BR112021003843A2 - biconjugados de folato de anticorpo anti-cd3 e seus usos - Google Patents

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Abstract

BICONJUGADOS DE FOLATO DE ANTICORPO ANTI-CD3 E SEUS USOS. São descritos no presente documento anticorpos com Folato anti-CD3 inovadores e seus usos no tratamento de doenças ou afecções que poderiam se beneficiar destes.

Description

“BICONJUGADOS DE FOLATO DE ANTICORPO ANTI-CD3 E SEUS USOS”
REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório sob no U.S..
62/732.793, intitulado "Anti-CD3 Fab Folatos Antibodies and their Uses" depositado em 28 de agosto de 2018, cujo conteúdo é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida no formato ASCII via EFS-Web e é incorporada por meio deste a título de referência em sua totalidade. A cópia de ASCII foi criada em 28 de agosto de 2019 com o nome AMBX_0228_00PCT_Sequence_Listing.txt e tem 128.417 bytes.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A revelação da presente invenção pertence ao campo da imunoncologia.
Mais particularmente, a invenção se refere a anticorpos anti-CD3 e fragmentos ou variantes dos mesmos conjugados a uma ou mais moléculas de folato. A invenção também se refere a anticorpos anti-CD3 com Fab-Folato e variantes dos mesmos conjugados a polietilenoglicol (PEG).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] O câncer de ovário é um dos tipos de câncer mais comuns em mulheres mundialmente. Anualmente cerca de 250.000 mulheres, serão diagnosticadas com câncer de ovário e aproximadamente 140.000 mulheres a cada ano sucumbem a esta doença. A taxa de sobrevivência de cinco anos para o câncer de ovário varia dependendo do tipo e do estágio do câncer, sendo a tendência, os cânceres de ovário mais avançados têm as piores taxas de sobrevivência de cinco anos. As opções atuais de tratamento para câncer de ovário incluem quimioterapia, cirurgia, radiação ou uma combinação dessas terapias. As taxas de resposta para câncer de ovário avançado após citorredução cirúrgica seguida por quimioterapia com base em platina é de 80% com 40 a 60% sendo respostas completas. Infelizmente, aproximadamente 70% desses pacientes apresentarão recidiva com uma sobrevida livre de progressão mediana de 18 meses.
[005] Atualmente, há uma deficiência no campo para terapias direcionadas a cânceres de ovário e tipos de câncer de ovário, incluindo tumores de células eptiteliais, estromais e germinativas e incluindo câncer de trompa de Falópio e carcinoma peritoneal primário. Embora cirurgia, radiação e uma variedade de quimioterápicos sejam comumente usados para tratar pacientes com câncer de ovário, a Administração de Alimentos e Drogas (FDA) aceitou recentemente um pedido de licença de produtos biológicos suplementares (sBLA) para bevacizumabe (Avastin) para o tratamento de câncer de ovário avançado como terapia de primeira linha.
[006] A imunoterapia está sendo avaliada como uma nova opção de tratamento para pacientes com câncer, que usa células T biológicas ou modificadas para estimular o sistema imunológico do paciente para atacar seu câncer. Vários imunoterapêuticos têm se mostrado muito promissores e foram aprovados para tratar vários tipos de câncer.
Inibidores de checkpoint imunológico, células T receptoras de antígeno quimérico (CAR- T), engajadores de células T biespecíficas (BiTEs), vários projetos de anticorpos biespecíficos dependentes de células T (TDBs), anticorpos biespecíficos dependentes de células NK, anticorpos biespecíficos dependentes de macrófagos, e células que apresentam antígeno autólogo (APC)/vacinas contra o câncer são alguns dos imunoterapêuticos usados para tratar pacientes com câncer.
[007] Alguns produtos biológicos em avaliação clínica para pacientes com câncer de ovário incluem um conjugado de droga anticorpo contra o receptor alfa de folato (Mirvetuximabe soravtansina (IMGN853)), o anticorpo biespecífico EpCAM-CD3
(Catumaxomabe), um DLL4-VEGF biespecífico, vacinas direcionadas a NY-ESO-1 e um receptor alfa de folato de CAR-T (FOLR1).
[008] Foi relatado que o câncer de ovário tem um ambiente imunossupressor, o que torna o desenvolvimento de certos tipos de imunoterapêuticos, como inibidores de checkpoint, um desafio. Atualmente, nenhum imunoterapêutico foi aprovado para tratar pacientes com câncer de ovário, embora vários estejam sendo avaliados em ensaios clínicos.
[009] Os receptores de folato são expressos em uma série de cânceres, incluindo, mas não se limitando a, cânceres epiteliais, como mama, cervical, colorretal, renal, nasofaríngeo, ovário e endometrial. A família do receptor de folato (FR) em humanos inclui FRalpha, FRbeta e FRgamma. O receptor alfa de folato (FOLR1) é um receptor ancorado por GPI altamente expresso em aproximadamente 80-90% dos cânceres de ovário. O FOLR1 se liga ao ácido fólico, também conhecido como Vitamina B9, e ao metabólito primário do ácido fólico, 5-metil-tetra-hidrofolato (5-MTHF). A expressão elevada de FOLR1 é observada em aproximadamente 76% dos cânceres de ovário seroso de alto grau, que é o histótipo predominante, em comparação com 11% no câncer de ovário mucinoso. O FOLR1 tem expressão baixa e restrita em tecidos normais, o que o torna um alvo preferido para esforços de desenvolvimento de drogas oncológicas.
[010] Para superar as deficiências na técnica, os inventores desenvolveram um conjugado de anticorpo em um anticorpo anti-CD3 tendo um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente incorporados e compreendendo ainda uma ou mais moléculas de folato. O anticorpo biespecífico pode compreender ou consistir em um anticorpo anti- CD3, que foi projetado para ter um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural na cadeia pesada ou leve do Fab. O anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo pode compreender um anticorpo anti-CD3, que foi projetado para ter um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente nas cadeias pesadas e/ou leves.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[011] Os anticorpos biespecíficos anti-CD3 que recrutam células T citotóxicas para células cancerosas são uma nova abordagem promissora para o tratamento de vários tumores líquidos e sólidos. A presente invenção fornece anticorpos anti-CD3. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 é um anticorpo biespecífico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 inclui um aminoácido codificado de forma não natural na cadeia pesada ou leve do Fab, de preferência na cadeia pesada. Em algumas modalidades, o aminoácido não codificado naturalmente é para-acetil-fenilalanina (pAF).
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 inclui dois ou mais aminoácidos codificados de forma não natural nas cadeias pesadas e/ou leves do Fab, por exemplo, dois, três ou quatro aminoácidos codificados de forma não natural, opcionalmente em que os dois ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são pAF. Em algumas modalidades, o Fab anti-CD3 é conjugado ao folato. Em algumas modalidades, o Fab anti-CD3 é conjugado a um polímero solúvel em água, como polietilenoglicol (PEG). Em algumas modalidades, o Fab anti-CD3 é conjugado com folato e polietilenoglicol (PEG), opcionalmente usando ligantes bifuncionais. Em algumas modalidades, o Fab anti-CD3 é conjugado a duas moléculas de folato e duas de polietilenoglicol (PEG). Em algumas modalidades, a conjugação é por meio da cadeia lateral de um aminoácido codificado de forma não natural, como pAF. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 recruta células T citotóxicas para células tumorais positivas para receptor de folato (FR +). Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 tem eficácia melhorada, toxicidade reduzida, propriedades farmacocinéticas (PK) melhoradas, afinidade melhorada, ligação de antígeno associado ao tumor (TAA) melhorada, meia-vida in vivo melhorada (T1/2),
melhor atividade in vitro, meia-vida sérica melhorada e/ou atividade in vivo melhorada.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 tem eficácia melhorada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 tem toxicidade reduzida. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 tem propriedades PK melhoradas. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 tem afinidade melhorada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CD3 tem ligação de TAA melhorada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 tem T1/2 in-vivo melhorada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 tem atividade in vitro melhorada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 tem meia-vida sérica melhorada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 tem atividade in vivo melhorada. A presente invenção fornece a otimização de um conjugado Fab-Folato anti- CD3 que alveja células T citotóxicas para células tumorais positivas para receptor de folato (FR+) para eficácia ideal, toxicidade reduzida e propriedades farmacocinéticas (PK) ideais. Por exemplo, a presente invenção fornece um conjugado Fab-Folato anti-CD3 otimizado que alveja células T citotóxicas para células tumorais positivas para receptor de folato (FR +) para eficácia ideal, toxicidade reduzida e propriedades farmacocinéticas (PK) ideais. Para atingir um equilíbrio ideal entre eficácia e toxicidade devido à síndrome de liberação de citocina (CRS), os inventores realizaram ajuste fino do anticorpo anti- CD3, bem como otimizou a ligação do antígeno associado ao tumor (TAA). Para aumentar a meia-vida in vivo (T1/2), as moléculas tanto de Folato quanto de PEG de vários tamanhos foram conjugadas simultaneamente pelo uso de ligantes bifuncionais. Os conjugados otimizados mostraram atividade in vitro potente e seletiva, meia-vida sérica satisfatória e atividade in vivo potente em modelos de camundongos xenoenxertados. Esta abordagem semissintética é provável que seja aplicável para a geração de agentes biespecíficos anti-CD3 adicionais usando-se ligantes de moléculas pequenas seletivos para outros TAAs.
[012] Esta invenção fornece anticorpos anti-CD3 e seus conjugados com folato.
Esta invenção também fornece anticorpos anti-CD3 e seus conjugados para PEG. Esta invenção também fornece anticorpos anti-CD3 e seus conjugados para folato e PEG. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD3 inovadores da presente invenção compreendem um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma cadeia pesada de anticorpo completa. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma cadeia leve de anticorpo completa. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma cadeia pesada completa do anticorpo e uma cadeia leve de anticorpo completa. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma região variável de uma cadeia leve de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma região variável de uma cadeia pesada de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma região variável de uma cadeia leve e uma região variável de uma cadeia pesada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende pelo menos um CDR de uma cadeia leve de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende pelo menos um CDR de uma cadeia pesada de anticorpo anti-CD3. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende pelo menos um CDR de uma cadeia leve e pelo menos um CDR de uma cadeia pesada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende três CDRs de uma cadeia leve. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende três CDRs de uma cadeia pesada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende três CDRs de uma cadeia leve e três CDRs de uma cadeia pesada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois Fabs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois ou mais Fabs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um scFv. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CD3 compreende dois scFvs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois ou mais scFv. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um minicorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois minicorpos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois ou mais minicorpos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um diacorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois diacorpos.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois ou mais diacorpos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um BiTE. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois BiTEs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois ou mais BiTEs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um DART. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CD3 compreende dois DARTs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois ou mais DARTs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um TandAb. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois TandAbs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende dois ou mais TandAbs. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma região variável de uma cadeia leve e uma região variável de uma cadeia pesada. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma cadeia leve completa e uma cadeia pesada completa. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um ou mais domínios Fc ou parte do mesmo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma combinação de qualquer uma das modalidades anteriores. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um homodímero, heterodímero, homomultímero ou heteromultímero de qualquer uma das modalidades anteriores. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um polipeptídeo que se liga a um parceiro de ligação, em que o parceiro de ligação compreende um antígeno, um polipeptídeo, uma molécula de ácido nucleico, um polímero ou outra molécula ou substância. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 está associado a uma molécula ou substância de arcabouço não-anticorpo.
[013] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma ou mais modificações pós-tradução. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 está ligado a um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 está ligado a um polímero bifuncional, ligante bifuncional ou pelo menos um anticorpo anti-CD3 adicional. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 está ligado a um polipeptídeo que não é um anticorpo anti-CD3. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de ligação de antígeno compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural está ligado a um ou mais polipeptídeos de ligação de antígeno adicionais que também podem compreender um aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de ligação de antígeno compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural está ligado a um ou mais conjugados de polipeptídeo de molécula pequena que também podem compreender um aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD3 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural está ligado a um ou mais polipeptídeos de ligação de antígeno adicionais que também podem compreender um aminoácido codificado de forma não natural.
[014] Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural está ligado a um ligante de molécula pequena. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural está ligado a dois ligantes de moléculas pequenas. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural está ligado a dois ou mais ligantes de moléculas pequenas. Em algumas modalidades, o ligante de molécula pequena compreende uma molécula de folato ou DUPA. Em algumas modalidades, o ligante de molécula pequena compreende dois folato ou duas moléculas de DUPA. Em algumas modalidades, o ligante de molécula pequena compreende dois ou mais folato ou duas ou mais moléculas de DUPA. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural está ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água compreende uma porção química de poli (etilenoglicol). Em algumas modalidades, a molécula de poli (etilenoglicol) é um polímero bifuncional. Em algumas modalidades, o polímero bifuncional está ligado a um segundo polipeptídeo. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é um polipeptídeo de ligação de antígeno. Em algumas modalidades, o segundo polipeptídeo é um anticorpo anti-CD3. Em algumas modalidades, um ligante de molécula pequena está ligado a um polímero solúvel em água. Em algumas modalidades, dois ligantes de moléculas pequenas estão ligados a dois polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, dois ou mais ligantes de moléculas pequenas estão ligados a dois ou mais polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, um folato está ligado a uma molécula de PEG. Em algumas modalidades, duas moléculas de folato estão ligadas a dois polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, duas ou mais moléculas de folato estão ligadas a duas ou mais moléculas de PEG.
[015] Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos no anticorpo anti-CD3 podem ser com aminoácidos de ocorrência natural ou não natural, desde que pelo menos uma substituição seja com um aminoácido codificado de forma não natural.
[016] Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural compreende um grupo carbonila, um grupo acetila, um grupo aminooxi, um grupo hidrazina, um grupo hidrazida, um grupo semicarbazida, um grupo azida ou um grupo alcino.
[017] Em algumas modalidades, a molécula de poli (etilenoglicol) tem um peso molecular médio entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. Em algumas modalidades, a molécula de poli (etilenoglicol) tem um peso molecular médio entre 0,1 kDa e 50 kDa.
Em algumas modalidades, o poli (etilenoglicol) tem um peso molecular médio entre 1 kDa e 25 kDa, ou entre 2 e 22 kDa, ou entre 5 kDa e 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular médio pode ser cerca de 5 kDa, ou cerca de 10 kDa, ou cerca de 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular médio do polímero de poli (etilenoglicol) pode ser 5 kDa ou 10 kDa ou 20 kDa. Em certas modalidades, o peso molecular é determinado por métodos apropriados, como análise SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, espectrometria de massa e eletroforese capilar.
[018] Em algumas modalidades, a molécula de poli (etilenoglicol) é um polímero ramificado. Em algumas modalidades, cada ramificação do polímero ramificado de poli (etilenoglicol) tem um peso molecular entre 1 kDa e 100 kDa, ou entre 1 kDa e 50 kDa.
Em algumas modalidades, cada ramo do polímero ramificado de poli (etilenoglicol) tem um peso molecular de entre 1 kDa e 25 kDa, ou entre 2 e 22 kDa, ou entre 5 kDa e 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular de cada ramo do polímero ramificado de poli (etilinoglicol) pode ser de cerca de 5 kDa, ou cerca de 10 kDa, ou cerca de 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular de cada ramo do polímero ramificado de poli (etilenoglicol) pode ser de 5 kDa ou 10 kDa ou 20 kDa.
[019] A presente invenção também fornece um polipeptídeo de anticorpo anti- CD3 compreendendo um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa que está ligada a um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural em que o referido aminoácido codificado de forma não natural é incorporado ribossomicamente no polipeptídeo na fase pré locais selecionados.
[020] As modalidades da invenção fornecem um anticorpo anti-CD3 compreendendo pelo menos um dos SEQ ID NOs: 1-62. O anticorpo anti-CD3 compreendendo dois dos SEQ ID NOs: 1-62. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo anti-CD3 compreendendo dois dos SEQ ID NOs: 1-62. O anticorpo anti-CD3 compreendendo qualquer um dos SEQ ID NOs: 1-6 e qualquer um dos SEQ ID NOs: 7-
9. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3 compreendendo dois dos SEQ ID NOs: 1 a 5. Em outras modalidades, a invenção fornece uma molécula de ligação biespecífica compreendendo i) um primeiro domínio de ligação e ii) um segundo domínio de ligação em que o segundo domínio de ligação é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-62. Em outras modalidades, a invenção fornece uma molécula de ligação biespecífica compreendendo i) um primeiro domínio de ligação e ii) um segundo domínio de ligação em que o segundo domínio de ligação compreende um anti-CD3 compreendendo qualquer um dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57, e qualquer um dos SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62. Em outras modalidades, a invenção fornece uma molécula de ligação biespecífica compreendendo i) um primeiro domínio de ligação e ii) um segundo domínio de ligação em que o segundo domínio de ligação compreende um Fab anti-CD3 compreendendo qualquer um dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57. Em outras modalidades, a invenção fornece uma molécula de ligação biespecífica compreendendo i) um primeiro domínio de ligação e ii) um segundo domínio de ligação em que o segundo domínio de ligação compreende um Fab anti-CD3 compreendendo qualquer um dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,
49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57 ; e qualquer um dos SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62. Em outras modalidades, a invenção fornece um construto de ligação específica de CD3 citotoxicamente ativo compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em um ou mais dos SEQ ID NOs: 1-62. Em outras modalidades, a invenção fornece um construto de ligação específica de CD3 citotoxicamente ativo compreendendo a sequência de aminoácidos estabelecida em dois dos SEQ ID NO: 1-62. Em outras modalidades, a invenção fornece um construto de ligação específica de CD3 citotoxicamente ativo compreendendo um anti-CD3 n compreendendo qualquer um dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57. Em outras modalidades, a invenção fornece um construto de ligação específica de Fab CD3 citotoxicamente ativo compreendendo um Fab anti-CD3 n compreendendo qualquer um dos SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62. Em outras modalidades, a invenção fornece um construto de ligação específica de CD3 citotoxicamente ativo compreendendo um anti- CD3 n compreendendo qualquer um dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57; e qualquer um dos SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62. Outra modalidade da invenção fornece anticorpo Fab anti-CD3, em que o anticorpo anti-CD3 compreende um domínio de ligação compreendendo (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1-6 e (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7-9.
[021] Outra modalidade da invenção fornece um anticorpo anti-CD3 em que o anticorpo compreende uma ou mais modificações pós-tradução. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3 em que o anticorpo está ligado a um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa. Outra modalidade da invenção fornece um anticorpo anti-CD3 em que a molécula biologicamente ativa é folato. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo anti-CD3 compreendendo um ou mais folatos. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo anti-CD3 compreendendo dois folatos. Outra modalidade da invenção fornece anticorpo anti-CD3 em que a molécula biologicamente ativa é DUPA. As modalidades da invenção fornecem anticorpo anti-CD3 compreendendo um ou mais DUPA. As modalidades da invenção fornecem anticorpo anti-CD3 compreendendo dois DUPA.
[022] Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de qualquer um dos SEQ. ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57; e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de qualquer um dos SEQ. ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62.
[023] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um anti-CD3 compreendendo qualquer um dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um anti-CD3 compreendendo qualquer um dos SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62.
[024] . Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti- CD3 compreendendo qualquer um dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42,
43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57; e qualquer um dos SEQ ID
NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62. Outra modalidade da invenção fornece uma variante anti-CD3 compreendendo uma cadeia pesada de SEQ ID NO: 1-5 e uma cadeia leve de SEQ ID NO: 7-9. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo SEQ ID NOs: 7 e 10, ou 7 e 14, ou 7 e 11, ou 7 e 15, ou 7 e 12, ou 7 e 16, ou 7 e 13, ou 7 e 17, ou 7 e 1, ou 7 e 18, ou 7 e 19,
ou 12 e 18, ou 12 e 19, ou 12 e 16. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo SEQ ID NOs: 7 e 10, ou 7 e 14, ou 7 e 11, ou 7 e 15, ou 7 e 12, ou 7 e 16, ou 7 e 13, ou 7 e 17, ou 7 e 1, ou 7 e 18, ou 7 e 19,
ou 12 e 18, ou 12 e 19, ou 12 e 16, cada um compreendendo pelo menos um aminoácido não natural.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti- CD3 compreendendo SEQ ID NOs: 7 e 10, ou 7 e 14, ou 7 e 11, ou 7 e 15, ou 7 e 12, ou
7 e 16, ou 7 e 13, ou 7 e 17, ou 7 e 1, ou 7 e 18 ou 7 e 19, ou 12 e 18, ou 12 e 19, ou 12 e 16, cada um compreendendo dois aminoácidos não naturais.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo SEQ
ID NO: 7 compreendendo pelo menos um aminoácido não natural; e um dos SEQ ID NOs:
10 ou 14 ou 11 ou 15 ou 12 ou 16 ou 13 ou 17 ou 1 ou 18 ou 19 compreendendo pelo menos um aminoácido não natural.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo SEQ ID NO:12 compreendendo pelo menos um aminoácido não natural; e um dos SEQ ID NOs: 18 ou 19 ou 16 compreendendo pelo menos um aminoácido não natural.
Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo SEQ ID NOs: 58 e 49,
ou 58 e 40, ou 59 e 50, ou 59 e 41, ou 59 e 42, ou 59 e 52, ou 59 e 43, ou 59 e 44, ou 59 e 45, ou 59 e 54 ou 59 e 55, ou 59 e 46, ou 9 e 44, ou 9 e 53, ou 60 e 44, ou 60 e 53, ou
60 e 42, ou 60 e 51, 60 e 50, ou 60 e 41, ou 61 e 45, ou 61 e 54, ou 62 e 56, ou 62 e 47,
ou 62 e 48, ou 62 e 57, ou 7 e 47, ou 7 e 56. Em algumas modalidades, o anticorpo anti- CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo dois aminoácidos não naturais, o anticorpo compreendendo SEQ ID NOs: 18 e 16, ou 18 e 59, ou 18 e 43.
[025] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti- CD3 compreendendo SEQ ID NOs: 1 e 7, ou 1 e 8, ou 1 e 9. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo SEQ ID NOs: 2 e 7, ou 2 e 8, ou 2 e 9. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo SEQ ID NOs: 3 e 7, ou 3 e 8, ou 3 e 9. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo SEQ ID NOs: 4 e 7 ou 4 e 8 ou 4 e 9. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo SEQ ID NOs: 5 e 7, ou 5 e 8, ou 5 e 9. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende um Fab anti-CD3 compreendendo SEQ ID NOs: 6 e 7, ou 6 e 8, ou 6 e 9. O anticorpo anti-CD3 pode ser um anticorpo biespecífico compreendendo i) um primeiro domínio de ligação e ii) um segundo domínio de ligação em que o segundo domínio de ligação compreende o referido Fab anti-CD3. Outras modalidades da invenção fornecem anticorpo Fab anti-CD3 selecionado a partir de SEQ. ID NOs.: 1 a 62 tendo um aminoácido não codificado naturalmente incorporado. Em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural é especificamente incorporado ao local do anticorpo.
[026] Em outras modalidades, a invenção fornece anticorpo Fab anti-CD3 em que o aminoácido codificado de forma não natural é selecionado a partir do grupo que consiste em: uma O-metil-L-tirosina, uma L-3- (2-naftil) alanina, uma 3 -metil-fenilalanina, uma O-4-alil-L-tirosina, uma 4-propil-L-tirosina, p -propargiloxi-L-fenilalanina, um tri-O- acetil-GlcNAc-serina, uma L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma isopropil-L- fenilalanina, uma p-azido-L-fenilalanina, uma p-acil-L-fenilalanina, uma p-benzoil-L-
fenilalanina, uma L-fosfoserina, uma fosfonoserina, uma fosfonotirosina, uma p -iodo- fenilalanina, uma p-bromofenilalanina, uma p-amino-L-fenilalanina ou uma isopropil-L- fenilalanina.
[027] Outra modalidade da invenção fornece anticorpo Fab anti-CD3 em que o aminoácido codificado de forma não natural é especificamente incorporado no local. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3 em que o aminoácido codificado de forma não natural é especificamente incorporado em qualquer uma das posições H114, H115, H129, L157, H160, L172 e L205 (de acordo com a numeração de Kabat, também saber para o artesão habilidoso). As modalidades da invenção fornecem anticorpo Fab anti-CD3, em que o aminoácido codificado de forma não natural é especificamente incorporado na posição H114, H115, H129, L157, H160, L172 e L205 de acordo com a numeração de Kabat. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3, em que o aminoácido codificado de forma não natural é um local especificamente incorporado na posição 114. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3 em que o aminoácido codificado de forma não natural é um local especificamente incorporado na posição 115. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3 em que o aminoácido codificado de forma não natural é um local especificamente incorporado na posição 129. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3 em que o aminoácido codificado de forma não natural é especificamente incorporado no local na posição 157. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3, em que o aminoácido codificado de forma não natural é um local especificamente incorporado na posição 160. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3, em que o aminoácido codificado de forma não natural é um local especificamente incorporado na posição 172. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3, em que o aminoácido codificado de forma não natural é um local especificamente incorporado na posição 205. Outra modalidade da invenção fornece anticorpo Fab anti-CD3 em que pelo menos um aminoácido codificado de forma não natural é incorporado. Outra modalidade da invenção fornece anticorpo Fab anti-CD3 em que dois aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados. Outras modalidades da invenção fornecem uma variante de Fab anti-CD3 compreendendo pelo menos um aminoácido codificado de forma não natural na cadeia pesada ou leve. Outras modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural na cadeia leve. Outras modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural na cadeia pesada. Outra modalidade da invenção fornece uma variante de Fab anti-CD3 compreendendo dois aminoácidos codificados de forma não natural.
[028] . Outra modalidade da invenção fornece uma variante do Fab anti-CD3 em que a cadeia pesada compreende adicionalmente uma extensão de aminoácido no terminal C. As modalidades da invenção fornecem uma variante do Fab anti-CD3 em que a extensão de aminoácido compreende os aminoácidos DKTHT. Outra modalidade da invenção fornece uma variante do Fab anti-CD3 compreendendo ainda uma extensão de aminoácido na cadeia pesada no terminal C. Outras modalidades da invenção fornecem uma variante de Fab anti-CD3 em que a extensão de aminoácido compreende os aminoácidos DKTHT.
[029] Outra modalidade da invenção fornece anticorpo Fab anti-CD3 em que a sequência da cadeia pesada compreende resíduos de arcabouço de camundongo em uma ou mais posições para ligação de antígeno. Outras modalidades da invenção fornecem anticorpo Fab anti-CD3 em que a sequência da cadeia pesada compreende resíduos de arcabouço de camundongo nas posições 30, 49, 77 ou 93 (de acordo com a numeração de Kabat). Outra modalidade da invenção fornece anticorpo Fab anti-CD3 em que a sequência de cadeia leve compreende resíduos de arcabouço de camundongo em uma ou mais posições. Outra modalidade da invenção fornece anticorpo Fab anti-CD3 em que a sequência da cadeia leve compreende resíduos de arcabouço nas posições 36, 46, 49, 57 ou 58 (de acordo com a numeração de Kabat).
[030] Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo Fab anti-CD3 inclui um ligante. Em outra modalidade, a invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 em que o ligante é um polímero solúvel em água. Outra modalidade da invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 em que o polímero solúvel em água compreende poli (etilenoglicol). Outras modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3 em que o polímero solúvel em água é linear ou ramificado. Outra modalidade da invenção fornece anticorpo Fab anti-CD3 em que o polímero solúvel em água está ligado a um aminoácido codificado de forma não natural presente no anticorpo. Em algumas modalidades, o ligante é anexado ao anticorpo Fab anti-CD3 por meio da cadeia lateral do aminoácido não natural. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti- CD3 compreendendo pelo menos dois aminoácidos ligados a um polímero solúvel em água compreendendo um poli (etilenoglicol). Outra modalidade da invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 em que pelo menos um aminoácido ligado ao referido polímero solúvel em água é um aminoácido codificado de forma não natural. Outra modalidade da invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 compreendendo um ou mais poli (etilenoglicol). Outra modalidade da invenção fornece anticorpo Fab anti-CD3 em que o poli (etilenoglicol) está entre 1 kDa e 100 kDa. Outra modalidade da invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 compreendendo um ou mais folatos e um ou mais poli (etilenoglicol). Outra modalidade da invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 compreendendo dois folato e dois poli (etilenoglicol).
