩衝液中製備。SA生物感測器使用一次無需再生。對於數據評估，使用佛特比奧公司數據分析v11.0軟體。使用1 : 1 Langmuir模型確定動力學速率常數、結合速率常數（ka, M-1s-1）、解離速率常數（kd, s-1）和平衡速率常數（KD，M）。
使用 KinExA 進行細胞排序KinExA® 3200（Sapidyne公司，博伊西（Boise），愛達荷州（Idaho））儀器用於對抗CB1抗體與在HEK 293T細胞上瞬時表現的全長CB1（DNA391968-1，內部）的結合進行排序。在細胞排序實驗之前，確定了基準抗CB1抗體LIBC523661的細胞親和力。轉染一天後使用HEK 293T CB1細胞進行親和力實驗，並以1比3從250萬個細胞/mL滴定至約51個細胞/mL。HEK 293T CB1細胞在含有FreeStyle 293T培養基（吉布科公司（Gibco），#12338-018）、2%超低IgG FBS（英傑公司，#16250-078）、50 µg/mL G418（西格瑪公司，#G8168）和0.05% w/v/疊氮化鈉（西格瑪公司，#S2002）的細胞培養基中用最終抗體濃度（結合組濃度係抗體濃度的兩倍）5 pM、100 pM或1 nM的LIBC523661在室溫平衡24小時。藉由離心分離細胞，收集平衡上清液中的游離抗體，並藉由KinExA®技術進行測量，方法係將上清液藉由預先塗有山羊抗人Fc（英傑公司，#31125）的PMMA珠（Sapidyne公司）並用山羊抗人IgG（H+L）AlexFluor649（傑克遜免疫研究公司（Jackson Immunoresearch），#109-605-088）檢測。KD係使用KinExA® Pro軟體版本4.2.12中提供的單位點同質結合模型從曲線的非線性回歸獲得的。LIBC523661的KD確定為64.0 pM，95% CI 46.6 - 88.2 pM，每個細胞的受體數量等於110萬拷貝/細胞。使用KD對照曲線確定，LIBC523661需要約12,000個細胞/mL才能達到50% KD。因此，使用20 pM的每種抗體和12,000個細胞/mL進行抗CB1抗體的細胞排序。在不含細胞或含有HEK 293T CB1細胞的293培養基中製備抗CB1抗體，並在室溫孵育24小時。與親和力實驗類似，藉由離心分離細胞，收集上清液中的游離抗體並藉由KinExA®技術進行測量。每種抗CB1抗體的結合以抑制游離級分百分比（%IFF）的形式報告，計算方法為存在12,000個細胞/mL時獲得的抗體訊息減去空白的訊息除以不存在細胞時獲得的抗體訊息減去空白的訊息（%IFF越低，親和力越高，%IFF越高，親和力越低）。藉由將LIBC523661的%IFF除以抗體的%IFF，將所有抗CB1抗體的相對結合與LIBC523661進行比較。
親和力成熟10D10變體的Octet和Kinexa結合測定證實效力增強伴隨著與huCB1的結合親和力的改善（表16）。Octet揭示，較快的結合速率和較慢的解離速率使huCB1-ND結合親和力比10D10高10-50x，而Kinexa驗證了對細胞上表現的wt huCB1的結合改進。
[表16].示例性變體的Octet和Kinexa
   Octet（奈米盤） KinExA*（對細胞）   
名稱 k on，M -1s -1 k off，s -1 KD，nM 相對結合* IC50，nM（CP促效劑）
基準# 9.46E+03 1.25E-02 1326 0.5 95
10D10 1.64E+3 1.25E-02 755 0.5 121
26970-1 7.33E+04 5.53E-03 76 0.5 14
LIBC527814 5.66E+04 1.98E-03 35 1.9 2.1
LIBC528116 4.31E+04 1.23E-03 29 2.0 1.8
LIBC523797 5.15E+04 9.43E-04 18 2.1 3.4
LIBC523661 3.57E+04 2.75E-03 77 1.0 3.9
LIBC524049 5.90E+04 9.04E-04 15 1.5 3.7
LIBC527997 5.18E+04 1.36E-03 26 2.1 2.5
LIBC527919 5.62E+04 3.39E-03 60 2.9 3.0
*根據游離mAb相比於LIBC523661 mAb的分數計算 #臨床基準mAb
實例6.親和力成熟變體的改善的表現
測試同源和LC交換親和力成熟變體在HEK293和CHO細胞中的瞬時和穩定表現。五種最有效的同源10D10變體中有四種以100-200 mg/L在HEK 293-6E細胞中瞬時表現（表17），代表比10D10或基準變體高＞ 3x或＞ 7x的滴度。對LC序列的檢查表明，關鍵位置（尤其是L58Q）疏水性的降低可能與表現滴度的改善有關（表17）。最有效的LC交換10D10 HC變體以15-80 mg/L瞬時表現，並且在CHO-K1的穩定生產運行中以＞ 670 mg/L良好表現。
[表17].示例性同源親和力成熟變體的改善的表現
名稱 收穫量（mg/L）
10D10 34.6
10D10 HC D83K/LC N35Y 14.4
LIBC524049-1 26.2
LIBC523797-1 91.7
LIBC523661-1 177.1
LIBC523844-1 100.9
LIBC523969-1 121.9
實例7.親和力成熟抗體在動物模型中的影響
SEFL2形式的LIBC528116-1（37940-4）抗體（參見Jacobsen F. W.等人, J Biol Chem.[生物化學雜誌] 2017年2月3日；292(5): 1865-1875）擴大規模，用於在飲食誘導肥胖（DIO）轉基因小鼠中進行測試，該等小鼠中使用CRISPR-Cas9技術敲入huCB1供體DNA以介導小鼠 Cnr1編碼序列被人 CNR1對應物取代。具體來說，用高脂肪飲食（HFD，研究飲食D12492 60% kcal來自脂肪）餵養6至10週大的huCB1敲入（KI）小鼠13週以誘導肥胖症。將LIBC528116-1抗體和huIgG1對照抗體以每週30 mg/kg（QW）的劑量投與給小鼠，持續60天（n = 7隻小鼠/組），每3-4天測量體重和食物攝入。在治療第58天藉由MRI測量總脂肪質量，並分析動物的三酸甘油酯和胰島素水平，結果顯示在表18和圖6A-6C中。在第60天，與huIgG1對照相比，親和力成熟10D10變體使體重降低了15.9%，並且脂肪質量降低了22%，肝臟重量降低了47%，肝臟三酸甘油酯降低了64%，血漿胰島素降低了77%（表18，圖6A和6C）。相比之下，用10D10（26970-2）的D83K/N35Y變體進行的早期研究與同種型對照相比，對體重增加沒有影響。該等結果表明本文所述之有效周圍作用的抗CB1抗體係抗肥胖症、高胰島素血症和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的有效治療。
[表18].親和力成熟抗體對huCB1 KI小鼠體重、脂肪質量和肝臟重量的影響
名稱 IC50（nM） 小鼠模型 BW %變化 BW %變化 第45天 BW %變化 第60天 脂肪質量 %變化 肝臟重量 %變化（天）
利莫那班 3 mg/kg（6.5 μmol/kg，QD） 2.3    JAX WT DIO （12週HFD） -12.9%（第17天） N/A N/A -23% （第15天） -7%（第17天）
26970-2 mAb 30 mg/kg（0.2 μmol/kg，QW） 9.5 huCNR1 TG （12週HFD） -1.9%（第31-32天） N/A N/A -2%（第30天） -19%（第32天）
37940-4 mAb 30 mg/kg（0.2 μmol/kg，QW） 2.7 huCNR1 TG （13週HFD） -12.1%（第31-32天） -15.2% -15.9% -22%（第58天） -47%（第60天）
還測量了動物腎臟中的纖維化和炎症標誌物。具體來說，通過TRIzol提取從小鼠腎組織中提取並分離RNA。將50-100 mg組織和5 mm不銹鋼珠（凱傑（Qiagen），#69989）放入裝有1 mL TRIzol（生命技術公司（life Technologies）的Ambion，#15596018）的微量離心管中。TissueLyser II機器以頻率（1/S）30.0使用3分鐘並重複一次。然後將裂解物孵育5分鐘，然後快速離心。然後將200 μL氯仿（西格瑪-奧爾德里奇公司（Sigma-Aldrich），#372978-100 mL）添加到每個管中並渦旋30秒。然後將管孵育5分鐘，然後在4°C、12,000 g下旋轉管15分鐘。除去頂部水層並放入新的深孔板中並與等份的70% EtOH混合。混合後，將溶液從RNeasy Plus 96套組轉移至RNA板，並按照套組說明進行RNA分離（凱傑公司，#74192）。按照套組說明進行凱傑DNA酶步驟（凱傑公司，#79254）。RNA在不含RNA酶/DNA酶的水中稀釋，並通過NanoDrop 8000確認RNA的濃度。然後將RNA稀釋至50 ng/8.5 uL水，然後在Quantstudio 7 Flex即時PCR系統上運行。按照說明使用具有TaqMan基因引物探針組的TaqMan RNA-to Ct一步套組（應用生物系統公司（Applied Biosystems），#4392938）。CT值用於計算相對RNA表現水平。與對照IgG相比，抗CB1抗體治療降低了腎臟中纖維化和炎症標誌物的表現水平（圖6D）。
實例8.新的異種小鼠抗體實驗活動
小鼠免疫：用不同的免疫原組合對幾個異種小鼠組進行免疫。免疫原係：編碼全長huCB1（其具有用於T細胞激活的E3k表位）的質體DNA。DNA被包被在金顆粒上並皮內遞送；HEK293T細胞瞬時轉染具有E3k表位的全長huCB1。皮下遞送細胞；以及含有經過工程改造以增強穩定性的huCB1蛋白的奈米顆粒（奈米盤）。皮下遞送奈米顆粒。
免疫接種需要幾個月的時間；從動物身上採集血樣並定期測量CB1抗體滴度。因為先前的經驗和已發表的CB1結構表明CB1的大N末端結構域可能與藥物功能無關，因此只有對全長和截短的CB1（即，缺乏1-98個N-末端胺基酸）都顯示出滴度的動物被選擇用於收穫，以改善在篩選過程中發現功能性抗體的機會。藉由FACS對用全長或截短的huCB1或空載體瞬時轉染的CHO-S細胞進行滴度測量。
血漿B細胞篩選：傳統的融合瘤生成依賴於B細胞藉由與骨髓瘤細胞融合的方式永生化。由於融合效率低，如果有價值的B細胞殖株很少，則很難通過此過程回收。為了補充融合瘤的產生，對分泌抗體的血漿B細胞進行了直接篩選。後一種方法側重於記憶B細胞，用於藉由對不同的細胞群進行採樣來增加發現有價值殖株的機會。
用於篩選的B細胞取自處死的動物的脾臟、淋巴結和骨髓。使用商業CD138富集套組（幹細胞技術公司（Stemcell Technologies）17877）根據CD138細胞表面標誌物表現將血漿B細胞與記憶B細胞分離。然後將CD138+細胞與用截短的huCB1轉染的HEK293T細胞和用空載體轉染的HEK293T細胞組合。將三種類型的細胞在B細胞培養基中混合在一起，然後與溫熱的瓊脂糖溶液（西格瑪公司A5030，終濃度1%）混合，放入氟化油（RAN生物技術公司（RAN Biotechnologies）008-含氟界面活性劑-2wtH-50G）中並藉由渦旋乳化。結果係一種油包介質乳液，其中含有微滴，微滴中捕獲有細胞。孵育1小時並冷卻10分鐘後，從油中提取瓊脂糖微凝膠，用PBS中的1% FBS洗滌，並使用經螢光標記的抗人抗體作為二級檢測試劑（Jackson 109-545-098）進行篩選。在螢光顯微鏡下檢查微凝膠，並使用Eppendorf顯微操作器手動挑選那些含有螢光信號的微凝膠。將分離的微凝膠放入裝有裂解緩衝液的單獨PCR管中，並進行RT-PCR反應，以從捕獲在微凝膠中的B細胞中拯救抗體序列，以進行選殖和表現。
B細胞中CB1抗體的分子拯救和定序：使用Agencourt RNA Clean XP磁珠從含有產生CB1抗體的單個B細胞的樣本中純化RNA（總或mRNA）。純化的RNA用作模板轉換PCR中的模板，以藉由反轉錄生成第一股cDNA，然後進行cDNA擴增。使用Agencourt AMPure XP PCR清理套組清理cDNA，並用作擴增抗體重鏈和輕鏈可變區（V）基因的模板。使用cDNA作為模板並使用多重PCR擴增γ重鏈的可變區來獲得全人抗體γ重鏈。將5' γ鏈特異性引物與抗體重鏈的訊息序列退火，而3'引物與γ恒定域的區域退火。使用cDNA為模板並使用多重PCR擴增κ輕鏈的可變區來獲得全人抗體κ輕鏈。5' κ輕鏈特異性引物與抗體輕鏈的訊息序列退火，而3'引物與κ恒定域的區域退火。使用cDNA為模板並使用多重PCR擴增λ輕鏈的可變區來獲得全人抗體λ輕鏈。將5' λ輕鏈特異性引物與輕鏈的訊息序列退火，而3'引物與λ恒定域的區域退火。多重PCR反應中使用的引物也具有突出端，這有助於進行Golden Gate選殖到表現載體中。使用Agencourt AMPure XP PCR淨化套組純化來自多重PCR反應的擴增子。然後使用標準Golden Gate選殖方法將乾淨的PCR擴增子選殖到表現載體中，然後轉化到化學感受態大腸桿菌細菌細胞中。培養來自轉化的細菌菌落，然後直接定序。通過生物資訊學方法，自對應核酸序列推導出胺基酸序列。接著分析衍生的胺基酸序列，以確定抗體的種系序列起源，且鑒別與種系序列的偏差。
融合瘤的產生和篩選：融合瘤係藉由使用標準技術將B細胞與小鼠骨髓瘤細胞永生化而產生的。首先將融合瘤以每孔幾個殖株的密度鋪板，並針對與HEK293T或CHO-S細胞上瞬時表現的全長和截短的CB1的結合來篩選分泌的抗體。對顯示CB1結合的多株孔進行單細胞分選以獲得分泌單獨抗體的殖株。
