ES2866848T3 - Construcción de fusión del Fab contra la seroalbúmina a una entidad efectora, y el procedimiento de preparación de la misma - Google Patents

Construcción de fusión del Fab contra la seroalbúmina a una entidad efectora, y el procedimiento de preparación de la misma Download PDF

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Abstract

Un fragmento de fijación a antígeno (Fab) contra una seroalbúmina (SA), en donde el Fab comprende, (a) un dominio variable de cadena pesada (dominio VH) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.º 1, SEQ ID n.º 2, SEQ ID n.º 3, SEQ ID n.º 4, SEQ ID n.º 5 y SEQ ID n.º 6; y (b) un dominio variable de cadena ligera (dominio VL) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.º 7, SEQ ID n.º 8, SEQ ID n.º 9, SEQ ID n.º 10, SEQ ID n.º 11 y SEQ ID n.º 12, en donde el Fab se fija específicamente a la seroalbúmina.

Description

DESCRIPCIÓN
Construcción de fusión del Fab contra la seroalbúmina a una entidad efectora, y el procedimiento de preparación de la misma
Campo de la técnica
La presente descripción se refiere a un fragmento de fijación a antígeno (Fab) y a una proteína de fusión Fab-efector que lo comprende.
Antecedentes de la invención
La preparación de fragmentos de fijación a antígenos (Fab) es uno de los agentes terapéuticos de tipo anticuerpo monoclonal más exitosos. Por ejemplo, el abciximab (ReoPro®), el ranibizumab (Lucentis®) y el certolizumab pegol (Cimzia®), etc, ya se han autorizado como fármacos en muchos países. Además, las preparaciones de Fab policlonales que incluyen el abciximab (ReoPro®), el ranibizumab (Lucentis®) y el certolizumab pegol (Cimzia®) están disponibles comercialmente en la UE.
La conjugación de un dominio de efector exógeno puede conferir efectos terapéuticos a los fragmentos Fab, cuando adquieren un formato de fusión Fab-efector. Por lo tanto, de hecho, muchos fragmentos de anticuerpo en el estado de desarrollo clínico están conjugados a una entidad funcional exógena. En tal construcción de proteína de fusión con Fab (o construcción de Fab con entidades efectoras), el fragmento de fijación al antígeno puede aportar el envío específico sobre la diana, y la proteína o (poli)péptido (dominio efector) de la fusión puede aportar los efectos terapéuticos. Los dominios de fusión cuyo origen es procariota pueden incluir citotoxinas, por ejemplo, la desBuganina (una toxina vegetal desinmunizada) (véase Entwistle et al., (2012) Cáncer Biother Radiopharm. 27, 582-92), la enterotoxina estafilocócica (véase Ilack et al., (2003) Toxicology. 185, 161-174) o una forma mutante de la exotoxina de Pseudomonas (véase Choe et al., (1994) Cancer Res. 3460-3467; véase Kreitman et al., (1994) Int. J. Cancer 57, 856-864). Además, los dominios de fusión que comprenden polipéptidos de eucariotas, tales como, scFv (véase Lu et al., (2002) J. Immunolog. Meth, 267 213-226) o citocina (véase Holzer et al., (1996) Cytokine. 8, 214-221; véase Sjogaard et al., (1999) Int. J. Oncol. 15, 873-882) pueden funcionar como fármacos. Aunque el isótopo radiactivo está conjugado químicamente a un fragmento Fab o (Fab')2 en general, la citotoxina, citocina o enzima está fusionada genéticamente a Fab o (Fab')2. Se sabe que las moléculas de tipo Fab, a diferencia de scFv, Fv o dsFv, se pueden producir con facilidad hasta de 1 a 2 g/l de forma soluble en el periplasma de E. coli (véase Humphreys et al., J. Immunol. Methods, 209, 193-202; Carter et al., Biotechnology (NY), 10, 163167; Venturi et al., J Mol. Biol., 315, 1-8; Donzeau et al., Methods Mol Biol., 378, 14-31) o incluso en Pseudomonas fluorescens (véase Retallack et al., Prot Exp Purif. 81, 157-165). En la actualidad, se producen en E. coli muchos agentes biológicos disponibles en el mercado, tales como la rhGH, la insulina o diferentes tipos de citocinas (véase Graumann y Premstaller, (2006) Biotechnol J. 1, 164-186; Chadd y Chamow, (2001) Curr. Opin Biotechnol. 12, 188-194). En este sentido, la conexión genética de un dominio terapéutico a un fragmento Fab y otros agentes terapéuticos tiene grandes ventajas en el desarrollo de un nuevo agente medicinal biológico, y también para la mejora de la eficacia de los fármacos biológicos actuales. Además, una molécula de Fab se podría fusionar con otros fragmentos de anticuerpo, tales como scFv, Fv, dsFv o dAb, para preparar moléculas de anticuerpo biespecíficas o triespecíficas (véase Lu et al., (2002) J. Immunolog Meth. 267, 213-226). Sin embargo, en E. coli se ha visto dificultada la expresión de proteínas de fusión Fab-efector de las cuales el efector es de origen eucariota porque el dominio efector no podía ser biológicamente funcional debido a un plegamiento inadecuado o a que E. coli carece del proceso de glucosilación. Además, todavía no se ha estudiado a fondo el formato de fusión óptimo para producir proteínas de fusión Fab-efector en el periplasma de E. coli. La mayoría de las proteínas séricas que tienen una masa molecular de menos de entre 50 kDa y 60 kDa, tales como las citocinas y los factores de crecimiento, tienen una semivida breve in vivo, por ejemplo, de varios minutos a varias horas, debido a la eliminación renal. Así pues, la prolongación de la semivida sérica de los polipéptidos o proteínas terapéuticos es una de las áreas más intensamente estudiadas en la investigación biofarmacéutica (véase Kontermann, (2012) Wiley, ISBN: 978-3-527-32849-9). Con este propósito, se han desarrollado diferentes métodos, que incluyen pegilación, polisialilación, HESilación, glucosilación o análogo recombinante de PEG fusionado a una cadena de aminoácidos (de 500 a 600 aminoácidos) flexible e hidrófila (véase Chapman, 2002; Adv Drug Deliv Rev. 54. 531-545; Schlapschy et al., (2007) Prot Eng Des Sel. 20, 273-283; Contermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876; Jevsevar et al., (2012) Methods Mol. Biol, 901, 233-246). Además, el mecanismo de reciclaje mediado por FcRn se ha empleado directa o indirectamente para extender la semivida in vivo de las proteínas terapéuticas. Entre las proteínas séricas, se sabe que la seroalbúmina de humano (HSA, por su nombre en inglés) y una globulina inmunitaria (en concreto, la IgG) tienen una semivida excepcionalmente larga por el mecanismo de reciclaje mediado por FcRn. En el suero de un ser humano, la semivida de la albúmina es de 19 días y la de una molécula de IgG está entre 1 semana y casi 4 semanas según la subclase de IgG. Así pues, estas dos moléculas se han utilizado como compañeros de fusión para extender la semivida de las proteínas y/o (poli)péptidos terapéuticos.
La hGH recombinante (de aproximadamente 19 kDa) preparada en el citoplasma o el periplasma de E. coli se ha utilizado en la práctica clínica para tratar las enfermedades ocasionadas por la ausencia de hormonas de crecimiento en los niños, así como en los adultos, después del proceso de plegamiento in vitro (véase, Blethen et al., (1997) J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 418-420). Un inconveniente importante en la administración de la rhGH es la inyección diaria debido a la brevedad de su semivida (<30 min). Para extender la semivida de la hGH en el suero, se ha intentado la conjugación química del polietilenglicol (véase Clark et al., (1996) J. Biol. Chem. 271, 21969-21977; Pradhananga et al., 2002, J. Mol. Endocrinol. 29, 1114; Cho et al., 2011; Sondergaard et al., (2011) J. Clin. Endocrinol Metabol. 96, 681-688) y la conjugación química de la hGH modificada al brazo del Fab de la IgG humanizada de CovX-cuerpo (véase Palanki et al., (2013) Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 402-406). Además, la prolongación de la semivida de la hGH en el suero se ha conseguido con éxito mediante la fusión genética de la seroalbúmina humana (HSA) (Albutropin®) o las secuencias de polipéptidos que comprenden cientos de restos Pro-Ala-Ser (PAS) (PASilación) (véase Osborn et al., 2002, Eur J Pharmacol. 456, 149-158; Anderson et al., (2011) J. Biol Chem. 286, 5234-5241; Sleep et al., (2013) Biochimica et Biophysica Acta. 1830, 5526-5534; Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel.
26, 489-501). La mejor estudiada en esta categoría es VRS-317, una rGH conectada genéticamente a secuencias de aminoácidos XTEN en el extremo amino y en el extremo carboxilo, lo que permite una pauta de dosificación de un mes (véase Schellenberger et al., (2007) Nat Biotech. 27, 1186-1190; Cleland et al., (2012) J. Pharm. Sci. 101, 2744­ 2754; Yuen et al., (2013) J Clin Endocrinol Metab. 98, 2595-2603). De igual modo, la hGH está asociada a la enfermedad vascular (véase Thomas J Merimee et al., (1973), Diabetes, 22, 813-819) y a la enfermedad de Cretzfeldt-Jakob (véase John Powell-Jackson et al., 1985, Lancet, 2, 244-246). Además, el IFN-y acelera la enfermedad del injerto contra el receptor (véase Bruce R. Blazar et al., 2003, The Journal of Immunology, 171, 1272-1277) y el IFN-a está relacionado con la enfermedad autoinmunitaria (véase A Imagawa et al, 1995, The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 80, 922-926). De igual modo, el GSCF está relacionado con la enfermedad autoinmunitaria (véase Anke Franke et al, 2003, Blood, 102, 734-739) y el HCV está asociado a la hepatopatía (véase Van Thiel DH et al., Hepato-Gastroenterology, 42, 907-912).
Una proteína (o polipéptido) de fusión a Fab tiene un gran potencial como agente terapéutico para tratar enfermedades crónicas que requieren una gran dosis de fármacos durante un periodo de tiempo prolongado, en concreto, sobre todo cuando la proteína de fusión a Fab puede producirse en un sistema de expresión en microorganismos a bajo coste. Sin embargo, a pesar de tales posibles ventajas potentes por emplear un Fab, no ha habido ningún intento de aplicar un anticuerpo con Fab contra la seroalbúmina (SA) en el desarrollo de un fármaco de tipo proteína o (poli)péptido para que se extienda su semivida in vivo. En la presente memoria, los inventores han completado la presente invención con la construcción de nuevas construcciones de fusión entre el Fab contra la seroalbúmina (SA) y la proteína (o (poli)péptido) efectora, y con la confirmación del elevado rendimiento de la producción de construcciones de fusión funcionales en el periplasma de E. coli.
En la patente de los EE. UU. US2009/111745 se describen péptidos con dominio PLAD que incrementan la semivida en el suero debido a la conjugación a anticuerpos de dominio.
En la solicitud de patente internacional WO2010/063818 se describen métodos para seleccionar polipéptidos resistentes a las proteasas.
En la solicitud de patente internacional WO2005/118642 se describen composiciones, fusiones y conjugados de fármacos.
Descripción de la invención
Problema técnico
El problema técnico a resolver mediante la presente invención es dar a conocer un nuevo fragmento de fijación a antígeno (Fab) que tiene extendida la semivida sérica in vivo.
Otro problema técnico a solucionar mediante la presente invención es dar a conocer la construcción de fusión de Fab a entidades efectoras que permite la producción óptima en el periplasma de la célula hospedadora.
Aún otro problema técnico a solucionar mediante la presente invención es dar a conocer un vector de expresión y una célula hospedadora para producir las construcciones de Fab-efector en forma soluble con un rendimiento elevado.
Aún otro problema técnico a solucionar mediante la presente invención es dar a conocer una composición farmacéutica que comprende las construcciones de fusión de más arriba.
Solución al problema. La presente invención se define en las reivindicaciones que la acompañan.
Para resolver los problemas de más arriba, la presente descripción da a conocer una construcción (o formato) de fusión óptima Fab-efector para la expresión periplásmica en E. coli, en donde el Fab tiene un dominio variable de cadena pesada que está unido al dominio 1 constante de cadena pesada (Ch1), y tiene un dominio variable de cadena ligera que está unido al dominio constante de cadena ligera (Cl).
En la presente memoria se describe un Fab anti-SA de humano que se eligió como fragmento de anticuerpo, y se considera que la fusión de diferentes proteínas terapéuticas a la albúmina o a entidades de fijación a la albúmina, tales como péptidos pequeños o anticuerpos de dominio (dAb) se ha mostrado que extiende la semivida de las proteínas terapéuticas a través del mecanismo de reciclaje mediado por FcRn (véase Dennis et al., (2002) Biochimica et Biophysica Acta, 1830, 5526-5534; Sleep et al., (2013) Biochimica et Biophysica Acta. 1830, 5526-5534; Nguyen et al., (2006) Protein Eng Des Sel. 19, 291-297; Kontermann, (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876). Según estudios anteriores, un fragmento Fab tiene una semivida de eliminación de 16 a 20 h en los humanos (véase Ujhelyi y Robert, (1995) Clin Pharmacokinet. 28, 483-493) y de aproximadamente 3 h en las ratas después de la administración intravenosa (véase Nguyen et al., 2006, Protein Eng Des Sel. 19, 291-297). Sorprendentemente, la semivida del Fab (SL335) en esta descripción es de 37 h en las ratas, que es aproximadamente 12 veces más larga que la de los Fab convencionales de humano, y así pues es razonable suponer que el SL335 puede tener una semivida de al menos 160 a 200 h (6 a 8 días) en los humanos. Mientras tanto, dos dominios Vk, dAbr3 y dAbr16, cuya constante de afinidad de fijación a la RSA es de 13 nM y 1 mM, respectivamente, se sabía que tienen valores de t1/2 de 53 h (dAbr3) y 43 h (dAbr16) en las ratas (véase Holt et al., (2008) Protein Eng Des Sel. 21, 283-288). Además, el t1/2b del anticuerpo Fab4D5-H con una afinidad de 92 nM por la RSA era de 26,9 h (véase Nguyen et al., 2006). Por lo tanto, se deduce que la funcionalidad in vivo del SL335 es comparable a la de los dAb descritos anteriormente y la de los péptidos específicos de la SA. Cabe destacar que el VH y el VL de SL335 compartían solo una homología de aminoácidos del 65 al 67 % en la secuencia completa, y una homología de aminoácidos de aproximadamente el 50 % en la región determinante de complementariedad (CDR, por su nombre en inglés) con los dAb específicos de la albúmina descritos anteriormente (no se muestran los datos). Específicamente, el Fab específico de la seroalbúmina (SA) en una realización de la presente invención comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.° 1 (SA138 VH: Qv Ql LQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYGISWVRQA PGQGLEWVGW INTYSGGTKYA QKFQGRVTMT RDTSISTVYM ELSGLKSDDTAVY YCARLGHCQRGICSDAL DTWGQGTLVT VSS), SEQ ID n.° 2 (SA139 VH: EVQLLQSGAE VKEPGASVKV SCKASGYTFS SYGISWVRQA PGQGLEWVGR INTYNGNTGYA QRLQGRVTMT TDTSTSIAYM EVRSLRSDDTAVY YCARLGHCQRGICSDAL DTWGQGTMVT VSS), SEQ ID n.° 3 (SA140 VH: QVQLVQSGGG VVQTGGSLRL SCAASGFTFR NYGIHWVRQA PGKGLEWVAS ISYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSRNTVHV QMDSLRGGDTAVY YCARDVHYYGSGSYYNAF DIWGQGTLVT VSS), SEQ ID n.° 4 (SA141 VH: QVQLVQSGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWLSV ISHDGGFQYYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVY YCARAGWLRQYGM DVWGQGTLVT VSS), SEQ ID n.° 5 (SL18 VH: EVQLVQSGTE VKKPGESLKI SCKISGYSFT AYWIAWVRQM PGKGLEWMGM IWPPDADARYS PSFQGQVTFS VDKSISTAYL QWHSLKTSDTAVY YCARLYSGSY SPWGQGTLVT VSS) y SEQ ID n.° 6 (SL301, SL310 y SL335 VH: QVQLVQSGGG PVKPGGSLRL SCAASGFMFR AYSMNWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGRYIHYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL QMNSLRAEDTAVY YCARETVMAGKAL DYWGQGTLVT VSS); y un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.° 7 (SA130: ELVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS RYLNWYQQKP GKAPKLLIYG ASRLESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SDSVPVTFGQ GTRLEIKR), SEQ ID n.° 8 (SA139 VL: DIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPPYTFGQ GTKLEIKR), SEQ ID n.° 9 (SL18 VL: ELVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSIF NYVAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSKWPPTWTFGQ GTRVDIKR), SEQ ID n.° 10 (SL301 VL: ELVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASETVSS RQLAWYQQKP GQAPRLLIYG ASSRATGIPD RFSGSGSGTD FTLTISRLEP EDSAVFYCQQ YGSSPRTFGG GTKLEIKR), SEQ ID n.° 11 (SL310 VL: ELVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVSS SSLAWYQQKP GQAPRLLIYG ASSRATGIPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDAATYYCQK YSSYPLTFGQ GTKLEIKR) y SEQ ID n.° 12 (SL335 VL: ELVLTQSPGT LSLSPGETAT LSCRASQSVG SNLAWYQQKP GQAPRLLIYG ASTGATGVPA RFSGSRSGTD FTLTITSLQP EDFATYYCQQ YYSFLAKTFGQ GTQLEIKR). Y se describe en la presente memoria que el dominio Vh del Fab de más arriba está unido al dominio 1 constante de cadena pesada (dominio Cm) y que el dominio Vl del Fab está unido al dominio constante de cadena ligera (dominio Ckl). Además, el Fab específico de la seroalbúmina (SA) de la presente invención comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID n.° 13 (CDR1) (AYSMN), n.° 14 (CDR2) (SISSSGRYIHYADSVKG) y n.° 15 (CDR3) (ETVMAGKALDY) en la región Vh de SL335, y la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID n.° 16 (CDR1) (RASQSVGSNLA), n.° 17 (CDR2) (GASTGAT) y n.° 18 (CDR3) (QQYYSFLAKT) en la región Vl del SL335.
