JP2017025104A - 組織因子経路インヒビターに特異的に結合することが可能な抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
・J. Biochem、1995、118(1): 178〜182頁
・Blood Coagul. Fibrinolyis、1999、10 (6): 309〜19頁
・JP6153981A。
配列番号1は、全長ヒトTFPIのアミノ酸配列(シグナルペプチド配列は省く)を示す。
ANAFLγγLRPGSLγRγCKγγQCSFγγARγIFKDAγRTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP
YNSGKLγγFVQGNLγRγCMγγKCSFγγARγVFγNTγRTTγFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT
・配列番号5のアミノ酸31〜35 (SYYMY)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号5のアミノ酸50〜66 (EINPSNGDTNLNEKFKS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号5のアミノ酸99〜107 (WDRFDGFVY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号9のアミノ酸31〜35 (GYPMN)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号9のアミノ酸50〜66 (LINPYNGDTTFNQKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号9のアミノ酸99〜106 (GTVEYVDY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号13のアミノ酸31〜35 (TYWIH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号13のアミノ酸50〜66 (AIDPGNSDATYSQKFKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号13のアミノ酸99〜111 (EVYYGYDGDYFDY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号7のアミノ酸24〜34 (IISTNIDDDIN)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号7のアミノ酸50〜56 (EGNTLRP)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号7のアミノ酸89〜97 (LQSDDLPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号11のアミノ酸24〜33 (SASSSVFYMH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号11のアミノ酸49〜55 (DTSILSS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号11のアミノ酸88〜96 (QQWSSYPLT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号15のアミノ酸24〜38 (RASESVSVHGTHLMH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号15のアミノ酸54〜60 (AASKLES)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号15のアミノ酸93〜101 (QQSIGDPWT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号5のアミノ酸31〜35 (SYYMY)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号5のアミノ酸50〜66 (EINPSNGDTNLNEKFKS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号5のアミノ酸99〜107 (WDRFDGFVY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含み、その軽鎖が、
・配列番号7のアミノ酸24〜34 (IISTNIDDDIN)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号7のアミノ酸50〜56 (EGNTLRP)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号7のアミノ酸89〜97 (LQSDDLPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号9のアミノ酸31〜35 (GYPMN)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号9のアミノ酸50〜66 (LINPYNGDTTFNQKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号9のアミノ酸99〜106 (GTYEYVDY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含み、その軽鎖が、
