JP2016514687A - 組織因子経路インヒビターに対するプロドラッグ抗体 - Google Patents

Abstract

本開示は、凝固カスケードからのプロテアーゼにさらされた後で初めて組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に特異的に結合するプロドラッグ抗体を提供する。記載されているプロドラッグ抗体は血友病のような出血障害の治療に有用である。そのような治療に使用される場合、これらのプロドラッグ抗体は血栓症のような副作用の可能性を低減する一方で、他の抗ＴＦＰＩ抗体と比較して延長した半減期を示す。【選択図】図１

Description

３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１（ｃ）に従い、〜３１２キロバイトのサイズを有し２０１４年３月１４日付け作成の「ＢＡＹＲＰ０００４ＷＯ ＳＴ２５．ｔｘｔ」と称されるＡＳＣＩＩ準拠テキストファイルとして配列表を本明細書と共に提出する。前記ファイルの内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。

本出願は、２０１３年３月１５日付け出願の米国仮特許出願第６１／７９４，０２４号（その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）に基づく優先権の利益を主張するものである。

Ｉ．技術分野
技術分野は血友病および他の凝固障害の治療に関する。

ＩＩ．関連技術
血液凝固は、血液が安定な血餅を形成して出血を停止させるプロセスである。このプロセスには、血中を循環している幾つかの酵素前駆体および補酵素前駆体（または「凝固因子」）が関与している。それらの酵素前駆体および補酵素前駆体は幾つかの経路で相互作用し、該経路により、それらは活性化形態へと連続的または同時に変換される。最終的に、該プロセスは、第Ｖａ因子、イオン性カルシウムおよび血小板の存在下、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）によりプロトロンビンをトロンビンへと活性化する。そして活性化トロンビンは血小板凝集を誘発し、フィブリノーゲンをフィブリンに変換し、ついでこれは活性化第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩａ）により架橋されて血餅を形成する。

第Ｘ因子の活性化につながるプロセスは、２つの異なる経路、すなわち、接触活性化経路（以前は内因性経路として公知であった）および組織因子経路（以前は外因性経路として公知であった）により遂行されうる。凝固カスケードは、共通の経路へと合流する同等の重要性の２つの経路からなると以前は考えられていた。現在では、血液凝固の開始のための主要経路は組織因子経路であることが公知である。第Ｘ因子は、活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）と組合された組織因子（ＴＦ）により活性化されうる。第ＶＩＩａ因子とその必須補因子であるＴＦとの複合体は凝固カスケードの強力な開始因子である。

凝固の組織因子経路は組織因子経路インヒビター（「ＴＦＰＩ」）によって負に制御される。ＴＦＰＩはＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の天然のＦＸａ依存的フィードバックインヒビターである。それは多価クーニッツ型セリンプロテアーゼインヒビターのメンバーである。生理的には、ＴＦＰＩは活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に結合してヘテロ二量体複合体を形成し、ついでこれはＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体と相互作用して、その活性を抑制し、それにより凝固の組織因子経路を閉鎖する。原則として、ＴＦＰＩ活性の遮断はＦＸａおよびＦＶＩＩａ／ＴＦ活性を回復させて、組織因子経路の作用の持続時間を延長させ、ＦＸａの産生を増幅しうるが、これが血友病ＡおよびＢでは一般に欠損している。

実際、幾つかの予備実験的証拠は、ＴＦＰＩに対する抗体によるＴＦＰＩ活性の遮断が凝固時間の延長を正常化し、または出血時間を短縮することを示している。例えば、Ｎｏｒｄｆａｎｇらは、血友病血漿の希薄（ｄｉｌｕｔｅ）プロトロンビン時間が、ＴＦＰＩに対する抗体で該血漿を処理した後で正常化されることを示した（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１９９１，６６（４）：４６４−４６７）。同様に、Ｅｒｈａｒｄｔｓｅｎらは、血友病Ａウサギモデルにおける出血時間が抗ＴＦＰＩ抗体によって有意に短縮されることを示した（Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，１９９５，６：３８８−３９４）。これらの研究は、抗ＴＦＰＩ抗体によるＴＦＰＩの抑制が血友病ＡまたはＢの治療に有用でありうることを示唆している。これらの研究においてはポリクローナル抗ＴＦＰＩ抗体のみが使用された。

ハイブリドーマ技術を用いて、組換えヒトＴＦＰＩ（ｒｈＴＦＰＩ）に対するモノクローナル抗体が製造され、特定された。Ｙａｎｇら，Ｃｈｉｎ．Ｍｅｄ．Ｊ．，１９９８，１１１（８）：７１８−７２１を参照されたい。希薄プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に対するモノクローナル抗体の効果が試験された。実験は、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体が第ＩＸ因子欠乏血漿の希薄トロンボプラスチン凝固時間を短縮することを示した。組織因子経路は生理的凝固においてだけではなく、血友病の出血においても重要な役割を果たすことが示唆されている（Ｙａｎｇら，Ｈｕｎａｎ Ｙｉ Ｋｅ Ｄａ Ｘｕｅ Ｘｕｅ Ｂａｏ，１９９７，２２（４）：２９７−３００）。

Ｋｊａｌｋｅら，米国特許第７，０１５，１９４号は、出血エピソードの治療もしくは予防または凝固治療のための、ＦＶＩＩａおよびＴＦＰＩインヒビター（ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはそれらのフラグメントを包含する）を含む組成物を開示している。正常哺乳類血漿において凝固時間を減少させるためのそのような組成物の使用も開示されている。更に、ＦＶＩＩａおよびＴＦＰＩインヒビターの開示組成物中に第ＶＩＩＩ因子またはその変異体が含まれうることが示唆されている。ＦＶＩＩＩまたは第ＩＸ因子とＴＦＰＩモノクローナル抗体との組合せは示唆されていない。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を包含するＴＦＰＩインヒビターは、血友病の治療に加えて癌の治療に使用されうることも示唆されている（Ｈｕｎｇ，米国特許第５，９０２，５８２号を参照されたい）。

したがって、血液病および癌を治療するために、ＴＦＰＩに特異的な改良された抗体が必要とされている。

開示の概要
したがって、本開示においては、（ａ）第１軽鎖および第１重鎖可変領域を含み、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に免疫学的に結合する第１可変ドメイン、（ｂ）第１軽鎖および／または第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されたマスキングドメイン、ならびに（ｃ）第１軽鎖および／または第１重鎖可変領域とマスキングドメインとの間に挟まれたプロテアーゼ切断可能リンカーを含む抗体を提供する。該プロテアーゼ切断可能ドメインはトロンビン、プラスミン、第ＶＩＩａ因子または第Ｘａ因子切断部位でありうる。マスキングドメインは、第２軽鎖および第２重鎖可変領域を含む第２可変ドメインを含みうる。該抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体でありうる。該抗体はヒト抗体またはヒト化抗体、および／または一本鎖抗体でありうる。該抗体は２価であることが可能であり、２つのマスキングドメインを含むことが可能であり、１つは各第１軽鎖可変領域のアミノ末端に連結されており、あるいは該抗体は２価であることが可能であり、２つのマスキングドメインを含むことが可能であり、１つは各第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されており、あるいは該抗体は２価であることが可能であり、４つのマスキングドメインを含むことが可能であり、１つは各第１軽鎖可変領域および各第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されており、例えば、この場合、マスキングドメインのうちの２つは第２軽鎖可変領域であり、マスキングドメインのうちの２つは第２重鎖可変領域であり、ここで、第２軽鎖および重鎖可変領域は第２可変ドメインを形成している。第２可変ドメインは組織因子（ＴＦ）、赤血球またはアルブミンに結合しうる。マスキングドメインはアルブミン結合性タンパク質でありうる。該抗体はヒト組織因子経路インヒビターのクーニッツドメイン２に結合しうる。

また、プロモーターの制御下の前記抗体のコード領域を含む発現ベクター、およびそのような発現ベクターを含む細胞を提供する。また、医薬上許容されるバッファー、担体または希釈剤と共に製剤化された前記抗体を含む医薬製剤を提供する。

もう１つの実施形態においては、（ａ）第１軽鎖および第１重鎖可変領域を含み、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に免疫学的に結合する第１可変ドメイン、（ｂ）第１軽鎖および／または第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されたマスキングドメイン、ならびに（ｃ）第１軽鎖および／または第１重鎖可変領域とマスキングドメインとの間に挟まれたプロテアーゼ切断可能リンカーを含む抗体を、患者における凝固を促進させるのに有効な量で投与することを含む、対象における凝固障害の治療方法を提供する。該プロテアーゼ切断可能ドメインはトロンビン、プラスミン、第ＶＩＩａ因子または第Ｘａ因子切断部位でありうる。マスキングドメインは、第２軽鎖および第２重鎖可変領域を含む第２可変ドメインを含みうる。該抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体でありうる。該抗体はヒト抗体またはヒト化抗体、および／または一本鎖抗体でありうる。該抗体は２価であることが可能であり、２つのマスキングドメインを含むことが可能であり、１つは各第１軽鎖可変領域のアミノ末端に連結されており、あるいは該抗体は２価であることが可能であり、２つのマスキングドメインを含むことが可能であり、１つは各第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されており、あるいは該抗体は２価であることが可能であり、４つのマスキングドメインを含むことが可能であり、１つは各第１軽鎖可変領域および各第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されており、例えば、この場合、マスキングドメインのうちの２つは第２軽鎖可変領域であり、マスキングドメインのうちの２つは第２重鎖可変領域であり、ここで、第２軽鎖および重鎖可変領域は第２可変ドメインを形成している。第２可変ドメインは組織因子（ＴＦ）、赤血球またはアルブミンに結合しうる。マスキングドメインはアルブミン結合性タンパク質でありうる。該対象はヒトまたは非ヒト哺乳動物でありうる。該対象は外傷、血友病（例えば、血友病ＡまたはＢ）または癌に罹患していることが可能である。該抗体は全身投与されることが可能であり、あるいは出血部位に局所的または限局的に投与されることが可能である。該抗体は皮下、静脈内または動脈内に投与されうる。該抗体はヒト組織因子経路インヒビターのクーニッツドメイン２に結合しうる。

本明細書に記載されている任意の方法または組成物は、本明細書に記載されている任意の他の方法または組成物に関して実施されうると想定される。

特許請求の範囲および／または本明細書において「含む」なる語と共に用いられる場合の単数形表現の使用は「１（１つ、１個）」を意味しうるが、「１以上」、「少なくとも」および「１またはそれ以上」の意味とも合致する。

本明細書に記載されている任意の実施形態は本発明の任意の方法または組成物に関して実施されることが可能であり、その逆も言えると想定される。更に、本発明の組成物およびキットは、本発明の方法を達成するために使用されうる。

本出願の全体にわたって、「約」なる語は、ある値が、装置の誤差の固有変動、該値を決定するために用いられる方法の固有変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。

開示の詳細な説明
本開示は、血友病治療および他の治療のための、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に対する安全な長時間作用性抗体を記載する。現在、抗ＴＦＰＩ抗体はそれぞれ前臨床および臨床開発中であるが、抗ＴＦＰＩ抗体のインビボ半減期は他のＩｇＧ抗体のものより比較的短い。これは恐らく、標的媒介性クリアランスによるものであろう。また、抗ＴＦＰＩ抗体は、炎症を有する又はＦＶＩＩａで治療された患者においては特に、副作用を引き起こしうるという懸念も生じている。

