CN117545782A - 针对XIa因子抑制剂的抗体和抗原结合肽及其用途 - Google Patents

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CN117545782A
CN117545782A CN202280018012.XA CN202280018012A CN117545782A CN 117545782 A CN117545782 A CN 117545782A CN 202280018012 A CN202280018012 A CN 202280018012A CN 117545782 A CN117545782 A CN 117545782A
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J·M·吕特根
L·施内魏斯
G·C·拉克斯特劳
C·泰拉尼
A·K·迪尔格
J·R·平克尼
S·谢里夫
K·基什
Y·安
W·R·尤因
小斯坦利·理查德·克鲁斯特克
A·P·亚姆纽克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Janssen Pharmaceutica NV
Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica NV
Bristol Myers Squibb Co
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Abstract

本发明提供了新型抗原结合肽，如抗体或抗体片段，所述新型抗原结合肽特异性结合选择性FXIa抑制剂和/或FXIa和血浆激肽释放酶的双重抑制剂。本发明进一步涉及通过向受试者施用药物有效剂量的本文提供的抗原结合肽来降低FXIa抑制剂的抗血栓作用的方法。此外，本发明提供了检测生物样品中所述FXIa抑制剂的水平的检测试剂和方法。

Description

针对XIa因子抑制剂的抗体和抗原结合肽及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年1月8日提交的美国临时申请序列号63/135,016、2021年2月12日提交的美国临时申请序列号63/148,767、2021年2月23日提交的美国临时申请序列号63/152,595和2021年2月24日提交的美国临时申请序列号63/153,045的优先权权益，将其各自通过引用以其整体并入本文。
对序列表的引用
本申请包含名为055920-553P01US_Sequence_Lising.txt的序列表文件，文件大小约为316,130字节并且创建于2020年12月23日，已以ASCII格式以电子方式提交并且通过引用以其整体特此并入。
背景技术
尽管可获得抗凝血剂诸如达比加群、阿哌沙班、利伐沙班、华法林肝素、低分子量肝素(LMWH)和合成五糖以及抗血小板剂诸如阿司匹林和氯吡格雷/>但是血栓栓塞性疾病在发达国家仍然是主要死亡原因。发现和开发安全且有效的口服抗凝血剂用于预防和治疗大范围的血栓栓塞性障碍仍然是重要的。一种方法是通过靶向抑制凝血因子XIa(FXIa)来减少凝血酶的生成。FXIa是一种参与调节血液凝固的血浆丝氨酸蛋白酶，其通过组织因子(TF)与因子VII(FVII)的结合以产生因子Vlla(FVIIa)而在体内启动。所得TF:FVIIa复合物激活因子IX(FIX)和因子X(FX)，从而导致因子Xa(FXa)的产生。所产生的FXa催化凝血酶原转化成少量凝血酶，之后此途径被组织因子途径抑制剂(TFPI)关闭。然后凝血过程经由催化量的凝血酶对因子V、VIII和XI的反馈激活而进一步传播。所得大量凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，纤维蛋白聚合以形成血块的结构框架，并且激活血小板，血小板是凝血的关键细胞组分。因此，FXIa在传播此放大环路中起关键作用，因此是抗血栓疗法的有吸引力的靶标。
血浆前激肽释放酶是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的酶原并且以35至50μg/mL存在于血浆中。其结构与XI因子(FXI)的结构类似。总体而言，血浆激肽释放酶的氨基酸序列与FXI具有58％同源性。血浆激肽释放酶被认为在多种炎性障碍中发挥作用。血浆激肽释放酶的主要抑制剂是丝酶抑制蛋白C1酯酶抑制剂。呈现为C1酯酶抑制剂基因缺陷的患者会患遗传性血管性水肿(HAE)，导致面部、手部、咽喉、胃肠道和生殖器的间歇性肿胀。急性发作期间形成的水疱含有高水平的血浆激肽释放酶，它能裂解高分子量的激肽原，释放缓激肽，导致血管渗透性增加。使用大蛋白血浆激肽释放酶抑制剂治疗已被证明可通过阻止导致血管渗透性增加的缓激肽的释放来有效治疗HAE。
晚期糖尿病黄斑水肿患者的血浆激肽释放酶-激肽系统是异常丰富的。最近发表了血浆激肽释放酶促成糖尿病大鼠视网膜血管功能障碍。此外，施用血浆激肽释放酶抑制剂ASP-440改善了糖尿病大鼠的视网膜血管渗透性和视网膜血流异常。因此，血浆激肽释放酶抑制剂应具有作为治疗以减少与糖尿病性视网膜病变和糖尿病黄斑水肿相关的视网膜血管渗透性的效用。其他糖尿病并发症如脑出血、肾病、心肌病和神经病变，所有这些都与血浆激肽释放酶相关，也可被认为是血浆激肽释放酶抑制剂的靶标。迄今为止，尚无小分子合成血浆激肽释放酶抑制剂被批准用于医学用途。大蛋白血浆激肽释放酶抑制剂存在过敏反应的风险，如关于艾卡拉肽已报道的。
在WO 2016053455A1(其通过引用以其整体并入)中已提供了新型并且有效的选择性FXIa抑制剂或FXIa和血浆激肽释放酶的双重抑制剂，所述两类抑制剂用于治疗血栓栓塞性和/或炎性障碍。开发这些选择性FXIa抑制剂或FXIa和血浆激肽释放酶的双重抑制剂，如本发明提供的化合物，是基于在具有很少或没有另外的出血风险的情况下实现高水平抗血栓功效的能力。然而，在已向患者施用此类FXIa抑制剂时，在罕见的临床情况下会发生出血。在人体中，FXI缺乏性出血会发生在例如创伤后，尤其是在具有高纤溶活性的组织如口咽和尿路中。
存在促止血方法，包括凝血因子浓缩物和重组激活因子VII。这些药剂被批准为主要在血友病患者中使用，并且在没有特异性逆转剂时可考虑用于使用凝血酶或FXa抑制剂治疗的出血患者。然而，这些方法有促血栓形成的风险。因此，急需开发可在严重出血或需要紧急手术干预的受试者中立即逆转这些选择性FXIa抑制剂或FXIa和血浆激肽释放酶的双重抑制剂的抗血栓作用且没有相关促血栓风险的化合物，如本文公开的化合物。
发明内容
本发明提供了新型抗体或抗原结合肽，其特异性结合选择性FXIa抑制剂和/或FXIa和血浆激肽释放酶的双重抑制剂。本发明进一步提供通过向受试者施用药物有效剂量的本文提供的抗体或抗原结合肽来降低FXIa抑制剂的抗血栓作用的方法。此外，本发明提供了检测生物样品中所述FXIa抑制剂的水平的检测试剂和方法。
具体实施方案1：一种分离的抗原结合肽，其包含至少一个重链可变区(VH)和至少一个轻链可变区(VL)，其中所述至少一个VH包含以下中的至少一个：
(a)VH互补决定区1(VH-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列；
(b)VH-CDR2，其包含选自SEQ ID NO:13-22的氨基酸序列；或
(c)VH-CDR3，其包含选自SEQ ID NO:23-28的氨基酸序列；并且
其中所述至少一个VL包含以下中的至少一个：
(d)VL-CDR1，其包含选自SEQ ID NO:29-37的氨基酸序列；
(e)VL-CDR2，其包含选自SEQ ID NO:38-43的氨基酸序列；或
(f)VL-CDR3，其包含选自SEQ ID NO:44-51的氨基酸序列。
具体实施方案2：一种分离的抗原结合肽，其包含：
(a)至少一个重链可变区，其包含选自SEQ ID NO:52-83的氨基酸序列；以及
(b)至少一个轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO:84-99的氨基酸序列。
具体实施方案3：一种分离的抗原结合肽，其包含至少一个重链可变区(VH)和至少一个轻链可变区(VL)，其中所述VH包含三个互补决定区(CDR)：VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，并且所述VL包含三个CDR：VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中所述VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3的氨基酸序列分别包含选自以下的序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1、13、23、29、38和44；
(b)分别为SEQ ID NO:1、14、23、29、38和45；
(c)分别为SEQ ID NO:1、13、24、30、38和45；
(d)分别为SEQ ID NO:1、13、24、29、39和45；
(e)分别为SEQ ID NO:1、14、25、29、38和46；
(f)分别为SEQ ID NO:2、13、26、31、40和47；
(g)分别为SEQ ID NO:3、15、24、32、40和47；
(h)分别为SEQ ID NO:4、16、24、29、38和46；
(i)分别为SEQ ID NO:5、15、24、29、38和46；
(j)分别为SEQ ID NO:1、14、24、29、38和46；
(k)分别为SEQ ID NO:6、13、24、31、40和47；
(l)分别为SEQ ID NO:3、15、24、32、41和48；
(m)分别为SEQ ID NO:1、14、24、33、38和49；
(n)分别为SEQ ID NO:1、14、26、29、38和46；
(o)分别为SEQ ID NO:7、17、26、29、38和46；
(p)分别为SEQ ID NO:8、17、24、34、38和46；
(q)分别为SEQ ID NO:1、17、26、29、38和46；
(r)分别为SEQ ID NO:1、17、26、35、38和46；
(s)分别为SEQ ID NO:1、17、24、33、38和49；
(t)分别为SEQ ID NO:9、14、26、29、38和46；
(u)分别为SEQ ID NO:9、14、26、35、38和46；
(v)分别为SEQ ID NO:9、17、24、29、38和46；
(w)分别为SEQ ID NO:9、17、24、35、38和46；
(x)分别为SEQ ID NO:9、17、24、34、38和46；
(y)分别为SEQ ID NO:9、14、24、29、38和46；
(z)分别为SEQ ID NO:9、18、26、35、38和46；
(aa)分别为SEQ ID NO:8、14、24、29、38和46；
(bb)分别为SEQ ID NO:8、17、26、29、38和46；
(cc)分别为SEQ ID NO:9、19、26、29、38和46；
(dd)分别为SEQ ID NO:9、17、26、34、38和46；
(ee)分别为SEQ ID NO:10、20、27、36、42和50；
(ff)分别为SEQ ID NO:11、21、28、37、43和51；
(gg)分别为SEQ ID NO:12、22、26、33、38和46；
(hh)分别为SEQ ID NO:12、17、26、33、38和46；
(ii)分别为SEQ ID NO:9、17、26、33、38和46；以及
(jj)(a)至(ii)的变体，其中所述氨基酸序列中的任一个在其中具有1、2或3个保守氨基酸取代。
具体实施方案4：根据实施方案3所述的分离的抗原结合肽，其中所述至少一个VH区和所述至少一个VL区分别包含选自以下的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:84；
(b)分别为SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:85；
(c)分别为SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:86；
(d)分别为SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:87；
(e)分别为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:88；
(f)分别为SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:89；
(g)分别为SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:90；
(h)分别为SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:88；
(i)分别为SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:88；
(j)分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:91；
(k)分别为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:89；
(l)分别为SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:92；
(m)分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:93；
(n)分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:88；
(o)分别为SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:88；
(p)分别为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:88；
(q)分别为SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:88；
(r)分别为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:94；
(s)分别为SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:88；
(t)分别为SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:95；
(u)分别为SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:88；
(v)分别为SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:93；
(w)分别为SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:88；
(x)分别为SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:95；
(y)分别为SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:88；
(z)分别为SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:95；
(aa)分别为SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:88；
(bb)分别为SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:94；
(cc)分别为SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:88；
(dd)分别为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:95；
(ee)分别为SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:88；
(ff)分别为SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:88；
(gg)分别为SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:88；
(hh)分别为SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:94；
(ii)分别为SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:96；
(jj)分别为SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:97；
(kk)分别为SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:98；
(ll)分别为SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:99；
(mm)分别为SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:98；
(nn)分别为SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:99；
(oo)分别为SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:98；以及
(pp)(a)至(oo)的变体，其包含1、2、3或4个保守氨基酸取代。
具体实施方案5：根据前述实施方案中任一项所述的分离的抗原结合肽，其包含两个重链可变区，每个重链可变区与一个轻链可变区配对。
具体实施方案6：根据实施方案5所述的分离的抗原结合肽，其进一步包含含有选自SEQ ID NO:196-199的序列的多肽接头。
具体实施方案7：根据前述实施方案中任一项所述的分离的抗原结合肽，其中所述抗原结合肽特异性结合式(I)所示的化合物：
或其立体异构体或互变异构体，其中：
R1是C1-4烷基；
R2独立地选自F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CH3；
R3独立地选自CF3、CHF2、CH2F和CH3；
R4是H；并且
R5独立地选自F和Cl。
具体实施方案8：根据实施方案7所述的分离的抗原结合肽，其中所述化合物具有式(II)：
实施方案9：根据前述实施方案中任一项所述的分离的抗原结合肽是抗体。
具体实施方案10：根据前述实施方案中任一项所述的分离的抗原结合肽，其中所述抗原结合肽是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGACH2、微型抗体、F(ab’)3、四抗体、三抗体、双抗体、单域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2、scFv-Fc或串联Fab。
具体实施方案11：根据前述实施方案中任一项所述的分离的抗原结合肽，其包含选自以下的序列：
(a)分别为SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:160；
(b)分别为SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:160；
(c)分别为SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:161；
(d)分别为SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:161；
(e)分别为SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:162；
(f)分别为SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:162；
(g)分别为SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:163；
(h)分别为SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:163；
(i)分别为SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:164；
(j)分别为SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:164；
(k)分别为SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:165；
(l)分别为SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:165；
(m)分别为SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:166；
(n)分别为SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:166；
(o)分别为SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:164；
(p)分别为SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:164；
(q)分别为SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:164；
(r)分别为SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:164；
(s)分别为SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:167；
(t)分别为SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:167；
(u)分别为SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:165；
(v)分别为SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:165；
(w)分别为SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:168；
(x)分别为SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:168；
(y)分别为SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:169；
(z)分别为SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:169；
(aa)分别为SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:164；
(bb)分别为SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:164；
(cc)分别为SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:164；
(dd)分别为SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:164；
(ee)分别为SEQ ID NO:122和SEQ ID NO:164；
(ff)分别为SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:164；
(gg)分别为SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:164；
(hh)分别为SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:164；
(ii)分别为SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:170；
(jj)分别为SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:170；
(kk)分别为SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:164；
(ll)分别为SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:164；
(mm)分别为SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:171；
(nn)分别为SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:171；
(oo)分别为SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:164；
(pp)分别为SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:164；
(qq)分别为SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:169；
(rr)分别为SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:169；
(ss)分别为SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:164；
(tt)分别为SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:164；
(uu)分别为SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:171；
(vv)分别为SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:171；
(ww)分别为SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:164；
(xx)分别为SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:164；
(yy)分别为SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:171；
(zz)分别为SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:171；
(aaa)分别为SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:164；
(bbb)分别为SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:164；
(ccc)分别为SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:170；
(ddd)分别为SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:170；
(eee)分别为SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:164；
(fff)分别为SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:164；
(ggg)分别为SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:171；
(hhh)分别为SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:171；
(iii)分别为SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:164；
(jjj)分别为SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:164；
(kkk)分别为SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:164；
(lll)分别为SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:164；
(mmm)分别为SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:164；
(nnn)分别为SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:164；
(ooo)分别为SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:170；
(ppp)分别为SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:170；
(qqq)分别为SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:172；
(rrr)分别为SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:172；
(sss)分别为SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:173；
(ttt)分别为SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:173；
(uuu)分别为SEQ ID NO:156和SEQ ID NO:174；
(vvv)分别为SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:174；
(www)分别为SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:175；
(xxx)分别为SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:175；
(yyy)分别为SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:174；以及
(zzz)分别为SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:174；
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案12：根据前述实施方案中任一项所述的分离的抗原结合肽，其包含选自以下的序列：
(a)分别为SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:160；
(b)分别为SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:160；
(c)分别为SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:160；
(d)分别为SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:160；
(e)分别为SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:164；
(f)分别为SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:164；
(g)分别为SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:164；
(h)分别为SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:164；
(i)分别为SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:163；
(j)分别为SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:163；
(k)分别为SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:163；
(l)分别为SEQ ID NO:187和SEQ ID NO:163；
(m)分别为SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:162；
(n)分别为SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:162；
(o)分别为SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:162；
(p)分别为SEQ ID NO:187和SEQ ID NO:162；
(q)分别为SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:165；
(r)分别为SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:165；
(s)分别为SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:165；
(t)分别为SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:165；
(u)分别为SEQ ID NO:192和SEQ ID NO:161；
(v)分别为SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:161；
(w)分别为SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:161；以及
(x)分别为SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:161；
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案13：根据实施方案11所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:106和SEQ ID NO:164，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案14：一种分离的抗体Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:106和SEQ IDNO:164；
其中所述分离的抗体Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案15：根据实施方案12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:180和SEQ ID NO:164，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案16：一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:180和SEQID NO:164；
其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案17：根据实施方案12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:181和SEQ ID NO:164，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案18：一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:181和SEQID NO:164；
其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案19：根据实施方案12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:182和SEQ ID NO:164，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
/>
