CN101031588A - 药物组合物，融合物和结合物 - Google Patents

Abstract

提供了药物组合物，融合物和结合物。这种药物组合物和结合物包含一种治疗或诊断试剂，该试剂与结合血清白蛋白的抗体的抗原－结合片段融合或结合。相对于未结合或未融合的治疗或诊断试剂来讲，药物组合物、融合物和结合物具有更长的体内半衰期。

Description

药物组合物，融合物和结合物

相关申请

本申请要求保护在2004年12月2日提交的美国临时专利申请第60/632361号的权利和在2004年06月1日提交的美国临时专利申请第60/576271号的权利。上述申请的全部教导通过在此引证并入本文。

发明背景

许多拥有治疗和/或诊断作用活性的药物，其价值十分有限，因为当被给药后，它们很快地从体内被除去。例如，许多具有治疗有效活性的多肽通过肾被很快从循环中清除。因此，为了取得希望的治疗效果必需给予一个较大的剂量。一种具有改进药物动力学特性的改良的治疗和诊断制剂成为需要。与血清白蛋白结合的多肽是本领域内已知的。(见，如，欧洲专利第0486525 B1号(Cemu Bioteknik AB)；美国专利第6267964 B1号(Nygren等)；WO 04/001064 A2(Dyax公司)；WO 02/076489 A1(Dyax公司)；WO 01/45746(Genentech，Inc.))。

发明内容

本发明涉及具有改进的血清半衰期的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。在一方面，本发明是一种药物融合物，其中的药物融合物是一种具有如下分子式的连续多肽链：

a-(X)_n1-b-(Y)_n2-c-(Z)_n3-d或a-(Z)_n3-b-(Y)_n2-c-(X)_n1-d，

其中，X表示对第一目标有结合特异性的一种多肽药物；

Y表示一种对血清白蛋白有结合特异性的免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或一种对血清白蛋白有结合特异性的免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)；

Z表示对第二目标有结合特异性的一种多肽药物；

a，b，c和d分别是包括1至大约100个残基的多肽或缺失；

n1表示1至大约10；

n2表示1至大约10；和

n3表示0至大约10，

附带条件，当n1和n2为1且n3为0时，X不包括抗体链或抗体链的片段。

在一些实施方案中，Y包括从由序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26组成的组中选择的一种氨基酸序列，或从由序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22和序列号：23组成的组中选择的一种氨基酸序列。在某些特殊实施方案中，X是IL-1ra或IL-1ra的一种功能性变体。

在另一方面，药物融合物包括一种连续的多肽链，所述的链包括X’和T’亚基，其中

X’是一种多肽药物，附带条件，X’不包括抗体链或抗体链的片段；并且

Y’是表示对血清白蛋白有结合特异性的一种免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或对血清白蛋白有结合特异性的一种免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)。在某些实施方案中，Y’包括从由序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26组成的组中选择的一种氨基酸序列，或从由序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22和序列号：23组成的组中选择的一种氨基酸序列。在某些特殊实施方案中，X’是IL-1ra或IL-1ra的一种功能性变体。

在另一方面，本发明是一种药物结合物，其包括对血清白蛋白有结合特异性的一种免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或对血清白蛋白有结合特异性的一种免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)，和共价地结合所述V_H或V_L的药物。在一些实施方案中，免疫球蛋白重链可变区域包括从由序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26组成的组中选择的一种氨基酸序列，或从由序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22和序列号：23组成的组中选择的一种氨基酸序列。在某些特殊实施方案中，这种药物是IL-1ra或IL-1ra的一种功能性变体。

在另一方面，本发明是一种非共价药物结合物，其包括对血清白蛋白有结合特异性的一种免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或对血清白蛋白有结合特异性的一种免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)，和非共价地结合所述V_H或V_L的药物。在某些实施方案中，免疫球蛋白重链可变区域包括从由序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26组成的组中选择的一种氨基酸序列，或从由序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22和序列号：23组成的组中选择的一种氨基酸序列。

本发明也提供了编码这里所述药物融合物的重组核酸和构建物，和包括重组核酸和/或构建物的宿主细胞。本发明进一步提供了包括供养宿主细胞的制备药物融合物的方法，该宿主细胞包括一种编码这里所述的融合药物的重组核酸和/或构建物，在适合所述重组核酸表达的条件下，可生成该药物融合物。

本发明也提供了一种组合物(如药剂组合物)，其包括本发明的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。本发明也提供了对具有疾病或失调的病人进行治疗方法，如这里所述的，包括给予所述的病人本发明药物组合物(药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)的治疗有效剂量。在某些实施方案中，疾病或失调是一种炎症疾病，如关节炎(风湿性关节炎)。本发明也提供了使用本发明的药物组合物(药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)来制造治疗疾病或失调(如，炎症疾病，如关节炎(风湿性关节炎))的药物的方法。本发明也涉及这里所述的用于治疗，诊断或预防的一种药物组合物(药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。

附图说明

图1A是通过结合小鼠血清白蛋白(MSA)选择的三种V_ks氨基酸序列的阵列。所列的氨基酸序列来源于V_ks被称为的MSA16，亦称为DOM7m-16(序列1)，MSA12，亦称为DOM7m-12(序列2)，MSA26，亦称为DOM7m-26(序列3)。

图1B是通过结合鼠血清白蛋白(RSA)选择的六种V_ks氨基酸序列的阵列。所列的氨基酸序列来源于V_ks被称为DOM7r-1(序列4)，DOM7r-3序列5)，DOM7r-4(序列6)，DOM7r-5(序列7)，DOM7r-7(序列8)和DOM7r-8(序列9)。

图1C是通过结合人血清白蛋白(HSA)选择的六种V_ks氨基酸序列的阵列。所列的氨基酸序列来源于V_ks被称为DOM7h-2(序列号：10)，DOM7h-3(序列号：11)，DOM7h-4(序列号：12)，DOM7h-6(序列号：13)，DOM7h-1(序列号：14)和DOM7h-7(序列号：15)。

图1D是通过结合人血清白蛋白选择的七种V_HS氨基酸序列和参照序列的阵列。所列的氨基酸序列来源于V_HS被称为DOM7h-22(序列号：16)，DOM7h-23(序列号：17)，DOM7h-24(序列号：18)，DOM7h-25(序列号：19)，DOM7h-26(序列号：20)和DOM7h-21(序列号：21)，和DOM7h-27(序列号：22)。

图1E通过结合人血清白蛋白和鼠血清白蛋白选择的三种V_ks氨基酸序列的队列。所列的氨基酸序列来源于V_HS被称为DOM7h-8(序列号：24)，DOM7r-13(序列号：25)，DOM7r-14(序列号：26)。

图2A和2B是分别用于表达融合蛋白MSA16IL-1ra(也称DOM7m-16/IL-1ra)和IL-1raMSA16(也称IL-1ra/DOM7m-16)的载体的示意图。

图2C-2D表示编码融合蛋白IL-1raMSA16(也称IL-1ra/DOM7m-16)的核酸序列(序列号：27)和融合蛋白的氨基酸序列(序列号：28)。

图2E-2F表示编码融合蛋白MSA16IL-1ra(也称DOM7m-16/IL-1ra)的核酸序列(序列号：29)和融合蛋白的氨基酸序列(序列号：30)。

图2G-2H表示编码不与血清白蛋白结合的融合蛋白DummyIL-1ra的核酸序列(序列号：31)和融合蛋白的氨基酸序列(序列号：32)。

图3A表示IL-1诱导HeLa细胞产生IL-8，及在ELISA分析中检测IL-8的机理。

图3B是一张显示通过MRC-5细胞培养，IL-1ra(以“R&D”表示)，MSA16IL-1ra(  )和IL-1raMSA16(  )分别抑制受IL-1-诱导的IL-8分泌的图表。可见的抑制作用依赖于IL-1ra，MSA16IL-1ra和IL-1raMSA16的剂量。

图4A-4C分别表示了通过在不含鼠血清白蛋白(4A)，含5％鼠血清白蛋白(4B)，含10％鼠血清白蛋白(4C)的分析试验中培养MRC-5细胞，IL-1ra( )和MSA16IL-1ra(  )抑制受IL-1-诱导分泌IL-8的图表。在所有实验条件下，所观察到的抑制作用依赖于IL-1ra和MSA16IL-1ra的剂量。

图5示范性表达了ELISA的结果，证明了融合蛋白MSA16IL-1ra和融合蛋白IL-1raMSA16都能与血清白蛋白结合，但是融合蛋白DummyIL-1ra不与血清白蛋白结合。

图6A-6C分别是表示DOM7h-1结合人血清白蛋白(HSA)(6A)，DOM7h-7结合人血清白蛋白(HSA)(6B)，DOM7r-1结合鼠血清白蛋白(RAS)(6C)的BIACORE亲合数据的表格。

图7是一张表格，表示DOM7h-1，DOM7r-1，DOM7h-2，DOM7r-3，DOM7h-8，DOM7h-7，DOM7r-8，DOM7r-13，DOM7r-14，DOM7m-16，DOM7h-22，DOM7h-23，DOM7h-26，DOM7r-16，DOM7m-26，DOM7r-27和DOM7r-31与血清白蛋白结合的亲合力。DOM7h-8也结合猪血清白蛋白并且亲和力为60nM。

图8A表示存储于基因库中编号为NM_173842的编码人白介素1受体拮抗剂(IL-1ra)的核酸的核苷序列(序列号：33)。该核酸在65的位置有一个开放式阅读框。

图8B表示由在图8A中所示的核酸编码的人IL-1ra的氨基酸序列(序列号：34)。成熟蛋白质由152个氨基酸残基(序列号：34的26-177位氨基酸残基)组成。

图9是一张图表，表示了一段时期内(天数)，在给予CD1系雄性动物单一静脉内注射(大约1.5mg/kg)后，小鼠血清中结合dAb/HA表位标记融合蛋白的MSA浓度。使用山羊抗-HA(Abcam，UK)  捕获物和蛋白质L-HRP(Invitrogen，USA)检测药物进行ELISA测定血清浓度。存在1×小鼠血清时，建立已知浓度的结合dAb/HA融合蛋白的MSA标准曲线，以保证与测试样本的可比性。1分隔模型(WinNonlin软件，Pharsight公司，美国)显示结合dAb/HA表位标记融合蛋白的MSA具有29.1小时的半衰期并在曲线下具有559hr μg/ml面积。

图10是通过结合鼠血清白蛋白(RSA)选择的V_ks氨基酸序列的插图。图示序列来源于被称为DOM7r-15(序列37)，DOM7r-16(序列号：38)，DOM7r-17(序列号：39)，DOM7r-18(序列号：40)，DOM7r-19(序列号：41)的V_ks。

图11A-11B表示结合鼠血清白蛋白(RSA)的V_HS氨基酸序列的氨基酸序列。图示序列来源于被称为DOM7r-20(序列号：42)，DOM7r-21(序列号：43)，DOM7r-22(序列号：44)，DOM7r-23(序列号：45)，DOM7r-24(序列号：46)，DOM7r-25(序列号：47)，DOM7r-26(序列号：48)，DOM7r-27(序列号：49)，DOM7r-28(序列号：50)，DOM7r-29(序列号：51)，DOM7r-30(序列号：52)，DOM7r-31(序列号：53)，DOM7r-32(序列号：54)，DOM7r-33(序列号：55)的V_HS。

图12是一张图表，表示在给予CD1系雄性动物单一静脉内注射(大约1.5mg/kg剂量)后，在小鼠血清中包含HA抗原表位标记的DOM7m-16，DOM7m-26或未结合MSA的对照dAb浓度(％起始剂量)。使用山羊抗-HA(Abcam，UK)捕获物和蛋白质L-HRP(Invitrogen，USA)检测药物进行ELISA测定血清浓度。存在1×小鼠血清时，建立已知浓度的结合dAb/HA融合蛋白的MSA标准曲线，以保证与测试样本的可比性。1分隔模型(WinNonlin软件，Pharsight公司，美国)显示结合对照dAb具有20分钟的半衰期，而DOM7m-16，DOM7m-26在血清中的持续性显著持久。

图13是一张图表，表示在鼠胶原质-诱导的关节炎(CIA)模型中，DOM7m-16/IL-1ra与IL-1ra或ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)相比，能更有效的治疗关节炎。诱导关节炎，并且在第21天开始发作，小鼠用0.4mg/Kg的氟美松(类固醇)，1mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra(IL-1ra/抗-SA 1mg/Kg)或10mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra(IL-1ra/抗-SA 10mg/Kg)，1mg/Kg或10mg/Kg的IL-1ra，或5mg/Kg的ENBREL(entarecept；ImmunexCorporation)，或盐类处理。在这次研究中，结果显示DOM7m-16/IL-1ra较IL-1ra或ENBREL(entarecept；ImmunexCorporation)更加有效。正如预料的，针对IL-1ra的反应是受剂量依赖的，并且针对DOM7m-16/IL-1ra的反应也是受剂量依赖的。受1mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra处理所得的平均分始终低于受10mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra处理获得的平均分。在这项研究中，结果显示用DOM7m-16/IL-1ra处理的有效性较IL-1ra高10倍。

图14A-14G举例说明了皂素蛋白(saporin)多肽的氨基酸序列。图14A举例说明了皂素蛋白-2前驱体的氨基酸序列，其以保藏号为Swissprot Accession Number P27559(序列号：60)被存储。图14B举例说明了皂素蛋白-3的氨基酸序列，其作为Swissprot Accession Number P27560(序列号：61)被存储。图14C举例说明了皂素蛋白-4先驱的氨基酸序列，其作为SwissprotAccession Number P27561(序列号：62)被存储。序列号：62的1-24的氨基酸是信号多肽。图14D举例说明了皂素蛋白-5先驱的氨基酸序列，其作为Swissprot Accession Number Q41389(序列63)被存储。图14E举例说明了皂素蛋白-6原始的氨基酸序列，其作为Swissprot Accession Number P20656(序列号：64)被存储。序列号：64的1-24的氨基酸是信号多肽，并且序列号：64的278-299的氨基酸是一种潜在的前肽。序列号：64的25-277的氨基酸是成熟多肽(序列号：65)。图14F举例说明了皂素蛋白-7原始的氨基酸序列，其作为Swissprot Accession NumberQ41391(序列号：66)被存储。图14G举例说明了参照氨基酸序列包含一些突变体和皂素蛋白-6的异构体(序列号：67)。

图15举例说明了在WO2004/041862中揭示的结合鼠血清白蛋白的一些Camelid V_HHS的氨基酸序列。序列A(序列号：72)，序列B(序列号：73)，序列C(序列号：74)，序列D(序列号：75)，序列E(序列号：76)，序列F(序列号：77)，序列G(序列号：78)，序列H(序列号：79)，序列I(序列号：80)，序列J(序列号：81)，序列K(序列号：82)，序列L(序列号：83)，序列M(序列号：84)，序列N(序列号：85)，序列O(序列号：86)，序列P(序列号：87)，序列Q(序列号：88)。

具体实施方式

在本说明书中，实施方案以能够使说明书保持清楚且简练的方式被描述，但可以理解的是，在不脱离于本发明的情况下，实施方案可以被多样组合和分离。

与发明的任何一个实施方案具有相同分子式的已知组合物在根本上明确地被免责。相反地，新型组合物，已知组合物的新型化合物，已知组合物的新用途或包括已知组合物的新方法不被免责。

正如这里使用的，“药物”指能对病人施用，通过结合和/或改变病人中的生物目标分子的作用来产生一种有益的治疗和诊断效果的任何化合物(如，小有机分子，核酸，多肽)。目标分子可以是由病人基因组编码的内源目标分子(如，由病人编码的酶，受体，生长因子，细胞因子)或由病原体的基因组编码的外源目标分子(如病毒的基因组编码的酶，细菌，真菌，线虫类，或其它病原体)。

正如这里使用的，“药物组合物”指包括与一种多肽结合亚基共价或非共价结合药物的组合物，其中的多肽结合亚基包括一个特异结合可提高体内血清半衰期的多肽的结合位点(如，一个抗原-结合位点)。药物组合物可以是一种结合物，其中的药物共价或非共价地结合多肽结合亚基。药物可以直接或间接地共价或非共价结合多肽结合亚基(如，通过合适的连接物和/或补充结合成分(如生物素和抗生物素蛋白)的非共价结合)。当使用补充结合成分，结合成分的一部分能直接或通过一种合适的连接物亚基共价地结合药物，并且补充结合成分能直接或通过一种合适的连接物亚基共价地结合多肽结合亚基。当药物是一种多肽或肽，药物组合物可以是融合蛋白，其中的多肽或肽药物和多肽结合亚基是连续多肽链的非连续部分(亚基)。

正如这里使用的“结合物”指一种组合物，其包括与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段，其中血清白蛋白与药物结合。这些结合物包括  “药物结合物”，其包括一种与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段，其中，血清白蛋白与药物共价结合；和“非共价药物结合物”，其包括一种与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段，其中，血清白蛋白与药物非共价结合。

正如这里使用的“药物结合物”指一种包括与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段的组合物，其中血清白蛋白共价地与药物结合。药物可以直接地或通过一个合适的连接物亚基间接地共价结合抗原-结合片段。在任何合适的位置，如氨基末端，碳末端或通过合适的氨基酸侧链(如赖氨酸的ε氨基组)，药物可以与抗原-结合片段结合。

正如这里使用的“非共价药物组合物”指一种组合物，其包括与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段，其中血清白蛋白非共价地与药物结合。药物可以直接地(如，静电相互作用，疏水相互作用)或间接地(如，通过非共价结合补充结合成分(如生物素和抗生物素蛋白)，其中某一成分与药物共价结合并且此补充结合成分与抗原-结合片段共价结合)非共价结合抗原-结合片段。当使用补充结合成分时，结合成分的一部分可以直接地或通过合适的连接物亚基共价地与药物结合，并且补充结合成分可以直接或通过一种合适的连接物亚基共价地结合绑定血清白蛋白抗体的抗原-结合片段。

正如这里使用的“药物融合物”指一种包括与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段和多肽药物的融合蛋白。与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段和多肽药物作为单独的连续多肽链的非连续部分(亚基)的形式存在。

正如这里使用的术语“药物基准”指药物组合物和药物的活性，其根据用于分析，测试或测定活性的药物(或药物亚基)的数量进行标准化。一般而言，本发明的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)的分子量比它们包含的药物更大。因此，在重量上有相等剂量的药物组合物和药物，在分子或摩尔基础上，将包含不同药物剂量。如，如果本发明的药物组合物的分子量两倍于其包含的药物，则活性可以使用2μg的药物组合物和1μg的药物根据“药物基准”来测定，因为这些量中包含了相同数量的药物(就游离药物或药物组合物的一部分而言)。可以根据“药物基准”使用合适的计算对活性进行标准化和表述，如以每目标结合位点为基础，或者就酶药物而言，以每活性位点为基础表示活性。

正如这里使用的“白介素1受体拮抗剂”(IL-1ra)指自然产生的或内源性的哺乳动物IL-1ra蛋白和与自然的蛋白有着相同的氨基酸序列的蛋白或内源性的相应哺乳动物IL-1ra蛋白(如，重组蛋白，合成蛋白(如通过化学有机合成方法制备的))。因此，正如这里定义的，术语包括成熟蛋白质，多态性或等位基因突变体，和IL-1ra的其它异构体(如，通过选择性拼接或其它细胞机制来制备)，和前面所述的修饰的或未修饰的形式(如，脂质，糖基化，PEG化)。自然产生的或内源性IL-1ra包括野生型蛋白质如成熟IL-1ra，多态性或等位基因突变体和其它在哺乳动物中自然出现的异构体(如，人，非-人灵长类)。这些蛋白质可以从自然产生IL-1ra的供体中回收或分离。这些蛋白质和IL-1ra蛋白质与自然生产的或内源性的对应的IL-1ra具有相同的氨基酸序列，以相应的哺乳动物命名。如，对应的哺乳动物为人，则蛋白质被称为人IL-1ra。

IL-1ra的“功能性变体”包括功能片段，功能性变体蛋白，和/或功能融合蛋白，其可以通过合适的方法制备(如，突变(如，化学突变，放射性突变)，DNA重组技术)。一种“功能性变体”能拮抗白介素-11型受体。一般而言，与成熟IL-1ra(如N-末端，C-末端或内部的删除)相比，IL-1ra的片段或其部分包括一个氨基酸(如，一种或更多氨基酸)的删除和/或增加(如一个或更多氨基酸的删除或增加)。对于IL-1ra，片段或部分，其中仅邻近的氨基酸被删除或其中非-邻近的氨基酸也被删除。

人IL-1ra的功能性变体至少有大约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％氨基酸序列与人IL-1ra的152个氨基酸的成熟形式相同并可拮抗人白介素-11型受体。(见，Eisenberg等人的文献Nature 343：341-346(1990))。突变体包括一种或更多额外氨基酸(如，包括153或154或更多氨基酸)。如，突变体IL-1ra，具有一种由氨基-末端的甲硫氨酸残基组成的氨基酸序列，其位于序列号：33的26-177的残基后面。(KINERET(anakinra)，Amgen Inc.)。

正如这里使用的“皂素蛋白(saporin)”指由植物肥皂草产生的单-链核糖体-失活多肽的一个家族。(Stirpe，F.，等人的文献Biochem.J.216：617-625(1983)，Bagga，S.等人的文献J.Biol.Chem.278：4813-4820(2003)。)皂素蛋白多肽存在多种形式，其在长度和/或氨基酸序列上有所不同。(见，如，Id.andBarthelemy，I.等，J.Biol.Chem.268：6541-6548(1993)。)皂素蛋白-6是最有活性的皂素蛋白形式。(Bagga，S.等，J.Biol.Chem.278：4813-4820(2003)。)据报道，自然产生的皂素蛋白-6至少有四种异构体，其中在成熟多肽(序列号：65)48位置的氨基酸是Asp或Glu，并且在成熟多肽(序列号：65)91位置的氨基酸是Arg或Lys。(Barehelemy，I.等人的文献J.Biol.Chem.268：654 1-6548(1993)。)皂素蛋白-6的另外的形式包括那些多肽，其在成熟多肽(序列号：65)99位置的氨基酸是Ser或Leu；在成熟多肽(序列号：65)134位置的氨基酸是Gln或Lys；在成熟多肽(序列号：65)147位置的氨基酸是Ser或Leu；在成熟多肽(序列号：65)149位置的氨基酸是Ser或Phe；在成熟多肽(序列号：65)162位置的氨基酸是Asp或Asn；在成熟多肽(序列号：65)177位置的氨基酸是Ala或Val；在成熟多肽(序列号：65)188位置的氨基酸是Ile或Thr；在成熟多肽(序列号：65)196位置的氨基酸是Asn或Asp；在成熟多肽(序列号：65)198位置的氨基酸是Glu或Asp；在成熟多肽(序列号：65)231位置的氨基酸是Asn或Ser；在成熟多肽(序列号：65)233位置的氨基酸是Lys或Arg。(Id.)包含这些异构体和突变体的参照序列出现在图14G中(序列号：67)。