これらの課題に対処するために、本開示に記載されている抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体を開発した。これらの抗体は、それらが凝固カスケード産生性プロテアーゼにさらされる前には、ＴＦＰＩへの有意に低減した結合を示す。凝固が開始され、プロテアーゼが産生されると、プロテアーゼは、マスキングドメインを切断することにより該抗ＴＦＰＩ抗体を活性化して、ＴＦＰＩへのその結合を増強する。これらのプロドラッグ抗体は、既に記載されている抗ＴＦＰＩ抗体より良好な安全性および薬物動態プロファイルを示す一方で、血友病のような出血障害を治療するために使用されうる。

１．抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体
本明細書に開示されている抗体はＴＦＰＩに特異的に結合する。すなわち、それらは、無関係な抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に対するそれらの結合アフィニティより高い（例えば、少なくとも２倍高い）アフィニティでＴＦＰＩに結合する。本明細書中で用いる「組織因子経路インヒビター」または「ＴＦＰＩ」なる語は、細胞により天然で発現されるヒトＴＦＰＩの任意の変異体、アイソフォームおよび種ホモログを意味する。

幾つかの実施形態においては、プロドラッグ抗体は少なくとも約１０^５Ｍ^−１〜約１０^１２Ｍ^−１（例えば、１０^５Ｍ^−１、１０^５．５Ｍ^−１、１０^６Ｍ^−１、１０^６．５Ｍ^−１、１０^７Ｍ^−１、１０^７．５Ｍ^−１、１０^８Ｍ^−１、１０^８．５Ｍ^−１、１０^９Ｍ^−１、１０^９．５Ｍ^−１、１０^１０Ｍ^−１、１０^１０．５Ｍ^−１、１０^１１Ｍ^−１、１０^１１．５Ｍ^−１、１０^１２Ｍ^−１）のアフィニティでＴＦＰＩに結合する。抗原への抗体結合のアフィニティ（Ｋ_ｄ）は、例えば、イムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫特異的アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、二分子相互作用分析（ＢＩＡ）（例えば、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ＆ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ；Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５，１９９１；Ｓｚａｂｏら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５，１９９５（それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする））、および抗原を発現する細胞への抗体結合の定量のための蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む当技術分野で公知のいずれかの方法を用いてアッセイされうる。ＢＩＡは、相互作用物質のいずれをも標識することなく生物特異的相互作用をリアルタイムで分析するための技術（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭ）である。生物学的分子間のリアルタイム相互作用の指標として、光学的現象である表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）における変化が用いられうる。

抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体は、実質的に完全長の免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ）、それらの抗原結合性フラグメント、例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）_２、あるいは抗原結合部位を含有する構築物、例えばｓｃＦｖ、Ｆｖまたはジアボディ（ＴＦＰＩに特異的に結合しうるもの）を使用して構築されうる。「抗体」なる語は、天然抗体で見出されるものと同じ活性結合性コンホメーションへの抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）インサートの配向をもたらしうる他のタンパク質スカフォールドをも含み、この場合、これらのキメラタンパク質で観察されるＴＦＰＩへの結合が、該ＣＤＲが由来する天然抗体のＴＦＰＩ結合活性と比較して維持されるように、該スカフォールドが含有されている。

本明細書中で用いる「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含有しない抗体である（例えば、ＴＦＰＩに結合する単離された抗体は、ＴＦＰＩ以外の抗原に結合する抗体を実質的に含有しない）。しかし、ヒトＴＦＰＩのエピトープ、アイソフォームまたは変異体に結合する単離された抗体は、例えば他種由来（例えば、ＴＦＰＩ種ホモログ）の他の関連抗原に対する交差反応性を有しうる。単離された抗体は他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含有しないことが可能である。

特定の抗ＴＦＰＩ抗体は米国特許公開ＵＳ２０１２／２０２６８９１７、ＵＳ２０１２／０１０８７９６、ＵＳ２０１１／０２２９４７６および国際特許公開ＷＯ２０１２／１３５６７１（これらの文書のそれぞれの全開示を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。

Ａ．マスク化抗体
幾つかの実施形態においては、本明細書に開示されているプロドラッグ抗体は、ＴＦＰＩに結合する該抗体の能力を低減するマスキングドメインを有するように操作される。これらのマスキングドメインは凝固カスケードの要素または他の関連マーカーを認識しうるであろう。幾つかの実施形態においては、マスキングドメインは、組織因子（ＴＦ）、赤血球（ＲＢＣ）および／またはアルブミンのような生物学的分子を認識する以下の要素を含む。図１に示されているとおり、これらのマスキングドメインは、プロテアーゼ切断部位を介して、該抗体の可変領域に結合される。これらのマスキングドメインは抗体、ペプチド、タンパク質または別のスカフォールドでありうるであろう。いずれにせよ、マスキングドメインは、除去されるまでは、該抗体がその可変領域を介してＴＦＰＩに結合することを妨げる。

本明細書に開示されているプロドラッグ抗体は、１以上のプロテアーゼにより認識されるプロテアーゼ切断部位を含むように操作され。その切断はマスキングドメインを遊離し、ＴＦＰＩに該抗体が結合することを可能にする。本明細書中で用いる「プロテアーゼ切断部位」は、プロテアーゼにより認識され切断されるアミノ酸配列を意味する。幾つかの実施形態においては、プロテアーゼ切断部位は、抗ＴＦＰＩ抗体の可変領域をマスク（遮蔽）するように配置され、図１に示されている。幾つかの実施形態においては、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体は、トロンビン、プラスミンおよび／または第Ｘａ因子により切断されうる１以上のプロテアーゼ切断部位を含む。凝固カスケードにより活性化またはアップレギュレーションされるプロテアーゼのための他のプロテアーゼ切断部位が使用されうると予想される。幾つかの実施形態においては、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の可変領域をマスクするアミノ酸配列は、プロテアーゼ切断部位に加えて、ポリペプチドリンカー（例えば図１に例示されているとおり）および／またはＴＦ、ＲＢＣもしくはアルブミンに結合する抗体、ペプチド、タンパク質もしくは別のスカフォールドを含む。該リンカーは単一アミノ酸またはポリペプチド配列（例えば、１００アミノ酸まで）でありうる。例えば、該リンカーはＧＧＧＧＳ（配列番号１４９）でありうる。他の有用なリンカーには、配列番号１５１〜１７６に示されているものが含まれる。他の実施形態においては、リンカーは存在せず、図１に示されているとおり、ＴＦ、ＲＢＣまたはアルブミンに結合する抗体、ペプチド、タンパク質または別のスカフォールドで、ＴＦＰＩへのその結合をマスクするように、切断部位自体が可変領域上に挿入される。

トロンビンのための以下の少なくとも２つの最適切断部位が決定されている：（１）Ｘ_１−Ｘ_２−Ｐ−Ｒ−Ｘ_３−Ｘ_４（配列番号１４７）（ここで、Ｘ_１およびＸ_２は疎水性アミノ酸であり、Ｘ_３およびＸ_４は非酸性アミノ酸である）；および（２）ＧＲＧ。トロンビンはアルギニン残基の後で特異的に切断する。プラスミンも２つの前記切断部位を切断しうるが、トロンビンと比較して低い特異性で切断する。他の有用なトロンビン切断部位は配列番号１〜６０として示されている。他の有用なプラスミン切断部位は配列番号１２、４７、４８、５３および６１〜１３０として示されている。幾つかの実施形態においては、該切断部位はＬＶＰＲＧＳ（配列番号１３７）である。

幾つかの実施形態においては、第Ｘａ因子切断部位、例えばＩ（ＥまたはＤ）−Ｇ−Ｒ（配列番号１４８）が使用される。他の有用な第Ｘａ因子切断部位は配列番号２９、５９および６１〜６９として示されている。

切断部位に加えて、切断をより効率的にするためにプロテアーゼの第２結合部位、いわゆるエキソサイトが抗ＴＦＰＩプロドラッグ内に導入されうる。トロンビンのエキソサイトは、プロテアーゼ基質またはインヒビター、例えばＰＡＲ１、フィブリノーゲンおよびヒルジンの天然エキソサイトからのものでありうる。エキソサイトはまた、タンパク質からの他のエキソサイトの誘導体でありうる。

Ｂ．抗体合成
抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体は合成的または組換え的に製造されうる。抗体を製造するためには多数の技術が利用可能である。例えば、抗体を製造するためにファージ−抗体技術が用いられうる（Ｋｎａｐｐｉｋら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６，２０００（これを参照により本明細書に組み入れることとする））。抗体を得るためのもう１つのアプローチは、ＷＯ ９１／１７２７１およびＷＯ ９２／０１０４７（それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおり、Ｂ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。これらの方法においては、メンバーが種々の抗体をそれらの外表面上に提示する、ファージのライブラリーを作製する。抗体は、通常、ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして提示される。選択されたタンパク質への結合に関するアフィニティ増強により、ファージ提示抗体を選択する。抗体は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）法（例えば、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２：３６１−３６７，１９８３；米国特許第４，６３４，６６４号；米国特許第４，６３４，６６６号（それらの全てを参照により本明細書に組み入れることとする））を用いて製造されうる。

抗体はまた、該抗体を発現するいずれかの細胞、例えば、抗体コード化発現構築物でトランスフェクトされた宿主細胞から精製されうる。該宿主細胞は、該抗体が発現される条件下で培養されうる。精製抗体は、細胞において該抗体に付随していることがある他の細胞成分、例えば或るタンパク質、炭水化物または脂質から、当技術分野でよく知られた方法を用いて分離されうる。そのような方法には、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アルミニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび分取ゲル電気泳動が含まれるが、これらに限定されるものではない。調製物の純度は、当技術分野で公知のいずれかの手段、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により評価されうる。精製抗体の調製物は２以上のタイプの抗体を含有しうる。

あるいは、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体は、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法を用いて、例えば固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２−２０４，１９９５（それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする））を用いる直接的ペプチド合成により製造されうる。タンパク質合成は、手動技術を用いて又は自動化により行われうる。所望により、化学的方法を用いて、抗体のフラグメントを別々に合成し、合体して、完全長分子を製造することが可能である。

幾つかの実施形態においては、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体は「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）形態」としても構築可能であり、この場合、可変領域上のペプチドリンカー、抗体、ペプチド、タンパク質または別のスカフォールド内またはそれらの周辺に、ＴＦＰＩを認識するその能力をマスク（遮蔽）するように、プロテアーゼ切断部位が挿入される。抗原結合のためにｓｃＦｖの２つの可変領域を合体させるためには該ペプチドリンカーが必要であるため、該ペプチドリンカーまたは隣接領域の切断は、関心のあるプロテアーゼがｓｃＦｖのその抗原への結合を不活性化またはダウンレギュレーションすることを可能にする。

幾つかの実施形態においては、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体は、２つの結合部位を有する「ＩｇＧ形態」で構築され、ＴＦＰＩを認識するその能力をマスク（遮蔽）するように、可変領域と抗体、ペプチド、タンパク質または別のスカフォールドとの間に１個、２個、３個または４個のプロテアーゼ切断部位を含みうる。各場合において、プロテアーゼ切断部位は片側または両側でリンカーに隣接しうる。更に、各場合において、切断部位は同じ又は異なることが可能である。

