KR20210063351A - 항-cd3 항체 폴레이트 생체접합체 및 이들의 용도 - Google Patents

항-cd3 항체 폴레이트 생체접합체 및 이들의 용도 Download PDF

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KR20210063351A
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잉 선
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암브룩스, 인코포레이티드
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Abstract

신규한 항-CD3 폴레이트 항체 및 이로부터 이익을 얻을 질환 또는 병태의 치료에서의 이의 용도가 본원에 기재된다.

Description

항-CD3 항체 폴레이트 생체접합체 및 이들의 용도
관련 출원에 대한 참조
본 출원은 2018년 8월 28일에 출원된 "항-CD3 Fab 폴레이트 항체 및 이들의 용도"라는 제목의 미국 가출원 제62/732,793호의 이익을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다. ASCII 사본은 2019년 8월 28일에 생성되었고, 파일명은 AMBX_0228_00PCT_Sequence_Listing.txt이며, 128,417 바이트의 크기이다.
본 발명의 분야
본 발명 개시내용은 면역종양학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 하나 이상의 폴레이트(folate) 분자에 접합된 항-CD3 항체 및 이의 단편 또는 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된 항-CD3 Fab-폴레이트 항체 및 이의 변이체에 관한 것이다.
난소암은 전 세계적으로 여성에게 가장 흔한 암 중 하나이다. 매년 약 25만 명의 여성이 난소암으로 진단될 것이고 매년 대략 14만 명의 여성이 이 질환에 굴복한다. 난소암의 5년 생존율은 암의 유형 및 병기에 따라 다르며, 추세는 더 진행된 난소암이 가장 좋지 않은 5년 생존율을 갖는다는 것이다. 현재 난소암 치료 옵션은 화학요법, 수술, 방사선 또는 이들 요법의 조합을 포함한다. 용적축소(debulking)에 이어 백금 기반 화학요법 후 진행된 난소암에 대한 반응률은 80%이며, 40-60%는 완전한 반응이다. 불행히도, 이들 환자 중 대략 70%는 재발할 것이며, 무진행 생존 기간 중앙값(median progression free survival)은 18개월이다.
현재, 난소암 및 상피, 간질 및 생식 세포 종양을 포함하고 나팔관 암 및 원발성 복막 암종을 포함하는 난소암 유형을 표적으로 하는 치료 분야가 부족하다. 난소암 환자를 치료하기 위해 수술, 방사선 및 다양한 화학치료제가 일반적으로 사용되지만, 최근에 식품의약국(FDA)은 1차 요법(first line therapy)으로서 진행된 난소암의 치료를 위한 베바시주맙(Avastin)에 대한 보조적 생물학적 제제 허가 신청(supplemental biologics license application, sBLA)을 받아들였다.
면역요법은 암 환자를 위한 새로운 치료 옵션으로서 평가되고 있으며, 이는 환자의 면역 체계를 자극하여 이들의 암을 공격하기 위해 생물학적 제제 또는 조작된 T-세포를 사용한다. 여러 면역치료제가 큰 가능성을 보였으며, 다양한 유형의 암을 치료하도록 승인되었다. 면역 체크포인트 억제제, 키메라 항원 수용체 T-세포(CAR-T), 이중특이적 T-세포 관여자(BiTE), 다양한 디자인의 T-세포 의존적 이중특이적 항체(TDB), NK-세포 의존적 이중특이적 항체, 대식세포-의존적 이중특이적 항체, 및 자가 항원 제시 세포(APC)/암 백신은 암 환자를 치료하는 데 사용되는 면역치료제의 일부이다.
난소암 환자를 위해 임상 평가되고 있는 일부 생물학적 제제는 폴레이트 수용체 알파에 대한 항체 약물 접합체(미르베툭시맙 소라브탄신(Mirvetuximab soravtansine)(IMGN853)), EpCAM-CD3 이중특이적 항체(카투막소맙(Catumaxomab)), DLL4-VEGF 이중특이제, NY-ESO-1을 표적화하는 백신 및 폴레이트 수용체 알파(FOLR1)를 표적화하는 CAR-T를 포함한다.
난소암은 면역억제 환경을 갖는 것으로 보고되었고, 이는 체크포인트 억제제와 같은 특정 유형의 면역치료제를 개발하는 것을 어렵게 만든다. 몇 가지 면역치료제가 임상 시험에서 평가되고 있지만, 현재 어떠한 면역치료제도 난소암 환자를 치료하기 위해 승인되지 않았다.
폴레이트 수용체는, 비제한적으로 상피 암, 예컨대 유방, 자궁경부, 결장직장, 신장, 비인두, 난소, 및 자궁내막을 포함하는 많은 암에서 발현된다. 인간에서의 폴레이트 수용체(FR) 패밀리는 FR알파, FR베타, 및 FR감마를 포함한다. 폴레이트 수용체-알파(FOLR1)는 난소암의 대략 80-90%에서 고도로 발현되는 GPI 고정 수용체이다. FOLR1은 비타민 B9로도 알려진 폴레이트와 폴레이트의 일차 대사산물 5-메틸-테트라하이드로폴레이트(5-MTHF)에 결합한다. FOLR1의 고발현은 점액성 난소암에서의 11%에 비해 우세한 히스토타입(histotype)인 고등급 장액성 난소암(high grade serous ovarian cancer)의 대략 76%에서 관찰된다. FOLR1은 정상 조직에서 발현이 낮고 제한적이므로 종양학 약물 개발 노력을 위한 선호되는 표적이다.
당업계의 결함을 극복하기 위해, 본 발명자들은 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산이 혼입되고 하나 이상의 폴레이트 분자를 추가로 포함하는 항-CD3 항체에서 항체 접합체를 개발하였다. 이중특이적 항체는 Fab의 중쇄 또는 경쇄 상에 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 갖도록 조작된 항-CD3 항체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 이중특이적 항체 또는 항체 단편은 중쇄 및/또는 경쇄 상에 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 갖도록 조작된 항-CD3 항체를 포함할 수 있다.
세포독성 T 세포를 암 세포로 모집하는 항-CD3 이중특이적 항체는 다양한 액체 및 고체 종양의 치료를 위한 유망한 새로운 접근법이다. 본 발명은 항-CD3 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 Fab의 중쇄 또는 경쇄 내에, 바람직하게는 중쇄 내에, 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 파라-아세틸-페닐알라닌(pAF)이다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 Fab의 중쇄 및/또는 경쇄(들) 내에 2개 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산, 예컨대 2개, 3개, 또는 4개의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하고, 선택적으로 2개 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산은 pAF이다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab는 폴레이트에 접합된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 접합된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab는 선택적으로 이작용성 링커를 사용하여 폴레이트 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모두에 접합된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab는 2개의 폴레이트 및 2개의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자에 접합된다. 일부 구현예에서, 접합은 pAF와 같은 비자연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 세포독성 T 세포를 폴레이트 수용체 양성(FR+) 종양 세포로 모집한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 개선된 효능, 감소된 독성, 개선된 약동학(PK) 특성, 개선된 친화성, 개선된 종양 관련 항원(TAA) 결합, 개선된 생체내 반감기(T1/2), 개선된 시험관내 활성, 개선된 혈청 반감기, 및/또는 개선된 생체내 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 개선된 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 감소된 독성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 개선된 PK 특성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 개선된 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 개선된 TAA 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 개선된 생체내 T1/2을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 개선된 시험관내 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 개선된 혈청 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 개선된 생체내 활성을 갖는다. 본 발명은 최적 효능, 감소된 독성 및 최적 약동학(PK) 특성을 위해 세포독성 T 세포를 폴레이트 수용체 양성(FR+) 종양 세포로 표적화하는 항-CD3 Fab-폴레이트 접합체의 최적화를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 최적 효능, 감소된 독성 및 최적 약동학(PK) 특성을 위해 세포독성 T 세포를 폴레이트 수용체 양성(FR+) 종양 세포로 표적화하는 최적화된 항-CD3 Fab-폴레이트 접합체를 제공한다. 효능과 사이토카인 방출 증후군(CRS)으로 인한 독성 사이의 최적 균형을 맞추기 위해, 본 발명자들은 항-CD3 항체의 친화성을 미세 조정하였을 뿐만 아니라 종양 관련 항원(TAA) 결합을 최적화하였다. 생체내 반감기(T1/2)를 증가시키기 위해, 폴레이트 및 다양한 크기의 PEG 분자 모두가 이작용성 링커의 사용에 의해 동시에 접합되었다. 최적화된 접합체는 이종이식 마우스 모델에서 강력하고 선택적인 시험관내 활성, 양호한 혈청 반감기, 및 강력한 생체내 활성을 나타내었다. 이 반합성 접근법은 다른 TAA에 선택적인 소분자 리간드를 사용하여 추가적인 항-CD3 이중특이적 제제를 생성하는 데 이용될 수 있을 것 같다.
본 발명은 항-CD3 항체 및 폴레이트에 대한 이의 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 항-CD3 항체 및 PEG에 대한 이의 접합체를 제공한다. 본 발명은 또한 항-CD3 항체 및 폴레이트 및 PEG에 대한 이의 접합체를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 신규한 항-CD3 항체는 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 완전한 항체 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 완전한 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 완전한 항체 중쇄 및 완전한 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 항체 경쇄의 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 항체 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 항체 경쇄의 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 항-CD3 항체 중쇄의 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 경쇄의 적어도 하나의 CDR 및 중쇄의 적어도 하나의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 경쇄의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 중쇄의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 경쇄의 3개의 CDR 및 중쇄의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개의 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개 이상의 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개의 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개 이상의 scFv를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 미니바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개의 미니바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개 이상의 미니바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 디아바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개의 디아바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개 이상의 디아바디를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 BiTE를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개의 BiTE를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개 이상의 BiTE를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 DART를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개의 DART를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개 이상의 DART를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 TandAb를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개의 TandAb를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개 이상의 TandAb를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 완전한 경쇄 및 완전한 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 하나 이상의 Fc 도메인 또는 이의 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 상기 구현예 중 어느 것의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 임의의 상기 구현예의 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체 또는 이종다량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 결합 파트너에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하고, 결합 파트너는 항원, 폴리펩타이드, 핵산 분자, 중합체, 또는 다른 분자 또는 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 비-항체 스캐폴드 분자 또는 물질과 결합된다.
일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 연결된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 이작용성 중합체, 이작용성 링커, 또는 적어도 하나의 추가의 항-CD3 항체에 연결된다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 항-CD3 항체가 아닌 폴리펩타이드에 연결된다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항원-결합 폴리펩타이드는 비자연적으로 코딩된 아미노산을 또한 포함할 수 있는 하나 이상의 추가의 항원-결합 폴리펩타이드에 연결된다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항원-결합 폴리펩타이드는 또한 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함할 수 있는 하나 이상의 추가의 항원-결합 폴리펩타이드에 연결된다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체는 또한 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함할 수 있는 하나 이상의 추가의 항원-결합 폴리펩타이드에 연결된다.
일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 소분자 리간드에 연결된다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 2개의 소분자 리간드에 연결된다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 2개 이상의 소분자 리간드에 연결된다. 일부 구현예에서, 소분자 리간드는 폴레이트 또는 DUPA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 소분자 리간드는 2개의 폴레이트 또는 2개의 DUPA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 소분자 리간드는 2개 이상의 폴레이트 또는 2개 이상의 DUPA 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결된다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 이작용성 중합체이다. 일부 구현예에서, 이작용성 중합체는 제2 폴리펩타이드에 연결된다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 항원-결합 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩타이드는 항-CD3 항체이다. 일부 구현예에서, 소분자 리간드는 수용성 중합체에 연결된다. 일부 구현예에서, 2개의 소분자 리간드는 2개의 수용성 중합체에 연결된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 소분자 리간드는 2개 이상의 수용성 중합체에 연결된다. 일부 구현예에서, 폴레이트는 PEG 분자에 연결된다. 일부 구현예에서, 2개의 폴레이트 분자는 2개의 수용성 중합체에 연결된다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 폴레이트 분자는 2개 이상의 PEG 분자에 연결된다.
일부 구현예에서, 항-CD3 항체에서의 아미노산 치환은 자연발생 또는 비자연적 발생 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 단 적어도 하나의 치환은 비자연적으로 코딩된 아미노산으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 카르보닐기, 아세틸기, 아미노옥시기, 하이드라진기, 하이드라지드기, 세미카르바지드기, 아지드기, 또는 알킨기를 포함한다.
일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 0.1 kDa 내지 50 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜)은 1 kDa 내지 25 kDa, 또는 2 내지 22 kDa, 또는 5 kDa 내지 20 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 예를 들어, 평균 분자량은 약 5 kDa, 또는 약 10 kDa, 또는 약 20 kDa일 수 있다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 중합체의 평균 분자량은 5 kDa 또는 10 kDa 또는 20 kDa일 수 있다. 특정 구현예에서, 분자량은 적절한 방법, 예컨대 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 질량 분석법, 및 모세관 전기영동에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 분지형 중합체이다. 일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각각의 분지는 1 kDa 내지 100 kDa, 또는 1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각각의 분지는 1 kDa 내지 25 kDa, 또는 2 내지 22 kDa, 또는 5 kDa 내지 20 kDa의 분자량을 갖는다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각각의 분지의 분자량은 약 5 kDa, 또는 약 10 kDa, 또는 약 20 kDa일 수 있다. 예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체의 각각의 분지의 분자량은 5 kDa 또는 10 kDa 또는 20 kDa일 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산에 부착된 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자를 포함하는 항-CD3 항체 폴리펩타이드로서, 상기 비자연적으로 코딩된 아미노산은 미리 선택된 부위에서 폴리펩타이드 내로 리보솜적으로 혼입된 것인 항-CD3 항체 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 구현예는 서열번호: 1-62 중 적어도 하나를 포함하는 항-CD3 항체를 제공한다. 서열번호: 1-62 중 2개를 포함하는 항-CD3 항체. 본 발명의 구현예의 구현예는 서열번호: 1-62 중 2개를 포함하는 항-CD3 항체를 제공한다. 서열번호: 1-6 중 어느 하나 및 서열번호: 7-9 중 어느 하나를 포함하는 항-CD3 항체. 본 발명의 구현예는 서열번호: 1-5 중 2개를 포함하는 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 i) 제1 결합 도메인 및 ii) 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자로서, 제2 결합 도메인은 서열번호: 1-62로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 이중특이적 결합 분자를 제공한다. 다른 구현예에서 본 발명은 i) 제1 결합 도메인 및 ii) 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자로서, 제2 결합 도메인은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나, 및 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나를 포함하는 항-CD3을 포함하는 것인 이중특이적 결합 분자를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 i) 제1 결합 도메인 및 ii) 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자로서, 제2 결합 도메인은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함하는 것인 이중특이적 결합 분자를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 i) 제1 결합 도메인 및 ii) 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자로서, 제2 결합 도메인은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나; 및 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함하는 것인 이중특이적 결합 분자를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 1-62 중 하나 이상에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 1-62 중 2개에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나를 포함하는 항-CD3을 포함하는 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체를 제공한다. 다른 구현예에서 본 발명은 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함하는 세포독성 활성 CD3 Fab 특이적 결합 구조체를 제공한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나; 및 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나를 포함하는 항-CD3을 포함하는 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 항-CD3 항체는 (a) 서열번호: 1-6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 7-9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 결합 도메인을 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 항체로서, 항체는 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는 것인 항-CD3 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 항체는 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 연결되는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 항체로서, 생물학적 활성 분자는 폴레이트인 것인 항-CD3 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 하나 이상의 폴레이트를 포함하는 항-CD3 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 2개의 폴레이트를 포함하는 항-CD3 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 항체로서, 생물학적 활성 분자는 DUPA인 것인 항-CD3 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 하나 이상의 DUPA를 포함하는 항-CD3 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 2개의 DUPA를 포함하는 항-CD3 항체를 제공한다.
특정 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나의 중쇄 아미노산 서열; 및 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나를 포함하는 항-CD3을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나를 포함하는 항-CD3을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나; 및 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 서열번호: 1-5의 중쇄 및 서열번호: 7-9의 경쇄를 포함하는 항-CD3 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 7 및 10, 또는 7 및 14, 또는 7 및 11, 또는 7 및 15, 또는 7 및 12, 또는 7 및 16, 또는 7 및 13, 또는 7 및 17, 또는 7 및 1, 또는 7 및 18, 또는 7 및 19, 또는 12 및 18, 또는 12 및 19, 또는 12 및 16을 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 7 및 10, 또는 7 및 14, 또는 7 및 11, 또는 7 및 15, 또는 7 및 12, 또는 7 및 16, 또는 7 및 13, 또는 7 및 17, 또는 7 및 1, 또는 7 및 18, 또는 7 및 19, 또는 12 및 18, 또는 12 및 19, 또는 12 및 16을 포함하는 항-CD3 Fab를 포함하고, 각각은 적어도 하나의 비자연 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 7 및 10, 또는 7 및 14, 또는 7 및 11, 또는 7 및 15, 또는 7 및 12, 또는 7 및 16, 또는 7 및 13, 또는 7 및 17, 또는 7 및 1, 또는 7 및 18 또는 7 및 19, 또는 12 및 18, 또는 12 및 19, 또는 12 및 16을 포함하는 항-CD3 Fab를 포함하고, 각각은 2개의 비자연 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 적어도 하나의 비자연 아미노산을 포함하는 서열번호: 7; 및 적어도 하나의 비자연 아미노산을 포함하는 서열번호: 10, 또는 14, 또는 11, 또는 15, 또는 12, 또는 16, 또는 13, 또는 17, 또는 1, 또는 18 또는 19 중 하나를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 적어도 하나의 비자연 아미노산을 포함하는 서열번호: 12; 및 적어도 하나의 비자연 아미노산을 포함하는 서열번호: 18, 또는 19, 또는 16 중 하나를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 58 및 49, 또는 58 및 40, 또는 59 및 50, 또는 59 및 41, 또는 59 및 42, 또는 59 및 52, 또는 59 및 43, 또는 59 및 44, 또는 59 및 45, 또는 59 및 54 또는 59 및 55, 또는 59 및 46, 또는 9 및 44, 또는 9 및 53, 또는 60 및 44, 또는 60 및 53, 또는 60 및 42, 또는 60 및 51, 60 및 50, 또는 60 및 41, 또는 61 및 45, 또는 61 및 54, 또는 62 및 56, 또는 62 및 47, 또는 62 및 48, 또는 62 및 57, 또는 7 및 47, 또는 7 및 56을 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 2개의 비자연 아미노산을 포함하는 항-CD3 Fab를 포함하고, 항체는 서열번호: 18 및 16, 또는 18 및 59, 또는 18 및 43을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 1 및 7, 또는 1 및 8, 또는 1 및 9를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 2 및 7, 또는 2 및 8, 또는 2 및 9를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 3 및 7, 또는 3 및 8, 또는 3 및 9를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 4 및 7, 또는 4 및 8, 또는 4 및 9를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 5 및 7, 또는 5 및 8, 또는 5 및 9를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 6 및 7, 또는 6 및 8, 또는 6 및 9를 포함하는 항-CD3 Fab를 포함한다. 항-CD3 항체는 i) 제1 결합 도메인 및 ii) 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체로서, 제2 결합 도메인은 상기 항-CD3 Fab를 포함하는 것인 이중특이적 항체일 수 있다. 본 발명의 다른 구현예는 비자연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 서열번호: 1 내지 62로부터 선택된 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 항체 내로 부위 특이적으로 혼입된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, p-프로파르길옥시-L-페닐알라닌, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-아이오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 또는 이소프로필-L-페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 부위 특이적으로 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 위치 H114, H115, H129, L157, H160, L172, 및 L205(당업자에게 널리 공지된 카바트 넘버링에 따름) 중 어느 하나에 부위 특이적으로 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 카바트 넘버링에 따라 위치 H114, H115, H129, L157, H160, L172, 및 L205에 부위 특이적으로 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산이 위치 114에 부위 특이적으로 혼입된 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산이 위치 115에 부위 특이적으로 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산이 위치 129에 부위 특이적으로 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산이 위치 157에 부위 특이적으로 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산이 위치 160에 부위 특이적으로 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산이 위치 172에 부위 특이적으로 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 비자연적으로 코딩된 아미노산이 위치 205에 부위 특이적으로 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 적어도 하나의 비자연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 2개의 비자연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 다른 구현예는 중쇄 또는 경쇄에 적어도 하나의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 Fab 변이체를 제공한다. 본 발명의 다른 구현예는 경쇄에 하나의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 다른 구현예는 중쇄에 하나의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 2개의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 Fab 변이체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 변이체로서, 중쇄는 C-말단에 아미노산 연장을 추가로 포함하는 것인 항-CD3 Fab 변이체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 변이체로서, 아미노산 연장은 아미노산 DKTHT를 포함하는 것인 항-CD3 Fab 변이체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 중쇄 내의 C-말단에 아미노산 연장을 추가로 포함하는 항-CD3 Fab 변이체를 제공한다. 다른 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 변이체로서, 아미노산 연장은 아미노산 DKTHT를 포함하는 것인 항-CD3 Fab 변이체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 중쇄 서열은 항원 결합을 위해 하나 이상의 위치에 마우스 프레임워크 잔기를 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 다른 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 중쇄 서열은 위치 30, 49, 77 또는 93(카바트 넘버링에 따름)에 마우스 프레임워크 잔기를 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 경쇄 서열은 하나 이상의 위치에 마우스 프레임워크 잔기를 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 다른 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 경쇄 서열은 위치 36, 46, 49, 57 또는 58(카바트 넘버링에 따름)에 프레임워크 잔기를 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 항-CD3 Fab 항체는 링커를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 항-CD3 Fab 항체로서, 링커는 수용성 중합체인 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 다른 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 수용성 중합체는 선형 또는 분지형인 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 수용성 중합체는 항체에 존재하는 비자연적으로 코딩된 아미노산에 연결되는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 링커는 비자연 아미노산의 측쇄를 통해 항-CD3 Fab 항체에 부착된다. 본 발명의 구현예는 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 수용성 중합체에 연결된 적어도 2개의 아미노산을 포함하는 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 상기 수용성 중합체에 연결된 적어도 하나의 아미노산은 비자연적으로 코딩된 아미노산인 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 폴리(에틸렌 글리콜)은 1 kDa 내지 100 kDa인 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 하나 이상의 폴레이트 및 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 2개의 폴레이트 및 2개의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 항-CD3 Fab 항체를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 항-CD3 Fab 항체를 포함하는 높은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에서 세포 사멸을 최적화하는 방법으로서, 항체는 하나 이상의 폴레이트를 포함하고; 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산은 항체 내로 혼입되는 것인 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 항-CD3 Fab 항체를 포함하는 경로변경된(redirected) T 세포에 의해 높은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 종양 세포 사멸을 최적화하는 방법으로서, 항체는 하나 이상의 폴레이트를 포함하고; 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산은 항체 내로 혼입되는 것인 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 방법은 하나 이상의 수용성 중합체를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 수용성 중합체가 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 것인 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 수용성 중합체가 선형 또는 분지형인 것인 방법이 제공된다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 1 kDa 내지 100 kDa이다. 폴리(에틸렌 글리콜)은 5, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60 kDa이다. 또 다른 구현예에서, 폴레이트 수용체 수는 10,000개 초과이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 세포에서 세포독성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 T 세포 모집을 위해 그의 표적에 대한 항-CD3 항체의 친화성을 최적화하거나 감소시킴으로써 세포에서 세포독성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 T-세포 결합 전에 종양 세포에 우선적으로 결합하도록 하나를 초과하는 폴레이트를 접합시킴으로써 종양 세포의 세포독성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항 CD3 Fab 항체의 혈청 반감기를 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 Fab를 비제한적으로 HSA, C12-C16 아실 사슬, XTEN, 또는 수용성 중합체, 예컨대 PEG를 포함하는 약동학(PK) 연장 분자에 접합시킴으로써 항 CD3 Fab 항체의 혈청 반감기를 개선하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예는 세포독성 T 세포를 FR+ 종양 세포로 모집하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예는 효능을 개선하고, 독성을 감소시키고, PK 특성을 개선하고, 친화성을 개선하고, TAA 결합을 개선하고, 생체내 T1/2을 개선하고, 시험관내 활성을 개선하고, 혈청 반감기을 개선하고/거나, 생체내 활성을 개선하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예는 효능을 개선하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예는 독성을 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예는 PK 특성을 개선하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예는 친화성을 개선하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예는 TAA 결합을 개선하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예는 생체내 T1/2을 개선하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예는 시험관내 활성을 개선하는 방법을 제공한다. 또 다른 구현예는 생체내 활성을 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 중쇄 또는 경쇄 서열은 하나 이상의 위치에서 인간 생식계열 돌연변이를 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 중쇄 서열 인간 생식계열 돌연변이는 위치 35 또는 52(카바트 넘버링에 따름)에 있는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 항-CD3 Fab 항체로서, 경쇄 서열 인간 생식계열 돌연변이는 위치 53(카바트 넘버링에 따름)에 있는 것인 항-CD3 Fab 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 화합물 29A, 29B, 29C, 29D, 29E, 30A, 30B, 30C, 30D 및 30E에 따른 구조를 갖는 PEG 폴레이트 링커를 포함하는 항-CD3 Fab 항체를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD3 Fab 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 높은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에서 질환 또는 병태를 갖는 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 2개의 폴레이트 및 2개의 페길화된 분자를 포함하는 이중특이적 항-CD3 Fab가 제공된다. 또 다른 구현예에서 이중특이적 항-CD3 Fab 항체는 부위 특이적으로 혼입된 비자연적으로 코딩된 아미노산을 추가로 포함한다. 본 발명은 본 발명의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 암은 난소암이다. 일부 구현예에서, 난소암은 상피, 간질 및 생식 세포 종양이다. 일부 구현예에서, 난소암은 나팔관 암 및 원발성 복막 암종을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 폴레이트 수용체-알파(FOLR1)의 높은 발현을 특징으로 하며, 예컨대 난소암이다. 일부 구현예에서, 암은 세포독성 T 세포를 폴레이트 수용체 양성(FR+) 종양 세포로 모집함으로써 치료된다. 본 발명은 본 발명의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여함으로써 유전병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여함으로써 AIDs를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여함으로써 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 항-CD3 항체는 항-CD3 Fab 항체를 포함하는 이중특이적 항체일 수 있고, 선택적으로 항-CD3 Fab 항체는 2개의 폴레이트 및 2개의 페길화된 분자에 접합된다. 추가 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 상기 항-CD3 Fab 항체 내로 부위 특이적으로 혼입되고, 2개의 폴레이트 및 2개의 페길화된 분자에의 접합은 비자연 아미노산의 측쇄를 통해 이루어진다.
본 발명의 항-CD3 항체는 높은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에서 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 항-CD3 항체는 암을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 암은 난소암이다. 일부 구현예에서, 난소암은 상피, 간질 및 생식 세포 종양이다. 일부 구현예에서, 난소암은 나팔관 암 및 원발성 복막 암종을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 폴레이트 수용체-알파(FOLR1)의 높은 발현을 특징으로 하며, 예컨대 난소암이다. 일부 구현예에서, 암은 세포독성 T 세포를 폴레이트 수용체 양성(FR+) 종양 세포로 모집함으로써 치료된다. 본 발명의 항-CD3 항체는 유전병을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 항-CD3 항체는 AIDS를 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 항-CD3 항체는 당뇨병을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 상기 항-CD3 항체는 항-CD3 Fab 항체를 포함하는 이중특이적 항체일 수 있고, 선택적으로 항-CD3 Fab 항체는 2개의 폴레이트 및 2개의 페길화된 분자에 접합된다. 추가 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 상기 항-CD3 Fab 항체 내로 부위 특이적으로 혼입되고, 2개의 폴레이트 및 2개의 페길화된 분자에의 접합은 비자연 아미노산의 측쇄를 통해 이루어진다. 본 발명의 항-CD3 항체는 높은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에서 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 항-CD3 항체는 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 암은 난소암이다. 일부 구현예에서, 난소암은 상피, 간질 및 생식 세포 종양이다. 일부 구현예에서, 난소암은 나팔관 암 및 원발성 복막 암종을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 폴레이트 수용체-알파(FOLR1)의 높은 발현을 특징으로 하며, 예컨대 난소암이다. 일부 구현예에서, 암은 세포독성 T 세포를 폴레이트 수용체 양성(FR+) 종양 세포로 모집함으로써 치료된다. 본 발명의 항-CD3 항체는 유전병을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 항-CD3 항체는 AIDS를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 항-CD3 항체는 당뇨병을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 항-CD3 항체는 항-CD3 Fab 항체를 포함하는 이중특이적 항체일 수 있고, 선택적으로 항-CD3 Fab 항체는 2개의 폴레이트 및 2개의 페길화된 분자에 접합된다. 추가 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 상기 항-CD3 Fab 항체 내로 부위 특이적으로 혼입되고, 2개의 폴레이트 및 2개의 페길화된 분자에의 접합은 비자연 아미노산의 측쇄를 통해 이루어진다.
본 발명 개시내용은 항체 또는 단편 또는 변이체 내로 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 항-CD3 항체 또는 항체 단편 또는 변이체를 제공한다. 항-CD3 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 비제한적으로 Fv, Fc, Fab, 및(Fab')2, 단일 사슬 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이작용성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합, 가변 영역, 프레임워크 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄, 대체 스캐폴드 비-항체 분자, 이중특이적 항체 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 항-CD3 Fab 항체, 단편 또는 변이체이다.
본 발명 개시내용은 항-CD3 항체 또는 항체 단편을 포함하는 이중특이적 항체 접합체를 제공한다. 본 발명은 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 항-CD3 Fab 항체 또는 항체 단편을 포함하는 이중특이적 항체 접합체를 본원에 개시한다. 또한, 항-CD3 Fab 항체 또는 항체 단편 및 하나 이상의 폴레이트 분자를 포함하는 이중특이적 항체 접합체로서, 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산은 항-CD3 Fab 항체 내로 부위 특이적으로 혼입된 것인 이중특이적 항체 접합체가 본원에 개시된다. 항-CD3 Fab 항체 또는 항체 단편, 하나 이상의 폴레이트 분자, 및 하나 이상의 PEG 분자를 포함하는 이중특이적 항체 접합체로서, 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산은 항-CD3 Fab 항체 내로 부위 특이적으로 혼입된 것인 이중특이적 항체 접합체가 본원에 개시된다. 항체 또는 항체 단편; 하나 이상의 소분자; 및 하나 이상의 링커를 포함하는 항-CD3 Fab 이중특이적 항체로서, 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 링커에 의해 하나 이상의 소분자에 연결되고, 소분자는 하나 이상의 폴레이트 또는 하나 이상의 DUPA 분자 또는 유사체 또는 유도체인 것인 항-CD3 Fab 이중특이적 항체가 본원에 개시된다. 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 링커에 의해 하나 이상의 폴레이트 또는 하나 이상의 DUPA 분자에 부위 특이적으로 연결될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 비자연 아미노산을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 비자연 아미노산에 대한 하나 이상의 링커에 의해 하나 이상의 폴레이트 또는 하나 이상의 DUPA 분자에 연결될 수 있다. 비자연 아미노산은 항체 내로 부위 특이적으로 혼입될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 비자연 아미노산에 대한 하나 이상의 PEG 분자에 의해 하나 이상의 폴레이트 또는 DUPA 분자에 연결될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 대안적으로 자연 아미노산에 대한 하나 이상의 링커에 의해 하나 이상의 폴레이트 또는 하나 이상의 DUPA 분자에 연결될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 항-CD3 Fab일 수 있다.
항-CD3 Fab; 하나 이상의 폴레이트 분자; 및 하나 이상의 링커를 포함하는 이중특이적 항체 접합체로서, 항-CD3 Fab는 하나 이상의 링커에 의해 하나 이상의 폴레이트 분자에 연결된 것인 이중특이적 항체 접합체가 본원에 개시된다. 항-CD3 Fab는 하나 이상의 비자연 아미노산을 포함할 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 항-CD3 Fab의 자연 아미노산을 대체할 수 있다. 항-CD3 Fab; 하나 이상의 DUPA 분자; 및 하나 이상의 링커를 포함하는 이중특이적 항체 접합체로서, 항-CD3 Fab는 하나 이상의 링커에 의해 하나 이상의 DUPA 분자에 연결된 것인 이중특이적 항체 접합체가 본원에 개시된다. 항-CD3 Fab는 하나 이상의 비자연 아미노산을 포함할 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 항-CD3 Fab의 자연 아미노산을 대체할 수 있다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시된다. 본 발명 개시내용의 특징 및 이점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구현예를 제시하는 다음의 상세한 설명, 및 제공된 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 인간 PBMC에 대한 인간화된 항-CD3 Fab 결합을 도시한다. 인간 PBMC에 대한 HEK293 세포에서 발현된 인간화된 항-CD3 Fab의 결합(2개의 실험)이 나타나 있다. 3개의 vH 및 3개의 vL 사슬 서열을 조합하여 총 9개의 Fab를 시험하였다. vL1.0 사슬을 함유하는 3개의 Fab는 임의의 vH 사슬 조합을 갖는 인간 CD3에 대한 결합을 상실하였다.
도 2a-2f는 인간 및 시아노 PBMC에 대한 인간화된 항-CD3 Fab 결합의 적정(titration)을 도시한다. (도 2a), Fab1 적정; (도 2b), Fab 2 적정; (도 2c), Fab 3 적정; (도 2d), Fab 4 적정; (도 2e), Fab 5 적정; 및 (도 2f), Fab 6 적정을 도시한다.
도 3은 항-CD3 Fab1 분자의 랫트 약동학(PK) 분석을 도시한다. 인간화된 항-CD3 Fab1 분자의 페길화는 랫트에서 혈장 반감기(T1/2)를 연장한다.
도 4a-4b는 HEK293 세포로부터의 라운드 1 저친화성 Fab의 결합을 도시한다. 인간(도 4a) 및 시아노(도 4b) CD3에 대해 감소된 결합 친화성을 갖는 HEK293 세포로부터 생산된 라운드 1 항-CD3 Fab 변이체가 나타나 있다. 라운드 1 스크리닝에서 시험된 35개의 새로운 Fab 변이체 중에서, 4개의 선택된(Fab 7 내지 10) 감소된 친화성 Fab에 대한 적정 곡선이 대조군 Fab1과 함께 나타나 있다.
도 5a-5b는 인간 CD3에 대한 HEK293 세포로부터의 라운드 2 저친화성 Fab의 결합을 도시한다. 인간(도 5a) 및 시아노(도 5b) CD3에 대한 감소된 결합 친화성을 갖는 HEK293 세포로부터 생산된 라운드 2 항-CD3 Fab 변이체가 나타나 있다. 라운드 2 스크리닝에서 시험된 43개의 새로운 Fab 변이체 중에서, 4개의 선택된 감소된 친화성 Fab에 대한 적정 곡선이 모 대조군 Fab1과 함께 나타나 있다.
도 6a-6b는 인간 CD3에 대한 E. 콜리 세포로부터의 저친화성 Fab-폴레이트 변이체의 결합을 도시한다. 도 6a는 라운드 1의 결합을 나타내고, 도 6b는 인간 CD3에 대한 E. 콜리 세포로부터 정제된 항-CD3 Fab-HK129-폴레이트 분자의 라운드 2 저친화성 변이체의 결합을 나타낸다. 모 대조군인 Fab1-HK129-폴레이트가 양성 대조군으로서 포함된다.
도 7a-7b는 시아노 CD3에 대한 항-CD3 Fab-폴레이트 결합의 저친화성 변이체를 도시한다. 도 7a는 라운드 1의 결합을 나타내고, 도 7b는 시아노 CD3에 대한 E. 콜리 세포로부터 정제된 항-CD3 Fab-HK129-폴레이트 분자의 라운드 2 저친화성 변이체의 결합을 나타낸다. 모 대조군인 Fab1-HK129-폴레이트가 양성 대조군으로서 포함된다.
도 8은 인간 PBMC를 이용한 SKOV-3 세포에 대한 세포독성을 도시한다. 인간 PBMC를 이용한 E. 콜리 세포로부터 생산된 인간화된 항-CD3 Fab-HK129-폴레이트 분자의 4개의 저친화성 변이체의 시험관내 세포독성. 모 대조군인 Fab1-HK129-폴레이트가 양성 대조군으로서 포함된다.
도 9는 시아노 PBMC를 이용한 SKOV-3 세포에 대한 세포독성을 도시한다. 시아노 PBMC를 이용한 E. 콜리 세포로부터 생산된 인간화된 항-CD3 Fab-HK129-폴레이트 분자의 4개의 저친화성 변이체의 시험관내 세포독성. 모 대조군인 Fab1-HK129-폴레이트가 양성 대조군으로서 포함된다.
도 10a-10b는 T-세포 활성화를 도시한다. 도 10a는 다양한 저친화성 항-CD3 Fab-HK129-폴레이트 분자에 의한 SKOV-3 세포가 없는 T 세포 마커 CD25 및 CD69의 활성화를 나타낸다. 도 10(b)는 다양한 저친화성 항-CD3 Fab-HK129-폴레이트 분자에 의한 SKOV-3 세포를 갖는 T 세포 마커 CD25 및 CD69의 활성화를 나타낸다.
도 11a-11d는 SKOV-3 종양 세포의 부재(도 11a 및 11c) 또는 존재(도 11b 및 11d) 하에 다양한 저친화성 항-CD3 Fab-HK129-폴레이트 변이체의 IFN감마(도 11a 및 11b), 및 TNFα(도 11c 및 11d)를 이용한 시험관내 사이토카인 방출을 도시한다.
도 12a-12f는 본 발명의 항-CD3 Fab-폴레이트 이중특이적 접합체 및 PEG 링커의 예시를 도시한다. 도 12a는 폴레이트-PEG 리간드의 대표적인 예이고; 도 12b는 폴레이트-분지형 PEG 리간드의 대표적인 예이며; 도 12c-12d는 PEG 접합체를 갖는 CD3-폴레이트 이중특이제의 대표적인 예시이고; 도 12e는 C-말단 페길화를 갖는 CD3-폴레이트 이중특이제의 대표적인 예시이며; 도 12f는 CD3-Fab 가교에 의한 C-말단 페길화를 갖는 CD3-폴레이트 이중특이제의 대표적인 예시이다.
도 13a-13d는 페길화의 존재 및 부재 하에 CD3 Fab-폴레이트 접합체를 도시한다. 13a 및 13b는 단일 및 이중 접합된 항-CD3 Fab 조성물의 SDS-PAGE 겔 전기영동 분석을 나타내고; 도 13c는 항-CD3 Fab-폴레이트 C-말단 PEG 접합체의 SDS-PAGE 겔 전기영동 분석을 나타내며; 도 13d는 KB, OV-90 및 SKOV-3 세포에서 항-CD3 Fab-폴레이트 C-말단 PEG 접합체의 시험관내 세포독성을 나타낸다.
도 14는 시험관내 세포독성을 도시하고, 항-CD3 Fab-폴레이트 이중특이적 항체가 FOLRα 발현 KB 세포를 선택적으로 사멸시킨다는 것을 나타낸다.
도 15a-15b는 시험관내 세포독성을 도시한다. 도 15a는 항-CD3 Fab-폴레이트 이중특이적 항체가 20 nM 폴산의 존재 하에 FOLRα 발현 SKOV3 세포를 선택적으로 사멸시킨다는 것을 나타내고, 도 15b는 50 nM 폴레이트에서의 선택적 사멸을 나타낸다.
도 16a-16b는 시험관내 세포독성 데이터를 도시하고, 항-CD3 Fab-폴레이트 이중특이적 항체가 20 nM(도 16a) 또는 50 nM(도 16b) 5-mTHF의 존재 하에 FOLRα 발현 SKOV3 세포를 선택적으로 사멸시킨다는 것을 나타낸다.
도 17은 CD1 마우스에서의 마우스 약동학 연구를 도시한다.
