CN105944100B - 针对组织因子途径抑制剂(tfpi)的单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
提供了结合人组织因子途径抑制剂(TFPI)的分离的单克隆抗体和编码其的分离的核酸分子。还提供了包含所述抗TFPI单克隆抗体的药物组合物和通过施用所述抗体来治疗凝结缺乏或缺陷的方法。还提供了生成所述抗体的方法。
Description
本申请是基于申请日为2009年8月4日，优先权日为2008年8月4日，申请号为200980134625.4，发明名称为：“针对组织因子途径抑制剂(TFPI)的单克隆抗体”的专利申请的分案申请。
序列表提交
与本申请有关的序列表经由EFS网以电子形式提交，并且在此通过提及而将其完整收入说明书中。含有序列表的文本文件的名称是MSB7329PCT_Sequence_Listing_ST25。
发明领域
提供了结合人组织因子途径抑制剂(TFPI)的分离的单克隆抗体及其片段和相关发明。
发明背景
血液凝结(blood coagulation)是血液形成稳定的凝块以使流血停止的过程。该过程牵涉血液中循环的许多酶原和辅因子原(或“凝结因子”)。那些酶原和辅因子原经由序贯地或同时将它们转化成活化形式的数种途径而相互作用。最后，所述过程导致在存在因子Va、离子钙、和血小板的情况中由激活的因子X(FXa)将凝血酶原激活为凝血酶。激活的凝血酶继而诱导血小板聚集，而且将血纤蛋白原转化成血纤蛋白，其然后被激活的因子XIII(FXIIIa)交联以形成凝块。
可以通过两种独特的途径来实施导致因子X激活的过程：接触激活途径(以前称为内源性途径)和组织因子途径(以前称为外源性途径)。先前认为，凝结级联由连接至共同途径的同等重要的两种途径组成。现在知道用于启动血液凝结的主要途径是组织因子途径。
因子X可以被与激活的因子VII(FVIIa)联合的组织因子(TF)激活。因子VIIa和其必需的辅因子TF的复合物是凝固(clotting)级联的一种有力的引发剂。
凝结的组织因子途径受组织因子途径抑制剂(“TFPI”)负控制。TFPI是FVIIa/TF复合物的一种天然的、FXa依赖性反馈抑制剂。它是多价Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的成员。在生理学上，TFPI结合激活的因子X(FXa)以形成异二聚体复合物，其随后与FVIIa/TF复合物相互作用以抑制其活性，如此关闭凝结的组织因子途径。原则上，阻断TFPI活性可以恢复FXa和FVIIa/TF活性，如此延长组织因子途径作用的持续时间，而且放大FXa的生成，所述FXa是血友病A和B的共同缺陷。
实际上，一些初步实验证据已经指明，通过针对TFPI的抗体来阻断TFPI活性使延长的凝结时间正常化或者缩短流血时间。例如，Nordfang等显示了血友病血浆的延长的稀释凝血酶原时间(dilute prothrombin time)在用针对TFPI的抗体处理血浆后正常化(Thromb.Haemost,1991,66(4):464-467)。类似地，Erhardtsen等显示了通过抗TFPI抗体显著缩短血友病A兔模型中的流血时间(Blood Coagulation and Fibrinolysis,1995,6:388-394)。这些研究提示了抗TFPI抗体对TFPI的抑制对于治疗血友病A或B可以是有用的。在这些研究中仅使用多克隆抗TFPI抗体。
使用杂交瘤技术，制备并鉴定针对重组人TFPI(rhTFPI)的单克隆抗体。参见Yang等,Chin.Med.J.,1998,111(8):718-721。测试了单克隆抗体对稀释凝血酶原时间(PT)和激活部分促凝血酶原激酶时间(APTT)的影响。实验显示了抗TFPI单克隆抗体缩短因子IX缺乏型血浆的稀释促凝血酶原激酶凝结时间。提示了组织因子途径不仅在生理学凝结而且在血友病出血中发挥重要作用(Yang等,Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao,1997,22(4):297-300)。
Kjalke等的美国专利号7,015,194披露了包含FVIIa和TFPI抑制剂(包括多克隆或单克隆抗体或其片段)的组合物，用于治疗或预防流血事件或凝结处理。还披露了此类组合物在正常哺乳动物血浆中减少凝结时间的用途。进一步提示了，所披露的FVIIa和TFPI抑制剂的组合物中可以包含因子VIII或其变体。没有提示FVIII或因子IX与TFPI单克隆抗体的组合。
在治疗血友病外，还已经提示了可以使用TFPI抑制剂(包括多克隆或多克隆抗体)来进行癌症治疗(参见Hung的美国专利号5,902,582)。
因而，需要对TFPI特异性的抗体来治疗血液学疾病和癌症。
一般而言，已经使用遗传工程来创建鼠的、嵌合的、人源化的或完全人的抗体以生成用于人疾病的治疗性抗体。显示了鼠单克隆抗体作为治疗剂具有有限的用途，这是由于短的血清半衰期、不能触发人效应器功能、和人抗小鼠抗体的生成。Brekke和Sandlie,“Therapeutic Antibodies for Human Diseases at the Dawn of the Twenty-firstCentury,”Nature 2,53,52-62(2003年1月)。已经显示了嵌合抗体引起人抗嵌合抗体应答。人源化抗体进一步使抗体的小鼠构件最小化。然而，完全人抗体完全避免与鼠元件有关的免疫原性。如此，需要开发完全人抗体以避免与其它形式的遗传工程化单克隆抗体有关的免疫原性。特别地，若使用具有鼠构件或鼠起源的抗体，则诸如用抗TFPI单克隆抗体的血友病治疗会需要的长期(chronic)预防处理具有形成对该治疗的免疫应答的高风险，这是由于需要的频繁剂量给药和长的疗法持续时间。例如，血友病A的抗体疗法可以每周需要剂量给药，持续患者一生。这对免疫系统会是连续的考验。如此，需要用于血友病和相关的遗传性和获得性凝结缺乏或缺陷的抗体疗法的完全人抗体。
已经经由由Koehler和Milstein在“Continuous Cultures of Fused CellsSecreting Antibody of Predefined Specificity,”Nature 256,495-497(1975)中所描述的杂交瘤技术来生成治疗性抗体。也可以在原核生物和真核生物中重组生成完全人抗体。治疗性抗体优选抗体在宿主细胞中的重组生成而不是杂交瘤生成。重组生成具有如下的优点，即较大的产物一致性、可能地较高的生产水平、和受控制的制备，其使动物衍生的蛋白质的存在最小化或消除动物衍生的蛋白质的存在。出于这些原因，想要具有重组生成的单克隆抗TFPI抗体。
发明概述
提供了针对人组织因子途径抑制剂(TFPI)的单克隆抗体。进一步提供了编码其的分离的核酸分子。还提供了包含抗TFPI单克隆抗体的药物组合物和治疗遗传性和获得性凝结缺乏或缺陷诸如血友病A和B的方法。还提供了通过对有所需要的患者施用抗TFPI单克隆抗体来缩短流血时间的方法。还提供了用于生成依照本发明的结合人TFPI的单克隆抗体的方法。
具体的，本发明涉及以下项：
1.一种分离的单克隆抗体，其结合人组织因子途径抑制剂，其中所述抗体包含CDR3，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:388-430的氨基酸序列。
2.项1的分离的抗体，其中所述抗体进一步包含(a)CDR1，其包含选自SEQ ID NO:302-344的氨基酸序列，(b)CDR2，其包含选自SEQ ID NO:345-387的氨基酸序列，或(c)包含选自SEQ ID NO:302-344的氨基酸序列的CDR1和包含选自SEQ ID NO:345-387的氨基酸序列的CDR2两者。
3.一种分离的单克隆抗体，其结合人组织因子途径抑制剂，其中所述抗体包含CDR3，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:259-301的氨基酸序列。
4.项3的分离的抗体，其中所述抗体进一步包含(a)CDR1，其包含选自SEQ ID NO:173-215的氨基酸序列，(b)CDR2，其包含选自SEQ ID NO:216-258的氨基酸序列，或(c)包含选自SEQ ID NO:173-215的氨基酸序列的CDR1和包含选自SEQ ID NO:216-258的氨基酸序列的CDR2两者。
5.项1的抗体，其中所述抗体进一步包含CDR3，所述CDR3包含选自SEQID NO:259-301的氨基酸序列。
6.项5的抗体，其中所述抗体进一步包含(a)CDR1，其包含选自SEQ IDNO:302-344的氨基酸序列，(b)CDR2，其包含选自SEQ ID NO:345-387的氨基酸序列，(c)CDR1，其包含选自SEQ ID NO:173-215的氨基酸序列，和(d)CDR2，其包含选自SEQ ID NO:216-258的氨基酸序列。
7.项1的抗体，其中所述抗体包含重链和轻链可变区，其包含：
(a)包含含有SEQ ID NO:173、216和259的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:302、345和388的氨基酸序列的重链可变区；
(b)包含含有SEQ ID NO:174、217和260的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:303、346和389的氨基酸序列的重链可变区；
(c)包含含有SEQ ID NO:175、218和261的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:304、347和390的氨基酸序列的重链可变区；
(d)包含含有SEQ ID NO:176、219和262的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:305、348和391的氨基酸序列的重链可变区；
(e)包含含有SEQ ID NO:177、220和263的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:306、349和392的氨基酸序列的重链可变区；
(f)包含含有SEQ ID NO:178、221和264的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:307、350和393的氨基酸序列的重链可变区；
(g)包含含有SEQ ID NO:179、222和265的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:308、351和394的氨基酸序列的重链可变区；
(h)包含含有SEQ ID NO:180、223和266的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:309、352和395的氨基酸序列的重链可变区；
(i)包含含有SEQ ID NO:181、224和267的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:310、353和396的氨基酸序列的重链可变区；
(j)包含含有SEQ ID NO:182、225和268的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:311、354和397的氨基酸序列的重链可变区；
(k)包含含有SEQ ID NO:183、226和269的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:312、355和398的氨基酸序列的重链可变区；
(l)包含含有SEQ ID NO:184、227和270的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:313、356和399的氨基酸序列的重链可变区；
(m)包含含有SEQ ID NO:185、228和271的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:314、357和400的氨基酸序列的重链可变区；
(n)包含含有SEQ ID NO:186、229和272的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:315、358和401的氨基酸序列的重链可变区；
(o)包含含有SEQ ID NO:187、230和273的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:316、359和402的氨基酸序列的重链可变区；
(p)包含含有SEQ ID NO:188、231和274的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:317、360和403的氨基酸序列的重链可变区；
(q)包含含有SEQ ID NO:189、232和275的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:318、361和404的氨基酸序列的重链可变区；
(r)包含含有SEQ ID NO:190、233和276的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:319、362和405的氨基酸序列的重链可变区；
(s)包含含有SEQ ID NO:191、234和277的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:320、363和406的氨基酸序列的重链可变区；
(t)包含含有SEQ ID NO:192、235和278的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:321、364和407的氨基酸序列的重链可变区；