２．ポリヌクレオチド
本開示は、プロドラッグ抗体をコードするポリヌクレオチドをも提供する。これらのポリヌクレオチドは、例えば、治療用の大量の抗体を製造するために使用されうる。

ｍＲＮＡを鋳型として使用して、標準的な分子生物学技術で、抗体コード化ｃＤＮＡ分子を製造することが可能である。ついで、当技術分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；１９８９）Ｖｏｌ．１−３（これを参照により本明細書に組み入れることとする））のようなマニュアルに開示されている分子生物学技術を用いて、ｃＤＮＡ分子を複製させることが可能である。ポリヌクレオチドの追加コピーを得るために、ＰＣＲのような増幅技術が使用されうる。あるいは、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体をコードするポリヌクレオチドを合成するために、合成化学技術が用いられうる。

抗体をコードするポリヌクレオチドを発現させるために、挿入コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有する発現ベクター内に該ポリヌクレオチドを挿入することが可能である。抗体をコードする配列と適当な転写および翻訳制御要素とを含有する発現ベクターを構築するためには、当業者によく知られた方法が用いられうる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝的組換えが含まれる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９５）（それらを共に参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。

抗体をコードする配列を含有させ発現させるためには、種々の発現ベクター／宿主系が使用されうる。これらには、限定的なものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌のような微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）で形質転換された植物細胞系；あるいは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）；あるいは動物細胞系が含まれる。

制御要素または調節配列は、転写および翻訳を行うために宿主細胞タンパク質と相互作用する、ベクターの非翻訳領域、すなわち、エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域である。そのような要素は強度および特異性において様々でありうる。ベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導性プロモーターを含む幾つもの適当な転写および翻訳要素が使用されうる。例えば、細菌系におけるクローニングの場合には、誘導性プロモーターが使用されうる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターが昆虫細胞において使用されうる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーターもしくはエンハンサー（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯおよび貯蔵タンパク質遺伝子）または植物ウイルスに由来するプロモーターもしくはエンハンサー（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）がベクター内にクローニングされうる。哺乳類細胞系においては、哺乳類遺伝子由来または哺乳類ウイルス由来のプロモーターが使用されうる。抗体をコードするヌクレオチド配列の複数コピーを含有する細胞系を作製する必要がある場合には、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターが適当な選択マーカーと共に使用されうる。

３．ＴＦＰＩに対する抗体の製造方法
抗体の製造を含む追加的な有用な分子生物学的技術を記載している一般的なテキストとしては以下のものが挙げられる：ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；１９８９）Ｖｏｌ．１−３）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓａｂｅｌら［編］，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２０００年までの補遺））；Ｈａｒｌｏｗら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８），Ｐａｕｌ［編］）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９８））；ならびにＨａｒｌｏｗら（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８））（それらの全てを参照により本明細書に組み入れることとする）。

マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体を製造するために遺伝子工学を用いて、ヒトの疾患に対する治療用抗体が製造されている。マウスモノクローナル抗体は、短い血清半減期、ヒトエフェクター機能を誘発し得ないこと、およびヒト抗マウス抗体の産生ゆえに、治療用物質としての限られた用途しか有さないことが示されている（ＢｒｅｋｋｅおよびＳｎｄｌｉｅ，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｄａｗｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ Ｃｅｎｔｕｒｙ”，Ｎａｔｕｒｅ ２，５３，５２−６２（２００３年１月））。キメラ抗体はヒト抗キメラ抗体応答を引き起こすことが示されている。ヒト化抗体は抗体のマウス成分を更に最低限度にしたものである。一方、完全ヒト抗体は、マウス要素に関連した免疫原性を完全に回避する。特に、抗ＴＦＰＩモノクローナル抗体での血友病治療に要求されるような慢性的予防的治療は、マウス成分を有する又はマウス由来の抗体が使用された場合には、頻繁な投与が要求され治療が長期にわたるため、該治療に対する免疫応答の発生の高いリスクを有する。例えば、血友病Ａに対する抗体療法は患者の生涯にわたる毎週の投与を要しうる。これは免疫系に対する継続的なチャレンジとなるであろう。したがって、血友病ならびに凝固における関連遺伝的および後天的欠乏症または欠損症に対する抗体療法のための完全ヒト抗体が必要とされている。

治療用抗体は、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｆｕｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５）に記載されているハイブリドーマ技術により製造されている。完全ヒト抗体はまた、原核生物および真核生物において組換え製造されうる。治療用抗体には、ハイブリドーマ製造ではなく宿主細胞における抗体の組換え製造が好ましい。組換え製造は、より大きな製品一貫性、恐らくより高い製造レベル、および動物由来タンパク質の存在を最小化または排除する管理された製造という利点を有する。これらの理由により、組換え製造モノクローナル抗ＴＦＰＩ抗体を得ることが望ましいであろう。

該モノクローナル抗体は、本発明の実施形態におけるモノクローナル抗体の可変領域をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞内で発現させることにより組換え製造されうる。発現ベクターの補助により、該ヌクレオチド配列を含有する核酸は、該製造に適した宿主細胞においてトランスフェクトされ発現されうる。したがって、また、（ａ）本発明のモノクローナル抗体をコードする核酸分子を宿主細胞内にトランスフェクトし、（ｂ）該宿主細胞を培養して、該宿主細胞内で該モノクローナル抗体を発現させ、所望により、（ｃ）産生されたモノクローナル抗体を単離し、精製することを含む、ヒトＴＦＰＩに結合するモノクローナル抗体の製造方法を提供し、ここで、該核酸分子は本発明のモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。

１つの例においては、該抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、標準的な分子生物学技術により得られた部分的または完全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に機能的に連結されるように、発現ベクター内に挿入する。この場合、「機能的に連結（される）」なる語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が、抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター内に連結されることを意味すると意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主に和合性となるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は別々のベクター内に挿入されることが可能であり、あるいはより典型的には、両方の遺伝子は同一発現ベクター内に挿入される。抗体遺伝子は標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクターの相補的制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）により発現ベクター内に挿入される。本明細書に記載されている抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、所望のイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクター内にそれらを挿入してＶ_Ｈセグメントがベクター内でＣ_Ｈセグメントに機能的に連結されＶ_Ｌセグメントがベクター内でＣ_Ｌセグメントに機能的に連結されるようにすることにより、任意の抗体イソタイプの完全長抗体遺伝子を作製するために使用されうる。それに加えて又はその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター内にクローニングされうる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）でありうる。

抗体鎖コード化遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を含有する。「調節配列」なる語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むと意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列の選択を含む、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、望まれるタンパク質の発現のレベルなどのような要因に左右されうる、と当業者に理解されるであろう。哺乳類宿主細胞発現のための調節配列の例には、哺乳類細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。あるいは、非ウイルス調節配列、例えばユビキチンプロモーターまたはベータ−グロビンプロモーターが使用されうる。

抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞における該ベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子のような追加的配列を含有しうる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７号（全てＡｘｅｌら））。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、薬物（例えば、Ｇ４１８、ヒグロマイシンまたはメトトレキセート）に対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子の例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞における使用のためのもの）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。

軽鎖および重鎖の発現のためには、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術により宿主細胞内にトランスフェクトする。種々の形態の「トランスフェクション」なる語は、原核または真核宿主細胞内への外因性ＤＮＡの導入のために一般に用いられる多種多様な技術、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを含むと意図される。本発明の抗体を原核または真核宿主細胞において発現させることは理論的に可能であるが、真核細胞、特に哺乳類宿主細胞における発現が最も好ましい。なぜなら、そのような真核細胞、特に哺乳類細胞は、適切にフォールディングされた免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性が、原核細胞の場合より高いからである。

組換え抗体を発現させるための哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えばＲ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６−４２２０に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＫＢ１１細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳類宿主細胞に導入する場合には、該宿主細胞における該抗体の発現または該宿主細胞が培養される培地内への該抗体の分泌を可能にするのに十分な時間にわたり該宿主細胞を培養することにより、該抗体が産生される。標準的なタンパク質精製方法、例えば限外濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび遠心分離を用いて、抗体は培地から回収されうる。

４．無傷抗体を発現させるための部分抗体配列の使用
抗体は、６個の重鎖および軽鎖ＣＤＲに位置するアミノ酸残基を介して優先的に標的抗原と相互作用する。この理由により、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は個々の抗体間でＣＤＲ以外の配列より多様である。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用をもたらすため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列上にグラフト化された天然に存在する特異的抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、天然に存在する特異的抗体の特性を模倣した組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５；およびＱｕｅｅｎら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３を参照されたい）。そのようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的ＤＮＡデータベースから得られうる。これらの生殖系列配列は成熟抗体遺伝子配列とは異なる。なぜなら、それらは、Ｂ細胞成熟中にＶ（Ｄ）Ｊ連結により形成される完全構築可変遺伝子を含まないからである。元の抗体のものに類似した結合特性を有する無傷組換え抗体を再生成させるためには、個々の抗体の全ＤＮＡ配列を得ることは必要でない（ＷＯ ９９／４５９６２を参照されたい）。典型的には、この目的には、ＣＤＲ領域に広がる部分的重鎖および軽鎖配列で十分である。どの生殖系列可変および連結遺伝子セグメントが組換え抗体可変遺伝子に寄与したのかを決定するために、該部分配列を使用する。ついで、可変領域の欠落部分を埋めるために、生殖系列配列を使用する。重鎖および軽鎖リーダー配列は成熟中に切断され、最終的な抗体の特性に寄与しない。この理由により、配列構築物のために対応生殖系列リーダー配列を使用することが必要である。欠落配列を付加するために、連結またはＰＣＲ増幅によりクローン化ｃＤＮＡ配列を合成オリゴヌクレオチドと組合せることが可能である。あるいは可変領域全体を短い重複オリゴヌクレオチドのセットとして合成し、ＰＣＲ増幅により組合せて、完全に合成的な可変領域クローンを作製することが可能である。このプロセスは特定の制限部位の排除または含有あるいは特定のコドンの最適化のような一定の利点を有する。

天然配列と同じアミノ酸コード化容量を有する合成Ｖ配列を作製するために、合成オリゴヌクレオチドの重複セットを設計するために、重鎖および軽鎖転写産物のヌクレオチド配列を使用する。合成重鎖およびカッパ鎖配列は以下の３つの点で天然配列とは異なりうる：オリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅を促進させるために、反復ヌクレオチド塩基の配列が遮られる；コザック則（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０）に従い最適翻訳開始部位が組込まれる；ならびに翻訳開始部位の上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位が設けられる。

重鎖および軽鎖可変領域の両方に関して、最適化コード鎖配列および対応非コード鎖配列は対応非コードオリゴヌクレオチドのほぼ中点において３０〜５０個のヌクレオチド断片に分けられる。したがって、各鎖に関して、該オリゴヌクレオチドは、１５０〜４００ヌクレオチドのセグメントにわたる重複二本鎖セットへと合体されうる。ついで該プールを鋳型として使用して、１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を得る。典型的には、単一可変領域オリゴヌクレオチドセットは２つのプールへに分けられ、これらは別々に増幅されて２つの重複ＰＣＲ産物を与える。ついで、これらの重複産物をＰＣＲ増幅により合体させて、完全可変領域を形成させる。発現ベクター構築物内に容易にクローニングされうる断片を作製するために、ＰＣＲ増幅において重鎖または軽鎖定常領域の重複断片を含めることも望ましいかもしれない。