[031] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para otimizar a morte celular em uma célula que expressa números elevados de receptor de folato compreendendo um anticorpo Fab anti-CD3 em que o anticorpo compreende um ou mais folatos; e em que um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados no anticorpo. Em outra modalidade, a invenção fornece um método para otimizar a morte celular tumorais que expressam números elevados de receptores de folato pelas células T redirecionadas compreendendo um anticorpo Fab anti-CD3 em que o anticorpo compreende um ou mais folatos; e em que um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados no anticorpo. Em outra modalidade, o método compreende adicionalmente um ou mais de um polímero solúvel em água. Outra modalidade da invenção fornece o método em que o polímero solúvel em água compreende poli (etilenoglicol). Em outra, é fornecido um método em que o polímero solúvel em água é linear ou ramificado. O poli (etilenoglicol) está entre 1 kDa e 100 kDa.
O poli (etilenoglicol) tem 5, 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 kDa. Em outra modalidade, o número de receptor de folato é igual ou superior a 10.000.
[032] Outra modalidade da invenção fornece um método para reduzir a citotoxicidade em uma célula. Outra modalidade da invenção fornece um método para reduzir a citotoxicidade em uma célula otimizando ou reduzindo a afinidade do anticorpo anti-CD3 para o seu alvo para o recrutamento de células T. Outra modalidade da invenção fornece um método para aumentar a citotoxicidade das células tumorais por meio da conjugação de mais de um folato para se ligar preferencialmente às células tumorais antes da ligação das células T. Outra modalidade da invenção fornece um método para melhorar a meia-vida sérica de um anticorpo Fab anti-CD3. Outra modalidade da invenção fornece um método para melhorar a meia-vida sérica de um anticorpo Fab anti-CD3 conjugando o Fab a uma molécula de extensão farmacocinética
(PK) incluindo, mas não se limitando a HSA, cadeias acil C12-C16, XTEN ou polímeros solúveis em água como PEG. Outra modalidade fornece um método para recrutar células T citotóxicas para células tumorais FR +. Outra modalidade fornece um método para melhorar a eficácia, reduzir a toxicidade, melhorar as propriedades de PK, melhorar a afinidade, melhorar a ligação TAA, melhorar T1/2 in vivo, melhorar a atividade in vitro, melhorar a meia-vida sérica e/ou melhorar a atividade in vivo. Outra modalidade fornece um método para melhorar a eficácia. Outra modalidade fornece um método para reduzir a toxicidade. Outra modalidade fornece um método para melhorar as propriedades de PK. Outra modalidade fornece um método para melhorar a afinidade. Outra modalidade fornece um método para melhorar a ligação TAA. Outra modalidade fornece um método para melhorar T1/2 in-vivo. Outra modalidade fornece um método para melhorar a atividade in vitro. Outra modalidade fornece um método para melhorar a atividade in vivo.
[033] Outra modalidade da invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 em que a sequência da cadeia pesada ou da cadeia leve compreende mutações da linhagem germinativa humana em uma ou mais posições. As modalidades da invenção fornecem um anticorpo Fab anti-CD3 em que a mutação da linhagem germinativa humana da sequência da cadeia pesada está nas posições 35 ou 52 (de acordo com a numeração de Kabat). Outra modalidade da invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 em que a mutação da linhagem germinativa humana da sequência da cadeia leve está na posição 53 (de acordo com a numeração de Kabat).
[034] Outra modalidade da invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 compreendendo um ligante de folato PEG tendo o arcabouço de acordo com o composto 29A, 29B, 29C, 29D, 29E, 30A, 30B, 30C, 30D e 30E.
[035] Em outra modalidade, é fornecido um método para tratar um paciente com uma doença ou afecção em uma célula que expressa um número elevado de receptor de folato, compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo Fab anti-CD3 revelado no presente documento.
Em outra modalidade da invenção, é fornecido um Fab anti-CD3 biespecífico compreendendo dois folato e duas moléculas PEGuiladas.
Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD3
Fab biespecífico compreendendo ainda um local de aminoácido codificado de forma não natural especificamente incorporado.
A invenção fornece um método de tratamento do câncer pela administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD3 da invenção.
Em algumas modalidades, o câncer é câncer de ovário.
Em algumas modalidades, o câncer de ovário é um tumor eptitelial, estromal e de células germinativas.
Em algumas modalidades, o câncer de ovário compreende câncer de trompa de Falópio e carcinoma peritoneal primário.
Em algumas modalidades, o câncer é caracterizado pela alta expressão do receptor alfa de folato (FOLR1), como câncer de ovário.
Em algumas modalidades, o câncer é tratado pelo recrutamento de células T citotóxicas para células tumorais positivas para receptor de folato (FR +). A invenção fornece um método para tratar um doenças hereditárias pela administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD3 da invenção.
A invenção fornece um método para tratar um AIDS pela administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD3 da invenção.
A invenção fornece um método para tratar um diabetes pela administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD3 da invenção.
O referido anticorpo anti-CD3 da invenção pode ser um anticorpo biespecífico compreendendo um anticorpo Fab anti-CD3, opcionalmente em que o anticorpo Fab anti-
CD3 é conjugado a dois folato e duas moléculas PEGuiladas.
Em uma outra modalidade, um aminoácido codificado de forma não natural é especificamente incorporado ao referido anticorpo Fab anti-CD3 e a conjugação às duas moléculas de folato e duas moléculas PEGuiladas é através da cadeia lateral do aminoácido não natural.
[036] Os anticorpos anti-CD3 da invenção são para uso no tratamento de uma doença ou afecção em uma célula que expressa um número elevado de receptor de folato. Os anticorpos anti-CD3 da invenção são para uso no tratamento do câncer. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de ovário. Em algumas modalidades, o câncer de ovário é um tumor de células eptiteliais, estromais e germinativas. Em algumas modalidades, o câncer de ovário compreende câncer de trompa de Falópio e carcinoma peritoneal primário. Em algumas modalidades, o câncer é caracterizado pela alta expressão do receptor alfa de folato (FOLR1), como câncer de ovário. Em algumas modalidades, o câncer é tratado pelo recrutamento de células T citotóxicas para células tumorais positivas para receptor de folato (FR +). Os anticorpos anti-CD3 da invenção são para uso no tratamento de doenças hereditárias. Os anticorpos anti-CD3 da invenção são para uso no tratamento da AIDS. Os anticorpos anti-CD3 da invenção são para uso no tratamento de diabetes. O referido anticorpo anti-CD3 da invenção pode ser um anticorpo biespecífico compreendendo um anticorpo Fab anti-CD3, opcionalmente em que o anticorpo Fab anti-CD3 é conjugado a dois folato e duas moléculas PEGuiladas.
Em uma outra modalidade, um aminoácido codificado de forma não natural é especificamente incorporado ao referido anticorpo Fab anti-CD3 e a conjugação às duas moléculas de folato e duas moléculas PEGuiladas é através da cadeia lateral do aminoácido não natural. Os anticorpos anti-CD3 da invenção podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou afecção em uma célula que expressa um número elevado de receptor de folato. Os anticorpos anti-CD3 da invenção podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer. Em algumas modalidades, o câncer é câncer de ovário. Em algumas modalidades, o câncer de ovário é um tumor de células eptiteliais, estromais e germinativas. Em algumas modalidades, o câncer de ovário compreende câncer de trompa de Falópio e carcinoma peritoneal primário. Em algumas modalidades, o câncer é caracterizado pela alta expressão do receptor alfa de folato (FOLR1), como câncer de ovário. Em algumas modalidades, o câncer é tratado pelo recrutamento de células T citotóxicas para células tumorais positivas para receptor de folato (FR +). Os anticorpos anti-CD3 da invenção podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças hereditárias. Os anticorpos anti-CD3 da invenção podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento da AIDS. Os anticorpos anti- CD3 da invenção podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento de diabetes. O referido anticorpo anti-CD3 da invenção pode ser um anticorpo biespecífico compreendendo um anticorpo Fab anti-CD3, opcionalmente em que o anticorpo Fab anti-CD3 é conjugado a dois folato e duas moléculas PEGuiladas. Em uma outra modalidade, um aminoácido codificado de forma não natural é especificamente incorporado ao referido anticorpo Fab anti-CD3 e a conjugação às duas moléculas de folato e duas moléculas PEGuiladas é através da cadeia lateral do aminoácido não natural.
[037] A revelação da invenção fornece um anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo ou variante possuindo um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente incorporados no anticorpo ou fragmento ou variante. O anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo ou variante pode incluir, mas não está limitado a Fv, Fc, Fab e (Fab ') 2, Fv de cadeia única (scFv), diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos híbridos bifuncionais, CDR1, CDR2, CDR3, combinações de CDRs, regiões variáveis, regiões estruturais, regiões constantes, cadeias pesadas, cadeias leves, moléculas de não anticorpos de arcabouço alternativo, anticorpos biespecíficos e semelhantes. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo ou variante é um anticorpo Fab anti-CD3, fragmento ou variante.
[038] A revelação da invenção fornece conjugados de anticorpos biespecíficos compreendendo anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo. A presente invenção divulga aqui conjugados de anticorpos biespecíficos compreendendo anticorpo Fab anti- CD3 ou fragmento de anticorpo tendo um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente incorporados. Ainda são revelados aqui conjugados de anticorpos biespecíficos compreendendo anticorpo Fab anti-CD3 ou fragmento de anticorpo e uma ou mais moléculas de Folato, em que um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são especificamente incorporados ao local no anticorpo Fab anti-CD3 São revelados aqui conjugados de anticorpos biespecíficos compreendendo anticorpo Fab anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, uma ou mais moléculas de Folato e uma ou mais moléculas de PEG, em que um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são especificamente incorporados ao Fab anti-CD3 anticorpo. É revelado aqui um anticorpo biespecífico anti-CD3 Fab compreendendo: um anticorpo ou fragmento de anticorpo; uma ou mais moléculas pequenas; e um ou mais ligantes, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo está ligado a uma ou mais moléculas pequenas por um ou mais ligantes e em que as moléculas pequenas são um ou mais Folatos ou uma ou mais moléculas de DUPA ou análogo ou derivado. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser especificamente ligado a um ou mais folatos ou uma ou mais moléculas de DUPA por um ou mais ligantes. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender um ou mais aminoácidos não naturais. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser ligado a um ou mais folatos ou uma ou mais moléculas de DUPA por um ou mais ligantes a um ou mais aminoácidos não naturais. O aminoácido não natural pode ser incorporado especificamente no local do anticorpo. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser ligado a uma ou mais moléculas de Folato ou DUPA por uma ou mais moléculas de PEG a um ou mais aminoácidos não naturais. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode, alternativamente, ser ligado a um ou mais folatos ou uma ou mais moléculas de DUPA por um ou mais ligantes a um aminoácido natural. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser um Fab anti-CD3.
[039] São revelados aqui conjugados de anticorpos biespecíficos compreendendo: um Fab anti-CD3; uma ou mais moléculas de folato; e um ou mais ligantes, em que o Fab anti-CD3 está ligado a uma ou mais moléculas de Folato por um ou mais ligantes. O Fab anti-CD3 pode compreender um ou mais aminoácidos não naturais. O um ou mais aminoácidos não naturais podem substituir um aminoácido natural do Fab anti-CD3. São revelados aqui conjugados de anticorpos biespecíficos compreendendo: um Fab anti-CD3; uma ou mais moléculas DUPA; e um ou mais ligantes, em que o Fab anti-CD3 está ligado a uma ou mais moléculas de DUPA por um ou mais ligantes. O Fab anti-CD3 pode compreender um ou mais aminoácidos não naturais. O um ou mais aminoácidos não naturais podem substituir um aminoácido natural do Fab anti-CD3.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[040] As novas características da invenção são apresentadas com particularidade nas reivindicações anexas. Uma melhor compreensão das características e vantagens da divulgação da presente invenção será obtida a título de referência à seguinte descrição detalhada que estabelece modalidades ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados e os desenhos anexos fornecidos.
[041] A Figura 1 representa a ligação de Fab anti-CD3 humanizado a PBMC humano. A ligação de Fabs anti-CD3 humanizados expressos em células HEK293 a PBMC humana (2 experiências) é mostrada. Um total de 9 Fabs foram testados combinando 3 sequências de cadeia vH e 3 vL. 3 Fabs contendo ligação perdida de cadeia vL1.0 para CD3 humano com quaisquer combinações de cadeia vH.
[042] As Figuras 2A-2F representam a titulação de Fab anti-CD3 humanizado que se liga a PBMCs humanos e cyno. (Figura 2A), titulação Fab1 ; (Figura 2B), titulação de Fab 2 ; (Figura 2C), titulação de Fab 3 ; (Figura 2D), titulação Fab 4; (Figura 2E), titulação de Fab 5 ; e (Figura 2F), titulação de Fab 6.
[043] A Figura 3 representa a análise farmacocinética (PK) de rato de moléculas Fab1 anti-CD3. A PEGilação de moléculas Fab1 anti-CD3 humanizadas estende a meia- vida plasmática (T1/2) em ratos.
[044] As Figuras 4A-4B representam a ligação de Fabs de baixa afinidade Rodada 1 a partir de células HEK293. As variantes de Fab anti-CD3 rodada 1 produzidas a partir de células HEK293 com afinidades de ligação reduzidas para CD3 humano (Figura 4A) e cyno (Figura 4B) CD3 são mostradas. De 35 novas variantes de Fab testadas na triagem da Rodada 1, as curvas de titulação para 4 Fabs de afinidade reduzida selecionados (Fabs 7 a 10) são mostradas junto com Fab1 de controle.
[045] As Figuras 5A-5B representam a indução de Fabs de baixa afinidade da Rodada 2 de células HEK293 para CD3 humano. Variantes Fab anti-CD3 rodada 2 produzidas a partir de células HEK293 com afinidades de ligação reduzidas para CD3 humano (Figura 5A) e cyno (Figura 5B) CD3 são mostradas. De 43 novas variantes de Fab testadas na triagem da Rodada 2, as curvas de titulação para 4 Fabs de afinidade reduzida selecionados são mostradas junto com o controle parental Fab1.
[046] As Figuras 6A-6B representam a ligação de variantes de Fab-Folato de baixa afinidade de células de E. coli a CD3 humano. Figura 6A mostra a ligação da Rodada 1 e da Figura 6B mostra a ligação de variantes de baixa afinidade da Rodada 2 de moléculas de Fab-HK129-Folato anti-CD3 purificadas de células de E. coli a CD3 humano. Fab1-HK129-Folato, controle parental, está incluído como um controle positivo.
[047] As Figuras 7A-7B representam variantes de baixa afinidade de ligação de Fab-Folato anti-CD3 a CD3 cyno. Figura 7A mostra a ligação da Rodada 1 e da Figura 7B mostra a ligação de variantes de baixa afinidade da Rodada 2 de moléculas anti-CD3 Fab-HK129-Folato purificadas a partir de células de E. coli para cyno CD3. Fab1 -HK129- Folato, controle parental, está incluído como um controle positivo.
[048] Figura 8 representa a citotoxicidade para células SKOV-3 com PBMC humano. Citotoxicidade in vitro de 4 variantes de baixa afinidade de moléculas de Fab- HK129-Folato anti-CD3 humanizadas produzidas a partir de células de E. coli com PBMC humano. Fab1 -HK129-Folato, controle parental, está incluído como um controle positivo.
[049] Figura 9 representa a citotoxicidade para células SKOV-3 com cyno PBMC.
Citotoxicidade in vitro de 4 variantes de baixa afinidade de moléculas de Fab-HK129- Folato anti-CD3 humanizadas produzidas a partir de células de E. coli com PBMC cyno.
Fab1 -HK129-Folato, controle parental, está incluído como um controle positivo.
[050] As Figuras 10A-10B representam a ativação de células T. Figura 10A mostra a ativação de marcadores de células T CD25 e CD69 sem células SKOV-3 por várias moléculas de Fab-HK129-Folato anti-CD3 de baixa afinidade. Figura 10 (B) mostra a ativação de marcadores de células T CD25 e CD69 com células SKOV-3 por várias moléculas de Fab-HK129-Folato anti-CD3 de baixa afinidade.
[051] As Figuras 11A-11D representam a liberação de citocinas in vitro com IFNgama (Figuras 11A e 11B) e TNFα (Figuras 11C e 11D) de várias variantes de Fab- HK129-Folato anti-CD3 de baixa afinidade na ausência (Figuras 11A e 11C) ou na presença (Figuras 11B e 11D) de células tumorais SKOV-3.
[052] As Figuras 12A-12F representam ilustrações de conjugados biespecíficos de Fab-Folato anti-CD3 e ligante PEG da invenção. Figura 12A é um exemplo representativo de ligantes de Folato-PEG; Figura 12B é um exemplo representativo de ligantes PEG Ramificados em Folato; Figuras 12C-12D são ilustrações representativas dos biespecíficos CD3-Folato com conjugados de PEG; Figura 12E é uma ilustração representativa de CD3-Folato biespecífico com PEGuilação C-terminal; e Figura 12F é uma ilustração representativa de CD3-Folato biespecífico com PEGilação C-terminal por reticulação CD3-Fab.
[053] As Figuras 13A-13D representam conjugados CD3 Fab-Folato na presença e ausência de PEGilação. 13A e 13B mostram a análise de eletroforese em gel de SDS- PAGE de composições de Fab anti-CD3 de conjugado simples e duplo; Figura 13C mostra a análise de eletroforese em gel SDS-PAGE de conjugados de PEG anti-CD3 Fab-Folato C-terminal ; Figura 13D mostra a citotoxicidade in vitro de conjugados de PEG C-terminal de Fab-Folato anti-CD3 em células KB, OV-90 e SKOV-3.
[054] Figura 14 representa citotoxicidade in vitro e mostra que os anticorpos biespecíficos anti-CD3 Fab-Folato matam seletivamente células KB que expressam FOLRα.
[055] As Figuras 15A-15B representam citotoxicidade in vitro. Figura 15A mostra que os anticorpos biespecíficos de Fab-Folato anti-CD3 matam seletivamente células SKOV3 que expressam FOLRα na presença de ácido fólico a 20 nM e a Figura 15B mostra morte seletiva em ácido fólico a 50 nM.
[056] As Figuras 16A-16B representam dados de citotoxicidade in vitro e mostram que os anticorpos biespecíficos de Fab-Folato anti-CD3 matam seletivamente FOLRα que expressam células SKOV3 na presença de 20 nM (Figura 16A) ou 50 nM (Figura 16B) 5-mTHF.
[057] Figura 17 descreve o estudo farmacocinético de camundongo em camundongos CD1.
[058] As Figuras 18A-18B representam anticorpos biespecíficos anti-CD3 Fab-
Folato matam seletivamente macrófagos M2 humanos. Figura 18A mostra citotoxicidade de macrófagos in vitro por folato único contendo anticorpos biespecíficos anti-Fab-Folato anti-CD3. A seta e o número denotam diferenças de IC 50 vezes entre macrófagos M1 e M2.
As linhas pontilhadas indicam Fab1-HK129-Folato em M1 e M2 e as linhas sólidas indicam Fab1-HK129-5KPEG-Folato em M1 e M2. A Figura 18B mostra a citotoxicidade de macrófagos in vitro por folato duplo contendo anticorpos biespecíficos anti-CD3 Fab- Folato. A seta e o número denotam diferenças de IC 50 vezes entre macrófagos M1 e M2. As linhas pontilhadas indicam Fab1-HK129-LL157-BiFolato em M1 e M2 e as linhas sólidas indicam Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG em M1 e M2.
[059] As Figuras 19A-19B representam a eficácia antitumoral de anticorpos biespecíficos anti-CD3-Folato, Figura 19A mostra o volume do tumor e a Figura 19B mostra a massa/peso corporal; expressão de CD45 humano e indução de TILs são mostradas nas Figuras 19C e 19D, respectivamente.
[060] As Figuras 20A-20B representam a eficácia antitumoral de anticorpos biespecíficos anti-CD3-Folato, Figura 20A mostra o volume do tumor e a Figura 20B mostra 0 massa/peso corporal; expressão de CD45 humano e indução de TILs são mostradas nas Figuras 20C e 20D, respectivamente.
[061] As Figuras 21A-21F representam a eficácia antitumoral por administração de dose múltipla de anticorpos biespecíficos CD3-Folato em tumores cervicais humanos derivados da linha celular KB (Figura 21A mostra o crescimento do tumor, Figura 21B mostra o peso corporal) e a expressão de células T marcadores de ativação CD25 (Figura 21C), CD69 (Figura 21D), CD45 (Figura 21E) e CD3 (Figura 21F).
[062] As Figuras 22A-22B representam a eficácia antitumoral de anticorpos biespecíficos CD3-Folato em tumores cervicais humanos derivados da linha celular KB; Figura 22A mostra o crescimento do tumor e a Figura 22B mostra o peso corporal.
[063] As Figuras 23A-23B representam a eficácia antitumoral de anticorpos biespecíficos CD3-Folato em comparação com carboplatina em tumores ovarianos humanos derivados da linha celular OV-90; Figura 23A mostra o crescimento do tumor e a Figura 23B mostra o peso corporal.
DEFINIÇÕES
[064] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos, linhas celulares, construtos e reagentes específicos descritos no presente documento e, como tal, podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada no presente documento tem o propósito de descrever modalidades particulares apenas e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que será limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[065] Conforme usado no presente documento e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referência no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a um "Fab anti- CD3" ou "anticorpo anti-CD3 Fab-Folato" é uma referência a uma ou mais dessas proteínas e inclui seus equivalentes conhecidos pelos versados na técnica e assim por diante. Os termos "PEG-Folato" ou "Folato-PEG" e os termos "BiPEG-BiFolato" ou "BiFolato-BiPEG" são usados indistintamente no presente documento.
[066] A menos que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferenciais são agora descritos.
[067] Todas as publicações e patentes aqui mencionadas são aqui incorporadas a título de referência com o propósito de descrever e divulgar, por exemplo, as construções e metodologias que são descritas nas publicações, que podem ser usadas em conexão com a invenção presentemente descrita. As publicações aqui discutidas são fornecidas apenas para sua revelação antes da data de depósito do presente pedido.
Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não têm o direito de antecipar tal revelação em virtude de invenção anterior ou por qualquer outro motivo.
[068] O termo "substancialmente purificado" refere-se ao anticorpo Fab anti-CD3 que pode ser substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com a proteína como encontrada em seu ambiente de ocorrência natural, ou seja, uma célula nativa ou célula hospedeira no caso de anticorpo anti-CD3 produzido de forma recombinante. O anticorpo anti-CD3 que pode estar substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteína com menos de cerca de 30%, menos de cerca de 25%, menos de cerca de 20%, menos de cerca de 15%, menos de cerca de 10%, menos de cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% de proteína contaminante. Quando o anticorpo anti-CD3 ou variante do mesmo é produzido de forma recombinante pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente em cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2% ou cerca de 1% ou menos do peso seco das células. Quando o anticorpo anti-CD3 ou sua variante é produzida de forma recombinante pelas células hospedeiras, a proteína pode estar presente no periplasma e/ou meio de cultura em cerca de 5 g/l, cerca de 4 g/l, cerca de 3 g/l, cerca de 2 g/l, cerca de 1 g/l, cerca de 750 mg/l, cerca de 500 mg/l, cerca de 250 mg/l, cerca de 100 mg/l, cerca de 50 mg/l, cerca de 10 mg/l, ou cerca de 1 mg/l ou menos do peso seco das células. Assim, o anticorpo anti-CD3 "substancialmente purificado" conforme produzido pelos métodos da presente invenção pode ter um nível de pureza de pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, a pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, especificamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 75%, 80%, 85% e mais especificamente, um nível de pureza de pelo menos cerca de 90%, um nível de pureza de pelo menos cerca de 95%, um nível de pureza de pelo menos cerca de 99% ou mais, conforme determinado por métodos apropriados, tais como análise SDS/PAGE, RP-HPLC, SEC, e eletroforese capilar.
[069] Uma "célula hospedeira recombinante" ou "célula hospedeira" refere-se a uma célula que inclui um polinucleotídeo exógeno, independentemente do método usado para inserção, por exemplo, absorção direta, transformação, transdução, correspondência-f ou outros métodos conhecidos na técnica para criar células hospedeiras recombinantes. O polinucleotídeo exógeno pode ser mantido como um vetor não integrado, por exemplo, um plasmídeo ou, alternativamente, pode ser integrado no genoma do hospedeiro.
[070] Os anticorpos são proteínas que exibem especificidade de ligação a um antígeno específico. Os anticorpos nativos são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada possui em uma extremidade um domínio variável (VH ) seguido por uma série de domínios constantes. Cada cadeia leve possui um domínio variável em uma extremidade (VL ) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácidos particulares formem uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e pesada.
[071] O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente na sequência entre os anticorpos e são responsáveis pela especificidade de ligação de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída pelos domínios variáveis de anticorpos. Está concentrado em três segmentos denominados Regiões Determinantes de Complementaridade (CDRs), tanto nos domínios variáveis da cadeia leve como da cadeia pesada. As porções mais conservadas dos domínios variáveis são chamadas de regiões estruturais (FR). Os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem, cada um, quatro regiões FR, adotando amplamente um - configuração de folha, conectada por três CDRs, que formam laços conectando e, em alguns casos, fazendo parte da estrutura folha-. Os CDRs em cada cadeia são mantidos juntos em estreita proximidade pelas regiões FR e, com os CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação de antígeno de anticorpos (consulte Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. 1991)).
[072] Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante de suas cadeias pesadas, os anticorpos ou imunoglobulinas podem ser atribuídos a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e vários deles podem ser divididos em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG como IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; IgA como IgA1 e IgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas de α,,, γ e, respectivamente. As regiões constantes da cadeia leve que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas de  e , respectivamente. Das várias classes de imunoglobulinas humanas, apenas IgG1, IgG2, IgG3 e IgM humanos são conhecidos por ativar o complemento. A imunoglobulina pode ser selecionada a partir de uma IgG, IgA, IgD, IgE, IgM ou um fragmento ou uma modificação do mesmo.
[073] In vivo, a maturação de afinidade de anticorpos é conduzida pela seleção de antígeno de variantes de anticorpos de maior afinidade que são feitas principalmente por hipermutagênese somática. Uma "mudança de repertório" também ocorre frequentemente, na qual os genes da linhagem germinativa predominante da resposta secundária ou terciária são vistos como diferindo daqueles da resposta primária ou secundária.
[074] O processo de maturação de afinidade do sistema imunológico pode ser replicado pela introdução de mutações em genes de anticorpos in vitro e usando seleção de afinidade para isolar mutantes com afinidade melhorada. Esses anticorpos mutantes podem ser exibidos na superfície de bacteriófagos filamentosos ou microrganismos, como E. coli, levedura e anticorpos, podem ser selecionados por sua afinidade para o antígeno ou por sua cinética de dissociação (taxa de desaceleração) do antígeno. Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992). A mutagênese de caminhada de CDR foi empregada para afinidade de anticorpos humanos maduros que se ligam à glicoproteína de envelope humano gp120 do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1) (Barbas III et al. PNAS (EUA) 91: 3809-3813 (1994); e Yang et al. J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)); e um fragmento Fv de cadeia única anti-c-erbB-2 (Schier et al. J. Mol. Biol.
263:551567 (1996)). O embaralhamento da cadeia de anticorpos e a mutagênese de CDR foram usados para amadurecer por afinidade um anticorpo humano de alta afinidade direcionado contra a terceira alça hipervariável de HIV (Thompson et al. J. Mol.