具体实施方案20：一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:182和SEQID NO:164；
其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案21：根据实施方案12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:183和SEQ ID NO:164，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案22：一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:183和SEQID NO:164；
其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案23：根据实施方案12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:176和SEQ ID NO:160，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案24：一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:176和SEQID NO:160；
其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案25：根据实施方案12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:177和SEQ ID NO:160，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案26：一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:177和SEQID NO:160；
其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案27：根据实施方案12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:184和SEQ ID NO:162，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案28：一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:184和SEQID NO:162；
其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案29：根据实施方案12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:184和SEQ ID NO:163，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案30：一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:184和SEQID NO:163；
其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案31：根据实施方案12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:188和SEQ ID NO:165，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案32：一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:188和SEQID NO:165；
其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案33：根据实施方案12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQID NO:192和SEQ ID NO:161，
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案34：一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:192和SEQID NO:161；
其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物：
具体实施方案35：一种分离的多核苷酸，其包含编码根据实施方案1-34中任一项所述的抗原结合肽或抗体Fab片段或抗体串联Fab片段的核酸序列。
具体实施方案36：一种包含根据实施方案35所述的多核苷酸的分离的载体。
具体实施方案37：一种包含根据实施方案36所述的载体的分离的宿主细胞。
具体实施方案38：一种制备抗原结合肽或抗体Fab片段或抗体串联Fab片段的方法，其包括：(a)在促进蛋白质产生的培养条件下培养根据实施方案37所述的宿主细胞，使得所述宿主细胞产生所述抗原结合肽或所述抗体Fab片段或所述抗体串联Fab片段，和(b)从所述培养物中分离所述抗原结合肽或所述抗体Fab片段或所述抗体串联Fab片段。
具体实施方案39：一种检测试剂，其包含根据实施方案1-34中任一项所述的分离的抗原结合肽或分离的抗体Fab片段或分离的抗体串联Fab片段和可检测标记。
具体实施方案40：根据实施方案39所述的检测试剂，其中所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段与所述可检测标记连接。
具体实施方案41：一种在有需要的受试者中降低所述式(I)的化合物或其立体异构体或互变异构体的抗血栓作用的方法，其包括向所述受试者施用药物有效剂量的根据实施方案1-34中任一项所述的分离的抗原结合肽或分离的抗体Fab片段或分离的抗体串联Fab片段，其中：
R1是C1-4烷基；
R2独立地选自F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CH3；
R3独立地选自CF3、CHF2、CH2F和CH3；
R4是H；并且
R5独立地选自F和Cl。
具体实施方案42：根据实施方案41所述的方法，其中所述式(I)的化合物具有式(II)：
具体实施方案43：根据实施方案41或42所述的方法，其中所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段的药物有效剂量包含如下的所述抗原结合肽或所述抗体Fab片段或所述抗体串联Fab片段，其与所述式(I)或(II)的化合物的剂量的摩尔比为至少约1:1，或与存在于所述受试者中的式(I)或(II)的化合物的摩尔比为至少约1:1。
具体实施方案44：根据实施方案41-43中任一项所述的方法，其中将所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段与所述式(I)或(II)的化合物的施用并行施用或在施用所述式(I)或(II)的化合物之后施用。
具体实施方案45：根据实施方案41-44中任一项所述的方法，其中将所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段通过静脉内、肌内或皮下方式施用。
具体实施方案46：根据实施方案41-45中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
具体实施方案47：一种检测生物样品中式(I)的化合物或其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐的水平的方法，其中：
R1是C1-4烷基；
R2独立地选自F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CH3；
R3独立地选自CF3、CHF2、CH2F和CH3；
R4是H；并且
R5独立地选自F和Cl；所述方法包括：
(a)使所述生物样品与根据实施方案1-34中任一项所述的分离的抗原结合肽或分离的抗体Fab片段或分离的抗体串联Fab片段接触，并且
(b)检测所述化合物与所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段的结合复合物的水平。
具体实施方案48：根据实施方案47所述的方法，其中所述式(I)的化合物具有式(II)：
具体实施方案49：根据实施方案47或48所述的方法，其中所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段是经标记的。
具体实施方案50：根据实施方案47-49中任一项所述的方法，其中通过免疫学测定进行所述检测。
具体实施方案51：根据实施方案47-50任一项所述的方法，其中所述生物样品包括尿液、粪便、唾液、全血、血浆、器官组织、毛发、皮肤、细胞或细胞培养物。
具体实施方案52：一种在使用治疗有效量的式(I)的化合物或其立体异构体或互变异构体的受试者中结合所述式(I)的化合物或其立体异构体或互变异构体的方法，其包括向所述受试者施用药物有效剂量的根据权利要求1-34中任一项所述的分离的抗原结合肽或分离的抗体Fab片段或分离的抗体串联Fab片段，其中
R1是C1-4烷基；
R2独立地选自F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CH3；
R3独立地选自CF3、CHF2、CH2F和CH3；
R4是H；并且
R5独立地选自F和Cl。
具体实施方案53：根据实施方案52所述的方法，其中式(I)的化合物具有式(II)：
具体实施方案54：根据实施方案52或53中任一项所述的方法，其中所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段的药物有效剂量包含如下的所述抗原结合肽或所述抗体Fab片段或所述抗体串联Fab片段，其与所述式(I)或(II)的化合物的剂量的摩尔比为至少约1:1，或与存在于所述受试者中的式(I)或(II)的化合物的摩尔比为至少约1:1。
具体实施方案55：根据实施方案52-54中任一项所述的方法，其中将所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段与所述式(I)或(II)的化合物的施用并行施用或在施用所述式(I)或(II)的化合物之后施用。
具体实施方案56：根据实施方案52-55中任一项所述的方法，其中将所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段通过静脉内、肌内或皮下方式施用。
具体实施方案57：根据实施方案52-56任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
附图说明
图1A和图1B描绘了26D5 mAb的序列与最接近的人种系V和J基因序列的比较。图1A：示出了与IGHV3-53和IGHJ4种系序列相比的26D5的VH序列。示出了Kabat编号。示出了HCDR2和HCDR3的Kabat定义。示出了HCDR1的Kabat和AbM定义。图1A按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 205、83和220。图1B：示出了与IGKV1-12和IGKJ4种系序列相比的26D5的VK序列。示出了Kabat编号。示出了CDR的Kabat定义。图1B按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 206、98和207。
图2描绘了随机化以用于突变扫描的26D5-GV-Q mAb的位置。示出了对于在突变扫描中随机化的每个位置的Kabat编号。示出了对于LCDR1-3、HCDR2-3(但此处HCDR2缺少最后6个氨基酸)的Kabat定义；示出了对于HCDR1的AbM定义。图2按出现顺序分别公开了SEQ IDNO 33、46、208-209和26。
图3A-图3E描绘了26D5-GV-Q mAb的位置的热图扫描，表明了指示位置的突变对抗体结合的影响(有利、中性或不利)。图3A示出了LCDR1(SEQ ID NO:33)；图3B示出了LCDR3(SEQ ID NO:46)；图3C示出了HCDR1(SEQ ID NO:208)；图3D示出了HCDR2(SEQ ID NO:209)；图3E示出了HCDR3(SEQ ID NO:26)。
图4A和图4B描绘了由26D5-GV-Q抗体的亲和力成熟产生的后代的氨基酸序列的比对。Kabat定义用于CDR和编号。图4A示出了重链可变区(按出现顺序分别为SEQ ID NO 83、82、74、60、67、62、75、66、64、69、71、60、68、77、66、76、69、70、71、73、72、65、70和63)的比对。图4B示出了轻链可变区(按出现顺序分别为SEQ ID NO 98、99、88、88、88、88、88、88、88、88、88、93、93、94、95、88、95、88、94、95、88、94、95和88)的比对。
图5描绘了随机化以用于突变扫描的26D5-295-B08 mAb的位置。示出了对于在突变扫描中随机化的每个位置的Kabat编号。图5按出现顺序分别公开了SEQ ID NO 210-215。
图6A-图6F描绘了26D5-295-B08 mAb的CDR和相邻框架位置的热图扫描，表明了指示位置的突变对抗体结合的影响(进一步的解释见图3A)。图6A示出了LCDR1(SEQ ID NO:210)；图6B示出了LCDR2(SEQ ID NO:211)；图6C示出了LCDR3(SEQ ID NO:212)；图6D示出了HCDR1(SEQ ID NO:213)；图6E示出了HCDR2(SEQ ID NO:214)；图6F示出了HCDR3(SEQ IDNO:215)。
图7A和图7B描绘了随机化以创建复合文库的26D5-295-B08 mAb的氨基酸位置(图7A，复合芯片文库(按出现顺序分别为SEQ ID NO 216-219)；图7B，复合掺杂文库(SEQ IDNO:215))。
图8A和图8B描绘了由26D5-295-B08 mAb的亲和力成熟产生的后代的氨基酸序列的比对。Kabat定义用于CDR和编号。图8A示出了重链可变区(按出现顺序分别为SEQ ID NO83、82、60、54、52、54、60、53、61、56、59、57、57、58和55)的比对。图8B示出了轻链可变区(按出现顺序分别为SEQ ID NO 98、99、88、86、84、87、91、85、89、89、88、92、90、88和88)的比对。
图9描绘了用于确定化合物A活性逆转等于或大于50％所需抗体量的显色酶法测定的结果。在因子XIa底物和化合物A的浓度保持不变时，因子XIa酶活性(y轴)的活性被绘制成随着代表性亲和力成熟mAb的浓度(x轴)而变化。上图示出了使用亲本26D5的mAbIgG1f形式(SEQ ID NO:83和98；本文也称为P1-072224；在图中指示为“26D5mAb”)得出的数据。下图示出了使用26D5-296-G07的mAb IgG1f形式(SEQ ID NO:65和94；本文也称为P1-073056；在图中指示为“26D5-296-G07 mAb”)得出的数据。
图10描绘了表面等离子体共振(SPR)传感图，指示了亲本mAb 26D5(P1-072224)(图中指示为“26D5 mAb”)与化合物A的结合亲和力，该亲和力是在多种化合物浓度下测得的。
图11描绘了表面等离子体共振(SPR)传感图，指示了(顶部)mAb 26D5-GV-Q、(中部)mAb 26D5-295-B08和(底部)抗体Fab片段26D5-295-B08与化合物2的结合亲和力，该亲和力是在多种mAb/Fab浓度下测得的。
图12描绘了表面等离子体共振(SPR)传感图，指示了(顶部)抗体串联Fab(TanFab)片段26D5-75616-348-F10-TanFab和(底部)抗体串联Fab(TanFab)片段26D5-75214-343-F06-TanFab与化合物5的结合亲和力，该亲和力是在多种TanFab浓度下测得的。
图13描绘了时间分辨荧光能量转移(TR-FRET)得出的关于以下的竞争性结合数据：各自与化合物5结合的(A)26D5-GVR-Q-FT-Fab-长的mAb形式，(B)26D5-295-B08-Fab-长的mAb形式，和(C)26D5-75747-348-D07-Fab-长的mAb形式。
图14描绘了时间分辨荧光能量转移(TR-FRET)得出的关于以下的竞争性结合数据：各自与化合物5结合的所指示的抗体和抗体Fab片段。
图15描绘了所指示的抗体Fab片段的DSC热谱图。
图16描绘了通过与化合物A结合的抗体Fab片段26D5-GVR-Q-FT Fab的晶体学确定的结构。
图17描绘了通过与化合物A结合的抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的晶体学确定的结构。
图18描绘了中和抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短逆转化合物A的抗凝效应。人血浆凝固时间(aPTT)被绘制为随着化合物A和中和抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的血浆浓度而变化。
图19描绘了人血浆凝固时间(aPTT)随着未结合化合物A的血浆浓度而变化，无论抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短是否存在。人血浆凝固时间(aPTT)被绘制为在不存在(实心符号)和存在(空心符号)中和抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的情况下随着化合物A的血浆浓度而变化。
图20描绘了中和抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短逆转化合物A的抗凝效应。向兔施用静脉内剂量的化合物A(1mg/kg)20分钟后，再施用静脉内剂量的抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短(160mg/kg)。在基线即施用化合物A前不久以及在之后约24小时内测量血浆凝固时间(aPTT)。
图21描绘了由静脉内剂量的化合物A(1mg/kg)20分钟后，再静脉内剂量的抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短(160mg/kg)得出的抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短、化合物A和游离化合物A的药代动力学(兔血浆浓度)。
图22描绘了由各自以10mg/kg的静脉内剂量经10分钟输注施用得出的抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短和抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab的药代动力学(大鼠血浆浓度)。空心圆形/串联Fab指示抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab数据点。空心三角形/Fab指示抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短数据点。
图23描绘了由将化合物A以0.4mg/kg的静脉内剂量经10分钟输注施用后20分钟后，再将抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab以40mg/kg的静脉内剂量经10分钟输注施用得出的抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab、化合物A和游离化合物A的药代动力学(兔血浆浓度)。封闭的圆形/串联Fab指示抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab数据点。
图24描绘了中和抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab逆转化合物A的抗凝效应。人血浆凝固时间(aPTT)被绘制为随着化合物A和中和抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab的血浆浓度而变化。“串联Fab”是指抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab。
具体实施方式
本发明提供了新型抗体或抗原结合肽，其结合选择性FXIa抑制剂和/或FXIa和血浆激肽释放酶的双重抑制剂。如本文所用，FXIa抑制剂是式(I)所示的化合物并且具有抑制FXIa活性或功能的能力。因此，在一些实施方案中，本文提供的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)特异性结合式(I)所示的化合物或其立体异构体或互变异构体。在一些实施方案中，式(I)中的R1是C1-4烷基；式(I)中的R2独立地选自F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CH3；式(I)中的R3独立地选自CF3、CHF2、CH2F和CH3；式(I)中的R4是H；并且式(I)中的R5独立地选自F和Cl。在某些实施方案中，本文提供的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)特异性结合式(II)所示的化合物。如本文所用，术语式(I)或(II)的化合物涵盖所有具有式(I)或(II)的化合物或其立体异构体或互变异构体。
在具体实施方案中，被本发明的抗原结合肽结合的抗原是式(II)的化合物(本文也称为化合物A并且称为米尔维仙(milvexian))。米尔维仙是一种直接作用的可逆的小分子治疗剂，以高亲和力和选择性结合并抑制激活形式的人凝血因子XI(FXIa)。米尔维仙化学名为(5R,9S)-9-(4-(5-氯-2-(4-氯-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-6-氧代嘧啶-1(6H)-基)-21-(二氟甲基)-5-甲基-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃-4-酮。米尔维仙和制备米尔维仙的方法描述于美国专利号9,453,018中，其通过引用以其整体特此并入。
如本文所用，FXIa是指内源性途径中参与调节血液凝固的丝氨酸蛋白酶。FXIa的结构和生理功能通常是本领域熟知的。FXI，它主要由肝细胞合成并且以酶原形式循环。然后FXI被FXIIa和凝血酶生理激活。参见Mohammed B.等人Thromb Res.,161:94-105(2018)，其通过引用并入。
如本文所用，术语“抗原结合肽”是指识别并特异性结合靶分子(即抗原)的蛋白质或多肽分子。靶分子的例子包括但不限于小分子化合物、蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的任何部分或组合。
在一些实施方案中，本发明的抗原结合肽是一种抗体或抗体片段，例如但不限于(Fab)、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGACH2、微型抗体、F(ab’)3、四抗体、三抗体、双抗体、单域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2、scFv-Fc或串联Fab。
在一些实施方案中，本发明的抗原结合肽，例如抗体或Fab片段，可以是分离的。如本文所用，术语“分离的”意指核酸、肽或蛋白质从其天然环境中取出，例如从产生它的细胞或生物体中，或从天然存在核酸、肽或蛋白质的流体中取出。对于具有新型非天然存在的氨基酸序列的肽或蛋白质，“分离的”肽或蛋白质意指该蛋白质或肽已从产生该肽或蛋白质的工程化细胞中取出。出于本发明的目的，如果肽或蛋白质是混合物或组合物(例如药物配制品)的组分，肽或蛋白质仍然可以被认为是分离的，条件是该蛋白质或肽不在产生该肽或蛋白质的细胞内并且不在其原本的天然环境中。
在本发明的一个具体实施方案中，Fab作为抗原结合肽被提供。如本文所用，术语“Fab”或“抗体Fab片段”是熟知的术语并且是指全长抗体上与抗原结合的区域。在一些实施方案中，抗体Fab片段至少由全长轻链和重链的N末端部分构成。如本文所用，全长轻链至少包含轻链恒定区(CL)和轻链可变区(VL)；并且重链的N末端部分至少包含重链恒定区的CH1结构域和重链可变区(VH)。
在本发明的一个具体实施方案中，串联Fab作为抗原结合肽被提供。如本文所提供的串联Fab包含重链的至少一个N末端部分(VH-CH1)和至少一个全长轻链(VL-CL)。在一些实施方案中，本文提供的串联Fab包含重链的经由接头连接的两个或更多个N末端部分(例如，VH-CH1-接头-CH1-VH或VH-CH1-接头-VH-CH1)，每个与一个全长轻链(VL-CL)配对。在示例性实施方案中，本文提供的串联Fab包含重链的经由接头连接的两个的N末端部分(例如，VH-CH1-接头-CH1-VH或VH-CH1-接头-VH-CH1)，每个与一个全长轻链(VL-CL)配对。在一些实施方案中，接头是多肽接头。示例性串联Fab提供在本发明的表4中。术语“串联Fab”、“抗体串联Fab片段”和“抗体TanFab片段”在本文中可互换使用。
抗体的“可变区”是本领域熟知的术语，并且是指促成抗体特异性结合其抗原的轻链或重链的末端。术语“重链可变区”、“可变重链”和“VH”可互换使用，并且是指促成抗体特异性结合其抗原的重链末端。同样，术语“轻链可变区”、“可变轻链”和“VL”可互换使用，并且是指促成抗体特异性结合其抗原的轻链末端。
重链和轻链的可变区各自通常由通过三个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成。每条链中的CDR通过FR紧密保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起，促成抗体的抗原结合结构域的形成。用于确定CDR的技术是本领域通常已知的。例如，至少有两种技术用于确定CDR：(1)基于跨物种序列变异性的方法；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法。此外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。每条链的CDR按从氨基末端到羧基末端的方向编号为CDR1、CDR2和CDR3。
抗体的“恒定区”是本领域熟知的术语，并且是指不同抗体分子之间氨基酸序列相对恒定的抗体部分。通常，重链恒定区由三个不同的区域构成，称为CH1、CH2和CH3，按从氨基末端(N末端)末端到羧基末端(C末端)的方向编号。一条典型的轻链只有一个称为CL的恒定区。抗体的恒定区决定了它的特定效应子功能。本领域技术人员将容易理解抗体恒定区的术语和结构特征。
在一些实施方案中，抗原结合肽涵盖包含至少一个抗原识别位点的任何经修饰的多肽分子，只要该经修饰的多肽分子展现出期望的抗原结合活性即可。本文提供的抗原结合肽可以缀合或不缀合其他分子，如毒素、放射性同位素、荧光标记等。
如本文所用，术语“抗体”是本领域熟知的术语，并且是指免疫球蛋白分子，该免疫球蛋白分子通过免疫球蛋白分子的可变区的至少一部分内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶分子。抗体的结构是本领域通常已知的，并且常常由至少两条全长重链构成。大多数抗体，除最显要的骆驼抗体外，均由至少两条全长重链和至少两条全长轻链构成。如本文所用，抗体涵盖多克隆抗体、单克隆抗体(本文也称为“mAb”)、多特异性抗体(如从至少两种抗体生成的双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体和非人抗体。如本文所用的“抗体”可以是五大类免疫球蛋白中的任何一类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同种型)(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，这基于它们的重链恒定结构域(分别称为α、δ、ε、γ和μ)的身份。不同种类的免疫球蛋白具有不同且熟知的亚基结构和三维构型。
当提及重链可变结构域或轻链可变结构域中的残基(大约为轻链残基1-107和重链残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统。参见Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)。CDR的抗原相互作用残基也可以通过抗原-抗体复合物的晶体学研究来确定。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指代任何长度的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可以是直链或支链的，它可以包含经修饰的氨基酸，并且它可以被非氨基酸中断。该术语还涵盖已被自然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物。在一些实施方案中，氨基酸聚合物通过二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他的操纵或修饰而被修饰。在一些实施方案中，氨基酸聚合物通过与标记组分缀合而被修饰。定义中还包括含有本领域已知的一种或多种氨基酸类似物以及非天然氨基酸的肽。
术语“特异性地结合”(或“特异性结合”)是本领域熟知的，并且通常意指抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的抗原结合部分经由其抗原结合结构域特异性识别抗原，并且该结合需要抗原结合结构域与抗原之间的至少一些互补性。根据这个定义，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)被视为经由其抗原结合结构域“特异性结合”至抗原的表位比结合至随机无关的抗原更容易。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含提供于表1的VH和VL CDR序列的组合。在一些实施方案中，本文提供的本发明的抗体或抗体片段特异性结合本文公开的FXIa抑制剂(例如但不限于式(I)的FXIa抑制剂)，并且包含VH和VL CDR，其中每个CDR独立地具有相对于表1中公开的对应CDR的多达四(即，0、1、2、3或4)个保守氨基酸取代。
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在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含在表2中提供的VH和VL氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含在表3中提供的部分重链氨基酸序列和全长轻链氨基酸序列的组合。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含在表4中提供的串联部分重链氨基酸序列和全长轻链氨基酸序列的组合。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含本文所述的单独可变轻链或可变重链中的一个或多个。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含本文所述的可变轻链和可变重链二者。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含与本文所述的一条可变轻链配对的一条可变重链。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含多于一条可变重链，每条可变重链与本文所述的一条可变轻链配对。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含两条可变重链，每条可变重链与本文所述的一条可变轻链配对。
本发明还涵盖抗体或抗体片段，这些抗体或抗体片段包含与本文在表2所公开的VH和VL序列至少约80％、85％、89％、90％、95％或99％相同的VH和VL序列。
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本发明还涵盖抗体或抗体片段，这些抗体或抗体片段包含与本文在表3所公开的部分重链氨基酸序列和全长轻链氨基酸序列至少约80％、85％、89％、90％、95％或99％相同的部分重链氨基酸序列和全长轻链氨基酸序列。本发明还涵盖抗体或抗体片段，例如抗体Fab片段，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：表3中的重链的N末端部分中的任一个与表3中的全长轻链中的任一个的组合。本发明还涵盖抗体或抗体片段，例如抗体Fab片段，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：表3中的重链的N末端部分与表3中的全长轻链的所指示配对中的任一个。本发明还涵盖抗体或抗体片段，例如抗体Fab片段，其包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：SEQ ID NO:106的序列和SEQ ID NO:164的序列。本发明还涵盖抗体或抗体片段，例如抗体Fab片段，其包含SEQ ID NO:106的序列和SEQ ID NO:164的序列。本发明还涵盖抗体或抗体片段，例如抗体Fab片段，其基本上由SEQID NO:106的序列和SEQ ID NO:164的序列组成。本发明还涵盖抗体或抗体片段，例如抗体Fab片段，其由SEQ ID NO:106的序列和SEQ ID NO:164的序列组成。
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本发明还涵盖抗体或抗体片段，这些抗体或抗体片段包含与本文在表4所公开的部分重链氨基酸序列和全长轻链氨基酸序列至少约80％、85％、89％、90％、95％或99％相同的串联部分重链氨基酸序列和全长轻链氨基酸序列。
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“同一性”本身具有领域公认的含义并且可以使用已公布的技术计算。参见例如，COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY,Lesk,A.M.,编,Oxford University Press,NewYork,(1988)；BIOCOMPUTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS,Smith,D.W.,编,Academic Press,New York,(1993)；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA,PART I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,Humana Press,New Jersey,(1994)；SEQUENCE ANALYSISIN MOLECULAR BIOLOGY,von Heinje,G.,Academic Press,(1987)和SEQUENCE ANALYSISPRIMER,Gribskov,M.和Devereux,J.编,M Stockton Press,New York,(1991)。)虽然存在许多方法来测量两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性，但术语“同一性”对于熟练技术人员来说是熟知的。(Carillo,H.和Lipton,D.,SIAM J.Applied Math.48:1073(1988)。)通常用于确定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括但不限于在“Guide to HugeComputers,”Martin J.Bishop,编,Academic Press,San Diego,(1994)和Carillo,H.和Lipton,D.,SIAM J.Applied Math.48:1073(1988)中披露的方法。用于比对多核苷酸或多肽的方法被编码在计算机程序中，包括GCG程序包(Devereux,J.,等人,Nucleic AcidsResearch 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.215:403(1990))、Bestfit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575ScienceDrive,Madison,Wis.53711(使用Smith和Waterman的局部同源性算法,Advances inApplied Mathematics 2:482 489(1981))。