ついで、再構築された重鎖および軽鎖可変領域をクローン化プロモーター、翻訳開始配列、定常領域、３’非翻訳配列、ポリアデニル化配列および転写終結配列と合体させて、発現ベクター構築物を形成させる。重鎖および軽鎖発現構築物を単一ベクターへと合体させ、宿主細胞内にコトランスフェクトし、連続的にトランスフェクトし、または別々にトランスフェクトし、ついでそれを融合させて、両鎖を発現する宿主細胞を得ることが可能である。

したがって、もう１つの態様においては、ヒト抗ＴＦＰＩ抗体、例えばＴＰ２Ａ８、ＴＰ２Ｇ６、ＴＰ２Ｇ７、ＴＰ４Ｂ７などの構造的特徴を用いて、ＴＦＰＩへの結合の機能を保有する構造的に関連したヒト抗ＴＦＰＩ抗体を製造する。より詳細には、本発明のモノクローナル抗体の特異的に特定された重鎖および軽鎖領域の、１以上のＣＤＲを、公知ヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組換え的に合体させて、本発明の追加的組換え操作ヒト抗ＴＦＰＩ抗体を製造することが可能である。

５．医薬組成物
抗ＴＦＰＩプロドラッグは、医薬上許容される担体を含む医薬組成物中で提供されうる。医薬上許容される担体は、好ましくは、非発熱性である。抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体を含む医薬組成物は単独で又は少なくとも１つの他の物質、例えば安定化化合物と共に投与されることが可能であり、それは、塩類液（食塩水）、緩衝食塩水、デキストロースおよび水（これらに限定されるものではない）を含むいずれかの無菌生体適合性医薬担体中で投与されうる。種々の水性担体、例えば０．４％ 塩類液、０．３％ グリシンなどが使用されうる。これらの溶液は無菌であり、一般に、粒子状物を含有しない。これらの溶液は通常の良く知られた滅菌技術（例えば、濾過）により滅菌されうる。該組成物は、生理的条件に近づけるために、必要に応じて、医薬上許容される補助物質、例えばｐＨ調節および緩衝化剤などを含有しうる。医薬組成物中の抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の濃度は広範に、すなわち、約０．５重量％未満、通常は少なくとも約１％から、１５または２０重量％まで変動可能であり、主に、選択される個々の投与様式に従い、流体体積、粘度などに基づいて選択される。例えば、米国特許第５，８５１，５２５号（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。所望により、２以上の異なる抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体が医薬組成物に含まれうる。

有効成分に加えて、医薬組成物は、医薬用に使用されうる製剤への該組成物の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む適当な医薬上許容される担体を含有しうる。医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下または直腸手段（これらに限定されるものではない）を含む幾つかの経路により投与されうる。

医薬組成物が製造された後、それらは適当な容器内に配置され、適応病態の治療に関してラベル表示されうる。そのようなラベル表示は投与の量、頻度および方法を含むであろう。該組成物は更に、所望により貯蔵および使用のための説明を含む、成形スチロフォーム（Ｓｔｙｒｏｆｏａｍ）およびプラスチックブロー成形容器を含む適当なパッケージング材により一体化された１以上の容器を含有するキット内にパッケージング（包装）されうる。

６．出血障害の治療方法
Ａ．障害
血友病は、血管が破壊された際に出血を止めるために用いられる血液凝固または凝血を制御する身体の能力を損なう遺伝性遺伝障害の一群である。血友病Ａ（凝固第ＶＩＩＩ因子欠乏症）は、出生男性５，０００〜１０，０００人に約１人の割合で存在する最もよく見られる形態の該障害である。血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠乏症）は出生男性約２０，０００〜３４，０００人に約１人の割合で生じる。

ほとんどの劣性伴性Ｘ染色体障害と同様に、血友病は女性より男性で生じる可能性が高い。これは、女性は２つのＸ染色体を有するが、男性は１つしか有さないため、欠損遺伝子が、それを有する全ての男性で確実に顕在化するからである。女性は２つのＸ染色体を有し、血友病は稀であるため、女性が該遺伝子の２つの欠損コピーを有する可能性は非常に低く、したがって、女性は該障害の、ほぼ例外なく無症候性のキャリアである。女性キャリアは彼女らの母親または父親のいずれかから欠損遺伝子を受け継いでいる可能性があり、あるいはそれは新たな突然変異でありうる。女性が血友病を有することは有り得なくはないが、稀である。血友病ＡまたはＢを有する女性は血友病の男性とキャリアの女性との娘でなければならないことになるが、どちらの性別をも冒しうる凝固第ＸＩ因子欠乏による非伴性血友病Ｃはアシュケナージ系ユダヤ人（東欧）の系統でよりよく見られるが、他の集団群では稀である。

血友病は、正常凝血過程に必要とされる凝固因子の血漿凝固因子レベルを低下させる。したがって、血管が損傷されると、一時的なかさぶたは生じるが、凝固因子の欠損は、血液凝固の維持に必要なフィブリン形成を阻む。血友病患者は、それを有さない者より著しい出血を引き起こしはしないが、遥かに長時間にわたって出血しうる。重篤な血友病患者においては、小さな損傷でさえも、数日間または数週間も続く出血を引き起こしたり、あるいは更には決して完全には治癒しないことがある。脳または内部関節のような領域においては、これは致命的となったり、あるいは永続的に消耗性となりうる。

本開示の抗体により治療されうる他の出血障害には、後天性血小板機能欠損、先天性血小板機能欠損、先天性プロテインＣまたはＳ欠乏症、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、第ＩＩ因子欠乏症、第Ｖ因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）およびフォンヴィレブランド病が含まれる。

Ｂ．医薬組成物、経路および投与量
１以上の抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体を含む医薬組成物は単独で又は他の物質、薬物もしくは凝固因子と共に、血友病または他の凝固障害を治療するために患者に投与されうる。抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の「治療的有効量」は、凝固を促進する又は出血時間を低減する抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の量を意味する。治療的有効量の決定は当業者の技量の範囲に十分に含まれる。

治療的有効量は最初は細胞培養アッセイにおいて又は動物モデル、通常はラット、マウス、ウサギ、イヌもしくはブタにおいて評価されうる。動物モデルはまた、適当な濃度範囲および投与経路を決定するために使用されうる。ついでそのような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために用いられうる。

抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の治療有効性および毒性、例えば、ＥＤ_５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ_５０（集団の５０％に致死的な用量）は、細胞培養または実験動物において、標準的な薬学的手法により決定されうる。毒性効果対治療効果の用量比は治療指数であり、それは比，ＬＤ_５０／ＥＤ_５０として表されうる。

大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータはヒトでの使用のための投与量の範囲の決定において用いられる。そのような組成物に含まれる投与量は、好ましくは、毒性をほとんど又は全く伴わないＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される剤形、患者の感受性および投与経路に応じて、この範囲内で変動する。

厳密な投与量は、治療を要する患者に関連した要因を考慮して、実施者により決定される。投与量および投与は、抗ＴＦＰＩプロドラッグの十分なレベルが得られるように、または所望の効果が維持されるように調節される。考慮されうる要因には、病態の重症度、対象の全身健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組合せ、反応感受性ならびに治療に対する耐性／応答が含まれる。長時間作用性医薬組成物は、個々の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３〜４日ごと、毎週、または２週間に１回、投与されうる。

幾つかの実施形態においては、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の治療的に有効なインビボ投与量は約５μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（ｋｇは患者の体重）の範囲である。

抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体を含む医薬組成物の投与様式は、該抗体を宿主に運搬するいずれかの適当な経路（例えば、皮下、筋肉内、静脈内または鼻腔内投与）でありうる。

幾つかの実施形態においては、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体は、他の治療用物質を伴わずに投与される。幾つかの実施形態においては、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体は、凝固障害を有する者に血栓症を引き起こしうる範囲より低いトロンビンレベルが維持されることを確保しつつトロンビンの初期産生を増強するために、他の物質、例えば薬物または凝固因子と組合せて投与される。抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の投与は他の物質の投与の前、後またはそれと実質的に同時に行われうる。

以下の図面は本明細書の一部を構成し、本開示の或る態様を更に実証するために含まれている。本開示は、本明細書に記載されている特定の実施形態の詳細な説明と共にこれらの図面の１以上を参照することによって、より良く理解されうる。

抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の実施形態、およびそれがインビボでどのように機能するのかの例示。 抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の潜在的マスキング法の例示。 Ａ〜Ｂ。ＴＦＰＩおよびＴＦに対する可変領域が縦列連結されているＴＦ結合性プロドラッグのベクター地図。（図３Ａ）ＨＣ１−ｐＴＴＦ５ ｇＡ２００抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体フラグメントのベクター地図。（図３Ｂ）ＬＣ１−ｐＴＴＦ ６４１抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体フラグメントのベクター地図。 Ａ〜Ｃ。ＴＦまたはＲＢＣに対するｓｃＦｖが抗ＴＦＰＩ抗体の重鎖のアミノ末端上に連結されたＴＦ結合性プロドラッグおよびＲＢＣ結合性プロドラッグのベクター地図。（図４Ａ）ｐＱＭ１−３Ｅ１０ｓｃ−ｇＡ２００ＨＣ抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体フラグメントのベクター地図。（図４Ｂ）ｐＱＭ１−Ｔ１１９ｓｃ−ｇＡ２００ＨＣ抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体フラグメントのベクター地図。（図４Ｃ）ｐＱＭ１／ｇＡ２００ＬＣ抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体フラグメントのベクター地図。 Ａ〜Ｂ。アルブミン結合性プロドラッグのベクター地図。（図５Ａ）ｐＱＭ１−５６Ｅ４−ｇＡ２００Ｈ抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体フラグメントのベクター地図。（図５Ｂ）ｐＱＭ１−５６Ｅ４−ｇＡ２００Ｌ抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体フラグメントのベクター地図。 ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の非存在下の非還元条件およびＤＴＴの存在下の還元条件における、クーマシー染色を用いた、３Ｅ１０−ｓｃＦｖ−ｇＡ２００およびＴｅｒ１１９−ｓｃＦｖ−ｇＡ２００抗ＴＦＰＩ ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。 天然ｇＡ２００と比較して５６Ｅ４−ｇＡ２００の結合アフィニティを決定するためのＴＦＰＩ結合性ＥＬＩＳＡのグラフ。 抗体濃度の関数としてのＲＢＣへのＴｅｒ１１９ｓｃ−ｇＡ２００結合のグラフ。 種々の抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体および未修飾抗ＴＦＰＩ抗体ｇＡ２００に関するＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭ測定の結果［ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下または非存在下のＴＦＰＩに対する相対結合率］のグラフ。 Ａ〜Ｇ。（図１０Ａ）抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体５６Ｅ−ｇＡ２００および抗ＴＦＰＩ抗体ｇＡ２００の抗体濃度の関数としてのピークトロンビンのグラフ。（図１０Ｂ）抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体５６Ｅ４−ｇＡ２００および抗ＴＦＰＩ抗体ｇＡ２００の種々の濃度の関数としてのトロンビン産生のグラフであり、各抗体濃度において産生されたトロンビンの濃度を示している。（図１０Ｃ）トロンビンおよびＦＸａ活性化の両方により活性化されうるプロドラッグＴＰＰ−２６５４ならびにその親抗体ｇＡ２００のトロンビン産生プロファイルの比較。外因性トロンビンを加え、ついで該添加トロンビンを不活性化するためにヒルジンを加えることにより、ＴＰＰ−２６５４を活性化するトロンビンの能力を評価した。対照は、トロンビンの代わりにバッファーが加えられた反応を含む。（図１０Ｄ）プロドラッグＴＰＰ−２６５４を活性化するために要したトロンビンの力価測定を示す。試験されたトロンビン濃度は、生理的に潜在的に達成可能な範囲内である。（図１０Ｅ）プロドラッグＴＰＰ−２６５４を活性化するＦＸａの能力を間接的に評価した。ＴＧＡ反応を開始させるために用いるＴＦ濃度を増加させることにより、ＦＸａおよびトロンビンレベルを増加させた。ＴＰＰ−２６５４応答を増強する外因性トロンビンの能力を、ＦＸａおよびトロンビン活性化の両方により達成されるものと比較することにより、プロドラッグを活性するためのＦＸａの相対的寄与が評価されうる。（図１０Ｆ）トロンビンのみにより活性化されたプロドラッグＴＰＰ−２６５２のトロンビン産生を示す。ここでは、ＴＦＰＩ Ａｂを活性化するための変換のためには、プロドラッグＴＰＰ−２６５２は〜２．５Ｕ／ｍＬのトロンビンを要することを、力価測定研究は示した。（図１０Ｇ）該ＴＦ力価測定実験の結果において、ＦＸａに対するＴＰＰ−２６５２の相対的非感受性が認められうる。ＦＸａおよびトロンビン活性化の両方により活性化されるように設計されたＴＰＰ−２６５４とは対照的に、ＴＰＰ−２６５２は、より高いＴＦ使用用量においては、トロンビン産生における、より低い上昇を示した（図１０Ｇを図１０Ｅと比較されたい）。 抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体および未修飾抗ＴＦＰＩ抗体に対する種々の濃度のアルブミンの効果のグラフ。 本開示に従い抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体を製造するために組合されうる重鎖および軽鎖の配列。 本開示における抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の重鎖および軽鎖の配列。 Ａ〜Ｂ。本開示における抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の、選択された重鎖（図１４Ａ）ならびに重および軽鎖（図１４Ｂ）のアミノ末端配列。 図１５Ａ．ヒトまたはサルアルブミンの非存在または存在下のアルブミン結合性抗ＴＦＰＩプロドラッグのＴＦＰＩ結合（表面プラズモン共鳴−Ｂｉａｃｏｒｅデータ）。図１５Ｂ．ヒト／サルアルブミンの非存在下または存在下のトロンビンでの処理または非処理の後のアルブミン結合性抗ＴＦＰＩプロドラッグのＴＦＰＩ結合（表面プラズモン共鳴）。 １６Ａ〜Ｃ。（図１６Ａ〜Ｂ）トロンビン切断後の抗ＴＦＰＩプロドラッグＴＰＰ−２６５２およびＴＰＰ−２６５４の質量スペクトル。（図１６Ｃ）Ｆｘａで切断された抗ＴＦＰＩプロドラッグＴＰＰ−２６５４の質量スペクトル。

７．実施例
以下の実施例は、本開示の種々の態様を更に例示するために記載されている。以下の技術は、具体的な実施形態の実施において十分に機能することが本発明者により見出された技術および／または組成物を表し、その実施のための好ましい様態を構成しうると、当業者に理解されるべきである。しかし、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、これらの実施形態においては変更が施されることが可能であり、尚も同様または類似の結果が得られうる、と当業者は本開示を考慮して理解するであろう。

実施例１ − 抗ＴＦＰ１プロドラッグ抗体設計方法
抗ＴＦＰＩ活性をマスク（遮蔽）するためには少なくとも３つの方法が想定されているが、追加的な方法も想定される。抗組織因子抗体ドメイン、抗赤血球抗体ドメインまたはアルブミン結合性ペプチドがマスキング（遮蔽）ドメインとして使用されうる。マスキング機能は、第１標的、例えば組織因子、赤血球またはアルブミンへのプロドラッグ抗体結合を含みうる。抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体がその潜在性形態で存在する場合には、図１に示すとおり、凝固カスケードから産生されたプロテアーゼによりマスキング領域が切断されるまでは、ＴＦＰＩへの結合は全く生じないか、または有意に低減されるであろう。種々の形態のプロドラッグ抗体が設計されている。それらの形態の全ては、ＦｃＲｎ結合を可能にして長い半減期をもたらすＦｃ領域を含むが、可変領域は修飾されうる（縦列連結可変領域、ｓｃＦｖ−可変領域融合、ペプチド−可変領域融合などを含む）。これらのプロドラッグ抗体の表示を図２に示す。現在想定されているプロドラッグ抗体の親抗体はヒト抗体ライブラリーから見出された。これらの抗体は、それらのアフィニティおよび機能性を改善するために、十分に最適化されている。親抗体ｇＡ２００およびｇＢ９．７はヒトＴＦＰＩに対する高いアフィニティおよび特異性を有していて、組織因子（ＴＦ）により開始される凝固を促進させる。

マスキング法
Ａ．組織因子結合
組織因子（ＴＦ）は、酵素前駆体プロトロンビンからのトロンビン形成の開始に必要な、内皮細胞下組織および白血球に存在するタンパク質である。組織因子は、損傷が生じて初めて血流にさらされて、凝固を開始させる。したがって、ＴＦの標的化は、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体が損傷部位上で活性化されることを可能にする。抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体内に組込まれたＴＦ結合のマスキングドメインは、ＴＦの機能を阻止しないＴＦ結合性抗体、ペプチドまたは代替的スカフォールドでありうるであろう。

Ｂ．抗赤血球結合
ＲＢＣ（赤血球）は薬物および酵素の運搬のための担体またはデポーとして使用されている。ＲＢＣは生体適合性、生分解性であり、長い循環半減期を有し、種々の生物活性物質がローディングされうる。抗体での表面修飾はそれらの標的特異性を改善し、それらの循環半減期を増加させることが示されている。本開示においては、抗ＴＦＰＩ抗体のＮ末端において融合するマスキングドメインとして抗ＲＢＣ抗体を使用した。この抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体は、未修飾親抗ＴＦＰＩ抗体より長い潜在的循環時間を有するプロドラッグを与える。ＲＢＣ上の該プロドラッグの結合は、マスキングドメインが切断されるまでは、ＴＦＰＩに結合するその能力を更に低減するであろう。

Ｃ．アルブミン結合性ペプチド
アルブミンは、治療用および診断用物質のための、主として糖尿病、癌、関節リウマチおよび感染症の診断および治療のための汎用担体として登場した。ヒト血清アルブミンは、約４０ｍｇ／ｍＬの循環濃度を有する、体内で最も豊富なタンパク質である。アルブミンは６７ｋＤａの分子量を有する。アルブミン結合性部分は、抗ＴＦＰＩ抗体のＮ末端に融合するマスキングドメインとして使用可能であり、それにより、親抗ＴＦＰＩ抗体の場合より潜在的に長い循環時間を有する抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体が得られる。該プロドラッグ構築物においてはアルブミン結合性ペプチドを使用したが、アルブミン結合性部分はペプチド、天然アルブミン結合性ドメイン、スカフォールド、抗体または抗体フラグメント、例えばＦａｂ、ｓｃＦｖ、ドメイン抗体および他の誘導体でありうる。

Ｄ．プロテアーゼの選択および切断部位の設計
損傷が生じると、組織因子（ＴＦ）が血流にさらされ、第ＶＩＩ因子を活性化してＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体を形成する。ついでＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は第Ｘ因子を活性化し、ＦＸａはプロトロンビンをトロンビンへと活性化して、フィブリン形成および血液凝固を引き起こす。組織因子経路の主要役割は、「トロンビン・バースト（ｂｕｒｓｔ）」を引き起こすことであり、このプロセスにより、フィードバック活性化の役割に関して凝固カスケードの最も重要な構成成分であるトロンビンが瞬時に遊離される。また、凝固カスケードにおいて、一連の他の凝固因子が活性化される。

・ＴＦ−ＦＶＩＩａはＦＩＸおよびＦＸを活性化する。

・ＦＶＩＩ自体はトロンビン、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩおよびＦＸａにより活性化される。

・ＦＸａおよびその補因子ＦＶａはプロトロンビナーゼ複合体を形成し、これはプロトロンビンをトロンビンへと活性化する。

・ついでトロンビンは凝固カスケードの他の成分（ＦＶおよびＦＶＩＩＩを含む）を活性化し、活性化はＦＶＩＩＩをｖＷＦに結合した状態から遊離する。最終的にトロンビンはＦＸＩを活性化し、そしてこれはＦＩＸを活性化する。

・ＦＶＩＩＩａは補因子であり、一緒になってそれらは「テナーゼ」複合体を形成し、これはＦＸを活性化し、このようにしてサイクルが継続する（「テナーゼ」は「テン（十）」と、酵素に用いられる接尾語「−アーゼ」との短縮形である）。

多数の前記プロテアーゼ、例えばＦＶＩＩａ、ＦＸａおよびトロンビンは、抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体を活性化するために使用されうる。本開示においては、ＦＸａおよびトロンビンの切断部位をマスキングドメイン内に設けたが、挙げられている任意のその他のプロテアーゼも抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体内に組込まれうると想定される。

実施例２ − プロドラッグ抗体のベクター地図
９個のｇＡ２００−プロドラッグ重鎖（ＨＣ）および６個のｇＡ２００軽鎖変異体（ＬＣ）を、発現ベクターｐＴＴＦ５内へのインフュージョン（Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）クローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて構築した。全ての変異体はＦＸａの６アミノ酸切断部位ＥＧＲＴＡＴを含有していた。該突然変異タンパク質は、該切断部位に隣接する種々のＮ末端およびＣ末端欠失を含有していた。ＨＣ１突然変異タンパク質およびＬＣ１突然変異タンパク質の代表的プラスミド地図を図３Ａ〜Ｂに示す。１５個の軽鎖および重鎖変異体のＤＮＡ配列を図１２に示す。該ＨＣ突然変異タンパク質をＨＣ１〜ＨＣ９と命名し、該ＬＣ突然変異タンパク質をＬＣ１〜ＬＣ６と命名した。抗ＴＦＰＩと融合したｓｃＦｖ（抗ＲＢＣまたは抗ＴＦ）の代表的プラスミドベクター地図を図４Ａ〜４Ｃに示し、抗ＴＦＰＩと融合したアルブミン結合性ペプチドの代表的プラスミドベクター地図を図５Ａ〜Ｂに示す。図１３〜１４は、設けられた切断部位を有する種々の軽鎖および重鎖の組合せを含む１５個の構築物の配列を示す。