總共篩選了1325個Xenomouse殖株，其中71個與全長和截短的huCB1結合。71個殖株中的大多數都沒有功能，只有9個殖株符合小鼠實驗活動設定的效力標準。從九個殖株中分離出三個獨特的抗體。抗體的序列（表19和20）與10D10的序列相似。值得注意的是，親和力成熟抗體後出現的HCDR2中的Y57H突變也存在於該等抗體中（表19）。
[表19].小鼠實驗活動中抗體的CDR序列
名稱 Seq No. CDR1 Seq No. CDR2 Seq No. CDR3
LIBC529593-1 LV 471 RSSQSLLHRSGYNYLD 472 LGSNRAS 473 MQSLQTPRT
LIBC529593-1 HV 474 RGGDYWS 475 HIYYSGSTNYNPSLRS 476 DYDILTGYSYYYYGLDV
LIBC560340-1 LV 477 RSSQSLLYSNGHNFLD 478 LGSNRAS 479 MQALQTPRT
LIBC560340-1 HV 480 RGGDYWN 481 HIYYSGSKNYNPSLKS 482 GYDSSGYSYYYYGMDV
LIBC560657-1 LV 483 RSSQSLLYSNGHNYLD 484 LGSNRAP 485 MQALQTPRT
LIBC560657-1 HV 486 RGGDYWN 487 HIYYTGTKYYNPSLKS 488 GYDSSGYSYYYYGMDV
10D10 LV 91 RSSQSLLHSNGYNYLD 92 LGSNRAS 93 MQALQTPRT
10D10 HV 94 RGGDYWS 95 YIYYSGSTNYNPSLKS 96 DYDILTGYSYYYYGMDV
[表20] 來自小鼠實驗活動的抗體的可變區序列
名稱 Seq No. HC HV Seq No. LC LV
LIBC529593-1 489 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYSGSTNYNPSLRSRVRISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS    490 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR   
LIBC560340-1 491 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLICIVSGGSIRRGGDYWNWIRQHPGKGLEWIGHIYYSGSKNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDSSGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS 492 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGHNFLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGGGTKVEIKR   
LIBC560657-1 493 QVQLRESGPGLVKPSQTLSLICIVSGGSIRRGGDYWNWIRQHPGKGLEWIGHIYYTGTKYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDSSGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS 494 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGHNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRAPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYFCMQALQTPRTFGGGTKVEIKR   
10D10 127 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRATISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS 128 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKIRRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTFGQGTKVEIKR
抗體表徵：測試上述鑒定的抗體殖株與全長人CB1和N末端截短的人CB1的結合，以確認抗體與胞外環ECL1-3結合而不與CB1 N末端結合。還測試了與人CB2的結合，以確保不會因與CB2的交叉反應而產生副作用。最後，測試了與小鼠CB1的結合。結合研究後，使用TR-FRET cAMP測定進行功能篩選，以測量抗體對CB1的抑制作用。
為了評估靶標特異性，藉由FACS測量瞬時轉染目的蛋白的HEK293T細胞上的結合，並與空載體轉染的細胞的非特異性結合進行比較。結合結果以靶轉染的細胞和模擬轉染的細胞的平均螢光強度之比表示。結果顯示所有三種抗體均結合全長和截短的人CB1，但不結合人CB2或鼠CB1（表21）。
使用時間分辨福斯特共振能量轉移（TR-FRET）cAMP測定評估抗體對CB1功能的抑制作用。抑制CB1的抗體會導致cAMP增加，進而導致測定中FRET訊息減少。因此，較低的測定訊息意味著抗體對CB1的更好抑制。為了提高測定靈敏度，分別使用CP55、940和毛喉素激活細胞CB1和腺苷酸環化酶。利莫那班用作陽性對照。
簡而言之，將穩定轉染的CB1 CHO細胞在含有0.5% FBS、25 mM HEPES的DMEM（西格瑪公司Cat# D5671）中在37°C/5%CO2下培養過夜。測定當天，使用含有0.1% BSA（來自PE套組）、25 mM HEPES的DMEM（西格瑪公司Cat# D5671）以4倍於最終濃度以1 : 4滴定CB1抗體和利莫那班，將滴定的抗體以體積7.5 µL/孔轉移至384孔測定板。使用Accutase（西格瑪公司）收穫細胞並用含有0.5% FBS、25 mM HEPES的DMEM（西格瑪公司Cat# D5671）中和。使用含有0.1% BSA（來自PE套組）、25 mM HEPES的DMEM（西格瑪公司Cat# D5671）將該等細胞沈澱並重懸浮至1.33 x 106個細胞/mL。將來自Lance Ultra cAMP檢測套組（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer）；TRF0263）的抗cAMP抗體以抗體比細胞體積1比150的比例添加到細胞中，還將3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX；西格瑪公司）以1 mM的最終濃度加入到細胞中。將細胞以每孔15 µL或每孔20,000個細胞的體積轉移至測定板。使用含有0.1% BSA（來自PE套組）、25 mM HEPES的DMEM（西格瑪公司Cat# D5671）將毛喉素和CP55,940混合物稀釋至4倍於最終濃度，並以每孔7.5 µL的體積轉移至測定板。將測定板在37°C/5%CO2下孵育½小時，然後將EU-cAMP示蹤劑（珀金埃爾默公司；TRF0263）添加到每個孔中，並在室溫避光下進一步孵育1小時。最終孵育後，使用帶有EU615和APC 665發射過濾器的Envision讀板器讀取測定板。使用以下計算來分析數據：(665nm/615nm) x 10,000。較低的值（較低的FRET）表明對CB1的更強的抑制並且該數據用於計算IC50。結果表明，所有三種抗體的效力均遠優於10D10（表22和圖9）。
[表21].抗體的結合數據
抗體結合， MFI 比率
目標 LIBC529593 LIBC560340 LIBC560657
全長hu CB1 422 578 440
截短的hu CB1 495 705 444
全長hu CB2 1.1 1.0 1.0
全長μCB1 1.0 1.0 1.0
[表22].抗體的效力數據
分子 LIBC529593 LIBC560340 LIBC560657 10D10 利莫那班
IC50 ， nM 6.4 10.2 7.5 120 2.8
實例9.抗CB1抗體的進一步親和力成熟
進行了另一輪親和力成熟以進一步提高功能效力。對前一輪的親和力成熟抗體的分析（上面的實例1-3）表明，經GFP標記的huCB1-SMALP結合與同源10D10變體的IC50之間存在良好的相關性，並且huCB1-GFP-SMALP結合預測了大多數最有效的LC交換變體。因此，改善與huCB1-GFP-SMALP的結合係本輪親和力成熟中篩選和分選過程中的重點，以獲得具有亞奈米莫耳效力的抗體。
在這種親和力成熟中使用了兩種策略。首先，靠前的LC交換變體所共用的VK1 LC意外地屬於經過充分研究的種系，其中被預測暴露於溶劑並耐受突變的LCDR位置有很高的可信度。因此，為了進一步優化其LC，我們試圖將LIBC528116-1和其他靠前的LC交換變體的HC與先前在內部親和力成熟項目中使用的VK1/O2 LCDR文庫配對。雖然共晶結構表明暴露於溶劑的LC位置處的突變不太可能與huCB1產生接觸，但推測LC突變可能為HC環構形提供更優化的結構支持，以增強結合和效力。為了提高選擇嚴格性，構建並分選/篩選單價酵母展示Fab文庫，以改善對wtCB1-SMALP的結合，同時保留huCB1-ND結合（相比於LIBC58116-1 Fab）。
其次，我們利用來自新小鼠實驗活動的更多10D10樣抗體的出人意料的發現（參見實例8）來利用更好的親和力成熟起點。來自新小鼠實驗活動的抗體表明可以進一步探索HCDR2和HC FR3中的某些位置以提高結合和效力。此外，新抗體聚簇成兩個高度相關的HCDR3，其長度相差一個胺基酸（例如實例8的LIBC560657-1和LIBC529593-1），表明HCDR3的長度可以改變。用於進一步同源親和力成熟的酵母展示文庫將來自實例2的最有效的同源10D10變體的HC和LC突變合併到LIBC529593-1序列背景中並併入兩個HCDR3長度。HC文庫2併入了較短的HCDR3序列，並且還包含在HCDR3位置112處針對預測的DS異構化位點的修復。其他同源親和力成熟文庫的設計總結於表23-25中。
[表23].用於進一步同源AM的10D10樣HC文庫1的設計*
10D10 殘基 位置 多樣化策略
Y57 HCDR2 H #
I58 HCDR2 I、V
Y60 HCDR2 Y、Q
S65 HCDR2 E、A、K、T
S67 HCDR2 S、Q
N69 HCDR2 E、A、K、T
S73 HCDR2 S、N
L74 HCDR2 L、F
K75 HCDR2 K、R #
S76 HCDR2 S、G、N、D
A78 HFR3 V #
T79 HFR3 T、R #
D83 de 環（HFR3） N
S85 de 環 _（HFR3） Y
M136 HCDR3 M、L #
#：LIBC529593-1中發現的突變 *理論組合多樣性：1.6E4
[表24].用於進一步同源AM的10D10樣HC文庫2的設計*
10D10 殘基 位置 多樣化策略 10D10 殘基 位置 多樣化策略
Y57 HCDR2 H # A78 HFR3 V#
I58 HCDR2 I、V T79 HFR3 T、R#
Y60 HCDR2 Y、Q D83 de 環（HFR3） N
S65 HCDR2 E、A、K、T S85 de 環（HFR3） Y
S67 HCDR2 S、Q D109 HCDR3 G
N69 HCDR2 E、A、K、T I112 HCDR3 I、A、T、V
S73 HCDR2 S、N L113 HCDR3 缺失
L74 HCDR2 L、F T114 HCDR3 S
K75 HCDR2 K、R # M136 HCDR3 M、L#
S76 HCDR2 S、G、N、D         
#：LIBC529593-1中發現的突變 *理論組合多樣性：6.5E4
表25.用於進一步同源AM的10D10樣LC文庫的設計*
10D10 殘基 位置 多樣化策略
S34 LCDR1 R #
N35 LCDR1 S #
L58 LCDR2 L、Q
R94 LC FR3 S #
M107 LCDR3 R
A109 LCDR3 A、S #
L110 LCDR3 V、R
Q111 LCDR3 A、G
T135 LCDR3 I、L
#：LIBC529593-1中發現的突變 *理論組合多樣性：33（32+1）
將10D10 HC和LC文庫設計組合配對，以構建Fab酵母文庫，以針對增強的結合嚴格性進行選擇。對用於進一步親和力成熟的同源文庫進行分選/篩選，以改善對wtCB1-SMALP的結合，同時保留huCB1-ND結合（相比於LIBC523797-1 Fab）。
為進一步的親和力成熟實驗活動構建的文庫針對連續較低濃度的huCB1-GFP-SMALP（從25或50 nM開始）進行分選。我們在低至2-5 nM的huCB1-SMALP濃度（這代表比之前的親和力成熟實驗活動（實例2-4）中使用的濃度低20-50x的濃度）下進行了選殖結合篩選。然後基於與之前描述的類似原理（實例2和3）從進一步的VK1 LC優化實驗活動和進一步的同源親和力成熟實驗活動中選擇表現出最小非特異性結合和預定序列傾向的最改善的結合物。從VK1 LC優化獲得了八個殖株，從進一步的同源親和力成熟獲得了18個殖株。與分別來自LC交換和同源實驗活動的LIBC528116-1和LIBC523797-1 Fab-酵母基準相比，該等靠前殖株顯示出改進的huCB1-SMALP結合、相似的huCB1-ND結合和低水平的空ND結合。