所谓多核苷酸分别与参考核苷酸序列至少例如95％“相同”，意指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，但多核苷酸序列可以包括至多五个突变/参考核苷酸序列的每100个核苷酸。例如，为获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可以缺失或被另一核苷酸取代，或者可以将数量为参考序列中总核苷酸的至多5％的核苷酸插入参考序列中。
作为一个实际问题，任何特定核酸分子是否与本发明的核苷酸序列至少80％、85％、89％、90％、95％或99％相同可以使用已知的计算机程序来确定。用于确定查询序列与参考序列之间的最佳整体匹配的一种方法，也称为全局序列比对，可以基于Brutlag等人(Comp.App.Biosci.6:237-245(1990))的算法使用FASTDB计算机程序来确定。在常规的核苷酸序列比对中，查询序列和参考序列二者都是DNA序列；然而，可以通过将U's转换为T's来比较RNA序列。全局序列比对的结果以同一性百分比报告。在本发明的一个实施方案中，在DNA序列的FASTDB比对中用于计算同一性百分比的参数为：矩阵＝统一，k-元组＝4，错配罚分＝1，加入罚分＝30，随机化组长度＝0，截止得分＝1，空位罚分＝5，空位大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或受试核苷酸序列的长度(以较短者为准)。
如果参考序列比查询序列短是由于例如5’或3’缺失而不是由于内部缺失，则必须对结果进行手动校正。这是因为FASTDB程序在计算同一性百分比时不考虑参考序列的5’和3’截短。对于相对于查询序列在5'或3’端截短的参考序列，通过计算查询序列中的在参考序列5'和3’的不匹配/不对齐的碱基数占查询序列总碱基的百分比来校正同一性百分比。然后，从例如通过FASTDB程序使用规定的参数计算的同一性百分比中减去该百分比，以得出最终的同一性百分比得分。这个校正的得分出于本发明的目的被使用。出于手动调整同一性百分比得分的目的，仅计算如通过FASTDB比对显示的除参考序列中与查询序列不匹配/不对齐的5'和3’碱基之外的碱基。
例如，将90个碱基的参考序列与100个碱基的查询序列比对以确定同一性百分比。缺失发生在参考序列的5’端，因此，FASTDB比对不显示5’端前10个碱基的匹配/比对。10个未配对的碱基代表序列的10％(在5’和3’端不匹配的碱基数/查询序列中的碱基总数)，因此从由FASTDB程序计算的同一性百分比得分中减去10％。如果剩余的90个碱基完全匹配，则最终的同一性百分比为90％。在另一个例子中，将90个碱基的参考序列与100个碱基的查询序列进行比较。这次的缺失是内部缺失，因此在参考序列的5’或3’没有与查询不匹配/不对齐的碱基。在这种情况下，不对通过FASTDB计算的同一性百分比进行手动校正。再一次，仅对参考序列中与查询序列不匹配/不对齐的5’和3’碱基进行手动校正。
所谓多肽具有与本发明的查询氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列，意指受试多肽的氨基酸序列与查询序列相同，但受试多肽序列可以包括至多五个氨基酸改变/查询氨基酸序列的每100个氨基酸。换句话说，为获得具有与查询氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参考序列中至多5％的氨基酸残基可以被插入、缺失或被另一氨基酸取代。这些参考序列的改变可发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或发生在这些末端位置之间的任何地方，即单独地散布在参考序列的残基中或散布在参考序列内的一个或多个连续组中。
作为一个实际问题，任何特定多肽是否与例如表1-表4中任一个表中所示的氨基酸序列至少80％、85％、89％、90％、95％或99％相同可以使用已知的计算机程序来常规地确定。用于确定查询序列(本发明的序列)与参考序列之间的最佳整体匹配的一种优选方法，也称为全局序列比对，可以使用上述FASTDB计算机程序来确定。在序列比对中，查询序列与参考序列二者均为氨基酸序列。所述全局序列比对的结果是同一性百分比。在本发明的一个实施方案中，在氨基酸序列的FASTDB比对中用于计算同一性百分比的参数为：矩阵＝PAM 0，k-元组＝2，错配罚分＝1，加入罚分＝20，随机化组长度＝0，截止得分＝1，窗口大小＝序列长度，空位罚分＝5，空位大小罚分＝0.05，窗口大小＝500或受试氨基酸序列的长度(以较短者为准)。
如果参考序列比查询序列短是由于N末端或C末端缺失而不是由于内部缺失，则必须对结果进行手动校正。这是因为FASTDB程序在计算全局同一性百分比时不考虑参考序列的N和C末端截短。对于相对于查询序列在N和C末端截短的参考序列，通过计算查询序列中的在参考序列N和C末端的与对应的受试残基不匹配/不对齐的残基数占查询序列总碱基的百分比来校正同一性百分比。残基是否匹配/对齐由FASTDB序列比对的结果来确定。然后，从上述FASTDB程序使用规定的参数计算的同一性百分比中减去该百分比，以得出最终的同一性百分比得分。最终的同一性百分比得分出于本发明的目的被使用。出于手动调整同一性百分比得分的目的，仅考虑参考序列中与查询序列不匹配/不对齐的N和C末端的残基。也就是说，仅考虑除参考序列最远N和C末端残基之外的查询残基位置。
例如，将90个氨基酸残基的参考序列与100个残基的查询序列比对以确定同一性百分比。缺失发生在参考序列的N末端，因此，FASTDB比对不显示N末端前10个残基的匹配/比对。10个未配对的残基代表序列的10％(在N末端和C末端不匹配的残基数/查询序列中的残基总数)，因此从由FASTDB程序计算的同一性百分比得分中减去10％。如果剩余的90个残基完全匹配，则最终的同一性百分比为90％。在另一个例子中，将90个残基的参考序列与100个残基的查询序列进行比较。这次的缺失是内部缺失，因此在参考序列的N或C末端没有与查询不匹配/不对齐的残基。在这种情况下，不对通过FASTDB计算的同一性百分比进行手动校正。再一次，仅对如在FASTDB比对中显示的除了参考序列中与查询序列不匹配/不对齐的N和C末端之外的残基位置进行手动校正。
在公开的同一性百分比的范围内，本发明还涉及本发明公开的多肽的取代变体。取代变体包括其中一个或多个氨基酸残基被去除且被替代性残基替代的那些多肽。在一个方面，虽然上文公开的同一性百分比涉及指定的特定序列的总体序列，但保持恒定并且不受变异影响的氨基酸残基将是CDR的那些氨基酸残基，并且框架的氨基酸残基将受变异影响。例如，在一个具体实施方案中，当本发明的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)包含至少一个VH，该VH包含与SEQ ID NO:64的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列，VH的CDR区保持恒定并且框架区允许可变，只要SEQ ID NO:64的总体同一性百分比落在实施方案的范围内即可。在一个方面，变异是本质上保守的取代；然而本发明包含非保守的取代。用于本发明的目的的保守取代可以是如下表5-表7中所示定义的。氨基酸可以根据物理特性和对二级和三级蛋白质结构的贡献分类。保守取代在本领域被认为是一种氨基酸被另一种具有相似特性的氨基酸取代。示例性保守取代如下所示。
表5：保守取代
可替代地,保守氨基酸可以按照Lehninger(1975)Biochemistry,第二版；WorthPublishers,第71-77页中的描述来分组。
表6：保守取代
并且，再其他可替代的示例性保守取代如下所示。
表7：保守取代
在本发明的抗体或抗体片段的一些实施方案中，CH1结构域包含具有以下氨基酸序列的部分重链恒定区：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC(SEQ ID NO:202)。本发明还涵盖本发明的抗体或抗体片段，这些抗体或抗体片段包含具有与SEQ ID NO:202的CH1结构域至少约80％、85％、89％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列的CH1结构域。在本发明的抗体或抗体片段的一些实施方案中，CH1结构域包含具有以下氨基酸序列的部分重链恒定区：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTH(SEQ ID NO:203)。本发明还涵盖抗体或抗体片段，这些抗体或抗体片段包含具有与SEQ ID NO:203的CH1结构域至少约80％、85％、89％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列的CH1结构域。在本发明的抗体或抗体片段的一些实施方案中，CL结构域包含具有以下氨基酸序列的轻链恒定区：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:204)。本发明还涵盖抗体或抗体片段，这些抗体或抗体片段包含具有与SEQ ID NO:204的CH1结构域至少约80％、85％、89％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列的CL结构域。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含本文所述的单独重链N末端部分和全长轻链中的一个或多个。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)包含本文所述的重链N末端部分和全长轻链序列二者。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含与本文所述的一条全长轻链配对的一个重链N末端部分。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含多于一个重链N末端部分，每个重链N末端部分与本文所述的一条全长轻链配对。在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体片段包含两个重链N末端部分，每个重链N末端部分与本文所述的一条全长轻链配对。在某些实施方案中，两个重链N末端部分经由接头连接。
表4提供了本发明的示例性串联Fab的重链和轻链的序列。在一些实施方案中，串联Fab的重链包含经由接头连接的一个或两个抗体重链N末端部分，并且串联Fab的轻链包含抗体的全长轻链(VL-CL)。在一些实施方案中，串联Fab的重链可表示为VH-CH1-接头-CH1-VH或VH-CH1-接头-VH-CH1。
本发明涵盖的接头可以是具有各种结构的任何适合的分子。在某些实施方案中，接头是多肽接头。多肽接头可以具有各种长度。在一些实施方案中，接头是包含约20个或更少的氨基酸的多肽。示例性多肽接头序列提供于表8中并且在表4中加双下划线。
表8：示例性接头序列
接头序列 SEQ ID NO
ASTKGP SEQ ID NO:196
ASTKGPSVFPLAP SEQ ID NO:197
ELQLEESAAEAQEGELE SEQ ID NO:198
GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO:199
表9：mAb序列
在一些实施方案中，本发明提供了一种包含SEQ ID NO:201的氨基酸序列的抗原结合肽。
在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一个VH和至少一个VL的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)。在一些实施方案中，该至少一个VH包含：含有选自SEQ IDNO:1-12的氨基酸序列的VH互补决定区1(VH-CDR1)；含有选自SEQ ID NO:13-22的氨基酸序列的VH-CDR2；或含有选自SEQ ID NO:23-28的氨基酸序列的VH-CDR3。在一些实施方案中，该至少一个VL包含以下中的至少一个：含有选自SEQ ID NO:29-37的氨基酸序列的VL-CDR1；含有选自SEQ ID NO:38-43的氨基酸序列的VL-CDR2；或含有选自SEQ ID NO:44-51的氨基酸序列的VL-CDR3。在一些实施方案中，本发明的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)包含具有1、2、3或4个保守氨基酸取代的VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3。
在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)包含：至少一个VH，所述VH包含与选自SEQ ID NO:52-83的序列至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列；以及至少一个VL，所述VL包含与选自SEQ ID NO:84-99的序列至少约80％、85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，在本文表2中公开的至少一个VH区和至少一个VL区还涵盖包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的变体序列。
在一些实施方案中，本发明的串联Fab包含与表4中的序列至少约80％、85％、90％、95％和99％相同的序列。
本发明进一步涵盖包含如下核酸序列的多核苷酸，该核酸序列编码部分或全部的本文提供的抗原结合肽，例如但不限于抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，多核苷酸包含如下核酸序列，该核酸序列编码提供于表1中的CDR序列中的任一个。在一些实施方案中，多核苷酸包含如下核酸序列，该核酸序列编码提供于表2中的VH或VL中的任一个。在一些实施方案中，多核苷酸包含如下核酸序列，该核酸序列编码提供于表3中的重链N末端部分或全长轻链中的任一个。在一些实施方案中，多核苷酸包含如下核酸序列，该核酸序列编码提供于表4中的串联Fab重链和轻链序列中的任一个。
本发明还涵盖与本文公开的任何多核苷酸具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的多核苷酸。本发明进一步提供了编码本文公开的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的片段、类似物和衍生物的多核苷酸的变体。多核苷酸变体可以含有在编码区、非编码区、或两者中的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加、或缺失但不改变编码的多肽的特性或活性的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体由归因于遗传密码简并性的沉默取代产生。多核苷酸变体可以由于各种原因产生，例如以优化特定宿主的密码子表达。
在某些实施方案中，本发明的多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在相同阅读框中融合到编码有助于例如从宿主细胞中表达和分泌该多肽的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，成熟多肽是本文公开的抗原结合肽，例如但不限于抗体或抗体片段。在某些实施方案中，多核苷酸包含编码前导多肽序列的序列，该前导多肽序列充当分泌序列以控制从细胞转运多肽。具有前导序列的多肽是前蛋白(preprotein)，该先导序列可被宿主细胞切割以形成成熟形式的多肽。多核苷酸还可以编码蛋白质原(proprotein)，该蛋白质原是成熟蛋白质加上另外的5’氨基酸残基。具有原序列(prosequence)的成熟多肽是蛋白质原并且是蛋白质的一种非活性形式。一旦原序列被切割，就剩下活性成熟蛋白质。在某些实施方案中，多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编码序列在相同阅读框中融合到标记序列，该标记序列允许例如编码的多肽的纯化。
在一些实施方案中，本发明提供了包含本文提供的任一种多核苷酸的载体。如本文所用，术语“载体”是指构建体，该构建体能够在宿主细胞中递送并任选地表达一种或多种目的多核苷酸、蛋白质或序列。载体的例子包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂相关的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体、和某些真核细胞(如生产细胞)。
本发明进一步提供了包含本文提供的载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是分离的细胞。在一些实施方案中，分离的宿主细胞产生本文提供的抗原结合肽，例如但不限于抗体或抗体片段。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母、昆虫或高等真核生物细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核生物细胞包括如下所述的已建立的哺乳动物起源的细胞系。也可以使用无细胞翻译系统。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当的克隆和表达载体是本领域通常已知的。还有利地使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统表达重组蛋白。可以在哺乳动物细胞中表达重组蛋白，因为此类蛋白总体上被正确折叠、适当修饰和完全有功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括COS-7猴肾细胞系、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK细胞系。此外，用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统是本领域通常已知的。
由转化的宿主产生的本发明的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)可以根据任何合适的方法纯化。此类标准方法包括色谱法(例如离子交换、亲和及分级柱色谱)、离心、差异性溶解度或任何其他标准的蛋白质纯化技术。亲和力标签如六聚组氨酸(SEQ IDNO:221)、麦芽糖结合结构域、流感外壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶可以附接到蛋白质上以允许易于通过适当的亲和柱纯化。还可以使用如蛋白质水解、核磁共振、质谱和x射线晶体学等技术对分离的蛋白质进行物理表征。纯化抗体和其他蛋白质的方法是本领域通常已知的。
在某些实施方案中，本发明提供了一种制备本文公开的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的方法。在一个示例性实施方案中，该方法包括：(a)在促进蛋白质产生的培养条件下培养上文提供的宿主细胞，使得所述宿主细胞产生所述抗原结合肽，例如但不限于抗体或抗体片段；和(b)从培养的细胞中分离抗原结合肽，例如但不限于抗体或抗体片段。可以使用本领域通常已知的制备抗原结合肽的方法产生本发明的抗原结合肽，例如但不限于抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，本文提供的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)可用作检测试剂。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)被可检测地标记。术语“标记”当在本文中使用时是指直接或间接与抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)缀合的可检测化合物。该标记可以通过本身(例如放射性同位素标记或荧光标记)被检测，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物的化学改变。在某些实施方案中，所述标记选自免疫荧光标记、化学发光标记、磷光标记、酶标记、放射性标记、抗生物素蛋白/生物素、胶体金颗粒、带色颗粒和磁性颗粒。
在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)在体外或体内与式(I)或(II)的化合物形成结合复合物。在一些实施方案中，结合复合物是免疫复合物。通常，免疫复合物形成的检测是本领域熟知的，并且可以通过应用大量方法实现。在一些实施方案中，通过免疫学测定或免疫测定进行检测。
如本文所用，免疫学测定是指利用体外或体内抗体-抗原结合的特异性的任何测定。在一些实施方案中，该测定可用于鉴定在生物样品中靶分子的存在或不存在。在一些实施方案中，该测定可用于测量靶分子的量或水平。在一些实施方案中，靶分子是抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的免疫复合物，该免疫复合物是在体外或体内与式(I)或(II)的化合物形成的。在一些实施方案中，靶分子是式(I)或(II)的化合物本身。在一些示例性实施方案中，免疫学测定包括但不限于放射免疫测定、免疫组织化学、化学发光免疫测定(CLIA)、酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、计数免疫测定、流式细胞术、荧光免疫测定和荧光激活细胞分选法(FACS)。
如本文所用的生物样品可以是源自受试者的任何样品。在一些实施方案中，生物样品是尿液、粪便、唾液、全血、血浆、器官组织、毛发、皮肤、细胞或细胞培养物。在一些实施方案中，生物样品是液体样品。在一些实施方案中，生物样品可以用固定剂固定。例如，通常使用醛固定剂，如福尔马林(甲醛)和戊二醛。
本发明进一步提供了在有需要的受试者中降低FXIa抑制剂或FXIa和血浆激肽释放酶的双重抑制剂的抗血栓作用的方法。在一些实施方案中，本发明涉及降低FXIa抑制剂的抗血栓作用的方法。在某些实施方案中，FXIa抑制剂是式(I)或(II)的化合物。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用药物有效剂量的本文提供的抗原结合肽，例如但不限于抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)可以以高亲和力与式(I)或(II)的化合物结合，并且在体外或体内逆转其抗血栓作用。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)与式(I)或(II)的化合物的结合可在体外或体内中和其抗血栓作用。在一些实施方案中，抗原结合肽结合FXIa抑制剂，例如式(I)或(II)的化合物，并且由此防止FXIa抑制剂与FXIa结合。
术语“受试者”是指任何动物，包括但不限于人、非人灵长类动物等。在一些实施方案中，受试者是特定治疗的接受者。在一些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者是需要本文提供的治疗的人患者。在一些实施方案中，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。
术语例如“治疗”(“treating”、“treatment”或“to treat”)可互换使用，并且是指治愈、减缓、降低或减轻病理学病症的症状、逆转或中和病理学病症的效应和/或阻止病理学病症的进展的措施。如本文所用，术语治疗用于意指接受至少一种本发明的抗原结合肽，例如但不限于抗体或抗体片段。术语“预防”或“降低风险”用于意指预防或预防性措施，与未接受治疗的个体相比，这些措施预防和/或减缓所靶向的病理学病症的发展，或降低受试者患异常病症的风险。因此，需要治疗的受试者包括那些已经患有病症(如血栓形成)的受试者，易患病症的那些受试者，以及要预防病症的那些受试者。
本发明还提供了包含本文公开的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物组合物。在一些实施方案中，本发明的药物组合物涵盖治疗性组合物和/或预防性组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含治疗有效剂量的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)和药学上可接受的载体或赋形剂。此类药学上可接受的赋形剂是本领域通常已知的。常见的赋形剂包括但不限于防腐剂、增溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、吸附剂、媒介物、甜味剂、香料、着色剂、气味剂、盐(本发明的物质本身可以以药学上可接受的盐的形式提供)、缓冲液、包衣剂、和抗氧化剂。示例性赋形剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇、蔗糖、山梨糖醇及其任何组合。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是非活性成份。然而，应理解，药学上可接受的赋形剂有时会对药物组合物的制造、质量、安全性或功效有影响。在一些实施方案中，除了本发明的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)外，药物组合物还可包含治疗活性药剂。
可以将本发明的药物组合物提供在单位剂量或多剂量的容器(例如，密封的安瓿和小瓶)中，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要恰在使用前添加无菌液体载体(例如注射用水或盐水)。临时注射溶液和悬浮液可由无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。
可以将药物组合物根据用途以一种便利且适合的方式施用。在一些实施方案中，可以将药物组合物通过肠胃外途径施用。在一些实施方案中，肠胃外施用途径可以是静脉内、腹膜内、肌内、瘤内、皮下、鼻内或皮内途径。
适于透皮施用的药物组合物可作为离散的贴剂呈现，旨在与接受者的表皮保持长时间段的密切接触。例如，活性成分可如Pharmaceutical Research，3(6):318(1986)中总体上所述的通过离子透入法从贴剂递送。
其中载体是固体的适于鼻施用的药物组合物包括粒度例如在20至500微米范围内的粗粉，将其采用鼻吸的方式施用，即通过从靠近鼻子的装有粉末的容器中通过鼻腔快速吸入来施用。其中载体是液体的作为鼻腔喷雾剂或滴鼻剂施用的适合的组合物包括活性成分的水溶液或油溶液。
适于肠胃外施用的药物组合物可包括水性和非水性无菌注射溶液，该无菌注射溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制品与和预期接受者的血液基本上等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，该无菌悬浮液可以包括助悬剂和增稠剂。可用于可注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。
术语“有效剂量”、“治疗有效剂量”和“药物有效剂量”在本文中可互换使用，并且是指足以产生生理效应的剂量。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量是指一种抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)在有需要的受试者中有效降低或中和本文公开的化合物的抗血栓作用的量。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的一个药物有效剂量的施用可以立即逆转式(I)或(II)的化合物在有严重出血的受试者中的抗血栓作用。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的一个药物有效剂量的施用具有有限的作用持续时间。在某些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的单个药物有效剂量具有足够长的作用持续时间，以逆转式(I)或(II)的化合物的抗血栓作用。与此同时,抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的单个药物有效剂量具有足够短的作用持续时间，以允许在施用单个药物有效剂量后很快重新开始抗血栓疗法并且将增加的血栓栓塞事件风险的时间最小化。
在一些实施方案中，可以关于所陈述的目的凭经验并以常规方式确定药物有效剂量。例如，在一些实施方案中，式(II)的化合物的剂量的范围为从约25毫克(mg)每日一次(q.d.，或每天一次)至约375mg每日两次(b.i.d.，或每天两次)。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约25mg q.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约50mg q.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约75mg q.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约100mgq.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约125mg q.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约150mg q.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约175mg q.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约200mg q.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约375mg q.d.。
在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约25mg b.i.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约50mg b.i.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约75mg b.i.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约100mg b.i.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约125mg b.i.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约150mg b.i.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约175mg b.i.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约200mgb.i.d.。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量为约375mg b.i.d.。
在本发明的一些实施方案中，主要相对于之前施用的式(I)或(II)的化合物的剂量来确定抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量。在一些实施方案中，药物有效剂量包含如下的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)，其与之前施用于受试者的式(I)或(II)的化合物的剂量的摩尔比为至少约1:1。在一些实施方案中，药物有效剂量包含如下的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)，其与施用于受试者的式(I)或(II)的化合物的剂量的摩尔比为至少约2:1至约10:1。在一些实施方案中，药物有效剂量包含如下的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)，其与之前施用于受试者的式(I)或(II)的化合物的剂量的摩尔比为至少约15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
在一些实施方案中，药物有效剂量包含如下的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)，其与存在于受试者中的式(I)或(II)的化合物的量的摩尔比为至少约1:1。在一些实施方案中，药物有效剂量包含如下的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)，其与存在于受试者中的式(I)或(II)的化合物的量的摩尔比为至少约2:1至约10:1。在一些实施方案中，药物有效剂量包含如下的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)，其与存在于受试者中的式(I)或(II)的化合物的量的摩尔比为至少约15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1。
在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的药物有效剂量以质量比计算。例如，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的分子量(MW)可以是式(II)的化合物的MW的约75倍。在这个例子中，对每约100mg的式(II)的化合物，等摩尔的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)为约7.5克。因此，本领域技术人员可以容易地计算抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)与式(I)或(II)的化合物的质量比，因为根据本发明它们的摩尔质量可容易地获得。
在一些实施方案中，将在临床研究中确定抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的剂量。在这些研究之前，进行计算建模和模拟，其中并入(1)人药代动力学和药效学信息(来自1期研究)、(2)结合动力学和(3)预测的人PK参数。
可以将本发明的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)与式(I)或(II)的化合物的施用并行施用或在施用式(I)或(II)的化合物后施用。在一些实施方案中，将抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)与式(I)或(II)的化合物的施用并行施用。在一些实施方案中，将抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)在施用式(I)或(II)的化合物后立即施用。在示例性实施方案中，将抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)在开始施用式(I)或(II)的化合物后约30分钟施用。在一些示例性实施方案中，将抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)在已完成式(I)或(II)的化合物的施用后约20分钟施用。然而，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)和式(I)或(II)的化合物的施用可按照本领域技术人员认为适当的任何顺序并行或连续进行。
可通过技术人员认为合适的任何途径施用本发明的抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)。在一个实施方案中，通过静脉内、肌内或皮下方式施用抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)。在一些实施方案中，将抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)一天施用一次。在一些实施方案中，抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)一天施用多于一次。在一些实施方案中，将抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)经约10分钟的时间段施用。在一些实施方案中，将抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)经约小于约10分钟的时间段施用。在一些实施方案中，将抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)经约大于约10分钟的时间段施用。