因此，术语“皂素蛋白”包括前体蛋白，成熟多肽，自然蛋白，多态性或等位基因突变体，和其它异构体(如，通过选择性拼接或其它细胞机制产生的)，和前面所述的修饰或未修饰的形式(如，脂质，糖基化，PEG化)，包括自然产生的，合成的或重组产生的多肽。自然产生的或内源性皂素蛋白包括野生型蛋白质如成熟皂素蛋白(如成熟皂素蛋白-6)，多态性或等位基因突变体和其它在肥皂草中自然生成的异构体。这些蛋白能使用任何合适的方法从肥皂草中回收或分离。皂素蛋白的“功能性变体”包括功能片段，功能突变蛋白，和/或功能融合蛋白，其可以使用合适的方法(如，突变(如，化学突变，放射性突变)，DNA重组技术)来制备。一般而言，相对于成熟IL-1ra(如N-末端，C-末端或内部的删除)，皂素蛋白的片段或部分(如，皂素蛋白-6)包括含有一个氨基酸(如，一种或更多氨基酸)的删除和/或增加(如一个或更多氨基酸的删除或增加)的蛋白。与成熟皂素蛋白相比，仅邻近的氨基酸或其中非-邻近的氨基酸被删除的片段或配基也是预期的。可以制备皂素蛋白的各种功能性变体。如，可制备包含氨基-末端延伸的皂素蛋白-6的融合蛋白并且在兔网状细胞溶解产物分析中，仍然显示了保留完整的核糖体-抑制活性。(Barthelemy，I.等人的文献，J.Biol.Chem.268：6541-6548(1993)。)在体外分析中，突变体或皂素蛋白-6由于一个活性位点残基，Tyr72，Tyr120，Glu176，Arg179或Trp208(序列65的第72，120，176，179，或208)被丙胺酸取代，从而减少了细胞毒素活性。(Bagga，S.等人的文献J.Biol.Chem.278：4813-4820(2003)。)因此，如果制备另外的皂素蛋白的功能性变体，应避免活性位点残基上的突变，替换，取代，删除或修饰。优选地，与自然出现的成熟多肽相比，包含较少氨基酸的皂素蛋白功能性变体至少包括活性位点。如，与自然出现的成熟多肽相比，包含较少氨基酸的皂素蛋白功能性变体包括成熟皂素蛋白-6的活性位点残基(Tyr72，Tyr120，Glu176，Arg179或Trp208(序列号：65的第72，120，176，179，或208))，且至少有137个氨基酸长度，至少有150个氨基酸长度，至少有175个氨基酸长度，至少有200个氨基酸长度，至少有225个氨基酸长度，至少有250个氨基酸长度。

皂素蛋白功能性变体具有核糖体-失活活性(如，rRNA N-糖苷酶活性)和/或细胞毒素活性。这些活性可以用任何合适的方法容易地被评估，如，使用众所周知的兔网状细胞溶解产物试验或任何众所周知的使用肿瘤细胞系的细胞毒素试验进行蛋白质合成的抑制。(见，如，Bagga，S.等等J.Biol.Chem.278：4813-4820(2003)和Barthelemy，I.等J.Biol.Chem.268：6541-6548(1993))。

在某些实施方案中，皂素蛋白功能性变体至少有约80％，85％，90％，91％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％氨基酸序列与人IL-1ra和成熟皂素蛋白-6相同(序列号：65)。

本发明涉及了包括一种药物和一种多肽结合亚基的药物组合物，该多肽结合亚基包含在体内特异结合提高血清半衰期的多肽的结合位点(如，一个抗原-结合位点)。正如这里对药物组合物的详细描述，其包括一种与血清白蛋白特异结合的抗体的抗原-结合片段，药物和多肽结合亚基能相互共价或非共价地结合。在某些实施方案中，药物组合物是一种融合蛋白，其包括一种多肽药物和多肽结合亚基，该亚基含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的抗原-结合位点。在另一实施方案中，药物组合物包括的一种药物共价或非共价地结合多肽结合亚基，其包含了具有多肽结合特异性并提高体内血清半衰期的抗原-结合位点。

典型地，在体内提高血清半衰期的多肽是一种在体内自然生成，并且可抵抗内源性机制引发的降解或清除作用，该作用可清除生物体(如，人类)中非需要物质。如，可以从来源于细胞外间质的蛋白质，在血液中发现的蛋白质，在血脑屏障或神经组织发现的蛋白质，位于肾，肝，肺，心脏，皮肤或骨骼中的蛋白质，应激蛋白，疾病-特异蛋白，或Fc转运蛋白的蛋白质中选取在体内提高血清半衰期的多肽。

提高体内血清半衰期的合适多肽包括，如，铁传递蛋白受体特异的配基-神经药物制剂融合蛋白(见美国专利第5977307号，其指导在此通过参考被整合)，脑毛细管内皮细胞受体，转铁蛋白，转铁蛋白受体(如，可溶性转铁蛋白受体)，胰岛素，胰岛素-类似生长因子1(IGF1)受体，胰岛素-类似生长因子2(IGF2)受体，胰岛素受体，血液凝结因子X，a-1抗胰蛋白和HNF1a。在体内提高血清半衰期的合适的多肽也包括糖蛋白(酸性糖蛋白；AAG)，α-1抗胰糜蛋白酶抗体(ACT)，α-1微球蛋白(蛋白质HC；AIM)，抗凝血酶III(ATIII)，载脂蛋白A-1(Apo A-1)，载脂蛋白B(Apo B)，铜蓝蛋白(Cp)，补充成分C3(C3)，补充成分C4(C4)，酯酶抑制子(C1 INH)，C-活性蛋白(CRP)，铁蛋白(FER)，血液结合素(HPX)，脂蛋白(α)(Lp(α))，甘露糖-结合蛋白(MBP)，肌球素(Myo)，前清蛋白(转甲状腺蛋白；PAL)，视黄醇-结合蛋白(RBP)，和类风湿因子(RF)。

来源于细胞外间质的合适的蛋白包括，如，胶原质，层粘连蛋白，整合素类和纤维连接蛋白。胶原质是细胞外间质的主要蛋白质。现在已知的胶原质分子大约有15种，存在于身体的不同部位，如，在骨骼，皮肤，腱，韧带，角膜，内在器官中被发现的I型胶原质(占身体胶原质的90％)或在软骨，椎间盘，脊索，和眼睛的玻璃状液中被发现的II型胶原质。

来源于血液中的合适的蛋白质包括，如，血浆蛋白(如，纤维蛋白，α-2微球蛋白，血清白蛋白，纤维蛋白原(如，纤维蛋白原A，纤维蛋白原B)，血清淀粉蛋白A，触珠蛋白，抑制蛋白，泛素，胚泡激肽和β-2微球蛋白)，酶和酶抑制子(如，血浆酶原，溶解酵素，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，a-1抗胰蛋白和胰腺的胰岛素抑制子)，免疫系统蛋白质，如，免疫球蛋白蛋白质(如，IgA，IgD，IgE，IgG，IgM，免疫球蛋白轻链(kappa/lambda)，转运蛋白(如，视黄醇结合蛋白，a-1微球蛋白)，防御蛋白(如β-防御1，嗜中性粒细胞防御1，嗜中性粒细胞防御2和嗜中性粒细胞防御3)和类似物。

来源于血脑屏障和神经组织的合适的蛋白包括，如，黑皮素受体，髓磷脂，抗坏血酸转运蛋白和类似物。

在体内提高血清半衰期的合适的多肽也包括位于肾脏中的蛋白质(如，多囊蛋白，IV型胶原质，有机的阴离子转运蛋白K1，Heymann’s抗原)，位于肝脏中的蛋白质(如，酒精脱氢酶，G250)，位于肺脏中的蛋白质(如，结合IgA的分泌成分)，位于心脏中的蛋白质(如，HSP27，其与扩张型心肌病相连)，位于皮肤中的蛋白质(如，角蛋白)，骨骼特异蛋白如形态发生蛋白(BMPs)，其是具有生骨活性的蛋白质生长因子β超家族的变体亚类(如，BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-8)，肿瘤特异蛋白(如，滋养层抗原，herceptin受体，雌激素受体，组织蛋白酶(如，在肝和脾中发现的组织蛋白酶B)。

合适的疾病-特异蛋白包括，如，仅在活性T-细胞中表达的抗原，包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)，骨保护素配基(OPGL；见Nature 402，304-309(1999))，OX40(TNF受体家族的成员，其在活性T细胞中表达并在产生人T细胞白血病毒I型(HTLV-1)的细胞中特异上调；见，Immunol.165(1)：263-70(2000))。合适的疾病-特异蛋白也包括，如，金属蛋白酶(与关节炎/癌相关)包括果蝇CG6512，人paraplegin，人FtsH，人AFG3L2，鼠科ftsH；和拮抗生长因子，包括酸性纤维原细胞生长因子(FGF-1)，基础纤维原细胞生长因子(FGF-2)，血管上皮生长因子/血管渗透因子(VEGF/VPF)，转化生长因子-α(TGFα)，肿瘤坏死因子-α(TNFα)，血管生成素，白介素-3(IL-3)，白介素-8(IL-8)，血小板-起源上皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长因子(P1GF)，中期血小板-起源生长因子-BB(PDGF)，和fractalkine。

在体内提高血清半衰期的合适的多肽包括应激蛋白如热休克蛋白(HSPs)。HSPs通常在细胞内被发现。当它们在细胞外被发现时，则表示细胞已经凋亡或其内部物质已经溢出。当发生外伤，疾病或伤害后，出现非程序性的细胞凋亡，细胞外HSPs引发免疫系统的反应。结合细胞外HSP能使本发明的组合物定位于疾病位点。

在Fc转运蛋白中包括的合适的蛋白包括，如Brambell受体(也称FcRB)。这种Fc受体有两种功能，两种都被用于运输。作用(1)穿过胎盘从母体转运IgG给小孩(2)保护IgG免受降解从而延长其血清的半衰期。一般认为受体在内涵体中进行IgG的再生。(见，Holliger等人的文献Nat Biotechnol 15(7)：632-6(1997)。)

本发明的药物组合物包括任何多肽结合亚基，该亚基含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点(如抗原-结合位点)。优选地，多肽结合亚基作为一个独立的分子实体包括至少31，至少大约40，至少大约50，至少大约60，至少大约70，至少大约80氨基酸，至少大约90氨基酸，至少大约100氨基酸或至少大约110氨基酸。优选地，多肽结合亚基与提高体内血清半衰期的多肽相结合，其KD值大约至少为5mMKD(KD＝K_off(kd)/K_on(ka))。在某些实施方案中，通过细胞质共振测定多肽结合亚基与提高体内血清半衰期的多肽相结合的KD值大约为10至100nM，或大约是100nM至大约500Nm，或大约500nM至5Mm(如，使用BIACORE仪器)。在特殊的实施方案中，多肽结合亚基与提高体内血清半衰期的多肽相结合的KD值大约为50nM或大约70Nm，或大约100nM，或大约150nM或200nM。

优选地，包含特异结合提高体内血清半衰期的多肽的结合位点(如，抗原-结合位点)的多肽结合亚基不是原核或细菌多肽或肽。优选地，多肽结合亚基是真核的，哺乳动物的或人的多肽或肽。

在一定的实施方案中，包含特异结合提高体内血清半衰期的多肽的结合位点(如，抗原-结合位点)的多肽结合亚基是一种折叠蛋白区域。在另一实施方案中，作为一个单独的分子实体，多肽结合亚基的分子量至少有大约4Kda，至少有大约4.5Kda，至少有大约5Kda，至少有大约5.5Kda，至少有大约6Kda，至少有大约6.5Kda，至少有大约7Kda，至少有大约7.5Kda或至少有大约8Kda。

包含特异结合提高体内血清半衰期的多肽的结合位点(如，抗原-结合位点)的合适的多肽结合亚基能通过任何合适的方法被鉴定，如，在合适的粘合分析中，筛选自然产生的或非-自然产生的多肽。正如这里所描述，优选的包含特异结合提高体内血清半衰期的多肽的抗原-结合位点的合适的多肽结合亚基是特异与血清白蛋白结合的抗体的抗原结合片段。但是，与提高体内血清半衰期的其它多肽特异结合的抗体的抗原-结合片段也能被用于本发明。

如果期望的话，一种或更多种与提高体内血清半衰期的多肽结合的抗体或其抗原-结合片段的互补决定区域(CDRs)，可以转变为非-免疫球蛋白结构形式，而保留抗体或抗原-结合片段的抗原-结合特异性。本发明的药物组合物包括这种非-免疫球蛋白结合亚基。这种非-免疫球蛋白结合亚基能通过任何合适的方式制备，例如自然细菌受体如SpA已经被用作CDRs的移植结构，制备特异结合表位的多肽结合配基。这种操作的详细描述见美国专利申请第5831012号，其主旨通过引证在此并入本文。其它合适的结构包括纤维连接蛋白和亲和体(affibodies)。合适操作的详细描述见WO98/58965。其它合适的结构包括lipocallin和CTLA4，见van den Beuken等，J.Mol.Biol.310：591-601(2001)，和如在WO00/69907中描述的(Medical Research Council)，其基于细菌GroEL或其它伴侣多肽的环状结构范例。

在某些实施方案中，本发明的药物组合物包括特异与血清白蛋白结合的非-免疫球蛋白结合亚基，其中的非-免疫球蛋白结合亚基包括一种，两种或三种这里描述的CDRs的V_H，V_K，V_HH和合适的结构。在特定的实施方案中，非-免疫球蛋白结合亚基包括CDR3，但不包括CDR1或CDR2的V_H，V_K，V_HH和合适的结构。在其它实施方案中，非-免疫球蛋白结合亚基包括CDR1和CDR2，但不包括CDR3的V_H，V_K，V_HH和合适的结构。在其它实施方案中，非-免疫球蛋白结合亚基包括CDR1和CDR2和CDR3的V_H，V_K，V_HH和合适的结构。在其它实施方案中，药物组合物仅包括CDR3的V_H，V_K，V_HH和一种药物。

本发明的药物组合物能使用合适的方法制备，如这里提到的制备药物融合物，药物结合物和非共价的药物结合物的方法。此外，本发明的药物组合物具有这里详细描述的关于药物融合物，药物结合物和非共价的药物结合物的优势和作用。

本发明提供的药物组合物(药物融合物，药物结合物和非共价的药物结合物)对比于单独的药物(非共扼药物，非药物融合物)具有优化的制药学上的特性(如，增加血清半衰期)和其它的优势。药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物包括特异与血清白蛋白结合的抗体的抗原结合片段和一种或更多种所希望的药物。

正如这里提及的，本发明的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)对比于单独药物极大延长了体内血清半衰期和/或提高AUC。此外，在药物组合物(药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)中药物的活性一般没有较大改变。但是，对比于单独的药物，药物组合物的活性的一些改变是可以接受的并且一般是药物组合物(药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)制药学特性提高的弥补。如，药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)对药物靶标的结合较单独药物的亲和力低，但是由于药物组合物改良的制药学特性(如，延长的体内血清的半衰期，提高了AUC)，与单独药物相比，具有相等的或更高的功效。此外，较低剂量的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)能被施用从而取得希望得到的治疗或诊断功效。优选地，由于不多于100，或不多于50，不多于10，不多于5，不多于4，不多于3，不多于2种因素，药物组合物(药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)的活性不同于单独药物的活性。例如，一种药物可以具有一个1nM的KD，Ki或中和剂量50(ND50)，而一种药物组合物具有大约2nM，大约3nM，或大约4nM，或大约5nM，或大约10nM的KD，Ki或ND50。

优选地，药物组合物的活性(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)对比于药物的活性并不显著减少。在一定的实施方案中，药物组合物的活性相对于药物的活性降低程度不多于10％，不多于9％，不多于8％，不多于7％，不多于6％，不多于5％，不多于4％，不多于3％，不多于2％，不多于1％或基本不变。或者说，药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)至少保留了大约90％，大约91％，大约92％，大约93％，大约94％，大约95％，大约96％，大约97％，大约98％，大约99％的药物活性，或基本与药物活性相同。优选地，药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)和药物活性的测定和/或对比将在“药物主要成分”上进行。

正如这里所描述的，本发明的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)比单独的药物有更大的活性(如，在体内的活性)。如，在例6所示，当这些药物以相同重量的剂量(10mg/Kg或1mg/Kg)被施用时，在小鼠模型中，DOM7m-16/IL-1ra比IL-1ra在治疗关节炎方面更有效。即使DOM7m-16/IL-1ra的分子量大约是IL-1ra分子量的两倍，DOM7m-16/IL-1ra也更有效。因此，与接受IL-1ra的鼠相比，接受DOM7m-16/IL-1ra的鼠仅接受了一半的IL-1ra(作为在DOM7m-16/IL-1ra中的一个亚基)。

在特定的实施方案中，药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)比药物有更大的活性(如，在体内的活性)。如，药物组合物具有至少大约100％，至少大约150％，至少大约200％，至少大约250％，至少大约300％，至少大约350％，至少大约400％，至少大约450％，至少大约500％的药物的活性。优选地，在“药物主要成分”上进行药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)和药物活性的测定和/或对比。药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)和药物的活性可以使用合适的体内或体外系统测定。在特定的实施方案中，在体内测得药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)比其包含的药物具有更大的活性。在另一实施方案中，在体外测得药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)比其包含的药物具有更大的活性。

包括特异与血清白蛋白结合的抗体区域(dAb)的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)提供了更大的优势。相对于抗体和其它抗体的抗原结合片段，抗体区域是非常稳定的，也是很小的，其通过E.coli或酵母(如，Pichiapastoris)的表达以较高的产量被生产，并且，如这里所述，结合血清白蛋白的抗体的抗原结合片段可以很容易的从人源库或其它希望的种族中筛选出来。因此，包括与血清白蛋白结合的dAb的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)比在哺乳动物细胞中制备的药物(如，人，人源化的或嵌合的抗体)更容易制备，并且能使用非免疫原的dAbs(如，人dAb能制备药物融合物或药物结合物用于治疗和诊断人类中的疾病)。

当药物是含有与血清白蛋白结合的多肽结合亚基(如，与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段)的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)的一部分时，药物的免疫原性可以被降低。因此，含有与血清白蛋白结合(如，与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段)的多肽结合亚基的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)相比，单独药物有较少的免疫原性或是非-免疫原性的。因此，这些药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)能重复对病人施用，并将由于病人免疫系统产生的抗-药物抗体导致的失效作用最小化。

因此，这里描述的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物)与单独药物相比，具有更高的安全性和较少的负面作用。如，作为特异与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段的血清白蛋白-结合活性结果，药物融合物和结合物(药物结合物，非共价的药物结合物)在血管循环中具有提高的滞留时间。另外，在施用于身体组织后(如，血管内注射)，共扼物和药物融合物不能穿越血脑屏障，也不能在中枢神经系统中积累。因此，包含有神经学毒性的或不期望的作用于神经的效应的药物的共扼物(药物结合物，非共价的药物结合物)和药物融合物，与单独施用药物相比，具有更大的安全性和更小的副作用。相似地，共扼物(药物结合物，非共价的药物结合物)和药物融合物比单独施用药物对特殊器官(如，肾或肝)有更小的毒性。这里描述的共扼物和药物融合物能在血管循环中对一种结合药物的物质或靶标(如，毒素)产生屏蔽，从而降低了药物或靶标对组织效用(如，抑制了毒素的效用)。

体内半衰期的药物动力学分析和测定的合适的方法在本领域已被熟知。这些方法的描述，见，如，Kenneth，A等人的文献：Chemical Stability of Pharmacerticals：A Handbook forPharmacists，和Peters等人的文献Pharmacokinetc analysis：APractical Approach(1996)。也可以参考“Pharmacokinetics”，MGibaldi&D Perron，由Marcel Dekker出版，2^nd Rev.edition(1982)，其描述了药物动力学参数如t和t beta的半衰期(t_1/2alpha，t_1/2beta)和曲线下的面积(AUC)。

半衰期(t1/2alpha，t1/2beta)和AUC可以由结合物或融合物的血清浓度的时间曲线来测定。如，使用WinNonlin分析包(从Pharsight Corp.，Mountain View，CA94040，USA购得)模拟曲线。在第一阶段(alpha阶段)，药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)主要是在病人中实行分配，伴有一些消失。第二阶段(beta阶段)是终止阶段，这时的药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)已经被分配并且由于药物组合物从病人中清除而使血清浓度减少。talpha半衰期是第一阶段的半衰期而t beta半衰期是第二阶段的半衰期。因此，目前发明提供了一种药物组合物((如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)或包括本发明药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)的组合物，依照本发明该组合物的t alpha半衰期在15分钟的范围内或更长。在某一实施方案中，范围的下段是30分钟，45分钟，1小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8时，9小时，10小时，11小时或12小时。此外，或可选择地，药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)或依据本发明的组合物的t alpha半衰期大于等于12小时。在某一实施方案中，范围的上段是11，10，9，8，7，6或5小时。合适范围的例子是1-6小时，2-5小时或3-4小时。

有利地，目前发明提供的药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)的tβ半衰期在2.5小时的范围内或更长。在某一实施方案中，范围的下段是3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时或12小时。在某一实施方案中，药物组合物(的tβ半衰期大于等于21天。在某一实施方案中，范围的上段是12小时，24小时，2天，3天，5天，10天，15天或20天。在特殊的实施方案中，依据发明的药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)的tβ半衰期是12-60小时。在进一步的实施方案中，其范围是12-48小时。在进一步的实施方案中，其范围是12-26小时。

此外，或作为上述标准的选择，目前发明提供的药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)的AUC值(曲线下的面积)在0.01mg.min/ml的范围内或更多，或1mg.min/ml的范围内或更多。在某一实施方案中，范围的的下段是0.01，0.1，1，5，10，15，20，30，100，200或300mg.min/ml。在特殊的实施方案中，药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)的AUC值大于600mg.min/ml。在某一实施方案中，范围的上段是500，400，300，200，150，100，75或50mg.min/ml。在其它实施方案中，药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)的AUC值可以从下列组中选择：15-150mg.min/ml，15-100mg.min/ml，15-75mg.min/ml，15-50mg.min/ml，0.01-50mg.min/ml，0.1-50mg.min/ml，1-50mg.min/ml，5-50mg.min/ml，和10-50mg.min/ml。

本发明涉及的药物组合物(如药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)包括一种药物和多肽结合亚基，其含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点(如，一种抗原-结合位点)。在药物组合物优选的实施方案中，含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点(如，一种抗原-结合位点)的多肽结合亚基，对血清白蛋白具有结合特异性。

在一些实施方案中，药物组合物包括一种药物，其含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点(如，一种抗原-结合位点)，能与多肽结合亚基共价结合。在这些实施方案中，药物在任何合适的位置共价地结合多肽结合区域，如氨基-末端，羧基-末端或通过合适的氨基酸侧链(如，赖氨酸的ε氨基组)。