表26和27以及圖7總結了前8個進一步LC交換親和力成熟變體的CDR序列、種系資訊和結合數據。所有靠前的殖株均表現出針對CB1-SMALP和CB1-ND的改善的結合（表28），同時表現出與不相關的XCR1-SMALP和空-ND的最小結合。對於LIBC681737-1，在製備IgG1 SEFL2 mAb用於功能測試時包含LC P12S種系回復突變。
[表26].前8個進一步VK1 LC優化變體的CDR序列
名稱 Seq No. CDR1 Seq No. CDR2 Seq No. CDR3
LIBC680812-1_LC huCB1 LV 405 RASQSISSYLN 406 SARRLSS 407 QQYRSYPIT
LIBC680812-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 408 RGGDYWG 409 HVYQTGSTKYNPSFKD 410 NYDTLTGYSYYYYGMDV
LIBC680562-1_LC huCB1 LV 411 RASQSISSYLN 412 SARRLSS 413 QQYAKSPIT
LIBC680562-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 414 RGGDYWA 415 HIYQTGSTNYNPRFKG 416 NYDTLTGYSYYYYGMDV
LIBC680800-1_LC huCB1 LV 417 RASQSISSYLN 418 SARALSS 419 QQYRKFPLT
LIBC680800-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 420 RGGDYWA 421 HIYQTGSTNYNPRFKG 422 NYDTLTGYSYYYYGMDV
LIBC680574-1_LC huCB1 LV 423 RASQSISSYLN 424 GARRLGS 425 QQYSSLPVT
LIBC680574-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 426 RGGDYWA 427 HVYYTGSTKYNPSFKD 428 NYDTLTGYSYYYYGMDV
LIBC680773-1_LC huCB1 LV 429 RASQSISSYLN 430 KARLLSS 431 QQYSRLPLT
LIBC680773-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 432 RGGDYWA 433 HVYYTGSTNYNPRFKD 434 NYDTVTGYSYYYYGMDV
LIBC681594-1_LC huCB1 LV 435 RASQSISSYLN 436 KARKLSS 437 QQFGSMPLT
LIBC681594-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 438 RGGDYWA 439 HIYQTGSTNYNPRFKG 440 NYDTLTGYSYYYYGMDV
LIBC681737-1(LC:P12S)_LC huCB1 LV 441 RASQSISSYLN 442 SARRLAS 443 QQYYHPPIT
LIBC681737-1(LC:P12S)_mol:fdChaincf huCB1 HV 444 RGGDYWA 445 HVYYTGSTNYNPRFKD 446 NYDTVTGYSYYYYGMDV
LIBC681593-1_LC huCB1 LV 447 RASQSISSYLN 448 NARRLGS 449 QQYRSSPVT
LIBC681593-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 450 RGGDYWA 451 HIYQTGSTNYNPRFKG 452 NYDTLTGYSYYYYGMDV
LIBC681737-1_LC huCB1 LV 441 RASQSISSYLN 442 SARRLAS 443 QQYYHPPIT
LIBC681737-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 444 RGGDYWA 445 HVYYTGSTNYNPRFKD 446 NYDTVTGYSYYYYGMDV
[表27].前8個進一步VK1 LC優化變體的可變區序列
名稱 Seq No. LC LV Seq No. mol:fdChaincf HV
LIBC680812-1 453 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSARRLSSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRSYPITFGGGTKVEIKR 454 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWGWIRQHPGKGLEWIGHVYQTGSTKYNPSFKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTLTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC680562-1 455 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSARRLSSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYAKSPITFGGGTKVEIKR 456 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGSTNYNPRFKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTLTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC680800-1 457 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSARALSSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKFPLTFGGGTKVEIKR 458 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGSTNYNPRFKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTLTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC680574-1 459 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGARRLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSSLPVTFGGGTKVEIKR 460 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGSTKYNPSFKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTLTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC680773-1 461 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKARLLSSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSRLPLTFGGGTKVEIKR 462 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGSTNYNPRFKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTVTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC681594-1 463 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKARKLSSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFGSMPLTFGGGTKVEIKR 464 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGSTNYNPRFKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTLTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC681737-1(LC:P12S) 465 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSARRLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYHPPITFGGGTKVEIKR 466 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGSTNYNPRFKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTVTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC681593-1 467 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYNARRLGSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRSSPVTFGGGTKVEIKR 468 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGSTNYNPRFKGRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTLTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC681737-1 469 DIQMTQSPSSLPASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSARRLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYHPPITFGGGTKVEIKR 470 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWAWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGSTNYNPRFKDRATISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNYDTVTGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
[表28].前8個進一步VK1 LC優化變體的種系資訊
名稱 VH種系 VL種系
LIBC680562-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
LIBC680574-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
LIBC680773-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
LIBC680800-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
LIBC680812-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
LIBC681593-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
LIBC681594-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
LIBC681737-1 VH4|4-31/D3|3-9|RF2/JH6 VK1|O2/JK4
[表29].前8個進一步VK1 LC優化變體的結合數據
名稱 2.5nM CB1-         SMALP-GFP* 25nM XCR1-        SMALP-GFP* 0.2nM CB1-ND* 50nM 空 ND*
LIBC680562-1 1.94 0.64 3.34 0.68
LIBC680574-1 1.72 0.56 NA 0.72
LIBC680773-1 1.9 0.84 2.4 0.75
LIBC680800-1 1.76 0.47 2.52 0.78
LIBC680812-1 1.71 0.59 2.23 0.74
LIBC681593-1 2.37 0.72 NA 0.91