Biol. 256:77-88 (1996)). Balint e Larrick Gene 137:109-118 (1993) descrevem uma mutagênese de varredura dirigida por oligodeoxirribonucleotídeo assistida por computador em que todos os CDRs de um gene de região variável são simultaneamente e completamente pesquisados para variantes melhoradas. Um αv O anticorpo humanizado específico de 3 foi amadurecido por afinidade usando uma estratégia de mutagênese limitada inicial em que cada posição de todos os seis CDRs foi mutada seguida pela expressão e triagem de uma biblioteca combinatória incluindo os mutantes de maior afinidade (Wu et al. PNAS (EUA) 95: 6037-6-42 (1998)). Os anticorpos apresentados por fago são revistos em Chiswell e McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992); e Rader e Barbas III Opinião Atual em Biotech. 8:503-508 (1997). Em cada caso em que anticorpos mutantes com afinidade melhorada em comparação com um anticorpo parental são relatados nas referências acima, o anticorpo mutante tem substituições de aminoácidos em um CDR.
[075] Por "maturação de afinidade" aqui entende-se o processo de aumentar a afinidade de um anticorpo para o seu antígeno. Métodos para maturação de afinidade incluem, mas não estão limitados a métodos de triagem computacional e métodos experimentais.
[076] Por "anticorpo" aqui entende-se uma proteína que consiste em um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por todos ou parte dos genes do anticorpo.
Os genes de imunoglobulina incluem, mas não estão limitados a, os genes da região constante kappa, lambda, alfa, gama (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), delta, épsilon e mu, bem como a miríade de genes da região variável de imunoglobulina. Anticorpo aqui pretende incluir anticorpos de comprimento total e fragmentos de anticorpos e incluir anticorpos que existem naturalmente em qualquer organismo ou são modificados (por exemplo, são variantes). O anticorpo aqui revelado pode ser humano, humanizado, projetado, não humano e/ou anticorpo quimérico. Anticorpos humanizados e métodos de preparação bem conhecidos na técnica. (Ver, por exemplo, US Pat. Nº: 5.821.337; 7.527.791;
6.982.321; 7.087.409; 5,766,886)._ Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis em que CDRs ou porções dos mesmos são derivados de um anticorpo não humano, e as regiões estruturais ou porções do mesmo são derivados de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado pode compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas modalidades, os resíduos de arcabouço em um anticorpo humanizado podem ser substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano - o anticorpo a partir do qual os resíduos de CDR são derivados - para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo, por exemplo. Os anticorpos quiméricos podem referir-se a anticorpos gerados através da combinação ou união de dois ou mais genes de anticorpos originalmente codificados para anticorpos separados. Por exemplo, os anticorpos quiméricos podem ser gerados através da combinação ou união de dois ou mais genes de anticorpos (ou fragmentos dos mesmos), de espécies humanas, bovinas ou murinas. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção do anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser de um humano. ou macaco cynomolgus, mas não está limitado a tal. Em certas modalidades, os anticorpos aqui revelados podem ser reativos entre espécies, por exemplo, um anticorpo pode reconhecer um antígeno humano e um antígeno de macaco cynomogolus (por exemplo, um anticorpo humano/cyno).
[077] Por "fragmento de anticorpo" entende-se qualquer forma de um anticorpo diferente da forma de comprimento total. Os fragmentos de anticorpos aqui incluem anticorpos que são componentes menores que existem em anticorpos de comprimento total e anticorpos que foram projetados. Os fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a Fv, Fc, Fab e (Fab ') 2, Fv de cadeia única (scFv), diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos híbridos bifuncionais, CDR1, CDR2, CDR3, combinações de CDRs, regiões variáveis, regiões estruturais, regiões constantes, cadeias pesadas, cadeias leves, moléculas de não anticorpos de arcabouço alternativa, anticorpos biespecíficos e semelhantes (Maynard & Georgiou, 2000, Annu. Rev. Biomed. Eng.
2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opin. Biotechnol. 9:395-402). A menos que especificamente indicado de outra forma, as declarações e reivindicações que usam o termo "anticorpo" ou "anticorpos" podem incluir especificamente "fragmento de anticorpo" e "fragmentos de anticorpo". Em certas modalidades, o 'anticorpo anti-CD3', 'Fab anti- CD3', 'anticorpo Fab anti-CD3' e 'variante Fab anti-CD3' são fragmentos de anticorpo como aqui definidos.
[078] Por "método de triagem computacional" aqui se entende qualquer método para projetar uma ou mais mutações em uma proteína, em que o referido método utiliza um computador para avaliar as energias das interações de substituições de cadeia lateral de aminoácidos potenciais entre si e/ou com o resto da proteína.
[079] Por "anticorpo de comprimento total" aqui entende-se o arcabouço que constitui a forma biológica natural de uma cadeia H e/ou L. Na maioria dos mamíferos, incluindo humanos e camundongos, esta forma é um tetrâmero e consiste em dois pares idênticos de duas cadeias de imunoglobulina, cada par tendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, cada cadeia leve compreendendo os domínios de imunoglobulina VL e CL, e cada par pesado cadeia compreendendo domínios de imunoglobulina VH, Cγ1, Cγ2 e Cγ3. Em cada par, as regiões variáveis da cadeia leve e pesada (VL e VH ) são juntas responsáveis pela ligação a um antígeno, e as regiões constantes (CL, Cγ1, Cγ2 e Cγ3,
particularmente Cγ2 e Cγ3) são responsáveis para funções efetoras de anticorpos. Em alguns mamíferos, por exemplo, em camelos e lamas, os anticorpos de comprimento total podem consistir em apenas duas cadeias pesadas, cada cadeia pesada compreendendo os domínios de imunoglobulina VH, Cγ2 e Cγ3.
[080] Por "imunoglobulina (Ig)" aqui entende-se uma proteína que consiste em um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. As imunoglobulinas incluem, mas não estão limitadas a anticorpos. As imunoglobulinas podem ter uma série de formas estruturais, incluindo, mas não se limitando a anticorpos de comprimento total, fragmentos de anticorpos e domínios de imunoglobulinas individuais, incluindo, mas não se limitando a, VH, Cγ1, Cγ2, Cγ3, VL e CL.
[081] Por "domínio de imunoglobulina (Ig)" aqui, entende-se um domínio de proteína consistindo de um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina. Os domínios de Ig incluem, mas não estão limitados a, VH, Cγ1, Cγ2, Cγ3, VL e CL.
[082] Por "sequência de proteína variante", tal como aqui utilizado, entende-se uma sequência de proteína que tem um ou mais resíduos que diferem na identidade de aminoácidos de outra sequência de proteína semelhante. A referida sequência de proteína semelhante pode ser a sequência de proteína natural de tipo selvagem ou outra variante da sequência de tipo selvagem. Em geral, uma sequência inicial é referida como uma sequência "progenitora" e pode ser um tipo selvagem ou uma sequência variante. Por exemplo, as modalidades preferidas da presente invenção podem utilizar sequências parentais humanizadas nas quais análises computacionais são feitas para fazer variantes.
[083] Por "região variável" de um anticorpo aqui se entende um polipeptídeo ou polipeptídeos compostos pelo domínio de imunoglobulina VH, os domínios de imunoglobulina VL ou os domínios de imunoglobulina VH e VL incluindo variantes. A região variável pode referir- se a tais polipeptídeos isoladamente, como um fragmento Fv, como um fragmento scFv, como esta região no contexto de um fragmento de anticorpo maior, ou como esta região no contexto de um anticorpo de comprimento total ou uma alternativa, não -molécula de andaime de anticorpo.
[084] Com relação ao anticorpo Fab anti-CD3 da invenção, o termo "antigenicamente específico" ou "se liga especificamente" refere-se ao anticorpo anti- CD3 que se liga a um ou mais epítopos de um antígeno ou parceiro de ligação de interesse, mas que não substancialmente reconhecer e ligar outras moléculas em uma amostra contendo uma população mista de antígenos.
[085] O termo "anticorpo anti-CD3 biespecífico" ou 'anticorpo anti-CD3 multiespecífico ", tal como aqui utilizado, refere-se a um anticorpo anti-CD3 compreendendo dois ou mais sítios de ligação de antígeno ou sítios de ligação do parceiro de ligação, um primeiro sítio de ligação tendo afinidade para um primeiro antígeno ou epítopo e um segundo sítio de ligação tendo afinidade de ligação para um segundo antígeno ou epítopo distinto do primeiro. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-CD3 tem um local de ligação que se liga a CD3 e um local de ligação ou locais de ligação que têm afinidade de ligação para um antígeno ou epítopo diferente.
[086] O termo "epítopo", tal como aqui utilizado, refere-se a um local em um antígeno ou parceiro de ligação que é reconhecido pelo anticorpo Fab anti-CD3. Um epítopo pode ser uma sequência linear ou conformacionalmente formada ou forma de aminoácidos, se o antígeno compreender um polipeptídeo. Um epítopo também pode ser qualquer local em qualquer tipo de antígeno onde um anticorpo anti-CD3 se liga ao antígeno.
[087] Tal como aqui se utiliza, "polipeptídeo de ligação a antigénio" ou "anticorpo de Fab anti-CD3" devem incluir aqueles polipeptídeos e proteínas que têm pelo menos a atividade biológica de ligação a um parceiro de ligação específico tal como o antigénio específico, bem como análogos de CD3, CD3 isoformas, miméticos de CD3, fragmentos de CD3, proteínas CD3 híbridas, proteínas de fusão, oligômeros e multímeros, homólogos, variantes de padrão de glicosilação e muteínas, independentemente da atividade biológica dos mesmos, e ainda independentemente do método de síntese ou fabricação dos mesmos, incluindo, mas não limitado a, recombinante (seja produzido a partir de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou outra forma de ácido nucleico), in vitro, in vivo, por microinjeção de moléculas de ácido nucleico, métodos sintéticos, transgênicos e ativados por genes. Exemplos específicos de anticorpo anti-CD3 incluem, mas não estão limitados a, moléculas de anticorpo, cadeia pesada, cadeia leve, região variável, CDR, Fab, scFv, moléculas de arcabouço não-anticorpo alternativas, ligantes, receptores, peptídeos ou qualquer aminoácido sequência que se liga a um antígeno.
[088] Os polipeptídeos de ligação de antígeno incluem os sais e pró-drogas farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos sais, polimorfos, hidratos, solvatos, fragmentos biologicamente ativos, variantes biologicamente ativas e estereoisômeros do anticorpo anti-CD3 humano de ocorrência natural, bem como agonista, variantes miméticas e antagonistas do anticorpo anti-CD3 humano de ocorrência natural e suas fusões polipeptídicas. As fusões que compreendem aminoácidos adicionais no terminal amino, terminal carboxila, ou ambos, são englobadas pelo termo "polipeptídeo de ligação de antígeno". Fusões exemplares incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, anticorpo metionil anti-CD3 em que uma metionina está ligada ao terminal N do anticorpo anti-CD3 resultante da expressão recombinante, fusões para fins de purificação (incluindo, mas não se limitando a poli-histidina ou epítopos de afinidade), fusões com o propósito de ligar anticorpos anti-CD3 a outras moléculas biologicamente ativas, fusões com peptídeos de ligação à albumina sérica e fusões com proteínas séricas, como albumina sérica.
[089] O termo "antígeno" ou "parceiro de ligação" refere-se a uma substância que é o alvo para a atividade de ligação exibida pelo anticorpo anti-CD3. Praticamente qualquer substância pode ser um antígeno ou parceiro de ligação para um anticorpo Fab anti-CD3.
[090] Um anticorpo produzido naturalmente (Ab) é uma arcabouço tetramérica que consiste em duas cadeias pesadas de imunoglobulina (Ig) idênticas e duas cadeias leves idênticas. As cadeias pesadas e leves de um Ab consistem em domínios diferentes.
Cada cadeia leve tem um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL), enquanto cada cadeia pesada tem um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH). Cada domínio, consistindo em cerca de 110 resíduos de aminoácidos, é dobrado em uma estrutura de sanduíche- característica formada a partir de duas folhas- compactadas umas contra as outras, a imunoglobulina se dobra. Cada um dos domínios VL tem três regiões determinantes de complementaridade (CDR1-3) e os domínios VH cada um tem até três regiões determinantes de complementaridade (CDR1-3), que são laços, ou voltas, conectando filamentos  em uma extremidade dos domínios. As regiões variáveis de ambas as cadeias leve e pesada geralmente contribuem para a especificidade do antígeno, embora a contribuição das cadeias individuais para a especificidade não seja necessariamente igual. As moléculas de anticorpos evoluíram para se ligar a um grande número de moléculas usando laços CDR aleatórios.
[091] Subestruturas funcionais de Abs podem ser preparadas por proteólise e por métodos recombinantes. Eles incluem o fragmento Fab, que compreende os domínios VH-CH1 da cadeia pesada e os domínios VL-CL1 da cadeia leve unidos por uma única ligação dissulfeto intercadeia, e o fragmento Fv, que compreende apenas os domínios
VH e VL, e a porção Fc que compreende a região de ligação de não antígeno da molécula.
Em alguns casos, um único domínio VH retém afinidade significativa para o antígeno (Ward et al., Nature 341, 554-546, 1989). Também foi demonstrado que um certo monomérico a cadeia leve se ligará especificamente ao seu antígeno. (L. Masat et al., PNAS 91:893-896, 1994). Verificou-se que cadeias leves ou pesadas separadas também retêm alguma atividade de ligação de antígeno (Ward et al., Nature 341, 554-546, 1989).
[092] Outra subestrutura funcional é um Fv de cadeia simples (scFv), composta pelas regiões variáveis da cadeia pesada e leve da imunoglobulina, covalentemente conectada por um ligante peptídico (Sz Hu et al., Cancer Research, 56, 3055-3061, 1996).
Estas proteínas pequenas (Mr 25.000 Da) geralmente retêm especificidade e afinidade para o antígeno em um único polipeptídeo e podem fornecer um bloco de construção conveniente para moléculas maiores específicas do antígeno. A meia-vida curta dos scFvs na circulação limita sua utilidade terapêutica em muitos casos.
[093] Um pequeno esqueleto de proteína denominado "minicorpo" foi projetado usando uma parte do domínio VH de Ig como molde (Pessi et al., Nature 362, 367-369, 1993). Minicorpos com alta afinidade (constante de dissociação (K ) cerca de 10 -7 M) d para interleucina-6 foram identificados por alças aleatórias correspondentes a CDR1 e CDR2 de VH e, em seguida, selecionando mutantes usando o método de exibição de fago (Martin et al., EMBO J. 13, 5303-5309, 1994).
[094] Os camelos muitas vezes carecem de domínios de cadeia leve variáveis quando material semelhante a IgG de seu soro é analisado, sugerindo que a especificidade e afinidade de anticorpos suficientes podem ser derivadas de domínios VH (três ou quatro laços CDR) sozinhos. Domínios VH "camelizados" com alta afinidade foram feitos, e alta especificidade pode ser gerada randomizando apenas o CDR3.
[095] Uma alternativa ao "minicorpo" é o "diacorpo". Diacorpos são pequenos fragmentos de anticorpos bivalentes e biespecíficos, com dois sítios de ligação de antígeno. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH ) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL ) na mesma cadeia polipeptídica (VH -VL ). Diacorpos são semelhantes em tamanho ao fragmento Fab. Ao usar um ligante que é muito curto para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação de antígeno. Estes fragmentos de anticorpos diméricos, ou "diacorpos", são bivalentes e biespecíficos. (Ver, P. Holliger et al., PNAS 90:6444-6448, 1993).
[096] Peptídeos de CDR e miméticos de CDR orgânicos foram produzidos (Dougall et al., 1994, Trends Biotechnol. 12, 372-379). Os peptídeos CDR são peptídeos curtos, tipicamente cíclicos, que correspondem às sequências de aminoácidos das voltas CDR dos anticorpos. As alças CDR são responsáveis pelas interações anticorpo- antígeno. Peptídeos CDR e miméticos CDR orgânicos mostraram reter alguma afinidade de ligação (Smyth & von Itzstein, J. Am. Chem. Soc. 116, 2725, -2733, 1994). CDRs de camundongo foram enxertados na arcabouço de Ig humana sem a perda de afinidade (Jones et al., Nature 321, 522-525, 1986; Riechmann et al., 1988).
[097] No corpo humano, Abs específicos são selecionados e amplificados de uma grande biblioteca (maturação de afinidade). Os processos podem ser reproduzidos in vitro usando tecnologias de biblioteca combinatória. A exibição bem-sucedida de fragmentos Ab na superfície do bacteriófago tornou possível gerar e rastrear um grande número de mutações CDR (McCafferty et al., Nature 348, 552-554, 1990; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,7978-7982,1991; Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12, 433, -455, 1994). Um número crescente de Fabs e Fvs (e seus derivados) são produzidos por esta técnica. A técnica combinatória pode ser combinada com imitações de Ab.
[098] Vários domínios de proteínas que poderiam servir potencialmente como estruturas de proteínas foram expressos como fusões com proteínas do capsídeo de fago. Resenha em Clackson & Wells, Trends Biotechnol. 12, 173, -184, 1994). Vários desses domínios de proteína já foram usados como andaimes para exibir sequências peptídicas aleatórias, incluindo inibidor de tripsina pancreática bovina (Roberts et al., PNAS 89:2429-2433 1992), hormônio de crescimento humano (Lowman et al., Biochemistry 30:10832 -10838, 1991), (Venturini et al., Protein Peptide Letters 1:70-75 1994), e o domínio de ligação de IgG de Streptococcus (O'Neil et al., Techniques in Protein Chemistry V (Crabb, L,. ed.) pp. 517-524, Academic Press, San Diego, 1994).
Esses arcabouços exibiram um único loop ou região aleatória. Tendamistat tem sido usado como uma arcabouço de apresentação no fago filamentoso M13 (McConnell e Hoess, J. Mol. Biol. 250, 460, -470, 1995).
[099] A ligação covalente do polímero hidrofílico poli (etilenoglicol), abreviado PEG, é um método para aumentar a solubilidade em água, a biodisponibilidade, aumentar a meia-vida sérica, aumentar a meia-vida terapêutica, modular a imunogenicidade, modular a atividade biológica ou estender o tempo de circulação de muitas moléculas biologicamente ativas, incluindo proteínas, peptídeos e moléculas particularmente hidrofóbicas. O PEG tem sido amplamente utilizado em produtos farmacêuticos, em implantes artificiais e em outras aplicações onde a biocompatibilidade, a falta de toxicidade e a falta de imunogenicidade são importantes. A fim de maximizar as propriedades desejadas de PEG, o peso molecular total e o estado de hidratação do polímero de PEG ou polímeros ligados à molécula biologicamente ativa devem ser suficientemente altos para transmitir as características vantajosas tipicamente associadas à ligação do polímero de PEG, tais como aumento da solubilidade em água e meia-vida em circulação, embora não tenha um impacto adverso na bioatividade da molécula original.
[0100] Os derivados de PEG são frequentemente ligados a moléculas biologicamente ativas por meio de funcionalidades químicas reativas, como resíduos de lisina, cisteína e histidina, o terminal N e porções de carboidrato. As proteínas e outras moléculas geralmente têm um número limitado de locais reativos disponíveis para a fixação do polímero. Frequentemente, os locais mais adequados para modificação via ligação de polímero desempenham um papel significativo na ligação ao receptor e são necessários para a retenção da atividade biológica da molécula. Como resultado, a ligação indiscriminada de cadeias de polímero a tais locais reativos em uma molécula biologicamente ativa muitas vezes leva a uma redução significativa ou mesmo à perda total da atividade biológica da molécula modificada por polímero. (R. Clark et al., J. Biol. Chem., 271:21969-21977, 1996). Para formar conjugados com peso molecular de polímero suficiente para conferir as vantagens desejadas a uma molécula alvo, as abordagens da técnica anterior envolveram tipicamente a ligação aleatória de vários braços de polímero à molécula, aumentando assim o risco de uma redução ou mesmo perda total na bioatividade do pai molécula.
[0101] Os locais reativos que formam os locais para ligação de derivados de PEG às proteínas são ditados pela arcabouço da proteína. As proteínas, incluindo as enzimas, são compostas por várias sequências de alfa-aminoácidos, que possuem o arcabouço geral H2N-CHR-COOH. A porção alfa amino (H2N--) de um aminoácido se junta à porção carboxila (--COOH) de um aminoácido adjacente para formar ligações amida, que podem ser representadas como - (NH - CHR - CO ) n -, onde o subscrito “n” pode ser igual a centenas ou milhares. O fragmento representado por R pode conter locais reativos para a atividade biológica da proteína e para a ligação de derivados de PEG.
[0102] Por exemplo, no caso do aminoácido lisina, existe uma porção --NH 2 na posição épsilon, bem como na posição alfa. O épsilon --NH 2 é livre para reação em afecções de pH básico. Grande parte da técnica no campo da derivatização de proteínas com PEG tem sido direcionada ao desenvolvimento de derivados de PEG para ligação à porção épsilon - NH2 de resíduos de lisina presentes nas proteínas. ("Polietilenoglicol e derivados para PEGilação avançada", Catálogo de Engenharia Molecular Nektar, pp. 1- 17, 2003). Todos esses derivados de PEG têm a limitação comum, no entanto, de que não podem ser instalados seletivamente entre os numerosos resíduos de lisina presentes nas superfícies das proteínas. Esta pode ser uma limitação significativa nos casos em que um resíduo de lisina é importante para a atividade da proteína, existindo em um sítio ativo da enzima, por exemplo, ou nos casos em que um resíduo de lisina desempenha um papel na mediação da interação da proteína com outras moléculas biológicas, como no caso de locais de ligação ao receptor.
[0103] Uma segunda e igualmente importante complicação dos métodos existentes para a PEGuilação de proteínas é que os derivados de PEG podem sofrer reações colaterais indesejadas com resíduos diferentes daqueles desejados. A histidina contém uma porção imino reativa, representada estruturalmente como --N (H) -, mas muitas espécies quimicamente reativas que reagem com épsilon --NH 2 também podem reagir com --N (H) -. Da mesma forma, a cadeia lateral do aminoácido cisteína carrega um grupo sulfidrila livre, representado estruturalmente como –SH. Em alguns casos, os derivados de PEG direcionados ao grupo épsilon -NH 2 da lisina também reagem com cisteína, histidina ou outros resíduos. Isso pode criar misturas heterogêneas complexas de moléculas bioativas derivadas de PEG e pode destruir a atividade da molécula bioativa que está sendo direcionada. Seria desejável desenvolver derivados de PEG que permitissem que um grupo químico funcional fosse introduzido em um único local dentro da proteína que, então, permitiria o acoplamento seletivo de um ou mais polímeros de
PEG à molécula bioativa em locais específicos na superfície da proteína que são ambos bem definidos e previsíveis.
[0104] Além dos resíduos de lisina, um esforço considerável na técnica tem sido direcionado para o desenvolvimento de reagentes PEG ativados que têm como alvo outras cadeias laterais de aminoácidos, incluindo cisteína, histidina e o N-terminal. Ver, por exemplo, US Pat. No. 6.610.281, que é incorporado a título de referência no presente documento, e "Polietileno Glicol e Derivados para PEGilação Avançada", Catálogo de Engenharia Molecular Nektar, pp. 1-17, 2003. Um resíduo de cisteína pode ser introduzido seletivamente no local na arcabouço das proteínas usando mutagênese direcionada ao local e outras técnicas conhecidas na técnica, e a porção química sulfidrila livre resultante pode ser reagida com derivados de PEG que possuem grupos funcionais reativos com tiol. Esta abordagem é complicada, no entanto, em que a introdução de um grupo sulfidrila livre pode complicar a expressão, dobramento e estabilidade da proteína resultante. Assim, seria desejável ter um meio para introduzir um grupo químico funcional em moléculas bioativas que possibilitasse o acoplamento seletivo de um ou mais polímeros de PEG à proteína ao mesmo tempo em que fosse compatível com (isto é, não se envolvesse em reações colaterais indesejadas com) sulfidrilos e outros grupos químicos funcionais tipicamente encontrados em proteínas.
[0105] Conforme observado na técnica, muitos desses derivados que foram desenvolvidos para ligação às cadeias laterais de proteínas, em particular, a porção química -NH2 na cadeia lateral do aminoácido lisina e a porção química -SH na cadeia lateral de cisteína, provaram ser problemáticos em sua síntese e uso. Alguns formam ligações instáveis com a proteína que estão sujeitas a hidrólise e, portanto, se decompõem, degradam ou são instáveis em ambientes aquosos, como na corrente sanguínea. Algumas formam ligações mais estáveis, mas estão sujeitas a hidrólise antes da ligação ser formada, o que significa que o grupo reativo no derivado de PEG pode ser inativado antes que a proteína possa ser anexada. Alguns são um tanto tóxicos e, portanto, menos adequados para uso in vivo. Alguns são lentos demais para reagir para serem úteis na prática. Alguns resultam na perda da atividade da proteína ao se ligar a locais responsáveis pela atividade da proteína. Alguns não são específicos nos locais aos quais se fixarão, o que também pode resultar na perda da atividade desejável e na falta de reprodutibilidade dos resultados. A fim de superar os desafios associados à modificação de proteínas com frações de poli (etilenoglicol), derivados de PEG foram desenvolvidos que são mais estáveis (por exemplo, Patente US 6.602.498, que é incorporada no presente documento a título de referência) ou que reagem seletivamente com frações de tiol em moléculas e superfícies (por exemplo, Patente US 6.610.281, que é aqui incorporada a título de referência). Existe claramente uma necessidade na técnica de derivados de PEG que sejam quimicamente inertes em ambientes fisiológicos até que sejam chamados a reagir seletivamente para formar ligações químicas estáveis.
[0106] Recentemente, foi relatada uma tecnologia inteiramente nova nas ciências das proteínas, que promete superar muitas das limitações associadas às modificações específicas do local das proteínas. Especificamente, novos componentes foram adicionados à maquinaria biossintética de proteínas do procarioto Escherichia coli ( E.
coli ) (por exemplo, L. Wang, et al., Science 292:498-500, 2001) e o eucarioto Saccharomyces cerevisiae ( S. cerevisiae ) (por exemplo, J. Chin et al., Science 301:964- 7, 2003), que permitiu a incorporação de aminoácidos não codificados geneticamente em proteínas in vivo. Vários novos aminoácidos com novas propriedades químicas, físicas ou biológicas, incluindo rótulos de fotoafinidade e aminoácidos fotoisomerizáveis, cetoaminoácidos e aminoácidos glicosilados, foram incorporados de forma eficiente e com alta fidelidade em proteínas em E. coli e em levedura em resposta ao códon âmbar,
TAG, usando esta metodologia. Ver, por exemplo, JW Chin et al., Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027, 2002; JW Chin, & PG Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; JW Chin, et al., PNAS United States of America 99:11020-11024, 2002; e, L. Wang, & PG Schultz, Chem. Comm., 1-10, 2002. Esses estudos demonstraram que é possível introduzir seletivamente e rotineiramente grupos funcionais químicos, como grupos cetona, grupos alcino e frações azida, que não são encontrados em proteínas, que são quimicamente inertes a todos os grupos funcionais encontrados nos 20, aminoácidos geneticamente codificados e que podem ser usados para reagir de forma eficiente e seletiva para formar ligações covalentes estáveis.
[0107] A capacidade de incorporar aminoácidos não codificados geneticamente em proteínas permite a introdução de grupos funcionais químicos que poderiam fornecer alternativas valiosas para os grupos funcionais de ocorrência natural, como o épsilon – NH 2 da lisina, o sulfidril –SH da cisteína, o grupo imino de histidina, etc. Certos grupos funcionais químicos são conhecidos por serem inertes para os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos geneticamente codificados comuns, mas reagem de forma limpa e eficiente para formar ligações estáveis. Os grupos azida e acetileno, por exemplo, são conhecidos na técnica por sofrerem uma reação de cicloadição de Huisgen [3 + 2] em afecções aquosas na presença de uma quantidade catalítica de cobre. Ver, por exemplo, Tornoe, et al., (2002) Org. Chem. 67:3057-3064; e Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Ao introduzir uma porção química azida em uma arcabouço de proteína, por exemplo, pode-se incorporar um grupo funcional que é quimicamente inerte a aminas, sulfidrilas, ácidos carboxílicos, grupos hidroxila encontrados em proteínas, mas que também reage de maneira suave e eficiente com uma porção química de acetileno para formar um produto de cicloadição. É importante ressaltar que na ausência da porção acetileno, a azida permanece quimicamente inerte e não reativa na presença de outras cadeias laterais de proteínas e sob afecções fisiológicas.