在其它实施方案中，药物组合物包括一种药物，其含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点(如，一种抗原-结合位点)，能与多肽结合亚基非共价结合。在这些实施方案中，药物直接(如，通过静电相互作用，疏水相互作用)或间接地(如，通过非共价结合补充结合部分(如，生物素和抗生物素蛋白)非共价结合抗原-结合片段，其中某一部分共价结合药物并且互补结合部分共价结合抗原-结合片段)。当使用补充结合部分时，其中之一的结合部分能直接或通过合适的连接物亚基共价地结合药物，并且补充结合部分能直接或通过合适的连接物亚基共价地结合多肽结合区域。

在其它实施方案中，药物组合物是一种融合蛋白，其包括一种多肽药物和含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点(如，一种抗原-结合位点)的多肽结合亚基。这些融合蛋白包括一种连续的多肽链，所述的多肽链以含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点(如，一种抗原-结合位点)的多肽结合亚基作为第一个亚基，和一种多肽药物作为第二个亚基，其以多肽链的不连续部分(亚基)出现。第一亚基和第二亚基能直接或通过一种多肽结合物，或通过合适的氨基酸，或肽或多肽连接物连接相互绑定。另外的亚基(如，第三，第四)和/或连接序列能以适当的形式出现。第一个亚基可以位于N-末端，C-末端或相对于第二个亚基的内部(如，多肽药物)。在特定的实施方案中，融合蛋白包括一种或更多种多肽药物亚基和一种或更多种含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点(如，一种抗原-结合位点)的多肽结合亚基。在这些实施方案中，融合蛋白可以包括1-10种(如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)相同或不同的多肽结合亚基，和1-20种(如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20)相同或不同的含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点的多肽结合亚基。

含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点的多肽结合亚基和多肽药物亚基能出现在任何期望的位置。如，从氨基末端至羧基末端，亚基以下列顺序出现：一种或更多种多肽结合亚基，一种或更多种多肽药物亚基，一种或更多种多肽结合亚基。在另一例子中，从氨基末端至羧基末端，亚基以下列顺序出现：一种或更多种多肽结合亚基，一种或更多种多肽药物亚基，一种或更多种多肽结合亚基，一种或更多种多肽药物亚基，一种或更多种多肽结合亚基。正如这里描述的，多肽结合亚基和多肽药物可以直接或通过一种多肽结合物，或通过合适的氨基酸，或肽或多肽连接物连接相互绑定。

在特定的实施方案中，融合蛋白是一种连续的多肽链，其具有下列分子式(从氨基-末端至羧基-末端)：

a-(P)n2-b-(X)n1-c-(Q)n3-d或a-(Q)n3-b-(X)n1-c-(P)n2-d

其中X是一种多肽药物；

P和Q每个分别是一种含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点的多肽结合亚基；

a，b，c和d分别是包括1至大约100个残基的多肽或缺失；

n1，n2，n3分别表示X，P或Q亚基存在的数量；

n1是1至大约10；

n2是0至大约10；和

n3是0至大约10，

附加条件：n2和n3不能同时为零；并且

当n1和n2都为1时，n3为零，X不包括抗体链或抗体链的片段。

在一些实施方案中，n2为1，2，3，4，5，或6，且n3为零。在另一实施方案中，n3为1，2，3，4，5，或6，且n2为零。在其它实施方案中，n1，n2和n3都为1。

在特定的实施方案中，X不包括一种抗体链或抗体链的片段。

在优选的实施方案中，P和Q每个分别是能特异与血清白蛋白结合的多肽结合亚基。

在特殊的优选实施方案中，药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)包含一个多肽结合亚基，其含有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点(如，抗原结合位点)，其中的多肽结合区域是特异与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段。

本发明也涉及了在体内增加药物的血清半衰期的方法，包括将一种药物与含有在体内特异结合提高血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合亚基相结合，由此制备了相比与药物，具有更长的体内血清半衰期的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。

在某些实施方案中，在体内增加药物的血清半衰期而不减少药物的活性的方法，包括将一种药物与含有特异结合提高体内血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合亚基相结合，由此制备了相比与药物，具有更长的体内血清半衰期，并至少具有所述药物活性的大约90％的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。

在另一实施方案中，在体内增加药物的血清半衰期并减少药物的免疫原性的方法，包括将一种药物与在体内特异结合提高血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合亚基结合，由此制备了在体内，比药物具有更长的血清半衰期且更少免疫原性的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。

在另一实施方案中，减少药物免疫原性并不减少药物的活性的方法，包括将一种药物与在体内特异结合提高血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合亚基结合，由此制备了，比药物具有更少免疫原性的，至少是所述药物活性的大约90％的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。

在另一实施方案中，在体内增加药物的血清半衰期的并不减少药物的免疫原性和活性的方法，包括将一种药物与在体内特异结合提高血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合亚基结合，由此制备了在体内，比药物具有更长的血清半衰期的，更少免疫原性且至少是所述药物活性的大约90％的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。

正如这里描述的，药物和在体内特异结合提高血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合亚基可以通过共价的结合物(如，多肽结合物)或非共价的结合物，使用或不使用连接物而结合。在某些实施方案中，药物和在体内特异结合提高血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合亚基通过共价的结合物结合。如，制备的药物组合物是药物结合物或药物融合物。在另外的实施方案中，药物和在体内特异结合提高血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合亚基通过非共价的结合物结合，且药物组合物是一种非共价的药物结合物。

使用这种方法制备的药物组合物比药物有更大的活性(如，在体内的活性)。在一些实施方案中，制备比药物有更大的活性(如，在体内的活性)的药物组合物的方法，包括将一种药物与在体内特异结合提高血清半衰期的多肽的结合位点的多肽结合亚基结合，由此制备了比药物具有更长活性的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。在这些实施方案中，优选地，药物组合物的活性比这里所描述的药物的活性更大。

在优选的实施方案中，多肽结合亚基具有与血清白蛋白结合的特异性。在特殊的优选实施方案中，多肽结合亚基是特异与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段。

在特定的实施方案中，方法包括从一种或更多多肽(如特异与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段)中选择所述的多肽结合亚基，其中所选的多肽结合亚基与提高体内血清白蛋白半衰期的多肽结合，其KD值至少有大约5mM。

本发明也涉及使用多肽结合亚基来制备药物，所述多肽结合亚基具有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的结合位点，此药物包括一种药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，其中的药物结合所述的多肽结合亚基，提高药物在体内的血清半衰期，而药物活性的较少不超过10％。

在某些实施方案中，此应用是为了制备药物，药物包括药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，其中的药物结合所述的多肽结合亚基，提高药物在体内的血清半衰期和减少药物的免疫原性。

在其它实施方案中，此应用是为了制备药物，药物包括药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，其中的药物结合所述的多肽结合亚基，减少药物的免疫原性，而药物活性的较少不超过10％。

在其它实施方案中，此应用是为了制备药物，药物包括药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，其中的药物结合所述的多肽结合亚基，增加在体内药物的血清半衰期，减少药物的免疫原性，而药物活性的减少不超过10％。

正如这里所述，药物组合物包括一种药物和结合亚基，所述亚基具有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的多肽的结合位点，其通过共价结合物(如，多肽结合物)或非共价结合物，使用或不使用连接物被结合。在一些实施方案中，药物与多肽结合亚基通过共价结合物结合，所述多肽结合亚基具有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的多肽的结合位点。例如，药物组合物可以是一种药物结合物或药物融合物。在其它实施方案中，药物组合物包含一种药物和结合亚基，其具有与提高体内血清半衰期的多肽特异结合的多肽的结合位点，并通过非共价结合物被结合，而药物组合物是一种非共价药物结合物。

在特定的实施方案中，此应用是为了制备药物，药物包括药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，其中的药物结合所述的多肽结合亚基，增加所述药物的活性(在体内的活性)。在这些实施方案中，优选地，药物组合物的活性比这里描述的药物的活性更大。

在优选的实施方案中，多肽结合亚基具有与血清白蛋白结合的特异性。在特殊的优选实施方案中，多肽结合亚基是具有特异与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段。

与血清白蛋白结合抗体的抗原-结合片段

本发明的药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物包括(如一种或更多)与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段。抗原-结合片段能够特异结合施用药物结合物或药物融合物的动物中的血清白蛋白。优选地，抗原-结合片段具有结合人血清白蛋白的特异性。但是，兽医学上的应用将是预期的，并且抗原-结合片段能特异结合来源于希望动物的血清白蛋白，如来源于狗，猫，马，母牛，小鸡，绵羊，猪，山羊，貂及类似物。在某些实施方案中，抗原-结合片段特异结合来源于多于一种物种的血清白蛋白。如，正如这里描述的，特异结合大鼠血清白蛋白和小鼠血清白蛋白的人dAbs，和一种特异结合大鼠、小鼠和人血清白蛋白的dAbs已被制备。(表1和图7)这种dAbs具有使用相同药物结合物或药物融合物作临床前和临床研究的优势，从而避免使用其它合适药物融合物或药物结合物替代物作临床前研究的需要。

在发明中适合使用的抗原-结合片段包括，如，Fab片段，Fab’片段，F(ab’)₂片段，Fv片段(包括Fv(scFv)单链和二硫化物结合的Fv，一种单一可变区域，和dAbs(V_H，V_L)。这些抗原-结合片段可以使用合适的方法被制备，如使用胃蛋白酶，木瓜蛋白酶或其它具有切割特异性的蛋白酶将抗体进行蛋白质水解，或使用重组技术。如，通过使用合适的蛋白酶消化或使用DNA重组技术抗体制备Fv片段。如，编码轻链可变区域和重链可变区域的核酸可以被制备，其通过合适的多肽连接物连接，如2至大约20个甘氨酰基残基链。使用合适的技术(如，转染，转化，感染)，核酸可以被介导进入合适的宿主(如，E.coil)并且宿主可以在适合表达单链Fv片段的条件下培养。通过在自然终止子上游引入一个或更多终止密码子，可以用抗体基因制备多种抗体的抗原-结合片段。如，通过在编码重链hinge区域的序列的3’末端引入一种翻译终止子可以设计编码免疫球蛋白重链F(ab’)2部分的表达结构。本发明的药物结合物，非共价药物结合物和药物融合物包括与血清白蛋白结合的抗体单独重链和轻链或单独链的一部分(如，单一的V_H，V_k或V_λ)。

结合需要的血清白蛋白(如，人血清白蛋白)的抗体和其中的抗原-结合片段能从合适的天然的或人源化的抗体来源中选择，或在合适宿主中通过合适的免疫原的刺激而引发。如，通过使用血清白蛋白(如，分离的或纯化的人血清白蛋白)或血清白蛋白的肽(如，包含至少大约8，9，10，11，12，15，20，25，30，33，35，37，或40个氨基酸残基的肽)免疫合适的宿主(如，小鼠，人抗体-转基因小鼠，大鼠，兔子，小鸡，山羊，非-人的灵长类动物(如，猴))制备抗体。与血清白蛋白结合的抗体和抗原-结合片段也可以从重组抗体或抗原-结合片段库中选择，如噬菌体显示文库。这些文库包括抗体或抗体的抗原-结合片段，其包括天然的或人源化的氨基酸序列。如，文库包括包含人源化CDRs(如，任意氨基酸序列)和人结构区域的Fab片段。(见，如，美国专利第6300064号(Knappik等人)。)在其它例子中，文库包括在CDRs中有一种或多种序列差异的scFv片段或dAbs(单一的V_H，单一的V_k或单一的V_λ)。(见，如，WO99/20479(Tomlinson和Winter)，WO03/002609A2(Winter等人)，WO2004/003019A2(Winter等人)。)

合适的与血清白蛋白结合的抗体和其中的抗原-结合片段包括，如，人抗体和其中的抗原-结合片段，人源化抗体和其中的抗原-结合片段，嵌合抗体和其中的抗原-结合片段，啮齿动物(如，小鼠，大鼠)的抗体和其中的抗原结合片段，和单珠抗体(camelid)和其中的抗原-结合片段。在特定的实施方案中，药物结合物，非共价的药物结合物和药物融合物包括一种与血清白蛋白结合的camelidV_HH。Camelid V_HHs是免疫球蛋白单一的可变区域多肽，其来源于天然缺乏轻链的重链抗体。这些抗体出现在camelid种类中包括，骆驼，羊驼，单峰骆驼，和产于南美Andes山脉的骆马之类。V_HH分子比IgG分子小大约10倍，并且作为单一多肽，是非常稳定的且能抵制极端的PH和温度条件。合适的与血清白蛋白结合的Camelid V_HH包括于WO2004/041862(AblynxN.V.)和这里(图15和序列77-78)描述之中。在特定的实施方案中，结合人血清白蛋白的Camelid V_HH包括的氨基酸序列至少有80％，至少有85％，至少有90％，至少有95％，至少有96％，至少有97％，至少有98％，至少有99％的氨基酸序列与序列73，序列74，序列75，序列76，序列77，序列78，序列79，序列：80，序列81，序列82，序列83，序列84，序列85，序列86，序列87，序列88相一致。使用合适的序列队列运算法则和默认参数，如BLASTP可以测定氨基酸序列的一致性(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6)：2264-2268(1990))。

使用合适的技术可以制备免疫抗原，和多克隆和单克隆抗体产物。各种方法已经被描述。(见，如，Kohler等人的文献Nature，256：495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Milstein等人的文献Nature 266：550-552(1977)；Koprowski等人的美国专利第4172124号；Harlow，E.和D.Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold  Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY)；Current protocols In Molecular Biology，Vol.2(Supplement27，summer’94)，Ausubel，F.M.等人编辑的(JohnWiley&Sons：New York，NY)，11章(1991))。一般而言，通过将来源于永生细胞系(如，骨髓瘤细胞系如SP2/0，P3X63Ag8.653或骨髓瘤)的合适细胞与抗体-生产细胞融合可以制备杂交瘤细胞从而获得希望得到的单克隆抗体。抗体-生产细胞可以从人外围血或，优选地，脾或淋巴结，人-抗体转基因动物或其它合适经抗原免疫的动物中获得。生产人源抗体(如，人抗体)的细胞能用合适的方法制备，如，将人抗体-生产细胞和骨髓瘤或trioma细胞融合，或通过Epatein Barr病毒转染使活性人B细胞获得永生。(见，如，美国专利第6197582号(Trakht)；Niedbdala等人的文献Hybridoma，17：299-304(1998)；Zanella等人的文献JImmunol Methods，156：205-215(1992)；Gustafsson等人的文献Hum Antibodies Hybridomas，2：26-32(1991))。融合的或永生化的抗体-生产细胞(杂交瘤)能使用选择性培养基被分离，且通过有限稀释被克隆。细胞能使用合适的分析(如，ELISA)被鉴定，产生具有希望得到的特异性的抗体。

抗体也可以直接由分离的抗原-特异性抗体生产细胞(例如，来源于外围血或，优选地，脾或淋巴结的细胞，其产生具有希望特异性的抗体)制备，该细胞来源于经希望抗原免疫的人，人-抗体转基因动物或其它合适的动物。

当药物结合物，非共价药物结合物或药物融合物施用于人时，则与血清白蛋白结合(如，人血清白蛋白)的抗体或其中的抗原-结合片段是人，人源化的或嵌合的抗体或这些抗体的抗原-结合片段。这些抗体和抗原-结合片段的类型在人类中，具有较少的免疫原性或非免疫原性并且提供了广为人知的优势。如，由于对结合药物结合物或药物融合物的人抗体进行了加工，包含人，人源化的，或嵌合抗体的药物结合物，非共价药物结合物或药物融合物，能被重复施用于人体而功效损失较小或不损失(相对于其它完全的免疫原抗体)。当药物结合物，非共价药物结合物或药物融合物是给家畜施用时，能使用相似的抗体或抗原-结合片段。如，来源于鼠科动物或人抗体的CDRs能被移植入来源于希望的动物，如马或牛的结构区域。

人抗体和编码相同抗体的核酸可以来源于，如人或来源于人-抗体转基因动物。人-抗体转基因动物(如，老鼠)是能够产生人抗体全套文库的动物，如XENOMOUSE(Abgenix，Fremont，CA)，HUMAB-MOUSE，KIRIN TC MOUSE或KM-MOUSE(MEDAREX，Princeton，NJ)。一般而言，人-抗体转基因动物的基因组已经被改变，包括一个可以进行功能性调整的转移基因，其包括了来源于人免疫球蛋白位点的DNA。在人-抗体转基因动物中的内源性免疫球蛋白位点能被破坏或删除以除去动物产生由内源基因编码的抗体的能力。合适的制备人-抗体转基因动物的方法在本领域已被熟知。(见，如美国专利第5939598号和6075181号(Kucherlapati等人)，美国专利第5569825号，第5545806号，第5625126号，第5633425号，第5661016号和第5789650号(Lonberg等人)，Jakobovits等人的文献Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：551-2555 (1993)，Jakobovits等人的文献Nature，362：255-258(1993)，Jakobovits等人的WO98/50443，Jakobovits等人的WO98/24893，Lonberg等人的WO98/24884，Lonberg等人的WO97/13852，Lonberg等人的WO94/25585，Lonberg等人的EP0814259A2，Lonberg等人的GB2272440A，Lonberg等人的文献Nature 368：856-859(1994)，Lonberg等人的文献Int Rev Immunol 13(1)：65-93(1995)，Kucherlapati等人的 WO96/34096，Kucherlapati 等人的 EP 0463151B1 ，Kucherlapati等人的.EP0710719A1，Surani等人的美国专利第5545807号，Bruggemann等人的WO90/04036，Bruggemann等人的EP0438474B1，Taylor等人的文献Int.Immunol.6(4)579-591(1994)，Taylor等人的文献Nucleic Acids Research 20(23)：6287-6295(1992)，Green等人的文献Nature Genetics 7：13-21(1994)，Mendez等人的文献Nature Genetics 15：146-156(1997)，Tuaillon等，Proc Natl Acad Sci USA90(8)：3720-3724(1993)和Fishwild等人的文献Nat Biotechnol14(7)：845-851(1996)，前面的每一篇文献的主旨通过引证在此并入全文。)

使用合适的抗原(如，人血清白蛋白)免疫人-抗体转基因动物，并且通过传统的方法分离和融合抗体生成细胞形成杂交瘤。使用合适的分析(如，ELISA)能定具有希望特性(如，特异性，亲合性)的产生人抗体的杂交瘤，且如果有需要，可施用合适的培养技术进行挑选和亚克隆。

人源化抗体和其它CDR-移植抗体能使用合适的方法来制备。CDRs的一种CDR-移植抗体可以来源于与血清白蛋白结合(指供体抗体)的合适的抗体。其它合适CDRs的来源包括天然和人源化血清白蛋白-特异抗体，所述抗体来源于人或非人源如啮齿动物(如，小鼠，大鼠，兔)，小鸡，猪，山羊，非-人灵长类(如，猴)或一种文库。

人源化抗体的结构区域优选地起源于人，且可以来源于任何人抗体可变区域，该区域具有与供体抗体的抗原-结合区域的类似或相同区域(如，重链可变区域或轻链可变区域)相似的序列。起源于人的结构区域的其它来源包括人可变区域的标准序列。(见，如，Kettleboro μgh，C.A等人的文献Protein Engineering 4：773-783(1991)；Carter等人的WO94/04679；Kabat，E.A.等人的Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.GovernmentPrinting Office(1991))。CDR移植抗体的其它类型包括合适来源的结构区域，如由来源于马，牛，狗，猫等类似物的种系抗体基因片段编码的结构区域。

起源于人的结构区域能包括氨基酸的置换或交换，如“回复突变”，其用供给抗体相应位置的氨基酸残基替换来源于人或动物的结构区域的氨基酸残基。结构区域中可以发生一个或更多突变，包括一个或更多氨基酸的删除，插入和置换。变体可以通过各种合适的方法来制备，包括非人供体或受体人链的突变。(见，如，美国专利第5693762号(Queen等人)和第5859205号(Adair等人)，全部教导通过在此引证并入本文。)

抗体的恒定区域，抗体链(如，重链，轻链)或其片段或部分，如果存在，可以来源于任何合适的资源。如，人，人源化和特定嵌合抗体，抗体链(如，重链，轻链)或其片段或部分的恒定区域，如果存在，可以是起源于人并来源于任何合适的人抗体或抗体链。如，来源于人的恒定区域或其部分可以是来源于人的κ或λ轻链，和/或人γ(例如γ1，γ2，γ3，γ4)，μ，α(例如α1，α2)，δ或ε重链包括等位基因突变体。在特定的实施方案中，抗体或抗原-结合片段(如，来源于人的抗体，人抗体)能包括改变或裁剪功能(如效用功能)的氨基酸置换或替代。如，起源于人的恒定区域(如，γ1恒定区域，γ2恒定区域)能被设计从而减少补体的活性和/或Fc受体的结合。(见，如，美国专利第5648260号(Winter等)，5624821(Winter等)和5834597(Tso等)，整个教导通过在此引证并入本文。)优选地，包含这种氨基酸置换或替代的起源于人的氨基酸序列的恒定区域与来源于人的未改变的恒定区域的完整长度氨基酸序列至少有95％相同，优选地，与来源于人的未改变的恒定区域的完整长度氨基酸序列至少有99％相同。

人源化抗体，CDR移植抗体或人源化或CDR移植抗体的抗原-结合片段能使用任何合适的方法被制备。一些方法在本领域熟知。(见，如，美国专利第5225539号(Winter)，美国专利第5530101号(Qneen等人)。)人源化或CDR移植抗体的部分(如，CDRs，结构，恒定区域)能直接从合适的抗体中获得或起源(如，通过部分的全新合成)，或具有希望特性的编码抗体或其链的核酸能被制备或表达。为了制备链的一部分，一种或更多的终止密码子可以被介导入希望的位置。如，编码人源化的或CDR移植可变区域的核酸序列(如，DNA)能使用PCR突变的方法被构建以改变现有的DNA序列。(见，如，Kamman，M.，等人，Nucl.Acids Res.17：5404(1989)。)编码新的CDRs的PCR的引物能与先前的人源化可变区域的DNA模板杂交，该区域以相同的或非常相似的人可变区域为基础。(Sato，K.等人，CancerResearch53：851-856(1993))。如果不能获得用作模板的一种相似的DNA序列，则包含编码可变区域序列的核酸可以通过合成的寡核苷酸来构建(见，如，Kolbinger，F.，Protein Engineering8：971-980(1993))。编码一种信号肽的序列也能被整合进入核酸(如，合成，通过插入进入一种载体)。来源于受体抗体的天然信号肽序列，来源于其它抗体的信号肽序列或其它合适的序列可以被使用。(见，如，Kettleborough，C.A.，Protein Engineering 4：773-783(1991))。使用这些方法或其它合适的方法，能容易地制备突变体。在某一实施方案中，克隆的可变区域可以被突变，并且编码带有希望特性的序列可以被选择(如，来源于噬菌体文库；见，如，美国专利第5514548(Krebber等)和WO93/06213(Hoogenboom等))。

