CN105899532B - 抗血清白蛋白的fab-效应物部分的融合构建体及其制备方法 - Google Patents

抗血清白蛋白的fab-效应物部分的融合构建体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗原结合片段(Fab)和包括该抗原结合片段(Fab)的Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽。本发明的Fab特异性结合血清白蛋白，从而具有延长的体内半衰期。本发明的Fab的特征在于，没有对CH1结构域和CκL结构域中的链间二硫键负责的半胱氨酸残基。本发明的Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽可在大肠杆菌E.coli的细胞周质中进行高产量生产，并且具有增加的体内半衰期。另外，本发明提供了一种产生多种Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽的大肠杆菌E.coli菌株，和一种包括所述Fab‑效应物融合蛋白或(多)肽的药物组合物。

Description

抗血清白蛋白的FAB-效应物部分的融合构建体及其制备方法
技术领域
本发明涉及抗原结合片段(Fab)以及包括该抗原结合片段(Fab)的Fab-效应物融合蛋白。
背景技术
抗原结合片段(Fab)的制备是最成功的单克隆抗体治疗剂之一。例如，在很多国家已经批准了阿昔单抗
Figure BDA0000963629700000011
兰尼单抗
Figure BDA0000963629700000012
和赛妥珠单抗(Certolizumabpegol)
Figure BDA0000963629700000014
等为药物。此外，在欧盟，可在市场上购买包括阿昔单抗
Figure BDA0000963629700000013
兰尼单抗
Figure BDA0000963629700000015
和赛妥珠单抗
Figure BDA0000963629700000016
的多克隆Fab制剂。
当外源性效应物结构域与Fab形成Fab-效应物融合物形式时，外源性效应物结构域的缀合可赋予Fab治疗效果。因此，事实上，将在临床开发状态下的许多抗体片段缀合至外源性功能部分。在这样的Fab-融合蛋白构建体(或Fab-效应物部分构建体)中，抗原结合片段可提供靶标特异性的递送，并且融合蛋白或(多)肽(效应物结构域)可提供治疗效果。源自原核起源的融合结构域可包括细胞毒素，例如deBouganin(一种去免疫的植物毒素)(参见Entwistle et al.,(2012)Cancer Biother Radiopharm.27,582-92)、葡萄球菌肠毒素(SE)(参见Ilack et al.,(2003)Toxicology.185,161-174)或者假单胞菌(Pseudomonas)外毒素的突变体形式(参见Choe et al.,(1994)Cancer Res.54,3460-3467；参见Kreitman et al.,(1994)Int.J.Cancer 57,856-864)。另外，包括来自真核生物的多肽，诸如scFv(参见Lu et al.,(2002)J Immunolog Meth.267,213-226)或者细胞因子(参见Holzer et al.,(1996)Cytokine.8,214-221；参见Sjogaard et al.,(1999)Int JOncol.15,873-882)的融合结构域可起治疗剂的作用。尽管放射性同位素通常以化学方法缀合至Fab或(Fab')2片段，但是细胞毒素、细胞因子或酶以基因方式与Fab或(Fab')2融合。与scFv、Fv或dsFv不同，已知Fab分子可在大肠杆菌E.coli的细胞周质中(参见Humphreyset al.,J.Immunol.Methods.209,193-202；Carter et al.,Biotechnology(N Y).10,163167；Venturi et al.,J Mol Biol.315,1-8；Donzeau et al.,Methods Mol Biol.378,14-31)或者甚至在萤光假单胞菌Pseudomonas fluorescens中(参见Retallack et al.,Prot Exp Purif.81,157-165)以可溶性形式进行生产，很容易达到1～2g/L。目前，许多市售的生物试剂，诸如rhGH、胰岛素或多种类型的细胞因子，都是在大肠杆菌E.coli中生产的(参见Graumann and Premstaller,(2006)Biotechnol J.1,164-186；Chadd and Chamow,(2001)Curr Opin Biotechnol.12,188-194)。就这一点而言，治疗结构域与Fab片段和其他治疗剂的基因连接在新的生物药剂的开发中具有很大优势，而且在改善目前生物药物的功效上也具有很大优势。进一步地，Fab分子可与其他抗体片段，诸如scFv、Fv、dsFv或dAb融合，以制备双特异性或三特异性的抗体分子(参见Lu et al.,(2002)J ImmunologMeth.267,213-226)。但是，Fab-效应物融合蛋白(其中效应物是真核生物来源的)的表达在大肠杆菌E.coli中受到了阻碍，因为效应物结构域由于在大肠杆菌E.coli中的不恰当折叠或缺乏糖基化过程而没有生物学功能。此外，还没有对大肠杆菌E.coli的细胞周质中生产Fab-效应物融合蛋白的最优化的融合形式进行彻底的研究。分子量小于50kDa至60kDa之间的大部分血清蛋白，诸如细胞因子和生长因子，由于肾清除率，而在体内具有较短的半衰期，例如从几分钟至几小时。因此，延长治疗性多肽或蛋白的血清半衰期是生物制药研究中最热衷研究的领域之一(参见Kontermann,(2012)Wiley,ISBN:978-3-527-32849-9)。为此，已经开发了多种方法，包括聚乙二醇化、聚唾液酸化、羟基化(HESylation)、糖基化，或与柔性且亲水性的氨基酸链(500～600个氨基酸)融合的重组的PEG类似物(参见Chapman,2002；Adv Drug Deliv Rev.54.531～545；Schlapschy et al.,(2007)Prot Eng Des Sel.20,273～283；Contermann(2011)Curr Op Biotechnol.22,868～876；Jevsevar et al.,(2012)Methods Mol Biol.901,233～246)。进一步地，也已直接或间接利用了FcRn介导的再循环机制，以延长治疗性蛋白的体内半衰期。在血清蛋白中，已知人类血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白(尤其是IgG)在FcRn介导的再循环机制中具有非常长的半衰期。在人体中，白蛋白的血清半衰期是19天，而依赖于IgG的子类，IgG分子的血清半衰期在一周至几乎4周之间。因此，已经使用这两种分子作为融合伴侣，以延长治疗性蛋白和/或(多)肽的半衰期。
在大肠杆菌E.coli的细胞质或细胞周质中制备的、经体外折叠过程之后的重组hGH(～19kDa)已经在临床上用来治疗婴儿和成人中由于缺乏生长激素而引起的疾病(参见Blethen et al.,(1997)J.Clin.Endocrinol.Metab.82,418-420)。rhGH给药中的一个主要不便之处是，由于半衰期短(<30分钟)而需进行每日注射。为了延长hGH的血清半衰期，尝试了聚乙二醇的化学缀合(参见Clark et al.,(1996)J.Biol.Chem.271,21969-21977；Pradhananga et al.,2002J Mol Endocrinol.29,1114；Cho et al.,2011；Sondergaardet al.,(2011)J Clin Endocrinol Metabol.96,681-688)，和改性的hGH与人源化的CovX-主体IgG(CovX-Body IgG)的臂的化学缀合(参见Palanki et al.,(2013)Bioorg.Med.Chem.Lett.23,402-406)。此外，通过人类血清白蛋白(HSA)
Figure BDA0000963629700000021
或包括几百个Pro-Ala-Ser(PAS)残基(PAS化(PASylation))的多肽序列的基因融合，成功延长了血清中的hGH的半衰期(参见Osborn et al.,2002Eur J Pharmacol.456,149-158；Anderson et al.,(2011)J Biol Chem.286,5234-5241；Sleep et al.,(2013)Biochimicaet Biophysica Acta.1830,5526-5534；Schlapschy et al.,(2013)Protein Eng DesSel.26,489～501)。这一类别中得到最好研究的是VRS-317，这是一种在N-末端和C-末端与XTEN氨基酸序列基因连接的rGH，其允许一个月的给药方案(参见Schellenberger et al.,(2007)Nat Biotech.27,1186-1190；Cleland et al.,(2012)J Pharm Sci.101,2744-2754；Yuen et al.,(2013)J Clin Endocrinol Metab.98,2595-2603)。另外，hGH与血管疾病(参见Thomas J Merimee et.al.,(1973),Diabetes,22,813-819)和CRETZFELDT-JAKOB疾病(参见John Powell-Jackson et al.,1985,Lancet,2,244-246)相关。此外，IFN-γ加速移植物抗宿主病(Graft-Versus-Host-Disease)(参见Bruce R.Blazar et.al.,2003,The Journal of Immunology,171,1272-1277)，并且IFN-α与自身免疫性疾病相关(参见AImagawa et al.,1995,The Journal of clinical endocrinology&metabolism,80,922-926)。另外，GSCF与自身免疫性疾病相关(参见Anke Franzke et al.,2003,Blood,102,734-739)，与HCV相关的肝病相关(参见Van Thiel DH et al.,1995,Hepato-gastroenterology,42,907-912)。
特别当以较低成本在微生物表达系统中生产Fab-融合蛋白时，Fab-融合蛋白(或多肽)作为治疗试剂具有治疗长期需要大剂量药物的慢性疾病的巨大潜力。虽然利用Fab具有上述可能的潜在优势，但是在开发具有延长的体内半衰期的蛋白或(多)肽药物中，还没有尝试应用抗血清白蛋白(SA)的Fab抗体。在这一方面，本发明人通过构建了新的抗血清白蛋白(SA)的Fab-效应物蛋白(或(多)肽)融合构建体，并且证实功能性融合构建体在大肠杆菌E.coli的细胞周质中具有很高产量，从而完成了本发明。
发明内容
【技术问题】
本发明要解决的技术问题是，提供一种具有延长的体内血清半衰期的新的抗原结合片段(Fab)。
本发明要解决的另一技术问题是，提供一种Fab-效应物部分的融合构建体，该Fab-效应物部分的融合构建体能在宿主细胞的细胞周质中进行优化的生产。
本发明要解决的又一技术问题是，提供一种以高产量、可溶形式生产的Fab-效应物构建体的表达载体和宿主细胞。
本发明要解决的又一技术问题是，提供一种包括上述融合构建体的药物组合物。
【技术方案】
为了解决上述问题，本发明提供了一种用于在大肠杆菌E.coli的细胞周质中表达的、优化的Fab-效应物的融合构建体(或类型)，其中所述Fab具有与重链恒定区1(CH1)结合的重链可变区，和与轻链恒定区(CL)结合的轻链可变区。
在本发明的一个实施方式中，考虑到多种治疗性蛋白与白蛋白或与白蛋白结合部分(诸如小肽或结构域抗体(dAb))的融合物，通过FcRn介导的再循环机制延长了治疗性蛋白的半衰期(参见Dennis et al.,(2002)Biochimica et Biophysica Acta.1830,5526-5534；Sleep et al.,(2013)Biochimica et Biophysica Acta.1830,5526-5534；Nguyenet al.,(2006)Protein Eng Des Sel.19,291-297；Kontermann,(2011)Curr OpBiotechnol.22,868～876)，从而选择人类抗SA的Fab作为抗体片段。根据之前的研究，静脉内给药之后，Fab片段在人类中具有16～20h的消除半衰期(参见Ujhelyi and Robert,(1995)Clin Pharmacokinet.28,483493)，在大鼠中具有～3h的消除半衰期(参见Nguyenet al.,2006Protein Eng Des Sel.19,291～297)。令人惊奇地是，本发明中的Fab(SL335)在大鼠中的半衰期是37h，这比常规人类Fab的长约11倍，因此有理由认为SL335在人类中可能具有至少160～200h(6～8天)的半衰期。同时，已知两种Vk结构域，对RSA的结合亲和力分别为13nM和1mM的dAbr3和dAbr16，在大鼠中分别具有t1/2值53h(dAbr3)和43h(dAbr16)(参见Holt et al.,(2008)Protein Eng Des Sel.21,283-288)。此外，对RSA的亲和力为92nM的Ab Fab4D5-H的t1/2b是26.9h(参见Nguyen et al.,2006)。因此，暗示了SL335的体内功能性与之前报道的dAb以及对SA具有特异性的肽的功能性相当。值得注意地是，SL335的VH和VL与之前报道的白蛋白特异性dAb，在全序列水平上仅共享65％～67％的氨基酸同源性，而在互补决定区(CDR)水平上共享～50％的氨基酸同源性(数据未示出)。