CN103080135B - 能够特异性结合组织因子途径抑制剂的抗体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能够特异性结合组织因子途径抑制剂（TFPI）、中和游离TFPI且减少血液的凝固时间的抗体。此外，本发明涉及编码此类抗体的多核苷酸和包含多核苷酸或表达本发明的抗体的细胞。此类抗体单独以及与第二种试剂的组合在具有凝血病的受试者治疗中具有效用。

Description

能够特异性结合组织因子途径抑制剂的抗体

发明领域

本发明涉及能够特异性结合组织因子途径抑制剂（TFPI）的C末端且因此能够中和TFPI的游离库的抗体。本发明还涉及此类抗体的用途，例如治疗和药物用途。

发明背景

在具有凝血病的受试者中，例如在具有A和B型血友病的人类中，凝血级联的多个步骤由于例如凝血因子的不存在或不足够的存在而致使功能障碍。凝血级联的一部分的此类功能障碍导致不足够的血液凝固和可能的致命性出血，或对于内脏例如关节的损害。受试者例如具有A和B型血友病的人类可以接受凝血因子替代疗法例如分别的外源因子VIII或因子IX。然而，此类患者处于发展针对此类外源因子的“抑制剂”（抗体）的危险中，致使先前有效的疗法无效。此外，外源凝血因子仅可静脉内施用，这对于患者具有相当大的不便和不舒适。例如，婴儿和初学走路的孩子可能必须具有手术插入胸部静脉内的静脉内导管，以便使静脉接近得到保证。这使得其处于发展细菌感染和血栓形成并发症的极大危险中。具有凝血病的受试者可以仅在出血已开始后接受疗法而不是作为预防措施，这通常影响其一般生活质量。因此，特别在血友病团体和一般而言具有凝血病的受试者中仍存在许多未满足的医学需要。

凝血级联通常在血管壁损伤后开始行动，所述血管壁损伤使内皮下组织因子（TF）暴露于循环血液的组分。简言之，TF与在TF表达细胞的表面上的因子VII/因子VIIa（FVII/FVIIa）形成复合物。这种复合物将因子X（FX）活化为因子Xa（FXa），其与作为辅因子的因子Va（FVa）一起导致有限量的凝血酶（FIIa）的生成。小量凝血酶活化血小板，其导致磷脂的表面暴露，所述磷脂支持tenase复合物，因子VIIIa/因子IXa（FVIIIa/FIXa）的结合。tenase复合物将大量FX活化为FXa，这随后导致大量凝血酶的生成。完全凝血酶爆发是机械上强有力的纤维蛋白结构形成和止血塞稳定所需的。

在具有血友病的个体中，FVIII或FIX以低水平存在，或可以完全不存在。由于tenase活性的缺乏，生成FXa的能力低且不足以支持凝血的传播期。相比之下，TF介导的凝血起始相不依赖于tenase复合物的形成。然而，经由TF途径的凝血起始将在起始FXa生成后不久被血浆抑制剂阻断。一种此类抑制剂是组织因子途径抑制剂（TFPI），其抑制FXa和TF/FVIIa且作为进行中的凝血的反馈抑制剂起关键作用。TFPI仅在FXa的存在下是TF-FVIIa复合物的强抑制剂。因此，TF/FVIIa的有效抑制要求FXa的生成、FXa/TFPI复合物的形成、和三元TF/FVIIa/FXa/TFPI复合物的后续形成。

在体内存在几个TFPI库。主要部分与血管内皮结合，次要部分与血管中的脂蛋白相关，小部分存在于血小板中，并且最后，小量作为游离的循环TFPI存在。此外，TFPI作为TFPIα、TFPIβ和TFPIγ形式存在。TFPI的特定部分的抑制活性的中和可以证明在不希望有的出血治疗中有效。

能够结合TFPI的抗体是本领域已知的。几个文件公开能够结合TFPI的K3结构域的抗体，即：

· J. Biochem，1995，118（1）：178-182.

· Blood Coagul. Fibrinolyis，1999，10（6）：309-19.

· JP6153981A.

这些参考文献未公开用于治疗具有凝血病的受试者的TFPI抗体。

医学领域仍存在可以用于增强凝血的药物的需要。存在不仅可以静脉内还可以通过其他施用途径例如皮下施用的药物的需要。因此，存在关于即使当以低剂量施用时也是促凝血剂和/或具有高生物利用度的药物例如抗体的需要。此外，存在关于适合于预防治疗具有先天性或获得性凝血病的个体的药物例如抗体的需要，所述凝血病例如A型血友病、B型血友病、具有抑制剂的A型血友病或具有抑制剂的B型血友病。更具体而言，存在分别在具有A型血友病和B型血友病的个体中降低关于FVIII或FIX活性的阈值的药物例如抗体的需要。在能够结合TFPI的抗体的特定范围内，存在关于不结合所有TFPI库的抗体的需要，例如不影响内皮细胞结合的TFPI例如GPI锚定的TFPI库的功能的抗体。更具体而言，存在关于就其在血浆中的半衰期而言证实剂量线性的TFPI抗体的需要。

本文公开的是适合于用作药物的抗体。此类抗体可以对具有含或不含抑制剂的A或B型血友病的个体的生活质量具有大量而不是最少的影响。

发明概述

本发明人已开发了能够与全长组织因子途径抑制剂（TFPI）的C末端特异性结合的单克隆抗体，其中“C末端”在本文中定义为其为或对应于全长人TFPI（SEQ ID NO:1）的氨基酸残基186-276的TFPI部分。本发明涉及这些抗体及衍生自这些抗体和/或具有相似结合性质且能够调节游离TFPI的活性的其他抗体。

本发明的抗体可以能够特异性结合选自下述的残基：SEQ ID NO: 1的P186、S187、L190、P192、A193、D194、R195、G196、L197、C198、R199、A200、N201、E202、N203、R204、F205、Y206、Y207、N208、K213、R215、P216、F217、K218、Y219、S220、N225、E226、N227、N228、T230、S231、K232、Q233、E234、L236、R237、K240、K241、G242、F243、I244、Q245、R246、I247、S248、K249、G250、G251、L252、I253、K254、T255、K256、R257、K258、R259、K260、K261、Q262、R263、V264、K265、I266、A267、Y268、E269、E270、I271、F272、V273、K274、N275和M276。

本发明的抗体可以能够特异性结合选自下述的残基：SEQ ID NO: 1的P186、S187、L190、P192、A193、D194、R195、G196、L197、C198、R199、A200、N201、E202、N203、R204、F205、Y206、Y207、N208、K213、R215、P216、F217、K218、Y219、S220、N225、E226、N227、N228、T230、S231、K232、Q233、E234、L236和R237。

本发明的抗体可以能够特异性结合选自下述的残基：SEQ ID NO: 1的K240、K241、G242、F243、I244、Q245、R246、I247、S248、K249、G250、G251、L252、I253、K254、T255、K256、R257、K258、R259、K260、K261、Q262、R263、V264、K265、I266、A267、Y268、E269、E270、I271、F272、V273、K274、N275和M276。

一种具体抗体包含SEQ ID NO: 7的重链可变区和SEQ ID NO: 5的轻链可变区。另一种具体抗体包含SEQ ID NO: 9的重链可变区和SEQ ID NO: 11的轻链可变区。第三种具体抗体包含SEQ ID NO: 13的重链可变区和SEQ ID NO: 15的轻链可变区。

本发明还提供了编码本发明的抗体的多核苷酸，例如编码本发明的抗体轻链和/或抗体重链的多核苷酸。

本发明还提供了包含本发明的抗体或多核苷酸和药学可接受的载体或稀释剂的药物组合物。

还提供了用于在治疗或预防凝血病或刺激血液凝固中使用的本发明的抗体、多核苷酸和组合物。即，本发明提供了用于治疗或预防凝血病或刺激血液凝固的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用治疗或预防有效量的本发明的抗体、多核苷酸或组合物。

序列表简述

SEQ ID NO: 1提供了全长人TFPI的氨基酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 2提供了截短的TFPI（1-239）的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 3提供了截短的TFPI（1-245）的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 4提供了抗TFPI4F110（也称为mAb 4F110）的可变重（VH）结构域的核酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 5提供了抗TFPI4F110的可变重（VH）结构域的氨基酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 6提供了抗TFPI4F110的可变轻（VL）结构域的核酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 7提供了抗TFPI4F110的可变轻（VL）结构域的氨基酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 8提供了抗TFPI22F66的可变重（VH）结构域的核酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 9提供了抗TFPI22F66的可变重（VH）结构域的氨基酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 10提供了抗TFPI22F66的可变轻（VL）结构域的核酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 11提供了抗TFPI22F66的可变轻（VL）结构域的氨基酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 12提供了抗TFPI22F71的可变重（VH）结构域的核酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 13提供了抗TFPI22F71的可变重（VH）结构域的氨基酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 14提供了抗TFPI22F71的可变轻（VL）结构域的核酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 15提供了抗TFPI22F71的可变轻（VL）结构域的氨基酸序列（省略信号肽序列）。

SEQ ID NO: 16提供了用于HC（VH结构域）扩增的反向引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 17提供了用于TFPI22F66和TFPI22F71 LC（VL结构域）扩增的反向引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 18提供了用于TFPI4F110 LC扩增的反向引物的核酸序列。

SEQ ID NO: 19提供了因子VII/因子VIIa的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 20提供了因子VIII的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 21提供了因子IX的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 22提供了截短的TFPI（1-240）的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 23提供了截短的TFPI（1-241）的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 24提供了截短的TFPI（1-242）的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 25提供了截短的TFPI（1-243）的氨基酸序列。

SEQ ID NO: 26提供了截短的TFPI（1-244）的氨基酸序列。

附图描述

图1显示4F110 TFPI抗体对TF诱导的血块形成的作用。凝固时间用以多个固定浓度的TF（Innovin®稀释的1:7,500；1:15,000；1:30,000）和抗体（0.005 – 1 nM）的稀释PT测定进行测量。

图2显示4F110抗TFPI对FVIII耗尽血浆中TF诱导的凝血酶生成的作用。在10 nM4F110的不存在和存在下，通过钙化和对补充有10 µM PS/PC的含柠檬酸盐的FVIII耗尽血浆添加Innovin^®（TF来源）来起始凝固。

图3显示4F110抗TFPI对补充多个水平的rFVIII的FVIII耗尽血浆中TF诱导的凝血酶生成的作用。在10 nM 4F110的不存在和存在下，通过钙化和对补充有10 µM PS/PC的含柠檬酸盐的FVIII耗尽血浆添加Innovin^®（TF来源）来起始凝固。条显示基于1 nM的凝血酶阈值水平计算的相应滞后时间（平均值 ± SD，n = x）。

图4显示通过凝血弹性描记法（TEG）分析测量的，4F110抗TFPI和rFVIII对补充有150,000血小板/µl的FVIII耗尽血浆中TF诱导的血块生成的作用。A. TEG曲线显示在不存在抗TFPI的情况下，将0.005、0.05和1.0 U/ml rFVIII加入FVIII耗尽血浆中的作用。B.TEG曲线显示在10 nM 4F110抗TFPI的存在下，将0.005、0.05和1.0 U/ml rFVIII加入FVIII耗尽血浆中的作用。C.关于A中所示不含AB（空心条）和B中所示含AB（实心条）的曲线的R值（凝固时间）。D.关于A中所示不含AB（空心条）和B中所示含AB（实心条）的曲线的K（凝血动力学速度）值。E.关于A中所示不含AB（空心条）和B中所示含AB（实心条）的曲线的角度值。F.关于A中所示不含AB（空心条）和B中所示含AB（实心条）的曲线的MA（最大幅度）值。

图5显示TFPI表达细胞系的荧光激活细胞分选器（FACS）分析。图6中还举例说明的是，两种C末端单克隆抗体不能结合细胞表面上的TFPI。

图6显示命名为4F110、22F66、22F71、22F74、22F79和22F132的C末端TFPI抗体与截短的TFPI（1-239）不结合或结合极弱（中间五个条）。

图7显示在右侧列出的与不同截短形式的TFPI结合的六种TFPI抗体（4F110、22F66、22F71、22F132、22F79、22F74）。结合是相对于与野生型（wt）TFPI（1.0）的结合。

图8显示在磷脂（PS/PC）囊泡的存在下，FVIIa/TF/FXa活性的TFPI抑制的中和。空心圆圈：4F110；实心圆圈22F66；方块：22F71；灰色三角：22F79；空心三角：22F74；灰色菱形：22F132。

图9是TFPI的结构和多个TFPI库的底图。

发明详述

本发明涉及能够特异性结合全长组织因子途径抑制剂（TFPI）的抗体，例如结合TFPI的“C末端”的抗体。此类抗体可以特异性结合TFPI的C末端结构域和/或Kunitz 3（K3）结构域；即，它们可以结合TFPI的“C末端”，但可以不结合TFPI的Kunitz 1（K1）结构域、TFPI的Kunitz 2（K2）结构域、或其他相似分子。本发明的抗体可以不结合这样的TFPI分子，其包含K1和/或K2结构域，但缺乏对于K2结构域是C末端的TFPI部分。本发明的抗体可以不能结合截短的TFPI，例如C末端截短的TFPI。可以不由本发明的抗体结合的截短形式的TFPI包括SEQ ID NO: 2的多肽，和具有SEQ ID NO: 1的氨基酸1 – 161的序列的多肽。可替代地，抗体可以结合TFPI的K1结构域、TFPI的K2结构域、或其他分子例如与它们以之结合TFPI的C末端的那种相比较具有低亲和力的截短的TFPI分子。

如本文使用的，术语“TFPI”包含任何天然存在形式的TFPI，其可以衍生自任何合适的生物。例如，用于如本文所述使用的TFPI可以是脊椎动物TFPI，例如哺乳动物TFPI，例如来自灵长类动物（例如人）；啮齿类动物（例如小鼠或大鼠）、兔类动物（例如兔）；或偶蹄动物（例如牛、绵羊、猪或骆驼）的TFPI。优选地，TFPI是人TFPI。TFPI可以是成熟形式的TFPI，例如已在合适细胞内经历翻译后加工的TFPI蛋白质。此类成熟的TFPI蛋白质可以例如是糖基化的。TFPI可以是全长TFPI蛋白质。术语TFPI还包含此类TFPI分子的变体、同种型及其他同系物。变体TFPI分子可以具有与天然存在的TFPI相同类型的活性，例如中和FXa的催化活性的能力，或抑制TF-FVIIa/FXa复合物的能力。