与血清白蛋白结合的抗体或抗原-结合片段可以是一种嵌合抗体或嵌合抗体的抗原-结合片段。嵌合抗体或其抗原-结合片段包括一种来源于某一物种的可变区域(如，小鼠)和至少来源于其它物种(如，人)的恒定区域的一部分。嵌合抗体或嵌合抗体的抗原-结合片段能使用任何合适的方法来制备。一些合适的方法是本领域熟知的。(见，如，美国专利第4816567号(Cabilly等)，美国专利第5116946号(Capon等)。

获得与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段的优选方法包括从抗原-结合片段的全部集合中选择特异结合期望血清白蛋白的抗原-结合片段(如，scFvs，dAbs)。如，正如这里描述，结合血清清单蛋白的dAbs能从合适的噬菌体显示文库中选择。许多合适的细菌噬菌体显示文库和选择方法(如，单价的显示系统和多价的显示系统)已经被描述。(见，如，Griffiths等，美国专利第6555313B1(在此通过参考被整合)；Johnson等，美国专利第5733743(通过在此引证并入本文)；McCaffetty等，美国专利第5969108(通过在此引证并入本文)；Mulligan-Kehoe，美国专利第5702892(通过在此引证并入本文)；Winter，G等，Annu.Rev.Immunol.12：433-455 (1994)；Sounillion，P等，Appl.Biochem.Biotechnol.47(2-3)：175-189(1994)；Castagnoli，L.等，Comb.chem.High Throughput Screen，4(2)：121-133(2001)；WO99、20749(Tomlinson and Winter)；WO 03/002609 A2(Winter等)；WO 2004/003019A2(Winter等)。)在一种细菌噬菌体文库中显示的多肽能用任何合适的细菌噬菌体显示，如丝状噬菌体(如，fd，M13，F1)，溶解性噬菌体(如T4，T7，lambda)，或RNA噬菌体(如，MS2)，并选取那些与血清白蛋白(如，人血清白蛋白)结合的多肽。

一般而言，可以使用显示作为带有合适的噬菌体外壳蛋白的融合蛋白多肽全套文库的噬菌体文库。这种文库可以使用任何合适的方法被制备，如介导编码显示抗体或其抗原-结合片段的噬菌体载体或噬菌体展示载体的文库进入合适的宿主细菌，培养这些细菌以产生噬菌体(如，使用合适的辅助噬菌体或补充噬菌体)。使用合适的方法，如沉淀和离心，噬菌体文库可以从培养物中收集。

文库包括包含任何氨基酸序列差异的抗体或其抗原-结合片段的全套文库。如，全套文库可以包含抗体或其抗原-结合片段的氨基酸序列，其对应于期望物种的自然产生的抗体的氨基酸序列，和/或包括一种或更多任意或随机氨基酸序列区域(如，CDR序列)。在这种基因组或文库中的抗体或其抗原-结合片段包括任意或随机氨基酸序列区域和普通氨基酸序列区域。在特定的实施方案中，基因组中的所有多肽是抗体的抗原-结合片段的期望类型(如，人V_H或人V_L)。如，在基因组中，每一多肽可以包括V_H，V_L或Fv(如，Fv单链)。

使用合适的方法，氨基酸序列的差异能被介导入抗体或其抗原-结合片段的希望区域。例如，通过使用合适的突变方法(如，低保真度PCR，寡核苷酸-介导的或位点直接突变，使用NNK代码造成的多样化)或任何合适的方法制备编码多样化的抗体或其抗原-结合片段的核酸文库，氨基酸序列差异可以被介导入目标区域，如抗体可变区域的补充决定区域。如果希望，多样化的抗体或其抗原-结合片段的区域可以是任意的。

合适的噬菌体显示文库能用于选择与血清白蛋白结合并具有其它有益特性的抗体或抗原-结合片段。如，当未折叠时，抵制聚合的抗体或抗体结合片段能被选择。聚合受多肽浓度的影响并在许多时候从部分折叠或展开的媒介中出现。有助于部分折叠媒介的因素和条件，如提高的温度和较高的多肽浓度，促进不可逆的聚合。(Fink，A.L.，Folding & Design 3：R1-R23(1998)。)如，以浓缩的形式存储纯化的多肽，如以冻干的产物形式，经常导致至少部分多肽的不可逆聚合。在生物体系表达的多肽产物，如E.coli，经常导致包含体的形式，其包含了聚合多肽。对于生物产物体系来说，从包含体收集活性多肽将是非常困难的且需要增加额外的步骤，如重新折叠步骤。

当加热时，可可逆地抵制聚合和展开的抗体和抗原-结合片段能从合适的噬菌体显示文库中被选择。一般而言，包括显示抗体或其抗原-结合片段的全套文库的噬菌体显示文库被加热至至少有部分的显示抗体或其抗原-结合片段达到展开的温度(Ts)，然后被冷却至一种温度(Tc)，(其中Ts＞Tc，)由此至少抗体或其抗原-结合片段的部分已经被重新折叠并且多肽的部分已经被聚合。然后，可逆地展开及结合血清白蛋白的抗体或其抗原-结合片段在Tr的温度下被恢复。收集的可逆地展开的抗体或其抗原-结合片段有一个解链温度(Tm)，且优选地，全套文库被加热至Ts，冷却至Tc且可逆地展开的抗体或其抗原-结合片段在Tr被分离，在这里Ts＞Tm＞Tc，且 Ts＞Tm＞Tr。一般而言，噬菌体显示文库被加热至大约80℃且在选择前，冷却至室温或大约4℃。通过用具有可逆展开能力的残基代替一定的氨基酸残基，可以设计或制造可逆地展开并抵制聚合的抗体或其抗原-结合片段。选择和设计或制造可逆地展开的抗体或其抗原-结合片段的方法的详细描述，(见，WO2004/101790(Jespers等)，和美国临时专利申请第60/470340号(归档在2003，5，14)和第60/554021号(归档在2004，3，17)。WO2004/101790和两个美国临时专利申请的教导通过在此引证并入本文。

可逆地展开和抵制聚合的抗体或其抗原-结合片段提供了某些优势。如，由于它们抵制聚合，使用合适的生物生产体系，如E.coil，通过表达，能容易地以高产的可溶性蛋白形式制备可逆地展开的抗体或抗原-结合片段。此外，可逆地展开和抵制聚合的抗体或其抗原-结合片段能以比传统的多肽更高的浓缩形式存在和/或存储，且带有更少的聚合和活性丢失。DOM7h-26(序列号：20)是可逆展开的人V_H。

优选地，与血清白蛋白结合的抗体或抗原-结合片段包括一个可变区域(V_H，V_k，V_λ)，其中的一种或更多的结构区域(FR)包括(a)人结构区域的氨基酸序列，(b)人结构区域的氨基酸序列的至少8个相邻的氨基酸，或(c)编码人抗体基因片段的氨基酸序列，其中所述的结构区域被称为Kabat。在特定的实施方案中，一种或更多结构区域的氨基酸序列与由人抗体基因片段编码的相应的结构区域的氨基酸序列相同，或一种或更多结构区域的氨基酸序列与由人抗体基因片段编码的相应的结构区域的氨基酸序列有5个氨基酸的不同。

在其它实施方案中，FR1，FR2，FR3，FR4的氨基酸序列与由人抗体基因片段编码的相应结构区域的氨基酸序列相同，或FR1，FR2，FR3，FR4的氨基酸序列与由人抗体基因片段编码的相应结构区域的氨基酸序列有10个氨基酸的不同。在其它实施方案中，所述的FR1，FR2，FR3，的氨基酸序列与由所述的人抗体基因片段编码的相应结构区域的氨基酸序列相同。

在特殊的实施方案中，与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段包括基于人种系序列的免疫球蛋白的可变区域(如，(V_H，V_L)，和具有一个或更多个多变化的区域，如补充决定区域。V_H的合适的人种系序列包括，如，由V_H基因片段DP4，DP7，DP8，DP10，DP31，DP33，DP45，DP46，DP47，DP49，DP50，DP51，DP53，DP54，DP65，DP66，DP67，DP68，DP69编码的序列，和JH片段JH1，JH2，JH3，JH4，JH5，和JH6。V_L的合适的人种系序列包括，如，由Vk基因片段DPK1，DPK2，DPK3，DPK4，DPK5，DPK6，DPK7，DPK8，DPK9，DPK10，DPK12，DPK13，DPK15，DPK16，DPK18，DPK19，DPK20，DPK21，DPK22，DPK23，DPK24，DPK25，DPK26和DPK28编码的序列，和J_κ片段J_κ1，J_κ2，J_κ3，J_κ4，和J_κ5。

在特定的实施方案中，药物结合物，非共价药物结合物或药物融合物不包括小鼠，大鼠和/或兔子的与血清白蛋白结合的抗体或这种抗体的抗原-结合片段。

抗原-结合片段能以任何希望的亲合力，亲和速率和解离速率与血清白蛋白结合。亲和力(KD)，亲和速率(k_on或k_a)和解离速率(k_off或k_d)能够被选取以获得希望的特定药物的血清半衰期。如，可以得到药物的最大血清半衰期，其抑制慢性炎症疾病的发炎媒介(如，结合和抑制炎症细胞因子的dAb)，尽管有某些毒性药物希望有较短的半衰期(如，化学疗法的药物)。

一般而言，对于与血清白蛋白结合，快速的亲和速率和一种快速或中等速度的解离速率是优选的。当被施用后，带有这些特性的包含一种抗原-结合片段的药物结合物和药物融合物将快速与血清白蛋白结合，并且又快速地与血清白蛋白解离和重新结合。这些特性将降低药物的快速清除(如，通过肾)，但是仍然保证了药物靶标的高效传输和分布。

与血清白蛋白(如，dAb)结合的抗原-结合片段通常的结合亲和力为大约1nM至500uM。在某些实施方案中，与血清白蛋白结合的抗原-结合片段的KD(KD＝K_off(kd)/K_on(ka)的结合亲和力为大约10至100nM，或100nM至500nM，或500nM至5mM，如由表面胞质基因共振所测(如，用BIACORE仪器)。在特殊的实施方案中，药物结合物，非共价的药物结合物或药物融合物包括与血清白蛋白结合的抗体和抗体(如，dAb)的抗原-结合片段，其与血清白蛋白(如，人血清白蛋白)结合的KD值为大约50nM，或70nM，或100nM，或150nM或大约200nM。这里描述的具有改良的制药学上的特性的(如，延长的t1/2β，增加的AUC)药物结合物，非共价药物结合物和药物融合物可以和结合血清白蛋白的抗原-结合片段的亲和力相关。因此，具有改良的制药学上的特性的药物结合物，非共价药物结合物和药物融合物可以使用与血清白蛋白(如，人血清白蛋白)具有高结合亲和力(如，KD为大约500nM或更少，大约250nM或更少，大约100nM或更少，大约50nM或更少，大约10nM或更少，或大约1nM或更少，或大约100pM或更少)的抗原-结合片段来制备。

优选地，与结合血清白蛋白的抗原-结合片段共扼或融合的药物，结合其靶标(药物靶标)的亲和力(KD)比与血清白蛋白结合的抗原-结合片段的亲和力更强和/或K_off(kd)比与血清白蛋白结合的抗原-结合片段的K_off值更快，如由表面胞质基因共振所测(如，使用BIACORE仪器)。例如，结合其靶标的药物的亲和力可以比SA与结合SA的抗原-结合片段的亲和力强大约1至100,000，或大约100至100,000，或1000至100,000，或10,000至100,000倍。例如，结合SA的抗体的抗原-结合片段的结合亲和力大约为10uM，而结合靶标的药物的亲和力大约为100pM。

在特殊的实施方案中，与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段是一种结合人血清白蛋白的dAb。如，可以从由序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26组成的组中选择的VkdAb，或，可以从由序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22，和序列号：23组成的组中选择的V_H dAb。在其它实施方案中，与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段是结合人血清白蛋白的dAb，其包含任何前述的氨基酸序列的CDRs。在其它实施方案中，与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段是结合人血清白蛋白的dAb且包含的氨基酸序列至少有80％，或至少有85％，或至少有90％，或至少有95％，或至少有96％，或至少有97％，或至少有98％，或至少有99％的氨基酸序列与序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25，序列号：26，序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22或序列号：23相同。使用合适的序列队列运算法则和默认参数，如BLASTP(Karlin and Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(6)：2264-2268(1990))可以优选的测定氨基酸序列的一致性。

药物

本发明的特定的药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物)可以包括任何通过结合和/或改变个体中生物靶标分子的作用被施用入个体并产生有利的治疗或诊断作用的药物(如，小有机分子，核酸，多肽)。本发明的其它药物组合物(如，药物融合物)包括一种多肽或肽药物。在药物融合物的优选的实施方案中，药物不包括抗体链或抗体链的片段(如，V_H，V_κV，V_λ)。

在本发明中使用的合适的药物包括，如，免抑抑制药物(如，环孢霉素A，雷帕霉素，FK506，强的松)，抗病毒药物(阿昔洛韦，更昔洛韦，英地纳韦)，抗生素(青霉素，美满霉素，美满霉素，四环素)，抗-炎症药物(阿斯匹林，异丁苯丙酸，强的松)，细胞毒素或细胞药物(如，紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，土根碱，丝裂霉素c，依托泊甙，长春新碱，长春碱，秋水仙素，阿霉素，柔红霉素，二羟基炭疽菌素，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-二氢睾酮，糖皮质激素类，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，嘌呤霉素，和与任何前述药物类似或相当的药物。合适的药物也包括抗代谢物(如，氨甲蝶呤，6-巯基嘌呤，6-硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，5-氟脲嘧啶，氮烯咪胺)，烷基化药物(如，氮芥，硫代苯丁酸氮芥，CC-1065，苯丙氨酸氮芥，卡氮芥(BSNU)，环己亚硝脲(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲菌素，丝裂霉素C，和顺铂(II)(DDP)cisplatin)，蒽环类(如，柔红霉素(柔毛霉素前体)和阿霉素)，抗生素(如，放线菌素d(放线菌素前体)，博来霉素，光辉霉素，和氨茴霉素(AMC))，放射性物质(如，碘-125，-126)钇(如，钇-90，-91)和镨(如，镨-144，-145)，和蛋白酶抑制剂(如，基质金属蛋白酶的抑制剂)。其它合适的药物是核酸如反义核酸和RNAi。卡里奇霉素也可以用于发明中。

合适的药物也包括镇痛剂药物，其包括麻醉品(如，甲基吗啡，吗啡，钠洛酮，芬太尼，哌替啶，吗啡，曲马多，丙氧芬，羟可酮，美散痛，纳布啡)，非甾体抗-炎症药物(如，消炎痛，酮咯酸，奥湿克，布洛芬，萘普生，水杨酸盐，塞莱昔布，罗非昔布)，醋氨酚，辣椒辣素，齐考诺肽(ziconotide)，等类似物。

在特定的实施方案中，药物是多肽毒素，如，一种毒素如相思豆毒素，篦麻毒素A，假单胞菌外毒素，或白喉毒素。其它合适的多肽药物包括抗体或抗体的抗原-结合片段(如dAb)，多肽增效剂，催化剂，促分泌素，拮抗剂或抑制剂。如，多肽或肽药物能结合和增效或拮抗细胞表面蛋白，如CD抗原，细胞因子受体(如，白介素受体，趋化因子受体)，粘着分子或共刺激分子。如，多肽药物能结合一种细胞因子，生长因子，细胞因子受体，生长因子受体和其它靶标亚基，其包括但不非限制于：ApoE，Apo-SAA，BDNF，心肌营养素-1CEA，CD40，CD40亚基，CD56，CD38，CD138，EGF，EGF受体，ENA-78，嗜酸粒细胞趋化因子，嗜酸粒细胞趋化因子-2，Exodus-2，FAPα，酸性FGF，碱性FGF，纤维原细胞生长因子-10，FLT3亚基，Fractalkine(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-β1，人血清白蛋白，胰岛素，IFN-γ，IGF-I，IGF-II，IL-1α，IL-1β，IL-1受体，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8(72.a.a.)，IL-8(77a.a.)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，胰岛素α，胰岛素β，IP-10，角化细胞生长因子-2(KGF-2)，KGF，瘦素，LIF，淋巴细胞趋化因子，Mullerian抑制物质，单核细胞群落抑制因子，单核细胞引诱蛋白，M-CSF，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MIG，MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，骨髓起源的抑制因子-1(MPIF-1)，NAP-2，神经营养蛋白，神经生长因子，β-NGF，NT-3，NT-4，制瘤素M，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1α，SDF1β，SCF，SCGF，干细胞因子(SCF)，TARC，TGF-α，TGF-β，TGF-β2，TGF-β3，肿瘤坏死因子(TNF)，TNF-α，TNF-β，TNF受体I，TNF受体II，TNIL-1，TPO，VEGF，VEGFA，BEGFB，BEGFC，VEGFD，VEGF受体1，VEGF受体2，VEGF受体3，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-β，GRO-γ，HCC1，1-309，HER1，HER2，HER3，HER4。这种列表是决非穷尽的。

合适的药物也包括激素，包括垂体激素(PTH)，促肾上腺皮质的激素(LHRH)，促性腺激素-释放激素(GnRH)，黄体激素(LH)，促卵泡激素(FSH)，醛固酮等类似物。合适的药物也包括角化细胞生长因子，干扰素(如，IFN-α，IFN-β，IFN-γ)，促红细胞生成素(EPO)，蛋白酶，酯酶，LHRH类似物，增效剂和拮抗剂，阿片肽受体增效剂，如kappa阿片肽受体增效剂(如，强啡肽 A)，降血钙素和降血钙素类似物，抗利尿激素(后叶加压素)，催产素拮抗剂，血管活性的肠的多肽，凝血酶抑制剂，血管性血友病因子，表面活性剂和蜗牛毒液(如，ziconotide)。

合适的药物也包括具有抗-癌活性(如，增殖抑制，生长抑制，细胞凋亡包括，转移抑制，粘着抑制，新生血管形成抑制)的肽和多肽，其。一些这种肽和多肽为本领域所知。(见，如，Janin Y.L.，Amino Acids，25：1-40(2003)。该文献的教导，尤其是其中描述的肽和多肽，通过在此引证并入本文。)一些这种肽的氨基酸序列出现在表8中。

其它合适的药物包括具有抗-病毒活性的肽和多肽。一些这样的肽和多肽在本领域所熟知，如，在Giannecchini，等，J Viro.，77(6)：3724-33(2003)；Wang，J.，等，Clin Chem(2003)；Hilleman，M.R.，Vaccine，21(32)：4626-49(2003)；Tziveleka，L.A.，等，Curr Top Med Chem，3(13)：1512-35(2003)；Poritz，M.A.，等，Virology，313(1)：170-83(2003)；Oevermann，A.，等，Antiviral Res，59(1)：23-33(2003)；Cole，A.M.等，Curr Pharm Des，9(18)：1463-73(2003)；Pinon，J.D.，等，Virol，77(5)：3281-90(2003)；Sia，S.K.，等，Proc Natl Acad Sci USA，99(23)：14664-9(2002)；Biochem J，66(pt3)：863-72(2002)；de Soultrait，V.R.，et al，J MolBiol，18(1)：45-58(2002)；Witherell，G.，Curr Opin InvestingDrugs，2(3)：340-7(2001)；Ruff，M.R.，等，Antiviral Res，52(1)：63-75(2001)；Bultmann，H.，等，J.Virol，75(6)：2634-45(2001)；Egal，M.，等，Int J Antimicrob A Gents，13(1)：57-60(1999)；和Robinson，W.E.，Jr.，J Leukoc  Biol，63(1) ：94-100(1998)中描述的肽和多肽。这些参考文献的全部内容，尤其是这里描述的肽和多肽，通过在此引证并入本文。这些肽和多肽是能用于目前发明的药物组合物，药物融合物，药物结合物，非共价药物结合物的例子。

多肽药物也可以包括细胞因子或生长因子或受体的可溶性部分(如，细胞因子受体，生长因子受体，激素受体)或其它如上面所列的多肽。如，合适的多肽药物也可以包括受体(如，生长因子受体，细胞因子受体，激素受体)增效剂和拮抗剂，如，白介素1受体拮抗剂(Eisenberg等，Nature 343：341-346(1990))，凝血生成素受体增效剂(如，GW395058(de Serres等，Stem Cells17：316-326(1999))，黑色素皮质素受体拮抗剂(如，MCR-4拮抗剂(Cepoi等，Brain Res.1000：64-71(2004))，anginex，6DBF7(Mayo等，J.Biol.Chem.278：45746-45752(2003))，趋化因子模拟物(如，RANTES模拟物(Nardese等，Nat.Struct.Biol.8：611-615(2001))，生长激素(如，人生长激素)，生长激素类似物和生长激素促泌剂(如，CP-424391(MacAndrew等，Eur.J.Pharmacol.432：195-202(2001))，生长激素释放激素模拟物(如，MK-677(Chapman等，J.Clin.Endocrinol.Metab.82：3455-3463(1997))，细胞粘着分子相互作用抑制剂 (如，LFA-1/ICAM-1，VLA-1/VCAM-1(Yusuf-Makagiansar等，Med.Res.Rev.22：146-167(2002))，干扰素模拟物(如，SYR6(Sato等，Biochem.J.371(Pt.2)：603-608(2003)，赫赛汀模拟物(NatureBiotechnol.18：137(2000))，抗原表达抑制剂(Bolin等，J.Med.Chem.43：2135-2148(2000))，GPIIB/IIIA拮抗剂(如，FK633(Aoki等，Thromb.Res.81：439-450(1996))，alphaVbeta3拮抗剂(如，SC56631(Engleman等，J.Clin.Invest.99：2284-2292(1997))，促红细胞生成素模拟物(如，EMP1(Johnson等，Biochemistry37：3699-3710(1998))，阿片受体拮抗剂(如，〔(2S，3R)-TMT1〕DPDPE(Liao等，J.Med.Chem.41：4767-4776(1998))，造血因子(如，)促红细胞生成素(EPO)，粒细胞群落刺激因子(GM-CSF))。