具体地，在本发明的实施方式中，对血清白蛋白(SA)具有特异性的Fab包括：重链可变区，该重链可变区具有选自由SEQ ID NO.1(SA138VH:QVQLLQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYGISWVRQA PGQGLEWVGWINTYSGGTKYA QKFQGRVTMT RDTSISTVYM ELSGLKSDDTAVY YCARLGHCQRGICSDAL DTWGQGTLVTVSS)、SEQ ID NO.2(SA139VH:EVQLLQSGAE VKEPGASVKV SCKASGYTFS SYGISWVRQAPGQGLEWVGR INTYNGNTGYA QRLQGRVTMT TDTSTSIAYM EVRSLRSDDTAVY YCARLGHCQRGICSDALDTWGQGTMVT VSS)、SEQ ID NO.3(SA140VH:QVQLVQSGGG VVQTGGSLRL SCAASGFTFRNYGIHWVRQA PGKGLEWVAS ISYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSRNTVHV QMDSLRGGDTAVYYCARDVHYYGSGSYYNAF DIWGQGTLVT VSS)、SEQ ID NO.4(SA141VH:QVQLVQSGGG LVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWLSV ISHDGGFQYYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCARAGWLRQYGM DVWGQGTLVT VSS)、SEQ ID NO.5(SL18VH:EVQLVQSGTEVKKPGESLKI SCKISGYSFT AYWIAWVRQM PGKGLEWMGM IWPPDADARYS PSFQGQVTFS VDKSISTAYLQWHSLKTSDTAVY YCARLYSGSY SPWGQGTLVT VSS)和SEQ ID NO.6(SL301、SL310和SL335VH:QVQLVQSGGG PVKPGGSLRL SCAASGFMFR AYSMNWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGRYIHYA DSVKGRFTISRDNAKNSLYL QMNSLRAEDTAVY YCARETVMAGKAL DYWGQGTLVT VSS)组成的组中的氨基酸序列；和，轻链可变区，该轻链可变区具有选自由SEQ ID NO.7(SA130:ELVLTQSPSS LSASVGDRVTITCRASQSIS RYLNWYQQKP GKAPKLLIYG ASRLESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQSDSVPVTFGQ GTRLEIKR)、SEQ ID NO.8(SA139VL:DIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSISSYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPPYTFGQGTKLEIKR)、SEQ ID NO.9(SL18VL:ELVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSIF NYVAWYQQKPGQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSKWPPTWTFGQGTRVDIKR)、SEQ ID NO.10(SL301VL:ELVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASETVSS RQLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASSRATGIPD RFSGSGSGTD FTLTISRLEP EDSAVFYCQQ YGSSPRTFGG GTKLEIKR)、SEQ ID NO.11(SL310VL:ELVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVSS SSLAWYQQKP GQAPRLLIYGASSRATGIPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDAATYYCQK YSSYPLTFGQ GTKLEIKR)和SEQ IDNO.12(SL335VL:ELVLTQSPGT LSLSPGETAT LSCRASQSVG SNLAWYQQKP GQAPRLLIYGASTGATGVPA RFSGSRSGTD FTLTITSLQP EDFATYYCQQ YYSFLAKTFGQ GTQLEIKR)组成的组中的氨基酸序列。而且，上述Fab的VH结构域与重链恒定区1(CH1结构域)相连，并且Fab的VL结构域与轻链恒定区(CκL结构域)相连。进一步地，本发明的对血清白蛋白(SA)具有特异性的Fab包括在SL335的VH区中的SEQ ID NO.13(CDR1)(AYSMN)、SEQ ID NO.14(CDR2)(SISSSGRYIHYADSVKG)和SEQ ID NO.15(CDR3)(ETVMAGKALDY)的氨基酸序列，和在SL335的VL区中的SEQ ID NO.16(CDR1)(RASQSVGSNLA)、SEQ ID NO.17(CDR2)(GASTGAT)和SEQ IDNO.18(CDR3)(QQYYSFLAKT)的氨基酸序列。
在一个实施方式中，Fab的CH1结构域和CκL结构域中的半胱氨酸氨基酸可缺失或被丝氨酸残基取代。具体地，对于上述SL335，CH1结构域的半胱氨酸氨基酸是从该CH1结构域的N-末端起始的第233位氨基酸，而CκL结构域的半胱氨酸是从该CκL结构域的N-末端起始的第214位氨基酸，它们被丝氨酸残基取代。为了避免混淆，将构成Fab的H链和L链命名如下：1)Hcys：在第233位具有半胱氨酸的H链，2)Lcys：在第214位具有半胱氨酸的L链，3)Hser：在第233位具有丝氨酸的H链，和4)Lser：在第214位具有丝氨酸的L链。
在本发明的另一实施方式中，通过将效应物结构域经基因融合与Fab分子的Fd链或轻链的N-末端或C-末端连接，来构建Fab-效应物融合物。因为重组蛋白在大肠杆菌E.coli的细胞周质环境中的折叠和异源二聚化机制相当复杂，并且在很大程度上是未知的，因此不可预期哪种Fab-效应物融合物类型对于功能性表达是最佳的。
进一步地，在另一实施方式中，提供了一种抗原结合片段(Fab)和效应物结构域(生物活性效应物部分)的融合构建体，其中，Fab的CH1结构域的半胱氨酸氨基酸和CκL结构域的半胱氨酸氨基酸缺失或被丝氨酸残基取代；并且其中，所述生物活性效应物部分是蛋白或(多)肽；并且其中，所述Fab和所述生物活性效应物部分通过基因融合共价连接。可使用0～20个氨基酸的肽接头，通过基因融合使所述Fab和所述生物活性效应物部分共价连接。在包括本发明的hGH的六种Fab-效应物融合类型(或构建体)中，结果清楚地证明HserG/Lser在大肠杆菌E.coli中显示出最高的表达量。也就是说，按照本实施方式，通过缺失或被其他氨基酸残基取代去除CH1结构域中的Cys233以及CLk结构域中的Cys214，改善了SL335-融合效应物构建体在培养上清液中的可溶性表达。这样解决了三个重要问题。首先，效应物部分(例如hGH)与CH1的C-末端的融合，对于CLk的C-末端是优选的。之前，Lu et al.报道了，抗Flt-1的scFv与抗KDR的Fab的C-末端基因连接的产量比与CL结构域的C-末端连接的高4倍(参见Lu et al.,(2002)J Immunolog Meth.267,213-226)。尽管没有包括数据，但是本发明人使用大肠杆菌E.coli总裂解液进行蛋白印记(western blot)分析，显示出LcysG/Hcys和LserG/Hcys的Fd片段几乎完全降解，从而在大肠杆菌E.coli的上清液中没有检测到可溶形式的融合蛋白。因为VH结构域易于在大肠杆菌E.coli中聚集(Dudgeon et al.,(2009)Protein Eng Des Sel.22,217-220)，因此可推测，在CL的C-末端存在效应物结构域可能阻止VH结构域与VL结构域的相互作用以及CH1结构域与CL结构域的相互作用，从而导致Fd片段快速聚集并且降解。对比LserG/Hcys与LserG/Hser之间的可溶性表达量，发现CH1结构域中存在Cys233似乎加速了这一过程，这可能归因于异常二硫键的形成。在去除了CH1结构域中的Cys233之后，在CH1的末端存在的效应物结构域可能通过在VH-VL配对之前，部分阻挡了VH结构域上的疏水表面而对降低VH结构域的聚集具有有利影响。第二，CLk存在Cys214进一步以附加的方式恶化了SL335-hGH融合蛋白的可溶性生产。HserG/Lcys的产量比HserG/Lser低可解释为由于L链倾向于形成称为本周氏(Bence Jones)蛋白的同源二聚体(参见Kirsh etal.,(2005)J Immunol Methods.301,173-185)，其中，CLk的Cys214可对同源二聚体的稳定性起作用，或参与与融合蛋白中的其他半胱氨酸残基形成异常二硫键。还已知，Fab中的CH1与CL的C末端之间的二硫键是非常易变的，具有相当程度的灵活性(参见Rothlisberger etal.,(2005)J.Mol.Biol.347,773-789；Humphreys et al.,(2007)Protein Eng DesSel.20,227-234)。在这一方面，本发明提供了一种不含Cys233的重链恒定区1(CH1)和不含Cys214的轻链恒定区(CLk)的抗原结合片段(Fab)。同样，HerGF/Lser和HserIFNb/Lser在大肠杆菌E.coli中显示出最高的表达量。在本发明的融合构建体中，生物活性(多)肽(或蛋白)与Fab的摩尔比在1:1至10:1之间，优选在1:1至4:1之间。第三，SL335中存在的这两个C-末端半胱氨酸残基，一定程度上不但抑制了表达量还限制了抗hGH的抗体接近hGH结构域。如果干扰了效应物结构域与其配体之间的相互作用，则对于Fab-效应物融合物中的效应物结构域的治疗功能也是重要的。本发明人证明了，利用FabΔds作为融合伴侣不仅仅对hGH是有利的，因为对其他诸如G-CSF和IFN-b的效应物也产生了相同的结论。
在本发明的另一方面中，提供了表达载体和作为宿主细胞的突变体大肠杆菌E.Coli SUPEX5菌株(KCTC 12657BP)，来解决上述技术问题。通过对MC1061大肠杆菌E.Coli菌株进行随机化学诱变建立了这一菌株，其中选择MC1061大肠杆菌E.Coli菌株是因为该菌株来源于大肠杆菌E.Coli K12菌株，一种用于生产商用生物药物的主要宿主菌株之一。通过与亲本MC1061菌株进行对比，利用突变体SUPEX5大肠杆菌E.Coli菌株作为表达宿主进一步实现了对HserG/Lser生产的有利影响。通常，SL335-hGH融合物，以及Fabds与SUPEX5大肠杆菌E.Coli菌株的组合对Fab-效应物融合蛋白的可溶性表达都是有利的，这通过SL335-GCSF融合物(SL335wt-GCSF vs.SL335Δds-GCSF)、SL335-IFNβ融合物(SL335wt-IFNbvs.SL335Δds-IFNβ)、EGL4-hGH融合物(EGL4wt-hGH vs.EGL4Δds-hGH)和1β28-hGH融合物(1β28wt-hGH vs.1β28Δds-hGH)获得的结果得到了清楚地证明。因此，上述结果强有力地支持了，至少在SUPEX5大肠杆菌E.Coli菌株中，相对于常规Fab，利用FabΔds(没有CH1的Cys233和CLK的Cys214的Fab突变体形式)对Fab-效应物融合蛋白的可溶性表达是有利的。分子伴侣蛋白或二硫化物异构酶(FkpA、SurA、Skp、Sec A、Sec B、DsbA或Dsb C)的共表达会改善SL335wt-GCSF或甚至SL335Δds-GCSF的可溶性且功能性的表达，因为已知这些融合物提高可溶性Fab片段在大肠杆菌E.coli的细胞周质中的生产量(参见Schlapschy et al.,(2006)Escherichia coli.Protein Eng Des Sel.19,385-390)。本发明人相信，利用Fabds是有利，特别是当由于Fab-效应物融合蛋白在宿主细胞中的高表达，而使分子伴侣和在内质网中的二硫化物形成的催化机制超载时。
在本发明的一个实施方式中，尽管本发明中的分子大小增加了3倍，但使用培养瓶生产的SL335Δds-hGH的浓度约为10mg/L，这一产量高于之前的报道。按照之前的报道，对于rhGH在大肠杆菌E.coli的细胞周质中的可溶性表达的研究示出，pelB-hGH的产量是0.64～2.57mg/L并且ompA-hGH的产量是0.32～2.29mg/L(参见Sockolosky and Szoka,(2013)Protein Exp Purif.87,129-135)，而且rhGH的产量很大程度上依赖于所使用的启动子和宿主大肠杆菌E.coli菌株(参见Soares et al.,(2003)Protein Engineering.16,1131-1138)。通过简单的培养基优化，本发明人在使用培养瓶的培养上清液中通常获得～50mg/L的产量，这允许OD600nm＝～10～11(制备中的原稿)的细胞密度，通过对培养基组成和分批补料的培养系统进行精细调整，可进一步改善该细胞密度，以足以用于工业规模。
在本发明的另一方面，SL335ds-效应物蛋白示出对HSA的亲和力增加。在一个实施方式中，与亲本SL335相比，依赖于pH条件，SL335ds-hGH对HSA(人类血清白蛋白)的应答是提高的，为亲本SL335的5～9倍，对RSA(大鼠血清白蛋白)的应答是降低的，为1.3～4倍。抗体片段和效应物结构域的基因连接会影响抗体片段的抗原-结合亲和力，并且亲和力的变化很大程度上依赖于抗体片段、效应物结构域的性质以及如何连接这两个功能部分。不清楚的是，亲和力的这些差异是否是由没有链间二硫键或存在hGH融合结构域造成的。尽管如此，与IFN-a2b-DOM7h-14(其对人、小鼠和大鼠的SA的亲和力的降低分别为亲本DOM7h-14的7.7倍、22.3倍和15.8倍)(参见Walker et al.,(2010)Protein Eng Des Sel.23,271-278)相比，hGH融合物对SL335Δds与抗原的结合亲和力的影响似乎是可以忽略的。因此，相对于结构域Ab，Fab在维持亲和力和效应物折叠上具有优点，因为CH1和CL结构域提供了减小抗原结合区与结合至各配体的效应物结构域之间的位阻的空间。
在本发明的另一实施方式中，SL335Δds-hGH极大地延长了血清半衰期，其中，其t1/2(静脉内给药时为16.6h)与PEG5-hGH(250kDa)的t1/2类似(参见Clark et al.,1996)。有趣地是，SL335Δds-hGH的t1/2是
Figure BDA0000963629700000071
(t1/2＝2.96h)的5.6倍，并且SL335Δds-hGH与
Figure BDA0000963629700000072
之间的t1/2的差异在S.C.(皮下)给药中进一步扩大，达到16倍(97.2hvs.5.93h)(参见Osborn et al.,2002)，尽管这些对比是一种旁证，除非实验在相同设置下进行。类似地，IFN-a2b-DOM7h-14的t1/2也近似是HSA-IFN-a2b的1.5倍(参见Walker etal.,2010)。因此，似乎白蛋白-结合物的融合物提供了比具有白蛋白的融合物更长的半衰期，而潜在的机制还有待确定。值得注意的是，在I.V.给药中，SL335Δds-hGH的血清t1/2与VRS-317(t1/2＝15h)类似(Cleland et al.,(2012)J Pharm Sci.101,27442754)。这可能暗示，SL335Δds-hGH(称为
Figure BDA0000963629700000073