如本文使用的，术语“C末端”指对于氨基酸残基是C末端的TFPI的任何部分，所述氨基酸残基对应于人TFPI（SEQ ID NO: 1）的氨基酸187。术语“C末端”具体排除TFPI的Kunitz 1（K1）和Kunitz 2（K2）结构域。另一方面，术语“C末端”包括在TFPI的Kunitz 3（K3）结构域（氨基酸188-238）内的TFPI部分和/或包括氨基酸240-276的TFPI部分。

“游离TFPI”是含有可获得的“C末端”的体内TFPI库。术语“游离TFPI”指在血浆中的可溶性TFPI库。并非“游离TFPI”的其他TFPI库是GPI锚定的TFPI和脂蛋白结合的TFPI。与游离TFPI形成对比，这些TFPI库不具有可用于结合例如抗体的C末端。本发明的抗体可以能够特异性结合游离TFPI，但可以不能特异性结合GPI锚定的TFPI。本发明的抗体可以能够特异性结合游离TFPI，但可以不能特异性结合脂蛋白结合的TFPI。

因此，本发明涉及可以能够仅调节游离TFPI的活性的抗体。此类抗体可以具有缩短凝固时间的能力。例如，本发明的抗体可以具有缩短人FVIII缺乏血浆或人FIX缺乏血浆中的凝固时间的能力，或如在人全血的凝血弹性描记法（TEG）分析中测量的减少凝固的时间的能力。

本发明的抗体可以是在它们通过等同的免疫细胞制备的意义上的单克隆抗体，所述等同的免疫细胞都是相同亲本细胞的克隆。本发明的抗体可以使用实施例中所述的方法产生、筛选且纯化。本发明的抗体还可以借助于本领域技术人员已知的其他方法例如噬菌体展示或酵母展示产生。一旦产生，抗体就可以使用实施例中所述的方法筛选与例如全长TFPI、截短的TFPI（1-161）、截短的TFPI（1-239）、截短的TFPI（1-240）、截短的TFPI（1-241）、截短的TFPI（1-242）、截短的TFPI（1-243）、截短的TFPI（1-244）、截短的TFPI（1-245）和截短的TFPI（1-246）的结合。

术语“抗体”在本文中指衍生自种系免疫球蛋白序列的蛋白质，其能够特异性结合抗原或其部分。该术语包括任何同种型（即IgA、IgE、IgG、IgM和/或IgY）的全长抗体及其任何单链。

如本文提及的，术语“抗体”包括完整抗体和任何抗原结合片段（即“抗原结合部分”）或其单链。抗体指包含通过二硫键互联的至少两条重链（HC）和两条轻链（LC）的糖蛋白；或其抗原结合部分。每条重链包含重链可变区（VH）和重链恒定区（CH）。每条轻链包含轻链可变区（VL）和轻链恒定区（CL）。重和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区可以进一步再分成称为互补决定区（CDR）的高变异性区域，由称为构架区（FR）的更保守区域间隔。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的多种细胞（例如效应细胞）和经典补体系统的第一种组分（Clq）。

本发明的抗原结合片段的例子包括Fab、Fab'、F（ab）2、F（ab'）2、F（ab）S、Fv（一般为抗体单臂的VL和VH结构域）、单链Fv（scFv；参见例如Bird等人，Science 1988；242:42S-426；和Huston等人PNAS 1988；85:5879-5883）、dsFv、Fd（一般为VH和CHI结构域）、和dAb（一般为VH结构域）片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单条VH和单条VL链的单价分子；微体、双抗体、三抗体、四抗体和κ体（参见例如Ill等人Protein Eng 1997；10:949-57）；骆驼IgG；IgNAR；以及一个或多个分离的CDRs或功能互补位，其中分离的CDRs或抗原结合残基或多肽可以结合或连接在一起，以便形成功能抗体片段。多个类型的抗体片段已在例如Holliger和Hudson，Nat Biotechnol 2005；2S:1126-1136；WO2005040219，以及公开的美国专利申请20050238646和20020161201中描述或综述。

抗体的“Fab片段”包括“Fab”和“Fab（ab’）₂”片段通过切割在重链的N末端或C末端侧面上在铰链区中连接抗体重链的铰链半胱氨酸残基而衍生自所述抗体。“Fab”片段包括轻链的可变和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一个恒定结构域（CH1）。“F（ab'）₂”片段包含一对“Fab”片段，其一般通过其铰链半胱氨酸共价连接。Fab'通过切割连接F（ab'）₂中的重链的铰链二硫键而在形式上衍生自F（ab'）₂片段。除了抗体片段的二硫键连接外的其他化学偶联也是本领域已知的。Fab片段保留亲本抗体与其抗原结合的能力，潜在地具有更低的亲和力。F（ab'）₂片段能够二价结合，而Fab和Fab’片段可以单价结合。一般地，Fab片段缺乏恒定CH2和CH3结构域，即在其中将发生与Fc受体的相互作用的Fc部分。因此，Fab片段一般而言缺乏效应子功能。Fab片段可以通过本领域已知的方法通过抗体的酶促切割产生，例如使用木瓜蛋白酶以获得Fab或使用胃蛋白酶以获得F（ab'）₂，或Fab片段可以使用本领域技术人员众所周知的技术重组产生。

“Fv”片段是含有完全抗原识别和结合位点的抗体片段，且一般包含例如在单链可变结构域片段（scFv）中结合（其在性质中可以是共价的）的一条重和一条轻链可变结构域的二聚体。在这个构型中每个可变结构域的三个高变区相互作用，以限定在VH-VL二聚体表面上的抗原结合位点。总之，六个高变区或其亚组对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使仅包含对于抗原特异性的三个高变区的单个可变结构域也具有识别且结合抗原的能力，尽管通常以低于整个结合位点的亲和力（Cai & Garen，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，93：6280-6285，1996）。例如，仅具有重链可变结构域（VHH）的天然存在的骆驼科抗体可以结合抗原（Desmyter等人，J. Biol. Chem.，277：23645-23650，2002；Bond等人，J. Mol. Biol.2003；332：643-655）。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，而这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述，参见Pluckthun，1994，In：The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag，New York，第269-315页。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中片段包含连接至相同多肽链（VH和VL）中的轻链可变结构域（VL）的重链可变结构域（VH）。通过使用太短而不允许在相同链上的两个结构域之间配对的接头，迫使可变结构域与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体例如在EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，90:6444-6448中更全面地描述。

表达“线性抗体”指如Zapata等人，1995，Protein Eng.，8（10）:1057-1062中所述的抗体。简言之，这些抗体含有一对串联Fd区段（VH-CH1-VH-CH1），其连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。

如本文使用的，术语“单体”指具有重链可变结构域且不含轻链可变结构域的抗原结合分子。单体可以在不存在轻链的情况下结合抗原且一般具有三个高变区，例如指定为CDRH1、CDRH2和CDRH3的CDRs。重链IgG单体具有由二硫键连接的两个重链抗原结合分子。重链可变结构域包含一个或多个高变区，优选CDRH3或HVL-H3区。

抗体片段可以使用常规重组或蛋白质工程技术获得，并且片段可以以与完整抗体相同的方式筛选与全长TFPI、截短的TFPI（1-161）、截短的TFPI（1-239）、截短的TFPI（1-240）、截短的TFPI（1-241）、截短的TFPI（1-242）、截短的TFPI（1-243）、截短的TFPI（1-244）、截短的TFPI（1-245）和截短的TFPI（1-246）的结合。

本发明的抗体片段可以通过平截例如通过从多肽的N和/或C末端去除一个或多个氨基酸进行制备。片段还可以通过一个或多个内部缺失生成。

本发明的抗体可以是或可以包含MuTFPI4F110抗体、MuTFPI22F66抗体、MuTFPI22F71抗体、MuTFPI 22F74抗体、MuTFPI 22F79抗体、MuTFPI 22F132抗体的片段，或这些抗体中的任何一种的变体。本发明的抗体可以是或可以包含这些抗体之一的抗原结合部分，或其变体。例如，本发明的抗体可以是这些抗体之一或其变体的Fab片段，或它可以是衍生自这些抗体之一的单链抗体或其变体。

MuTFPI4F110抗体具有如SEQ ID NO: 5中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO: 7中所示的可变轻链序列。本发明的抗体可以包含这个可变重链序列和/或这个可变轻链序列。MuTFPI4F110抗体具有在SEQ ID NO: 5的氨基酸残基31 - 35、50 - 66和99 – 107，和SEQ ID NO: 7的氨基酸残基24 - 34、50 - 56和89 - 97上所示的CDR序列。本发明的抗体可以包含这些CDR序列中的1、2、3、4、5或所有6个。本发明的抗体可以包含SEQ ID NO: 5的氨基酸残基99 - 107。

MuTFPI22F66抗体具有如SEQ ID NO: 9中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:11中所示的可变轻链序列。本发明的抗体可以包含这个可变重链序列和/或这个可变轻链序列。MuTFPI22F66抗体具有在SEQ ID NO: 9的氨基酸残基31 - 35、50 - 66和99 – 106，和SEQ ID NO: 11的氨基酸残基24 - 33、49 - 55和88 - 96上所示的CDR序列。本发明的抗体可以包含这些CDR序列中的1、2、3、4、5或所有6个。本发明的抗体可以包含SEQ ID NO: 9的氨基酸残基99 - 106。

MuTFPI22F71抗体具有如SEQ ID NO: 13中所示的可变重链序列和如SEQ ID NO:15中所示的可变轻链序列。本发明的抗体可以包含这个可变重链序列和/或这个可变轻链序列。MuTFPI22F71抗体具有在SEQ ID NO: 13的氨基酸残基31 - 35、50 - 66和99 – 111，和SEQ ID NO: 15的氨基酸残基24 - 38、54 - 60和93 - 101上所示的CDR序列。本发明的抗体可以包含这些CDR序列中的1、2、3、4、5或所有6个。本发明的抗体可以包含SEQ ID NO:13的氨基酸残基99 - 111。

本发明的抗体可以是人抗体或人源化抗体。如本文使用的，术语“人抗体”预期包括具有可变区的抗体，其中构架和CDR区衍生自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么恒定区还衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变）。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不预期包括其中衍生自另一个哺乳动物物种例如小鼠的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。

此类人抗体可以是人单克隆抗体。此类人单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括得自转基因非人动物例如转基因小鼠、大鼠或兔的B细胞，具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组，其融合至永生化细胞。

人抗体可以分离自在人种系序列的选择上构建的序列文库，进一步带有天然和合成序列多样性地多样化。

人抗体可以通过人淋巴细胞的体外免疫接种随后为用EB病毒转化淋巴细胞进行制备。

术语“人抗体衍生物”指任何修饰形式的人抗体，例如抗体和另一种试剂或抗体的缀合物。

术语“人源化抗体”意指人/非人嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最低限度序列（CDR序列）。人源化抗体因此是人免疫球蛋白（接纳体抗体），其中来自接纳体的高变区的残基替换为具有所需特异性、亲和力和能力，来自非人物种（供体抗体）的高变区例如来自小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的残基。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基替换为相应非人残基。此类修饰的例子是一种或多种所谓的回复突变的引入。

术语“人源化抗体衍生物”指任何修饰形式的人源化抗体，例如抗体和另一种试剂或抗体的缀合物。

此外，人源化抗体可以包含在接纳体抗体或供体抗体中未发现的残基。这些修饰制备为进一步精炼抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个和一般两个可变结构域的基本上全部，其中高变环的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且FR残基的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体可以任选还包含免疫球蛋白恒定区（Fc）的至少一部分，一般为人免疫球蛋白的那种。

抗体的“可结晶的片段”区域（“Fc区”/“Fc结构域”）是抗体的N末端区域，其包含恒定CH2和CH3结构域。Fc结构域可以与称为Fc受体的细胞表面受体，以及补体系统的一些蛋白质相互作用。Fc区使得抗体能够与免疫系统相互作用。在本发明的一个方面，抗体可以改造为包括在Fc区内的修饰，一般改变其功能性质中的一种或多种，例如尤其是血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、蛋白质稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性或其缺乏。此外，本发明的抗体可以是化学修饰的（例如一个或多个化学部分可以附着至抗体）或是修饰的，以改变其糖基化，再次改变抗体的一种或多种功能性质。优选地，经修饰的Fc结构域包含下述突变中的一个或多个和可能全部，其分别导致对于特定Fc受体减少的亲和力（L234A、L235E和G237A）和减少的C1q介导的补体固定（A330S和P331S）（残基编号根据EU指数）。

在一个方面，本发明的抗体可以改造为包括在Fc区内的修饰，一般改变抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、蛋白质稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性或其缺乏。此外，本发明的抗体可以是化学修饰的（例如一个或多个化学部分可以附着至抗体）或是修饰的，以改变其糖基化，再次改变抗体的一种或多种功能性质。

本发明的抗体的同种型可以是IgG，例如IgG1、例如IgG2、例如IgG4。需要时，抗体的类别可以通过已知技术进行“转换”。例如，最初作为IgM分子产生的抗体可以类别转换为IgG抗体。类别转换技术也可以用于将一个IgG亚类转化为另一个，例如：从IgG1到IgG2或IgG4；从IgG2到IgG1或IgG4；或从IgG4到IgG1或IgG2。还可以执行通过来自不同IgG亚类的区域组合的生成恒定区嵌合分子的抗体改造。

在一个实施方案中，CHI的铰链区是修饰的，从而使得改变例如增加或减少铰链区中的半胱氨酸残基数目。这种方法例如在通过Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。

恒定区可以进一步进行修饰，以稳定抗体，例如减少二价抗体分离成两个单价VH-VL片段的危险。例如，在IgG4恒定区，残基S241可以突变为脯氨酸（P）残基，以允许在铰链上的完全二硫桥形成（参见例如，Angal等人，Mol Immunol. 199S；30:105-8）。

本发明的抗体将具有结合TFPI的能力。本发明的抗体优选能够特异性结合TFPI的C末端。即，它能够以比它以之结合TFPI的K1结构域、TFPI的K2结构域或另一种分子那种的更大结合亲和力结合TFPI的C末端。