・配列番号11のアミノ酸24〜33 (SASSSVFYMH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号11のアミノ酸49〜55 (DTSILSS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号11のアミノ酸88〜96 (QQWSSYPLT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号13のアミノ酸31〜35 (TYWIH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号13のアミノ酸50〜66 (AIDPGNSDATYSQKFKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号13のアミノ酸99〜111 (EVYYGYDGDYFDY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含み、その軽鎖が、
・配列番号15のアミノ酸24〜38 (RASESVSVHGTHLMH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つ、もしくは3つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR1配列、および/または
・配列番号15のアミノ酸54〜60 (AASKLES)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR2配列、および/または
・配列番号15のアミノ酸93〜101 (QQSIGDPWT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸のうちの1つもしくは2つが、異なるアミノ酸により置換されうるCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号5のアミノ酸31〜35 (SYYMY)のCDR1配列、および/または
・配列番号5のアミノ酸50〜66 (EINPSNGDTNLNEKFKS)のCDR2配列、および/または
・配列番号5のアミノ酸99〜107 (WDRFDGFVY)のCDR3配列
を含み、その軽鎖が、
・配列番号7のアミノ酸24〜34 (IISTNIDDDIN)のCDR1配列、および/または
・配列番号7のアミノ酸50〜56 (EGNTLRP)のCDR2配列、および/または
・配列番号7のアミノ酸89〜97 (LQSDDLPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号9のアミノ酸31〜35 (GYPMN)のCDR1配列、
・配列番号9のアミノ酸50〜66 (LINPYNGDTTFNQKFKG)のCDR2配列、および
・配列番号9のアミノ酸99〜106 (GTYEYVDY)のCDR3配列
を含み、その軽鎖が、
・配列番号11のアミノ酸24〜33 (SASSSVFYMH)のCDR1配列、
・配列番号11のアミノ酸49〜55 (DTSILSS)のCDR2配列、および
・配列番号11のアミノ酸88〜96 (QQWSSYPLT)のCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
・配列番号13のアミノ酸31〜35 (TYWIH)のCDR1配列、
・配列番号13のアミノ酸50〜66 (AIDPGNSDATYSQKFKD)のCDR2配列、および
・配列番号13のアミノ酸99〜111 (EVYYGYDGDYFDY)のCDR3配列
を含み、その軽鎖が、
・配列番号15のアミノ酸24〜38 (RASESVSVHGTHLMH)のCDR1配列、
・配列番号15のアミノ酸54〜60 (AAASKLES)のCDR2配列、および
・配列番号15のアミノ酸93〜101 (QQSIGDPWT)のCDR3配列
を含む、実施形態1から4のいずれか1つに記載の抗体。
免疫化および融合
全長TFPI (配列番号1)によりマウスを免疫化した。
・全長TFPIに対する結合、およびTFPI(1-161)に対する非結合についてのスクリーニング
・内皮細胞系列またはTFおよびTFPIトランスフェクト細胞による細胞アッセイ
・血漿中のTFPI中和活性(希釈プロトロンビン時間)
・ヒト血漿中で測定される凝固動態(内因性トロンビンポテンシャル; ETP)およびヒト全血液中で測定される凝固動態(トロンボエラストグラフィー; TEG)
・上記の特徴を伴うモノクローナル抗体の結合に関与する全長可溶性TFPIにおける特異的な阻害性エピトープの同定
モノクローナル抗体は、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
マウス抗TFPI K3/C末端特異的mAbのクローニングおよび配列決定
この実施例では、マウス抗TFPI抗体であるMuTFPI4F110、MuTFPI22F66、およびMuTFPI22F71の重鎖配列および軽鎖配列のクローニングおよび配列決定について説明する。
希釈プロトロンビン時間(dPT)
希釈ヒトトロンボプラスチンと組み合わせたヒト血漿により、希釈プロトロンビン(PT)解析を実施した。プロテインA精製したTFPIモノクローナル抗体を、その濃度を増大させながら添加したときの、血漿中の凝固時間を測定し、対象のmAbによる凝固時間の用量依存的な短縮について追跡した。
内因性トロンビンの形成