本发明进一步提供了检测生物样品中式(I)或(II)的化合物的水平的方法。在一些实施方案中，该方法包括使生物样品与抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)接触。在一些实施方案中，该方法包括检测式(I)或(II)的化合物与抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的结合复合物的水平。在一些实施方案中，该方法包括使生物样品与抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)接触，然后检测化合物与抗原结合肽(例如但不限于抗体或抗体片段)的结合复合物的水平。
本公开文本的广度和范围不应受任何上述示例性方面限制，而应仅根据以下权利要求及其等同物定义。
将可以贯穿本申请引用的所有引用的参考文献(包括文献参考文献、专利、专利申请和网站)的内容都出于任何目的明确地通过引用以其整体特此并入，其中引用的参考文献亦是如此。
实施例
实施例1：使用表达人抗体基因的转基因小鼠产生抗化合物A的人单克隆抗体-抗原和相关化合物的制备
针对化合物A的全人单克隆抗体，为因子XIa的特异性抑制剂，通过用化合物A的钥孔戚血蓝蛋白(KLH)缀合形式(如下所示)免疫转基因小鼠来制备。
实施例1A.化合物3的合成
步骤1：1-(4-氯-2-(1-((5R,9S)-21-(二氟甲基)-5-甲基-4-氧代-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃(pyrazolacyclononaphane)-9-基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基)苯基)-1H-1，2，3-三唑-4-甲酸叔丁酯(化合物1)的合成
向含有在乙腈(3.7mL)中的1-(4-氯-2-(6-羟基嘧啶-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸叔丁酯(105mg，0.28mmol)的白色悬浮液的100mL烧瓶中添加HATU(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐)(117mg，0.31mmol)和DBU(1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯)(55.0μl，0.37mmol)。将所得澄清黄色溶液在室温下搅拌5分钟。添加(5R,9S)-9-氨基-21-(二氟甲基)-5-甲基-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃-4-酮(94mg，0.281mmol)，并且将所得的悬浮液在室温下搅拌3小时此时将其浓缩至干。将残余物溶解于1mL EtOAc中并且加载到40g Isco柱上。将产物用在己烷中0％至100％ EtOAc的线性梯度经35分钟洗脱。将产物在100％ EtOAc下直接洗脱。分离到呈白色固体的1-(4-氯-2-(1-((5R,9S)-21-(二氟甲基)-5-甲基-4-氧代-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃-9-基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸叔丁酯(161mg，0.233mmol，83％产率)。
步骤2：1-(4-氯-2-(1-((5R,9S)-21-(二氟甲基)-5-甲基-4-氧代-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃-9-基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸盐酸盐(化合物1A)的合成
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将1-(4-氯-2-(1-((5R,9S)-21-(二氟甲基)-5-甲基-4-氧代-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃-9-基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸叔丁酯(161mg，0.233mmol)溶解于在二噁烷中的HCl中(3ml，12.00mmol)，并且搅拌2小时，此时通过LCMS完成脱保护。将反应混合物浓缩至干并且进一步在真空中干燥过夜。分离到呈淡黄色固体的1-(4-氯-2-(1-((5R,9S)-21-(二氟甲基)-5-甲基-4-氧代-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃-9-基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸盐酸盐(150mg，0.223mmol，96％产率)。
步骤3：3-(2-(2-(1-(4-氯-2-(1-((5R,9S)-21-(二氟甲基)-5-甲基-4-氧代-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃-9-基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲酰胺)乙氧基)乙氧基)丙酸(化合物1B)的合成
将1-(4-氯-2-(1-((5R,9S)-21-(二氟甲基)-5-甲基-4-氧代-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃-9-基)-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基)苯基)-1H-1,2,3-三唑-4-甲酸盐酸盐(40mg，0.063mmol)、3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(14.67mg，0.063mmol)和三乙胺(8.77μl，0.063mmol)溶解于DMF(N,N-二甲基甲酰胺)(2mL)中。添加BOP(苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐)(27.8mg，0.063mmol)，并且将得到的混合物在室温下搅拌4小时。将残余物浓缩至干，并且随后用CH2Cl2(4mL)和TFA(三氟乙酸)(2mL)稀释。将反应混合物在室温下搅拌2小时，并且然后浓缩至干残余物。
通过制备型HPLC完成化合物1的纯化。
制备型HPLC-柱＝Sunfire制备型C18 OBD 5微米(30x 100mm)
溶剂A＝10％ MeOH，90％水，10mM乙酸铵
溶剂B＝90％ MeOH，10％水，10mM乙酸铵
25％ B至100％ B的线性梯度
实施例1B.化合物2和3的合成
3-(2-(2-(2-((5R,9S)-9-(4-(5-氯-2-(4-氯-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-6-氧代嘧啶-1(6H)-基)-5-甲基-4-氧代-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(3,4)-吡唑并环壬蕃-21-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(化合物2)和3-(2-(2-(2-((5R,9S)-9-(4-(5-氯-2-(4-氯-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-6-氧代嘧啶-1(6H)-基)-5-甲基-4-氧代-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃-21-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(化合物3)的合成
将(5R,9S)-9-(4-(5-氯-2-(4-氯-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)-6-氧代嘧啶-1(6H)-基)-5-甲基-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(5,4)-吡唑并环壬蕃-4-酮(化合物4)(70mg，0.121mmol)、3-(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸叔丁酯(41.4mg，0.121mmol)和碳酸铯(39.6mg，0.121mmol)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)(3mL)中加热至60℃保持1小时然后冷却至室温。将反应混合物过滤，并且然后浓缩至干。将残余物用CH2Cl2(4mL)和TFA(2mL)稀释，并且然后在室温下搅拌1小时。通过制备型HPLC完成所得化合物2和化合物3的纯化。
制备型HPLC-柱＝Sunfire制备型C18 OBD 5微米(30x 100mm)
溶剂A＝10％ MeOH，90％水，10mM乙酸铵
溶剂B＝90％ MeOH，10％水，10mM乙酸铵
25％ B至100％ B的线性梯度
分离到呈白色固体的化合物2(40mg，0.051mmol，41.8％产率)和化合物3(15mg，0.019mmol，15.51％产率)。
将化合物2、化合物3和化合物1与BSA和KLH缀合，用于免疫和ELISA筛选。
与KLH缀合：将化合物1、2或3的2mg样品用90μL的DMSO溶解，随后用390μL的MES缓冲液溶解，并且旋涡混合。然后将200μL KLH(10mg/mL原液)添加至混合物中。最后添加50μLEDC(20mg/mL原液)。将样品在室温下在黑暗中孵育3hr并且然后用5L 1x DPBS(Lonza，目录号17-512Q)透析。
缀合BSA：将化合物(化合物2、化合物3或化合物1)的2mg样品用200μL的DMSO溶解，随后用200μL的MES缀合缓冲液(MES pH 4.7)溶解，并且旋涡混合。然后将400μL BSA(5mg/mL原液)添加至混合物中。最后，添加50μL EDC(20mg/mL原液)。(添加的比率为10x化合物:1x载体:2x激活剂。)将样品在室温下在黑暗中孵育3hr并且然后用5L 1x DPBS(Lonza，目录号17-512Q)透析。
化合物5(化合物2的生物素标记形式)具有以下结构：
N-(1-((5R,9S)-9-(4-(5-氯-2-(4-氯-1H-1,2,3-三唑-1-基))苯基)-6-氧代嘧啶-1(6H)-基)-5-甲基-4-氧代-21H-3-氮杂-1(4,2)-吡啶-2(3,4)-吡唑并环壬蕃-21-基)-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十五烷-15-基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(化合物5)的合成
将化合物2(16mg，0.02mmol)、N-(2-氨基乙基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊酰胺(5.9mg，0.02mmol)、生物素和三乙胺(2.9μl，0.02mmol)溶解于DMF(2mL)中。添加BOP(9.1mg，0.02mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌4小时。然后通过制备型HPLC纯化反应混合物。
制备型HPLC-柱＝Sunfire制备型C18 OBD 5微米(30x 100mm)
溶剂A＝10％ MeOH，90％水，10mM乙酸铵
溶剂B＝90％ MeOH，10％水，10mM乙酸铵
25％ B至100％ B的线性梯度
分离到呈白色固体的化合物5(18mg，80％)。
实施例2：使用表达人抗体基因的转基因小鼠产生抗化合物A的人单克隆抗体-对小鼠的免疫
通过对人Ig转基因小鼠品系HCo42:01KCo5:01[J/K]小鼠进行免疫产生人抗化合物A抗体(Lonberg,Handbook of Experimental Pharmacology 113:49,1994；Lonberg等人.Nature 368:856,1994)。免疫原是三种KLH-化合物缀合形式化合物1-KLH、化合物2-KLH和化合物3-KLH连同Ribi佐剂(RA)的混合物。免疫方案由以下组成：足垫注射在Ribi佐剂中的免疫原混合物。每三到五天对小鼠进行一次免疫，持续三周，共注射七次，并且在组织收集前一天的融合前加强剂后收获淋巴结。体内实验依据Bristol-Myers Squibb公司动物护理和使用委员会的规章进行。收获三只免疫小鼠的淋巴结，匀浆并且汇集。杂交瘤是通过基于电场的电融合与小鼠骨髓瘤融合配偶体SP2/0-Ag14(ATCC CRL-1581TM)电融合产生的。将融合细胞在选择性HAT培养基中在多孔板中铺板7天，随后通过ELISA针对抗原结合进行筛选。基于这些结果，选择来自于融合物6938的杂交瘤克隆1H2、9C8、24H1和26D5用于进一步的分析、亚克隆和测序。亚克隆杂交瘤扩增至400ml培养物以用于纯化。将分泌的全人抗体经由蛋白A亲和色谱法纯化。来自杂交瘤亚克隆1873.6938.26D5.D12(本文称为‘26D5’)的性能最好的全人抗体最终进入亲和力成熟。
实施例3：抗体的亲和力成熟
为了提高人mAb 26D5对化合物A的亲和力，对其进行了亲和力成熟活动。首先，将mAb 26D5序列与最接近的人种系V和J基因序列进行比较(图1A-图1B)。为了降低人体内免疫原性的风险，将不同于种系的框架位置突变或恢复到种系序列，产生人mAb 26D5-GV-Q(其全人抗体形式在本文也称为P1-072226)，其保持了与化合物A的类似结合。然后将mAb26D5-GV-Q(P1-072226)作为突变扫描的起点，其测量了图2中示出的抗体CDR位置中每个可能的单个氨基酸取代的相对适合度。深度突变扫描方法已描述于Araya等人,Trends inBiotechnology 29:435,2001；Forsynth等人,mAbs 5:523,2013；和Wrenbeck等人,Curr.Opin.Struct.Biol.45:36,2017。首先，创建了scFv(单链)文库，其中使用示于图2中的CDR位置处的NNK寡核苷酸产生每个单独的氨基酸取代。在产生这种单一突变体文库时，设计了多个寡核苷酸，每个寡核苷酸在单个位置单独地并入NNK密码子，其中N＝A、C、G、T并且K＝G、T。这些简并密码子的使用允许在被并入NNK密码子的位置处编码所有20种天然存在的氨基酸(加上终止密码子)。除HCDR1外所有的CDR均使用Kabat定义，其中使用AbM定义(Abhinandan和Martin,Mol.Immunol.45:3832,2008；Swindells等人,J.Mol.Biol.429:356,2017)，并且HCDR2的位置60-65不包括在分析中。接下来，使用mRNA展示(Xu等人,Chemistry&Biology 9:933,2002；Roberts和Szostak,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12297,1997；Kurz等人,Nucleic Acids Res.28:E83,2000)，通过单轮的体外转录和翻译获得DNA文库，在此过程中，其编码mRNA经由嘌呤霉素连接被融合到其自身的scFv蛋白质分子上。在选择过程中，任何与化合物5(化合物2的生物素标记形式)结合的scFv都会被磁性链霉亲和素珠捕获，洗脱，并且通过PCR扩增。最后，使用下一代测序(NGS)对产生的初始DNA文库和洗脱的DNA(编码与化合物5结合的scFv)二者进行测序。
为了分析NGS数据，使用FLASH(Magoc和Salzberg，Bioinformatics27:2957,2011)将来自NGS的配对末端正向和反向读段序列进行组装，并且根据突变位置和突变氨基酸的身份分箱。从分析中消除所有质量差的序列和那些包含多个突变位点的序列。接下来，将选择后群体中每个序列的频率除以在起始群体中的频率来获得富集比(ER)。换句话说，富集比是化合物5-结合样品中特定序列变体的计数除以初始文库中的计数。然后这个亲本26D5-GV-Q mAb的富集比被归一化。以此方式，评估了如本文所讨论的CDR区中的每个单个氨基酸取代对结合化合物5(因此，推断A)的影响。图3A示出了使用突变扫描数据分析产生的LCDR1热图，并且允许解释单个氨基酸取代的序列-活性关系。通常，这种方法的误差为大约两倍。因此，富集比(ER)值从0.5到2被认为是中性取代，即保持与化合物5结合特性的取代。ER值大于2被认为有利于结合或是结合优选的，并且ER值小于0.5被认为不利于结合。图3B-图3E示出了剩余的CDR的热图。
基于从NGS数据计算的富集比，针对单个有利的氨基酸取代和组合合成了可变区基因，并且克隆到具有人IgG1f Fc区和人LCκ区(CK)的IgG表达载体中。将载体以小规模(2ml培养物)瞬时地转染到Expi293 HEK细胞中，并且使用蛋白A过滤板纯化。使用SPR(表面等离子体共振)和功能活性评估IgG蛋白质(见下文数据)。该评估后鉴定的目的抗体的序列示于图4A-图4B。
具体而言，使用三种不同的文库设计选择后代26D5-295-B08用于进一步亲和力成熟。对于第一个设计，在26D5-295-B08上进行第二次突变扫描，随机化图5所示的残基。在这个第二次突变扫描中，Kabat和/或AbM CDR定义之外的位置基于它们在共晶结构中与化合物A的接近度被随机化。来自26D5-295-B08的突变扫描的热图示于图6A-图6F。如前所述，针对单个有利的氨基酸取代和组合合成可变区基因，并且克隆到IgG1f表达载体中以用于测定。从26D5-295-B08的突变扫描中鉴定的目的MAb包括：26D5-75202-343-A09、26D5-75229-343-A10,26D5-75203-343-B09、26D5-75017-343-F04和26D5-75214-343-F06(序列见表1-表3)。除非另有具体说明，否则实施例中公开的所有人抗体均为IgG1f(例如，SEQ ID NO:200)和人LCκ形式(例如，SEQ ID NO:204)。
此外，基于26D5-295-B08构建了两个复合文库(芯片和掺杂)，以更全面地随机化目的位置(图7A-图7B)。芯片文库被设计为包含CDR和侧翼框架位置内所有氨基酸(半胱氨酸和甲硫氨酸除外)的单取代和双取代，并且如图7A所示具有一些另外的修饰。该设计还去除了含有化学不利物的序列，并且经由芯片寡核苷酸(Twist Bioscience)合成。掺杂文库将随机化集中在HCDR3和周围的框架残基上，从而在单个CDR内获得超过两个突变。编码该文库的DNA寡核苷酸是基于26D5-295-B08 DNA序列通过对随机化区域“掺杂”生成的。对于随机化区域中的每个核苷酸，寡核苷酸含有70％的26D5-295-B08 DNA碱基和各10％的其他碱基。例如，如果26D5-295-B08 DNA在特定位置有G，那么掺杂的寡核苷酸在该位置将含有70％ G、10％ A、10％ C和10％ T。这允许目的区域更深的随机化，同时仍然使文库偏向原始亲本序列。这些寡核苷酸用于产生单独的芯片和掺杂DNA scFv文库。这些文库是根据上述方案使用mRNA展示来选择的，但在后面的几轮中相继多轮掺入解离率。使用NGS对得到的群体进行测序，并且对数据进行分析以选择用于合成的可变区，并且克隆到IgG表达载体中以用于测试。从芯片文库中鉴定的目的MAb包括：26D5-75592-348-A04、26D5-75768-348-A10、26D5-75576-348-B03、26D5-75746-348-C07、26D5-75747-348-D07和26D5-75602-348-F04(序列见表1-表3)。MAb 26D5-75616-348-F10被鉴定为来自掺杂文库的目的抗体。图8A-图8B示出了来自mAb 26D5-295-B08的亲和力成熟的目的序列。
为确认小规模结果，将目的抗体的表达载体以340mL的规模瞬时地转染到Expi293HEK细胞中，并且使用预装的20mL POROS A柱纯化，使用Amicon 30K MWCO过滤器经缓冲液交换到PBS中，使用0.2μm PES过滤器无菌过滤，分装并保存在-80℃。对每个样品通过LC/MS进行质量确认，并通过分析型SEC进行表征。
实施例4：通过显色酶法测定表征mAb
mAb在化合物A的存在下保护FXIa酶活性的能力被用来筛选测定亲和力提高的抗体。测定使用来自Chromogenix的S-2366显色肽作为因子XIa酶的底物。将每个测试的mAb从100nM连续地稀释至1.5nM，并且与2.5nM化合物A或对照化合物在37℃孵育10分钟。然后添加显色底物S-2366至最终浓度为0.5mM，并且添加人FXIa酶(Haematologic Techologies,Inc.；HCZIA-0160)至最终浓度为0.2nM。浓度为2.5nM的化合物A对FXIa活性产生了约90％的抑制，即几乎完全占有了FXIa。此处所描述的测定是为了产生有意义的动态范围而设立的。立即在Molecular Devices SPECTRAmax上在37℃读取板在405nm处的OD值，以测量底物水解的速率。将信号相对于0％激活(具有化合物A情况下的FXIa酶)和100％激活(无抑制剂情况下的FXIa酶)归一化。EC50被确定为抗体逆转50％或更多的由化合物A诱导的抑制。示例结果示于图9中。
实施例5：重组α-化合物A抗体Fab片段的制备
将选择的抗体作为未加标签的抗体Fab片段克隆到pTT5载体中，用于Expi293表达。Fab序列见SEQ ID NO。优化的DNA序列接收自GenScript，用于哺乳动物表达。为了1L规模的表达，将3x 106个细胞/mL的900mL细胞接种于2L康宁烧瓶中。向50mL Opti-MEMTM中添加各0.25mg的重链和轻链DNA构建体。将在150mL的Opti-MEMTM中的4.1mL ExpiFectamineTM在室温下孵育5分钟，然后将上述150mL中的50mL添加至DNA/Opti-MEMTM混合物中并在室温下孵育20分钟。将总共100mL转染混合物添加至900mL细胞中并且放置在37℃摇床中(125rpm，空气中8％ CO2)。在第一天用2mM VPA和50ml CHO CD高效进料B供养产物。第5天测试细胞活力并且收获产物。平均细胞活力/细胞密度为80％/6x 106个细胞/mL。将产物在4℃在2,000rpm下离心20分钟。将条件培养基上清液通过0.2um过滤器过滤。将30mL重组蛋白A琼脂糖凝胶FF柱用2个柱体积(CV)的6M胍和2个CV的0.033M HCl洗涤，之后用1x杜氏PBS平衡。上清液经验证pH>7.0，然后以10mL/min加载到重组蛋白A琼脂糖凝胶柱中。对于所有1873.6938.26D5.D12的后代(包括亲和力成熟变体)均观察到经由框架蛋白A相互作用的重组蛋白A结合。将柱子用1x DPBS洗涤直到达到基线，然后用80mM乙酸钠(pH 2.8)洗脱至填充有约20ml Tris HCl(pH 8.0)的容器中，这样蛋白质能在洗脱时中和。然后用1x DPBS中和柱子。将洗脱的样品浓缩至<10mL，并且以2.5mL/min加载到平衡的(1x DPBS)S200 26/600柱上。以2.5mL/min收集5mL级分，并通过SDS-PAGE和色谱图分析以合并。典型产量为150-250mg/L的纯化的抗体Fab片段。
实施例6：通过表面等离子体共振(SPR)(BiacoreTM)分析表征mAb和Fab
通过SPR(BiacoreTM)使用蛋白A捕获法检查杂交瘤表达的26D5亲本mAb(IgG1f形式的VH SEQ ID NO:83和VL SEQ ID NO:98)(P1-072224)和亲和力成熟的mAb与化合物A的结合。运行缓冲液是具有0.05％ Tween 20和2％ DMSO的1xPBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)。结合实验在37℃下进行。蛋白A以高密度(蛋白A的2000+RU)被包被在CM5 S-系列传感芯片(Cytiva，目录号29149603)。蛋白A的固定使用制造商推荐的标准胺偶联固定程序进行。然后以3uL/min的流速在蛋白A表面上以2ug/mL的浓度捕获亲和力成熟抗体2分钟。然后将化合物A以100uL/min的流速以范围为100-3nM(100、50、25、12.5、6.25、3.125nM)的浓度注射到捕获的抗体上(图10)，并且对于筛选以范围为100-3nM(100、33、11nM)的浓度注射到捕获的抗体上，保持2分钟，并且允许解离至少450秒。每个循环后，用10mM甘氨酸(pH 1.5)的40秒脉冲使芯片表面再生。使用仅与蛋白A表面的背景结合来减去非特异性结合。所有实验均使用Biacore T200Control software v.2在Biacore T200表面等离子体共振仪上运行。使用Biacore T200evaluation software v 3.1进行数据分析。测定表观亲和力仅仅用于排序，因为解离速率太慢而无法通过Biacore测量。示例结合测定数据示于图10，并且结合测定数据报告于表10中。表10中mAb的名称是指呈IgG1f形式的具有表3中对应Fab的H和L链序列的mAb。
表10.SPR数据
Biacore蛋白A mAb捕获
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使用用先前与化合物2、化合物3或化合物1缀合的BSA包被的CM5 S-系列传感芯片(Cytiva，目录号29149603)，通过SPR(BiacoreTM)检查第一轮亲和力成熟的抗体Fab片段与缀合形式的化合物A的结合。固定水平是150-250RU。运行缓冲液是具有0.05％ Tween 20的1xPBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)。结合实验在25℃下进行。将浓度为200-0.8nM之间的抗体Fab片段以30uL/mni的流速注射到BSA-化合物包被的表面保持2分钟。抗体Fab片段然后被允许解离15分钟。每个循环后，用10mM甘氨酸(pH 2)的1分钟脉冲和50mM NaOH的1分钟脉冲使芯片表面再生。所有实验都在相同的设备上运行，并且用之前所描述的相同的软件分析。测定表观亲和力仅仅用于排序，因为解离速率太慢而无法通过Biacore测量。还以类似的方式对选定的mAb进行对比实验(见图11)。示例结合测定数据示于图11，并且化合物2-BSA的结合测定数据报告于表11中。表11中的Fab的序列示于表3。
表11.SPR数据
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使用来自Cytiva的生物素-CAP S-系列传感芯片和试剂盒(目录号28920234)，通过SPR(BiacoreTM)检查第一轮和第二轮亲和力成熟的抗体Fab片段与缀合形式的化合物A的结合。使生物素-CAP芯片在缓冲液中水合过夜。将在水中50％的生物素-CAP试剂以2uL/min的流速流过芯片表面150s。将化合物5(化合物2的生物素化形式)以0.25ug/mL以10uL/min的流速捕获在生物素CAP表面上，进行20秒脉冲。运行缓冲液是具有0.05％ Tween 20的1xPBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)。实验在25℃或37℃下进行。将浓度为100-3nM的抗体Fab片段以30uL/min的流速注射到生物素-CAP-化合物5表面保持3分钟。抗体Fab片段被允许解离11.7分钟。每个循环后，用在250mM NaOH中的6M盐酸胍的两个2分钟脉冲使芯片表面再生。所有实验都在相同的设备上运行，并且用之前所描述的相同的软件分析。测定表观亲和力仅仅用于排序，因为解离速率太慢而无法通过Biacore测量。示例结合测定数据示于图12，并且抗体TanFab片段的结合测定数据报告于表12中。表12中的TanFab的序列示于表4。
表12.SPR数据
实施例7：通过TR-FRET测定表征mAb和Fab
开发了一种竞争性TR-FRET(时间分辨荧光共振能量转移)测定，以在37℃达到平衡时对α-化合物A mAb与化合物A的解离的排序。测定缓冲液是HBS-N(10mM HEPES，150mMNaCl，pH 7.4；GE Healthcare)，0.1％(w/v)BSA(牛血清白蛋白；Sigma)，2％ DMSO(二甲基亚砜；Sigma)。所有试剂均在测定缓冲液中制备并且以等体积分配到白色384微孔板中，每孔最终体积为20μl，终浓度如下：4nM化合物5(化合物2的生物素化类似物)，100-0.1nM(7点滴定)人α-化合物A抗体，0.1nM铕标记的α-小鼠IgG(LANCE Eu-W1024；PerkinElmer)，5nM链霉亲和素-D2(Cisbio)，以及4nM mAb 26D5 VH_A10G_Y33A_S53P_M89V_G95A；VK_W32N_H38Q(P1-075621，格式化为具有小鼠IgG Fc的第二轮优化亲本26D5-295-B08)。首先将化合物5和α-化合物A抗体滴定物添加至微孔板中，并且在37℃、1000rpm下经受初始孵育1小时以促进抗体与化合物结合。初始孵育期后，按顺序添加铕α-小鼠IgG、链霉亲和素-D2和26D5-小鼠IgG(P1-075621)，然后将板放回到37℃、1000rpm孵育。使用Perkin Elmer EnVision读板仪读取微孔板，并且将测量的FRET信号定义为[665nm]/[620nm]*10,000。在30分钟(T0)和24小时(T24)间隔后读取微孔板。对于每个抗体滴定，将FRET信号转换为相对于没有α-化合物A抗体的孔的％抑制：(100-((在[抗体浓度]时的FRET/0nM时的FRET)*100)。使用TIBCOSpotfire(v.7)绘制％抑制抗体滴定，并且使用四参数模型曲线拟合确定IC50。报告了各时间点的IC50，以及相对于T0的IC50曲线偏移。IC50曲线偏移表明，当测定达到平衡时，α-化合物A抗体与生物素化化合物解离，随后允许26D5-小鼠IgG1(P1-075621)竞争者结合并且产生在测定中检测到的FRET信号。
从α-化合物A 26D5亲和力优化筛选收集的示例性竞争性FRET数据示于图13。示出了三种代表性的人抗体：1)26D5-GVR-Q-FT-Fab-长的IgG1f mAb形式；本文也称为P1-072226(不同之处在于，在26D5-GVR-Q-FT HC中的R31在P1-072226HC中为S31)，顶部小图，2)第一轮优化后代26D5-295-B08-Fab-长的IgG1f mAb形式(本文也称为P1-072963)，中间小图，和3)第二轮优化后代26D5-75747-348-D07-Fab-长的IgG1fmAb形式(本文也称为P1-075747)，底部小图。沿着每条抗体滴定曲线用星标注了IC50。T0与T24 IC50之间的差值被定义为Δ，并且在每个小图中报告这些值。26D5-GVR-Q-FT-Fab-长mAb亲本展现出最显著的T0-T24 IC50偏移，63nM。由于在随后的后代(P1-072963：20.5nM，然后P1-075747：4.3nM)中通过相继几轮的亲和力成熟提高了化合物A的解离速率(解离率)，T0-T24 IC50偏移被最小化。通过T24 IC50和IC50偏移(Δ)对α-化合物A抗体排序，以鉴定相对于mAb 26D5-GVR-Q-FT-Fab-长亲本和mAb26D5-295-B08(P1-072963)具有改进的37℃化合物A解离速率的抗体。
还修改了以上定义的竞争性TR-FRET测定，以评估重新格式化为Fab的优化26D5抗体后代。将α-化合物A抗体和Fab滴定系列扩展至250-0.244nM(11点滴定)，并且一式四份收集每个浓度重复。将测定孵育扩展至包括另外的48hr时间点以确保达到平衡，并且报告了T48hr IC50和IC50偏移。在Graphpad Prism(v.8)中绘制％抑制滴定，并且拟合为四参数模型。在其他方面，所有其他实验设置条件与抗体TF-FRET测定是相同的。
图14和表13示出了将人抗体和Fab进行比较的针对亲和力优化的α-化合物A 26D5后代收集的竞争性FRET数据。每个小图代表了单一的α-化合物A序列，其中抗体(mAb，实线，圆圈)和Fab(虚线，三角形)形式叠加。26D5亲本Fab(Fab 26D5-GV-Q；本文也称为P1-073708)和第一轮优化后代Fab 26D5-295-C08(本文也称为P1-074468-1)展现出至少26nM的显著的T48 IC50偏移。第二轮亲和力成熟的优化后代在抗体和Fab形式下都保持了从化合物A缓慢的37℃解离，展现出最小的T48 IC50偏移。FRET数据提供于表13中。表13中的mAb/Fab的名称是指表1-表3中的对应序列。表13中列出的所有mAb为人IgG1f/LCκ形式。
表13(“-1”，“-2”等是指在其他方面相同的mAb或Fab的批号)
实施例8：凝胶过滤
使用具有Shodex K403-4F的Agilent 1260HPLC系统和100mM磷酸钠150mM氯化钠(pH 7.3)的流动相，以0.3mL/min的流速，注射纯化Fab等分试样(20ug)，运行时间为20分钟。凝胶过滤标准品证实，大多数Fab为至少98％的单体，其回收率大于75％。
实施例9：Fab的热稳定性分析
利用UNchained Labs UNcle TM/Tagg分析，用浓度为20uM的Fab在采用或不采用浓度为50uM的化合物A(或对照化合物)的情况下进行热稳定性分析。以0.5℃/min从25℃至90℃扫描毛细管。此外，还使用Malvern MicroCal VP-Capillary DSC，通过差示扫描量热法分析对选择的Fab进行分析。样品进行缓冲液匹配，并且在采用或不采用浓度为15uM的化合物A(或对照化合物)的情况下加载浓度为10uM的Fab。扫描温度范围为15℃-110℃，速率为60℃/Hr(过滤周期：16秒，增益：无)。使用制造商为UNcle和Malvern Capillary DSC二者提供的软件进行样品分析。图15和下表14示出了代表性的DSC结果。表14中的Fab的序列示于表3。
表14(差示扫描量热法得出的热稳定性)
实施例10：动力学排除分析(KinExA)
本文公开的抗体Fab片段与化合物A的溶液亲和力是使用动力学排除分析(KinExA)测量的。用26D5亲和力成熟的抗体Fab片段在100、200和300pM(平衡24-72小时)下进行化合物A的重复滴定。通过以下方式测量26D5亲和力成熟的抗体Fab片段的相对未结合浓度：在具有化合物5的链霉亲和素涂层珠上捕获，随后用识别人IgG Fab的荧光标记的抗体来检测。用相同的测定形式测量用以测定复合物缔合速率的动力学分析，不同之处在于，制备单管混合物(200pM Fab和400pM化合物A)和立即去除时间点(没有平衡)。结果示于下表15中。通过DSC热稳定性和KinExA分析，将两种Fab，即26D5-75229-343-A10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-Fab-短鉴定为前两种Fab。抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短(SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:164；见表3)被选择用于如下所述的X射线晶体学和实施例12中所述的体内研究。
表15 KinExA(动力学排除分析)
实施例11：Fab的结晶
将具有GGHHHHHHH(SEQ ID NO:222)亲和力标签的Fab26D5-GVR-Q-FT-Fab-短在DPBS(Dulbecco磷酸盐缓冲盐水)缓冲液中浓缩至10mg/ml。使蛋白质与5倍摩尔过量的化合物A复合，并在4℃下孵育过夜。使复合物通过坐滴蒸汽扩散法结晶。液滴由1μl复合物和1μl储池组成。结晶储池由溶解在水中至总体积为100ml的20g PEG 3350和20mM的无缓冲的柠檬酸钠组成。通过将2.5μl 40％ PEG400:40％甘油(v/v)与7.5μl储池溶液的混合物连续添加至液滴中，来制备晶体，以用于在液氮中闪蒸冷却。
将抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短在DPBS缓冲液中浓缩至20mg/ml。使蛋白质与5倍摩尔过量的化合物A复合，并在4℃下孵育过夜。使复合物通过坐滴蒸汽扩散法结晶。液滴由1μl复合物和1μl储池组成。结晶储池由100mM CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)(pH 10.5)、200mM硫酸锂、1.2M磷酸钠和0.8M磷酸钾组成。通过将2.5μl 40％ PEG400:40％甘油(v/v)与7.5μl储池溶液的混合物连续添加至液滴中，来制备晶体，以用于在液氮中闪蒸冷却。