(u)包含含有SEQ ID NO:193、236和279的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:322、365和408的氨基酸序列的重链可变区；
(v)包含含有SEQ ID NO:194、237和280的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:323、366和409的氨基酸序列的重链可变区；
(w)包含含有SEQ ID NO:195、238和281的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:324、367和410的氨基酸序列的重链可变区；
(x)包含含有SEQ ID NO:196、239和282的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:325、368和411的氨基酸序列的重链可变区；
(y)包含含有SEQ ID NO:197、240和283的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:326、369和412的氨基酸序列的重链可变区；
(z)包含含有SEQ ID NO:198、241和284的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:327、370和413的氨基酸序列的重链可变区；
(aa)包含含有SEQ ID NO:199、242和285的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:328、371和414的氨基酸序列的重链可变区；
(bb)包含含有SEQ ID NO:200、243和286的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:329、372和415的氨基酸序列的重链可变区；
(cc)包含含有SEQ ID NO:201、244和287的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:330、373和416的氨基酸序列的重链可变区；
(dd)包含含有SEQ ID NO:202、245和288的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:331、374和417的氨基酸序列的重链可变区；
(ee)包含含有SEQ ID NO:203、246和289的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:332、375和418的氨基酸序列的重链可变区；
(ff)包含含有SEQ ID NO:204、247和290的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:333、376和419的氨基酸序列的重链可变区；
(gg)包含含有SEQ ID NO:205、248和291的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:334、377和420的氨基酸序列的重链可变区；
(hh)包含含有SEQ ID NO:206、249和292的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:335、378和421的氨基酸序列的重链可变区；
(ii)包含含有SEQ ID NO:207、250和293的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:336、379和422的氨基酸序列的重链可变区；
(jj)包含含有SEQ ID NO:208、251和294的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:337、380和423的氨基酸序列的重链可变区；
(kk)包含含有SEQ ID NO:209、252和295的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:338、381和424的氨基酸序列的重链可变区；
(ll)包含含有SEQ ID NO:210、253和296的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:339、382和425的氨基酸序列的重链可变区；
(mm)包含含有SEQ ID NO:211、254和297的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:340、383和426的氨基酸序列的重链可变区；
(nn)包含含有SEQ ID NO:212、255和298的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:341、384和427的氨基酸序列的重链可变区；
(oo)包含含有SEQ ID NO:213、256和299的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:342、385和428的氨基酸序列的重链可变区；
(pp)包含含有SEQ ID NO:214、257和300的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:343、386和429的氨基酸序列的重链可变区；
(qq)包含含有SEQ ID NO:215、258和301的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:344、387和430的氨基酸序列的重链可变区；
或
(rr)包含含有SEQ ID NO:194、237和280的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:335、378和421的氨基酸序列的重链可变区。
8.项1的单克隆抗体，其包含：
(a)具有多肽序列SEQ ID NO:2的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:4的重链可变区；
(b)具有多肽序列SEQ ID NO:6的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:8的重链可变区；
(c)具有多肽序列SEQ ID NO:10的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:12的重链可变区；
(d)具有多肽序列SEQ ID NO:14的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:16的重链可变区；
(e)具有多肽序列SEQ ID NO:18的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:20的重链可变区；
(f)具有多肽序列SEQ ID NO:22的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:24的重链可变区；
(g)具有多肽序列SEQ ID NO:26的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:28的重链可变区；
(h)具有多肽序列SEQ ID NO:30的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:32的重链可变区；
(i)具有多肽序列SEQ ID NO:34的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:36的重链可变区；
(j)具有多肽序列SEQ ID NO:38的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:40的重链可变区；
(k)具有多肽序列SEQ ID NO:42的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:44的重链可变区；
(l)具有多肽序列SEQ ID NO:46的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:48的重链可变区；
(m)具有多肽序列SEQ ID NO:50的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:52的重链可变区；
(n)具有多肽序列SEQ ID NO:54的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:56的重链可变区；
(o)具有多肽序列SEQ ID NO:58的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:60的重链可变区；
(p)具有多肽序列SEQ ID NO:62的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:64的重链可变区；
(q)具有多肽序列SEQ ID NO:66的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:68的重链可变区；
(r)具有多肽序列SEQ ID NO:70的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:72的重链可变区；
(s)具有多肽序列SEQ ID NO:74的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:76的重链可变区；
(t)具有多肽序列SEQ ID NO:78的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:80的重链可变区；
(u)具有多肽序列SEQ ID NO:82的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:84的重链可变区；
(v)具有多肽序列SEQ ID NO:86的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:88的重链可变区；
(w)具有多肽序列SEQ ID NO:90的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:92的重链可变区；
(x)具有多肽序列SEQ ID NO:94的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:96的重链可变区；
(y)具有多肽序列SEQ ID NO:98的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:100的重链可变区；
(z)具有多肽序列SEQ ID NO:102的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:104的重链可变区；
(aa)具有多肽序列SEQ ID NO:106的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:108的重链可变区；
(bb)具有多肽序列SEQ ID NO:110的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:112的重链可变区；
(cc)具有多肽序列SEQ ID NO:114的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:116的重链可变区；
(dd)具有多肽序列SEQ ID NO:118的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:120的重链可变区；
(ee)具有多肽序列SEQ ID NO:122的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:124的重链可变区；
(ff)具有多肽序列SEQ ID NO:126的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:128的重链可变区；
(gg)具有多肽序列SEQ ID NO:130的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:132的重链可变区；
(hh)具有多肽序列SEQ ID NO:134的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:136的重链可变区；
(ii)具有多肽序列SEQ ID NO:138的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:140的重链可变区；
(jj)具有多肽序列SEQ ID NO:142的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:144的重链可变区；
(kk)具有多肽序列SEQ ID NO:146的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:148的重链可变区；
(ll)具有多肽序列SEQ ID NO:150的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:152的重链可变区；
(mm)具有多肽序列SEQ ID NO:154的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:156的重链可变区；
(nn)具有多肽序列SEQ ID NO:158的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:160的重链可变区；