LIBC681594-1 2.57 1.04 3.56 0.83
LIBC681737-1 1.94 0.62 1.89 0.73
LIBC528116（Fab） 1 1 1 1
*與LIBC528116（Fab）相比的相對結合倍數變化，在減去背景後計算
表30和31以及圖8A和8B總結了前18個進一步同源親和力成熟變體的CDR序列、種系資訊和結合數據。18個結合物中的大多數利用較短的HCDR3，並在HC文庫2的文庫設計中擁有HC T79R FR3突變，這突出了合理合併來自所有可用序列-功能關係的特徵的益處。所有十八個同源變體均滿足針對huCB1-GFP-SMALP的嚴格結合改善閾值，並且與不相關的XCR1-SMALP和空-ND具有最小的結合（表32）。相對於LIBC523797-1，該等變體還表現出與CB1 SMALP更好的結合。對於LIBC674043-1和LIBC674200-1，VH R149S和VL G76D種系回復突變也包含在被產生用於功能測試的IgG1 SEFL2 mAb組中。
[表30].前18個進一步同源變體的CDR序列
名稱 Seq No. CDR1 Seq No. CDR2 Seq No. CDR3
LIBC673972-1_LC huCB1 LV 257 RSSQSLLHRSGYNYLD 258 LGSNRAS 259 MQSLQTPRT
LIBC673972-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 260 RGGDYWS 261 HIYYTGQTAYNPNLRN 262 GYDASGYSYYYYGLDV
LIBC673952-1_LC huCB1 LV 263 RSSQSLLHRSGYNYLD 264 QGSNRAS 265 RQARALPRT
LIBC673952-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 266 RGGDYWS 267 HVYYTGQTTYNPSFRG 268 DYDILTGYSYYYYGLDV
LIBC673982-1_LC huCB1 LV 269 RSSQSLLHRSGYNYLD 270 LGSNRAS 271 RQSVALPRT
LIBC673982-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 272 RGGDYWS 273 HIYYTGSTTYNPSFRG 274 DYDISGYSYYYYGMDV
LIBC674043-1_LC huCB1 LV 275 RSSQSLLHRSGYNYLD 276 LGSNRAS 277 MQSLQTPRT
LIBC674043-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 278 RGGDYWS 279 HIYYTGQTTYNPNFKG 280 GYDASGYSYYYYGMDV
LIBC673948-1_LC huCB1 LV 281 RSSQSLLHRSGYNYLD 282 LGSNRAS 283 MQSLQTPRT
LIBC673948-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 284 RGGDYWS 285 HIYYTGSTKYNPSLKN 286 GYDVSGYSYYYYGLDV
LIBC674090-1_LC huCB1 LV 287 RSSQSLLHRSGYNYLD 288 QGSNRAS 289 MQSLQTPRT
LIBC674090-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 290 RGGDYWS 291 HIYYAGSTAYNPNFRG 292 GYDTSGYSYYYYGLDV
LIBC674200-1(LC:G76D)_LC huCB1 LV 293 RSSQSLLHRSGYNYLD 294 LGSNRAS 295 MQSLQTPRT
LIBC674200-1(LC:G76D)_mol:fdChaincf huCB1 HV 296 RGGDYWS 297 HVYYTGQTAYNPNFRN 298 GYDVSGYSYYYYGMDV
LIBC673965-1_LC huCB1 LV 299 RSSQSLLHRSGYNYLD 300 LGSNRAS 301 MQSLQTPRT
LIBC673965-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 302 RGGDYWS 303 HVYYTGQTAYNPSLRG 304 GYDTSGYSYYYYGLDV
LIBC674216-1_LC huCB1 LV 305 RSSQSLLHRSGYNYLD 306 LGSNRAS 307 MQSLQTPRT
LIBC674216-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 308 RGGDYWS 309 HIYYTGQTAYNPSLRN 310 GYDISGYSYYYYGLDV
LIBC674043-1(mol:fdChaincf:R149S)_LC huCB1 LV 275 RSSQSLLHRSGYNYLD 276 LGSNRAS 277 MQSLQTPRT
LIBC674043-1(mol:fdChaincf:R149S)_mol:fdChaincf huCB1 HV 278 RGGDYWS 279 HIYYTGQTTYNPNFKG 280 GYDASGYSYYYYGMDV
LIBC674214-1_LC huCB1 LV 311 RSSQSLLHRSGYNYLD 312 LGSNRAS 313 MQSLQTPRT
LIBC674214-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 314 RGGDYWS 315 HVYYEGSTKYNPSFRG 316 GYDVSGYSYYYYGLDV
LIBC674235-1_LC huCB1 LV 317 RSSQSLLHRSGYNYLD 318 LGSNRAS 319 MQSLQTPRT
LIBC674235-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 320 RGGDYWS 321 HVYYAGSTTYNPSLKS 322 GYDVSGYSYYYYGLDV
LIBC674257-1_LC huCB1 LV 323 RSSQSLLHRSGYNYLD 324 LGSNRAS 325 MQSLQTPRT
LIBC674257-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 326 RGGDYWS 327 HIYYTGQTKYNPSLRG 328 GYDISGYSYYYYGLDV
LIBC674200-1_LC huCB1 LV 293 RSSQSLLHRSGYNYLD 294 LGSNRAS 295 MQSLQTPRT
LIBC674200-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 296 RGGDYWS 297 HVYYTGQTAYNPNFRN 298 GYDVSGYSYYYYGMDV
LIBC674153-1_LC huCB1 LV 329 RSSQSLLHRSGYNYLD 330 LGSNRAS 331 MQSLQTPRT
LIBC674153-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 332 RGGDYWS 333 HVYYTGSTAYNPSFRG 334 GYDTSGYSYYYYGLDV
LIBC674002-1_LC huCB1 LV 335 RSSQSLLHRSGYNYLD 336 LGSNRAS 337 MQSLQTPRT
LIBC674002-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 338 RGGDYWS 339 HIYYKGSTEYNPSLRG 340 GYDVSGYSYYYYGLDV
LIBC674276-1_LC huCB1 LV 341 RSSQSLLHRSGYNYLD 342 LGSNRAS 343 MQSLQTPRT
LIBC674276-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 344 RGGDYWS 345 HVYYTGSTTYNPNFKG 346 GYDASGYSYYYYGLDV
LIBC674024-1_LC huCB1 LV 347 RSSQSLLHRSGYNYLD 348 LGSNRAS 349 MQSLQTPRT
LIBC674024-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 350 RGGDYWS 351 HVYQTGSTKYNPSFKN 352 GYDVSGYSYYYYGLDV
LIBC674035-1_LC huCB1 LV 353 RSSQSLLHRSGYNYLD 354 LGSNRAS 355 MQSLQTPRT
LIBC674035-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 356 RGGDYWS 357 HIYYAGQTKYNPSFKN 358 GYDISGYSYYYYGLDV
LIBC674229-1_LC huCB1 LV 359 RSSQSLLHRSGYNYLD 360 QGSNRAS 361 MQSLQTPRT
LIBC674229-1_mol:fdChaincf huCB1 HV 362 RGGDYWS 363 HIYQTGQTKYNPSFKG 364 GYDVSGYSYYYYGMDV
[表31].前18個進一步同源變體的可變區序列
名稱 Seq No. LC LV Seq No. mol:fdChaincf HV
LIBC673972-1 365 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 366 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYTGQTAYNPNLRNRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDASGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC673952-1 367 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYQGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQARALPRTFGQGTKVEIKR 368 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGQTTYNPSFRGRVTISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDILTGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC673982-1 369 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCRQSVALPRTFGQGTKVEIKR 370 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYTGSTTYNPSFRGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYDISGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC674043-1 371 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 372 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYTGQTTYNPNFKGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDASGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSR
LIBC673948-1 373 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 374 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYTGSTKYNPSLKNRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDVSGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674090-1 375 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYQGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 376 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYAGSTAYNPNFRGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDTSGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674200-1(LC:G76D) 377 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 378 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGQTAYNPNFRNRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDVSGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC673965-1 379 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 380 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGQTAYNPSLRGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDTSGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674216-1 381 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 382 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYTGQTAYNPSLRNRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDISGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674043-1（mol:fdChaincf:R149S） 383 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 384 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYTGQTTYNPNFKGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDASGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
LIBC674214-1 385 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 386 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYEGSTKYNPSFRGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDVSGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674235-1 387 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 388 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYAGSTTYNPSLKSRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDVSGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674257-1 389 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 390 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYTGQTKYNPSLRGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDISGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
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LIBC674153-1 393 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 394 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGSTAYNPSFRGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDTSGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674002-1 395 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 396 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYKGSTEYNPSLRGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDVSGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674276-1 397 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 398 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYYTGSTTYNPNFKGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDASGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674024-1 399 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 400 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHVYQTGSTKYNPSFKNRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDVSGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674035-1 401 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 402 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYYAGQTKYNPSFKNRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDISGYSYYYYGLDVWGQGTTVTVSS
LIBC674229-1 403 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRSGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYQGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTPRTFGQGTKVEIKR 404 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIRRGGDYWSWIRQHPGKGLEWIGHIYQTGQTKYNPSFKGRVRISVNTYKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGYDVSGYSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
[表32].前18個進一步同源變體的結合數據
HTB條碼 10 nM CB1 SMALP* 5 nM CB1 SMALP* 50 nM XCR1 SMALP* 0.5 nM CB1 ND* 50 nM空ND*
LIBC529593-1（Fab） 1.06 1.42 1.50 0.38 1.14
LIBC523797-1（Fab） 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
LIBC673948-1 2.46 1.37 0.88 0.64 0.48
LIBC673952-1 1.91 1.23 0.59 0.77 0.62
LIBC673965-1 2.50 1.30 0.74 0.65 0.43
LIBC673982-1 2.16 1.24 0.79 0.78 0.60
LIBC673972-1 2.46 1.46 0.80 0.63 0.40
LIBC674024-1 2.39 1.24 0.86 0.49 0.55
LIBC674035-1 2.74 1.29 0.91 0.52 0.56
LIBC674043-1 3.23 1.20 0.62 1.85 0.75
LIBC674090-1 2.85 1.20 0.74 1.35 0.99
LIBC674002-1 2.59 1.49 0.91 0.46 0.03
LIBC674153-1 2.62 1.35 0.68 1.83 0.33
LIBC674200-1 3.31 1.33 0.79 2.08 0.74
LIBC674214-1 2.10 1.17 0.68 1.76 1.09
LIBC674216-1 1.96 1.10 0.52 1.66 0.65
LIBC674229-1 3.17 1.11 0.80 2.22 0.75
LIBC674235-1 2.05 1.30 0.68 1.28 0.72
LIBC674257-1 3.34 1.19 0.77 1.86 0.73
LIBC674276-1 2.06 1.17 0.54 2.04 0.51
*與LIBC523797-1（Fab）相比的相對結合倍數變化，在減去背景後計算
實例10.進一步親和力成熟變體的功能分析
將從上述實例9分離的殖株進行選殖並表現為IgG1 SEFL2 mAb用於功能分析。如上所述（例如，實例8）使用TR-FRET cAMP測定分析抗體的拮抗劑活性，並且抗體的效力總結於表33中。在所有四個實驗中所有抗體的效力均為個位數nM，其中一些抗體效力小於1 nM。
[表33].進一步親和力成熟的示例性抗體的IC50值
分子 IC50（nM，n = 4） 分子 IC50（nM，n = 4）
LIBC673952-1 2.48 LIBC680562-1 0.71
LIBC673965-1 2.21 LIBC680574-1 0.75
LIBC673972-1 2.43 LIBC680773-1 0.74
LIBC673982-1 2.11 LIBC680800-1 1.57
LIBC674090-1 1.76 LIBC680812-1 0.68
LIBC674200-1 2.39 LIBC681593-1 0.61
LIBC674200-1 (LC:G76D) 2.23 LIBC681594-1 1.24
LIBC674229-1 4.16 LIBC681737-1 0.55
26970-1 14.41      
10D10 346.54      
利莫那班 3.40      
LIBC528116-1 2.02      
實例11.動物模型中進一步親和力成熟變體的影響
YTE形式的進一步親和力成熟抗體LIBC673952（52777）和LIBC680574（52778）（Dall’Acqua等人, The Journal of Immunology [免疫學雜誌], 169: 5171-5180 (2002)）被規模擴大用於在飲食誘導的其中敲入了huCB1的肥胖（DIO）轉基因小鼠中測試。用高脂肪飲食（HFD）餵養6-10週齡的huCB1敲入（KI）小鼠15週以誘導肥胖。將抗體（52777、52778和37940）和對照抗體（huIgG對照）以30 mg/kg QW投與給小鼠，持續35天，每3-4天測量動物的體重和食物攝入並且結果顯示在圖10A和10B中。投與進一步親和力成熟抗體降低了動物的體重（圖10A），而平均每日食物攝入沒有顯著變化（圖10B）。還測量了動物的脂肪質量和肝臟重量，結果顯示在圖10C和10D中。該等結果表明本文所述之有效周圍作用的抗CB1抗體係抗肥胖症、高胰島素血症和NASH的有效治療。
實例12.能量消耗和胰島素耐受性測試中抗CB1 mAb的影響
材料與方法：所有使用小鼠的研究都遵守所有相關的道德法規，並且所進行的研究獲得了美商安進公司IACUC機構審查委員會（千橡市，加利福尼亞州）的批准。動物飼養室的照明保持在12 : 12小時光 : 暗週期，環境溫度和濕度範圍分別為68-79°F和30-70%。動物可以按指示藉由自動供水系統或藉由水瓶隨意獲取經過輻照的顆粒飼料和反滲透氯化水（0.3至0.5 ppm）。每週更換籠子。