使用Pilatus 6M检测器在Advanced Photon Source在光束线17-ID下收集数据。使用autoPROC包处理数据[Vonrhein,C.,Flensburg,C,Keller,P.,Sharff,A.,Smart,O.,Paciorek,W.,Womack,T.&Bricogne,G.(2011).Data processing and analysis with theautoPROC toolbox.Acta Crystallogr.Sect.D 67,293-302]，包括用于处理的底层软件XDS、用于缩放的XSCALE和用于数据的各向异性程度的STARANISO[W.Kabsch(2010).XDS.Acta Crystallogr.Sect.D 66,125-132和W.Kabsch(2010).Integration,scaling,space-group assignment and post-refinement.Acta Crystallogr.Sect.D 66,133-144；STARANISO(Tickle,I.J.,Flensburg,C.,Keller,P.,Paciorek,W.,Sharff,A.,Vonrhein,C.,Bricogne,G.(2018).STARANISO(可在万维网址staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi获得)Cambridge,UnitedKingdom:Global Phasing Ltd)。
26D5-GVR-Q-FT-Fab-短/化合物A晶体具有与如下空间群P212121一致的对称性，其晶胞边缘为和/>每个不对称单元有一个复合物。各向同性处理时数据扩展至/>但使用椭圆截止线来保留数据，该截止线在a*中扩展至/>在b*中扩展至/>以及在c*中扩展至/>通过分子置换按以下方式确定结构：使用PHASER(McCoy,A.J.,Grosse-Kunstleve,R.W.,Adams,P.D.,Winn,M.D.,Storoni,L.C.&Read,R.J.(2007).Phaser Crystallographic Software.J.Appl.Crystallogr.40,658-674.)，采用针对源自PDB 2O5X的CL:CH1(Verdino,P.,Aldag,C.,Hilvert,D.,Wilson,I.A.(2008)Closely Related Antibody Receptors Exploit Fundamentally DifferentStrategies for Steroid Recognition.Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 105,11725-11730)、源自PDB 4PY7的VL(Wyrzucki,A.,Dreyfus,C.,Kohler,I.,Steck,M.,Wilson,I.A.,Hangartner,L.(2014)Alternative Recognition of the Conserved Stem Epitope InInfluenza AVirus Hemagglutinin By A VH3-30-Encoded HeterosubtypicAntibody.J.Virol.88,7083-7092.)以及源自PDB 4TSA的VH(Wensley,B.Structure of aLysozyme Fab Complex,unpublished.)的模型。从VH和VL模型中去除所有CDR(互补决定区)。初始电子密度图示出了化合物A的明确的电子密度。使用GRADE创建配体的几何约束(Smart,O.S.,Womack,T.O.,Sharff,A.,Flensburg,C.,Keller,P.,Paciorek,W.,Vonrhein,C.和Bricogne,G.,Global Phasing,Ltd.,Cambridge,United Kingdom)，并且最初使用RHOFIT放置(Womack,T.O.,Smart,O.S.,Sharff,A.,Flensburg,C.,Keller,P.,Paciorek,W,Vonrhein,C.和Bricogne,G.,Global Phasing,Ltd.,Cambridge,UnitedKingdom)。结构通过使用Coot进行交替轮次的建模(Emsley,P.,Lokhamp,B.,Scott,W.G.&Cowtan,K.(2010).Features and Development of Coot.Acta Crystallogr Sect.D 66,486-501)、以及用autoBUSTER精修(Bricogne,G.,Blanc,E.,Brandl,M.,Flensburg,C,Keller,P.,Paciorek,W.,Roversi,P,Sharff,A.,Smart,O.,Vonrhein,C,Womack,T.BUSTER2.11.7版.Global Phasing,Ltd.,Cambridge,United Kingdom)来改进。图16中的图像示出了26D5-GVR-Q-FT-Fab-短/化合物A的复合物的精修结构。
26D5-75616-348-F10-Fab-短/化合物A晶体具有与如下空间群P1一致的对称性，其晶胞边缘为α＝83.4°；β＝88.4°；γ＝67.9°，每个不对称单元有四个复合物。各向同性处理时数据扩展至/>但使用椭圆截止线来保留数据，该截止线在0.880a*+0.436b*-0.189c*中扩展至/>在0.063a*+0.898b*-0.436c*中扩展至/>以及在0.093a*+0.382b*+0.920c*中扩展至/>通过分子置换按以下方式确定结构：使用PHASER(McCoy,A.J.,Grosse-Kunstleve,R.W.,Adams,P.D.,Winn,M.D.,Storoni,L.C.&Read,R.J.(2007).Phaser CrystallographicSoftware.J.Appl.Crystallogr.40,658-674.)，采用针对源自抗体Fab片段26D5-GVR-Q-FT-Fab-短的CL:CH1、VL和VH的模型，其中VH模型中去除CDR-H3。初始电子密度图示出了化合物A的电子密度。结构通过使用Coot进行交替轮次的建模(Emsley,P.,Lokhamp,B.,Scott,W.G.&Cowtan,K.(2010).Features and Development of Coot.Acta CrystallogrSect.D 66,486-501)以及用autoBUSTER使用自动NCS约束精修(Bricogne,G.,Blanc,E.,Brandl,M.,Flensburg,C.,Keller,P.,Paciorek,W.,Roversi,P,Sharff,A.,Smart,O.,Vonrhein,C.&Womack,T.BUSTER 2.11.7版.Global Phasing,Ltd.,Cambridge,UnitedKingdom和Smart,O.S.Womack,T.O.,Flensburg,C.,Keller,P.,Paciorek,W.,Sharff,A.,Vonrhein,C.&Bricogne,G.(2012).Exploiting structure similarity in refinement:automated NCS and target-structure restraints in BUSTER.Acta CrystallogrSect.D 68,368-380)来改进。图17中的图像示出了26D5-75616-348-F10-Fab-短/化合物A的复合物的精修结构。
通过DSC热稳定性和KinExA分析，将两种Fab，即26D5-75229-343-A10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-Fab-短鉴定为前两种Fab。抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的X射线晶体学证明了抗体Fab片段与化合物A的1:1化学计量的结合和在抗体Fab片段的重链与轻链之间的裂缝中结合的机制。
实施例12：抗体Fab片段的血浆结合研究
研究旨在评价26D5-75616-348-F10-Fab-短逆转血浆中米尔维仙抗凝效应的能力。
体外研究
抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短中和因子XIa抑制剂化合物A的体外抗凝活性的能力是通过将Fab片段与含有已知量的化合物A的血浆组合来确定的。将化合物A的血浆浓度选择为提供aPTT的显著增加，其中显著增加可定义为凝固时间(例如aPTT)比不存在因子XIa抑制剂时的凝固时间长至少20％。能够与血浆内的因子XIa抑制剂结合的抗体或抗体Fab片段降低了因子XIa抑制剂结合因子XIa的能力，导致凝固时间(例如aPTT)相对于不存在抗体或抗体Fab片段时的凝固时间减少。
将化合物A以8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.3和15.6nM的浓度添加至汇集的正常人血浆中。将抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短以8000、4000、2000、1000、500、250、125、62.5、31.3和15.6nM的相同浓度添加至汇集的正常人血浆中。将含有化合物A的血浆、含有抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的血浆和正常的血浆组合以产生各自不同的浓度：化合物A:26D5-75616-348-F10-Fab-短的摩尔比为5:5、5:4、5:3和5:2，包括不存在抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短情况下的化合物A。
使用FS(Siemens/Dade-Behring)按照说明书的指导确定每个样品的活化部分凝血活酶时间(aPTT)(即人血浆凝固时间)。关于aPTT测定的描述参见Goodnight,S.H.等人,“Screening Tests of Hemostasis”,Disorders of Thrombosis and Hemostasis:AClinical Guide,第2版,第41-51页,McGraw-Hill,New York(2001)。血浆(0.05mL)被温热至37℃，保持1分钟。将/>FS(0.05mL)添加至血浆中，并且再孵育3分钟。在反应中添加氯化钙(25mM，0.05mL)，引发凝血。凝血时间是指从添加氯化钙时刻到检测到血块的时间(以秒计)。
图18示出了血浆凝固时间(aPTT)随着因子XIa抑制剂即化合物A的浓度和中和抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的浓度而变化。图19示出了在不存在(实心符号)和存在(空心符号)中和抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的情况下，血浆凝固时间(aPTT)随着游离因子XIa抑制剂化合物A的浓度而变化。图示出了在不存在和存在抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的情况下，凝固时间(aPTT)随着未结合的化合物A的血浆浓度而变化。
将含有多种浓度和摩尔比的化合物A和抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的人血浆样品进行处理，并且如下文更详细描述的测定每个样品中化合物A和抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短(未结合和结合的)的浓度。
血浆中化合物A的总浓度是指未结合的化合物A、与血浆蛋白结合的化合物A和与抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短结合的化合物A。游离的或未结合的化合物A是指未与血浆蛋白或抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短结合的化合物A。
血浆中未结合的化合物A经由超滤方法(MilliporeSigma)(30kDa分子量截留值)获得。将血浆(0.5mL)放置于超滤装置(/>Ultracel PL膜,REF#4104；MilliporeSigma)的上室内。将装置放置于固定角度的离心机转子(SORVALL SLA-3000；Thermo Scientific)中，并且在2,000x g下离心20分钟(SORVALL RC 6Plus；ThermoScientific)后收集超滤液。
将血浆和血浆超滤液的等分试样在-80℃在聚丙烯管中冷冻。使用液相色谱串联质谱(LC/MS)分析测定血浆中化合物A的总浓度和血浆超滤液中未结合的化合物A的浓度。使用以下所描述的蛋白质沉淀程序制备用于LC/MS分析的样品。
将生物样品的等分试样(20μL)转移到96孔板(1.2mL，圆底聚丙烯)中。添加含50％水和0.5％甲酸的甲醇溶液(20μL)。盖上板并且在95℃的摇床上混合20分钟。通过将含有内标[10nM，稳定同位素标记(13C,15N)的化合物A]和1％甲酸的乙腈(80μL)添加至上一步所得溶液中进行蛋白质沉淀过程。将板在室温下进一步涡旋混合15分钟，然后在3,600rpm下离心5min。将上清液的等分试样(100μL)转移到注射板(96孔，0.3mL)中。将上清液(5μL)注射到与QTRAP MS/MS(AB Sciex 6500)串联质谱仪连接的超效LC系统(AcquityUPLC)中。将分析物在C18柱(Waters HSS T3，2X 50mm，1.8μm)上在60℃下分离，梯度流速为0.7ml/min，由两种缓冲溶液(A：水，0.1％甲酸；B：乙腈，0.1％甲酸)组成。检测在代表前体(M+H)+种类的正电喷雾电离模式下通过使用多反应监测(MRM)进行。监测的MRM跃迁是：化合物A为626→319，同位素标记的化合物A为630→323。最低定量限为0.5nM。
血浆中的抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的浓度如下确定。在自动化微流控平台(Gyros Protein Technologies AB)上通过配体结合测定测量血浆中以下二者的血浆浓度：总抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短和未与化合物A结合的抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短。生物素化的小鼠抗人κ(SouthernBiotech，AL)用作针对总抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的捕获分子。使样品、标准品和QC在1xPTB(1％BSA/0.05％Tween20/PBS)中达到10％血浆最终基质浓度，并且加载到/>自动化微流控平台中。使用采用/>Bioaffy 200CD的3-步-2-洗涤Wizard方法(GyrosProtein Technologies AB)。最后的洗涤步骤后，使用Alexa/>647标记的小鼠抗人Igκ轻链mAb克隆G20-361(BD目录号555861，批号8333691)检测捕获的总抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短。血浆样品中总抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的浓度由通过/>技术测量的荧光强度使用由抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短校准品生成的四参数逻辑斯谛(4-PL)校准曲线计算得到。血浆中总抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短校准曲线的范围为250至25000ng/mL。定量上限和定量下限是25000和250ng/mL。质控样品制备为在血浆中为20000、7500、750ng/mL。在每个实验中分析校准品和QC，以确保可接受的测定性能。测定性能在可接受范围内：标准品和QC的CV％低于20％，并且QC回收率在标称值的±20％内。
化合物5用作针对未与化合物结合的抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的捕获分子。使样品、标准品和QC在1x PTB(1％BSA/0.05％Tween20/PBS)中达到10％血浆最终基质浓度，并且加载到自动化微流控平台中。使用采用/>Bioaffy 200CD的3-步-2-洗涤Wizard方法。最后的洗涤步骤后，使用Alexa/>647标记的小鼠抗人Igκ轻链mAb克隆G20-361(BD目录号555861，批号8333691)检测捕获的“活性/游离的”抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短。血浆样品中“活性/游离的”Fab(26D5-75616-348-F10-Fab-短)的浓度由通过/>测量的荧光强度使用由抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短校准品生成的四参数逻辑斯谛(4-PL)校准曲线计算得到。血浆中“活性/游离的”抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短校准曲线的范围为250至25000ng/mL。定量上限和定量下限是25000和250ng/mL。质控样品制备为在血浆中为20000、7500、750ng/mL。在每个实验中分析校准品和QC，以确保可接受的测定性能。测定性能在可接受范围内：标准品和QC的CV％低于20％，并且QC回收率在标称值的±20％内。
体内研究
体内实验依据Bristol-Myers Squibb公司动物护理和使用委员会的规章进行。在兔(雄性新西兰白兔，2至4kg)的中央耳动脉插入留置导管用于采血，以及在耳缘静脉插入留置导管用于施用物质。将化合物A以1.0mg/kg的剂量经10分钟以定速静脉内输注施用。从化合物A输注完成后20分钟开始，将抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短以160mg/kg的剂量经10分钟以定速静脉内输注施用。抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的施用剂量代表化合物A施用剂量的标称2倍摩尔过量。在施用化合物A前、在输注化合物A结束时、在施用抗体Fab片段前即刻、在施用抗体Fab片段结束时、和在施用抗体Fab片段后在从化合物A给药开始长达24小时内以不同的间隔取1.5mL血液样品。将血液样品添加至在聚丙烯管中0.167mL的3.8％柠檬酸钠中，倒置至少两次以彻底混合，并且置于冰上。在采血1小时内，将全血以至少1,500x的重力离心至少10分钟分离血浆。通过以上所述的超滤方法获得未结合的化合物A。
用活化部分凝血活酶时间(aPTT)测量化合物A的抗凝效应。使用FS(Siemens/Dade-Behring)按照说明书的指导确定aPTT。血浆(0.05mL)被温热至37℃，保持1分钟。将/>FS(0.05mL)添加至血浆中并且再孵育3分钟。在反应中添加氯化钙(25mM，0.05mL)，引发凝血。凝血时间是指从添加氯化钙时刻到检测到血块的时间(以秒计)。
体内施用化合物A后，兔血浆aPTT相对于基线增加至大约2倍。在20分钟后施用抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短，兔血浆aPTT回到基线并且保持在该水平超过12小时。图20示出了在静脉内剂量的化合物A(1mg/kg)20分钟后，再给予静脉内剂量的抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短(160mg/kg)后的兔血浆凝固时间(aPTT)。结果为3只动物的平均值。
如上所述确定化合物A(总的和未结合的)和抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的血浆浓度。PK参数是通过血浆浓度与时间数据的非隔室分析(Phoenix WinNonlin软件，6.4版，Pharsight Corporation，山景城，加利福尼亚州)获得的。低于定量下限的数值不用于计算。采用线性和对数梯形求和结合来计算血浆浓度-时间曲线下面积(AUC[0-T])。在静脉内施用后，估计总血浆清除率(CL)、稳态分布体积(Vss)、终末半衰期(T-HALF)和平均保留时间(MRT)。使用至少3个具有可定量浓度的时间点对T-HALF进行估计。
向兔施用化合物A(1mg/kg)后，化合物A的血浆浓度是4.3μM，并且未结合的化合物A的血浆浓度是290nM。施用抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短(160mg/kg)后，化合物A的血浆浓度是14μM，并且未结合的化合物A的血浆浓度小于0.2nM。未结合的化合物A的血浆浓度降低归因于它与抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短的高结合亲和力。化合物A的血浆浓度增加归因于抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短主要分布在血管室并且依据质量作用定律化合物A从血管外再分布到血管空间。未结合的化合物A的兔血浆浓度保持低于10nM超过12小时。图21示出了静脉内剂量的化合物A(1mg/kg)20分钟后，再给予静脉内剂量的抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短(160mg/kg)后，抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短、化合物A和未结合的化合物A的兔血浆浓度。结果为3只动物的平均值。
实施例13：抗体串联Fab片段的药代动力学
26D5-75616-348-F10-TanFab(串联Fab重链SEQ ID NO:180，串联Fab轻链SEQ IDNO:164)是依据本领域已知的标准程序生成和纯化的，类似于上述实施例5中描述的方法。
在大鼠内的药代动力学
体内实验依据Bristol-Myers Squibb公司动物护理和使用委员会的规章进行。在大鼠(雄性斯普拉格-杜勒，0.2至0.4kg)的颈静脉插入留置导管用于采血和施用物质。将抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短和抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab各自以10mg/kg的剂量经10分钟以定速静脉内输注施用。在输注结束和从给药开始至48小时内以不同的间隔取0.2mL血液样品。将血液样品添加至在聚丙烯管中的EDTA中，倒置至少两次以彻底混合，并且置于冰上。在采血1小时内，将全血以至少1,500x的重力离心至少10分钟分离血浆。如下确定血浆中抗体Fab片段26D5-75616-348-F10-Fab-短和抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab的浓度。
如下确定血浆中26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab的浓度。在自动化微流控平台(Gyros Protein Technologies AB)上通过配体结合测定测量血浆中以下二者的血浆浓度：总26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab以及未与化合物A结合的26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab。将生物素化的小鼠抗人κ(SouthernBiotech目录号9230-08，批号K5613-X088)用作针对总26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab的捕获分子。使样品、标准品和QC在1x PTB(1％BSA/0.05％Tween20/PBS)中达到10％血浆最终基质浓度，并且加载到/>自动化微流控平台中。使用采用/>Bioaffy 200CD的3-步-2-洗涤Wizard方法(Gyros Protein Technologies AB)。最后的洗涤步骤后，使用Alexa/>647标记的小鼠抗人Igκ轻链mAb克隆G20-361(Becton Dickinson目录号555861，批号833694)检测捕获的总26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab。血浆样品中总26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab的浓度由通过/>技术测量的荧光强度使用由26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab校准品生成的四参数逻辑斯谛(4-PL)校准曲线计算得到。血浆中总26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab校准曲线的范围为10至25000ng/mL。定量上限和定量下限是25000和10ng/mL。质控样品制备为在血浆中为20000、7500、750、75、30ng/mL。在每个实验中分析校准品和QC，以确保可接受的测定性能。测定性能在可接受范围内：标准品和QC的CV％低于20％，并且QC回收率在标称值的±20％内。
化合物5被用作针对未与化合物A结合的26D5-75616-348-F10-Fab-短以及26D5-75616-348-F10-TanFab的捕获分子。使样品、标准品和QC在1x PTB(1％BSA/0.05％Tween20/PBS)中达到10％血浆最终基质浓度，并且加载到自动化微流控平台中。使用采用/>Bioaffy 200CD的3-步-2-洗涤Wizard方法。最后的洗涤步骤后，使用Alexa/>647标记的小鼠抗人Igκ轻链mAb克隆G20-361(Becton Dickinson目录号555861，批号8333694)检测捕获的“活性/游离的”26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab。血浆样品中“活性/游离的”26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab的浓度由通过/>测量的荧光强度使用由26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab校准品生成的四参数逻辑斯谛(4-PL)校准曲线计算得到。血浆中“活性/游离的”26D5-75616-348-F10-Fab-短和26D5-75616-348-F10-TanFab校准曲线的范围为10至25000ng/mL。定量上限和定量下限是25000和10ng/mL。质控样品制备为在血浆中为20000、7500、750、75、30ng/mL。在每个实验中分析校准品和QC，以确保可接受的测定性能。测定性能在可接受范围内：标准品和QC的CV％低于20％，并且QC回收率在标称值的±20％内。
图22示出了所得到的药代动力学数据。
在兔内的药代动力学
体内试验依据Bristol-Myers Squibb公司动物护理和使用委员会的规章进行。在兔(雄性新西兰白兔，2至4kg)的股动脉和静脉插入留置导管用于采血，以及在耳缘静脉插入留置导管用于施用物质。将化合物A以0.4mg/kg(0.64微摩尔/千克)的剂量经10分钟以定速静脉内输注施用。从化合物A输注完成后20分钟开始，将抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab以40mg/kg(0.43微摩尔/千克)的剂量经10分钟以定速静脉内输注施用。抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab的施用剂量代表化合物A施用剂量的标称1.34倍摩尔过量(2*0.43/0.64)，其考虑了2:1的结合能力。在施用化合物A前、在输注化合物A结束时、在施用抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab前即刻、在施用抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab结束时、和在施用抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab后从化合物A给药开始长达24小时内以不同的间隔取1.5mL血液样品。
将血液样品添加至在聚丙烯管中0.167mL的3.8％柠檬酸钠中，倒置至少两次以彻底混合，并且置于冰上。在采血1小时内，将全血以至少1,500x的重力离心至少10分钟分离血浆。通过以上所述的超滤方法获得未结合的化合物A。将血浆和血浆超滤液的等分试样在-80℃在聚丙烯管中冷冻。使用液相色谱串联质谱(LC/MS)分析测定血浆中化合物A的总浓度和血浆超滤液中未结合的化合物A的浓度。使用以下所描述的蛋白质沉淀程序制备用于LC/MS分析的样品。
将生物样品的等分试样(20μL)转移到96孔板(1.2mL，圆底聚丙烯)中。添加含50％水和0.5％甲酸的甲醇溶液(20μL)。盖上板并且在95℃的摇床上混合20分钟。通过将含有内标[1μM]和1％甲酸的乙腈(80μL)添加至上一步所得溶液中进行蛋白质沉淀过程。将板在室温下进一步涡旋混合15分钟，然后在3,700rpm下离心8min。将上清液的等分试样(100μL)转移到注射板(96孔，0.3mL)中。将上清液(3μL)注射到与四极杆MS/MS(Thermo Quantiva)串联质谱仪连接的超效LC系统(Acquity iClass uPLC)中。将分析物在C18柱(WatersHSS T3，2X 50mm，1.8μm)上在40℃下分离，梯度流速为0.6ml/min，由两种缓冲溶液(A：水，5mM甲酸铵，0.1％甲酸；B：乙腈，0.1％甲酸)组成。检测在代表前体(M+H)+种类的正电喷雾电离模式下通过使用多反应监测(MRM)进行。监测的MRM跃迁是：化合物A为626.3→319.1，内标为474.3→269。最低定量限为0.5nM。
如上在本实施例中所述的确定在血浆中的抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab的浓度。
图23示出了所得到的药代动力学数据。
体外研究
将化合物A以2000nM的浓度添加至汇集的正常人血浆中。将抗体串联Fab片段26D5-75616-348-F10-TanFab以1000nM的浓度添加至汇集的正常人血浆中。将含有化合物A的血浆、含有26D5-75616-348-F10-TanFab的血浆和正常的血浆组合以产生各自不同的浓度：化合物A:26D5-75616-348-F10-TanFab的摩尔比为2:1、2:0.8、2:0.6和2:0.4，包括不存在26D5-75616-348-F10-TanFab情况下的化合物A。如上在实施例12中所述的确定每个样品的活化部分凝血活酶时间(aPTT)(即人血浆凝固时间)。图24示出了所得到的血浆凝固数据。
序列表
<110> 百时美施贵宝公司
杨森制药有限公司
<120> 针对XIa因子抑制剂的抗体和抗原结合肽及其用途
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<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
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肽
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肽
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Pro
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His
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多肽
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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115
<210> 55
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
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<210> 57
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<210> 58
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 58
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Asp Met Ser Tyr Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Thr Ala Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 60
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 60
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Ile Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
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100 105 110
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115
<210> 62
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
20 25 30
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
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<210> 63
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Glu Asn
20 25 30
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100 105 110
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115
<210> 65
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Glu Asn
20 25 30
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<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<210> 67
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 67
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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115
<210> 68
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
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85 90 95
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100 105 110
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115
<210> 69
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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115