)可以执行比一周一次更长的或甚至一个月一次的给药方案。
在本发明的另一实施方式中，SL335Δds-hGH的药效学效果似乎远远好于
Figure BDA0000963629700000074
的药效学效果，并且考虑到一周给药一次的方案，有效性在摩尔基础上是
Figure BDA0000963629700000075
的7倍。不幸的是，我们不得不在第11天中断了两周的药效学研究，因为一些经过垂体切除术的大鼠，特别是属于仅赋形剂组的那些大鼠，提前死亡了。这似乎是因为在8月进行手术之后，从日本至韩国的长距离运输对动物产生了严重压力，这反映在属于仅赋形剂组的动物体重减少了5％，并且产生比我们预期更大的标准偏差。尽管如此，SL335Δds-hGH似乎仍明显具有被开发为长效hGH的巨大潜力，因而从现在起，我们将它称为
Figure BDA0000963629700000076
在本发明的另一实施方式中，与上述Fab融合的生物活性多肽是选自由激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体组成的组中的任一种。
在本发明的又一实施方式中，生物活性多肽是选自由人类生长激素、生长激素释放激素(GHRH)、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、集落刺激因子(CSFs)、胰高血糖素样肽、G蛋白偶联受体、白细胞介素、白细胞介素受体、酶、白细胞介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制子、转移生长因子(metastasis growth factor)、α1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、高度糖基化的促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子XIII、纤溶酶原激活因子、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素(angiostatin)、血管紧张肽、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、促甲状腺激素、自体毒素(autotaxin)、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、受体、受体拮抗体、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段组成的组中的任一种。
在本发明的另一方面中，提供了一种药物组合物，其中，该组合物包括本发明的Fab-效应物部分的融合构建体，以及药学上可接受的赋形剂，并且在体内具有增加的持续性。可通过多种方式将本发明的药物组合物给药至体内，这些方式包括口服给药、经皮给药、皮下给药、静脉内给药或肌肉给药，并且更优选的是，本发明的药物组合物可作为注射型制剂给药。进一步地，可使用本领域技术人员公知的方法来配制本发明的药物组合物，以在给药之后，提供活性成分的快速、持久或延迟的释放。上述制剂可为片剂、丸剂、粉末、小袋剂、酏剂、混悬剂、乳剂，汤剂(solution)、糖浆、气雾剂、软明胶胶囊和硬明胶胶囊、无菌注射溶液、无菌包装粉末等的形式。适当的载剂、赋形剂和稀释剂的实例是乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。进一步地，上述制剂可额外包括填充剂、防凝集剂、润滑剂，润湿剂、芳香剂、乳化剂、防腐剂等。
应理解地是，应当根据各种相关因素来确定实际给药的融合蛋白或多肽的量，所述因素包括要治疗的疾病，所选择的给药途径，个体患者的年龄、性别和体重，以及患者症状的严重程度；以及，活性成分的生物活性多肽的类型。因为本发明的融合蛋白在血液中具有非常优异的持续性，因此可显著减少包括本发明的融合蛋白的肽制剂的给药次数和频率。
如本文所使用的，除非上下文中另有清楚指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”也包括复数形式。进一步地，在一定程度上说明书和/或权利要求书中使用术语“包含/包括(including)”、“包含/包括(includes)”、“具有/有(having)”、“具有/有(has)”、“具有/带有/缀合(with)”、“诸如/如(such as)”或其变体，这样的术语不是限制性的，并且旨在表示与术语“包括(comprising)”的方式类似的含义。
在本发明中，“生物活性多肽或蛋白”是指当给予包括人类的哺乳动物时，表现出有用的生物活性的(多)肽或蛋白。
在本发明中，“Fab-效应物部分的融合构建体(或类型)”是其中生物活性(多)肽或蛋白与Fab共价连接的构建体。进一步地，“Fab-效应物部分的融合构建体(或类型)”理解为包含Fab-融合蛋白、Fab-融合(多)肽、融合构建体和融合物类型。
就此，实施例中详细描述了本发明。应注意，实施例的描述不限制如在本公开中描述的本发明的范围。
【有益效果】
在本发明中，提供了抗血清白蛋白FabΔds-相关(SAFA)技术，作为开发长效生物治疗剂的新的平台技术。在这方面，相对于包括聚乙二醇化、Fc-融合、AlbudAb技术和白蛋白-融合物的传统技术，本发明在体内的长时间作用、维持效应物结构域的构形、结合亲和力、简单生产及低成本程序方面具有优点。
附图说明
图1示出了单克隆噬菌体ELISA的结果，以确定抗-SA的Fab噬菌体抗体的结合特异性。
图2示出了通过ELISA对人类Fab克隆的抗原-结合特异性的确定。
图3示出了SL335的体内药代动力学。
图4是本研究所构建的六种SL335-hGH融合物类型的图解。
图5示出了ELISA的结果，以确定大肠杆菌E.coli培养上清液中，可溶性SL335-hGH融合物的产量和结合反应性。使用TMB底物使结合信号可视化，并且使用ELISA酶标仪测量450nm处的吸光度。数据表示三次实验的平均值±SD。
图6显示确定SL335和SL335-hGH变体的宿主E.coli-依赖的和温度依赖的表达(20℃，A；25℃，B；或30℃，C)的ELISA结果。
图7显示确定大肠杆菌E.coli培养上清液中，可溶性SL335-GCSF和SL335-IFNβ融合构建体的产量的ELISA结果。
图8显示确定大肠杆菌E.coli培养上清液中，可溶性EGL4-hGH(A)和1β28-hGH融合物(B)的产量的ELISA结果。
图9是通过SDS-PAGE和蛋白印记对SL335wt-hGH和SL335ds-hGH的分析结果。
图10是通过基于芯片的毛细管电泳对HcycG/Lcys和HserG/Lser的分析结果。
图11是通过MALDI-TOF质谱分析法对HcycG/Lcys和HserG/Lser的分析结果。
图12是使用FPLC，经由凝胶过滤对HserG/Lser的纯化。
图13示出了通过Nb2-11细胞增殖测定，对SL335ds-hGH的hGH体外生物活性的测定。
图14示出了通过ELISA和体外Nb2-11细胞增殖测定，对SL335ds-hGH的血清稳定性的测定。
图15是Growtropin或SL335ds-hGH在大鼠中的药代动力学分析。
图16示出了经
Figure BDA0000963629700000102
或SL335Δds-hGH处理的垂体切除的大鼠中，剂量依赖性的体重增加。N＝3只大鼠/处理组，每只大鼠每天进行一次体重测量。
图17示出了经
Figure BDA0000963629700000101
或SL335Δds-hGH处理的胫骨长度的剂量依赖性的增加。N＝3-4只大鼠/处理组，每只大鼠进行一次胫骨测量。
图18给出了本发明的pHEKA载体。
图19示出了本发明的pHEKA载体的核酸序列。
图20示出了由本发明的抗-SA的Fab克隆所利用的VH基因和VL基因的，推导出的氨基酸序列。
图21示出了由本发明的抗-SA的Fab克隆所利用的VH基因(A)和VL基因(B)的DNA序列。
图22示出了本发明的Fab-效应物融合构建体的序列信息。在接头和效应物结构域下面标有下划线，CDR以粗体示出。
具体实施方式
1、材料和分析
1-(1)克隆和菌株
按照标准程序(参见Sambrook et al.,(1989)分子克隆：实验指南，第二版(Molecular cloning:A laboratory manula,2nd ed.),(纽约，USA：冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)))，进行所有的DNA克隆实验。由韩国大田市的Bioneer合成用于构建SL335-效应物融合构建体的测序级的寡核苷酸和密码子优化的基因。除非另有说明，在94℃1min，58℃1min，且72℃1min进行25个循环，然后72℃10min的条件下，使用Pyrobest或Ex-Taq DNA聚合酶(Takara,tsu,日本)进行PCR扩增。还从Takara购买了限制性内切酶、虾碱性磷酸酶(SIP)和T4DNA连接酶。使用大肠杆菌E.coli MC1061菌株[araD139Del(araA-leu)7697Del(lac)X74galK16galE15(GalS)λ-e14-mcrA0relA1rpsL150(strR)spoT1mcrB1hsdR2](ATCC,马纳萨斯,USA)进行克隆，并且使用大肠杆菌E.coliSUPEX5进行重组蛋白表达。使用大肠杆菌E.coli TG1菌株{F'[traD36proAB+lacIqlacZΔM15]supE thi-1Δ(lac-proAB)Δ(mcrB-hsdSM)5,(rK -mK -)}(Agilent Technologies,帕洛阿尔托,USA)进行重组噬菌体的制备。
1-(2)HuDVFab-8L抗体库的生物淘选
按先前描述的方法(参见Joo et al.,(2008)J.Immunol.Methods.333,24-37；Huret al.,(2010)Immunol Lett.132,24-30)进行与靶标抗原结合的重组噬菌体的富集。简单来讲，在4℃，将缀合有人类、大鼠或小鼠的血清白蛋白(分别为HSA、RSA或MSA)(Sigma-Aldrich,圣路易斯,MO,USA)的甲苯磺酰化磁珠，与来自HuDVFab-8L抗体库(AprilBio,春川市(Chuncheon),韩国)的1010噬菌体混合4h，并且用含0.02％吐温(Tween)的磷酸缓冲盐水(PBST)冲洗三次。使用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸，pH 2)，洗脱与珠子结合的噬菌体抗体。使用经洗脱的噬菌体感染携带对应的轻(L)(VL+CLk)链的新鲜的TG1细胞，并且使TG1细胞生长在含25μg/ml氨苄青霉素、10μg/ml羧苄青霉素和10μg/ml四环素的2YT培养基(2×YT/ACT)中。然后，使用Ex-12辅助噬菌体(AprilBio)使重组噬菌体扩增，以用于随后的淘选。在最终淘选之后，进行单克隆噬菌体ELISA，以鉴定出阳性克隆。将来自阳性克隆的Fd(VH+CH1)基因亚克隆到pHg3A-3载体(AprilBio,春川市,韩国)中，并且使用在pLf1T-3噬菌粒载体(AprilBio)中的全部1.4108人类幼稚(humannave)kL链进行L链优化。
1-(3)-DNA测序分析
使用非凡质粒小提试剂盒(Wizard Plasmid Miniprep Kit)(Promega,麦迪逊(Medison),WI,USA)，从产生抗-SA的Fab分子的大肠杆菌E.coli细胞中，分离pHf1g3A-2(AprilBio)噬菌粒和pLf1A-3质粒(AprilBio)。使用与pHf1g3A-2或pLT-2互补的两种不同的测序引物(5'-gtgccgttctatagccatagcac-3'(SEQ ID NO:19)和5'-ggcactggctggtttcgctaccgtg-3'(SEQ ID NO:20))，分别读出VH和VL基因。由韩国大田市的SolGent进行DNA测序。
1-(4)pHEKA表达载体的构建
使用Pyrobest DNA聚合酶和一组PCR引物#1(5'-gggagatcttgaaatgagctgttgacaattaatcatccg-3'(SEQ ID NO:21))和#2(5'-cctctttaatttttaataataaagttaatcgataattcc-3'(SEQ ID NO:22))，通过PCR扩增，从pTrcHis-B载体(Invitrogen,卡尔斯巴德(Carlsbad),CA,USA)，获得含Bgl II限制位点+trc启动子+g10翻译增强子-核糖体结合位点(RBS)的DNA片段#1。使用PCR引物#3(5'-ggaattatcgattaactttattattaaaaattaaagaggtatatattaggatccgagc tcgagttctgca-3'(SEQ ID NO:23))和#4(5'-gggcactacgtgcgaaaggcccagtctttcgact-3'(SEQ ID NO:24))，通过PCR扩增，从与上述相同的模板获得含g10翻译增强子+RBS+BamH I+多克隆位点(MCS)+转录终止子的DNA片段#2。使用Ex-Taq DNA聚合酶和一组PCR引物#1和#4，进行链接PCR，以将这两条DNA片段组合在一起。通过琼脂糖凝胶电泳，分离得到的～520bp DNA片段。之后，使用Bgl II和Dra III对连接PCR产物和pET28a(Invitrogen)质粒进行限制性酶切，并且使用T4DNA连接酶在RT下保持2h，以使它们连接在一起。使用3ml连接反应液转化MC1061电感受态细胞，然后在含50μg/ml卡那霉素(Sigma-Aldrich)的2YT板上选择大肠杆菌E.coli转化株。为了将Fab基因亚克隆到pHEKA载体中，使用一组PCR引物#5(5'-ggccgcagatctgttaattaaggaggaatttaaagaattcatgaaaaaactgctgttcgcgattccgct-3'(SEQ ID NO:25))和#6(5'-gggaagcttattaacaagatttgggctcaactctcttgtcc-3'(SEQ ID NO:26))，从pHf1g3A-2噬菌粒载体，PCR扩增Fd(VH+CH1)链基因；并且，使用一组PCR引物#7(5'-gggggatccatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtg-3'(SEQ ID NO:27))和#8(5'-attcctccttaattaacagatctgcggccgcactcgagattaacactctcccctgttgaagctc tttgt-3'(SEQ ID NO:28))，从pLT-2质粒载体，PCR扩增L链基因。使用PCR引物#6和#7，通过链接PCR，将得到的Fd链基因片段和L链基因片段组合在一起，并且从琼脂糖凝胶中切出得到的大小为～1.4kbp的PCR产物。之后，使用BamH I和Hind III对PCR产物和pHEKA质粒进行限制性酶切，使用T4DNA连接酶在RT下保持2h，以使它们连接在一起，然后经电穿孔进入大肠杆菌E.coli MC1061或SUPEX5的电感受态细胞中。下面的表1中，示出在制备pHEKA表达载体时所使用的PCR引物。另外，图18示出了pHEKA表达载体的示意图。