トロンビン活性は、Bachem (Bubendorf、Switzerland)製の蛍光基質であるZ-Gly-Gly-Arg-AMC.HCl (I-1140)の転換により、持続的に評価した。蛍光は、励起波長および発光波長を、それぞれ、368nmおよび460nMとするセットで、マイクロ滴定プレートのFluorskan Ascent flourometer (Thermo Labsystems、Helsinki、Finland)により測定した。較正器を用いて、形成されたトロンビン量、および内部フィルター効果について得られた相対蛍光単位の補正、および蛍光性基質の消費量を計算させた。加えて、トロンビン-α2-マクログロブリン複合体による基質転換への寄与を差し引いた(9)。これらの補正は、Synapse BV (Maastricht、the Netherlands)により市販されている自動較正トロンボグラム(CAT)コンピュータソフトウェアにより自動で行った。最後に、データの一次導関数をとり、これにより、トロンビン生成曲線を得、内因性トロンビンポテンシャル(ETP)である全曲線下面積の計算を可能とした。
トロンボエラストグラフィー(TEG)による測定
クエン酸で安定化させたFVIII枯渇血漿(Helena)に、(最終濃度): 0.12pMのTF (Innovin (登録商標)、1:50,000)、1μl当たり150,000個の洗浄血小板、および多様な濃度(0.0、0.005、0.05、0.01、および1.0U/ml)の組換えFVIII (ReFacto (登録商標))を補充した。320μlのこのプレミックスを、20μlの0.2M CaCl2を含有するトロンボエラストグラフのカップへと移して、10nMのMuTFPI4F110の非存在下または存在下における凝固を開始させた。最長120分間にわたり、TEG出力を持続的に追跡した(5000型TEG解析器、Haemoscope Corporation、Niles、IL、USA)。以下のTEG変数: R時間(凝固時間、すなわち、凝固が開始されてから2mmの振幅が得られるまでの時間)、α角(R値と、TEG出力の変曲点とのなす角として測定される血栓の発生)、K値(あるレベルの血栓強度(振幅=20mm)に達するまでの凝固反応速度)、およびMA値(血栓の力学的な最大強度を反映するTEG出力の最大振幅)を記録した。
FACS解析
TFPI陽性ヒト内皮様不死化細胞系であるEAHy926WT (臍帯静脈血管内皮細胞に由来する)を、膜結合型TFPIの結合についての陽性対照として用いた。アエロリシン耐性EAHy926AR細胞は、それらの表面においてTFPIを発現せず、陰性対照として用いた。
ELISA
TFPIのC末端テールを切断することが、MuTFPI22F66、MuTFPI22F71、MuTFPI22F74、MuTFPI22F79、およびMuTFPI22F132に対するTFPIの結合アフィニティーに対して及ぼす影響を、ELISAまたはForteBioプラットフォームを用いるリアルタイム結合解析により解析した。野生型(wt) TFPI (配列番号1)またはアミノ酸1〜239 (配列番号2)、1〜240 (配列番号22)、1〜241 (配列番号23)、1〜242 (配列番号24)、1〜243 (配列番号25)、1〜244 (配列番号26)、または1〜245 (配列番号3)を包含する切断型TFPI突然変異体であるTFPI変異体を、HEK293-F細胞内で発現させた。細胞培養物に由来する馴化培地を用いて、ELISAまたはリアルタイム結合解析を行った。
PS/PC小胞の存在下におけるTFPIによるFVIIa/TF/FXa活性の阻害に対する中和
用いた材料は、BSA緩衝液(50mMのHepes、0.1MのNaCl、5mMのCaCl2、0.1mg/mlのBSA、pH 7.4)、EDTA: 50mM、および下記の表に列挙される試薬であった。
結合相互作用解析
結合相互作用解析は、Biacore 3000による表面プラズモン共鳴を介して得た。固定濃度における関与性モノクローナル抗体の捕捉は、固定化マウス抗IgG抗体により得た。異なる濃度のTFPIについて調べた。結合定数(Kon、Koff、KD)の決定は、TFPIと対象の抗体とが1:1で相互作用することを仮定して得た。
mAb ID TFPIに対する結合についてのmAB 4F110との競合
TFPI-22F66 あり
TFPI-22F71 あり
TFPI-22F74 なし
TFPI-22F79 なし
TFPI-22F132 なし
TFPI-22F158 あり
TFPI-22F174 あり
TFPI-4F110 あり
比較モデル化によるエピトープの決定
エピトープモデルは、公表されたx線結晶構造解析によるTFPI1〜2の構造に基づき、市販のコンピュータプログラムであるModeller [N. Eswar、M. A. Marti-Renom、B. Webb、M. S. Madhusudhan、D. Eramian、M. Shen、U. Pieper、A. Sali、「Comparative Protein Structure Modeling With MODELLER」、「Current Protocols in Bioinformatics」、John Wiley & Sons, Inc.、補遺15、5.6.1〜5.6.30、2006]により作成した。TFPI1〜3では、相対結合可能性が40%を超える残基が、186〜187、190、192〜208、213、215〜220、225〜228、230〜234、および236〜237であることが判明した。C末端については、残基240〜276の相対結合可能性が40%より大きかった。
第VIIa因子変異体活性アッセイ(in vitroにおける加水分解アッセイ)