En la presente memoria se describe que el aminoácido de la cisteína del dominio Ch1 y del dominio Ckl del Fab podrían estar delecionados o sustituidos por restos de serina. En concreto, como para el SL335 de más arriba, están sustituidos por restos de serina el aminoácido de la cisteína del dominio Ch1 que es el 233.° aminoácido comenzando desde el extremo amino del dominio Ch1, y la cisteína del dominio Ckl que es el 214.° aminoácido comenzando desde el extremo amino del dominio Ckl. Para evitar la confusión, las cadenas H y las cadenas L que forman el Fab se nombran del siguiente modo: 1) Hcys: la cadena H con cisteína en la 233.a posición, 2) Lcys: la cadena L con cisteína en la 214.a posición, 3) Hser: la cadena H con serina en la 233.a posición y 4) Lser: la cadena L con serina en la 214.a posición.
En la presente memoria se describe que la fusión Fab-efector se construye mediante la conexión del dominio efector al extremo amino o carboxilo de Fd o de la cadena ligera de una molécula de Fab mediante fusión genética. Ya que los mecanismos de plegamiento y de heterodimerización de las proteínas recombinantes en el medio periplásmico de E. coli son más bien complicados y en buena parte desconocidos, no se puede predecir qué formato de fusión Fabefector será el óptimo para una expresión funcional.
Además, en otra realización se da a conocer una construcción de fusión de un fragmento de fijación a antígeno (Fab) y un dominio efector (una entidad efectora bioactiva), en donde se describe que el aminoácido de la cisteína del dominio Ch1 y el aminoácido de la cisteína del dominio Ckl del Fab están delecionados o sustituidos por restos de serina; y en donde la entidad efectora bioactiva es una proteína o un (poli)péptido; y en donde el Fab y la entidad efectora bioactiva están unidos covalentemente por fusión genética. El Fab y la entidad efectora bioactiva pueden estar unidos covalentemente por fusión genética mediante el uso de un conector peptídico que comprende de 0 a 20 aminoácidos. Entre los seis formatos (o construcciones) de fusión Fab-efector que comprenden la hGH de la presente invención, los resultados demuestran con claridad que HserG/Lser presentaba el rendimiento de expresión más alto en E. coli. Es decir, de acuerdo con esta descripción, la retirada de tanto la Cys233 del dominio Ch 1 como de la Cys214 del dominio Clk por deleción o bien por sustitución con otro resto aminoacídico mejora la expresión soluble de las construcciones de fusión SL335-efector en el sobrenadante de cultivo. Esto aborda tres cuestiones importantes. Primero, la fusión de una entidad efectora, por ejemplo, hGH, al extremo carboxilo de Ch 1 es preferible al extremo carboxilo de Clk. Anteriormente, Lu et al. habían descrito que la conexión genética del scFv anti-Flt-1 al extremo carboxilo de Ch 1 del Fab anti-KDR produjo un rendimiento cinco veces más alto que la conexión al extremo carboxilo del dominio Cl (véase Lu et al., (2002) J Immunolog Meth. 267, 213-226). Aunque los datos no estaban incluidos, el análisis de inmunotransferencia de los presentes inventores con el uso de lisados totales de E. coli reveló que los fragmentos Fd de LcysG/Hcys y LserG/Hcys estaban casi completamente degradados, lo que hizo que no se pudiera detectar la forma soluble de las proteínas de fusión en el sobrenadante de E. coli. Ya que los dominios Vh son propensos a la agregación en E. coli (Dudgeon et al., (2009) Protein Eng Des Sel. 22, 217-220), se puede especular que la presencia de un dominio efector en el extremo carboxilo de C l puede limitar la interacción de un dominio Vh con un dominio Vl y de un dominio Ch 1 con un dominio Cl , lo que conlleva la agregación rápida y la degradación de los fragmentos Fd. Al comparar los rendimientos de expresión soluble entre LserG/Hcys y LserG/Hser, la presencia de la Cys233 en el dominio Ch 1 parecía acelerar este proceso probablemente debido a la formación de puentes disulfuro aberrantes. Después de eliminar la Cys233 del dominio Ch 1, la presencia de un dominio efector en el extremo de un Ch 1 podría tener un efecto beneficioso sobre la reducción de la agregación del dominio Vh al bloquear parcialmente las superficies hidrófobas del dominio Vh antes del emparejamiento de Vh con Vl . Segundo, la presencia de la Cys214 de C lk agrava adicionalmente la producción soluble de la proteína de fusión SL335-hGH de una manera aditiva. Que el rendimiento de HserG/Lcys sea menor que el de HserG/Lser se pudo explicar por la tendencia a formar homodímeros que tienen las cadenas L, en lo que se conoce como proteínas de Bence Jones (véase Kirsh et al., (2005) J. Immunol Methods. 301, 173-185), en las que la Cys214 de Clk puede actuar en la estabilización de los homodímeros, o está implicada en la formación de uno o varios puentes disulfuro aberrantes con otros restos de cisteína en la proteína de fusión. También se sabe que los puentes disulfuro entre los extremos carboxilo de Ch 1 y Cl en un Fab son muy móviles y presentan una considerable flexibilidad (véase Rothlisberger et al., (2005) J. Mol. Biol.
347, 773-789; Humphreys et al., (2007) Protein Eng Des Sel. 20, 227-234). En este sentido, la presente descripción da a conocer un fragmento de fijación a antígeno (Fab) sin la Cys233 del dominio 1 constante de cadena pesada (Cm) ni la Cys214 del dominio constante de cadena ligera (Clk). Así mismo, HerGF/Lser y HserIFNb/Lser mostraban el rendimiento de expresión más alto en E. coli. En la construcción de fusión de la presente invención, la proporción molar entre el polipéptido (o proteína) bioactivo y el Fab está entre 1:1 y 10:1, preferentemente entre 1:1 y 4:1. En tercer lugar, no solo el rendimiento de expresión, sino también la accesibilidad del anticuerpo anti-hGH al dominio hGH, está constreñido hasta cierto punto por la presencia de estos dos restos de cisteína en el extremo carboxilo de SL335. Esto podría ser importante para la función terapéutica de un dominio efector en una fusión Fab-efector si también está obstaculizada la interacción entre un dominio efector y su ligando. Los presentes inventores demostramos que la utilización de Fabáds a modo de compañero de fusión es beneficioso no solo para la hGH, dado que otros efectores, tales como G-CSF e IFN-p, nos llevaron a las mismas conclusiones.
En otro aspecto de la presente invención, se dan a conocer un vector de expresión y la cepa mutante de E. coli SUPEX5 (KCTC 12657BP) como célula hospedadora para solucionar los problemas técnicos. Esta cepa se creó mediante la mutagénesis química aleatoria de la cepa de E. coli MC1061, que se eligió porque procede de la cepa de E. coli K12, una de las principales cepas hospedadoras para producir biosustancias farmacéuticas comerciales. Al compararla con la cepa original MC1061, la utilización de la cepa mutante de E. coli SUPEX5 como hospedador para la expresión implantó adicionalmente el efecto beneficioso sobre la producción de HserG/Lser. No solo para la fusión SL335-hGH, ya que la combinación de Fabds y la cepa de E. coli SUPEX5 resulta también ventajosa para la expresión soluble de una proteína de fusión Fab-efector en general, lo que ya quedó demostrado con claridad por los resultados obtenidos de las fusiones SL335-GCSF (SL335wt-GCSF frente a SL335áds-GCSF), fusiones SL335-IFNp (SL335wt-IFNp frente a SL335áds-IFNp), fusiones EGL4-hGH (EGL4wt-hGH frente a EGL4áds-hGH), y fusiones ip28-hGH (1p28wt-hGH frente a 1p28áds-hGH). Por lo tanto, los resultados apoyan plenamente que la utilización de Fabáds, la forma mutante de Fab sin la Cys233 de Ch 1 ni la Cys214 de Clk , es más beneficiosa que un Fab convencional para la expresión soluble de las proteínas de fusión Fab-efector al menos en la cepa de E. coli SUPEX5. La coexpresión de las proteínas de tipo chaperona o de la disulfuro isomerasa (FkpA, SurA, Skp, SecA, SecB, DsbA o DsbC) mejoraría la expresión soluble y funcional de SL335wt-GCSF o incluso de SL335áds-GCSF, ya que se sabe que estas fusiones incrementan el rendimiento de la producción periplásmica de los fragmentos Fab solubles en E. coli (véase Schlapschy et al., (2006) Escherichia coli. Protein Eng Des Sel. 19, 385-390). Los inventores pensamos que la utilización de Fabds puede ser beneficiosa sobre todo cuando las chaperonas y la maquinaria catalítica para la formación de puentes disulfuro en el retículo endoplásmico están sobrecargadas debido a la elevada expresión de las proteínas de fusión Fab-efector en las células hospedadoras.
En la presente memoria se describe que SL335áds-hGH se produjo a una concentración de aproximadamente 10 mg/l con el uso de un matraz de cultivo, lo que era un rendimiento más alto que lo descrito anteriormente, a pesar de que se cuadruplicó el tamaño molecular en la presente descripción. De acuerdo con los resultados anteriores, los estudios sobre la expresión soluble de la rhGH en el periplasma de E. coli mostraron que el rendimiento era de 0,64 a 2,57 mg/l para peIB-hGH, y de 0,32 a 2,29 mg/l para ompA-hGH (véase Sockolosky y Szoka, (2013) Protein Exp Purif. 87, 129­ 135), mientras que el rendimiento de rhGH dependía en buena parte de los promotores y de las cepas de E. coli hospedadoras que se utilizaban (véase Soares et al., (2003) Protein Engineering. 16, 1131-1138). Mediante una simple optimización del medio, los inventores obtuvimos sistemáticamente el rendimiento de aproximadamente 50 mg/l en el sobrenadante de cultivo con el uso de un matraz de cultivo que permite que la densidad celular alcance una DO600nm de aproximadamente 10 a 11 (manuscrito en preparación), que además se puede mejorar lo suficiente para la escala industrial mediante el ajuste refinado de la composición del medio y un sistema del cultivo alimentado por lotes.
En la presente memoria se describe que las proteínas SL335ds-efector incrementan su afinidad por la HSA. En la presente memoria se describe que la SL335-hGH mostraba un incremento de cinco a nueve veces en respuesta a la HSA (seroalbúmina de humano) y una disminución de 1,3 a 4 veces en respuesta a la RSA (seroalbúmina de rata) según el valor de pH en comparación con la de la SL335 original. La unión genética de un fragmento de anticuerpo y un dominio efector afectaría a la afinidad de fijación al antígeno que presenta el fragmento de anticuerpo, y el cambio de la afinidad puede tener un amplio margen de variación según la naturaleza de un fragmento de anticuerpo, un dominio efector y cómo se unen estas 2 entidades funcionales. No está claro si estas diferencias de afinidad son resultado de la ausencia del puente disulfuro intercatenario o de la presencia del dominio de fusión de hGH. No obstante, el efecto que la fusión a la hGH tiene sobre la afinidad de fijación de SL335áds por los antígenos parece nimia en comparación con el del IFN-a2b-DOM7 h-14, cuya afinidad por la SA de humano, de ratón y de rata disminuyó 7,7, 22,3 y 15,8 veces con respecto a la DOM7 h-14 original (véase Walker et al., (2010) Protein Eng Des Sel., 23, 271-278). Así pues, el Fab podría tener una ventaja frente al anticuerpo de dominio a la hora de mantener la afinidad y el plegamiento del efector, ya que los dominios Ch1 y Cl dejan sitio para reducir el impedimento estérico entre una región de fijación al antígeno y un dominio efector que se fija a los correspondientes ligandos.
En otra realización de la presente invención, la SL335áds-hGH extendió muchísimo la semivida sérica puesto que su t1/2 (16,6 h en la administración intravenosa) era similar a la de PEG5-hGH (250 kDa) (véase Clark et al., 1996). Es interesante que el t1/2 de SL335áds-hGH fuera 5,6 veces más largo que el de Albutropin® (t1/2 = 2,96 h) y la diferencia de t1/2 entre SL335áds-hGH y Albutropin® se aumentase hasta 16 veces (97,2 h frente a 5,93 h) cuando la administración era s.c. (subcutánea) (véase Osborn et al., 2002), aunque estas comparaciones son circunstanciales a menos que los experimentos se realicen en las mismas condiciones. De igual forma, el t1/2 de IFN-a2b-DOM7 h-14 era también aproximadamente 1,5 veces más largo que el de HSA-IFN-a2b (véase Walker et al, 2010). Por lo tanto, parece probable que la fusión de un fijador de albúmina proporcione una semivida más larga que la fusión con la albúmina, aun cuando los mecanismos subyacentes todavía estén por determinar. Resulta destacable que el t1/2 en el suero de SL335áds-hGH cuando la administración es i.v. fuera similar al de VRS-317 (t1/2 = 15 h) (Cleland et al., (2012) J. Pharm. Sci. 101, 2744-2754). Esto podría sugerir que se pudo haber alargado la dosificación más allá de una vez a la semana o incluso una vez al mes para SL335áds-hGH (denominado SAFAtropin®).
En la presente memoria se describe que los efectos farmacodinámicos de SL335áds-hGH parecían muy superiores a los de Albutropin® y 7 veces más potentes que Growtropin® medido en moles, teniendo en cuenta la pauta de dosificación de una vez a la semana. Por desgracia, tuvimos que interrumpir un estudio farmacodinámico de 2 semanas el día 11 por la muerte prematura de algunas de las ratas hipofisectomizadas, sobre todo las que pertenecían al grupo «solo excipiente». Parecía probable que los animales se sintiesen gravemente alterados debido al transporte a larga distancia desde Japón a Corea del Sur después de la intervención quirúrgica durante el mes de agosto, lo que se manifestó por el adelgazamiento del 5 % de los que pertenecían al grupo «solo excipiente» y a los valores de desviación estándar mayores de lo que anticipamos. No obstante, parece claro que la SL335áds-hGH tiene un enorme potencial para que se desarrolle como una hGH de acción prolongada y, por lo tanto, la denominamos SAFAtropin® de ahora en adelante.
En otra realización de la presente invención, el polipéptido bioactivo fusionado al Fab de más arriba es cualquiera seleccionado entre el grupo que consiste en hormona, citocina, enzima, anticuerpo, factor de crecimiento, factor de transcripción, factor sanguíneo, vacuna, proteína estructural, proteína de tipo ligando y receptor.