[0108] Várias referências divulgam a modificação de polipeptídeos por conjugação de polímero ou glicosilação. O termo " anticorpo anti-CD3 " ou "polipeptídeo de ligação de antígeno" refere-se a um anticorpo anti-CD3 como descrito acima, bem como um polipeptídeo que retém pelo menos uma atividade biológica de um anticorpo de ocorrência natural, incluindo, mas não se limitando a, atividades diferentes de ligação de antígeno. Outras atividades além da ligação de antígeno incluem, mas não estão limitadas a, qualquer uma ou mais das atividades associadas ao Fc. O termo "anticorpo anti-CD3" ou "polipeptídeo de ligação de antígeno" inclui, mas não está limitado a, polipeptídeos conjugados a um polímero, como PEG e podem ser constituídos por uma ou mais derivatizações adicionais de cisteína, lisina, N ou C- aminoácidos terminais ou outros resíduos. Além disso, o anticorpo anti-CD3 pode compreender um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa, em que o aminoácido ao qual o ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa está conjugado pode ser um aminoácido não natural de acordo com a presente invenção ou pode ser conjugado a um aminoácido codificado naturalmente utilizando técnicas conhecidas na técnica, tais como acoplamento a lisina ou cisteína. As Patentes No. 4.904.584 revela polipeptídeos PEGuilados depletados de lisina, em que pelo menos um resíduo de lisina foi deletado ou substituído por qualquer outro resíduo de aminoácido. WO 99/67291 divulga um processo para conjugar uma proteína com PEG, em que pelo menos um resíduo de aminoácido na proteína é deletado e a proteína é contatada com PEG sob afecções suficientes para atingir a conjugação com a proteína. WO 99/03887 revela variantes PEGuiladas de polipeptídeos pertencentes à superfamília do hormônio de crescimento, em que um resíduo de cisteína foi substituído por um resíduo de aminoácido não essencial localizado em uma região específica do polipeptídeo. WO 00/26354 revela um método de produção de uma variante polipeptídica glicosilada com alergenicidade reduzida, que em comparação com um polipeptídeo parental correspondente compreende pelo menos um local de glicosilação adicional.
[0109] O termo "polipeptídeo de ligação de antígeno" também inclui anticorpos anti-CD3 glicosilados, tais como, mas não se limitando a, polipeptídeos glicosilados em qualquer posição de aminoácido, formas glicosiladas ligadas a N ou A do polipeptídeo.
As variantes contendo alterações de nucleotídeo único também são consideradas variantes biologicamente ativas do anticorpo anti-CD3. Além disso, variantes de emenda também estão incluídas. O termo "polipeptídeo de ligação de antígeno" também inclui heterodímeros de anticorpo anti-CD3, homodímeros, heteromultímeros ou homomultímeros de qualquer um ou mais anticorpos anti-CD3 ou qualquer outro polipeptídeo, proteína, carboidrato, polímero, molécula pequena, ligante, ligante ou outra molécula biologicamente ativa de qualquer tipo, ligada por meios químicos ou expressa como uma proteína de fusão, bem como análogos polipeptídicos contendo, por exemplo, deleções específicas ou outras modificações, mas mantendo a atividade biológica.
[0110] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de ligação de antígeno compreendem ainda uma adição, substituição ou deleção que modula a atividade biológica do anticorpo anti-CD3. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular uma ou mais propriedades ou atividades do anticorpo anti-CD3, incluindo, mas não se limitando a, modular a afinidade para o antígeno, modular (incluindo, mas não se limitando a, aumenta ou diminui) o antígeno conformacional ou outras alterações estruturais secundárias, terciárias ou quaternárias, estabilizar as alterações conformacionais do antígeno ou outras alterações estruturais secundárias, terciárias ou quaternárias, induzir ou causar alterações conformacionais do antígeno ou outras alterações estruturais secundárias, terciárias ou quaternárias, modular a meia-vida circulante, modular a meia-vida terapêutica, modular a estabilidade do polipeptídeo, modular a dose, modular a liberação ou biodisponibilidade, facilitar a purificação ou melhorar ou alterar uma determinada via de administração. Da mesma forma, os polipeptídeos de ligação de antígeno podem compreender sequências de clivagem de protease, grupos reativos, domínios de ligação a anticorpos (incluindo, mas não se limitando a, FLAG ou poli-His) ou outras sequências baseadas em afinidade (incluindo, mas não se limitando a, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, mas não se limitando a, biotina) que melhoram a detecção (incluindo, mas não se limitando a, GFP), purificação ou outras características do polipeptídeo.
[0111] O termo "polipeptídeo de ligação de antígeno" também abrange homodímeros, heterodímeros, homomultímeros e heteromultímeros de anticorpos anti- CD3 que estão ligados, incluindo, mas não se limitando àqueles ligados diretamente por meio de cadeias laterais de aminoácidos não codificados naturalmente, sejam os mesmos ou diferentes cadeias laterais de aminoácidos não codificados naturalmente, a cadeias laterais de aminoácidos codificados naturalmente, como fusões ou indiretamente por meio de um ligante. Ligantes exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, pequenos compostos orgânicos, polímeros solúveis em água de uma variedade de comprimentos, como poli (etilenoglicol) ou polidextrano, ou polipeptídeos de vários comprimentos.
[0112] Os versados na técnica apreciarão que as posições de aminoácidos correspondentes às posições em uma sequência de polipeptídeo de ligação a antígeno particular podem ser prontamente identificadas em um fragmento do polipeptídeo de ligação a antígeno ou polipeptídeo de ligação a antígeno relacionado, etc. Por exemplo, alinhamento de sequência programas como o BLAST podem ser usados para alinhar e identificar uma posição particular em uma proteína que corresponde a uma posição em uma sequência relacionada.
[0113] O termo "polipeptídeo de ligação de antígeno" abrange polipeptídeos de ligação de antígeno compreendendo uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Os polipeptídeos de ligação de antígeno da presente invenção podem ser constituídos por modificações com um ou mais aminoácidos naturais em conjunto com uma ou mais modificações de aminoácidos não naturais. Substituições exemplares em uma ampla variedade de posições de aminoácidos em polipeptídeos de anticorpo anti- CD3 de ocorrência natural foram descritas, incluindo, mas não se limitando a substituições que modulam uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo de ligação de antígeno, tais como, mas não se limitando para aumentar a atividade agonista, aumentar a solubilidade do polipeptídeo, converter o polipeptídeo em um antagonista, etc. e são abrangidos pelo termo "anticorpo anti-CD3".
[0114] Um "aminoácido codificado de forma não natural" refere-se a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirolisina ou selenocisteína.
Outros termos que podem ser usados como sinônimos com o termo "aminoácido codificado de forma não natural" são "aminoácido não natural", "aminoácido não natural", "aminoácido não natural", "aminoácido não canônico", e suas versões com hifenização e não hifenização. O termo "aminoácido codificado de forma não natural" também inclui, mas não está limitado a, aminoácidos que ocorrem por modificação (por exemplo, modificações pós-tradução) de um aminoácido codificado naturalmente (incluindo, mas não limitado a, os 20 aminoácidos comuns ou pirolisina e selenocisteína), mas não são incorporados naturalmente em uma cadeia polipeptídica crescente pelo complexo de tradução. Exemplos de tais aminoácidos de ocorrência não natural incluem, mas não estão limitados a, N -acetilglucosaminil-L-serina, N -acetilglucosaminil-L-treonina e O-
fosfotirosina. Em algumas modalidades, os aminoácidos não naturais compreendem uma porção química de sacarídeo. Exemplos de tais aminoácidos incluem N -acetil-L- glucosaminil-L-serina, N -acetil-L-galactosaminil-L-serina, N -acetil-L-glucosaminil-L- treonina, N -acetil-L-glucosaminil- L-asparagina e O -manosaminil-L-serina. Exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos em que a ligação N- ou O- de ocorrência natural entre o aminoácido e o sacarídeo é substituída por uma ligação covalente não comumente encontrada na natureza - incluindo, mas não se limitando a, um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e semelhantes. Exemplos de tais aminoácidos também incluem sacarídeos que não são comumente encontrados em proteínas de ocorrência natural, como 2-desoxi-glicose, 2-desoxigalactose e semelhantes.
Exemplos específicos de aminoácidos não naturais incluem, mas não estão limitados a, uma p -acetil-L-fenilalanina, uma p- propargiloxifenilalanina, O-metil-L- tirosina, uma L-3- (2-naftil) alanina, uma 3 -metil-fenilalanina, uma O-4-alil-L-tirosina, uma 4-propil-L-tirosina, um tri-O-acetil-GlcNAc -serina, uma L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma isopropil-L-fenilalanina, uma p -azido-L-fenilalanina, uma p -acil-L- fenilalanina, uma p -benzoil-L-fenilalanina, uma L-fosfoserina, uma fosfonoserina, uma fosfonotirosina, uma p -iodo-fenilalanina, uma p- bromofenilalanina, uma p -amino-L- fenilalanina e uma isopropil-L-fenilalanina e semelhantes.
[0115] Um "grupo de modificação do terminal amino" refere-se a qualquer molécula que pode ser ligada ao terminal amino de um polipeptídeo. Da mesma forma, um "grupo de modificação do terminal carboxi" refere-se a qualquer molécula que pode ser ligada ao terminal carboxi de um polipeptídeo. Os grupos de modificação terminal incluem, mas não estão limitados a, vários polímeros solúveis em água, peptídeos ou proteínas, como albumina sérica, ou outras frações que aumentam a meia-vida sérica dos peptídeos.
[0116] Os termos "grupo funcional", "porção química ativa", "grupo de ativação", "grupo de saída", "sítio reativo", "grupo quimicamente reativo" e "porção química quimicamente reativa" são usados na técnica e no presente documento para se referir a distintos, porções definíveis ou unidades de uma molécula. Os termos são um tanto sinônimos nas artes químicas e são usados aqui para indicar as porções de moléculas que desempenham alguma função ou atividade e são reativas com outras moléculas.
[0117] O termo "ligação" ou "ligante" é usado no presente documento para se referir a grupos ou ligações que normalmente são formados como resultado de uma reação química e normalmente são ligações covalentes. Ligações hidroliticamente estáveis significam que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água em valores de pH úteis, incluindo, mas não se limitando a, sob afecções fisiológicas por um longo período de tempo, talvez até indefinidamente.
Ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis significam que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue. Ligações enzimaticamente instáveis ou degradáveis significam que a ligação pode ser degradada por uma ou mais enzimas. Como entendido na técnica, PEG e polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na arcabouço do polímero ou no grupo ligante entre o arcabouço do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula de polímero. Por exemplo, ligações éster formadas pela reação de ácidos carboxílicos de PEG ou ácidos carboxílicos de PEG ativados com grupos álcool em um agente biologicamente ativo geralmente hidrolisam sob afecções fisiológicas para liberar o agente. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, mas não estão limitadas a, ligações de carbonato; ligações de imina resultaram da reação de uma amina e um aldeído; ligações de éster de fosfato formadas pela reação de um álcool com um grupo fosfato; ligações de hidrazona que são produtos da reação de uma hidrazida e um aldeído; ligações acetal que são o produto da reação de um aldeído e um álcool; ligações ortoéster que são o produto da reação de um formato e um álcool; ligações peptídicas formadas por um grupo amina, incluindo, mas não se limitando a, em uma extremidade de um polímero, tal como PEG, e um grupo carboxila de um peptídeo; e ligações oligonucleotídicas formadas por um grupo fosforamidita, incluindo, mas não se limitando a, no final de um polímero, e um grupo hidroxila 5 'de um oligonucleotídeo. Ligantes ramificados podem ser usados em polipeptídeos de ligação a antígeno da invenção.
[0118] O termo "molécula biologicamente ativa", "porção química biologicamente ativa" ou "agente biologicamente ativo" quando usado no presente documento significa qualquer substância que pode afetar quaisquer propriedades físicas ou bioquímicas de um sistema biológico, via, molécula ou interação relacionada a um organismo, incluindo mas não limitado a vírus, bactérias, bacteriófago, transposon, príon, insetos, fungos, plantas, animais e humanos. Em particular, tal como aqui utilizado, as moléculas biologicamente ativas incluem, mas não estão limitadas a, qualquer substância destinada a diagnóstico, cura, mitigação, tratamento ou prevenção de doenças em humanos ou outros animais, ou para aumentar o bem estar físico ou mental de humanos ou animais.
Exemplos de moléculas biologicamente ativas incluem, mas não estão limitados a, peptídeos, proteínas, enzimas, drogas de moléculas pequenas, drogas pesadas, drogas leves, corantes, lipídios, nucleosídeos, oligonucleotídeos, toxinas, células, vírus, lipossomas, micropartículas e micelas. As classes de agentes biologicamente ativos que são adequados para uso com a invenção incluem, mas não estão limitados a, drogas, pró-drogas, radionuclídeos, agentes de imagem, polímeros, antibióticos, fungicidas, agentes antivirais, agentes anti-inflamatórios, agentes antitumorais, agentes cardiovasculares, agentes ansiolíticos, hormônios, fatores de crescimento, agentes esteroidais, toxinas derivadas de micróbios e semelhantes.
[0119] Os anticorpos anti-CD3 com Fab-Folato da invenção podem ser conjugados com moléculas como PEG para melhorar a distribuição in vivo e os perfis farmacocinéticos. Leong et al. descrevem a PEGuilação específica do local de um fragmento Fab ′ de um anticorpo anti-IL-8 com uma taxa de depuração diminuída sobre a forma não PEGuilada e pouca ou nenhuma perda de atividade de ligação de antígeno (Leong, SR et al. (2001) Cytokine 16 :106-119).
[0120] Vários ligantes cliváveis diferentes são conhecidos pelos versados na técnica. Ver US Pat. Nos. 4.618.492; 4.542.225 e 4.625.014. Os mecanismos para a liberação de um agente a partir desses grupos ligantes incluem, por exemplo, irradiação de uma ligação fotolábil e hidrólise catalisada por ácido. As Patentes No. 4.671.958, por exemplo, inclui uma descrição de imunoconjugados compreendendo ligantes que são clivados no local alvo in vivo pelas enzimas proteolíticas do sistema complemento do paciente. O comprimento do ligante pode ser predeterminado ou selecionado dependendo de uma relação espacial desejada entre o anticorpo anti-CD3 e a molécula ligada a ele. Em vista do grande número de métodos que foram relatados para anexar uma variedade de compostos de radiodiagnóstico, compostos radioterapêuticos, drogas, toxinas e outros agentes a anticorpos, um versado na técnica será capaz de determinar um método adequado para anexar um determinado agente a um anticorpo anti-CD3 ou outro polipeptídeo.
[0121] Um "polímero bifuncional" refere-se a um polímero que compreende dois grupos funcionais discretos que são capazes de reagir especificamente com outras porções (incluindo, mas não se limitando a, grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Um ligante bifuncional tendo um grupo funcional reativo com um grupo em um componente biologicamente ativo particular e outro grupo reativo com um grupo em um segundo componente biológico pode ser usado para formar um conjugado que inclui o primeiro componente biologicamente ativo, o ligante bifuncional e o segundo componente biologicamente ativo. Muitos procedimentos e moléculas de ligação para ligação de vários compostos a peptídeos são conhecidos. Ver, por exemplo, o Pedido de Patente Europeia No. 188.256; Patentes sob no U.S...
4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784; 4.680.338; 4.569.789; e 4.589.071 que são aqui incorporados a título de referência. Um "polímero multifuncional" refere-se a um polímero que compreende dois ou mais grupos funcionais discretos que são capazes de reagir especificamente com outras frações (incluindo, mas não se limitando a, grupos laterais de aminoácidos) para formar ligações covalentes ou não covalentes. Um polímero bifuncional ou polímero multifuncional pode ter qualquer comprimento molecular ou peso molecular desejado e pode ser selecionado para fornecer um espaçamento ou conformação desejado particular entre uma das moléculas ligadas ao anticorpo anti-CD3.
[0122] Conforme usado no presente documento, o termo "polímero solúvel em água" se refere a qualquer polímero que é solúvel em solventes aquosos. A ligação de polímeros solúveis em água ao anticorpo anti-CD3 pode resultar em alterações incluindo, mas não se limitando a, meia-vida sérica aumentada ou modulada, ou meia-vida terapêutica aumentada ou modulada em relação à forma não modificada, imunogenicidade modulada, associação física modulada características tais como agregação e formação de multímero, ligação de receptor alterada e dimerização ou multimerização de receptor alterada. O polímero solúvel em água pode ou não ter sua própria atividade biológica e pode ser utilizado como um ligante para anexar um anticorpo anti-CD3 a outras substâncias, incluindo, mas não se limitando a um ou mais anticorpos anti-CD3, ou um ou mais biologicamente moléculas ativas. Polímeros adequados incluem, mas não estão limitados a, polietilenoglicol, polietilenoglicol propionaldeído, mono C1-C10 alcoxi ou derivados de ariloxi (descritos na Patente US No. 5.252.714 que é incorporada aqui a título de referência), monometoxi-polietilenoglicol, polivinilpirrolidona, álcool polivinílico, poliaminoácidos, diviniléter anidrido maleico, N- (2- Hidroxipropil) -metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano incluindo sulfato de dextrano, polipropileno glicol, copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poliol polioxietilado, heparina, fragmentos de heparin glicanos, celulose e derivados de celulose, incluindo, mas não se limitando a metilcelulose e carboximetilcelulose, amido e derivados de amido, polipeptídeos, polialquilenoglicol e seus derivados, copolímeros de polialquilenoglicóis e seus derivados, éteres de poliviniletil e alfa-beta-poli [( 2-hidroxietil) -DL-aspartamida e semelhantes, ou suas misturas. Exemplos de tais polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polietilenoglicol e albumina sérica.
[0123] Tal como aqui utilizado, o termo "polialquilenoglicol" ou "poli (alquenoglicol)" refere-se a polietilenoglicol (poli (etilenoglicol)), polipropilenoglicol, polibutilenoglicol e seus derivados. O termo "polialquilenoglicol" abrange polímeros lineares e ramificados e pesos moleculares médios entre 0,1 kDa e 100 kDa. Em algumas modalidades, o "polialquilenoglicol" ou "poli (alquenoglicol)" pode ser de cerca de ou entre 5K a 50K. Outras modalidades exemplares são listadas, por exemplo, em catálogos de fornecedores comerciais, como o catálogo da Shearwater Corporation "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001). Tal como aqui utilizado, o poli (etilenoglicol) com um peso molecular de 5 kDa, 10kDa, 20kDa etc., é referido no presente documento como “5K PEG”, “10K PEG”, “20K PEG etc.”, respectivamente.
[0124] Conforme usado no presente documento, o termo "meia-vida sérica modulada" significa a mudança positiva ou negativa na meia-vida circulante de um anticorpo anti-CD3 modificado em relação à sua forma não modificada. A meia-vida sérica é medida tomando amostras de sangue em vários pontos de tempo após a administração do anticorpo anti-CD3 e determinando a concentração daquela molécula em cada amostra. A correlação da concentração sérica com o tempo permite o cálculo da meia-vida sérica. A meia-vida sérica aumentada desejavelmente tem pelo menos cerca de duas vezes, mas um aumento menor pode ser útil, por exemplo, quando permite um regime de dosagem satisfatório ou evita um efeito tóxico. Em algumas modalidades, o aumento é pelo menos cerca de três vezes, pelo menos cerca de cinco vezes, pelo menos cerca de dez vezes, pelo menos cerca de quinze vezes, pelo menos cerca de vinte vezes, pelo menos cerca de vinte e cinco vezes, pelo menos cerca de trinta vezes, pelo menos cerca de quarenta vezes, ou pelo menos cerca de cinquenta vezes ou mais
[0125] O termo "meia-vida terapêutica modulada", tal como aqui utilizado, significa a mudança positiva ou negativa na meia-vida da quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD3 ou anticorpo anti-CD3 compreendendo uma molécula biologicamente ativa modificada, em relação ao seu não -forma modificada. A meia-vida terapêutica é medida medindo as propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas da molécula em vários momentos após a administração. O aumento da meia-vida terapêutica desejavelmente permite um regime de dosagem benéfico particular, uma dose total benéfica particular, ou evita um efeito indesejado. Em algumas modalidades, o aumento da meia-vida terapêutica resulta do aumento da potência, aumento ou diminuição da ligação da molécula modificada ao seu alvo, ou aumento ou diminuição de outro parâmetro ou mecanismo de ação da molécula não modificada.
[0126] O termo "isolado", quando aplicado a um ácido nucleico ou proteína, denota que o ácido nucleico ou proteína está substancialmente livre de outros componentes celulares com os quais está associado no estado natural. Pode estar em um estado homogêneo. As substâncias isoladas podem estar em um estado seco ou semisseco, ou em solução, incluindo, mas não se limitando a, uma solução aquosa.
Pureza e homogeneidade são normalmente determinadas usando técnicas de química analítica, como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada. Em particular, um gene isolado é separado dos quadros de leitura abertos que flanqueiam o gene e codificam uma proteína diferente do gene de interesse. O termo "purificado" denota que um ácido nucleico ou proteína dá origem a substancialmente uma banda em um gel eletroforético. Particularmente, isso significa que o ácido nucleico ou a proteína é pelo menos 85% puro, pelo menos 90% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 99% ou mais puro.
[0127] O termo "ácido nucleico" refere-se a desoxirribonucleotídeos, desoxirribonucleosídeos, ribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros dos mesmos na forma de cadeia simples ou dupla. A menos que especificamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência e são metabolizados de uma maneira semelhante aos nucleotídeos de ocorrência natural. A menos que especificamente limitado de outra forma, o termo também se refere a análogos de oligonucleotídeos incluindo PNA (ácido peptidonucleico), análogos de DNA usados em tecnologia antisense (fosforotioatos, fosforamidatos e semelhantes). A menos que indicado de outra forma, uma sequência de ácido nucleico particular também abrange implicitamente suas variantes modificadas de forma conservativa (incluindo, mas não se limitando a, substituições de códons degenerados) e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada. Especificamente, as substituições degeneradas de códons podem ser alcançadas gerando sequências nas quais a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída com base mista e/ou resíduos de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081,191; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260 :2605-2608,1985; e Cassol et al., 1992; Rossolini et al.,
Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994).
[0128] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados indistintamente aqui para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Isto é, uma descrição dirigida a um polipeptídeo se aplica igualmente a uma descrição de um peptídeo e uma descrição de uma proteína e vice-versa. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos de ocorrência natural, bem como polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um aminoácido codificado de forma não natural. Tal como aqui utilizado, os termos abrangem cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento total ( isto é, antígenos), em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações peptídicas covalentes.
[0129] O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos de ocorrência natural e não natural, bem como análogos de aminoácidos e miméticos de aminoácidos que funcionam de maneira semelhante aos aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos codificados naturalmente são os 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e pirolisina e selenocisteína. Análogos de aminoácidos se referem a compostos que têm a mesma arcabouço química básica de um aminoácido de ocorrência natural, ou seja, um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, como homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Esses análogos têm grupos R modificados (tais como norleucina) ou esqueletos peptídicos modificados, mas retêm a mesma arcabouço química básica de um aminoácido de ocorrência natural.
[0130] Os aminoácidos podem ser referidos no presente documento por seus símbolos de três letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB. Os nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos por seus códigos de uma única letra comumente aceitos.
[0131] "Variantes modificadas de forma conservadora" se aplicam a sequências de aminoácidos e de ácido nucleico No que diz respeito a sequências de ácido nucleico particulares, "variantes modificadas de forma conservadora" refere-se aos ácidos nucleicos que codificam sequências de aminoácidos idênticas ou essencialmente idênticas, ou onde o ácido nucleico não codifica uma sequência de aminoácidos, a sequências essencialmente idênticas. Por causa da degenerescência do código genético, um grande número de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codificam qualquer proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Essas variações de ácido nucleico são "variações silenciosas", que são uma espécie de variações modificadas de forma conservadora. Cada sequência de ácido nucleico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve todas as variações silenciosas possíveis do ácido nucleico. Um versado na técnica reconhecerá que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, que normalmente é o único códon para metionina, e TGG, que normalmente é o único códon para triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo está implícita em cada sequência descrita.
[0132] Quanto às sequências de aminoácidos, um versado na técnica reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais a um ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo ou sequência de proteína que altera, adiciona ou deleta um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos no código sequência é uma "variante modificada conservativamente", em que a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substituição conservativa que fornecem aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica. Essas variantes modificadas de forma conservadora são adicionais e não excluem variantes polimórficas, homólogos interespécies e alelos da invenção.
[0133] Cada um dos oito grupos a seguir contém aminoácidos que são substituições conservadoras entre si: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M); ( consulte, por exemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (WH Freeman & Co.; 2ª edição (dezembro de 1993).
[0134] Os termos "idêntico" ou porcentagem de "identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais. As sequências são "substancialmente idênticas" se tiverem uma porcentagem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais ( ou seja, cerca de 60% de identidade, opcionalmente cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95% de identidade sobre uma região especificada), quando comparada e alinhada para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação, ou região designada como medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência ou por alinhamento manual e inspeção visual. Esta definição também se refere ao complemento de uma sequência de teste. A identidade pode existir ao longo de uma região que tem pelo menos cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou ao longo de uma região que tem 75-100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou, quando não especificado, ao longo de toda a sequência ou um polinucleotídeo ou polipeptídeo.
[0135] Para comparação de sequência, normalmente uma sequência atua como uma sequência de referência, à qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas da subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa do algoritmo da sequência são designados. Os parâmetros padrão do programa podem ser usados ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência então calcula a porcentagem de identidades de sequência para as sequências de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.
[0136] O termo "sujeito" conforme aqui utilizado, refere-se a um animal, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um ser humano, que é o objeto de tratamento, observação ou experimento.
[0137] O termo "quantidade eficaz", tal como aqui utilizado, refere-se à quantidade do polipeptídeo de aminoácido não natural (modificado) sendo administrado que irá aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas da doença, afecção ou distúrbio sendo tratado. As composições contendo o polipeptídeo de aminoácido não natural (modificado) aqui descrito podem ser administradas para tratamentos profiláticos, intensificadores e/ou terapêuticos.
[0138] Os termos "intensificar" ou "intensificar" significam aumentar ou prolongar a potência ou a duração de um efeito desejado. Assim, no que diz respeito ao aumento do efeito de agentes terapêuticos, o termo "intensificação" refere-se à capacidade de aumentar ou prolongar, seja em potência ou duração, o efeito de outros agentes terapêuticos em um sistema. Uma "quantidade eficaz de intensificação", tal como aqui utilizada, refere-se a uma quantidade adequada para aumentar o efeito de outro agente terapêutico em um sistema desejado. Quando usado em um paciente, as quantidades eficazes para este uso dependerão da gravidade e do curso da doença, distúrbio ou afecção, terapia anterior, estado de saúde do paciente e resposta aos medicamentos e do julgamento do médico assistente.
[0139] O termo "modificado", conforme usado no presente documento, refere-se à presença de uma modificação pós-tradução em um polipeptídeo. O termo da forma "(modificado)" significa que os polipeptídeos sendo discutidos são opcionalmente modificados, isto é, os polipeptídeos em discussão podem ser modificados ou não modificados.
[0140] O termo "modificado pós-tradução" e "modificado" refere-se a qualquer modificação de um aminoácido natural ou não natural que ocorre a tal aminoácido após ele ter sido incorporado em uma cadeia polipeptídica. O termo abrange, apenas a título de exemplo, modificações co-traducionais in vivo, modificações pós-tradução in vivo e modificações pós-tradução in vitro.