將雄性huCNR1 TG小鼠（4-7週齡）從查理斯河實驗室（Charles River Laboratories）（霍利斯特，加利福尼亞州）運送到美商安進公司（千橡市，加利福尼亞州），抵達後單獨飼養，並開始高脂肪飲食（HFD）餵養（60% kcal脂肪，研究飲食D12492i）12週。HFD餵養12週後，小鼠適應水瓶一週，然後將n = 24隻小鼠轉移至綜合實驗動物監測系統（CLAMS，哥倫布儀器公司（Columbus Instruments），哥倫布（Columbus），俄亥俄州- Oxymax型號2018，0233-004M，Oxymax Windows v5.53軟體，硬體設定190395）適應額外兩週。在此期間測量了氧氣消耗（VO2）、二氧化碳產生（VCO2）、呼吸交換率（RER）和能量消耗（HEAT）。治療開始時，小鼠已餵食HFD總計15週，n = 23隻小鼠根據第-3天至第-1天的基線測量期間的體重、年齡、VO2、VCO2、RER和熱量被隨機分為兩組。每週以30 mg/kg（2 mL/kg）給小鼠IP給予huIgG1對照PL-42466（n = 11隻小鼠）或CB1 mAb 37940-17（n = 12隻小鼠），總共注射5次。小鼠從第-14天到第7天被安置在CLAMS系統中，在第7-14天被返回圈養籠中，從第14天到第28天返回到CLAMS系統，並在第28天被返回圈養籠中用於研究。每週測量體重和食物攝入。為簡單起見，數據顯示為開燈和關燈循環（12小時開:12小時關）。
對於胰島素耐受性測試（ITT），在治療第32天（第5次IP注射後4天），小鼠於早上6點禁食6小時。中午12點，使用血糖儀（AlphaTrak）藉由眼眶後采血測量血糖，並立即給小鼠IP給予胰島素（0.75 U/kg）。在投與胰島素後30分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘藉由眼眶采血測量血糖。使用GraphPad Prism（版本9.5.1）計算每隻小鼠的曲線下面積（AUC）。
結果：對於光週期（6am-6pm）和暗週期（6pm-6am），以熱量（kcal/hr/kg）和呼吸交換率（RER）測量的能量消耗每週（適應、第1週、第3週和第4週）進行平均。在光週期中當小鼠休息時，CB1 mAb治療的小鼠在治療第4週期間的能量消耗顯著較高（對於CB1而言與基線相比增加+12%，相比之下，對於對照而言與基線相比增加+4%，p = 0.0325；雙向重複測量ANOVA連同Sidak多重比較檢驗，圖11A）。此外，在治療第3週期間，CB1 mAb治療組的RER顯著降低（治療p = 0.0125；雙向重複測量ANOVA連同Sidak多重比較檢驗），表明脂質氧化增加（圖11A）。
為了評估胰島素敏感性，進行了胰島素耐受性測試（ITT）。禁食6小時後，小鼠的基線血糖測量結果沒有差異；然而，投與胰島素後，CB1 mAb治療的小鼠在胰島素注射後30分鐘、60分鐘和90分鐘具有統計學上更低的血糖（p ＜ 0.01，雙向重複測量ANOVA連同Sidak多重比較檢驗）和降低25%的AUC（p = 0.0006；學生未配對t檢驗），表明CB1 mAb治療後胰島素敏感性顯著改善（圖11B）。
實例13. Tg32小鼠中ANT-CB1 MAB的腦攝取研究
進行本研究係為了表徵在雄性huFcRn Tg 32純合小鼠中靜脈內推注投與後示例性抗CB1拮抗劑mAb的單劑量血漿藥物動力學和腦攝取。
材料與方法：在整個研究期間隨意提供食物和水。在給藥前一天，將儲備測試品從-70°C（±10°C）儲存中取出並置於2-8°C下解凍過夜。在劑量投與的早晨，將儲備測試品從2-8°C儲存中取出，藉由輕輕顛倒混合，並置於濕冰上進行稀釋程序。將媒劑從2-8°C儲存中取出，並且藉由輕輕顛倒混合，並置於濕冰上進行稀釋程序。對於所有組，將儲備測試品在適當的配製物緩衝液中稀釋以獲得實驗設計中列出的最終劑量溶液濃度。劑量溶液製備後，將所有剩餘媒劑（如果適用）返回至2-8°C儲存。劑量投與後，將所有剩餘的儲備測試品（如果適用）和剩餘的給藥溶液（如果適用）置於-70°C（± 10°C），並轉移給生物分析首席研究員進行後續分析和儲存。測試動物通過側尾靜脈接受適當給藥溶液的靜脈內推注劑量。
SARSTEDT Microvette® K3 EDTA血漿分離管用於通過頜下靜脈穿刺在每個連續時間點收集每個測試系統約0.05 mL的全血。將全血放入SARSTEDT Microvette®血漿管中後，藉由輕輕顛倒8-10次將管混合並置於濕冰上。使用校準的Eppendorf 5417R離心機系統（布林克曼儀器公司（Brinkmann Instruments, Inc.），韋斯特一級利，紐約州 11590）將樣本在2-8°C以約14,000 rcf離心5分鐘。所有血漿樣本在分析前均儲存在約-70°C（±10°C）。
研究結束時進行經心灌注。每個測試系統均用異氟烷（5% O2(g)，速率為1.5 L/min）深度麻醉，並在整個灌注過程中保持在手術麻醉平面下。在皮膚上在胸骨正下方切開一個切口，並找到胸骨尖端的位置。抓住胸骨，穿過隔膜並沿著肋骨籃兩側切開以暴露心臟，使動物出現氣胸。使心臟穩定，並將20號、½”的針放入左心室。針通過管道連接到灌注/注射泵，並且允許0.9%鹽水以大約4 mL/分鐘的速率運行大約5分鐘。一旦建立流動，就切開右心房，讓液體流出動物，防止脈管系統過度加壓。用鹽水灌注5分鐘後，再灌注10%中性緩衝福馬林5分鐘。灌注完成後，將針從左心室取出，並採集一或多個適當的組織用於後續分析。
在最終時間點放血後立即從每個測試系統中收穫組織，如下所述。提取後用0.9%無菌鹽水沖洗組織，用乾紗布吸乾，立即放入冷凍管（Eppendorf Protein LoBind，目錄號#0030108116）中，稱重，並浸入液氮中以快速冷凍組織。一旦組織被快速冷凍，它們就會在屍檢過程中儲存在乾冰上，以及儲存在-70°C（± 10°C）以供後續分析。
使用酶聯免疫吸附測定（ELISA）分析用於PK測試品濃度測定的血漿和組織樣本。分析前樣本保持在-70°C（±10°C）。對每個劑量組每個採樣時間所有小鼠的平均血漿測試品濃度相比於時間數據進行非房室分析。目的參數包括第10天的組織比血漿百分比比率和半衰期（t 1/2）。
結果：抗體的PK和腦暴露顯示在下表34中。結果表明，抗CB1 mAb的腦暴露係該抗體血漿濃度的0.2%。已知表現人新生兒Fc受體（hFcRn）的轉基因Tg32小鼠可預測mAb治療劑的人PK（Avery等人 mAbs [單株抗體] 20161）。該等結果表明，0.002分數的mAb血漿濃度可以分佈至腦。該等結果也與之前發表的關於其他小鼠模型中免疫球蛋白G1（IgG1）mAb的文獻一致（例如，Avery L. B.等人, MAbs.[單株抗體] 2016年8月-9月;8(6):1064-78. doi: 10.1080/19420862.2016.1193660. 2016年5月27日電子出版.PMID: 27232760；PMCID: PMC4968115；Shah D. K.等人, MAbs.[單株抗體] 2013年3月-4月;5(2):297-305. doi: 10.4161/mabs.23684. 2013年2月13日電子出版.PMID: 23406896；PMCID: PMC3893240；和Garg A.和Balthasar J. P., AAPS J.[AAPS雜誌] 2009年9月;11(3):553-7. doi: 10.1208/s12248-009-9129-9. 2009年7月28日出版.PMID: 19636712；PMCID: PMC2758122）。
[表34] 抗CB1 mAb的PK和腦暴露
   動物系統 抗CB1 mAb
PK（T 1/2） Tg32小鼠（huFcRn） 10.37天
腦暴露（第10天血漿濃度的%） Tg32小鼠（huFcRn） 0.21 ± 0.07 %
實例14. CB1-Fab複合物的CRYO-EM結構
huCB1與10D10的Fab和四種親和力成熟（AM）抗體複合的cryo-EM結構以約3.1至3.7 Å的解析度解析，這足以確定表位/互補位相互作用。抗體的效力範圍為1.77至47 nM。cryo-EM結構證實，只有抗體的重鏈參與結合，並且CB1的ECL2係主要表位。此外，HCDR1在CB1 ECL2的結合中起主要作用，這與AM抗體的HCDR1序列高度保守的事實相一致。與HCDR1相鄰的R32（AHo編號）也參與表位相互作用。HCDR2在序列方面係多樣的，並且HCDR2中的某些殘基（例如Y59，AHo編號）似乎有助於結合親和力。HCDR3的Y131和Y132（AHo編號）在測試的抗體中係保守的，並與CB1結合。
[表35].親和力成熟變體的共通序列
Seq. No. 名稱 序列
530 共通序列_ 親和力成熟變體HV CDR1 RGGDYWX1 X1係A、S或G
531 共通序列_ 親和力成熟變體HV CDR2 HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10 X2係I或V；X3係H、Y或Q；X4係E、T或S；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N
532 共通序列_ 親和力成熟變體HV CDR3 X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV X11係D、E或N；X12係A、I、P、T或V；X13係F、L或V；X14係S或T；並且X15係H、N或Y
533 共通序列_ 親和力成熟變體LV CDR1 RSSQSLLX16SX17GX18NYX19D X16係H、S或T；X17係S、T或Y；X18係A、N、I或Y；並且X19係L或V
534 共通序列_ 親和力成熟變體LV CDR2 X20GSNRA X20係L或Q
535 共通序列_ 親和力成熟變體LV CDR3 X21QAX22X23X24PRT X21係M或R；X22係L、I、R或V；X23係Q、E、T、A或G；並且X24係T、I、L或Q
564 共通序列_進一步親和力成熟LC交換變體HV CDR1 RGGDYWX1 X1係A或G
565 共通序列_進一步親和力成熟LC交換變體HV CDR2 HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10 X2係I或V；X3係Y或Q；X4係T；X5係S；X6係K或N；X7係S或R；X8係F；X9係K；並且X10係G或D
566 共通序列_進一步親和力成熟LC交換變體HV CDR3 X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV X11係N；X12係T；X13係L或V；X14係T；並且X15係Y
405 共通序列_進一步親和力成熟LC交換變體LV CDR1 RASQSISSYLN
536 共通序列_進一步親和力成熟LC交換變體LV CDR2 X39ARX40LX41S X39係N、S、K或G；X40係R、K、L或A；並且X41係A、G或S
537 共通序列_進一步親和力成熟LC交換變體LV CDR3 QQX42X43X44X45PX46T X42係Y或F，X43係R、A、S、G或Y；X44係S、K、R或H；X45係S、L、F、Y、P或M；並且X46係L、I或V
1 共通序列_進一步親和力成熟同源變體HV CDR1 RGGDYWS
538 共通序列_進一步親和力成熟同源變體HV CDR2 HX25YX26X27GX28TX29YNPX30X31X32X33 X25係I或V；X26係Y或Q；X27係A、E、K或T；X28係S或Q；X29係A、E、K或T；X30係N或S；X31係F或L，X32係K或R；並且X33係G、S或
539 共通序列_進一步親和力成熟同源變體HV CDR3 X34YDX35X36X37GYSYYYYGX38DV X34係D或G；X35係A、I、T或V；X36係L或不存在；X37係S或T；並且X38係M或L
257 共通序列_進一步親和力成熟同源變體LV CDR1 RSSQSLLHRSGYNYLD
534 共通序列_進一步親和力成熟同源變體LV CDR2 X20GSNRA X20係L或Q
540 共通序列_進一步親和力成熟同源變體LV CDR3 X47QX48X49X50X51PRT X47係M或R；X48係A或S；X49係L、R或V；X50係Q或A；並且X51係T或L
雖然已經著重於較佳的方面描述了本發明，但是對於熟悉該項技術者來說將顯而易見的是可以使用較佳的化合物和方法的變化形式，並且旨在以不同於如本文特別描述的方式實踐本發明。因此，本發明包括涵蓋在如由以下請求項限定的本發明之精神和範圍內的所有修改。
無
[圖1A和1B]顯示了靠前的親和力成熟的同源變體之結合譜。
[圖2A和2B]顯示了靠前的親和力成熟的LC交換變體之結合譜。
[圖3A]顯示了靠前的同源親和力成熟變體的HV CDR和FR3序列比對。圖3B顯示了靠前的同源親和力成熟變體的LV CDR和FR3序列比對。
[圖4A]顯示了靠前的LC交換親和力成熟變體的HV CDR和FR3序列比對。圖4B顯示了靠前的LC交換親和力成熟變體的LV CDR序列比對。
[圖5A]顯示了示例性親和力成熟抗體的拮抗劑。圖5B顯示了示例性親和力成熟的抗體的反向促效劑活性。
[圖6A和6B]顯示了在肥胖人CB1敲入小鼠中示例性親和力成熟抗體對體重和食物攝入的減少。圖6C顯示了抗體的脂肪質量、肝臟三酸甘油酯和胰島素水平的降低。圖6D顯示了示例性親和力成熟的抗體對腎損傷、纖維化和炎症標誌物的影響。
[圖7]顯示了靠前的LC交換親和力成熟變體的HV和LV CDR序列比對。
[圖8A]顯示了靠前的另外的同源親和力成熟變體的HV CDR和FR3序列比對。圖8B顯示了靠前的另外的同源親和力成熟變體的LV CDR序列比對。