天然(野生型)第VIIa因子および第VIIa因子変異体(本明細書の以下では、いずれも「第VIIa因子」と称する)を並行してアッセイして、それらの特異的活性を直接比較した。アッセイは、マイクロ滴定プレート(MaxiSorp、Nunc、Denmark)により実施した。最終濃度を1mMとする比色基質であるD-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド(S-2288、Chromogenix、Sweden)を、0.1MのNaCl、5mMのCaCl2、および1mg/mlのウシ血清アルブミンを含有する50mMのHepes、pH 7.4中の第VIIa因子 (最終濃度を100nMとする)へと添加する。SpectraMax (商標) 340プレートリーダー(Molecular Devices、USA)により、405nmにおける吸光度を持続的に測定する。酵素を含有しないブランクウェルにおける吸光度を差し引いた後の、20分間にわたるインキュベーションにおいて発生した吸光度を用いて、変異体第VIIa因子の活性と野生型第VIIa因子の活性との比を計算した。
比=(A405nmにおける第VIIa因子の変異体)/(A405nmにおける第VIIa因子の野生型)
第VIIa因子変異体活性アッセイ(in vitroにおけるタンパク質分解アッセイ)
天然(野生型) 第VIIa因子および第VIIa因子変異体(本明細書の以下では、いずれも「第VIIa因子」と称する)を並行してアッセイして、それらの特異的活性を直接比較した。アッセイは、マイクロ滴定プレート(MaxiSorp、Nunc、Denmark)により実施した。第VII因子a (10nM)および第X因子 (0.8マイクロモル)を、0.1MのNaCl、5mMのCaCl2、および1mg/mlのウシ血清アルブミンを含有する100マイクロリットルの50mMのHepes、pH 7.4中で15分間にわたりインキュベートした。次いで、0.1MのNaCl、20mMのEDTA、および1mg/mlのウシ血清アルブミンを含有する50マイクロリットルの50mM Hepes、pH 7.4を添加することにより、第X因子の切断を停止させた。最終濃度を0.5mMとする比色基質であるZ-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド(S-2765、Chromogenix、Sweden)を添加することにより、生成する第Xa因子の量を測定する。SpectraMax (商標) 340プレートリーダー(Molecular Devices、USA)により、405nmにおける吸光度を持続的に測定する。FVIIaを含有しないブランクウェルにおける吸光度を差し引いた後の、10分間にわたるインキュベーションにおいて発生した吸光度を用いて、変異体第VIIa因子の活性と野生型第VIIa因子の活性との比を計算した。比=(A405nmにおける第VIIa因子の変異体)/(A405nmにおける第VIIa因子の野生型)
第VIII因子活性アッセイ(比色アッセイ)
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)を、Coatest SP試薬(Chromogenix)を用いるFVIII比色アッセイにより、以下の通りに評価する。rFVIII試料およびFVIII標準物質(例えば、NIBSCによる第7次国際FVIII標準物質に照らして較正した、精製野生型rFVIII)を、Coatestアッセイ緩衝液(50mMのトリス、150mMのNaCl、1%のBSA、pH7.3、保存剤含有)中で希釈する。50μlずつの試料、標準物質、および緩衝液による陰性対照を、96ウェルマイクロ滴定プレート(Nunc)へと2連で添加する。Coatest SPキットによる第IXa因子/ 第X因子試薬、リン脂質試薬、およびCaCl2を、5:1:3 (容量:容量:容量)で混合し、この混合物75μlをウェルに添加する。室温で15分間にわたるインキュベーションの後、第Xa因子基質であるS-2765/トロンビンインヒビターであるI-2581の混合物50μlを添加し、室温で10分間にわたり試薬をインキュベートしてから、25μlの1Mクエン酸、pH3を添加する。620nMにおける吸光度を基準波長として用いるSpectramaxマイクロ滴定プレートリーダー(Molecular Devices)により、415nmにおける吸光度を測定する。全ての試料から陰性対照の値を差し引き、FVIII濃度と対比してプロットされた吸光度値を直線回帰させることにより、検量線を作成する。比活性は、試料の活性を、HPLCにより決定されるタンパク質濃度で除することにより計算する。試料の濃度は、クロマトグラムにおいて軽鎖に対応するピーク下面積を積分し、アミノ酸解析を行うことにより濃度が決定されている、野生型の非修飾rFVIIIのパラレル解析における同じピーク面積と比較することにより決定した。
第VIII因子活性アッセイ(1段階凝固アッセイ)
rFVIII化合物のFVIII活性(FVIII:C)を、1段階FVIII凝固アッセイにより、以下の通りにさらに評価する。rFVIII試料およびFVIII標準物質(例えば、NIBSCによる第7次国際FVIII標準物質に照らして較正した、精製野生型rFVIII)を、HBS/BSA緩衝液(1%のBSAを伴う20mMのhepes、150mMのNaCl、pH7.4)中で約10U/mlまで希釈した後、VWF (Dade Behring)を含有するFVIII欠損血漿中で10倍に希釈する。その後、試料を、HBS/BSA緩衝液中で希釈する。単一因子プログラムを用いるACL300R測定器またはACL5000測定器(Instrumentation Laboratory)を用いて、APTT凝固時間を測定する。VWF (Dade Behring)を伴うFVIII欠損血漿をアッセイ血漿として用い、SynthASil (HemosIL(商標)、Instrumentation Laboratory)をaPTT試薬として用いる。凝固測定器内では、希釈試料または標準物質を、FVIII欠損血漿およびaPTT試薬と37℃で混合する。塩化カルシウムを添加し、濁度を測定することにより、血栓形成までの時間を決定する。FVIII標準物質の希釈液の血栓形成時間についての検量線に基づき、試料中のFVIII:Cを計算する。