도 18a-18b는 항-CD3 Fab-폴레이트 이중특이적 항체가 인간 M2 대식세포를 선택적으로 사멸시킨다는 것을 도시한다. 도 18a는 단일 폴레이트 함유 항-CD3 Fab-폴레이트 이중특이적 항체에 의한 시험관내 대식세포 세포독성을 나타낸다. 화살표 및 숫자는 M1 및 M2 대식세포 사이의 IC50 배수 차이를 나타낸다. 점선은 M1 및 M2에서의 Fab1-HK129-폴레이트를 나타내고, 실선은 M1 및 M2에서의 Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트를 나타낸다. 도 18b는 이중 폴레이트 함유 항-CD3 Fab-폴레이트 이중특이적 항체에 의한 시험관내 대식세포 세포독성을 나타낸다. 화살표 및 숫자는 M1 및 M2 대식세포 사이의 IC50 배수 차이를 나타낸다. 점선은 M1 및 M2에서의 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트를 나타내고, 실선은 M1 및 M2에서 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG를 나타낸다.
도 19a-19b는 항-CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 항종양 효능을 도시하고, 도 19a는 종양 부피를 나타내며, 도 19b는 질량/체중을 나타내고; 인간 CD45의 발현 및 TIL의 유도는 각각 도 19c 및 19d에 나타나 있다.
도 20a-20b는 항-CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 항종양 효능을 도시하고, 도 20a는 종양 부피를 나타내며, 도 20b는 질량/체중을 나타내고; 인간 CD45의 발현 및 TIL의 유도는 각각 도 20c 및 20d에 나타나 있다.
도 21a-21f는 KB 세포주로부터 유래된 인간 자궁경부 종양에서 CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 다중 용량 투여에 의한 항종양 효능(도 21a는 종양 성장을 나타내고, 도 21b는 체중을 나타냄), 및 T-세포 활성화 마커 CD25(도 21c), CD69(도 21d), CD45(도 21e), 및 CD3(도 21f)의 발현을 도시한다.
도 22a-22b는 KB 세포주로부터 유래된 인간 자궁경부 종양에서 CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 항종양 효능을 도시하고; 도 22a는 종양 성장을 나타내며, 도 22b는 체중을 나타낸다.
도 23a-23b는 OV-90 세포주로부터 유래된 인간 난소 종양에서 카르보플라틴과 비교하여 CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 항종양 효능을 도시하고; 도 23a는 종양 성장을 나타내며, 도 23b는 체중을 나타낸다.
정의
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 구조체, 및 시약에 제한되지 않으며, 이와 같이 다양할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 특정 구현예를 단지 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니고 이는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a," "an," 및 "the"는 문맥이 달리 명확히 나타내지 않는 한 복수 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "항-CD3 Fab" 또는 "항-CD3 Fab-폴레이트 항체"에 대한 언급은 하나 이상의 이러한 단백질에 대한 언급이며, 당업자에게 공지된 등가물 등을 포함한다. 용어 "PEG-폴레이트" 또는 "폴레이트-PEG" 및 용어 "BiPEG-바이폴레이트" 또는 "바이폴레이트-BiPEG"는 본원에 상호교환적으로 사용된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치, 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 물질이 이하 설명된다.
본원에 언급된 모든 간행물 및 특허는, 예를 들어, 현재 기재된 발명과 관련하여 사용될 수 있는, 간행물에 기재된 구성 및 방법론을 설명하고 개시할 목적으로 본원에 참고로 포함된다. 본원에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 전에 이들의 공개를 위해서만 제공된다. 본원의 어떤 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용에 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
용어 "실질적으로 정제된"은 그의 자연발생 환경에서 발견되는 단백질을 정상적으로 수반하거나 이와 상호작용하는 성분, 즉 재조합으로 생산된 항-CD3 항체의 경우 천연 세포, 또는 숙주 세포가 실질적으로 또는 본질적으로 없을 수 있는 항-CD3 Fab 항체를 지칭한다. 세포 물질이 실질적으로 없을 수 있는 항-CD3 항체는 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 l% 미만의 오염 단백질을 갖는 단백질의 제제를 포함한다. 항-CD3 항체 또는 이의 변이체는 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되고, 단백질은 세포의 건조 중량의 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 이하로 존재할 수 있다. 항-CD3 항체 또는 이의 변이체는 숙주 세포에 의해 재조합으로 생산되고, 단백질은 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10mg/L, 또는 약 1 mg/L 이하의 세포의 건조 중량으로 주변세포질 및/또는 배양 배지에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 생산된 "실질적으로 정제된" 항-CD3 항체는 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 및 모세관 전기영동와 같은 적절한 방법에 의해 결정된 바와 같이 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%의 순도 수준, 구체적으로, 적어도 약 75%, 80%, 85%의 순도 수준, 및 보다 구체적으로, 적어도 약 90%의 순도 수준, 적어도 약 95%의 순도 수준, 적어도 약 99% 이상의 순도 수준을 가질 수 있다.
"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는, 삽입을 위해 사용되는 방법, 예를 들어, 직접 흡수, 형질전환, 형질도입, f-교배(f-mating), 또는 재조합 숙주 세포를 생성하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법에 관계없이, 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포를 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오타이드는 통합되지 않은 벡터, 예를 들어, 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 또는 대안적으로, 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다.
항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질이다. 천연 항체는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 디설파이드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입의 중쇄 사이에 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 둔 사슬내 디설파이드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VH)을 갖고 이후에 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인(VL) 및 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체들 사이에서 서열이 광범위하게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 결합 특이성을 담당한다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인을 통해 고르게 분포되지 않는다. 그것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중되어 있다. 가변 도메인의 매우 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 각각은 4개의 FR 영역을 포함하고, 이는 주로 루프 연결을 형성하는 3개의 CDR에 의해 연결된 β-시트 배열을 채택하고, 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 매우 근접하여 뭉쳐 있으며, 다른 사슬로부터의 CDR과 함께, 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)).
불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접 관여하지 않지만 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 이들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 상이한 부류에 할당될 수 있다. 면역글로불린의 5개의 주요한 부류인 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중 몇 개는 하위부류(아이소타입), 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로서 IgG; IgA1 및 IgA2로서 IgA로 더 분류될 수 있다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, e, γ 및 μ로 불린다. 상이한 부류의 면역글로불린에 해당하는 경쇄 불변 영역은 각각 κ, 및 λ로 불린다. 다양한 인간 면역글로불린 부류 중에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgM만이 보체를 활성화하는 것으로 알려져 있다. 면역글로불린은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 또는 이의 단편 또는 변형으로부터 선택될 수 있다.
생체내에서, 항체의 친화성 성숙은 주로 체세포성 과돌연변이유발에 의해 만들어지는 더 높은 친화성 항체 변이체의 항원 선택에 의해 유도된다. 2차 또는 3차 반응의 우세한 생식계열 유전자가 1차 또는 2차 반응의 것과 상이한 것으로 보이는 "레퍼토리 이동(repertoire shift)"이 또한 종종 발생한다.
면역 시스템의 친화성 성숙 과정은 시험관내에서 항체 유전자에 돌연변이를 도입하고 친화성 선택을 사용하여 개선된 친화성을 갖는 돌연변이체를 단리함으로써 반복될 수 있다. 이러한 돌연변이 항체는 사상형 박테리오파아지 또는 미생물, 예컨대 E. 콜리, 효모의 표면 상에서 디스플레이될 수 있고, 항체는 항원에 대한 이들의 친화성에 의해 또는 항원으로부터 이들의 해리 동역학(오프-레이트)에 의해 선택될 수 있다. Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896(1992). 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1)의 인간 외피 당단백질 gp120에 결합하는 인간 항체(Barbas III et al. PNAS(USA) 91: 3809-3813(1994); 및 Yang et al. J. Mol. Biol. 254:392-403(1995)); 및 항-c-erbB-2 단일 사슬 Fv 단편(Schier et al. J. Mol. Biol. 263:551567(1996))을 친화성 성숙시키기 위해 CDR 워킹 돌연변이유발(CDR walking mutagenesis)이 사용되어 왔다. HIV의 제3 초가변 루프에 대한 고친화성 인간 항체를 친화성 성숙시키기 위해 항체 사슬 셔플링 및 CDR 돌연변이유발이 사용되었다(Thompson et al. J. Mol. Biol. 256:77-88(1996)). 문헌[Balint and Larrick Gene 137:109-118(1993)]은 개선된 변이체를 위해 가변 영역 유전자의 모든 CDR이 동시에 그리고 철저히 검색되는 컴퓨터 지원 올리고데옥시리보뉴클레오타이드-유도 스캐닝 돌연변이유발을 기술한다. αvβ3-특이적 인간화된 항체는 6개의 모든 CDR의 모든 위치가 돌연변이된 후 가장 큰 친화성 돌연변이체를 포함하는 조합 라이브러리를 발현 및 스크리닝하는 초기 제한된 돌연변이유발 전략을 사용하여 친화성 성숙되었다(Wu et al. PNAS(USA) 95: 6037-6-42(1998)). 파아지 디스플레이된 항체가 문헌[Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84(1992); 및 Rader and Barbas III Current Opinion in Biotech. 8:503-508(1997)]에서 검토된다. 상기 문헌에서 모 항체와 비교하여 개선된 친화성을 갖는 돌연변이 항체가 보고된 각각의 경우, 돌연변이 항체는 CDR에 아미노산 치환을 갖는다.
본원에서 "친화성 성숙"은 항원에 대한 항체의 친화성을 향상시키는 과정을 의미한다. 친화성 성숙 방법은 비제한적으로 컴퓨터 스크리닝 방법 및 실험 방법을 포함한다.
본원에서 "항체"는 항체 유전자의 전부 또는 일부에 의해 실질적으로 코딩된 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성되는 단백질을 의미한다. 면역글로불린 유전자는, 비제한적으로, 카파, 람다, 알파, 감마(IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4), 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 무수히 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 본원에서 항체는 전장 항체 및 항체 단편을 포함하는 것을 의미하고 임의의 유기체에서 자연적으로 존재하거나 조작된(예컨대, 변이체) 항체를 포함하는 것을 의미한다. 본원에 개시된 항체는 인간, 인간화된, 조작된, 비인간, 및/또는 키메라 항체일 수 있다. 인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,821,337호; 제7,527,791호; 제6,982,321호; 제7,087,409호; 제5,766,886호 참고). 일반적으로, 인간화된 항체는 CDR 또는 이의 일부가 비인간 항체로부터 유래되고 프레임워크 영역 또는 이의 일부가 인간 항체 서열로부터 유래된 된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화된 항체에서의 프레임워크 잔기는 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 회복하거나 개선하기 위해 CDR 잔기가 유래된 항체인 비인간 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환될 수 있다. 키메라 항체는 원래 별개의 항체를 코딩하는 2개 이상의 항체 유전자들을 조합하거나 연결함으로써 생성된 항체를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체는 인간, 소 또는 쥣과 종으로부터의 2개 이상의 항체 유전자(또는 이로부터의 단편)를 조합하거나 연결함으로써 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편의 적어도 일부는 인간, 또는 시아노몰구스 원숭이으로부터 유래될 수 있지만, 이제 제한되지 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 종간 반응성일 수 있으며, 예를 들어 항체는 인간 항원 및 시아노몰구스 원숭이 항원(예컨대, 인간/시아노 항체)을 인식할 수 있다.
"항체 단편"은 전장 형태 이외의 임의의 형태의 항체를 의미한다. 본원의 항체 단편은 전장 항체, 및 조작된 항체 내에 존재하는 더 작은 성분인 항체를 포함한다. 항체 단편은 비제한적으로 Fv, Fc, Fab, 및 (Fab')2, 단일 사슬 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이작용성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합, 가변 영역, 프레임워크 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄, 대체 스캐폴드 비-항체 분자, 이중특이적 항체 등을 포함한다(Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). 달리 구체적으로 나타내지 않는 한, 용어 "항체" 또는 "항체들"을 사용하는 진술 및 청구항은 명시적으로 "항체 단편" 및 "항체 단편들"을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, '항-CD3 항체', '항-CD3 Fab', '항-CD3 Fab 항체' 및 '항-CD3 Fab 변이체'는 본원에 정의된 바와 같은 항체 단편이다.
본원에서 "컴퓨터 스크리닝 방법"은 단백질 내에 하나 이상의 돌연변이를 설계하기 위한 임의의 방법을 의미하며, 상기 방법은 컴퓨터를 사용하여 서로와의 및/또는 단백질의 나머지와의 잠재적인 아미노산 측쇄 치환의 상호작용의 에너지를 평가한다.
본원에서 "전장 항체"는 항체 H 및/또는 L 사슬의 자연 생물학적 형태를 구성하는 구조를 의미한다. 인간 및 마우스를 포함하는 대부분의 포유동물에서, 이 형태는 사량체이며, 2개의 면역글로불린 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각각의 쌍은 하나의 경쇄 및 하나의 중쇄를 가지며, 각각의 경쇄는 면역글로불린 도메인 VL 및 CL을 포함하고, 각각의 중쇄는 면역글로불린 도메인 VH, Cγ1, Cγ2, 및 Cγ3을 포함한다. 각 쌍에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역(VL 및 VH)은 함께 항원에의 결합을 담당하고, 불변 영역(CL, Cγ1, Cγ2, 및 Cγ3, 특히 Cγ2, 및 Cγ3)은 항체 효과기 기능을 담당한다. 일부 포유동물에서, 예를 들어 낙타와 라마에서, 전장 항체는 2개의 중쇄로만 구성될 수 있고, 각각의 중쇄는 면역글로불린 도메인 VH, Cγ2, 및 Cγ3을 포함한다.
본원에서 "면역글로불린(Ig)"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩된 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성되는 단백질을 의미한다. 면역글로불린은 비제한적으로 항체를 포함한다. 면역글로불린은 비제한적으로 전장 항체, 항체 단편, 및 개별 면역글로불린 도메인, 예컨대 비제한적으로 VH, Cγ1, Cγ2, Cγ3, VL, 및 CL을 포함하는 많은 구조적 형태를 가질 수 있다.
본원에서 "면역글로불린(Ig) 도메인"은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 코딩된 폴리펩타이드로 구성되는 단백질 도메인을 의미한다. Ig 도메인은 비제한적으로 VH, Cγ1, Cγ2, Cγ3, VL, 및 CL을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "변이체 단백질 서열"은 또 다른 유사한 단백질 서열과 아미노산 동일성이 상이한 하나 이상의 잔기를 갖는 단백질 서열을 의미한다. 상기 유사한 단백질 서열은 자연 야생형 단백질 서열, 또는 야생형 서열의 또 다른 변이체일 수 있다. 일반적으로, 출발 서열은 "모" 서열로 지칭되고, 야생형 또는 변이체 서열일 수 있다. 예를 들어, 바람직한 본 발명의 구현예는 변이체를 만들기 위해 컴퓨터 분석이 수행될 때 인간화된 모 서열을 이용할 수 있다.
본원의 항체의 "가변 영역"은 변이체를 포함하여 VH 면역글로불린 도메인, VL 면역글로불린 도메인, 또는 VH 및 VL 면역글로불린 도메인으로 구성되는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 의미한다. 가변 영역은 Fv 단편, scFv 단편, 더 큰 항체 단편의 맥락에서 이 영역, 또는 전장 항체 또는 대안적인 비항체 스캐폴드 분자의 맥락에서 이 영역과 같은 단리된 폴리펩타이드를 지칭할 수 있다.
본 발명의 항-CD3 Fab 항체와 관련하여, 용어 "항원적으로 특이적인" 또는 "특이적으로 결합한다"는 관심있는 항원 또는 결합 파트너의 하나 이상의 에피토프에 결합하지만, 항원의 혼합된 집단을 함유하는 샘플에서 다른 분자를 실질적으로 인식하지 않고 이에 결합하지 않는 항-CD3 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "이중특이적 항-CD3 항체" 또는 '다중특이적 항-CD3 항체"는 2개 이상의 항원 결합 부위 또는 결합 파트너 결합 부위인 제1 항원 또는 에피토프에 대해 친화성을 갖는 제1 결합 부위 및 제1 결합 부위와 구별되는 제2 항원 또는 에피토프에 대해 결합 친화성을 갖는 제2 결합 부위를 포함하는 항-CD3 항체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 항-CD3 항체는 CD3에 결합하는 결합 부위 및 상이한 항원 또는 에피토프에 대해 결합 친화성을 갖는 결합 부위 또는 결합 부위들을 갖는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "에피토프"는 항-CD3 Fab 항체에 의해 인식되는 항원 또는 결합 파트너 상의 부위를 지칭한다. 항원이 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 에피토프는 선형 또는 입체형태적으로 형성된 서열 또는 모양의 아미노산일 수 있다. 에피토프는 또한 임의의 유형의 항원 상의 임의의 위치일 수 있고, 여기에 항-CD3 항체가 항원에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, "항원-결합 폴리펩타이드" 또는 "항-CD3 Fab 항체"는 이의 생물학적 활성에 관계없이, 그리고 추가적으로, 비제한적으로, 재조합(cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA 또는 다른 형태의 핵산으로부 생산되는지 여부), 시험관내, 생체내, 핵산 분자의 미세주입, 합성, 유전자도입, 및 유전자 활성화 방법을 포함하는 합성 또는 제조 방법에 관계없이, 특정 결합 파트너, 예컨대 항원뿐만 아니라 이의 CD3 유사체, CD3 아이소타입, CD3 모방체, CD3 단편, 하이브리드 CD3 단백질, 융합 단백질, 올리고머 및 다량체, 동족체, 당화 패턴 변이체, 및 뮤테인과 특이적으로 결합하는 생물학적 활성을 적어도 갖는 폴리펩타이드 및 단백질을 포함할 것이다. 항-CD3 항체의 특정 예는, 비제한적으로, 항체 분자, 중쇄, 경쇄, 가변 영역, CDR, Fab, scFv, 대체 스캐폴드 비-항체 분자, 리간드, 수용체, 펩타이드, 또는 항원에 결합하는 임의의 아미노산 서열을 포함한다.
항원-결합 폴리펩타이드는 자연발생 인간 항-CD3 항체의 약제학적으로 허용가능한 염 및 전구약물, 및 염의 전구약물, 다형체, 수화물, 용매화물, 생물학적 활성 단편, 생물학적 활성 변이체 및 입체이성질체뿐만 아니라 자연발생 인간 항-CD3 항체 및 이의 폴리펩타이드 융합의 작용제, 모방체, 및 길항제 변이체를 포함한다. 아미노 말단, 카르복실 말단, 또는 둘 모두에 추가의 아미노산을 포함하는 융합은 용어 "항원-결합 폴리펩타이드"에 의해 포함된다. 예시적인 융합은, 비제한적으로, 예컨대, 재조합 발현, 정제를 위한 융합(비제한적으로 폴리-히스티딘 또는 친화성 에피토프 포함), 항-CD3 항체를 다른 생물학적 활성 분자에 연결하기 위한 융합, 혈청 알부민 결합 펩타이드와의 융합, 및 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질과의 융합으로부터 비롯되는 메티오닌이 항-CD3 항체의 N-말단에 연결된 메티오닐 항-CD3 항체를 포함한다.
용어 "항원" 또는 "결합 파트너"는 항-CD3 항체에 의해 나타나는 결합 활성에 대한 표적인 물질을 지칭한다. 실질적으로 임의의 물질이 항-CD3 Fab 항체에 대한 항원 또는 결합 파트너일 수 있다.
자연적으로 생산된 항체(Ab)는 2개의 동일한 면역글로불린(Ig) 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 구성된 사량체성 구조이다. Ab의 중쇄 및 경쇄는 상이한 도메인으로 구성된다. 각각의 경쇄는 하나의 가변 도메인(VL) 및 하나의 불변 도메인(CL)을 갖는 반면, 각각의 중쇄는 하나의 가변 도메인(VH) 및 3개의 불변 도메인(CH)을 갖는다. 약 110개의 아미노산 잔기로 구성되는 각각의 도메인은 서로에 대해 팩킹된 2개의 β-시트로부터 형성된 특징적인 β-샌드위치 구조, 즉 면역글로불린 접힘으로 접힌다. VL 도메인 각각은 3개의 상보성 결정 영역(CDR1-3)을 갖고, VH 도메인 각각은 도메인의 하나의 말단에서 β-가닥을 연결하는 루프 또는 회전인 최대 3개의 상보성 결정 영역(CDR1-3)을 갖는다. 경쇄 및 중쇄 모두의 가변 영역은 일반적으로 항원 특이성에 기여하지만, 특이성에 대한 개별 사슬의 기여가 반드시 동일한 것은 아니다. 항체 분자는 무작위화된 CDR 루프를 사용하여 많은 분자에 결합하도록 진화하였다.
Ab의 기능적 하부구조는 단백질 분해 및 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들은 단일 사슬간 디설파이드 결합에 의해 연결된 중쇄의 VH-CH1 도메인 및 경쇄의 VL-CL1 도메인을 포함하는 Fab 단편, 및 VH 및 VL 도메인만을 포함하는 Fv 단편, 및 분자의 비-항원 결합 영역을 포함하는 Fc 부분을 포함한다. 일부 경우, 단일 VH 도메인은 항원에 대해 유의한 친화성을 유지한다(Ward et al., Nature 341, 554-546, 1989). 또한, 특정 단량체성 κ 경쇄가 그의 항원에 특이적으로 결합할 것으로 나타났다(L. Masat et al., PNAS 91:893-896, 1994). 분리된 경쇄 또는 중쇄는 때때로 일부 항원-결합 활성을 유지하는 것으로 밝혀졌다(Ward et al., Nature 341, 554-546, 1989).
또 다른 기능적 하부구조는 펩타이드 링커에 의해 공유 연결된 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 단일 사슬 Fv(scFv)이다(S-z Hu et al., Cancer Research, 56, 3055-3061, 1996). 이러한 작은(Mr 25,000 Da) 단백질은 일반적으로 단일 폴리펩타이드에서 항원에 대한 특이성 및 친화성을 유지하고, 더 큰 항원 특이적 분자를 위한 간편한 빌딩 블록을 제공할 수 있다. 순환에서 scFv의 짧은 반감기는 많은 경우에 이들의 치료적 유용성을 제한한다.
"미니바디"로 불리는 작은 단백질 스캐폴드는 Ig VH 도메인의 일부를 주형으로서 사용하여 설계되었다(Pessi et al., Nature 362, 367-369, 1993). 인터루킨-6에 대해 높은 친화성(해리 상수(Kd) 약 10-7 M)을 갖는 미니바디는 VH의 CDR1 및 CDR2에 해당하는 루프를 무작위화한 다음, 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 돌연변이체를 선택함으로써 확인되었다(Martin et al., EMBO J. 13, 5303-5309, 1994).
낙타는 종종 이들의 혈청으로부터의 IgG-유사 물질을 분석할 때 가변 경쇄 도메인이 종종 없으며, 이는 충분한 항체 특이성 및 친화성이 VH 도메인(3개 또는 4개의 CDR 루프) 단독으로부터 유래될 수 있음을 시사한다. 높은 친화성을 갖는 "낙타화된(camelized)" VH 도메인이 제조되었고, 높은 특이성은 CDR3만을 무작위화함으로써 생성될 수 있다.
"미니바디"에 대한 대안은 "디아바디"이다. 디아바디는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 2가 및 이중특이적 항체 단편이다. 단편은 동일한 폴리펩타이드 사슬(VH-VL) 상의 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 디아바디는 Fab 단편과 크기가 유사하다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍을 형성하기에 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 또 다른 사슬의 상보적인 도메인과 쌍을 형성하여 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 된다. 이들 이량체성 항체 단편, 또는 "디아바디"는 2가이고 이중특이적이다.(See, P. Holliger et al., PNAS 90:6444-6448, 1993).
CDR 펩타이드 및 유기 CDR 모방체가 제조되었다(Dougall et al., 1994, Trends Biotechnol. 12, 372-379). CDR 펩타이드는 항체의 CDR 루프의 아미노산 서열에 해당하는 짧은, 전형적으로 사이클릭 펩타이드이다. CDR 루프는 항체-항원 상호작용을 담당한다. CDR 펩타이드 및 유기 CDR 모방체는 일부 결합 친화성을 유지하는 것으로 나타났다(Smyth & von Itzstein, J. Am. Chem. Soc. 116, 2725-2733, 1994). 마우스 CDR은 친화성의 손실 없이 인간 Ig 프레임워크 상에 이식되었다(Jones et al., Nature 321, 522-525, 1986; Riechmann et al., 1988).
인체에서, 큰 라이브러리로부터 특정 Ab가 선택되고 증폭된다(친화성 성숙). 이 과정은 조합 라이브러리 기술을 사용하여 시험관내에서 재현될 수 있다. 박테리오파아지의 표면 상에 Ab 단편의 성공적인 디스플레이는 수많은 CDR 돌연변이를 생성하고 스크리닝하는 것을 가능하게 하였다(McCafferty et al., Nature 348, 552-554, 1990; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,7978-7982, 1991; Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455, 1994). 더 많은 Fab 및 Fv(및 이들의 유도체)가 이 기술에 의해 생산된다. 조합 기술이 Ab 모방체와 조합될 수 있다.
잠재적으로 단백질 스캐폴드로 작용할 수 있는 많은 단백질 도메인이 파아지 캡시드 단백질과의 융합체로서 발현되었다. 문헌[Clackson & Wells, Trends Biotechnol. 12:173-184, 1994]을 검토한다. 이들 단백질 도메인 중 몇 가지는 소 췌장 트립신 억제제(Roberts et al., PNAS 89:2429-2433 1992), 인간 성장 호르몬(Lowman et al., Biochemistry 30:10832-10838, 1991), (Venturini et al., Protein Peptide Letters 1:70-75 1994), 및 스트렙토코커스(Streptococcus)의 IgG 결합 도메인(O'Neil et al., Techniques in Protein Chemistry V(Crabb, L,. ed.) pp. 517-524, Academic Press, San Diego, 1994)을 포함하는 무작위 펩타이드 서열을 디스플레이하기 위한 스캐폴드로서 이미 사용되었다. 이들 스캐폴드는 단일 무작위화된 루프 또는 영역을 디스플레이하였다. 텐다미스타트(Tendamistat)는 사상형 파아지 M13 상의 제시 스캐폴드로서 사용되었다(McConnell and Hoess, J. Mol. Biol. 250:460-470, 1995).
PEG로 약칭되는 친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜)의 공유 부착은 단백질, 펩타이드, 및 특히 소수성 분자를 포함하는 많은 생물학적 활성 분자의 수용성, 생체이용률을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키거나, 치료 반감기를 증가시키거나, 면역원성을 조절하거나, 생물학적 활성을 조절하거나, 또는 순환 시간을 연장시키는 방법이다. PEG는 제약, 인공 이식편, 및 생체적합성, 독성 부족, 및 면역원성 부족이 중요한 다른 응용분야에서 광범위하게 사용되어 왔다. PEG의 원하는 특성을 최대화하기 위해, PEG 중합체 또는 생물학적 활성 분자에 부착된 중합체의 총 분자량 및 수화 상태는 모 분자의 생물활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서, 전형적으로 PEG 중합체 부착과 관련된 유리한 특징, 예컨대 수용성 및 순환 반감기 증가를 부여하기에 충분히 높아야 한다.
PEG 유도체는 반응성 화학 기능성을 통해 생물학적 활성 물질, 예컨대 리신, 시스테인 및 히스티딘 잔기, N-말단 및 탄수화물 모이어티에 자주 연결된다. 단백질 및 다른 분자는 종종 중합체 부착에 이용가능한 반응 부위의 수가 제한적이다. 종종, 중합체 부착을 통한 변형에 가장 적합한 부위는 수용체 결합에서 중요한 역할을 하며, 분자의 생물학적 활성의 유지에 필요하다. 그 결과, 생물학적 활성 분자 상의 이러한 반응 부위에 중합체 사슬을 무작위적으로 부착시키는 것은 종종 중합체 변형된 분자의 생물학적 활성을 유의하게 감소시키거나 심지어 완전히 상실시킨다(R. Clark et al., J. Biol. Chem., 271:21969-21977, 1996). 표적 분자에 원하는 이점을 부여하기 위해 충분한 중합체 분자량을 갖는 접합체를 형성하기 위해, 선행 기술 접근법은 전형적으로 수많은 중합체 팔의 분자에 무작위 부착하는 것을 포함함으로써 모 분자의 생물활성의 감소 또는 심지어 완전한 상실의 위험을 증가시켰다.
PEG 유도체를 단백질에 부착하기 위한 위치를 형성하는 반응 부위는 단백질의 구조에 의해 결정된다. 효소를 포함하는 단백질은 일반적인 구조 H2N--CHR―COOH를 갖는 알파-아미노산의 다양한 서열로 구성된다. 하나의 아미노산의 알파 아미노 모이어티(H2N--)는 인접한 아미노산의 카르복실 모이어티(--COOH)에 결합하여 아미드 연결을 형성하며, 이는 --(NH--CHR--CO)n--로 표시될 수 있고, 여기서 아래 첨자 "n"은 수백 또는 수천일 수 있다. R로 표시되는 단편은 단백질 생물학적 활성 및 PEG 유도체의 부착을 위한 반응 부위를 함유할 수 있다.
예를 들어, 아미노산 리신의 경우, 엡실론 위치뿐만 아니라 알파 위치에 --NH2 모이어티가 존재한다. 엡실론 --NH2는 염기성 pH 조건 하에 반응이 없다. PEG를 이용한 단백질 유도체화 분야의 많은 기술은 단백질에 존재하는 리신 잔기의 엡실론 --NH2 모이어티에 부착시키기 위한 PEG 유도체를 개발하는 데 집중하였다.("Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, pp. 1-17, 2003). 그러나, 이들 PEG 유도체들은 모두 단백질의 표면 상에 존재하는 수많은 리신 잔기 중에서 선택적으로 설치될 수 없다는 공통적인 한계가 있다. 이것은 예를 들어 효소 활성 부위에 존재하는 리신 잔기가 단백질 활성에 중요한 경우, 또는 수용체 결합 부위의 경우에서와 같이 리신 잔기가 단백질과 다른 생물학적 분자와의 상호작용을 매개하는 역할을 하는 경우에 중요한 한계일 수 있다
기존 단백질 페길화 방법의 두 번째이나 동등하게 중요한 문제는 PEG 유도체가 원하는 잔기가 아닌 잔기와 부 반응을 겪을 수 있다는 것이다. 히스티딘은 구조적으로 --N(H)--로 표시되는 반응성 이미노 모이어티를 함유하지만, 엡실론 --NH2 와 반응하는 많은 화학적 반응성 종은 또한 --N(H)--과 반응할 수 있다. 유사하게, 아미노산 시스테인의 측쇄는 구조적으로 -SH로서 표시되는 유리 설프하이드릴기를 갖는다. 일부 경우, 리신의 엡실론 --NH2 기에 대한 PEG 유도체는 또한 시스테인, 히스티딘 또는 다른 잔기와 반응한다. 이것은 PEG 유도체화된 생물활성 분자의 복잡하고 이질적인 혼합물을 생성할 수 있고, 표적화되는 생물활성 분자의 활성을 파괴할 위험이 있다. 화학적 작용기가 단백질 내의 단일 부위에 도입되도록 허용하고 이는 이후에 잘 정의되고 에측가능한 단백질 표면 상의 특정 부위에서 생물활성 분자에 하나 이상의 PEG 중합체의 선택적 결합을 가능하게 할 PEG 유도체를 개발하는 것이 바람직할 것이다
리신 잔기 외에도, 시스테인, 히스티딘 및 N-말단을 포함하는 다른 아미노산 측쇄를 표적화하는 활성화된 PEG 시약의 개발을 위해 당업계에 상당한 노력이 집중되어 왔다. 예컨대, 문헌[본원에 참조로 포함된 미국 특허 제6,610,281호, 및 "Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation", Nektar Molecular Engineering Catalog, pp. 1-17, 2003]을 참고한다. 시스테인 잔기는 부위-지향 돌연변이유발 및 당업계에 공지된 다른 기술을 사용하여 단백질의 구조 내로 부위 선택적으로 도입될 수 있고, 생성된 유리 설프하이드릴 모이어티는 티올-반응성 작용기를 갖는 PEG 유도체와 반응할 수 있다. 하지만, 이 접근법은 유리 설프하이드릴기의 도입이 생성된 단백질의 발현, 접힘 및 안정성을 복잡하게 만들 수 있다는 점에서 복잡하다. 따라서, 하나 이상의 PEG 중합체를 단백질에 선택적으로 결합시키면서 동시에 설프하이드릴 및 단백질에서 전형적으로 발견되는 다른 화학 작용기와 양립가능한(즉, 이들과 원하지 않는 부 반응에 관여하지 않는) 화학 작용기를 생물활성 분자 내로 도입하는 수단을 갖는 것이 바람직할 것이다.
당업계에 언급된 바와 같이, 단백질의 측쇄에 부착하기 위해 개발된 많은 이들 유도체, 특히, 리신 아미노산 측쇄 상의 --NH2 모이어티 및 시스테인 측쇄 상의 -SH 모이어티는 이들의 합성 및 사용에 문제가 있음이 입증되었다. 일부는 가수분해되어 혈류와 같은 수성 환경에서 분해되거나 불안정한 단백질과의 불안정한 연결을 형성한다. 일부는 더 안정적인 연결을 형성하지만, 연결이 형성되기 전에 가수분해되고, 이는 PEG 유도체 상의 반응기가 단백질이 부착되기 전에 비활성화될 수 있음을 의미한다. 일부는 다소 독성이 있으므로, 생체내에서 사용하기에 적합하지 않다. 일부는 반응아히게 너무 느려서 실제 유용하지 않다. 일부는 단백질의 활성을 담당하는 부위에 부착함으로써 단백질 활성을 손실시킨다. 일부는 이들이 부착할 부위에서 특이적이지 않고, 이는 또한 원하는 활성의 손실 및 결과의 재현성 부족을 초래할 수 있다. 단백질을 폴리(에틸렌 글리콜) 모이어티로 변형하는 것과 관련된 문제를 극복하기 위해, 보다 안정하거나(예컨대, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,602,498호) 분자 및 표면 상의 티올 모이어티와 선택적으로 반응하는 PEG 유도체가 개발되었다(예컨대, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,610,281호). 안정한 화학적 결합을 형성하기 위해 선택적으로 반응하도록 요청할 때까지 생리학적 환경에서 화학적으로 불활성인 PEG 유도체가 당업계에 분명히 필요하다.
최근에, 단백질 과학에서 완전히 새로운 기술이 보고되었으며, 이는 단백질의 부위 특이적 변형과 관련된 많은 한계를 극복할 것으로 보인다. 구체적으로, 새로운 성분이 원핵생물 에스케리키아 콜리(E. coli)(예컨대, L. Wang, et al., Science 292:498-500, 2001) 및 진핵생물 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)(예컨대, J. Chin et al., Science 301:964-7, 2003)의 단백질 생합성 기구에 첨가되었고, 이는 생체내에서 비유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질에 혼입하는 것을 가능하게 하였다. 광친화성 표지 및 광이성질화가능한 아미노산, 케토 아미노산, 및 글리코실화된 아미노산을 포함하는 신규한 화학적, 물리적 또는 생물학적 특성을 갖는 많은 새로운 아미노산이 이 방법을 사용하여 앰버 코돈 TAG에 대한 반응으로 E. 콜리 및 효모 내의 단백질 내로 효율적으로 그리고 높은 정확도로 통합되었다. 예컨대, 문헌[J. W. Chin et al., Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027, 2002; J. W. Chin, & P. G. Schultz,(2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al., PNAS United States of America 99:11020-11024, 2002; and, L. Wang, & P. G. Schultz, Chem. Comm., 1-10, 2002]를 참고한다. 이들 연구는 단백질에서 발견되지 않고, 20개의 일반적인 유전적으로 코딩된 아미노산에서 발견되는 모든 작용기에 화학적으로 비활성이고, 효율적이고 선택적으로 반응하여 안정한 공유 연결을 형성하는 데 사용될 수 있는 화학적 작용기, 예컨대 케톤기, 알킨기 및 아지드 모이어티를 선택적으로 그리고 일상적으로 도입하는 것이 가능하다는 것을 입증하였다.
비유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질 내로 혼입하는 능력은 리신의 엡실론 -NH2, 시스테인의 설프하이드릴 -SH, 히스티딘의 이미노기 등과 같은 자연발생 작용기에 대한 유용한 대안을 제공할 수 있는 화학적 작용기의 도입을 허용한다. 특정 화학적 작용기는 20개의 일반적인 유전적으로 코딩된 아미노산에서 발견되는 작용기에는 비활성이지만 쉽게 그리고 효율적으로 반응하여 안정한 연결을 형성하는 것으로 알려져 있다. 아지드 및 아세틸렌 기는, 예를 들어, 촉매량의 구리의 존재하에 수성 조건에서 후이겐(Huisgen) [3+2] 사이클로첨가 반응을 겪는 것으로 당업계에 알려져 있다. 예컨대, 문헌[Tornoe, et al.,(2002) Org. Chem. 67:3057-3064; and, Rostovtsev, et al.,(2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599]을 참고한다. 아지드 모이어티를 단백질 구조 내로 도입함으로써, 예를 들어, 단백질에서 발견되는 아민, 설프하이드릴, 카르복실산, 하이드록실기에 화학적으로 비활성이지만, 또한 아세틸렌 모이어티와 부드럽게 그리고 효율적으로 반응하는 작용기를 혼입하여 사이클로첨가 생성물을 형성하는 작용기를 혼입할 수 있다. 중요하게도, 아세틸렌 모이어티의 부재 하에, 아지드는 다른 단백질 측쇄의 존재 하에 그리고 생리적 조건 하에 화학적으로 비활성 및 비반응성을 유지한다.
다양한 참고문헌은 중합체 접합 또는 당화에 의한 폴리펩타이드의 변형을 개시한다. 용어 "항-CD3 항체" 또는 "항원-결합 폴리펩타이드"는 상기 기재된 바와 같은 항-CD3 항체뿐만 아니라 비제한적으로, 항원 결합 이외의 활성을 포함하는, 자연발생 항체의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 항원 결합 이외의 활성은, 비제한적으로, Fc와 관련된 활성 중 어느 하나 이상을 포함한다. 용어 "항-CD3 항체" 또는 "항원-결합 폴리펩타이드"는, 비제한적으로, PEG와 같은 중합체에 접합된 폴리펩타이드를 포함하고, 시스테인, 리신, N 또는 C-말단 아미노산, 또는 다른 잔기의 하나 이상의 추가의 유도체화를 포함할 수 있다. 또한, 항-CD3 항체는 링커, 중합체 또는 생물학적 활성 분자를 포함할 수 있고, 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자가 접합되는 아미노산은 본 발명에 따른 비자연 아미노산일 수 있거나 리신 또는 시스테인에의 커플링과 같이 당업계에 알려진 기술을 이용하여 자연적으로 코딩된 아미노산에 접합될 수 있다. 미국 특허 제4,904,584호는 페길화된 리신 결실된 폴리펩타이드로서, 적어도 하나의 리신 잔기가 결실되었거나 임의의 다른 아미노산 잔기로 대체된 것인 폴리펩타이드를 개시한다. WO 제99/67291호는 단백질을 PEG와 접합시키기 위한 과정으로서, 단백질 상의 적어도 하나의 아미노산 잔기는 결실되고, 단백질은 단백질에의 접합을 달성하기에 충분한 조건 하에 PEG와 접촉되는 것인 과정을 개시한다. WO 제99/03887호는 성장 호르몬 수퍼패밀리에 속하는 폴리펩타이드의 페길화된 변이체로서, 시스테인 잔기는 폴리펩타이드의 특정 영역에 위치한 비필수 아미노산 잔기로 치환된 것인 변이체를 개시한다. WO 제00/26354호는 상응하는 모 폴리펩타이드와 비교하여 적어도 하나의 추가의 당화 부위를 포함하는, 감소된 알레르기원성을 갖는 글리코실화된 폴리펩타이드 변이체를 생산하는 방법을 개시한다.