【表1】
制备pHEKA表达载体的PCR引物
Figure BDA0000963629700000121
1-(5)-突变体大肠杆菌E.Coli SUPEX5菌株的建立
基本按照之前的工作所描述的进行化学诱变。简单来讲，使大肠杆菌E.coliMC1061细胞，生长在含50μg/ml氨苄青霉素的鲁尼肉汤(Luria Broth，LB)培养基中，至OD600为～0.3，其中大肠杆菌E.coli MC1061细胞表达与碱性磷酸酶(AP)融合的抗-人支链酮酸脱氢酶复合体-E2(BCKD-E2)scFv。通过在3,000g离心10min，收集在5ml培养物中所含的细胞，用冷的0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)冲洗两次。然后，将细胞重悬在1.9ml相同的缓冲液中，使用50μg/ml N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)(Sigma-Adrich,圣路易斯,MO,USA)，在37℃处理15min、30min和45min。在MNNG处理之后，混合细胞，冲洗两次，并且重悬在2ml LB培养基中。然后，如所述进行具有双膜系统的集落挖掘测定(colony lift assay)。简单来讲，用低蛋白结合能力的第一尼龙膜(0.45m Nytran N尼龙印记膜)(GE HealthcareLife Science,沃瓦托萨(Wauwatosa),WI,USA)，覆盖含50μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml羧苄青霉素的LB琼脂板。突变的细菌以106细胞/板的密度扩散到膜上，并且在37℃生长8h。同时，将第二硝酸纤维素膜(Bio-TraceTM NT硝酸纤维素转移膜)(PALL,华盛顿港(PortWashington),NY,USA)，铺放到含50μg/ml氨苄青霉素、10μg/ml羧苄青霉素和1mM异丙基--D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)(Sigma-Aldrich)的新鲜的LB琼脂板上。从LB琼脂板上移走第一尼龙膜，并且将第一尼龙膜放置到第二膜上，然后在37℃孵育5h。孵育之后，移去第一膜(具有菌落)，并且将第一膜放置到含50μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml羧苄青霉素的新鲜的LB琼脂板上，并且储存在4℃，用于稍后回收细菌。第二膜在含0.1％v/v Tween 20(PBS/Tween)的新鲜磷酸缓冲盐水中冲洗三次，持续10min，然后浸没在氯化硝基四氮唑蓝(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)底物(Duchefa,哈勒姆(Haarelem),荷兰)中，以使大肠杆菌E.coli菌落的AP可视化。从对应的第一滤膜上挑选出显示出区别性AP活性的大肠杆菌E.coli菌落，汇集在一起，并且进行第二轮诱变和集落挖掘测定。在第二轮集落挖掘测定之后，选择出试验性阳性的大肠杆菌E.coli菌落，并且使其生长在含50μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml羧苄青霉素的10ml 2YT培养基中，直至OD600达到0.5。将IPTG以0.1mM的终浓度添加到培养物中，并且使细胞在27℃生长过夜。然后，通过在3,300g离心20min，收获培养上清液。为了制备细胞周质提取物，将细胞沉淀块重悬在细胞周质提取缓冲液(2储存物；200mMTris-HCl，20mM EDTA，2M NaCl，pH 7.4)中，冻融三次，并且在4℃、10,000g离心20min。通过收获上清液，最终获得含可溶性抗-BCKD-AP融合物的细胞周质提取物。用含1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich)的PBS制备培养上清液和细胞周质提取物的系列稀释物，并且在96孔微量滴定板(SPL,韩国)中，50ml培养上清液或细胞周质提取物样品与100ml对硝基苯磷酸(pNPP)底物(Roche,南旧金山,CA,USA)混合。5～10min之后，向每一孔中添加25μl 3MNaOH以终止反应，并且使用ELISA酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)测量415nm处的吸光度。使示出抗-BCKD-AP融合物的表达增强的四株突变体大肠杆菌E.coli菌株(M#5、M#7、M#54和M#69)，在没有抗生素的2YT培养基中，在37℃生长过夜。然后，将细胞以～103细胞/板的密度涂布到LB琼脂板上，并且在37℃生长过夜。将得到的菌落复制到具有或没有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上。选择出在没有抗生素LB琼脂板中生长，但在具有抗生素的LB琼脂板中不生长的大肠杆菌E.coli菌落，并且使其在没有抗生素的2YT培养基中生长，直至OD600达到～1.0。通过添加甘油(20％v/v)来制备细胞储存物，并且储存在80℃。为了在克隆中使用，按照标准方案，使用突变株制备电感受态细胞，并且储存在80℃。将突变体大肠杆菌E.coli菌株之一M#5命名为SUPEX5(KCTC 12657BP)，并且用于表达Fab和Fab-效应物融合蛋白。
1-(6)-酶-连接的免疫吸附测定(ELISA)
对于单克隆噬菌体ELISA，通过噬菌体营救，从阳性大肠杆菌E.coli克隆中获得重组噬菌体，并且以～108CFU/孔添加到包被有5μg/ml HSA、RSA、MSA或BSA的MaxiSorb ELISA板(Nunc,罗斯基勒(Roskilde),丹麦)上。在37℃，在pH 6或pH 7.4下保持1h，使噬菌体能与抗原结合。使用缀合HRPO的山羊抗-人κL的Ab(Sigma-Aldrich)作为第二抗体。使用TMB底物(BD Science,圣荷西(San Jose),CA,USA)使结合信号可视化，并且使用ELISA酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)测量450nm处的吸光度。数据表示三次实验的平均值标准偏差。对于传统ELISA，将多种抗原[人类SA、大鼠SA、小鼠SA、猴SA(Alpha diagnositic Intl.,圣安东尼奥市,TX,USA)、犬SA(CUSABIO,中国湖北武汉)、兔SA(Sigma-Aldrich)、表皮生长因子受体(EGFR)(R&D systems,明尼阿波里斯市,MN,USA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)(R&Dsystems)、IL-15受体α(IL-15Rα)(R&D systems)、IL-1β(eBioscience,圣地亚哥,CA,USA)、CD16a(R&D systems)、c-MET(义翘神州生物技术有限公司(Sinobiological),中国北京)]，以5μg/ml的浓度固定至微量滴定板上，并且使Fab分子能与抗原结合，并且通过如上过程进行检测。为了确定可溶性Fab或Fab-hGH融合蛋白的浓度，使用小鼠抗-人IgG的Fd的mAb(AprilBio)作为捕获Ab，并且使用缀合HRPO的山羊抗-人κL链的pAb(Sigma-Aldrich)作为检测抗体，进行夹心法ELISA。使用具有已知浓度的人类Fab片段(Bethyl,蒙哥马利(Montgomery),TX,USA)来绘制标准曲线。使用T-20、对hGH的C-末端具有特异性的山羊pAb(Santacruz Biotechnology,达拉斯(Dallas),Tx,USA)和NYThGH、对全长hGH具有特异性的小鼠mAb(Prospec,东布朗士维克(East Brunswick),NJ,USA)检测hGH结构域，然后，分别使用缀合HRPO的兔抗山羊IgG的pAb(Sigma-Aldrich)或缀合HRPO的山羊抗小鼠IgG的pAb(Sigma-Aldrich)作为第二抗体。使用山羊抗人GCSF的pAb(R&D Systems)来检测G-CSF结构域，并且使用兔抗人IFN-β的pAb(PEPROTECH,洛基山(Rocky Hill),USA)来检测IFN-β结构域。
1-(7)-可溶性Fab和Fab-效应物融合蛋白的制备
可溶性Fab和Fab-hGH融合蛋白的生产通过使大肠杆菌E.coli SUPEX5细胞在37℃，在10ml或1L含50μg/ml卡那霉素的2YT培养基中生长，直至OD600nm＝0.5，然后添加0.05mMIPTG。伴随剧烈振荡，在20℃孵育20h之后，通过在3,300g离心20min，分离培养上清液和细胞沉淀块。如之前所述，获得细胞周质提取物。使培养上清液和/或细胞周质提取物通过固定有HSA(AprilBio)的琼脂糖(Sepharose)4B树脂，来进行纯化。在彻底冲洗之后，使用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸,10％甘油,pH 3)，洗脱结合到树脂上的Fab分子，之后立即用Tris缓冲液(0.5M Tris HCl，2M NaCl，pH 9.0)进行中和。在使用AKTA FPLC(GE Healthcare,沃瓦托萨(Wauwatosa),WI,USA)进行亲和纯化之后，还对HserG/Lser进行凝胶过滤。简单来讲，使用平衡缓冲液(20mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4)对HiprepTM16/60SephacrylTM S-200HRP再包装柱(repacked Column)进行平衡，并且上样5μl HserG/Lser(SL335Δds-hGH融合物)。使用平衡缓冲液在0.35Mpa报警压力下，以0.5μl/min的运行流速进行洗脱。如下所述，通过SDS-PAGE分析组分编号13、16、19和23。
1-(8)通过生物膜干涉法(biolayer interferometry)进行亲和力测量
除了使用AR2G(胺反应性第二代(Amine Reactive Second-Generation))传感器(Costin et al.,(2013)J Virol.87,52-66)之外，如前所述的，使用具有Octet RED系统(ForteBio,门洛帕克(Menlo park),CA,USA)的生物膜干涉法，进行在纯化的SL335与抗原(人类SA、大鼠SA或小鼠SA)之间的实时结合测定。简单来讲，使预定浓度的SL335与动力学级AR2G生物传感器偶联，并且通过在动力学缓冲液(1M乙醇胺，pH 8.5)中孵育，从传感器表面去除没有结合的Fab片段。然后，在pH 6.0或pH 7.4的条件下，使探针能与预定浓度的人类SA、大鼠SA或小鼠SA结合(人类SA在pH 6和pH 7.4下的浓度：200nM、100nM、50nM、25nM和12.5nM；大鼠SA在pH 6下的浓度：4mM、1mM、500nM、250nM和125nM；大鼠SA在pH 7.4下的浓度：4mM、2mM、1mM、500nM和125nM；小鼠SA在pH 6和pH 7.4下的浓度：20mM、10mM、5mM、2.5mM和12.5mM)，然后在pH 6或pH 7.4下，在含0.1％BSA的PBS中解离。使用Octet QK软件包计算结合和解离动力学，该Octet QK软件包适于1:1结合模型所观察到的结合曲线，以计算结合速率常数。使用至少三种不同浓度的人类SA、大鼠SA或小鼠SA，计算结合和解离速率常数。以动力学解离速率常数除以动力学结合速率常数的方式，计算平衡解离常数。
1-(9)SL335-hGH融合构建体的生成
为了创建SL335ds，通过PCR扩增，使用一组PCR引物#9(5'-ggggaatt catgaaatatctgctgcctacggcggcggcgggcctgctgctgctggctgcacaa-3'(SEQ ID NO:29))和#10(5'-gggaagcttttagctgctcttcggttccacgcgtt-3'(SEQ ID NO:30))，从SL335的密码子优化的Fd链基因，获得突变体Fd(Cys233Ser233取代)(称为Hser)。使用EcoR I/Hind III处理～750bp PCR产物，并且与pHEKA连接。还通过PCR扩增，从SL335的密码子优化的L链基因，使用一组PCR引物#11(5'-gggggatccatgaaaaaaactgcgattgcgattgcggtgctggccggctttg-3'(SEQ ID NO:31))和#12(5'-gggctcgagttagctttcgc cgcggttaaagctctttg-3'(SEQ ID NO:32))，获得突变体L链(Cys214→Ser214取代)(称为Lser)，经BamH I/Xho I切割并且克隆到含Hser的pHEKA中。用于生成HcysG/Lcys构建体的克隆程序如下：使用一组PCR引物#9和#13(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3'(SEQ ID NO:33))，从SL335的密码子优化的Fd，PCR扩增具有Cys233的野生型Fd(称为Hcys)；并且，还使用一组PCR引物#14(5'-ggttctgcaccagctcctggatcttttccgaccattccgctgagccg-3'(SEQ ID NO:34))和#15(5'-gggaagcttttagaagccgcaggagccctcca-3'(SEQ ID NO:35))，从密码子优化的hGH基因，PCR扩增含接头序列的hGH。使用一组PCR引物#9和#15，通过组合PCR(assembly PCR)将Hcys和hGH基因连接在一起，经EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含具有SL335的Cys214野生型L链的pHEKA中(称为Lcys)。为了生成LcysG/Hcys构建体，使用一组PCR引物#11和#16(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcattcgccgcggttaaagctcttt-3'(SEQ ID NO:36))，从SL335的密码子优化的L链，PCR扩增Lcys，并且还使用一组PCR引物#14和#17(5'-gggctcgagttagaagccgcaggagccctcca-3'(SEQ ID NO:37))，从密码子优化的hGH基因，PCR扩增含接头序列的hGH。使用一组PCR引物#11和#17，通过组合PCR连接Lcys和hGH基因，以生成LcysG，经BamH I/Xho I切割，并且克隆到含野生型Fd的pHEKA中。为了创建HserG/Lcys构建体，使用一组PCR引物#9和#18(5'-gggctcgagttagaagccgcaggagccctcca-3'(SEQ ID NO:38))，从密码子优化的野生型Fd链，PCR扩增Hser。如创建HcysG/Lcys构建体那样，进行含接头序列的hGH的PCR扩增、组合PCR和HserG的克隆。为了生成LserG/Hcys构建体，使用一组PCR引物#11和#19(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3'(SEQ ID NO:39))，从SL335的密码子优化的L链，PCR扩增Lser。如在创建LcysG/Hcys构建体中那样，进行含接头序列的hGH的PCR扩增、组合PCR和LserG的克隆。为了生成HerG/Lser构建体，除了使用含Lser的pHEKA进行克隆之外，如创建HserG/Lcys构建体那样，进行HserG和hGH的PCR扩增，以及组合PCR。除了使用含Hser的pHEKA进行克隆之外，如创建LserG/Hcys构建体那样，构建LserG/Hser。下面的表2中，示出了用于制备SL335-hGH融合构建体和SL335Δds-hGH融合构建体的PCR引物。