実施例３ − プロドラッグ抗体の発現および製造
チャイニーズハムスター卵巣細胞を宿主細胞で使用した場合、アマクサ（Ａｍａｘａ）のニュークレオフェクション（Ｎｅｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）技術を用いて、トランスフェクションを行った。簡潔に説明すると、反応当たり２×１０^６個の細胞を１０００ｒｐｍで５分間ペレット化した。ペレットを反応当たり１００μｌのヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）溶液Ｖに再懸濁させた。２μｇのｐＱＭ１−３Ｅ１０ｓｃ−ｇＡ２００ＨＣ（ｐＱＭ１−ｇＡ２００ＬＣを伴う）、ｐＱＭ１−Ｔｅｒ１１９ｓｃ−ｇＡ２００ＨＣ（ｐＱＭ１−ｇＡ２００ＬＣを伴う）またはｐＱＭ１−５６Ｅ４−ｇＡ２００ＨＣ（ｐＱＭ１−５６Ｅ４−ｇＡ２００ＬＣを伴う）をそれぞれ、該細胞に加えた。ついで溶液Ｖ中のＤＮＡ／細胞をヌクレオキュベット（Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ）容器に移した。プログラムＵ０２４を使用して、ヌクレオフェクター（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）（登録商標）においてエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、０．５ｍＬの加温培地を該細胞に直ちに加え、ついで４．５ｍＬ／ウェルの予め加温されたＱｍｉｘ１培地（抗体を含有しない）と共に６ウェルプレートに移し、シェーカー上の３７℃のインキュベーターに戻した。トランスフェクションの３〜４日後、プロドラッグ抗体の発現を測定した。陽性発現細胞に関して、安定プールを作製した。該細胞を０．５×１０^６／ｍＬに希釈し、Ｇ４１８を０．７ｍｇ／ｍＬに加えた。細胞密度が３〜４×１０^６／ｍＬに達したら、該細胞を０．４×１０^６／ｍＬに再び希釈し、０．７ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含有するＱｍｉｘ１中で常に維持した。該選択は約２週間を要し、ついで生産段階に入った。細胞生存度が＞９５％に回復し、細胞密度が３．５〜４×１０^６／ｍＬに達したら、培養温度を３０℃に切り換えた。温度切り換えの４〜７日後、馴らし培地を回収した。該細胞を５０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により除去した。該馴らし培地をミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）濃縮器を使用して５倍濃縮し、ついで９０００ｒｐｍで４０分間の追加的遠心分離を行った。

ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞を宿主細胞として使用した場合には、それらを、懸濁培養として、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．１％ プルロニックＦ６８および２５ｍｇ／Ｌ Ｇ４１８で補足されたＦ１７培地内で維持した。トランスフェクションを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、２５ＫＤ、直鎖状）を使用して行った。簡潔に説明すると、トランスフェクションの前日に１×１０^６細胞／ｍｌを播いた。トランスフェクションの当日に、細胞密度を１．７×１０^６／ｍＬに調節した。１Ｌの細胞をトランスフェクトするために、０．５ｍｇの各ＶＥＣ−４５８１およびＶＥ−４５６８（ＴＰＰ２６５２用）、またはＶＥＣ−４５８３および４５６８（ＴＰＰ２６５４用）を５００ｍｌのＦ１７培地中で希釈し、２ｍｌのＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩストック）を５００ｍｌのＦ１７中で希釈した。希釈したＤＮＡおよびＰＥＩを一緒にし、室温で１０分間のインキュベーションの後、細胞に加えた。ついで細胞を１２５ｒｐｍのシェーカー上の３７℃のインキュベーターに戻した。トランスフェクションの２４時間後、１％ 超低ＩｇＧ ＦＢＳおよび０．５ｍＭ バルプロ酸を該細胞に加えた。トランスフェクションの３〜４日間後、プロドラッグ抗体の発現を測定し、細胞生存度が７０％に低下したら、発現を停止させた。ついで２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により馴らし培地を回収して細胞を除去し、ついで９０００ｒｐｍで４０分間の追加的遠心分離を行った。

実施例４ − 抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の精製
プロドラッグタンパク質を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡカラム（５ｍＬ ＨｉＴｒａｐ，ＧＥ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，＃２８−４０８２−５５）を使用して、ＣＨＯ細胞馴らし培地から精製した。培地を限外濾過により５〜１０倍濃縮し、または濃縮することなく使用した。「平衡化バッファー」（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）中でカラムを平衡化した後、１〜１．５ｍＬ／分の流速でカラム全体に培地をポンピングした。ローディング後、カラムを４ｍＬ／分の流速で５〜１０カラム体積（ＣＶ）の平衡化バッファーで洗浄した。ついでカラムを「酢酸洗浄バッファー」（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ５．４）で再平衡化した。

カラムからの結合タンパク質の溶出を、以下の３段階溶出を用いて、１ｍＬ／分の流速で行った：（１）５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．４；（２）５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．２；および（３）１００ｍＭ Ｇｌｙｅｉｎｅ−ＨＣ１、ｐＨは３．０。画分（１ｍＬ／画分）を、ｐＨを上昇させるための１ｍｌの「製剤化バッファー」（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５，４）を含有するチューブ内に集めた。カラムを、１００ｍＭ グリシン（ｐＨ２．８）を使用して再生させ、ついでｄＨ_２Ｏで洗浄し、２０％ エタノール中で保存した。

２８０ｎｍの吸光度によるモニタリングにより決定されたタンパク質含有画分をプールし、４℃で一晩の透析により、またはスピン脱塩カラムにより、製剤化バッファー中にバッファー交換した。１０ｋＤａの濃縮器を使用する限外濾過により最終タンパク質溶液の濃縮を行った。濃縮または透析中に生じた可能性のある沈殿物を２０００×ｇで３０分間の遠心分離により除去した。最終サンプルを、０．２２ｍｍカートリッジを使用して滅菌濾過した。

精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）およびウエスタンブロットにより特徴づけした。内毒素レベルも測定した。ａＳＥＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、純度は典型的には９０％を超えていた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを図６に示す。

実施例５ − ＧＡ２００および５６Ｅ４−ＧＡ２００のインビトロＴＦＰＩ結合ＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｂ ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）をＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬのＴＦＰＩで４℃でコートした。該プレートを５％ 脱脂乾燥乳ＰＢＳ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０中で室温で１時間ブロッキングした。未消化および消化抗体の系列３倍希釈液を該ウェルに加え（１００μＬ／ウェル）、室温で１時間インキュベートした。該プレートをＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。アンプレックスレッド（Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液での検出のために、二次抗Ｆａｂ−ＨＲＰ結合抗体を加えた（１００μＬの１：１０，０００希釈液）を加えた。図７において認められうるとおり、ＨＳＡ結合性プロドラッグ抗体は、その親抗ＴＦＰＩ抗体ｇＡ２００より若干低減した、ＴＦＰＩへの結合を示す。

実施例６ − ＴＥＲ１１９ＳＣ−ＧＡ２００プロドラッグ抗体のＲＢＣ結合ＥＬＩＳＡ
赤血球へのプロドラッグ結合を試験するために、ＥＬＩＳＡを用いた。透明な９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートのウェルを、１０^７／ｍｌの濃度で（ＣａもＭｇも含有しない）ＤＰＢＳ中に再懸濁された１００μＬのマウスゴーストＲＢＣでコートした。プレートをテープで密封し、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＤＰＢＳＴ（ＤＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）で１回洗浄し、ついで室温で１時間、５％ 乳／ＤＰＢＳＴでブロッキングした。ブロッキングバッファーを廃棄し、５０μＬの希釈サンプルをウェルごとに加えた。サンプルをＰＢＳ中で１：３で系列希釈した。該プレートを室温で１時間インキュベートし、ついでＤＰＢＳＴで素早く５回洗浄した。ＰＢＳＴ（ＨＲＰヤギ抗ｈＦＡＢ，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ｃａｔ＃１０９−０３５−０９７）中で１：５０００希釈された１００μＬの二次抗体をウェルごとに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、ついでＤＰＢＳＴで５回洗浄した。ＨＲＰ基質（Ａｍｐｌｅｘ Ｒｅｄ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ａ２２１７７）を加え、４８５ｎｍの励起波長および５９５ｎｍの発光波長での蛍光測定をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で行った。図８において認められうるとおり、該プロドラッグ抗体は、１０ｎＭを超える濃度でＲＢＣに結合した。

実施例７ − 抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体のＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭ分析
方法
アミンカップリングキットを製造業者の説明に従い使用して、ヒトＴＦＰＩをＣＭ４またはＣＭ５チップ上に固定化した。抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体または親抗ＴＦＰＩ抗体を、１５μｇ／ｍＬ ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下または非存在下の１０μｇ／ｍＬ 抗体で、該系に流動させた。各注入の完了の２秒後に結合レベルを測定した。動力学アッセイにおいては、一連の濃度の抗体を注入し、３０分間の解離時間を設けた。ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、該抗体の解離および会合速度をモデル化した。

結果
図９はヒトＴＦＰＩへの種々のプロドラッグ抗体の結合を示す。図９に示されているとおり、ＨＳＡの非存在下ではＡＢＰ−ｇＡ２００プロドラッグ抗体は１７９反射単位（ＲＵ）でＴＦＰＩに結合するが、ＨＳＡの存在下ではシグナルは３６ＲＵへと８０％減少した。逆に、ヒトアルブミンはＴＦＰＩへの親抗体ｇＡ２００の結合に有意な影響を及ぼさなかった。

ＲＢＣ結合性プロドラッグ抗体Ｔｅｒ１１９ｓｃＦｖ−ｇＡ２００はｇＡ２００と同じレベルでＴＦＰＩに結合したが、ＴＦ結合性プロドラッグ抗体３Ｅ１０ｓｃＦｖ−ｇＡ２００は２２％の残留レベルでＴＦＰＩに結合した。

それらのプロドラッグ抗体の結合を更に測定するために、動力学アッセイを行ってアフィニテイを測定した。表１ａ〜ｄに示されているとおり、抗ＴＦプロドラッグ抗体３Ｅ１０ｓｃＦｖ ｇＡ２００および抗ＲＢＣプロドラッグ抗体Ｔｅｒ１１９ｓｃＦｖ−ｇＡ２００は、それぞれ２９．７１倍および１４．６６倍、ＴＦＰＩへの結合を低減した。アルブミン結合性プロドラッグ抗体ＡＢＰ−ｇＡ２００はＴＦＰＩへの結合を低減しなかったが、ＨＳＡと混合されインキュベートされた後は、ＴＦＰＩへのその結合は同様に１５．３４倍低減した。

ＡＢＰ−ｇＡ２００の切断を更に最適化するために、本発明者らはＡＢＰ−ｇＡ２００の切断部位を修飾した。アルブミン結合性ペプチドと重鎖の可変領域との間に種々の切断部位を挿入した。図１４Ａ〜Ｂに示されているとおり、該切断部位の周辺にスペーサーＧＧＧＧＳを挿入した。ＴＰＰ−２６５１、ＴＰＰ−２６５２、ＴＰＰ−２６５３およびＴＰＰ２６５５はトロンビン切断部位を含有していたが、ＴＰＰ−２６５４は、ＦＸａおよびトロンビンの両方により切断されうるリンカーを含有していた。表１ｂに示されているとおり、ヒトまたはサルアルブミンの存在下、これらの抗体はＴＦＰＩへのそれらの結合をＴＰＰ−２６５４に関しては最高で２８．６倍、ＴＰＰ−２６５２に関しては３９．６倍低減したが、親抗体ｇＡ２００は、アルブミンの非存在下または存在下、類似したＴＦＰＩ結合アフィニティを有していた。ＴＰＰ−２６５３は完全には発現されなかったため、そのデータは示さなかった。これらの良く発現されたプロドラッグ抗体を精製し、プロテアーゼ、すなわちトロンビンまたは第Ｘａ因子により消化した。これらのプロテアーゼの除去の後、ＬＣ−ＭＳを用いて該抗体を分析した。結果は、該プロテアーゼが該アルブミン結合性ペプチドを切断したことを示している。ＴＰＰ−２６５２およびＴＰＰ−２６５４の代表的データを図１６に示した。