용어 "항원-결합 폴리펩타이드"는 또한 글리코실화된 항-CD3 항체, 예컨대 비제한적으로, 임의의 아미노산 위치에서 글리코실화된 폴리펩타이드, N-연결되거나 O-연결된 글리코실화된 형태의 폴리펩타이드를 포함한다. 단일 뉴클레오타이드 변화를 함유하는 변이체는 또한 항-CD3 항체의 생물학적 활성 변이체로 간주된다. 또한, 스플라이스 변이체가 또한 포함된다. 용어 "항원-결합 폴리펩타이드"는 또한 화학적 수단에 의해 연결되거나 융합 단백질로서 발현되는, 임의의 하나 이상의 항-CD3 항체 또는 임의의 다른 폴리펩타이드, 단백질, 탄수화물, 중합체, 소분자, 링커, 리간드, 또는 임의의 유형의 다른 생물학적 활성 분자의 항-CD3 항체 이종이량체, 동종이량체, 이종다량체, 또는 동종다량체, 뿐만 아니라 예를 들어, 특이적 결실 또는 다른 변형을 함유하지만 생물학적 활성을 유지하는 폴리펩타이드 유사체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원-결합 폴리펩타이드는 항-CD3 항체의 생물학적 활성을 조절하는 부가, 치환 또는 결실을 추가로 포함한다. 예를 들어, 부가, 치환 또는 결실은, 비제한적으로, 항원에 대한 친화성을 조절하거나, 항원 입체형태적 또는 다른 2차, 3차 또는 4차 구조적 변화를 조절(비제한적으로 증가 또는 감소 포함)하거나, 항원 입체형태적 또는 다른 2차, 3차 또는 4차 구조적 변화를 안정화시키거나, 항원 입체형태적 또는 다른 2차, 3차 또는 4차 구조적 변화를 유도 또는 유발하거나, 순환 반감기를 조절하거나, 치료 반감기를 조절하거나, 폴리펩타이드의 안정성을 조절하거나, 용량을 조절하거나, 방출 또는 생체이용률을 조절하거나, 정제를 용이하게 하거나, 또는 특정 투여 경로를 개선 또는 변경하는 것을 포함하는, 항-CD3 항체의 하나 이상의 특성 또는 활성을 조절할 수 있다. 유사하게, 항원-결합 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 검출(비제한적으로, GFP 포함), 정제 또는 다른 특성을 개선하는 프로테아제 절단 서열, 반응기, 항체-결합 도메인(비제한적으로, FLAG 또는 폴리-His 포함) 또는 다른 친화성 기반 서열(비제한적으로, FLAG, 폴리-His, GST 등 포함) 또는 연결된 분자(비제한적으로, 바이오틴 포함)를 포함할 수 있다.
용어 "항원-결합 폴리펩타이드"는 또한 비자연적으로 코딩된 아미노산 측쇄를 통해, 동일하거나 상이한 비자연적으로 코딩된 아미노산 측쇄에, 자연적으로 코딩된 아미노산 측쇄에 직접 연결되거나, 융합으로서, 또는 링커를 통해 간접적으로 연결된 항-CD3 항체 동종이량체, 이종이량체, 동종다량체, 및 이종다량체를 포함한다. 예시적인 링커는 비제한적으로, 작은 유기 화합물, 다양한 길이의 수용성 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리덱스트란, 또는 다양한 길이의 폴리펩타이드를 포함한다.
당업자는 특정 항원-결합 폴리펩타이드 서열에서의 위치에 상응하는 아미노산 위치가 항원-결합 폴리펩타이드 또는 관련된 항원-결합 폴리펩타이드의 단편 등에서 쉽게 확인될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, BLAST와 같은 서열 정렬 프로그램은 관련 서열에서의 위치에 상응하는 단백질 내의 특정 위치를 정렬 및 확인하는 데 사용될 수 있다.
용어 "항원-결합 폴리펩타이드"는 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실을 포함하는 항원-결합 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 비자연 아미노산 변형과 함께 하나 이상의 자연 아미노산을 이용한 변형을 포함할 수 있다. 자연발생 항-CD3 항체 폴리펩타이드 내의 매우 다양한 아미노산 위치에서의 예시적인 치환이 기재되었고, 이는 비제한적으로, 작용제 활성을 증가시키고, 폴리펩타이드의 용해도를 증가시키고, 폴리펩타이드를 길항제 등으로 전환시키는 것과 같은 항원-결합 폴리펩타이드의 생물학적 활성 중 하나 이상을 조절하는 치환을 비제한적으로 포함하고, 이는 용어 "항-CD3 항체"에 의해 포함된다.
"비자연적으로 코딩된 아미노산"은 20개의 일반적인 아미노산 중 하나 또는 피로리신 또는 셀레노시스테인이 아닌 아미노산을 지칭한다. 용어 "비자연적으로 코딩된 아미노산"과 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비자연 아미노산," "비자연발생 아미노산," "비정규 아미노산", 및 이의 다양하게 하이픈으로 연결하거나 연결하지 않은 형태이다. 용어 "비자연적으로 코딩된 아미노산"은 또한, 비제한적으로, 자연적으로 코딩된 아미노산(비제한적으로, 20개의 일반적인 아미노산 또는 피로리신 및 셀레노시스테인)의 변형(예컨대, 번역 후 변형)에 의해 발생하지만 그 자체가 번역 복합체에 의해 성장하는 폴리펩타이드 사슬 내로 자연적으로 혼입되지 않는 아미노산을 포함한다. 이러한 비자연적으로 발생하는 아미노산의 예는, 비제한적으로, N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌, 및 O-포스포티로신을 포함한다. 일부 구현예에서, 비자연 아미노산은 당류 모이어티를 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 또한 아미노산과 당류 사이의 자연발생 N- 또는 O-연결이 비제한적으로, 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함하는 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 공유 연결에 의해 대체되는 예를 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 또한 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등과 같은 자연발생 단백질에서 일반적으로 발견되지 않는 당류를 포함한다.
비자연 아미노산의 특정 예는, 비제한적으로, p-아세틸-L- 페닐알라닌, p-프로파르길옥시페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-아이오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 및 이소프로필-L-페닐알라닌 등을 포함한다.
"아미노 말단 변형기"는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 유사하게, "카르복시 말단 변형기"는 폴리펩타이드의 카르복시 말단에 부착될 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 말단 변형기는, 비제한적으로, 다양한 수용성 중합체, 펩타이드 또는 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 또는 펩타이드의 혈청 반감기를 증가시키는 다른 모이어티를 포함한다.
용어 "작용기", "활성 모이어티", "활성화기", "이탈기", "반응 부위", "화학적 반응기" 및 "화학적 반응성 모이어티"는 분자의 구별되는 정의가능한 부분 또는 단위를 지칭하기 위해 당업계 및 본원에서 사용된다. 이 용어는 화학 분야에서 다소 동의어이며, 일부 기능 또는 활성을 수행하고 다른 분자와 반응하는 분자의 부분을 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
용어 "연결" 또는 "링커"는 일반적으로 화학 반응의 결과로서 형성되고 전형적으로 공유 연결인 기 또는 결합을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 가수분해적으로 안정한 연결은 연결이 물에서 안정하고, 비제한적으로, 연장된 기간 동안, 아마도 심지어 무기한으로, 생리학적 조건 하를 포함하는 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는다는 것을 의미한다. 가수분해적으로 불안정하거나 또는 분해가능한 연결은 연결이 예를 들어, 혈액을 포함하는, 물 또는 수성 용액에서 분해가능하다는 것을 의미한다. 효소적으로 불안정하거나 분해가능한 연결은 연결이 하나 이상의 효소에 의해 분해될 수 있다는 것을 의미한다. 당업계에서 이해되는 바와 같이, PEG 및 관련 중합체는 중합체 백본 내에 또는 중합체 백본 및 중합체 분자의 말단 작용기 중 하나 이상 사이의 링커기 내에 분해가능한 연결을 포함할 수 있다. 예를 들어, PEG 카르복실산 또는 활성화된 PEG 카르복실산과 생물학적 활성 물질 상의 알코올기의 반응에 의해 형성된 에스테르 연결은 일반적으로 생리학적 조건 하에서 가수분해되어 제제를 방출한다. 다른 가수분해적으로 분해가능한 연결은, 비제한적으로, 카르보네이트 연결; 아민 및 알데히드의 반응으로부터 생성된 이민 연결; 알코올을 포스페이트기와 반응시켜 형성된 포스페이트 에스테르 연결; 하이드라지드 및 알데히드의 반응 생성물인 하이드라존 연결; 알데히드 및 알코올의 반응 생성물인 아세탈 연결; 포르메이트 및 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 연결; 비제한적으로 PEG와 같은 중합체의 말단에 있는 것을 포함하는 아민기, 및 펩타이드의 카르복실기에 의해 형성된 펩타이드 연결; 및 비제한적으로, 중합체의 말단에 있는 것을 포함하는 포스포르아미다이트기, 및 올리고뉴클레오타이드의 5' 하이드록실기에 의해 형성된 올리고뉴클레오타이드 연결을 포함한다. 분지형 링커가 본 발명의 항원-결합 폴리펩타이드에서 사용될 수 있다.
용어 "생물학적 활성 분자", "생물학적 활성 모이어티" 또는 "생물학적 활성 물질"은 본원에서 사용될 때 비제한적으로, 바이러스, 박테리아, 박테리오파아지, 트랜스포존, 프리온, 곤충, 진균, 식물, 동물, 및 인간을 포함하는, 유기체와 관련된 생물학적 시스템, 경로, 분자, 또는 상호작용의 임의의 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성 분자는, 비제한적으로, 인간 또는 다른 동물에서 질환을 진단, 치유, 완화, 치료, 또는 예방하거나, 또는 인간 또는 동물의 물리적 또는 정신적 웰빙을 향상시키기 위한 임의의 물질을 포함한다. 생물학적 활성 분자의 예는, 비제한적으로, 펩타이드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 경질 약물, 연질 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 올리고뉴클레오타이드, 독소, 세포, 바이러스, 리포좀, 마이크로입자 및 미셀을 포함한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 생물학적 활성제의 부류는, 비제한적으로, 약물, 전구약물, 방사성핵종, 영상화제, 중합체, 항생제, 살진균제, 항바이러스제, 항염증제, 항종양제, 심혈관제, 항불안제, 호르몬, 성장 인자, 스테로이드성 제제, 미생물 유래 독소 등을 포함한다.
본 발명의 항-CD3 Fab-폴레이트 항체는 생체내 전달 및 약동학 프로파일을 개선하기 위해 PEG와 같은 분자에 접합될 수 있다. Leong 등은 비페길화된 형태에 비해 감소된 제거율을 갖고 항원 결합 활성이 거의 손실되지 않거나 전혀 손실되지 않은 항-IL-8 항체의 Fab' 단편의 부위 특이적 페길화를 기술한다(Leong, S.R. et al.(2001) Cytokine 16:106-119).
많은 상이한 절단가능한 링커가 당업자에게 알려져 있다. 미국 특허 제4,618,492호; 제4,542,225호, 및 제4,625,014호를 참고한다. 이들 링커 기로부터 제제의 방출을 위한 메커니즘은, 예를 들어, 광불안정 결합의 조사 및 산 촉매된 가수분해를 포함한다. 미국 특허 제4,671,958호는, 예를 들어, 환자의 보체 시스템의 단백질분해 효소에 의해 생체내에서 표적 부위에서 절단되는 링커를 포함하는 면역접합체의 설명을 포함한다. 링커의 길이는 항-CD3 항체 및 이에 연결된 분자 사이의 원하는 공간 관계에 따라 미리 결정되거나 선택될 수 있다. 다양한 방사선 진단 화합물, 방사선 치료 화합물, 약물, 독소, 및 다른 제제를 항체에 부착하기 위해 보고된 많은 방법을 고려하여, 당업자는 주어진 제제를 항-CD3 항체 또는 다른 폴리펩타이드에 부착하는 적합한 방법을 결정할 수 있을 것이다.
"이작용성 중합체"는 공유 또는 비공유 연결을 형성하기 위해 다른 모이어티(비제한적으로, 아미노산 측 기 포함)와 특이적으로 반응할 수 있는 2개의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 특정 생물학적 활성 성분 상의 기와 반응하는 하나의 작용기, 및 제2 생물학적 성분 상의 기와 반응하는 또 다른 기를 갖는 이작용성 링커가 제1 생물학적 활성 성분, 이작용성 링커 및 제2 생물학적 활성 성분을 포함하는 접합체를 형성하는 데 사용될 수 있다. 다양한 화합물을 펩타이드에 부착하기 위한 많은 절차 및 링커 분자가 알려져 있다. 예컨대, 본원에 참고로 포함된 유럽 특허 출원 제188,256호; 미국 특허 제4,671,958호, 제4,659,839호, 제4,414,148호, 제4,699,784호; 제4,680,338호; 제4,569,789호; 및 제4,589,071호를 참고한다. "다작용성 중합체"는 공유 또는 비공유 연결을 형성하기 위해 다른 모이어티(비제한적으로, 아미노산 측 기 포함)와 특이적으로 반응할 수 있는 2개 이상의 별개의 작용기를 포함하는 중합체를 지칭한다. 이작용성 중합체 또는 다작용성 중합체는 임의의 원하는 분자 길이 또는 분자량일 수 있으며, 항-CD3 항체에 연결된 분자 중 하나 사이에 특정한 원하는 간격 또는 입체형태를 제공하도록 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수용성 중합체"는 수성 용매에서 가용성인 임의의 중합체를 지칭한다. 수용성 중합체를 항-CD3 항체에 연결하는 것은, 비제한적으로, 변형되지 않은 형태에 비해 증가되거나 조절된 혈청 반감기, 또는 증가되거나 조절된 치료 반감기, 조절된 면역원성, 조절된 물리적 결합 특징, 예컨대 응집 및 다량체 형성, 변경된 수용체 결합 및 변경된 수용체 이량체화 또는 다량체화를 포함하는 변화를 초래할 수 있다. 수용성 중합체는 그 자체의 생물학적 활성을 갖거나 갖지 않을 수 있고, 비제한적으로 하나 이상의 항-CD3 항체, 또는 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 포함하는 항-CD3 항체를 다른 물질에 부착하기 위한 링커로서 이용될 수 있다. 적합한 중합체는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드, 모노 C1-C10 알콕시 또는 이의 아릴옥시 유도체(본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,252,714호에 기재됨), 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리아미노산, 디비닐에테르 말레익 무수물, N-(2-하이드록시프로필)-메타크릴아미드, 덱스트란, 덱스트란 설페이트를 포함하는 덱스트란 유도체, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 헤파린, 헤파린 단편, 다당류, 올리고당류, 글리칸, 셀룰로오스 및 비제한적으로 메틸셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스 유도체, 전분 및 전분 유도체, 폴리펩타이드, 폴리알킬렌 글리콜 및 이의 유도체, 폴리알킬렌 글리콜의 공중합체 및 이의 유도체, 폴리비닐 에틸 에테르, 및 알파-베타-폴리[(2-하이드록시에틸)-DL-아스파르타미드 등, 또는 이의 혼합물이다. 이러한 수용성 중합체의 예는, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜 및 혈청 알부민을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리알킬렌 글리콜" 또는 "폴리(알켄 글리콜)"은 폴리에틸렌 글리콜(폴리(에틸렌 글리콜)), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리부틸렌 글리콜, 및 이의 유도체를 지칭한다. 용어 "폴리알킬렌 글리콜"은 선형 및 분지형 중합체 및 0.1 kDa 내지 100 kDa의 평균 분자량을 포함한다. 일부 구현예에서, "폴리알킬렌 글리콜" 또는 "폴리(알켄 글리콜)"은 약 또는 5K 내지 50K일 수 있다. 다른 예시적인 구현예가, 예를 들어, Shearwater사의 카달로그 "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications"(2001)와 같은 상업적인 공급업체 카달로그에 열거되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 5 kDa, 10kDa, 20kDa 등의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)은 각각 "5K PEG", "10K PEG", "20K PEG 등"으로서 본원에서 지칭된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조절된 혈청 반감기"는 그의 변형되지 않은 형태에 비해 변형된 항-CD3 항체의 순환 반감기의 양 또는 음의 변화를 의미한다. 혈청 반감기는 항-CD3 항체의 투여 후 다양한 시점에 혈액 샘플을 채취하고 각각의 샘플에서 상기 분자의 농도를 결정함으로써 측정된다. 혈청 농도와 시간과의 상관관계는 혈청 반감기의 계산을 허용한다. 증가된 혈청 반감기는 바람직하게는 적어도 약 2배를 갖지만, 예를 들어 만족스러운 투여 요법을 가능하게 하거나 독성 효과를 피하는 경우 더 작은 증가가 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 증가는 적어도 약 3배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 또는 적어도 약 50배 이상이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "조절된 치료 반감기"는 그의 변형되지 않은 형태에 비해, 항-CD3 항체 또는 변형된 생물학적 활성 분자를 포함하는 항-CD3 항체의 치료적 유효량의 반감기의 양 또는 음의 변화를 의미한다. 치료 반감기는 투여 후 다양한 시점에 분자의 약동학 및/또는 약력학적 특성을 측정함으로써 측정된다. 증가된 치료 반감기는 바람직하게는 특정 유익한 투여 요법, 특정 유익한 총 용량을 가능하게 하거나, 또는 원하지 않는 효과를 피한다. 일부 구현예에서, 증가된 치료 반감기는 증가된 효능, 그의 표적에 대한 변형된 분자의 증가되거나 감소된 결합, 또는 또 다른 매개변수 또는 변형되지 않은 분자의 작용 기전의 증가 또는 감소로부터 비롯된다.
핵산 또는 단백질에 적용될 때 용어 "단리된"은 핵산 또는 단백질이 자연 상태에서 결합된 다른 세포 성분이 실질적으로 없다는 것을 의미한다. 그것은 균질 상태일 수 있다. 단리된 물질은 건조 또는 반건조 상태, 또는 비제한적으로 수성 용액을 포함하는 용액일 수 있다. 순도 및 균질성은 전형적으로 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 분석 화학 기술을 사용하여 결정된다. 제제에 존재하는 우세한 종인 단백질은 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 유전자는 유전자의 측면에 있고 관심 있는 유전자 이외의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. 용어 "정제된"은 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 실질적으로 하나의 밴드를 생성한다는 것을 의미한다. 특히, 핵산 또는 단백질이 적어도 85% 순수하거나, 적어도 90% 순수하거나, 적어도 95% 순수하거나, 적어도 99% 이상 순수한다는 것을 의미한다.
용어 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 또는 리보뉴클레오타이드 및 이의 중합체를 지칭한다. 특별히 제한되지 않는 한, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 자연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 특별히 제한되지 않는 한, 이 용어는 또한 안티센스 기술에 사용되는 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)인 PNA(펩티도핵산)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 유사체를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(비제한적으로, 축퇴성 코돈 치환 포함) 및 상보적 서열 뿐만 아니라 명시적으로 표시된 서열을 내재적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합된 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608, 1985; 및 Cassol et al., 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
용어 "폴리펩타이드," "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩타이드에 대한 설명은 펩타이드의 설명 및 단백질의 설명에 동일하게 적용되며, 그 반대로 마찬가지이다. 이 용어는 자연발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비자연적으로 코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 이 용어는 아미노산 잔기는 공유 펩타이드 결합에 의해 연결된, 전장 단백질(즉, 항원)을 포함하는 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함한다.
용어 "아미노산"은 자연발생 및 비자연발생 아미노산뿐만 아니라 자연발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연적으로 코딩된 아미노산은 20개의 일반적인 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 및 발린) 및 피로리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 자연발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉, 수소, 카르복실기, 아미노기, 및 R기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예컨대, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 백본을 갖지만, 자연발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다.
아미노산은 일반적으로 알려진 세 글자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회에 의해 권고된 한 글자 기호에 의해 본원에서 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드는 이들의 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전적 코드의 축퇴성으로 인해, 많은 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩타이드를 변경하지 않고 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 한 종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩타이드를 코딩하는 본원의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 설명한다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈(일반적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 일반적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG 제외)은 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내재되어 있다.
아미노산 서열과 관련하여, 당업자는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 아미노산의 작은 백분율을 변경, 추가 또는 결실하는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것이며, 여기서 변경은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체가 포함되며, 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자를 배제하지 않는다.
다음 8개의 기 각각은 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글리신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 리신(K); 5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(들), 트레오닌(T); 및 8) 시스테인(C), 메티오닌(M);(예컨대, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties(W H Freeman & Co.; 2nd edition(December 1993) 참고).
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 서열은 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 육안 검사에 의해 측정되는 바와 같이 비교 윈도우, 또는 지정된 영역에 대해 최대 대응을 위해 비교 및 정렬될 때, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 백분율(즉, 특정 영역에 대해 약 60% 동일성, 선택적으로 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 동일성)을 갖는 경우, "실질적으로 동일"하다. 이 정의는 또한 시험 서열의 보체를 지칭한다. 동일성은 적어도 약 50개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이인 영역에 대해, 또는 75-100개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이인 영역에 대해, 또는, 명시되지 않은 경우, 전체 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드에 걸쳐 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 기본 프로그램 매개변수가 사용될 수 있거나, 대체 매개변수가 지정될 수 있다. 이후, 서열 비교 알고리즘은 프로그램 매개변수에 기초하여, 참조 서열 대비 시험 서열에 대한 백분율 서열 동일성을 계산한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "유효량"은 치료되는 질환, 병태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 투여되는 (변형된) 비자연 아미노산 폴리펩타이드의 양을 지칭한다. 본원에 기재된 (변형된) 비자연 아미노산 폴리펩타이드를 함유하는 조성물은 예방, 향상, 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다.
용어 "향상시키다" 또는 "향상"은 원하는 효과의 효능 또는 지속시간을 증가시키거나 연장시키는 것을 의미한다. 따라서, 치료 제제의 효과를 향상시키는 것과 관련하여, 용어 "향상"은 효능 또는 지속시간에서, 시스템 상의 다른 치료제의 효과를 증가시키거나 연장시키는 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 "향상-유효량"은 원하는 시스템에서 또 다른 치료제의 효과를 향상시키는 데 충분한 양을 지칭한다. 환자에서 사용되는 경우, 이 사용에 효과적인 양은 질환, 장애 또는 병태의 중증도 및 경과, 이전 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 의사의 판단에 의존할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "변형된"은 폴리펩타이드의 번역 후 변형의 존재를 지칭한다. 형태 "(변형된)" 용어는 논의되는 폴리펩타이드가 선택적으로 변형된다는 것을 의미하며, 즉, 논의 중인 폴리펩타이드가 변형되거나 변형되지 않을 수 있다는 것을 의미한다.
용어 "번역 후에 변형된" 및 "변형된"은 폴리펩타이드 사슬 내로 혼입된 후 이러한 아미노산 발생하는 자연 또는 비자연 아미노산의 임의의 변형을 지칭한다. 이 용어는, 단지 예로서, 공동번역 생체내 변형, 번역 후 생체내 변형, 및 번역 후 시험관내 변형을 포함한다.
예방적 또는 치료적 적용에서, (변형된) 비자연 아미노산 폴리펩타이드를 함유하는 조성물은 질환, 장애 또는 병태의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키에 충분한 양으로, 질환, 병태 또는 장애를 이미 앓고 있는 환자에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량," 또는 "치료적 유효량"으로 정의되며, 질환, 장애 또는 병태의 중증도 및 경과, 이전의 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료 환자의 판단에 좌우될 것이다. 일상적인 실험(예컨대, 용량 상승 임상 시험)에 의해 이러한 치료적 유효량을 결정하는 것은 당업계의 기술 내에서 널리 고려된다.
용어 "치료"는 예방적 및/또는 치료적 치료를 지칭하기 위해 사용된다.
달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에서 질량 분광법, NMR, HPLC, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 종래의 방법이 사용된다.
상세한 설명
도입
본 발명자들은 수용성 중합체 분자의 부재 또는 존재 하에 생물학적 활성 분자 또는 제제를 포함하는 이중특이적 항체를 개발하였다. 특정 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 PEG 분자의 부재 또는 존재 하에 하나 이상의 폴레이트 분자를 포함하는 항-CD3 항체, 단편 또는 변이체를 포함하는 이중특이적 항체를 제공한다. 하나 이상의 PEG 분자는 단일 또는 이중 PEG, 예를 들어, 단일 또는 이중 5K PEG, 10K PEG, 20K PEG 이상일 수 있다. 하나 이상의 PEG 분자는 선형 또는 분지형일 수 있다. 항-CD3 항체, 단편 또는 변이체는, 비제한적으로, Fab의 중쇄 내에 위치 114, 115, 129, 또는 160(카바트 넘버링에 따름), 그리고 경쇄 내에 위치 157, 172, 205(카바트 넘버링에 따름)를 포함하는, 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 내의 임의의 적합한 위치에, 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들어, 파라-아세틸-페닐알라닌(pAF)을 갖도록 조작된 항-CD3 Fab 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 Fab의 중쇄(K129; 카바트 넘버링) 및 경쇄(L157; 카바트 넘버링) 상에 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들어, 파라-아세틸-페닐알라닌(pAF)을 갖도록 조작된 항-CD3 Fab를 포함할 수 있다. 이중특이적 항체는 Fab의 중쇄(K129; 카바트 넘버링) 및 경쇄(L157; 카바트 넘버링) 상에 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산, 예를 들어, 파라-아세틸-페닐알라닌(pAF)을 갖도록 조작된 항-CD3 Fab로 구성될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 하나 이상의 PEG 분자는 독점적 옥심 화학을 사용하여 항-CD3 항체에 혼입된, 하나 이상의 비자연 아미노산, 예를 들어 pAF에 접합된 하나 이상의 폴레이트 분자에 접합되거나 연결되어, 예를 들어 항-CD3 Fab에 안정하게 접합된 1개 또는 2개의 PEG 및/또는 폴레이트 분자를 생성할 수 있다. 하나 이상의 PEG 분자, 예를 들어 5K, 10K, 또는 20K PEG의 부가는 시험관내 및 생체내 모두에서 FOLR1 발현 세포에 대해 특이적인 세포독성을 유지하면서, 이중특이적 항체의 약동학 특성의 유의한 개선을 제공한다. 전-종양형성 대식세포(M2) 및 MDSC 세포는 본원에 개시된 페길화된 항-CD3 Fab-폴레이트 조성물이 우선적으로 고갈되는 것으로 관찰되었다. 이 결과는 개선된 약동학 특성이 덜 빈번한 투여를 요구하고, 주입 펌프를 사용하는 투여를 제거할 수 있음을 시사한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "PEG-폴레이트" 또는 "폴레이트-PEG" 및 "BiPEG-바이폴레이트" 또는 "바이폴레이트-BiPEG"는 상호교환적으로 사용된다.
항체, 항체 단편 및 이의 변이체
본 발명의 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 인간, 인간화된, 조작된, 비-인간, 및/또는 키메라 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 본원에 제공된 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 2개 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 제1 아미노산 서열은 제1 항체 사슬을 포함할 수 있고, 제2 아미노산 서열은 제2 항체 사슬을 포함할 수 있다. 제1 항체 사슬은 제1 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2 항체 사슬은 제2 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체의 사슬은 항체 중쇄, 항체 경쇄, 또는 항체 중쇄의 영역 또는 모두 및 항체 경쇄의 영역 또는 모두의 조합을 지칭할 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 제공된 항체는 중쇄 또는 이의 단편 또는 변이체, 및 경쇄 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 2개의 항체 사슬을 포함하는 항체의 2개의 아미노산 서열은, 하나 이상의 디설파이드 결합, 화학적 링커, 펩타이드 링커, 또는 이의 조합에 의해 연결될 수 있다. 화학적 링커는 비자연 아미노산을 통한 링커를 포함한다. 화학적 링커는 하나 이상의 비자연 아미노산을 통한 링커를 포함한다. 화학적 링커는 화학적 접합체를 포함할 수 있다. 펩타이드 링커는 2개의 아미노산 서열을 연결하는 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 펩타이드 링커는 1개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상, 55개 이상, 60개 이상, 65개 이상, 70개 이상, 75개 이상, 80개 이상, 85개 이상, 90개 이상, 95개 이상, 100개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 링커는 항체의 도메인, 예컨대 가변 도메인, CH1, CH2, CH3, 및/또는 CL 도메인을 포함하는 임의의 항체의 일부일 수 있다. 일부 구현예에서, 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어, 펩타이드 링커를 통해, 연결된다. 일부 경우, 중쇄 및 경쇄는, 예를 들어, 하나 이상의 디설파이드 결합에 의해 연결된다.
본 발명 개시내용의 항체, 항체 단편 및 항체 변이체는 효과기 세포 상의 항원과 상호작용하거나 결합할 수 있다. 효과기 세포는, 비제한적으로, 면역 세포, 증가 또는 감소된 세포독성 활성을 갖는 유전적으로 변형된 세포, 숙주 방어 메커니즘에 관여하는 세포, 항염증성 세포, 백혈구, 림프구, 대식세포, 적혈구, 혈소판, 호중구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 대식 세포, NK 세포, B-세포, 또는 T-세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포 또는 자연 살해 T 세포일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 T-세포 상의 수용체, 예컨대, 비제한적으로 T-세포 수용체(TCR)와 상호작용할 수 있다. TCR은 TCR 알파, TCR 베타, TCR 감마, 및/또는 TCR 델타 또는 TCR 제타를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편은 림프구, 수지상 세포, B-세포, 대식세포, 단핵구, 호중구 및/또는 NK 세포 상의 수용체에 결합할 수 있다. 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편은 세포 표면 수용체에 결합할 수 있다. 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편은 폴레이트 수용체에 결합할 수 있다. 본 개시내용의 항체 또는 항체 단편은 T-세포 표면 항원, 예를 들어, 비제한적으로 2-[3-(1,3-디카르복시 프로필)-우레이도]펜탄디오산(DUPA) 또는 이의 유사체 또는 유도체에 접합될 수 있다. 예를 들어, 각각 그 전체가 참조로 본원에 포함된 미국 특허 제6,479,470호; WO제2017/136659호 및 WO제2014/153164호를 참고한다.
특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체 또는 항체 단편은 항-CD3 항체 또는 이의 항체 단편 또는 변이체이다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항-CD3 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 인간화될 수 있다. 본원에 개시된 항-CD3 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는, 비제한적으로, CD3 유사체, 아이소타입, 모방체, 단편, 또는 하이브리드를 포함한다. 본 발명의 항-CD3 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 비제한적으로 Fv, Fc, Fab, 및(Fab')2, 단일 사슬 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이작용성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합, 가변 영역, 프레임워크 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄, 대체 스캐폴드 비항체 분자, 이중특이적 항체 등을 포함한다. 본 발명의 항-CD3 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 서열번호: 1 내지 62의 서열을 포함한다. 본 발명의 항체, 단편 또는 변이체는 항-CD3 Fab 항체, 단편 또는 변이체일 수 있다. 본 발명의 항체, 단편 또는 변이체는 하나 이상의 항-CD3 Fab를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체, 단편 또는 변이체는 2개의 항-CD3 Fab를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 1 내지 62의 서열로부터 선택된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 1 내지 62의 서열로부터 선택된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열로 구성된다. 특정 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나의 중쇄 아미노산 서열; 및 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.
비자연 아미노산을 포함하는 항-CD3 이중특이적 항체가 또한 본원에 개시되어 있다. 특정 구현예에서, 항-CD3 이중특이적 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 비제한적으로 Fv, Fc, Fab, 및(Fab')2, 단일 사슬 Fv(scFv), 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이작용성 하이브리드 항체, CDR1, CDR2, CDR3, CDR의 조합, 가변 영역, 프레임워크 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄, 대체 스캐폴드 비항체 분자, 이중특이적 항체 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 이중특이적 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 Fab 이중특이적 항체, 단편, 또는 변이체이다. 본 발명의 항-CD3 Fab 이중특이적 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 서열번호: 1 내지 62 중 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체, 단편 또는 변이체는 항-CD3 Fab 항체, 단편 또는 변이체일 수 있다. 항-CD3 이중특이적 항체는 서열번호: 1 내지 62의 서열로부터 선택된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체는 서열번호: 1 내지 62의 서열로부터 선택된 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열로 구성된다. 특정 구현예에서, 항-CD3 이중특이적 항체는 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나의 중쇄 아미노산 서열; 및 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나의 경쇄 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 이중특이적 항체, 단편 또는 변이체는 CD3에 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체, 단편 또는 변이체는 종간 반응성일 수 있다. 이중특이적 항체, 단편 또는 변이체는 인간 및 원숭이 항원과 종간 반응성일 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 종간 반응성 CDR을 포함한다. 이중특이적 항체는 인간화된 항체일 수 있다.
표 1: 중쇄 및 경쇄 내에 밑줄이 그어진 비자연 아미노산 pAF 혼입의 위치와 함께 HC-DKTHT 연장을 갖거나 갖지 않는 인간화된 항-CD3 변이체의 신규한 아미노산 서열. 하기 표 내의 모든 서열이 또한 개시되어 있고, 여기서 pAF는 임의의 다른 비자연 아미노산에 의해 대체된다
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비자연 아미노산
본 발명은 적어도 하나의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체, 항체 단편 또는 변이체를 제공한다. 적어도 하나의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 항-CD3 항체에 도입하는 것은 일반적으로 발생하는 20개의 아미노산과 반응하지 않으면서 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산과의 특정 화학 반응을 수반하는 접합 화학의 적용을 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체가 본원에 개시된다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 20개의 자연 아미노산 중 하나를 코딩하지 않는 코돈에 의해 코딩될 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 넌센스 코돈(정지 코돈)에 의해 코딩될 수 있다. 정지 코돈은 앰버 코돈(amber codon)일 수 있다. 앰버 코돈은 UAG 서열을 포함할 수 있다. 정지 코돈은 오커 코돈(ochre codon)일 수 있다. 오커 코돈은 UAA 서열을 포함할 수 있다. 정지 코돈은 오팔(opal) 또는 엄버 코돈(umber codon)일 수 있다. 오팔 또는 엄버 코돈은 UGA 서열을 포함할 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 4-염기 코돈에 의해 코딩될 수 있다.
하나 이상의 비자연 아미노산은, 비제한적으로, p-아지도페닐알라닌(pAz), p-벤조일페닐알라닌(pBpF), p-프로파르길옥시페닐알라닌(pPrF), p-아이오도페닐알라닌(pIF), p-시아노페닐알라닌(pCNF), p-카르복실메틸페닐알라닌(pCmF), 3-(2-나프틸)알라닌(NapA), p-보로노페닐알라닌(pBoF), o-니트로페닐알라닌(oNiF),(8-하이드록시퀴놀린-3-일)알라닌(HQA), 및 (2,2'-바이피리딘-5-일)알라닌(BipyA)을 포함할 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 β-아미노산(β3 및 β2), 호모-아미노산, 프롤린 및 피루브산 유도체, 3-치환된 알라닌 유도체, 글리신 유도체, 고리-치환된 페닐알라닌 및 티로신 유도체, 선형 코어 아미노산, 디아미노산, D-아미노산, N-메틸 아미노산, 또는 이의 조합일 수 있다. 비자연 아미노산은 또한, 비제한적으로, 1) 다양한 치환된 티로신 및 페닐알라닌 유사체, 예컨대 O-메틸-L-티로신, p-아미노-L-페닐알라닌, 3-니트로-L-티로신, p-니트로-L-페닐알라닌, m-메톡시-L-페닐알라닌 및 p-이소프로필-L-페닐알라닌; 2) 광 가교될 수 있는 아릴 아지드 및 벤조페논 기를 갖는 아미노산; 3) 아세틸-L-페닐알라닌 및 m-아세틸-L-페닐알라닌, O-알릴-L-티로신, O-(2-프로피닐)-L-티로신, p-에틸티오카르보닐-L-페닐알라닌 및 p-(3-옥소부타노일)-L-페닐알라닌을 포함하는, 고유한 화학적 반응성을 갖는 아미노산; 4) p-아이오도 및 p-브로모-L-페닐알라닌을 포함하는 X선 결정학에서 페이징(phasing)을 위한 중-원자-함유 아미노산; 5) 산화환원-활성 아미노산 디하이드록시-L-페닐알라닌; 6) b-N-아세틸글로코사민-O-세린 및 a-N-아세틸갈락토사민-O-트레오닌을 포함하는 글리코실화된 아미노산; 7) 나프틸, 단실, 및 7-아미노쿠마린 측쇄를 갖는 형광 아미노산; 8) 아조벤젠 및 니트로벤질 Cys, Ser, 및 Tyr 측쇄를 갖는 광절단가능하고 광이성질체화가능한 아미노산; 9) 포스포티로신 모방체 p-카르복시메틸-L-페닐알라닌; 10) 글루타민 동족체 호모글루타민; 및 11) 2-아미노옥타노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비자연 아미노산은 N-아세틸글루코사미닐-L-세린, N-아세틸글루코사미닐-L-트레오닌, 및 O-포스포티로신이다. 일부 구현예에서, 비자연 아미노산은 당류 모이어티를 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 N-아세틸-L-글루코사미닐-L-세린, N-아세틸-L-갈락토사미닐-L-세린, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-트레오닌, N-아세틸-L-글루코사미닐-L-아스파라긴 및 O-만노사미닐-L-세린을 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 또한 아미노산 및 당류 사이의 자연발생 N- 또는 O-연결이 자연에서 일반적으로 발견되지 않는 공유 연결로 대체되는 예를 포함하고, 이는 비제한적으로, 알켄, 옥심, 티오에테르, 아미드 등을 포함한다. 이러한 아미노산의 예는 또한 2-데옥시-글루코스, 2-데옥시갈락토스 등과 같은 자연발생 단백질에서 일반적으로 발견되지 않는 당류를 포함한다. 비자연 아미노산의 특정 예는, 비제한적으로, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-프로파르길옥시페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-아이오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 및 이소프로필-L-페닐알라닌 등을 포함한다. 추가의 비자연 아미노산은 문헌[Liu et al., Annu Rev Biochem, 79:413-44, 2010; Wang et al., Angew Chem Int Ed, 44:34-66, 2005; 및 국제 출원 번호: PCT/US2012/039472, PCT/US2012/039468, PCT/US2007/088009, PCT/US2009/058668, PCT/US2007/089142, PCT/US2007/088011, PCT/US2007/001485, PCT/US2006/049397, PCT/US2006/047822 및 PCT/US2006/044682]에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 저체가 참조로 본원에 포함도어 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 비자연 아미노산은 p-아세틸페닐알라닌(pAF)일 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 비자연 아미노산을 갖는 항-CD3 항체는 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함한다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 번역 후 변형은 특정 반응기에 적합한 것으로 당업자에게 알려진 화학 반응을 이용하여 제1 반응기를 포함하는 적어도 하나의 비자연 아미노산에 대한 제2 반응기를 포함하는, 비제한적으로, 수용성 중합체, 폴리에틸렌 글리콜의 유도체, 약물, 제2 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유사체, 항체 또는 항체 단편, 생물학적 활성제, 소분자, 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합을 포함하는 분자의 부착을 포함한다. 예를 들어, 제1 반응기는 알키닐 모이어티(비제한적으로, 비자연 아미노산 p-프로파르길옥시페닐알라닌 포함, 여기서 프로파르길기는 때때로 아세틸렌 모이어티로도 지칭됨)이고, 제2 반응기는 아지도 모이어티이며, [3+2] 사이클로부가 화학 방법이 이용된다. 또 다른 예에서, 제1 반응기는 아지도 모이어티(비제한적으로, 비자연 아미노산 p-아지도-L-페닐알라닌 포함)이고, 제2 반응기는 알키닐 모이어티이다. 본 발명의 변형된 항-CD3 항체 폴리펩타이드의 특정 구현예에서에서, 적어도 하나의 번역 후 변형을 포함하는 적어도 하나의 비자연 아미노산(비제한적으로, 케토 작용기를 함유하는 비자연 아미노산 포함)이 사용되며, 여기서 적어도 하나의 번역 후 변형은 당류 모이어티를 포함한다. 특정 구현예에서, 번역 후 변형은 진핵생물 세포 또는 비진핵생물 세포에서 생체내에서 이루어진다. 다른 구현예에서, 번역 후 변형은 시험관내에서 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 번역 후 변형은 시험관내 및 생체내에서 이루어진다.