另外的合适的肽和多肽药物包括结合人IL-1受体1型的肽拮抗剂(如，AF11377(FEWTPGYWQPYALPL，序列号：56)，AF11869(FEWTPGYWQJYALPL，序列号：57(J＝1-氮杂环丁二烯-2-羧酸)，FEWTPGYWOJY(序列号：58)，FEWTPGWYQJY(序列号：59)，FEWTPGWYQJYALPL(序列号：60)，或任何包括酰化的氨基末端和/或氨化羧基末端的随意前述序列(Akeson等，J.Biol.Chem.271：30517-305123(1996))，TNF-alpha-介导的细胞毒性的肽拮抗剂(如，在Chirinos-Rojas等人的文献J.Immunol.161：5621-5626(1998)中描述的)，促红细胞生成素受体的肽增效剂(如，在McConnel等，Biol.Chem.379：1279_1286(1998)或Wrighton等，Science 273：458-464(1996)中描述的)，胰高血糖素-类似多肽-1(GLP-1(7-37)，GLP-1(7-36)氨基化合物和其类似物(见，如，Ritzel U.等，J.Endocrinology 159：93-102(1998))，和干扰素(如，INFα，INFβ，INFγ)。另外合适的多肽和肽药物包括整联蛋白抑制剂(如，RGD肽，如H-Glu[cyclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)]₂(Janssen，M.L.等，Canner Research62：6146-6151 (2002))，cyclo (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys)(Haubner，R.，等，J.Nucl.Med.42：326-336(2001)，核糖体-失活蛋白(RIPs)如皂角毒(如，序列号：67)，基质金属蛋白酶抑制剂(如，美国专利第5616605号)，和抗病毒肽和多肽，如HIV融合抑制剂(如，T-1249和T-20(FUZEON(enfuvirtide)；Trimeris Inc.)，和可溶性受体拮抗剂如免疫粘着剂(如，LFA3-Ig，CTLA4-Ig)。

抗菌多肽和肽药物也适用于本发明。合适的抗菌多肽和肽药物的例子包括adenoregulin，人汗腺抗菌肽(dermcidin-1L)，杀菌肽(如，杀菌肽-类似物肽，人-LL-37/Hcap-18)，防御素类，包括α-防御素类(如，人嗜中性粒细胞肽1(HNP-1)，HNP-2，HNP-3，HNP-4，人防御素5，人防御素6)，β-防御素类(如，人β-防御素-1，人β-防御素-2)，和θ-防御素类(如，θ-防御素-1)，富组蛋白(如，富组蛋白1，富组蛋白3，富组蛋白5)，乳铁蛋白肽-来源的肽和相关肽(见，Tomita M.，等，Acta Paediatr.Jpn.36：585-591(1994)和Strom，M.B.，等Biochem Cell Biol.80：65-74(2002))。

药物融合物

发明的药物融合物是包括一种连续的多肽链的融合蛋白，所述的链包括与血清白蛋白结合作为第一亚基的抗体的抗原-结合片段，其与作为第二亚基的多肽药物连结。第一和第二亚基可以通过肽结合物相互直接地结合，或通过一个合适的氨基酸或肽或多肽连接物连接。另外的亚基(如，第三，第四)和/或连接物序列可以适当地出现。第一亚基可以位于N-末端，C-末端或第二亚基(即，多肽药物)的内部。在特定的实施方案中，每一亚基的出现可以多于一个拷贝。如，药物融合物可以包括两个或更多第一亚基，每一亚基包括与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段(如，结合人血清白蛋白的V_H和结合人血清白蛋白的V_L或两种或更多结合人血清白蛋白的V_Hs或V_Ls)。

在某些实施方案中，药物融合物是一种连续的多肽链，其公式如下：

a-(X)_n1-b-(Y)_n2-c-(Z)_n3-d或a-(Z)_n3-b-(Y)_n2-c-(X)_n1-d；

其中X是对第一靶标具有结合特异性的一种多肽药物；

Y是对血清白蛋白具有结合特异性的抗体的单链抗原-结合片段；

Z是对第二靶标具有结合特异性的多肽药物；

a，b，c和d分别是包括约1-100个氨基酸残基的多肽或缺失；

n1是1至大约10；

n2是1至大约10；和

n3是0至大约10，

附加条件：当n1和n2都为1而n3为零时，X不包括抗体链或抗体链的片段。

在某一实施方案中，X和Z都不包括抗体链或抗体链的片段。在某一实施方案中，n1为1，n3为2，n2为2，3，4，5，6，78，或9。优选地，Y是对血清白蛋白具有结合特异性的免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或Y是对血清白蛋白具有结合特异性的免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)。更优选地，Y是结合人血清白蛋白的dAb(如，V_H，V_k，或V_λ)。在特殊的实施方案中，X或Z是人IL-1α或人IL-1ra的功能性变体。

在特定的实施方案中，Y包括从序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26组成的组中选择的氨基酸序列。在其它实施方案中，Y包括从序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22和序列号：23组成的组中选择的氨基酸序列。

在其它实施方案中，药物融合物包括亚基X’和Y’，其中X’是一种多肽药物，附加条件为X不包括抗体链或抗体链的片段；并且Y’是对血清白蛋白具有结合特异性的抗体的单链抗原-结合片段。优选地，Y’是对血清白蛋白具有结合特异性的免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或Y’是对血清白蛋白具有结合特异性的免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)。更优选地，Y’是结合人血清白蛋白的dAb(如，V_H，V_k，或V_λ)。X’可以位于Y’的氨基末端，或Y’可以位于X’的氨基末端。在某些实施方案中，X’和Y’被氨基酸分离，或被包含两个至大约100个氨基酸的肽或多肽连接物分离。在特殊的实施方案中，X’是人IL-1ra或人IL-1ra的功能性变体。

在特定的实施方案中，Y’包括从序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26组成的组中选择的氨基酸序列。在其它实施方案中，Y’包括从序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22和序列号：23组成的组中选择的氨基酸序列。

在特殊的实施方案中，药物融合物包括与血清白蛋白结合的dAb和人IL-1ra(如，序列号：28)。优选地，dAb结合人血清白蛋白并包含人结构区域。

在其它实施方案中，药物融合物或药物结合物包括的人IL-1ra功能性变体至少有大约80％，或至少有大约85％，或至少有大约90％，或至少有大约95％，或至少有大约96％，或至少有大约97％，或至少有大约98％，或至少有大约99％的氨基酸序列与人IL-1ra的成熟的152个氨基酸形式和人白介素-11型受体拮抗剂相同。(见，Eisenberg等，Nature 343：341-346(1990)。)突变体包括一个或更多个另外的氨基酸(如，包括153或154或更多氨基酸)。本发明的药物融合物可以用任意合适的方法来制备。如，在某些实施方案中可以通过在合适的表达载体中插入编码药物融合物的核酸来制备。作为结果的结构随后被介导入合适的细胞用于表达。表达后，使用合适的方法，融合蛋白可以从细胞溶解产物，或优选地从培养基或外周胞质中分离或纯化。(见，如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F.M.等，eds.，Vol.2，Suppl.26，pp.16.4.1-16.7.8(1991))。

合适的表达载体可以包括许多成分，如，复制起点，选择性标记基因，一种或更多表达控制元件，如，转录控制元件(如，启动子，增强子，终止子)和/或一种或更多翻译信号，信号序列或前导序列，等类似物。如果存在，载体或其它资源可以提供表达控制元件和信号序列。如，编码抗体链的克隆核酸的转录和/或翻译控制序列能用于指导表达。

启动子能用于在希望的宿主细胞中进行表达。启动子可以是结构型的或诱导型的。如，启动子可以与编码抗体，抗体链或其部分的核酸相连，从而指导核酸的转录。各种合适的原核启动子(如，lac，tac，E.coli的T3，T7启动子)和真核启动子(如，肉瘤病毒40的早期或晚期启动子，Rous肉瘤病毒长末端重复启动子，细胞巨化病毒启动子，腺病毒晚期启动子)可以通过购买得到。

此外，典型地，表达载体包括一种用于选择带有载体的宿主细胞的选择性标记，在载体为可复制的表达载体情况下，包括一个起点或复制点。编码抗菌或药物抗性产物的基因是普遍的可选择性标记并可以用于原核(如，内酰胺酶基因(氨苄青霉素抗性)，针对四环素抗性的Tet基因)和真核细胞(如，新霉素(G418或geneticin)，gpt(霉酚酸)，氨苄青霉素，或潮霉素抗性基因)。吲哚满还原酶标记基因允许在各种宿主中选择氨甲蝶呤。编码宿主营养缺陷型标记的基因产物的基因(如，LEU2，URA3，HIS3)经常在酵母中作为选择性标记。使用病毒(如，杆状病毒)或噬菌体载体，和能够整合进入宿主细胞基因组的载体，逆转录酶病毒载体，也是预期的。合适的在哺乳动物细胞和原核细胞(E.coli)，昆虫细胞(果蝇Schnieder S2细胞，Sf9)和酵母(P.methanolica，P.pastoris，S.cerevisiae)中表达的表达载体在本领域熟知。

正如这里描述的，提供了表达一种药物融合物的重组宿主细胞和制备药物融合物的方法。重组宿主细胞包括编码药物融合物的重组核酸。药物融合物可以通过在合适的宿主细胞中表达编码蛋白的重组核酸来制备，或使用其它合适的方法。如，这里描述的表达结构可以被介导进入合适的宿主细胞，而结果细胞在合适于结构表达的条件下被维持(如，在培养，在动物中)。合适的宿主细胞可以是原核的，包括细菌细胞如E.coli，B.subtilis和/或其它合适的细菌，真核的，如真菌或酵母细胞(如，毕氏酵母，黑曲霉菌株，酿酒酵母菌，裂殖酵母体系，粗糙脉孢菌)，或其它低等的真核细胞，和高等真核细胞如来源于昆虫的宿主细胞(如，Sf9昆虫细胞(WO 94/06087(O’Connor)或哺乳动物(如，COS细胞，如COS-1(ATCC编目号CRL-1650)和COS-7((ATCC编目号CRL-1651)，CHO(如，ATCC编目号CRL-9096)，293(ATCC编目号CRL-1573)，HeLa(ATCC编目号CRL-2)，CV1(ATCC编目号CRL-70)，WOP(Dailey等，J.Virol.54：739-749(1985))，3T3，293T(Pear等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，90：8392-8396(1993))，NSO细胞，SP2/0，HuT78细胞，和类似物(见，如，Avsubel，F.M.等，eds.Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley&Son Inc.，(1993)。

本发明也包括制备药物融合物的方法，包括在适合于药物融合物表达的条件下维持本发明的重组宿主细胞的方法。方法可以进一步包括药物融合物分离或收集的步骤。在另一实施方案中，药物融合物的成分(如结合人血清白蛋白的dAb和IL-1ra)通过化学聚集以创建连续的多肽链。

结合物

在另一方面，本发明提供的结合物包括与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段，其用于结合药物。这种结合物包括“药物结合物”，所述药物结合物包括与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段，其与一种药物共价结合，和“非共价药物结合物”，所述非共价药物结合物包括与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段，其与一种药物非共价结合。优选地，结合物非常稳定从而与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段和药物在体内(如，当进入人体时)仍然相互结合(无论是共价地或非共价的)。优选地，不多于大约20％，不多于大约15％，不多于大约10％，不多于大约9％，不多于大约8％，不多于大约7％，不多于大约6％，不多于大约5％，不多于大约4％，不多于大约3％，不多于大约2％，不多于大约1％或没有结合物在体内分离或分解释放药物和抗原-结合片段。如，在“体内”的稳定性可以通过在血清中(如，人血清)在37℃下连续24小时孵育药物结合物或非共价的药物结合物而方便地评估。在这样的方法的某一例子中，相等数量的药物结合物和未结合药物被稀释在两瓶不同的血清中。每瓶的一半的内容物被速冻于-20℃，另一半在37℃下连续24小时孵育。通过合适的方法，如SDS-PAGE和/或Westernblotting，分析四个样本。使用结合药物的抗体，可以探测Westernblotting。如果没有分离，在药物结合物通道中的所有药物停留于药物结合物的大小上。许多其它合适的方法能用于评估“体内”的稳定性，如，使用合适的分析方法如，色谱(如，凝胶过滤，离子交换，倒相)，ELISA，质谱分析法和类似的方法，分析通过上面描述的方法制备的样本。

药物结合物

在另一方面，本发明提供的药物结合物包括对血清白蛋白具有结合特异性的抗体的抗原-结合片段，和共价地结合所述抗原-结合片段的药物，附加条件：药物结合物不是单独的连续多肽链。

在某些实施方案中，药物结合物包括一种对血清白蛋白具有结合特异性的免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或一种对血清白蛋白具有结合特异性的免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)和一种共价地结合所述V_H或V_L的药物，附加条件：药物结合物不是单独的连续多肽链。优选地，药物结合物包括与血清白蛋白结合的独立的V_H或与血清白蛋白结合的独立的V_L。在特定的实施方案中，包括结合人血清白蛋白的dAb的V_k和包括从序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26组成的组中选择的氨基酸序列。在其它实施方案中，药物结合物包括结合人血清清单蛋白的dAb的V_H和从序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22，和序列号：23组成的组中选择的氨基酸序列。

药物结合物可以包括任何希望的药物并可使用任意合适的方法制备。如，药物可以结合与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段，所述片段直接地或通过一种合适的连接物在一个或更多个位置，如氨基-末端，羧基-末端或通过氨基酸侧链间接地结合。在某一实施方案中，药物结合物包括一种结合人血清白蛋白的dAb和一种多肽药物(如，人IL-1ra或人IL-1ra的功能性变体)，并且多肽药物的氨基-末端(如，人IL-1ra或人IL-1ra的功能性变体)直接地或通过合适的连接物亚基结合dAb的羧基-末端。在其它实施方案中，药物结合物包括结合人血清白蛋白的dAb和共价结合dAb的两种或更多种不同药物。如，第一种药物可以被共价地(直接或间接)结合至dAb的羧基-末端而第二种药物可以被共价地(直接或间接)结合至氨基-末端或通过侧链氨基酸组(如，赖氨基的ε氨基酸组)结合。这种药物结合物可以使用熟知的选择性耦合的方法被制备。(见，如，Hermanson，G.T.，Bioconj μgate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)。)

可以使用多种将药物与特异结合血清白蛋白的抗体的抗原-结合片段结合的方法。选择的特定方法依赖于被结合的药物。如果需要的话，包含末端功能性基团的连接物能被用于抗原-结合片段和药物的连接。一般而言，包含一种反应功能性基团(或被修饰以包含一种反应的功能性基团)的药物通过一种连接物或直接与结合血清白蛋白的抗体的抗原-结合片段接触完成结合过程。在适当的条件下，包含(或被修饰以包含)一种化学亚基或功能性基团的药物与第二种化学基团反应，从而形成一种共价结合。如果希望，合适的化学反应基团能通过任何合适的方法加入抗原-结合片段或一种连接物。(见，如，Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)。)在本领域已知许多合适的反应性化学基团化合物，如氨基能与亲电子基团如甲苯磺酸盐，mesylate，卤素基团(氯，溴基，氟代，碘代)，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)，等类似物反应。硫基能与马来酰亚胺，碘乙酰，丙烯基邻甲苯基，氮苯基二硫化物，5-硫醇-2-硝基安息香酸(TNB-thiol)，等类似物反应。醛功能基团耦合氨基-或肼-包含分子，而叠氮基能与三价磷基团反应形成氨基磷酸酯或磷酸酰亚胺连接的。介导活性基团进入分子的合适的方法被本领域所知(见如，Hermanson，G.T.，Bioconj μgateTechniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)。

在某些实施方案中，通过两个硫醇的反应形成二硫化合物连接，使对血清白蛋白具有结合特异性的抗体的抗原-结合片段与药物结合。在其它实施方案中，通过磷酸酰亚胺基团和伯胺形成异硫脲连接，使对血清白蛋白具有结合特异性的抗体的抗原-结合片段与药物结合。

合适的连接分子可以是线性的或分支型的，并包括如，四甘醇，C₂-C₁₂亚烃基，-NH-(CH₂)_P-NH-或-(CH₂)_P-NH-(其中p是1-12)，-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH-CH-NH-，包括1-100(尤其是1-12)个氨基酸和类似物的多肽链。

非共价药物结合物

某些非共价键(如，氢键，范德华键)能产生稳定的，高特异的分子间连接。如，通过在补充结合部分之间多价的非共价连接获得的分子识别相互作用，成为许多重要的生物相互作用基础，如使酶与底物的结合，抗体与抗原的识别，亚基结合受体，和多肽和肽的稳定三维结构。因此，这种弱的非共价相互作用(如，氢键，范德华健)能被用于对血清白蛋白有结合特异性的抗体的抗原-结合片段与药物的相互结合。

优选地，连接抗原-结合片段和药物的非共价键是足够稳定的以至于其在体内仍保持相互结合(如，当被注射进入人体)。通常，连接抗原-结合片段和药物的非共价键的强度大约是10¹⁰M^-1。在特殊的实施方案中，非共价键的强度大约是10¹¹M^-1，大约是10¹²M^-1，大约是10¹³M^-1，大约是10¹⁴M^-1，大约是10¹⁵M^-1。已知在生物素和抗生物素蛋白之间及生物素和抗生蛋白链菌素之间的这种相互作用是非常有效的且在许多条件下十分稳定，且正如这里描述的在生物素和抗生物素蛋白之间和生物素和抗生蛋白链菌素之间的这种相互作用能被用于制备本发明的非共价药物结合物。

非共价键能在对血清白蛋白有结合特异性的抗体的抗原-结合片段与药物之间直接地形成，或能在合适的补充结合部分之间形成(如生物素和抗生物素蛋白之间或生物素和抗生蛋白链菌素之间)，其中某一部分共价地结合药物而补充结合部分共价地结合抗原-结合片段。当补充结合部分被使用时，某一结合部分能直接或通过合适的连接亚基共价地结合药物，而补充结合部分能直接或通过合适的连接亚基共价地结合与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合部分。

补充结合配对是选择性地相互结合的分子对。许多补充结合配对被本领域所知，如，抗体(或其抗原-结合片段)和其同类的抗原或表位，酶和其底物，及受体和其配基。优选的补充结合配对是生物素和抗生物素蛋白，及生物素和抗生蛋白链菌素。

针对特异结合血清白蛋白的抗原-结合片段或药物的补充结合对的成员，其直接或间接共价结合可以通过上述方法被制备，如，通过使用或不使用连接物将补充结合部分与结合血清白蛋白的抗体的抗原-结合片段反应，该补充结合部分包括一种反应功能基团(或被修饰以包含反应功能基团)。特殊方法的选择依赖于被结合的化合物(如，药物，补充结合配对，与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段)。如果需要的话，包含末端反应的功能基团的连接(如，同型双功能基化合物连接，异型双功能基化合物连接)可以被用于抗原-结合片段和/或药物与补充结合配对的连接。在某一实施方案中，包含两个明显反应亚基的异型双功能基化合物连接能被使用。异型双功能基化合物连接能被选择以至于某一反应亚基可以与对血清白蛋白有结合特异性的抗体的抗原-结合片段或药物反应，而其它的反应亚基可以与补充结合部分反应。任何合适的连接(如异型双功能基化合物连接)能被使用并且许多这种亚基被本领域所知且可通过商业途径购得(如，Pierce Biotechnology，Inc.IL)。

组合物及治疗和诊断的方法

提供了包括本发明的药物组合物的组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，包括制药学上的或生理学上的组合物(如，人和/或兽用药)。制药学或生理学组合物包括一种或更多药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，及制药学或生理学可接受载体。典型地，这些载体包括水的或酒精/水的溶液，乳液或悬浮液，包括盐和/或带缓冲的媒介。肠道外的媒介包括氯化钠溶液，Ringer’葡萄糖，葡萄糖和氯化钠和Ringer’s乳酸盐。合适的生理学-可接受的辅剂，如果需要保持多肽复合物的悬浮剂的形式，可以选择如羧甲纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，凝胶和藻酸盐等增稠剂。静脉内介质包括流动的和有营养的补充物和电解补充物，如基于Ringer’s的葡萄糖。也可以存在防腐剂和其它添加剂，如抗菌剂，抗氧化剂，鳌合药物和惰性气体(Mack(1982)Remington’s PharmaceuticalSciences，16th Edition)。

组合物可以包括一种希望数量的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。如，组合物可以包含大约5％-大约99％重量的药物结合物，非共价药物结合物或药物融合物。在特殊的实施方案中，组合物可以包括大约10％-大约99％，大约20％-大约99％，大约30％-大约99％，大约40％-大约99％，大约50％-大约99％，大约60％-大约99％，大约70％-大约99％，大约80％-大约99％，大约90％-大约99％，大约95％-大约99％重量的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)。在某一例子中，组合物是冷冻干燥(冻干的)。

这里描述的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，典型地用于阻止，抑制或治疗炎症情况(如，急性和/或慢性的炎症疾病)，如慢性阻塞性肺炎(如，慢性支气管炎，慢性阻塞性支气管炎，肺气肿)，过敏的超敏性，癌，细菌或病毒感染，肺炎，如细菌性肺炎(如，由葡萄球菌引起的肺炎))，自体免疫疾病(其包括，但不限于，I型糖尿病，多元硬化病，关节炎(如，骨关节炎，风湿性关节炎，少年风湿性关节炎，银屑病关节炎，狼疮性关节炎，脊柱关节病(如，强直性脊柱炎)，系统性红斑狼疮，肠内炎症疾病(如，Crohn’s疾病，溃疡性结肠炎)，Behcet’s综合症和重症肌无力)，子宫内膜异位，牛皮癣，腹腔粘连(如，腹腔手术后遗症)，哮喘，和感染性休克。这里描述的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，能被用于阻止，抑制或治疗疾病，如慢性或急性外伤疾病，慢性或急性神经疾病，急性或慢性肌与骨骼疾病，慢性或急性癌症及类似疾病。这里描述的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，能作为诊断的目的而被使用。

使用这里描述的药物组合物(如，药物结合物，非共价的药物结合物，药物融合物)，能阻止，抑制或治疗癌症，包括淋巴瘤(如，B细胞淋巴瘤，急性骨髓淋巴瘤，Hodgkin’s淋巴瘤，非-Hodgkin’s淋巴瘤)，骨髓瘤(如，多元骨髓瘤)，肺癌(如，小细胞肺癌，非-小细胞肺癌)，直肠癌，头和颈癌，胰腺癌，肝癌，胃癌，胸癌，卵巢癌，膀胱癌，白血病(如，急性骨髓性白血病，慢性骨髓性白血病，急性淋巴细胞的白血病，慢性淋巴细胞的白血病)，腺癌，直肠癌，造血癌(如，骨髓增生异常综合症，骨髓及外骨髓增殖的疾病(如，真性红血球增多症，原发性血小板增多症，先天性骨髓纤维变性)，及类似疾病。

这里描述的药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)也合适用于阻止，抑制或治疗子宫内膜异位，纤维症，不育性，早产，勃起功能障碍，骨质疏松症，糖尿病(如，II型糖尿病)，生长疾病，HIV感染，呼吸疾病综合症，肿瘤和遗尿。

在本申请中，术语“阻止”包括在疾病感染之前施用保护组合物。“抑制”指在感染事件发生后，但是在临床疾病出现之前，施用组合物。“治疗”包括在疾病症状明显后施用保护组合物。