<210> 70
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
20 25 30
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100 105 110
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115
<210> 71
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
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100 105 110
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115
<210> 72
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
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115
<210> 73
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
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100 105 110
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115
<210> 74
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Glu Asn
20 25 30
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100 105 110
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115
<210> 75
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Glu Asn
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 76
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Glu Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
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115
<210> 77
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 78
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 78
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu
50 55 60
Gln Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Asp Phe Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Lys Gly Trp
100 105 110
Phe Glu Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 79
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 79
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Gly Ile Tyr His Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Tyr Asp Ile Leu Thr Gly Tyr Tyr Asn Gln Tyr
100 105 110
Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 80
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 80
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 81
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 81
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 82
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ala Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Gln Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 85
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 88
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 88
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 89
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Asn Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Gln
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Trp Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Gln
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Pro Ala Ser Asn Leu Trp Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Asn Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 93
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 93
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 95
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 95
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Glu Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 96
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 96
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Gln
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 97
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 97
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 100
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
<210> 101
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
<210> 102
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
<210> 103
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 103
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
<210> 104
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 104
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
<210> 105
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
<210> 106
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Glu Phe Gly Leu Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
<210> 107
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Glu Phe Gly Leu Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
<210> 108
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 108
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Val Ser Ile Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ile Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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<211> 223
<212> PRT
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<220>
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多肽
<400> 109
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<210> 110
<211> 219
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<213> 人工序列
<220>
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多肽
<400> 110
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多肽
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<220>
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多肽
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多肽
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多肽
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<223> 人工序列的描述：合成
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多肽
<400> 120
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<400> 121
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<400> 123
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<211> 223
<212> PRT
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<220>
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多肽
<400> 125
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<211> 219
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<220>
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多肽
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多肽
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<220>
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多肽
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多肽
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多肽
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多肽
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
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多肽
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<400> 136
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<223> 人工序列的描述：合成
多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
<210> 141
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 141
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
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130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<211> 223
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 143
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 144
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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165 170 175
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
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<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 147
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Val Ser Glu Asn
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 148
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 149
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 150
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Asn
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
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<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 151
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Asn
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 152
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
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<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 153
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<211> 229
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 154
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225
<210> 155
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 155
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225 230
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<211> 219
<212> PRT
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<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 156
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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
<210> 157
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 157
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
<210> 158
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 158
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215
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<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 159
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
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145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
<210> 160
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 161
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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100 105 110
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115 120 125
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 162
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 163
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 163
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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165 170 175
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 164
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 164
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 165
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 165
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
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Asn Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Glu Phe Pro Leu
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100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
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Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 166
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 166
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Gln
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100 105 110
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115 120 125
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180 185 190
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 167
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 167
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Trp Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 168
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 168
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
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Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 169
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 169
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 170
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 170
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 171
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 171
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 172
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 172
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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130 135 140
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145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 173
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 173
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 174
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 174
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 175
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 175
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 176
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 176
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly
210 215 220
Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly
225 230 235 240
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser
245 250 255
Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
260 265 270
Val Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
275 280 285
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
290 295 300
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Ala Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
325 330 335
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
340 345 350
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
355 360 365
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
385 390 395 400
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
405 410 415
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
420 425 430
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
435 440
<210> 177
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly
210 215 220
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
245 250 255
Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
260 265 270
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg
275 280 285
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
290 295 300
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
305 310 315 320
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp
325 330 335
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
340 345 350
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
355 360 365
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
370 375 380
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
385 390 395 400
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
405 410 415
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
420 425 430
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
435 440 445
Lys Ser Cys
450
<210> 178
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 178
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Leu Gln Leu Glu
210 215 220
Glu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Glu Gly Glu Leu Glu Glu Val Gln Leu
225 230 235 240
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
245 250 255
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp
260 265 270
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Tyr
275 280 285
Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Phe
325 330 335
Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
340 345 350
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
355 360 365
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
370 375 380
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
385 390 395 400
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
405 410 415
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
420 425 430
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
435 440 445
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
450 455
<210> 179
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly
275 280 285
Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
290 295 300
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
305 310 315 320
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Phe Gly Gly
325 330 335
Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
420 425 430
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
435 440 445
Glu Pro Lys Ser Cys
450
<210> 180
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 180
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Glu Phe Gly Leu Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly
210 215 220
Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly
225 230 235 240
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser
245 250 255
Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
260 265 270
Val Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
275 280 285
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
290 295 300
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Ala Arg Ala Glu Phe Gly Leu Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu
325 330 335
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
340 345 350
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
355 360 365
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
385 390 395 400
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