(oo)具有多肽序列SEQ ID NO:162的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:164的重链可变区；
(pp)具有多肽序列SEQ ID NO:166的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:168的重链可变区；
(qq)具有多肽序列SEQ ID NO:170的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:172的重链可变区；或
(rr)具有多肽序列SEQ ID NO:86的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:136的重链可变区。
9.一种分离的单克隆抗体，其结合人组织因子途径抑制剂，其中所述抗体包含人重链可变区，其包含与选自下组的氨基酸序列具有至少96％同一性的氨基酸序列：SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:100、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:140、SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:168、和SEQ ID NO:172中所列出的氨基酸序列。
10.一种分离的单克隆抗体，其结合人组织因子途径抑制剂，其中所述抗体包含人轻链可变区，其包含与选自下组的氨基酸序列具有至少97％同一性的氨基酸序列：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:94、SEQ IDNO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:138、SEQ IDNO:142、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:166、和SEQ ID NO:170中所列出的氨基酸序列。
11.项1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10的抗体，其中所述抗体选自下组：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD、和IgE抗体。
12.项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的抗体，其中在存在所述抗体的情况中的血液凝固时间是缩短的，如通过稀释凝血酶原时间所测量的。
13.项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11的抗体，其是抗体片段或单链抗体。
14.药物组合物，其包含治疗有效量的项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的单克隆抗体和药学可接受载体。
15.一种用于治疗遗传性和获得性凝结缺乏或缺陷的方法，包括对患者施用治疗有效量的项14的药物组合物。
16.项15的方法，其中所述方法治疗血友病A或B。
17.一种用于缩短流血时间的方法，包括对患者施用治疗有效量的项14的药物组合物。
18.一种用于治疗遗传性和获得性凝结缺乏的方法，包括施用(a)第一量的结合人组织因子途径抑制剂的单克隆抗体和(b)第二量的因子VIII或因子IX，其中所述第一和第二量在一起对于治疗所述缺乏或缺陷是有效的，且进一步其中因子VII不是共施用的。
19.药物组合物，其包含治疗有效量的(a)项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13的单克隆抗体和(b)因子VIII或因子IX的组合；其中所述组合物不含因子VII。
20.一种用于治疗遗传性和获得性凝结缺乏或缺陷的方法，包括对有所需要的患者施用治疗有效量的项19的药物组合物。
21.一种用于缩短流血时间的方法，包括对患者施用治疗有效量的项19的药物组合物。
22.一种针对人组织因子途径抑制剂的分离的完全人单克隆抗体。
23.药物组合物，其包含治疗有效量的项22的单克隆抗体和药学可接受载体。
24.一种用于治疗遗传性和获得性凝结缺乏或缺陷的方法，包括对患者施用治疗有效量的项23的药物组合物。
25.项24的方法，进一步包括施用因子VIII或因子IX。
26.一种分离的核酸分子，其编码结合人组织因子途径抑制剂的抗体，其中所述抗体包含CDR3，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:388-430的氨基酸序列。
27.一种分离的核酸分子，其编码结合人组织因子途径抑制剂的抗体，其中所述抗体包含CDR3，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:259-301的氨基酸序列。
28.一种用于生成结合人组织因子途径抑制剂的完全人单克隆抗体的方法，包括：
(i)将编码所述完全人单克隆抗体的核苷酸序列转染入宿主细胞中，并
(ii)培养所述宿主细胞以表达所述单克隆抗体。
29.项28的方法，其中所述单克隆抗体包含CDR3，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:388-430的氨基酸序列。
30.一种用于生成结合人组织因子途径抑制剂的单克隆抗体的方法，包括：
(i)将编码所述单克隆抗体的核苷酸序列转染入宿主细胞中，并
(ii)培养所述宿主细胞以表达所述单克隆抗体，
其中所述单克隆抗体包含CDR3，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:259-301的氨基酸序列。
31.项29的方法，其中所述单克隆抗体包含含有选自SEQ ID NO:388-430的氨基酸序列的重链CDR3和含有选自SEQ ID NO:259-301的氨基酸序列的轻链CDR3。
32.一种针对人组织因子途径抑制剂的Kunitz域2的分离的完全人单克隆抗体。
33.药物组合物，其包含治疗有效量的项32的单克隆抗体和药学可接受载体。
34.一种用于治疗遗传性和获得性凝结缺乏或缺陷的方法，包括对患者施用治疗有效量的项33的药物组合物。
35.项34的方法，进一步包括施用因子VII、因子VIII或因子IX。
附图简述
图1：通过淘选和筛选选择的Fab的代表性例子对人TFPI(“h-TFPI”)和小鼠TFPI(“m-TFPI”)的结合活性。测试针对雌二醇-BSA(“EsB”)的对照Fab和通过淘选TFPI选择的12种Fab(1-4和6-13)。Y轴表示ELISA结果的荧光单位。
图2：通过淘选和筛选人抗体文库获得的4种代表性抗TFPI抗体(4B7:TP-4B7、2A8:TP-2A8、2G6:TP-2G6、2G7:TP-2G7)的剂量依赖性体外功能活性，如通过其缩短的dPT所显示的。实验包括掺入TFPI消减的血浆中的0.5ug/mL mTFPI。
图3：抗TFPI Fab，即Fab-2A8(来自TP-2A8)的体外功能活性，如ROTEM测定法中所测试的。
图4：克隆TP-2G6(“2G6”)转化为IgG后对人TFPI和小鼠TFPI的结合活性。Δ：IgG-2G6结合小鼠TFPI；□：IgG-2G6结合人TFPI；▲：对照IgG结合小鼠TFPI；■：对照IgG结合人IgG。
图5：抗TFPI抗体TP-2A8(“2A8”)、TP-3G1(“3G1”)、和TP-3C2(“3C2”)缩短血友病A小鼠中的全血凝固时间，如ROTEM测定法中所测试的。每个点代表一个单独的血友病A小鼠。
图6：抗TFPI单克隆抗体TP-2A10(SEQ ID NO:18)、TP-2B1(SEQ ID NO:22)、TP-2A2(SEQ ID NO:2)、TP-2G2(SEQ ID NO:66)、TP-2A5.1(SEQ ID NO:6)、TP-3A3(SEQ ID NO:98)、TP-2A8(SEQ ID NO:14)、TP-2B8(SEQ ID NO:34)、TP-2G7(SEQ ID NO:82)、TP-4H8(SEQID NO:170)、TP-2G4(SEQ ID NO:70)、TP-3F2(SEQ ID NO:134)、TP-2A6(SEQ ID NO:10)、TP-3A2(SEQ ID NO:94)、TP-2C1(SEQ ID NO:42)、TP-3E1(SEQ ID NO:126)、TP-3F1(SEQ IDNO:130)、TP-3D3(SEQ ID NO:122)、TP-4A7(SEQ ID NO:150)、TP-4G8(SEQ ID NO:166)、TP-2B3(SEQ ID NO:26)、TP-2F9(SEQ ID NO:62)、TP-2G5(SEQ ID NO:74)、TP-2G6(SEQ ID NO:78)、TP-2H10(SEQ ID NO:90)、TP-2B9(SEQ ID NO:38)、TP-2C7(SEQ ID NO:46)、TP-3G3(SEQ ID NO:142)、TP-3C2(SEQ ID NO:114)、TP-3B4(SEQ ID NO:110)、TP-2E5(SEQ ID NO:58)、TP-3C3(SEQ ID NO:118)、TP-3G1(SEQ ID NO:138)、TP-2D7(SEQ ID NO:50)、TP-4B7(SEQ ID NO:158)、TP-2E3(SEQ ID NO:54)、TP-2G9(SEQ ID NO:86)、TP-3C1(SEQ ID NO:86)、TP-3A4(SEQ ID NO:102)、TP-2B4(SEQ ID NO:30)、TP-3H2(SEQ ID NO:146)、TP-4A9(SEQ ID NO:154)、TP-4E8(SEQ ID NO:162)、和TP-3B3(SEQ ID NO:106)的可变轻链之间的氨基酸序列比对。
图7：抗TFPI单克隆抗体TP-2A10(SEQ ID NO:20)、TP-3B3(SEQ ID NO:108)、TP-2G4(SEQ ID NO:72)、TP-2A5.1(SEQ ID NO:8)、TP-4A9(SEQ ID NO:156)、TP-2A8(SEQ IDNO:16)、TP-2B3(SEQ ID NO:28)、TP-2B9(SEQID NO:40)、TP-2H10(SEQ ID NO:92)、TP-3B4(SEQ ID NO:112)、TP-2C7(SEQ ID NO:48)、TP-2E3(SEQ ID NO:56)、TP-3C3(SEQ ID NO:120)、TP-2G5(SEQ ID NO:76)、TP-4B7(SEQ ID NO:160)、TP-2G6(SEQ ID NO:80)、TP-3C2(SEQ ID NO:116)、TP-2D7(SEQ ID NO:52)、TP-3G1(SEQ ID NO:140)、TP-2E5(SEQ ID NO:60)、TP-2B8(SEQ ID NO:36)、TP-3F1(SEQ ID NO:132)、TP-3A3(SEQ ID NO:100)、TP-4E8(SEQ ID NO:164)、TP-4A7(SEQ ID NO:152)、TP-4H8(SEQ ID NO:172)、TP-2A6(SEQ ID NO:12)、TP-2C1(SEQ ID NO:44)、TP-3G3(SEQ ID NO:144)、TP-2B1(SEQ ID NO:24)、TP-2G7(SEQ ID NO:84)、TP-3H2(SEQ ID NO:148)、TP-2A2(SEQ ID NO:4)、TP-3E1(SEQ ID NO:128)、TP-2G2(SEQ ID NO:68)、TP-3D3(SEQ ID NO:124)、TP-2G9(SEQ ID NO:88)、TP-2B4(SEQ ID NO:32)、TP-3A2(SEQ ID NO:96)、TP-2F9(SEQ ID NO:64)、TP-3A4(SEQ ID NO:104)、TP-3C1(SEQ ID NO:136)、TP-3F2(SEQ ID NO:136)、和TP-4G8(SEQ ID NO:168)的可变重链之间的氨基酸序列比对。
图8：显示对用(1)抗TFPI抗体TP-2A8(“2A8”)、(2)2A8和重组因子VIII、(3)小鼠IgG、和(4)重组因子VIII处理的小鼠进行尾静脉横断后24小时里的存活率的图。
图9：显示用抗TFPI抗体TP-2A8(“2A8”)、因子VIIa、和2A8和因子VIIa的组合处理的小鼠的凝固时间和凝块形成时间测定法的图。
图10：显示与单独的FVIII抑制剂相比用FVIII抑制剂及抗TFPI抗体TP-2A8(“2A8”)和抗TFPI抗体TP-4B7(“4B7”)处理的正常人血液的凝固时间的图。
发明详述
定义
如本文中所使用的，术语“组织因子途径抑制剂”或“TFPI”指由细胞天然表达的人TFPI的任何变体、同等型和物种同系物。在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的抗体对TFPI的结合减少血液凝固时间。