用于筛选保护或治疗疾病的药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)的效用的动物模型可购买得到。在易感老鼠中测试系统性红斑狼疮(SLE)的方法被本领域所知(Knight等(1978)J.Exp.Med.，147：1653；Reinersten等(1978)New Eng.J.Med.，299：515)。通过引入其它物种的可溶性AchR蛋白而诱导产生疾病，在SJL/J雌鼠中测定Myasthenia Gravis(MG)。(Lindstrom等(1988)Adv.Immunol.，42：233)。通过注射II型胶原质在易感小鼠种类中诱导产生关节炎(Surart等(1984)Ann.Immunol.42：233)。通过注射分枝杆菌热休克蛋白在易感大鼠中诱导佐剂性关节炎的模型已经被描述(Van Eden等(1988)Nature，331：171)。治疗骨关节炎的效率可以在通过关节内注射胶原酶诱导产生关节炎的鼠科模型中被评估(Blom，A.B.等，Oateoarthritis Carlilage 12：627-635(2004)。正如描述的，通过施用甲状腺球蛋白在小鼠中诱导产生甲状腺炎(Maron等(1980)J.Exp.Med.，152：1115)。胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)可以自然发生或能在特定的小鼠种类中诱导，如由Kanasawa等(1984)Diabetologia，27：113中描述的。EAE在小鼠和大鼠中作为在人中的MS的模型。在这种模型中，通过施用髓鞘碱性蛋白诱导神经脱髓鞘疾病(见，Paterson(1986)Texbook of Immunopathology，Mischer等，eds.，Grune and Stratton，New York，pp.179-213；McFarlin等(1973)Science，179：478：and Satoh等(1987)J.Immunol.，138：179)。

本发明的药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)可以作为单独药物施用或和其它药物联合使用。包括各种免疫治疗药物，如，cylcosporine，氨甲蝶呤，阿霉素，顺铂，免疫毒素和类似物。制药学组合物可以包括各种细胞毒素或其它与本发明的药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)联合的药物的“混合”物，或根据目前发明的包括不同药物的药物组合物((如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)的合并。

根据任何合适的技术，药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)可以被施用入任何个人或病人。依赖于药物组合物和治疗的疾病或情况不同，用药的不同途径包括，如，口服，饮食，局部，透皮，直肠的，注射(如，静脉内的，动脉内的，肌肉内的，皮下的，皮内的，腹膜内，胸内，动脉内注射)，吸入(例如，支气管内，鼻腔或口腔内吸入，鼻内点滴)。正如需要，给药可以是局部的或全身的。给药的优选的模式依赖于药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)的选择，和治疗情况(如，疾病)可以是不同的。给药的剂量和频率依赖于年龄，性别和病人的条件，协同注射的其它药物，禁忌症和其它临床医生考虑的参数。药物组合物的治疗有效剂量(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)被施用。治疗有效剂量是在给药条件下获得希望的治疗效果的剂量。

这里定义的术语“主体”或“个体”包括动物，如哺乳动物，包括，但不限于，灵长目(人)，牛，绵羊，山羊，马，狗，猫，兔子，豚鼠，大鼠，小鼠或其它牛，羊，马，犬，猫，啮齿目的或鼠科物种。

药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)能作为中性组合物或盐被施用。通过与合适的有机或无机酸，如氯化氢，溴化氢，醋酸，高氯酸等类似物反应，组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)的盐包括胺或其它能获得的碱性基团。带有季铵基团的化合物也含有抗阴离子剂如，氯化物，溴化物，碘化物，醋酸盐，高氯酸盐等类似物。包含羧酸或其它酸性功能基团的化合物的盐类可以通过与合适的基团，如，羟基反应来制备。酸性功能基团的盐含有抗阴离子剂如钠，钾等类似物。

本发明也提供了给主体(如病人)施用药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)的试剂盒，包括药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)，药物输送装置和，可选择地，使用说明书。药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)可以某种形式提供，如冻干形式。在特定的实施方案中，药物输送装置从注射器，吸入器，鼻内的或眼睛的给药装置(如，mister，眼睛或鼻子的点滴器)，和无针注射装置组成的组中选择。

本发明的药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)能被冻干存储且在使用前在合适的容器中复溶。任何合适冻干的方法(如，喷雾干燥，原丝烘干)和/或复溶技术都可以被使用。本领域的技术人员认为冻干和复溶可以导致抗体活性不同程度的丢失(如，传统的免疫球蛋白，IgM抗体比IgG抗体的活性丢失更多)且不得不通过调整使用水平而获得补偿。在特殊的实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包括如这里描述的一种冻干的药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)。优选地，冻干的药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)在复溶时，丢失的活性不多于20％，或不多于25％，或不多于30％，或不多于35％，或不多于40％，或不多于45％，或不多于50％(如针对血清白蛋白的结合活性)。活性是在药物组合物冻干前需要产生效果的药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)的剂量。如，药物结合物或药物融合物在希望的时期内需要取得或维持希望的血清浓度的剂量。在冻干前任何合适的方法可以用于测定药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)的活性，且在复溶后使用相同的方法测定活性以测得丢失的活性的数量。

包括药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)或其混合物的组合物能被用药从而起到预防和/或治疗的作用。在特定的治疗应用中，在给药的情况下，被选细胞群足够起到预期治疗或预防效果的剂量，如至少局部阻止，抑制，调控，杀死，或其它可测参数，被定义为“治疗-有效数量或剂量”。需要取得的这种剂量的数量依赖于疾病的严重程度和病人自身免疫系统的普通状态和健康情况，但是大致的范围从大约10μg/kg至大约80mg/kg，或大约每千克重含0.005至5.0mg的药物结合物或药物融合物，0.05至2.0mg/kg/dose的剂量是被普遍使用的。如，本发明的药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)可以每天(如，每天4次注射)，每两天，每三天，一周两次，一周一次，两周一次，一个月一次，或两个月一次，按10μg/kg-80mg/kg，大约100μg/kg-80mg/kg，大约1mg/kg-80mg/kg，大约1mg/kg-70mg/kg，大约1mg/kg-60mg/kg，大约1mg/kg-50mg/kg，大约1mg/kg-40mg/kg，大约1mg/kg-30mg/kg，大约1mg/kg-20mg/kg，大约1mg/kg-10mg/kg，大约10μg/kg-10mg/kg，大约10μg/kg-5mg/kg，大约10μg/kg-2.5mg/kg，大约1mg/kg，大约2mg/kg，大约3mg/kg，大约4mg/kg，大约5mg/kg，大约6mg/kg，大约7mg/kg，大约8mg/kg，大约9mg/kg，大约10mg/kg的剂量被注射。

在预防应用中，包括药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)或其混合物的组合物也可以以相似的或稍低的剂量给药。根据目前的发明，包括药物组合物(如，药物结合物，非共价药物结合物，药物融合物)的组合物可以用于预防和治疗以帮助改变，钝化，杀死或清除哺乳动物中的选择性靶标细胞。

实施例

白介素1受体拮抗剂(IL-ra)是一种通过竞争抑制IL-1与白介素-1型1受体(IL-1R1)的结合来阻止IL-1的生物活性的拮抗剂。炎症刺激和包括发炎和免疫学反应的各种生理性反应的调节能诱导IL-1产生。IL-1具有的活性范围包括软骨的降解和骨骼再吸收的刺激。在风湿性关节炎病人中，局部产生IL-1的数量被提高并且自然出现IL-1ra的水平是不足以竞争这些反常增加的数量。有一些对RA有用的治疗方法，包括疾病调节风湿病药(DMARDS)如，氨甲蝶呤，和生物制剂如KINERET(anakinra，Amgen Inc)。

KINERET(anakinra，Amgen Inc)是一种重组物，由153个氨基酸组成并具有17.3kilodaltons分子量，是人白介素-1受体拮抗剂的非糖基化形式。(KINETET(anakinra，Amgen Inc)对应于在自然出现的IL-1ra中的152个氨基酸和额外的N-末端的甲硫氨酸。)在对一种或多种DMARDs失效的18岁或更大年龄的病人中，KINERET(anakinra，Amgen Inc)被用来减少严重风湿性关节炎的征兆和病症程度。剂量为每天单剂量皮下注射100mgs。T_β1/2为4-6小时并且在14-28天71％病人在注射部位具有反应。

我们在这里示范了一种血清-清蛋白结合物dAb与治疗多肽相连接形成的化合物，其(i)具有与治疗多肽相似的活性(ii)也与血清白蛋白结合。而且，目前的发明提供了一种方法来制备更长血清半衰期的治疗多肽，如我们将血清白蛋白结合物dAb与IL-1ra相连产生的化合物的半衰期长于单独的IL-1ra。

实施例1结合小鼠，大鼠和人血清白蛋白的区域抗体的选择

这个实施例解释了针对血清白蛋白的单独区域抗体(dAb)的制备方法。描述了针对小鼠血清白蛋白(MSA)，人血清白蛋白(HSA)和大鼠血清白蛋白(RSA)的dAb的选择。

如在W02004/003019A2中所描述选择针对小鼠血清白蛋白的dAbs。使用了三种人噬菌体显示抗体文库。每一文库基于单独的人V_H(V3-23/DP47和J_H 4b)或Vk(o12/o2/DPK9和J_κ)结构，其与补充决定区域(CDR1，CDR2，CDR3)合并的侧链上带有由NNK密码子编码的差异。

文库1(V_H)：

差异位置：H30，H31，H33，H35，H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H97，H98。

文库位置：6.2×10⁹

文库2(V_H)：

差异位置：H30，H31，H33，H35，H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H97，H98，H99，H100，H100A，H100B。

文库位置：4.3×10⁹

文库3(Vk)：

差异位置：L30，L31，L32，L34，L50，L53，L91，L92，L93，L94，L96

文库位置：2×10⁹

V_H和V_k文库已经通过预选分别结合基因亚基蛋白A和蛋白L，因此在选择文库中大部分的克隆是有功能的。上面所示的文库的大小对应于预选后的大小。

使用独立文库进行血清白蛋白的两轮选择。对于每一选择，抗原被包被在100μg/ml的4mlPBS免疫管中。在第一轮选择中，三种文库的每一文库针对HSA(Sigma)或MSA(Sigma)被单独地包被。在第二轮选择中，从第一轮选择的六种噬菌体被包被，针对(i)相同的抗原(如，第一轮的MSA，第二轮的MSA)和(ii)针对相互作用的抗原(如，第一轮的MSA，第二轮的HSA)结果产生第二轮选择的12种结果。在每一例子中，在第二轮的选择后测试48种克隆与HSA和MSA的结合。可溶的dAb片段正如由Harrison et al，Methods Enzymol.1996；267：83-109所描述作为scFv片段被制备，并且随后进行标准的ELISA方案(Hoogenboom等1991)Nucleic Acids Res.，19：4133)，除了使用的2％tween PBS作为抑制缓冲液，及用蛋白质L-HRP(Sigma)(针对VkS)和蛋白A-HRP(Amersham Pharmacia Biotech)(针对V_HS)测定结合的dAbs。

一种高于背景的信号显示了与MSA，HSA或其两者结合的dAbs，将以可溶的形式结合塑料并在ELISA中被测试，但其所有都是血清白蛋白特异的。克隆通过测序(见表1)揭示21种唯一的dAb序列被鉴定。在选择的VkdAb克隆之间，氨基酸水平最小的相似性为86.25％((69/80)×100；当所有的各种残基是不同的结果，如克隆24和34)。在选择的V_HdAb克隆之间，氨基酸水平最小的相似性为94％(127/136)×100)。

下面，结合dAbs的血清白蛋白被测试其从溶液中捕获生物素化抗原的能力。ELISA方案(如上所述)随后被执行，除了ELISA板包被了1μg/ml的蛋白L(针对V_k克隆)和1μg/ml蛋白A(针对V_H克隆)。按照方案，可溶的dAb从溶液中被捕获，并用生物素标记的MSA或HSA和链霉亲和素标记的HRP测定。以每血清白蛋白分子获得平均2个生物素为目标，根据制造商的方案制备生物素化的MSA和HSA。通过ELISA测定了捕获溶液中生物素化MSA的24个克隆。这些中的两个克隆(克隆2和38)同时捕获HSA。接着，dAbs被测试其与包被在CM5 biacore芯片上的MSA结合的能力。在biacore上，八种克隆被发现结合MSA。

正如先前所描述的针对抗-MSA的dAbs，针对人血清白蛋白和大鼠血清白蛋白的dAbs被选择，除了下面方案的修正：合成的V_H区域的噬菌体文库是文库4G，其基于包含DP47种系基因和J_H4片段的人V_H3。下面特异位点的差异通过突变(使用NNK密码子；根据Kabat标号)而引入，如CDR1：30，31，33，35；CDR2：50，52，52a，53，55，56；和CDR3：4-12的各种残基：如H95，H96，H97，和H98在4GH11和H95，H96，H97，H98，H99，H100，H100a，H100b，H100c，H100d，H100e和H100f在4GH19。最后的3种CDR3残基是FDY因此CDR3的长度的变化范围为7-15残基。文库包括了＞1×10¹⁰种独立的克隆。

V_H和V_k文库的子集已经被预选分别结合种属配基蛋白A和蛋白L，因此在未选择的文库中大多数的克隆是功能性的。上述显示的文库的大小与预选后的大小相应。

分别使用V_H和V_k文库的亚类对大鼠和人血清白蛋白进行两轮选择。对于每一选择，抗原可以(i)以100μl/ml浓度溶于4mlPBS并包被于免疫管(nunc)中，或(ii)被生物标记并随后被生物素珠(第一步)和抗生物素蛋白珠(第二步)捕获，用于可溶形式的选择。(见表1用于分离每个克隆的选择策略的详细描述。)在每一例子中，在第二轮选择后，24个噬菌体克隆被测试其结合HSA或RSA的能力。

在其中的一轮选择中，在噬菌体ELISA中，如果克隆的大部分是阳性，则来源于这一选择的DNA被克隆进入表达载体制备可溶性dAb，且挑选单个克隆。按Harrison等描述的制备scFv片段(Methods Enzymol.1996；26783-109)的方法，制备可溶性dAb片段并且随后执行标准的ELISA方案(Hoogenboom等(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133)，除了使用2％的TWEEN PBS作为封闭缓冲液及用抗-myc-HRP测定结合的dAbs。在ELISA中呈阳性的克隆，随后使用BIACORE表面细胞质基因组共振仪(Biacore AB)筛选结合MSA，RSA或HSA的克隆。结合MSA，RSA或HSA的dAbs被进一步研究。克隆随后被测序并且唯一的dAb序列被鉴定。

表1.结合血清白蛋白的dAbs的选择方案

dAb	文库	第一轮选择	第二轮选择	Biacore结合
					DOM7r-1	4G Vk	10微克/毫升管RSA	10微克/毫升管RSA	RSA
DOM7r-3	4G Vk	10微克/毫升管RSA	10微克/毫升管RSA	RSA
					DOM7r-4	4G Vk	10微克/毫升管RSA	10微克/毫升管RSA	RSA，MSA
DOM7r-5	4G Vk	10微克/毫升管RSA	10微克/毫升管RSA	RSA
					DOM7r-7	4G Vk	10微克/毫升管RSA	10微克/毫升管RSA	RSA，MSA
DOM7r-8	4G Vk	10微克/毫升管RSA	1O微克/毫升管RSA	RSA，MSA
					DOM7h-1	4G Vk	10微克/毫升管HSA	10微克/毫升管HSA	HSA
DOM7h-2	4G Vk	100nM可溶性HSA	50nM可溶性HSA	HSA

DOM7h-3	4G Vk	10微克/毫升管HSA	10微克/毫升管HSA
					DOM7h-4	4G Vk	10微克/毫升管HSA	10微克/毫升管HSA
DOM7h-6	4G Vk
					DOM7h-7	4G Vk
DOM7h-8	4G Vk	200nM可溶性HSA	50nM可溶性RSA	HSA，RSA，MSA
					DOM7r-13	4G Vk	200nM可溶性HSA	50nM可溶性RSA	RSA，MSA
DOM7r-14	4G Vk	200nM可溶性HSA	50nM可溶性RSA	RSA，MSA
					DOM7h-21	4G VH	100μg/mlHSA管	100μg/mlHSA管	HSA
DOM7h-22	4G VH	100μg/mlHSA管	100μg/mlHSA管	HSA
					DOM7h-23	4G VH	100μg/mlHSA管	100μg/mlHSA管	HSA
DOM7h-24	4G VH	100μg/mlHSA管	100μg/mlHSA管	HSA
					DOM7h-25	4G VH	100μg/mlHSA管	100μg/mlHSA管	HSA
DOM7h-26	4G VH	100μg/mlHSA管	10μg/mlHSA管	HSA
					DOM7h-27	4G VH	100μg/mlHSA管	10μg/mlHSA管	HSA

与BIACORE芯片上(Biacore AB)的血清白蛋白结合的dAbs被进一步分析以获得关于亲合力的信息。分析通过使用包被了血清白蛋白的CM5芯片(羧甲基右旋糖苷基质)进行。流动细胞1是未包被的，封锁的阴性对照，流动细胞2被HSA包被，流动细胞3被RSA包被而流动细胞4被MSA包被。使用BIACORE包被液，血清白蛋白被固定在PH为5.5的醋酸盐的缓冲液中，达到500共振单位(Rus)包被材料的目标。每一感兴趣的dAb在200ml-500ml的E.coli周质中表达，且用PH为2.2的氨基乙酸和PBS交换缓冲液洗脱，对V_Hs使用蛋白质A-streamline亲合树脂(Amersham，UK)，对Vk_s使用蛋白质L-琼脂糖亲合树脂(Affitech，Norway)从上清中分离分批吸收。通过在BIACOREHBS-EP缓冲液中稀释并流经BIACORE芯片，制备一系列浓度的dAb(在5nM至5uM范围)。

在KD的范围内浓缩dAb获得数据，亲合力(KD)将通过数据的亲和速率和解离速率曲线的相称性从BIACORE数据中计算。测定对血清白蛋白有不同亲合力的dAbs。针对HSA的DOM7h-8，针对HSA的DOM7h-2，针对RSA的DOM7r-1的亲合力在10-100nM范围内。针对HSA的DOM7h-7，针对RSA的DOM7h-8，针对HSA的DOM7h-26的亲合力在100-500nM范围内。针对HSA的DOM7h-23，针对HSA的DOM7h-1的亲合力在500nM-5uM范围内。实施例的数据包括在图6A-6C中。

实施例2.制备带有IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)的抗-血清白蛋白抗体融合蛋白

本实施例表述了制备包含IL-1ra和结合血清白蛋白的dAb的融合蛋白的方法。制备两种融合蛋白，一种在dAb N-末端带有IL-1ra(MSA16IL-1ra)和一种在dAb C-末端带有IL-1ra(IL-1raMSA16)。融合蛋白的序列和载体在图2C和2D中显示。同时也制备不结合MSA的对照融合蛋白，其序列在图2E中显示。

KINERET(anakinra，Amgen Inc)具有4-6小时的短半衰期，推荐剂量要求称为每日注射。这种要求导致71％的案例在14-28天中产生注射位点反应。因此，具有较长血清半衰期的人IL-1ra的形式是有利的并且能提高功效和降低剂量频率。这些都是制药学希望的特性。

克隆

简要地，正如下面描述，设计两种多克隆位点(MCSs)并且插入带有T7启动子的表达载体中。设计限制性位点用于插入IL1-ra，dAb，GAS引导序列和连接物。其中一种(MCS1+3)编码带有IL-1ra dAb N末端的蛋白而另一(MCS 2+4)编码带有IL-1ra dAb C末端的蛋白。

dAbIL1-ra融合蛋白的克隆位点1+3

NdeI，stuffer，SalI，stuffer，XhoI，BamHI

gcgcatatgttagtgcgtcgacgtcaaaaggccatagcgggcggccgctgcaggtctcgagtgcgatggatcc(序列号：35)

IL-1ra dAb融合蛋白的克隆位点2+4

NdeI，stuffer，StUI，SacI，sutffer，SalI，NotI，TAA TAA BamHI

Gcgcatatgttaagcgaggccttctggagagagctcaggagtgtcgacggacatccagatgacccaggcggccgctaataaggatccaatgc(序列号：36)

使用合适的限制性内切酶剪切MCS及连接编码引导序列的退火启动子，GAS引导序列被插入每一表达载体。接着，编码连接子的连接DNA以相似的方式被插入。从一种cDNA克隆通过PCR获得编码IL-1ra的DNA(使用经设计增加所需限制性位点的引物)且被插入TOPO克隆载体。通过核酸测序确定正确的序列后，从TOPO载体切离编码IL-1ra的DNA且连接入包含引导序列和连接物的载体。最后，通过SalI/NotI对片段(通过凝胶纯化提纯)和载体酶切，从dAb表达载体切离编码dAb的DNA并插入载体中。

表达和纯化

MSA16IL 1-ra，IL1-ra MSA16和dummyIL-1ra在E.coli周质表达，并使用蛋白质L-琼脂糖亲合树脂(Affitech，Norway)用PH为2.2的氨基乙酸洗脱，从上清中分批吸收纯化。在考马斯染色后，通过SDS-PAGE凝胶电泳分析纯化dAbs。对于一种蛋白质(IL-1raMSA16)，＞90％的蛋白质具有预期的大小因此不用进一步纯化被即可进行活性分析。其它蛋白质(MSA16IL1-ra和dummyIL-1ra)受较小的条带污染且需在PH为9的RESOURSEQ离子交换柱上通过FPLC离子交换色谱进一步提纯。使用0-500mM线性盐梯度的NaCl洗脱蛋白。在SDS-PAGE凝胶电泳后，含有预期大小蛋白质的片段被结合从而产生纯度＞90％的结合部分。这种蛋白被用于进一步的纯化。

实施例3.在体外测定IL1-ra融合蛋白的活性

MRC-5 IL-8分析

MSA16IL-1ra融合蛋白被测试其中和在MRC-5细胞中由IL-1引发的IL-8分泌的能力(ATCC Accession No.CCL-171；American Type Culture Collection，Manassas，VA)。该方法由Akeson，L.et al (1996) Journal of Biological Chemistry27130517-30523描述的方法调整而来，其介绍了在HUVEC中由IL-1引发的IL-8的分泌，使用MRC-5细胞替代HUVEC细胞系。简要地，将MRC-5细胞置于微孔板中，和dAbIL-1ra融合蛋白或作为对照的IL-1ra，和IL-1(100pg/ml)一起孵育过夜。孵育后吸出细胞上清且通过夹心ELISA测量IL-8的浓度。(R&DSystems)。

IL-1ra在融合蛋白中的活性导致IL-8分泌的减少。由于MSA16IL-1ra融合蛋白的活性和IL-1ra MSA16融合蛋白的活性引起的IL-8分泌的减少将与IL-1ra对照(重组体人IL-1ra，R&Dsystems)的引起的减少进行对比。每一测试蛋白质的中和剂量50(ND₅₀)被测定并且显示在表2中。