405 410 415
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
420 425 430
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
435 440
<210> 181
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 181
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Glu Phe Gly Leu Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly
210 215 220
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
245 250 255
Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
260 265 270
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg
275 280 285
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
290 295 300
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
305 310 315 320
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Glu Phe Gly Leu Glu Asp
325 330 335
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
340 345 350
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
355 360 365
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
370 375 380
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
385 390 395 400
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
405 410 415
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
420 425 430
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
435 440 445
Lys Ser Cys
450
<210> 182
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 182
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Glu Phe Gly Leu Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Leu Gln Leu Glu
210 215 220
Glu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Glu Gly Glu Leu Glu Glu Val Gln Leu
225 230 235 240
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
245 250 255
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp
260 265 270
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Tyr
275 280 285
Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Glu Phe
325 330 335
Gly Leu Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
340 345 350
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
355 360 365
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
370 375 380
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
385 390 395 400
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
405 410 415
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
420 425 430
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
435 440 445
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
450 455
<210> 183
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 183
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Glu Phe Gly Leu Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
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210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Tyr Pro Gly
275 280 285
Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
290 295 300
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
305 310 315 320
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Glu Phe Gly Leu
325 330 335
Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
420 425 430
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
435 440 445
Glu Pro Lys Ser Cys
450
<210> 184
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 184
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
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130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
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Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly
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225 230 235 240
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser
245 250 255
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Val Ser Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
355 360 365
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
370 375 380
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Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<210> 185
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 185
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
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Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
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Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
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340 345 350
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
355 360 365
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
370 375 380
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
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Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
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420 425 430
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435 440 445
Lys Ser Cys
450
<210> 186
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 186
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
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Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
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Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
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Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
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Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Tyr
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Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Phe
325 330 335
Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
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420 425 430
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Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
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<210> 187
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 187
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
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Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
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Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
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Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
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355 360 365
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Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
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435 440 445
Glu Pro Lys Ser Cys
450
<210> 188
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 188
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
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Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
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<210> 189
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 189
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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435 440 445
Lys Ser Cys
450
<210> 190
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 190
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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100 105 110
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115 120 125
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145 150 155 160
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165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
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195 200 205
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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355 360 365
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450 455
<210> 191
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 191
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Val Ser Ile Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
85 90 95
Ile Gly Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Val Ser Ile Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Tyr Pro Gly
275 280 285
Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
290 295 300
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
305 310 315 320
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Phe Gly Gly
325 330 335
Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
420 425 430
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
435 440 445
Glu Pro Lys Ser Cys
450
<210> 192
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 192
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly
210 215 220
Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly
225 230 235 240
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser
245 250 255
Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
260 265 270
Val Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
275 280 285
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
290 295 300
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
305 310 315 320
Ala Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
325 330 335
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
340 345 350
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
355 360 365
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
385 390 395 400
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
405 410 415
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
420 425 430
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
435 440
<210> 193
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 193
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Ala Ser Thr Lys Gly
210 215 220
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala
245 250 255
Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala
260 265 270
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg
275 280 285
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
290 295 300
Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu
305 310 315 320
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp
325 330 335
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
340 345 350
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
355 360 365
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
370 375 380
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
385 390 395 400
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
405 410 415
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
420 425 430
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
435 440 445
Lys Ser Cys
450
<210> 194
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 194
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Glu Leu Gln Leu Glu
210 215 220
Glu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Glu Gly Glu Leu Glu Glu Val Gln Leu
225 230 235 240
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
245 250 255
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp
260 265 270
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Tyr
275 280 285
Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Phe
325 330 335
Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
340 345 350
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
355 360 365
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
370 375 380
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
385 390 395 400
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
405 410 415
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
420 425 430
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
435 440 445
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
450 455
<210> 195
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 195
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Gly Phe Gly Gly Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Tyr Pro Gly
275 280 285
Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
290 295 300
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
305 310 315 320
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Gly Phe Gly Gly
325 330 335
Pro Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
340 345 350
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
355 360 365
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
370 375 380
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
385 390 395 400
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
405 410 415
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
420 425 430
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
435 440 445
Glu Pro Lys Ser Cys
450
<210> 196
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 196
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
1 5
<210> 197
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 197
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
1 5 10
<210> 198
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 198
Glu Leu Gln Leu Glu Glu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Glu Gly Glu Leu
1 5 10 15
Glu
<210> 199
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 199
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 200
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 200
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210> 201
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 201
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Glu Phe Gly Leu Glu Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 202
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 202
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
100
<210> 203
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 203
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
100 105
<210> 204
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 204
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 205
<211> 97
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 205
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 206
<211> 94
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 206
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe
85 90
<210> 207
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 207
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 208
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 208
Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 209
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 209
Phe Ile Tyr Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 210
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 210
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr
1 5 10
<210> 211
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 211
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 212
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 212
Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 213
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 213
Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn Ala Met Ser Trp Val
1 5 10
<210> 214
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 214
Trp Val Ser Phe Ile Tyr Pro Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 215
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 215
Ala Arg Ala Gly Phe Gly Gly Gly Asp Tyr Trp
1 5 10
<210> 216
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 216
Asn Leu Ala Trp Tyr
1 5
<210> 217
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 217
Ala Met Ser Trp Val
1 5
<210> 218
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 218
Trp Val Ser Phe Ile
1 5
<210> 219
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 219
Ala Arg Ala Gly Phe
1 5
<210> 220
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 220
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 221
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
6xHis标签
<400> 221
His His His His His His
1 5
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<400> 222
Gly Gly His His His His His His His
1 5

Claims (57)

1.一种分离的抗原结合肽，其包含至少一个重链可变区(VH)和至少一个轻链可变区(VL)，其中所述至少一个VH包含以下中的至少一个：
(a)VH互补决定区1(VH-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:1-12的氨基酸序列；
(b)VH-CDR2，其包含选自SEQ ID NO:13-22的氨基酸序列；或
(c)VH-CDR3，其包含选自SEQ ID NO:23-28的氨基酸序列；并且
其中所述至少一个VL包含以下中的至少一个：
(d)VL-CDR1，其包含选自SEQ ID NO:29-37的氨基酸序列；
(e)VL-CDR2，其包含选自SEQ ID NO:38-43的氨基酸序列；或
(f)VL-CDR3，其包含选自SEQ ID NO:44-51的氨基酸序列。
2.一种分离的抗原结合肽，其包含：
(a)至少一个重链可变区，其包含选自SEQ ID NO:52-83的氨基酸序列；以及
(b)至少一个轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO:84-99的氨基酸序列。