[圖9]顯示了從小鼠抗體實驗活動中分離出的抗體的拮抗劑活性。
[圖10A]顯示了在肥胖人CB1敲入小鼠中示例性的另外的親和力成熟抗體對體重的減輕。圖10B顯示了抗體對食物攝入的影響。圖10C顯示了抗體對脂肪質量的影響，圖10D顯示了抗體對肝臟重量的影響。
[圖11A]顯示了用示例性抗CB1抗體進行的治療增加了動物模型（小鼠）中的能量消耗並降低了呼吸交換率。圖11B顯示了用示例性抗CB1抗體治療增加動物模型中的胰島素敏感性。
無
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Claims (69)

  1. 一種結合人大麻素受體1（huCB1）的分離的抗體，其中該抗體包含重鏈可變區（HV）和輕鏈可變區（LV），該重鏈可變區包含重鏈互補區（CDR）HCDR1、HCDR2和HCDR3，並且該輕鏈可變區包含輕鏈互補區（CDR）LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中該等重鏈和輕鏈CDR選自以下中任一項： (a) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 135-137，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 138-140； (b) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 426-428，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 423-425； (c) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 266-268，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 263-235； (d) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 129-131，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 132-134； (e) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 159-161，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 162-164； (f) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 207-209，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 210-212； (g) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1-3，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 4-6；以及 (h) HCDR1、HCDR2和HCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 55-57，並且LCDR1、LCDR2和LCDR3分別包含胺基酸序列SEQ ID NO: 58-60。
  2. 如請求項1所述之抗體，其中該抗體包含含有選自SEQ ID NO: 228、SEQ IN NO: 460、SEQ ID NO: 368、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 252、SEQ ID NO: 98和SEQ ID NO: 116的胺基酸序列的HV。
  3. 如請求項1或2所述之抗體，其中該抗體包含含有選自SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 459、SEQ ID NO: 367、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 251、SEQ ID NO: 97和SEQ ID NO: 115的胺基酸序列的LV。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之抗體，其中該抗體包含選自以下中任一項的HV和LV： i) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 228的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 227的LV； ii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 460的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 459的LV； iii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 368的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 367的LV； iv) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 100的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 99的LV； v) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 236的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 235的LV； vi) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 226的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 225的LV； vii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 252的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 251的LV； viii) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 98的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 97的LV；以及 ix) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 116的HV，包含胺基酸序列SEQ ID NO: 115的LV。
  5. 一種結合huCB1的分離的抗體，其中該抗體包含HV和LV，其中 a)     該HV包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中 HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A、S或G； HCDR2包含胺基酸序列HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10（SEQ ID NO: 531），其中X2係I或V；X3係H、Y或Q；X4係E、T或S；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；並且 HCDR3包含胺基酸序列X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV（SEQ ID NO: 532），其中X11係D、E或N；X12係A、I、P、T或V；X13係F、L或V；X14係S或T；並且X15係H、N或Y； 並且 b)    該LV屬於VK1/O2/JK4、VK2/A19/JK1或VK3/A27/JK1種系。
  6. 如請求項5所述之抗體，其中 a)     HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A或S； HCDR2包含胺基酸序列HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10（SEQ ID NO: 531），其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係E、T或S；X5係S或Q；X6係A或K；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；並且 HCDR3包含胺基酸序列X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV（SEQ ID NO: 532），其中X11係D、E或N；X12係A、I、P或V；X13係L或V；X14係S或T；並且X15係H或Y；並且 b)    該LV屬於VK2/A19/JK1種系。
  7. 如請求項6所述之抗體，其中X4係T，X15係Y。
  8. 如請求項5-7中任一項所述之抗體，其中 b)    該LV包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中 LCDR1包含胺基酸序列RSSQSLLX16SX17GX18NYX19D（SEQ ID NO: 533），其中X16係H、S或T；X17係S、T或Y；X18係A、N、I或Y；並且X19係L或V； LCDR2包含胺基酸序列X20GSNRA（SEQ ID NO: 534），其中X20係L或Q；並且 LCDR3包含胺基酸序列X21QAX22X23X24PRT（SEQ ID NO: 535），其中X21係M或R；X22係L、I、R或V；X23係Q、E、T、A或G；並且X24係T、I、L或Q。
  9. 如請求項8所述之抗體，其中X24係L。
  10. 如請求項5所述之抗體，其中 a) HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A、G或S； HCDR2包含胺基酸序列HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10（SEQ ID NO: 531），其中X2係I或V；X3係H、Y或Q；X4係T或S；X5係K、S或Q；X6係A、K或N；X7係N、S、K或R；X8係F或L；X9係E或K；並且X10係G、D、S或N；並且 HCDR3包含胺基酸序列X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV（SEQ ID NO: 532），其中X11係D或N；X12係A、I或T；X13係F、L或V；X14係S或T；並且X15係H、N或Y；並且 b) 該LV屬於VK1/O2/JK4或VK3/A27/JK1種系。
  11. 如請求項10所述之抗體，其中a) X1係A或G；X3係Q或Y，X4係T，X8係F，X14係T；並且X15係Y。
  12. 如請求項10或11所述之抗體，其中b) 該LV屬於VK1/O2/JK4種系。
  13. 如請求項10或11所述之抗體，其中 b)    該LV屬於VK1/O2/JK4種系並且包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且其中 LCDR1包含胺基酸序列RASQSISNYLN（SEQ ID NO: 132）、RASQSIISYLN（SEQ ID NO: 150）或RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 186）； LCDR2包含胺基酸序列AASSLHS（SEQ ID NO: 133）或AASSLRS（SEQ ID NO: 151）；並且 LCDR3包含胺基酸序列QQYQSYPLT（SEQ ID NO: 134）或QQYSNYPLT（SEQ ID NO: 152）； 或 b)    該LV屬於VK3/A27/JK1種系並且包含輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且其中 LCDR1包含胺基酸序列RASQSVSSYLG（SEQ ID NO: 168）； LCDR2包含胺基酸序列GASSRAT（SEQ ID NO: 169）；並且 LCDR3包含胺基酸序列QQYGSSPRT（SEQ ID NO: 170）。
  14. 如請求項13所述之抗體，其中LCDR1包含胺基酸序列RASQSISNYLN（SEQ ID NO: 132），LCDR2包含胺基酸序列AASSLHS（SEQ ID NO: 133），且LCDR3包含胺基酸序列QQYQSYPLT（SEQ ID NO: 134）。
  15. 如請求項10所述之抗體，其中 a)     HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWX1（SEQ ID NO: 530），其中X1係A或G， HCDR2包含胺基酸序列HX2YX3X4GX5TX6YNPX7X8X9X10（SEQ ID NO: 531），其中X2係I或V；X3係Y或Q；X4係T；X5係S；X6係K或N；X7係S或R；X8係F；X9係K；並且X10係G或D；並且 HCDR3包含胺基酸序列X11YDX12X13X14GX15SYYYYGMDV（SEQ ID NO: 532），其中X11係N；X12係T；X13係L或V；X14係T；並且X15係Y，並且 b)    該LV屬於VK1/O2/JK4種系。