[0141] Em aplicações profiláticas ou terapêuticas, as composições contendo o polipeptídeo de aminoácido não natural (modificado) são administradas a um paciente que já sofre de uma doença, afecção ou distúrbio, em uma quantidade suficiente para curar ou pelo menos interromper parcialmente os sintomas da doença, desordem ou afecção. Tal quantidade é definida como uma "quantidade profilaticamente eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" e dependerá da gravidade e do curso da doença, distúrbio ou afecção, terapia anterior, estado de saúde do paciente e resposta aos medicamentos, e o julgamento do médico assistente. É considerado dentro da habilidade da técnica para alguém determinar tais quantidades terapeuticamente eficazes por experimentação de rotina ( por exemplo, um ensaio clínico de aumento de dose).
[0142] O termo "tratar" é usado para se referir a tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos.
[0143] Salvo indicação em contrário, são utilizados métodos convencionais de espectroscopia de massa, RMN, HPLC, química de proteínas, bioquímica, técnicas de DNA recombinante e farmacologia, dentro da perícia da técnica.
DESCRIÇÃO DETALHADA INTRODUÇÃO
[0144] Os inventores desenvolveram um anticorpo biespecífico compreendendo uma molécula ou agente biologicamente ativo na ausência ou presença de uma molécula de polímero solúvel em água. Em certas modalidades, a invenção fornece um anticorpo biespecífico compreendendo um anticorpo anti-CD3, fragmento ou variante compreendendo uma ou mais moléculas de folato na ausência ou presença de uma ou mais moléculas de PEG. A uma ou mais moléculas de PEG podem ser um PEG único ou duplo, por exemplo, um PEG 5K simples ou duplo, PEG 10K, PEG 20K ou superior. A uma ou mais moléculas de PEG podem ser lineares ou ramificadas. O anticorpo, fragmento ou variante anti-CD3 compreende um anticorpo Fab anti-CD3 que foi projetado para ter um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural, como, por exemplo, para-acetil-fenilalanina (pAF), em qualquer posição adequada na sequência de aminoácidos da cadeia pesada ou leve, incluindo, mas não se limitando a, na cadeia pesada nas posições 114, 115, 129 ou 160 (de acordo com a numeração de Kabat) e na cadeia leve nas posições 157, 172, 205 (de acordo com a numeração de Kabat), do Fab.
O anticorpo biespecífico pode compreender um Fab anti-CD3 que foi projetado para ter um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural, tais como, por exemplo, para- acetil-fenilalanina (pAF) no pesado (K129; numeração de Kabat) e cadeias leves (L157;
numeração de Kabat) do Fab. O anticorpo biespecífico pode consistir em um Fab anti- CD3 que foi projetado para ter um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural, como, por exemplo, para-acetil-fenilalanina (pAF) no pesado (K129; numeração de Kabat ) e cadeias leves (L157; numeração de Kabat) do Fab. Em algumas modalidades da invenção, uma ou mais moléculas de PEG podem ser conjugadas ou ligadas a uma ou mais moléculas de folato conjugadas a um ou mais aminoácidos não naturais, por exemplo, pAF, incorporados ao anticorpo anti-CD3 usando química oxima proprietária, resultando em, por exemplo, uma ou duas moléculas de PEG e/ou Folato conjugadas de forma estável ao Fab anti-CD3. A adição de uma ou mais moléculas de PEG, por exemplo 5K, 10K ou 20K PEG, fornece melhorias significativas nas propriedades farmacocinéticas do anticorpo biespecífico, enquanto mantém a citotoxicidade específica contra células que expressam FOLR1 tanto in vitro quanto in vivo. Observou-se que macrófagos pró- tumorigênicos (M2) e células MDSCs eram preferencialmente esgotados com as composições de Fab-Folato anti-CD3 PEGuiladas aqui reveladas. Os resultados sugerem que as propriedades farmacocinéticas melhoradas exigirão dosagem menos frequente e podem evitar a administração usando uma bomba de infusão. Conforme usado no presente documento, os termos "PEG-Folato" ou "Folato-PEG" e "BiPEG-BiFolato" ou "BiFolato-BiPEG" são usados indistintamente.
[0145] Anticorpos, fragmentos de anticorpos e variantes dos mesmos
[0146] O anticorpo ou fragmentos de anticorpo ou variantes da invenção podem ser humanos, humanizados, projetados, não humanos e/ou anticorpos quiméricos ou fragmentos de anticorpos. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante aqui fornecido pode compreender duas ou mais sequências de aminoácidos. Uma primeira sequência de aminoácidos pode compreender uma primeira cadeia de anticorpo e uma segunda sequência de aminoácidos pode compreender uma segunda cadeia de anticorpo. Uma primeira cadeia de anticorpo pode compreender uma primeira sequência de aminoácidos e uma segunda cadeia de anticorpo pode compreender uma segunda sequência de aminoácidos. Uma cadeia de um anticorpo pode referir-se a uma cadeia pesada de anticorpo, uma cadeia leve de anticorpo ou uma combinação de uma região ou toda uma cadeia pesada de anticorpo e uma região ou toda uma cadeia leve de anticorpo. Como um exemplo não limitativo, um anticorpo fornecido aqui compreende uma cadeia pesada ou fragmento ou variante do mesmo, e uma cadeia leve ou fragmento ou variante do mesmo. Duas sequências de aminoácidos de um anticorpo, incluindo duas cadeias de anticorpo, podem ser conectadas por uma ou mais ligações dissulfeto, um ligante químico, um ligante peptídico ou uma combinação dos mesmos. Um ligante químico inclui um ligante por meio de um aminoácido não natural. Um ligante químico inclui um ligante por meio de um ou mais aminoácidos não naturais. Um ligante químico pode incluir um conjugado químico. Um ligante de peptídeo inclui qualquer sequência de aminoácidos que une as duas sequências de aminoácidos. O ligante de peptídeo pode compreender 1 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais, 40 ou mais, 45 ou mais, 50 ou mais, 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais, 95 ou mais, 100 ou mais aminoácidos. O ligante peptídico pode ser uma porção de qualquer anticorpo, incluindo um domínio de um anticorpo, como um domínio variável, CH1, CH2, CH3 e/ou domínio CL. Em algumas modalidades, uma cadeia pesada e uma leve são conectadas, por exemplo, por meio de um ligante peptídico. Em alguns casos, uma cadeia pesada e uma cadeia leve são conectadas, por exemplo, por uma ou mais ligações dissulfeto.
[0147] Anticorpos, fragmentos de anticorpos e variantes de anticorpos da revelação da invenção podem interagir ou se envolver com um antígeno em uma célula efetora. A célula efetora pode incluir, mas não está limitada a, uma célula imune, uma célula geneticamente modificada com aumento ou diminuição da atividade citotóxica, uma célula envolvida no mecanismo de defesa do hospedeiro, uma célula anti- inflamatória, um leucócito, um linfócito, um macrófago, um eritrócito, um trombócito, um neutrófilo, um monócito, um eosinófilo, um basófilo, um mastócito, uma célula NK, uma célula B ou uma célula T. Em algumas modalidades, a célula imune pode ser uma célula T, como uma célula T citotóxica ou uma célula T assassina natural. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode interagir com um receptor em uma célula T, tal como, mas não se limitando a um receptor de célula T (TCR). O TCR pode compreender TCR alfa, TCR beta, TCR gama e/ou TCR delta ou TCR zeta. O anticorpo ou fragmentos de anticorpo da revelação podem se ligar a um receptor em um linfócito, célula dendrítica, célula B, macrófago, monócitos, neutrófilos e/ou células NK. O anticorpo ou fragmentos de anticorpo da revelação podem se ligar a um receptor de superfície celular. O anticorpo ou fragmentos de anticorpo da revelação podem se ligar a um receptor de folato. O anticorpo ou fragmentos de anticorpo da revelação podem ser conjugados a um antígeno de superfície de células T, por exemplo, mas não limitado a ácido 2- [3- (1,3- dicarboxipropil) -ureido] pentanodioico (DUPA) ou análogos ou derivados disso. Veja, por exemplo, Patente dos EUA nº 6.479.470; WO2017/136659 e WO2014/153164, cada um aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.
[0148] Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de anticorpos aqui revelados são anticorpos anti-CD3 ou fragmentos de anticorpos ou variantes dos mesmos. Em certas modalidades, os anticorpos anti-CD3 ou fragmentos de anticorpos ou variantes aqui revelados podem ser humanizados. Anticorpos anti-CD3 ou fragmentos de anticorpos ou variantes aqui revelados incluem, mas não estão limitados a, análogos de CD3, isoformas, miméticos, fragmentos ou híbridos. Os anticorpos anti-CD3 ou fragmentos de anticorpos ou variantes da presente invenção incluem, mas não estão limitados a Fv, Fc, Fab e (Fab ') 2, Fv de cadeia única (scFv), diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos híbridos bifuncionais, CDR1, CDR2, CDR3, combinações de CDRs, regiões variáveis, regiões estruturais, regiões constantes, cadeias pesadas, cadeias leves, moléculas de não anticorpos de arcabouço alternativo, anticorpos biespecíficos e semelhantes. Os anticorpos anti-CD3 ou fragmentos de anticorpos ou variantes da presente invenção compreendem uma sequência de SEQ. ID NOs: 1 a 62.
Os anticorpos, fragmentos ou variantes da presente invenção podem ser um anticorpo, fragmento ou variante Fab anti-CD3. Os anticorpos, fragmentos ou variantes da presente invenção podem compreender um ou mais Fabs anti-CD3. Os anticorpos, fragmentos ou variantes da presente invenção podem compreender dois Fabs anti-CD3. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada e/ou cadeia leve selecionada a partir de uma sequência de SEQ. ID NOs: 1 a 62. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD3 consiste em uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada e/ou de cadeia leve selecionada a partir de uma sequência de SEQ. ID NOs: 1 a 62. Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de qualquer um dos SEQ.
ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57; e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de qualquer um dos SEQ. ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62.
[0149] Anticorpos biespecíficos anti-CD3 compreendendo aminoácidos não naturais também são revelados aqui. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-CD3 ou fragmentos de anticorpo ou variantes incluem, mas não estão limitados a Fv, Fc, Fab e (Fab ') 2, Fv de cadeia única (scFv), diacorpos, triacorpos, tetracorpos, anticorpos híbridos bifuncionais, CDR1, CDR2, CDR3, combinações de CDRs, regiões variáveis, regiões estruturais, regiões constantes, cadeias pesadas, cadeias leves, moléculas de não anticorpos de andaime alternativo, anticorpos biespecíficos e semelhantes. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-CD3 ou fragmentos de anticorpo ou variantes é um anticorpo biespecífico anti-CD3 Fab, fragmento ou variante compreendendo um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural. Os anticorpos biespecíficos anti-CD3 Fab ou fragmentos de anticorpos ou variantes da presente invenção podem compreender uma ou mais sequências de SEQ. ID NOs: 1 a
62. Os anticorpos biespecíficos, fragmentos ou variantes da presente invenção podem ser um anticorpo Fab anti-CD3, fragmento ou variante. O anticorpo biespecífico anti-CD3 pode compreender uma sequência de aminoácidos da cadeia pesada e/ou da cadeia leve selecionada a partir de uma sequência de SEQ. ID NOs: 1 a 62. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 consiste em uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada e/ou cadeia leve selecionada a partir de uma sequência de SEQ. ID NOs: 1 a 62. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico anti-CD3 compreende uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada de qualquer um dos SEQ. ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57; e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve de qualquer um dos SEQ. ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico, fragmentos ou variantes revelados aqui se ligam especificamente a CD3. O anticorpo biespecífico, fragmentos ou variantes podem ser reativos entre espécies. O anticorpo biespecífico, fragmentos ou variantes podem ser espécies reativas cruzadas com antígenos humanos e de macaco. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende um CDR reativo entre espécies. O anticorpo biespecífico pode ser um anticorpo humanizado.
Tabela 1: Novas sequências de aminoácidos de variantes anti-CD3 humanizadas com e sem extensão HC-DKTHT com a localização da incorporação do aminoácido não natural pAF sublinhada nas cadeias pesadas e leves. Também são reveladas todas as sequências na tabela abaixo, em que pAF é substituído por qualquer outro aminoácido não natural SEQ. ID CORRENTE Sequência NO -
NÃO 1 HC (vH1.2 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1) APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI
LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 2 HC (vH1.1 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1) APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN
SLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 3 HC (vH1.0 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1) APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN
SLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 4 HC (vH1.2 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1- APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI DKTHT) LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 5 HC (vH1.1 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1- APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN DKTHT) SLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 6 HC (vH1.0 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ
CH1- APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN DKTHT) SLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 7 LC (vL1.2 + QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ CL) QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 8 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL1.1 + CL) QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 9 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQ (vL1.0 + CL) QKPGQAPRTLIYGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 10 HC (vH1.2 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1- APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI HA114pAF) LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT LVTVSSpAFSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 11 HC (vH1.2 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1- APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI HS115pAF) LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT LVTVSSApAFTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 12 HC (vH1.2 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1- APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI HK129pAF) LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 13 HC (vH1.2 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1- APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI HT160pAF) LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALpAFSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 14 HC (vH1.2 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1- APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI HA114pAF + LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT DKTHT) LVTVSSpAFSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 15 HC (vH1.2 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1- APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI HS115pAF + LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT DKTHT) LVTVSSApAFTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 16 HC (vH1.2 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1- APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI HK129pAF- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT DKTHT) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 17 HC (vH1.2 + EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ CH1- APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI HT160pAF + LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT DKTHT) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALpAFSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 18 LC (vL1.2 + QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ CL- QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSG LL157pAF) AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNApA
FQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 19 LC (vL1.2 + QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ CL- QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSG LK172pAF) AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV
FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSpAFDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 20 LC (vL1.2 + QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ CL- QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSG LS205pAF) AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV
FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLpAFSPVTKSFNRGEC 21 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.3 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGT DKTHT) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE
PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 22 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.2 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT DKTHT) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE
PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 23 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.1 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT DKTHT) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE
PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 24 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.4 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ DKTHT) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 25 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.5 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ DKTHT) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 26 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.6 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ DKTHT) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF
PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 27 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVRQ (vH3.1 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT DKTHT) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE
PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 28 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ
(vH3.2 + APGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT DKTHT) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE
PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 29 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVRQ (vH3.3 + APGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT DKTHT) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE
PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 30 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.3 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1) LYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGT
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 31 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.2 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1) LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 32 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.1 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1) LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 33 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.4 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1) SLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 34 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.5 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1) SLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 35 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.6 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1) SLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPS
SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 36 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVRQ (vH3.1 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1) LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 37 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH3.2 + APGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1) LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 38 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVRQ (vH3.3 + APGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1) LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT
LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS
LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 39 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL2.3 + CL) QKPGQAPRGLIYGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 40 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.3 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGT HK129pAF- LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF DKTHT) STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHT 41 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.2 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT HK129pAF- LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF DKTHT) STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHT 42 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH1.0 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ
HK129pAF- GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF DKTHT) STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHT 43 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.1 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT HK129pAF- LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF DKTHT) STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHT 44 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.4 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ HK129pAF- GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF DKTHT) STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHT 45 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.5 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ HK129pAF- GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF DKTHT) STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHT 46 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.6 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ HK129pAF- GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF DKTHT) STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHT 47 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVRQ (vH3.1 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT HK129pAF- LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF DKTHT) STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHT 48 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH3.2 + APGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT HK129pAF- LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF DKTHT) STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSCDKTHT 49 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.3 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGT HK129pAF) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSC 50 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.2 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT HK129pAF) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSC 51 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH1.0 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ HK129pAF) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSC 52 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.1 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT HK129pAF) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSC 53 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.4 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ HK129pAF) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSC 54 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH2.5 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ HK129pAF) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSC
55 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQ (vH2.6 + APGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKN CH1- SLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ HK129pAF) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSC 56 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVRQ (vH3.1 + APGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT HK129pAF) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSC 57 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQ (vH3.2 + APGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNI CH1- LYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGT HK129pAF) LVTVSSASTKGPSVFPLAPSS pAF
STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK
VEPKSC 58 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL2.4 + CL) QKPGQAPRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 59 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQ (VL2.1 + CL) QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 60 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQ (vL2.5 + CL) QKPGQAPRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 61 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL2.2 + CL) QKPGQAPRTLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 62 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL3.1 + CL) QKPGQAPRGLIGGTNNRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC Aminoácidos não naturais
[0150] A presente invenção fornece anticorpos anti-CD3, fragmentos de anticorpos ou variantes compreendendo pelo menos um aminoácido codificado de forma não natural. A introdução de pelo menos um aminoácido codificado de forma não natural em um anticorpo anti-CD3 pode permitir a aplicação de químicas de conjugação que envolvem reações químicas específicas com um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural, embora não reaja com os 20 aminoácidos de ocorrência comum.
[0151] Em algumas modalidades aqui reveladas, estão os anticorpos anti-CD3 compreendendo um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural. O um ou mais aminoácidos não naturais podem ser codificados por um códon que não codifica um dos vinte aminoácidos naturais. O um ou mais aminoácidos não naturais podem ser codificados por um códon sem sentido (códon de parada). O códon de parada pode ser um códon âmbar. O códon âmbar pode compreender uma sequência UAG. O códon de terminação pode ser um códon ocre. O códon ocre pode compreender uma sequência UAA. O códon de parada pode ser um códon opala ou umber. O códon opala ou umber pode compreender uma sequência UGA. O um ou mais aminoácidos não naturais podem ser codificados por um códon de quatro bases.
[0152] O um ou mais aminoácidos não naturais podem incluir, mas não estão limitados a, p-azidofenilalanina (pAz), p-benzoilfenilalanina (pBpF), p- propargiloxifenilalanina (pPrF), p-iodofenilalanina (pIF), p-cianofenilalanina ( pCNF), p- carboxilmetilfenilalanina (pCmF), 3-(2-naftil) alanina (NapA), p-boronofenilalanina (pBoF),
o-nitrofenilalanina (oNiF), (8-hidroxiquinolina-3-il) alanina (HQA), e (2,2'-bipiridin-5-il)
alanina (BipyA). Os um ou mais aminoácidos não naturais podem ser β-aminoácidos (β3 e β2), homo-aminoácidos, derivados de prolina e ácido pirúvico, derivados de alanina 3-
substituídos, derivados de glicina, fenilalanina substituída por anel e derivados de tirosina, lineares aminoácidos centrais, diaminoácidos, D-aminoácidos, N-metil aminoácidos ou uma combinação dos mesmos.
Os aminoácidos não naturais também podem incluir, mas não estão limitados a, 1) vários análogos de tirosina e fenilalanina substituídos, tais como O-metil-L-tirosina, p-amino-L-fenilalanina, 3-nitro-L-tirosina, p - nitro-L-fenilalanina, m-metoxi-L-fenilalanina e p-isopropil-L-fenilalanina; 2) aminoácidos com grupos aril azida e benzofenona que podem ser foto-reticulados; 3) aminoácidos que têm reatividade química única, incluindo acetil-L-fenilalanina e m-acetil-L-fenilalanina, O- alil-L-tirosina, O- (2-propinil) -L-tirosina, p-etiltiocarbonil-L- fenilalanina e p- (3-
oxobutanoil) -L-fenilalanina; 4) aminoácidos contendo átomos pesados para a progressão na cristalografia de raios-X incluindo p-iodo e p-bromo-L-fenilalanina; 5) o aminoácido redox-ativo di-hidroxi-L-fenilalanina; 6) aminoácidos glicosilados incluindo bN-
acetilglucosamina-O-serina e aN-acetilgalactosamina-O-treonina; 7) aminoácidos fluorescentes com cadeias laterais naftil, dansil e 7-aminocumarina; 8) aminoácidos fotocliváveis e fotoisomerizáveis com cadeias laterais de azobenzeno e nitrobenzil Cys,
Ser e Tyr; 9) o mimético de fosfotirosina p-carboximetil-L-fenilalanina; 10) o homoglutamina glutamina; e 11) ácido 2-aminooctanóico.
Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é N -acetilglucosaminil-L-serina, N -acetilglucosaminil-L-treonina e O-fosfotirosina.
Em algumas modalidades, os aminoácidos não naturais compreendem uma porção química de sacarídeo.
Exemplos de tais aminoácidos incluem N -acetil-L- glucosaminil-L-serina, N -acetil-L-galactosaminil-L-serina, N -acetil-L-glucosaminil-L-
treonina, N -acetil-L-glucosaminil- L-asparagina e O -manosaminil-L-serina.
Exemplos de tais aminoácidos também incluem exemplos em que a ligação N- ou O- de ocorrência natural entre o aminoácido e o sacarídeo é substituída por uma ligação covalente não comumente encontrada na natureza - incluindo, mas não se limitando a, um alceno, uma oxima, um tioéter, uma amida e semelhantes. Exemplos de tais aminoácidos também incluem sacarídeos que não são comumente encontrados em proteínas de ocorrência natural, como 2-desoxi-glicose, 2-desoxigalactose e semelhantes. Exemplos específicos de aminoácidos não naturais incluem, mas não estão limitados a, uma p -acetil-L- fenilalanina, uma p- propargiloxifenilalanina, O-metil-L-tirosina, uma L-3- (2-naftil) alanina, uma 3-metil-fenilalanina, uma O-4-alil-L-tirosina, uma 4-propil-L-tirosina, um tri-O-acetil- GlcNAc -serina, uma L-Dopa, uma fenilalanina fluorada, uma isopropil-L-fenilalanina, uma p -azido-L-fenilalanina, uma p -acil-L-fenilalanina, uma p -benzoil-L-fenilalanina, uma L-fosfoserina, uma fosfonoserina, uma fosfonotirosina, uma p -iodo-fenilalanina, uma p- bromofenilalanina, uma p -amino-L-fenilalanina e uma isopropil-L-fenilalanina e semelhantes. Aminoácidos não naturais adicionais são revelados em Liu et al., Annu Rev Biochem, 79:413-44, 2010; Wang et al., Angew Chem Int Ed, 44:34-66, 2005; e Nºs de aplicativos internacionais: PCT/US2012/039472, PCT/US2012/039468, PCT/US2007/088009, PCT/US2009/058668, PCT/US2007/089142, PCT/US2007/088011, PCT/US2007/001485, PCT/US2006/049397, PCT/US2006/047822 e PCT/US2006/044682, cada um dos quais é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, o um ou mais aminoácidos não naturais podem ser p-acetilfenilalanina (pAF).
[0153] Em certas modalidades da invenção, um anticorpo anti-CD3 com pelo menos um aminoácido não natural inclui pelo menos uma modificação pós-tradução. Em uma modalidade, a pelo menos uma modificação pós-tradução compreende a ligação de uma molécula incluindo, mas não se limitando a, um polímero solúvel em água, um derivado de polietilenoglicol, uma droga, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou análogo de polipeptídeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um agente biologicamente ativo, uma pequena molécula ou qualquer combinação dos acima ou qualquer outro composto ou substância desejável, compreendendo um segundo grupo reativo a pelo menos um aminoácido não natural compreendendo um primeiro grupo reativo utilizando metodologia química que é conhecido por um especialista na técnica como sendo adequado para os grupos reativos particulares Por exemplo, o primeiro grupo reativo é uma porção química de alquinil (incluindo, mas não se limitando a, o aminoácido não natural p- propargiloxifenilalanina, onde o grupo propargil também é algumas vezes referido como uma porção química de acetileno) e o segundo grupo reativo é um porção química de azido e metodologias de química de cicloadição [3 + 2] são utilizadas. Em outro exemplo, o primeiro grupo reativo é a porção química azido (incluindo, mas não se limitando a, o aminoácido não natural p -azido-L-fenilalanina) e o segundo grupo reativo é a porção química alquinil. Em certas modalidades do polipeptídeo de anticorpo anti-CD3 modificado da presente invenção, pelo menos um aminoácido não natural (incluindo, mas não se limitando a, aminoácido não natural contendo um grupo ceto funcional), compreendendo pelo menos um pós-tradução a modificação é usada onde pelo menos uma modificação pós-tradução compreende uma porção química de sacarídeo. Em certas modalidades, a modificação pós-tradução é feita in vivo em uma célula eucariótica ou em uma célula não eucariótica. Em outras modalidades, a modificação pós-tradução é feita in vitro. Em outra modalidade, a modificação pós-tradução é feita in vitro e in vivo.
[0154] Em algumas modalidades, o aminoácido não natural pode ser modificado para incorporar um grupo químico. Em algumas modalidades, o aminoácido não natural pode ser modificado para incorporar um grupo cetona. O um ou mais aminoácidos não naturais podem compreender pelo menos um grupo oxima, carbonila, dicarbonila, hidroxilamina ou uma combinação dos mesmos. O um ou mais aminoácidos não naturais podem compreender pelo menos uma carbonila, dicarbonila, alcoxiamina, hidrazina, alqueno acíclico, alquino acíclico, ciclooctila, aril/alquil azida, norborneno, ciclopropeno, trans-cicloocteno ou tetrazina ou grupo funcional ou uma combinação dos mesmos.
[0155] Em algumas modalidades aqui reveladas, o aminoácido não natural é especificamente incorporado no local do anticorpo, fragmento de anticorpo ou variante.
Em algumas modalidades, o aminoácido não natural é especificamente incorporado em um anticorpo anti-CD3, fragmento de anticorpo ou variante. Métodos para incorporar um aminoácido não natural em uma molécula, por exemplo, proteínas, polipeptídeos ou peptídeos, são revelados nas Patentes sob no U.S...: 7.332.571; 7.928.163; 7.696.312;
8.008.456; 8.048.988; 8.809.511; 8.859.802; 8.791.231; 8.476.411; ou 9.637.411, ( cada um dos quais é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade), e nos Exemplos aqui. O um ou mais aminoácidos não naturais podem ser incorporados por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, sistemas com base em células ou livres de células podem ser usados, e cepas auxotróficas também podem ser usadas no lugar de tRNA e sintetase projetados. Em certas modalidades, a sintetase de tRNA ortogonal é usada conforme revelado, por exemplo, em PCT/US2002/012465; PCT/US2002/012635; PCT/US2003/032576; PCT/US2005/044041; PCT/US2005/043603; PCT/US2005/046618, cada um aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. A incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais no anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante pode compreender a modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos no anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante. A modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos no anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante pode compreender a mutação de um ou mais nucleotídeos na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante. A mutação de um ou mais nucleotídeos na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante pode compreender a alteração de um códon que codifica um aminoácido para um códon sem sentido. Incorporar um ou mais aminoácidos não naturais no anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante pode compreender modificar um ou mais resíduos de aminoácidos no anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante para produzir um ou mais códons âmbar no anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante.
O um ou mais aminoácidos não naturais podem ser incorporados no anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante em resposta a um códon âmbar. O um ou mais aminoácidos não naturais podem ser especificamente incorporados no anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante. A incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais no anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante pode compreender um ou mais aminoácidos não naturais codificados geneticamente com reatividade química ortogonal em relação aos vinte aminoácidos canônicos para modificar especificamente o local da molécula biologicamente ativa ou agente de direcionamento. A incorporação de um ou mais aminoácidos não naturais pode compreender o uso de um par de tRNA/aminoacil-tRNA sintetase para incorporar especificamente um ou mais aminoácidos não naturais em locais definidos na molécula biologicamente ativa ou agente de direcionamento em resposta a um ou mais códon sem sentido âmbar. Métodos adicionais para incorporar aminoácidos não naturais incluem, mas não estão limitados a, métodos revelados em Chatterjee et al., A Versatile Platform for Single- and Multiple- Unnatural Amino Acid Mutagenesis in Escherichia coli, Biochemistry, 2013; Kazane et al., J Am Chem Soc, 135 (1):340-6, 2013; Kim et al., J Am Chem Soc, 134 (24):9918-21, 2012; Johnson et al., Nat Chem Biol, 7 (11):779-86, 2011; e Hutchins et al., J Mol Biol, 406 (4):595-603, 2011. O um ou mais aminoácidos não naturais podem ser produzidos através da reação seletiva de um ou mais aminoácidos naturais. A reação seletiva pode ser mediada por uma ou mais enzimas. Em exemplos não limitativos, a reação seletiva de uma ou mais cisteínas com a enzima geradora de formilglicina (FGE) pode produzir uma ou mais formilglicinas conforme descrito em Rabuka et al., Nature Protocols 7: 1052, -1067, 2012). O um ou mais aminoácidos não naturais podem envolver uma reação química para formar um ligante. A reação química para formar o ligante pode incluir uma reação bioortogonal. A reação química para formar o ligante pode incluir química de clique. Ver, por exemplo, o documento WO2006/050262 aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.