本发明的抗体的靶分子可以是如本文描述的任何TFPI分子，例如天然存在的TFPI分子、完全成熟的TFPI分子或全长TFPI分子。TFPI分子可以是在体内存在的形式。靶分子可以是以在体内存在于血浆中的形式的TFPI。本发明的抗体可以能够区分与一些而不是其他结合的多个天然存在形式的TFPI。例如，本发明的抗体可以不能结合天然存在的截短形式的TFPI，其不包含K3结构域和/或羧基末端结构域。然而，靶分子可以是截短的TFPI分子，其包含K3结构域和/或羧基末端。靶分子可以是TFPI分子的变体或片段。靶分子可以由SEQ IDNO: 1的氨基酸序列或其片段或其他变体组成，或可以包含SEQ ID NO: 1的氨基酸序列或其片段或其他变体。靶分子包含用于抗体结合的合适表位，例如本文描述的表位。

靶分子可以包含TFPI或TFPI的特定区域例如TFPI的K3结构域或C末端的五个或更多个、十个或更多个、十五个或更多个、二十个或更多个、二十五个或更多个、或三十个或更多个表面可接近的残基。表面可接近的残基是具有超过40%相对可接近性的残基。

测量表面可接近性的方法是本领域众所周知的，首先通过Lee & Richards in1971 [B. Lee和F.M. Richards，"The Interpretation of Protein Structures：Estimation of Static Accessibility" J. Mol. Biol. 55，379-400（1971）]描述。表面可接近性可以使用来自Accelrys Inc.的计算机程序Quanta 2005进行计算，使用源于例如X射线结构或同源性构建结构的原子坐标。

术语“结合亲和力”在本文中用作两种分子例如抗体或其片段和抗原之间的非共价相互作用的强度量度。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用（固有活性）。

在两种分子例如抗体或其片段和抗原之间通过单价相互作用的结合亲和力可以通过解离或结合常数（K_D）的测定进行定量。进而，K_D可以通过复合物形成和解离动力学的测量例如通过SPR法（Biacore）进行测定。对应于单价复合物的结合和解离的速率常数分别被称为结合速率常数k_a（或k_on）和解离速率常数k_d（或k_off）。K_D通过等式K_D = k_d / k_a与k_a和k_d有关。

遵循上述定义，与不同分子相互作用结合的结合亲和力，例如不同抗体对于给定抗原的结合亲和力的比较，可以通过比较关于个别抗体/抗原复合物的K_D值进行比较。

类似地，相互作用的特异性可以通过关于目的相互作用例如在抗体和抗原之间的特异性相互作用的K_D值与并非目的相互作用的K_D值的测定和比较进行评估。

一般地，关于抗体就靶而言的K_D将比就其他非靶分子例如环境中的无关材料或伴随材料的K_D小2倍、优选5倍、更优选10倍。更优选地，K_D将小50倍、例如小100倍或小200倍；甚至更优选小500倍、例如小1,000倍或小10,000倍。

这个结合常数的值可以通过众所周知的方法直接测定，并且甚至对于复杂混合物可以通过方法例如Caceci等人（Byte 9:340-362，1984）中所述的那些进行计算。例如，K_D可以使用双联滤器硝酸纤维素滤器结合测定，例如由Wong & Lohman（Proc. Natl. Acad.Sci. USA 90，5428-5432，1993）公开的那种进行确定。估计配体例如抗体针对靶的结合能力的其他标准测定是本领域已知的，包括例如ELISAs、蛋白质印迹、RIAs和流式细胞术分析。抗体的结合动力学和结合亲和力还可以通过本领域已知的标准测定进行评估，例如通过使用Biacore™系统的表面等离振子共振（SPR）。

可以进行竞争结合测定，其中抗体与靶的结合与靶由那种靶的另一种配体例如另一种抗体的结合相比较。在其下发生50%抑制的浓度称为Ki。在理想条件下，Ki等于K_D。Ki值决不小于K_D，因此可以方便地取代Ki的测量，以提供关于K_D的上限。

本发明的抗体可以对于其靶具有1 x 10^-7M或更小、1 x 10^-8M或更小、或1 x 10^-9M或更小、或1 x 10^-10M或更小、1 x 10^-11M或更小、或1 x 10^-12M或更小的K_D。本发明的抗体的K_D可以小于0.8 nM、例如小于0.7 nM、例如小于0.6 nM、例如小于0.5 nM、例如小于0.4 nM、例如小于0.3 nM、例如小于0.2 nM、例如小于0.1 nM、例如小于0.05 nM、例如小于0.025nM、例如小于0.015 nM、例如小于0.10 nM。

特异性结合其靶的抗体可以以高亲和力结合其靶，即显示出如上讨论的低K_D，并且可以以更低的亲和力结合其他非靶分子。例如，抗体可以以1 x 10^-6M或更多、更优选1 x10^-5 M或更多、更优选1 x 10^-4 M或更多、更优选1 x 10^-3 M或更多、甚至更优选1 x 10^-2 M或更多的K_D与非靶分子结合。本发明的抗体优选能够以这样的亲和力与其靶结合，所述亲和力是其对于与另一种非靶分子结合的亲和力的至少两倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍或更大。

本发明的抗体可以能够中和FVIIa/TF/FX复合物的TFPI抑制。

本发明的抗体可以能够这样结合TFPI，从而使得受试者中游离TFPI的百分比减少为小于50%、例如小于30%、例如小于29%、例如小于28%、例如小于27%、例如小于26%、例如小于25%、例如小于24%、例如小于23%、例如小于22%、例如小于21%、例如小于20%、例如小于19%、例如小于18%、例如小于17%、例如小于16%、例如小于15%、例如小于14%、例如小于13%、例如小于12%、例如小于11%、例如小于10%、例如小于9%、例如小于8%、例如小于7%、例如小于6%、 例如小于5%、例如小于4%、例如小于3%、例如小于2%、例如小于1%、例如1%- 0%。

当在本文中使用时，术语“互补决定区”（“CDR”）或“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。CDRs一般包含轻链可变结构域中的氨基酸残基24-34（L1）、50-56（L2）和89-97（L3），以及重链可变结构域中的31-35（H1）、50-65（H2）和95-102（H3）；（Kabat等人（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公开号91-3242）和/或来自“高变环”的那些残基（轻链可变结构域中的残基26-32（L1）、50-52（L2）和91-96（L3），以及重链可变结构域中的26-32（H1）、53-55（H2）和96-101（H3）；Chothia和Lesk，J. Mol. Biol 1987；196:901-917）。一般地，在这个区域中的氨基酸残基编号通过Kabat等人，同上中所述的方法执行。短语例如“Kabat位置”、“ Kabat残基”和“根据Kabat”在本文中指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的这个编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可以含有对应于可变结构域的构架（FR）或CDR的缩短或插入的更少或另外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在CDR H2的残基52后的氨基酸插入（根据Kabat的残基52a、52b和52c），和在重链FR残基82后的插入残基（例如根据Kabat的残基82a、82b和82c等）。残基的Kabat编号可以通过在抗体序列的同源性区域上与“标准”Kabat编号序列的比对对于给定抗体进行测定。

术语“构架区”或“FR”残基指如本文定义的，不在CDRs内的那些VH或VL氨基酸残基。

本发明的抗体可以包含来自本文公开的一种或多种特异性抗体的CDR区，例如来自SEQ ID NOs：5、7、9、11、13或15内的CDR序列。在本发明的抗体的轻链内的CDR序列可以在下述位置进行鉴定：SEQ ID NO: 7的氨基酸24 - 34、50 - 56和89 - 97；SEQ ID NO: 11的氨基酸24 - 33、49 - 55和88 - 96；SEQ ID NO: 15的氨基酸24 - 38、54 - 60和93 -101。在本发明的抗体的重链内的CDR序列可以在下述位置进行鉴定：SEQ ID NO: 5的氨基酸31 - 35、50 - 66和99 - 107；SEQ ID NO: 9的氨基酸31 - 35、50 - 66和99-106；SEQID NO: 9的氨基酸31 - 35、50 - 66和99-106；SEQ ID NO: 13的氨基酸31 - 35、50 - 66和99-111。

本发明的抗体可以包含这些CDR序列中的任何一种或多种。本发明的抗体可以包含本文描述的抗体之一的CDR3重链序列，例如SEQ ID NO: 5的氨基酸99 - 107、SEQ IDNO: 9的99 - 106或SEQ ID NO: 13的99 - 111。本发明的抗体可以包含来自本文描述的特异性抗体之一的所有六个CDRs，例如上文所述来自SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 7的CDR氨基酸、上文所述来自SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 11的CDR氨基酸、或上文所述来自SEQ IDNO: 13和SEQ ID NO: 15的CDR氨基酸。

如本文使用的，术语“表位”在“抗原结合多肽”（Ab）及其相应“抗原”（Ag）之间的分子相互作用的背景中定义。术语抗原（Ag）指用于免疫活性脊椎动物的免疫接种的分子实体，以产生识别Ag的抗体（Ab）。此处，Ag更广泛地命名，并且一般预期包括由Ab特异性识别的靶分子，从而包括在用于产生Ab的免疫接种过程中使用的分子的片段或模拟物。因此，对于结合TFPI的C末端的Abs，全长TFPI、截短的TFPI及包含TFPI的C末端部分的其他TFPI变体称为Ag。

一般地，术语“表位”指在Ag上Ab与之特异性结合的领域或区域，即与Ab物理接触的领域或区域。蛋白质表位可以包含在Ag中直接涉及与Ab结合的氨基酸残基（也称为表位的免疫显性组分），和不直接涉及结合的其他氨基酸残基，例如由Ab有效封闭的Ag的氨基酸残基（换言之，氨基酸残基在Ab的“溶剂排除表面”和/或“脚印”内）。术语表位在本文中包括在TFPI的K3结构域或C末端结构域的任何特定区域中的两个类型的结合位点，其特异性结合抗TFPI抗体，或根据本发明的另一种“C末端”特异性试剂，除非另有说明（例如在本发明涉及直接结合特定氨基酸残基的抗体的一些背景中）。“C末端”可以包含许多不同表位，其可以包括但不限于（1）线性肽抗原决定簇，（2）由在成熟C末端构象中彼此定位接近的一个或多个非邻接氨基酸组成的构象抗原决定簇；和（3）其完全或部分由共价附着至“C末端”的分子结构例如碳水化合物基团组成的翻译后抗原决定簇。

关于给定抗体（Ab）/抗原（Ag）对的表位可以使用多种实验和计算表位作图方法，在不同细节水平进行限定且表征。实验方法包括诱变、X射线晶体学、核磁共振（NMR）光谱学、氢化氘交换质谱法（HX-MS）和多种竞争结合方法。因为每种方法依赖于独特原理，所以表位的描述与它通过其测定的方法密切联系。因此，关于给定Ab/Ag对的表位将取决于采用的表位作图方法不同地限定。

在其最详细的水平上，关于Ag和Ab之间的相互作用的表位可以通过限定Ag-Ab相互作用中存在的原子接触的空间坐标，以及关于其对于结合热力学的相对贡献的信息进行限定。在较不详细的水平上，表位可以通过限定Ag和Ab之间的原子接触的空间坐标进行表征。在进一步较不详细的水平上，如通过特异性标准例如在Ab和Ag中的原子之间的距离限定的，表位可以通过它包含的氨基酸残基进行表征。在进一步较不详细的水平上，表位可以通过功能例如通过与其他Abs的竞争结合进行表征。表位还可以更一般地定义为包含这样的氨基酸残基，对于其通过另一种氨基酸的置换将改变在Ab和Ag之间的相互作用的特征。

在通过Ab例如Fab片段及其Ag之间的复合物的空间坐标限定的X射线衍生的晶体结构的背景中，术语表位在本文中具体定义为特征在于与Ab中的重原子具有在2-6 Å、例如3 Å、例如4 Å、例如5 Å的距离内的重原子（即，非氢原子）的K3或C末端残基，除非上下文另有说明或相矛盾。

根据取决于使用的表位作图方法，表位的描述和定义在不同细节水平上获得的事实，遵循关于相同Ag上的不同Abs的表位比较可以类似地在不同细节水平上进行。

例如由X射线结构测定的，如果在氨基酸残基水平上描述的表位含有相同氨基酸残基组，则它们被说成是等同的。如果至少一个氨基酸残基由表位共享，则表位被说成重叠。如果没有氨基酸残基由表位共享，则表位被说成是分开的（独特的）。

如果相应Ab的结合是相互排斥的，即如果一个Ab的结合排除其他Ab的同时结合，则通过竞争结合表征的表位被说成是重叠的。如果Ag能够同时容纳两种相应Ab的结合，则表位被说成是分开的（独特的）。

术语“互补位”的定义通过反转角度衍生自上文“表位”的定义。因此，术语“互补位”指Ag与之特异性结合的Ab上的领域或区域，即它以之与Ag作出物理接触。

在通过Ab例如Fab片段及其Ag之间的复合物的空间坐标限定的X射线衍生的晶体结构的背景中，术语互补位在本文中具体定义为特征在于与C末端结构域中的重原子具有在2-6 Å、例如3 Å、例如4 Å、例如5 Å的距离内的重原子（即，非氢原子）的Ag残基，除非上下文另有说明或相矛盾。

关于给定抗体（Ab）/抗原（Ag）对的表位和互补位可以通过常规方法进行鉴定。例如，表位的一般定位可以通过评估抗体结合不同片段或变体TFPI多肽的能力进行测定。在TFPI内与抗体作出接触的具体氨基酸（表位）和在抗体中与TFPI作出接触的具体氨基酸（互补位），还可以使用常规方法例如实施例中所述的那些进行测定。例如，抗体和靶分子可以是组合的和/或Ab/Ag复合物可以是结晶的。复合物的晶体结构可以进行测定且用于鉴定在抗体及其靶之间的特异性相互作用位点。

根据本发明的抗体可以结合与本文具体公开的本发明抗体相同的TFPI表位、结构域或部分。例如，可以通过比较其与TFPI的结合与单克隆抗体MuTFPI4F110、MuTFPI22F66和MuTFPI22F71的那种；或通过比较仍未鉴定的抗体的功能与MuTFPI4F110、MuTFPI22F66和MuTFPI22F71的那种，鉴定本发明的其他仍未鉴定的抗体。可以用于此类鉴定目的的分析和测定包括TFPI中和测定，例如：FXa抑制测定；ELISA和结合相互作用分析，例如实施例中所述的那些。

本发明的抗体可以结合包含一个或多个氨基酸残基的表位，例如在全长TFPI的C末端内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47个氨基酸残基，例如6-10个氨基酸残基或16-21个氨基酸残基，其中当如实施例中所述进行测量时，所述一个或多个氨基酸具有超过40%的相对可接近性。因此，本发明的抗体可以结合包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47个氨基酸残基的表位，例如选自SEQ ID NO: 1的氨基酸残基186-187、190、192-208、213、215-220、225-228、230-234、236-237和240-276的6-10个氨基酸残基或16-21个氨基酸残基。