En aún otra realización de la presente invención, el polipéptido bioactivo es cualquiera seleccionado entre el grupo que consiste en hormona de crecimiento de humano, hormona liberadora de la hormona de crecimiento (GHRH), péptido liberador de la hormona del crecimiento, interferones, receptores de interferones, factores estimulantes de colonias (CSF), péptidos de tipo glucagón, receptor acoplado a proteínas G, interleucinas, receptores de interleucinas, enzimas, proteínas de fijación a interleucinas, proteínas de fijación a citocinas, factor de activación de macrófagos, péptido de macrófago, factor de linfocitos B, factor de linfocitos T, proteína A, inhibidor de la alergia, glucoproteínas de la necrosis celular, inmunotoxina, linfotoxina, factor de la necrosis tumoral, supresores tumorales, factor de crecimiento de las metástasis, antitripsina a l, albúmina, a-lactalbúmina, apolipoproteína E, eritropoyetina, eritropoyetina altamente glucosilada, angiopoyetinas, hemoglobina, trombina, péptido activador del receptor de la trombina, trombomodulina, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor IX, factor XIII, factor de activación del plasminógeno, péptido de fijación a la fibrina, urocinasa, estreptocinasa, hirudina, proteína C, proteína C reactiva, inhibidor de la renina, inhibidor de la colagenasa, superóxido dismutasa, leptina, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor de crecimiento epitelial, factor de crecimiento epidérmico, angiostatina, angiotensina, factor de crecimiento óseo, proteína estimulante del hueso, calcitonina, insulina, péptido natriurético auricular, factor inductor de cartílago, elcatonina, factor activador de tejido conjuntivo, inhibidor de la vía de la tromboplastina tisular, hormona estimulante del folículo, hormona luteinizante, hormona liberadora de la hormona luteinizante, factores de crecimiento de los nervios, hormona paratiroidea, relaxina, secretina, somatomedina, factor de crecimiento de tipo insulina, hormona suprarrenal, glucagón, colecistocinina, polipéptido pancreático, péptido liberador de gastrina, factor liberador de corticotropina, hormona estimulante de la tiroides, autotaxina, lactoferrina, miostatina, receptores, antagonistas de receptores, antígenos de la superficie celular, antígenos de vacuna procedentes de virus, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpo.
En otro aspecto de la presente invención, se da a conocer una composición farmacéutica, en donde la composición comprende construcciones de fusión de Fab con entidades efectoras de la presente invención y excipiente farmacéuticamente aceptable, y tiene incrementada la sostenibilidad in vivo. La composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar en un organismo por diferentes vías, que incluyen la administración oral, transcutánea, subcutánea, intravenosa o intramuscular, y más preferentemente se puede administrar como una preparación de tipo inyección. Además, la composición farmacéutica de la presente invención se puede formular con el uso del método bien conocido por los expertos en la técnica para ofrecer una liberación rápida, sostenida o retardada del ingrediente activo después de la administración del mismo. Las formulaciones pueden estar en forma de un comprimido, píldora, polvo, bolsita, elixir, suspensión, emulsión, solución, jarabe, aerosol, cápsula de gelatina blanda y dura, solución inyectable estéril, polvo envasado estéril y similares. Los ejemplos de vehículos, excipientes y diluyentes idóneos son lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidones, goma arábiga, alginatos, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoatos, propilhidroxibenzoatos, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. Además, las formulaciones pueden incluir adicionalmente cargas, antiaglutinantes, lubricantes, humectantes, saborizantes, emulsionantes, conservantes y similares.
Debe entenderse que la cantidad de proteína o polipéptido de fusión realmente administrada debe determinarse a la luz de diferentes factores relevantes, entre ellos la afección a tratar, la vía de administración seleccionada, la edad, sexo y masa corporal de cada paciente, y de la intensidad de los síntomas de los pacientes; y el tipo de polipéptido bioactivo del ingrediente activo. Ya que la proteína de fusión de la presente invención tiene una sostenibilidad muy notable en la sangre, se pueden reducir significativamente el número y la frecuencia de administración de las preparaciones peptídicas que comprenden la proteína de fusión de la presente invención.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, las formas singulares «un», «una», «el» y «la» pretenden incluir las formas plurales también, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que se utilizan en la especificación y/o en las reivindicaciones, las expresiones «que incluye(n)», «entre ellos», «incluye(n)», «que tiene(n)», «tiene(n)», «con», «tal como», o variantes de las mismas, tales expresiones no son limitantes y se pretende que sean inclusivas de una manera similar a la expresión «que comprende(n)».
En la presente invención, «polipéptido o proteína bioactivo» es el (poli)péptido o la proteína que representa la actividad biológica útil cuando se administra en un mamífero, que incluye el ser humano.
En la presente invención, la «construcción (o formato) de fusión Fab-entidad(es) efectora(s)» es la construcción en la que un (poli)péptido bioactivo o proteína bioactiva está unido covalentemente al Fab. Además, «construcción (o formato) de fusión Fab-entidad(es) efectora(s)» se entiende que incluye proteína de fusión a Fab, (poli)péptido de fusión a Fab, construcciones de fusión y formatos de fusión.
En este sentido, la presente invención se describe en detalle en los ejemplos. Se debe observar que la descripción de los ejemplos no limita el alcance de la invención, tal y como se describe en la descripción precedente.
Efectos ventajosos de la invención
En la presente invención se da a conocer una tecnología asociada a Fab antiseroalbumínicos (SAFA, por su nombre en inglés) como una nueva plataforma tecnológica para desarrollar sustancias biofarmacéuticas de acción prolongada. En este sentido, la presente invención tiene ventajas frente a otras tecnologías convencionales, entre ellas la PEGilación, fusión a Fc, tecnología AlbudAb y fusiones a la albúmina en términos de acción prolongada in vivo, a la vez que se mantiene la conformación de un dominio efector, la afinidad de fijación, y la simplicidad de producción y procedimientos con un coste bajo.
Breve descripción de los dibujos
En la Figura 1 se muestran los resultados de ELISA para fagos con monoclonales para determinar la especificidad de fijación de los anticuerpos con Fab anti-SA de los fagos.
En la Figura 2 se muestra la determinación por ELISA de la especificidad de fijación a antígeno que presentan los clones de Fab de humano.
En la Figura 3 se representa la farmacocinética in vivo de SL335.
La Figura 4 es un diagrama que representa los seis formatos de fusión SL335-hGH construidos en este estudio. En la Figura 5 se muestran los resultados de ELISA para determinar el rendimiento y la reactividad de fijación de las fusiones SL335-hGH solubles en el sobrenadante de cultivo de E. coli. Las señales de fijación se visualizaron con el TMB como sustrato y se midió la absorbancia a 450 nm con el uso de un lector de ELISA. Los datos representan la media ± DE de tres experimentos.
En la Figura 6 se representa el ELISA para determinar la expresión dependiente de la temperatura y de la E. coli hospedadora que presentan SL335 y las variantes SL335-hGH (20 °C, A; 25 °C, B; o 30 °C, C).
En la Figura 7 se representa el ELISA para determinar el rendimiento de las construcciones de fusión SL335-GCSF y SL335-IFNp solubles en el sobrenadante de cultivo de E. coli.
En la Figura 8 se representa el ELISA para determinar el rendimiento de las fusiones EGL4-hGH (A) y 1 p28-hGH (B) solubles en el sobrenadante de cultivo de E. coli.
En la Figura 9 se representan los análisis de SL335wt-hGH y SL335ds-hGH mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia.
En la Figura 10 se representan los análisis de HcycG/Lcys y HserG/Lser mediante electroforesis capilar basada en chips.
En la Figura 11 se representa el análisis de HcycG/Lcys y HserG/Lser mediante espectrometría de masas de tipo MALDI-TOF.
En la Figura 12 se representa la purificación de HserG/Lser mediante filtración en gel con el uso de FPLC. En la Figura 13 se muestra la determinación de la bioactividad de hGH in vitro de SL335ds-hGH mediante el ensayo de proliferación celular en Nb2-11.
En la Figura 14 se muestra la determinación de la estabilidad sérica de SL335ds-hGH por ELISA y con el ensayo in vitro de proliferación celular en Nb2-11.
La Figura 15 es el análisis farmacocinético de Growtropin® o SL335ds-hGH en las ratas.
En la Figura 16 se muestra el aumento de peso dependiente de la dosis en las ratas hipofisectomizadas tratadas con Growtropin® o SL335áds-hGH. N = 3 ratas por grupo de tratamiento, una medición de peso al día para cada rata.
En la Figura 17 se muestra el incremento dependiente de la dosis con respecto a la longitud de la tibia con tratamiento de Growtropin® o SL335áds-hGH. N = 3 o 4 ratas por grupo de tratamiento, una medición de la tibia por rata.
En la Figura 18 se describe el vector pHEKA de la presente invención.
En la Figura 19 se muestra la secuencia del ácido nucleico del vector pHEKA de la presente invención.
En la Figura 20 se muestra la secuencia de aminoácidos deducida de los genes de Vh y de Vl utilizados por los clones de Fab anti-SA de la presente invención.
En la Figura 21 se muestra la secuencia de ADN de los genes de Vh (A) y de Vl (B) utilizados por los clones de Fab anti-SA de la presente invención.
En la Figura 22 se muestra la información de secuencia de las construcciones de fusión Fab-efector de la presente invención. El conector y los dominios efectores están subrayados, y las CDR aparecen en negrita.
Modo para la invención
1. Material y análisis
1-(1) Clonación y cepas
Todos los experimentos de clonación de ADN se realizaron de acuerdo con el procedimiento estándar (véase Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, 2.a ed., (Nueva York, EE. UU: Cold Spring Harbor Laboratory Press)). Los oligonucleótidos de calidad para secuenciación y los genes con optimización de los codones para montar las construcciones de fusión SL335-efector se sintetizaron en Bioneer, Daejeon, Corea del Sur. Se realizó la amplificación por PCR con Pyrobest o la ADN polimerasa Ex-Taq (Takara, Tsu, Japón) en la condición de 25 ciclos a 94 °C durante 1 min, 58 °C durante 1 min y 72 °C durante 1 min, seguido de 72 °C durante 10 min, a menos que se mencione otra cosa. Las endonucleasas de restricción, la fosfatasa alcalina de langostino (SIP) y la ADN ligasa de T4 también se compraron en Takara. La cepa de E. coli MC1061 [araD139 Del(araA-leu)7697 Del(lac)X74 galK16 galE15(GalS) lambda-e14-mcrA0 relA1 rpsL150(strR) spoT1 mcr B1 hsdR2] (a Tc C, Manassas, EE. UU.) se utilizó para la clonación y la cepa de E. coli SUPEX5 se utilizó para la expresión de proteínas recombinantes. La cepa de E. coli TG1 {F' [traD36 proAB+lacIqlacZAM15]supE thi-1 A(lac-proAB) A(mcrB-hsdSM)5,(rK 'mK ')} (Agilent Technologies, Palo Alto, EE. UU.) se utilizó para las preparaciones de fagos recombinantes.
1-(2) Rondas de biocribado de la genoteca de anticuerpos HuDVFab-8L
Se realizó un enriquecimiento de fagos recombinantes fijados a los antígenos deseados, tal y como se describió anteriormente (véase Joo et al., (2008) J. Immunol. Methods. 333, 24-37; Hur et al., Immunol Lett. 132, 24-30). Brevemente, las perlas magnéticas tosiladas conjugadas con seroalbúmina de humano, rata o ratón (HSA, RSA o MSA, respectivamente) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Misuri, EE. UU.) se mezclaron con 1010 fagos de la genoteca de anticuerpos HuDVFab-8L (AprilBio, Chuncheon, Corea del Sur) durante 4 h a 4 °C, y se lavó 3 veces con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween al 0,02 % (PBST). Los anticuerpos de los fagos que se fijaron a las perlas se eluyeron con el tampón de elución (glicina a 0,1 M, pH 2 ). Las células TG1 recién cultivadas que llevaban las correspondientes cadenas ligera (L) (Vl + Clk) se infectaron con los fagos eluidos y se hicieron crecer en el medio 2 YT que contenía ampicilina a 25 pg/ml, carbenicilina a 10 pg/ml y tetraciclina a 10 pg/ml (2 * YT/ACT). A continuación, los fagos recombinantes se amplificaron con ayuda del fago cooperador Ex-12 (AprilBio) para la posterior ronda de cribados. Después de la última ronda de cribado, se realizó un ELISA con los fagos monoclonales para identificar los clones positivos. El gen de Fd (Vh + Cm) de los clones positivos se subclonó en el vector pHg3A-3 (AprilBio, Chuncheon, Corea del Sur) y la optimización de la cadena L se realizó con el repertorio de [1,4 x 108 cadenas Lk indiferenciadas de humano] en el vector de tipo fagémido pLf1T-3 (AprilBio).
1-(3) Análisis de secuenciación de ADN
El fagémido pHflg3A-2 (AprilBio) y el plásmido pLflA-3 (AprilBio) se aislaron de las células de E. coli que producen moléculas de Fab anti-SA con el uso del kit para minipreparaciones de plásmido Wizard (Promega, Madison, Wisconsin, EE. UU.). Se utilizaron dos cebadores de secuenciación diferentes (5'-gtgccgttctatagccatagcac-3' (SEQ ID n.° 19) y 5'-ggcactggctggtttcgctaccgtg-3' (SEQ ID n.° 20)) que eran complementarios a pHflg3A-2 o pLT-2 para leer el gen de Vh y el de Vl, respectivamente. La secuenciación de ADN se hizo en SolGent, Daejeon, Corea del Sur.
1-(4) Construcción del vector de expresión pHEKA
El fragmento de ADN n.° 1 que contenía un sitio de restricción de BglII + promotor de trc + el sitio de fijación del ribosoma (RBS) potenciador de la traducción de g10 se obtuvo mediante amplificación por PCR del vector pTrcHis-B (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.) con la ADN polimerasa Pyrobest y la pareja de los cebadores de PCR n.° 1 (5'-gggagatcttgaaatgagctgttgacaattaatcatccg-3' (SEQ ID n.° 21)) y n.° 2 (5'-cctctttaatttttaataataaagttaatcgataattcc-3' (SEQ ID n.° 22)). El fragmento de ADN n.° 2 que contenía un potenciador de la traducción de g10 RBS BamHI + sitio de clonación múltiple (MCS, por su nombre en inglés) terminador de la transcripción se obtuvo mediante amplificación por PCR a partir del mismo molde que antes con el uso de los cebadores de PCR n.° 3 (5'-ggaattatcgattaactttattattaaaaattaaagaggtatatattaggatccgagctcgagttctgca-3' (SEQ ID n.° 23)) y el n.° 4 (5'-gggcactacgtgcgaaaggcccagtctttcgact-3' (SEQ ID n.° 24)). Se realizó una PCR de conexión para ensamblar estos dos fragmentos de ADN con la ADN polimerasa Ex-Taq y la pareja de los cebadores de PCR n.° 1 y n.° 4. El fragmento de ADN resultante de 520 pb se aisló por electroforesis en gel de agarosa. Después, el producto de la PCR de conexión y el plásmido pET28a (Invitrogen) se digirieron por restricción con Bgl II y Dra III y se ligaron entre sí con la ADN ligasa de T4 durante 2 h a TA. Después de la transformación de las células electrocompetentes MC1061 con 3 ml de la reacción de ligación, los transformantes de E. coli se seleccionaron en placas de 2 YT que contenían 50 pg/ml de kanamicina (Sigma-Aldrich). Para subclonar los genes de Fab en el vector pHEKA, cada gen de las cadenas Fd (Vh + Ch1) se amplificó por PCR a partir del vector de tipo fagémido pHf1g3A-2 con el uso la pareja de los cebadores de PCR n.° 5 (5'-ggccgcagatctgttaattaaggaggaatttaaagaattcatgaaaaaactgctgttcgcgattccgct-3' (SEQ ID n.° 25)) y n.° 6 (5'-gggaagcttattaacaagatttgggctcaactctcttgtcc-3' (SEQ ID n.° 26)) y cada gen de las cadenas L se amplificó por PCR a partir del vector plasmídico pLT-2 con la pareja de los cebadores de PCR n.° 7 (5'-gggggatccatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtg-3' SEQ ID n.° 27)) y n.° 8 (5'-attcctccttaattaacagatctgcggccgcactcgagattaacactctcccctgttgaagctctttgt-3' (SEQ ID n.° 28)). Los fragmentos de los genes de Fd y de la cadena L resultantes se ensamblaron mediante una PCR de conexión con el uso de los cebadores de PCR n.° 6 y n.° 7, y el producto de la PCR resultante de -1,4 kpb de tamaño se recortó del gel de agarosa. Después, el producto de PCR y el plásmido pHEKA se digirieron con Bam HI y Hind III, se ligaron con la ADN ligasa de T4 durante 2 h a TA y se electroporaron en las células de E. coli electrocompetentes MC1061 o SUPEX5. Los cebadores de PCR utilizados para preparar el vector de expresión pHEKA se muestran en la tabla 1 que vienen a continuación. En la Figura 18 se muestra un diagrama del vector de expresión pHEKA.