如本文中所使用的，“抗体”指整个抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。该术语包括天然存在的或由正常的免疫球蛋白基因片段重组过程形成的全长免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)，或免疫球蛋白分子中保留特异性结合活性的免疫学活性部分诸如抗体片段。不管结构，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。例如，抗TFPI单克隆抗体片段结合TFPI的表位。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体的术语“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的例子包括(i)Fab片段，即一种由VL、VH、CL和CH1域构成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即一种包含由铰链区处的二硫化物桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1域构成；(iv)Fv片段，其由抗体的单条臂的VL和VH域构成，(v)dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH域构成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个域，即VL和VH是由不同基因编码的，但是可以使用重组方法通过合成的接头来连接它们，所述合成的接头使它们能够作为单条蛋白质链生成，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；及Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也意图涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。使用对于本领域技术人员已知的常规技术来获得这些抗体片段，并以与完整的抗体相同的方式来对片段筛选功效。
如本文中所使用的，术语“抑制结合”和“阻断结合”(例如，指抑制/阻断TFPI配体对TFPI的结合)可互换使用，涵盖部分和完全抑制或阻断两者。抑制和阻断还意图包括与不与抗TFPI抗体接触的TFPI相比在与抗TFPI抗体接触时TFPI对生理学底物的结合亲和力的任何可测量降低，例如阻断TFPI与因子Xa的相互作用或者阻断TFPI-因子Xa复合物与组织因子、因子VIIa或组织因子/因子VIIa的复合物的相互作用达至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。
如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一分子组成的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物展示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因而，术语“人单克隆抗体”指具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变区和恒定区的展示单一结合特异性的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或者通过体内体细胞突变引入的突变)。
如本文中所使用的，“分离的抗体”意图指基本上没有具有不同抗原性特异性的其它抗体的抗体(例如结合TFPI的分离的抗体基本上没有结合与TFPI不同的抗原的抗体)。然而，结合人TFPI的表位、同等型或变体的分离的抗体可以具有与其它相关抗原(例如来自其它物种的(例如TFPI物种同系物))的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上没有其它细胞材料和/或化学物。
如本文中所使用的，“特异性结合”指抗体对预定抗原的结合。典型地，抗体以至少约105M-1的亲和力结合，而且以比其结合与预定抗原或紧密相关抗原不同的无关抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力高(例如大至少两倍)的亲和力结合预定抗原。短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。
如本文中所使用的，关于IgG抗体的术语“高亲和力”指至少约107M-1、在一些实施方案中至少约108M-1、在一些实施方案中至少约109M-1、1010M-1、1011M-1或更大，例如多至1013M-1或更大的结合亲和力。然而，对于其它抗体同种型，“高亲和力”结合可以有所变化。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合指至少约1.0x 107M-1的结合亲和力。如本文中所使用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如IgM或IgG1)。
“互补决定区”或“CDR”指抗体分子的重链可变区或轻链可变区内形成与结合的抗原的三维结构互补的N端抗原结合表面的三个高变区之一。从重链或轻链的N端出发，这些互补决定区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。CDR牵涉抗原-抗体结合，而且CDR3包含对于抗原-抗体结合特异性的独特区域。因此，抗原结合位点可以包括6个CDR，其包含来自各个重链和轻链V区的CDR区。
如本文中所使用的，“保守取代”指牵涉用一种或多种氨基酸取代具有相似生物化学特性的氨基酸且不导致多肽的生物学或生物化学功能损失的多肽修饰。“保守氨基酸取代”指用具有相似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基的。本领域中已经限定了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、beta-分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。涵盖的是，本发明的抗体可以具有保守的氨基酸取代，而且仍保留活性。
对于核酸和多肽，术语“实质的同源性”(substantial homology)指明在最佳比对和比较时两个核酸或两个多肽或其指定序列在至少约80％的核苷酸或氨基酸，通常至少约85％，优选地约90％、91％、92％、93％、94％、或95％，更优选地至少约96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、或99.5％的核苷酸或氨基酸中是相同的，具有适当的核苷酸或氨基酸插入或缺失。或者，区段会在选择性杂交条件下与该链的互补物杂交时存在核酸的实质同源性。本发明包括与本文中所列举的特定核酸序列和氨基酸序列具有实质同源性的核酸序列和多肽序列。
两个序列间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置总数x 100)，其考虑缺口的数目和每个缺口的长度，它们需要被引入以进行两个序列的最佳比对。可以使用数学算法(诸如不限于VectorNTITM(InvitrogenCorp.,Carlsbad,CA)的AlignXTM模块)来实现两个序列间的序列比较和百分比同一性测定。对于AlignXTM，多重比对的缺省参数是：缺口开放罚分：10；缺口延伸罚分：0.05；缺口分开罚分范围：8；比对延迟的％同一性：40。(进一步的详情参见http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/LINNEA-Online-Guides/LINNEA-C ommunities/Vector-NTI-Community/Sequence-analysis-and-data-management-s oftware-for-PCs/AlignX-Module-for-Vector-NTI-Advance.reg.us.html)。
可以使用CLUSTALW计算机程序(Thompson等,Nucleic Acids Research,1994,2(22):4673-4680)来测定用于测定询问序列(本发明的序列)与主题序列之间的最好总体匹配的另一种方法(也称为全局序列比对)，所述CLUSTALW计算机程序基于Higgins等(Computer Applications in the Biosciences(CABIOS),1992,8(2):189-191)的算法。在序列比对中，询问和主题序列都是DNA序列。所述全局序列比对的结果按百分比同一性计。DNA序列的CLUSTALW比对中经由成对比对来计算百分比同一性所使用的优选参数是：矩阵＝IUB，k-元组＝1，顶部对角线的数目＝5，缺口罚分＝3，缺口开放罚分＝10，缺口延伸罚分＝0.1。对于多重比对，优选下列CLUSTALW参数：缺口开放罚分＝10，缺口延伸参数＝0.05；缺口分开罚分范围＝8；比对延迟的％同一性＝40。
核酸可以存在于全部细胞中、细胞溶胞物中，或者以部分纯化的或基本上纯的形式存在。核酸在纯化得离开与其在天然环境中正常相关的其它细胞成分时是“分离的”或“给予基本上纯的”。为了分离核酸，可以使用标准的技术诸如下列各项：碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域中公知的其它技术。
单克隆抗体
通过针对人TFPI淘选并筛选人抗体文库鉴定出44种TFPI结合抗体。对每种单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区测序，并鉴定它们的CDR区。表1中汇总了与每种单克隆抗体的这些区域对应的序列标识符数字(“SEQ ID NO”)。
表1。每种TFPI结合单克隆抗体的重链可变区(“VH”)和轻链可变区(“VL”)的序列标识符数字(“SEQ ID NO”)的汇总。还提供了每种重链和轻链的CDR区(“CDR1”、“CDR2”、和“CDR3”)的序列标识符数字。N.A.：核酸序列；A.A.：氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种结合人组织因子途径抑制剂的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含CDR3，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:388-430的氨基酸序列。这些CDR3是从淘选和筛选过程中鉴定的抗体的重链鉴定的。在又一个实施方案中，此抗体进一步包含(a)CDR1，其包含选自SEQ ID NO:302-344的氨基酸序列，(b)CDR2，其包含选自SEQID NO:345-387的氨基酸序列，或(c)包含选自SEQ ID NO:302-344的氨基酸序列的CDR1和包含选自SEQ ID NO:345-387的氨基酸序列的CDR2两者。
在另一个实施方案中，提供了共享来自淘选和筛选过程中鉴定的抗体的轻链之一的CDR3的抗体。如此，本发明涉及一种结合人组织因子途径抑制剂的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含CDR3，所述CDR3包含选自SEQ ID NO:259-301的氨基酸序列。在别的实施方案中，所述抗体进一步包含(a)CDR1，其包含选自SEQ ID NO:173-215的氨基酸序列，(b)CDR2，其包含选自SEQ ID NO:216-258的氨基酸序列，或(c)包含选自SEQ ID NO:173-215的氨基酸序列的CDR1和包含选自SEQ ID NO:216-258的氨基酸序列的CDR2两者。
在另一个实施方案中，抗体包含来自通过筛选和淘选鉴定的抗体的重链的CDR3和来自轻链的CDR3。如此，提供了一种结合人组织因子途径抑制剂的抗体，其中所述抗体包含含有选自SEQ ID NO:388-430的氨基酸序列的CDR3和含有选自SEQ ID NO:259-301的氨基酸序列的CDR3。在又一个实施方案中，所述抗体进一步包含(a)CDR1，其包含选自SEQ IDNO:302-344的氨基酸序列，(b)CDR2，其包含选自SEQ ID NO:345-387的氨基酸序列，(c)CDR1，其包含选自SEQ ID NO:173-215的氨基酸序列，和/或(d)CDR2，其包含选自SEQ IDNO:216-258的氨基酸序列。
在其它具体的实施方案中，所述抗体包含重链和轻链可变区，其包含：
(a)包含含有SEQ ID NO:173、216和259的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:302、345和388的氨基酸序列的重链可变区；
(b)包含含有SEQ ID NO:174、217和260的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:303、346和389的氨基酸序列的重链可变区；
(c)包含含有SEQ ID NO:175、218和261的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:304、347和390的氨基酸序列的重链可变区；
(d)包含含有SEQ ID NO:176、219和262的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:305、348和391的氨基酸序列的重链可变区；
(e)包含含有SEQ ID NO:177、220和263的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:306、349和392的氨基酸序列的重链可变区；
(f)包含含有SEQ ID NO:178、221和264的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:307、350和393的氨基酸序列的重链可变区；
(g)包含含有SEQ ID NO:179、222和265的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:308、351和394的氨基酸序列的重链可变区；
(h)包含含有SEQ ID NO:180、223和266的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:309、352和395的氨基酸序列的重链可变区；
(i)包含含有SEQ ID NO:181、224和267的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:310、353和396的氨基酸序列的重链可变区；