表2

蛋白质	中和剂量50
		IL-1ra	0.5nM
MSA16IL-1ra	2nM
		MSA16IL-1ra MSA16	8nM

结果表示，IL-1ra保留了作为带有抗-血清白蛋白dAb的融合结构的部分活性。MSA16IL-1ra蛋白质被进一步研究以评估其药物代谢动力学(PK研究)。

血清白蛋白，抗IL-1ra夹心ELISA

测试三种dAb/IL-1ra融合蛋白结合血清白蛋白的能力并同时通过单克隆抗-IL1ra抗体测定。被测试的融合蛋白是MSA16IL-1ra，IL-1ra MSA16和dummyIL-1ra。简要地，ELISA板用10μg/ml的大鼠血清白蛋白包被过夜，用0.05％Tween PBS洗脱5次，然后用4％Marvel PBS封闭1小时。封闭后，板用0.05％Tween PBS洗脱5次，然后用4％MPBS稀释的每种dAb IL-1ra融合蛋白孵育1小时。每一融合蛋白在1uM及7个连续的4倍稀释(如，至60pM)浓度时被孵育。在孵育后，板用0.05％TweenPBS洗脱5次，然后根据制造商推荐的稀释度，以4％MPBS稀释的针对人IL-1受体拮抗剂(Abcam，UK)的兔多克隆抗体(ab-2573)稀释液孵育1小时。孵育之后，板被用0.05％Tween PBS洗脱5次，且用4％MPBS进行1/2000稀释的二抗(抗-兔IgG-HRP)稀释液孵育1小时。用二抗孵育后，板用0.05％TweenPBS洗脱3次并用PBS洗脱2次，然后用50ul每孔的TMB微孔过氧化物底物(KPL，MA)反应并用50ul每孔的HCL终止反应。在450nM读取吸收值。

在超过2×背景水平的夹心ELISA中以1uM浓度测定MSA16IL-1ra和IL-1raMSA16蛋白。MSA16IL-1ra蛋白在2×或更高背景水平以低至3.9nM的稀释液测定，而IL-1raMSA16蛋白在2×背景水平以低至500nM的稀释液测定。据报道，由于对照结构(dummyIL-1ra)不结合血清白蛋白，结合血清白蛋白的MSA16IL-1ra融合蛋白对血清白蛋白是特异的。

实施例4.在小鼠PK研究中测定药物融合物的血清半衰期

A.在小鼠中测定结合MSA的dAb/HA表位标记融合蛋白的血清半衰期

结合MSA的dAb/HA表位标记融合蛋白在E.coli周质中表达，使用蛋白质L-琼脂糖亲合树脂(Affitech，Norway)并且用PH为2.2的氨基乙酸洗脱，从上清中分批吸收纯化。在以大约1.5mg/kg静脉内注射进入CD1品系雄性动物后，在小鼠中测定融合蛋白的血清半衰期。通过ELISA方法，使用羊抗-HA(Abcam，UK)捕获并用4％Marvel封闭的蛋白L-HRP(Invitrogen，USA)检测，分析融合蛋白的血清半衰期。用0.05％Tween-20，PBS洗脱。在存在1×小鼠血清时建立已知浓度的结合dAb/HA融合蛋白的MSA标准曲线，以提供测试样本间的比较。1分隔模型(WinNonlin软件，Pharsight公司，美国)显示结合MSA的dAb/HA表位标记融合蛋白具有29.1小时的半衰期并在曲线下具有559hr.μg/ml面积。这表明了与单独的HA表位标记多肽的预期的数分钟半衰期相比，具有很大的提高。

运用HA表位标签作为药物模型的研究结果表明，当药物与结合血清白蛋白的抗体的抗原-结合片段(例如，dAb)形成融合物或共扼物时，药物的体内血清半衰期可以延长。

在小鼠中抗-MSA dAbs DOM7m-16和DOM7m-26，和不结合MSA的对照dAb的体内半衰期也被评估。并且，DOM7m-16，DOM7m-26和对照dAb包含HA表位标记，作为药物模型(如，蛋白质，多肽或肽药物)。在这一研究中，不结合MSA的对照dAb的体内半衰期为20分钟，而DOM7m-16和DOM7m-26的体内半衰期明显大于此半衰期。(图12)在进一步的研究中发现DOM7m-16在小鼠的体内半衰期为29.5小时。

在另外的研究中，包含HA表位标记的DOM7h-8小鼠体内半衰期(t1/2β)也被估计。一种2分隔模型(WinNonlin软件，Pharsight公司，美国)显示DOM7h-8具有29.1小时的t1/2β。

使用HA表位标记作为药物模型的每一项研究的结果(如，蛋白质，多肽或肽药物)，显示了当药物被制备成带有与血清白蛋白结合的抗体的抗原-结合片段的药物融合物或药物结合物药物时，药物的体内半衰期能被极大的增加。

B.测定在小鼠中结合MSA的dAb/IL-1ra融合蛋白的血清半

衰期

结合MSA的dAb/IL-1ra融合蛋白(MSA16IL-1ra)在E.coli周质中表达，使用蛋白质L-琼脂糖亲合树脂(Affitech，Norway)并用PH为2.2的氨基乙酸洗脱，从上清中分批吸收纯化。以大约1.5mg/kg静脉内注射进入CD1品系雄性动物后，测定小鼠中MSA16IL-1ra(DOM7m-16/IL-1ra)，带有不结合MSA的dAb的IL-1ra融合蛋白(Dummy dAb/IL-1ra)，和融合HA表位标记的抗-MSAdAb(DOM7m-16HA标记)的血清半衰期。

通过IL-1ra夹心ELISA(R&D系统，USA)分析血清水平。在存在1×小鼠血清时建立已知浓度dAb/IL-1ra融合蛋白的标准曲线，以提供测试样本的比较。使用WinNonlin药物动力学软件(Pharsight Corp.USA)建立模型。

预期地，当与非-MSA结合的dAb与IL-1ra形成的融合蛋白对照相比，带有抗-MSA dAb的IL-1ra融合蛋白的血清半衰期有极大地提高。非-MSA结合的dAb/IL-1ra融合蛋白对照预期具有短的血清半衰期。

研究的结果显示在表3中，并显示带有抗-MSA dAb的IL-1ra融合蛋白(DOM7m-16/IL-1ra)与带有不结合MSA的dAb的IL-1ra融合蛋白(Dummy dAb/IL-1ra)相比，其血清半衰期大约增长了10倍。结果也揭示了，与dummy/IL-1ra(AUC：1.5hr.μg/ml)相比，DOM7m-16/IL-1ra(AUC：267hr.μg/ml)的浓度时间曲线下的面积有＞200倍的提高。

表3

药剂	半衰期
		DOM7m-16/IL-ra	4.3小时
Dummy/IL-1ra	0.4小时
		DOM7m-16HA标记	29小时

这些研究的结果表明当药物作为带有结合血清白蛋白的抗体的抗原-结合片段的药物融合蛋白或药物结合物被制备时，药物在体内的血清半衰期和AUC有明显地提高。

实施例5.测定在大鼠中结合RSA的dAb/HA表位标记融合蛋白的血清半衰期

带有C-末端HA标记的抗-鼠血清白蛋白dAbs在E.coli周质表达且用PH为2.2的氨基乙酸和PBS交换缓冲液洗脱，对V_HS使用蛋白质A-streamline亲合树脂(Amersham，UK)，对Vk_S使用蛋白质L-琼脂糖亲合树脂(Affitech，Norway)从上清中分离分批吸收。  为了测定血清半衰期，将大鼠分组，每组4只，以1.5mg/Kg的浓度被给予单独i.v.施用DOM7r-27，DOM7r-31，DOM7r-16，DOM7r-3，DOM7h-8或结合非相关抗原的对照dAb(HEL4)。7天后，从尾部血管连续放血获得血清样本，通过在ELISA板上包被山羊抗-HA(Abcam，cambridge UK)，并随后用蛋白质A-HRP(针对V_HdAbs)或蛋白质L-HRP(针对VkdAbs)测定进行夹心法ELISA分析。在存在1×小鼠血清时建立已知浓度的dAb标准曲线，以提供测试样本的比较。使用一种2分隔模型(使用WinNonlin参数软件(Pharsight公司，美国))计算t1/2β和曲线下的面积(AUC)(表4)。在鼠中HEL4对照的t1/2β为30分钟，且基于获得的数据，DOM7h-8预期的AUC在大约150hr.μg/ml和2500hr.μg/ml之间。

表4

药剂	框架	鼠血清白蛋白亲合力(KD)	t1/2β	AUC(hr.μg/mL)
					DOM7r-3	VK	12nM	13.7小时	224
DOM7r-16	VK	1uM	34.4小时	170
					DOM7r-27	VH	250nM	14.8小时	78.9
DOM7r-31	VH	5uM	5.96小时	71.2

使用HA表位标记作为药物(如蛋白质，多肽，或肽药物)模型进行小鼠研究，结果表明当药物被制备成带有与血清白蛋白结合的抗体的抗原结合片段的药物融合物或药物结合物时，药物的内体的血清半衰期被极大地提高。

人体内半衰期的预测

使用异速生长标度在动物中获得的半衰期数据能估计dAb，药物融合物或药物结合物在人体内的半衰期。根据动物重量的log值和在3种动物中测定的体内半衰期的log值绘制图表。通过描绘的点划制直线并根据公式logY＝log(a)+blog(W)，使用直线的斜率和y轴的截距计算人体内半衰期，其中Y是人体内半衰期，log(a)是y轴的截距，b是斜率，和W是人的体重。使用体重大约为35克(如小鼠)，大约为260克(如，大鼠)和大约重2710克的动物获得的体内半衰期的数据可以绘制这一直线。对于这种计算，人的体重可以认为是70000克。基于在小鼠和大鼠中获得的半衰期的数据，在人类中结合血清白蛋白的dAbs，如DOM7h-8的t1/2β预期为大约5.5小时至40小时，且AUC大约为150hr.μg/mL至2500hr.μg/mL。

例6.抗-SA dAb/IL-1ra药物融合物在胶原质引发的风湿性关节炎小鼠关节炎模型中的效用。

融合DOM7m-16/IL-1ra和IL-1ra在风湿性关节炎小鼠模型中(以II型胶原质在DBA/1小鼠中引发关节炎)的效用被评估。在实验过程中，小鼠在装有HEPA-过滤Scantainer的标准2型饲养笼中饲养，温度为20-24℃，并按12-小时明亮，12-小时黑暗为一个周期。食物(Harlan-Teklad通用食物2016)和UV灭菌水被随意提供。小鼠应至少在开始实验7天前放入设备中饲养以保证环境适应性。

将Arthrogen-CIA佐剂和Arthrogen-CIA胶原质(都来源于MD biosciences)以1∶1的比例进行乳化直至形成稳定的乳化液，注射7-8周龄的DBA/1小鼠(来源于Taconic M and B，Domholtveg，丹麦)一次。当乳化液加入至一大杯水中可形成固体小块时则该乳化液被认为是稳定的。随后可将乳化物注射小鼠。

乳化物注射21天后，引发关节炎最严重的20只动物被挑清除出该研究，而剩余的小鼠按10只每组分组(每组含5只雄性，5只雌性)。小鼠按表5进行治疗，所治疗的输送浓度都经计算，按10ml/Kg给药。

表5

组	治疗
		1	IL-1ra，1mg/Kg(腹腔内注射(ip.)bolus)
2	IL-1ra，10mg/Kg(ip.bolus)
		3	DOM7m-16/IL-1ra，1mg/Kg(ip.bolus)
4	DOM7m-16/IL-1ra，10mg/Kg(ip.bolus)
		5	ENBREL(entarecept；Immunex Corporation，5mg/Kg(ip.bolus)
6	盐水(阴性对照)，10ml/Kg(ip.bolus)
		7	地塞米松(阳性对照)，0.4mg/Kg(皮下注射)

从21天至49天，每周3次对关节炎严重程度临床分值进行记录。如果个别小鼠的关节炎分值大于等于12，或具有严重的恶化的病症时则进行安乐死。

在临床分值中，每个肢体将根据一下的标准评分，而四个肢体的分值相加获得小鼠的总分值。以每个小鼠具有0到16之间的分值作为该方法的结果。评分标准为：0＝正常；1＝轻微但明确的踝和腕的红肿，或限定于个别趾的明显红肿，而不考虑感染趾的数量；2＝中等的踝和腕的红肿；3＝包括脚趾的整个掌的严重红肿；4＝包括多个关节的肢体的最严重红肿。

在治疗的每一天根据个体小鼠的临床分值对每个治疗组进行计算，获得组平均关节炎分值。任何由于伦理原因从研究中去除的动物将给予最大分值16。根据时间绘制组平均关节炎分值图(图13)。

运用Wilcoxon试验对第49天的平均关节炎分值进行统计分析。统计分析表明与盐水对照组相比(组6)，DOM7m-16/IL-1ra(1mg/Kg或10mg/Kg(组3和4))治疗的两个组在第49天的关节炎分值具有明显改善(明显性水平分别为P＜1％和P＜0.05％)。相反，以1mg/Kg的IL-1ra治疗的小鼠(组1)第49天的关节炎分值没有统计学意义的改善，而以10mg/Kg的IL-1ra治疗的小鼠(组2)具有明显的改善，其明显性水平为P＜5％。以ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)(组5)治疗的小鼠第49天的关节炎分值具有明显性水平P＜10％的明显改善。

与以5mg/Kg的5ENBREL(entarecept；ImmunexCorporation)(组5)进行标准治疗相比，以10mg/Kg剂量DOM7m-16/IL-1ra进行治疗的组(组4)，能有效地改善第49天的关节炎分值(明显性水平为P＜0.05％)。此外，以1mg/Kg更低剂量的DOM7m-16/IL-1ra进行治疗的组(组3)，与相同剂量的IL-1ra单独治疗(组1)(明显性水平为P＜10％)相比，能跟有效地改善第49天的关节炎分值。

本研究的结果表明特定剂量的DOM7m-16/IL-1ra比IL-1ra和5ENBREL(entarecept；Immunex Corporation)更为有效。如预期的，IL-1ra的效应是剂量依赖的，而DOM7m-16/IL-1ra的效应也是剂量依赖的。以1mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra进行治疗的平均分值要低于10mg/Kg的DOM7m-16/IL-1ra进行治疗的平均分值。这些图示结果(图13)表明以DOM7m-16/IL-1ra进行治疗与以IL-1ra进行治疗相比，其效果要高10倍。

DOM7m-16/IL-1ra融合蛋白具有出众的疗效，尽管其仅含有一半重量的作为IL-1受体结合表位的IL-1ra(例如，与1mgIL-1ra(MW＝17.1KD)相比，1mg DOM7m-16/IL-1ra融合蛋白(MW＝31.2KD)仅含有约一半IL-1受体结合表位。)

本研究的结果表明结合血清白蛋白的dAb可以与IL-1ra连接(对RA进行临床治疗)并且药物融合兼具更长的血清半衰期特性(相对于dAb)和受体结合特性(相对于IL-1ra)。由于药物融合物的血清保留期，治疗CIA所需的DOM7m-16/IL-1ra融合蛋白效应剂量要显著低于IL-1ra。

本研究的结果表明除了增长的半衰期和提高的AUC优点之外，与结合血清白蛋白的抗体的抗原-结合片段 (例如，dAb)相结合的药物融合物或药物结合物，是高效的并优于单独药物的治疗药物。例如，在小鼠CIA模型中显示，与单独使用IL-1ra相比，更低剂量的药物融合物是有效的并可长期抑制由IL-1引发的关节炎症和关节损坏，并可提供针对疾病进程的更好的保护。

实施例7.抗-SA dAb/皂素蛋白的非共价药物结合物

核糖体-失活蛋白皂素蛋白(一种抗-癌药物)对变性剂和蛋白酶是高度稳定的且被用作一种针对T淋巴细胞的目标毒素。通过生物素-链霉亲和素连接物将皂素蛋白联接到DOM7h-8，制备非-共价药物结合物。这种非-共价药物结合物获得的结果表明，当与药物联接时，DOM7h-8保留了其结合血清白蛋白的特性。

通过在HB2151细胞中表达重组核酸，制备的变体DOM7h-8亦称DOM7h-8cys，其C-末端108位的精氨酸(序列号：24的108位氨基酸)被半胱氨酸残基取代。细胞生长后，在30℃用过夜表达自体诱导物Tbreadymix(Merck Kga，Germany)诱导72小时，通过离心收集上清。使用蛋白L-琼脂糖亲合捕获，从上清提纯DOM7h-8cys。然后用10个柱状物体积的2×PBS洗脱树脂并用pH为2的0.1M的氨基乙酸洗脱DOM7h-8cys。洗脱的DOM7h-8cys用0.2×体积的pH为8的Tris中和并浓缩至1mg/ml(使用一种CENTRICON 20集中器(Millipore Corp.，MA)。

使用NAP5脱盐柱(GE Healthcare/Amersham Biosciences，NJ)，浓缩的DOM7h-8cys溶液交换至PBS并测定浓度。然后使用EZ-LINK sulfo-NHS-LC-biotin(Pierce Biotechnology Inc.，IL)将dAb生物素化(通过原初胺)。被生物素化的dAb和链霉亲和素-皂素蛋白(Advanced Targeting Systems，San Deigo)以1∶1的摩尔比例混合。

为了确定dAb/皂素蛋白混合物的形成，使用夹心法ELISA测定完整的复合物。以每孔100ul体积，10μg/ml浓度的人血清白蛋白(HSA)在ELISA板的半数孔中包被过夜。孵育过夜后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后整个板用2％PBS封闭2小时。封闭后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用在2％TwenPBS中稀释至0.5uM的DOM7h-8/皂素蛋白非-共价共扼物孵育1小时。作为相同ELISA板上的对照，0.5uM的未耦联的皂素蛋白和0.5uM的未耦联的DOM7h-8在2％的Tween PBS中孵育。另外的对照是相同的三种被稀释的蛋白质，其在不包被HSA并经2％Tween封闭的ELISA板的孔中孵育。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用2％Tween PBS稀释至1/2000的山羊抗-皂素蛋白多克隆抗体(Advanced Therapeutic Systems)稀释液孵育1小时。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用二抗体孵育1小时(1/2000的抗-山羊Ig HRP共扼物)。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用PBS洗一次并在纸上轻打使其干燥。用100ul 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺作为底物进行ELISA反应并用50ul的1M盐酸终止反应。通过比较共扼物的OD600和每一非共扼部分的OD600，可以确定非-共价的共扼物DOM7h-8和皂素蛋白的存在。

表6

	DOM7h-8/皂素蛋白	DOM7h-8	皂素蛋白
				OD600(用HSA包被的板)	0.311	0.060	0.079
OD600(用2％TweenPBS封闭的板)	0.078	0.068	0.075

研究结果表明，一种药物可以与结合血清白蛋白的抗体的抗原-结合片段共扼，且共扼的抗原-结合片段仍保留血清白蛋白-结合活性。此外，由于生物素-链霉亲和素相互作用的稳定性和强度，结果表明可以制备共价结合和非共价结合的共扼物，其仍保留结合血清白蛋白的抗体的抗原-结合片段的血清白蛋白-结合活性。

实施例8.抗-SA dAb/荧光素共扼物

荧光素异硫氰酸盐(FITC)能通过氨基，巯基，咪唑基，酪氨酰或羰基横向连接在蛋白质上。它具有389Da的分子量，其在大小上相当于许多小分子药物。带有这一共扼物获得的结果表明，当与小分子化学物耦联时，抗-SA dAb保留了其结合血清白蛋白的特性，并且小分子药物能与抗-SA dAb共扼。

正如在实施例7中所描述的方法可以制备浓缩的DOM7h-8cys。使用 NAP5脱盐柱(GE Healthcare/AmershamBiosciences，NJ)，浓缩的DOM7h-8cys被交换至pH为8的50mM的Borate(耦合缓冲液)，然后使用2ml的CENTRICON 20浓缩器(Millipore Corp.，MA)将其浓缩至2.3mg/ml。根据制造商的说明FITC(Pierce Biotechnology Inc.)在二甲替甲酰胺(DMF)中被稀释至10mg/ml，然后FITC∶dAb以摩尔比24∶1的比例，在耦合缓冲液中与dAb混合。反应被允许进行30分钟。之后，使用经PBS预先-平衡的PD10脱盐柱(GE Healthcare/AmershamBiosciences，NJ)从反应中移去过量的未反应的FITC，并用PBS洗DOM7h-8cys/FITC。

为了确定FITC/dAb耦合反应是成功的，夹心法ELISA被用于测定耦合的dAb。每孔100ul体积，10μg/ml浓度的人血清白蛋白(HSA)被包被在ELISA板的半数孔中过夜。孵育过夜后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后所有的孔用2％PBS封闭2小时。封闭后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用在2％TwenPBS中稀释至1uM的DOM7h-8cys/FITC孵育1小时。作为在相同ELISA板上的对照，1uM与抗体耦联的FITC和1uM未耦联的DOM7h-8在2％Tween PBS中孵育。另外的对照是相同的三种被稀释的蛋白质，其在不包被HSA并经2％Tween封闭的ELISA板的孔中孵育。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用2％Tween PBS稀释至1/500的兔抗-FITC抗体(Serotec)稀释液孵育1小时。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用2％Tween PBS稀释的二抗(1/5000抗-兔Ig HRP共扼物)孵育1小时。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后在纸上轻打使其干燥。每孔用100ul 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物进行ELISA反应并且每孔用50ul 1M盐酸终止反应。通过比较共扼物的0D600和每一非共扼部分的OD600，可以确定非-共价的共扼物DOM7h-8和FITC的存在。

表7

	DOM7h-8/FITC	DOM7h-8	FITC耦合的抗体(阴性对照)
				OD600(用HSA包被的板)	0.380	0.042	0.049
OD600(用2％TweenPBS封闭的板)	0.041	0.041	0.045

实施例9.抗-SA dAb/多肽共扼物

许多多肽具有治疗效果。带有N-或C-末端半胱氨酸的模型多肽能与抗-血清白蛋白dAb耦合。

在这种情况中，四种不同的多肽将被使用：多肽1YPYDVPDYAKKKKKKC(序列号：68)；多肽2CKKKKKKYPYDVPDYA(序列号：69)；多肽3HHHHHHKKKKKKC(序列号：70)；多肽4：CKKKKKKHHHHHH(序列号：71)。多肽1和2包含红血球凝聚素标记(HA标记)的序列而多肽3和4包含His标记序列。正如在实施例7中描述的方法可以制备浓缩的DOM7h-8cys。

用5mM二硫苏糖醇还原浓缩的dAb，然后使用NAP5脱盐柱(GE Healthcare/Amersham Biosciences，NJ)，浓缩的dAb被交换至耦合缓冲液(pH为6.5的20mM的BisTris，5mM EDTA，10％氨基乙酸)。使用5mM终浓度的二硫基联吡啶封闭半胱氨酸(为了阻止dAb与其自身形成二聚体)，该二硫基联吡啶来源于100mM的二硫基联吡啶DMSO储存液，并被加入至dAb溶液。dAb与二硫基联吡啶一起耦合20-30分钟。使用PD10脱盐柱移去多余的未反应的二硫基联吡啶且在耦合缓冲液中(pH为6.5的20mM的BisTris，5mM EDTA，10％氨基乙酸)洗脱dAb。最终的蛋白质被冻干直至需要使用。