抗ＴＦＰＩプロドラッグの切断効率とマスキング機能とのバランスを更に向上させるために、本発明者らは、抗体ｇＡ２００のリンカー長およびトランケート化ＦＲ１ドメインを改変した。ＡＢＰを有するプロドラッグのアミノ末端配列を図に示した。

実施例８ − 抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体に関するトロンビン産生アッセイ
ヒトＨｅｍＡ血漿を使用して、ＴＦＰＩプロドラッグ抗体のトロンビン産生アッセイ（ＴＧＡ）を行った。血小板欠乏血漿（ＰＰＰ）試薬および較正物質を１ｍＬの蒸留水で再構成させた。１００ｎＭから出発する１．５６ｎＭの最終濃度の抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体の１：２系列希釈液をＨｅｍＡヒト血漿に加えた。血漿のみのサンプルを対照として使用した。９６ウェルＴＧＡプレートにおいて、２０μＬのＰＰＰ試薬または較正物質を各ウェルに加え、種々の濃度の抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体を含有する８０μＬの血漿サンプルを加えた。該プレートをＴＧＡ装置内に配置した。ついで該装置は２０μＬのＦｌｕＣａ（Ｆｌｕ基質＋ＣａＣｌ_２）を各ウェル内に自動的に分注した。トロンビン産生を６０分間測定した。Ｔｅｒ１１９ｓｃＦｖ−ｇＡ２００をＴＧＡにおいて試験した際、マウスＲＢＣゴーストにＨｅｍＡ血漿を添加した。Ｔｅｒ１１９ｓｃＦｖ−ｇＡ２００をマウスＲＢＣ−ＧＯＬＤと共に室温で１５分間インキュベートした。

図１０Ａ〜Ｂに示されているとおり、５６Ｅ４−ｇＡ２００はその親抗体ｇＡ２００より低いトロンビンピークを与えた。このことは、血漿中のヒトアルブミンが抗ＴＦＰＩの活性を低減しうることを示している。５６Ｅ４ｇＡ２００により生じたトロンビンの形状は低く、幅広いピークはまた、該抗体が時間ゼロにおいてはそれほど活性ではなく、産生されたＦＸａまたはトロンビンにより活性化された可能性があることを示している。

生理的条件下でプロドラッグＴＦＰＩ抗体をより活性なＴＦＰＩ抗体に変換する可能性を、１）（生理的レベルにおいて）ＴＦＰＩ Ａｂ媒介性ＴＧＡ応答を増強する外因性トロンビンの能力、および２）ＴＧＡ反応においてＦＸａおよびトロンビンを産生させ、ＴＦＰＩ抗体誘導性応答における後続の増強をモニタリングすることにより、モデル化した。

外因性トロンビンの添加は、生理的に潜在的に達成可能なレベルの該酵素に対するプロドラッグＴＦＰＩ抗体の感受性を直接的に評価するであろう。１２００ｎＭ Ａｂを０．５〜２．５Ｕ／ｍＬのトロンビンと共に１時間プレインキュベートし、ついでトロンビン特異的不可逆的インヒビターであるヒルジン（０．５〜２．５Ｕ／ｍＬ）でトロンビンを１時間不活性化することにより、これを行った。ＴＧＡ反応におけるヒルジンのキャリオーバーの効果を評価するために、トロンビンの代わりにバッファーを使用してＴＧＡ反応におけるヒルジンのキャリオーバーの効果を評価した。幾つかの場合には、対照として、無関係なＡｂまたは親抗体ｇＡ２００（アルブミンマスキング配列もプロテアーゼ感受性部位も有さないもの）をプロＴＦＰＩＡｂの代わりに使用した。該抗体−トロンビン−ヒルジン混合物を１０〜１００ｎＭのＡｂ濃度に系列希釈し、該混合物をＴＧＡ反応において更に１：１０希釈した。使用した開始因子が、１ｐＭ ＴＦ−４μＭ 血小板を含有するＰＰＰ−Ｌｏｗであった以外は前記に記載されているとおりに、ＴＧＡ反応を行った。無関係な抗体でのＴＧＡ結果をプロドラッグＴＦＰＩ抗体での結果から差し引いた。

プロテアーゼ切断の前および後のプロＴＦＰＩ Ａｂ ＴＰＰ−２６５４のＴＧＡプロファイルを図１０に示す。親ｇＡ２００のＴＧＡ応答はトロンビンインキュベーションによっては不変であったが、トロンビンおよびＦＸａの両方に感受性の切断部位を含有するＴＰＰ−２６５４は、トロンビンと共にプレインキュベートされた場合、応答の増強を示した。しかし、ピークＴＧＡ応答はｇＡ２００の場合より低かった。このことは、プロテアーゼ切断の効率を増加させるためには、ＴＦＰＩ Ａｂ活性の完全な脱マスキングが、より高いトロンビンレベルまたは最適化プロテアーゼ感受性部位の存在を要しうることを示唆している。

ある範囲のトロンビン濃度（０．５〜２．５Ｕ／ｍＬ）での力価測定実験は、プロドラッグＴＦＰＩ抗体からより活性なＴＦＰＩ抗体への最大変換が、インビボで潜在的に達成可能なレベルである１Ｕ／ｍＬ トロンビンにおいて達成されうることを確証した（図１０Ｄ）。

ＦＸａまたはトロンビンが、特に両方のプロテアーゼ感受性部位を含有するプロドラッグ抗体において、プロドラッグ抗体を活性ＴＦＰＩ抗体に、より効率的に変換しうるかどうかを評価するために、ｉｎ ｓｉｔｕでのＦＸａおよびトロンビンの増加の効果を評価した。開始因子としてのＴＦの濃度を増加させることにより、ｉｎ ｓｉｔｕのＦＸａ産生を増加させた。これらの実験においては、ＴＧＡ反応における開始因子としてＰＰＰ−Ｌｏｗ（１ｐＭ ＴＦ−４μＭ ＰＬ）またはＰＰＰ試薬（５ｐＭ ＴＦ−４μＭ ＰＬ）を使用することにより、ＴＦ濃度を１ｐＭから５ｐＭまで変動させた。ＴＦの増加はＴＦ−ＦＶＩＩａの直接作用によりＦＸａを増加させ、そしてＦＸａの増加はトロンビン産生を増加させるであろう。前記のとおりにＴＧＡ反応を行い、１ｐＭおよび５ｐＭ ＴＦでのＴＧＡ反応間の応答における相違を比較することにより、結果を分析した。

１ｐＭおよび５ｐＭ ＴＦ開始因子間のピークトロンビン応答（デルタピーク）における相違の増加において、特に２．５Ｕ／ｍＬ トロンビンと共にプレインキュベートされたプロドラッグＴＦＰＩ抗体の場合には、ＴＰＰ−２６５４のＦＸａおよびトロンビン感受性は明らかであった（図１０Ｅ）。プロＴＦＰＩ Ａｂ ＴＰＰ−２６５４のピークトロンビン応答を、初期トロンビンプレインキュベーションで達成された応答を超えて更に増強しうることは、ＦＸａ切断がアルブミン結合性ペプチドの完全な脱マスキングに更に寄与しうることを示した。

マスキングアルブミン結合性ペプチドがトロンビン切断により除去されるプロＴＦＰＩ Ａｂ（ＴＰＰ−２６５２）のＴＧＡ応答を図１０Ｆ〜Ｇに示す。ＴＰＰ−２６５２のトロンビン感受性を図１０Ｆに示す。この図は、被検トロンビンの最大濃度（２．５Ｕ／ｍＬ）において、ＴＧＡ応答における僅かな増強が被検抗体の最高レベルで検出されたに過ぎなかったことを示している。ＴＧＡを開始させるために使用ＴＦ濃度を増加させることによりＦＸａ（およびトロンビン）を増加させることはＴＰＰ−２６５２のＴＧＡ応答を更に若干増強したに過ぎなかった（図１０Ｆ）。これはＴＰＰ−２６５４でのトロンビン応答における大きな増強とは対照的であり、その場合には、トロンビン前処理ＴＰＰ２６５４は、５ｐＭ ＴＦで産生されたＦＸａに更にさらされた（図１０Ｅを図１０Ｇと参照されたい）。

これらの結果は、種々のプロテアーゼ感受性部位が活性ＴＦＰＩ Ａｂへのプロドラッグ−ＴＦＰＩ抗体の変換に影響を及ぼしうることを示唆している。

実施例９ − 抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体に関するＦＸａアッセイ
材料および方法
以下の試薬をＦＸａアッセイに使用した。

アッセイバッファー：１×バッファーは２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ７．４、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２、０．１％ ＢＳＡである。

ＴＦＰＩ − Ｒ＆Ｄ（Ｃａｔ＃２９７４−ＰＩ，ＭＷ 〜３５ｋＤａ）。製品挿入説明に従い１０μＬの２５ｍＭ Ｔｒｉｓおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を加えることにより、ＴＦＰＩを１００μｇ／ｍＬに再構成させた。該２．８６μＭ ストックを１／１４３希釈して、２０ｎＭ 実施ストックを得た。

ＦＸａ − Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｔ＃ ＨＣＸ−００６０，ＭＷ − ５８．９ｋＤａ）ストック２μＭアリコートをアッセイバッファー中で予め調製し、−８０℃で保存した。該２μＭ ストックを１／１０００希釈して２ｎＭ 実施ストックを得た。

Ｓ−２７６５ − Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ（Ｃａｔ＃ Ｓ−２７６５，ＭＷ − ７１４．６Ｄａ）。凍結乾燥物の２５ｍｇを７ｍＬの蒸留水に溶解することにより、５ｍＭ 実施ストックを調製した。該５ｍＭ 実施ストックをアッセイウェル内に直接加えた。

抗ＴＦＰＩ抗体の４×用量曲線をアッセイバッファーにおいて作成する。各抗体濃度の６０μＬを４×（２０ｎＭ）濃度のＴＦＰＩと一緒にした。抗体／ＴＦＰＩ混合物を室温で３０分間インキュベートする。ＦＸａの２×（２ｎＭ）濃度の１２０μＬを該Ａｂ／ＴＦＰＩ混合物に加え、室温で３０分間インキュベートする。ついで該Ａｂ／ＴＦＰＩ／ＦＸａ混合物を１００μＬ／ウェルで二重にアッセイプレートに移し、ついで２０μＬの５ｍＭ 基質を加える。該プレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘプレートリーダーにおいて３分間にわたって４０５ｎｍで動力学的に直ちに読取る。アルブミン結合性抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体５６Ｅ４−ｇＡ２００を試験した場合には、９６ウェル丸底ポリプロピレンプレート内で３４μＬの８×抗ＴＦＰＩ抗体を種々の濃度の３４μＬのアルブミンと一緒にした。ついで該溶液を室温で１５分間インキュベートし、６８μＬの２０ｎＭ（４×）ＴＦＰＩをα−ＴＦＰＩ Ａｂ／アルブミンに加えた。