MOLÉCULAS/AGENTES BIOLOGICAMENTE ATIVOS
[0156] São revelados aqui anticorpos anti-CD3 ou fragmentos de anticorpos ou suas variantes compreendendo uma molécula biologicamente ativa ligada ao anticorpo ou fragmento ou variante por meio de um aminoácido não natural. Moléculas biologicamente ativas incluem, mas não estão limitadas a uma pequena molécula ou agente, um composto não peptídico, uma droga, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou polipeptídeo análogo ou derivado, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante, um segundo agente biologicamente ativo, um agente de direcionamento, ou qualquer combinação dos acima ou qualquer outro composto ou substância desejável. Em algumas modalidades, o agente biologicamente ativo está envolvido no recrutamento de células T citotóxicas para uma célula, incluindo, mas não se limitando a um câncer ou célula tumoral. Em algumas modalidades, a molécula biologicamente ativa é uma molécula pequena, tal como, mas não limitada a, ácido fólico ou um derivado ou análogo do mesmo ou ácido 2- [3- (1,3-dicarboxipropia) ureidol] pentanodioico (DUPA) ou um derivado ou análogo deste. Em algumas modalidades, a molécula biologicamente ativa é folato ou um derivado ou análogo do mesmo. A molécula biologicamente ativa pode ser selecionada a partir de uma molécula de alvo celular, um ligante, uma proteína, um peptídeo, um peptóide, um aptâmero de DNA, um ácido nucleico de peptídeo, uma vitamina, um substrato ou um análogo de substrato, um receptor de colecistocinina B, um receptor de hormônio liberador de gonadotropina, um receptor de somatostatina 2, uma integrina avb3, um receptor de peptídeo liberador de gastrina, um receptor de neurocinina 1, um receptor de melanocortina 1, um receptor de neurotensina, receptor de neuropeptídeo Y e molécula semelhante a lectina tipo C 1, a receptor, um co-receptor, uma proteína transmembranar ou um marcador celular ou proteína da superfície celular. A molécula biologicamente ativa pode se ligar a uma célula alvo. A molécula biologicamente ativa pode ligar uma proteína da superfície celular ou um marcador da superfície celular ou uma molécula da superfície celular em uma célula. A molécula biologicamente ativa pode se ligar a uma molécula de superfície celular em uma célula, incluindo, mas limitada a, um câncer ou célula tumoral ou célula imunossupressora. A molécula da superfície celular pode ser uma molécula receptora de folato. A molécula biologicamente ativa pode ser um agente que se liga ao antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), tal como, mas não limitado a, DUPA ou um análogo ou derivado deste. A molécula ou agente biologicamente ativo pode se ligar a uma célula superexpressando ou expressando altamente um marcador de superfície celular, proteína ou receptor.
[0157] Em algumas modalidades, a molécula biologicamente ativa pode ser um folato ou ligante de folato ou análogo ou derivado do mesmo. A molécula biologicamente ativa pode se ligar a uma proteína receptora de folato (FR). Essa molécula biologicamente ativa pode ser ácido N- (4 - {[(2-amino-4-oxo-1,4-dihidropteridin-6-il) metil] amino} benzoil) -L-glutâmico (ácido fólico), ou um análogo ou derivado deste. Um análogo deste pode ser uma porção que é baseada em ácido fólico e preserva a ligação FR. O análogo do ácido fólico pode preservar uma porção significativa da arcabouço do ácido fólico. Além disso, o análogo de ácido fólico pode ser uma forma ligeiramente modificada de ácido fólico devido à sua conjugação com um ligante ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante. Por exemplo, o análogo de ácido fólico pode ser ligeiramente modificado devido à conjugação de um grupo carboxil folato ao ligante ou anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante. Além disso, o ácido fólico pode ser ligeiramente modificado por causa de sua conjugação com um ligante ou um anticorpo ou fragmento de anticorpo, mas mantém suas propriedades de ligação a FR. Em algumas modalidades, a molécula de folato tem como alvo o receptor alfa de folato. Em algumas modalidades, a molécula de folato tem como alvo o receptor beta de folato. Em algumas modalidades, ácido fólico ou folato é usado como uma molécula biologicamente ativa ou agente de direcionamento para se ligar ao antígeno receptor de folato (FR), que é superexpresso ou altamente expresso em linhas celulares FR +. Em algumas modalidades, a célula é uma célula cancerosa ou uma célula imunossupressora, mas não está limitada a tal.
[0158] A molécula ou agente biologicamente ativo pode ser ligado especificamente a um local por um ou mais ligantes a um ou mais aminoácidos não naturais do anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante. O ligante pode ser um ligante químico, um ligante peptídico ou uma combinação dos mesmos. Um ligante químico inclui um ligante por meio de um aminoácido não natural. Um ligante químico inclui um ligante por meio de um ou mais aminoácidos não naturais. Um ligante químico pode incluir um conjugado químico. Um ligante de peptídeo inclui qualquer sequência de aminoácidos que une as duas sequências de aminoácidos. O ligante de peptídeo pode compreender 1 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 15 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 30 ou mais, 35 ou mais, 40 ou mais, 45 ou mais, 50 ou mais, 55 ou mais, 60 ou mais, 65 ou mais, 70 ou mais, 75 ou mais, 80 ou mais, 85 ou mais, 90 ou mais, 95 ou mais, 100 ou mais aminoácidos. O ligante peptídico pode ser uma porção de qualquer anticorpo, incluindo um domínio de um anticorpo, como um domínio variável, CH1, CH2, CH3 e/ou domínio CL. O anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante pode ser conjugado a uma molécula biologicamente ativa. O anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante pode ser conjugado a uma molécula biologicamente ativa por meio de um ligante químico e/ou peptídico. Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo anti-CD3 ou fragmentos de anticorpo ou variante conjugado com uma ou mais moléculas ou agentes biologicamente ativos. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas ou agentes biologicamente ativos são uma ou mais moléculas pequenas. Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 ou fragmentos de anticorpo ou variante conjugado com uma ou mais moléculas pequenas. Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 ou fragmentos de anticorpo ou variante conjugado a uma ou mais moléculas de folato. Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo Fab anti-CD3 ou fragmentos de anticorpo ou variante conjugado com uma ou mais moléculas de DUPA. Em algumas modalidades, uma ou mais moléculas de folato e/ou uma ou mais moléculas de DUPA podem ser conjugadas a um anticorpo Fab anti- CD por meio de um ligante químico e/ou peptídico. LIGANTES/AGLUTINANTES/CONJUGADOS
[0159] Um anticorpo anti-CD3 ou um polipeptídeo de ligação de antígeno e uma pequena molécula podem ser unidos por um ligante, polímero ou ligação covalente. O ligante, polímero ou pequena molécula em si pode compreender um grupo funcional que não é reativo para os 20 aminoácidos comuns. O ligante ou polímero pode ser um ligante bifuncional ou polímero. O ligante bifuncional ou polímero é um ligante ramificado ou polímero. Uma ou mais ligações envolvidas na união de um anticorpo anti-CD3 ou um polipeptídeo de ligação de antígeno através do ligante, polímero ou ligação covalente à molécula biologicamente ativa podem ser irreversíveis, reversíveis ou instáveis nas afecções desejadas. Uma ou mais ligações envolvidas na união de um anticorpo anti- CD3 ou um polipeptídeo de ligação de antígeno através do ligante, polímero ou ligação covalente a uma molécula podem permitir a liberação modulada do polipeptídeo de ligação de antígeno ou outra molécula. Uma diversidade de moléculas pequenas pode ser gerada por um especialista na técnica por meios químicos, isolamento como produtos naturais ou outros meios.
[0160] São revelados aqui anticorpos anti-CD3 ou fragmentos de anticorpos ou variantes compreendendo um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente ligados a um ou mais polímeros solúveis em água, tais como molécula ou ligantes de polietilenoglicol (PEG). O anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo ou variante compreendendo o aminoácido codificado de forma não natural pode ser ligado a dois polímeros solúveis em água, tais como duas moléculas de polietilenoglicol (PEG) ou ligantes. O anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante compreendendo o aminoácido codificado de forma não natural e uma ou mais moléculas biologicamente ativas podem ser ligados a um ou mais polímeros solúveis em água, tais como molécula de polietilenoglicol (PEG) ou ligante. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou variante compreendendo o aminoácido codificado de forma não natural e duas moléculas biologicamente ativas está ligado a dois polímeros solúveis em água, tais como molécula de polietilenoglicol (PEG) ou ligante.
[0161] Os métodos podem compreender a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo a uma molécula biologicamente ativa, ou um polímero solúvel em água, ou um conjugado compreendendo uma molécula biologicamente ativa e um polímero solúvel em água. O método pode compreender a conjugação de um ou mais ligantes a uma molécula biologicamente ativa para produzir um intermediário de ligante de molécula biologicamente ativa e a conjugação do intermediário ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. O método pode compreender a conjugação de um ou mais ligantes a uma molécula de PEG para produzir um intermediário de ligante de PEG e a conjugação do intermediário de ligante de PEG ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. O método pode compreender a conjugação de um ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um intermediário anticorpo-ligante ou intermediário fragmento- ligante de anticorpo e conjugar o intermediário anticorpo-ligante ou intermediário anticorpo-fragmento-ligante a outra molécula biologicamente ativa, ou um polímero solúvel em água ou um conjugado compreendendo uma molécula biologicamente ativa e um polímero solúvel em água. Os métodos aqui revelados podem compreender a conjugação de um ou mais ligantes a um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpos, uma ou mais moléculas biologicamente ativas, ou combinações dos mesmos para produzir um ou mais intermediários, tais como um intermediário anticorpo-ligante, um intermediário fragmento-ligante de anticorpo e/ou um intermediário conjugado-ligante de anticorpo de molécula biologicamente ativa. Os métodos podem compreender a conjugação de um primeiro ligante a um anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um intermediário anticorpo-ligante ou intermediário fragmento-ligante de anticorpo. Os métodos podem compreender a conjugação de um ligante com uma molécula biologicamente ativa para produzir um intermediário de ligação-molécula biologicamente ativa.
[0162] O método de produção de um conjugado de anticorpo biespecífico anti- CD3 da invenção pode compreender (a) conjugar um primeiro ligante ao anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais incorporados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo (b) conjugando um segundo ligante para a molécula biologicamente ativa para produzir um intermediário molécula-ligante biologicamente ativo; e (c) ligar os dois intermediários para produzir o conjugado anticorpo anti-CD3-molécula biológica ativa; a molécula biologicamente ativa pode ser uma molécula pequena incluindo, mas não se limitando a, um folato ou uma molécula de
DUPA ou um análogo ou derivado do mesmo.
Em certas modalidades, o método de produção de um conjugado de anticorpo biespecífico anti-CD3 da invenção pode compreender (a) conjugar um primeiro ligante ao anticorpo ou fragmento de anticorpo compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais incorporados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um intermediário ligante de anticorpo ou intermediário ligante de fragmento de anticorpo; (b) conjugar um segundo ligante com a molécula biologicamente ativa para produzir um intermediário molécula-ligante biologicamente ativo; e (c) ligar os dois intermediários para produzir o conjugado anticorpo anti-CD3-molécula biológica ativa; a molécula biologicamente ativa pode ser uma molécula pequena incluindo, mas não se limitando a, um folato ou uma molécula de
DUPA ou um análogo ou derivado do mesmo.
O método de produção de um conjugado de folato-anticorpo Fab anti-CD3 biespecífico da invenção pode compreender (a)
conjugar um primeiro ligante com o anticorpo Fab anti-CD3 ou fragmento de anticorpo compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais incorporados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um intermediário ligante de anticorpo ou intermediário ligante de fragmento de anticorpo; (b) conjugar um segundo ligante com a molécula biologicamente ativa para produzir um intermediário molécula-ligante biologicamente ativo; e (c) ligar os dois intermediários entre si para produzir o conjugado anticorpo anti-CD3 Fab-molécula biológica ativa; a molécula biologicamente ativa compreendendo uma ou mais moléculas de folato ou DUPA ou análogos ou derivados; o ligante compreendendo um ou mais ligantes químicos e/ou peptídicos; o ligante compreendendo uma ou mais moléculas de PEG.
A uma ou mais moléculas de PEG é uma molécula de PEG linear ou ramificada. A uma ou mais moléculas de PEG ramificadas é um ligante bifuncional. A molécula de PEG tem um peso molecular médio de 5kDa, 10kDa, 20kDa, 30kDa 40kDa, 50kDa ou superior. A molécula de PEG tem um peso molecular médio de 5K, 10K ou 20K.
[0163] A conjugação de um ou mais ligantes com o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou molécula biologicamente ativa pode ocorrer simultaneamente. A conjugação de um ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo ou molécula biologicamente ativa pode ocorrer sequencialmente. A conjugação de um ou mais ligantes com o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou molécula biologicamente ativa pode ocorrer em um processo de etapa única, como uma conjugação enzimática, ou uma etapa química, ou processo ou reação. A conjugação de um ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo ou molécula biologicamente ativa pode ocorrer em um processo de duas etapas, como duas conjugações enzimáticas, ou duas etapas químicas, ou dois processos ou duas reações. A conjugação de um ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo ou molécula biologicamente ativa pode ocorrer em duas ou mais etapas de processos, tais como duas ou mais conjugações enzimáticas, ou etapas químicas, ou processos ou reações.
[0164] A conjugação de um intermediário com um anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou molécula biologicamente ativa, ou um polímero solúvel em água pode compreender química de oxima para formar uma ligação de oxima e/ou química de clique, como bem conhecido pelo versado na técnica. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender um ou mais aminoácidos não naturais. A ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo a um intermediário pode compreender a formação de uma oxima entre o aminoácido não natural e o intermediário de ligação. Conjugar um ligante a um anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou molécula biologicamente ativa ou molécula solúvel em água pode compreender uma ligação iônica, uma ligação covalente, uma ligação não covalente ou uma combinação das mesmas entre o ligante e o anticorpo ou fragmento de anticorpo, ou molécula biologicamente ativa ou molécula solúvel em água.
A conjugação de um ligante a um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou molécula biologicamente ativa ou molécula solúvel em água é conhecida na técnica. Ver, por exemplo, Roberts et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54:459-476 (2002).
[0165] A conjugação de um ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo e/ou molécula biologicamente ativa pode compreender a formação de uma ou mais oximas entre o ligante e o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou molécula biológica ativa. A conjugação de um ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo e/ou molécula biologicamente ativa pode compreender a formação de uma ou mais ligações estáveis entre o ligante e o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou molécula biologicamente ativa. A conjugação de um ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo e/ou molécula biologicamente ativa pode compreender a formação de uma ou mais ligações covalentes entre o ligante e o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou molécula biologicamente ativa. A conjugação de um ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo e/ou molécula biologicamente ativa pode compreender a formação de uma ou mais ligações não covalentes entre o ligante e o anticorpo, fragmento de anticorpo ou molécula biologicamente ativa. A conjugação de um ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo e/ou ligante pode compreender a formação de uma ou mais ligações iônicas entre o ligante e o anticorpo ou fragmento de anticorpo ou molécula biologicamente ativa.
[0166] A conjugação de um ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender a conjugação específica de um local ou mais ligantes ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. A conjugação específica do local pode compreender a ligação de um ou mais ligantes ao aminoácido não natural do anticorpo ou fragmento de anticorpo. A ligação de um ou mais ligantes ao aminoácido não natural do anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender a formação de uma oxima. A ligação de um ou mais ligantes ao aminoácido não natural do anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender a formação de um sulfeto. A ligação de um ou mais ligantes ao aminoácido não natural do anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender, a título de exemplo não limitativo, a reação de uma hidroxilamina de um ou mais ligantes com um aldeído ou cetona de um aminoácido. O aminoácido pode ser um aminoácido não natural. A ligação de um ou mais ligantes ao aminoácido não natural do anticorpo ou fragmento de anticorpo pode compreender, a título de exemplo não limitativo, a reação de um derivado de bromo de um ou mais ligantes com tiol de um aminoácido. O aminoácido pode ser um aminoácido não natural.
[0167] Um ou mais PEG ou ligantes podem compreender uma ponte dissulfeto que conecta dois resíduos de cisteína usando química de conjugação como é conhecido pelo especialista na técnica. (Veja também, por exemplo, tecnologia ThioBridge ™, Abzena). Duas ou mais moléculas de PEG ou ligantes podem compreender uma ponte maleimida que conecta dois resíduos de aminoácidos. Os dois aminoácidos podem estar no terminal C do anticorpo ou fragmento de anticorpo. Um ou mais ligantes podem compreender uma ponte maleimida que conecta dois resíduos de cisteína. Os dois resíduos de cisteína podem ser C-terminais do anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, um ou mais PEG podem ser uma conjugação de PEG C-terminal.
Em algumas modalidades, uma molécula de PEG C-terminal pode não envolver ligação dissulfeto covalente ou ligação entre o anticorpo de cadeia pesada e leve ou fragmentos de anticorpo. Em algumas modalidades, duas ou mais moléculas de PEG localizadas no terminal C podem ser ligadas covalentemente ou reticuladas entre as cadeias pesada e leve do anticorpo ou fragmento de anticorpo. Tais conjugados de PEG ou ligantes são aqui descritos.
[0168] Em algumas modalidades aqui reveladas estão ligantes de folato-PEG compreendendo um ou mais folato e uma ou mais moléculas de PEG. As uma ou mais moléculas de PEG podem ser de 5 kDa, 10 kDa, 15 kDa, 20 kDa ou mais. As moléculas de PEG abrangem polímeros lineares e ramificados e pesos moleculares médios entre 0,1 kDa e 100 kDa. Em algumas modalidades, a molécula de poli (etilenoglicol) ou um ligante tem um peso molecular entre cerca de 0,1 kDa e cerca de 100 kDa. Em algumas modalidades, a molécula de poli (etilenoglicol) ou um ligante tem um peso molecular entre 0,1 kDa e 50 kDa. Em algumas modalidades, a molécula de poli (etilenoglicol) ou um ligante é um polímero ramificado ou ligante. Em algumas modalidades, cada ramo do polímero ramificado de poli (etilenoglicol) ou ligante tem um peso molecular entre 1 kDa e 100 kDa, ou entre 1 kDa e 50 kDa. As moléculas de PEG são bem conhecidas na técnica, por exemplo, consulte o catálogo da Shearwater Corporation "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001).
[0169] Em certas modalidades aqui reveladas estão conjugados PEGuilados de Fab-Folato anti-CD3 compreendendo uma ou mais moléculas de PEG. Em certas modalidades aqui reveladas estão conjugados PEGuilados de Fab-Folato anti-CD3 compreendendo uma ou mais moléculas de PEG C-terminal. Em algumas modalidades, uma molécula de PEG C-terminal pode não envolver ligação dissulfeto covalente ou ligação entre o anticorpo de cadeia pesada e leve ou fragmentos de anticorpo. Em algumas modalidades, uma molécula de PEG C-terminal pode ser anexada separadamente à cadeia pesada e à cadeia leve do anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, duas ou mais moléculas de PEG C-terminal podem ser ligadas covalentemente ou reticuladas entre as cadeias pesada e leve do anticorpo ou fragmentos de anticorpo. Em algumas modalidades, duas ou mais moléculas de PEG podem ser ligadas covalentemente ou reticuladas por meio de uma ponte maleimida que conecta dois resíduos de cisteína.
[0170] A PEGilação pode ser usada para melhorar a farmacocinética e modular a citotoxicidade de uma composição. A PEGilação de uma proteína pode aumentar sua meia-vida sérica retardando a depuração renal, uma vez que a porção PEG adiciona um raio hidrodinâmico considerável à proteína. A ligação covalente do polímero hidrofílico poli (etilenoglicol), abreviado PEG, é um método para aumentar a solubilidade em água, a biodisponibilidade, aumentar a meia-vida sérica, aumentar a meia-vida terapêutica, modular a imunogenicidade, modular a atividade biológica ou estender o tempo de circulação de muitas moléculas biologicamente ativas, incluindo proteínas, peptídeos e moléculas particularmente hidrofóbicas. O PEG tem sido amplamente utilizado em produtos farmacêuticos, em implantes artificiais e em outras aplicações onde a biocompatibilidade, a falta de toxicidade e a falta de imunogenicidade são importantes. De preferência, a PEGuilação não altera, ou apenas altera minimamente, a atividade da molécula biologicamente ativa. De preferência, o aumento na meia-vida é maior do que qualquer diminuição na atividade biológica. Rader et al. em Proc Natl Acad Sci US A. 2003, 29 de abril; 100 (9):5396-400, que é incorporado a título de referência aqui, descreve um método para fornecer função efetora e meia-vida sérica estendida para pequenas moléculas sintéticas por meio de sua reação com um molécula de anticorpo genérico. O complexo descrito foi criado por uma ligação covalente reversível entre o mAb 38C2, um anticorpo catalítico que imita as enzimas aldolase naturais e um derivado de dicetona de uma integrina direcionada ao peptídeomimético Arg-Gly-Asp por meio de um resíduo de lisina reativo no anticorpo. Além de um aumento na meia-vida do peptídeomimético, o complexo mostrou redirecionamento seletivo do anticorpo para a superfície das células que expressam integrina α v  3 e α v  5.
[0171] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreendendo o aminoácido codificado de forma não natural está ligado a um polímero solúvel em água, tal como polietilenoglicol (PEG), através da cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreendendo o aminoácido codificado de forma não natural é ligado ao folato, onde a referida ligação é através da cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreendendo o aminoácido codificado de forma não natural está ligado a um derivado de folato através da cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreendendo o aminoácido codificado de forma não natural está ligado a um polímero solúvel em água, tal como polietilenoglicol (PEG), onde a referida ligação é através da cadeia lateral do aminoácido codificado de forma não natural. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreendendo o aminoácido codificado de forma não natural está ligado a um derivado de polímero solúvel em água, tal como um derivado de polietilenoglicol (PEG), em que o referido link é através da cadeia lateral do código de forma não natural codificado aminoácido. Em algumas modalidades, ligantes de polímero-folato solúveis em água são fornecidos, e o anticorpo anti-CD3 compreendendo pelo menos um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural está ligado ao folato e/ou ao polímero solúvel em água e/ou para o ligante através da cadeia lateral de um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural.
[0172] Em algumas modalidades, a porção química de folato é derivada da seguinte arcabouço, incluindo o arcabouço ilustrada nas Figuras 12A-12F:
.
[0173] Em algumas modalidades, o polímero solúvel em água é poli (etilenoglicol). Em algumas modalidades, o termo poli (etilenoglicol) inclui poli (etilenoglicol) em qualquer forma, incluindo poli (etilenoglicol) linear, poli (etilenoglicol) ramificado, poli (etilenoglicol) bifuncional, poli (etilenoglicol) com multimembros, poli (etilenoglicol) derivado e poli (etilenoglicol) bifurcado.
[0174] O peso molecular do poli (etilenoglicol) pode estar entre 1 kDa e 100 kDa. O peso molecular do poli (etilenoglicol) pode ser 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 kDa. O peso molecular do poli (etilenoglicol) pode estar entre cerca de 1 kDa e cerca de 25 kDa, ou entre cerca de 5 kDa e 20 kDa. O peso molecular do poli (etilenoglicol) pode ser cerca de 5 kDa, ou cerca de 10 kDa, ou cerca de 20 kDa. O peso molecular do poli (etilenoglicol) pode ser 5 kDa ou 10 kDa ou 20 kDa. O peso molecular do poli (etilenoglicol) pode ser 5 kDa.
[0175] Em algumas modalidades, o ligante de polímero-folato bifuncional solúvel em água tem a seguinte estrutura: Em que: A tem a estrutura de:
B é um grupo bivalente que conecta A e C; C e E são, cada um, independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em –alquileno–, - -alquileno-C (O) -, - (alquileno-O) n' -alquileno-, - (alquileno-O) n' -alquileno-C (O) -, - (alquileno-O) n' - (CH 2 ) n' –NHC (O) - (CH 2 ) n' –C (Me) 2 –S – S– (CH 2 ) n' – NHC (O) - (alquileno – O) n' –alquileno–, - (alquileno – O) n ' –alquileno – U – alquileno – C (O) -, e - (alquileno – O) n' –alquileno – U – alquileno–, onde n 'é independentemente um número inteiro maior ou igual a um; D é um grupo trivalente que conecta C, F e E; F é um polímero solúvel em água, como polietilenoglicol (PEG); e onde Y é selecionado a partir do grupo que consiste em uma hidroxilamina, metil, aldeído, aldeído protegido, cetona, cetona protegida, tioéster, éster, dicarbonil, hidrazina, amidina, imina, diamina, azida, ceto-amina, ceto-alcino, alcino, cicloalquino e ene-diona.
[0176] Em algumas modalidades, B é um resíduo de heterohidrocarbil bivalente substituído. Em algumas modalidades, os substituintes incluem um ou mais grupos funcionais carboxila, cetona e/ou amida. Em algumas modalidades, os heteroátomos são selecionados de N, O e S.
[0177] Em algumas modalidades, B tem a seguinte arcabouço:
[0178] Em algumas modalidades, D é um resíduo de heterohidrocarbila trivalente substituído. Em algumas modalidades, os substituintes incluem um ou mais grupos funcionais carboxila, cetona e/ou amida. Em algumas modalidades, os heteroátomos são selecionados de N, O e S.
[0179] Em algumas modalidades, D tem a seguinte arcabouço:
[0180] Em algumas modalidades, C e E são, cada um - (alquileno-O) n ' -alquileno- . Em algumas modalidades, cada alquileno é –CH 2 CH 2 -.
[0181] Em algumas modalidades, n 'é 1 a 20, ou 1 a 10, ou 1 a 5.
[0182] Em algumas modalidades, F tem o arcabouço: em que n está entre 2 e 10.000. Em algumas modalidades, n é escolhido de modo que o peso molecular do poli (etilenoglicol) (PEG) esteja entre 1 kDa e 100 kDa. Por exemplo, o peso molecular pode ser 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 ou 60 kDa.
Por exemplo, o peso molecular pode estar entre cerca de 1 kDa e cerca de 25 kDa, ou entre cerca de 5 kDa e 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular pode ser de cerca de 5 kDa, ou cerca de 10 kDa, ou cerca de 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular pode ser 5 kDa ou 10 kDa ou 20 kDa. Por exemplo, o peso molecular pode ser 5 kDa.
[0183] Em algumas modalidades, o ligante de polímero-folato bifuncional solúvel em água tem a seguinte arcabouço: .
[0184] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 compreendendo pelo menos um aminoácido codificado de forma não natural está ligado ao ligante de PEG- folato polimérico solúvel em água bifuncional e, consequentemente, tem a seguinte arcabouço: em que A, B, C, D, E e F são conforme definidos em qualquer uma das modalidades acima e Z é uma oxima ou ligação cíclica conectada por meio de um aminoácido não natural ao anticorpo anti-CD3.