Tabla 1
[Tabla 1]
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1-(5) Consolidación de la cepa mutante de E. coli SUPEX5
La mutagénesis química se llevó a cabo esencialmente tal y como está descrito en un trabajo anterior. Brevemente, las células de E. coli MC1061 que expresan el scFv contra complejo E2 de la deshidrogenasa de cetoácidos de cadena ramificada de humano (BCKD-E2) fusionado con la fosfatasa alcalina (AP, por su nombre en inglés) se hicieron crecer en el caldo de cultivo de Luria (LB) que contenía 50 pg/ml de ampicilina hasta una DO600 de aproximadamente 0,3. Las células contenidas en 5 ml del cultivo se recogieron por centrifugación a 3000g durante 10 min, y se lavaron dos veces con tampón de citrato de sodio a 0,1 M frío (pH 5,5). A continuación, las células se resuspendieron en 1,9 ml del mismo tampón y se trataron con 50 pg/ml de W-metil-W'-nitro-W-nitrosoguanidina (MNNG) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Misuri, EE. UU.) a 37 °C durante 15, 30 y 45 min. Después del tratamiento con MNNG, se mezclaron las células, se lavaron dos veces y se resuspendieron en 2 ml del medio LB. A continuación, se realizó un ensayo con levantamiento de colonas con un sistema de dos membranas tal y como está descrito. Brevemente, cada placa de agar de LB que contenía 50 pg/ml de ampicilina y 10 pg/ml de carbenicilina se cubrió con la primera membrana de nilón (membrana de nilón para transferencia Nytran N de 0,45 m) (GE Healthcare Life Science, Wauwatosa, Wisconsin, EE. UU.) con poca capacidad de fijación de proteínas. Las bacterias mutadas se extendieron sobre las membranas a la densidad de 106 células/placa y se hicieron crecer durante 8 h a 37 °C. Mientras tanto, la segunda membrana de nitrocelulosa (membrana de nitrocelulosa para transferencia Bio-Trace™ NT) (PALL, Port Washington, Nueva York, EE. UU.) se depositó sobre placas de agar de LB recién preparadas que contenían ampicilina a 50 pg/ml, carbenicilina a 10 pg/ml de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a 1 mM (Sigma-Aldrich). La primera membrana de nilón se retiró del agar de LB sembrado y se colocó encima de la segunda membrana, seguido de una incubación a 37 °C durante 5 h. Después de la incubación, se retiró la primera membrana (con colonias), se colocó sobre placas de agar de LB recién preparadas que contenían ampicilina a 50 pg/ml y carbenicilina a 10 pg/ml, y se conservaron a 4 °C para la recuperación posterior de las bacterias. La segunda membrana se lavó tres veces durante 10 min en solución salina tamponada con fosfato recién preparada que contenía Tween 20 al 0,1 % v/v (PBS/Tween) y se introdujo en el sustrato de cloruro de azul de nitrotetrazolio (NBT)/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) (Duchefa, Haarelem, Países Bajos) para visualizar la AP de las colonias de E. coli. Las colonias de E. coli que mostraban una actividad AP distintiva se picaron de su correspondiente primer filtro, se combinaron y se realizó la segunda ronda de mutagénesis y ensayo de levantamiento de colonias. Después de la segunda ronda de levantamiento de colonias, se seleccionaron los posibles clones de E. coli positivos y se hicieron crecer en 10 ml del medio 2 YT que contenía ampicilina a 50 pg/ml y carbenicilina a 10 ug/ml hasta que la DO600 llegó a 0,5. Se añadió el IPTG al cultivo a una concentración final de 0,1 mM y las células se hicieron crecer durante una noche a 27 °C. A continuación, el sobrenadante de cultivo se recogió por centrifugación a 3300g durante 20 min. Para preparar los extractos periplásmicos, el sedimento celular se resuspendió en el tampón de extracción periplásmica (concentrado 2*; Tris-HCl a 200 mM, EDTA a 20 mM, NaCl a 2 M, pH 7,4). se congeló y descongeló 3 veces, y se centrifugó a 10000g durante 20 min a 4 °C. El extracto periplásmico con la fusión soluble anti-BCKD-AP se obtuvo finalmente al recoger el sobrenadante. Se prepararon diluciones en serie del sobrenadante de cultivo y del extracto periplásmico con el uso de PBS que contenía seroalbúmina bovina al 1 % (BSA) (Sigma-Aldrich) y 50 ml de sobrenadante de cultivo, o se mezclaron las muestras de extracto periplásmico con 100 ml de un sustrato de fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) (Roche, South San Francisco, CA, EE. UU) en una placa de microtitulación de 96 pocillos (SPL, Corea del Sur). Al cabo de 5 a 10 min, se añadieron 25 pl de NaOH a 3 M en cada pocillo para parar la reacción y se midió la absorbancia a 415 nm con un lector de ELISA (Bio-Rad, Hercules, California, EE. UU.). Las cuatro cepas de E. coli mutantes (M#5, M#7, M#54 y M#69) con realce de la expresión de la fusión anti-BCKD-AP se hicieron crecer en el medio 2 YT sin antibióticos a 37 °C durante una noche. Las células se extendieron a continuación sobre placas de agar de LB a una densidad de aproximadamente 103 células/placa y se hicieron crecer a 37 °C durante una noche. Las colonias resultantes se replicaron sobre placas de agar de LB con o sin ampicilina a 50 pg/ml. Se seleccionaron las colonias de E. coli que crecían en las placas de agar de LB sin los antibióticos, pero que no lograron crecer en las placas de agar de LB con antibióticos, y se hicieron crecer en el medio 2 YT sin antibióticos hasta que la DO600 alcanzó -1,0. Las reservas de células se prepararon con la adición de glicerol (20 % v/v) y se almacenaron a 80 °C. Para ser utilizadas para la clonación, las células electrocompetentes se prepararon a partir de las cepas mutantes de acuerdo con un protocolo estándar, y se conservaron a 80 °C. El M#5, una de las cepas de E. coli mutantes, se denominó SUPEX5 (KCTC 12657BP) y se utilizó para expresar el Fab y las proteínas de fusión Fab-efector.
1-(6) Ensayo inmunoenzimático (ELISA)
Para el ELISA de los fagos con monoclonales, se obtuvo el fago recombinante a partir de los clones de E. coli positivos mediante el rescate de fagos, y se añadieron aproximadamente 108 UFC/pocillo a las placas de ELISA MaxiSorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) que se revistieron con HSA, RSA, MSA o BSA a 5 pg/ml. Se dejó que el fago se fijara a los antígenos a pH 6 o a pH 7,4 durante 1 h a 37 °C. Se utilizó un anticuerpo de cabra contra la cadena Lk de humano conjugado a la HRPO (Sigma-Aldrich) como anticuerpo secundario. La señal de la fijación se visualizó con TMB (BD Science, San Jose, California, EE. UU.) como sustrato y se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de ELISA (Bio-Rad, Hercules, California, EE. UU.). Los datos representan la media de tres experimentos con la desviación estándar. Para el ELISA convencional, se inmovilizaron sobre placas de microtitulación los diferentes antígenos [SA de humano, SA de rata, SA de ratón, SA de mono (Alpha Diagnostic Intl., San Antonio, Texas, EE. UU.), SA de perro (CUSABIO, Wuhan, Hubei, China), SA de conejo (Sigma-Aldrich), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (R&D Systems Minneapolis, Minnesota, EE. UU.), molécula de adhesión de las células epiteliales (EpCAM) (R&D Systems), receptor a de la IL-15 (IL-15Ra) (R&D Systems), IL-1p (eBioscience, San Diego, California, Ee . UU.), CD16a (R&D Systems), c-MET (Sinobiological, Pekín, China)] a la concentración de 5 pg/ml, se dejó que las moléculas de Fab se fijasen a los antígenos, y se realizó la detección como más arriba. Para determinar la concentración de las proteínas solubles de Fab o de la fusión Fab-hGH, se realizó un ELISA de tipo sándwich con un anticuerpo monoclonal de ratón contra el Fd de la IgG de humano (AprilBio) como anticuerpo de captura y el anticuerpo policlonal de cabra contra la cadena Lk de humano conjugado a HRPO (Sigma-Aldrich) como anticuerpo de detección. El fragmento Fab de humano (Bethyl, Montgomery, Texas, EE. UU.) con una concentración conocida se utilizó para dibujar la curva patrón. Para detectar el dominio de hGH, se utilizaron T-20, un anticuerpo policlonal de cabra específico contra el extremo carboxilo del hGH (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, EE. UU.), y NYThGH, un anticuerpo monoclonal de ratón específico contra la hGH completa (Prospec, East Brunswick, Nueva York, EE. UU.), seguido de un anticuerpo policlonal de conejo contra la IgG de cabra conjugado a HRPO (Sigma-Aldrich) o un anticuerpo policlonal de cabra contra la IgG de ratón conjugado a HRPO (Sigma-Aldrich), respectivamente, como anticuerpo secundario. Se utilizó un anticuerpo policlonal de cabra contra el GCSF de humano (R&D Systems) para detectar el dominio del G-CSF y se utilizó un anticuerpo policlonal de conejo contra el IFN-p de humano (PEPROTECH, Rocky Hill, EE. UU.) para detectar el dominio del IFN-p.
1-(7) Preparación de las proteínas solubles de Fab y de la fusión Fab-efector
Las proteínas solubles de Fab y de la fusión Fab-hGH se produjeron al hacer crecer las células SUPEX5 de E. coli en 10 ml o 1 l del medio 2 YT que contenía kanamicina a 50 pg/ml a 37 °C hasta que se alcanzó una DO600nm de 0,5 seguido de la adición de IPTG a 0,05 mM. Después de 20 h de incubación a 20 °C con agitación vigorosa, se separaron el sobrenadante de cultivo y el sedimento celular por centrifugación a 3300g durante 20 min. Los extractos periplásmicos se obtuvieron tal y como se describió más arriba. Para la purificación, el sobrenadante de cultivo y/o los extractos periplásmicos se hicieron pasar luego a través de resinas de Sepharose 4B en las que se había inmovilizado la HSA (AprilBio). Después de un lavado extenso, las moléculas de Fab fijadas a la resina se eluyeron con el tampón de elución (glicina a 0,1 M, glicerol al 10 %, pH 3) seguido de la neutralización inmediata con tampón de Tris (Tris-HCl a 0,5 M, NaCl a 2 M, pH 9,0). También se realizó la filtración en gel de HserG/Lser después de la purificación de afinidad con el uso de FPLC AKTA (GE Healthcare, Wauwatosa, Wisconsin, EE. UU). Brevemente, una columna reempaquetada HiPrep™ 16/60 Sephacryl™ S-200HRP se equilibró con el tampón de equilibrado (HEPES a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 7,4) y se cargó con 5 pl de HserG/Lser (fusión SL335áds-hGH). Se eluyó con el tampón de equilibrado a la presión de alarma de 0,35 MPa y la velocidad de flujo de 0,5 pl/min. Se analizaron las fracciones de número 13, 16, 19 y 23 por SDS-PAGE, tal y como se describe a continuación.
1-(8) Medición de la afinidad mediante interferometría de biocapa
Se realizaron ensayos de fijación sobre la marcha entre el SL335 purificado y los antígenos (SA de humano, SA de rata o SA de ratón) con el uso de una interferometría de biocapa con un sistema Octet RED (ForteBio, Menlo Park, California, EE. UU.) tal y como está descrito anteriormente, salvo que se utilizaron sensores AR2G (de segunda generación para aminas reactivas) (Costin et al., (2013) J Virol. 87, 52-66). Brevemente, la concentración predeterminada de SL335 se acopló a los biosensores AR2G de calidad cinética y los fragmentos de Fab sin fijar se retiraron de la superficie de los sensores al incubarlos en el tampón de cinética (etanolamina a 1 M, pH 8,5). A continuación, se dejó que las sondas se fijasen a las SA de humano, SA de rata o SA de ratón a las concentraciones predeterminadas en las condiciones de pH 6,0 o pH 7,4 (concentración de la SA de humano a pH 6 y pH 7,4: 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM y 12,5 nM; concentración de la SA de rata a pH 6: 4 mM, 1 mM, 500 nM, 250 nM y 125 nM; concentración de la SA de rata a pH 7,4: 4 mM, 2 mM, 1 mM, 500 nM y 125 nM; concentración de la SA de ratón a pH 6 y pH 7,4: 20 mM, 10 mM, 5 mM, 2,5 mM y 12,5 mM), seguido de la disociación en PBS que contenía BSA al 0,1 %, pH 6 o pH 7,4. Se calcularon la cinética de fijación y de disociación con el paquete informático Octet QK, que ajusta las curvas de fijación observadas a un modelo de fijación 1:1 para calcular la constante de la velocidad de asociación. Las constantes de las velocidades de asociación y de disociación se calcularon con el uso de al menos 3 concentraciones diferentes de SA de humano, SA de rata o SA de ratón. La constante de disociación en equilibrio se calculó como la constante cinética de la velocidad de disociación dividida por la constante cinética de la velocidad de asociación.
1-(9) Generación de las construcciones con la fusión SL335-hGH
Para crear el SL335ds, el mutante de Fd (sustitución de Cys233 por Ser233 ), denominado Hser, se obtuvo mediante la amplificación por PCR a partir del gen de cadena Fd de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 (5'-ggggaattcatgaaatatctgctgcctacggcggcggcgggcctgctgctgctggctgcacaa-3' (SEQ ID n.° 29)) y n.° 10 (5'-gggaagcttttagctgctcttcggttccacgcgtt-3', SEQ ID n.° 30)). El producto de la PCR de aproximadamente 750 pb se trató con EcoR l/Hind III y se ligó con el pHEKA. La cadena L mutante (sustitución de Cys214 ^ Ser214 ), denominada Lser, también se obtuvo mediante la amplificación por PCR del gen de la cadena L de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 11 (5'-gggggatccatgaaaaaaactgcgattgcgattgcggtgctggccggctttg-3' (SEQ ID n.° 31)) y n.° 12 (5'-gggctcgagttagctttcgccgcggttaaagctctttg-3' (SEQ ID n.° 32)), se cortó con BamH I/Xho I y se clonó en el pHEKA que contenía la Hser. Los procedimientos de clonación para generar la construcción HcysG/Lcys fueron los siguientes: el Fd de tipo silvestre con Cys233 , denominado Hcys, se amplificó por PCR a partir del Fd de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 y n.° 13 (5' -agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3' (SEQ ID n.° 33) y el hGH que contenía una secuencia conectora también se amplificó por PCR a partir del gen de hGH con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 14 (5'-ggttctgcaccagctcctggatcttttccgaccattccgctgagccg-3' (SEQ ID n.° 34)) y n.° 15 (5'-gggaagcttttagaagccgcaggagccctcca-3' (SEQ ID n.° 35)). Los genes de Hcys y de hGH se conectaron entre sí para generar HcysG mediante la PCR de ensamblaje con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 y n.° 15, se cortó con EcoR I/Hind III y se clonó en el pHEKA que contenía la cadena L de tipo silvestre de SL335 con la Cys214 , denominado Lcys. Para generar la construcción LcysG/Hcys, la Lcys se amplificó por PCR a partir de la cadena L de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 11 y n.° 16 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcattcgccgcggttaaagctcttt-3', (SEQ ID n.° 36)), y el hGH que contenía una secuencia conectora también se amplificó por PCR a partir del gen de hGH con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 14 y n.° 17 (5'-gggctcgagttagaagccgcaggagccctcca-3' (SEQ ID n.° 37)). El gen de Lcys y de hGH se unieron para generar la LcysG mediante la PCR de ensamblaje con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 11 y n.° 17, se cortó con BamH I/Xho I y se clonó en el pHEKA que contenía el Fd de tipo silvestre. Para crear la construcción HserG/Lcys, se amplificó la Hser por PCR a partir de la cadena Fd de tipo silvestre con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 y n.° 18 (5'-gggctcgagttagaagccgcaggagccctcca-3' (SEQ ID n.° 38)). La amplificación por PCR de la hGH que contenía una secuencia conectora, la PCR de ensamblaje y la clonación de HserG se realizaron igual que para crear la construcción HcysG/Lcys. Para generar la construcción LserG/Hcys, la Lser se amplificó por PCR a partir de la cadena L de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 11 y n.° 19 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3' (SEQ ID n.° 39)). La amplificación por PCR de la hGH que contenía una secuencia conectora, la PCR de ensamblaje y la clonación de LserG se realizaron como cuando se creó la construcción LcysG/Hcys. Para generar la construcción HerG/Lser, la amplificación por PCR de HserG y de hGH, y la PCR de ensamblaje, se realizaron igual que para crear la construcción HserG/Lcys, salvo que para clonar se usó el pHEKA que contenía la Lser. La LserG/Hser también se construyó igual que como se creó la construcción LserG/Hcys, salvo que para clonar se usó el pHEKA que contenía la Hser. Los cebadores de PCR para preparar las construcciones de fusión SL335-hGH y las construcciones de fusión SL335áds-hGH se muestran en la tabla 2 que viene a continuación.