일부 구현예에서, 비자연 아미노산은 화학기를 혼입하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 비자연 아미노산은 케톤기를 혼입하도록 변형될 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 적어도 하나의 옥심, 카르보닐, 디카르보닐, 하이드록실아민기 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 적어도 하나의 카르보닐, 디카르보닐, 알콕시-아민, 하이드라진, 아사이클릭 알켄, 아사이클릭 알킨, 사이클로옥틴, 아릴/알킬 아지드, 노르넨, 사이클로프로펜, 트랜스-사이클로옥텐, 또는 테트라진 작용기 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 일부 구현예에서, 비자연 아미노산은 항체, 항체 단편 또는 변이체 내로 부위 특이적으로 혼입된다. 일부 구현예에서, 비자연 아미노산은 항-CD3 항체, 항체 단편 또는 변이체 내로 부위 특이적으로 혼입된다. 분자, 예를 들어, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드 내로 비자연 아미노산을 혼입시키는 방법은, 미국 특허 제7,332,571호; 제7,928,163호; 제7,696,312호; 제8,008,456호; 제8,048,988호; 제8,809,511호; 제8,859,802호; 제8,791,231호; 제8,476,411호; 또는 제9,637,411호(이들 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함됨), 및 본원의 실시예에 개시되어 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 당업계에 공지된 방법에 의해 혼입될 수 있다. 예를 들어, 세포 기반 또는 무세포 시스템이 사용될 수 있고, 또한 조작된 tRNA 및 합성효소 대신에 영양요구성 균주가 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 직교 tRNA 합성효소는 예를 들어, 제PCT/US2002/012465호; 제PCT/US2002/012635호; 제PCT/US2003/032576호; 제PCT/US2005/044041호; 제PCT/US2005/043603호; 제PCT/US2005/046618호에 개시된 바와 같이 사용되며, 각각은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산을 항체 또는 항체 단편 또는 변이체 내로 혼입시키는 것은 항체 또는 항체 단편 또는 변이체에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시키는 것을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편 또는 변이체에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시키는 것은 항체 또는 항체 단편 또는 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오타이드를 돌연변이시키는 것을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편 또는 변이체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오타이드를 돌연변이시키는 것은 아미노산을 코딩하는 코돈을 넌센스 코돈으로 변경하는 것을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편 또는 변이체 내로 하나 이상의 비자연 아미노산을 혼입시키는 것은 항체 또는 항체 단편 또는 변이체에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시켜 항체 또는 항체 단편 또는 변이체에서 하나 이상의 앰버 코돈을 생산하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 앰버 코돈에 반응하여 항체 또는 항체 단편 또는 변이체 내로 혼입될 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 항체 또는 항체 단편 또는 변이체 내로 부위 특이적으로 혼입될 수 있다. 항체 또는 항체 단편 또는 변이체 내로 하나 이상의 비자연 아미노산을 혼입시키는 것은 생물학적 활성 분자 또는 표적화 제제를 부위 특이적으로 변형시키기 위해 표준 20개의 아미노산에 대해 직교 화학 반응성을 갖는 하나 이상의 유전적으로 코딩된 비자연 아미노산을 포함할 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산을 혼입시키는 것은 하나 이상의 앰버 넌센스 코돈에 대한 반응으로 생물학적 활성 분자 또는 표적화제 내의 정의된 부위에 하나 이상의 비자연 아미노산을 부위 특이적으로 혼입시키기 위해 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 쌍을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 비자연 아미노산을 혼입시키기 위한 추가의 방법은, 비제한적으로, 문헌[Chatterjee et al., A Versatile Platform for Single- and Multiple-Unnatural Amino Acid Mutagenesis in Escherichia coli, Biochemistry, 2013; Kazane et al.,J Am Chem Soc, 135(1):340-6, 2013; Kim et al., J Am Chem Soc, 134(24):9918-21, 2012; Johnson et al., Nat Chem Biol, 7(11):779-86, 2011; 및 Hutchins et al., J Mol Biol, 406(4):595-603, 2011]에 개시된 방법을 포함한다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 하나 이상의 자연 아미노산의 선택적 반응을 통해 생산될 수 있다. 선택적 반응은 하나 이상의 효소에 의해 매개될 수 있다. 비제한적인 예에서, 하나 이상의 시스테인과 포르밀글리신 생성 효소(FGE)와의 선택적 반응은 문헌[Rabuka et al., Nature Protocols 7: 1052-1067, 2012]에 기재된 바와 같이 하나 이상의 프로밀글리신을 생산할 수 있다. 하나 이상의 비자연 아미노산은 링커를 형성하는 화학 반응을 수반할 수 있다. 링커를 형성하는 화학 반응은 생물직교 반응을 포함할 수 있다. 링커를 형성하는 화학 반응은 클릭 화학을 포함할 수 있다. 예를 들어 그 전체가 참조로 본원에 포함된 WO제2006/050262호를 참조한다.
생물학적 활성 분자/제제
비자연 아미노산을 통해 항체 또는 단편 또는 변이체에 연결된 생물학적 활성 분자를 포함하는 항-CD3 항체 또는 이의 항체 단편 또는 변이체가 본원에 개시된다. 생물학적 활성 분자는 비제한적으로 소분자 또는 제제, 비펩타이드 화합물, 약물, 제2 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 유사체 또는 유도체, 항체 또는 항체 단편 또는 변이체, 제2 생물학적 활성제, 표적화제, 또는 상기 또는 임의의 다른 바람직한 화합물 또는 물질의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 활성제는 세포독성 T 세포를 비제한적으로 암 또는 종양 세포를 포함하는 세포로 모집하는 데 관여한다. 일부 구현예에서, 생물학적 활성 분자는, 비제한적으로, 폴산 또는 이의 유도체 또는 유사체 또는 2-[3-(1,3-디카르복시프로피)우레이돌] 펜탄디오산(DUPA) 또는 이의 유도체 또는 유사체와 같은 소분자이다. 일부 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 폴레이트 또는 이의 유도체 또는 유사체이다. 생물학적 활성 분자는 세포-표적화 분자, 리간드, 단백질, 펩타이드, 펩토이드, DNA 앱타머, 펩타이드 핵산, 비타민, 기질 또는 기질 유사체, 콜레시스토키닌 B 수용체, 고나도트로핀 방출 호르몬 수용체, 소마토스타틴 수용체 2, avb3 인테그린, 가스트린 방출 펩타이드 수용체, 뉴로키닌 1 수용체, 멜라노코르틴 1 수용체, 뉴로텐신 수용체, 뉴로펩타이드 Y 수용체 및 C-유형 렉틴 유사 분자 1, 수용체, 공동-수용체, 막횡단 단백질 또는 세포 마커 또는 세포 표면 단백질로부터 선택될 수 있다. 생물학적 활성 분자는 표적 세포에 결합할 수 있다. 생물학적 활성 분자는 세포 상의 세포 표면 단백질 또는 세포 표면 마커 또는 세포 표면 분자에 결합할 수 있다. 생물학적 활성 분자는 비제한적으로 암 또는 종양 세포 또는 면역 억제 세포를 포함하는 세포 상의 세포 표면 분자에 결합할 수 있다. 세포 표면 분자는 폴레이트 수용체 분자일 수 있다. 생물학적 활성 분자는, 비제한적으로, DUPA 또는 이의 유사체 또는 유도체와 같은 전립선-특이적 막 항원(PSMA)에 결합하는 제제일 수 있다. 생물학적 활성 분자 또는 제제는 세포 표면 마커, 단백질 또는 수용체를 과발현하거나 고도로 발현하는 세포에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 생물학적 활성 분자는 폴레이트 또는 폴레이트 리간드 또는 이의 유사체 또는 유도체일 수 있다. 생물학적 활성 분자는 폴레이트 수용체 단백질(FR)에 결합할 수 있다. 이러한 생물학적 활성 분자는 N-(4-{[(2-아미노-4-옥소-1,4-디하이드롭테리딘-6-일)메틸]아미노}벤조일)-L-글루탐산(폴산), 또는 이의 유사체 또는 유도체일 수 있다. 이의 유사체는 폴산에 기초하고 FR 결합을 보존하는 모이어티일 수 있다. 폴산 유사체는 폴산의 구조의 중요한 부분을 보존할 수 있다. 더욱이, 폴산 유사체는 링커 또는 항체 또는 항체 단편 또는 변이체에 대한 접합 때문에 약간 변형된 형태일 수 있다. 예를 들어, 폴산 유사체는 링커 또는 항체 또는 항체 단편 또는 변이체에 대한 폴레이트 카르복실기의 접합으로 인해 약간 변형될 수 있다. 또한, 폴산은 링커 또는 항체 또는 항체 단편에 대한 접합 때문에 약간 변형될 수 있지만 그의 FR 결합 특성을 유지할 수 있다. 일부 구현예에서, 폴레이트 분자는 폴레이트 수용체 알파를 표적화한다. 일부 구현예에서, 폴레이트 분자는 폴레이트 수용체 베타를 표적화한다. 일부 구현예에서, 폴산 또는 폴레이트는 FR+ 세포주 상에 과발현되거나 고도로 발현되는 폴레이트 수용체(FR) 항원에 결합하기 위한 생물학적 활성 분자 또는 표적화제로서 사용된다. 일부 구현예에서, 세포는 암 세포 또는 면역 억제 세포이지만, 이에 제한되지 않는다.
생물학적 활성 분자 또는 제제는 하나 이상의 링커에 의해 항체 또는 항체 단편 또는 변이체의 하나 이상의 비자연 아미노산에 부위 특이적으로 연결될 수 있다. 링커는 화학적 링커, 펩타이드 링커, 또는 이의 조합일 수 있다. 화학적 링커는 비자연 아미노산을 통한 링커를 포함한다. 화학적 링커는 하나 이상의 비자연 아미노산을 통한 링커를 포함한다. 화학적 링커는 화학적 접합체를 포함한다. 펩타이드 링커는 2개의 아미노산 서열을 연결하는 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 펩타이드 링커는 1개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상, 55개 이상, 60개 이상, 65개 이상, 70개 이상, 75개 이상, 80개 이상, 85개 이상, 90개 이상, 95개 이상, 100개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드 링커는 항체의 도메인, 예컨대 가변 도메인, CH1, CH2, CH3, 및/또는 CL 도메인을 포함하는 임의의 항체의 일부일 수 있다. 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 생물학적 활성 분자에 접합될 수 있다. 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 화학적 및/또는 펩타이드 링커를 통해 생물학적 활성 분자에 접합될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 생물학적 활성 분자 또는 제제에 접합된 항-CD3 항체 또는 항체 단편 또는 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 생물학적 활성 분자 또는 제제는 하나 이상의 소분자이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 소분자에 접합된 항-CD3 Fab 항체 또는 항체 단편 또는 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 폴레이트 분자에 접합된 항-CD3 Fab 항체 또는 항체 단편 또는 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 DUPA 분자에 접합된 항-CD3 Fab 항체 또는 항체 단편 또는 변이체를 제공한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 폴레이트 분자 및/또는 하나 이상의 DUPA 분자는 화학적 및/또는 펩타이드 링커를 통해 항-CD Fab 항체에 접합될 수 있다.
PEG 링커/리간드/접합체
항-CD3 항체 또는 항원-결합 폴리펩타이드 및 소분자는 링커, 중합체 또는 공유 결합에 의해 연결될 수 있다. 링커, 중합체, 또는 소분자 자체는 20개의 일반적인 아미노산에 대해 반응하지 않는 작용기를 포함할 수 있다. 링커 또는 중합체는 이작용성 링커 또는 중합체일 수 있다. 이작용성 링커 또는 중합체는 분지형 링커 또는 중합체이다. 링커, 중합체, 또는 공유 결합을 통해 항-CD3 항체 또는 항원-결합 폴리펩타이드를 생물학적 활성 분자에 결합하는 데 관여하는 하나 이상의 결합은 원하는 조건 하에 비가역적, 가역적 또는 불안정할 수 있다. 링커, 중합체, 또는 공유 결합을 통해 항-CD3 항체 또는 항원-결합 폴리펩타이드를 분자에 연결하는 데 관여하는 하나 이상의 결합은 항원-결합 폴리펩타이드 또는 다른 분자의 조절된 방출을 허용할 수 있다. 다양한 소분자는 화학적 수단, 천연 생성물로서의 단리, 또는 다른 수단에 의해 당업자에 의해 생성될 수 있다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자 또는 리간드와 같은 하나 이상의 수용성 중합체에 연결된 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체 또는 항체 단편 또는 변이체가 본원에 개시된다. 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 2개의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자 또는 리간드와 같은 2개의 수용성 중합체에 연결될 수 있다. 비자연적으로 코딩된 아미노산 및 하나 이상의 생물학적 활성 분자를 포함하는 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 하나 이상의 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자 또는 링커에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산 및 2개의 생물학적 활성 분자를 포함하는 항체 또는 항체 단편 또는 변이체는 2개의 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자 또는 링커에 연결된다.
방법은 항체 또는 항체 단편을 생물학적 활성 분자, 또는 수용성 중합체, 또는 생물학적 활성 분자 및 수용성 중합체를 포함하는 접합체에 연결하는 것을 포함할 수 있다. 방법은 하나 이상의 링커를 생물학적 활성 분자에 접합시켜 생물학적 활성 분자-링커 중간체를 생산하는 단계 및 중간체를 항체 또는 항체 단편에 접합시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 하나 이상의 링커를 PEG 분자에 접합시켜 PEG-링커 중간체를 생산하는 단계 및 PEG-링커-중간체를 항체 또는 항체 단편에 접합시키는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편에 접합시켜 항체-링커 중간체 또는 항체 단편-링커 중간체를 생산하는 단계 및 항체-링커 중간체 또는 항체-단편-링커 중간체를 또 다른 생물학적 활성 분자, 또는 수용성 중합체, 또는 생물학적 활성 분자 및 수용성 중합체를 포함하는 중합체에 접합시키는 단계를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 방법은 하나 이상의 링커를 하나 이상의 항체 또는 항체 단편, 하나 이상의 생물학적 활성 분자, 또는 이의 조합에 접합시켜 하나 이상의 중간체, 예컨대 항체-링커 중간체, 항체 단편-링커 중간체 및/또는 생물학적 활성 분자 항체 접합체-링커 중간체를 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 제1 링커를 항체 또는 항체 단편에 접합시켜 항체-링커 중간체 또는 항체 단편-링커 중간체를 생산하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 링커를 생물학적 활성 분자에 접합시켜 생물학적 활성 분자-링커 중간체를 생산하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 이중특이적 항-CD3 항체 접합체를 생산하는 방법은 (a) 제1 링커를 항체 또는 항체 단편 내로 혼입된 하나 이상의 비자연 아미노산을 포함하는 항체 또는 항체 단편에 접합시키는 단계; (b) 제2 링커를 생물학적 활성 분자에 접합시켜 생물학적 활성 분자-링커 중간체를 생산하는 단계; 및 (c) 2개의 중간체를 함께 연결하여 항-CD3 항체-생물학적 활성 분자 접합체를 생산하는 단계를 포함할 수 있고; 생물학적 활성 분자는 비제한적으로 폴레이트 또는 DUPA 분자 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 소분자일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항-CD3 항체 접합체를 생산하는 방법은 (a) 제1 링커를 항체 또는 항체 단편 내로 혼입된 하나 이상의 비자연 아미노산을 포함하는 항체 또는 항체 단편에 접합시켜 항체-링커 중간체 또는 항체 단편-링커 중간체를 생산하는 단계; (b) 제2 링커를 생물학적 활성 분자에 접합시켜 생물학적 활성 분자-링커 중간체를 생산하는 단계; 및 (c) 2개의 중간체를 함께 연결하여 항-CD3 항체-생물학적 활성 분자 접합체를 생산하는 단계를 포함할 수 있고; 생물학적 활성 분자는 비제한적으로 폴레이트 또는 DUPA 분자 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 소분자일 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항-CD3 Fab 항체-폴레이트 접합체를 생산하는 방법은 (a) 제1 링커를 항체 또는 항체 단편 내로 혼입된 하나 이상의 비자연 아미노산을 포함하는 항-CD3 Fab 항체 또는 항체 단편에 접합시켜 항체-링커 중간체 또는 항체 단편-링커 중간체를 생산하는 단계; (b) 제2 링커를 생물학적 활성 분자에 접합시켜 생물학적 활성 분자-링커 중간체를 생산하는 단계; 및 (c) 2개의 중간체를 함께 연결하여 항-CD3 Fab 항체-생물학적 활성 분자 접합체를 생산하는 단계를 포함할 수 있고; 생물학적 활성 분자는 하나 이상의 폴레이트 또는 DUPA 분자 또는 유사체 또는 유도체를 포함하고; 링커는 하나 이상의 화학적 및/또는 펩타이드 링커를 포함하며; 링커는 하나 이상의 PEG 분자를 포함한다. 하나 이상의 PEG 분자는 선형 또는 분지형 PEG 분자이다. 하나 이상의 분지형 PEG 분자는 이작용성 링커이다. PEG 분자는 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa 이상의 평균 분자량을 갖는다. PEG 분자는 5K, 10K 또는 20K의 평균 분자량을 갖는다.
하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편, 또는 생물학적 활성 분자에 접합시키는 것은 동시에 발생할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편, 또는 생물학적 활성 분자에 접합시키는 것은 순차적으로 발생할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편, 또는 생물학적 활성 분자에 접합시키는 것은 효소적 접합, 또는 화학적 단계, 또는 과정 또는 반응과 같은 단일 단계 과정에서 발생할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편, 또는 생물학적 활성 분자에 접합시키는 것은 2개의 효소적 접합, 또는 2개의 화학적 단계, 또는 2개의 공정 또는 2개의 반응과 같은 2개의 단계 과정에서 발생할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편, 또는 생물학적 활성 분자에 접합시키는 것은 2개 이상의 효소적 접합, 또는 화학적 단계, 또는 공정 또는 반응과 같은 2개 이상의 단계 과정에서 발생할 수 있다.
중간체를 항체 또는 항체 단편, 또는 생물학적 활성 분자, 또는 수용성 중합체에 접합시키는 것은 당업자에게 널리 알려진 바와 같이, 옥심 결합을 형성하기 위한 옥심 화학 및/또는 클릭 화학을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 비자연 아미노산을 포함할 수 있다. 항체 또는 항체 단편을 중간체에 연결하는 것은 비자연 아미노산 및 링커 중간체 사이에 옥심을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 링커를 항체 또는 항체 단편, 또는 생물학적 활성 분자 또는 수용성 분자에 접합시키는 것은 링커 및 항체 또는 항체 단편, 또는 생물학적 활성 분자 또는 수용성 분자 사이의 이온 결합, 공유 결합, 비공유 결합, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 링커를 항체 또는 항체 단편 또는 생물학적 활성 분자 또는 수용성 분자에 접합시키는 것은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어 문헌[Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476(2002)]을 참고한다.
하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편 및/또는 생물학적 활성 분자에 접합시키는 것은 링커 및 항체 또는 항체 단편 또는 생물학적 활성 분자 사이에 하나 이상의 옥심을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편 및/또는 생물학적 활성 분자에 접합시키는 것은 링커 및 항체 또는 항체 단편 또는 생물학적 활성 분자 사이에 하나 이상의 안정한 결합을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편 및/또는 생물학적 활성 분자에 접합시키는 것은 링커 및 항체 또는 항체 단편 또는 생물학적 활성 분자 사이에 하나 이상의 공유 결합을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편 및/또는 생물학적 활성 분자에 접합시키는 것은 링커 및 항체, 항체 단편 또는 생물학적 활성 분자 사이에 하나 이상의 비공유 결합을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편 및/또는 리간드에 접합시키는 것은 링커 및 항체 또는 항체 단편 또는 생물학적 활성 분자 사이에 하나 이상의 이온 결합을 형성하는 것을 포함할 수 있다.
하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편에 접합시키는 것은 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편에 부위 특이적으로 접합시키는 것을 포함할 수 있다. 부위 특이적 접합은 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편의 비자연 아미노산에 연결하는 것을 포함할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편의 비자연 아미노산에 연결하는 것은 옥심의 형성을 포함할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편의 비자연 아미노산에 연결하는 것은 설파이드의 형성을 포함할 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편의 비자연 아미노산에 연결하는 것은, 비제한적인 예로서, 하나 이상의 링커의 하이드록실아민을 아미노산의 알데히드 또는 케톤과 반응시키는 것을 포함할 수 있다. 아미노산은 비자연 아미노산일 수 있다. 하나 이상의 링커를 항체 또는 항체 단편의 비자연 아미노산에 연결하는 것은, 비제한적인 예로서, 하나 이상의 링커의 브로모 유도체를 아미노산의 티올과 반응시키는 것을 포함할 수 있다. 아미노산은 비자연 아미노산일 수 있다.
하나 이상의 PEG 또는 링커는 당업자에 의해 공지된 바와 같은 접합 화학을 사용하여 2개의 시스테인 잔기를 연결하는 디설파이드 다리를 포함할 수 있다(또한, 예를 들어 ThioBridge™ technology, Abzena 참조). 2개 이상의 PEG 분자 또는 링커는 2개의 아미노산 잔기를 연결하는 말레이미드 다리를 포함할 수 있다. 2개의 아미노산은 항체 또는 항체 단편의 C-말단에 있을 수 있다. 하나 이상의 링커는 2개의 시스테인 잔기를 연결하는 말레이미드 다리를 포함할 수 있다. 2개의 시스테인 잔기는 항체 또는 항체 단편의 C-말단일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 PEG는 C-말단 PEG 접합일 수 있다. 일부 구현예에서, C-말단 PEG 분자는 중쇄 및 경쇄 항체 또는 항체 단편 사이에 공유 디설파이드 연결 또는 부착을 포함하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 C-말단 위치된 PEG 분자는 항체 또는 항체 단편의 중쇄 및 경쇄 사이에 공유 부착되거나 가교될 수 있다. 이러한 PEG 접합체 또는 링커는 본원에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴레이트 및 하나 이상의 PEG 분자를 포함하는 폴레이트-PEG 링커가 본원에 개시된다. 하나 이상의 PEG 분자는 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa 이상일 수 있다. PEG 분자는 선형 및 분지형 중합체 및 0.1 kDa 내지 100 kDa의 평균 분자량을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자 또는 링커는 약 0.1 kDa 내지 약 100 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자 또는 링커는 0.1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자 또는 링커는 분지형 중합체 또는 링커이다. 일부 구현예에서, 폴리(에틸렌 글리콜) 분지형 중합체 또는 링커의 각각의 분지는 1 kDa 내지 100 kDa, 또는 1 kDa 내지 50 kDa의 분자량을 갖는다. PEG 분자는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Shearwater Corporation's catalog "Polyethylen Glycol and Derivatives for Biomedical Applications"(2001)]을 참고한다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 PEG 분자를 포함하는 항-CD3 Fab-폴레이트 페길화된 접합체가 본원에 개시된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 C-말단 PEG 분자를 포함하는 항-CD3 Fab-폴레이트 페길화된 접합체가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, C-말단 PEG 분자는 중쇄 및 경쇄 항체 또는 항체 단편 사이에 공유 디설파이드 연결 또는 부착을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, C-말단 PEG 분자는 항체 또는 항체 단편의 중쇄 및 경쇄에 개별적으로 부착될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 C-말단 PEG 분자는 항체 또는 항체 단편의 중쇄 및 경쇄 사이에 공유 부착되거나 가교될 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 PEG 분자는 2개의 시스테인 잔기를 연결하는 말레이미드 다리를 통해 공유 부착되거나 가교될 수 있다.
페길화는 약동학을 개선하고 조성물의 세포독성을 조절하는 데 사용될 수 있다. 단백질의 페길화는 PEG 모이어티가 단백질에 상당한 유체역학적 반경을 추가하므로, 신장 제거를 지연시킴으로써 그의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. PEG로 약칭되는 친수성 중합체 폴리(에틸렌 글리콜)의 공유 부착은 수용성, 생체이용률을 증가시키거나, 혈청 반감기를 증가시키거나, 치료 반감기를 증가시키거나, 면역원성을 조절하거나, 생물학적 활성을 조절하거나, 또는 단백질, 펩타이드, 및 특히 소수성 분자를 포함하는 많은 생물학적 활성 분자의 순환 시간을 연장시키는 방법이다. PEG는 의약품, 인공 임플란트, 및 생체적합성, 독성 부족, 및 면역원성 부족이 중요한 다른 분야에서 광범위하게 사용되었다. 바람직하게는, 페길화는 생물학적 활성 분자의 활성을 변경하지 않거나 단지 최소한으로 변경한다. 바람직하게는, 반감기의 증가는 생물학적 활성의 임의의 감소보다 크다. 본원에 참고로 포함된 문헌[Rader et al. in Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Apr 29;100(9):5396-400]은 일반 항체 분자와 반응시키는 것을 통해 작은 합성 분자에 효과기 기능 및 연장된 혈청 반감기를 제공하는 방법을 기술한다. 기재된 복합체는 자연 알돌라제 효소를 모방하는 촉매성 항체인 mAb 38C2, 및 항체 상의 반응성 리신 잔기를 통해 Arg-Gly-Asp 펩티도모방체를 표적화하는 인테그린의 디케톤 유도체 사이의 가역적 공유 결합에 의해 생성되었다. 펩티도모방체의 반감기의 증가 외에도, 복합체는 항체를 인테그린 αvβ3 및 αvβ5 발현 세포의 표면에 선택적으로 재표적화하는 것을 나타내었다.
일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체는 비자연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 수용성 중합체에 연결된다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체는 폴레이트에 연결되고, 상기 연결은 비자연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해서 이루어진다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체는 비자연적으로 코딩된 아미노산을 통해 폴레이트 유도체에 연결된다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체는 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결되고, 상기 연결은 비자연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해 이루어진다. 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체는 수용성 중합체 유도체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 유도체에 연결되고, 상기 연결은 비자연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해서 이루어진다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체-폴레이트 링커가 제공되며, 적어도 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체는 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산의 측쇄를 통해 폴레이트 및/또는 수용성 중합체 및/또는 링커에 연결된다.
일부 구현예에서, 폴레이트 모이어티는 도 12a-12f에 예시된 구조를 포함하는 하기 구조로부터 유래된다:
Figure pct00010
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리(에틸렌 글리콜)이다. 일부 구현예에서, 용어 폴리(에틸렌 글리콜)은 선형 폴리(에틸렌 글리콜), 분지형 폴리(에틸렌 글리콜), 이작용성 폴리(에틸렌 글리콜), 다중아암 폴리(에틸렌 글리콜), 유도체화된 폴리(에틸렌 글리콜) 및 포크 모양의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다.
폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량은 1 kDa 내지 100 kDa일 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60 kDa일 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량은 약 1 kDa 내지 약 25 kDa, 또는 약 5 kDa 내지 20 kDa일 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량은 약 5 kDa, 또는 약 10 kDa, 또는 약 20 kDa일 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량은 5 kDa 또는 10 kDa 또는 20 kDa일 수 있다. 폴리(에틸렌 글리콜)의 분자량은 5 kDa일 수 있다.
일부 구현예에서, 이작용성 수용성 중합체-폴레이트 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00011
상기 식에서:
A는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00012
B는 A 및 C를 연결하는 2가 기이며;
C 및 E는 각각 독립적으로 -알킬렌-, -알킬렌-C(O)-, -(알킬렌-O)n'-알킬렌-, -(알킬렌-O)n'-알킬렌-C(O)-, -(알킬렌-O)n'-(CH2)n'-NHC(O)-(CH2)n'-C(Me)2-S-S-(CH2)n'-NHC(O)-(알킬렌-O)n'-알킬렌-, -(알킬렌-O)n'-알킬렌-U-알킬렌-C(O)-, 및 -(알킬렌-O)n'-알킬렌-U-알킬렌-으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
n'는 독립적으로 1 이상의 정수이며;
D는 C, F 및 E를 연결하는 3가 기이고;
F는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 수용성 중합체이며;
Y는 하이드록실아민, 메틸, 알데히드, 보호된 알데히드, 케톤, 보호된 케톤, 티오에스테르, 에스테르, 디카르보닐, 하이드라진, 아미딘, 이민, 디아민, 아지드, 케토-아민, 케토-알킨, 알킨, 사이클로알킨, 및 엔-디온으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, B는 치환된 2가 헤테로하이드로카르빌 잔기이다. 일부 구현예에서, 치환기는 하나 이상의 카르복실, 케톤 및/또는 아미드 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 헤테로원자는 N, O 및 S로부터 선택된다.
일부 구현예에서, B는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00013
일부 구현예에서, D는 치환된 3가 헤테로하이드로카르빌 잔기이다. 일부 구현예에서, 치환기는 하나 이상의 카르복실, 케톤 및/또는 아미드 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 헤테로원자는 N, O 및 S로부터 선택된다.
일부 구현예에서, D는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00014
일부 구현예에서, C 및 E는 각각 -(알킬렌-O)n'-알킬렌-이다. 일부 구현예에서, 각각의 알킬렌은 -CH2CH2-이다.
일부 구현예에서, n'는 1 내지 20, 또는 1 내지 10, 또는 1 내지 5이다.
일부 구현예에서, F는 하기 구조를 갖고:
Figure pct00015
상기 식에서 n은 2 내지 10,000이다. 일부 구현예에서, n은 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)의 분자량은 1 kDa 내지 100 kDa이도록 선택된다. 예를 들어, 분자량은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 또는 60 kDa일 수 있다. 예를 들어, 분자량은 약 1 kDa 내지 약 25 kDa, 또는 약 5 kDa 내지20 kDa일 수 있다. 예를 들어, 분자량은 약 5 kDa, 또는 약 10 kDa, 또는 약 20 kDa일 수 있다. 예를 들어, 분자량은 5 kDa 또는 10 kDa 또는 20 kDa일 수 있다. 예를 들어, 분자량은 5 kDa일 수 있다.
일부 구현예에서, 이작용성 수용성 중합체-폴레이트 링커는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00016
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체는 수용성 중합체 이작용성 PEG-폴레이트 링커에 연결되고, 따라서 하기 구조를 가지며:
Figure pct00017
상기 식에서, A, B, C, D, E 및 F는 상기 구현예 중 어느 것에 정의된 바와 같고, Z는 비자연 아미노산을 통해 항-CD3 항체에 연결된 옥심 또는 사이클릭 연결이다.
일부 구현예에서, Z는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00018
상기 식에서:
J는 선택적이며, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 사이클로알킬렌, 치환된 저급 사이클로알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 알키닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 저급 헤테로사이클로알킬렌, 치환된 저급 헤테로사이클로알킬렌, 아릴렌, 치환된 아릴렌, 헤테로아릴렌, 치환된 헤테로아릴렌, 알카릴렌, 치환된 알카릴렌, 아르알킬렌, 또는 치환된 아르알킬렌이고;
G는 선택적이며, 존재하는 경우 저급 알킬렌, 치환된 저급 알킬렌, 저급 알케닐렌, 치환된 저급 알케닐렌, 저급 헤테로알킬렌, 치환된 저급 헤테로알킬렌, -O-, -O-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S-, -S-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -S(O)k-, 여기서 k는 1, 2, 또는 3이고, -S(O)k(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)-, -C(O)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(S)-, -C(S)-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')-, -NR'-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')CO-(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, 및 -C(R')2-N(R')-N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택된 링커이고, 각각의 R'는 독립적으로 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;
R은 H, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬이고;
R1은 H, 아미노 보호기, 수지, 적어도 하나의 아미노산, 폴리펩타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드이며;
R2는 OH, 에스테르 보호기, 수지, 적어도 하나의 아미노산, 폴리펩타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드이고;
여기서, R1 및/또는 R2는 항-CD3 항체이며; 및
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, 할로겐, 저급 알킬, 또는 치환된 저급 알킬이거나, 또는 R3 및 R4 또는 2개의 R3 기는 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에서, Z는 하기 구조를 가지며,
Figure pct00019
상기 식에서, J, G, R1, R2, R3 및 R4는 상기 정의된 바와 같고,
상기 식에서, D는 하기 구조를 가지며:
Figure pct00020
상기 식에서, 각각의 R17은 독립적으로 H, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 알킬알콕시, 치환된 알킬알콕시, 폴리알킬렌 옥사이드, 치환된 폴리알킬렌 옥사이드, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-ON(R")2, -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-C(O)SR", -(알킬렌 또는 치환된 알킬렌)-S-S-(아릴 또는 치환된 아릴), -C(O)R", -C(O)2R", 또는 -C(O)N(R")2,로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 각각의 R"는 독립적으로 수소, 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알콕시, 치환된 알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 알카릴, 치환된 알카릴, 아르알킬, 또는 치환된 아르알킬이며;
각각의 Z1은 결합, CR17R17, O, S, NR', CR17R17-CR17R17, CR17R17-O, O-CR17R17, CR17R17-S, S-CR17R17, CR17R17-NR', 또는 NR'-CR17R17이고;
각각의 R'는 H, 알킬, 또는 치환된 알킬이며;
각각의 Z2는 결합, -C(O)-, -C(S)-, 선택적으로 치환된 C1-C3 알킬렌, 선택적으로 치환된 C1-C3 알케닐렌, 및 선택적으로 치환된 헤테로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 Z3은 독립적으로 결합, 선택적으로 치환된 C1-C4 알킬렌, 선택적으로 치환된 C1-C4 알케닐렌, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, -O-, -S-, -C(O)-, -C(S)-, 및 -N(R')-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 T3은 결합, C(R")(R"), O, 또는 S이며; 단, T3이 O 또는 S일 때, R"는 할로겐일 수 없고;
각각의 R"은 H, 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 또는 치환된 사이클로알킬이며;
m 및 p는 0, 1, 2, 또는 3이고, 단 m 또는 p 중 적어도 하나는 0이 아니고;
M2는
Figure pct00021
이며, 상기 식에서, (a)는 B 기에 대한 결합을 나타내고, (b)는 헤테로사이클기 내의 각각의 위치에 대한 결합을 나타내며;
M3은
Figure pct00022
이고, 상기 식에서, (a)는 B 기에 대한 결합을 나타내고, (b)는 헤테로사이클기 내의 각각의 위치에 대한 결합을 나타내며;
M4는
Figure pct00023
이고, 상기 식에서 (a)는 B 기에 대한 결합을 나타내고, (b)는 헤테로사이클기 내의 각각의 위치에 대한 결합을 나타내며;
각각의 R19는 독립적으로 C1-C6 알킬, C1-C6 알콕시, 에스테르, 에테르, 티오에테르, 아미노알킬, 할로겐, 알킬 에스테르, 아릴 에스테르, 아미드, 아릴 아미드, 알킬 할로겐화물, 알킬 아민, 알킬 설폰산, 알킬 니트로, 티오에스테르, 설포닐 에스테르, 할로설포닐, 니트릴, 알킬 니트릴, 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택되고;
q는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11이며;
각각의 R16은 독립적으로 수소, 할로겐, 알킬, NO2, CN, 및 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 PEG 유도체를 이용하여 단백질을 선택적으로 변형하는 매우 효율적인 방법을 제공하며, 이는 셀렉터(selector) 코돈에 대한 반응으로 비제한적으로 케톤, 아지드 또는 아세틸렌 모이어티를 함유하는 20개의 자연적으로 혼입된 아미노산에서 발견되지 않는 작용기 또는 치환기를 함유하는 아미노산을 비제한적으로 포함하는 비유전적으로 코딩된 아미노산을 단백질 내로 선택적으로 혼입하고, 후속적으로 상기 아미노산을 적합하게 반응성인 PEG 유도체로 변형시키는 것을 포함한다. 일단 혼입되면, 아미노산 측쇄는 이후에 자연적으로 코딩된 아미노산에 존재하는 특정 작용기 또는 치환기에 적합한 것으로 당업자에게 알려진 화학 방법을 이용하여 변형될 수 있다. 매우 광범위한 공지된 화학 방법이 수용성 중합체를 단백질 내로 혼합하기 위해 본 발명에서 사용하기에 적합하다. 이러한 방법은 비제한적으로 아세틸렌 또는 아지드 유도체 각각을 이용한 후이겐 [3+2] 사이클로부가 반응을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예컨대, Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109, 1991; 및, Huisgen, R. in 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176, 1984).
후이겐 [3+2] 사이클로부가 방법은 친핵성 치환 반응이 아닌 사이클로부가를 포함하기 때문에, 단백질은 매우 높은 선택성으로 변형될 수 있다. 반응은 반응 혼합물에 촉매량의 Cu(I) 염을 첨가함으로써, 우수한 위치선택성(1,4 > 1,5)으로 수성 조건에서 실온에서 수행될 수 있다(예컨대, Tornoe, et al., Org. Chem. 67:3057-3064, 2002; 및, Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599, 2002; 및 WO 제03/101972호 참고). [3+2] 사이클로부가를 통해 본 발명의 단백질에 부가될 수 있는 분자는 비제한적으로 아지도 또는 아세틸렌 유도체를 포함하는 적합한 작용기 또는 치환기를 갖는 사실상 임의의 분자를 포함한다. 이들 분자는 비제한적으로 p-프로파르길옥시페닐알라닌을 포함하는 아세틸렌기, 또는 비제한적으로 p-아지도-페닐알라닌을 포함하는 아지도기를 갖는 비자연 아미노산에 부가될 수 있다.
후이겐 [3+2] 사이클로부가로부터 생성되는 5원 고리는 일반적으로 환원 환경에서 가역적이지 않으며, 수성 환경에서 장기간 동안 가수 분해에 대해 안정적이다. 결과적으로, 매우 다양한 물질의 물리적 및 화학적 특성은 본 발명의 활성 PEG 또는 PEG 유도체를 사용하여 까다로운 수성 조건 하에서 변형될 수 있다. 훨씬 더 중요하게도, 아지드 및 아세틸렌 모이어티는 서로 특이적이기 때문에(그리고, 예를 들어, 20개의 일반적인 유전적으로 코딩된 아미노산 중 어느 것과 반응하지 않음), 단백질은 극히 높은 선택성으로 하나 이상의 특정 부위에서 변형될 수 있다.
본 발명은 또한 하나 이상의 아세틸렌 또는 아지드 모이어티를 갖는 PEG 유도체 및 관련된 친수성 중합체의 수용성 및 가수분해적으로 안정한 유도체를 제공한다. 아세틸렌 모이어티를 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질에 선택적으로 도입된 아지드 모이어티와의 결합에 대해 매우 선택적이다. 유사하게, 아지드 모이어티를 함유하는 PEG 중합체 유도체는 셀렉터 코돈에 대한 반응으로 단백질 내로 선택적으로 도입된 아세틸렌 모이어티와의 커플링에 매우 선택적이다.
보다 구체적으로, 아지드 모이어티는, 비제한적으로, 알킬 아지드, 아릴 아지드 및 이들 아지드의 유도체를 포함한다. 알킬 및 아릴 아지드의 유도체는 아세틸렌-특이적 반응성이 유지되는 한 다른 치환기를 포함할 수 있다. 아세틸렌 모이어티는 알킬 및 아릴 아세틸렌 및 각각의 유도체를 포함한다. 알킬 및 아릴 아세틸렌의 유도체는 아지드 특이적 반응성이 유지되는 한 다른 치환기를 포함할 수 있다.
따라서, 항-CD3 항체는 표적 분자 또는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 입증하는 임의의 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 의도된다. 임의의 알려진 항체 또는 항체 단편은 항-CD3 항체이다.
일 구현예에서, 비자연 아미노산(예컨대, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌)을 포함하는 항-CD3 항체의 조성물이 제공된다. p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌을 포함하고, 비제한적으로, 단백질 및/또는 세포를 포함하는 다양한 조성물이 또한 제공된다. 일 양태에서, p-(프로파르길옥시)-페닐알라닌 비자연 아미노산을 포함하는 조성물은 직교 tRNA를 추가로 포함한다. 비자연 아미노산은, 비제한적으로, 아미노-아실 결합을 통해 직교 tRNA에 공유 결합되거나, 직교 tRNA의 말단 리보스 당의 3'OH 또는 2'OH에 공유 결합되는 것 등을 포함하여, 직교 tRNA에 결합(비제한적으로, 공유적 결합 포함)될 수 있다.
항-CD3 항체 활성 및 그의 항원 또는 결합 파트너에 대한 항-CD3 항체의 친화성의 측정
항-CD3 항체 활성은 표준 시험관내 또는 생체내 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 항-CD3 항체에 결합하는 세포 또는 세포주(비제한적으로, 천연 항-CD3 항체 항원 또는 결합 파트너를 함유하는 세포 또는 재조합 항-CD3 항체 항원 또는 결합 파트너 생산 세포 포함)는 항-CD3 항체 결합을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 비자연 아미노산을 포함하는 비페길화된 또는 페길화된 항원-결합 폴리펩타이드의 경우, 그의 항원 또는 결합 파트너에 대한 항-CD3 항체의 친화성은 BIAcore™ 바이오센서(Pharmacia) 또는 Octet(ForteBio)와 같이 당업계에 알려진 기술을 사용하여 측정될 수 있다.