(j)包含含有SEQ ID NO:182、225和268的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:311、354和397的氨基酸序列的重链可变区；
(k)包含含有SEQ ID NO:183、226和269的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:312、355和398的氨基酸序列的重链可变区；
(l)包含含有SEQ ID NO:184、227和270的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:313、356和399的氨基酸序列的重链可变区；
(m)包含含有SEQ ID NO:185、228和271的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:314、357和400的氨基酸序列的重链可变区；
(n)包含含有SEQ ID NO:186、229和272的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:315、358和401的氨基酸序列的重链可变区；
(o)包含含有SEQ ID NO:187、230和273的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:316、359和402的氨基酸序列的重链可变区；
(p)包含含有SEQ ID NO:188、231和274的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:317、360和403的氨基酸序列的重链可变区；
(q)包含含有SEQ ID NO:189、232和275的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:318、361和404的氨基酸序列的重链可变区；
(r)包含含有SEQ ID NO:190、233和276的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:319、362和405的氨基酸序列的重链可变区；
(s)包含含有SEQ ID NO:191、234和277的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:320、363和406的氨基酸序列的重链可变区；
(t)包含含有SEQ ID NO:192、235和278的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:321、364和407的氨基酸序列的重链可变区；
(u)包含含有SEQ ID NO:193、236和279的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:322、365和408的氨基酸序列的重链可变区；
(v)包含含有SEQ ID NO:194、237和280的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:323、366和409的氨基酸序列的重链可变区；
(w)包含含有SEQ ID NO:195、238和281的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:324、367和410的氨基酸序列的重链可变区；
(x)包含含有SEQ ID NO:196、239和282的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:325、368和411的氨基酸序列的重链可变区；
(y)包含含有SEQ ID NO:197、240和283的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:326、369和412的氨基酸序列的重链可变区；
(z)包含含有SEQ ID NO:198、241和284的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:327、370和413的氨基酸序列的重链可变区；
(aa)包含含有SEQ ID NO:199、242和285的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:328、371和414的氨基酸序列的重链可变区；
(bb)包含含有SEQ ID NO:200、243和286的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:329、372和415的氨基酸序列的重链可变区；
(cc)包含含有SEQ ID NO:201、244和287的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:330、373和416的氨基酸序列的重链可变区；
(dd)包含含有SEQ ID NO:202、245和288的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:331、374和417的氨基酸序列的重链可变区；
(ee)包含含有SEQ ID NO:203、246和289的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:332、375和418的氨基酸序列的重链可变区；
(ff)包含含有SEQ ID NO:204、247和290的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:333、376和419的氨基酸序列的重链可变区；
(gg)包含含有SEQ ID NO:205、248和291的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:334、377和420的氨基酸序列的重链可变区；
(hh)包含含有SEQ ID NO:206、249和292的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:335、378和421的氨基酸序列的重链可变区；
(ii)包含含有SEQ ID NO:207、250和293的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:336、379和422的氨基酸序列的重链可变区；
(jj)包含含有SEQ ID NO:208、251和294的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:337、380和423的氨基酸序列的重链可变区；
(kk)包含含有SEQ ID NO:209、252和295的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:338、381和424的氨基酸序列的重链可变区；
(ll)包含含有SEQ ID NO:210、253和296的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:339、382和425的氨基酸序列的重链可变区；
(mm)包含含有SEQ ID NO:211、254和297的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:340、383和426的氨基酸序列的重链可变区；
(nn)包含含有SEQ ID NO:212、255和298的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:341、384和427的氨基酸序列的重链可变区；
(oo)包含含有SEQ ID NO:213、256和299的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:342、385和428的氨基酸序列的重链可变区；
(pp)包含含有SEQ ID NO:214、257和300的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:343、386和429的氨基酸序列的重链可变区；
(qq)包含含有SEQ ID NO:215、258和301的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:344、387和430的氨基酸序列的重链可变区；或
(rr)包含含有SEQ ID NO:194、237和280的氨基酸序列的轻链可变区和包含含有SEQ ID NO:335、378和421的氨基酸序列的重链可变区。
在另一个实施方案中，本发明涉及抗体，其包含：
(a)具有多肽序列SEQ ID NO:2的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:4的重链可变区；
(b)具有多肽序列SEQ ID NO:6的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:8的重链可变区；
(c)具有多肽序列SEQ ID NO:10的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:12的重链可变区；
(d)具有多肽序列SEQ ID NO:14的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:16的重链可变区；
(e)具有多肽序列SEQ ID NO:18的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:20的重链可变区；
(f)具有多肽序列SEQ ID NO:22的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:24的重链可变区；
(g)具有多肽序列SEQ ID NO:26的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:28的重链可变区；
(h)具有多肽序列SEQ ID NO:30的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:32的重链可变区；
(i)具有多肽序列SEQ ID NO:34的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:36的重链可变区；
(j)具有多肽序列SEQ ID NO:38的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:40的重链可变区；
(k)具有多肽序列SEQ ID NO:42的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:44的重链可变区；
(l)具有多肽序列SEQ ID NO:46的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:48的重链可变区；
(m)具有多肽序列SEQ ID NO:50的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:52的重链可变区；
(n)具有多肽序列SEQ ID NO:54的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:56的重链可变区；
(o)具有多肽序列SEQ ID NO:58的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:60的重链可变区；
(p)具有多肽序列SEQ ID NO:62的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:64的重链可变区；
(q)具有多肽序列SEQ ID NO:66的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:68的重链可变区；
(r)具有多肽序列SEQ ID NO:70的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:72的重链可变区；
(s)具有多肽序列SEQ ID NO:74的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:76的重链可变区；
(t)具有多肽序列SEQ ID NO:78的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:80的重链可变区；
(u)具有多肽序列SEQ ID NO:82的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:84的重链可变区；
(v)具有多肽序列SEQ ID NO:86的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:88的重链可变区；
(w)具有多肽序列SEQ ID NO:90的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:92的重链可变区；
(x)具有多肽序列SEQ ID NO:94的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:96的重链可变区；
(y)具有多肽序列SEQ ID NO:98的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:100的重链可变区；