Tabla 2
[Tabla 2]
Figure imgf000013_0001
1-(10) Generación de las construcciones de la fusión SL335-GCSF
Los procedimientos de clonación para generar la construcción HcysGF/Lcys fueron los siguientes; la Hcys se amplificó por PCR a partir de la cadena H de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 y n.° 20 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctttcgccgcggttaaagctctttg-3' (SEQ ID n.° 40)) y el G-CSF que contenía una secuencia conectora también se amplificó por PCR a partir del gen de G-CSF con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 21 (5'-ggttctgcaccagctcctggatctgcgcctacctatcgcgcgagca-3' (SEQ ID n.° 41)) y n.° 22 (5'-gggaagcttattaaggctgtgccagatggcgcag-3' (SEQ ID n.° 42)). Los genes de Hcys y de G-CSF se unieron entre sí mediante una PCR de ensamblaje con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 y n.° 22, se cortó con EcoR I/Hind III y se clonó en el pHEKA que contenía la cadena L de SL335. Para generar la construcción LcysGF/Hcys, la Lcys se amplificó por PCR a partir de la cadena L de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 11 y n.° 23 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcattcgccgcggttaaagctcttt-3' (SEQ ID n.° 43)) y el G-CSF que contenía una secuencia conectora también se amplificó por PCR a partir del gen de G-CSF con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 21 y n.° 24 (5'-taacagatctgcggccgcactcgagattaaggctgtgccagatggcgcag-3' (SEQ ID n.° 44)). Los genes de Lcys y G-CSF se unieron mediante una PCR de ensamblaje con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 11 y n.° 25 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3' (SEQ ID n.° 45)), se cortó con BamH I/Xho I y se clonó en el pHEKA que contenía el Fd de SL335. Para crear la construcción HserGF/Lser, la Hser se amplificó por PCR a partir del Fd de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 y n.° 25. Los genes de Hser y de G-CSF se unieron entre sí mediante una PCR de ensamblaje con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 y n.° 22, se cortó con EcoR I/Hind III, y se clonó en el pHEKA que contenía la Lser. Para generar la construcción LserGF/Hser, la Lser se amplificó por PCR a partir de la cadena L de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 11 y n.° 26 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctttcgccgcggttaaagctctttg-3' (SEQ ID n.° 46)) y el G-CSF que contenía una secuencia conectora también se amplificó por PCR a partir del gen de G-CSF con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 21 y n.° 24. Los genes de Lcys y G-CSF se unieron mediante una PCR de ensamblaje con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 11 y n.° 25, se cortó con BamH I/Xho I y se clonó en el pHEKA que contenía la Hser. Los cebadores de PCR para preparar las construcciones de fusión SL335-GCSH y las construcciones de fusión SL335áds-GCSF se muestran en la tabla 3 que viene a continuación.
Tabla 3
[Tabla 3]
Figure imgf000014_0001
1-(11) Generación de las construcciones de fusión SL335-IFNB
Los procedimientos de clonación para generar la construcción HcysIFNp/Lcys fueron de la manera siguiente. La Hcys se amplificó por PCR a partir de la cadena H de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de cebadores n.° 9 y n.° 27 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3' (SEQ ID n.° 47)) y el IFNp que contenía una secuencia conectora también se amplificó por PCR a partir del gen del IFNpla con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 28 (5'-ggttctgcaccagctcctggatcttcatacaacctgctgggcttcctg-3' (SEQ ID n.° 48)) y n.° 29 (5'-gggaagcttttagttgcgcagatagccggtcag-3' (SEQ ID n.° 49)). Los genes de Hcys y de IFNpla se unieron entre sí mediante una PCR de ensamblaje con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 y n.° 29, se cortó con EcoR I/Hind III, y se clonó en el pHEKA que contenía la Lcys. Para crear la construcción HserIFNp/Lser, la Hser se amplificó por PCR a partir de la cadena H de SL335 con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 y n.° 30 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3' (SEQ ID n.° 50)). Los genes de Hser y de IFNpla se unieron entre sí mediante una PCR de ensamblaje con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 9 y n.° 29, se cortó con EcoR l/Hind III y se clonó en el pHEKA que contenía la Lser. Los cebadores de la PCR para la preparación de las construcciones de fusión SL334-IFNp y las construcciones de fusión SL335áds-IFNp se muestran en la tabla 4 que viene a continuación.
Tabla 4
[Tabla 4]
Figure imgf000014_0002
1-(12) Generación de las construcciones de las fusiones EGL4-hGH y 1b28-hGH
El EGL4, un Fab de humano anti-EGFR, y el 1b28, un Fab de humano anti-IL-1 b, se habían aislado de la genoteca de anticuerpos HuDVFab-8L (sin publicar, AprilBio Co.). Para crear EGL4wt y EGL4áds, las Hcys y Hser se amplificaron por PCR a partir del ADNc del gen de la cadena H de EGL4 con el uso de las parejas de los cebadores de PCR n.° 5 y n.° 6, y n.° 5 y n.° 31 (5'-gggaagcttattaactagatttgggctcaactctcttg-3' (SEQ ID n.° 51)), respectivamente. Los productos de la PCR de aproximadamente 750 pb se trataron con EcoR I/Hind III y se ligaron con el pHEKA, seguido de la transformación de las células competentes MC1061. Lcys y Lser también se amplificaron por PCR a partir del ADNc del gen de la cadena L de EGL4 con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 11 y n.° 32 (5'-gggctcgagttagcattcgccgcggttaaagctcttt-3' (SEQ ID n.° 52)), y n.° 11 y n.° 33 (5'-gggctcgagttagctttcgccgcggttaaagctcttt-3' (SEQ ID n.° 53)), respectivamente. Se cortaron con BamH I/Xho I y se clonaron en el pHEKA que contenía la Hcys o Hser de EGL4, respectivamente. Para crear la construcción de fusión EGL4wt-hGH, los procedimientos de clonación para generar la construcción HcysG/Lcys fueron los que vienen a continuación. La Hcys se amplificó por PCR a partir del ADNc de la cadena H de EGL4 con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 5 y n.° 34 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccacaagatttgggctcaactctcttgtc-3' (SEQ ID n.° 54)) y el hGH que contenía una secuencia conectora también se amplificó por PCR a partir del gen de hGH con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 14 y n.° 15. Los genes de Hcys y de hGH se unieron entre sí mediante una p Cr de ensamblaje con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 5 y n.° 15, se cortó con EcoR \/Hind III y se clonó en el pHEKA que contenía la Lcys de EGL4. Para crear la construcción de fusión EGL4áds-hGH, la Hser se amplificó por PCR a partir del ADNc de la cadena H de EGL4 con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 5 y n.° 35 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccactagatttgggctcaactctcttgtc-3' (SEQ ID n.° 55)) y el hGH que contenía una secuencia conectora también se amplificó por PCR a partir del gen de HGH con los codones optimizados con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 14 y n.° 15. Los genes de Hser y hGH se unieron entre sí mediante una p Cr de ensamblaje con el uso de la pareja de los cebadores de PCR n.° 5 y n.° 15, se cortó con EcoR \/Hind III, y se clonó en el pHEKA que contenía la Lser de EGL4áds. 1b28w t, 1b28áds, 1b28wt-hGH y 1b28áds-hGH se crearon igual que las fusiones EGL4-hGH con el uso de las mismas parejas de cebadores de PCR, salvo que el ADNc de 1b28 sirvió de molde para la PCR. Los cebadores de PCR para preparar las construcciones de fusión EGL4-hGH y 1b28-hGH se muestran en la tabla 5 que viene a continuación.
Tabla 5
[Tabla 5]
Figure imgf000015_0001
1-(13) Análisis en SDS-PAGE y de inmunotransferencia
Para el análisis por SDS-PAGE, las proteínas purificadas SL335wt-hGH y SL335áds-hGH se resuspendieron en el tampón de muestras LDS de NuPAGE® (Invitrogen) con o sin el reductor de muestras de NuPAGE® (Invitrogen), y se cargó en el gel a una concentración de 7 pg/pocillo. Las bandas de proteína se visualizaron mediante la tinción con azul de Coomassie (Bio-Rad). Para los análisis de inmunotransferencia, 500 ng de SL335wt-hGH y SL335áds-hGH purificadas por afinidad se cargaron en cada pocillo como más arriba y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear la membrana con leche desnatada al 3 % (Bio-Rad) en PBS que contenía Tween al 0,01 % (Sigma-Aldrich), las proteínas se detectaron por incubación con un anticuerpo policlonal de cabra contra la cadena L k de humano conjugado con AP (Bethyl). A la membrana se le añadió el sustrato de cloruro de azul de nitrotetrazolio (NBT)/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP) (Duchefa) para visualizar las señales de la fijación.
1-(14) Electroforesis capilar basada en chips
La electroforesis capilar basada en chips se llevó a cabo con el sistema Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California, EE. UU.). Las muestras con proteínas se prepararon de acuerdo con el protocolo del fabricante y se analizaron en el kit Protein 80, que es el recomendado para el análisis de proteínas entre 5 a 80 kDa. Brevemente, las muestras se mezclaron con el tampón de muestra en presencia o en ausencia de DTT para la electroforesis reductora o no reductora, respectivamente. Las muestras se desnaturalizaron a 95 °C y se cargaron en el chip que se había rellenado con los reactivos adecuados, que incluían el colorante fluorescente y la solución de gel. A continuación, se introdujo el chip en el sistema y se hizo funcionar en el sistema con el uso del programa informático Expert 2100. Los resultados se representaron gráficamente para reflejar las unidades de intensidad de la fluorescencia frente al tamaño de las proteínas.
1-(15) Espectrometría de masas de tipo MALDI-TOF
La espectrometría de masas de tipo MALDI-TOF se realizó en un dispositivo Autoflex III Smartbeam (Bruker Daltonics, Billerica, Massachusetts, EE. UU.). La muestra se mezcló con el mismo volumen de matriz para MALDI (10 mg/ml de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico) y se pulverizó sobre una placa de MALDI deseada. La calibración externa se realizó con un kit de calibración de péptidos y proteínas para MALDI-MS (Sigma-Aldrich). Los espectros de masas en el margen de m/z de 15000-160000 y 10000-70000 se adquirieron para la fusión SL335wt-hGH y la fusión SL335áds-hGH, respectivamente, en el modo de ion positivo.
1-(16) Ensayo de bioactividad de hGH in vitro
Las células de linfoma de rata Nb2-11 (Sigma-Aldrich) se hicieron crecer en DMEM completo suplementado con suero de caballo al 5 % (Sigma-Aldrich) y penicilina/estreptomicina (Invitrogen) al 1 % en una incubadora humidificada a 37 °C con CO2 al 5 % (Tanaka et al, 1980). Las células se lavaron 2 veces con DMEM, se centrifugaron a 1000g durante 5 min y se resuspendieron en DMEM que contenía suero de caballo al 5 % (v/v) a 8 * 104 células/ml. A cada pocillo de las placas de 96 pocillos se le añadió una alícuota a 50 pg de la suspensión celular y se incubó durante una noche. A continuación, las células se trataron con concentraciones crecientes (de 0 a 20 mM) de Growtropin® (una rhGH sin modificaciones; Dong-A Pharmaceuticals, Seúl, Corea del Sur) o SL335áds-hGH en 50 ml de DMEM que contenía suero de caballo al 5 % durante 48 h a 37 °C. Después de la incubación, se le añadieron 10 pl de CCK-8 (Dojindo, Mashiki-Machi, Japón) a cada pocillo y se incubó durante 4 h. La absorbancia se registró en un lector de microplacas (Bio-Rad) a una longitud de onda de 450 nm.
1-(17) Estabilidad sérica de SL335ñds-hGH
SL335wt y SL335áds-hGH (concentración final de 10 pg/ml) se resuspendieron en suero bovino fetal (FBS) (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.) que contenía azida de sodio al 0,03 % y se incubaron durante 16 días a 37 °C. Se tomaron alícuotas pequeñas (50 ml) cada día y se conservaron a -20 °C antes de utilizarse. La reactividad de fijación a la HSA se determinó por ELISA y se midió la bioactividad de hGH in vitro en las células Nb2-11 (Sigma-Aldrich) tal y como está descrito más arriba.
1-(18) Ensayo farmacocinético in vivo
Se realizaron estudios de farmacocinética (PK) en una empresa investigadora por contrato (CRO, por su nombre en inglés) certificada (ChemOn, Suwon, Corea del Sur). Los animales se alimentaron con una dieta estándar de pienso para roedores y agua ilimitada, y se mantuvieron en una habitación con humedad y temperatura constantes con la iluminación controlada (12 h de luz seguidas de 12 h de oscuridad). Brevemente, el SL335 y el Fab Neg (un Fab de humano irrelevante) se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) o subcutánea (s.c.) por separado en grupos de tres ratas Sprague Dawley a 1 mg/kg y se obtuvieron muestras de suero en diferentes puntos de tiempo (5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 96 h y 144 h para la vía i.v., y 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h y 96 h para la vía s.c.). La concentración de SL335 y Fab Neg en las muestras de suero se midió por ELISA de tipo sándwich con anticuerpo monoclonal de ratón contra el Fd de IgG de humano y el anticuerpo monoclonal de cabra contra la cadena Lk de humano conjugado con HRPO como anticuerpos de captura y de detección, respectivamente. También se incluyeron en el ensayo fragmentos Fab de humano de concentración conocida para obtener una curva patrón. Cada curva de la concentración sérica frente al tiempo se ajustó para un modelo no compartimental con el programa informático WinNonlin (SL335 y Fab Neg), y se representaron gráficamente con el programa informático Sigma Plot. De igual forma, se inyectó Growtropin® y SL335áds-hGH por vía intravenosa o subcutánea por separado en grupos de tres a cuatro ratas. La dosis de Growtropin® y SL335áds-hGH para la administración i.v. fue de 0,3 mg/kg, y para la administración s.c. fue de 0,6 mg/kg, respectivamente. Se obtuvieron muestras de suero a diferentes puntos de tiempo (5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h y 8 h para Growtropin®, y 5 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 96 h y 144 h para SL335áds-hGH). La cantidad de Growtropin® en las muestras de suero se midió con el kit de detección de ELISA para hGH (Genway, San Diego, California, EE. UU.) y la de SL335áds-hGH se midió con el ELISA de tipo sándwich tal y como está descrito más arriba. Se ajustó una curva de concentración sérica frente al tiempo para un modelo unicompartimental con el uso del programa informático WinNonlin (versión 6.2) de Phoenix™.
1- (19) Ensayo farmacodinámico in vivo
La capacidad para promover el aumento de peso que presentaban la dosis diaria de Growtropin® y la dosis semanal de SL335áds-hGH se analizó en las ratas hipofisectomizadas mediante la administración s.c. en ChemOn, tal y como está descrito más arriba (véase Clark et al., (1996) J. Biol. Chem. 271,21969-21977). Brevemente, se compraron ratas Sprague Dawley jóvenes hipofisectomizadas (Harlan, Tokio, Japón) y se descartó del estudio cualquier animal que engordara más de 7 g durante los primeros 15 días después de la intervención quirúrgica. Los animales se repartieron al azar entre cinco grupos de tratamiento (solo excipiente, inyección diaria de 0,3 mg/kg de Growtropin® y una inyección semanal de 0,6 mg/kg, 1,2 mg/kg o 2,4 mg/kg de SL335áds-hGH). Se les anotó la masa corporal cada día después de que comenzara la pauta de dosificación. Se midió cuidadosamente el crecimiento óseo de la tibia con un compás calibrador de huesos. Se hicieron las comparaciones estadísticas con un análisis de varianza seguido de la prueba de Dunnetts para comparaciones múltiples y se consideraron significativos los valores de p por debajo de 0,05.