Claims (15)
- 全長TFPIのC末端に特異的に結合することが可能な抗体。
- 前記C末端が、TFPI(配列番号1)のアミノ酸186〜276に対応する、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体の重鎖が、配列番号5のアミノ酸99〜107 (WDRFDGFVY)のCDR3配列を含み、これらのアミノ酸のうちの1つまたは2つが、異なるアミノ酸により置換されうる、請求項1または2に記載の抗体。
- 前記抗体の重鎖が、配列番号9のアミノ酸99〜106 (GTYEYVDY)のCDR3配列を含み、これらのアミノ酸のうちの1つまたは2つが、異なるアミノ酸により置換されうる、請求項1または2に記載の抗体。
- 前記抗体の重鎖が、配列番号13のアミノ酸99〜111 (EVYYGYDGDYFDY)のCDR3配列を含み、これらのアミノ酸のうちの1つ、2つまたは3つが、異なるアミノ酸により置換されうる、請求項1または2に記載の抗体。
- 重鎖が、
・配列番号5のアミノ酸31〜35 (SYYMY)のCDR1配列、および/もしくは
・配列番号5のアミノ酸50〜66 (EINPSNGDTNLNEKFKS)のCDR2配列、および/もしくは
・配列番号5のアミノ酸99〜107 (WDRFDGFVY)のCDR3配列を含み、
軽鎖が、
・配列番号7のアミノ酸24〜34 (IISTNIDDDIN)のCDR1配列、および/もしくは
・配列番号7のアミノ酸50〜56 (EGNTLRP)のCDR2配列、および/もしくは
・配列番号7のアミノ酸89〜97 (LQSDDLPYT)のCDR3配列を含むか、
または重鎖が、
・配列番号9のアミノ酸31〜35 (GYPMN)のCDR1配列、および/もしくは
・配列番号9のアミノ酸50〜66 (LINPYNGDTTFNQKFKG)のCDR2配列、および/もしくは
・配列番号9のアミノ酸99〜106 (GTYEYVDY)のCDR3配列を含み、軽鎖が、
・配列番号11のアミノ酸24〜33 (SASSSVFYMH)のCDR1配列、および/もしくは
・配列番号11のアミノ酸49〜55 (DTSILSS)のCDR2配列、および/もしくは
・配列番号11のアミノ酸88〜96 (QQWSSYPLT)のCDR3配列を含むか、
または重鎖が、
・配列番号13のアミノ酸31〜35 (TYWIH)のCDR1配列、および/もしくは
・配列番号13のアミノ酸50〜66 (AIDPGNSDATYSQKFKD)のCDR2配列、および/もしくは
・配列番号13のアミノ酸99〜111 (EVYYGYDGDYFDY)のCDR3配列を含み、軽鎖が、
・配列番号15のアミノ酸24〜38 (RASESVSVHGTHLMH)のCDR1配列、および/もしくは
・配列番号15のアミノ酸54〜60 (AASKLES)のCDR2配列、および/もしくは
・配列番号15のアミノ酸93〜101 (QQSIGDPWT)のCDR3配列
を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。 - 前記抗体が、配列番号5および7、または配列番号9および11、または配列番号13および15を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の抗体。
- 切断型TFPI (1〜161)、切断型TFPI (1〜185)、切断型TFPI (1〜239)、または切断型TFPI (1〜245)からなる群から選択される切断型TFPIには特異的に結合することが可能でない、請求項1から7のいずれか一項に記載の抗体。
- リン脂質の存在下における、TFPIによるTF/FVIIa/FXaの阻害を中和することが可能である、請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む医薬製剤。
- 血液凝固障害を有する対象を治療するための、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体、または請求項10に記載の医薬製剤。
- 血液凝固障害を有する対象を治療するための、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体、および第VIIa因子ポリペプチド、第VIII因子ポリペプチド、または第IX因子ポリペプチドからなるリストから選択される、止血を増強する別の作用剤。
- A型血友病を治療するための、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体、および第VIII因子ポリペプチド。
- B型血友病を治療するための、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体、および第IX因子ポリペプチド。
- インヒビターを伴うA型血友病またはB型血友病を治療するための、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体、および第VIIa因子ポリペプチド。
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