항-CD3 항체를 생성하는 데 사용되는 방법에 관계없이, 항-CD3 항체는 생물학적 활성이 분석된다. 적절한 경우 세포 분열 정도를 확인하기 위해 삼중수소 티미딘 분석이 수행될 수 있다. 그러나, 원하는 활성을 확인하기 위해 다른 생물학적 분석이 사용될 수 있다. 효소적, 증식적, 또는 대사적 활성과 같은 항원의 생물학적 활성을 억제하는 능력을 측정하는 것과 같은 생물학적 분석은 또한 항-CD3 항체 활성의 지표를 제공한다. 당업자에게 잘 알려진 다른 시험관내 분석이 생물학적 활성을 확인하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 생물학적 활성 시험은 항원의 생물학적 활성에 적절한 바와 같은 생물학적 활성(변경되지 않은 항-CD3 항체와 비교하여), 상이한 생물학적 활성(변경되지 않은 항-CD3 항체와 비교하여)의 증가 또는 감소, 수용체 친화성 분석, 입체형태적 또는 구조적 변화, 또는 혈청 반감기 분석과 같은 원하는 결과에 대한 분석을 제공해야 한다. 당업자는 원하는 최종 결과에 대한 시험에 유용한 다른 분석을 인식할 것이다.
효능, 기능적 생체내 반감기, 및 약동학 매개변수의 측정
본 발명의 중요한 양태는 수용성 중합체 모이어티에 대한 항-CD3 항체의 접합을 갖거나 갖지 않는 항-CD3 항체의 제작에 의해 수득되는 연장된 생물학적 반감기이다. 항-CD3 항체 혈청 농도의 급격한 감소는 접합된 및 접합되지 않은 항-CD3 항체 및 이의 변이체를 이용한 치료에 대한 생물학적 반응을 평가하는 것을 중요하게 만들었다. 바람직하게는, 본 발명의 접합된 및 접합되지 않은 항-CD3 항체 및 이의 변이체는 또한 정맥내 투여 후에 혈청 반감기를 연장하여, 예컨대 ELISA 방법에 의해 또는 일차 스크리닝 분석에 의해 측정될 수 있다. 생체내 생물학적 반감기의 측정은 본원에 기재된 바와 같이 수행된다.
비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항원-결합 폴리펩타이드에 대한 약동학 매개변수는 정상 스프라구에-다울레이 수컷 랫트에서 평가될 수 있다. 항-CD3 항체에 대한 약동학 데이터는 몇 가지 종에서 잘 연구되어 있으며, 이는 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체에 대해 수득된 데이터와 직접 비교될 수 있다.
본 발명에 따른 항-CD3 항체의 특이적 활성은 당업계에 알려진 다양한 분석에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 따라 수득되고 정제된 항-CD3 항체 뮤테인, 또는 이의 단편의 생물학적 활성은 본원에 기재되거나 언급되거나 당업자에게 알려진 방법에 의해 시험될 수 있다.
투여 및 약제학적 조성물
본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질(비제한적으로, 하나 이상의 비자연 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체, 합성효소, 단백질 등)은 비제한적으로, 적합한 약제학적 담체와 조합된 것을 포함하여, 치료적 용도를 위해 선택적으로 사용된다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 화합물의 치료적 유효량, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체 또는 부형제는, 비제한적으로, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및/또는 이의 조합을 포함한다. 제제는 투여 방식에 적합하도록 제조된다. 일반적으로, 단백질을 투여하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 발명의 폴리펩타이드의 투여에 적용될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 치료적 조성물은 선택적으로 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 효능, 조직 대사를 확인하고 투여량을 추정하기 위해, 하나 이상의 적절한 시험관내 및/또는 생체내 질환 동물 모델에서 시험된다. 특히, 투여량은 초기에 자연 아미노산 동족체에 대한 본원의 비자연 아미노산의 활성, 안정성 또는 다른 적합한 측정에 의해(비제한적으로, 하나 이상의 비자연 아미노산을 포함하도록 변형된 항-CD3 항체와 자연 아미노산 항-CD3 항체의 비교 포함), 즉, 관련 분석에서 결정될 수 있다.
투여는 혈액 또는 조직 세포와의 최종적인 접촉 내로 분자를 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 임의의 경로에 이루어진다. 본 발명의 비자연 아미노산 폴리펩타이드는 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 임의의 적합한 방식으로 투여된다. 본 발명의 맥락에서 이러한 폴리펩타이드를 환자에게 투여하는 적합한 방법이 이용가능하며, 둘 이상의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있음에도 불구하고, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 작용 또는 반응을 제공할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물의 다양한 적합한 제제가 있다.
폴리펩타이드 조성물은, 비제한적으로 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하, 또는 직장 수단을 포함하는 많은 경로에 의해 투여될 수 있다. 비자연 아미노산 폴리펩타이드, 변형되거나 변형되지 않은 비자연 아미노산 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 또한 리포좀을 통해 투여될 수 있다. 이러한 투여 경로 및 적절한 제제는 일반적으로 당업자에게 알려져 있다.
비자연 아미노산 단독 또는 다른 적합한 성분과 조합된 비자연 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체는 또한 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 제제(즉, 이들은 "분무"될 수 있음)로 제조될 수 있다. 에어로졸 제제는 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 가압된 허용가능한 추진제 내에 위치할 수 있다.
예를 들어, 관절내, 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 및 피하 경로에 의한 것과 같은 비경구 투여에 적합한 제제는 항산화제, 완충액, 정균작용제, 및 제제를 의도된 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성의 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성의 멸균 현탁액을 포함한다. 포장된 항-CD3 항체의 제제는 앰플 및 바이알과 같은 단위 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기에 제공될 수 있다.
비경구 투여 및 정맥내 투여가 바람직한 투여 방법이다. 특히, 현재 사용되는 제제와 함께, 현재 사용 중인 제제와 함께 자연 아미노산 동족체 치료제에 이미 사용 중인 투여 경로(비제한적으로, EPO, GH, 항-CD3 항체, G-CSF, GM-CSF, IFN, 인터루킨, 항체, 및/또는 임의의 다른 약제학적으로 전달되는 단백질에 전형적으로 사용되는 것 포함)는 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 투여 및 제제를 위한 바람직한 경로를 제공한다.
본 발명의 맥락에서 환자에게 투여되는 용량은 응용분야에 따라 시간이 지남에 따라 환자에서 유익한 치료 반응을 갖기에 충분하거나, 비제한적으로, 병원체에 의한 감염을 억제하기에 충분하거나, 또는 다른 적절한 활성을 갖기에 충분하다. 용량은 특정 벡터, 또는 제제의 효능, 및 사용된 비자연 아미노산 폴리펩타이드의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 환자의 병태뿐만 아니라 치료될 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다. 용량의 크기는 또한 특정 환자에서 특정 벡터, 제제 등의 투여에 수반하는 임의의 부작용의 존재, 특성, 및 정도에 의해 결정된다.
질환(비제한적으로, 암, 유전병, 당뇨병, AIDS 등 포함)의 치료 또는 예방에서 투여될 벡터 또는 제제의 유효량을 결정할 때, 의사는 순환 혈장 수준, 제제 독성, 질환의 진행, 및/또는 관련된 경우, 항-비자연 아미노산 폴리펩타이드 항체의 생산을 평가한다.
예를 들어, 70 kg 환자에게 투여되는 용량은 전형적으로 관련 조성물의 변경된 활성 또는 혈청 반감기에 맞춰 조정된 현재 사용되는 치료 단백질의 투여량과 동등한 범위이다. 본 발명의 벡터는 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제, 자연 아미노산 폴리펩타이드, 핵산, 뉴클레오타이드 유사체, 생물학적 반응 변형제 등의 투여를 포함하는 임의의 공지된 통상적인 요법에 의한 치료 조건을 보충할 수 있다.
투여를 위해, 본 발명의 제제는 관련 제제의 LD-50 또는 ED-50, 및/또는 비제한적으로, 환자의 질량 및 전체 건강에 적용된 바와 같은 것을 포함하는 다양한 농도에서 비자연 아미노산의 임의의 부작용의 관찰에 의해 결정된 속도로 투여된다. 투여는 단일 또는 분할 용량을 통해 달성될 수 있다.
제제를 주입받는 환자가 발열, 오한 또는 근육통이 발생하는 경우, 적절한 용량의 아스피린, 이부프로펜, 아세타미노펜 또는 다른 통증/발열 제어 약물을 받는다. 발열, 근육통, 및 오한과 같은 주입에 대한 반응을 경험하는 환자는 아스피린, 아세타미노펜, 또는, 비제한적으로, 디펜하이드라민의 미래 주입 30분 전에 미리 약물 투여된다. 메페리딘(meperidine)은 해열제 및 항히스타민제에 빠르게 반응하지 않는 더 심한 오한 및 근육통에 사용된다. 세포 주입은 반응의 심각성에 따라 느려지거나 중단된다.
본 발명의 인간 항원-결합 폴리펩타이드는 포유동물 대상체에 직접 투여될 수 있다. 투여는 항-CD3 항체를 대상체에게 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 본 발명의 구현예에 따른 항-CD3 항체 조성물은 경구, 직장, 국소, 흡입(비제한적으로, 에어로졸을 통한 것 포함), 구강(비제한적으로, 설하 포함), 질, 비경구(비제한적으로, 피하, 근육내, 피내, 관절내, 흉막내, 복강내, 뇌내, 동맥내, 또는 정맥내 포함), 국소(즉, 기도 표면을 포함하는, 피부 및 점막 표면 모두) 및 경피 투여에 적합한 것을 포함하지만, 임의의 주어진 경우에서의 가장 적합한 경로는 치료되는 병태의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 투여는 국소 또는 전신일 수 있다. 화합물의 제제는 앰플 및 바이알과 같은 단위 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기에 제공될 수 있다. 본 발명의 항-CD3 항체는 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 단위 투여량 주사가능한 형태(비제한적으로, 용액, 현탁액, 또는 유화액 포함)로 혼합물로 제조될 수 있다. 본 발명의 항-CD3 항체는 또한 연속 주입(비제한적으로, 삼투압 펌프와 같은 미니펌프 사용), 단일 볼루스 또는 서방형 데포 제제에 의해 투여될 수 있다.
투여에 적합한 제제는 수성 및 비수성 용액, 항산화제, 완충액, 정균 작용제, 및 제제를 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 등장성 멸균 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 멸균 분말, 과립, 및 정제로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 일부 결정된다. 따라서, 본 발명의 약제학적 조성물(선택적인 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제 포함)의 광범위한 적합한 제제가 있다(예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985 참고).
적합한 담체는 포스페이트, 보레이트, HEPES, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 2가 금속 이온, 예컨대 아연, 코발트, 또는 구리; 당 알코올, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 Tween™, Pluronics™ 또는 PEG를 함유하는 완충액을 포함한다.
PEG와 같은 수용성 중합체에 연결된 것을 포함하는 본 발명의 항-CD3 항체는 또한 지속 방출 시스템에 의해 또는 이의 일부로서 투여될 수 있다. 지속 방출 조성물은, 비제한적으로, 성형된 물품 형태의 반투과성 중합체 매트릭스, 비제한적으로, 필름, 또는 마이크로캡슐을 포함한다. 지속 방출 매트릭스는 생체적합성 물질, 예컨대 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 1981; Langer, Chem. Tech., 12: 98-105, 1982), 에틸렌 비닐 아세테이트(상기 Langer et al.,) 또는 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산(EP 제133,988호), 폴리락티드(폴리락트산)(미국 특허 제3,773,919호; EP 제58,481호), 폴리글리콜리드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜리드(락트산 및 글리콜산의 공중합체) 폴리무수물, L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556. 1983), 폴리(오르토)에스테르, 폴리펩타이드, 히알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카르복실산, 지방산, 포스포지질, 다당류, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산, 예컨대 페닐알라닌, 티로신, 이소류신, 폴리뉴클레오타이드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘을 포함한다. 지속 방출 조성물은 또한 리포좀으로 포획된 화합물을 포함한다. 리포좀 함유 화합물은 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다: DE 제3,218,121호; (Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692,1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034, 1980; EP 제52,322호; EP 제36,676호; EP 제88,046호; EP 제143,949호; EP 제142,641호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 제102,324호). 인용된 모든 참고문헌 및 특허는 본원에 참조로 포함되어 있다.
리포좀으로 포획된 항-CD3 항체는, 예컨대, DE 제3,218,121호; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034, 1980; EP 제52,322호; EP 제36,676호; EP 제88,046호; EP 제143,949호; EP 제142,641호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 제102,324호에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀의 조성 및 크기는 널리 알려져 있으며 당업자에 의해 경험적으로 쉽게 결정될 수 있다. 리포좀의 일부 예는, 예컨대, 문헌[Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331, 1995; Lasic D and Papahadjopoulos D(eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES, 1998; Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B(ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT, 2002; Park JW, et al., Clin. Cancer Res. 8:1172-1181, 2002; Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3):109-118, 2002; Mamot C, et al., Caneer Res. 63: 3154-3161, 2003]에 기재되어 있다. 인용된 모든 참고문헌 및 특허는 본원에 참조로 포함되어 있다.
본 발명의 맥락에서 환자에게 투여되는 용량은 시간이 지남에 따라 대상체에서 유익한 반응을 일으키기에 충분해야 한다. 일반적으로, 용량당 비경구로 투여되는 본 발명의 항-CD3 항체의 총 약제학적 유효량은 환자 체중의 약 0.01 μg/kg/일 내지 약 100 μg/kg, 또는 약 0.05 mg/kg 내지 약 1 mg/kg의 범위이지만, 이것은 치료적 재량에 좌우된다. 투여 빈도는 또한 치료적 재량에 좌우되며, 인간에서 사용하도록 승인된 상업적으로 이용가능한 항-CD3 항체 제품보다 더 빈번하거나 덜 빈번할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 이중특이적 항원-결합 폴리펩타이드는 상기 기재된 임의의 투여 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 항-CD3 항체 생체접합체의 치료적 용도
본 발명의 항-CD3 항체 폴리펩타이드는 광범위한 장애를 치료하는 데 유용하다. 본원에 개시된 항-CD3 항체 조성물은 면역 반응을 조절하는 데 사용될 수 있다. 면역 반응의 조절은 면역 반응을 자극, 활성화, 증가, 향상, 또는 상향조절하는 것을 포함할 수 있다. 면역 반응의 조절은 면역 반응을 저해, 억제, 예방, 감소, 또는 하향조절하는 것을 포함할 수 있다. 개시된 항-CD3 항체-폴레이트 조성물은 고체 종양을 침투하는 데 이점을 가질 수 있는 반면, 자연 폴레이트 리간드는 예를 들어 종양 상의 폴레이트 수용체 알파, 및 면역 억제 세포 상의 폴레이트 수용체 베타를 표적화한다. 일부 구현예에서, 종양은 액체 또는 고체 종양이다.
본 발명의 항-CD3 접합체 또는 약제학적 조성물을 이용하여 대상체의 병태를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 암에서, 특정 세포 표면 수용체의 과발현은 건강한 세포에 대한 효과를 최소화하면서 소분자 또는 약물을 이용하여 암 세포를 선택적으로 표적화하는 것을 허용할 수 있다. 예를 들어, 전립선암 특이적 막 항원(PMSA)-표적화 2-[3-(1,3-디카르복시 프로필)-우레이도]펜탄디오산(DUPA)은 T-세포 표면 항원(항-CD3) 결합 항체에 접합되어 세포독성 T-세포를 선택적으로 모집하거나 표적화하여 전립선암 세포를 사멸시킬 수 있다. N-(4-{[(2-아미노-4-옥소-1,4-디하이드로프테리딘-6-일)메틸]아미노}벤조일)-L-글루탐산(폴산)은 또한 FR+ 암 세포주 상에서 과발현되는 폴레이트 수용체(FR) 항원에 결합하는 생물학적 활성 분자로서 사용될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공한다. 암은, 비제한적으로, 상피, 간질 및 생식 세포 종양을 포함하는 난소암일 수 있다. 난소암은 나팔관 암 또는 원발성 복막 암종을 포함할 수 있다. 암은 폴레이트 수용체-알파(FOLR1)의 고발현을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어 난소암일 수 있다. 암은 세포독성 T 세포를 폴레이트 수용체 양성(FR+) 종양 세포로 모집함으로써 치료될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여함으로써 유전병, AIDs 또는 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 항-CD3 항체 또는 치료제는 항-CD3 Fab 항체를 포함하는 이중특이적 항체일 수 있고, 선택적으로 항-CD3 Fab 항체는 2개의 폴레이트 및 2개의 페길화된 분자에 접합된 부위 특이적으로 혼입된 비자연적으로 코딩된 아미노산을 선택적으로 포함한다. 추가 구현예에서, 상기 항-CD3 Fab 항체 내로 그리고 2개의 폴레이트 및 2개의 페길화된 분자에의 접합은 비자연 아미노산의 측쇄를 통해 이루어진다.
본 발명은 높은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에서 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용하기 위한 항-CD3 항체를 제공한다. 본 발명의 항-CD3 항체는, 비제한적으로, 상피, 간질 및 생식 세포 종양을 포함하는, 비제한적으로, 난소암 난소암을 포함하는 암을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 난소암은 나팔관 암 또는 원발성 복막 암종을 포함할 수 있다. 암은 폴레이트 수용체-알파(FOLR1)의 고발현을 특징으로 할 수 있으며, 예를 들어 난소암일 수 있다. 암은 세포독성 T 세포를 폴레이트 수용체 양성(FR+) 종양 세포로 모집함으로써 치료될 수 있다. 본 발명의 항-CD3 항체는 비제한적으로 유전병, AIDS, 또는 당뇨병을 치료하는 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 항-CD3 항체는 높은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에서 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 항-CD3 항체는 비제한적으로, 상피, 간질 및 생식 세포 종양을 포함하는, 비제한적으로, 난소암 난소암을 포함하는 암을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. 난소암은 나팔관 암 또는 일차 복막 암종을 포함할 수 있다. 암은 폴레이트 수용체-알파(FOLR1)의 고발현을 특징으로 할 수 있으며, 예컨대 난소암일 수 있다, 예를 들어. 암은 세포독성 T 세포를 폴레이트 수용체 양성(FR+) 종양 세포로 모집함으로써 치료될 수 있다. 본 발명의 항-CD3 항체는 비제한적으로 유전병, AIDS 또는 당뇨병을 치료하기 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 치료될 병태는 암이다. 암은, 비제한적으로, 유방암, 뇌암, 췌장암, 피부암, 폐암, 간암, 담낭암, 결장암, 난소암, 전립선암, 자궁암, 골암, 및 혈액암(백혈병) 암 또는 이들 암 중 어느 것과 관련된 암 또는 질환 또는 병태일 수 있다. 암종은 신체의 표면을 덮고, 호르몬을 생산하고, 땀샘을 구성하는 세포인 상피 세포에서 시작되는 암이다. 비제한적인 예로서, 암종은 유방암, 췌장암, 폐암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 신장암, 방광암, 위암, 전립선암, 간암, 난소암, 뇌암, 질암, 외음부암, 자궁암, 구강암, 음경암, 고환암, 식도암, 피부암, 나팔관 암, 두경부암, 위장관 간질암, 선암종, 피부 또는 안내 흑색종, 항문 영역의 암, 소장의 암, 내분비계의 암, 갑상선의 암, 부갑상선의 암, 부신의 암, 요도의 암, 신우의 암, 수뇨관암, 자궁내막의 암, 자궁경부의 암, 뇌하수체의 암, 중추신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 뇌간 신경교종, 및 척추 종양을 포함한다. 일부 경우, 암은 피부암, 예컨대 기저 세포 암종, 편평, 흑색종, 비흑색종, 또는 광선(태양) 각화증이다. 일부 구현예에서, 암은 고도로 발현된 폴레이트 수용체 알파 또는 베타를 갖는 임의의 암이다. 일부 구현예에서, 치료될 병태는 질환 또는 병태이다. 질환 또는 병태는 병원성 감염일 수 있다. 병원성 감염은 박테리아 감염일 수 있다. 병원성 감염은 바이러스 감염일 수 있다. 질환 또는 병태는 염증성 질환일 수 있다. 질환 또는 병태는 자가면역 질환일 수 있다. 자가면역 질환은 당뇨병일 수 있다. 질환 또는 병태는 암일 수 있다. 일부 구현예에서, 질환 또는 병태는 고도로 발현된 폴레이트 수용체 알파 또는 베타를 갖는 임의의 질환 또는 병태이다. 질환 또는 병태는 병원성 감염일 수 있다. 생물학적 활성 분자는 감염된 세포 상의 세포 표면 분자와 상호작용할 수 있다. 생물학적 활성 분자는 박테리아, 바이러스, 또는 기생충 상의 분자와 상호작용할 수 있다. 병원성 감염은 하나 이상의 병원체에 의해 유발될 수 있다. 일부 경우, 병원체는 박테리아, 진균, 바이러스, 또는 원생동물이다. 예시적인 병원체는 비제한적으로: 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미디아(Chlamydia), 클라미도필라(Chlamydophila), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 엔테로코커스(Enterococcus), 에세리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 해모필러스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 레지오넬라(Legionella), 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이코플라스마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 리케차(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio), 또는 예르시니아(Yersinia)를 포함한다. 병원체는 바이러스일 수 있다. 바이러스의 예는, 비제한적으로, 아데노바이러스(adenovirus), 콕사키바이러스(coxsackievirus), 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus), 간염 바이러스(Hepatitis virus)(예컨대, 간염 A, B, 및 C), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus)(유형 1 및 2), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 헤르페스 바이러스(herpes virus), HIV, 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 홍역 바이러스(measles virus), 볼거리 바이러스(mumps virus), 파필로마바이러스(papillomavirus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 폴리오바이러스(poliovirus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 풍진 바이러스(rubella virus), 및 바리셀라-조스터 바이러스(varicella-zoster virus)를 포함한다. 바이러스에 의해 유발되는 질환 또는 병태의 예는, 비제한적으로, 감기, 독감, 간염, AIDS, 수두(chicken pox), 풍진, 볼거리, 홍역, 사마귀, 및 소아마비(poliomyelitis)를 포함한다. 질환 또는 병태는 자가면역 질환 또는 자가면역 관련 질환일 수 있다. 자가면역 장애는 신체가 자기 자신의 조직을 공격하게 하는 신체의 면역 체계의 오작동일 수 있다. 자가면역 질환 및 자가면역 관련 질환의 예는, 비제한적으로, 애디슨병(Addison's disease), 원형 탈모증(alopecia areata), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 항포스포지질 증후군(antiphospholipid syndrome, APS), 자가면역 재생불량성 빈혈(autoimmune aplastic anemia), 자가면역 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis), 자가면역 심근염(autoimmune myocarditis), 베체트병(Behcet's disease), 셀리악 스프루(celiac sprue), 크론병(Crohn's disease), 피부근염(dermatomyositis), 호산성 근막염(eosinophilic fasciitis), 결절성 홍반(erythema nodosum), 거대 세포 동맥염(giant cell arteritis, 측두 동맥염), 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 그레이브병(Graves' disease), 하시모토병(Hashimoto's disease), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP), IgA 신증(IgA nephropathy), 소아 관절염(juvenile arthritis), 당뇨병, 소아 당뇨병(juvenile diabetes), 카와사키 증후군(Kawasaki syndrome), 람베르트-이튼 증후군(Lambert-Eaton syndrome), 루푸스(SLE), 혼합 결합 조직병(mixed connective tissue disease, MCTD), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 천포창(pemphigus), 결절다발 동맥염(polyarteritis nodosa), 유형 I, II, & III 자가면역 다선성 증후군(type I, II, & III autoimmune polyglandular syndromes), 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatica), 다발근육염(polymyositis), 건선(psoriasis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 라이터(Reiter's syndrome), 재발성 다발 연골염(relapsing polychondritis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 유육종증(sarcoidosis), 경피증(scleroderma), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 정자 및 고환 자가면역(sperm & testicular autoimmunity), 강직 인간 증후군(stiff person), 타카야수 동맥염(Takayasu's arteritis), 측두 동맥염(temporal arteritis)/거대 세포 동맥염(giant cell arteritis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 포도막염(uveitis), 혈관염(vasculitis), 백반증(vitiligo), 및 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis)을 포함한다.
질환 또는 병태는 염증성 질환일 수 있다. 염증성 질환의 예는, 비제한적으로, 폐포염(alveolitis), 아밀로이드증(amyloidosis), 맥관염(angiitis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 무혈관성 괴사(avascular necrosis), 바제도병(Basedow's disease), 안면 신경 마비(Bell's palsy), 활액낭염(bursitis), 손목 터널 증후군(carpal tunnel syndrome), 셀리악병(celiac disease), 담관염(cholangitis), 슬개연골연화증(chondromalacia patella), 만성 활동 간염(chronic active hepatitis), 만성 피로 증후군(chronic fatigue syndrome), ㅋ코간 증후군(Cogan's syndrome), 선천성 고관절 이형성증(congenital hip dysplasia), 갈비연골염(costochondritis), 크론병(Crohn's Disease), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 드꿰르벵 건염(De Quervain's tendinitis), 당뇨병 관련 관절염, 미만성 특발성 골격 과다골화증(diffuse idiopathic skeletal hyperostosis), 원반모양 루푸스(discoid lupus), 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome), 가족성 지중해열(familial mediterranean fever), 근막염(fascitis), 결합조직염(fibrositis)/섬유근육통(fibromyalgia), 오십견(frozen shoulder), 결절낭종(ganglion cysts), 거대 세포 동맥염(giant cell arteritis), 통풍(gout), 그레이브병(Graves' Disease), HIV-관련 류마티스병 증후군(HIV-associated rheumatic disease syndrome), 부갑상선기능항진 관련 관절염(hyperparathyroid associated arthritis), 감염성 관절염(infectious arthritis), 염증성 장 증후군(inflammatory bowel syndrome)/과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 소아 류마티스성 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 라임병(lyme disease), 마르판 증후군(Marfan's Syndrome), 미쿨리츠병(Mikulicz's Disease), 혼합 결합 조직병(mixed connective tissue disease), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 근막 통증 증후군(myofascial pain syndrome), 골관절염(osteoarthritis), 골연화증(osteomalacia), 골다공증(osteoporosis) 및 코르티코스테로이드 유도 골다공증(corticosteroid-induced osteoporosis), 파제트병(Paget's Disease), 재발 류머티즘(palindromic rheumatism), 파킨슨병(Parkinson's Disease), 플럼머병(Plummer's Disease), 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatica), 다발근육염(polymyositis), 가통풍(pseudogout), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 레이노 현상(Raynaud's Phenomenon)/증후군, 라이터 증후군(Reiter's Syndrome), 류마티스성 열(rheumatic fever), 류마티스양 관절염(rheumatoid arthritis), 유육종증, 좌골신경통(sciatica)(허리 신경근병(lumbar radiculopathy)), 경피증(scleroderma), 괴혈병(scurvy), 겸상 세포 관절염(sickle cell arthritis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome), 척추관 협착증(spinal stenosis), 척추전방전위증(spondylolisthesis), 스틸병(Still's Disease), 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosis), 타카야수(Pulseless)병, 건염(Tendinitis), 테니스 엘보우(tennis elbow)/골프 엘보우(golf elbow), 갑상선 관련 관절염(thyroid associated arthritis), 방아쇠 수지(trigger finger), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 및 휘플병(Whipple's Disease)을 포함한다.
항-CD3 항체를 함유하는 약제학적 조성물은 비제한적으로, 단독으로 또는 병태 질환의 일부로서 사용되는 항증식제, 항염증제, 또는 항바이러스제와 같은 항-CD3 항체 작용제 또는 길항제에 의해 영향을 받을 수 있는 장애를 경험하고 있는 인간 환자에게 다양한 수단에 의한 투여에 효과적인 강도로 제제화될 수 있다. 항-CD3 항체의 평균 양은 다양할 수 있으며, 특히 자격을 갖춘 의사의 권고 및 처방에 기초해야 한다. 항-CD3 항체의 정확한 양은 치료되는 병태의 정확한 유형, 치료되는 환자의 병태뿐만 아니라 조성물 내의 다른 성분과 같은 인자에 따른 선호 문제이다. 본 발명은 또한 항암 화학치료제 또는 면역치료제와 같은 또 다른 활성제의 치료적 유효량의 투여를 제공하지만, 이에 제한되지 않는다. 제공될 양은 항-CD3 항체를 이용한 요법에 기초하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 예시하기 위해 제공되며 청구된 발명을 제한하기 위해 제공되는 것은 아니다.
실시예 1
항-CD3 항체 내로 비자연적으로 코딩된 아미노산의 바람직한 혼입 부위의 선택을 위한 기준: - 본 실시예는 항원-결합 폴리펩타이드인 CD3 내의 바람직한 부위가 항-CD3 항체의 2개의 분자로 구성된 3차원 구조, 또는 항-CD3 항체의 2차, 3차, 또는 4차 구조를 이용하여 비자연적으로 코딩된 아미노산을 도입하기 위해 어떻게 선택될 수 있는지 보여준다.
하기 기준은 비자연적으로 코딩된 아미노산의 도입을 위한 항-CD3 항체의 각각의 위치를 평가하는데 사용되며: 잔기 (a)는 항-CD3 항체의 3차원 구조, 또는 2차, 3차, 또는 4차 구조의 구조적 분석에 기초하여 항-CD3 항체의 결합을 방해하지 않아야 하며, b) 알라닌 또는 상동체 스캐닝 돌연변이유발에 의해 영향을 받지 않아야 하고, (c) 표면 노출되고 주변 잔기와 최소 반데르발스 또는 수소 결합 상호작용을 나타내어야 하며, (d) 항-CD3 항체의 노출된 면 중 하나 이상에 있을 수 있고, (e) 제2 항-CD3 항체, 또는 이의 다른 분자 또는 단편에 나란히 놓인 항-CD3 항체의 부위 또는 부위들일 수 있으며, (f) 항-CD3 항체 변이체에서 결실되거나 가변적이어야 하고, (g) 비자연적으로 코딩된 아미노산으로 치환시 보존적 변화를 초래할 것이며, (h) 원하는 완전한 구조의 유연성 또는 강직성을 변경함으로써, 항-CD3 항체 자체 또는 하나 이상의 항-CD3 항체를 포함하는 이량체 또는 다량체의 입체형태를 조절할 수 있고, (i) 매우 유연한 영역 또는 구조적으로 강직한 영역에서 발견될 수 있고, (j) 상보성 결정 영역(CDR)에서 발견되거나 발견되지 않는다. 또한, 각각의 단백질 원자에 대한 돌출 정도를 평가하기 위해 Cx 프로그램(Pintar et al. Bioinformatics, 18, pp 980)을 이용하여, 항-CD3 항체 분자 상에서 추가 계산이 수행되었다. 결과적으로, 일부 구현예에서, 비자연적으로 코딩된 코딩된 아미노산은 항-CD3 항체의 하나 이상의 위치에서 치환된다.
실시예 2
E. 콜리에서 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 항체의 발현: - 직교 tRNA(O-tRNA) 및 직교 아미노아실 tRNA 합성효소(O-RS)를 포함하는 도입된 번역 시스템이 비자연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 항-CD3 항체를 발현하는 데 사용된다. O-RS는 비자연적으로 코딩된 아미노산을 갖는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 결국 번역 시스템은 코딩된 셀렉터 코돈에 대한 반응으로, 항-CD3 항체 내로 비자연적으로 코딩된 아미노산을 삽입한다.
변형된 항-CD3 항체 유전자 및 직교 아미노아실 tRNA 합성효소/tRNA 쌍(원하는 비자연적으로 코딩된 아미노산에 특이적)을 함유하는 플라스미드를 이용한 E. 콜리의 형질전환은 항-CD3 항체 내로 비자연적으로 코딩된 아미노산의 부위 특이적 혼입을 허용한다. 0.01-100 mM의 특정 비자연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 배지에서 37℃에서 성장한 형질전환된 E. 콜리는 높은 정확성 및 효율로 변형된 항-CD3 항체를 발현한다. 비자연적으로 코딩된 아미노산을 함유하는 항-CD3 항체는 주변세포질에서 가용성 단백질로서 E. 콜리 숙주 세포에 의해 생산된다. 항-CD3 항체의 정제 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석, 또는 전기분무-이온화 이온 트랩 질량 분석법 등에 의해 확인된다.
발현/억제: 비자연적으로 코딩된 아미노산을 이용한 억제 - 파라-아세틸-페닐알라닌(pAF): E. 콜리에서 앰버 돌연변이의 억제는 당업계에 알려진 표준 프로토콜을 사용하여 달성된다. 간략하게, E. 콜리(Fab)에서 항체 단편의 주변세포질 억제를 위해, 발현 벡터 구조체는 직교 tRNA 합성효소(예를 들어, M. 잔나스키이(M. jannaschii)로부터의 직교 티로실-tRNA-합성효소(MjTyrRS))를 코딩하는 플라스미드를 이용하여 E. 콜리 숙주 세포 내로 형질전환된다. 밤새 박테리아 배양물을 LB 배지(Luria-Bertani) 또는 수퍼브로쓰(Superbroth)를 함유하는 진탕 플라스크 내로 1:100으로 희석하고, 대략 0.8의 OD까지 37℃에서 성장시킨다. 파라-아세틸-페닐알라닌(pAF)을 4 mM의 최종 농도로 첨가함으로써 앰버 코돈의 억제가 달성되는 동안 Fab 발현이 유도된다. 배양물을 25℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
비자연적으로 코딩된 아미노산 유도체를 이용한 억제: 비자연적으로 코딩된 아미노산의 유도체(예를 들어, pAF(aa 9.2))를 이용한 앰버 돌연변이의 억제는 사용된 직교 합성효소(예를 들어, M. 잔나스키이로부터의 티로실-tRNA-합성효소(MjTyrRS))가 아미노산에 특이적인 것을 제외하고, 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 달성된다. 예를 들어, 억제는 유도 시점에 aa9.2(4 mM)를 첨가함으로써 달성된다.
세포를 원심분리에 의해 채취하고, 100 ug/ml의 리소자임이 보충된 주변세포질 방출 완충액(50 mM NaPO4, 20% 수크로스, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 재현탁하고, 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 상층액 내의 항체 단편을 이들의 His 태그에 의해 프로바인드(ProBind) 비드(Invitrogen; Carlsbad, CA) 상에 고정시키고, 비드를 결합 완충액으로 광범위하게 세척하고, 결합된 단편을 0.5 M 이미다졸을 이용하여 비드로부터 용출시킨다. 정제된 단편을 저장 완충액(50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 5% 수크로스, pH 7.8)에서 투석하였다. 주변세포질에서 발현된 Fab 단편의 소규모 분석을 위해, 15 ml의 배양물로부터 E. 콜리를 원심분리에 의해 수집하고, 10 ug/ml의 DNase가 보충된 1 ml의 용해 완충액(B-PER, Pierce Biotechnology; Rockford, IL)에 재현탁시킨다. 혼합물을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 단백질 로딩 완충액(Invitrogen; Carlsbad, CA)에서 1X로 희석하고 SDS-PAGE에 의해 분석한다.
실시예 3
pFUSE 벡터에서 인간화된 항-CD3 유전자의 설계 및 제작 - 마우스 단클론 항-CD3 항체 SP34(Harvard BIDMC)를 인간화하였다. 인실리코 분석 및 설계에 기초하여, 선택된 인간 프레임워크 스캐폴드 내로 마우스 CDR 서열 외에 다양한 마우스 프레임워크 역 돌연변이를 함유하는 3개의 가변 중쇄(vH1.0, vH1.1 & vH1.2) 및 3개의 가변 경쇄 유전자(vL1.0, vL1.1 & vL1.2)(genewiz, South Plainfield, NJ)의 합성을 수행하였다. 표 2는 도 1에 언급된 9개의 인간화된 항-CD3 Fab의 3개의 가변 중쇄(vH) 및 3개의 가변 경쇄(vL)에 보유된, 이들의 카바트 넘버링과 함께, 마우스 프레임워크 잔기(역 돌연변이)를 열거한다. 인간 프레임워크 서열로 다시 되돌려진 아미노산 잔기가 볼드체로 나타나 있다.
표 2 - 마우스 프레임워크 잔기의 목록
Figure pct00024
표 2에 나타낸 바와 같이, 가변 경쇄에 5개의 마우스 역 돌연변이(V36, G46, G49, G57 및 V58) 및 가변 중쇄에 4개의 마우스 역 돌연변이(N30, A49, I77 및 V93)가 있다. 표 2에 나타난 6개의 짧은 합성 가변 유전자를 Invivogen의 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 발현 벡터(각각 pFUSE-CHIg-HG1 및 pFUSE-CLig-hk) 내로 클로닝하여, 인간화된 항-CD3 SP34 항체를 발현하는 플라스미드를 생성하였다. 도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 인간 잔기로 전환된 5개의 모든 마우스 역 돌연변이를 갖는 가변 경쇄 vL1.0은 임의의 가변 중쇄(vH) 사슬 조합과의 결합을 상실하였다.
실시예 4
HEK293 일시적 시스템에서 인간화된 항-CD3 항체의 발현: 이전 실시예에 기재된 인간화된 SP34 항체를 각각의 vH 유전자 함유 플라스미드를 각각의 vL 유전자 함유 플라스미드와 조합함으로써 HEK293 세포 내로 일시적으로 발현시켰다(공동-형질감염). 각각의 공동-형질감염 실험으로부터의 세포 배양 배지 내의 단백질 농도를 결정하고, 추가 정제 없이 PBMC 기반 CD3 결합 분석에 직접 사용하였다. 사용된 대조군은 키메라 양성 대조군인 SP34 구조체, 및 음성 대조군인 관련없는 PSMA 항체 구조체였다. 비자연 아미노산 혼입이 없고, HC-DKTHT 연장이 있거나 없는 인간화된 항-CD3 항체를 또한 HEK293 세포에서 발현시키고 특성화하였다(표 3). 이들 항체를 저친화성 Fab 변이체를 스크리닝하는 데 사용하였다. 표 3은 본원에 개시된 Fab WT 서열을 생성하기 위해 다양한 조합으로 사용된 인간화된 항-CD3 중쇄(vH+CH1) 및 경쇄(vL+CL) 서열의 신규한 야생형(WT) 아미노산 서열을 보여준다. 또한 인간화된 항-CD3 중쇄(vH+CH1-DKTHT) 서열의 WT 아미노산 서열이 표 3에 나타나 있다.
표 3 - 야생형(WT) 아미노산 서열 - 항-CD3 중쇄(vH+CH1), (vH+CH1-DKTHT) 및 경쇄(vL+CL)
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예 5
활성화된 인간 및 시아노 PBMC와의 CD3 결합에 대한 시험: 생성된 인간화된 항-CD3 항체들을 구별하기 위해, 인간 CD3에 대한 결합을 활성화된 인간 PBMC(n=2)를 사용하여 시험하였다. PBMC의 활성화 및 후속 형광-기반 CD3 결합 분석을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(예를 들어, Angew Chem Int Ed Engl, 52(46):12101-12104, 2013 참고). 도 1에 나타낸 바와 같이, vL1.0 경쇄를 갖는 3개의 항체는 임의의 vH 중쇄 조합으로 인간 CD3에 대한 결합을 상실하였다. 활성화된 인간 및 시아노 PBMC를 각각 사용하여 인간 및 시아노 CD3 모두에 대한 나머지 6개의 인간화된 항체의 결합을 적정하였다. 도 2a-2f에 나타낸 바와 같이, 6개의 모든 인간화된 항-CD3 항체(표 3에 나타낸 3개의 vH 중쇄와 2개의 vL 경쇄 조합으로부터 조작됨)는 인간 및 시아노 CD3 모두에 대해 대등한 결합을 유지하였다. 6개의 인간화된 항-CD3 항체는 다음과 같이 수득하였다: Fab1, Fab2 및 Fab3 야생형은 각각 LC((vL1.2+CL); (서열번호: 7)) 및 HC((vH1.2+CH1); (서열번호: 1)), ((vH1.1+CH1); (서열번호: 2)) 및 ((vH1.0+CH1);(서열번호: 3))의 조합에 의해 생성되었다. Fab4, Fab 5 및 Fab6 야생형은 각각 LC((vL1.1+CL); (서열번호:8)) 및 HC((vH1.2+CH1);(서열번호:1)), ((vH1.1+CH1); (서열번호:2)) 및 ((vH1.0+CH1); (서열번호:3))의 조합에 의해 생성되었다.