【表2】
用于SL335-hGH融合构建体或SL335Δds-hGH融合构建体的PCR引物
Figure BDA0000963629700000161
1-(10)-SL335-GCSF融合构建体的生成
生成HcysGF/Lcys构建体的克隆程序如下：使用一组PCR引物#9和#20(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctttcgccgcggttaaagctctttg-3'(SEQ ID NO:40))，从SL335的密码子优化的H链，PCR扩增Hcys，并且还使用一组PCR引物#21(5'-ggttctgcaccagctcctggatctgcgcctacctatcgcgcgagca-3'(SEQ ID NO:41))和#22(5'-gggaagcttattaaggctgtgccagatggcgcag-3'(SEQ ID NO:42))，从密码子优化的G-CSF基因，PCR扩增含接头序列的G-CSF。使用一组PCR引物#9和#22，通过组合PCR将Hcys和G-CSF基因连接在一起，经EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含SL335的L链的pHEKA中。为了生成LcysGF/Hcys构建体，使用一组PCR引物#11和#23(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcattcgccgcggttaaagctcttt-3'(SEQ ID NO:43))，从SL335的密码子优化的L链，PCR扩增Lcys，并且使用一组PCR引物#21和#24(5'-taacagatctgcggccgcactcgagattaaggctgtgccagatg gcgcag-3'(SEQ ID NO:44))，从密码子优化的G-CSF基因，PCR扩增含接头序列的G-CSF。使用一组PCR引物#11和#25(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctgc tcttcggttccacgcgtt-3'(SEQ ID NO:45))，通过组合PCR连接Lcys和G-CSF基因，经BamH I/Xho I切割，并且克隆到含SL335的Fd的pHEKA中。为了创建HserGF/Lser构建体，使用一组PCR引物#9和#25，从SL335的密码子优化的Fd，PCR扩增Hser。使用一组PCR引物#9和#22，通过组合PCR将Hser和G-CSF基因连接在一起，经EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含Lser的pHEKA中。为了生成LserGF/Hser构建体，使用一组PCR引物#11和#26(5-agatccaggagctggtgcagaaccgctttcgccgcggttaaagctctttg-3(SEQ IDNO:46))，从SL335的密码子优化的L链，PCR扩增Lser，并且还使用一组PCR引物#21和#24，从密码子优化的G-CSF基因，PCR扩增含接头序列的G-CSF。使用一组PCR引物#11和#25，通过组合PCR连接Lcys和G-CSF基因，经BamH I/Xho I切割，并且克隆到含Hser的pHEKA中。下面的表3中，示出了用于制备SL335-GCSH融合构建体和SL335Δds-GCSF融合构建体的PCR引物。
【表3】
用于SL335-GCSH融合构建体或SL335Δds-GCSF融合构建体的PCR引物
Figure BDA0000963629700000171
1-(11)SL335-IFN-b融合构建体的生成
用于生成HcysIFNb/Lcys构建体的克隆程序如下。使用一组引物引物#9和#27(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3'(SEQ ID NO:47))，从SL335的密码子优化的H链，PCR扩增Hcys，并且还使用一组PCR引物#28(5'-ggttctgcaccagctcctggatcttcatacaacctgctgggcttcctg-3'(SEQ ID NO:48))和#29(5'-gggaagcttttagttgcgcagatagccggtcag-3'(SEQ ID NO:49))，从密码子优化的IFN-b1a基因，PCR扩增含接头序列的IFN-b。通过一组PCR引物#9和#29，通过组合PCR，将Hcys和IFN-b1a基因连接在一起，经EcoRI/Hind III切割，并且克隆到含Lcys的pHEKA中。为了创建HserIFN-b/Lser构建体，使用一组PCR引物#9和#30(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3'(SEQ IDNO:50))，从SL335的密码子优化的H链，PCR扩增Hser。使用一组PCR引物#9和#29，通过组合PCR，将Hser和IFN-b1a基因连接在一起，经EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含Lser的pHEKA中。下面的表4中，示出了用于制备SL334-IFNb融合构建体和SL335Δds-IFNb融合构建体的PCR引物。
【表4】
用于SL335-IFNb融合构建体或SL335Δds-IFNb融合构建体的PCR引物
Figure BDA0000963629700000181
1-(12)EGL4-hGH融合构建体和1b28-hGH融合构建体的生成
已经从HuDVFab-8L抗体库(未公开,AprilBio Co.)中，分离出了EGL4、人类抗-EGFR的Fab和1b28、人类抗-IL-1b的Fab。为了创建EGL4wt和EGL4Δds，分别使用PCR引物组#5和#6，以及#5和#31(5'-gggaagcttattaactagatttgggctca actctcttg-3'(SEQ ID NO:51))，从EGL4cDNA的H链基因，PCR扩增Hcys和Hser。～750bp PCR产物经EcoR I/Hind III处理，并且与pHEKA连接，然后转化MC1061感受态细胞。分别使用PCR引物组#11和#32(5'-gggctcgagttagcattcgccgcggttaaagctcttt-3'(SEQ ID NO:52))，以及#11和#33(5'-gggctcgagttagctttcgccgcggttaaagctcttt-3'(SEQ ID NO:53))，从EGL4cDNA的L链基因，PCR扩增Lcys和Lser。它们经BamH I/Xho I切割，并且分别克隆到含EGL4的Hcys或Hser的pHEKA中。为了创建EGL4wt-hGH融合构建体，用于生成HcysG/Lcys构建体的克隆程序如下。使用一组PCR引物#5和#34(5'-agatccaggagctggtgcagaaccacaagatttgggctcaactctcttgtc-3'(SEQID NO:54))，从EGL4cDNA，PCR扩增Hcys，并且使用一组PCR引物#14和#15，从密码子优化的hGH基因，PCR扩增含接头序列的hGH。使用一组PCR引物#5和#15，通过组合PCR将Hcys和hGH基因连接在一起，经EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含EGL4的Lcys的pHEKA中。为了创建EGL4Δds-hGH融合构建体，使用一组PCR引物#5和#35(5'-agatccaggagctggtgcagaaccactagatttggg ctcaactctcttgtc-3'(SEQ ID NO:55))，从EGL4cDNA的H链，PCR扩增Hser，并且还使用一组PCR引物，从密码子优化的HGH基因，PCR扩增含接头序列的hGH。使用一组PCR引物#5和#15，通过组合PCR将Hser和hGH基因连接在一起，经EcoR I/Hind III切割，并且克隆到含EGL4Δds的Lser的pHEKA中。除了使用1b28cDNA作为PCR模板之外，如EGL4-hGH融合物那样，使用相同的PCR引物，创建1b28wt、1b28Δds、1b28wt-hGH和1b28Δds-hGH。下面的表5中，示出了用于制备EGL4-hGH融合构建体和1b28-hGH融合构建体的PCR引物。
【表5】
用于制备EGL4-hGH融合构建体和1b28-hGH融合构建体的PCR引物
Figure BDA0000963629700000191
1-(13)SDS-PAGE和蛋白印记分析
对于SDS-PAGE分析，将纯化的SL335wt-hGH蛋白和SL335Δds-hGH蛋白重悬在有或者没有
Figure BDA0000963629700000192
样品还原剂(Invitrogen)的
Figure BDA0000963629700000193
LDS样品缓冲液(Invitrogen)中，并且以7μg/孔的浓度加载到凝胶上。使用考马斯蓝染色(Bio-Rad)，使蛋白条带可视化。对于蛋白印记分析，如上将500ng亲和纯化的SL335wt-hGH和SL335Δds-hGH加载到每孔中，并且转移到硝酸纤维素膜上。使用在含0.01％Tween(Sigma-Aldrich)的PBS中的3％脱脂奶(Bio-Rad)对膜进行封闭，然后通过与缀合AP(Bethyl)的山羊抗人κL链的pAb孵育，来检测蛋白。将氯化硝基四氮唑蓝(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(BCIP)底物(Duchefa)添加到膜上，以使结合信号可视化。
1-(14)基于芯片的毛细管电泳
使用Agilent 2100生物分析仪系统(Agilent Technologies,圣克拉拉(SantaClara),CA,USA)，进行基于芯片的毛细管电泳。按照制造商的方案制备蛋白样品，并且在Protein 80试剂盒上进行分析，其中Protein 80试剂盒被推荐用于分析5～80kDa的蛋白。简单来讲，在分别用于还原或非还原电泳的有或没有DTT的情况下，将样品与样品缓冲液混合。使样品在95℃变性，并且加载到已填充了包含荧光染料和凝胶溶液的适当试剂的芯片上。然后，将芯片插入系统中，并且在系统上使用Expert 2100软件运行。标绘结果，以反映针对蛋白大小的荧光强度单位。
1-(15)MALDI-TOF质谱分析法
在Autoflex III Smartbeam装置((Bruker Daltonics,比勒利卡(Billerica),MA,USA)上，进行MALDI-TOF质谱分析法。将样品与相同体积的MALDI基质(10mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸)混合，并且点在MALDI靶标板上。使用肽和蛋白MALDI-MS校准试剂盒(Peptide and Protein MALDI-MS Calibration Kit,Sigma-Aldrich)，进行外部校准。在正离子模式下，分别为SL335wt-hGH融合物和SL335Δds-hGH融合物获取m/z范围为15000160000和1000070000的质谱。
1-(16)体外hGH生物活性的测定
使Nb2-11大鼠淋巴瘤细胞(Sigma-Aldrich)在37℃，潮湿的5％CO2培养箱中，生长在添加有5％马血清(Sigma-Aldrich)和1％青霉素链霉素(Invitrogen)的完全DMEM中(Tanakaet al.,1980)。将细胞用DMEM冲洗两次，在1,000g离心5min，并且以8×104细胞/ml重悬在含5％(v/v)马血清的DMEM中。将50μg等份的细胞悬浮液添加到96孔板的每一孔中，并且孵育过夜。然后，使用在含5％马血清的50ml DMEM中的、浓度逐渐增加的(0～20nM)
Figure BDA0000963629700000201
(未改性的rhGH；Dong-A Pharmaceuticals,首尔,韩国)或SL335Δds-hGH，在37℃处理细胞48h。孵育之后，将10μl CCK-8(Dojindo,益城町(Mashiki-machi),日本)添加到每一孔中，并且孵育4h。在酶标仪(Bio-Rad)上，记录波长450nm处的吸光度。
1-(17)SL335Δds-hGH的血清稳定性
将SL335wt和SL335Δds-hGH(10μg/ml终浓度)重悬在含0.03％叠氮化钠的胎牛血清(FBS)(Thermo Scientific,沃尔瑟姆(Waltham),MA,USA)中，并且在37℃孵育16天。每天采集少量等份样品(50ml)，并且在使用之前储存在-20℃。通过ELISA确定对HSA的结合反应性，并且如上所述，使用Nb2-11细胞(Sigma-Aldrich)测量hGH体外生物活性。
1-(18)体内药代动力学测定
在有资质的CRO公司(ChemOn,水原市(Suwon),韩国)中，进行了PK研究。以啮齿动物颗粒饲料的标准饮食和任意饮水条件下饲养动物，并将动物饲养在恒湿和恒温的、具有受控照明(12h照明，然后是12h黑暗)的房间中。简单来讲，以1mg/kg的量，分别将SL335和Neg Fab(不相关的人类Fab)静脉内(IV)或皮下(SC)注射到Sprague Dawley大鼠体内，每组三只，并且在几个时间点(对于I.V.为5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、24h、48h、96h和144h；而对于S.C.为5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、24h、48h和96h)获得血清样品。分别使用小鼠抗人IgG Fd的mAb和缀合HRPO的山羊抗人κL链的pAb作为捕获抗体和检测抗体，通过夹心法ELISA，测量血清样品中的SL335和Neg Fab的浓度。在测定中还包括已知浓度的人类Fab片段，以获得标准曲线。使用WinNonlin软件使(SL335和Neg Fab)血清浓度相对于时间的曲线拟合为非房室模型，并且使用Sigma Plot软件进行绘制。类似地，分别将