本发明的抗体可以结合包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47个氨基酸残基的表位，例如选自SEQ ID NO: 1的P186、S187、L190、P192、A193、D194、R195、G196、L197、C198、R199、A200、N201、E202、N203、R204、F205、Y206、Y207、N208、K213、R215、P216、F217、K218、Y219、S220、N225、E226、N227、N228、T230、S231、K232、Q233、E234、L236、R237、K240、K241、G242、F243、I244、Q245、R246、I247、S248、K249、G250、G251、L252、I253、K254、T255、K256、R257、K258、R259、K260、K261、Q262、R263、V264、K265、I266、A267、Y268、E269、E270、I271、F272、V273、K274、N275和M276的6-10个氨基酸残基或16-21个氨基酸残基。例如，抗体可以结合包含选自SEQ ID NO: 1的P186、S187、L190、P192、A193、D194、R195、G196、L197、C198、R199、A200、N201、E202、N203、R204、F205、Y206、Y207、N208、K213、R215、P216、F217、K218、Y219、S220、N225、E226、N227、N228、T230、S231、K232、Q233、E234、L236和R237的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个氨基酸残基的表位。抗体可以结合包含选自SEQ ID NO: 1的K240、K241、G242、F243、I244、Q245、R246、I247、S248、K249、G250、G251、L252、I253、K254、T255、K256、R257、K258、R259、K260、K261、Q262、R263、V264、K265、I266、A267、Y268、E269、E270、I271、F272、V273、K274、N275和M276的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26个氨基酸残基的表位，例如4-15个氨基酸残基，例如6-10个氨基酸残基。

本发明的抗体可以具有与本发明的另一种抗体竞争结合TFPI或如本文描述的另一种合适靶的能力。例如，本发明的抗体可以与本文描述的鉴定为MuTFPI4F110、MuTFPI22F66和MuTFPI22F71的抗体交叉竞争结合TFPI，或由MuTFPI4F110、MuTFPI22F66和MuTFPI22F71抗体结合的TFPI的合适片段或变体。此类交叉竞争抗体可以基于其在标准结合测定中与本发明的已知抗体交叉竞争的能力进行鉴定。例如，通过使用Biacore™系统的SPR、ELISA测定或流式细胞术可以用于证实交叉竞争。此类交叉竞争可以暗示两种抗体结合等同、重叠或相似表位。

“表位框并（Epitope binning）”指使用竞争结合测定鉴定抗体对，其能够或不能同时结合抗原例如TFPI，从而鉴定与TFPI的相同或重叠表位结合的抗体。具有相同或重叠结合特异性的抗体家族（或框）随后可以用于帮助限定在TFPI上的特异性表位。表位框并实验提供存在抗原上不同的表位的证据。然而，它们单独地不鉴定或“映射”针对在TFPI上的特异性氨基酸序列或定位的表位。对于结合的竞争可以对于任何抗体或片段对进行估计。抗体家族（或框）的有利性质可以与就抗体框而言限定的特异性表位的结合关联。

如上文解释的，TFPI下调血液凝固。它通过抑制FXa的活性且通过在FXa的存在下抑制TF-FVIIa复合物实现这点。通过本发明的抗体抑制的TFPI活性可以是这些活性的任何或其任何下游效应。例如，本发明的抗体可以导致血液凝固中的增加、在FXa的存在或水平下的增加或TF-FVIIa的活性增加。优选地，当与（a）人FVIII缺乏血浆或（b）人全血接触时，本发明的抗体减少凝固时间。

TFPI活性的测量可以包含评估游离TFPI在血液样品中抑制凝血或减少凝固时间的活性。例如，此类方法可以包括在其中应发生凝血的条件下，使TFPI与血液的样品或血液制品例如包含血液凝固因子的血浆或血清接触，且测定血液的凝固是否得到抑制或凝固时间是否通过TFPI的存在得到减少。此类样品中血液凝固的水平或凝固时间随后可以与其中同样存在测试抗体的等价样品中的那种相比较。如果凝血的水平增加或凝固时间在抗体样品中减少，则这暗示该抗体抑制样品中的TFPI活性。

血液凝固可以通过寻找血液自身、血浆的凝固，或位于TFPI作用点下游的凝血级联的一种或多种特征进行检测。例如，该方法可以评估样品中的FXa水平或TF-FVIIa活化。

用于评估血液凝固和凝固时间的多种其他方法是本领域众所周知的。例如，抗体对血液凝固时间的任何作用可以使用如实施例中所述的稀释凝血酶原时间分析（dPT分析）进行评估。简言之，使人血浆与人促凝血酶原激酶接触。血浆凝固花费的时间在测试抗体的存在和不存在下进行测量。阳性对照可以用于此类分析中，例如FVIIa（NovoSeven®）的添加，其预期减少凝固时间。本发明的抗体应能够减少此类方法中的凝固时间。优选地，本发明的抗体应能够以剂量依赖性方式减少凝固时间。

凝血弹性描述法（TEG）可以用于评估全血样品例如FVIII缺乏的全血中的血块形成和纤维蛋白溶解的动力学。通过比较关于在抗体的存在和不存在下的血块形成花费的时间，因此可以类似地在全血样品中评估抗体减少凝固时间或刺激血液凝固的能力。

评估本发明的抗体的功能效应的方法因此可以在体外执行。此类方法优选对人血液或血浆的样品执行。此类样品可以是正常人血液或血浆，或可以缺乏或补充有涉及血液凝固的一种或多种因子。例如，这些方法可以使用正常人全血、正常人血浆或者FVIII缺乏的血浆或全血执行。FVIII缺乏的血液或血浆可以通过使合适的血液或血浆样品与中和抗FVIII抗体接触来生成。此类体外方法可以是结合相互作用分析或TFPI中和分析，例如实施例中所述的那些。

一旦合适的抗体已得到鉴定且选择，就可以通过本领域已知的方法鉴定抗体的氨基酸序列。编码抗体的基因可以使用特异性和/或简并引物进行克隆。抗体可以通过常规方法重组产生。

本发明还涉及编码本发明的抗体的多核苷酸。因此，本发明的多核苷酸可以编码如本文描述的任何抗体。术语“核酸分子”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，并且指任何长度的聚合形式的核苷酸，为脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、信使RNA（mRNA）、cDNA、重组多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。本发明的多核苷酸可以以分离或纯化的形式提供。

“编码”所选多肽的核酸序列是核酸分子，当置于合适调节序列的控制下时，其在体内转录（在DNA的情况下）和翻译（在mRNA的情况下）成多肽。编码序列的边界通过在5'（氨基）末端上的起始密码子和在3'（羧基）末端上的翻译终止密码子决定。为了本发明的目的，此类核酸序列可以包括但不限于来自病毒、原核生物或真核生物mRNA的cDNA，来自病毒或原核生物DNA或RNA的基因组序列，和甚至合成DNA序列。翻译终止序列可以位于编码序列的3'。

本发明的多核苷酸可以包含编码如上所述的VH或VL氨基酸序列的序列。例如，本发明的多核苷酸可以编码包含选自下述的任何一种或多种序列的多肽：SEQ ID NOs：5、7、9、11、13和15；或其变体或片段。

本发明的多核苷酸可以根据本领域众所周知的方法进行合成，如例如在Sambrook等人（1989，Molecular Cloning - a laboratory manual；Cold Spring Harbor Press）中描述的。

本发明的核酸分子可以以表达盒的形式提供，其包括控制序列、与插入序列可操作地连接的信号肽序列，从而允许在体内表达本发明的抗体。这些表达盒一般又在载体（例如质粒或重组病毒载体）内提供。此类表达盒可以直接施用于宿主受试者。可替代地，包含本发明的多核苷酸的载体可以施用于宿主受试者。优选地，多核苷酸使用基因载体进行制备和/或施用。合适的载体可以是能够携带足够量的遗传信息且允许本发明的多肽表达的任何载体。

本发明因此包括包含此类多核苷酸序列的表达载体。此类表达载体是分子生物学领域中常规构建的，且可以例如涉及使用质粒DNA和合适起始区、启动子、增强子、信号肽序列及其他元件，例如可能是必需且以正确方向放置的多腺苷酸化信号，以便允许本发明的肽表达。其他合适载体将是对于本领域技术人员显而易见的。在这点上的进一步例子参考Sambrook等人。

本发明还包括已经修饰为表达本发明的抗体的细胞。此类细胞包括瞬时、或优选稳定的高等真核生物细胞系，例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，低等真核生物细胞，例如酵母或原核生物细胞例如细菌细胞。可以通过插入编码本发明的抗体的载体或表达盒进行修饰的具体细胞例子包括哺乳动物HEK293、CHO、BHK、NSO和人视网膜细胞。优选地，选择的细胞系将是不仅稳定，还允许多肽的成熟糖基化和细胞表面表达的那种。

在另一个方面，本发明提供了包含本发明的分子的组合物和制剂，例如本文描述的抗体、多核苷酸、载体和细胞。例如，本发明提供了包含连同药学可接受的载体一起配制的本发明的一种或多种抗体的药物组合物。

相应地，本发明的一个目的是提供包含此类抗体的药物制剂，所述抗体以1 mg/ml- 200 mg/ml的浓度存在，并且其中所述制剂具有2.0 - 10.0的pH。制剂可以进一步包含缓冲系统、一种或多种防腐剂、一种或多种张力剂、一种或多种螯合剂、稳定剂和表面活性剂。防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂在药物组合物中的使用是技术人员众所周知的。可以参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

在一个实施方案中，药物制剂是含水制剂。此类制剂一般是溶液或悬液。术语“含水制剂”定义为包含至少50%w/w水的制剂。同样地，术语“含水制剂”定义为包含至少50%w/w水的溶液，并且术语“含水悬液”定义为包含至少50%w/w水的悬液。

在另一个实施方案中，药物制剂是冷冻干燥制剂，在使用前医生或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂。

在进一步方面，药物制剂包含此类抗体的水溶液和缓冲液，其中抗体以1-200 mg/ml的浓度存在，并且其中所述制剂具有约2.0 – 约10.0的pH。

本发明的抗体或药物制剂可以用于治疗具有凝血病的受试者。

如本文使用的，术语“受试者”包括具有凝血病的任何人患者、或非人脊椎动物。

如本文使用的，术语“治疗”指有此需要的任何人或其他脊椎动物受试者的医学治疗。所述受试者预期已经历通过医学从业者或兽医学从业者的体格检查，其给出指示所述特异性治疗的使用对于所述人或其他脊椎动物的健康是有利的暂时或确定诊断。根据受试者的健康现状，所述治疗的时机和目的可以从一个个体到另一个不等。因此，所述治疗可以是预防、姑息、症状和/或治愈的。就本发明而言，预防、姑息、症状和/或治愈治疗可以代表本发明的分开方面。

如本文使用的，术语“凝血病”指增加的出血趋势，其可以通过正常凝血级联的任何促凝血组分的任何定性或定量缺乏，或纤维蛋白溶解的任何上调引起。此类凝血病可以是先天性和/或获得性和/或医源性的，并且通过本领域技术人员进行鉴定。

先天性凝血病的非限制性例子是A型血友病、B型血友病、因子VII缺乏、因子XI缺乏、von Willebrand氏病和血小板减少症例如Glanzmann氏血小板机能不全（thombasthenia）和Bernard-Soulier综合征。具有“抑制剂”（即针对因子VIII的同种抗体）的A型血友病和具有“抑制剂”（即针对因子IX的同种抗体）的B型血友病是部分先天性和部分获得性的凝血病的非限制性例子。

获得性凝血病的非限制性例子是由维生素K缺乏引起的丝氨酸蛋白酶缺乏；此类维生素K缺乏可以通过维生素K拮抗剂例如华法林施用引起。获得性凝血病还可以在广泛创伤后出现。在另外称为“血液恶性循环”的这种情况下，它的特征在于血稀释（稀释的血小板减少症（thrombocytopaenia）和凝固因子的稀释）、体温过低、凝固因子的消耗和代谢紊乱（酸中毒）。输液疗法和纤维蛋白溶解增加可以恶化这种情况。所述出血可以来自身体的任何部分。

医源性凝血病的非限制性例子是抗凝剂药疗法 – 例如肝素、阿司匹林、华法林和其他血小板聚集抑制剂的超剂量，其可以开处方为治疗血栓栓塞性疾病。医源性凝血病的第二个非限制性例子是通过过度和/或不适当的输液疗法诱导的那种，例如可以通过输血诱导的那种。

在本发明的一个实施方案中，出血与A或B型血友病相关。在另一个实施方案中，出血与具有获得性抑制剂的A或B型血友病相关。在另一个实施方案中，出血与血小板减少症相关。在另一个实施方案中，出血与von Willebrand氏病相关。在另一个实施方案中，出血与严重组织损伤相关。在另一个实施方案中，出血与严重创伤相关。在另一个实施方案中，出血与手术相关。在另一个实施方案中，出血与出血性胃炎和/或肠炎相关。在另一个实施方案中，出血是例如胎盘早剥中的血崩。在另一个实施方案中，出血在具有机械止血的有限可能性的器官中出现，例如颅内、耳内或眼内。在另一个实施方案中，出血与抗凝疗法相关。

本发明的抗体或制剂的使用可以在有此需要的受试者中显著减少失血。所述抗体或制剂的使用可以显著减少流血时间。因此，本发明还是能够结合TFPI的C末端的抗体用于治疗具有凝血病的受试者的用途。此外，本发明是用能够结合TFPI的C末端的单克隆抗体治疗有此需要的受试者的方法。本发明的所述单克隆抗体的使用优选减少体内凝固时间，而不引起瞬时血小板减少症。

本发明的抗体可以肠胃外例如静脉内、例如肌内、例如皮下施用。可替代地，本发明的抗体可以经由非肠胃外途径例如经口或局部施用。本发明的抗体可以预防性施用。本发明的抗体可以治疗性（根据需要）施用。

本发明的抗体的合适剂量可以通过熟练的医学或兽医学从业者进行测定。本发明的抗体的合适剂量可以在约0.1µg/kg – 约100mg/kg待治疗患者体重的范围中。

此外，本发明的抗体可以与一种或多种其他治疗剂或制剂共施用。其他试剂可以是增强止血的试剂，例如因子VII多肽、因子VIII多肽或因子IX多肽。其他试剂可以预期治疗患者的其他症状或状况。例如，其他试剂可以是止痛剂、免疫抑制剂或抗炎剂。其他试剂可以是单克隆抗体，例如公开于国际专利申请WO2010072691中的那些之一。