(z)具有多肽序列SEQ ID NO:102的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:104的重链可变区；(aa)具有多肽序列SEQ ID NO:106的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:108的重链可变区；
(bb)具有多肽序列SEQ ID NO:110的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:112的重链可变区；
(cc)具有多肽序列SEQ ID NO:114的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:116的重链可变区；
(dd)具有多肽序列SEQ ID NO:118的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:120的重链可变区；
(ee)具有多肽序列SEQ ID NO:122的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:124的重链可变区；
(ff)具有多肽序列SEQ ID NO:126的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:128的重链可变区；
(gg)具有多肽序列SEQ ID NO:130的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:132的重链可变区；
(hh)具有多肽序列SEQ ID NO:134的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:136的重链可变区；
(ii)具有多肽序列SEQ ID NO:138的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:140的重链可变区；
(jj)具有多肽序列SEQ ID NO:142的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:144的重链可变区；
(kk)具有多肽序列SEQ ID NO:146的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:148的重链可变区；
(ll)具有多肽序列SEQ ID NO:150的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:152的重链可变区；
(mm)具有多肽序列SEQ ID NO:154的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:156的重链可变区；
(nn)具有多肽序列SEQ ID NO:158的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:160的重链可变区；
(oo)具有多肽序列SEQ ID NO:162的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:164的重链可变区；
(pp)具有多肽序列SEQ ID NO:166的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:168的重链可变区；
(qq)具有多肽序列SEQ ID NO:170的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:172的重链可变区；或
(rr)具有多肽序列SEQ ID NO:86的轻链可变区和具有多肽序列SEQ ID NO:136的重链可变区。
还提供了一种结合人组织因子途径抑制剂的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含人重链可变区，其包含与选自下组的氨基酸序列具有至少89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:100、SEQID NO:104、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:144、SEQID NO:148、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:168、和SEQ ID NO:172中所列出的氨基酸序列。
还提供了一种结合人组织因子途径抑制剂的分离的单克隆抗体，其中所述抗体包含人轻链可变区，其包含与选自下组的氨基酸序列具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或99.5％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58、SEQID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:82、SEQID NO:86、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:126、SEQ IDNO:130、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:166、和SEQ ID NO:170中所列出的氨基酸序列。
在依赖使用上文所讨论的序列标识符的抗体描述外，也可以通过参照本文中所描述的实验中分离的Fab克隆来描述一些实施方案。在一些实施方案中，重组抗体包含下列克隆的重链和/或轻链CDR3：TP-2A2、TP-2A5.1、TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8。在一些实施方案中，所述抗体可以进一步包含这些抗体的CDR2，而且仍进一步包含这些抗体的CDR1。在其它实施方案中，所述抗体可以进一步包含CDR的任何组合。
因而，在另一个实施方案中，提供了抗TFPI抗体，其包含：(1)人重链框架区、人重链CDR1区、人重链CDR2区、和人重链CDR3区，其中所述人重链CDR3区是TP-2A2、TP-2A5.1、TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8的重链CDR3；和(2)人轻链框架区、人轻链CDR1区、人轻链CDR2区、和人轻链CDR3区，其中所述人轻链CDR3区是TP-2A2、TP-2A5.1、TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8的轻链CDR3，其中所述抗体结合TFPI。抗体可以进一步包含TP-2A2、TP-2A5.1、TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8的重链CDR2和/或轻链CDR2。抗体可以进一步包含TP-2A2、TP-2A5.1、TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8的重链CDR1和/或轻链CDR1。
上文所描述的经工程化改造的抗体的CDR1、2、和/或3区可以包含精确的氨基酸序列，如本文中所公开的TP-2A2、TP-2A5.1、TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8的那些。
然而，普通熟练技术人员会领会，TP-2A2、TP-2A5.1、TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8的精确CDR序列的一些偏差可以是有可能的，只要仍保留抗体有效结合TFPI的能力。因而，在另一个实施方案中，经工程化改造的抗体可以由一个或多个CDR构成，所述CDR例如与TP-2A2、TP-2A5.1、TP-2A6、TP-2A8、TP-2A10、TP-2B1、TP-2B3、TP-2B4、TP-2B8、TP-2B9、TP-2C1、TP-2C7、TP-2D7、TP-2E3、TP-2E5、TP-2F9、TP-2G2、TP-2G4、TP-2G5、TP-2G6、TP-2G7、TP-2G9、TP-2H10、TP-3A2、TP-3A3、TP-3A4、TP-3B3、TP-3B4、TP-3C1、TP-3C2、TP-3C3、TP-3D3、TP-3E1、TP-3F1、TP-3F2、TP-3G1、TP-3G3、TP-3H2、TP-4A7、TP-4A9、TP-4B7、TP-4E8、TP-4G8、或TP-4H8的一个或多个CDR是至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的。
抗体可以是多种种类的抗体之任一种的，诸如但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌性IgA、IgD、和IgE抗体。
在一个实施方案中，提供了一种针对人组织因子途径抑制剂的分离的完全人单克隆抗体。
在另一个实施方案中，提供了针对人组织因子途径抑制剂的Kunitz域2的分离的完全人单克隆抗体。
核酸
还提供了编码上文所描述的任何单克隆抗体的分离的核酸分子。
制备针对TFPI的抗体的方法
可以通过在宿主细胞中表达编码依照本发明的实施方案的单克隆抗体的可变区的核苷酸序列来重组生成单克隆抗体。借助于表达载体，可以将含有所述核苷酸序列的核酸在适合于生成的宿主细胞中转染并表达。因而，还提供了一种用于生成与人TFPI结合的单克隆抗体的方法，包括：
(a)将编码本发明的单克隆抗体的核酸分子转染入宿主细胞中，
(b)培养所述宿主细胞以便在宿主细胞中表达所述单克隆抗体，和任选地
(c)分离并纯化所生成的单克隆抗体，其中所述核酸分子包含编码本发明的单克隆抗体的核苷酸序列。
在一个例子中，为了表达抗体或其抗体片段，将通过标准的分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中以使基因与转录和翻译控制序列可操作连接。在此背景中，术语“可操作连接”意图指将抗体基因连接入载体中以使载体内的转录和翻译控制序列服务其预期的调节抗体基因转录和翻译的功能。表达载体和表达控制序列选择为与所使用的表达宿主细胞相容。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分开的载体中，或者更典型地，将这两种基因都插入同一表达载体中。通过标准的方法来将抗体基因插入表达载体中(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补的限制性位点，或者若没有限制性位点存在，则为平端连接)。可以使用本文中所描述的抗体的轻链和重链可变区来创建任何抗体同种型的全长抗体基因，其通过将它们插入已经编码想要的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中以使VH区段与载体内的CH区段可操作连接并使VL区段与载体内的CL区段可操作连接来实现。另外/或者，重组表达载体可以编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可以将抗体链基因克隆入载体中以使信号肽以符合读码框方式与抗体链基因的氨基末端连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
在抗体链编码基因外，本发明的重组表达载体携带调节序列，其在宿主细胞中控制抗体链基因的表达。术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)，其控制抗体链基因的转录或翻译。此类调节序列记载于例如Goeddel；Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,SanDiego,Calif.(1990)。本领域技术人员会领会的是，表达载体的设计(包括调节序列的选择)可以取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、想要的蛋白质表达水平等因素。供哺乳动物宿主细胞表达用的调节序列的例子包括指导哺乳动物细胞中高水平的蛋白质表达的病毒元件，诸如自巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤衍生的启动子和/增强子。或者，可以使用非病毒调节序列，诸如泛素启动子或β-珠蛋白启动子。
在抗体链基因和调节序列外，重组表达载体可以携带别的序列，诸如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标志基因。选择标志基因促进已经导入载体的宿主细胞的选择(参见例如均为Axel等的美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，典型地，选择标志基因对已经导入载体的宿主细胞赋予对药物诸如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。选择标志基因的例子包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于通过甲氨蝶呤选择/扩增在dhfr-宿主细胞中使用)和neo基因(用于G418选择)。
对于轻链和重链的表达，通过标准的技术将编码重链和轻链的表达载体转染入宿主细胞中。术语“转染”的各种形式意图涵盖极其多种通常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖苷转染等。虽然理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是抗体在真核细胞，且最优选地哺乳动物宿主细胞中的表达是最优选的，这是因为此类真核细胞，且特别地哺乳动物细胞比原核细胞更有可能装配并分泌正确折叠且有免疫学活性的抗体。