[0185] Em algumas modalidades, Z tem o arcabouço de: Em que:
[0186] J é opcional, e quando presente é alquileno inferior, alquileno inferior substituído, cicloalquileno inferior, cicloalquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, alquinileno, heteroalquileno inferior, heteroalquileno substituído, heterocicloalquileno inferior, heterocicloalquileno inferior substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, heteroarileno substituído, alcarileno, alcarileno substituído, aralquileno ou aralquileno substituído;
[0187] G é opcional e, quando presente, é um ligante selecionado do grupo que consiste em alquileno inferior, alquileno inferior substituído, alquenileno inferior, alquenileno inferior substituído, heteroalquileno inferior, heteroalquileno inferior substituído, -O-,- O- (alquileno ou alquileno substituído) -, -S-,- S- (alquileno ou alquileno substituído) -, -S (O) k - em que k é 1, 2 ou 3, -S (O) k (alquileno ou alquileno substituído) -,- C (O) -,- C (O) - (alquileno ou alquileno substituído) -, -C (S) -,- C (S) - (alquileno ou alquileno substituído) -, -N (R ') -,- NR '- (alquileno ou alquileno substituído) -,- C (O) N (R ') -,- CON (R ') - (alquileno ou alquileno substituído) -, -CSN (R') -,- CSN (R ') - (alquileno ou alquileno substituído) -,- N (R ') CO- (alquileno ou alquileno substituído) -,- N (R ') C (O) O-,- S (O) k N (R ') -,- N (R ') C (O) N (R') -,- N (R ') C (S) N (R') -,- N (R ') S (O) k N (R') -,- N (R ') - N =, -C (R') = N-, -C (R ') = NN (R') -, -C (R ') = NN =,- C (R ') 2 -N = N-, e- C (R ') 2- N (R ')- N (R ') -, onde cada R' é independentemente H, alquil ou alquila substituída; R é H, alquil, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída; R1 H, um grupo de proteco de amino, resina, pelo menos um aminoido, poliptido ou polinucleido; R2 é OH, um grupo éster, resina, pelo menos um aminoácido, polipeptídeo, ou polinucleótido protector; em que R1 e/ou R 2 é o anticorpo anti-CD3; e R3 e R4 são cada um independentemente H, halogéneo, alquilo inferior ou alquilo inferior substituído, ou R3 e R4 ou dois grupos R3 formam opcionalmente um cicloalquila ou um heterocicloalquila.
[0188] Em algumas modalidades, Z tem o arcabouço de onde J, G, R1, R 2, R3 e R4 são como definidos acima, e onde D tem o arcabouço de: onde cada R17 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em H, alquil, alquila substituída, alquenila, alquenila substituído, alquinil, alquinil substituído, alcoxi, alcoxi substituído, alquilalcoxi, alquilalcoxi substituído, óxido de polialquileno, óxido de polialquileno substituído, arila, arila substituída, heteroarila, heteroarila substituída, alcarila, alcarila substituída, aralquila, aralquila substituída, - (alquileno ou alquileno substituído) -ON (R ") 2, - (alquileno ou alquileno substituído) -C (O) SR", - (alquileno ou alquileno substituído) -SS- (aril ou aril substituído),- C (O) R ”,- C (O) 2 R ”, ou- C (O) N (R ”) 2, em que cada R” é independentemente hidrogênio, alquila, alquila substituída, alquenila, alquenila substituída, alcoxi, alcoxi substituído, arila, arila substituída, heteroarila, alcarila, alcarila substituída, aralquila ou aralquila substituída;
cada Z1 é uma ligação, CR17 R17, O, S, NR ', CR17 R17 -CR17 R17, CR17 R17 -O, O- CR17 R17, CR17 R17 -S, S-CR17 R17, CR17 R17 -NR 'ou NR'-CR17 R17 ;
cada R' é H, alquila ou alquila substituída;
cada Z 2 é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação,- C (O) -, - C (S) -, opcionalmente substituo, C 1 -C 3 alquileno, opcionalmente substituo, C 1 -C 3 alquenileno, e heteroalquila, opcionalmente substituídos;
cada Z3 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em uma ligação, C1-C4 alquileno opcionalmente substituído, C1-C4 alquenileno opcionalmente substituído, , heteroalquila opcionalmente substituída, -O-, -S-,- C (O) -, -
C (S) - e -N (R ') -; cada T3 é uma ligação, C (R '') (R ''), O ou S; com a afecção de que quando T3 é
O ou S, R '' não pode ser halogéneo;
cada R ' é H, halogênio, alquila, alquila substituída, cicloalquila ou cicloalquila substituída;
m e p são 0, 1, 2 ou 3, desde que pelo menos um de m ou p não seja 0; (b) (b) (b) (b) (b) R3 C (b) C C (b) (b) C S (b) C C (b) C O (a) R3 M é dois , (a) R4 R4 , (a) R4 , (a) R4 , (a) R4 , (b) (b) (b) (b) R3 R3 R3 C C (b) O C (b) S C (b) C C (b) R3 R4 R4 (a) , (a) , (a) , ou (a) , onde (a) indica ligação ao grupo B e (b) indica ligação às respectivas posições dentro do grupo heterociclo; (b) (b) (b) (b) (b) R3 R3 C C (b) C (b) C C (b) C O (b) C S (b) R4 M é (a) , (a) R4 , (a) , (a) , ou (a) , 3 onde (a) indica ligação ao grupo B e (b) indica ligação às respectivas posições dentro do grupo heterociclo; (b) (b) (b) (b) (b) R3 C C (b) O C (b) S C (b) C (b) C C (b) R4 R3 R3 M 4 é (a) , (a) , (a) , (a) , ou (a) , onde (a) indica ligação ao grupo B e (b) indica ligação às respectivas posições dentro do grupo heterociclo; cada R19 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em C 1 -C 6 alquilo, C 1 -C 6 alcoxi, éster, éter, tioéter, aminoalquilo, halogeo, alquilo éster, aril éster, amida, arilo amida, alquilo, halogeneto de alquilo amina, ácido alquil sulfônico, alquil nitro, tioéster, sulfonil éster, halosulfonila, nitrila, alquil nitrila e nitro; q é 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11; e cada R16 é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em hidrogênio, halogênio, alquil, NO 2, CN e alquila substituída.
[0189] Esta invenção fornece um método altamente eficiente para a modificação seletiva de proteínas com derivados de PEG, que envolve a incorporação seletiva de aminoácidos não codificados geneticamente, incluindo, mas não se limitando a, aqueles aminoácidos contendo grupos funcionais ou substituintes não encontrados no 20 naturalmente aminoácidos incorporados, incluindo, mas não se limitando a uma cetona, uma porção de azida ou acetileno, em proteínas em resposta a um códon seletor e a modificação subsequente desses aminoácidos com um derivado de PEG adequadamente reativo. Uma vez incorporadas, as cadeias laterais de aminoácidos podem então ser modificadas utilizando metodologias químicas conhecidas pelos versados na técnica como sendo adequadas para os grupos funcionais particulares ou substituintes presentes no aminoácido codificado naturalmente. Metodologias químicas conhecidas de uma ampla variedade são adequadas para uso na presente invenção para incorporar um polímero solúvel em água na proteína. Tais metodologias incluem, mas não estão limitadas a uma reação de cicloadição de Huisgen [3 + 2] ( consulte, por exemplo, Padwa, A. em Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, Ed. Trost, BM, Pergamon, Oxford, p. 1069-1109, 1991; e, Huisgen, R. em 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176, 1984) com, incluindo, mas não se limitando a, acetileno ou derivados de azida, respectivamente.
[0190] Como o método de cicloadição de Huisgen [3 + 2] envolve uma cicloadição em vez de uma reação de substituição nucleofílica, as proteínas podem ser modificadas com seletividade extremamente alta. A reação pode ser realizada à temperatura ambiente em afecções aquosas com excelente regiosseletividade, (1,4> 1,5), pela adição de quantidades catalíticas de sais de Cu (I) à mistura de reação. ( Ver, por exemplo, Tornoe, et al., Org. Chem. 67:3057-3064, 2002; e Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int.
Ed. 41:2596-2599, 2002; e WO 03/101972). Uma molécula que pode ser adicionada a uma proteína da invenção através de uma cicloadição [3 + 2] inclui virtualmente qualquer molécula com um grupo funcional adequado ou substituinte incluindo, mas não limitado a um derivado de azido ou acetileno. Estas moléculas podem ser adicionadas a um aminoácido não natural com um grupo acetileno, incluindo, mas não se limitando a, p- propargiloxifenilalanina ou grupo azido, incluindo, mas não se limitando a p-azido- fenilalanina, respectivamente.
[0191] O anel de cinco membros que resulta da cicloadição de Huisgen [3 + 2] não é geralmente reversível em ambientes redutores e é estável contra hidrólise por longos períodos em ambientes aquosos. Consequentemente, as características físicas e químicas de uma ampla variedade de substâncias podem ser modificadas sob afecções aquosas exigentes com o PEG ativo ou derivados de PEG da presente invenção. Ainda mais importante, porque as porções azida e acetileno são específicas uma da outra (e não reagem, por exemplo, com qualquer um dos 20 aminoácidos geneticamente codificados comuns), as proteínas podem ser modificadas em um ou mais locais específicos com alta seletividade.
[0192] A invenção também fornece derivados solúveis em água e hidroliticamente estáveis de derivados de PEG e polímeros hidrofílicos relacionados tendo uma ou mais porções de acetileno ou azida. Os derivados de polímero PEG que contêm porções de acetileno são altamente seletivos para o acoplamento com porções de azida que foram introduzidas seletivamente em proteínas em resposta a um códon seletor. Da mesma forma, os derivados de polímero PEG que contêm porções de azida são altamente seletivos para o acoplamento com porções de acetileno que foram introduzidas seletivamente em proteínas em resposta a um códon seletor.
[0193] Mais especificamente, as porções azida compreendem, mas não estão limitadas a, alquilazidas, arilazidas e derivados dessas azidas. Os derivados das alquil e aril azidas podem incluir outros substituintes, desde que a reatividade específica do acetileno seja mantida. As porções de acetileno compreendem alquil e aril acetilenos e derivados de cada um. Os derivados dos alquil e aril acetilenos podem incluir outros substituintes, desde que a reatividade específica da azida seja mantida.
[0194] Um anticorpo anti-CD3, portanto, destina-se a incluir qualquer polipeptídeo que demonstra uma capacidade de se ligar especificamente a uma molécula ou antígeno alvo. Qualquer anticorpo ou fragmento de anticorpo conhecido é um anticorpo anti-CD3.
[0195] Em uma modalidade, são fornecidas composições de anticorpo anti-CD3 que incluem um aminoácido não natural (tal como p- (propargiloxi) -fenilalanina). Várias composições compreendendo p- (propargiloxi) -fenilalanina e, incluindo, mas não se limitando a, proteínas e/ou células, também são fornecidas. Em um aspecto, uma composição que inclui o aminoácido não natural de p - (propargiloxi) -fenilalanina inclui ainda um tRNA ortogonal. O aminoácido não natural pode ser ligado (incluindo, mas não limitado a, covalentemente) ao tRNA ortogonal, incluindo, mas não se limitando a, covalentemente ligado ao tRNA ortogonal por meio de uma ligação amino-acila, covalentemente ligada a um 3'OH ou a 2 'OH de um açúcar ribose terminal do tRNA ortogonal, etc.
MEDIÇÃO DA ATIVIDADE DO ANTICORPO ANTI-CD3 E AFINIDADE DO ANTICORPO ANTI-CD3 PARA SEU ANTÍGENO OU PARCEIRO DE LIGAÇÃO
[0196] A atividade do anticorpo anti-CD3 pode ser determinada usando ensaios padrão in vitro ou in vivo. Por exemplo, células ou linhas celulares que se ligam ao anticorpo anti-CD3 (incluindo, mas não se limitando a, células contendo antígeno de anticorpo anti-CD3 nativo ou parceiro de ligação ou antígeno de anticorpo anti-CD3 recombinante ou células produtoras de parceiro de ligação) podem ser usadas para monitorar células anti -Ligação do anticorpo CD3. Para um polipeptídeo de ligação de antígeno não PEGuilado ou PEGuilado compreendendo um aminoácido não natural, a afinidade do anticorpo anti-CD3 para o seu antígeno ou parceiro de ligação pode ser medida usando técnicas conhecidas na técnica, como um biossensor BIAcore ™ ( Pharmacia) ou Octet (ForteBio).
[0197] Independentemente de quais métodos são usados para criar o anticorpo anti-CD3, o anticorpo anti-CD3 está sujeito a ensaios de atividade biológica. Os ensaios de timidina tritiada podem ser realizados para determinar o grau de divisão celular, se apropriado. Outros ensaios biológicos, no entanto, podem ser usados para determinar a atividade desejada. Ensaios biológicos, como medir a capacidade de inibir a atividade biológica de um antígeno, como uma atividade enzimática, proliferativa ou metabólica, também fornecem uma indicação de anticorpo anti-CD3 atividade. Outros ensaios in vitro bem conhecidos pelos versados na técnica podem ser usados para determinar a atividade biológica. Em geral, o teste de atividade biológica deve fornecer análise para o resultado desejado, como aumento ou diminuição da atividade biológica (em comparação com o anticorpo anti-CD3 não alterado), atividade biológica diferente (em comparação com o anti-CD3 não alterado anticorpo), análise de receptor de afinidade, as alterações conformacionais ou estruturais, ou análise de meia-vida no soro, como apropriado para o antigénio é a atividade biológica. Os especialistas na técnica reconhecerão outros ensaios úteis para testar os resultados finais desejados. MEDIÇÃO DE POTÊNCIA, MEIA-VIDA FUNCIONAL IN VIVO E PARÂMETROS
FARMACOCINÉTICOS
[0198] Um aspecto importante da invenção é a meia-vida biológica prolongada que é obtida pela construção do anticorpo anti-CD3 com ou sem conjugação do anticorpo anti-CD3 a uma porção de polímero solúvel em água. A rápida diminuição das concentrações séricas do anticorpo anti-CD3 tornou importante avaliar as respostas biológicas ao tratamento com anticorpo anti-CD3 conjugado e não conjugado e suas variantes. De preferência, o anticorpo anti-CD3 conjugado e não conjugado e suas variantes da presente invenção têm meia-vida sérica prolongada também após administração iv, tornando possível a medição por exemplo, por método ELISA ou por um ensaio de triagem primária. A medição da meia-vida biológica in vivo é realizada como aqui descrito.
[0199] Os parâmetros farmacocinéticos para um polipeptídeo de ligação de antígeno compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural podem ser avaliados em ratos machos Sprague-Dawley normais). Os dados farmacocinéticos para o anticorpo anti-CD3 são bem estudados em várias espécies e podem ser comparados diretamente com os dados obtidos para o anticorpo anti-CD3 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural.
[0200] A atividade específica do anticorpo anti-CD3 de acordo com esta invenção pode ser determinada por vários ensaios conhecidos na técnica. A atividade biológica das muteínas do anticorpo anti-CD3, ou seus fragmentos, obtidos e purificados de acordo com esta invenção, pode ser testada por métodos descritos ou referenciados aqui ou conhecidos dos versados na técnica.
ADMINISTRAÇÃO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
[0201] Os polipeptídeos ou proteínas da invenção (incluindo, mas não se limitando a, anticorpo anti-CD3, sintetases, proteínas compreendendo um ou mais aminoácidos não naturais, etc.) são opcionalmente empregados para usos terapêuticos, incluindo, mas não se limitando a, em combinação com um veículo farmacêutico adequado. Tais composições, por exemplo, compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Tal transportador ou excipiente inclui, mas não está limitado a, solução salina, solução salina tamponada, dextrose, água, glicerol, etanol e/ou combinações dos mesmos. A formulação é feita de acordo com o modo de administração.
Em geral, os métodos de administração de proteínas são bem conhecidos na técnica e podem ser aplicados à administração dos polipeptídeos da invenção.
[0202] As composições terapêuticas que compreendem um ou mais polipeptídeos da invenção são opcionalmente testadas em um ou mais modelos animais adequados de doença in vitro e/ou in vivo, para confirmar a eficácia, metabolismo do tecido e estimar dosagens, de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, as dosagens podem ser inicialmente determinadas pela atividade, estabilidade ou outras medidas adequadas de não naturais aqui para homólogos de aminoácidos naturais (incluindo, mas não se limitando a, comparação de um anticorpo anti-CD3 modificado para incluir um ou mais aminoácidos não naturais para um natural anticorpo anti-CD3 de aminoácido), ou seja, em um ensaio relevante.
[0203] A administração é por qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir uma molécula em contato final com as células do sangue ou tecido. Os polipeptídeos de aminoácidos não naturais da invenção são administrados de qualquer maneira adequada, opcionalmente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Métodos adequados de administração de tais polipeptídeos no contexto da presente invenção a um paciente estão disponíveis e, embora mais de uma via possa ser usada para administrar uma composição particular, uma via particular pode muitas vezes fornecer uma ação ou reação mais imediata e eficaz do que outra rota.
[0204] Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular a ser administrada, bem como pelo método particular usado para administrar a composição. Consequentemente, existe uma grande variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas da presente invenção.
[0205] As composições polipeptídicas podem ser administradas por uma série de vias incluindo, mas não se limitando a meios orais, intravenosos, intraperitoneais, intramusculares, transdérmicos, subcutâneos, tópicos, sublinguais ou retais. As composições compreendendo polipeptídeos de aminoácidos não naturais, modificados ou não modificados, também podem ser administradas por meio de lipossomas. Essas vias de administração e formulações apropriadas são geralmente conhecidas dos especialistas na técnica.
[0206] O anticorpo anti-CD3 compreendendo um aminoácido não natural, sozinho ou em combinação com outros componentes adequados, também pode ser feito em formulações de aerossol (ou seja, eles podem ser "nebulizados") para serem administrados por inalação. As formulações de aerossol podem ser colocadas em propelentes pressurizados aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, nitrogênio e semelhantes.
[0207] Formulações adequadas para administração parenteral, tal como, por exemplo, por vias intraarticular (nas articulações), intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal e subcutânea, incluem soluções de injeção estéreis isotônicas aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes espessantes, estabilizantes e conservantes. As formulações de anticorpo anti-CD3 embalado podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou multidose, como ampolas e frascos.
[0208] A administração parenteral e a administração intravenosa são os métodos de administração preferenciais. Em particular, as vias de administração já em uso para terapêuticas homólogas de aminoácidos naturais (incluindo, mas não se limitando a, aquelas tipicamente usadas para EPO, GH, anticorpo anti-CD3, G-CSF, GM-CSF, IFNs, interleucinas, anticorpos, e/ou qualquer outra proteína distribuída farmaceuticamente), juntamente com as formulações em uso atual, fornecem as vias de administração e formulação preferidas para os polipeptídeos da invenção.
[0209] A dose administrada a um paciente, no contexto da presente invenção, é suficiente para ter uma resposta terapêutica benéfica no paciente ao longo do tempo ou, incluindo, mas não se limitando a, para inibir a infecção por um patógeno ou outra atividade apropriada, dependendo no aplicativo. A dose é determinada pela eficácia do vetor ou formulação particular e pela atividade, estabilidade ou meia-vida sérica do polipeptídeo de aminoácido não natural empregado e a afecção do paciente, bem como o peso corporal ou área de superfície do paciente a ser tratado. O tamanho da dose também é determinado pela existência, natureza e extensão de quaisquer efeitos colaterais adversos que acompanham a administração de um determinado vetor, formulação ou semelhante em um determinado paciente.
[0210] Ao determinar a quantidade eficaz do vetor ou formulação a ser administrada no tratamento ou profilaxia de doenças (incluindo, mas não se limitando a, cânceres, doenças hereditárias, diabetes, AIDS ou semelhantes), o médico avalia os níveis plasmáticos circulantes, toxicidades da formulação, progressão da doença e/ou quando relevante, a produção de anticorpos polipeptídicos de aminoácidos não naturais.
[0211] A dose administrada, por exemplo, a um paciente de 70 quilogramas, está tipicamente na faixa equivalente às dosagens de proteínas terapêuticas utilizadas atualmente, ajustadas para a atividade alterada ou meia-vida sérica da composição relevante. Os vetores desta invenção podem suplementar as afecções de tratamento por qualquer terapia convencional conhecida, incluindo administração de anticorpos, administração de vacinas, administração de agentes citotóxicos, polipeptídeos de aminoácidos naturais, ácidos nucleicos, análogos de nucleotídeos, modificadores de resposta biológica e semelhantes.
[0212] Para administração, as formulações da presente invenção são administradas a uma taxa determinada pelo LD-50 ou ED-50 da formulação relevante e/ou observação de quaisquer efeitos colaterais dos aminoácidos não naturais em várias concentrações, incluindo, mas não se limitando a, conforme aplicado à saúde geral e geral do paciente. A administração pode ser realizada em doses únicas ou divididas.
[0213] Se um paciente submetido à infusão de uma formulação desenvolver febre, calafrios ou dores musculares, ele receberá a dose apropriada de aspirina, ibuprofeno, acetaminofeno ou outro medicamento para controlar a dor/febre. Os pacientes que apresentarem reações à infusão, como febre, dores musculares e calafrios, são pré-medicados 30 minutos antes das futuras infusões com aspirina, acetaminofeno ou, incluindo, mas não se limitando a, difenidramina. A meperidina é usada para calafrios e dores musculares mais graves que não respondem rapidamente aos antipiréticos e anti-histamínicos. A infusão de células é retardada ou interrompida dependendo da gravidade da reação.
[0214] Os polipeptídeos de ligação de antígeno humano da invenção podem ser administrados diretamente a um sujeito mamífero. A administração é por qualquer uma das vias normalmente utilizadas para a introdução de anticorpos anti-CD3 a um sujeito. As composições de anticorpo anti-CD3 de acordo com modalidades da presente invenção incluem aquelas adequadas para oral, retal, tópica, inalação (incluindo, mas não se limitando a, por meio de um aerossol), bucal (incluindo, mas não se limitando a, sublingual), vaginal, parenteral (incluindo, mas não se limitando a, subcutâneo, intramuscular, intradérmico, intraarticular, intrapleural, intraperitoneal, inracerebral, intraarterial ou intravenoso), tópico (isto é, superfícies cutâneas e mucosas, incluindo superfícies das vias aéreas) e administração transdérmica, embora a maioria a rota adequada em qualquer caso dependerá da natureza e gravidade da afecção a ser tratada. A administração pode ser local ou sistêmica. As formulações de compostos podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou multidose, tais como ampolas e frascos. O anticorpo anti-CD3 da invenção pode ser preparado em uma mistura em uma forma injetável de dosagem unitária (incluindo, mas não se limitando a, solução, suspensão ou emulsão) com um transportador farmaceuticamente aceitável. O anticorpo anti-CD3 da invenção também pode ser administrado por infusão contínua (usando, incluindo, mas não se limitando a, minibombas, tais como bombas osmóticas), bolus único ou formulações de depósito de liberação lenta.
[0215] As formulações adequadas para administração incluem soluções aquosas e não aquosas, soluções estéreis isotônicas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, espessamento agentes, estabilizadores e conservantes. As soluções e suspensões podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo descrito anteriormente.
[0216] As composições farmacêuticas da invenção podem compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis são determinados em parte pela composição particular a ser administrada, bem como pelo método particular usado para administrar a composição. Deste modo, existe uma ampla variedade de formulações adequadas de composições farmacêuticas (incluindo transportadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizadores) do presente invento (consulte, por exemplo., Remingtons Pharmaceutical Sciences, 17 th ed. 1985).
[0217] Os veículos adequados incluem tampões contendo fosfato, borato, HEPES, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; iões metálicos divalentes, tais como zinco, cobalto ou cobre; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, como sódio; e/ou surfactantes não iônicos, como Tween ™, Pluronics ™ ou PEG.
[0218] Os anticorpos anti-CD3 da invenção, incluindo aqueles ligados a polímeros solúveis em água, tais como PEG, também podem ser administrados por ou como parte de sistemas de liberação sustentada. As composições de liberação sustentada incluem, incluindo, mas não se limitando a, matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, incluindo, mas não se limitando a, filmes ou microcápsulas. As matrizes de liberação sustentada incluem materiais biocompatíveis, tais como poli (2-hidroxietil metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167- 277 1981; Langer, Chem. Tech., 12: 98-105, 1982), acetato de etileno vinil (Langer et al., Supra ) ou ácido poli-D - (-) - 3-hidroxibutírico (EP 133.988), polilactídeos (ácido polilático) (Patente US No. 3.773.919; EP 58.481 ), poliglicólido (polímero de ácido glicólico), polilactídeo co-glicolídeo (copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico) polianidridos, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato (U. Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556. 1983), poli (orto) ésteres, polipeptídeos, ácido hialurônico, colágeno, sulfato de condroitina, ácidos carboxílicos, ácidos graxos, fosfolipídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, poliaminoácidos, aminoácidos, tais como fenilalanina, tirosina, isoleucina, polinucleotídeos, polivinilpropileno, polivinilpirrolidona e silicone. As composições de liberação sustentada também incluem um composto aprisionado em lipossomas. Os lipossomas contendo o composto são preparados por métodos conhecidos per se: DE
3.218.121; (Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 82: 3688-3692,1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 77: 4030-4034, 1980; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP
143.949; EP 142.641; Pat. Japonesa Appln. 83-118008; Patente US 4.485.045 e
4.544.545; e EP 102.324). Todas as referências e patentes citadas são aqui incorporadas a título de referência.
[0219] O anticorpo anti-CD3 encapsulado em lipossomas pode ser preparado por métodos descritos em, por exemplo, DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA., 82: 3688-3692, 1985; Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 77: 4030-4034, 1980; EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Pat. Japonesa Appln.
83-118008; Patentes sob no U.S... 4.485.045 e 4.544.545; e EP 102.324. A composição e o tamanho dos lipossomas são bem conhecidos ou podem ser facilmente determinados empiricamente por um especialista na técnica. Alguns exemplos de lipossomas descritos em, por exemplo, Park JW, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1327-1331, 1995; Lasic D e Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES, 1998; Drummond DC, et al., Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, em Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT, 2002; Park JW, et ai, Clin. Cancer Res.
8:1172-1181, 2002; Nielsen UB, et al., Biochim. Biophys. Acta 1591 (1-3):109-118, 2002; Mamot C, et al., Cancer Res. 63: 3154, -3161, 2003). Todas as referências e patentes citadas são aqui incorporadas a título de referência.
[0220] A dose administrada a um paciente no contexto da presente invenção deve ser suficiente para causar uma resposta benéfica no sujeito ao longo do tempo.
Geralmente, a quantidade farmaceuticamente eficaz total do anticorpo anti-CD3 da presente invenção administrado por via parenteral por dose está na faixa de cerca de 0,01 μg/kg/dia a cerca de 100 μg/kg, ou cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 mg/kg, do peso corporal do paciente, embora isso esteja sujeito a critério terapêutico. A frequência da dosagem também está sujeita a critério terapêutico e pode ser mais ou menos frequente do que os produtos de anticorpos anti-CD3 comercialmente disponíveis e aprovados para uso em humanos. Geralmente, um polipeptídeo biespecífico de ligação de antígeno da invenção pode ser administrado por qualquer uma das vias de administração descritas acima.
USOS TERAPÊUTICOS DE BIOCONJUGADOS DE ANTICORPO ANTI-CD3 DA
INVENÇÃO
[0221] Os polipeptídeos de anticorpo anti-CD3 da invenção são úteis para o tratamento de uma ampla gama de distúrbios. As composições de anticorpos anti-CD3 aqui reveladas podem ser usadas para modular uma resposta imune. A modulação de uma resposta imune pode compreender a estimulação, ativação, aumento, aumento ou regulação positiva de uma resposta imune. A modulação de uma resposta imune pode compreender a supressão, inibição, prevenção, redução ou regulação negativa de uma resposta imune. As composições de folato de anticorpo anti-CD3 reveladas podem ter vantagens na penetração de tumores sólidos, enquanto o ligante de folato natural tem como alvo o receptor alfa de folato em tumores, por exemplo, e o receptor beta de folato em células imunossupressoras. Em algumas modalidades, o tumor é um tumor líquido ou sólido.
[0222] São revelados aqui métodos para tratar um sujeito para uma afecção com um conjugado anti-CD3 ou composição farmacêutica da invenção. Em alguns cânceres, a superexpressão de receptores específicos da superfície celular pode permitir o direcionamento seletivo de células cancerosas com pequenas moléculas ou drogas, enquanto minimiza os efeitos nas células saudáveis. Por exemplo, o antígeno de membrana específico do câncer de próstata (PMSA) direcionado ao ácido 2- [3- (1,3- dicarboxipropil) -ureido] pentanodioico (DUPA) pode ser conjugado a um antígeno de superfície da célula T (anti-CD3) anticorpo de ligação para recrutar seletivamente ou direcionar células T citotóxicas para matar células de câncer de próstata. O ácido N- (4 - {[(2-amino-4-oxo-1,4-dihidropteridin-6-il) metil] amino} benzoil) -L-glutâmico (ácido fólico) também pode ser usado como uma molécula biológica ativa para se ligar ao antígeno do receptor de folato (FR), que é superexpresso nas linhas de células cancerígenas FR +.