2. Resultados experimentales
2- (1) Aislamiento de los clones de Fab anti-SA
La genoteca de anticuerpos HuDVFab-8L se cribó con las perlas magnéticas conjugadas con SA de humano, SA de rata o SA de ratón a pH 6 o pH 7,4. Después de 3 rondas de bioselección guiada, se realizó un ELISA para fagos con monoclonales para identificar los clones de los anticuerpos en fagos que eran específicos contra los antígenos. Se identificaron más de 60 clones positivos con el ELISA (no se muestran los datos) y un análisis de secuenciación de ADN de los genes de Vh y Vl identificó 8 anticuerpos en fagos independientes, denominados SA138, SA139, SA140, SA141, SL18, SL301, SL310 y SL335, respectivamente. La reactividad de fijación de estos clones a SA humana, SA de rata, SA de ratón o SA bovina se confirmó mediante un ELISA para fagos con monoclonales en las condiciones de pH 6 o pH 7,4 (Figuras 1A y 1B). Tres clones de anticuerpo en fago, SA138, SA139 y SA141, eran reactivos solo contra la SA de humano, independientemente de las condiciones de pH. El SA140 también reconoció la SA de humano únicamente a pH 7,4, pero su reactividad de fijación desapareció a pH 6. Por otra parte, SL18, SL310 y SL335 se fijaban a la SA de humano, SA de rata y SA de ratón en ambas condiciones de pH con una intensidad ligeramente diferente. El SL301 era significativamente reactivo contra la SA de humano y la SA de rata a ambos pH, y débilmente reactivo a la SA de ratón solo a pH 7,4. Ninguno de los 8 clones de Fab reaccionaba con la SA bovina. SL18, SL301, SL310 y SL335 se caracterizaron adicionalmente debido a su reactividad cruzada con las SA de al menos dos especies diferentes. Los genes de cadena L y de Fd de 4 clones de anticuerpo en fago se subclonaron en el vector pHEKA para la expresión periplásmica en E. coli, y los fragmentos Fab solubles se prepararon a partir del sobrenadante de cultivo o de los extractos periplásmicos. Después de la purificación de afinidad, se realizó un ELISA para comparar la reactividad de fijación de estos fragmentos con SA de humano, SA de rata o SA de ratón en las condiciones de pH 6 (Figura 2A) y de pH 7,4 (Figura 2B). En cada pocillo de las placas de microtitulación se inmovilizó HSA, RSA, MSA o BSA a la concentración de 5 pg/ml y se dejó que 4 moléculas de Fab purificadas (SL18, SL301, SL310 y SL335) se fijaran a los antígenos a pH 6,0 (Figura 2A) o a pH 7,4 (Figura 2B). Como anticuerpo secundario se utilizó el de anticuerpo policlonal de cabra contra la cadena Lk de humano conjugado a HRPO. Las señales de fijación se visualizaron con TMB a modo de sustrato y se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de ELISA (Bio-Rad). Los datos representan la desviación estándar de la media de tres experimentos. En la fijación a la SA de humano, el orden de las señales de fijación fue SL335 > SL310 > SL301 > SL18 tanto a pH 6 como a pH 7,4. En la fijación a la SA de rata, el orden era SL335 > SL310 > SL301 > SL18 a pH 6 y SL335 = SL310 > SL301 = SL18 a pH 7,4. En la fijación a la SA de ratón, el orden fue SL18 > SL335 > SL310 a pH 6 y SL335 > SL310 > SL18 a pH 7,4. En consonancia con la Figura 2, el SL301 no logró fijarse a la SA de ratón a pH 6, y muy débilmente a pH 7,4. Se halló que SL335 era, entre los 4 clones de Fab, el que mejor se fijaba a la SA de humano y a la SA de rata, independientemente de la condición del pH. El SL335 se fijó a la SA de humano a pH 6 dos veces más fuerte que a pH 7,4 (50 % de la señal de fijación a 20 ng/ml frente a 40 ng/ml), 20 veces más fuerte que a la SA de rata en la misma condición de pH (50 % de la señal de fijación a 20 ng/ml frente a 400 ng/ml) y 4 veces más fuerte que a la SA de rata a pH 7,4 (50 % de la señal de fijación a 40 ng/ml frente a 160 ng/ml).
2-(2) Reacción cruzada y afinidad de fijación de SL335
Ya que SL335 era el que mejor se fijaba entre 4 clones de Fab contra la SA de humano, se analizó adicionalmente la reactividad cruzada por ELISA. La reactividad de fijación a SA de humano, SA de rata y SA de ratón se reprodujo tal y como se muestra en la Figura 2. También se encontró que el SL335 reconocía intensamente la SA de macaco cangrejero y se unía débilmente a la SA de perro. Sin embargo, el SL335 no reconocía la SA de conejo ni tampoco otros antígenos irrelevantes, entre ellos EGFr , EpCAM, IL-15Ra, IL-1 b, CD16a o c-MET. La afinidad de fijación de SL335 por la SA de humano, por la SA de rata y por la SA de ratón a pH 6 o pH 7,4 se midió además mediante la interferometría de biocapa al pasar a través de diferentes concentraciones de los antígenos en los biosensores que estaban revestidos con SL335 (véase la tabla 6 más adelante). Los resultados se correlacionan bien con los datos de ELISA de la Figura 2 en que la constante de disociación de SL335 por la HSA era de 9 nM a pH 6 y de 13 nM a pH 7,4, respectivamente, y por la RSA era de 122 nM y 65 nM a pH 6 y pH 7,4, respectivamente. La afinidad de fijación de SL335 por la MSA era de aproximadamente 10 nM a pH 6 y de 1,6 nM a pH 7,4, pero estos datos no se incluyeron en la tabla 6 debido a que no eran fiables.
Tabla 6
[Tabla 6]
Figure imgf000017_0001
Se calculó la cinética de fijación y la cinética de disociación con el uso del paquete de programas informáticos Octed QK.
2-(3) Farmacocinética in vivo de SL335
De todas las proteínas plasmáticas, la HSA tiene una semivida excepcionalmente prolongada por el mecanismo de reciclaje mediado por FcRn, y se utiliza corrientemente como compañera de fusión para extender la semivida de las proteínas terapéuticas. Además, se sabía que los fragmentos de anticuerpo que están asociados a la seroalbúmina prolongaban su semivida en el suero. De ahí que se realizara un análisis farmacocinético para comprobar si el SL335 también tiene una semivida sérica larga. El Fab de humano con una especificidad de fijación desconocida se incluyó como control negativo (Fab Neg). El SL335 y el Fab Neg se inyectaron por vía intravenosa o subcutánea por separado en el grupo de 3 ratas a 1 mg/kg y se recogieron muestras de suero en diferentes puntos del tiempo (5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 96 h y 144 h para la vía i.v.; y 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h y 96 h para la vía s.c.). La concentración de SL335 y de Fab Neg en las muestras de suero se midió con el ELISA de tipo sándwich en el que se usó el anticuerpo monoclonal de ratón contra el Fd de IgG de humano y el anticuerpo policlonal de cabra contra la cadena L k de humano conjugado con HRPO como anticuerpos de captura y de detección, respectivamente. También se incluyeron en el ensayo los fragmentos Fab de humano de concentración conocida para obtener una curva patrón. Cada curva de concentración en el suero frente al tiempo se ajustó para un modelo unicompartimental con el programa informático WinNonlin (SL335 y Fab Neg) y para un modelo bicompartimental con el programa informático Sigma Plot. En la administración intravenosa, la semivida terminal (t1/2) de SL335 fue de 37 h y su área bajo la curva (AUC0 ^ ~ ) fue de 187 h mg/ml, que representa un incremento de diez veces de la t1/2 y un incremento de 26 veces del AUC0 ^ ~ en comparación con el Fab Neg (3,8 h y 7 h mg/ml, respectivamente) (Figura 3A). La inyección subcutánea de SL335 produjo mediciones similares, que incluían un incremento de 9 veces de la t1/2 (120 h frente a 13 h) y un incremento de 44 veces del AUC0 ^ ~ en comparación con el Fab Neg (87 frente a 2 h mg/ml) (Figura 3B). Estos resultados mostraron con claridad que se prolongaba la semivida de SL335 en el suero, e implicaba que el SL335 no interferiría con la interacción entre RSA y FcRn en las ratas.
2-(4) Producción de las fusiones SL335-hGH
El SL335 se utilizó para crear dos fusiones SL335-hGH y cuatro fusiones SL335-hGH más mediante la fusión genética de la hGH recombinante (aminoácidos 27 a 191) con el extremo amino o carboxilo del Fd o de la cadena L a través de un conector peptídico corto. El ADNc de la hGH recombinante (aminoácidos 27 a 191) se fusionó al extremo carboxilo de la cadena H o L de SL335wt en una forma de Fab clásico a través de un conector peptídico corto, lo que da lugar a la construcción de dos formatos de fusión (HcysG/Lcys y LcysG/Hcys). También se construyeron cuatro formatos de fusión más (HerG/Lcys, LserG/Hcys, HserG/Lser y LserG/Hser) como está descrito más arriba, salvo que se utilizó SL335 en una forma nula (SL335null) o una forma de Fab sin disulfuro (SL335áds) en la cual la Cys233 del extremo carboxilo de C h1 y/o la Cys214 del extremo carboxilo de CLk estaban remplazadas por Ser. Para la expresión periplásmica de las proteínas de fusión, se colocó la secuencia líder de ompA (MKKTAIAIAVLAGFATVAQA (SEQ ID n.° 56)) delante de la cadena L o de las fusiones L-hGH, y la secuencia líder de pelB (MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (SEQ ID n.° 57)) se colocó delante de la cadena H o de las fusiones H-hGH. En estos experimentos preliminares, la unión genética de hGH al extremo amino de Fd o de la cadena L dio lugar a una expresión baja o nula de las proteínas de fusión solubles. La fusión de hGH al extremo carboxilo del Fd también mostró poco rendimiento de expresión y parecía interrumpir el plegamiento del dominio hGH probablemente debido a la formación aberrante del puente disulfuro en la fusión SL335-hGH (no se muestran los datos). Previamente, se había descrito que la retirada del puente disulfuro intercatenario de un Fab mediante la mutación de los restos de Cys del extremo carboxilo en C h1 y en CLk (Cys233 y Cys214, respectivamente) no alteraba la cantidad producida en el periplasma, ni la estabilidad tras la extracción y la purificación, ni la estabilidad sérica, ni la semivida sérica (véase Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest; Humphreys et al., (1997) J. Immunol. Methods. 209, 193-202; Humphreys et al., (2007) Protein Eng Des Sel. 20, 227-234). Al reemplazar tanto la Cys233 de la C h1 como la Cys214 de la CLk por serina (sustituciones Cys233 ^ Ser233 y Cys214 ^ Ser214), comprobamos si estos restos de Cys en el SL335 modulan la expresión soluble y el plegamiento adecuado de las fusiones SL335-hGH. En la Figura 4 se ilustran 6 construcciones de fusión SL335-hGH. Además de SL335wt y SL335áds, una variante más de SL335, denominada SL335null, también se creó por sustitución de la Cys233 de C h1 o bien de la Cys214 de CLk por Ser para clarificar el efecto de cada resto de cisteína (Cys233 o Cys214) por separado. Los dos derivados de fusión de SL335wt fueron HcysG/Lcys (fusión HCys233-hGH emparejada con la LCys214) y LcysG/Hcys (fusión LCys214-hGH emparejada con la HCys233), los dos derivados de fusión de SL335null fueron HserG/Lcys (fusión HSer233-hGH emparejada con la LCys214) y LserG/HCys (fusión LSer214-hGH emparejada con la HCys233). Finalmente, los dos derivados de fusión de SL335áds fueron HserG/Lser (fusión HSer233-hGH emparejada con la LSer214) y LserG/Hser (fusión Lser214-hGH emparejada con la HSer233). Estas 6 construcciones de fusión SL335-hGH se expresaron en las células hospedadoras SUPEX5 de E. coli, y el rendimiento y la reactividad de fijación a HSA de estas 6 proteínas de fusión SL335-hGH en el sobrenadante de cultivo se analizaron por ELISA. Los clones de E. coli que expresan las proteínas de fusión SL335-hGH se hicieron crecer en las mismas condiciones en presencia de IPTG, y se recogió cada sobrenadante de cultivo mediante una centrifugación breve. La concentración de cada fusión SL335-hGH soluble se midió mediante ELISA de tipo sándwich con el anticuerpo monoclonal de ratón contra el Fd de humano como anticuerpo de captura, y el anticuerpo policlonal de cabra contra la cadena L k de humano conjugado con HRPO se utilizó como anticuerpo de detección (Figura 5A). No se detectaron formas solubles de Fab a partir de LcysG/Hcys o LserG/Hcys. Aunque los datos no se presentan, la inmunotransferencia con los lisados celulares de E. coli reveló que la Cys233 de Fd era responsable de la degradación cuantiosa y la ausencia de secreción de los fragmentos Fd probablemente debido a la agregación de las proteínas. El rendimiento de HcysG/Lcys fue de 0,5 pg/ml y el de HserG/Lcys y LserG/Hser fue de aproximadamente 1,8 pg/ml y 1,4 pg/ml, respectivamente (Figura 5A). Es interesante que el rendimiento de HserG/Lser fuera de aproximadamente 4 pg/ml, que era 8 veces mayor que el de HcysG/Lcys. Los extractos periplásmicos mostraron el mismo patrón de expresión, aunque el rendimiento total fuera solo del -30 % del presente en el sobrenadante de cultivo (no se muestran los datos). En la repetición de los experimentos se confirmó que la diferencia de rendimiento entre HcysG/Lcys y HserG/Lser era independiente de la variación clonal o de la velocidad de crecimiento de los clones de E. coli. La reactividad de fijación de las fusiones SL335-hGH a la HSA se comparó en las placas de microtitulación revestidas con HSA a 5 pg/ml, y se incubó con diluciones seriadas del sobrenadante de cultivo que contenía las fusiones SL335-hGH. A continuación, las fusiones SL335-hGH fijadas a la HSA se detectaron con el anticuerpo policlonal de cabra contra la cadena L k de humano conjugado con HRPO. Tal y como se esperaba, la detección de HserG/Lser que se fijó a la HSA con el anticuerpo policlonal contra la L k de humano produjo una señal de fijación 8 veces más fuerte que la de HcysG/Lcys, y una señal de fijación aproximadamente 4 veces más fuerte que la de HserG/Lcys y LserG/Hser (Figura 5 b ). También se observó el mismo patrón en la señal de fijación cuando T-20, un anticuerpo policlonal de cabra específico del extremo carboxilo de la hGH, se utilizó para detectar las fusiones SL335-hGH (Figura 5C). Sin embargo, en la detección con NYThGH, un anticuerpo monoclonal de ratón específico de la hGH completa, la HserG/Lser produjo una señal de fijación 30 veces mayor que la de HserG/Lcys y LserG/Hser, y una señal de fijación 60 veces mayor que la de HcysG/Lcys (Figura 5D), lo que sugiere que la fijación de NYThGH al dominio hGH de HcysG/Lcys se veía entorpecido por la presencia del puente disulfuro intercatenario en el SL335. Ya que HcysG/Lcys y HserG/Lser representan la utilización de SL335wt y SL335áds para crear las fusiones SL335-hGH, recibieron el nombre de fusión SL335wt-hGH y fusión SL335áds-hGH, respectivamente, a partir de entonces (Figura 5).