用于表达重组抗体的哺乳动物宿主细胞的例子包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括与DHFR选择标志(例如如记载于R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601-621的)一起使用的dhfr-CHO细胞，其记载于Urlaub和Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-4220)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞、HKB11细胞和SP2细胞。在将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过培养宿主细胞达足以容许抗体在宿主细胞中表达或将抗体分泌入培养宿主细胞的培养基中的一段时间来生成抗体。可以使用标准的蛋白质纯化方法诸如超滤、大小排阻层析、离子交换层析和离心来从培养基回收抗体。
部分抗体序列表达完整抗体的用途
抗体主要经由位于6个重链和轻链CDR的氨基酸残基与靶抗原相互作用。出于此原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外部的序列在各抗体间更加多种多样。参见例如图6和图7，其中分别鉴定出依照本发明的单克隆抗体的轻和重可变链中的CDR区。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以有可能表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体，其通过构建包含嫁接到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列的来自特定天然存在抗体的CDR序列的表达载体来实现(参见例如Riechmann,L.等,1998,Nature332:323-327；Jones,P.等,1986,Nature 321:522-525；及Queen,C.等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86:10029-10033)。此类框架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库获得。这些种系序列会与成熟的抗体基因序列不同，因为它们不会包括完全装配的可变基因，其在B细胞成熟过程中通过V(D)J连接而形成。获得特定抗体的整个DNA序列以再创建具有与初始抗体的那些结合特性相似的结合特性的完整重组抗体是不必要的(参见WO99/45962)。跨越CDR区的部分重链和轻链序列对于此目的通常是足够的。使用部分序列来确定哪些种系可变和连接基因区段促成重组的抗体可变基因。然后，使用种系序列来填充可变区的缺少部分。重链和轻链前导序列在蛋白质成熟过程中被切割，而且不促成最终抗体的特性。出于此原因，对表达构建体使用相应的种系前导序列是必要的。为了添加缺少的序列，可以通过连接或PCR扩增来组合克隆的cDNA序列与合成的寡核苷酸。或者，整个可变区可以合成为一套短的、重叠的寡核苷酸，并通过PCR扩增来组合以创建完全合成的可变区克隆。此方法具有某些优点，诸如消除或包含特定的限制性位点，或优化特定的密码子。
使用重链和轻链转录物的核苷酸序列来设计重叠的一组合成的寡核苷酸，以创建与天然序列具有相同的氨基酸编码能力的合成的V序列。合成的重链和kappa链序列可以以三种方式与天然序列不同：中断重复核苷酸碱基串以便于寡核苷酸合成和PCR扩增；依照Kozak的规则(Kozak,1991,J.Biol.Chem.266:19867-19870)来掺入最佳的翻译起始位点；及在翻译起始位点上游工程化改造HindIII位点。
对于重链和轻链可变区两者，近似地在相应的非编码寡核苷酸的中点将经优化的编码和相应的非编码链序列分解为30-50个核苷酸的部分。如此，对于每条链，可以将寡核苷酸装配成跨越150-400个核苷酸的区段的重叠双链组。然后，使用集合作为模板来生成150-400个核苷酸的PCR扩增产物。典型地，会将单一可变区寡核苷酸组分解为两个集合，对它们进行分开扩增以生成两种重叠的PCR产物。然后，通过PCR扩增来组合这些重叠的产物以形成完整的可变区。可能还想要包括PCR扩增中的重链或轻链恒定区的重叠片段以生成可以容易地克隆入表达载体构建体中的片段。
然后，将再构建的重链和轻链可变区与克隆的启动子、翻译启动、恒定区、3’非翻译的多聚腺苷酸化、和转录终止序列组合以形成表达载体构建体。可以将重链和轻链表达构建体组合入单一载体中，共转染、连续转染、或分开转染入宿主细胞中，然后将所述宿主细胞融合以形成表达这两条链的宿主细胞。
如此，在另一个方面，使用人抗TFPI抗体(例如TP2A8、TP2G6、TP2G7、TP4B7等)的结构特征来创建保留结合TFPI的功能的结构相关人抗TFPI抗体。更具体地，可以将本发明的单克隆抗体的明确鉴定的重链和轻链区的一个或多个CDR与已知的人框架区和CDR重组组合以创建本发明的别的、经重组工程化改造的人抗TFPI抗体。
因而，在另一个实施方案中，提供了一种用于制备抗TFPI抗体的方法，包括：制备如下的抗体，其包含(1)人重链框架区和人重链CDR，其中所述人重链CDR3包含选自SEQ IDNO:388-430的氨基酸序列的氨基酸序列和/或(2)人轻链框架区和人轻链CDR，其中所述轻链CDR3包含选自SEQ ID NO:259-301的氨基酸序列的氨基酸序列；其中所述抗体保留结合TFPI的能力。在其它实施方案中，使用本发明的其它CDR来实施所述方法。
药物组合物
还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的抗TFPI单克隆抗体和药学可接受载体。“药学可接受载体”是可以添加至活性成分以帮助配制或稳定制剂而不对患者引起显著不利的毒物学效果的物质。此类载体的例子是本领域技术人员公知的，包括水、糖诸如麦芽糖或蔗糖、清蛋白、盐诸如氯化钠等。其它载体记载于例如E.W.Martin的Remington’sPharmaceutical Sciences。此类组合物会含有治疗有效量的至少一种抗TFPI单克隆抗体。
药学可接受载体包括无菌水溶液或分散体和和供即时制备无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂。对药学活性物质使用此类介质和药剂是本领域中已知的。优选地，组合物配制用于胃肠外注射。组合物可以配制为溶液、微乳、脂质体、或其它适合于高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、及液态聚乙二醇等)、及其合适的混合物。在一些情况中，它在组合物中会包含等张剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、或氯化钠。
可以如下制备无菌可注射溶液，即根据需要在具有上文所列举的一种成分或成分组合的合适溶剂中掺入需要量的活性化合物，接着过滤灭菌。一般而言，通过将活性化合物掺入无菌媒介中来制备分散体，所述无菌媒介含有基础分散介质及来自那些上文所列举的成分的其它所需成分。在供制备无菌可注射溶液用的无菌粉剂的情况中，一些制备方法是自其先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其它想要成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥(冻干)。
药学用途
可以为治疗目的使用单克隆抗体来制备遗传性和获得性凝结缺乏或缺陷。例如，可以使用上文所描述的实施方案中的单克隆抗体来阻断TFPI与FXa的相互作用，或者以阻止对TF/FVIIa活性的TFPI依赖性抑制。另外，还可以使用单克隆抗体来恢复TF/FVIIa驱动的FXa生成以回避FVIII或FIX依赖性FXa扩增的不足。
单克隆抗体在止血病症诸如血小板减少(thrombocytopenia)、血小板病症和流血病症(例如血友病A和血友病B)的治疗中具有治疗用途。可以通过对所有需要的患者施用治疗有效量的抗TFPI单克隆抗体来治疗此类病症。单克隆抗体在治疗诸如外伤和出血性中风(hemorrhagic stroke)等的适应症中不受控制的流血中也具有治疗用途。如此，还提供了一种用于缩短流血时间的方法，包括对所有需要的患者施用治疗有效量的本发明的抗TFPI单克隆抗体。
抗体可以作为单一疗法或者与其它疗法联合使用以解决止血病症。例如，认为本发明的一种或多种抗体与凝固因子诸如因子VIIa、因子VIII或因子IX的共施用对于治疗血友病是有用的。在一个实施方案中，提供了一种用于治疗遗传性和获得性凝结缺乏或缺陷的方法，包括施用(a)第一量的结合人组织因子途径抑制剂的单克隆抗体和(b)第二量的因子VIII或因子IX，其中所述第一和第二量在一起对于治疗所述缺乏或缺陷是有效的。在另一个实施方案中，提供了一种用于治疗遗传性和获得性凝结缺乏或缺陷的方法，包括施用(a)第一量的结合人组织因子途径抑制剂的单克隆抗体和(b)第二量的因子VIII或因子IX，其中所述第一和第二量在一起对于治疗所述缺乏或缺陷是有效的，且进一步其中因子VII不是共施用的。本发明还包括药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的单克隆抗体和因子VIII或因子IX的组合，其中所述组合物不含因子VII。“因子VII”包括因子VII和因子VIIa。这些联合疗法有可能降低凝固因子的必要输注频率。共施用或联合疗法意指各自分开配制或在一种组合物中共同配制且当分开配制时在近似相同时间或在不同时间，但在相同治疗期里施用的两种治疗药物的施用。
可以以如下剂量和频率对患有血友病A或B的受试者胃肠外施用药物组合物，所述剂量和频率可以随流血事件的严重程度而变化，或者在预防疗法的情况中，可以随患者的凝固缺乏的严重程度而变化。
可以以推注(bolus)或者通过连续输注来对有所需要的患者施用组合物。例如，作为Fab片段存在的发明性抗体的推注施用可以在0.0025至100mg/kg体重、0.025至0.25mg/kg、0.010至0.10mg/kg或0.10-0.50mg/kg的量中。对于连续输注，可以以0.001至100mg/kg体重/分钟、0.0125至1.25mg/kg/分钟、0.010至0.75mg/kg/分钟、0.010至1.0mg/kg/分钟或0.10-0.50mg/kg/分钟施用作为Fab片段存在的发明性抗体，持续一段1-24小时、1-12小时、2-12小时、6-12小时、2-8小时、或1-2小时的时间。对于施用作为全长抗体(具有完整的恒定区)存在的发明性抗体，剂量量可以是约1-10mg/kg体重、2-8mg/kg、或5-6mg/kg。此类全长抗体通常会通过延续一段30分钟至3小时的时间的输注来施用。施用频率会取决于状况的严重程度。频率范围可以为每周三次至每两或三周一次。
另外，可以经由皮下注射来对患者施用组合物。例如，可以经由皮下注射每周、每两周或每月对患者施用10至100mg抗TFPI抗体的剂量。
如本文中所使用的，“治疗有效量”指有效增加体内的凝固时间或者在其它情况中对有所需要的患者引起可测量的体内益处所需要的抗TFPI单克隆抗体或所述抗体与因子VIII或因子IX的组合的量。精确量会取决于许多因素，包括但不限于治疗性组合物的成分和物理特征、预期的患者群体、个体患者考虑等，而且本领域技术人员可以容易地确定。
实施例
通用材料和方法
实施例1：针对人TFPI淘选并筛选人抗体文库
针对TFPI淘选人抗体文库
通过针对人TFPI(American Diagnostica)淘选噬菌体展示组合人抗体文库HuCalGold(Rothe等,J.Mol.Biol.,2008,376:1182-1200)来选择抗TFPI抗体。简言之，将200μlTFPI(5μg/ml)于4℃在96孔Maxisorp板上包被过夜，然后用含有5％乳的PBS缓冲液封闭平板。用含有0.01％Tween-20的PBS(PBST)清洗平板后，将组合人抗体文库的等分试样添加至经TFPI包被的孔，并温育2小时。用PBST洗去未结合的噬菌体，并用二硫苏糖醇稀释抗原结合的噬菌体，感染，并在大肠杆菌(E.coli)菌株TG1中扩增。通过辅助噬菌体来挽救噬菌体以进行下一轮淘选。进行总共三轮淘选，并在ELISA测定法中针对人TFPI筛选来自前两轮的克隆。
在ELISA中通过抗原结合来筛选抗体克隆
为了选择结合人TFPI的抗体克隆，将来自第二和第三轮淘选的噬菌体克隆的Fab基因亚克隆入细菌表达载体中，并在大肠杆菌菌株TG1中表达。将细菌溶胞物添加至经人TFPI包被的Maxisorp板的孔。清洗后，使用偶联有HRP的山羊抗人Fab作为检测抗体，并通过添加具有过氧化氢的AmplexRed(Invitrogen)来使平板显影。认为比背景高至少5倍的信号为阳性。通过相似的小鼠TFPI结合ELISA来测定抗人TFPI抗体对小鼠TFPI的交叉反应性。用小鼠TFPI(R&D System)、BSA和溶菌酶包被平板。使用后两种抗原作为阴性对照。图1中显示了代表性的数据组。
抗TFPI人抗体的序列
针对TFPI淘选并筛选HuCal Gold人抗体文库后，对阳性抗体克隆实施DNA测序，产生44种独特的抗体序列(表2)。这些抗体序列中，29种是lambda轻链，而15种是kappa轻链。我们对重链可变区的分析揭示了VH3为28种、VH6为14种、VH1为1种及VH5为1种。
表2：44种抗TFPI抗体的可变区的肽序列
与小鼠TFPI的交叉反应性
还在ELISA中对上述44种人TFPI结合克隆测试对小鼠TFPI的结合。找到与小鼠TFPI交叉反应性的19种抗体。为了便于使用小鼠血友病模型进行的研究，我们进一步表征了这19种抗体及对人TFPI特异性的5种抗体。图1中显示了代表性的数据组。这些抗体在ELISA中无一结合BSA或溶菌酶。
实施例2：抗TFPI抗体的表达和纯化