  16. 如請求項15所述之抗體，其中 a)     HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWA（SEQ ID NO: 414）或RGGDYWG（SEQ ID NO: 408）； HCDR2包含胺基酸序列HVYYTGSTKYNPSFKD（SEQ ID NO: 427）、HVYYTGSTNYNPRFKD（SEQ ID NO: 445）、HIYQTGSTNYNPRFKG（SEQ ID NO: 415）或HVYQTGSTKYNPSFKD（SEQ ID NO: 409）；並且 HCDR3包含胺基酸序列NYDTLTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 410）或NYDTVTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 446）。
  17. 如請求項15或16所述之抗體，其中b) 該LV包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，並且其中LCDR1包含序列RASQSISSYLN（SEQ ID NO: 405）；LCDR2包含序列X39ARX40LX41S（SEQ ID NO: 536），其中X39係N、S、K或G；X40係R、K、L或A；並且X41係A、G或S；並且LCDR3包含序列QQX42X43X44X45PX46T（SEQ ID NO: 537），其中X42係Y或F，X43係R、A、S、G或Y；X44係S、K、R或H；X45係S、L、F、Y、P或M；並且X46係L、I或V。
  18. 如請求項17所述之抗體，其中X42係Y。
  19. 如請求項5-18中任一項所述之抗體，其中該HV的位置83處的胺基酸係N，並且該HV的位置85處的胺基酸係Y。
  20. 如請求項19所述之抗體，其中該LV的位置94處的胺基酸係S。
  21. 一種結合huCB1的分離的抗體，該抗體包含HV和LV，其中 a)     該HV包含CDRH1、CDRH2和CDRH3，其中 CDRH1包含胺基酸序列RGGDYWS（SEQ ID NO: 1）； CDRH2包含胺基酸序列HX25YX26X27GX28TX29YNPX30X31X32X33（SEQ ID NO: 538），其中X25係I或V；X26係Y或Q；X27係A、E、K或T；X28係S或Q；X29係A、E、K或T；X30係N或S；X31係F或L，X32係K或R；並且X33係G、S或N；並且 CDRH3包含胺基酸序列X34YDX35X36X37GYSYYYYGX38DV（SEQ ID NO: 539），其中X34係D或G；X35係A、I、T或V；X36係L或不存在；X37係S或T；並且X38係M或L；並且 b)    該LV屬於VK2/A19/JK1種系。
  22. 如請求項21所述之抗體，其中a) X26係Y，X34係G，X36不存在，並且X37係S。
  23. 如請求項21或22所述之抗體，其中b) 該LV包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中LCDR1包含胺基酸序列RSSQSLLHRSGYNYLD（SEQ ID NO: 257）；LCDR2包含胺基酸序列LGSNRAS（SEQ ID NO: 258）或QGSNRAS（SEQ ID NO: 264）；並且LCDR3包含胺基酸序列MQSLQTPRT（SEQ ID NO: 259）、RQSVALPRT（SEQ ID NO: 271）或RQARALPRT（SEQ ID NO: 265）。
  24. 如請求項21-23中任一項所述之抗體，其中該HV的位置83處的胺基酸係N，並且該HV的位置85處的胺基酸係Y。
  25. 如請求項24所述之抗體，其中該HV的位置79處的胺基酸係R。
  26. 如請求項21-25中任一項所述之抗體，其中該LV的位置94處的胺基酸係S，或位置76處的胺基酸係D，或兩者。
  27. 如請求項5-26中任一項所述之抗體，其中與HVYYTGSTNYNPRFKD（SEQ ID NO: 136）相比，該抗體的HCDR2包含5個或更少的突變。
  28. 如請求項27所述之抗體，其中與NYDTVTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 137）相比，該抗體的HCDR3包含3個或更少的突變。
  29. 如請求項5-26中任一項所述之抗體，其中與HVYYTGSTKYNPNFKG（SEQ ID NO: 8）相比，該抗體的HCDR2包含5個或更少的突變。
  30. 如請求項29所述之抗體，其中與DYDILTGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 9）相比，該抗體的HCDR3包含4個或更少的突變。
  31. 一種結合huCB1的分離的抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合分子包含含有HCDR1、HCDR2和HCDR3的HV和含有LCDR1、LCDR2和LCDR3的LV，其中HCDR1包含胺基酸序列RGGDYWS（SEQ ID NO :474）或RGGDYWN（SEQ ID NO: 480），HCDR2包含胺基酸序列HIYYSGSTNYNPSLRS（SEQ ID NO: 475）、HIYYSGSKNYNPSLKS（SEQ ID NO: 481）或HIYYTGTKYYNPSLKS（SEQ ID NO: 487），並且HCDR3包含胺基酸序列DYDILYGYSYYYYGLDV（SEQ ID NO: 476）或GYDSSGYSYYYYGMDV（SEQ ID NO: 475），並且其中LCDR1包含胺基酸序列RSSQSLLHRSGYNYLD（SEQ ID NO: 471）、RSSQSLLYSNGHNFLD（SEQ ID NO: 477）或RSSQSLLYSNGHNYLD（SEQ ID NO: 483），LCDR2包含胺基酸序列LGSNRAS（SEQ ID NO: 472）或LGSNRAP（SEQ ID NO: 484），並且LCDR3包含胺基酸序列MQSLQTPRT（SEQ ID NO: 473）或MQALQTPRT（SEQ ID NO: 479）。
  32. 如請求項31所述之抗體，其中該HV包含胺基酸序列SEQ ID NO: 489、SEQ ID NO: 491或SEQ ID NO: 493，並且該LV包含胺基酸序列SEQ ID NO: 490、SEQ ID NO: 492或SEQ ID NO: 494。
  33. 如請求項5或21所述之抗體，其中該重鏈中根據AHo編號的位置32處的胺基酸係R。
  34. 如請求項1-33中任一項所述之抗體，其中該抗體係單株抗體。
  35. 如請求項34所述之抗體，其中該單株抗體係嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
  36. 如請求項34或35所述之抗體，其中該單株抗體係huCB1的拮抗劑抗體。
  37. 如請求項34或35所述之抗體，其中該單株抗體係huCB1的反向促效劑抗體。
  38. 如請求項36或37所述之抗體，其中該抗體與包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 256的重鏈可變區和具有胺基酸序列SEQ ID NO: 255的輕鏈可變區的抗體（10D10 LC N35Y）相比對huCB1的結合親和力高至少3倍。
  39. 如請求項36所述之抗體，其中如使用基於細胞的cAMP測定所確定的，該抗體具有10 nM或更低的IC50。
  40. 如請求項39所述之抗體，其中如使用基於細胞的cAMP測定所確定的，該抗體具有5 nM或更低、或1 nM或更低的IC50。
  41. 如請求項34-40中任一項所述之抗體，其中該單株抗體係人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
  42. 如請求項41所述之單株抗體，其中該單株抗體係人IgG1抗體，較佳的是人IgG1z抗體。
  43. 如請求項41或42所述之單株抗體，其中該抗體在其重鏈中根據EU編號的胺基酸位置N297處包含突變。
  44. 如請求項43所述之單株抗體，其中該突變係N297G。
  45. 如請求項43或44所述之單株抗體，其中該抗體在其重鏈中進一步包含根據EU編號的R292C和V302C突變。
  46. 如請求項41-45中任一項所述之單株抗體，其中該抗體在其重鏈中根據EU編號的胺基酸位置M252、S254和T256處包含突變。
  47. 如請求項46所述之單株抗體，其中該等突變係M252Y、S254T和T256E。
  48. 如請求項40所述之單株抗體，其中該抗體包含選自SEQ ID NO: 520-529的重鏈恒定區胺基酸序列和選自SEQ ID NO: 513-519的輕鏈恒定區胺基酸序列。
  49. 如請求項40所述之抗體，其中該抗體包含： i) SEQ ID NO: 525、526或527的重鏈恒定區胺基酸序列以及SEQ ID NO: 518或519的輕鏈恒定區胺基酸序列；或 ii) SEQ ID NO: 525、526或527的重鏈恒定區胺基酸序列以及SEQ ID NO: 518的輕鏈恒定區胺基酸序列。
  50. 一種藥物組成物，其包含如請求項1-49中任一項所述之抗體和藥學上可接受的賦形劑。
  51. 一種分離的多核苷酸，其編碼如請求項1-50中任一項所述之抗體。
  52. 一種表現載體，其包含如請求項51所述之多核苷酸。
  53. 一種宿主細胞，其包含如請求項52所述之表現載體。
  54. 一種產生結合huCB1的抗體之方法，該方法包括在允許該抗體表現的條件下培養如請求項53所述之宿主細胞並從培養基或該宿主細胞回收該抗體。
  55. 一種治療需要拮抗或反向激動CB1受體的受試者之方法，該方法包括向該受試者投與有效量的如請求項1-49中任一項所述之抗體或如請求項50所述之藥物組成物。
  56. 一種用於治療對拮抗或反向激動CB1受體有響應的受試者中的疾病或障礙之方法，該方法包括向該受試者投與如請求項1-49中任一項所述之抗體或如請求項50所述之藥物組成物。
  57. 如請求項55或56所述之方法，其中該CB1受體係周圍CB1受體。
  58. 如請求項57所述之方法，其中該投與導致體重減輕、食慾降低、代謝參數改善、血糖水平降低、胰島素水平降低、三酸甘油酯水平降低、腎損傷減少、腎纖維化減少、腎炎症減輕和腎功能改善中的一或多種。
  59. 如請求項57所述之方法，其中該疾病或障礙選自肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝性疾病、肝病、纖維化、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、原發性膽汁性肝硬化、腎臟疾病、腎纖維化、慢性腎病、IgA腎病、骨質疏鬆症、動脈粥樣硬化、心血管疾病、癌症、炎性疾病、及其組合。
  60. 一種用於治療有需要的受試者中的疾病或障礙之方法，該方法包括向該受試者投與如請求項1-49中任一項所述之抗體或如請求項50所述之藥物組成物，其中該疾病或障礙係肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝性疾病、肝病、纖維化、NASH、原發性膽汁性肝硬化、腎臟疾病、腎纖維化、慢性腎病、IgA腎病、骨質疏鬆症、動脈粥樣硬化、心血管疾病、癌症、炎性疾病或其組合。
  61. 如請求項60所述之方法，其中該疾病或障礙係肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝性疾病、肝病、NASH、腎臟疾病、腎纖維化、慢性腎病、或其組合。
  62. 如請求項60或61所述之方法，其中該投與導致體重減輕、食慾降低、代謝參數改善、血糖水平降低、胰島素水平降低、三酸甘油酯水平降低、腎損傷減少、腎纖維化減少、腎炎症減輕和腎功能改善中的一或多種。
  63. 如請求項54-62中任一項所述之方法，其中該受試者係人。
  64. 如請求項1-49中任一項所述之抗體或如請求項50所述之藥物組成物，用於在拮抗或反向激動周圍CB1受體中使用。
  65. 如請求項1-49中任一項所述之抗體或如請求項50所述之藥物組成物，用於在治療選自以下的疾病或障礙中使用：肥胖症、糖尿病、血脂異常、代謝性疾病、纖維化、肝病、NASH、原發性膽汁性肝硬化、腎臟疾病、腎纖維化、慢性腎病、IgA腎病、骨質疏鬆症、動脈粥樣硬化、心血管疾病、癌症、炎性疾病、及其組合。
  66. 如請求項64或65所述之抗體，其中該使用導致體重減輕、食慾降低、代謝參數改善、血糖水平降低、胰島素水平降低、三酸甘油酯水平降低、腎損傷減少、腎纖維化減少、腎炎症減輕和腎功能改善中的一或多種。
  67. 如請求項59或60所述之方法，或如請求項65所述之抗體，其中該疾病或障礙洗肥胖症。
  68. 如請求項67所述之方法或抗體，其中該受試者具有至少為27 kg/m 2的BMI。
  69. 如請求項68所述之方法或抗體，其中該受試者具有至少為30 kg/m 2的BMI。
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