本发明的抗体和所述一种或多种其他试剂的共施用可以以许多不同方法实现。在一个实施方案中，本发明的抗体和其他试剂可以一起在单一组合物中施用。在另一个实施方案中，本发明的抗体和其他试剂可以分开但作为组合疗法的部分进行施用。例如，本发明的抗体可以在其他试剂之前、之后或同时施用。以其最广泛的意义，根据本发明的共施用指本发明的抗体和其他试剂同时存在于人血中，与施用两种或多种试剂的时间无关。因此，本发明的抗体可以与外源FVIIa多肽、FVIII多肽或FIX多肽同时存在于血液中。

术语“因子VII（a）”在本文中包含未切割（uncloven）的酶原，因子VII（FVII），以及切割且因此活化的蛋白酶，因子VIIa（FVIIa）。“因子VII（a）”包括FVII（a）的天然等位基因变体，其可以从一个个体到另一个存在且出现。野生型人因子VIIa序列在SEQ ID NO: 19，以及Proc Natl Acad Sci USA 1986；83:2412-2416中提供。

野生型人凝血因子VII（a）（SEQ ID NO. 19）:

野生型FVII由406个氨基酸残基组成，并且由如通过同源性限定的四个结构域组成。存在N末端Gla结构域，随后为两个表皮生长因子（EGF）样结构域和C末端丝氨酸蛋白酶结构域。FVII在血浆中作为单链分子循环。在激活为活化的FVII（FVIIa）后，分子在残基Arg152和Ile153之间切割，导致通过二硫键结合在一起的二链蛋白质。轻链含有Gla和EGF样结构域，而重链是蛋白酶结构域。FVIIa要求与其细胞表面辅因子组织因子（TF）结合，以变得生物学活性的。

因子VII（a）可以是血浆衍生的或重组产生的，使用众所周知的生产和纯化方法。糖基化、γ-羧化和其他翻译后修饰的程度和定位可以取决于选择的宿主细胞及其生长条件而改变。在SEQ ID NO. 19，“γ”（gamma）代表γ-羧化的Glu（‘E’）保留。术语“因子VII（a）多肽”在本文中指野生型因子VIIa分子以及FVII（a）变体、FVII（a）衍生物和FVII（a）缀合物。此类变体、衍生物和缀合物可以显示出相对于野生型人因子VIIa的基本上相同或改善的生物学活性。

如本文使用的，术语“FVII（a）变体”意指具有SEQ ID NO: 19的序列的因子FVII，其中亲本蛋白质的一个或多个氨基酸已替换为另一个氨基酸，和/或其中亲本蛋白质的一个或多个氨基酸已缺失，和/或其中一个或多个氨基酸已插入蛋白质中，和/或其中一个或多个氨基酸已加入亲本蛋白质中。此类添加可以在亲本蛋白质的N末端或C末端或两者上发生。在这个定义内的“类似物”仍具有以其活化形式的FVII活性。在一个实施方案中，变体与SEQ ID NO: 19的序列至少90%等同。在另一个实施方案中，变体与SEQ ID NO: 19的序列至少95%等同。如本文使用的，关于特异性位置的任何提及指SEQ ID NO: 19中的相应位置。

与重组野生型人因子VII（a）相比较，具有基本上相同或增加的蛋白酶解活性的FVII（a）变体的非限制性例子包括公开于WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、WO03/027147、WO 03/037932、WO 04/029090、WO 05/024006和EP 05108713.8、US 7173000B2；和JP4451514 B2中的那些。

如本文使用的，术语“因子VII（a）衍生物”意指显示出相对于野生型人因子VIIa的基本上相同或改善的生物学活性的FVII多肽，其中亲本肽的一个或多个氨基酸已遗传和/或化学和/或酶促修饰，例如通过烷基化、糖基化、加入聚乙二醇、酰化、酯形成、二硫键形成或酰胺形成。

术语“加入聚乙二醇的人因子VII（a）”指PEG分子已与之缀合的人因子VII（a）多肽。此类PEG分子可以附着至因子VIIa多肽的任何部分，包括因子VIIa多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分。这包括但不限于加入聚乙二醇的人因子VIIa、半胱氨酸-加入聚乙二醇的人因子VIIa及其变体。因子VIIa衍生物的非限制性例子包括例如公开于WO 03/031464和WO 04/099231和WO 02/077218中的加入糖基聚乙二醇的FVII（a）衍生物。

术语“半胱氨酸-加入聚乙二醇的人因子VII（a）”指其中PEG分子缀合至半胱氨酸的硫氢基的因子VII（a）多肽，所述半胱氨酸已引入所述人因子VIIa内。

术语“改善的生物学活性”指显示出下述的FVII（a）多肽：i）在组织因子的存在和/或不存在下，与重组野生型人因子VIIa相比较，基本上相同或增加的蛋白酶解活性，或ii）与重组野生型人因子VIIa相比较，具有基本上相同或增加的TF亲和力的FVII（a）多肽，或iii）与重组野生型人因子VIIa相比较，具有基本上相同或增加的血浆半衰期的FVII（a）多肽，或iv）对于活化血小板具有基本上相同或增加的亲和力的FVII（a）多肽。FVIIa多肽的活性可以使用例如如实施例中所述的体外水解测定或体外蛋白酶解测定进行测试。

“因子VIII”或“FVIII”在本文中指人血浆糖蛋白，其是内源性凝血途径的成员且是血液凝固必需的。“天然FVIII”是衍生自如SEQ ID NO: 20（氨基酸1-2332）中所示的全长序列的人FVIII分子。术语“因子VIII（a）”和“FVIII（a）”在本文中包括FVIII和FVIIIa。“FVIII（a）”包括FVIII（a）的天然等位基因变体，其可以从一个个体到另一个存在且出现。FVIII（a）可以是血浆衍生的或重组产生的，使用众所周知的生产和纯化方法。糖基化、酪氨酸硫酸化和其他翻译后修饰的程度和定位可以取决于选择的宿主细胞及其生长条件而改变。

因子VIII（FVIII）是主要通过肝细胞产生的大的复杂糖蛋白。FVIII由2351个氨基酸组成，包括信号肽，且含有如通过同源性限定的几个不同结构域。存在三个A结构域、独特的B结构域和两个C结构域。结构域次序可以作为NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-COOH列出。FVIII作为在B-A3边界分开的两条链在血浆中循环。链通过二价金属离子结合进行连接。A1-A2-B链称为重链（HC），而A3-C1-C2称为轻链（LC）。A1（a₁区域）和A2（a₂区域）C末端和A3结构域（a₃区域）N末端的小酸性区域在其与其他凝固蛋白质的相互作用中起重要作用，所述其他凝固蛋白质包括凝血酶和von Willebrand因子（vWF或VWF），关于FVIII的载体蛋白质。

内源FVIII分子在体内作为具有多个大小的B结构域的分子库循环，最短的具有在位置740上的C末端，即在A2-a₂的C末端上。具有不同长度的B结构域的这些FVIII分子都具有完全促凝血剂活性。在由凝血酶活化后，FVIII在位置372上A1-a₁的C末端，在位置740上A2-a₂的C末端，以及在位置1689上a₃和A3之间切割，后面的切割释放a₃区域，伴随关于VWF的亲和力的丧失。活化的FVIII分子称为FVIIIa。活化允许FVIIIa与磷脂表面如活化的血小板和活化因子IX（FIXa）相互作用，即形成tenase复合物，允许因子X（FX）的有效活化。

FVIII分子/变体可以是B结构域截短的FVIII分子，其中剩余结构域紧密对应于如SEQ ID NO: 20的氨基酸编号1-740和1649-2332中所示的序列。在此类变体以及衍生自全长序列的FVIII中，可以引入突变，以便例如减少vWF结合容量。氨基酸修饰例如置换和缺失可以引入分子内，以便修饰FVIII对于多个其他组分例如LRP的结合容量、多个受体、其他凝血因子、细胞表面、糖基化位点的引入和/或取消等。不取消FVIII活性的其他突变还可以容纳在根据本发明的FVIII分子/变体中。

根据本发明施用的FVIII分子能够以这样的方式在凝血级联中起作用，所述方式在功能上类似于或等价于FVIII，经由与活化血小板上的FIXa相互作用诱导FXa的形成且支持血块的形成。FVIII活性可以使用本领域众所周知的技术在体外进行评估。血块分析、FX活化测定（通常称为生色测定）、凝血酶生成测定和全血凝血弹性描记法是此类体外技术的例子。根据本发明的FVIII分子具有FVIII活性，其是天然人FVIII的那种的至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、100%或甚至超过100%。

FVIII中的B结构域跨越SEQ ID NO: 20的氨基酸741-1648。B结构域在几个不同位点上切割，在循环血浆FVIII分子中生成大异质性。重糖基化的B结构域的确切功能是未知的。已知的是B结构域对于凝血级联中的FVIII活性是可有可无的。重组FVIII因此以B结构域缺失/截短的变体的形式频繁产生。

内源全长FVIII作为单链前体分子合成。在分泌前，前体切割成重链和轻链。重组B结构域缺失的FVIII可以借助于两种不同策略产生。不含B结构域的重链和轻链个别地作为两条不同多肽链（二链策略）合成，或B结构域缺失的FVIII作为单条前体多肽链（单链策略）合成，其以与全长FVIII前体相同的方式切割成重和轻链。

在通过单链策略产生的B结构域缺失的FVIII前体多肽中，重和轻链部分通常通过接头分离。为了使在B结构域缺失的FVIII中引入免疫原性表位的危险降到最低，接头的序列优选衍生自FVIII B结构域。最低限度，接头必须包含关于蛋白酶的识别位点，所述蛋白酶将B结构域缺失的FVIII前体多肽切割成重和轻链。在全长FVIII的B结构域中，氨基酸1644-1648构成这个识别位点。导致在B结构域缺失的FVIII活化后接头去除的凝血酶切割位点位于重链中。因此，接头的大小和氨基酸序列不能影响其通过凝血酶活化从剩余FVIII分子中去除。B结构域的缺失/平截是用于FVIII生产的优点。然而，B结构域的部分可以包括在接头中，而不减少生产力。B结构域对生产力的负面作用仍未归于B结构域的任何特异性大小或序列。

因子IXa（FIXa）是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，其通过生成作为tenase复合物部分的大多数因子Xa在止血中起关键作用，所述因子Xa是在凝血过程中支持合适的凝血酶形成所需的（在（Hoffman和Monroe，III 2001）中综述）。

因子IX（FIX）是与因子VII、凝血酶原、因子X和蛋白质C具有结构相似性的维生素K依赖性凝血因子。循环酶原形式由分成四个不同结构域的415个氨基酸组成，其包含N末端富含γ-羧基谷氨酸（Gla）的结构域、两个EGF结构域和C末端胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域。FIX的活化通过在Arg¹⁴⁵-Ala¹⁴⁶和Arg¹⁸⁰-Val¹⁸¹上的有限蛋白酶解发生，释放35-aa片段，所谓的活化肽（Schmidt和Bajaj 2003）。活化肽是重糖基化的，含有两个N联和直到四个O联聚糖。

如本文使用的，“因子IX”或“FIX”指人血浆因子IX糖蛋白，其是内源性凝血途径的成员且是血液凝固必需的。“因子IX（a）”包括FIX（a）的天然等位基因变体，其可以从一个个体到另一个存在且出现。因子IX（a）可以是血浆衍生的或重组产生的，使用众所周知的生产和纯化方法。糖基化、γ羧化和其他翻译后修饰的程度和定位可以取决于选择的宿主细胞及其生长条件而改变。除非另有说明或指示，因子IX意指在凝血中以其正常作用的任何功能人因子IX蛋白质分子，包括其任何片段、类似物和衍生物。

“野生型FIX”的一个例子是如SEQ ID NO: 21中所示的全长人FIX分子。

野生型人凝血因子IX（SEQ ID NO: 21）:

在SEQ ID NO: 21中，“γ”代表γ-羧化的Glu（‘E’）保留。在完全γ-羧化的FIX中，前12个Glu残基是γ-羧化的，但存在其中发生较少γ-羧化的变体，尤其是在重组FIX的情况下。还注意到在FIX中在位置148上出现二态性，其可以是Ala或Thr（参见McGraw等人（1985）PNAS，82:2847）。两个都是“野生型”FIX。

如本文使用的，术语“FIX类似物”意指具有SEQ ID NO: 21的序列的因子FIX，其中亲本蛋白质的一个或多个氨基酸已替换为另一个氨基酸，和/或其中亲本蛋白质的一个或多个氨基酸已缺失，和/或其中一个或多个氨基酸已插入蛋白质中，和/或其中一个或多个氨基酸已加入亲本蛋白质中。此类添加可以在亲本蛋白质的N末端或C末端或两者上发生。在这个定义内的“类似物”仍具有以其活化形式的FIX活性。在一个实施方案中，变体与SEQID NO: 21的序列至少90%等同。在进一步的实施方案中，变体与SEQ ID NO: 21的序列至少95%等同。如本文使用的，关于特异性位置的任何提及指SEQ ID NO: 21中的相应位置。

除非另有说明，因子IX结构域包括下述氨基酸残基：Gla结构域是从位于（reside）Tyr1到残基Lys43的区域；EGF1是从残基Gln44到残基Leu84的区域；EGF2是从残基Asp85到残基Arg145的区域；活化肽是从残基Ala146到残基Arg180的区域；并且蛋白酶结构域是从残基Val181到Thr414的区域。轻链指包含Gla结构域、EGF1和EGF2的区域，而重链指蛋白酶结构域。