多肽1-4分别以200uM的浓度溶解在水中，并使用5mM DTT还原，然后用NAP5脱盐柱(GE Healthcare/AmershamBiosciences，NJ)脱盐。然后，为了生成多肽-dAb耦合物，每一多肽加入到还原溶液中并以20∶1的比例封闭dAb。为了确定多肽，dAb耦合反应的成功性，夹心法ELISA将被用于测定抗-SAdAb/多肽共扼物。

每孔100ul体积，10μg/ml浓度的人血清白蛋白(HSA)在ELISA板半数孔中包被过夜。孵育过夜后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用4％MarvelPBS封闭2小时。封闭后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用4％MarvelPBS稀释至1uM的DOM7h-8/多肽共扼物孵育1小时。作为在相同ELISA板上的对照，20uM未耦联的多肽和1uM未耦联的DOM7h-8在4％MPBS中孵育。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后在4％Marvel PBS中，用针对多肽1和2的山羊抗-HA抗体(Abcam)的1/2000稀释液，和针对多肽3和4的NiNTA-HRP的1/2000稀释液孵育1小时。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，然后用4％MPBS稀释至1/2000的抗-山羊HRP二抗孵育1小时(其它孔封闭孵育1小时)。孵育后，板用PBS，0.05％Tween洗三次，用PBS洗一次，然后在纸上轻打使其干燥。用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物进行ELISA反应并用1M盐酸终止反应。通过比较共扼物的OD600和每一非共扼部分的OD600，可以确定非-共价的共扼物DOM7h-8/多肽共扼物的存在。

表8抗癌症多肽
			多肽种类	多肽序列	作用/应用
LH-RH增效剂和拮抗剂	P-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2序列号：89	性激素依赖的恶性疾病的治疗
			Gastrin释放多肽	P-Glu-Gln-Arg-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2序列号：90	小细胞肺癌
生长激素抑制素	P-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Trp-Lys-Tyr-Phe-Thr-Ser-Cys序列号：91	肿瘤(普通)
			GH-RH	Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi(CH2-NH)-Leu-NH2(RC-3094)序列号：92	恶性胶质瘤，前列腺癌
VEGF	Arg-Arg-Lys-Arg-Arg-Arg序列号：93	人Colon癌
				Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg序列号：94	肿瘤细胞增殖
	Arg-Thr-Glu-Leu-Asn-Val-Gly-Ile-Asp-Phe-Asn-Trp-Glu-Tyr-Pro-Ala-Ser-Lys序列号：95	肿瘤细胞增殖和迁移
				His-His-Glu-Val-Val-Lys-Phe-Mel-Asp-Val-Tyr-Gln序列号：96	抑制内皮细胞反应

	Asn-Ile-Thr-Val-Thr-Leu-Lys-Lys-Phe-Pro-Leu序列号：97	Angiogenesis抑制子
			EGF	Cys-His-Ser-Gly-Tyr-Val-Gly-Val-Arg-Cys序列号：98	抑制EGF基底细胞增殖
	Tyr-Cys-Asp-Gly-Phe-Tyr-Ala-Cys-Tyr-Met-Asp-Val-Nh2序列号：99	结合HER2
			IL-6	Gly-Gly-Cys-Lys-Leu-Trp-Thr-Ile-Pro-Glu-Cys-Gly-Gly序列号：100	抑制细胞生长
IL-8	Ala-Val-Leu-Pro-Arg序列号：101	Apoptosis诱导和在体内的抗癌反应
			PDGF	Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Glu-Ser-Gly-Lys-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-Leu-Lys-Pro-Thr序列号：102	抑制恶性神经胶质瘤的生长
TNF	AcCys-Pro-Ser-Glu-Gly-Leu-Cys-NH2序列号：103	抑制肿瘤的生长
				Ac-Cys-Pro-Ser-Glu-Gly-Thr-His-Val-Leu-Cys-NH2序列号：104
	Ac-Leu-Ala-Asn-Gly-Val-Glu序列号：105

	Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu-NH2序列号：106
				Val-Ala-Asn-Pro-Gln-Ala-Glu-Gly-Gln-Leu序列号：107
	Cyclic Lys-Gly-Asp-Gln-Leu-Ser序列号：108
				Cyclic Tyr-Ser-Gln-Val-Leu-Phe-Gly序列号：109
Alpha-feto蛋白质	Glu-Met-Thr-Pro-Val-Asn-Pro-Gly序列号：110	抑制雌激素依赖的胸癌细胞
			Sialyl-Lewismimics	Ile-Glu-Leu-Leu-Gln-Ala-Arg序列号：111	抑制肺部肿瘤细胞
尿激酶-型血纤维蛋白溶酶原催化剂	Cys-Val-Ser-Asn-Lys-Tyr-Phe-Ser-Asn-Ile-His-Trp-Cys序列号：112	uPA/uPAR拮抗剂
				Phe-X-X-Tyr-Lys-Trp序列号：113	uPA/uPAR拮抗剂
	Lys-Trp-X-X-Ar序列号：114	uPA/uPAR拮抗剂
				Leu-Asn-Phe-Ser-Gln-Tyr-Leu-Trp-Tyr-Tyr-NH2	uPA/uPAR拮抗剂

	序列号：115
				Ac-Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-NH2序列号：116	抑制肿瘤的发展和血管发生
P53	Ac-Met-Pro-Arg-Phe-Met-Asp-Tyr-Trp-Glu-Gly-Leu-Asn-NH2序列号：117	抑制Hdm2和p53的结合
				Met-Val-Arg-Arg-Phe-Leu-Val-Thr-Leu-Arg-Ile-Arg-Arg-Ala-Cys-Gly-Pro-Pro-Arg-Val序列号：118	阻止p53泛素化
	Gly-Ser-Arg-Ala-His-Ser-Ser-His-Leu-Lys-Ser-Lys-Gly-Gln-Ser-Thr-Ser-Arg-His-Lys-Lys-Lys-Leu序列号：119	激活p53
			P34cdc2	Cys-Ala-Phe-Tyr-Ile序列号：120	抑制p34/p33和pRb2和p107之间的相互作用
	Leu-Cys-Ala-Phe-Tyr-Ile-Met-Ala-Lys序列号：121
				Met-Cys-Ser-Met-Tyr-Gly-Ile-Cys-Lys序列号：122
Cdk2	Tyr-Ser-Phe-Val-His-Gly-Phe-Phe-Asn-Phe-Arg-Val-Ser-Trp-Arg-Glu-Met-Leu-Ala序列号：123	抑制Cdk2和组蛋白H1之间的相互反应

P21WAF1	Lys-Arg-Arg-Gln-Thr-Ser-Met-Thr-Ala-Phe-Tyr-His-Ser-Lys-Arg-Arg-Leu-Ile-Phe-Ser序列号：124	诱导G1/S生长休止
				Lys-Arg-Arg-Leu-Ile-Phe-Ser-Lys序列号：125
	Phe-Leu-Asp-Thr-Leu-Val-Val-Leu-His-Arg序列号：126
			E2F/DP转录	Arg-Cys-Val-Arg-Cys-Arg-Phe-Val-Val-Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Val-Arg-Cys-Leu-Val序列号：127	在体内抑制E2F的作用
	Leu-Asn-Trp-Ala-Trp-Ala-Ala-Glu-Val-Leu-Lys-Val-Gln-Lys-Arg-Arg-Ile-Tyr-Asp-Ile-Thr-Asn-Val序列号：128
				Leu-Glu-Gly-Ile-Gln-Leu-Ile-Ala-NH2序列号：129
	Phe-Trp-Leu-Arg-Phe-Thr序列号：130
				Trp-Val-Arg-Trp-His-Phe序列号：131
	Trp-Val-Arg-Trp-His序列号：132
				Trp-His-Phe-Ile-Phe-Trp

	序列号：133
				Ile-Trp-Leu-Ser-Gly-Leu-Ser-Arg-Gly-Val-Trp-Val-Ser-Phe-Pro序列号：134
	Gly-Ser-Arg-Ile-Leu-Thr-Phe-Arg-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Trp-Tyr-Ala-Ser序列号：135
				Asp-Glu-Leu-Lys-Arg-Ala-Phe-Ala-Ala-Leu-Arg-Asp-Gln-Ile序列号：136
Bc12	Lys-Lys-Leu-Ser-Glu-Cys-Leu-Lys-Lys-Arg-Ile-Gly-Asp-Glu-Leu-Asp-Ser序列号：137	在细胞自由体系中引发apoptpsis
				Gly-Gln-Val-Gly-Arg-Gln-Leu-Ala-Ile-IleGly-Asp-Asp-Ile-Asn-Arg序列号：138
	Arg-Asn-Ile-Ala-Arg-His-Leu-Ala-Gln-Val-Gly-Asp-Ser-Met-Asp-Arg序列号：139
			整合	Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH2	抑制肿瘤细胞结

	序列号：140	合ECMs
				Ac-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NH2序列号：141
	Ac-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NHCH3序列号：142
				Ac-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-N(CH3)2序列号：143
	Phe(pNH2)-Ile-Gly-Ser-Arg-NH2序列号：144
				Ac-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NHCH(CH3)2序列号：145
	CO(Asp-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-NHPr)2序列号：146
				Arg-Gly-Asp序列号：147
	Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg序列号：148
				Ile-Pro-Cys-Ssn-Asn-Lys-Gly-Ala-His-Ser-Val-Gly-Leu-Met-Trp-Trp-Met-Leu-Ala-Arg序列号：149
血管抑	Ser-Pro-His-Arg-Pro-Arg-Phe-Ser-Pro-

素相似物	Ala序列号：150
				Ser-ProHis-Ala-His-Gly-Tyr-Ile-Pro-Ser序列号：151
	Thr-Pro-His-Thr-His-Asn-Arg-Thr-Pro-Glu序列号：152
				Thr-Pro-His-Arg-His-Gln-Lys-Thr-Pro-Glu序列号：153
	Glu-Pro-His-Arg-His-Ser-Ile-Phe-Thr-Pro-Glu序列号：154
			钙粘附蛋白	Ac-Cys-His-Ala-Val-Cys-NH2序列号：155	抑制血管发生
组蛋白去乙酰化酶	Cys-Glu-Lys-His-Ile-Met-Glu-Lys-Ile-Gln-Gly-Arg-Gly-Asp-Asp-Asp-Asp序列号：156	白介素抑制剂
			MMP2	Cys-Thr-Thr-His-Trp-Gly-Phe-Thr-Leu-Cys序列号：156	肿瘤转移

尽管此发明已经用其中涉及的优选实施方案被显著地表示和描述，但是本领域的普通技术人员明白，在不背离发明及附加的权利要求的范围的条件下，可以有各种形式和描述的改变。

Claims (75)

1.一种药物融合物，其具有如下的分子式：

a-(X)_n1-b-(Y)_n2-c-(Z)_n3-d或a-(Z)_n3-b-(Y)_n2-c-(X)_n1-d，

其中

X是对第一靶标具有结合特异性的一种多肽药物；

Y是一种对血清白蛋白具有结合特异性的免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或一种对血清白蛋白有结合特异性的免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)；

Z是对第二靶标具有结合特异性的一种多肽药物；

a，b，c和d分别是一种包括1至大约100个氨基酸残基的多肽或缺失；

n1是1至大约10；

n2是1至大约10；和

n3是0至大约10，

附带条件，当n1和n2都为1且n3为0时，则X不包括抗体链或抗体链的片段。

2.根据权利要求1的药物融合物，其中n1和n3都为1，且n2为2至大约10。

3.根据权利要求1的药物融合物，其中Y包括从由序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26组成的组中选择的一种氨基酸序列。

4.根据权利要求1的药物融合物，其中Y包括从由序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22和序列号：23组成的组中选择的氨基酸序列。

5.根据权利要求1的药物融合物，其中X是IL-1ra或IL-1ra的功能变体。

6.根据权利要求1的药物结合物，其中X是止痛剂，抗-癌药剂，激素或抗菌的多肽或肽。

7.根据权利要求1的药物结合物，其中X是免疫抑制剂，抗病毒剂，抗生素，抗-发炎剂，细胞毒素或细胞毒剂。

8.根据权利要求1的药物结合物，其中X是蛋白酶抑制剂。

9.一种药物融合物，其包括X’和Y’亚基，其中

X’是多肽药物，附带条件，X’不包括抗体链或抗体链的片段；并且

Y’是表示对血清白蛋白有结合特异性的免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或对血清白蛋白有结合特异性的一种免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)。

10.根据权利要求9的药物融合物，其中X’位于Y’的氨基末端。

11.根据权利要求9的药物融合物，其中Y’位于X’的氨基末端。

12.根据权利要求9的药物融合物，其中所述的V_H和V_L对人血清白蛋白具有结合特异性。

13.根据权利要求12的药物融合物，其中Y’包括从由序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26组成的组中选择的氨基酸序列。

14.根据权利要求12的药物融合物，其中Y’包括从由序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22和序列号：23组成的组中选择的氨基酸序列。

15.根据权利要求9的药物融合物，其中X’是IL-1ra或IL-1ra的功能性变体。

16.一种药物结合物，包括对血清白蛋白有结合特异性的免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或对血清白蛋白有结合特异性的免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)，和共价地结合V_H或V_L的药物。

17.根据权利要求16的药物结合物，其中药物结合物包括单一的V_H。

18.根据权利要求16的药物结合物，其中药物结合物包括单一的V_L。

19.根据权利要求16的药物结合物，其中所述的药物通过连接物亚基共价地结合所述的V_H或V_L。

20.根据权利要求16的药物结合物，其中两种或更多种不同的药物共价地结合所述的V_H或V_L。

21.根据权利要求16的药物结合物，其中药物是多肽。

22.根据权利要求22的药物结合物，其中所述的多肽是IL-1ra或IL-1ra的功能性变体。

23.根据权利要求16的药物结合物，其中药物是止痛剂，抗-癌药剂，激素或抗菌的多肽或肽。

24.根据权利要求16的药物结合物，其中药物是免疫抑制剂，抗病毒剂，抗生素，抗-炎症剂，细胞毒素或细胞毒素的药剂，抗代谢物，烷化剂，抗癌剂，或放射性药物。

25.根据权利要求16的药物结合物，其中药物是蛋白酶抑制剂。

26.根据权利要求16的药物结合物，其中所述的对血清白蛋白有结合特异性的一种免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或对血清白蛋白有结合特异性的免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)，包括从序列号：10，序列号：11，序列号：12，序列号：13，序列号：14，序列号：15，序列号：24，序列号：25和序列号：26，序列号：16，序列号：17，序列号：18，序列号：19，序列号：20，序列号：21，序列号：22和序列号：23组成的组中选择的氨基酸序列。

27.一种重组核酸，其编码权利要求1或权利要求9的药物融合物的。

28.一种包括权利要求27的重组核酸的核酸构建物。

29.一种包括权利要求27的重组核酸的宿主细胞。

30.一种制备一种药物融合物的方法，包括在合适的条件下维持权利要求27的宿主细胞表达所述的重组核酸，由此制备一种药物融合物。

31.一种的药物组合物，包括权利要求1或权利要求9的药物融合物和一种生理学上可接受的载体。

32.一种的药物组合物，包括权利要求16的药物结合物和一种生理学上可接受的载体。

33.一种治疗患有炎症疾病的患者的方法，包括给所述的个体施用治疗有效剂量的权利要求5，15，22中任何一种药物结合物或药物融合物。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述的炎症疾病是关节炎。

35.权利要求3，4，13，14和26中的任何一种药物结合物或药物融合物在治疗，诊断或预防中的应用。

36.权利要求5，15，22中的任何一种药物结合物或药物融合物在治疗，诊断或预防中的应用。

37.权利要求5，15，22中的任何一种药物结合物或药物融合物在制备用于治疗炎症疾病的药物中的应用。

38.根据权利要求37所述的应用，其中所述的炎症疾病是关节炎。

39.一种非共价的药物结合物，其包括一种对血清白蛋白有结合特异性的免疫球蛋白重链可变区域(V_H)，或一种对血清白蛋白有结合特异性的免疫球蛋白轻链可变区域(V_L)，和一种非共价地结合所述V_H或V_L的药物。

40.根据权利要求39所述的非共价药物结合物，其中所述的V_H或V_L和所述的药物通过补充结合部分非共价地结合。

41.根据权利要求40所述的非共价的药物结合物，其中所述的补充结合部分是生物素和抗生物素蛋白，或生物素或链霉亲合素。

42.一种具有特异性结合位点能够特异结合对血清体内半衰期有提高作用的多肽的多肽结合亚基在药物生产中的应用，所述药物包括一种药物组合物，在此药物组合物中，药物与所述的多肽结合亚基相结合，从而增加了药物的体内半衰期且对于药物的活性的减少不多于大约10％，

43.一种具有特异性结合位点能够特异结合对血清体内半衰期有提高作用的多肽的多肽结合亚基在药物生产中的应用，所述药物包括一种药物组合物，在此药物组合物中，药物与所述的多肽结合亚基相结合，从而增加了药物的体内半衰期且减少了药物的免疫原性。

44.一种具有特异性结合位点能够特异结合对血清体内半衰期有提高作用的多肽的多肽结合亚基在药物生产中的应用，所述药物包括一种药物组合物，在此药物组合物中，药物与所述的多肽结合亚基相结合，从而减少了药物的免疫原性且使药物活性的减少不多于大约10％。

45.一种具有特异性结合位点能够特异结合对血清体内半衰期有提高作用的多肽的多肽结合亚基在药物生产中的应用，所述药物包括一种药物组合物，在此药物组合物中，药物与所述的多肽结合亚基相结合，从而增加了药物的体内血清半衰期并减少了药物的免疫原性且对于药物活性的减少不多于大约10％。

46.根据权利要求42-45所述的任何一种应用，其中药物包括一种药物组合物，其中的一种药物与所述的多肽结合亚基共价地结合。

47.根据权利要求46所述的应用，其中药物组合物是一种药物融合物或药物结合物。

48.根据权利要求42-45所述的任何一种应用，其中药物包括一种药物组合物，其中的一种药物与所述的多肽结合亚基非共价地结合。

49.根据权利要求48所述的应用，其中药物组合物是一种非共价的药物结合物。

50.根据权利要求42-49所述的任何一种应用，其中所述的多肽结合亚基具有对血清白蛋白的结合特异性。

51.根据权利要求50所述的应用，其中所述的多肽结合亚基是一种对血清白蛋白具有结合特异性的抗体的抗原-结合片段。

52.根据权利要求42-51所述的任何一种应用，其中的药物包括一种比所述药物具有更大活性的药物组合物。

53.一种增加药物体内血清半衰期且不明显减少药物活性的方法，包括将一种药物与一种具有一个结合位点的多肽结合亚基结合，该结合位点对提高体内血清半衰期的多肽有结合特异性，由此制备一种药物组合物。

其中所述的药物组合物相对于所述的药物具有更长的体内血清半衰期，并具有至少所述药物90％的活性。

54.一种增加药物的体内血清半衰期和减少药物的免疫原性的方法，包括将一种药物与一种具有一个结合位点的多肽结合亚基结合，该结合位点对提高体内血清半衰期的多肽有结合特异性，由此制备一种药物组合物，

其中所述的药物组合物相对于所述的药物具有更长的体内血清半衰期，和比所述药物较小的免疫原性。

55.一种增减少药物的免疫原性而不明显减少药物活性的方法，包括将一种药物与一种具有一个结合位点的多肽结合亚基结合，该结合位点对提高体内血清半衰期的多肽有结合特异性，由此制备一种药物组合物，

其中所述的药物组合物相对于所述的药物具有较小的免疫原性，和具有至少所述药物90％的活性。

56.一种增加药物的体内血清半衰期和减少药物的免疫原性的方法，包括将一种药物与一种具有一个结合位点的多肽结合亚基结合，该结合位点对提高体内血清半衰期的多肽有结合特异性，由此制备一种药物组合物，

其中所述的药物组合物相对于所述的药物具有更长的体内血清半衰期，比所述药物有较小的免疫原性，和具有至少所述药物90％的活性。

57.根据权利要求53-56所述的任何一种方法，包括将所述药物与所述多肽结合亚基共价地结合。

58.根据权利要求57所述的方法，其中药物组合物是一种药物融合物或药物结合物。

59.根据权利要求53-56所述的任何一种方法，包括将所述药物与所述多肽结合亚基非共价地结合。

60.根据权利要求59的方法，其中药物组合物是一种非共价的药物结合物。

61.根据权利要求53-60所述的任何一种方法，其中的方法进一步包括从一种或更多种多肽中选择所述的多肽结合亚基，其中被选择的多肽带有至少大约5mM的KD值，结合亚基结合提高体内半衰期的一种多肽。

62.根据权利要求53-61所述的任何一种方法，其中所述的多肽结合亚基对血清白蛋白具有结合特异性。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述的多肽结合亚基是一种对血清白蛋白具有结合特异性的抗体的抗原-结合片段。

64.根据权利要求53-63所述的任何一种方法，其中药物组合物比所述的药物具有更大的活性。

65.一种药物组合物，包括一种与具有一个结合位点的多肽结合亚基结合的药物，该结合位点在药物制备时对提高体内血清半衰期的多肽有结合特异性，

其中所述的药物组合物相对于药物具有更长的体内血清半衰期，和具有至少大约90％的药物活性。

66.一种药物组合物，包括一种与具有一个结合位点的多肽结合亚基结合的药物，该结合位点在药物制备时对提高体内血清半衰期的多肽有结合特异性，

其中所述的药物组合物相对于药物具有更长的体内血清半衰期，并比所述的药物更小的免疫原性。

67.一种药物组合物，包括一种与具有一个结合位点的多肽结合亚基结合的药物，该结合位点在药物制备时对提高体内血清半衰期的多肽有结合特异性，

其中所述的药物组合物相比所述的药物更小的免疫原性，并具有至少90％的所述药物的活性。

68.一种药物组合物，包括一种与具有一个结合位点的多肽结合亚基结合的药物，该结合位点在药物制备时对提高体内血清半衰期的多肽有结合特异性，

其中所述的药物组合物相对于药物具有更长的体内血清半衰期，比所述的药物更小的免疫原性，并具有至少90％的所述药物的活性。

69.根据权利要求65-68所述的任何一种药物组合物，其中的药物与所述的多肽结合亚基共价地结合。

70.根据权利要求69的药物组合物，其中所述的药物组合物是一种药物融合物或药物结合物。

71.根据权利要求65-68的所述任何一种药物组合物，其中的药物与所述的多肽结合亚基非共价地结合。

72.根据权利要求71的药物组合物，其中所述的药物组合物是一种非共价的药物结合物。

73.根据权利要求65-72所述的任何一种方法，其中所述的多肽结合亚基对血清白蛋白具有结合特异性。

74.根据权利要求73的方法，其中所述的多肽结合亚基是一种对血清白蛋白具有结合特异性的抗体的抗原-结合片段。

75.根据权利要求65-74所述的任何一种药物组合物，其中的药物组合物比所述的药物具有更大的活性。

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