Para determinar si el elevado rendimiento de la fusión SL335áds-hGH soluble dependía de la retirada del puente disulfuro intercatenario de SL335, de las cepas de E. coli hospedadoras o de la temperatura de inducción, el SL335w t, el SL335áds, la fusión SL335wt-hGH y la fusión SL335áds-hGH se expresaron en las células MC1061 originales así como en las células SUPEX5 mutantes a 20 °C (Figura 6A), 25 °C (Figura 6B) o 30 °C (Figura 6C), y se midió la cantidad de moléculas de Fab en el sobrenadante de cultivo mediante ELISA. El rendimiento del SL335wt expresado en la cepa MC1061 fue de 1 pg/ml a 20 °C, que era aproximadamente 3 veces mayor que a 25 °C y 30 °C. Esta supuesta inducción de SL335wt por debajo de 25 °C es ventajosa sobre todo cuando se utilizó MC1061 de cepa hospedadora. Se obtuvieron resultados similares también con la cepa SUPEX5. En el caso de SL335áds, el rendimiento fue de aproximadamente 1,3 pg/ml a 20 °C independientemente de la cepa de E. coli hospedadora y de la temperatura de inducción. Estos resultados indicaban que la presencia o ausencia del puente disulfuro intercatenario en un Fab no influye de manera significativa en el rendimiento de la producción de Fab soluble a 20 °C independientemente de la cepa de E. coli hospedadora. El rendimiento de la fusión SL335wt-hGH fue de aproximadamente 0,3 a 0,5 pg/ml independientemente de la cepa de E. coli hospedadora y de la temperatura de inducción. Por otra parte, el rendimiento de la fusión SL335áds-hGH expresada en la cepa MC1061 fue de 1,8 pg/ml tanto a 20 °C como a 25 °C, y de 1,5 pg/ml a 30 °C, lo que muestra una dependencia de la temperatura menos importante, mientras que el rendimiento de la fusión SL335áds-hGH expresada en la cepa SUPEX5 fue de 4,0 pg/ml tanto a 20 °C como a 25 °C, y de 3,5 pg/ml a 30 °C. Estos resultados significan que la utilización de la forma SL335áds y la cepa SUPEX5 de E. coli permitía que rendimiento de la proteína de fusión SL335-hGH fuera aproximadamente 12 veces mayor en comparación con la combinación de la forma SL335wt y la cepa MC1061 de E. coli.
2-(5) Generación de las construcciones de fusión SL335-GCSF, SL335-IFNB, EGL4-hGH y 1b28-hGH
Para demostrar el efecto beneficioso de una forma Fabáds y de la cepa SUPEX5 para mejorar la expresión soluble de una proteína de fusión Fab-efector, se generaron diferentes construcciones de fusión Fab-efector. Primero, se crearon 2 variantes de fusión de SL335-GCSF (HcysGCSF/Lcys que se denominó SL335wt-GCSF, HserGF/Lser que se denominó SL335áds-GCSF) y 2 variantes de fusión de SL335-IFNp (HcysIFNp/Lcys que se denominó SL335wt-IFNp, HserIFNp/Lser que se denominó SL335áds-IFNp) del mismo modo que se generaron las fusiones SL335wt-hGH y SL335áds-hGH para determinar la influencia de un dominio efector. La temperatura de inducción se fijó a la óptima de 20 °C, y el rendimiento de la expresión de estas proteínas de fusión en el sobrenadante de cultivo de E. coli se comparó por ELISA. El rendimiento de SL335wt-GCSF fue de 0,3 y 0,6 mg/ml en MC1061 y SUPEX5, respectivamente, y el de SL335áds-GCSF fue de 0,6 y 1,5 mg/ml en MC1061 y SUPEX5, respectivamente (Figura 7A). Mientras que el rendimiento de SL335wt-IFNp fue de 0,16 mg/ml tanto en MC1061 como en SUPEX5, y el de SL335áds-IFNp fue de 0,2 y 0,5 mg/ml en MC1061 y SUPEX5, respectivamente (Figura 7B). Por lo tanto, la combinación de la fusión SL335áds-GCSF y la cepa SUPEX5 produjo un rendimiento aproximadamente 5 veces mayor de una forma de fusión SL335-GCSF que la combinación de la fusión S335wt-GCSF y la cepa MC1061, y la combinación de la fusión SL335áds-IFNp y la cepa SUPEX5 produjo una cantidad aproximadamente 3 veces mayor de una forma de fusión SL335-IFNp que la combinación de la fusión SL335wt-IFNp y la cepa MC1061. Segundo, también creamos dos construcciones de fusión de Fab-hGH con el uso de EGL4, un Fab de humano anti-EFGR, y 1b28, un Fab de humano anti-IL-1 b para determinar la influencia de un Fab. Del mismo modo que para generar las fusiones SL335wt-hGH y SL335áds-hGH, las 2 construcciones de fusión de EGL4-hGH fueron la fusión EGL4wt-hGH en el formato HcysG/Lcys y la fusión EGL4áds-hGH en el formato HserG/Lser. Así mismo, las construcciones de fusión de 1b284-hGH fueron la fusión 1b28wt-hGH en el formato HcysG/Lcys y la fusión 1b28áds-hGH en el formato HserG/Lser. El rendimiento de la fusión EGL4wt-hGH fue de 8090 ng/ml en las cepas MC1061 y SUPEX5, y el rendimiento de la fusión EGL4áds-hGH fue de 140 ng/ml en la cepa MC1061 y de 220 ng/ml en la cepa SUPEX5 (Figura 8A), lo que indicaba que la combinación de la fusión EGL4áds-hGH y la célula hospedadora SUPEX5 producía una cantidad 2,4 veces mayor de una proteína de fusión EGL4-hGH en el sobrenadante de cultivo en comparación con la combinación de la fusión EGL4wt-hGH y la célula hospedadora MC1061. En el caso de las construcciones de fusión de 1b28-hGH, el rendimiento de la fusión 1b284wt-hGH fue de 50 ng/ml en la cepa MC1061 y de 100 ng/ml en la cepa SUPEX5, respectivamente, y el rendimiento de la fusión 1b28áds-hGH fue de 900 ng/ml en la cepa MC1061 y de 4 mg/ml en la cepa SUPEX5 (Figura 8B), lo que indica que la combinación de la fusión 1 b28áds-hGH y la cepa hospedadora SUPEX5 producía una cantidad 800 veces mayor de una forma de fusión de 1 b28-hGH en el sobrenadante de cultivo en comparación con la combinación de la fusión 1b28wt-hGH y la célula hospedadora MC1061.
2-(6) Caracterización molecular de SL335wt-hGH y SL335úds-hGH
Las fusiones SL335wt-hGH y SL335áds-hGH se caracterizaron adicionalmente a nivel molecular. Las proteínas de fusión en el sobrenadante de cultivo se purificaron por afinidad al hacerlas pasar por resinas revestidas con HSA, y se analizaron por SDS-PAGE e inmunotransferencia en condiciones reductoras y no reductoras. Las HcysG/Lcys (carril 1) y HserG/Lser (carril 2) se purificaron por afinidad a partir del sobrenadante de cultivo con perlas de Sepharose en las que se había inmovilizado la HSA y se llevó a cabo la SDS-PAGE con el uso de un gel de Bis-Tris al 4-12 % en las condiciones reductora o no reductora. Las bandas de proteínas se visualizaron con tinción de azul de Coomassie (Figura 9A). Las proteínas de cada SDS-PAGE se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y el anticuerpo de cabra contra la Lk de humano conjugado con AP se utilizó para detectar Lcys y Lser (Figura 9B). Las señales de fijación se visualizaron con un sustrato de NBT/BCIP. En el análisis de Sd S-PAGE, tanto SL335wt-hGH como SL335áds-hGH produjeron dos bandas proteicas principales a un tamaño de 46 kDa y 23 kDa que se corresponden con las fusiones Fd-hGH y las cadenas L, respectivamente, en las condiciones reductoras. En las condiciones no reductoras, la SL335áds-hGH produjo, como se esperaba, dos bandas proteicas idénticas debido a la falta de un puente disulfuro intercatenario. En el caso de SL335wt-hGH, era visible una banda proteica principal de 70 kDa que corresponde a una forma heterodimérica correcta de SL335wt-hGH. También se encontraron muchos derivados de SL335wt-hGH de tamaños diferentes, que incluían 4 bandas proteicas prominentes que oscilaban de 24 kDa a 45 kDa cuya identidad se desconocía y un par de bandas proteicas débiles que tenían un tamaño de 100 kDa y 135 kDa. En todas las muestras también se veían proteínas de un tamaño de 15 kDa y 12,5 kDa. A continuación, se realizó el análisis de inmunotransferencia con el anticuerpo monoclonal contra el Fd de humano, el anticuerpo policlonal contra la cadena Lk y el anticuerpo policlonal anti-hGH, T-20. La inmunotransferencia con el anticuerpo monoclonal contra el Fd de humano detectó solamente HcysG y HserG de un tamaño de 46 kDa tanto en las condiciones reductoras como las no reductoras (no se muestran los datos). Por otra parte, con el anticuerpo policlonal contra la cadena Lk se detectaron en la condición no reductora 4 bandas proteicas que oscilaban de 24 kDa a 45 kDa, así como las más grandes de 70 kDa en la muestra de SL335wt-hGH (Figura 9B). Este resultado indicaba que la Cys214 de la cadena L es responsable de la formación de diferentes cadenas L multiméricas, al menos mediante la formación de puentes disulfuro aberrantes. La inmunotransferencia en la condición no reductora con el anticuerpo policlonal anti-hGH T-20 reconoció correctamente la forma heterodimérica de 70 kDa de SL335wt-hGH y la HerG monomérica de aproximadamente 45 kDa de SL335áds-hGH (Figura 9C). Las proteínas de un tamaño de 15 kDa y 12,5 kDa no se detectaron con ninguno de estos anticuerpos, lo que sugiere que eran productos de degradación de las fusiones o bien contaminaciones de las proteínas del hospedador E. coli.
Una electroforesis capilar basada en chips confirmó el análisis por SDS-PAGE. Se prepararon HcysG/Lcys (Figura 10A) y HserG/Lser (Figura 10B) con tampón de muestra en presencia o ausencia de DTT para la electroforesis reductora o no reductora, y se llevó a cabo la electroforesis capilar basada en chips con el sistema Agilent 2100 Bioanalyzer de acuerdo con el protocolo del fabricante y el uso del kit Protein 80. Los resultados se representaron gráficamente para reflejar las unidades de intensidad de fluorescencia frente al tamaño de las proteínas. La SL335wt-hGH produjo varios derivados de SL335wt-hGH que tenían un tamaño que oscilaba de 27,1 kDa a 52,4 kDa en la condición no reductora, y muchos de ellos desaparecieron en la condición reductora en presencia de DTT (Figura 10A). La SL335áds-hGH produjo picos proteicos casi idénticos entre las condiciones no reductora y reductora, salvo por cambios menores de la masa molecular (Figura 10B).
SL335wt-hGH y SL335áds-hGH se analizaron adicionalmente mediante espectrometría de masas de tipo MALDI-TOF. La espectrometría de masas de tipo MALDI-TOF se realizó en un dispositivo Autoflex III Smartbeam (Bruker Daltonics, Billerica, Massachusetts, EE. UU.). Las HcysG/Lcys (Figura 11A) y HserG/Lser (Figura 11B) purificadas por afinidad se mezclaron con la matriz de MALDI y se les adquirió el espectro sobre el margen de m/z de 10000 a 150000 Da en el modo de iones positivos. El espectro de masas en el margen de m/z de 10000 a 70000 se adquirió para SL335áds-hGH. Para SL335wt-hGH, se obtuvo el de 150000 a 160000, ya que la muestra de SL335wt-hGH mostró bandas de proteínas de más de 70 kDa, como se muestra en la Figura 8A. La masa molecular de Lcys, HcysG y SL335wt-hGH se identificó que era de 23226 Da, 46226 Da y 69837 Da, respectivamente (Figura 11A). El tamaño de cada una de las 3 proteínas que son más grandes que la correcta SL335wt-hGH se halló que era de 92824 Da, 117455 Da y 139347 Da. En el caso de SL335áds-hGH, la masa molecular de Lser y HserG se identificó que era de 23 334 Da y 46667 Da, respectivamente (Figura 11B). Que el pico de HserG fuera más bajo que el de Lser podría representar una menor eficacia de ionización para las moléculas más grandes, o la presencia en la muestra de una relación molar de HserG más baja que la de Lser.
La SL335áds-hGH purificada por afinidad se purificó adicionalmente al hacerla pasar a través de una columna de Sephacryl™ S-200HR con el uso de FPLC. Se realizó la filtración en gel de HserG/Lser después de la purificación por afinidad en la columna preempaquetada de Sephacryl™ S-200HR y FPLC AKTA (GE Healthcare, Wauwatosa, Wisconsin, EE. UU.). La columna se equilibró con el tampón de equilibrado (HEPES a 20 nM, pH 7,4 que contiene NaCl a 150 mM) y se le cargó la HserG/Lser purificada por afinidad. La elución se llevó a cabo con el tampón de equilibrado a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. Las flechas indican las fracciones elegidas para el análisis por SDS-pAg E (Figura 12A). Las fracciones n.° 13, n.° 16, n.° 19 y n.° 23 que se recuperaron de dos picos característicos se analizaron en un gel de Bis-Tris al 4-12 % en las condiciones reductoras (Figura 12B). Las bandas de proteína se visualizaron con la tinción de azul de Coomassie. Se distinguieron dos picos que correspondían a aproximadamente 66 kDa y 25 kDa desde la fracción n.° 12 a la n.° 27 (Figura 9A). Así pues, se analizaron 4 fracciones (fracciones n.° 13, n.° 16, n.° 19 y n.° 23) mediante SDS-PAGE en las condiciones reductoras para determinar el contenido proteico de las fracciones (Figura 9B). Los resultados mostraron que las fracciones del pico de 66 kDa (fracciones n.° 13, n.° 16 y n.° 19) contenían la SL335áds-hGH heterodimérica y que la fracción del pico de 25 kDa (fracción n.° 23) contenía principalmente la Lser monomérica.
2-(7) Caracterización funcional in vitro de SL335ñds-hGH
Para determinar si la retirada de un puente disulfuro intercatenario de SL335wt y la fusión de hGH afectan a la afinidad de fijación por HSA o RSA, se realizó un ensayo de interferometría de biocapa con el uso de SL335áds-hGH en las condiciones de pH 6 y pH 7,4 (véase la tabla 6 que se muestra más adelante). Las contantes de disociación de SL335áds-hGH para la HSA fueron de 1,7 nM a pH 6 y de 1,5 nM a pH 7,4, lo que mostró un incremento de la afinidad de 5 veces y 8,7 veces en comparación con la de SL335, respectivamente. Las constantes de disociación de la RSA fueron de 499 nM a pH 6 y de 83,6 nM a pH 7,4, lo que mostró una disminución de la afinidad de 4,2 veces y 1,3 veces en comparación con la de SL335, respectivamente.
También se midió in vitro la actividad hGH de SL335ds-hGH con el uso de las células de linfoma de rata Nb2-11 que proliferan tras el tratamiento con hGH de manera dependiente de la concentración. Las células de linfoma de rata Nb2-11 se resuspendieron a 8 x 104 células/ml en DMEM que contenía suero de caballo al 5 % (v/v) y se añadió una alícuota de 50 pl de la suspensión celular a cada pocillo de las placas de 96 pocillos, seguido de la incubación durante una noche. A continuación, las células se trataron con concentraciones crecientes de Growtropin® o HserG/Lser (de 0 a 20 nM) en 50 ml de DMEM que contenía suero de caballo al 5 % durante 48 h a 37 °C. Después de la incubación, se le añadieron 10 pl de la solución de CCK-8 a cada pocillo y las células se incubaron durante 4 h. Se grabó la absorbancia en un lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm. Los datos representan la DE de la media de 3 experimentos. En ausencia de HSA, la SL335áds-hGH fue capaz de estimular el crecimiento de Nb2-11 con una CE50 aparente de 50 pM (3,5 ng/ml) (Figura 13A). Este valor es 6,7 veces menos potente que el de Growtropin®, la rhGH estándar (7,5 pM). En presencia de HSA a 10 mM, la correspondiente potencia de Growtropin® y SL335áds-hGH no se vio afectada en buena medida, aunque la SL335áds-hGH representó una reducción de aproximadamente 5 veces en la potencia en comparación con la de Growtropin® (Figura 13B). La SL335 que se utilizó de control negativo no mostró ningún efecto proliferativo. Estos resultados demostraron con claridad que la SL335áds-hGH tenía bioactividad de una hGH funcional.