促凝血剂例如FVIIa多肽、FVIII多肽或因子IX多肽的凝固活性可以使用本领域技术人员已知的凝固测定例如实施例中所述的那些进行测定。

在其下本发明的抗体与第二种试剂例如因子VIIa多肽、因子VIII多肽或因子IX多肽一起共施用的时间可以通过熟练的医学或兽医学从业者进行测定。

下述是本发明的实施方案的非限制性列表：

实施方案1：能够特异性结合全长TFPI的C末端的抗体。

实施方案1a：根据实施方案1的抗体，其中所述C末端是人TFPI（SEQ ID NO: 1）的氨基酸186-276。

实施方案1b：根据实施方案1或1a中任一个的抗体，其是单克隆抗体。

实施方案2：根据实施方案1-1b中任一个的抗体，其中所述抗体的表位包含选自下述的一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO: 1的P186、S187、L190、P192、A193、D194、R195、G196、L197、C198、R199、A200、N201、E202、N203、R204、F205、Y206、Y207、N208、K213、R215、P216、F217、K218、Y219、S220、N225、E226、N227、N228、T230、S231、K232、Q233、E234、L236、R237、K240、K241、G242、F243、I244、Q245、R246、I247、S248、K249、G250、G251、L252、I253、K254、T255、K256、R257、K258、R259、K260、K261、Q262、R263、V264、K265、I266、A267、Y268、E269、E270、I271、F272、V273、K274、N275和M276。

实施方案2a：根据实施方案1-1b中任一个的抗体，其中所述抗体的表位包含选自下述的一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO: 1的P186、S187、L190、P192、A193、D194、R195、G196、L197、C198、R199、A200、N201、E202、N203、R204、F205、Y206、Y207、N208、K213、R215、P216、F217、K218、Y219、S220、N225、E226、N227、N228、T230、S231、K232、Q233、E234、L236、R237、K240、K241、G242和F243。

实施方案3：根据实施方案1-1b中任一个的抗体，其中所述抗体的表位包含选自下述的一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO: 1的P186、S187、L190、P192、A193、D194、R195、G196、L197、C198、R199、A200、N201、E202、N203、R204、F205、Y206、Y207、N208、K213、R215、P216、F217、K218、Y219、S220、N225、E226、N227、N228、T230、S231、K232、Q233、E234、L236和R237。

实施方案4：根据实施方案1-1b中任一个的抗体，其中所述抗体的表位包含选自下述的一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO: 1的K240、K241、G242、F243、I244、Q245、R246、I247、S248、K249、G250、G251、L252、I253、K254、T255、K256、R257、K258、R259、K260、K261、Q262、R263、V264、K265、I266、A267、Y268、E269、E270、I271、F272、V273、K274、N275和M276。

实施方案5：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ IDNO: 5的氨基酸31 - 35（SYYMY）的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换。

实施方案6：根据实施方案1-5中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ IDNO: 5的氨基酸50-66（EINPSNGDTNLNEKFKS）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案7：根据实施方案1-6中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ IDNO: 5的氨基酸99-107（WDRFDGFVY）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案8：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ IDNO: 9的氨基酸31 - 35（GYPMN）的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换。

实施方案9：根据实施方案1-4和8中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQID NO: 9的氨基酸50-66（LINPYNGDTTFNQKFKG）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案10：根据实施方案1-4和8-9中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO: 9的氨基酸99-106（GTYEYVDY）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案11：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ IDNO: 13的氨基酸31 - 35（TYWIH）的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换。

实施方案12：根据实施方案1-4和11中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO: 13的氨基酸50-66（AIDPGNSDATYSQKFKD）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案13：根据实施方案1-4和11-12中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO: 13的氨基酸99-111（EVYYGYDGDYFDY）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案14：根据实施方案1-7中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ IDNO: 7的氨基酸24-34（IISTNIDDDIN）的CDR1序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案15：根据实施方案1-7和14中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 7的氨基酸50-56（EGNTLRP）的CDR2序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换。

实施方案16：根据实施方案1-7和14-15中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 7的氨基酸89-97（LQSDDLPYT）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案17：根据实施方案1-4和8-10中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 11的氨基酸24-33（SASSSVFYMH）的CDR1序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案18：根据实施方案1-4、8-10和17中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 11的氨基酸49-55（DTSILSS）的CDR2序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换。

实施方案19：根据实施方案1-4、8-10和17-18中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 11的氨基酸88-96（QQWSSYPLT）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案20：根据实施方案1-4和11-13中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸24-38（RASESVSVHGTHLMH）的CDR1序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案21：根据实施方案1-4、11-13和20中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸54-60（AASKLES）的CDR2序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换。

实施方案22：根据实施方案1-4、11-13和20-21中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸93-101（QQSIGDPWT）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案23：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含：

· SEQ ID NO: 5的氨基酸31 - 35（SYYMY）的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 5的氨基酸50-66（EINPSNGDTNLNEKFKS）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 5的氨基酸99-107（WDRFDGFVY）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案24：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含：

· SEQ ID NO: 9的氨基酸31 - 35（GYPMN）的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 9的氨基酸50-66（LINPYNGDTTFNQKFKG）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 9的氨基酸99-106（GTYEYVDY）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案25：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含：

· SEQ ID NO: 13的氨基酸31 - 35（TYWIH）的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 13的氨基酸50-66（AIDPGNSDATYSQKFKD）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 13的氨基酸99-111（EVYYGYDGDYFDY）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案26：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含：

· SEQ ID NO: 7的氨基酸24-34（IISTNIDDDIN）的CDR1序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 7的氨基酸50-56（EGNTLRP）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 7的氨基酸89-97（LQSDDLPYT）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案27：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含：

· SEQ ID NO: 11的氨基酸24-33（SASSSVFYMH）的CDR1序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 11的氨基酸49-55（DTSILSS）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 11的氨基酸88-96（QQWSSYPLT）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案28：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含：

· SEQ ID NO: 15的氨基酸24-38（RASESVSVHGTHLMH）的CDR1序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 15的氨基酸54-60（AASKLES）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 15的氨基酸93-101（QQSIGDPWT）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案29：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含：

· SEQ ID NO: 5的氨基酸31 - 35（SYYMY）的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 5的氨基酸50-66（EINPSNGDTNLNEKFKS）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 5的氨基酸99-107（WDRFDGFVY）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换；

并且其中所述抗体的轻链包含：

· SEQ ID NO: 7的氨基酸24-34（IISTNIDDDIN）的CDR1序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 7的氨基酸50-56（EGNTLRP）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 7的氨基酸89-97（LQSDDLPYT）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案30：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含：

· SEQ ID NO: 9的氨基酸31 - 35（GYPMN）的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 9的氨基酸50-66（LINPYNGDTTFNQKFKG）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 9的氨基酸99-106（GTYEYVDY）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换；

并且其中所述抗体的轻链包含：

· SEQ ID NO: 11的氨基酸24-33（SASSSVFYMH）的CDR1序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 11的氨基酸49-55（DTSILSS）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 11的氨基酸88-96（QQWSSYPLT）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案31：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含：

· SEQ ID NO: 13的氨基酸31 - 35（TYWIH）的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 13的氨基酸50-66（AIDPGNSDATYSQKFKD）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 13的氨基酸99-111（EVYYGYDGDYFDY）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换；

并且其中所述抗体的轻链包含：

· SEQ ID NO: 15的氨基酸24-38（RASESVSVHGTHLMH）的CDR1序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 15的氨基酸54-60（AASKLES）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换；和/或

· SEQ ID NO: 15的氨基酸93-101（QQSIGDPWT）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以由不同的氨基酸置换。

实施方案32：根据实施方案5-31中任一个的抗体，其中所述氨基酸置换是保守置换。

实施方案33：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述重链包含：

· SEQ ID NO: 5的氨基酸31 - 35（SYYMY）的CDR1序列，和/或

· SEQ ID NO: 5的氨基酸50-66（EINPSNGDTNLNEKFKS）的CDR2序列，和/或

· SEQ ID NO: 5的氨基酸99-107（WDRFDGFVY）的CDR3序列；

并且其中所述抗体的轻链包含：

· SEQ ID NO: 7的氨基酸24-34（IISTNIDDDIN）的CDR1序列，和/或

· SEQ ID NO: 7的氨基酸50-56（EGNTLRP）的CDR2序列，和/或

· SEQ ID NO: 7的氨基酸89-97（LQSDDLPYT）的CDR3序列。

实施方案34：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述重链包含：

· SEQ ID NO: 9的氨基酸31 - 35（GYPMN）的CDR1序列，

· SEQ ID NO: 9的氨基酸50-66（LINPYNGDTTFNQKFKG）的CDR2序列，和

· SEQ ID NO: 9的氨基酸99-106（GTYEYVDY）的CDR3序列；

并且其中所述轻链包含：

· SEQ ID NO: 11的氨基酸24-33（SASSSVFYMH）的CDR1序列，

· SEQ ID NO: 11的氨基酸49-55（DTSILSS）的CDR2序列，和

· SEQ ID NO: 11的氨基酸88-96（QQWSSYPLT）的CDR3序列。

实施方案35：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述重链包含：

· SEQ ID NO: 13的氨基酸31 - 35（TYWIH）的CDR1序列，

· SEQ ID NO: 13的氨基酸50-66（AIDPGNSDATYSQKFKD）的CDR2序列，和

· SEQ ID NO: 13的氨基酸99-111（EVYYGYDGDYFDY）的CDR3序列；

并且其中所述轻链包含：

· SEQ ID NO: 15的氨基酸24-38（RASESVSVHGTHLMH）的CDR1序列，

· SEQ ID NO: 15的氨基酸54-60（AASKLES）的CDR2序列，和

· SEQ ID NO: 15的氨基酸93-101（QQSIGDPWT）的CDR3序列。

实施方案36：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ IDNO: 5。

实施方案37：根据实施方案1-4和36中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 7。

实施方案38：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ IDNO: 9。

实施方案39：根据实施方案1-4和38中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 11。

实施方案40：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ IDNO: 13。

实施方案41：根据实施方案1-4和40中任一个的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO: 15。

实施方案42：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 7。

实施方案43：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 11。

实施方案44：根据实施方案1-4中任一个的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO: 15。

实施方案45：根据实施方案1-44中任一个的抗体，其是人源化抗体。

实施方案46：根据实施方案1-45中任一个的抗体，其中所述抗体的同种型是IgG。

实施方案47：根据实施方案46的抗体，其中所述同种型是IgG1、IgG2或IgG4。

实施方案48：根据实施方案47的抗体，其中所述抗体的同种型是IgG4。

实施方案49：根据实施方案1-48中任一个的抗体，其中所述抗体的K_D小于4.0 nM、例如小于3.0 nM、例如小于2.0 nM、例如小于1.0 nM、例如小于0.8 nM、例如小于0.7 nM、例如小于0.6 nM、例如小于0.5 nM、例如小于0.4 nM、例如小于0.3 nM、例如小于0.2 nM、例如小于0.1 nM、例如小于0.05 nM、例如小于0.02 nM、例如小于0.01 nM。

实施方案50：根据实施方案1-49中任一个的抗体，其不能结合截短的TFPI（1-185）。

实施方案51：根据实施方案1-49中任一个的抗体，其不能结合截短的TFPI（1-239）。

实施方案52：根据实施方案1-51中任一个的抗体，其不能结合TFPI的K1或K2结构域。

实施方案53：根据实施方案1-52中任一个的抗体，其不能结合GPI锚定的TFPI和/或脂蛋白结合的TFPI。

实施方案54：根据实施方案1-53中任一个的抗体，其在磷脂的存在下能够中和TF/FVIIa/FXa的TFPI抑制。

实施方案55：根据实施方案1-54中任一个的抗体，其能够这样结合TFPI的C末端，从而使得受试者中游离TFPI的百分比减少为小于50%、例如小于40%、例如小于30%、例如小于20%、例如小于10%。

实施方案55a：根据实施方案1-55中任一个的抗体，其能够与MuTFPI4F110竞争结合TFPI。

实施方案55b：根据实施方案1-55中任一个的抗体，其不能与MuTFPI4F110竞争结合TFPI。

实施方案56：根据实施方案1-55a中任一个的抗体，其减少体内凝固时间，而不显著减少血小板计数。

实施方案57：根据实施方案56的抗体，其中所述血小板计数不减少为原始血小板计数的约80%、例如约75%、例如约70%、例如约65%、例如约60%、例如约55%、例如约50%、例如约45%、例如约40%、例如约35%、例如约30%、例如约25%。

实施方案58：根据实施方案1-57中任一个的抗体，其减少体内凝固时间，而不引起瞬时血小板减少症。

实施方案59：药物制剂，其包含根据实施方案1-58中任一个的抗体。

实施方案59a：药物制剂，其包含根据实施方案1-58中任一个的抗体、和因子VIIa、因子VIII或因子IX多肽。

实施方案60：根据实施方案59的药物制剂，其适合于肠胃外使用。

实施方案61：根据实施方案60的药物制剂，其适合于静脉内使用。

实施方案62：根据实施方案60的药物制剂，其适合于皮下使用。

实施方案63：根据实施方案1-58中任一个的抗体或根据实施方案58-62中任一个的药物制剂，其用于治疗具有凝血病的受试者。

实施方案64：根据实施方案1-58中任一个的抗体或根据实施方案58-62中任一个的药物制剂，其用于治疗任何先天性、获得性和/或医源性凝血病，例如可以选自含或不含抑制剂的A型血友病、和含或不含抑制剂的B型血友病。

实施方案64a：根据权利要求1-9中任一项的抗体和选自FVIIa多肽、FVIII多肽或FIX多肽的第二种凝血试剂，其用于治疗具有凝血病的受试者。

实施方案64b：根据实施方案1-58中任一个的抗体和FVIII多肽，其用于治疗A型血友病。

实施方案64c：根据实施方案1-58中任一个的抗体和FIX多肽，其用于治疗B型血友病。

实施方案64d：根据实施方案1-58中任一个的抗体和FVIIa多肽，其用于治疗具有抑制剂的A或B型血友病。

实施方案65：治疗具有凝血病的受试者的方法，其包括给所述受试者施用根据实施方案1-58中任一个的抗体。

实施方案65a：治疗具有A型凝血病的受试者的方法，其包括给所述受试者施用根据实施方案1-58中任一个的抗体和FVIII多肽。

实施方案65b：治疗具有B型凝血病的受试者的方法，其包括给所述受试者施用根据实施方案1-58中任一个的抗体和FIX多肽。

实施方案65c：治疗具有FVII缺乏的受试者的方法，其包括给所述受试者施用根据实施方案1-58中任一个的抗体和FVII多肽。

实施方案65d：治疗具有含抑制剂的A型凝血病的受试者的方法，其包括给所述受试者施用根据实施方案1-58中任一个的抗体和FVII多肽。

实施方案65e：治疗具有含抑制剂的B型凝血病的受试者的方法，其包括给所述受试者施用根据实施方案1-58中任一个的抗体和FVII多肽。

实施方案66：根据实施方案61的方法，其中所述凝血病是任何先天性、获得性和/或医源性凝血病，例如可以选自含或不含抑制剂的A型血友病、和含或不含抑制剂的B型血友病。