将抗TFPI抗体(作为Fab片段)表达，并自细菌菌株TG1纯化。简言之，将含有抗体表达质粒的细菌菌株TG1的单克隆挑出，并在存在34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖的情况中在8ml2xYT培养基中培养过夜。将7ml体积的培养物转移至含有34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖的250ml新鲜的2xYT培养基。温育3小时后，添加0.5mM IPTG以诱导Fab表达。于25℃继续培养过夜。离心培养物以沉淀细菌细胞。然后将沉淀物在Bug Buster裂解缓冲液(Novagen)中重悬。离心后，过滤细菌裂解的上清液。依照制造商的指令通过Ni-NTA柱(Qiagen)对Fab片段进行亲和纯化。
实施例3：抗TFPI抗体的EC50和结合亲和力的测定
使用纯化的Fab抗体来测定抗TFPI抗体对人或小鼠TFPI的EC50。与上文所描述的类似地，在ELISA中评估EC50。使用SoftMax来分析结果。在Biacore测定法中测定抗TFPI抗体的结合亲和力。简言之，使用胺偶联试剂盒(GEHealthCare)依照制造商的指令将抗原(或是人或是小鼠TFPI)在CM5芯片上固定化。相对于抗原质量来调节固定化的TFPI的量以给出约300个RU。在流动相中分析抗体Fab，并在Biacore测定法中使用至少五种不同浓度(0.1、0.4、1.6、6.4和25nM)的纯化的抗体。使用Biacore T100评估软件来计算动力学和结合亲和力。
如表3中所显示的，24种抗TFPI Fab显示了对人TFPI(0.09至792nM)和小鼠TFPI(0.06至1035nM)的多种EC50，因而通过Biacore测定的亲和力对人TFPI是不同的(1.25至1140nM)。在Fab对小鼠TFPI的Biacore研究中，亲和力的变化更小(3.08至51.8nM)。
表3：24种抗体针对人或小鼠TFPI的结合活性，如通过ELISA和Biacore所测定的(hTFPI：人TFPI；mTFPI：小鼠TFPI；Neg：信号比背景的两倍小；ND，未完成)。
实施例4：抗TFPI Fab向IgG的转化
所有鉴定的抗TFPI抗体都是完全人Fab，其可以可行地转化为人IgG作为治疗剂。然而，在此实施例中，将选定的Fab转化为含有小鼠IgG恒定区的嵌合抗体，因此它们更适合于在小鼠模型中测试。将选定抗体的可变区嫁接入含有小鼠恒定区的哺乳动物表达载体中。然后，将完全装配的IgG分子在HKB11细胞中转染并表达(Mei等,Mol.Biotechnol.,2006,34:165-178)。将培养物上清液收集并浓缩。遵循制造商的指令通过Hitrap蛋白G柱(GEHealthcare)来对抗TFPI IgG分子进行亲和纯化。
实施例5：抗TFPI中和性抗体的选择
基于其在三种实验条件下对TFPI活性的抑制来选择抗TFPI中和性抗体。使用TFPI活性测定法(American Diagnostica Inc.,Stamford,CT)(即一种用于测量TFPI抑制TF/FVIIa复合物将因子X激活为因子Xa的催化活性的能力的三阶段生色测定法)来测量TFPI活性。抗TFPI抗体的中和活性与恢复的FXa生成量成比例。在第一种背景中，将纯化的抗TFPI抗体与指定浓度的人或小鼠重组TFPI(R&D System)一起温育。温育后，将样品与TF/FVIIa和FX混合，然后使用FXa(即一种高度特异性的fXa生色底物)来测量TF/FVIIa复合物的残余活性。此底物仅被测定法中生成的FXa切割，释放对硝基苯胺(pNA)生色团，其在405nm处测量。自使用已知TFPI活性水平构建的标准曲线插入样品中存在的TFPI活性。以终点模式实施测定法。在两种其它背景中，将抗TFPI抗体掺入正常人血浆或血友病A血浆中，并测量恢复的FXa生成。
实施例6：抗TFPI抗体在稀释凝血酶原时间(dPT)测定法中缩短凝固时间
实施dPT测定法，基本上如Welsch等,Thrombosis Res.,1991,64(2):213-222中所描述的。简言之，通过混合血浆与0.1个体积的对照缓冲液或抗TFPI抗体来制备人正常血浆(FACT,George King Biomedical)、人TFPI消减的血浆(American Diagnostica)或血友病A血浆(George King Biomedical)。于25℃温育30分钟后，将血浆样品(100μl)与作为促凝血酶原激酶源的200μl适当稀释的(1:500稀释)Simplastin(Biometieux)组合，并使用纤维测定仪STA4(Stago)来测量凝固时间。用PBS或含有0.1M氯化钠、0.1％牛血清清蛋白和20μM氯化钙的0.05M基于Tris的缓冲液(pH 7.5)稀释促凝血酶原激酶。
实施例7：单独的或与重组因子VIII或因子IX联合的抗TFPI抗体在ROTEM测定法中缩短血液凝固时间
ROTEM系统(Pentapharm GmbH)包括四通道仪器、计算机、血浆标准品、激活剂和一次性杯和针。ROTEM止血系统的血栓弹力图(thrombelastographic)参数包括：凝固时间(CT)，其反映到启动血液凝固的反应时间(启动数据收集后获得2mm振幅所需要的时间)；用于反映凝固扩展(clotting propagation)的凝固形成时间(CFT)和alpha角、和用于反映凝块坚固性的最大限度振幅和最大限度弹性模数(elastic modulus)。在ROTEM测定法中，评估300μl新鲜的柠檬酸化的全血或血浆。依照制造商的指令重建并混合所有组分，数据收集持续每个系统需要的时间期限。简言之，通过用自动化移液器将300μl血液或血浆取出/分配入ROTEM杯中来混合样品，其中添加20μl CaCl2(200mmol)，接着立即混合样品并启动样品收集。使用计算机控制的(软件第2.96版)ROTEM系统来收集数据达2小时。
图3和图5中显示了ROTEM测定法在检测抗TFPI抗体在缩短血液凝固时间方面的效果中的例示性结果。图3显示了在用NATEM启动ROTEM系统时，TP-2A8-Fab单独地或与重组FVIII联合地缩短人血友病A血浆或小鼠血友病A全血中的凝固时间。图5显示了与阴性对照小鼠IgG抗体相比，IgG型式的抗TFPI抗体(TP-2A8、TP-3G1、和TP-3C2)缩短凝固时间。基于这些结果和本领域的了解，技术人员会预期与单独的这些抗体相比，这些抗TFPI抗体与重组FIX联合也缩短凝固时间。
实施例8：抗TFPI抗体的体外功能活性
为了在阻断TFPI功能上调查TFPI抗体，使用生色测定法ACTICHROME和稀释凝血酶原时间(dPT)两者来测试通过淘选和筛选获得的抗体的功能活性。在这两种测定法中，使用单克隆大鼠抗TFPI抗体(R&D System)作为阳性对照，并使用人多克隆Fab作为阴性对照。在生色测定法中，与大鼠单克隆抗体相比，8种抗体抑制超过50％的TFPI活性(表4)。在dPT测定法中，所有这8种抗TFPI Fab显示高度抑制效果，这使凝固时间缩短在80秒下，而8种Fab之4种使dPT缩短在70秒下。图2中显示了4种代表性克隆在缩短dPT上的剂量依赖性。然而，具有低的TFPI抑制活性或没有TFPI抑制活性的其它人抗TFPIFab在dPT中也缩短凝固时间。例如，虽然显示小于25％的抑制活性，但是TP-3B4和TP-2C7仍将dPT缩短至小于70秒。对抑制活性和dPT的简单线性回归分析提示显著的相关性(p＝0.0095)但大的方差(R平方＝0.258)。
表4：抗TFPI抗体的体外功能活性，如通过其在人TFPI测定法和dPT测定法中的抑制活性所测定的。
还在ROTEM测定法中测试抗TFPI Fab之一，即Fab-2A8，其中使用具有低水平因子VIII的人血友病A血浆或小鼠血友病A全血。如图3中所显示的，比较多克隆兔抗TFPI抗体，Fab-2A8在人血友病A血浆中显示相似的活性，将凝固时间(CT)从2200秒降低至约1700秒。在使用小鼠血友病A全血时，对照抗体兔抗TFPI将CT从2700秒缩短至1000秒，而Fab-2A8将CT从2650秒缩短至1700秒。这些结果指明Fab-2A8可以在人血浆和小鼠血液两者中显著缩短凝固时间(p＝0.03)。
实施例9：抗TFPI抗体转化为嵌合IgG后的功能
因子Xa生成和稀释凝血酶原时间的体外测定法指明，24种抗TFPI Fab中至少六种，即TP-2A8、TP-2B3、TP-2G6、TP-3C2、TP-3G1和TP-4B7能阻断TFPI功能。为了便于使用血友病A小鼠进行的体内研究，我们使用鼠IgG1同种型将这六种抗TFPI人Fab转化成嵌合IgG。将IgG表达载体转染入HKB11细胞中，并在培养物上清液中收集表达的抗体，并在蛋白G柱上纯化。在将代表性克隆2G6-Fab转化为IgG时，2G6-IgG显示人TFPI的EC50结合升高2倍(从0.48nM至0.22nM)和对小鼠TFPI的升高10倍(从5.18nM至0.51nM)。图4中显示了IgG-2G6结合人和小鼠TFPI的结果。
实施例10：在血友病A(HemA)小鼠尾静脉横断模型中对存活率的影响
已经为药理学评估建立了小鼠尾静脉横断模型。此模型模拟正常个体与严重血友病患者之间观察到的一大批流血表型。对于这些研究，使用雄性血友病A小鼠(8周龄和20至26克)。损伤前通过单独地或与凝固因子诸如FVIII(0.1IU/小鼠)一起用抗TFPI单克隆抗体(40μg/小鼠)进行尾静脉输注来对小鼠给药。剂量给药后24小时时，将离尖端2.7mm(以直径计)处的尾的左静脉横断。在横断后24小时里观察存活。表明在与重组FVIII一起给予时存活率是剂量依赖的(数据未显示)。图8中显示的数据来自两项分开的研究(分别地，n＝15和n＝10)。此结果显示了与对照小鼠IgG相比，TP-2A8-IgG显著延长血友病A小鼠的存活；而且与重组FVIII联合的展示比单独的任一试剂更好的存活率。
实施例11：抗TFPI抗体与重组因子VIIa的联合进一步缩短凝固时间和凝块形成时间
使用EXTEM(1:1000稀释)和小鼠血友病A全血在ROTEM系统中评估抗TFPI抗体和重组FVIIa(Novo Nordisk)的联合效应。将指定量的抗TFPI抗体TP-2A8-IgG(“2A8”)和重组FVIIa(“FVIIa”)添加入300μl柠檬酸化的小鼠血友病A全血中，并使用EXTEM系统来启动血液凝固。图9显示了将TP-2A8-IgG或重组FVIIa添加入小鼠血友病A全血中分别缩短凝固时间和凝块形成时间。TP-2A8-IgG和重组FVIIa(“2A8+FVIIa”)的联合进一步缩短凝固时间和凝块形成时间，指明抗TFPI抗体与重组FVIIa的联合在用或不用抑制剂治疗血友病患者中是有用的。
实施例12：抗TFPI抗体在FVIII抑制剂诱导的人血友病血液中缩短凝固时间
还在ROTEM测定法中测试选定的抗TFPI抗体2A8和4B7，其使用中和性FVIII抗体来诱导自非血友病患者吸取的全血中的血友病来进行。图10显示了正常的人血液具有约1000秒的凝固时间。在存在FVIII中和性抗体(PAH，100微克/mL)的情况中，将凝固时间延长至约5200秒。通过添加抗TFPI抗体2A8或4B7来显著缩短延长的凝固时间，指明抗TFPI抗体在用抑制剂治疗血友病患者中是有用的。
实施例13：抑制性抗TFPI抗体结合人TFPI的Kunitz域
使用Western印迹和ELISA来测定抑制性抗体结合TFPI的那个/些域。使用重组全长人TFPI或TFPI域来进行这些研究。ELISA与实施例3相似。在Western印迹中，将人TFPI或域在4-12％Bis-Tris SDS PAGE运行缓冲液MES(Invitrogen,Carlsbad,CA)上运行，然后转移至纤维素膜。与抑制剂性抗体一起温育10分钟后，使用SNAPid系统(Millipore,Billerica,MA)清洗该膜三次。将1至10,000稀释的偶联有HRP的驴抗小鼠抗体(Pierce,Rockford,IL)与膜一起温育10分钟。相似的清洗步骤后，使用SuperSignal底物(Pierce,Rockford,IL)来使膜显现。虽然对照抗Kunitz域1抗体结合全长TFPI、截短的TFPI和域，抑制性抗TFPI抗体仅结合含有Kunitz域2的TFPI。这指明对Kunitz域2的结合对于抗体的抑制功能是必需的。
表5：如通过Western印迹和ELISA测定的抗体结合的域
| Anti-K1 | mIgG | TP-2A8 | TP-2B3 | TP-2G6 | TP-3C2 | TP-3G1 | TP-4B7 | |
| 全长 | + | - | + | + | + | + | + | + |
| K1+K2+K3 | + | - | + | + | + | + | + | + |
| K1+K2 | + | - | + | + | + | + | + | + |
| K1 | + | - | - | - | - | - | - | - |
虽然本发明已经参照具体的实施方案和实施例进行了描述，但是应当理解可以进行各种修饰和变化，而且可以在不背离本发明的真实精神和范围的前提下替换等同方案。因而，说明书和实施例要以例示性而非限制性意义看待。此外，通过提及而将本文中所提及的所有文章、书籍、专利申请和专利完整收入本文。
Claims (4)
1.一种分离的治疗组合物，其包含人单克隆IgG抗体，其特异性结合包含人组织因子途径抑制剂(TFPI)的Kunitz-2域的区域，其中所述抗体的重链具有如SEQ ID NO:305氨基酸序列所示的CDR-1区域，如SEQ ID NO:348氨基酸序列所示的CDR-2区域，如SEQ ID NO:391氨基酸序列所示的CDR-3区域，并且其中所述抗体的轻链具有如SEQ ID NO:176氨基酸序列所示的CDR-1区域，如SEQ ID NO:219氨基酸序列所示的CDR-2区域，如SEQ ID NO:262氨基酸序列所示的CDR-3区域。
2.权利要求1的组合物，进一步包含因子VIII或因子IX，没有因子VII。
3.权利要求1的组合物，其中所述抗体通过Biacore测定法具有与人TFPI的1.25至1140nM的亲和力。
4.权利要求1的组合物，其中将所述抗体以10至100mg的剂量在用于注射的药学可接受的载体中配制。
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