Figure BDA0000963629700000211
和SL335Δds-hGH静脉内或皮下注射到大鼠的体内，每组三至四只。对于I.V.给药，
Figure BDA0000963629700000212
和SL335Δds-hGH的剂量是0.3mg/kg，而对于S.C.给药，
Figure BDA0000963629700000213
和SL335Δds-hGH的剂量是0.6mg/kg。在几个时间点(对于
Figure BDA0000963629700000214
为5min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h和8h，而对于SL335Δds-hGH为5min、30min、1h、2h、4h、8h、24h、48h、96h和144h)，获得血清样品。使用hGH ELISA检测试剂盒(Genway,圣地亚哥(San Diego),CA,USA)测量血清样品中的
Figure BDA0000963629700000215
的量，并且使用如上所述的夹心法ELISA测量SL335Δds-hGH的量。使用PhoenixTM WinNonlin软件(6.2版)，使血清浓度相对于时间的曲线拟合为单房室模型。
1-(19)体内药效学测定
如前所述，在ChemOn，使用S.C.给药，在垂体切除的大鼠中分析
Figure BDA0000963629700000216
每日给药量和SL335Δds-hGH一周一次给药量在促进体重增加中的能力(参见Clark et al.,(1996)J.Biol.Chem.271,21969-21977)。简单来讲，购买垂体切除的Sprague Dawley幼小大鼠(Harlan,东京,日本)，并且在手术之后的第一个15天中增重超过7g的所有动物从研究中排除。将动物随机分成5个处理组(仅赋形剂，每日注射0.3mg/kg
Figure BDA0000963629700000217
和一周注射一次0.6mg/kg、1.2mg/kg或2.4mg/kg SL335Δds-hGH)。在起始给药方案之后，每天记录体重。使用骨卡尺，仔细测量胫骨的生长。使用方差分析，然后进行邓尼特多重比较检验(DunnettsMultiple Comparison Test)来进行统计学比较，而且认为p值小于0.05是具有显著性的。
2、实验结果
2-(1)抗-SA的Fab克隆的分离
在pH 6或pH 7.4的条件下，针对缀合有人类SA、大鼠SA或小鼠SA的磁珠，选择HuDVFab-8L抗体库。在三轮生物淘选之后，进行单克隆噬菌体ELISA，以鉴定出对抗原具有特异性的噬菌体抗体克隆。通过ELISA鉴定出超过60个阳性克隆(数据未示出)，并且对VH和VL基因进行DNA测序分析，鉴定出8个离散的噬菌体抗体，分别称为SA138、SA139、SA140、SA141、SL18、SL301、SL310和SL335。通过在pH 6或pH 7.4的条件下，进行单克隆噬菌体ELISA，确认这些克隆与人类SA、大鼠SA、小鼠SA或牛SA的结合反应性(图1A&图1B)。不管pH条件如何，三个噬菌体抗体克隆SA138、SA139和SA141都仅对人类SA有反应性。SA140仅在pH7.4下识别人类SA，但它在pH 6下结合反应性消失。另一方面，SL18、SL310和SL335在两种pH条件下都与人类SA、大鼠SA和小鼠SA结合，但具有稍微不同的强度。SL301在两种pH下与人类SA和大鼠SA具有显著反应性，而仅在pH 7.4下与小鼠SA的反应性弱。八个Fab克隆全部对牛SA没有反应性。因为对来自至少两种不同物种的SA具有交叉反应性，而对SL18、SL301、SL310和SL335进行了进一步表征。将四个噬菌体抗体克隆的Fd链和L链基因亚克隆到pHEKA载体中，用于在大肠杆菌E.coli中进行细胞周质表达，并且由培养上清液或细胞周质提取物制备可溶性Fab片段。在进行亲和纯化之后进行ELISA，以对比这些片段在pH 6(图2A)和pH7.4(图2B)的条件下，对人类SA、大鼠SA或小鼠SA的结合反应性。将浓度为5μg/ml的HSA、RSA、MSA或BSA固定在微量滴定板的每一个孔中，并且允许四种纯化的Fab分子(SL18、SL301、SL310和SL335)在pH 6(图2A)和pH7.4(图2B)下与抗原结合。使用缀合有HRPO的山羊抗人κL链的pAb作为第二抗体。使用TMB底物使结合信号可视化，并且使用ELISA酶标仪(Bio-Rad)测量450nm处的吸光度。数据表示三次实验的平均值标准偏差。在与人类SA结合中，结合信号的顺序在pH 6和pH 7.4下都是SL335>SL310>SL301>SL18。在大鼠SA结合中，顺序在pH 6下是SL335>SL310>SL301>SL18，而在pH 7.4下是SL335＝SL310>SL301＝SL18。在小鼠SA结合中，顺序在pH 6下是SL18>SL335>SL310，而在pH 7.4下是SL335>SL310>SL18。从图2看出，SL301在pH 6下不与小鼠SA结合，而且在pH 7.4下结合非常弱。发现不管pH条件如何，在四种Fab克隆中，都是SL335与人类SA和大鼠SA结合最好。SL335与人类SA的结合强度在pH 6下是其在pH 7.4下的两倍(50％结合信号为20ng/ml vs.40ng/ml)，是相同pH条件下与大鼠SA结合强度的20倍(50％结合信号为20ng/ml vs.400ng/ml)，并且在pH 7.4下是与大鼠SA结合强度的4倍(50％结合信号为40ng/ml vs.160ng/ml)。
2-(2)SL335的交叉反应性和结合亲和力
因为SL335是四种抗人类SA的Fab克隆中最好的结合物，因此通过ELISA进一步分析了它的交叉反应性。如图2所示，再现了与人类SA、大鼠SA和小鼠SA的结合反应性。还发现，SL335高度识别食蟹猴SA，但与犬SA的结合较弱。另外，SL335不识别兔SA，以及其它包括EGFR、EpCAM、IL-15Ra、IL-1b、CD16a或c-MET的不相关的抗原。经由生物膜干涉法，通过使不同浓度的抗原通过涂敷有SL335的生物传感器(参见下面的表6)，进一步测量了SL335在pH6或pH 7.4下对人类SA、大鼠SA和小鼠SA的结合亲和力。结果与图2中的ELISA数据的相关性很好，其中SL335对HSA的解离常数在pH 6下是9nM且在pH 7.4下是13nM，对RSA的解离常数在pH 6和pH 7.4下分别是122nM和65nM。SL335对MSA的结合亲和力在pH 6下约是10mM且在pH 7.4下约是1.6mM，但是这些数据由于缺少可靠性而没有示于表6中。
【表6】
通过生物膜干涉结合测定对SL335和HserG/Lser的结合亲和力的确定
Figure BDA0000963629700000231
使用Octet QK软件包，计算结合动力学和解离动力学。
2-(3)SL335的体内药代动力学
在所有的血浆蛋白中，HSA在FcRn介导的再循环机制中具有格外长的半衰期，并且通常用作延长治疗蛋白的半衰期的融合伴侣。此外，与血清白蛋白相关的抗体片段已知具有延长的血清半衰期。因此，进行了药代动力学分析，以证实SL335是否也具有长的血清半衰期。使用了具有未知结合特异性的人类Fab作为阴性对照(Neg Fab)。分别将1mg/kg的SL335和Neg Fab静脉内或皮下注射到大鼠体内，每组三只，并且在几个时间点(对于I.V.为5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、24h、48h、96h和144h，并且对于S.C.为5min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、24h、48h和96h)收集血清样品。分别使用小鼠抗人IgG Fd的mAb和缀合HRPO的山羊抗人κL链的pAb作为捕获抗体和检测抗体，通过夹心法ELISA，测量血清样品中的SL335和Neg Fab的浓度。在测定中还使用已知浓度的人类Fab片段，以获得标准曲线。使用WinNonlin软件使血清浓度对时间的曲线拟合为单房室模型(SL335和Neg Fab)，并且使用Sigma Plot软件使其拟合为双房室模型。在静脉内给药中，SL335的末期半衰期(t1/2)是37h，并且其曲线下面积(AUC0→∞)是187h mg/ml，这表示与Neg Fab(分别为3.8h mg/ml和7hmg/ml)相比，t1/2的增加为其10倍，而AUC0→∞的增加为其26倍(图3A)。SL335的皮下注射产生了类似的测量结果，包括与Neg Fab相比，t1/2的增加是其9倍(120h vs.13h)，而AUC0→∞的增加是其44倍(87vs.2h mg/ml)(图3B)。这些结果清楚地示出SL335具有延长的血清半衰期，并且暗示了SL335在大鼠中不会干扰RSA与FcRn之间的相互作用。
2-(4)SL335-hGH融合物的产生
通过将重组的hGH(27～191aa)经由短的肽接头，基因融合至Fd或L链的N-末端或C-末端，而使用SL335来创建两种SL335-hGH融合物和四种额外的SL335-hGH融合物。将重组的hGH cDNA(27～191aa)经由短的肽接头，融合至经典Fab形式的SL335wt的H链或L链的C-末端，从而产生两种融合类型(HcysG/Lcys和LcysG/Hcys)的构建体。除了使用无效形式(SL335无效)的SL335或ds Fab形式(SL335Δds)(其中CH1的C-末端的Cys233和/或CLk的C-末端的Cys214被替换成Ser)之外，与上面一样，构建了四种额外的融合类型(HserG/Lcys、LserG/Hcys、HserG/Lser和LserG/Hser)。对于融合蛋白的细胞周质表达，将ompA(MKKTAIAIAVLAGFATVAQA(SEQ ID No:56))前导序列置于L链或L-hGH融合物的上游，并且将pelB前导序列(MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(SEQ IN No:57))置于H链或H-hGH融合物的上游。在这些预备实验中，hGH与Fd链或L链的N-末端的基因连接，导致可溶性融合蛋白的低表达或不表达。hGH与Fd的C-末端的融合也示出低表达量，并且似乎中断了hGH结构域的折叠，这很可能是由于SL335-hGH融合物中的异常二硫键合导致的(数据未示出)。之前报道了通过突变CH1和CLk中的C-末端Cys残基(分别为Cys233和Cys214)而去除Fab的链间二硫键，不影响细胞周质生产水平、提取和纯化的稳定性、血清稳定性或血清半衰期(参见Kabat et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest；Humphreys et al.,(1997)J.Immunol.Methods.209,193202；Humphreys et al.,(2007)Protein Eng Des Sel.20,227234)。通过将CH1的Cys233和CLk的Cys214都替换成丝氨酸(Cys233Ser233和Cys214Ser214取代)，我们测试了SL335中的这些Cys残基是否调节SL335-hGH融合物的可溶性表达和适当的折叠。图4例示了六种SL335-hGH融合构建体。除了SL335wt和SL335Δds之外，还通过将CH1的Cys233或CLk的Cys214取代成Ser，以分别说明每一个半胱氨酸残基(Cys233或Cys214)的效果，而创建了被称为SL335无效的又一种SL335变体。两种SL335wt融合衍生物是HcysG/Lcys(与LCys214配对的HCys233-hGH融合物)和LcysG/Hcys(与HCys233配对的LCys214-hGH融合物)，两种SL335无效融合衍生物是HserG/Lcys(与LCys214配对的HSer233-hGH融合物)和LserG/Hcys(与HCys233配对的LSer214-hGH融合物)。最后，两种SL335Δds融合衍生物是HserG/Lser(与LSer214配对的HSer233-hGH融合物)和LserG/Hser(与HSer233配对的LSer214-hGH融合物)。在大肠杆菌E.coli SUPEX5宿主细胞中表达这六种SL335-hGH融合构建体，并且通过ELISA分析这六种SL335-hGH融合蛋白在培养上清液中的产量和HSA-结合反应性。在存在IPTG的相同条件下，使表达SL335-hGH融合蛋白的大肠杆菌E.coli克隆生长，并且通过简单的离心收获培养上清液。使用小鼠抗人Fd的mAb作为捕获Ab并且使用缀合HRPO的山羊抗人κL链的pAb作为检测抗体，通过夹心法ELISA，测量可溶性SL335-hGH融合物的浓度(图5A)。没有检测到来自LcysG/Hcys或LserG/Hcys的可溶性Fab形式。尽管没有示出数据，但是使用大肠杆菌E.coli细胞裂解液进行的蛋白印记显示出，Fd的Cys233对重链降解和不分泌Fd片段负责，这很可能是由于蛋白聚集导致的。HcysG/Lcys的产量是0.5μg/ml，并且HserG/Lcys和LserG/Hser的产量分别为约1.8μg/ml和1.4μg/ml(图5A)。有趣地是，HserG/Lser的产量是约4μg/ml，为HcysG/Lcys产量的8倍。细胞周质提取物示出相同的表达模式，但是总产量仅为在培养上清液中存在的产量的～30％(数据未示出)。在重复实验中，证实了在HcysG/Lcys和HserG/Lser之间产量的差异不依赖于大肠杆菌E.coli克隆的克隆变异或生长速率。使用包被有5μg/ml HSA的微量滴定板，与含SL335-hGH融合物的培养上清液的系列稀释液孵育，来对比SL335-hGH融合物与HSA的结合反应性。然后，使用缀合HRPO的山羊抗-人的κL链的pAb，检测与HSA结合的SL335-hGH融合物。如预期的那样，使用抗-人κL的pAb检测与HSA结合的HserG/Lser产生的结合信号是HcysG/Lcys的8倍，并且是HserG/Lcys和LserG/Hser的结合信号的约4倍(图5B)。当使用T-20、对hGH的C-末端具有特异性的山羊pAb来检测SL335-hGH融合物时，也观察到了类似的结合信号模式(图5C)。但是，在使用对全长hGH具有特异性的小鼠mAb NYThGH检测时，HserG/Lser产生的结合信号是HserG/Lcys和LserG/Hser的30倍，并且是HcysG/Lcys的结合信号的60倍(图5D)，这暗示SL335中存在的链间二硫键干扰了NYThGH与HcysG/Lcys的hGH结构域的结合。因为HcysG/Lcys和HserG/Lser分别表示利用SL335wt和SL335Δds来创建SL335-hGH融合物，因此在下文中，将它们分别称为SL335wt-hGH融合物和SL335Δds-hGH融合物(图5)。