図１１に示されているとおり、ｇＡ２００のＶ_ｍａｘはヒトまたはサルのいずれのアルブミンにも影響されなかった。アルブミン結合性プロドラッグ抗体５６Ｅ４−ｇＡ２００はアルブミンの濃度の増加と共にＶ_ｍａｘを減少させた。ヒトまたはサルアルブミンの濃度が５μＭに達した際、該プロドラッグ抗体の抗ＴＦＰＩ活性は９０％抑制された。

実施例１０ − 抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体のプロテアーゼ消化
該プロドラッグのプロテアーゼ切断およびプロテアーゼ枯渇のためにＮｏｖａｇｅｎ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ切断捕捉キット（６９０２２−３）およびＮｏｖａｇｅｎ第Ｘａ因子キット（６９０３７−３）を使用した。

以下に簡潔に説明するとおり、プロドラッグ切断のためにビオチン化トロンビンを使用した。

各プロドラッグに関する５０μＬの反応液は５μｇのプロドラッグ、５μＬの１０×キット トロンビン切断／捕捉バッファー、１単位のトロンビン、５０μＬに調節するための脱イオン水を含有していた。該反応液を室温で３７℃でインキュベートした。該切断反応後、酵素１単位当たり１６ｍｌの割合の沈降樹脂（３２ｍｌの５０％スラリー）を使用して、該ビオチン化トロンビンをストレプトアビジンアガロース（該キットにおいて供給されるもの）で除去した。該アガロースを該反応チューブに加えた後、該チューブを、穏やかに振とうしながら、室温で３０分間インキュベートした。該反応物全体を、スピンフィルターを備えたキット供給カップに移した。ついで該チューブを５００×ｇで５分間遠心分離した。収集チューブ内の濾液は、ビオチン化トロンビンを含まない切断プロドラッグを含有する。

プロドラッグ切断のために第Ｘａ因子を使用した場合には、各プロドラッグに関する５０μＬの反応液は５μｇのプロドラッグ、１０×キット第Ｘａ因子切断／捕捉バッファー、１単位の第Ｘａ因子、および５０μＬの全体積に調節するための脱イオン水を含有していた。該反応液を３７℃で１時間インキュベートした。該切断反応後、第Ｘａ因子をＸａｒｒｅｓｔ^ＴＭアガロース（該キットにおいて供給されるもの）で除去した。まず、Ｘａｒｒｅｓｔアガロースの沈降樹脂体積当たり１ｌの体積の１×第Ｘａ因子切断／捕捉バッファーを加えることにより、Ｘａｒｒｅｓｔアガロースを平衡化した。Ｘａｒｒｅｓｔアガロースを１０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、廃棄した。該アガロースを１０体積の１×第Ｘａ因子切断／捕捉バッファーに再懸濁させ、１０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、廃棄した。１沈降樹脂体積の１×第Ｘａ因子切断／捕捉バッファーを該チューブに加え、該樹脂を完全に再懸濁させた。調製されたＸａｒｒｅｓｔアガロースを、２ｍｌ スピンフィルター（キットと共に含まれているもの）のサンプルカップに移した。プロドラッグ切断反応液の全体積を、調製されたＸａｒｒｅｓｔアガロースに加えた。該チューブを室温で５分間インキュベートし、１０００×ｇで５分間遠心分離してＸａｒｒｅｓｔアガロースを除去した。結合第Ｘａ因子をサンプルカップ内に維持する。該切断プロドラッグは遠心分離中に濾液チューブ内に流入する。

実施例１１ − 抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体のＬＣ−ＭＳ
抗ＴＦＰＩプロドラッグ抗体ＴＰＰ−２６５２およびＴＰＰ−２６５４のＬＣ−ＭＳ分析を無傷または還元条件下で行った。無傷タンパク質の場合には、２μｇをＰＬＲＰカラムに直接ローディングした。還元サンプルの場合には、ＰＬＲＰカラムへのローディングの前に、試験サンプルを１０ｍＭ ＤＴＴで３７℃で３０分間処理する。

ＰＬＲＰ−Ｓ（８μｍ ４０００Ａ，０．３×１５０ｍｍ）を有するＡｇｉｌｅｎｔ １２００キャピラリーＬ系を７０℃で使用して、ＬＣ分離を行った。ＬＣのためのバッファー系は以下のとおりであった：Ａ：０．１％ ギ酸＋０．０１％ ＴＦＡ、Ｂ：０．１％ ギ酸＋０．０１％ ＴＦＡを含有するアセトニトリル、流速１０μＬ／分。勾配：２分で１０％ Ｂ、１５分で９０％ Ｂへ、９０％ Ｂで５分間、１０％ Ｂの平衡化を１０分間。

Ａｇｉｌｅｎｔ ６５２０ Ｑ−ＴＯＦ系を使用してＭＳ分析を行った。その条件は以下のとおりであった：二重ＥＳＩ（ＤｕａｌＥｓｉ）源、ガス温度：３５０℃、乾燥ガス：７ｐｓｉ、ネブライザー：１０ｐｓｉ、スキャン範囲：５００〜３０００ ａｍｕ、１スペクトル／秒。１サイクル当たり２つの実験：還元形態の場合には３５００ｖ、１７５ｖのフラグメンター、６５ｖのスキマー、および無傷タンパク質の場合には４０００ｖ、３５０ｖのフラグメンター、１００ｖのスキマー。参照イオン：１２２１．９９０６３７および２４２１．９１３９９ ａｍｕ、５０ｐｐｍのウィンドウ、Ｍｉｎ １０００．該プロドラッグ抗体を精製し、トロンビンまたは第Ｘａ因子のいずれかのプロテアーゼで消化した。これらのプロテアーゼの除去の後、ＬＣ−ＭＳを用いて該抗体を分析した。結果は、該プロテアーゼが該アルブミン結合性ペプチドを切断したことを示している。ＴＰＰ−２６５２およびＴＰＰ−２６５４の代表的データを図１６Ａ〜Ｃに示した。

本出願において開示され特許請求されている組成物および方法の全ては、本開示を参照すれば、過度な実験を行うことなく製造され実施されうる。本開示の組成物および方法は好ましい実施形態に関して記載されているが、本開示の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物および方法に、ならびに該方法の工程において又は該方法の工程の順序において、変更が施されうることが当業者に明らかであろう。より詳細には、本明細書に記載されている物質の代わりに、同一または類似結果をもたらす化学的かつ生理的に関連した或る物質が使用可能であることが明らかであろう。当業者に明らかな全てのそのような類似置換体および修飾は、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の精神、範囲および概念に含まれるとみなされる。

Claims (35)

1. （ａ）第１軽鎖および第１重鎖可変領域を含み、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に結合する第１可変ドメイン、
   （ｂ）第１軽鎖および／または第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されたマスキングドメイン、ならびに
   （ｃ）第１軽鎖および／または第１重鎖可変領域とマスキングドメインとの間に挟まれたプロテアーゼ切断可能リンカー
   を含む抗体。
2. 該プロテアーゼ切断可能ドメインがトロンビン、プラスミン、第ＶＩＩａ因子または第Ｘａ因子切断部位である、請求項１記載の抗体。
3. 該マスキングドメインが、第２軽鎖および第２重鎖可変領域を含む第２可変ドメインを含む、請求項１記載の抗体。
4. 該抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体である、請求項１記載の抗体。
5. 該抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１記載の抗体。
6. 該抗体が一本鎖抗体である、請求項１記載の抗体。
7. 該抗体が２価であり、２つのマスキングドメインを含み、１つが各第１軽鎖可変領域のアミノ末端に連結されている、請求項１記載の抗体。
8. 該抗体が２価であり、２つのマスキングドメインを含み、１つが各第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されている、請求項１記載の抗体。
9. 該抗体が２価であり、４つのマスキングドメインを含み、１つが各第１軽鎖可変領域および各第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されている、請求項１記載の抗体。
10. 該マスキングドメインのうちの２つが第２軽鎖可変領域であり、該マスキングドメインのうちの２つが第２重鎖可変領域であり、ここで、第２軽鎖および重鎖可変領域が第２可変ドメインを形成している、請求項９記載の抗体。
11. 第２可変ドメインが組織因子（ＴＦ）、赤血球またはアルブミンに結合する、請求項３または１０記載の抗体。
12. 該マスキングドメインがアルブミン結合性ペプチドまたはタンパク質である、請求項１、７または８記載の抗体。
13. プロモーターの制御下の請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体のコード領域を含む発現ベクター。
14. 請求項１３記載の発現ベクターを含む細胞。
15. 医薬上許容されるバッファー、担体または希釈剤と共に製剤化された請求項１〜１２のいずれか１項記載の抗体を含む医薬製剤。
16. （ａ）第１軽鎖および第１重鎖可変領域を含み、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）に免疫学的に結合する第１可変ドメイン、
    （ｂ）第１軽鎖および／または第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されたマスキングドメイン、ならびに
    （ｃ）第１軽鎖および／または第１重鎖可変領域とマスキングドメインとの間に挟まれたプロテアーゼ切断可能リンカー
    を含む抗体を、対象における凝固を促進させるのに有効な量で投与することを含む、対象における凝固障害の治療方法。
17. 該プロテアーゼ切断可能ドメインがトロンビン、プラスミン、第ＶＩＩａ因子または第Ｘａ因子切断部位である、請求項１６記載の方法。
18. 該マスキングドメインが、第２軽鎖および第２重鎖可変領域を含む第２可変ドメインを含む、請求項１６記載の方法。
19. 該対象がヒトである、請求項１６記載の方法。
20. 該対象が非ヒト哺乳動物である、請求項１６記載の方法。
21. 該抗体が一本鎖抗体である、請求項１６記載の方法。
22. 該抗体が２価であり、２つのマスキングドメインを含み、１つが各第１軽鎖可変領域のアミノ末端に連結されている、請求項１６記載の方法。
23. 該抗体が２価であり、２つのマスキングドメインを含み、１つが各第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されている、請求項１６記載の方法。
24. 該抗体が２価であり、４つのマスキングドメインを含み、１つが各第１軽鎖可変領域および各第１重鎖可変領域のアミノ末端に連結されている、請求項１６記載の方法。
25. 該マスキングドメインのうちの２つが第２軽鎖可変領域であり、該マスキングドメインのうちの２つが第２重鎖可変領域であり、ここで、第２軽鎖および重鎖可変領域が第２可変ドメインを形成している、請求項２４記載の方法。
26. 第２可変ドメインが組織因子（ＴＦ）、赤血球またはアルブミンに結合する、請求項１８または２５記載の方法。
27. 該マスキングドメインがアルブミン結合性タンパク質である、請求項１６、２２または２３記載の方法。
28. 該対象が外傷、血友病または癌に罹患している、請求項１６記載の方法。
29. 該対象が血友病ＡまたはＢに罹患している、請求項１６記載の方法。
30. 該抗体を全身投与する、請求項１６記載の方法。
31. 該抗体を出血部位に局所的または限局的に投与する、請求項１６記載の方法。
32. 該抗体を皮下、静脈内または動脈内に投与する、請求項１６記載の方法。
33. 該抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌性ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体である、請求項１６記載の抗体。
34. 該抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１６記載の方法。
35. 該抗体がヒト組織因子経路インヒビターのクーニッツドメイン２に結合する、請求項１６記載の方法。

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