데이터가 2개의 CD3 기질에 대한 결합과 관련하여 6개의 인간화된 항체 사이에 유의한 차이를 나타내지 않았으므로, Fab1(vH1.2+vL1.2 조합)을 본 발명의 중요한 측면을 추가로 입증하기 위해 선택하였다. 예를 들어, Fab1은 이전에 기재된 직교 앰버 억제 시스템(예를 들어, WO제2017/079272호, WO제2012/166560호 및 WO제2013/192360호 참고)을 통해 독점적 비자연 아미노산(UAA) 혼입 기술을 사용하는 추가 최적화를 위해 Escherichia coli에서의 발현에 사용되었다. 이들 6개의 Fab에서의 결합 활성의 유지에 필요한 마우스 프레임워크 역 돌연변이의 목록은 표 4에 나타나 있으며, 이는 도 2a-2f에 언급된 6개의 인간화된 항-CD3 Fab에서 유지된, 이들의 카바트 넘버링과 함께, 마우스 프레임워크 잔기(역 돌연변이)의 목록을 제공한다. 인간 프레임워크 서열로 되돌려진 아미노산 잔기는 볼드체로 표시되어 있다. Fab1을 생성하는 vL1.2 및 vH1.2 가변 사슬 조합(밑줄쳐짐)을 추가 변형을 위한 리드로서 선택하였다.
표 4 - 6개의 인간화된 항-CD3 Fab에서 유지된 마우스 프레임워크 잔기
Figure pct00028
실시예 6
E. 콜리 발현 벡터 내로 합성 Fab 유전자의 클로닝: 합성 Fab 유전자를 깁슨 어셈블리 클로닝 키트(Gibson Assembly cloning kit, New England Biolabs)를 사용하여 독점적 표준 E. 콜리 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 각각의 발현 플라스미드의 서열 검증 후, 각각을 표준 E. 콜리 생산 숙주 W3110B60 균주 내로 형질전환시키고, 각각의 플라스미드에 대한 단리된 단일 콜로니를 정제하여 글리세롤 바이알을 제조하였다. 글리세롤 바이알은 이들 Fab 분자의 E. 콜리 발효를 위한 생산 클론으로서 역할을 하였다. 이들 Fab를 조작하는 데 사용된 4개의 중쇄 및 3개의 경쇄의 아미노산 서열이 표 5에 서열번호: 10 내지 20으로서 나타나 있다.
표 5 - E. 콜리에서 생산된 밑줄쳐진 비자연 아미노산 pAF 혼입 부위을 갖는 인간화된 항-CD3 Fab1(vH1.2+CH1, vL1.2+CL) 중쇄 및 경쇄 서열의 아미노산 서열.
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
3개의 경쇄(LL157pAF, LK172pAF, 및 LS205pAF) pAF 변이체(서열번호: 18 내지 20), 뿐만 아니라 3개의 이중 pAF 변이체((HK129pAF+LL157pAF); (서열번호: 16 및 18)); ((HK129pAF+LK172pAF); (서열번호: 16 및 19)), 및 ((HK129pAF+LS205pAF)(서열번호: 16 및 20))를 조작하였다. 서열번호: 10 내지 13은 5-aa 중쇄 C-말단 연장 - DKTHT가 없는 중쇄 pAF 변이체를 나타낸다.
E. 콜리 발효: 항-CD3 Fab-pAF의 생산을 위한 발효 공정은 2단계로 구성된다: (i) 접종물 제조 및 (ii) 발효기 생산. 접종물은 단일 글리세롤 바이알로부터 시작되고, 해동되고, 250 mL 배플 엔렌마이어 플라스크에서 50 mL의 정의된 시드 배지 내로 1:1000(v/v) 희석되고, 37℃ 및 250 rpm에서 인큐베이션된다. 사용하기 전에, 발효기를 세척하고, 오토클레이브한다. 지정된 양의 기초 배지를 발효기에 첨가하고, 증기 멸균한다. 접종 전에 지정된 양의 카나마이신 설페이트 용액, 공급 배지 및 P2000 소포제를 기초 배지에 첨가된다. 오토클레이브 후 발효기에 첨가된 모든 용액은 무균 첨가 전에 0.2 μm 여과하거나 오토클레이브한다.
생산 발효기는 접종물의 내용물의 무균 이동에 의해 0.0004의 표적 OD600으로 접종된다. 접종 후, 배양물을 OD600의 결정을 위해 적절한 간격으로 샘플링한다. 온도, pH 및 용존 산소를 모니터링하고 각각 37℃, 7.0, 및 ≥ 30%의 지정된 설정점으로 제어한다. pH를 수산화 암모늄 용액 또는 황산을 첨가하여 제어한다. 용존 산소는 교반 속도를 변화시키고 살포된 공기/산소 혼합물 내의 산소의 조성을 증가시킴으로써 제어한다. 소포제는 발포를 제어하기 위해 발효 공정 동안 첨가한다.
세포 밀도가 > 25의 OD600에 도달하면, 공급 배지 덩어리를 첨가한다. 세포 밀도가 > 50의 OD600에 도달하면, 발효 끝까지 0.052 mL/L-시작 부피/분으로 감소될 때까지 공급 배지를 32시간 동안 0.094 mL/L-시작 부피/분의 일정한 유속으로 첨가한다. 공급 시작 직후, 지정된 양의 비자연적으로 코딩된 아미노산(예를 들어, pAF) 용액을 무균으로 첨가하여 비자연 아미노산을 단백질 아미노산 서열 내로 혼입시킨다. 동시에, 온도는 성장 동안 사용된 37℃로부터 생산을 위해 27℃로 이동한다. 생산은 phoA 프로모터에 의해 제어되고 배지 내의 포스페이트 수준이 고갈될 때 시작한다. 채취는 유도 후 대략 48시간에 개시된다.
실시예 7
정제 및 폴레이트 및 PEG-폴레이트에의 접합: 본 발명의 항-CD3 Fab를 E. 콜리 세포에서 생산하고 전체 세포 용해물(WCL) 상층액으로부터 회수한다. 세포 용해를 4℃에서 수행한다. 세포를 원래의 발효 부피와 동일한 부피에서 100 mM 아세트산, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 3.5에서 용해하여, 4.1-4.2의 용해 후 pH를 생성한다.
용해 후, WCL을 4℃에서 30분 동안 15,900 x g에서 원심분리하고 여과(0.8/0.2 마이크론)하여 침전된 단백질 및 세포 파편을 제거한다. 이후, Capto S 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 E. 콜리 WCL 상층액으로부터 항-CD3 Fab를 포획한다. Capto S 컬럼 후, 부틸 HP 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 연마 컬럼으로 사용하여 Capto S 용리 풀에 존재하는 생성물 관련 불순물로부터 온전한 항-CD3 Fab를 단리한다. 이후, 온전한 항-CD3 Fab를 함유하는 부틸 HP 용리 풀을 50 mM 아세테이트, 5% 트레할로스, pH 4.0 내로 완충액 교환하고 농축하여 폴레이트 또는 PEG-폴레이트와의 접합을 준비한다. 이 단계는 4℃에서 수행되며, Amicon Ultracel 10K 재생 셀룰로오스(15 mL) 원심분리 장치를 사용한다.
50 mM 아세테이트, 5% 트레할로스, pH 4 내로 완충액 교환 및 농축 후, 암 세포 상의 폴레이트 수용체를 표적화하기 위해 항-CD3 Fab를 폴레이트 또는 PEG-폴레이트와 접합시킨다. 접합 반응은 28℃, pH 4에서 24-48시간 동안 수행한다. 폴레이트와의 접합 후, 항-CD3 Fab-폴레이트를 제제 완충액, 50 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 5% 트레할로스, pH 6.0 내로 완충액 교환한다. 이 단계는 4℃에서 수행되며, Amicon Ultracel 10K 재생 셀룰로오스(15 mL) 원심분리 장치를 이용한다. PEG-폴레이트와의 접합 후, Toyo SP 5PW 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 접합되지 않은, 단일 및 이중 접합된 항-CD3 Fab-PEG-폴레이트를 분리한다.
CD3 Fab 폴레이트-5KPEG, CD3 Fab 폴레이트-10KPEG, CD3 Fab 폴레이트-20KPEG, CD3 Fab 폴레이트-(5K)2PEG, CD3 Fab 폴레이트-(10K)2PEG, 화합물을 생성하였다. 완충액 용액(pH 4의 50 mM 아세테이트, 5% 트레할로스)에서의 CD3 Fab에, 원하는 폴레이트-PEG(5K, 10K, 20K, 5K2, 또는 10K2 PEG)를 28℃에서 첨가하였다. 1시간 후, 혼합물을 양이온 교환 크로마토그래피(Toyo SP 5PW)에 의해 정제하고, 원심 필터(c/o 10K)를 사용하여 50 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 5% 트레할로스, pH 6.0 완충액과 함께 제제화하여 원하는 CD3 Fab-폴레이트-페길화된 조성물을 수득하였다. CD3 Fab 폴레이트 접합체의 구조, 화학, 및 접합이 본원에 기재되며, 도 12a-12d에 예시되어 있다.
추가로, CD3 Fab 폴레이트-페길화된 C-말단 접합체를 생성하였다. PBS(2.0 mL) 중의 CD3 폴레이트(8.0 mg)에, EDTA(6.7 uL, 0.5 M, pH8) 및 DTT(0.4 mg)를 첨가하고, 용액을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물을 PBS 용리액 중의 5 mmol EDTA를 갖는 탈염 컬럼에 의해 정제하였다. 혼합물에 Mal-PEG를 다양한 농도(4.2 mg 5K, 8.2 mg 10K, 또는 16 mg 20K)로 실온에서 첨가하였다. 2시간 후, 혼합물을 Toyo SP 5PW 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하여 CD3 Fab 폴레이트-(PEG5K)2 C-말단 접합체, CD3 Fab 폴레이트-(PEG10K)2 C-말단 접합체, 및 CD3 Fab 폴레이트-(PEG20K)2 C-말단 접합체를 수득하였다. C-말단 PEG 접합체의 구조, 화학 및 접합이 본원에 기재되어 있으며 도 12e-12f에 예시되어 있다.
실시예 8
시험관내 결합 및 사멸 분석: 다양한 중쇄 부위(HA114, HS115, HK129, HT160)에 접합된 폴레이트를 갖는 정제된 인간화된 항-CD3 Fab를 초기에 이들 위치에 pAF를 갖는 상응하는 접합되지 않은 단백질뿐만 아니라 대조군으로서 WT 단백질을 갖는 인간 및 시아노 CD3에 대한 결합에 대해 시험하였다. 표 6은 활성화된 인간 및 시아노 PBMC에 대한 E. 콜리 세포로부터 정제된 변형된 항-CD3 Fab1 단백질의 EC50을 보여준다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 상이한 부위에서의 pAF 또는 접합된 폴레이트는 이들의 CD3 결합을 유의하게 방해하지 않았다.
표 6. 변형된 항-CD3 Fab1 단백질의 결합
Figure pct00032
이들 폴레이트-접합된 항-CD3 Fab의 세포독성을 50 nM 혈청 폴레이트(SFA)가 있거나 없는 E:T=10:1에서 SKOV-3 세포를 갖는 활성화된 인간 및 시아노 PBMC를 이용하여 시험하였다. 세포독성 분석은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(예를 들어, Angew Chem Int Ed Engl, 52(46):12101-12104, 2013 참고). 간략하게, 다양한 E:T 비율에서 효과기 세포(활성화된 PBMC 또는 비활성화된 PBMC) 및 표적 세포(SKOV-3, KB 등)를 밤새 또는 표시된 바와 같이 다양한 농도의 항-CD3 Fab-폴레이트와 함께 U-바닥 96-웰 플레이트에서 공동 인큐베이션하였다. 배양 배지 내로 방출된 LDH의 양을 세포독성 지표로서 사용하였고, 제조업체의 지침에 따라 프로메가(Promega)의 비방사성 세포독성 분석 키트로 측정하였다.
표 7에 나타낸 바와 같이, 폴레이트 접합 부위 사이에서 사멸 EC50에 유의한 차이가 없었다. 그러나, 유리 SFA에 의한 경쟁적 억제로 인해 SFA가 없는 것과 비교하여 50 nM SFA가 존재할 때 세포독성 EC50의 약 15-60배 감소가 관찰되었다. 또한, 시아노 EC50은 각각의 변이체에 대해 인간 EC50보다 약 10배 높았다.
표 7 - SKOV-3 세포에 대한 변형된 항-CD3 Fab1 단백질의 세포독성
Figure pct00033
실시예 9
다양한 폴레이트 수용체(FRα) 수준을 갖는 다양한 FOLRα 종양 세포주에 대한 항-CD3-폴레이트 변이체의 세포독성: 3개의 상이한 항-CD3 Fab-폴레이트 접합체의 활성을 이들의 세포 표면에 다양한 수준의 FRα 과발현을 갖는 6개의 상이한 세포주를 이용한 시험관내 세포독성 분석에 의해 HA114, HS115 및 HK129 부위에서 시험하였다(표 8). FRα 수는 폐포 기저 상피 세포 암종 A549 세포주에서 세포당 5,700개부터 비인두 암 세포주에서 세포당 1,630,000개까지 다양하였다. 세포를 활성화된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC; 표적:효과기 세포의 비율 1:10)와 공동 배양하고, 50 nM SFA의 존재 하에 다양한 농도의 항-CD3 Fab-폴레이트으로 처리하였다. 세포독성은 용해된 세포로부터 방출된 LDH 수준을 측정하고, CellTiter-Glo 및 FACS 기반 독성 분석을 이용하여 정량화하였다.
표 8 - 다양한 FRα 종양 세포주에 대한 항-CD3-폴레이트 변이체의 세포독성
Figure pct00034
3개의 모든 상이한 접합 부위에서의 항-CD3 Fab-폴레이트 접합체는 10K 초과의 FRα를 갖는 5개의 모든 세포주의 효율적인 사멸을 입증하였다. 그러나, 5,700의 FRα를 갖는 임의의 부위 접합체를 갖는 A549 세포주에서는 사멸이 관찰되지 않았다. 효율적인 사멸을 위해 약 10,000 FRα의 임계가 있는 것 같지만; 사멸 활성은 10K의 상기 임계 값을 초과하는 FRα 수와 무관한 것으로 보인다. 시험관내 사멸 EC50은 항체 내의 폴레이트 접합 부위 상에서 유의하게 변하지 않았으므로, HK129 위치를 추가 실험을 위한 폴레이트 접합 부위로 선택하였다.
실시예 10
본 실시예는 단일 부위에서 폴레이트-PEG 접합시 또는 제2 폴레이트(바이폴레이트)의 첨가시에 다양한 항-CD3 Fab1-HK129-pAF 분자의 시험관내 결합 친화성 및 세포독성 활성에 대한 효과를 입증한다.
폴레이트-PEG 접합의 효과: 표 9는 결합에 대한 효과를 보여주고, 표 10은 본원에 기재된 바와 같은 이작용성 링커를 사용하여 5K 또는 20K 선형 PEG 분자와 폴레이트와의 접합시 세포독성을 보여준다. 5K 또는 20K PEG 크기에 따라 활성화된 인간 및 시아노 PBMC 모두에 대해 결합의 완만한 감소(1.7 내지 8.4배)가 관찰되었다. 그러나, 세포독성 활성은 인간 및 시아노 PBMC 모두에 대해 5K PEG와 비교하여 20K PEG에서 크게 감소하였다(3.7 내지 5.6배 대 50 내지 58배). 이 실험에 기초하여, 20K PEG 대신에 5K PEG룰 반감기 연장에 사용하였다.
표 9 - CD3 결합
Figure pct00035
표 10 - 세포독성
Figure pct00036
이중 폴레이트(바이폴레이트) 접합의 효과: 표 11은 시험관내 결합에 대한 중쇄 HK129 부위와 조합된 2개의 경쇄 부위(LL157 및 LK172)에서의 제2 폴레이트 접합의 효과를 보여주고, 표 12는 세포독성을 보여준다. 예상대로, HK129 단일 폴레이트 분자보다 바이폴레이트 변이체에서 결합 친화성 및 세포독성 활성 모두의 약간의 증가가 관찰되었다. 이중 대 단일 폴레이트 분자의 세포독성의 약간의 증가는 또한 50 nM SFA의 존재 또는 부재에서 명백하였다. 이 실험에 기초하여, LK172 부위보다 LL157 부위를 향후 연구를 위해 HK129 부위와 조합하여 사용하였다.
표 11 - CD3 결합
Figure pct00037
표 12 - 세포독성
Figure pct00038
결합 친화성 및 시험관내 세포독성의 요약: 표 13은 페길화 및 제2 폴레이트 접합으로 인한 다양한 항-CD3 Fab의 결합 및 세포독성 활성에 대한 효과를 요약한다. CD3 및 FRα 모두에 대한 결합 친화성의 약간의 감소는 효능의 유의한 감소를 초래하며, PEG 크기와 관련이 있다. 바이폴레이트 분자의 접합은 CD3 결합 친화성의 일부 감소에도 불구하고 FRα에 대한 친화성 및 이에 의한 세포독성 효능을 증가시켰다. PEG 접합으로 인한 두 표적에 대한 친화성의 감소에도 불구하고, 모든 CD3-Fab-폴레이트 분자의 시험관내 사멸 EC50은 37 내지 335 pM의 범위에서 높은 효능을 유지하였다.
표 13 - 페길화된 다양한 항-CD3 Fab의 결합 및 세포독성 활성.
Figure pct00039
실시예 11
항-CD3 Fab1 분자에 의한 SKOV-3 세포의 세포독성에 대한 다양한 효과기 대 표적(E:T) 세포 비율의 효과: SKOV-3 세포의 세포독성에 대한 E:T 비율의 효과를 시험하기 위해, 3개의 항-CD3 Fab1 분자의 세포독성 분석을 50 nM SFA의 존재 하에 10:1, 5:1, 1:1, 1:5 및 1:10의 E:T 비율에서 수행하였다. 예상대로, 그리고 표 14에 나타낸 바와 같이, E:T 비율은 시험관내 사멸 효능과 상관관계가 있었다. E:T=1:1에서, 바이폴레이트 분자에 대해 EC50의 2배 증가가 관찰된 반면, 5KPEG-폴레이트 분자에서 8배 감소가 관찰되었다. 3개의 모든 분자는 10:1 내지 1:10의 E:T 비율 내에서 1.69 내지 175 pM의 EC50으로 매우 강력한 상태를 유지하였다.
표 14 - 시험관내 세포독성에 대한 효과기 대 표적(E:T) 세포 비율
Figure pct00040
실시예 12
혈장 반감기를 연장하기 위한 항-CD3 Fab1 분자의 페길화: 랫트에서 PEG 접합이 있거나 없는 항-CD3 Fab1-폴레이트 접합체의 약동학 특성을 조사하였다. 수컷 스프라구에 다울레이 랫트(약 7주령)를 사용하였다. 투여일에, 각 동물의 체중을 측정하였다. kg 체중당 1 mg의 접합되지 않은 및 접합된 항-CD3 항체 샘플을 각각 3마리의 랫트의 꼬리 정맥 내로 정맥내 주사하였다. 주사 후 상이한 시점에, CO2 마취 하에 각 랫트로부터 500 μl의 혈액을 채혈하였다. 혈액 샘플을 실온에서 1.5시간 동안 보관한 다음, 원심분리(4℃, 18000 x g, 5분 동안)에 의해 혈청을 단리하였다. 혈청 샘플을 분석 당일까지 -80℃에 보관하였다. 혈청 샘플 내의 활성 항-CD3 항체의 양은 얼음 상에서 샘플을 해동한 후 항-CD3 항체 시험관내 활성 분석에 의해 정량화하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 혈청 농도는 1시간 미만의 혈청 반감기로 동일한 속도로 2개의 항-CD3 Fab1-폴레이트 및 상응하는 접합되지 않은 항-CD3 Fab1에 대해 빠르게 감소하였다. 반면, 2개의 PEG-접합된 항-CD3 Fab1의 혈청 반감기는 각각 5KPEG 및 Bi5KPEG에 대해 6.1시간 및 10.6시간까지 유의하게 연장되었다. 표 15는 랫트에서 다양한 항-CD3 Fab1 분자의 IV 투여 후 다양한 PK 매개변수를 보여준다. 이 데이터는 Bi5KPEG-바이폴레이트가 T1/2을 연장시키고 AUC를 유의하게 증가시킨다는 것을 예시한다(Fab1-폴레이트 대비 13.2배 및 Fab1-5KPEG-폴레이트 대비 3.9배).
표 15 - 랫트에서 다양한 Fab1 분자의 약동학
Figure pct00041
실시예 13
본 실시예는 HEK293 세포에서 항-CD3 저친화성 항체 변이체에 대한 생성 및 스크리닝을 입증한다.
마우스 역 및 생식계열 돌연변이의 디콘볼루션(de-convolution): 항-CD3 항체의 인간화 동안 수득된 vH 및 vL 서열 모두에 대한 마우스 프레임워크 잔기(역 돌연변이)를 한 번에 하나씩 다시 인간 생식계열 잔기로 다시 되돌려 항원 결합에 대한 이들의 효과(디콘볼루션)를 관찰함으로써 조사하였다. vH 서열의 경우, 카바트 위치 30, 49, 77 및 93에서의 4개의 마우스 프레임워크 잔기(역 돌연변이)는 항원 결합에서 중요한 역할을 하는 것으로 예측되었다(표 2-3 및 16-17). 유사하게, vL 서열의 경우, 카바트 위치 36, 46, 49, 57 및 58에서의 5개의 마우스 프레임워크 잔기(역 돌연변이) 역시 항원 결합에서 중요한 역할을 하는 것으로 예측되었다.
표 16 - 항-CD3 Fab1 경쇄(LC) 역 및 생식계열 돌연변이 위치
Figure pct00042
표 17 - 항-CD3 Fab1 중쇄(HC) 역 및 생식계열 돌연변이 위치.
Figure pct00043
항원 결합에 대한 효과(디콘볼루션)를 평가하기 위해, 4개의 새로운 vL(vL2.1 내지 vL2.4) 및 3개의 새로운 vH(vH2.1 내지 vH 2.3) 플라스미드(표 16-17에서 라운드 1 플라스미드)를 생성하였다. 이들 vH 및 vL 플라스미드를 HEK293 세포를 이용한 공동 형질감염 실험에서 상기 실시예에 기재된 원래의 vH 및 vL 플라스미드(표 16-17에서 라운드 0 플라스미드)와 함께 사용하였다. 총 35회의 일시적 형질감염을 라운드 1 스크리닝에서 수행하였고, 세포 배양 상층액을 직접 사용하여 하기 및 상기 실시예에 기재된 결합에 대해 스크리닝하였다.
라운드 1로부터의 스크리닝 결과에 기초하여, 3개의 추가의 vH 플라스미드(vH2.4 내지 2.6)(표 16-17에서 라운드 2 플라스미드)를 생성하여 개별 역 돌연변이의 추가 효과를 평가하였다. 유사한 방식으로, vL(vL2.5)에 대한 새로운 플라스미드를 2개의 마우스 역 돌연변이를 조합함으로써 생성하였다. 추가로, vH 및 vL CDR 내에서 발견된 마우스 생식계열 돌연변이를 이 라운드에서 감소된 결합을 부여하기 위해 분석하였다. 이를 위해, 3개의 새로운 vH 플라스미드(vH3.1 내지 3.3)(표 16-17에서 라운드 2 플라스미드)를 HC-CDR1 내의 카바트 위치 N35 및 HC-CDR2 내의 Y52c에서의 아미노산을 변경함으로써 생성하였다. 유사한 방식으로, vL 플라스미드(vL3.1)(표 16-17에서 라운드 2 플라스미드)를 LC-CDR2 내의 카바트 위치 K53에서의 아미노산을 변경함으로써 생성하였다. 라운드 2 스크리닝 실험을 다양한 vL/vH 플라스미드 쌍을 선택적으로 조합함으로써 총 43개의 형질감염으로 수행하였다.
인간 및 시아노 CD3 결합에 대한 스크리닝: HEK293 배양 상층액을 스크리닝 단계에서 인간 CD3에 대한 결합을 시험하는 데 직접 사용하였다. 라운드 1 실험에서, 처음에는 35개의 클론을 3개의 상이한 단백질 농도에서 인간 CD3에의 결합에 대해 시험하였고, 13개를 인간 및 시아노 CD3 모두에 대한 상세한 결합 분석을 위해 선택하였다. 각각의 클론에 대해 11점 결합 적정 곡선을 인간(도 4a) 및 시아노 CD3(도 4b)에 대해 생성하였다. 데이터에 기초하여, Fab 7 내지 10을 추가 평가를 위한 저친화성 후보로서 선택하였다(도 4a-4b). 유사하게, 43개의 클론을 라운드 2 실험에서 스크리닝하였다. 라운드 1에 대해 상기 기재된 바와 같은 2단계 스크리닝 후, 11개의 저친화성 변이체를 수득하였고, 이중 4개가 도 5a-5b에 표시된 바와 같이 나타나 있다.
이후, 이들 15개의 저친화성 항-CD3 Fab 변이체(라운드 1로부터의 Fab 7-10 및 라운드 2로부터의 Fab 11-21)를 하기 실시예에 기재된 바와 같이 비자연 아미노산(UAA) 혼입 및 추가 시험을 위해 E. 콜리 발현 시스템 내로 전환시켰다. 도 6a는 도 4a에 나타낸 바와 같은 동일한 야생형 Fab의 Fab-폴레이트 접합체를 나타낸다. 라운드 2 스크리닝으로부터 수득된 야생형 Fab를 대표하는 Fab-폴레이트 접합체가 도 6b에 도시되어 있다. 표 18은 저친화성 돌연변이의 목록뿐만 아니라 이들의 HC, LC 및 Fab ID를 보여준다. 나타낸 바와 같이, 마우스 프레임워크 역 돌연변이 및 생식계열 CDR 돌연변이 모두는 인간 및 시아노 CD3 모두에 대한 감소된 결합을 부여하는 데 중요한 역할을 한다. 가변 경쇄(vL)에서, LC-CDR2 내의 카바트 위치 V36, G46, G49, G57 및 V58에서의 5개의 마우스 역 잔기 및 카바트 위치 K53에서의 하나의 마우스 생식계열 잔기는 감소된 결합에 관여하였다. 가변 중쇄(vH)에서, 카바트 위치 N30, A49, I77 및 V93에서의 4개의 마우스 역 잔기 및 HC-CDR1 내의 카바트 위치 N35 및 HC-CDR2 내의 위치 Y52c에서의 2개의 마우스 생식계열 감소된 결합에 관여하였다.
표 18 - 저친화성 인간화된 항-CD3 Fab 변이체에서 돌연변이의 목록
Figure pct00044
표 19 - HEK293 세포에서 Fab의 저친화성 변이체를 스크리닝하는 데 사용된 인간화된 항-CD3 중쇄(vH+CH1), (vH+CH1-DKTHT) 및 경쇄(vL+CL)의 아미노산 서열
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
서열번호: 21 내지 29는 저친화성 변이체 Fab를 스크리닝하는 데 사용된 5-aa C-말단 연장 - DKTHT를 갖는 중쇄의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 30 및 38은 5-aa 중쇄 C-말단 연장이 없는 이들 인간화된 중쇄 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 39는 HEK293 세포에서 저친화성 변이체 Fab를 스크리닝하는 데 사용된 경쇄의 아미노산 서열을 나타낸다.
실시예 14
본 실시예는 중쇄 HK129 앰버 돌연변이를 갖는 E. 콜리 세포로부터 생산된 저친화성 인간화된 항-CD3 Fab 변이체의 제작, 발현, 정제 및 시험을 입증한다.
E. 콜리 발현 벡터 내로의 클로닝: 상기 실시예에 기재된 바와 같이 중쇄 HK129 위치에 삽입되고 독점적 E. 콜리 발현 벡터 내로 클로닝된 앰버 TAG 정지 코돈을 갖는 STII-LC-Spacer-STII-HC 발현 카세트 구성을 갖는 표 20, 서열번호: 40-62에 개시된 모든 저친화성 변이체에 대해 합성 유전자를 디자인하였다. 이들 Fab를 조작하기 위해 사용된 중쇄 및 경쇄 모두의 아미노산 서열은 서열번호: 40 내지 62로서 나타나 있다. 서열번호: 40 내지 48은 시험에 사용된 5-aa 중쇄 C-말단 연장 - DKTHT를 갖는 인간화된 중쇄 HK129 pAF 변이체를 나타낸다. 서열번호: 49 및 57은 5-aa 중쇄 C-말단 연장 - DKTHT가 없는 이들 인간화된 중쇄 HK129 pAF 변이체를 나타낸다. 서열번호: 58-62는 서열번호: 40 내지 48의 HK129pAF-DKTHT 변이체와 조합되어 사용된 경쇄 서열을 나타내며, 이는 E. 콜리에서 발현되고 추가로 특성화되었다.
표 20 - E. 콜리에서 발현된 저친화성 항-CD3 Fab-HK129pAF 중쇄 및 경쇄 서열의 아미노산 서열. 또한 하기 표에 모든 서열이 또한 개시되어 있으며, 여기서 pAF는 임의의 다른 비자연 아미노산에 의해 대체된다.
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
발효, 정제 & 폴레이트 접합: E. 콜리 발효, 정제, 폴레이트 접합 및 접합 후 정제를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 수행하였다.
인간 및 시아노 CD3에 대한 폴레이트 접합된 Fab의 결합: 인간화된 항-CD3 Fab의 E. 콜리 생산되고 폴레이트 접합된 저친화성 변이체의 결합을 상기 실시예에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 6a-6b는 양성 대조군 Fab1과 함께 항-CD3 Fab-HK129-폴레이트의 저친화성 Fab 변이체의 2개의 서브세트에 대한 인간 CD3에의 결합 친화성을 보여준다. 시험한 저친화성 Fab 중에서, 10개는 시험한 가장 높은 농도(1000 nM)에서도 인간 CD3에 유의하게 결합하지 못하였다. 나머지 4개의 Fab(Fab 7 내지 10; 표 18에 기재됨)의 결합 EC50은 2.31 nM인 대조군 Fab1과 비교하여 23.4 nM 내지 83.6 nM로 다양하였다. Fab 21은 1000 nM 농도에서도 포화하지 않는 약한 결합 활성을 나타내었다. 매우 유사한 결합 프로파일이 도 7a-7b에 나타낸 바와 같이 시아노 CD3 결합에 대해 관찰되었다.
인간 및 시아노 PBMC를 이용한 폴레이트 접합된 Fab의 세포독성 분석: 저친화성 Fab의 세포독성을 상기 실시예에 기재된 바와 같이 수행하였다. 도 8은 SKOV-3 세포를 이용한 활성화된 인간 PBMC의 세포독성 데이터를 보여준다. 나타낸 바와 같이, 인간 CD3에 대해 10 내지 36배 감소된 결합 친화성을 갖는 4개의 모든 Fab(도 6a-6b)는 대조군 Fab1(도 8)과 비교하여 대등한 사멸 활성을 나타내었다. 3개의 Fab(Fab 11, 19, 및 20)는 어떤 세포독성 활성도 나타내지 않았다(데이터 미제시). 모든 다른 8개의 Fab는 1000 nM 농도에서도 결합하지 못하였음에도 불구하고 대등한 사멸 활성을 나타내었다. 활성화된 시아노 PBMC에서 매우 유사한 세포독성 프로파일이 관찰되었다(도 9).
실시예 15
본 실시예는 인간화된 항-CD3 저친화성 항체 변이체의 T 세포 활성화 및 사이토카인 방출 분석을 입증한다.
T 세포 활성화/사이토카인 방출 분석: 정제된 인간 T 세포 및 T 세포 고갈된 인간 PBMC를 각각 EasySep 인간 T 세포 농축 키트 및 EasySep 인간 CD3 양성 선택 키트(STEMCELL Technologies Inc)에 의해 동일한 부피의 전혈로부터 단리하였다. 단리된 T 세포 및 부속 세포의 순도를 유세포 분석법에 의해 확인하였다. 부속 세포의 존재 하에 T 세포의 활성화를 선택적으로 모니터링하기 위해, 정제된 T 세포를 T 세포 고갈된 인간 PBMC와 혼합하기 전에 제조사의 프로토콜에 따라 Cellvue Lavender 세포 라벨링 키트(eBioscience)로 표지하였다. 생성된 재구성된 PBMC를 항-CD3 Fab 변이체의 존재 하에 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 48시간 후, 세포를 APC-Cy7-접합된 항-인간 CD25(Biolegend) 또는 PE-접합된 항-인간 CD69(BD Biosciences)로 표지하고 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 배양된 상층액에서의 IFNγ 및 TNFα의 방출을 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA) 키트(R&D System)에 의해 측정하였다.
도 10a-10b에 나타낸 바와 같이, SKOV-3 세포의 존재 하에 달성된 유의한 T 세포 활성화(CD25 및 CD 69 T 세포 마커에 의함)는 다양한 저친화성 항-CD3 Fab-HK129-폴레이트 분자에 대해 강하게 용량 의존적이다. 유사한 상관관계가 각각 SKOV-3 종양 세포의 부재 및 존재하에 IFNγ에 대한 사이토카인 방출 분석 도 11a-11b에서 관찰되었고 SKOV-3 종양 세포의 부재 및 존재하에 TNFα에 대한 사이토카인 방출 분석 도 11c-11d에서 관찰되었다.
저친화성 변이체 특성화의 요약: 표 21은 HK129-폴레이트 변형을 갖는 12개의 저친화성 항-CD3 Fab 변이체에 대한 결합 및 세포독성 데이터(인간 및 시아노 CD3), 뿐만 아니라 T 세포 활성화(CD25 및 CD69 마커), 및 사이토카인 방출(IFNγ 및 TNFα) 분석을 요약한다. 나타낸 바와 같이, CD3 결합 강도, 세포독성 잠재성, T 세포 활성화 및 사이토카인 방출 사이에 일반적인 상관관계가 있다.
표 21 - 다양한 항-CD3 Fab-HK129-폴레이트 저친화성 변이체에 의한 CD3 결합, 시험관내 세포독성, T 세포 활성화 및 사이토카인 방출의 요약.
Figure pct00052
데이터 세트에 기초하여, 마우스에서의 생체내 시험을 포함하는 상세한 시험관내 특성화를 위해 3개의 저친화성 변이체 Fab9, Fab10, Fab21을 모 분자 Fab1과 함께 선택하였다. 표 22는 세포독성 및 2개의 사이토카인의 생산과 관련된 이들 변이체 사이의 비교를 보여준다. 나타낸 바와 같이, 사이토카인 생산은 T 세포 활성화 및 사멸에 대한 것보다 훨씬 더 높은 EC50을 갖는다. 따라서, 사이토카인 방출이 심각한 유의한 안전성 문제를 일으키지 않지만 사멸 효능 및 T-세포 활성화가 손상되지 않는 항-CD3 Fab 농도의 범위를 확인할 수 있다. 이 항-CD3 항체 친화성 미세 조정 접근법은 이러한 2개의 반대 사건의 분리를 허용하고, 효능을 손상시키지 않으면서 더 나은 안전성 프로파일을 달성할 수 있다.
표 22 - HK129-폴레이트 변형을 갖는 3개의 선택된 저친화성 변이체의 특성화
Figure pct00053
실시예 16:
항-CD3 Fab1, 9 & 10의 인실리코 면역원성 분석: 잠재적인 면역원성을 평가하기 위해, 항-CD3 Fab1, Fab9 및 Fab10의 아미노산 서열을 'HLA 클래스 II - 글로벌 v4.0' 설정(Lonza, UK)을 사용하여 Lonza의 Epibase 플랫폼에 기초하여 T 헬퍼(Th)-세포 에피토프로도 알려진 추정상의 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 II 제한된 에피토프의 존재에 대해 인실리코로 스캐닝하였다. 표적 서열로부터 유래된 모든 가능한 10머 펩타이드의 HLA 결합 특이성을 분석하였다. 프로파일을 43개의 DRB1, 8개의 DRB3/4/5, 22개의 DQ 및 12개의 DP, 즉, 총 85개의 HLA 클래스 II 알로타입에 대해 알로타입 수준에서 수행하였다. 자가-펩타이드에 해당하는 펩타이드는 '생식계열 여과된(germline filtered)' 펩타이드로 별도로 처리하였다. 결과의 일반적인 개요로서, 표 23은 DRB1, DRB3/4/5, DQ 및 DP 유전자에 해당하는 강한 결합제의 수(에피토프 수)를 보여준다. 항원에 대해 생성된 체액 반응에서와 같이, 관찰된 Th 세포 활성화/증식은 일반적으로 DRB1 특이성의 측면에서 해석된다. 표 23의 결과는 Fab 1, Fab9 및 Fab10이 각각 강한 잠재적인 DRB1 결합제 13, 11 및 13에 해당하였음을 보여준다. 표 24는 인간화된 치료 항체와 대등한 글로벌 집단에서의 이들 3개의 Fab 각각에 대한 DRB1 위험 스코어를 보여준다. 3개의 Fab 중에서, Fab9는 최소 면역원성이다.
표 23. DRB1, DRB3/4/5, DQ 및 DP 유전자에 해당하는 HLA 결합제(에피토프 수).
Figure pct00054
표 24. 글로벌 집단에서 3개의 Fab의 DRB1 위험 스코어.
Figure pct00055
실시예 17
도 12a-12f에 예시된 이작용성 PEG-폴레이트 링커의 설계 및 합성. 본 실시예는 다양한 PEG-폴레이트 링커 화합물의 합성 경로 및 구조를 입증한다.
Figure pct00056
본 실시예는 화합물 10의 합성을 위한 합성 경로를 입증한다.
Figure pct00057
N 10 - 트리플루오로아세틸프테로산 (2). 둥근 바닥 플라스크 내의 1.0 g 프테로산(pteroic acid)(1)에 10 ml의 트리플루오로아세틱 무수물을 질소 하에 10분 동안 적가하였다. 반응 혼합물을 빛이 없는 곳에서 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 진갈색 용액을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 증발시켰다. 생성된 점성 갈색 오일을 에테르로 분쇄하고, 분리된 침전물을 여과에 의해 수집하고, 에테르로 세척하고, 밤새 진공 하에서 건조시켜 연갈색 분말로서 조 중간체를 수득하였다. 조 아실화된 물질을 무수 THF에 재현탁시키고 얼음으로 처리하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 10시간 동안 교반하였고; 이 시간 동안 연갈색 침전물을 분리하였다. 반응 혼합물을 에테르로 희석하고, 침전물을 여과에 의해 수집하고, 에테르로 세척하고, 진공 하에서 밤새 건조시켜 연갈색 분말로서 N 10 -트리플루오로아세틸프테로산(2)(1.45 g 조)를 수득하였고, 이를 추가 정제 없이 다음 반응에 사용하였다.
N 10 - 트리플루오로아세틸프테로산 OSu 에스테르(3). 무수 DMSO 중의 N 10-트리플루오로아세틸프테로산(2)의 용액을 N-하이드록시석신이미드(0.43 g)로 처리한 다음, 실온에서 한 부분으로 EDCI-HCl(2.04 g)을 처리하였다. 생성된 어두운 용액을 주위 온도에서 24시간 동안 교반하고 빙냉수(40 ml)로 희석하였다. 분리된 미세한 갈색 침전물을 원심분리에 의해 수집하고, 냉수로 세척하고, 밤새 건조시키고, 진공 하에서 1일 동안 건조시켜 갈색 분말로서 화합물(3), MS(ESI) m/z 506(M+H)+을 수득하였다.