实施方案67：多核苷酸，其编码根据实施方案1-58中任一个的抗体。

实施方案68：根据实施方案67的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NOs：4、6、8、10、12和14的至少一个序列。

实施方案69：真核细胞，其包含根据实施方案67-69中任一个的多核苷酸。

实施方案70：真核细胞，其表达根据实施方案1-58中任一个的抗体或其片段。

实施方案71：根据实施方案70的真核细胞，其是哺乳动物细胞。

实施方案72：根据实施方案71的哺乳动物细胞，其选自HEK293、CHO、BHK、NSO和人视网膜细胞。

本发明通过下述实施例进一步举例说明，所述实施例不应解释为进一步限制性的。所有图以及本申请自始至终引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容特别引入本文作为参考。

实施例

实施例1：免疫接种和融合

用全长TFPI（SEQ ID NO: 1）免疫接种小鼠。

RBF小鼠用于小鼠单克隆抗体的免疫接种和生产。注射在小鼠的背部皮下进行。将20μg TFPI与完全弗氏佐剂混合用于第一次注射。在后续免疫接种中，不完全弗氏佐剂与相同浓度的抗原一起使用。末次免疫接种后十天，使用ELISA就TFPI特异性抗体筛选来自小鼠的眼睛血。具有阳性血清滴度的小鼠通过静脉内注射用10 μg TFPI加强，并且在三天后处死。无菌取出脾脏且分散至单细胞悬液。脾细胞和骨髓瘤细胞的融合通过PEG方法或通过电融合完成。

筛选程序

· 筛选与全长TFPI的结合和无与TFPI（1-161）的结合

· 用内皮细胞系或TF & TFPI转染细胞的细胞测定

· 在血浆中的TFPI中和活性（稀释凝血酶原时间）

· 在人血浆（内源凝血酶潜能；ETP）和人全血（血栓弹性描记法；TEG）中测量的血块动力学

· 在涉及具有上述特征的单克隆抗体结合的全长可溶性TFPI上的特异性抑制表位的鉴定。

mAbs的纯化

借助于蛋白A亲和层析纯化单克隆抗体。

实施例2：小鼠抗TFPI K3/C末端特异性mAbs的克隆和测序

这个实施例描述抗TFPI抗体MuTFPI4F110、MuTFPI22F66和MuTFPI22F71的鼠重链和轻链序列的克隆和测序。

使用来自Qiagen的RNeasy-Mini Kit从杂交瘤细胞中提取总RNA，且用作用于cDNA合成的引物。使用来自Clontech的SMART™ RACE cDNA扩增试剂盒，在5’-RACE反应中合成cDNA。使用Phusion Hot Start聚合酶（Finnzymes）和SMART™ RACE试剂盒中作为正向引物包括的通用引物混合物（UPM），通过PCR执行HC和LC序列的后续靶扩增。用于HC（VH结构域）扩增的反向引物的序列在SEQ ID NO: 16中给出。用于MuTFPI22F66和MuTFPI22F71 LC（VL结构域）扩增的反向引物的序列在SEQ ID NO: 17中给出。用于MuTFPI4F110 LC扩增的反向引物的序列在SEQ ID NO: 18中给出。

通过凝胶电泳分离PCR产物，使用来自GE Healthcare Bio-Sciences的GFX PCRDNA & Gel Band Purification Kit提取，且使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit和化学感受态的TOP10大肠杆菌（E.coli）（Invitrogen）克隆用于测序。使用来自AppliedBiosystems的AmpliTaq Gold Master Mix和M13uni/M13rev引物，对所选菌落执行菌落PCR。使用ExoSAP-IT酶混合物（USB）执行菌落PCR提纯。测序在MWG Biotech，MartinsriedGermany执行，使用M13uni（-21）/M13rev（-29）测序引物。使用VectorNTI程序分析且注释序列。根据制造商的说明书使用所有试剂盒和试剂。

对于下列每个杂交瘤鉴定单个独特的鼠κ型LC和单个独特的鼠HC，亚类IgG1：MuTFPI4F110、MuTFPI22F66和MuTFPI22F71。核酸和氨基酸序列如序列表中显示；不包括引导肽序列。

实施例3：稀释凝血酶原时间（dPT）

用与稀释人促凝血酶原激酶组合的人血浆的稀释凝血酶原（PT）分析。在增加的蛋白A纯化的TFPI单克隆抗体浓度加入后测量血浆中的凝块时间，以寻找对于目的mAbs的凝固时间的剂量依赖性减少。

将120 µl柠檬酸盐稳定的FVIII耗尽血浆（Helena）与以多个终浓度（0.0-1.0 nM）的5 µl MuTFPI4F110混合，且在室温温育15分钟。通过ACL300分析在37℃测量凝固。通过将75 µl血浆与75 µl试剂在20 mM Hepes，150 mM NaCl，pH 7.4中混合起始凝血，所述试剂含有0.02 M CaCl₂和1:3,750；1:7,500；或1:15,000稀释的脂肪化组织因子（TF）（Innovin^®）。如图1中所示，MuTFPI4F110在所有三个TF浓度以浓度依赖性方式缩短凝固时间。

血浆中存在的仅部分TFPI含有完整的C末端。这个数据暗示抗体与这个全长TFPI部分的结合有效促进FVIII耗尽血浆中TF诱导的凝固。

实施例4：内源凝血酶形成

在来自Bachem（Bubendorf，瑞士）的荧光底物Z-Gly-Gly-Arg-AMC.HCl（I-1140）转化后连续评估凝血酶活性。在微量滴定板FluorskanAscent荧光计（Thermo Labsystems，Helsinki，芬兰）中测量荧光，其中激发和发射波长分别设为368和460 nm。校准器用于允许计算形成的凝血酶量和校准获得的相对荧光单位用于内部过滤效应和生荧光底物消耗。此外，扣除通过凝血酶–α2-肌球蛋白复合物对于底物转化的贡献（9）。借助于由Synapse BV（Maastricht，荷兰）提供的校准的自动化凝血酶曲线法（thrombogram）（CAT）计算机软件自动执行这些校准。最后，取得获得凝血酶生成曲线的数据的第一个衍生物，允许总曲线下面积的计算，内源凝血酶潜能（ETP）。

在图2中研究MuTFPI4F110对补充有10 µM PS/PC的FVIII耗尽血浆中的凝血酶生成的作用。在不存在抗TFPI的情况下，通过再钙化和添加Innovin^®至1/50,000的最终稀释度的凝血触发不诱导可测量的凝血酶生成。相比之下，在10 nM MuTFPI4F110的存在下发生凝血酶生成。在起始增加后，凝血酶浓度到达约2 nM的稳态水平。

MuTFPI4F110在一般对于重度和中度A型血友病的亚正常水平的FVIII的存在下进行研究，以查看它是否能够改善或标准化凝血酶生成。图3中的结果显示在10 nMMuTFPI4F110的不存在和存在下，用0-2 IU/ml rFVIII（REFacto^®）补充FVIII耗尽血浆对TF诱导的凝血酶生成的作用。凝血酶生成低于在不存在添加rFVIII的情况下的检测水平，并且仅在rFVIII加入至高于~ 0.3 IU/ml rFVIII的水平时才可测量。补充有更高水平的rFVIII导致在凝血酶活性峰中的剂量依赖性增加且缩短凝血酶生成的滞后时间。如图2中举例说明的，在更高分辨率时，在10 nM MuTFPI4F110的存在下的凝血酶生成实验显示在FVIII耗尽的血浆中的TFPI中和导致凝血酶生成的增强。在约13分钟的滞后时间后，凝血酶浓度增加且到达约2 nM的稳态水平。rFVIII添加至高于约0.05 IU/ml的水平改变这个模式，并且诱导在由单独的MuTFPI4F110诱导的基本稳态水平之上的另外瞬时凝血酶峰。结果显示针对TFPI的C末端的MuTFPI4F110单独促进凝血的起始，并且与FVIII的亚最佳水平组合，它还增强凝血酶爆发的生成。

实施例5：血栓弹性描记法（TEG）测量

将柠檬酸盐稳定的FVIII耗尽血浆（Helena）补充有（终浓度）：0.12 pM TF（Innovin^®，1:50,000）、150,000洗涤的血小板/µl和多个浓度（0.0；0.005；0.05；0,01和1.0U/ml）的重组FVIII（ReFacto^®）。当320 µl这种预混合物转移至含有20 µl 0.2 M CaCl₂的血栓弹性描记器杯时，起始在10 nM MuTFPI4F110的不存在和存在下的凝固。连续跟踪TEG痕迹直到120分钟（5000系列TEG分析器，Haemoscope Corporation，Niles，IL，USA）。记录下述TEG变量：R时间（凝固时间，即从凝血开始直到获得2 mm幅度的时间）、α-角度（测量为在R值和TEG痕迹的拐点之间的角度的血块发展）、K（到达一定水平的血块强度的血块动力学的速度，幅度= 20 mm）和MA（反映血块的最大限度机械强度的TEG痕迹的最大幅度）。

结果显示在对应于重度和中度血友病的不存在rFVIII的情况下和在低浓度的rFVIII下，MuTFPI4F110增强TF诱导的血块形成，即缩短凝固时间（R值）且增强血块发展（角度值）的速率。

实施例6：FACS分析

TFPI阳性人内皮样永生化细胞系EAHy926WT（衍生自脐静脉内皮细胞）用作用于结合膜结合的TFPI的阳性对照。气单胞菌溶素抗性EAHy926AR细胞在其表面上不表达TFPI且用作阴性对照。

用抗TFPI抗体和相应同种型对照抗体hzATNP的染色如下完成：将洗涤的细胞系制剂（50000细胞/孔）连同50 μl稀释的TFPI抗体或滴定的同种型对照一起加入96孔板（Greiner，目录号65021），给出终浓度5 μg/ml。细胞制剂随后在4摄氏度温育1小时。在温育和洗涤（具有5%胎牛血清的PBS缓冲液，以200g离心5分钟）后，加入次级RPE标记的抗人抗体（在PBS缓冲液中1:200稀释），且在4摄氏度温育另1小时。最后，将细胞洗涤且通过低聚甲醛（1%重量/体积（w/v）低聚甲醛）固定，且在流式细胞仪中在36小时内分析。

在图5中，显示了C末端特异性抗TFPI抗体（4F100和4F110）和同种型对照抗体hzATNP（0.5 μg/ml）与EAHy926WT和EAHy926AR的结合。

此处明确的是针对TFPI的C末端的抗TFPI抗体不结合由内皮细胞系EAHy926WT表达的经由GPI锚定的TFPI，而针对Kunitz 2的抗体选择性结合EAHy926WT，且不结合气单胞菌溶素抗性TFPI阴性细胞系EAHy926AR。

实施例7：ELISA

使用ForteBio平台，借助于ELISA或实时结合分析来分析截短TFPI的C末端尾部对TFPI与MuTFPI22F66、MuTFPI22F71、MuTFPI22F74、MuTFPI22F79和MuTFPI22F132的结合亲和力的作用。其为野生型（wt）TFPI（SEQ ID NO: 1）或包含氨基酸1-239（SEQ ID NO: 2）、1-240（SEQ ID NO: 22）、1-241（SEQ ID NO: 23）、1-242（SEQ ID NO: 24）、1-243（SEQ ID NO:25）、1-244（SEQ ID NO: 26）或1-245（SEQ ID NO: 3）的截短的TFPI突变体的TFPI变体，在HEK293-F细胞中表达。使用来自细胞培养的条件化培养基执行ELISAs或实时结合分析。

借助于ELISA估计在条件化培养基中wt TFPI和截短的TFPI突变体的浓度，其结合TFPI K1-K2（山羊抗TFPI，内部的）和K2（MAb4F36，内部的）。与这些抗体的结合不受平截影响。可替代地，生物素标记的MAb4F36在链霉抗生物素蛋白包被的BioSensor尖端（ForteBio）上捕获，且用于浓度估计。

在ELISA设置中，使用列出的MAbs各自作为捕获抗体且使用MAb4F36用于检测，分析突变对TFPI结合MuTFPI22F66、MuTFPI22F71、MuTFPI22F74、MuTFPI22F79或MuTFPI22F132的能力的作用。使用ForteBio平台，测量TFPI变体与在链霉抗生物素蛋白包被的BioSensor尖端（ForteBio）上捕获的生物素标记的MuTFPI22F66、MuTFPI22F71、MuTFPI22F74、MuTFPI22F79和MuTFPI22F132的直接结合。

图7反映相对于表达水平和相对于wt计算的平截的作用。证实与其与全长TFPI的结合相比较，mAb 4F110与三种截短形式1-243、1-244和1-245的结合不受影响，而mAb22F74与所有截短的TFPI形式的结合强烈减少。剩余的测试抗体位于这个范围内。

实施例8：在PS/PC囊泡的存在下，中和FVIIa/TF/FXa活性的TFPI抑制

使用的材料是BSA缓冲液（50 mM Hepes；0.1 M NaCl，5 mM CaCl₂，0.1 mg/mlBSA，pH 7.4）EDTA：50 mM和下表中列出的试剂：

以如上表中所示终浓度的所有组分一起加入。将25 µl FX和25 µl TFPI mAb以多个浓度加入微量滴定孔中的25 µl人TFPI、25 µl FVIIa-TF（innovin）和PS/PC囊泡。将混合物在室温温育15分钟。加入50 µl EDTA，随后为50 µl S-2765。将板混合且在Spectramax中在405 nm处阅读15分钟。100%活性是获得的FVIIa/TF/FX的活性，其中不存在TFPI。

在上表中列出的六个C末端 TFPI mAbs能够在PS/PC囊泡的存在下中和复合物FVIIa/TF/FX的TFPI抑制。抗体还在不存在PS/PC的情况下中和TFPI。

实施例9：结合相互作用分析

在Biacore 3000中通过表面等离振子共振获得结合相互作用分析。用固定的小鼠抗IgG获得以固定浓度的有关单克隆抗体的捕获。测试不同浓度的TFPI。获得结合常数（k_on、k_off、K_D）的测定，假定TFPI和目的抗体的1:1相互作用。