3.一种分离的抗原结合肽，其包含至少一个重链可变区(VH)和至少一个轻链可变区(VL)，其中所述VH包含三个互补决定区(CDR)：VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3，并且所述VL包含三个CDR：VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3，其中所述VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3的氨基酸序列分别包含选自以下的序列：
(a)分别为SEQ ID NO:1、13、23、29、38和44；
(b)分别为SEQ ID NO:1、14、23、29、38和45；
(c)分别为SEQ ID NO:1、13、24、30、38和45；
(d)分别为SEQ ID NO:1、13、24、29、39和45；
(e)分别为SEQ ID NO:1、14、25、29、38和46；
(f)分别为SEQ ID NO:2、13、26、31、40和47；
(g)分别为SEQ ID NO:3、15、24、32、40和47；
(h)分别为SEQ ID NO:4、16、24、29、38和46；
(i)分别为SEQ ID NO:5、15、24、29、38和46；
(j)分别为SEQ ID NO:1、14、24、29、38和46；
(k)分别为SEQ ID NO:6、13、24、31、40和47；
(l)分别为SEQ ID NO:3、15、24、32、41和48；
(m)分别为SEQ ID NO:1、14、24、33、38和49；
(n)分别为SEQ ID NO:1、14、26、29、38和46；
(o)分别为SEQ ID NO:7、17、26、29、38和46；
(p)分别为SEQ ID NO:8、17、24、34、38和46；
(q)分别为SEQ ID NO:1、17、26、29、38和46；
(r)分别为SEQ ID NO:1、17、26、35、38和46；
(s)分别为SEQ ID NO:1、17、24、33、38和49；
(t)分别为SEQ ID NO:9、14、26、29、38和46；
(u)分别为SEQ ID NO:9、14、26、35、38和46；
(v)分别为SEQ ID NO:9、17、24、29、38和46；
(w)分别为SEQ ID NO:9、17、24、35、38和46；
(x)分别为SEQ ID NO:9、17、24、34、38和46；
(y)分别为SEQ ID NO:9、14、24、29、38和46；
(z)分别为SEQ ID NO:9、18、26、35、38和46；
(aa)分别为SEQ ID NO:8、14、24、29、38和46；
(bb)分别为SEQ ID NO:8、17、26、29、38和46；
(cc)分别为SEQ ID NO:9、19、26、29、38和46；
(dd)分别为SEQ ID NO:9、17、26、34、38和46；
(ee)分别为SEQ ID NO:10、20、27、36、42和50；
(ff)分别为SEQ ID NO:11、21、28、37、43和51；
(gg)分别为SEQ ID NO:12、22、26、33、38和46；
(hh)分别为SEQ ID NO:12、17、26、33、38和46；
(ii)分别为SEQ ID NO:9、17、26、33、38和46；以及
(jj)(a)至(ii)的变体，其中所述氨基酸序列中的任一个在其中具有1、2或3个保守氨基酸取代。
4.根据权利要求3所述的分离的抗原结合肽，其中所述至少一个VH区和所述至少一个VL区分别包含选自以下的氨基酸序列：
(a)分别为SEQ ID NO:52和SEQ ID NO:84；
(b)分别为SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:85；
(c)分别为SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:86；
(d)分别为SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:87；
(e)分别为SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:88；
(f)分别为SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:89；
(g)分别为SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:90；
(h)分别为SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:88；
(i)分别为SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:88；
(j)分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:91；
(k)分别为SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:89；
(l)分别为SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:92；
(m)分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:93；
(n)分别为SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:88；
(o)分别为SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:88；
(p)分别为SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:88；
(q)分别为SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:88；
(r)分别为SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:94；
(s)分别为SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:88；
(t)分别为SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:95；
(u)分别为SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:88；
(v)分别为SEQ ID NO:68和SEQ ID NO:93；
(w)分别为SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:88；
(x)分别为SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:95；
(y)分别为SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:88；
(z)分别为SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:95；
(aa)分别为SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:88；
(bb)分别为SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:94；
(cc)分别为SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:88；
(dd)分别为SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:95；
(ee)分别为SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:88；
(ff)分别为SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:88；
(gg)分别为SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:88；
(hh)分别为SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:94；
(ii)分别为SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:96；
(jj)分别为SEQ ID NO:79和SEQ ID NO:97；
(kk)分别为SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:98；
(ll)分别为SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:99；
(mm)分别为SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:98；
(nn)分别为SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:99；
(oo)分别为SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:98；以及
(pp)(a)至(oo)的变体，其包含1、2、3或4个保守氨基酸取代。
5.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合肽，其包含两个重链可变区，每个重链可变区与一个轻链可变区配对。
6.根据权利要求5所述的分离的抗原结合肽，其进一步包含多肽接头，所述多肽接头包含选自SEQ ID NO:196-199的序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合肽，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合式(I)所示的化合物：
或其立体异构体或互变异构体，其中：
R1是C1-4烷基；
R2独立地选自F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CH3；
R3独立地选自CF3、CHF2、CH2F和CH3；
R4是H；并且
R5独立地选自F和Cl。
8.根据权利要求7所述的分离的抗原结合肽，其中所述化合物具有式(II)：
9.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合肽，其为抗体。
10.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合肽，其中所述分离的抗原结合肽是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGACH2、微型抗体、F(ab’)3、四抗体、三抗体、双抗体、单域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2、scFv-Fc或串联Fab。
11.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合肽，其包含选自以下的序列：
(a)分别为SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:160；
(b)分别为SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:160；
(c)分别为SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:161；
(d)分别为SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:161；
(e)分别为SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:162；
(f)分别为SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:162；
(g)分别为SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:163；
(h)分别为SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:163；(i)分别为SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:164；(j)分别为SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:164；(k)分别为SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:165；(l)分别为SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:165；(m)分别为SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:166；(n)分别为SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:166；(o)分别为SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:164；(p)分别为SEQ ID NO:113和SEQ ID NO:164；(q)分别为SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:164；(r)分别为SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:164；(s)分别为SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:167；(t)分别为SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:167；(u)分别为SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:165；(v)分别为SEQ ID NO:119和SEQ ID NO:165；(w)分别为SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:168；(x)分别为SEQ ID NO:111和SEQ ID NO:168；(y)分别为SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:169；(z)分别为SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:169；(aa)分别为SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:164；(bb)分别为SEQ ID NO:117和SEQ ID NO:164；(cc)分别为SEQ ID NO:120和SEQ IDNO:164；(dd)分别为SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:164；(ee)分别为SEQ ID NO:122和SEQ IDNO:164；(ff)分别为SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:164；(gg)分别为SEQ ID NO:124和SEQ IDNO:164；(hh)分别为SEQ ID NO:125和SEQ ID NO:164；(ii)分别为SEQ ID NO:126和SEQ IDNO:170；(jj)分别为SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:170；(kk)分别为SEQ ID NO:128和SEQ IDNO:164；(ll)分别为SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:164；(mm)分别为SEQ ID NO:128和SEQ IDNO:171；(nn)分别为SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:171；(oo)分别为SEQ ID NO:130和SEQ IDNO:164；(pp)分别为SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:164；(qq)分别为SEQ ID NO:132和SEQ IDNO:169；(rr)分别为SEQ ID NO:133和SEQ ID NO:169；(ss)分别为SEQ ID NO:134和SEQ IDNO:164；(tt)分别为SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:164；(uu)分别为SEQ ID NO:134和SEQ IDNO:171；(vv)分别为SEQ ID NO:135和SEQ ID NO:171；
(ww)分别为SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:164；
(xx)分别为SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:164；
(yy)分别为SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:171；
(zz)分别为SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:171；
(aaa)分别为SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:164；
(bbb)分别为SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:164；
(ccc)分别为SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:170；
(ddd)分别为SEQ ID NO:139和SEQ ID NO:170；
(eee)分别为SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:164；
(fff)分别为SEQ ID NO:141和SEQ ID NO:164；
(ggg)分别为SEQ ID NO:142和SEQ ID NO:171；
(hhh)分别为SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:171；
(iii)分别为SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:164；
(jjj)分别为SEQ ID NO:145和SEQ ID NO:164；
(kkk)分别为SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:164；
(lll)分别为SEQ ID NO:147和SEQ ID NO:164；
(mmm)分别为SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:164；
(nnn)分别为SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:164；
(ooo)分别为SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:170；
(ppp)分别为SEQ ID NO:151和SEQ ID NO:170；
(qqq)分别为SEQ ID NO:152和SEQ ID NO:172；
(rrr)分别为SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:172；
(sss)分别为SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:173；
(ttt)分别为SEQ ID NO:155和SEQ ID NO:173；
(uuu)分别为SEQ ID NO:156和SEQ ID NO:174；
(vvv)分别为SEQ ID NO:157和SEQ ID NO:174；
(www)分别为SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:175；
(xxx)分别为SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:175；
(yyy)分别为SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:174；以及
(zzz)分别为SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:174；
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
12.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗原结合肽，其包含选自以下的序列：
(a)分别为SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:160；
(b)分别为SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:160；
(c)分别为SEQ ID NO:178和SEQ ID NO:160；
(d)分别为SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:160；
(e)分别为SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:164；
(f)分别为SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:164；
(g)分别为SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:164；
(h)分别为SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:164；
(i)分别为SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:163；
(j)分别为SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:163；
(k)分别为SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:163；
(l)分别为SEQ ID NO:187和SEQ ID NO:163；
(m)分别为SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:162；
(n)分别为SEQ ID NO:185和SEQ ID NO:162；
(o)分别为SEQ ID NO:186和SEQ ID NO:162；
(p)分别为SEQ ID NO:187和SEQ ID NO:162；
(q)分别为SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:165；
(r)分别为SEQ ID NO:189和SEQ ID NO:165；
(s)分别为SEQ ID NO:190和SEQ ID NO:165；
(t)分别为SEQ ID NO:191和SEQ ID NO:165；
(u)分别为SEQ ID NO:192和SEQ ID NO:161；
(v)分别为SEQ ID NO:193和SEQ ID NO:161；
(w)分别为SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:161；以及
(x)分别为SEQ ID NO:195和SEQ ID NO:161；
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
13.根据权利要求11所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:106和SEQID NO:164；
其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
14.一种分离的抗体Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:164；其中所述分离的抗体Fab片段特异性结合所述式(II)的化合物
15.根据权利要求12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:180和SEQID NO:164，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
16.一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:164；其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合式(II)的化合物
17.根据权利要求12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:181和SEQID NO:164，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
18.一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:164；其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合式(II)的化合物
19.根据权利要求12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:182和SEQID NO:164，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
20.一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:164；其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合式(II)的化合物
21.根据权利要求12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:183和SEQID NO:164，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
22.一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:164；其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合式(II)的化合物
23.根据权利要求12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:176和SEQID NO:160，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
24.一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:176和SEQ ID NO:160；其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合式(II)的化合物
25.根据权利要求12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:177和SEQID NO:160，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
26.一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:177和SEQ ID NO:160；其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合式(II)的化合物
27.根据权利要求12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:184和SEQID NO:162，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
28.一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:162；其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合式(II)的化合物
29.根据权利要求12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:184和SEQID NO:163，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
30.一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:163；其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合式(II)的化合物
31.根据权利要求12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:188和SEQID NO:165，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
32.一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:188和SEQ ID NO:165；其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合式(II)的化合物
33.根据权利要求12所述的分离的抗原结合肽，其分别包含序列SEQ ID NO:192和SEQID NO:161，其中所述分离的抗原结合肽特异性结合所述式(II)的化合物：
34.一种分离的抗体串联Fab片段，其包含序列SEQ ID NO:192和SEQ ID NO:161；其中所述分离的抗体串联Fab片段特异性结合式(II)的化合物
35.一种分离的多核苷酸，其包含编码根据权利要求1-34中任一项所述的抗原结合肽或抗体Fab片段或抗体串联Fab片段的核酸序列。
36.一种包含根据权利要求35所述的分离的多核苷酸的载体。
37.一种包含根据权利要求36所述的载体的宿主细胞。
38.一种制备抗原结合肽或抗体Fab片段或抗体串联Fab片段的方法，其包括：(a)在促进蛋白质产生的培养条件下培养根据权利要求37所述的宿主细胞，使得所述宿主细胞产生所述抗原结合肽或所述抗体Fab片段或所述抗体串联Fab片段，和(b)从所述培养物中分离所述抗原结合肽或所述抗体Fab片段或所述抗体串联Fab片段。
39.一种检测试剂，其包含根据权利要求1-34中任一项所述的分离的抗原结合肽或分离的抗体Fab片段或分离的抗体串联Fab片段和可检测标记。
40.根据权利要求39所述的检测试剂，其中所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段与所述可检测标记连接。
41.一种在有需要的受试者中降低所述式(I)的化合物或其立体异构体或互变异构体的抗血栓作用的方法，其包括向所述受试者施用药物有效剂量的根据权利要求1-34中任一项所述的分离的抗原结合肽或分离的抗体Fab片段或分离的抗体串联Fab片段，其中：
R1是C1-4烷基；
R2独立地选自F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CH3；
R3独立地选自CF3、CHF2、CH2F和CH3；
R4是H；并且
R5独立地选自F和Cl。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述式(I)的化合物具有式(II)：
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段的药物有效剂量包含如下的所述抗原结合肽或所述抗体Fab片段或所述抗体串联Fab片段，其与所述式(I)或(II)的化合物的剂量的摩尔比为至少约1:1，或与存在于所述受试者中的式(I)或(II)的化合物的摩尔比为至少约1:1。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的方法，其中将所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段与所述式(I)或(II)的化合物的施用并行施用或在施用所述式(I)或(II)的化合物之后施用。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的方法，其中将所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段通过静脉内、肌内或皮下方式施用。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
47.一种检测生物样品中式(I)的化合物或其立体异构体、互变异构体或药学上可接受的盐的水平的方法，其中：
R1是C1-4烷基；
R2独立地选自F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CH3；
R3独立地选自CF3、CHF2、CH2F和CH3；
R4是H；并且
R5独立地选自F和Cl；所述方法包括：
(a)使所述生物样品与根据权利要求1-34中任一项所述的分离的抗原结合肽或分离的抗体Fab片段或分离的抗体串联Fab片段接触，以及
(b)检测所述化合物与所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段的结合复合物的水平。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述式(I)的化合物具有式(II)：
49.根据权利要求47或48所述的方法，其中所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段是经标记的。
50.根据权利要求47-49中任一项所述的方法，其中通过免疫学测定进行所述检测。
51.根据权利要求47-50中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括尿液、粪便、唾液、全血、血浆、器官组织、毛发、皮肤、细胞或细胞培养物。
52.一种在使用治疗有效量的式(I)的化合物或其立体异构体或互变异构体的受试者中结合所述式(I)的化合物或其立体异构体或互变异构体的方法，其包括向所述受试者施用药物有效剂量的根据权利要求1-34中任一项所述的分离的抗原结合肽或分离的抗体Fab片段或分离的抗体串联Fab片段，其中
R1是C1-4烷基；
R2独立地选自F、Cl、CF3、CHF2、CH2F、CH3；
R3独立地选自CF3、CHF2、CH2F和CH3；
R4是H；并且
R5独立地选自F和Cl。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述式(I)的化合物具有式(II)：
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段的药物有效剂量包含如下的所述抗原结合肽或所述抗体Fab片段或所述抗体串联Fab片段，其与所述式(I)或(II)的化合物的剂量的摩尔比为至少约1:1，或与存在于所述受试者中的式(I)或(II)的化合物的摩尔比为至少约1:1。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的方法，其中将所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段与所述式(I)或(II)的化合物的施用并行施用或在施用所述式(I)或(II)的化合物之后施用。
56.根据权利要求52-55中任一项所述的方法，其中将所述分离的抗原结合肽或所述分离的抗体Fab片段或所述分离的抗体串联Fab片段通过静脉内、肌内或皮下方式施用。
57.根据权利要求52-56中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
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