为了确定可溶性SL335Δds-hGH融合物的高产量依赖于SL335中的链间二硫键的去除、宿主大肠杆菌E.coli菌株还是诱导温度，而在20℃(图6A)、25℃(图6B)或30℃(图6C)，在亲本MC1061以及突变体SUPEX5细胞中表达了SL335wt、SL335Δds、SL335wt-hGH融合物和SL335Δds-hGH融合物，并且通过ELISA测量了在培养上清液中的Fab分子的量。在MC1061菌株中表达的SL335wt的产量在20℃是1μg/ml，这是25℃和30℃下产量的约3倍。这意味着，当使用MC1061作为宿主菌株时，低于25℃诱导SL335wt是特别有利的。使用SUPEX5菌株也获得了类似的结果。在SL335Δds的情况中，不管宿主大肠杆菌E.coli菌株和诱导温度如何，在20℃下的产量都约为1.3μg/ml。这些结果示出，不管大肠杆菌E.coli宿主菌株如何，Fab中有或没有链间二硫键都不显著影响20℃下的可溶性Fab生产的产量。不管宿主大肠杆菌E.coli菌株和诱导温度如何，SL335wt-hGH融合物的产量都约为0.3～0.5μg/ml。另一方面，在MC1061菌株中表达的SL335Δds-hGH融合物的产量在20℃和25℃下都为1.8μg/ml，在30℃下为1.5μg/ml，这示出了较小的温度依赖性，然而，在SUPEX5菌株中表达的SL335Δds-hGH融合物的产量在20℃和25℃下都为4.0μg/ml，在30℃下为3.5μg/ml。这些结果意味着，利用SL335Δds形式和大肠杆菌E.coli SUPEX5菌株所获得的SL335-hGH融合蛋白产量是以SL335wt形式和大肠杆菌E.coli MC1061菌株的组合所获得的产量的12倍。
2-(5)SL335-GCSF、SL335-IFNb、EGL4-hGH和1b28-hGH融合构建体的生成
为了证明FabΔds形式和SUPEX5菌株对改善Fab-效应物融合蛋白的可溶性表达的有利效果，而生成了多种Fab-效应物融合构建体。首先，以与生成SL335wt-hGH和SL335Δds-hGH融合物相同的方式，创建了两种SL335-GCSF融合物变体(被称为SL335wt-GCSF的HcysGCSF/Lcys，被称为SL335Δds-GCSF的HserGF/Lser)和两种SL335-IFNb融合物变体(被称为SL335wt-IFNb的HcysIFNb/Lcys，被称为SL335Δds-IFNb的HserIFNb/Lser)，以确定效应物结构域的影响。将诱导温度设置为最优化的20℃，并且通过ELISA对比这些融合蛋白在大肠杆菌E.coli培养上清液中的表达量。SL335wt-GCSF在MC1061和SUPEX5中的产量分别为0.3mg/ml和0.6mg/ml，并且SL335Δds-GCSF在MC1061和SUPEX5中的产量分别为0.6mg/ml和1.5mg/ml(图7A)。另外，SL335wt-IFNb在MC1061和SUPEX5中的产量都约为0.16mg/ml，并且SL335Δds-IFNb在MC1061和SUPEX5中的产量分别为0.2mg/ml和0.5mg/ml(图7B)。因此，SL335Δds-GCSF融合物和SUPEX5菌株的组合的SL335-GCSF融合物产量是SL335wt-GCSF融合物和MC1061的组合的5倍，并且SL335Δds-IFNb融合物和SUPEX5菌株的组合产生的SL335-IFNb融合物形式的量是SL335wt-IFNb融合物和MC1061菌株的组合的约3倍。其次，我们还使用EGL4(人抗-EFGR的Fab)和1b28(人抗-IL-1b的Fab)创建了两种Fab-hGH融合构建体，以确定Fab的影响。以与生成SL335wt-hGH和SL335Δds-hGH融合物相同的方式，两种EGL4-hGH融合构建体是HcysG/Lcys类型的EGL4wt-hGH融合物和HserG/Lser类型的EGL4Δds-hGH融合物。同样，1b284-hGH融合构建体是HcysG/Lcys类型的1b28wt-hGH融合物和HserG/Lser类型的1b28Δds-hGH融合物。EGL4wt-hGH融合物在MC1061和SUPEX5菌株中的产量是8090ng/ml，并且EGL4Δds-hGH融合物在MC1061菌株中的产量是140ng/ml，而在SUPEX5菌株中的产量是220ng/ml(图8A)，这指示EGL4Δds-hGH融合物和SUPEX5宿主细胞的组合在培养上清液中产生的EGL4-hGH融合蛋白的量是EGL4wt-hGH融合物和MC1061宿主细胞的组合的2.4倍。在1b28-hGH融合构建体的情况中，1b284wt-hGH融合物的产量在MC1061菌株中是50ng/ml，并且在SUPEX5菌株中的产量是100ng/ml，1b28Δds-hGH融合物在MC1061菌株中的产量是900ng/ml，并且在SUPEX5菌株中的产量是4mg/ml(图8B)，这指示1b28Δds-hGH融合物和SUPEX5宿主细胞的组合在培养上清液中产生的1b28-hGH融合物形式的量是1b28wt-hGH融合物和MC1061宿主细胞的组合的800倍。
2-(6)SL335wt-hGH和SL335Δds-hGH的分子特征
进一步描述了SL335wt-hGH和SL335Δds-hGH融合物在分子水平上的特征。在培养上清液中的融合蛋白穿过包被有HSA的树脂进行亲和纯化，并且通过在还原和非还原条件下的SDS-PAGE和蛋白印记进行分析。使用HSA-固定的琼脂糖珠子，从培养上清液中亲和纯化HcysG/Lcys(泳道1)和HserG/Lser(泳道2)，并且使用4-12％Bis-Tris凝胶，在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE。使用考马斯蓝染色(图9A)使蛋白条带可视化。将各SDS-PAGE的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，并且使用缀合AP的山羊抗-人κL的Ab，检测Lcys和Lser(图9B)。使用NBT/BCIP底物，使结合信号可视化。在SDS-PAGE分析中，在还原条件下，SL335wt-hGH和SL335Δds-hGH都产生了分别对应于Fd-hGH融合物和L链的，大小为46kDa和23kDa的两条主要蛋白条带。正如所预期的那样，在非还原条件下，由于没有链间二硫键，SL335Δds-hGH产生了两条相同的蛋白条带。在SL335wt-hGH的情况下，可看到对应于SL335wt-hGH的正确异二聚体形式的主要的70kD蛋白条带。然而，还发现了很多不同大小的SL335wt-hGH衍生物，包括24kDa～45kDa的四条明显的未知蛋白条带，和大小对应于100kDa和135kDa的少数几个弱蛋白条带。从所有样品中，都可以看到大小为15kDa和12.5kDa的蛋白。然后，使用抗人Fd的mAb、抗-κL链的pAb和抗-hGH的pAb T-20，进行蛋白印记分析。在非还原条件和还原条件下(数据未示出)，使用抗-人Fd的mAb进行的印记，仅检测到大小为46kDa的HcysG和HserG。另一方面，在非还原条件下(图9B)，通过抗-κL链的pAb全部检测到SL335wt-hGH样品中的24kDa～45kDa的四条蛋白条带，以及比70kDa大的那些蛋白条带。这一结果指示，L链的Cys214至少经由形成异常二硫键，而对多种多聚体L链的形成负责。在非还原条件下(图9C)，使用T-20抗-hGH的pAb进行印记，正确识别出SL335wt-hGH的70kDa异二聚体形式，和SL335Δds-hGH的～45kDa的单体HerG。通过这些抗体的任意一种都没有检测到大小为15kDa和12.5kDa的蛋白，这暗示它们是来自融合物的降解产物，或者是来自大肠杆菌E.coli宿主蛋白的污染物。
基于芯片的毛细管电泳证实了SDS-PAGE分析。使用用于还原或非还原电泳的、有或没有DTT的样品缓冲液，来制备HcysG/Lcys(图10A)和HserG/Lser(图10B)，并且按照制造商的方案，使用蛋白80(Protein 80)试剂盒，经Agilent 2100生物分析仪系统，进行基于芯片的毛细管电泳。绘制结果以反映针对蛋白大小的荧光强度单位。在非还原条件下，SL335wt-hGH产生了大小在27.1kDa～52.4kDa范围内的SL335wt-hGH衍生物，而这些衍生物中有很多在有DTT的还原条件下消失了(图10A)。除了在分子量上有较小变化之外，SL335Δds-hGH在非还原条件和还原条件下，几乎产生了相同的蛋白质峰(图10B)。
使用MALDI-TOF质谱分析法，进一步分析了SL335wt-hGH和SL335Δds-hGH。在Autoflex III Smartbeam装置(Bruker Daltonics,比勒利卡(Billerica),MA,USA)上，进行了MALDI-TOF质谱分析法。将亲和纯化的HcysG/Lcys(图11A)和HserG/Lser(图11B)与MALDI基质混合，并且获取正离子模式的、在10000～150000Da的m/z范围中的谱图。获取SL335Δds-hGH的、在10000～70000的m/z范围中的质谱。获得SL335wt-hGH的、在15000～160000的m/z范围中的质谱，因为如图8A所示，SL335wt-hGH样品示出了大于70kDa的蛋白条带。鉴定出Lcys、HcysG和SL335wt-hGH的分子质量分别为23,226Da、46226Da和69,837Da(图11A)。比正确的SL335wt-hGH大的三个离散蛋白的大小为92,824Da、117,455Da和139,347Da。在SL335Δds-hGH的情况中，鉴定出Lser和HserG的分子质量分别为23,334Da和46,667Da(图11B)。与Lser相比，HserG的低峰可能表示了较大分子的较低电离效率，或者样品中存在比Lser低的HserG的摩尔比率。
通过使用FPLC，通过SephacrylS-200HR柱，进一步纯化经亲和纯化的SL335Δds-hGH。在使用SephacrylTM S-200HR预填充柱和AKTA FPLC(GE Healthcare,沃瓦托萨(Wauwatosa),WI,USA)进行了亲和纯化之后，进行HserG/Lser的凝胶过滤。使用平衡缓冲液(含150mM NaCl的20mM HEPES pH 7.4)对柱子进行平衡，并且加载经亲和纯化的HserG/Lser。使用平衡缓冲液，以0.5ml/min的运行流速进行洗脱。箭头指示选定用于SDS-PAGE分析的组分(图12A)。在还原条件下，通过4-12％Bis-Tris凝胶，分析了从两个不同峰取得的组分#13、#16、#19和#23(图12B)。使用考马斯蓝染色，使蛋白条带可视化。对应于约66kDa和25kDa的两个峰由来自#12～#27的组分可视化(图9A)。然后，在还原条件下，通过SDS-PAGE分析了四种组分(组分#13、#16、#19和#23)，以确定组分中的蛋白内容物(图9B)。结果示出了，来自66kDa峰的组分(组分#13、#16和#19)含有异二聚体SL335Δds-hGH，而来自25kDa峰的组分(组分#23)主要含有单体Lser。
2-(7)SL335Δds-hGH的体外功能表征
为了确定去除hGH的融合物和SL335wt中的链间二硫键是否影响HSA或RSA的结合亲和力，在pH 6和pH 7.4条件下，使用SL335Δds-hGH进行了生物膜干涉测定(参见下面的表6)。SL335Δds-hGH与HSA的解离常数在pH 6下是1.7nM且在pH 7.4下是1.5nM，显示出SL335Δds-hGH与HSA的亲和力分别是SL335的5倍和8.7倍。SL335Δds-hGH与RSA的解离常数在pH 6下为499nM且在pH 7.4下是83.6nM，显示出SL335Δds-hGH与RSA的亲和力的减小相对于SL335分别是4.2倍和1.3倍。
还使用Nb2-11大鼠淋巴瘤细胞，测量了SL335ds-hGH的体外hGH活性，其中Nb2-11大鼠淋巴瘤细胞经hGH处理，以浓度依赖的方式进行增殖。将Nb2-11大鼠淋巴瘤细胞以8×104细胞/ml的浓度重悬在含5％(v/v)马血清的DMEM中，并且将50μl等份的细胞悬浮液添加到96孔板的每一孔中，然后孵育过夜。然后，使用在含5％(v/v)马血清的DMEM中的、浓度渐增的
Figure BDA0000963629700000281
或HserG/Lser，在37℃对细胞处理48h。在孵育之后，将10μlCCK-8溶液添加到每一孔中，并且将细胞孵育4h。在酶标仪上，记录450nm波长处的吸光度。数据表示三次实验的平均值SD。在没有HSA时，SL335Δds-hGH能够刺激Nb2-11的生长，具有50pM(3.5ng/ml)的明显的EC50(图13A)。该值与rhGH标准(7.5pM)
Figure BDA0000963629700000282
的有效性相比减小的倍数为6.7倍。在有10mM HSA时，
Figure BDA0000963629700000283
和SL335Δds-hGH各自的效能很大程度上没有受到影响，虽然与
Figure BDA0000963629700000284
相比，SL335Δds-hGH的效能表现出约5倍的降低(图13B)。用作阴性对照的SL335没有示出任何增殖效果。这些结果清楚地证明，SL335Δds-hGH具有hGH功能性生物活性。
然后，将SL335Δds-hGH在37℃孵育16天，以确定血清稳定性。使用FBS(而不是人血清)来重悬样品，因为SL335Δds-hGH和SL335与人血清中的HSA的结合能力会使后续实验复杂化。一天收集一次样品，并且通过ELISA(图14A)和Nb2-11细胞增殖测定(图14B)，分别测量HSA-结合反应性和体外生物活性。仍使用SL335作为对照。与SL335类似，甚至在37℃孵育16天之后，SL335Δds-hGH与HSA的结合反应性以及Nb2-11增殖活性也没有发生变化，这证明尽管没有链间二硫键，SL335Δds-hGH也与SL335一样稳定。
2-(8)大鼠中的药代动力学和药效学研究
因为SL335Δds-hGH示出是长效hGH的有希望的候选物，因此进行了体内功效研究。首先，在单次静脉内或皮下注射之后，通过测量每一类似物作为时间函数的血清水平，对比了
Figure BDA0000963629700000285
和SL335Δds-hGH在大鼠体内的药代动力学。向每组大鼠(一组四只)，皮下注射(图15A)单次剂量0.6mg/kg的Growtropin或SAFAtropin，或静脉内注射(图15B)单次剂量0.3mg/kg的Growtropin或SAFAtropin。取决于蛋白，在延伸至144h的期间，间隔采集血清样品。如上所述，通过ELISA，以所示次数分析
Figure BDA0000963629700000286
或
Figure BDA0000963629700000287
的血清样品。药代动力学参数示于表7中。
【表7】
大鼠体内，Growtropin或SAFAtropin的单次静脉内或皮下注射给药的药代动力学参数
Figure BDA0000963629700000291
示出的值是平均值标准偏差。缩写如下：Cmax：最高浓度；t1/2：末期半衰期；AUC0→∞：推测至无穷大的浓度-时间曲线下面积；Cl/f：明显的总血浆清除率。
不论给药途径如何，SL335Δds-hGH都示出t1/2的大幅延长。在静脉内给药中，SL335Δds-hGH的t1/2的增加是Growtropin的83倍(16.6h vs.0.2h)，在皮下给药中，其增加是68倍(97.2h vs.1.4h)。
不管给药途径如何，与