A continuación, se determinó la estabilidad en el suero con la incubación de la SL335áds-hGH a 37 °C durante 16 días. Para resuspender las muestras se utilizó FBS en vez de suero humano, ya que la capacidad de fijación de SL335áds-hGH y SL335 a la HSA del suero humano podría complicar los experimentos posteriores. Las muestras se recogieron 1 vez al día, y la reactividad de fijación a la HSA se midió por ELISA (Figura 14a ) y la bioactividad in vitro se midió con el ensayo de proliferación celular en Nb2-11 (Figura 14B). También se incluyó la SL335 como control. De forma similar a la SL335, la reactividad de fijación a la HSA y la actividad proliferativa en Nb2-11 que presentaba la SL335áds-hGH no cambiaron ni siquiera después de 16 días de incubación a 37 °C, lo que demuestra que la SL335áds-hGH es tan estable como la SL335, a pesar de la ausencia del puente disulfuro intercatenario.
2-(8) Estudios de farmacocinética y farmacodinámica en las ratas
Ya que se mostró que la SL335áds-hGH era una candidata prometedora para una hGH de acción prolongada, se realizaron estudios de eficacia in vivo. Primero se comparó en las ratas la farmacocinética de Growtropin® y SL335áds-hGH con la medición de la concentración sérica de cada análogo en función del tiempo transcurrido después de una única inyección intravenosa o subcutánea. A cada grupo de ratas (4 en cada grupo) se le administró una inyección subcutánea (Figura 15A) de una única dosis en embolada de 0,6 mg/kg de Growtropin o SAFAtropin, o una inyección intravenosa (Figura 15B) de una única dosis en embolada de 0,3 mg/kg de Growtropin o SAFAtropin. Se tomaron muestras de suero a lo largo de intervalos que se extendieron hasta 144 h en función de la proteína. En las muestras de suero a los tiempos indicados se les analizó la presencia de Growtropin® o SAFAtropin® por ELISA tal y como está descrito más arriba. Los parámetros farmacocinéticos se muestran en la tabla 7.
Tabla 7
[Tabla 7]
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Los valores mostrados son medias con la desviación estándar. Las abreviaturas son las siguientes: Cmáx: concentración máxima; Lio: semivida terminal; AUC0^ ~: área bajo la curva de concentración en función del tiempo extrapolada al infinito; Cl/f: eliminación plasmática total aparente.
La SL335áds-hGH mostró una extensión considerable de la ti /2 independientemente de la vía de administración. En la administración intravenosa, la SL335áds-hGH representó un incremento de 83 veces del ti/2 en comparación con Growtropin (16,6 h frente a 0,2 h) y un incremento de 69 veces cuando la administración era subcutánea (97,2 h frente a 1,4 h).
La SL335áds-hGH también mostró un incremento de aproximadamente 10 veces del AUC0^ ~ y una velocidad de eliminación (Cl/f) 10 veces más lenta en comparación con Growtropin®, independientemente de la vía de administración. A cada grupo de ratas (4 en un grupo) se le administró una inyección subcutánea de una única dosis en embolada de 0,6 mg/kg de Growtropin® o SAFAtropin®, o una inyección intravenosa de una única dosis en embolada de 0,3 mg/kg de Growtropin o SAFAtropin. Se tomaron muestras de suero durante intervalos que se extendieron hasta 144 h en función de la proteína. Las muestras de suero se analizaron a los tiempos indicados la presencia de Growtropin® o SAFAtropin® por un ELISA como el descrito más arriba. Es interesante que los valores de Cmáx de SL335áds-hGH fueran 6 veces y 3 veces menores que los de Growtropin® según la vía de administración.
A continuación, se comparó la tasa de crecimiento de las ratas hipofisectomizadas durante 10 días después de la administración s.c. diaria de Growtropin® o un control de tampón con excipiente («solo excipiente»), o de la administración s.c. semanal de SL335ds-hGH. Las ratas hipofisectomizadas se trataron solo con excipiente o con 0,3 mg/kg de Growtropin® al día, o con una dosis creciente de SAFAtropin® los días 0 y 7 (Figura 16). Las líneas continuas indican el cambio porcentual medio de la masa corporal. Las barras de error representan la desviación estándar. Las ratas tratadas con excipiente mostraron una pérdida de peso de aproximadamente el 5 %. A su vez, las que recibieron una inyección diaria de Growtropin® (0,3 mg/kg) mostraron un aumento de peso del 5 %, lo que daba lugar a un aumento de peso total del 10 % con respecto al grupo de «solo excipiente». Las inyecciones semanales de SL335áds-hGH producían un aumento de peso dependiente de la dosis, en donde la dosis de 2,4 mg/kg produjo un aumento de peso del 15 % y la dosis de 0,6 mg/kg produjo un aumento de peso del 3,5 %. Una pauta de dosificación de SL335áds-hGH equimolar (1,2 mg/kg) dio lugar a un aumento de peso del 5 % que era comparable al obtenido mediante las inyecciones diarias de Growtropin®.
En la Figura 17 se muestra que la administración semanal de 0,6 mg/kg de SL335áds-hGH consiguió incrementar la longitud de la tibia de manera equivalente a la conseguida con la administración diaria de Growtropin®. Las barras rellenas indican la media de la longitud medida del hueso de la tibia. Las barras de error representan la desviación estándar.
Aplicabilidad industrial
La presente invención se utilizaría para desarrollar agentes terapéuticos proteicos o polipeptídicos bioactivos, ya que las construcciones de las fusiones de la invención se pueden preparar para que comprendan diferentes tipos de entidades efectoras, que incluyen la hormona de crecimiento de humano, interferón, eritropoyetina, factores estimulantes de colonias o derivados de los mismos, y derivados de anticuerpos, etc.
TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS A LOS FINES DEL PROCEDIMIENTO EN MATERIA DE PATENTES
FORMULARIO INTERNACIONAL
RECIBO EN EL CASO DE UN DEPÓSITO ORIGINAL
expedido de conformidad con la Norma 7.1
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un fragmento de fijación a antígeno (Fab) contra una seroalbúmina (SA), en donde el Fab comprende,
(a) un dominio variable de cadena pesada (dominio Vh) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.° 1, SEQ ID n.° 2, SEQ ID n.° 3, SEQ ID n.° 4, SEQ ID n.° 5 y SEQ ID n.° 6; y
(b) un dominio variable de cadena ligera (dominio Vl) que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID n.° 7, SEQ ID n.° 8, SEQ ID n.° 9, SEQ ID n.° 10, SEQ ID n.° 11 y SEQ ID n.° 12, en donde el Fab se fija específicamente a la seroalbúmina.
2. Un fragmento de fijación a antígeno (Fab) que se fija a una seroalbúmina (SA), en donde el Fab comprende, (a) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID n.° 13 (CDR1), 14 (c Dr 2) y 15 (CDR15) que determinan las CDR del dominio Vh; y
(b) las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID n.° 16 (CDR1), 17 (CDR2) y 18 (CDR3) que determinan las c Dr del dominio Vl.
3. El Fab de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el dominio Vh tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.° 6 y el dominio Vl tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n.° 12.
4. Una construcción de fusión del fragmento de fijación a antígeno (Fab) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y una entidad efectora bioactiva; en donde la entidad efectora bioactiva es una proteína o un polipéptido; y en donde el Fab y la entidad efectora bioactiva están unidos covalentemente mediante fusión genética.
5. La construcción de fusión de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el Fab y la entidad efectora bioactiva están unidos covalentemente mediante fusión genética con el uso de un conector peptídico de 0 a 20 aminoácidos.
6. La construcción de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en donde la entidad efectora bioactiva es una seleccionada entre el grupo que consiste en hormona, citocina, enzima, anticuerpo, factor de crecimiento, factor de transcripción, factor sanguíneo, vacuna, proteína estructural, proteína de tipo ligando y receptor.
7. La construcción de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la entidad efectora bioactiva es una que se selecciona entre el grupo que consiste en hormona del crecimiento humano (hGH), hormona liberadora de la hormona de crecimiento (GHRH), péptido liberador de la hormona de crecimiento, interferones, receptores de interferones, factores estimulantes de colonias (CSF), péptidos de tipo glucagón, receptor acoplado a proteínas G, interleucinas, receptores de interleucinas, enzimas, proteínas de fijación a interleucinas, proteínas de fijación a citocinas, factor de activación de macrófagos, péptido de macrófago, factor de linfocitos B, factor de linfocitos T, proteína A, inhibidor de la alergia, glucoproteínas de la necrosis celular, inmunotoxina, linfotoxina, factor de la necrosis tumoral, supresores tumorales, factor del crecimiento de las metástasis, antitripsina a l, albúmina, a-lactalbúmina, apolipoproteína E, eritropoyetina, eritropoyetina altamente glucosilada, angiopoyetinas, hemoglobina, trombina, péptido activador del receptor de la trombina, trombomodulina, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor IX, factor XIII, factor activador del plasminógeno, péptido de fijación a la fibrina, urocinasa, estreptocinasa, hirudina, proteína C, proteína reactiva C, inhibidor de la renina, inhibidor de la colagenasa, superóxido dismutasa, leptina, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor de crecimiento epitelial, factor de crecimiento epidérmico, angiostatina, angiotensina, factor de crecimiento óseo, proteína estimulante del hueso, calcitonina, insulina, péptido natriurético auricular, factor inductor de cartílago, elcatonina, factor activador de tejido conjuntivo, inhibidor de la vía de la tromboplastina tisular, hormona estimulante del folículo, hormona luteinizante, hormona liberadora de la hormona luteinizante, factores de crecimiento de los nervios, hormona paratiroidea, relaxina, secretina, somatomedina, factor de crecimiento de tipo insulina, hormona suprarrenal, glucagón, colecistocinina, polipéptido pancreático, péptido liberador de gastrina, factor liberador de corticotropina, hormona estimulante de la tiroides, autotaxina, lactoferrina, miostatina, receptores, antagonistas de receptores, antígenos de la superficie celular, antígenos de vacuna procedentes de virus, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpo.
8. La construcción de fusión de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la entidad efectora bioactiva es la hGH, los GCSF o los IFN.
9. La construcción de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde la relación molar del polipéptido bioactivo o de la proteína bioactiva por el Fab está entre 1:1 y 10:1, preferentemente entre 1:1 y 4:1.
10. Un vector de expresión que comprende:
(a) un promotor;
(b) una primera secuencia de ácido nucleico que codifica el Fab de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y
(c) una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido bioactivo o una proteína bioactiva, y, optativamente, un conector, en donde el promotor, la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico están operativamente unidas.
11. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 10.
12. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la célula hospedadora es E. coli.
13. La célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la célula hospedadora es SUPEX5 (KCTC 12657BP).
14. Un método para incrementar la semivida in vivo de una proteína bioactiva o de un polipéptido, que comprende la conexión de una proteína bioactiva o de un polipéptido al Fab de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 mediante fusión genética.
15. El método para incrementar la semivida in vivo de una proteína bioactiva o de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la proteína bioactiva o el polipéptido se conecta al Fab mediante un conector peptídico que comprende de 0 a 20 aminoácidos.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en donde la proteína bioactiva o el (poli)péptido es una proteína o un polipéptido seleccionado(a) entre el grupo que consiste en hormona del crecimiento humano (hGH), hormona liberadora de la hormona de crecimiento (GHRH), péptido liberador de la hormona de crecimiento, interferones (IFN), receptores de interferones, factores estimulantes de colonias (CSF), factores estimulantes de colonias de granulocitos (GCSF), péptidos de tipo glucagón, receptor acoplado a proteínas G, interleucinas, receptores de interleucinas, enzimas, proteínas de fijación a interleucinas, proteínas de fijación a citocinas, factor de activación de macrófagos, péptido de macrófago, factor de linfocitos B, factor de linfocitos T, proteína A, inhibidor de la alergia, glucoproteínas de la necrosis celular, inmunotoxina, linfotoxina, factor de la necrosis tumoral, supresores tumorales, factor del crecimiento de las metástasis, antitripsina a l, albúmina, a-lactalbúmina, apolipoproteína E, eritropoyetina, eritropoyetina altamente glucosilada, angiopoyetinas, hemoglobina, trombina, péptido activador del receptor de la trombina, trombomodulina, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor IX, factor XIII, factor activador del plasminógeno, péptido de fijación a la fibrina, urocinasa, estreptocinasa, hirudina, proteína C, proteína reactiva C, inhibidor de la renina, inhibidor de la colagenasa, superóxido dismutasa, leptina, factor de crecimiento derivado de las plaquetas, factor de crecimiento epitelial, factor de crecimiento epidérmico, angiostatina, angiotensina, factor de crecimiento óseo, proteína estimulante del hueso, calcitonina, insulina, péptido natriurético auricular, factor inductor de cartílago, elcatonina, factor activador de tejido conjuntivo, inhibidor de la vía de la tromboplastina tisular, hormona estimulante del folículo, hormona luteinizante, hormona liberadora de la hormona luteinizante, factores de crecimiento de los nervios, hormona paratiroidea, relaxina, secretina, somatomedina, factor de crecimiento de tipo insulina, hormona suprarrenal, glucagón, colecistocinina, polipéptido pancreático, péptido liberador de gastrina, factor liberador de corticotropina, hormona estimulante de la tiroides, autotaxina, lactoferrina, miostatina, receptores, antagonistas de receptores, antígenos de la superficie celular, antígenos de vacuna procedentes de virus, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y fragmentos de anticuerpo.
17. Una composición farmacéutica que comprende la construcción de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9 y un excipiente farmacéuticamente aceptado.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108623691B (zh) * 2017-03-17 2020-05-15 北京比洋生物技术有限公司 IgG样长效免疫融合蛋白及其应用
JP2021527706A (ja) * 2018-06-18 2021-10-14 アンウィタ バイオサイエンシス， インク． 抗メソテリンコンストラクト及びその使用
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
KR102485892B1 (ko) * 2020-04-09 2023-01-09 주식회사 에이프릴바이오 고양이 과립구 집락 자극인자 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도
KR20220044057A (ko) * 2020-09-29 2022-04-06 주식회사 에이프릴바이오 인터루킨-18 결합 단백질 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 이의 용도
TW202409093A (zh) * 2022-06-15 2024-03-01 比利時商Ｕｃｂ生物製藥公司 融合蛋白
KR20240048577A (ko) * 2022-10-04 2024-04-16 주식회사 에이프릴바이오 난포자극 호르몬 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
CN1678634A (zh) * 2002-06-28 2005-10-05 多曼蒂斯有限公司 免疫球蛋白单个变体抗原结合区及其特异性构建体
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
GB0315450D0 (en) * 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
CN101031588A (zh) * 2004-06-01 2007-09-05 多曼蒂斯有限公司 药物组合物，融合物和结合物
KR20120133403A (ko) * 2004-06-01 2012-12-10 도만티스 리미티드 증강된 혈청 반감기를 가지는 이특이성 융합 항체
KR20070041781A (ko) * 2004-08-11 2007-04-19 트루비온 파마슈티칼스, 인코포레이티드 결합 도메인 융합 단백질
US20060073152A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-06 Genentech, Inc. Therapeutic agents with decreased toxicity
MX2007006602A (es) * 2004-12-02 2007-12-10 Domantis Ltd Peptidos de dominio plad con vida media en suero aumentada debido a conjugacion con anticuerpos de dominio.
EP1860120B1 (en) * 2005-02-08 2018-01-24 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Method for improving antibody
AU2008261042A1 (en) * 2007-06-08 2008-12-11 Dow Global Technologies Inc. Expression of soluble antibody fragment by truncation of CH1 domain
ES2622460T3 (es) * 2007-09-26 2017-07-06 Ucb Biopharma Sprl Fusiones de anticuerpos con doble especificidad
EP2288715B1 (en) * 2008-04-11 2014-09-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
SI2334705T1 (sl) * 2008-09-26 2017-05-31 Ucb Biopharma Sprl Biološki produkti
CN102307897B (zh) * 2008-12-05 2016-01-20 葛兰素集团有限公司 选出蛋白酶抗性多肽的方法
EP2461831B1 (en) * 2009-08-06 2018-11-21 Novo Nordisk Health Care AG Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
GB201005063D0 (en) * 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
CN102666586A (zh) * 2009-09-30 2012-09-12 葛兰素集团有限公司 具有延长的半衰期的药物融合体和缀合物
CN107936121B (zh) * 2011-05-16 2022-01-14 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
DK2776466T3 (da) * 2011-11-11 2017-11-20 Ucb Biopharma Sprl Albuminbindende antistoffer og bindingsfragmenter deraf

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