当与mAb 4F110结合时，通过mAb 4F110固定在CM5芯片上获得不同mAbs对于结合TFPI的竞争，随后为50 nM TFPI的结合，随后为多个浓度的mAbs（22F66、22F71、22F74、22F79、22F132、22F158、22F174、4F110），以测试竞争。结果显示于下表中。芯片的再生通过10 mM甘氨酸，pH 1.7获得。

mAb ID 与mAB 4F110竞争结合TFPI

TFPI-22F66 是

TFPI-22F71 是

TFPI-22F74 否

TFPI-22F79 否

TFPI-22F132 否

TFPI-22F158 是

TFPI-22F174 是

TFPI-4F110 是

C末端mAbs分成就与mAb 4F110的竞争而言的两个组。两个组中的抗体展示TFPI中和活性。

实施例10：借助于比较建模的表位测定

基于公开的TFPI1-2的x射线晶体结构，借助于商购可得的计算机程序，Modeller[N. Eswar，M. A. Marti-Renom，B. Webb，M. S. Madhusudhan，D. Eramian，M. Shen，U.Pieper，A. Sali. Comparative Protein Structure Modeling With MODELLER. CurrentProtocols in Bioinformatics，John Wiley & Sons，Inc.，Supplement 15，5.6.1-5.6.30，2006]生成表位模型。对于TFPI1-3，发现具有大于40%的相对可接近性的残基是186-187、190、192-208、213、215-220、225-228、230-234和236-237。对于C末端，残基240-276具有大于40%的相对可接近性。

实施例11：因子VIIa变体活性测定（体外水解测定）

天然（野生型）因子VIIa和因子VIIa变体（两者在下文都称为“因子VIIa”）平行测定，以直接比较其比活性。测定在微量滴定板（MaxiSorp，Nunc，丹麦）中执行。将终浓度1 mM的生色底物D-Ile-Pro-Arg-对硝基苯胺（S-2288，Chromogenix，瑞典）加入溶于50 mMHepes，pH 7.4中的因子VIIa（终浓度100 nM），所述50 mM Hepes，pH 7.4含有0.1 M NaCl、5mM CaCl₂和1 mg/ml牛血清白蛋白。在405 nm处的吸光度在SpectraMax^TM 340板阅读器（Molecular Devices，USA）中连续测量。在扣除不含酶的空白孔中的吸光度后，在20分钟温育过程中发展的吸光度用于计算在变体和野生型因子VIIa的活性之间的比：

比 =（A_{405 nm} 因子VIIa变体）/（A_{405 nm} 因子VIIa野生型）。

实施例12：因子VIIa变体活性测定（体外蛋白酶解测定）

天然（野生型）因子VIIa和因子VIIa变体（两者在下文都称为“因子VIIa”）平行测定，以直接比较其比活性。测定在微量滴定板（MaxiSorp，Nunc，丹麦）中执行。将溶于100microL 50 mM Hepes，pH 7.4中的因子VIIa（10 nM）和因子X（0.8 microM）温育15分钟，所述50 mM Hepes，pH 7.4含有0.1 M NaCl、5 mM CaCl₂和1 mg/ml牛血清白蛋白。随后通过加入含有0.1 M NaCl、20 mM EDTA和1 mg/ml牛血清白蛋白的50 microL 50 mM Hepes，pH7.4停止因子X切割。通过加入生色底物Z-D-Arg-Gly-Arg-对硝基苯胺（S-2765，Chromogenix，瑞典）终浓度0.5 mM测量生成的因子Xa量。在405 nm处的吸光度在SpectraMax^TM 340板阅读器（Molecular Devices，USA）中连续测量。在扣除不含FVIIa的空白孔中的吸光度后，在10分钟过程中发展的吸光度用于计算在变体和野生型因子VIIa的蛋白酶解活性之间的比：

比 =（A_{405 nm} 因子VIIa变体）/（A_{405 nm} 因子VIIa野生型）。

实施例13：因子VIII活性测定（生色测定）

rFVIII化合物的FVIII活性（FVIII:C）在生色FVIII测定中进行估计，使用如下的Coatest SP试剂（Chromogenix）：rFVIII样品和FVIII标准（例如针对来自NIBSC的第7个国际FVIII标准校准的纯化的野生型rFVIII）在Coatest测定缓冲液（50 mM Tris、150 mMNaCl、1%BSA，pH 7.3，含防腐剂）中稀释。将五十µl样品、标准和缓冲液阴性对照一式两份地加入96孔微量滴定板（Nunc）中。将来自Coatest SP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl₂ 5:1:3（体积:体积:体积）混合，并且将75 µl这个加入孔中。在室温15分钟温育后，加入50 µl因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物，并且在加入25 µl 1 M柠檬酸，pH 3前，将试剂在室温温育10分钟。在Spectramax微量滴定板阅读器（Molecular Devices）上测量在415 nm处的吸光度，其中在620 nm处的吸光度用作参考波长。从所有样品中扣除关于阴性对照的值，并且通过与FVIII浓度比较标绘的吸光度值的线性回归制备校准曲线。通过将样品的活性除以通过HPLC测定的蛋白质浓度来计算比活性。通过整合在对应于轻链的层析图中的峰下面积测定样品的浓度，且与在野生型未修饰的rFVIII的平行分析中的相同峰面积相比较，而浓度通过氨基酸分析进行测定。

实施例14：因子VIII活性测定（一步血块测定）

rFVIII化合物的FVIII活性（FVIII:C）如下在一步FVIII血块测定中进一步估计：rFVIII样品和FVIII标准（例如针对来自NIBSC的第7个国际FVIII标准校准的纯化的野生型rFVIII）在HBS/BSA缓冲液（20 mM hepes、150 mM NaCl，pH 7.4含1%BSA）中稀释至约10 U/ml，随后为在含有VWF（Dade Behring）的FVIII缺乏血浆中的10倍稀释。随后将样品在HBS/BSA缓冲液中稀释。使用单因子程序，使用ACL300R或ACL5000仪器（InstrumentationLaboratory）测量APTT凝块时间。具有VWF（Dade Behring）的FVIII缺乏血浆用作测定血浆，并且SynthASil（HemosIL^TM，Instrumentation Laboratory）用作aPTT试剂。在血块仪器中，在37℃将稀释的样品或标准与FVIII缺乏的血浆和aPTT试剂混合。加入氯化钙且通过测量浊度测定直到血块形成的时间。基于FVIII标准的稀释度的血块形成时间的标准曲线计算样品中的FVIII:C。

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本发明包括如由可应用的法律允许的，在所附的权利要求中引用的主题的所有修饰和等价物。

序列表

<110> Novo Nordisk A/S

<120> 能够特异性结合组织因子途径抑制剂的抗体

<130> 8201

<140> EP10167911.6

<141> 2010-06-30

<160> 26

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 276

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225 230 235 240

Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys

245 250 255

Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe

260 265 270

Val Lys Asn Met

275

<210> 2

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的TFPI (1-239)

<400> 2

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys

225 230 235

<210> 3

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 截短的TFPI (1-245)

<400> 3

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225 230 235 240

Lys Gly Phe Ile Gln

245

<210> 4

<211> 354

<212> DNA

<213> 小家鼠

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caggtccaac tgcagcagtc tggggctgaa ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagttg 60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcatc agttactata tgtactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gattggagag attaatccta gcaatggtga tactaacctc 180

aatgagaagt tcaagagcaa ggccacactg actgtagaca aatcctccag cacagtatac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtac aagatgggat 300

aggttcgacg gttttgttta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc tgca 354

<210> 5

<211> 118

<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Asp Thr Asn Leu Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Trp Asp Arg Phe Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

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<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 6

gaaacaactg tgacccagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggagg aaaagtcacc 60

atcagatgca taatcagcac taatattgat gatgatataa actggtacca gcagaagcca 120

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cgattctcca gcagtggcta tggtacagat tttgttttta caattgaaaa catgctctca 240

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly

1 5 10 15

Gly Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Ile Ser Thr Asn Ile Asp Asp Asp

20 25 30

Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile

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Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Ser

50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Met Leu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Asp Leu Pro Tyr

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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

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<212> DNA

<213> 小家鼠

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tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacccca tgaactgggt gaggcagagc 120

catggaaaga accttgagtg gattggactt attaatcctt acaatggtga tactactttc 180

aaccagaaat tcaagggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240

atggaactcc tcagtctgac ttctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagagggacg 300

tatgaatatg ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a 351

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

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Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Pro Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Ile

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Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Thr Phe Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Glu Tyr Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

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<212> DNA

<213> 小家鼠

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 12

gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cagctttacc acctactgga tacactgggt taagcagagg 120

cctggacagg gtctagaatg gattggtgct attgatcctg gaaatagtga tgctacctac 180

agccagaagt tcaaggacaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgccttc 240

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tactatggtt acgacgggga ctactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360

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<212> PRT

<213> 小家鼠

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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala

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Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Ala Ile Asp Pro Gly Asn Ser Asp Ala Thr Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Asn Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

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<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 14

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atctcctgca gagccagtga aagtgtcagt gttcatggta ctcatttaat gcactggtac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa gctagaatct 180

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<212> PRT

<213> 小家鼠

<400> 15

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Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

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65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Ile

85 90 95

Gly Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

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<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 16

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<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 17

gttgttcaag aagcacacga ctg 23

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 18

gctctagact aacactcatt cctgttgaag ctcttg 36

<210> 19

<211> 406

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu

1 5 10 15

Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys

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Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn

65 70 75 80

Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly

85 90 95

Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys

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Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr

115 120 125

Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg

130 135 140

Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro

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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln

165 170 175

Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala

180 185 190

His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu

195 200 205

Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg

210 215 220

Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn

225 230 235 240

His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp

245 250 255

His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr

260 265 270

Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu

275 280 285

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Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser

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Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser

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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr

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Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys

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405

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr

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Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro

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Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys

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Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro

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Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val

65 70 75 80

Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val

85 90 95

Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala

100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val

115 120 125

Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn

130 135 140

Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser

145 150 155 160

His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu

165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu

180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp

195 200 205

His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser

210 215 220

Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg

225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His

245 250 255

Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu

260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile

275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly

290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met

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Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg

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Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp

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Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe

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Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His

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Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu

385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro

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Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile

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Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys

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Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala

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Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp

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Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala

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Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu

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Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala

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Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg

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His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe

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Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser

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Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp

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Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys

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Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala

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Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln

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Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr

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Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr

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1715 1720 1725

Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe

1730 1735 1740

Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu

1745 1750 1755

Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val

1760 1765 1770

Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser

1775 1780 1785

Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg

1790 1795 1800

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys

1805 1810 1815

Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys

1820 1825 1830

Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His

1835 1840 1845

Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu

1850 1855 1860

Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu

1865 1870 1875

Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu

1880 1885 1890

Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu

1895 1900 1905

Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly

1910 1915 1920

Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln

1925 1930 1935

Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile

1940 1945 1950

His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys

1955 1960 1965

Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe

1970 1975 1980

Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val

1985 1990 1995

Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu

2000 2005 2010

Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala

2015 2020 2025

Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr

2030 2035 2040

Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser

2045 2050 2055

Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val

2060 2065 2070

Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly

2075 2080 2085

Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile

2090 2095 2100

Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn

2105 2110 2115

Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser

2120 2125 2130

Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr

2135 2140 2145

Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg

2150 2155 2160

Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu

2165 2170 2175

Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser

2180 2185 2190

Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala

2195 2200 2205

Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val

2210 2215 2220

Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met

2225 2230 2235

Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr

2240 2245 2250

Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly

2255 2260 2265

His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe

2270 2275 2280

Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp

2285 2290 2295

Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp

2300 2305 2310

Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala

2315 2320 2325

Gln Asp Leu Tyr

2330

<210> 21

<211> 414

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg

1 5 10 15

Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe

20 25 30

Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly

35 40 45

Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp

50 55 60

Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys

65 70 75 80

Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu

85 90 95

Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr

100 105 110

Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Pro Ala Val Pro

115 120 125

Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg

130 135 140

Ala Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala

145 150 155 160

Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp

165 170 175

Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro

180 185 190

Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser

195 200 205

Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr

210 215 220

Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr

225 230 235 240

Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His

245 250 255

Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu

260 265 270

Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys

275 280 285

Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly

290 295 300

Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu

305 310 315 320

Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu

325 330 335

Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe

340 345 350

His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His

355 360 365

Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp

370 375 380

Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val

385 390 395 400

Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr

405 410

<210> 22

<211> 240

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225 230 235 240

<210> 23

<211> 241

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225 230 235 240

Lys

<210> 24

<211> 242

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225 230 235 240

Lys Gly

<210> 25

<211> 243

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225 230 235 240

Lys Gly Phe

<210> 26

<211> 244

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp

20 25 30

Gly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr

35 40 45

Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn

50 55 60

Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn

65 70 75 80

Ala Asn Arg Ile Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe

85 90 95

Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg

100 105 110

Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly

115 120 125

Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys

130 135 140

Asn Ile Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly

145 150 155 160

Thr Gln Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys

165 170 175

Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro

180 185 190

Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn

195 200 205

Ser Val Ile Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly

210 215 220

Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys

225 230 235 240

Lys Gly Phe Ile

Claims (10)

1.能够在TFPI SEQ ID NO: 1的氨基酸186-276内特异性结合的抗体，其中重链包含：

· SEQ ID NO: 5的氨基酸31 - 35(SYYMY)的CDR1序列，

· SEQ ID NO: 5的氨基酸50-66(EINPSNGDTNLNEKFKS)的CDR2序列，

· SEQ ID NO: 5的氨基酸99-107(WDRFDGFVY)的CDR3序列；并且轻链包含：

· SEQ ID NO: 7的氨基酸24-34(IISTNIDDDIN)的CDR1序列，和

· SEQ ID NO: 7的氨基酸50-56(EGNTLRP)的CDR2序列，和

· SEQ ID NO: 7的氨基酸89-97(LQSDDLPYT)的CDR3序列。

2.根据权利要求1的抗体，其中所述抗体包含SEQ ID NO：5和7。

3.根据权利要求1-2中任一项的抗体，其不能特异性结合选自下述的截短的TFPI：TFPI(1-161)、截短的TFPI(1-185)、截短的TFPI(1-239)或截短的TFPI(1-245)。

4.根据权利要求1-3中任一项的抗体，其在磷脂的存在下能够中和TF/FVIIa/FXa的TFPI抑制。

5.一种药物制剂，其包含根据权利要求1-4中任一项的单克隆抗体。

6.根据权利要求1-4中任一项的抗体、或根据权利要求5的药物制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗具有凝血病的受试者。

7.根据权利要求1-4中任一项的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗有或没有抑制剂的A或B型血友病。

8.根据权利要求1-4中任一项的抗体和因子VIII多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗A型血友病。

9.根据权利要求1-4中任一项的抗体和因子IX多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗B型血友病。

10.根据权利要求1-4中任一项的抗体和因子VIIa多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗具有抑制剂的A或B型血友病。