Figure BDA0000963629700000292
相比，SL335Δds-hGH的AUC0→∞的增加是
Figure BDA0000963629700000294
的10倍，清除率(Cl/f)的减慢是
Figure BDA0000963629700000293
的超过10倍。对于每一组大鼠(一组四只)，通过皮下注射单一剂量的0.6mg/kg Growtropin或SAFAtropin，或静脉注射单一剂量的0.3mg/kg Growtropin或SAFAtropin给药。取决于蛋白，在延伸至144h的使间隔中，采集血清样品。如上所述，通过ELISA，以所示次数分析
Figure BDA0000963629700000295
或
Figure BDA0000963629700000296
的血清样品。有趣地是，取决于给药途径，SL335Δds-hGH的Cmax值的降低分别是
Figure BDA0000963629700000297
的6倍和3倍。
接下来，在每日S.C.给药
Figure BDA00009636297000002912
或赋形剂缓冲液对照(仅赋形剂)，或一周S.C.给药一次SL335ds-hGH之后，对比10天中垂体切除的大鼠的生长率。垂体切除的大鼠经仅赋形剂处理或每日经0.3mg/kg
Figure BDA00009636297000002913
处理，或在第0天和第7天使用剂量渐增的
Figure BDA0000963629700000298
处理。实线指示体重的平均百分比变化。误差棒表示标准偏差。经赋形剂处理的大鼠示出约5％的失重。然而，接受每天注射
Figure BDA0000963629700000299
(0.3mg/kg)的大鼠示出5％的体重增加，也就是相对仅赋形剂组产生总共10％的体重增加。一周注射一次SL335Δds-hGH产生剂量依赖性的体重增加，其中，2.4mg/kg的剂量产生15％的体重增加，而0.6mg/kg的剂量产生3.5％的体重增加。等摩尔的SL335Δds-hGH(1.2mg/kg)剂量方案得到5％的体重增加，这与每日注射
Figure BDA00009636297000002910
获得的体重增加相当。
图17示出了一周给药一次0.6mg/kg SL335Δds-hGH实现了与每日给药
Figure BDA00009636297000002911
等量的，胫骨长度的增加。实心棒指示测量的胫骨长度的平均值。误差棒表示标准偏差。
【工业实用性】
因为可制备本发明的融合构建体，以包括多种类型的效应物部分(包括人类生长激素、干扰素、促红细胞生成素、集落刺激因子或其衍生物，以及抗体衍生物等)，因此能使用本发明来开发生物活性蛋白或多肽治疗剂。
本文中所引用的所有专利、公开申请或参考文件的教导都通过引用整体并入本文中。
Figure BDA0000963629700000301
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Figure IDA0000963629790000391
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Claims (29)

1.一种针对血清白蛋白(SA)的抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段包括：
(a)重链可变区VH结构域，具有选自由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6组成的组中的氨基酸序列；和
(b)轻链可变区VL结构域，具有选自由SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12组成的组中的氨基酸序列；
其中，半胱氨酸氨基酸缺失，或者被除了半胱氨酸之外的其它任意氨基酸残基取代；
其中，经缺失或取代的半胱氨酸用于CH1结构域中重链和轻链之间的二硫键，或用于CκL结构域中重链和轻链之间的二硫键，或用于CH1结构域中重链和轻链之间以及CκL结构域中重链和轻链之间的二硫键；
其中，所述抗原结合片段特异性结合血清白蛋白。
2.一种结合血清白蛋白(SA)的抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段包括：
(a)决定VH结构域的CDR的SEQ ID NO.13(CDR1)、SEQ ID NO.14(CDR2)和SEQ ID NO.15(CDR3)的氨基酸序列；和
(b)决定VL结构域的CDR的SEQ ID NO.16(CDR1)、SEQ ID NO.17(CDR2)和SEQ ID NO.18(CDR3)的氨基酸序列；
其中，半胱氨酸氨基酸缺失，或者被除了半胱氨酸之外的其它任意氨基酸残基取代；
其中，经缺失或取代的半胱氨酸用于CH1结构域中重链和轻链之间的二硫键，或用于CκL结构域中重链和轻链之间的二硫键，或用于CH1结构域中重链和轻链之间以及CκL结构域中重链和轻链之间的二硫键；
其中，所述抗原结合片段特异性结合血清白蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合片段，其中，所述VH结构域与重链恒定区1CH1结构域相连，并且所述VL结构域与轻链恒定区CκL结构域相连。
4.根据权利要求1或2所述的抗原结合片段，其中，所述VH结构域具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列，并且所述VL结构域具有SEQ ID NO.12的氨基酸序列。
5.一种生物活性效应物部分与根据权利要求1或2所述的抗原结合片段的融合构建体，其中，所述生物活性效应物部分是蛋白或多肽；并且其中，所述抗原结合片段和所述生物活性效应物部分通过基因融合共价连接。
6.一种表达载体，包括：(a)启动子，(b)编码权利要求或2所述的抗原结合片段的第一核酸序列；和(c)编码生物活性多肽或蛋白以及可选的接头的第二核酸序列，其中，所述启动子、所述第一核酸序列和所述第二核酸序列被可操作地连接在一起。
7.一种宿主细胞，包括权利要求6所述的表达载体。
8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是大肠杆菌E.coli。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是SUPEX5 KCTC 12657BP。
10.一种提高生物活性蛋白或多肽在大肠杆菌E.coli的细胞周质中的可溶性表达的方法，包括将权利要求6所述的表达载体引入大肠杆菌E.coli中。
11.根据权利要求10所述的提高生物活性蛋白或多肽在大肠杆菌E.coli的细胞周质中的可溶性表达的方法，其中，所述大肠杆菌E.coli是SUPEX5 KCTC 12657BP。
12.一种增加生物活性蛋白或多肽的体内半衰期的方法，该方法包括通过基因融合，使生物活性蛋白或多肽与权利要求1或2所述的抗原结合片段连接在一起。
13.根据权利要求12所述的增加生物活性蛋白或多肽的体内半衰期的方法，其中，所述生物活性蛋白或多肽通过具有0～20个氨基酸的肽接头与抗原结合片段连接在一起。
14.根据权利要求12所述增加生物活性蛋白或多肽的体内半衰期的方法，其中，生物活性蛋白或多肽是选自由人类生长激素(hGH)、生长激素释放激素(GHRH)、生长激素释放肽、干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、胰高血糖素样肽、白细胞介素、酶、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制子、转移生长因子、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子XIII、纤溶酶原激活因子、纤维蛋白结合肽、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、瘦蛋白、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张肽、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、促甲状腺激素、自体毒素、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、受体、受体拮抗体、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段组成的组中的一种。
15.根据权利要求12所述增加生物活性蛋白或多肽的体内半衰期的方法，其中，生物活性蛋白或多肽是选自由α1-抗胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、链激酶、超氧化物歧化酶、因子VIIa、干扰素受体、G蛋白偶联受体、白细胞介素受体、细胞因子结合蛋白、高度糖基化的促红细胞生成素和粒细胞-集落刺激因子(GCSF)组成的组中的一种。
16.根据权利要求12所述增加生物活性蛋白或多肽的体内半衰期的方法，其中，生物活性蛋白或多肽是白细胞介素结合蛋白。
17.根据权利要求1或2所述的抗原结合片段，其中，所述除了半胱氨酸之外的其它任意氨基酸残基是丝氨酸。
18.根据权利要求5所述的融合构建体，其中，所述除了半胱氨酸之外的其它任意氨基酸残基是丝氨酸。
19.根据权利要求5所述的融合构建体，其中，所述抗原结合片段和生物效应物部分通过基因融合由具有0～20个氨基酸的肽接头共价连接。
20.根据权利要求5所述的融合构建体，其中，所述生物活性效应物部分是选自由激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体组成的组中的一种。
21.根据权利要求5所述的融合构建体，其中，所述生物活性效应物部分是选自由人类生长激素(hGH)、生长激素释放激素(GHRH)、生长激素释放肽、干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、胰高血糖素样肽、白细胞介素、酶、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制子、转移生长因子、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子XIII、纤溶酶原激活因子、纤维蛋白结合肽、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、瘦蛋白、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张肽、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、促甲状腺激素、自体毒素、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、受体、受体拮抗体、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段组成的组中的一种。
22.根据权利要求5所述的融合构建体，其中，所述生物活性蛋白或多肽是选自由α1-抗胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、链激酶、超氧化物歧化酶、因子VIIa、干扰素受体、G蛋白偶联受体、白细胞介素受体、细胞因子结合蛋白、高度糖基化的促红细胞生成素和粒细胞-集落刺激因子(GCSF)组成的组中的一种。
23.根据权利要求5所述的融合构建体，其中，所述生物活性蛋白或多肽是白细胞介素结合蛋白。
24.根据权利要求5所述的融合构建体，其中，所述生物活性效应物部分与抗原结合片段的摩尔比在1:1至10:1之间。
25.根据权利要求10所述的提高生物活性蛋白或多肽在大肠杆菌E.coli的细胞周质中的可溶性表达的方法，其中，所述生物活性蛋白或多肽是选自由激素、细胞因子、酶、抗体、生长因子、转录因子、血液因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白和受体组成的组中的一种。
26.根据权利要求10所述的提高生物活性蛋白或多肽在大肠杆菌E.coli的细胞周质中的可溶性表达的方法，其中，所述生物活性蛋白或多肽是选自由人类生长激素(hGH)、生长激素释放激素(GHRH)、生长激素释放肽、干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、胰高血糖素样肽、白细胞介素、酶、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制因子、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制子、转移生长因子、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶受体激活肽、血栓调节蛋白、因子VII、因子VIII、因子IX、因子XIII、纤溶酶原激活因子、纤维蛋白结合肽、水蛭素、蛋白C、C反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、瘦蛋白、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、血管抑素、血管紧张肽、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、胰岛素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、促黄体激素、促黄体激素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、胆囊收缩素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、促甲状腺激素、自体毒素、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、受体、受体拮抗体、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段组成的组中的一种。
27.根据权利要求10所述的提高生物活性蛋白或多肽在大肠杆菌E.coli的细胞周质中的可溶性表达的方法，其中，所述生物活性蛋白或多肽是选自由α1-抗胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、链激酶、超氧化物歧化酶、因子VIIa、干扰素受体、G蛋白偶联受体、白细胞介素受体、细胞因子结合蛋白、高度糖基化的促红细胞生成素和粒细胞-集落刺激因子(GCSF)组成的组中的一种。
28.根据权利要求10所述的提高生物活性蛋白或多肽在大肠杆菌E.coli的细胞周质中的可溶性表达的方法，其中，所述生物活性蛋白或多肽是白细胞介素结合蛋白。
29.根据权利要求24所述的融合构建体，其中，所述生物活性效应物部分与抗原结合片段的摩尔比在1:1至4:1之间。
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