Fmoc - Glu - O t Bu - Lys ( Boc )- O t Bu (7). 무수 THF(40 mL) 중의 Fmoc-Glu-OtBu(4)(4.26 g) 및 N-하이드록시석신이미드(1.15 g)의 혼합물에 실온에서 한 부분으로 DCC(2.06 g)를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 밤새 교반한 다음, 고체를 여과하고, THF로 세척하였다. 조합된 여과물을 증발 건조시키고 진공 하에서 건조시켜 흰색 포말로서 조 Fmoc-Glu(OSu)-O t Bu(5)(5.3 g)를 생성하였다. 이 물질을 THF(20 mL)에 재용해시키고, 실온에서 무수 THF(50 mL) 중의 H-Lys(Boc)-OtBu-HCl(6)(3.39 g), 및 DIPEA(3.5 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 HPLC 분석에 의해 반응이 완료된 것으로 판단될 때까지 주위 온도에서 4시간 동안 교반하고, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트(100 mL)에 재용해시키고, 10% 수성 시트르산(50 mL), 물(50 mL), 및 염수(50 mL)로 세척하고, 황산 나트륨으로 건조시켰다. 진공 하에서 용매를 제거한 후, 잔류물을 5% 에테르/헥산(50 mL)으로 분쇄하였다. 분리된 흰색 고체 생성물을 여과하고, 헥산으로 세척하고, 진공 하에서 건조시켜 Fmoc-Glu-O t Bu-Lys(Boc)-O t Bu(7)를 수득하였다.
H- Glu - O t Bu - Lys ( Boc )- O t Bu (8). DCM 중의 Fmoc-Glu-O t Bu-Lys(Boc)-O t Bu(7)의 용액을 디에틸 아민으로 처리하였다. 생성된 용액을 HPLC 분석에 의해 탈보호가 완료된 것으로 판단될 때까지 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 모든 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 먼저 디클로로메탄으로 용리한 다음 디클로로메탄 중의 5-10% MeOH로 용리하는 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 무색 오일로서 H-Glu-O t Bu-Lys(Boc)-O t Bu(8)를 수득하였다.
화합물 9: 무수 DMF 중의 아민 8의 용액을 한 부분으로 N 10-트리플루오로아세틸프테로산 OSu 에스테르(3)로 처리하였다. 생성된 혼합물을 HPLC 분석에 의해 완료를 모니터링하면서 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 에틸 아세테이트 중의 10% 메탄올로 용리하는 실리카 겔 패드를 통해 여과하였다. 조합된 여과물을 증발 건조시키고, 에틸 아세테이트에 재용해시키고, 10% 수성 시트르산, 물, 포화 NaHCO3, 및 염수로 순차적으로 세척하였다. 추출물을 황산 나트륨으로 건조시키고, 증발시키고, 진공 하에서 밤새 건조시켜 갈색 고체로서 조 9를 수득하였다.
화합물 10: 조 화합물 9을 트리플루오로아세트산 및 디클로로메탄의 1:1(v/v) 혼합물에 용해시켰다. 생성된 용액을 HPLC 분석에 의해 판단된 바와 같이 전체 탈보호가 완료될 때까지 실온에서 2시간 동안 방치하였다. 모든 용매를 진공 하에서 제거하고, 잔류 갈색 오일을 디에틸 에테르로 분쇄하고, 잠시 초음파 처리하였다. 분리된 옅은 침전물을 여과에 의해 수집하고, 에테르로 철저히 세척하고, 진공 하에서 하루 동안 건조시켜 옅은 노란색 분말로서 생성물 10을 수득하였다.
본 실시예는 화합물 13의 합성을 위한 합성 경로를 입증한다
Figure pct00058
화합물 12: DMF(15 mL) 중의 화합물 10(0.45 g) 및 화합물 11(0.26 g)의 용액에 실온에서 DIEA(0.44 mL)를 첨가하였다. HPLC 분석에 의해 11의 완전한 소모가 관찰될 때까지 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 pH 5 아세테이트 완충액(0.5M) 및 1 mL의 아세토니트릴로 희석하고, 용리액으로서 20-90% 아세토니트릴/0.05% TFA 구배를 사용한 C18 역상 HPLC에 의해 정제하여 동결건조 후 흰색 고체로서 화합물 12를 수득하였다.
화합물 13: DMF(1.5 mL) 중의 화합물 12(0.31 g)의 용액에 실온에서 하이드라진, H20(0.19 mL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 물(~ 2 mL)로 희석하고, 용리액으로서 20-90% 아세토니트릴/0.05% TFA 구배를 사용한 C18 역상 HPLC에 의해 정제하여 동결건조 후 황색 고체로서 화합물 13을 수득하였다. MS(ESI) m/z 831(M+H)+.
본 발명은 화합물 11(CAS#: 1415328-95-8)의 합성을 위한 합성 경로를 입증함으로써 하기에 예시된 바와 같은 링커 합성을 포함한다.
Figure pct00059
화합물 16: 무수 THF 중의 테트라에틸렌 글리콜 14의 용액에 나트륨을 작은 조각으로 실온에서 첨가하고, 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 생성된 용액에 아크릴레이트 15를 15분 동안 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반한 다음, 진공 하에서 농축시키고, 염수에 재현탁시킨 다음, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 조합된 유기상을 염수로 세척하고, 황산 나트륨으로 건조시켰다. 진공에서 용매를 제거하여 투명한 황색 오일로서 화합물 16을 수득하였다.
화합물 17: 무수 DCM 중의 알코올 16 및 피리딘의 혼합물에 토실 클로라이드를 0℃에서 작은 부분으로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 30분 동안 교반한 다음, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 10% 시트르산으로 ??칭하고; 수성 층을 에틸 아세테이트로 추출하고, 조합된 유기물을 포화 중탄산 나트륨, 물, 염수로 세척하고, 황산 나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 실리카 젤 상에서 정제하여 무색 오일로서 토실레이트 17을 수득하였다.
화합물 18: DMF 중의 토실레이트 17 및 N-하이드록시프탈이미드의 혼합물에 DBU를 실온에서 첨가하였다. 생성된 진한 적색의 용액을 1시간 동안 90℃까지 가열한 다음, 냉각하고, 10% 시트르산으로 ??칭하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기상을 포화 수성 중탄산 나트륨, 물, 및 염수로 철저히 세척하고, 황산 나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거한 후, 잔류물을 실리카 겔 상에서 정제하여 무색 오일로서 화합물 18을 수득하였다.
화합물 19: t-부틸 에스테르 18을 실온에서 TFA 및 DCM의 1:1 혼합물로 처리하였다. 3시간 후, 용매를 진공에서 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄에 넣고, 염수로 철저히 세척하고, 황산 나트륨으로 건조시켰다. 진공 하에서 용매를 제거한 후, 조 카르복실산 19을 황색 투명 오일로서 수득하였다.
화합물 11: 무수 THF 중의 조 카르복실산 19를 N-하이드록시석신이미드로 처리한 다음, 실온에서 DCC로 처리하였다. 6시간 동안 계속 교반하고, 고체를 여과에 의해 제거하고, THF로 세척하였다. 여과물을 증발시키고, 잔류물을 실리카 패드에 통과시키고, EtOAc로 세척하여 무색 오일로서 화합물 11을 수득하였고, 이는 저장시에 흰색 고체로 서서히 응고되었다.
본 실시예는 분지형 링커 합성, 예를 들어, 화합물 25의 합성을 위한 합성 경로를 개시한다:
Figure pct00060
화합물 21: Boc-Lys-OH 20 DCM(50 ml) 중의 OSu 에스테르 11(1.55 g) 및 Boc-Lys-OH 20(0.72 g)의 용액에 DIEA(1.03 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 10분 후, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 혼합물을 1N HCl(50 ml), 포화 중탄산 나트륨(50 ml) 및 염수(50 ml)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시켰다. 용매를 제거하여 흰색 고체로서 조 산 21을 수득하였고, 이는 정제하지 않고 다음 단계에서 사용하였다.
화합물 22: 미가공(crude) 산 21을 무수 THF에 용해시키고 N-하이드록시석신이미드로 처리한 다음, 실온에서 DCC로 처리하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 다음, 여과하여 DCU를 제거하고, THF로 세척하였다. 생성물을 용리액으로서 0-10% 메탄올/DCM 구배를 사용하여 실리카 겔 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 단리하여 흰색 고체로서 화합물 22를 수득하였다, MS(ESI) m/z 737(M+H)+.
화합물 24: 화합물 22를 DCM에 용해시키고 화합물 23으로 처리하였다. 생성된 혼합물을 DIEA로 처리하고 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM에 의해 희석하고 물, 염수로 세척하고, 황산 나트륨으로 건조시켰다. 조 생성물을 5% 시트르산(20 ml), 및 염수(50 ml)에 의해 정제하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시켰다. 용매를 진공 속에서 제거하여 흰색 고체로서 화합물 24를 수득하였다. 조 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. MS(ESI) m/z 887(M+H)+.
화합물 25: 화합물 24를 THF에 용해시키고 N-하이드록시석신이미드로 처리한 다음, 실온에서 DCC로 처리하였다. 4시간 후, 혼합물을 여과하여 DCU를 제거하고, 진공 하에서 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로서 0-6% 메탄올/DCM 구배를 사용하는 실리카 겔 상의 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 흰색 고체로서 화합물 25를 수득하였다, MS(ESI) m/z 984(M+H)+.
본 실시예는 화합물 30의 합성을 위한 합성 경로를 개시한다.
Figure pct00061
본 실시예는 분지형 PEG-폴레이트 화합물 30의 합성을 개시한다.
Figure pct00062
Figure pct00063
화합물 26: DMF(5 ml) 중의 화합물 25(0.6 g, 조) 및 화합물 10(0.6 g)의 용액에 DIEA(0.47 mL)를 23℃에서 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 C18 컬럼을 사용하여 20분 동안 5% 내지 60%의 물/90% ACN 0.05% TFA 구배를 갖는 Prep-LC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 진공 하에서 증발시켜 갈색 고체로서 화합물 26을 수득하였다; MS(ESI) m/z 1535(M+H)+.
화합물 27: 화합물 26(0.25 g)에 DCM(3 ml) 및 TFA(2 ml)를 23℃에서 첨가한 다음, 30분 동안 교반하였다. 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔류물을 DCM(~ 5 ml)에 용해시키고, 용액을 원뿔 튜브 내의 45 ml의 MTBE에 적가하였다. 침전물을 원심분리(4000 rpm, 5분)에 의해 단리하고 건조시켜 갈색 고체로서 화합물 27을 수득하였다; MS(ESI) m/z 1434(M+H)+.
화합물 29A: DMF(2 ml) 중의 화합물 27(0.054 g) 및 화합물 28A(PEG5K-C5-NHS, 0.17 g)의 용액에 DIEA(0.034 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 40 mL의 MTBE에 적가하고, 원심분리(5분, 4000 rpm)하여 침전물을 분리하였다. 침전물에 45 mL의 MTBE를 첨가하고, 원심분리(5분, 4000 rpm)하였다. 용매를 따라 내고, 흰색 침전물을 높은 진공 하에서 밤새 건조시켜 조 흰색 고체로서 화합물 29A를 수득하였다.
화합물 30A: 물(10 ml) 중의 화합물 29A(0.24 g)의 용액에 하이드라진, H2O(0.033 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 24시간 동안 교반한 후, 혼합물을 C18 컬럼을 사용하여 20분 동안 20% 내지 100%의 ACN 및 0.05% TFA 물 구배를 갖는 Prep-LC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 증발시켰다. 잔류물을 물(10 ml)에 용해시키고 동결건조하여 연황색 고체로서 화합물 30A를 수득하였다(예를 들어 도 12 참고).
화합물 29B: DMF(6 ml) 중의 화합물 27(0.04 g) 및 화합물 28B(PEG10K-C5-NHS, 0.26 g)의 용액에 DIEA(0.040 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 16시간 동안 교반한 후, 혼합물을 40 mL의 MTBE에 적가하고, 원심분리(5분, 4000 rpm)하여 침전물을 분리하였다. 침전물에 45 mL의 MTBE를 첨가한 다음, 원심분리(5분, 4000 rpm)하였다. 용매를 따라 내고, 흰색 침전물을 높은 진공 하에서 밤새 건조시켜 조 흰색 고체로서 화합물 29B를 수득하였다.
화합물 30B: 물(6 ml) 중의 화합물 29B(0.47 g)의 용액에 하이드라진, H2O(0.080 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 6시간 동안 교반한 후, 혼합물을 C18 컬럼을 사용하여 20분 동안 20% 내지 100%의 ACN 및 0.05% TFA 물 구배를 갖는 Prep-LC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 증발시켰다. 잔류물을 물(10 ml)에 용해시키고 동결건조하여 연황색 고체로서 화합물 30B를 수득하였다.
화합물 29C: DMF(8 ml) 중의 화합물 27(0.040 g) 및 화합물 28C(PEG20K-C5-NHS, 0.51 g)의 용액에 DIEA(0.040 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 16시간 동안 교반한 다음, 혼합물을 40 mL의 MTBE에 적가하고, 원심분리(5분, 4000 rpm)하여 침전물을 분리하였다. 침전물에 45 mL의 MTBE를 첨가하고, 다시 원심분리(5분, 4000 rpm)하였다. 용매를 따라 내고, 흰색 침전물을 높은 진공 하에서 밤새 건조시켜 조 흰색 고체로서 화합물 29C를 수득하였다.
화합물 30C: 물(8 ml) 중의 화합물 29C(0.67 g, < 0.031 mmol)의 용액에 하이드라진, H2O(0.060 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 6시간 동안 교반한 후, 혼합물을 C18 컬럼을 사용하여 20분 동안 20% 내지 100%의 ACN 및 0.05% TFA 물 구배를 갖는 Prep-LC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 증발시켰다. 잔류물을 물(10 ml)에 용해시키고 동결건조하여 연황색 고체로서 화합물 30C를 수득하였다.
화합물 29D: DMF(4 ml) 중의 화합물 27(0.033 g, 0.023 mmol) 및 화합물 28D((PEG10K)2-C2-NHS, 0.4 g)의 용액에 DIEA(0.020 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 18시간 동안 교반한 후, 혼합물을 40 mL의 MTBE에 적가하고, 원심분리(5분, 4000 rpm)하여 침전물을 분리하였다. 침전물에 45 mL의 MTBE를 첨가하고, 원심분리(5분, 4000 rpm)하였다. 용매를 따라 내고, 흰색 침전물을 높은 진공 하에서 밤새 건조시켜 조 흰색 고체로서 화합물 29D를 수득하였다.
화합물 30D: 물(8 ml) 중의 화합물 29D(0.45 g, < 0.021 mmol)의 용액에 하이드라진, H2O(0.080 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 48시간 동안 교반한 후, 혼합물을 C18 컬럼을 사용하여 20분 동안 20% 내지 100%의 ACN 및 0.05% TFA 물 구배를 갖는 Prep-LC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 증발시켰다. 잔류물을 물(10 ml)에 용해시키고 동결건조하여 연황색 고체로서 화합물 30D를 수득하였다.
화합물 28E: DMF(0.5 ml) 중의 화합물 28E1((PEG5K)2-NHS, 0.1 g) 및 아미노발레르산(0.003 g)의 용액에 DIEA(0.010 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, 혼합물을 물을 이용하여 1 mL로 희석시키고, 탈염 컬럼에 의해 정제하였다. 수집된 분획을 동결건조시켜 흰색 고체로서 화합물 28E를 수득하였다.
화합물 30E: DMF(2 mL) 중의 화합물 28E(0.04 g), DMTMMT(0.003 g) 및 DIEA(0.005 mL)의 용액에 화합물 27(0.009 g)을 23℃에서 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 후, LCMS는 반응이 완료되었음을 보여주었다. 이 혼합물(조 화합물 29E)에 하이드라진, H2O(2 ul)를 원위치에서 첨가하였다. 1시간 동안 교반한 다음, 혼합물을 C18 컬럼을 사용하여 20분 동안 20% 내지 100%의 ACN 및 0.05% TFA 물 구배를 갖는 Prep-LC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 조합하고 증발시켰다. 잔류물을 물(10 ml)에 용해시키고 동결건조하여 연황색 고체로서 화합물 30E를 수득하였다.
Figure pct00064
화합물 31: DMF(1.0 ml) 중의 20K-PEG-아민(0.31 g) 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 2-(비스(2-(2,5-디옥소-2,5-디하이드로-1H-피롤-1-일)에틸)아미노)아세테이트(0.003 g)의 용액에 DIEA(0.006 mL)를 23℃에서 첨가하였다. 30분 후, 혼합물을 탈염 컬럼(PD-10)으로 정제하고, 밤새 동결건조하여 흰색 고체로서 화합물 31을 수득하였다. 다른 PEG 변이체는 본원에 기재된 동일한 절차를 사용하여 제조될 수 있다.
실시예 18
본 실시예는 이중 앰버를 함유하는 인간화된 항-CD3 Fab 리드 분자의 제작, 발현 및 정제를 입증한다. 제2 pAF 혼입 부위를 Fab1-HK129pAF, Fab9-HK129pAF 및 Fab10-HK129pAF 내의 항-CD3 Fab 경쇄 위치 LL157에 첨가하여, 각각 Fab1-HK129pAF-LL157pAF, Fab9-HK129pAF-LL157pAF 및 Fab10-HK129pAF-LL157pAF로서 새로운 Fab 분자를 생성하였다. 이는 이전 실시예에 기재된 바와 같은 임의의 이작용성 링커를 사용하여 각각의 Fab에서 2개의 폴레이트 + 2개의 5KPEG 분자의 접합을 허용하였다.
시험관내 활성, 생체내 효능 및 PK 연구에 사용된 CD3-PEG-폴레이트 정제된 단백질을 SDS 겔 전기영동(SDS PAGE)에 의해 분석하였다. 정제된 CD3을 옥심 화학을 사용하여 pAF 부위에서 5K 또는 10K PEG-폴레이트와 접합시킨 다음, 접합 후에 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 접합되지 않은, 단일 부위 및 이중 부위 접합된 형태를 단리하였다(도 13a-13b). 정제 후, 조성물을 50 mM 히스티딘, 100 mM NaCl, 5% 트레할로스 pH 6에서 제제화하고 멸균 여과하였다.
도 13a는 5K PEG 접합체를 갖는 5 μg의 각각의 정제된 CD3-폴레이트 이중특이적 항체를 나타낸다. 레인 3 및 6은 각각 단일 및 이중 pAF 혼입을 갖는 접합되지 않은 CD3 Fab 조성물을 나타낸다. 레인 4 및 7은 각각 단일 및 이중 pAF 및 폴레이트를 갖는 CD3 Fab 조성물을 나타낸다. 레인 5 및 8은 각각 접합된 5KPEG-폴레이트 및 Bi5KPEG-바이폴레이트를 나타낸다.
도 13b는 웰당 10 μg 단백질이 로딩된 비환원 조건 하의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 레인 2 및 7은 접합되지 않은 CD3 Fab 조성물을 나타내고, 레인 3 및 4는 각각 상이한 이중 접합된 Bi5KPEG-바이폴레이트 CD3 Fab 조성물을 나타내며, 레인 5 및 6은 각각 이중 접합된 Bi10KPEG-바이폴레이트 및 10KPEG-폴레이트를 나타낸다. 데이터(도 13a-b)는 PEG 크기에 기초하여 예상된 분자량 증가를 갖는 모든 샘플에 대한 고순도(> 90%)를 예시한다.
접합 효율을 증가시키기 위해, 정제된 CD3 Fab 조성물을 2단계 접합 과정을 사용하여 PEG-폴레이트와 접합시켰다. 폴레이트를 옥심 화학을 사용하여 pAF 부위에서 접합시킨 다음, 말레이미드-티올 클릭 화학을 사용하여 중쇄 및 경쇄 모두의 C-말단 시스테인에서 5K, 10K 또는 20K PEG와 PEG 접합시켰다. 도 13c는 웰당 10 μg의 단백질이 로딩된 비환원(레인 2-5) 및 환원(레인 7-10) 조건 하의 SDS-PAGE를 보여준다. 레인 2 및 7은 바이폴레이트 접합되지 않은 조성물을 나타내고, 레인 3 및 8, 4 및 9, 5 및 10 각각은 각각 바이폴레이트-C-말단 Bi5KPEG, Bi10KPEG 및 Bi20KPEG 조성물을 나타낸다. 도 13c의 데이터는 PEG 크기에 기초하여 예상된 분자량 증가를 갖는 모든 샘플에 대한 고순도(> 95%)를 예시한다.
실시예 19
본 실시예는 CD3 Fab1 조성물 및 2개의 저친화성 변이체 Fab9 및 Fab10에 대한 바이폴레이트 및 바이-PEG 접합의 효과를 입증한다. 인간 CD3 결합 및 세포독성: 표 25는 50 nM SFA의 존재 하에 Fab1 분자의 결합 친화성 및 세포독성에 대한 Bi5KPEG-바이폴레이트의 접합을 포함하는 다양한 변형의 효과를 보여준다.
표 25 - 항-CD3 Fab1 변형의 시험관내 결합 및 세포독성 활성
Figure pct00065
시험관내 세포독성 연구를 또한 KB, OV-90 및 SKOV-3 세포에서 50 nM SFA의 존재 하에 5K, 10K 또는 20K PEG C-말단 접합체를 갖는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체를 사용하여 수행하였다(도 13d, 표 26). PEG 길이가 증가함에 따라 효능이 약간 감소하였지만, 시험된 모든 구조체는 강력한 세포독성 활성을 유지하였다. 결과 및 경향은 시험된 모든 세포주 사이에서 일관되었다. 이들 연구에 기초하여, PEG 크기가 증가함에 따라 관찰되는 효능의 약간의 감소가 반감기 연장으로부터의 노출 증가에 의해 상쇄될 것이라고 가정된다.
표 26 - 다양한 세포에서 항-CD3-폴레이트 C-말단 변형의 시험관내 세포독성
Figure pct00066
표 27은 20 nM SFA의 존재 하에 인간 CD3에 대한 모 Fab1 뿐만 아니라 2개의 저친화성 변이체 Fab 9 및 10의 결합 친화성을 비교한다. 나타낸 바와 같이, 상기 실시예에 기재된 바와 같은 PEG-폴레이트 이작용성 링커를 사용한 Bi5KPEG-바이폴레이트의 접합은 이들의 접합되지 않은 대조군과 비교하여 3개의 모든 Fab에 대해 인간 CD3 결합 및 상응하는 세포독성 잠재력의 감소를 야기하였다.
표 27 - 저친화성 Fab 9 및 10의 특성화
Figure pct00067
T-세포 활성화 및 사이토카인 방출: 표 27은 3개의 변형된 Fab에 의한 T 세포 마커 CD69의 활성화 및 2개의 사이토카인 IFNγ 및 TNFα의 방출을 보여준다. 상기 실시예에 나타낸 바와 같이, CD3 결합, 세포독성 잠재력, T 세포의 활성화 및 이후의 사이토카인의 방출 사이의 일반적인 상관관계는 바이폴레이트-Bi5KPEG 접합에 의한 유의한 변형 후에도 모든 Fab에 유효하다. 이것은 동시에 CD3 친화성을 낮추고 종양 관련 항원(TAA) 친화성을 증가시킴으로써 사이토카인 방출 증후군으로 인해 독성을 최소화하면서 효능이 유지될 수 있음을 시사한다. 또한, 반감기(T1/2) 연장을 포함하는 PK 특성은 독점적 UAA(비자연 아미노산) 혼입 기술을 사용하는 부위 특이적 페길화에 의해 개선되었다.
실시예 20
시험관내 세포독성 데이터는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 FOLRα 발현 KB 세포를 선택적으로 사멸시킨다는 것을 보여준다. KB 세포를 폴레이트의 생리학적으로 관련된 농도인 50 nM 폴레이트의 존재 하에 증가하는 농도의 CD3-폴레이트 이중특이적 항체로 처리하였다. 가장 강력한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체인 폴레이트의 2개 분자를 함유하는 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트는 1.3 pM의 IC50 값을 나타내었다(도 14). 단일 폴레이트를 함유하는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체인 Fab1-HK129-폴레이트는 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트보다 31배 덜 강력한 40.3 pM의 IC50 값을 나타내었다. 이 데이터는 2개의 폴레이트가 CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 효능을 증가시킨다는 것을 보여준다. 5KPEG의 첨가는 효능을 감소시켰다. 198 pM의 IC50 값과 함께 단일 CD3-폴레이트 이중특이적 항체인 Fab1-HK129-폴레이트, 및 Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트 사이에 효능의 4.9배 감소가 관찰되었다. 48.5 pM의 IC50 값과 함께 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트 및 Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트 사이에 효능의 37.3배 감소가 관찰되었다. 이들 데이터는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 생리학적으로 관련된 농도의 폴레이트에서 강력한 시험관내 세포독성을 유지한다는 것을 보여준다.
실시예 21
시험관내 세포독성 데이터는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 20 또는 50 nM 폴레이트의 존재 하에 FOLRα를 발현하는 SKOV3 세포를 선택적으로 사멸시킨다는 것을 보여준다. SKOV3 세포를 폴레이트의 생리학적 관련 농도인 20 또는 50 nM의 폴산에서 증가하는 농도의 CD3-폴레이트 이중특이적 항체로 처리하였다(도 15a 및 15b). CD3-폴레이트 이중특이적 항체는 폴레이트 농도가 20 nM로부터 폴레이트에 대한 일반적인 생리학적 관련 농도의 상위에 가까운 50 nM로 증가하였을 때 5.6배로부터 8배로 효능 감소를 나타내었다. 5KPEG의 첨가는 또한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 효능을 감소시켰다. 단일 폴레이트 및 단일 5KPEG 폴레이트 이중특이적 항체 사이에서 5.4배 감소 및 이중 폴레이트 및 이중 5KPEG 폴레이트 이중특이적 항체 사이에서 22.9배 감소가 관찰되었다. 단일 및 이중 페길화된 CD3-폴레이트 이중특이적 항체 사이에는 유의한 효능 차이가 관찰되지 않았다. 데이터, 표 28은 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 폴레이트의 생리학적 관련 농도의 존재 하에 FOLRα를 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있고, 페길화된 항체가 페길화되지 않은 항체와 비교하여 감소된 효능을 가짐에도 불구하고, CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 FOLRα 발현 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 보여준다.
표 28 - SKOV3 세포에서 시험관내 세포독성
Figure pct00068
실시예 22
추가 시험관내 세포독성 연구를 20 또는 50 nM 5-mTHF의 존재 하에 수행하였다. SKOV3 세포를 20 또는 50 nM(인간 혈청에서 발견되는 주요 형태의 폴레이트의 생리학적 관련 농도)의 5-메틸테트라하이드로폴레이트(5-mTHF)의 존재 하에 증가하는 농도의 CD3-폴레이트 이중특이적 항체로 처리하였다(도 16a 및 16b). 5-mTHF는 FOLRα에 대해 1-10 nM의 결합 친화성을 가지며, 1 nM 미만의 결합 친화성을 갖는 폴레이트처럼 FOLRα에 결합하지 않는다. CD3-폴레이트 이중특이적 항체는 이중 및 단일 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 대해 각각 0.03 내지 0.16 pM 및 0.1 내지 1.5 pM의 매우 강력한 IC50 값을 유지하였다. 데이터, 표 29는, CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 5-mTHF의 생리학적 관련 농도의 존재 하에 FOLRα를 발현하는 SKOV3 세포에 대해 강력한 시험관내 세포독성을 갖는다는 것을 보여준다.
표 29 - 5-mTHF의 존재 하에 시험관내 세포독성
Figure pct00069
실시예 23
CD1 마우스에서 마우스 약동학 연구: CD3-폴레이트 이중특이적 항체를 1 또는 5 mg/kg에서 CD-1 마우스의 마우스 꼬리 정맥을 통해 정맥내 주사하였다. 혈액 샘플을 9개의 시점에서 수집하고, ELISA를 통해 분석하였다. 데이터는 5KPEG의 첨가가 혈청 노출(AUClast)을 증가시킨다는 것을 분명히 보여주었다(표 30-31 및 도 17). 1 mg/kg에서 Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트는 Fab1-HK129-폴레이트에 비해 4.3배 개선을 나타내었고, 5 mg/kg에서 Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트는 Fab1-HK129-폴레이트에 비해 5배 개선을 나타내었다. Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트는 1 mg/kg에서 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트에 비해 16.25배 개선을 나타내었고, Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트는 5 mg/kg에서 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트에 비해 21.7배 개선을 나타내었다. 데이터는 Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트 및 Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트 사이에 3.9배 차이를 보여준다. 또한 5KPEG가 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 첨가될 때 혈청 반감기(T1/2)의 개선이 관찰되었다. 혈청 반감기의 가장 큰 개선은 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 혼입된 2개의 5KPEG에서 관찰되었다. Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트는 1 mg/kg에서 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트에 비해 혈청 반감기의 4.2배 개선을 나타내는 반면, Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트는 5 mg/kg에서 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트에 비해 혈청 반감기의 6.25배 개선을 나타낸다. 데이터는 5KPEG의 첨가가 CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 혈청 노출 및 혈청 반감기를 개선한다는 것을 보여주며, 이는 생체내에서 효과적인 혈청 노출을 달성하기 위해 덜 빈번한 투여를 야기한다.
표 30 - CD3-폴레이트 이중특이적 단일 앰버 항체 마우스 약동학 분석
Figure pct00070
표 31 - CD3-폴레이트 이중특이적 이중 앰버 항체 마우스 약동학 분석
Figure pct00071
실시예 24
본 실시예는 CD3-폴레이트-폴레이트 이중특이적 항체가 인간 M2 대식세포를 사멸시킨다는 것을 입증한다: 대식세포는 숙주 방어 역할을 하는 이종 세포 집단이다. 고전적으로 활성화된 대식세포(M1 대식세포)는 염증촉진 기능, 종양-침윤성 림프구 모집, 및 항종양 활성을 갖는 반면, M2 대식세포는 항염증성이고 조직 리모델링, 암 세포 이동, 침입, 및 전이에 관여한다. 인간 M2 대식세포는 암세포 증식과 관련되며, 난소암의 불량한 예후와 관련되었다. M2 대식세포의 억제는 체크포인트 억제제와 같은 면역종양학 요법의 활성을 향상시킬 수 있다. 인간 M2 대식세포는 FOLRβ 또는 FRβ를 발현하고, FR은 폴레이트에 대해 FOLRα 또는 FRα과 유사한 결합 친화성을 갖는다. 따라서, M1 대식세포에 대한 재분극에 의해 또는 M2 대식세포를 선택적으로 사멸시키는 것에 의해 M1 대 M2 대식세포의 비율을 증가시키는 전략은 암 치료에서 잠재적인 치료 접근법을 제공한다.
연구 1: 대식세포에 대한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 효과를 평가하기 위해, 하기 실험을 수행하였다: Fab1-HK129-LL157-pAF, Fab1-HK129-LL157-폴레이트 및 Fab1-HK129-LL157-5KPEG 폴레이트를 50 nM 폴산의 존재 하에 인간 M2 대식세포 및 인간 T-세포와 함께 인큐베이션하였다. 데이터는 Fab1-HK129-LL157-폴레이트 및 Fab1-HK129-LL157-5KPEG-폴레이트가 각각 1.2 pM 및 112.1 pM의 IC50 값으로 인간 M2 대식세포를 사멸시킨다는 것을 보여준다(데이터 미제시). 폴레이트가 부족한 Fab1-HK129-LL157-pAF는 인간 M2 대식세포 사멸을 유발하지 않는다. 데이터는 Fab1-HK129-LL157-폴레이트 및 Fab1-HK129-LL157-5KPEG-폴레이트 세포독성이 FOLRβ에의 결합에 특이적이라는 것을 뒷받침한다. 또한, 데이터는 FOLRα를 발현하는 종양 세포를 사멸시키는 것 외에도, CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 M2 대식세포 세포 및 아마도 다른 FOLRα/β 발현 면역-억제 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 시사한다.
연구 2: 이들 연구에서, 단핵구 유래의 대식세포를 건강한 공여자의 인간 혈액으로부터 생성하고, M1 대식세포 분화를 위한 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 또는 M2 대식세포 분화를 위한 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)로 처리하였다.
연구를 수행하기 전에, 폴레이트 수용체 베타(FOLRβ 또는 FR-β) 발현을 초기에 유세포 분석법에 의해 측정하였고, 중앙 형광 강도(MFI)의 측면에서 M1 대식세포보다 M2에서 평균 26배 증가하는 것으로 나타났다.
인간 M1 또는 M2 대식세포를 96-웰 투명 바닥 흰색 플레이트에 9,000 세포/웰로 시딩하고, 밤새 인큐베이션하였다. 다음날, 인간 T 세포의 90,000개의 세포를 효과기 세포로서 대식세포 함유 웰에 10:1의 효과기: 표적(E:T) 세포 비율로 첨가하고, 3일 동안 37℃, 5% CO2에서 20 nM 폴산의 존재 하에 CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 연속 희석액(0.001 pM 내지 100 nM)과 함께 배양하였다. 대식세포의 상대적 생존율을 부유 세포를 제거한 후 CellTiter-Glo(100 uL/웰)에 의해 측정하고 처리되지 않은 대조군의 백분율로서 계산하였다.
CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 대한 페길화의 효과: 표 32는 20 nM 폴산의 존재 하에 단일 폴레이트를 함유하는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 의한 시험관내 대식세포 세포독성에 대한 IC50 데이터를 보여준다. Fab1-HK129-폴레이트는 M1 대식세포에서 85.0 pM(범위 53.5-120.0 pM)의 평균 IC50 및 M2 대식세포에서 5.6 pM(범위 1.4 pM-15.0 pM)의 평균 IC50을 갖는다. IC50 비율에 기초하여, M2 대식세포는 Fab1-HK129-폴레이트를 갖는 M1에 비해 평균 27배(5-42배 범위) 개선된다. Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트는 M1 대식세포에서 616.8 pM(범위 198.0-908.9 pM)의 평균 IC50 및 M2 대식세포에서 13.4 pM(범위 2.3-33.2 pM)의 평균 IC50을 나타내고, M1 및 M2 대식세포 사이의 개선된 평균 IC50 비율은 M2 대식세포에서 평균 69배(범위 23-126배) 개선되었다. 이들 결과는 단일 폴레이트를 함유하는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 M2 대식세포 사멸에 특이적이고, 단일 폴레이트를 함유하는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체(Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트)의 페길화가 Fab1-HK129-폴레이트보다 M2 대식세포 사멸에 더 선택적임을 나타낸다.
표 32 - 20 nM 폴산의 존재하에 단일 폴레이트를 함유하는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 의한 시험관내 대식세포 세포독성
Figure pct00072
대표적인 공여자인 공여자 6007로부터의 단일 폴레이트 함유 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 의한 시험관내 대식세포 세포독성의 결과가 도 18a에 도시되어 있다. 화살표와 숫자는 M1 및 M2 대식세포 사이의 IC50배 차이를 나타낸다. 점선은 M1 및 M2에서 Fab1-HK129-폴레이트를 나타내고, 실선은 M1 및 M2에서 Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트를 나타낸다.
표 33은 20 nM 폴산의 존재 하에 이중 폴레이트를 함유하는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 의한 시험관내 대식세포 세포독성을 위한 IC50 데이터를 나타낸다. Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트는 M1 대식세포에서 29.2 pM(범위 10.9-42.8 pM)의 평균 IC50 및 M2 대식세포에서 1.5 pM(범위 0.1 pM-5.5 pM)의 평균 IC50을 가지며, M1 및 M2 대식세포 사이의 평균 IC50 비율은 72배 차이(범위 6-212배)이다. Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG는 M1 대식세포에서 1620.8 pM(범위 834.7-2651 pM)의 평균 IC50 및 M2 대식세포에서 15.7 pM(범위 3.6-52.4 pM)의 평균 IC50을 나타내며, M1 및 M2 대식세포 사이의 개선된 평균 IC50 비율은 M2 대식세포에서 181배(범위 49-501배)이다. 이들 결과는 이중 폴레이트를 함유하는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 M2 대식세포 사멸에 특이적이라는 것을 나타낸다. 이중 폴레이트를 함유하는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체(Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG)의 페길화는 표 XXX에 나타낸 바와 같이 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트 또는 Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트보다 효능이 적으며 M2 대식세포 사멸에 대해 더 선택적인 것으로 나타난다.
표 33 - 20 nM 폴산의 존재 하에 이중 폴레이트를 함유하는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 의한 시험관내 대식세포 세포독성
Figure pct00073
도 18b는 대표적인 공여자인 공여자 6007로부터의 이중 폴레이트 함유 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 의한 시험관내 대식세포 세포독성의 결과를 보여준다. 화살표와 숫자는 M1 및 M2 대식세포 사이의 IC50배 차이를 나타낸다. 점선은 M1 및 M2에서의 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트를 나타내고, 실선은 M1 및 M2에서의 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG를 나타낸다.
9.1-45.1 nM의 범위인 인간 혈청에서 발견되는 주요 형태의 폴레이트의 생리학적 관련 농도를 모방하기 위해 추가 연구를 수행하였다. 이 생리학적 범위 중에서, 86.7%(37.5 nM)는 1차 폴산 대사산물인 5-메틸-테트라하이드로폴레이트(5-mTHF)이고, 4%(1.2 nM)만이 대사되지 않은 폴산이다(Pfeiffer et al., Br. J. Nutr., 2015 June 28: 113(12):1965-1977). 당업계에 잘 알려진 바와 같이, FR-베타에 대한 폴산의 결합 친화성은 1 nM 미만이며, FR-베타에 대한 5-mTHF의 친화성은 1-10 nM이다. 이 정보에 기초하여, 폴레이트 및 5-mTHF의 농도 또는 조성은 CD3-폴레이트 이중특이적 항체의 활성에 영향을 미칠 수 있는 것으로 가정되었다. 이를 평가하기 위해, 하기 실험을 수행하였다: 45 nM 5-mTHF의 존재 하에 시험관내 대식세포 세포독성 데이터가 표 34 및 표 35에 나타나 있다. Fab1-HK129-폴레이트의 IC50은 M1 또는 M2 대식세포에서 각각 평균 9.1 pM 및 0.31 pM이고, Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트의 IC50은 평균 48.5 pM 및 1.26 pM이다. Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트의 IC50은 M1에서 평균 4.0 pM 및 M2에서 평균 0.05 pM이고, Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG의 IC50은 M1에서 평균 99.4 pM 및 M2에서 평균 0.85 pM이다. 이들 데이터는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 폴산보다 5-mTHF의 존재 하에 더 강력하다는 것을 보여준다(표 32 및 표 33). M1 및 M2 사이의 IC50 비율은 단일 폴레이트 함유 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 의해 평균 43배 및 57배이고, 이중 폴레이트 함유 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 의해 평균 89배 및 212배이다. 이들 데이터는 CD3-폴레이트 함유 이중특이적 항체가 M2 대식세포 특이적 사멸을 유지하고 페길화가 5-mTHF의 생리학적 관련 농도에서 보다 특이성을 제공한다는 것을 나타낸다.
표 34. 45 nM 5-mTHF의 존재 하에 단일 폴레이트 함유 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 의한 시험관내 대식세포 세포독성
Figure pct00074
표 35. 45 nM 5-mTHF의 존재 하에 이중 폴레이트 함유 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 의한 시험관내 대식세포 세포독성
Figure pct00075
전체적으로, 데이터는 폴산 또는 5mTHF 대사산물의 존재 하에 이중 페길화된 CD3-폴레이트 조성물이 단일 페길화된 CD3-폴레이트 조성물보다 M2 대식세포 사멸에 대해 더 큰 특이성을 나타내었음을 보여준다. 따라서, 개선된 선택성은 더 많은 페길화로 관찰되었다.
FRβ 발현을 조사하기 위해 CD3-폴레이트 이중특이적 항체를 이용한 추가 연구를 또한 인간 골수 유래 억제자 세포(MDSC)에서 수행하였다. 건강한 공여자로부터의 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트 및 Fab1-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트로 처리하여 단핵 MDSC(mMDSC)에 대한 이들의 세포독성 활성을 시험하였다. 각각의 CD3-폴레이트 이중특이적 항체에 대해 0, 1, 10, 및 100 pM을 PBMC 내로 첨가하고, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, mMDSC를 유세포 분석법을 사용하여 CD3-/CD33+/CD11b+/CD14+/HLA-DRlow 집단에 의해 게이팅(gating)하고, 처리되지 않은 대조군으로부터의 살아있는 세포의 백분율(%)을 측정하였다.
관찰에 기초할 때, mMDSC의 백분율은 용량 의존적 방식으로 감소하였다. Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트는 각각 10 pM 대 100 pM에서 72%에서 24%로 용량 의존적 감소를 나타내었다. 유사하게, Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트는 각각 10 pM 대 100 pM에서 88%에서 22%로 용량 의존적 감소를 나타내었다. 이들 결과는 높은 HLA-DR을 갖는 비-MDSC가 보존된다는 점을 고려할 때 CD3-폴레이트 이중특이적 항체를 이용한 치료가 mMDSC를 선택적으로 제거하였음을 입증한다.
이러한 억제 세포가 폴레이트 수용체를 발현할 수 있고 면역종양학 약물의 활성의 억제에 관여한다는 점을 고려할 때, 이것은 체크포인트 억제제 및 다른 면역종양학 약물을 사용한 조합 요법이 폴레이트 수용체가 발현될 수 있는 다양한 암 또는 병태/질환/장애를 위한 치료제로서 이용될 수 있음을 시사한다. 이것은 다른 면역종양학 요법과 유의하게 상이한 유용한 치료제로서 본 발명의 CD3-폴레이트 조성물의 용도를 뒷받침한다.
실시예 25
본 실시예는 여러 세포 유형에서 FOLRα에 대한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체 결합 친화성을 입증한다. FOLRα 발현 KB 세포에 대한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체 결합 친화성: 표 36에 나타낸 바와 같이, Fab1-HK129-폴레이트는 1.97 nM의 친화성으로 FOLRα 발현 KB 세포에 결합하고, Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트는 3.69 nM의 친화성으로 결합한다. Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트는 0.85 nM의 친화성으로 KB 세포에 결합하고, Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트는 2.28 nM의 친화성로 결합한다. 페길화된 항체는 FOLRα 발현 KB 세포에 대해 낮은 nM 범위인 페길화되지 않은 항체와 유사한 결합 친화성을 유지하였다.
표 36 - KB 세포에 대한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체 결합 친화성
Figure pct00076
인간 T-세포에 대한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체 결합 친화성: Fab1-HK129-pAF(항-CD3 Fab)는 폴레이트 또는 PEG를 함유하지 않고 1.59 nM의 친화성으로 인간 T-세포에 결합한다(표 37). Fab1-HK129-폴레이트는 1.53 nM의 친화성으로 CD3 발현 인간 T-세포에 결합하고, Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트는 2.34 nM의 친화성으로 결합한다. 이들 CD3-폴레이트 이중특이적 항체는 인간 T-세포에 대해 유사한 결합 친화성을 갖는다. Fab1-HK129-LL157-pAF는 0.604 nM의 친화성으로 인간 T-세포에 결합한다. Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트는 0.669 nM의 친화성으로 인간 T-세포에 결합하고, Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트는 3.34 nM의 친화성을 갖는다. 이들 데이터는 페길화된 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 페길화되지 않은 형태보다 인간 T-세포에 대해 약 5배 더 낮은 결합 친화성을 갖는다는 것을 보여준다. 이들 데이터는 또한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 인간 T-세포에 대해 낮은 nM 결합 친화성을 갖는다는 것을 보여준다.
표 37 - 인간 T-세포에 대한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체 결합 친화성
Figure pct00077
시아노몰구스 원숭이 T-세포에 대한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체 결합 친화성: 표 38에 나타낸 바와 같이, Fab1-HK129-pAF는 2.67 nM의 친화성으로 시아노몰구스 원숭이 T-세포에 결합한다. Fab1-HK129-폴레이트는 2.69 nM의 친화성으로 CD3 발현 시아노몰구스 원숭이 T-세포에 결합하고, Fab1-HK129-5KPEG-폴레이트는 3.31 nM의 친화성으로 결합한다. 이것은 단일 앰버 부위를 갖는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 시아노몰구스 원숭이 T-세포에 대해 유사한 결합 친화성을 갖는다는 것을 입증한다. 이중 앰버 부위를 갖는 CD3-폴레이트 구조체는 시아노몰구스 원숭이 T-세포에서 유사한 결합 친화성을 나타내었다. 표 38에 나타낸 바와 같이, Fab1-HK129-LL157-pAF는 0.995 nM의 친화성으로 시아노몰구스 원숭이 T-세포에 결합한다. Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트는 1.0 nM의 친화성으로 시아노몰구스 원숭이 T-세포에 결합하고, Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-바이폴레이트는 5.01 nM의 친화성으로 결합한다. 따라서, 데이터는 페길화된 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 페길화되지 않은 형태보다 시아노몰구스 원숭이 T-세포에 대해 약 5배 낮은 결합 친화성을 갖는다는 것을 추가로 보여준다. 전체적으로, 데이터는 CD3-폴레이트 이중특이적 항체가 시아노몰구스 원숭이 T-세포에 대해 낮은 nM 결합 친화성을 갖는다는 것을 보여준다.
표 38 - 시아노몰구스 원숭이 T-세포에 대한 CD3-폴레이트 이중특이적 항체 결합 친화성
Figure pct00078
실시예 26
하기 연구는 본 발명의 CD3 폴레이트 항체를 사용한 마우스에서의 생체내 안전성 및 효능 연구를 입증한다.
연구 1: 항-CD3-폴레이트 이중특이적 항체를 KB 세포주로부터 유래된 인간 자궁경부 종양을 갖는 암컷 면역 손상된 마우스에서 다중 용량 투여에 의해 항종양 효능에 대해 시험하였다. 비표적화 항-CD3 항체를 대조군으로서 포함시켰다. KB 자궁경부 종양을 갖는 암컷 NSG 마우스(처음에는 동결된 계대 3으로부터 성장한, 계대 7로부터의 2.0 x 106 세포로 접종됨)를 각각 8마리씩 5개의 그룹으로 분류하였다. 종양이 대략 100 mm3 크기일 때, 7.5x 106 PanT 세포를 마우스에 복막내로 접종하였다. 24시간 후, 마우스를 하기 치료군으로 무작위 분류하였다: G1: 항-CD3 Fab1-HK129-pAF 대조군(0.05 mpk), 각각 0.01 mpk 및 0.05 mpk의 CD3 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG를 갖는 G2 및 G3, G4: Fab9-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG(0.125 mpk), 및 G5: CD3 Fab1-HK129-폴레이트 대조군(0.25 mpk); 및 종양 부피(도 19a) 및 질량/체중(도 19b)을 결정하였다. 모든 마우스에게 종양이 평균 대략 ~125 mm3인 7일에 정맥내(IV) 투여하였다. 동물을 매주 2회 캘리퍼 측정에 의한 종양 성장 및 체중에 대해 모니터링하였다. 모든 CD3-폴레이트 이중특이적 조성물은 효능을 나타내었고, 도 19a에 나타낸 바와 같이, 그룹 3(Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG, 0.05 mpk)이 종양 성장(TGI = 82%)을 방해하는 데 가장 큰 영향을 미쳤다. 대조군인 CD3 Fab-HK129-pAF 항체를 제외한 모든 조성물은 체중 감소를 유발하였다(도 19b).
바이오마커 분석: 치료 개시 전과 치료 개시 후 7일 및 24일에 각각의 동물로부터 혈액 샘플을 채취하였다. CD3-폴레이트 활성화/표적화에 의해 제안된 바와 같이 치료가 말초 인간 T-세포 집단을 증가시키는지 결정하기 위해 샘플을 FACs 분석에 의해 인간 CD45/마우스 CD45의 백분율에 대해 분석하였다. 연구 종결시에, 종양을 인간 림프구 마커 hCD45를 사용하여, 종양 침윤성 림프구(TIL)의 존재에 대해 FACs에 의해 분석하였다. 모든 CD3-폴레이트 치료군은 항종양 효능 및 인간 CD45의 혈액 수준을 다양한 정도로 증가시키는 능력을 나타내었고, 가장 높은 수준의 인간 CD45는 0.05 mpk에서 이중특이적 항체 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG에 의한 치료에 기여하였다(도 19c). 이 연구는 또한 종양 성장 억제 및 종양 침윤성 림프구(TIL)를 촉진하는 본 발명의 CD3-폴레이트 조성물의 능력을 조사하였다. 또한, 종양 면역 감시 활성화의 특징인 TIL의 존재는 대조군에 비해 모든 치료에서 증가하는 것으로 나타났고, 그룹 3(Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG, 0.05 mpk)은 TIL의 가장 높은 유도를 가지고 있었다(도 19d).
연구 2: 이 연구는 KB 종양을 갖는 NCG 마우스에서 종양 성장 억제(TGI) 및 마우스 혈액/종양 침윤에서의 인간 CD45의 백분율을 조사하였다. 단일, (Fab1-HK129-LL157-폴레이트-5KPEG), 및 이중, (Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG), 페길화된 항-CD3-폴레이트 이중특이적 항체를 KB 세포주로부터 유래된 인간 자궁경부 종양을 갖는 암컷 면역 손상된 마우스에서의 다중 용량 투여에 의해 항종양 효능에 대해 시험하였다. 비표적화 CD3 항체를 대조군으로서 포함시켰다. KB 자궁경부 종양을 갖는 35마리의 암컷 NCG 마우스(처음에 동결된 계대 3으로부터 성장된, 계대 5로부터의 2.0 x 106 세포로 접종됨)를 각각 10마리씩 3개의 그룹으로 분류하였다. 종양이 대략 85-100 mm3일 때, 마우스에게 6.0 x 106 PanT 세포를 복막내로 접종하였다. 24시간 후, 마우스를 하기 치료군으로 무작위 분류하였다: 각각 5일마다 0.025 mpk로, G1: CD3 Fab1-HK129-pAF 대조군, G2: Fab1-HK129-LL157-폴레이트-5KPEG, G3: Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG(도 20a 및 20b). 모든 마우스에게 7일에 6.0 x 106 Pan-T 세포를 접종하고 종양이 평균 대략 ~100 mm3인 8일에 정맥내로(IV) 투여하였다. 동물을 매주 2회 캘리퍼 측정에 의해 종양 성장(도 20a) 및 체중(도 20b)에 대해 모니터링하였다. 모든 CD3-폴레이트 표적화 조성물은 다양한 정도의 효능을 나타내었고, G2: Fab1-HK129-LL157-폴레이트-5KPEG(단일 PEG 조성물)가 종양 성장(TGI =85%)을 억제하는 데 가장 큰 영향을 미쳤고, 76%의 TGI를 갖는 G3: Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG(이중 PEG 조성물)과 비교하여 10마리의 마우스 중 4마리는 완전한 종양 저해(CR)를 유발하였고, 10마리의 동물 중 3마리는 CR을 가지고 있었다(도 20a). 모든 시험 물품은 용인되었고, G3(이중 PEG 조성물)은 몇 마리의 마우스에서 약간의 체중 감소를 나타내었으나, 이들은 15% 감소를 초과하지 않았다(도 20b).
바이오마커 분석: 상기에 설명된 바와 같이 치료 시작 후 7일 및 8일에 각 동물로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 치료가 CD3-폴레이트 활성화/표적화를 통해 말초 인간 T-세포 집단을 증가시키는지 결정하기 위해 혈액 샘플을 인간 CD45의 백분율 변화에 대해 분석하였다. 연구 종결시에, 종양을 인간 림프구 마커 hCD45를 사용하여, 종양 침윤성 림프구(TIL)에 대해 FACs에 의해 분석하였다. 모든 CD3-폴레이트 치료군은 항종양 효능 및 혈액(도 20c), 및 종양(도 20d), 인간 CD45의 수준을 다양한 정도로 증가시키는 능력을 나타내었고, 가장 높은 수준의 인간 CD45 및 TGI는 단일 페길화된 CD3-폴레이트 표적화 조성물을 이용한 치료에 기여하였다. 연구 3은 연구 1 및 2와 유사한 결과를 보여준다. KB 자궁경부 종양(처음에 동결된 계대 3으로부터 성장된, 계대 5로부터의 2.0 x 106 세포로 접종됨)을 갖는 50마리의 암컷 NSG-인간화된 마우스(Jackson laboratories로부터의 CD34+)를 10마리씩 5개의 그룹으로 분류하였다. 종양이 대략 80-100 mm3일 때, 치료를 시작하였다. G1: Fab1-HK129-pAF 대조군(0.0125 mpk) G2: Fab1-HK129-바이폴레이트(0.0025 mpk), G3:Fab1-HK129-바이폴레이트(0.0125 mpk), G4: Fab1-HK129-바이폴레이트-Bi5KPEG(0.0025 mpk), G5: Fab1-HK129-바이폴레이트-Bi5KPEG(0.0125 mpk). 모든 마우스에게 매주 2회 정맥내로(IV) 투여하였다. 동물을 매주 2회 캘리퍼 측정에 의해 종양 성장(도 21a) 및 체중(도 21b)에 대해 모니터링하였다. T-세포 활성화를 치료 5일(두 번째 용량 후 1일)에 동물로부터 채취된 혈액 샘플에서 분석하였다. CD3-폴레이트 표적화 조성물이 T-세포 활성화 마커의 발현을 증가시키는지 결정하기 위해 혈액 샘플을 FACs 분석에 의해 인간 CD45, CD3, CD25 및 CD69의 백분율에 대해 분석하였다(도 21c-21f). 종양 침윤성 림프구(TIL)를 또한 연구 말기에 분석하였고, 각 그룹으로부터의 5개의 종양을 FACs에 의해 TIL(CD45, CD3 및 CD8)에 대해 분석하였다. 모든 CD3-폴레이트 표적화 조성물은 다양한 정도의 효능을 나타내었지만, 유사한 용량에서 모든 페길화된 CD3-폴레이트 표적화 조성물(87% TGI에서 그룹 G4 및 91% TGI에서 G5)은 T-세포 활성화 마커 CD25 /CD69의 유도, 증가된 TIL, 및 더 큰 항종양 성장 억제를 포함하여, 동일한 용량에서 이들의 페길화되지 않은 아이소타입보다 우수하였다(51% TGI에서 그룹 G2 및 67% TGI에서 G3). 모든 시험 물품은 마우스에서 미미한 체중 감소를 유발하였지만 15%를 초과하지 않았다.
연구 4: CD3-폴레이트 이중특이적 항체인 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트 및 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG를 KB 세포주로부터 유래된 인간 자궁경부 종양을 갖는 암컷 면역 손상된 마우스에서의 다중 용량 투여에 의해 항종양 효능에 대해 시험하였다. 비표적화 CD3 항체(Fab1-HK129-pAF)를 대조군으로서 포함시켰다. KB 자궁경부 종양을 갖는 65마리의 암컷 NSG 마우스(처음에 계대 3으로부터 성장된, 계대 7로부터의 2.0 x 106 세포로 접종됨)를 각각 10마리씩 6개의 그룹으로 분류하였다. 종양이 대략 85-100 mm3일 때, 7.5 x 106 PanT 세포를 마우스 내로 복막내로 접종하였다. 24시간 후, 마우스를 하기 치료군으로 무작위 분류하였다: G1: CD3 Fab1-HK129-pAF 대조군, G2: Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG(0.0125 mpk), G3: Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG(0.05 mpk), G4: Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트(0.0125 mpk), G5: Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트(0.05 mpk). 모든 마우스에게 종양이 평균 대략 ~100 mm3인 8일에 정맥내로(IV) 투여하였다. 동물을 매주 2회 캘리퍼 측정에 의해 종양 성장 및 체중에 대해 모니터링하였다. 도 22a에 나타낸 바와 같이, 모든 CD3-폴레이트 표적화 조성물은 항종양 활성(TGI= G2:92%, G4:55%, G5:90%)을 나타내었고, 그룹 G3(0.05 mpk에서 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG)은 종양 성장(TGI = 99%)을 억제하는 데 가장 큰 영향을 미쳤고, 8마리의 마우스 중 6마리는 완전한 종양 저해(CR)를 경험하였다. 대조군 CD3 Fab 항체를 제외한 모든 시험 조성물은 일부 체중 감소를 유발하였으나 15% 감소를 초과하지 않았다(도 22b). 이 연구 결과는 CD3 Fab-폴레이트 화합물에 대한 PEG 부가의 생물물리적 특성에 기여할 수 있는 용량 의존적 반응이 있음을 보여준다.
연구 5: CD3-폴레이트 이중특이적 항체인 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트 및 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG를 OV-90 세포주로부터 유래된 인간 난소 종양을 갖는 암컷 면역 손상된 마우스에서의 다중 용량 투여에 의해 항종양 효능에 대해 시험하였다(도 23a 및 23b). OV-90은 본 발명의 CD3 Fab-폴레이트 조성물이 난소암을 위한 표준 치료즉, 플라틴 기반 요법에 대한 내성 모델에서 활성을 갖는지 결정하기 위해 선택하였다. 비표적화 CD3 항체(Fab1-HK129-pAF)를 대조군으로서 포함시켰다. OV-90 난소 종양을 갖는 70마리의 암컷 NSG 마우스(처음에 동결된 계대 2로부터 성장된, 계대 5로부터의 7.5 x 106 세포로 접종됨)를 각각 10마리씩 6개의 그룹으로 분류하였다. 종양이 대략 100-200 mm3일 때, 7.5 x 106 PanT 세포를 마우스 내로 복막내로 접종하였다. 24시간 후, 마우스를 하기 치료군으로 무작위 분류하였다: G1: Fab1-HK129-pAF 대조군, G2: Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트(0.0125 mpk), G3: Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트(0.05 mpk), G4: Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG(0.0125 mpk), G5: Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG(0.05 mpk), 및 G6: 카르보플라틴(100 mpk). 모든 마우스에게 종양이 평균 대략 ~100 mm3인 8일에 정맥내로(IV) 투여하였다. 그룹 1 내지 5에게 총 3개의 용량을 위해 5일마다 투여한 반면, 그룹 6에게 총 2개의 용량을 위해 7일 후(15일)에 투여하였다. 동물을 매주 2회 캘리퍼 측정에 의한 종양 성장 및 체중에 대해 모니터링하였다. OV-90 모델은 난소암을 치료하기 위한 카르보플라틴의 표준 치료에 대해 내성이지만(그룹 G6), 시험된 모든 CD3-Fab 폴레이트 표적화 조성물은 다양한 정도의 효능을 나타내었고, G5 그룹(0.05 mpk에서 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG)은 종양 성장(TGI = 81%)을 억제하는 데 가장 큰 영향을 미쳤다; 도 23a. 대조군 CD3 Fab 항체를 제외한 모든 시험 조성물은 체중 감소를 유발하였지만 각각의 그룹에서 20% 체중 감소를 초과하지 않았다(도 23b).
연구 4의 결과와 유사하게, 연구 5는 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트-Bi5KPEG로 처리된 그룹이 Fab1-HK129-LL157-바이폴레이트로 처리된 그룹보다 동일한 농도로 투여될 때 더 우수한 항종양 활성을 갖는다는 것을 보여준다. 이것은 CD3 Fab-폴레이트 조성물에 대한 PEG 첨가로부터 비롯되는 향상된 생물물리적 특성에 기인할 수 있다. 추가로 낮은 폴레이트 수용체 카피를 갖는 난소암 세포(예컨대, 세포당 ~ 10K 카피를 갖는 OV-90)에서, 강한 항종양 효과가 여전히 관찰된다는 점에 유의한다. 이것은 높은 카피수의 폴레이트 수용체를 전제로 하지 않고, 환자 집단을 치료하기 위한 최전선 치료제로서의 본 발명의 CD3 Fab-폴레이트 조성물의 용도를 뒷받침한다. 이것은 본원에서 시험관내 세포독성 분석에 의해 추가로 확인되며, 이는 낮은 폴레이트 수용체 카피수를 갖는 세포가 여전히 피코몰 범위에서 EC50 값을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 27
비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 Fab-폴레이트 이중특이적 항체(Fab-바이폴레이트, Fab-폴레이트-PEG, 및 Fab-바이폴레이트-BiPEG) 조성물의 안전성 및 효능의 인간 임상 시험.
목적: 피하 투여된 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 항-CD3 Fab-폴레이트 이중특이적 재조합 인간 항체의 안전성 및 약동학을 동일한 표적 항원에 특이적인 상업적으로 이용가능한 제품과 비교하기 위해.
환자: 20-40세 및 체중 60-90 kg 범위의 18명의 건강한 지원자를 연구에 등록시킨다. 대상체는 혈액학 또는 혈청 화학, 및 음성 소변 독성 스크린, HIV 스크린, 및 간염 B 표면 항원에 대해 임상적으로 유의한 비정상적인 실험실 값을 갖지 않을 것이다. 이들은 다음의 증거가 없어야 한다: 고혈압; 임의의 원발성 혈액 질환의 병력; 유의한 간, 신장, 심혈관, 위장관, 비뇨생식기, 대사, 신경계 질환의 병력; 빈혈 또는 발작 장애의 병력; 박테리아 또는 포유동물 유래 제품, PEG, 또는 인간 혈청 알부민에 대해 알려진 민감성; 카페인 함유 음료를 습관적으로 많이 섭취하는 자; 임의의 다른 임상 시험에 참여하거나 연구 시작 30일 이내에 수혈 또는 기증된 경우; 연구 시작 3개월 이내에 항-CD3 항체에 노출된 경우; 연구 시작 7일 이내에 질병이 있는 경우; 및 연구 전 신체 검사 또는 연구 시작 14일 이내에 임상 실험실 평가에서 유의한 이상이 있는 경우. 모든 대상체는 안전성에 대해 평가될 수 있으며, 약동학 분석을 위한 모든 혈액 수집은 예정대로 수집된다. 모든 연구는 기관 윤리 위원회 승인 및 환자 동의 하에 수행된다.
이것은 건강한 여성 지원자에서 I상, 단일 센터, 오픈 라벨(open-label), 무작위화된, 2기간 교차 연구일 것이다. 18명의 대상체는 2개의 치료 순서 그룹(9명의 대상체/그룹) 중 하나에 무작위로 할당된다. 항-CD3 항체는 당업자에 의해 이를 필요로 하는 대상체에게 항체를 도입하는 데 일반적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 국소로 또는 전신으로 투여 기간을 통해 투여된다. 본 발명에 따른 항-CD3 항체 조성물은 피하로, 근육내로, 피내로, 관절내로, 흉막내로, 복막내로, 동맥내로, 또는 정맥내로 투여될 수 있지만, 어떤 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 치료되는 질환 및/또는 병태의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 투여는 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 이중특이적 항-CD3 Fab-폴레이트 항체 및 선택된 상업적으로 이용가능한 제품의 동등한 용량을 사용하여 볼루스 피하(s.c.) 또는 정맥내 주사로서 2개의 개별 투여 기간에 걸쳐 이루어질 수 있다. 상업적으로 이용가능한 제품의 투여 용량 및 빈도는 포장 라벨에 표시된 대와 같다. 상업적으로 이용가능한 제품을 사용하여, 추가 투여, 투여 빈도, 또는 원하는 다른 매개변수는 대상체의 추가 그룹을 포함시킴으로써 연구에 추가될 수 있다. 각각의 투여 기간은 14일 휴지(washout) 시간에 의해 분리된다. 대상체는 2개의 투여 기간 각각 동안 투여 전 적어도 12시간 및 투여 후 72시간 동안 연구 센터에 감금되지만 투여 시간 사이에는 감금되지 않는다. 페길화된 이중특이적 항-CD3 항체에 대해 추가의 투여, 빈도, 또는 다른 매개변수가 시험되는 경우 대상체의 추가 그룹이 첨가될 수 있다. 항-CD3 항체의 실험 제제는 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 이중특이적 항-CD3 Fab-폴레이트 항체이다.
혈액 샘플링: 항-CD3 Fab-폴레이트 이중특이적 항체의 투여 전후에 직접적인 정맥 천자에 의해 연속 혈액을 채취한다. 혈청 항-CD3 항체 농도의 결정을 위한 정맥 혈액 샘플(5 mL)은 투여 전 약 30, 20, 및 10분에(3개의 기준선 샘플) 그리고 투여 후 대략 하기 시간에 수득된다: 30분 및 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 및 72시간. 각각의 혈청 샘플을 2개의 분취물로 나눈다. 모든 혈청 샘플을 -20℃에 보관한다. 혈청 샘플을 드라이 아이스 상에서 배송한다. 공복 임상 실험실 시험(혈액학, 혈청 화학, 및 소변검사)은 1일에 초기 용량 직전, 4일 아침, 16일에 투여 직전, 및 19일 아침에 수행한다.
생물분석 방법: 혈청 이중특이적 항-CD3 Fab-폴레이트 항체 농도의 결정을 위해 방사선면역분석(RA) 또는 ELISA 키트 절차를 사용한다.
안전성 결정: 활력 징후는 각각의 투여 직전(1일 및 16일), 및 각각의 투여 후 6, 24, 48, 및 72시간에 기록한다. 안전성 결정은 부작용의 발생 및 유형 및 기준선으로부터의 임상 실험실 시험의 변화에 기초한다. 또한, 혈압, 및 신체 검사 결과를 포함하는 활력 징후 측정에서 연구 전으로부터의 변화를 평가한다.
데이터 분석: 용량 후 혈청 농도 값을 각각의 용량 후 값으로부터 투여 전 30, 20, 및 10분에 수집된 3개의 샘플로부터의 항-CD3 항체 수준의 평균으로부터 결정된 평균 기준선 항-CD3 항체 농도를 차감함으로써 용량 전 기준선 항-CD3 항체 농도에 대해 보정한다. 용량 전 혈청 항-CD3 항체 농도는 분석의 정량화 수준 미만인 경우 평균 값의 계산에 포함시키지 않는다. 기준선 항-CD3 항체 농도에 대해 보정된 혈청 농도 데이터로부터 약동학 매개변수를 결정한다. 약동학 매개변수는 최신 버전의 BIOAVL 소프트웨어를 사용하는 Digital Equipment Corporation VAX 8600 컴퓨터 시스템 상에서 모델 독립적인 방법에 의해 계산한다. 하기 약동학 매개변수를 결정한다: 피크 혈청 농도(Cmax); 피크 혈청 농도까지의 시간(tmax); 선형 사다리꼴 규칙을 사용하여 계산된 0시간부터 마지막 혈액 샘플링 시간(AUC0 - 72)까지의 농도-시간 곡선하 면적(AUC); 및 제거율 상수로부터 계산된 최종 제거 반감기(t1/2). 제거율 상수는 로그-선형 농도-시간 플롯의 말단 선형 영역에서의 연속 데이터 지점의 선형 회귀에 의해 추정한다. 약동학 매개변수의 평균, 표준 편차(SD), 및 변동 계수(CV)를 각 치료에 대해 계산한다. 매개변수 평균의 비율(보존된 제제/보존되지 않은 제제)을 계산한다.
안전성 결과: 부작용의 발생은 치료군에 균등하게 분포된다. 기준선 또는 연구 전 임상 실험실 시험 또는 혈압으로부터 임상적으로 유의한 변화는 없고, 신체 검사 결과 및 활력 징후 측정에서 연구 전으로부터의 눈에 띄는 변화는 없다. 2개의 치료군에 대한 안전성 프로파일은 유사하게 나타나야 한다.
약동학 결과: 동일한 표적 항원에 특이적인 하나 이상의 상업적으로 이용가능한 제품의 단일 용량을 받은 후 18명의 모든 대상체에서 평균 혈청 항-CD3 항체 Fab-폴레이트 이중특이적 농도-시간 프로파일(기준선 항-CD3 항체 수준에 대해 보정되지 않음)을 측정된 각각의 시점에 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 이중특이적 항-CD3 항체와 비교한다. 모든 대상체는 정상적인 생리적 범위 내의 용량 전 기준선 항-CD3 항체 농도를 가져야 한다. 약동학 매개변수를 용량 전 평균 기준선 항-CD3 항체 농도에 대해 보정된 혈청 데이터로부터 결정하고, Cmax 및 tmax를 결정한다. 선택된 임상 비교기(들)에 대한 평균 tmax는 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 이중특이적 항-CD3에 대한 tmax보다 유의하게 짧다. 최종 반감기 값은 본 발명의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 이중특이적 항-CD3 항체에 대한 최종 반감기와 비교하여 시험된 상업적으로 이용가능한 항-CD3 항체 제품에 대해 유의하게 짧다.
결론적으로, 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 이중특이적 항-CD3 항체의 피하 투여된 단일 용량은 안전할 것이며 건강한 여성 대상체에 의해 잘 용인될 것이다. 부작용의 비교 발생, 임상 실험실 값, 활력 징후, 및 신체 검사 결과에 기초할 때, 항-CD3 항체의 상업적으로 이용가능한 형태 및 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 이중특이적 항-CD3 fab 폴레이트 항체의 안정성 프로파일은 동등할 것이다. 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하는 이중특이적 항-CD3 항체는 잠재적으로 환자 및 건강 관리 제공자에게 큰 임상적 유용성을 제공한다.
본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고, 본 출원의 취지 및 범위 및 첨부된 청구범위 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
본 발명은 하기 번호가 매겨진 구현예에 의해 추가로 설명된다:
1. 서열번호: 1-61 중 적어도 하나를 포함하는 항-CD3 Fab 항체.
2. 제1항에 있어서, 서열번호: 1-61 중 2개를 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체.
3. i) 제1 결합 도메인 및 ii) 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자로서, 제2 결합 도메인은 서열번호: 1-61로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 이중특이적 결합 분자.
4. 서열번호: 1-61 중 하나 이상에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 세포독성 활성 CD3 Fab 특이적 결합 구조체.
5. 항-CD3 Fab 항체로서, 항-CD3 항체는 (a) 서열번호: 1-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 (b) 서열번호: 4-5로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 결합 도메인을 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체.
6. 제4항에 있어서, 항체는 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 연결되는 것인 항-CD3 Fab 항체.
7. 제6항에 있어서, 생물학적 활성 분자는 폴레이트인 것인 항-CD3 Fab 항체.
8. 제1항에 있어서, 비자연적으로 코딩된 아미노산이 혼입된 것인 항-CD3 Fab 항체.
9. 제6항에 있어서, 중쇄는 C-말단에 아미노산 연장을 포함하는 것인 항-CD3 Fab 변이체.
10. 제9항에 있어서, 아미노산 연장은 아미노산 DKTHT를 포함하는 것인 항-CD3 Fab 변이체.
11. 제5항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 서열은 항원 결합을 위한 하나 이상의 위치에 프레임워크 잔기 또는 생식계열 돌연변이를 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체.
12. 제6항에 있어서, 링커는 수용성 중합체인 것인 항-CD3 Fab 항체.
13. 제12항에 있어서, 수용성 중합체는 선형 또는 분지형인 것인 항-CD3 Fab 항체.
14. 제6항에 있어서, 하나 이상의 폴레이트 및 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체.
15. 제5항의 항-CD3 Fab 항체를 포함하는 높은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에서 세포 사멸을 최적화하는 방법으로서, 항체는 하나 이상의 폴레이트를 포함하고; 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산은 항체 내로 혼입되는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 폴레이트 수용체 수는 10,000개 이상인 것인 방법.
17. 제5항에 있어서, 화합물 30에 따른 구조를 갖는 PEG 폴레이트 링커를 추가로 포함하는 것인 항-CD3 Fab 항체.
18. 제17항의 항-CD3 Fab 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 높은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에서 질환 또는 병태를 갖는 환자를 치료하는 방법.
19. 제3항에 있어서, 2개의 폴레이트 및 2개의 페길화된 분자를 포함하는 것인 이중특이적 항-CD3 Fab 항체.
20. 제19항에 있어서, 부위 특이적으로 혼입된 비자연적으로 코딩된 아미노산을 추가로 포함하는 것인 이중특이적 항-CD3 Fab 항체.
SEQUENCE LISTING <110> Ambrx, Inc. <120> Anti-CD3 Fab-Folate Antibodies and Their Uses <130> AMBX-0228.00PCT <150> 62/723,793 <151> 2018-08-28 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.2+CH1) <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys 225 <210> 2 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (VH1.1+CH1) <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys 225 <210> 3 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.0+CH1) <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys 225 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.2+CH1-DKTHT) <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 <210> 5 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.1+CH1-DKTHT) <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180 185 190 Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 195 200 205 Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 210 215 220 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 <210> 6 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.0+CH1-DKTHT) <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 165 170 175 Thr Phe Pro Ala Val 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130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 8 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC (vL1.0+CL) <400> 8 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 9 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC (vL1.0+CL) <400> 9 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 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Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro Ala Phe 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 11 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.2+CH1- HS115pAF) <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Pro Ala 115 120 125 Phe Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 12 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Seuence <220> <223> HC (vH1.2+CH1- HK129pAF) <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 13 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.2+CH1- HT160pAF) <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Pro Ala Phe Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 14 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.2+CH1- HA114pAF+ DKTHT) <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 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Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Pro Ala 115 120 125 Phe Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 <210> 16 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.2+CH1- HK129pAF-DKTHT) <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 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<210> 17 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.2+CH1- HT160pAF+ DKTHT) <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135 140 Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160 Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Pro Ala Phe Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 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Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 <210> 49 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH2.3+CH1- HK129pAF) <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 50 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH2.2+CH1- HK129pAF) <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 51 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH1.0+CH1- HK129pAF) <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 52 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH2.1+CH1- HK129pAF) <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 53 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH2.4+CH1- HK129pAF) <400> 53 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 54 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH2.5+CH1- HK129pAF) <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 55 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH2.6+CH1- HK129pAF) <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 56 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH3.1+CH1- HK129pAF) <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 57 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC (vH3.2+CH1- HK129pAF) <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Pro Ala Phe Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 <210> 58 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC (vL2.4+CL ) <400> 58 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 59 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC (VL2.1+CL) <400> 59 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 60 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC (vL2.5+CL) <400> 60 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 61 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC (vL2.2+CL) <400> 61 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 62 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC (vL3.1+CL) <400> 62 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (44)

  1. 서열번호: 1-62 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호: 1-62 중 2개의 아미노산 서열을 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    a) 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나; 및
    b) 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나
    를 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호: 1-6 중 어느 하나 및 서열번호: 7-9 중 어느 하나를 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  5. 제4항에 있어서, 서열번호: 4-6 중 어느 하나 및 서열번호: 7-9 중 어느 하나를 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항체 단편은 IgG, Fv, Fab, (Fab')2, 또는 단일 사슬 Fv(scFv)를 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  7. (i) 제1 결합 도메인; 및 ii) 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 결합 분자로서, 제2 결합 도메인은 서열번호: 1-62 중 적어도 하나를 포함하는 것인 이중특이적 결합 분자.
  8. 제7항에 있어서, 제2 결합 도메인은 서열번호: 1-62 중 2개를 포함하는 것인 이중특이적 결합 분자.
  9. 제7항에 있어서, 제2 결합 도메인은,
    a) 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나; 및
    b) 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나
    를 포함하는 것인 이중특이적 결합 분자.
  10. 제7항에 있어서, 제2 결합 도메인은 서열번호: 1-6 중 어느 하나 및 서열번호: 7-9 중 어느 하나를 포함하는 것인 이중특이적 결합 분자.
  11. 서열번호: 1-62 중 적어도 하나를 포함하는 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체.
  12. 서열번호: 1-62 중 2개를 포함하는 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체.
  13. a) 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 및 57 중 어느 하나; 및
    b) 서열번호: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, 및 62 중 어느 하나
    를 포함하는, 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체.
  14. 제13항에 있어서, 서열번호: 1-6 중 어느 하나 및 서열번호: 7-9 중 어느 하나를 포함하는 것인 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체.
  15. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 단편은 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산을 포함하고, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 파라-아세틸 페닐알라닌, p-니트로페닐알라닌, p-설포티로신, p-카르복시페닐알라닌, o-니트로페닐알라닌, m-니트로페닐알라닌, p-보로닐 페닐알라닌, o-보로닐페닐알라닌, m-보로닐페닐알라닌, p-아미노페닐알라닌, o-아미노페닐알라닌, m-아미노페닐알라닌, p-아실페닐알라닌, o-아실페닐알라닌, m-아실페닐알라닌, p-OMe 페닐알라닌, o-OMe 페닐알라닌, m-OMe 페닐알라닌, p-설포페닐알라닌, o-설포페닐알라닌, m-설포페닐알라닌, 5-니트로 His, 3-니트로 Tyr, 2-니트로 Tyr, 니트로 치환된 Leu, 니트로 치환된 His, 니트로 치환된 De, 니트로 치환된 Trp, 2-니트로 Trp, 4-니트로 Trp, 5-니트로 Trp, 6-니트로 Trp, 7-니트로 Trp, 3-아미노티로신, 2-아미노티로신, O-설포티로신, 2-설포옥시페닐알라닌, 3-설포옥시페닐알라닌, o-카르복시페닐알라닌, m-카르복시페닐알라닌, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-프로파르길-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-Dopa, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-아이오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌 및 p-프로파르길옥시-L-페닐알라닌인 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  16. 제15항에 있어서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 항체 내로 부위 특이적으로 혼입되는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  17. 제1항 내지 제6항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 링커, 중합체, 또는 생물학적 활성 분자에 연결되는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  18. 제17항에 있어서, 링커 또는 중합체는 이작용성 중합체 또는 이작용성 링커인 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 생물학적 활성 분자는 소분자를 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  20. 제1항 내지 제6항, 제15항 및 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 분자는 하나 이상의 폴레이트 분자 또는 이의 유사체 또는 유도체를 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  21. 제1항 내지 제6항, 제15항 및 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 비자연적으로 코딩된 아미노산은 수용성 중합체에 연결되는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  22. 제21항에 있어서, 수용성 중합체는 하나 이상의 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)을 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  23. 제22항에 있어서, PEG는 비자연적으로 코딩된 아미노산 또는 생물학적 활성 분자에 연결되는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  24. 제22항에 있어서, PEG는 C-말단 중쇄 및/또는 경쇄 도메인에 공유결합으로 접합되는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  25. 제24항에 있어서, PEG는 디설파이드 결합 가교를 통해 C-말단 중쇄 및 경쇄 도메인에 접합되는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, PEG는 선형 또는 분지형인 것인 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  27. 제17항에 있어서, 하나 이상의 폴레이트 및 하나 이상의 PEG 분자를 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  28. 제3항에 있어서, 중쇄 및 경쇄 서열은 항원 결합을 위한 하나 이상의 위치에 프레임워크 잔기 및/또는 생식계열 돌연변이를 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  29. 제28항에 있어서, 항원 결합 최적화를 위한 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  30. 제17항에 있어서, 화합물 29A, 29B, 29C, 29D, 29E, 30A, 30B, 30C, 30D 및 30E에 따른 PEG 링커 분자 구조를 추가로 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  31. 제7항에 있어서, 항체, 또는 단편은 하나 이상의 번역 후 변형을 포함하는 것인 항-CD3 항체 또는 항체 단편.
  32. 요법에서 사용하기 위한 제1항 내지 제6항 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항-CD3 항체 또는 항체 단편, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자, 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체.
  33. 제1항 내지 제6항 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항-CD3 항체 또는 항체 단편, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자, 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체를 포함하는 많은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에서의 세포 사멸의 최적화 방법으로서, 항체, 결합 분자, 또는 결합 구조체는 하나 이상의 폴레이트를 포함하고; 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산은 항체 내로 혼입되는 것인 세포 사멸의 최적화 방법.
  34. 제33항에 있어서, 폴레이트 수용체 수는 10,000개 이상인 것인 세포 사멸의 최적화 방법.
  35. 제33항에 있어서, 하나 이상의 비자연적으로 코딩된 아미노산, 또는 하나 이상의 폴레이트 분자, 또는 중쇄 또는 경쇄의 C-말단, 또는 중쇄 및 경쇄 모두의 C-말단에 연결된 하나 이상의 PEG 분자를 추가로 포함하는 것인 세포 사멸의 최적화 방법.
  36. 제1항 내지 제6항 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 많은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에서 질환 또는 병태를 갖는 대상체의 치료 방법.
  37. 제1항 내지 제6항 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 갖는 환자의 치료 방법.
  38. 제37항에 있어서, 암은 폴레이트 수용체-알파(FOLR1)의 고발현을 특징으로 하고, 선택적으로 암은 난소암인 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 난소암은 상피 종양, 간질 종양, 생식 세포 종양, 나팔관 암 또는 원발성 복막 암종을 포함하는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제6항 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병을 갖는 환자의 치료 방법.
  41. 제1항 내지 제6항 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, AIDs를 갖는 환자를 치료하는 방법.
  42. 제1항 내지 제6항 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항-CD3 항체의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 유전병을 갖는 환자의 치료 방법.
  43. 높은 폴레이트 수용체 수를 발현하는 세포에 사용하기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제6항 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항-CD3 Fab 항체, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자, 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체의 용도.
  44. 제1항 내지 제6항 및 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항의 항-CD3 항체, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항의 이중특이적 결합 분자, 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 세포독성 활성 CD3 특이적 결합 구조체의 치료적 유효량 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 Fab 조성물.
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