[0223] A invenção fornece um método de tratamento do câncer pela administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD3 da invenção. O câncer pode ser câncer de ovário, incluindo, mas não se limitando a, um tumor eptitelial, estromal e de células germinativas. O câncer de ovário pode compreender um câncer das trompas de Falópio ou carcinoma peritoneal primário.
O câncer pode ser caracterizado pela alta expressão do receptor alfa de folato (FOLR1), como o câncer de ovário, por exemplo. O câncer pode ser tratado através do recrutamento de células T citotóxicas para células tumorais positivas para receptor de folato (FR +). Em algumas modalidades, a invenção fornece um método para tratar um doenças hereditárias, AIDs ou diabetes pela administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD3 da invenção. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 ou terapêutico pode ser um anticorpo biespecífico compreendendo um anticorpo Fab anti-CD3, opcionalmente em que o anticorpo Fab anti- CD3 compreende um local especificamente incorporado de aminoácido não codificado de forma natural opcionalmente conjugado a dois folatos e dois PEGuilados moléculas. Em uma outra modalidade, no referido anticorpo Fab anti-CD3 e a conjugação com os dois folato e duas moléculas PEGuiladas é através da cadeia lateral do aminoácido não natural.
[0224] A invenção fornece anticorpos anti-CD3 para uso no tratamento de uma doença ou afecção em uma célula que expressa um número elevado de receptor de folato. Os anticorpos anti-CD3 da invenção são para uso no tratamento de câncer, incluindo, mas não se limitando a, câncer de ovário, incluindo, mas não se limitando a, um tumor eptitelial, estromal e de células germinativas. O câncer de ovário pode compreender um câncer das trompas de Falópio ou carcinoma peritoneal primário. O câncer pode ser caracterizado pela alta expressão do receptor alfa de folato (FOLR1), como o câncer de ovário, por exemplo. O câncer pode ser tratado através do recrutamento de células T citotóxicas para células tumorais positivas para receptor de folato (FR +). Os anticorpos anti-CD3 da invenção são para uso no tratamento de doenças hereditárias, AIDS ou diabetes, mas não estão limitados a tais. Os anticorpos anti-CD3 da invenção podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou afecção em uma célula que expressa um número elevado de receptor de folato. Os anticorpos anti-CD3 da invenção podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento do câncer, incluindo, mas não se limitando a, câncer de ovário, incluindo, mas não se limitando a, um tumor eptitelial, estromal e de células germinativas. O câncer de ovário pode compreender um câncer das trompas de Falópio ou carcinoma peritoneal primário. O câncer pode ser caracterizado pela alta expressão do receptor alfa de folato (FOLR1), como o câncer de ovário, por exemplo. O câncer pode ser tratado através do recrutamento de células T citotóxicas para células tumorais positivas para receptor de folato (FR +). Os anticorpos anti-CD3 da invenção podem ser usados na fabricação de um medicamento para o tratamento de doenças hereditárias, AIDS ou diabetes, mas não está limitado a tais.
[0225] Em algumas modalidades, a afecção a ser tratada é um câncer. O câncer pode ser, mas não está limitado a, um câncer de mama, um câncer de cérebro, um câncer de pâncreas, um câncer de pele, um câncer de pulmão, um câncer de fígado, um câncer de vesícula biliar, um câncer de cólon, um câncer de ovário, um câncer de próstata, um câncer uterino, um câncer ósseo e um câncer de sangue (leucêmico) ou um câncer ou doença ou afecções relacionadas a qualquer um desses cânceres. Carcinomas são cânceres que começam nas células epiteliais, que são células que cobrem a superfície do corpo, produzem hormônios e constituem as glândulas. A título de exemplo não limitativo, os carcinomas incluem câncer de mama, câncer de pâncreas, câncer de pulmão, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer retal, câncer de rim, câncer de bexiga, câncer de estômago, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de ovário, câncer de cérebro, vaginal câncer, câncer vulvar, câncer uterino, câncer oral, câncer peniano, câncer testicular, câncer de esôfago, câncer de pele, câncer das trompas de Falópio,
câncer de cabeça e pescoço, câncer estromal gastrointestinal, adenocarcinoma, melanoma cutâneo ou intraocular, câncer da região anal, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, câncer da uretra, câncer da pelve renal, câncer do ureter, câncer do endométrio, câncer do colo do útero, câncer da glândula pituitária, neoplasias do sistema nervoso central (SNC), linfoma primário do SNC, glioma do tronco cerebral e tumores do eixo espinhal. Em alguns casos, o câncer é um câncer de pele, como um carcinoma basocelular, escamoso, melanoma, não melanoma ou ceratose actínica (solar). Em algumas modalidades, o câncer é qualquer câncer com receptor alfa ou beta de folato altamente expresso. Em algumas modalidades, a afecção a ser tratada é uma doença ou afecção. A doença ou afecção pode ser uma infecção patogênica. A infecção patogênica pode ser uma infecção bacteriana. A infecção patogênica pode ser uma infecção viral. A doença ou afecção pode ser uma doença inflamatória. A doença ou afecção pode ser uma doença auto-imune. A doença autoimune pode ser diabetes. A doença ou afecção pode ser um câncer. Em algumas modalidades, a doença ou afecção é qualquer doença ou afecção com receptor alfa ou beta de folato altamente expresso. A doença ou afecção pode ser uma infecção patogênica. A molécula biologicamente ativa pode interagir com uma molécula da superfície celular em uma célula infectada. A molécula biologicamente ativa pode interagir com uma molécula de uma bactéria, um vírus ou um parasita. As infecções patogênicas podem ser causadas por um ou mais patógenos. Em alguns casos, o patógeno é uma bactéria, fungo, vírus ou protozoário.
Patógenos exemplares incluem, mas não estão limitados a: Bordetella, Borrelia, Brucella, Campylobacter, Chlamydia, Chlamydophila, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia,
Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Vibrio ou Yersinia.
O patógeno pode ser um vírus.
Exemplos de vírus incluem, mas não estão limitados a, adenovírus, coxsackievírus, vírus de Epstein-Barr, vírus da hepatite (por exemplo,
hepatite A, B e C), vírus herpes simplex (tipo 1 e 2), citomegalovírus, vírus herpes, HIV,
vírus influenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, vírus do papiloma, vírus da parainfluenza, poliovírus, vírus sincicial respiratório, vírus da rubéola e vírus varicela-
zóster.
Exemplos de doenças ou afecções causadas por vírus incluem, mas não estão limitados a, resfriado, gripe, hepatite, AIDS, catapora, rubéola, caxumba, sarampo, verrugas e poliomielite.
A doença ou afecção pode ser uma doença autoimune ou doença relacionada autoimune.
Uma doença autoimune pode ser um mau funcionamento do sistema imunológico do corpo que faz com que o corpo ataque seus próprios tecidos.
Exemplos de doenças autoimunes e doenças relacionadas autoimunes incluem, mas não estão limitados a, doença de Addison, alopecia areata, espondilite anquilosante,
síndrome antifosfolipídeo (APS), anemia aplástica autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença celíaca de Behiacet, miocardite autoimune,
Doença de Crohn, dermatomiosite, fasciite eosinofílica, eritema nodoso, arterite de células gigantes (arterite temporal), síndrome de Goodpasture, doença de Graves, doença de Hashimoto, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), diabetes por IgA,
síndrome de Kawaki, artrite juvenil, diabetes, artrite juvenil,, Síndrome de Lambert-Eaton,
lúpus (LES), doença mista do tecido conjuntivo (MCTD), esclerose múltipla, miastenia gravis, pênfigo, poliarterite nodosa, síndromes poliglandulares autoimunes tipo I, II e III,
polimialgia reumática, polimiosite, psoríase, artríase psoriática, Síndrome de Reiter,
policondrite recorrente, artrite reumatóide, sarcoidose, esclerodermia, Síndrome de Sjogren, espermatozóide e autoimunidade testicular, síndrome da pessoa rígida, arterite de Takayasu, arterite temporal/arterite de células gigantes, colite ulcerativa, uveíte,
vasculite, vitiligo e granulomatose de Wegener.
[0226] A doença ou afecção pode ser uma doença inflamatória. Exemplos de doenças inflamatórias incluem, mas não estão limitados a, alveolite, amiloidose, angiite, espondilite anquilosante, necrose avascular, doença de Basedow, paralisia de Bell, bursite, síndrome do túnel do carpo, doença celíaca, colangite, condromalácia patelar, hepatite crônica ativa, fadiga crônica síndrome, síndrome de Cogan, displasia congênita do quadril, costocondrite, doença de Crohn, fibrose cística, tendinite de De Quervain, artrite associada ao diabetes, hiperostose esquelética idiopática difusa, lúpus discoide, síndrome de Ehlers-Danlos, febre mediterrânea familiar, fascite, fibromialgia/fibromialgia congelada, ombro, cistos ganglionares, arterite de células gigantes, gota, doença de Graves, síndromes de doença reumática associada ao HIV, artrite associada a hiperparatireoide, artrite infecciosa, síndrome do intestino inflamatório/síndrome do intestino irritável, artrite reumatóide juvenil, doença de lyme, síndrome de Marfan, doença de Mikulicz, mista doença do tecido conjuntivo, esclerose múltipla, miofáscia síndrome da dor, osteoartrite, osteomalácia, osteoporose e osteoporose induzida por corticosteroides, Doença de Paget, reumatismo palindrômico, Doença de Parkinson, Doença de Plummer, polimialgia reumática, polimiosite, pseudogota, artrite psoriática, Reumatismo palindrômico, Doença de Parkinson, Doença de Plummer, polimialgia reumática, polimiosite, pseudogota, artrite psoriática, Síndrome reumática reumática, Síndrome de Raynaud Reumatoide, Síndrome Reumática, sarcoidose, ciática (radiculopatia lombar), esclerodermia, escorbuto, artrite falciforme, Síndrome de Sjogren, estenose espinhal, espondiloistese, Doença de Still, lúpus eritematose sistêmico, Doença de Takayasu (cotovelo sem pulso, cotovelo sem pulso, tendinite associada ao tênis, cotovelo de tênis) dedo em gatilho, colite ulcerosa, granulomatose de Wegener e doença de Whipple.
[0227] As composições farmacêuticas contendo o anticorpo anti-CD3 podem ser formuladas em uma dosagem eficaz para administração por vários meios a um paciente humano que sofre de distúrbios que podem ser afetados por agonistas ou antagonistas do anticorpo anti-CD3, tais como, mas não se limitando a, antiproliferativos, anti- inflamatórios ou antivirais são usados, isoladamente ou como parte de uma afecção ou doença. As quantidades médias de anticorpos anti-CD3 podem variar e, em particular, devem ser baseadas nas recomendações e prescrição de um médico qualificado. A quantidade exata de anticorpo anti-CD3 é uma questão de preferência sujeita a fatores como o tipo exato de afecção a ser tratada, a afecção do paciente a ser tratado, bem como os outros ingredientes da composição. A invenção também fornece a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de outro agente ativo, como um agente quimioterápico anticâncer ou agente imunoterapêutico, mas não está limitada a tal. A quantidade a ser dada pode ser prontamente determinada por um especialista na técnica com base na terapia com anticorpo anti-CD3.
EXEMPLOS
[0228] Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitar, a invenção reivindicada. EXEMPLO 1
[0229] Critérios para a seleção de locais preferenciais de incorporação de aminoácidos codificados de forma não natural no anticorpo anti-CD3:- Este exemplo demonstra como locais preferenciais dentro do polipeptídeo de ligação de antígeno, CD3, podem ser selecionados para a introdução de aminoácidos codificados de forma não natural utilizando o arcabouço tridimensional composto por duas moléculas de anticorpo anti-CD3, ou o arcabouço secundário, terciário ou quaternário de anticorpo anti-CD3.
[0230] Os critérios a seguir são usados para avaliar cada posição do anticorpo anti-CD3 para a introdução de um aminoácido codificado de forma não natural:o resíduo (a) não deve interferir com a ligação de qualquer anticorpo anti-CD3 com base na análise estrutural de estruturas tridimensionais, ou o arcabouço secundário, terciário ou quaternário do anticorpo anti-CD3, b) não deve ser afetada por alanina ou mutagênese de varredura homóloga, (c) deve ser exposta à superfície e exibir interações de ligação de hidrogênio ou van der Waals mínimas com resíduos circundantes, (d) pode estar em uma ou mais das faces expostas do anticorpo anti-CD3, (e) pode ser um local ou locais do anticorpo anti-CD3 que são justapostos a um segundo anticorpo anti-CD3, ou outra molécula ou fragmento do mesmo, (f) deve ser deletado ou variável nas variantes do anticorpo anti-CD3, (g) resultaria em mudanças conservadoras após a substituição com um aminoácido codificado de forma não natural, (h) pode modular a conformação do próprio anticorpo anti-CD3 ou um centavo r ou multímero compreendendo um ou mais anticorpos anti-CD3, alterando a flexibilidade ou rigidez da arcabouço completa conforme desejado, (i) pode ser encontrado em regiões altamente flexíveis ou regiões estruturalmente rígidas e (j) são encontrados em regiões determinantes de complementaridade (CDR) ou não. Além disso, cálculos adicionais foram realizados na molécula de anticorpo anti-CD3, utilizando o programa Cx (Pintar et al. Bioinformatics, 18, pp 980) para avaliar a extensão da protrusão para cada átomo de proteína. Como resultado, em algumas modalidades, o aminoácido codificado de forma não natural é substituído por uma ou mais posições do anticorpo anti-CD3. EXEMPLO 2
[0231] Expressão de anticorpo anti-CD3 incluindo um aminoácido codificado de forma não natural em E. coli:- Um sistema de tradução introduzido que compreende um tRNA ortogonal (O-tRNA) e um aminoacil tRNA sintetase ortogonal (O-RS) é usado para expressar anti -Anticorpo CD3 contendo um aminoácido codificado de forma não natural.
O O-RS preferencialmente aminoacila o O-tRNA com um aminoácido codificado de forma não natural. Por sua vez, o sistema de tradução insere o aminoácido codificado de forma não natural no anticorpo anti-CD3, em resposta a um códon seletor codificado.
[0232] A transformação de E. coli com plasmídeos contendo o gene do anticorpo anti-CD3 modificado e o par de aminoacil tRNA sintetase/tRNA ortogonal, (específico para o aminoácido codificado de forma não natural desejado), permite a incorporação específica do local de codificado de forma não natural aminoácido no anticorpo anti-CD3. A E. coli transformada, cultivada a 37 C em meio contendo entre 0,01-100 mM do aminoácido codificado de forma não natural particular, expressa o anticorpo anti-CD3 modificado com alta fidelidade e eficiência. O anticorpo anti-CD3 contendo um aminoácido codificado de forma não natural é produzido pelas células hospedeiras de E. coli como proteínas solúveis nos métodos periplasmáticos para purificação do anticorpo anti-CD3 são bem conhecidos na técnica e são confirmados por SDS-PAGE, Análises Western Blot ou espectrometria de massa com armadilha de íons de ionização por eletrospray e semelhantes.
[0233] EXPRESSÃO/SUPRESSÃO: Supressão com aminoácido codificado não natural -para-acetil-fenilalanina (pAF): A supressão das mutações Amber em E. coli é alcançada usando protocolos padrão conhecidos na técnica. Resumidamente, para a supressão periplasmática de fragmentos de anticorpo em E. coli (Fab), o construto do vetor de expressão é transformado em células hospedeiras de E. coli com um plasmídeo que codifica uma sintetase de tRNA ortogonal (por exemplo, tirosil-tRNA-sintetase ortogonal de M. jannaschii ( Mj TyrRS)). Culturas bacterianas de um dia para o outro foram diluídas 1:100 em frascos de agitação contendo meio LB (Luria-Bertani) ou Superbroth e cultivadas a 37 o C até uma DO de aproximadamente 0,8. A expressão de Fab é induzida enquanto a supressão do códon âmbar é alcançada pela adição de para
-acetil-fenilalanina (pAF) a uma concentração final de 4 mM. As culturas foram incubadas a 25ºC de um dia para o outro.
[0234] Supressão com derivados de aminoácidos não codificados naturalmente : A supressão de mutações âmbar com um derivado de um aminoácido codificado de forma não natural (por exemplo, pAF (aa 9.2)) é alcançada de maneira semelhante à descrita acima, exceto que a sintetase ortogonal (por exemplo, tirosil-tRNA-sintetase de M.
jannaschii (MjTyrRS)) usado é específico para o aminoácido. Por exemplo, a supressão é alcançada pela adição de aa9.2 (4 mM) no momento da indução.
[0235] As células são colhidas por centrifugação e ressuspensas em tampão de libertação periplásmica (NaPO4 50 mM, 20% de sacarose, EDTA a 1 mM, pH 8,0) suplementado com 100 ug/ml de lisozima e incubadas em gelo durante 30 minutos. Após a centrifugação, os fragmentos de anticorpo no sobrenadante são imobilizados em esferas ProBind (Invitrogen; Carlsbad, CA) em virtude de sua etiqueta His, as esferas são lavadas extensivamente com tampão de ligação e os fragmentos ligados eluídos das esferas com 0,5 M de imidazol. Os fragmentos purificados foram dialisados em tampão de armazenamento (HEPES a 50 mM, NaCl a 150 mM, glicerol a 10%, sacarose a 5%, pH 7,8). Para análise em pequena escala de fragmentos Fab expressos no periplasma, E. coli de 15 ml de cultura são coletados por centrifugação e ressuspensos em 1 ml de tampão de lise (B-PER, Pierce Biotechnology; Rockford, IL) suplementado com 10 ug/ml de DNase. A mistura é incubada a 37ºC por 30 minutos, diluída a 1X em tampão de carregamento de proteína (Invitrogen; Carlsbad, CA) e analisada por SDS-PAGE.
EXEMPLO 3
[0236] Projeto e construção de genes anti-CD3 humanizados em vetores pFUSE - O anticorpo monoclonal de camundongo anti-CD3 SP34 (Harvard BIDMC) foi humanizado. Com base na análise e projeto in-silico, síntese de 3 cadeias pesadas variáveis (vH1.0, vH1.1 e vH1.2) e 3 genes de cadeia leve variáveis (vL1.0, vL1.1 e vL1.2) (Genewiz, South Plainfield, NJ) contendo várias retro-mutações de arcabouço de camundongo, além das sequências de CDR de camundongo no esqueleto de framework humano selecionado. A Tabela 2 lista os resíduos de arcabouço de camundongo (mutações reversas), com sua numeração de Kabat, que foram retidos em 3 cadeias pesadas variáveis (vH) e 3 cadeias leves variáveis (vL) de 9 Fabs anti-CD3 humanizados mencionados na Figura 1 Os resíduos de aminoácidos que foram revertidos para as sequências estruturais humanas são mostrados em negrito. Tabela 2 - Lista de resíduos da arcabouço de camundongo ID ID Retro- de LC Retro-mutação(ões) de LC de HC mutação(ões) de HC vL1. V36F/G46T/G49Y/G57W/V vH1. N30/A49G/I77S/V 0 58T 0 93 vL1. vH1. N30/A49/I77S/V9 1 V36/G46/G49/G57/V58 1 3 vL1. vH1. 2 V36/G46/G49/G57/V58T 2 N30/A49/I77/V93
[0237] Conforme mostrado na Tabela 2, existem 5 mutações de camundongo em cadeias leves variáveis (V36, G46, G49, G57 e V58) e 4 mutações de camundongo em cadeias pesadas variáveis (N30, A49, I77 e V93). Os 6 genes variáveis sintéticos curtos mostrados na Tabela 2 foram clonados nos vetores de expressão da cadeia pesada (HC) e da cadeia leve (LC) da Invivogen (pFUSE-CHIg-HG1 e pFUSE-CLig-hk, respectivamente) resultando em plasmídeos que expressam anti-humanizado Anticorpos CD3 SP34. Como mostrado na Figura 1 e Tabela 2, cadeia leve variável vL1.0 com todas as 5 mutações de camundongo convertidas em resíduos humanos perderam a ligação com quaisquer combinações de cadeia pesada variável (vH).
EXEMPLO 4
[0238] Expressão de anticorpos anti-CD3 humanizados no sistema transiente
HEK293: O os anticorpos SP34 humanizados descritos no Exemplo anterior foram expressos transitoriamente em células HEK293 combinando cada plasmídeo contendo o gene vH com cada plasmídeo contendo o gene vL (co-transfecção). A concentração de proteína no meio de cultura de células de cada experiência de co-transfecção foi determinada e usada diretamente para ensaios de ligação de CD3 com base em PBMC sem purificação adicional. Os controles usados foram construção quimérica de SP34, controle positivo e uma construção de anticorpo PSMA não relacionado, controle negativo. Os anticorpos anti-CD3 humanizados, sem incorporação de aminoácidos não naturais e com ou sem extensão HC-DKTHT também foram expressos em células HEK293 e caracterizados (Tabela 3). Estes anticorpos foram usados na pesquisa de variantes de Fab de baixa afinidade. A Tabela 3 mostra novas sequências de aminoácidos de tipo selvagem (WT) de sequências de cadeia pesada (vH + CH1) e leve (vL + CL) anti-CD3 humanizadas usadas em combinações variáveis para gerar sequências Fab WT aqui reveladas. Também são mostradas na Tabela 3 as sequências de aminoácidos WT de sequências de cadeia pesada anti-CD3 humanizada (vH + CH1- DKTHT).
Tabela 3 - Sequências de aminoácidos de tipo selvagem (WT) - cadeias pesadas de anti-CD3 (vH + CH1), (vH + CH1-DKTHT) e leves (vL + CL) SEQ. ID. CADEIA SEQUÊNCIA NO. 1 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.2+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK ) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
2 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.1+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK ) NSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWG
QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV
PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 3 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.0+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS ) KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW
GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 4 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.2+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK -DKTHT) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 5 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.1+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK -DKTHT) NSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWG
QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV
PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 6 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.0+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS -DKTHT) KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW
GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 7 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL1.2+CL) QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLS
GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 8 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL1.1+CL) QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLS
GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 9 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQ (vL1.0+CL) QKPGQAPRTLIYGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC EXEMPLO 5
[0239] Teste para ligação de CD3 com PBMC humano e cyno ativado: Para distinguir entre os anticorpos anti-CD3 humanizados gerados, a ligação ao CD3 humano foi testada usando PBMCs humanos ativados (n = 2). A ativação de PBMCs e subsequentes ensaios de ligação de CD3 com base em fluorescência foram seguidos conforme descrito anteriormente (consulte, por exemplo, Angew Chem Int Ed Engl, 52 (46):12101-12104, 2013). Como mostrado na Figura1, três anticorpos com cadeia leve vL1.0 perderam a ligação ao CD3 humano com quaisquer combinações de cadeia pesada vH. A ligação dos 6 anticorpos humanizados restantes a ambos CD3 humano e cyno usando PBMCs humanos e cyno ativados, respectivamente, foi titulada. Conforme mostrado nas Figuras 2A-2F, todos os 6 anticorpos anti-CD3 humanizados (desenvolvidos a partir de 3 cadeias pesadas vH com 2 combinações de cadeia leve vL mostradas na Tabela 3) retiveram ligação comparável a CD3 humano e cyno. Os seis (6) anticorpos anti-CD3 humanizados foram obtidos como segue: Fab1, Fab2 e Fab3 do tipo selvagem foram gerados por combinação de LC ((vL1.2+CL); (SEQ.ID. NO:7)) e HC ((vH1.2+CH1); (SEQ.ID. NO:1)), ((vH1.1+CH1); (SEQ.ID. NO:2)) e ((vH1.0+CH1); (SEQ.ID. NO:3)) respectivamente. Fab4, Fab 5 e Fab6 de tipo selvagem foram gerados por combinação de LC ((vL1.1+CL); (SEQ.ID. NO:8)) e HC ((vH1.2+CH1); (SEQ.ID.
NO:1)), ((vH1.1+CH1); (SEQ.ID. NO:2)) e ((vH1.0+CH1); (SEQ.ID. NO:3)) respectivamente.
[0240] Uma vez que os dados não mostraram nenhuma diferença significativa entre os 6 anticorpos humanizados no que diz respeito à ligação a ambos os substratos CD3, Fab1 (combinação vH1.2+vL1.2) foi selecionado para demonstrar adicionalmente os principais aspectos da presente invenção. Por exemplo, Fab1 foi usado para expressão em Escherichia coli para otimização adicional empregando tecnologia de incorporação de aminoácidos não naturais (UAA) proprietária através do sistema de supressão âmbar ortogonal descrito anteriormente (consulte por exemplo, WO2017/079272, WO2012/166560 e WO2013/192360). A lista de mutações estruturais de camundongo que foram necessárias para a retenção da atividade de ligação nestes 6 Fabs é mostrada na Tabela 4, que fornece uma lista de resíduos de framework de camundongos (mutações reversas), com sua numeração Kabat, que foram retidos em 6 Fabs anti-CD3 humanizados mencionados nas Figuras 2A-2F. Os resíduos de aminoácidos que foram revertidos para a sequência estrutural humana são mostrados em negrito. A combinação de cadeia variável vL1.2 e vH1.2 resultando em Fab1 (sublinhado) foi escolhida como líder para modificações adicionais.
Tabela 4 - Resíduos de arcabouço de camundongo retidos em 6 Fabs anti-CD3 humanizados No de ID de Retro-mutação(ões) de ID de Retro-mutação(ões) de Fab LC LC HC HC Fab1 vL1.2 V36/G46/G49/G57/V58T vH1.2 N30/A49/I77/V93 Fab2 vL1.2 V36/G46/G49/G57/V58T vH1.1 N30/A49/I77S/V93 Fab3 vL1.2 V36/G46/G49/G57/V58T vH1.0 N30/A49G/I77S/V93 Fab4 vL1.1 V36/G46/G49/G57/V58 vH1.2 N30/A49/I77/V93 Fab5 vL1.1 V36/G46/G49/G57/V58 vH1.1 N30/A49/I77S/V93 Fab6 vL1.1 V36/G46/G49/G57/V58 vH1.0 N30/A49G/I77S/V93 EXEMPLO 6
[0241] Clonagem de genes de Fab sintético em vetor de expressão de E. coli: Os genes de Fab sintético foram clonados no vetor de expressão de E. coli padrão proprietário usando o kit de clonagem Gibson Assembly (New England Biolabs). Após a verificação da sequência de cada plasmídeo de expressão, cada um foi transformado na cepa W3110B60 do hospedeiro de produção de E. coli padrão e uma única colônia isolada para cada plasmídeo foi purificada para fazer frascos de glicerol. Os frascos de glicerol serviram como clones de produção para a fermentação de E. coli dessas moléculas Fab. As sequências de aminoácidos das 4 cadeias pesadas e 3 cadeias leves usadas na engenharia desses Fabs são mostradas na Tabela 5 como SEQ. ID. NOs: 10 a 20.
Tabela 5 - Sequências de aminoácidos de sequência de cadeia pesada e leve de Fab1 anti-CD3 humanizado (vH1.2+CH1, vL1.2+CL) com o aminoácido não natural, pAF, local de incorporação sublinhado que foram produzidos em E. coli.
SEQ. ID. CADEIA SEQUÊNCIA NO. 10 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.2+CH1- QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS HA114pAF) KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSpAFSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 11 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.2+CH1- QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS HS115pAF) KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSApAFTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 12 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.2+CH1- QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS HK129pAF) KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 13 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.2+CH1- QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS HT160pAF) KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW
GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALpAFSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 14 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR
(vH1.2+CH1- QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS HA114pAF+ KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW DKTHT) GQGTLVTVSSpAFSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK
THT 15 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.2+CH1- QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS HS115pAF+ KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW DKTHT) GQGTLVTVSSApAFTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK
THT 16 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.2+CH1- QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS HK129pAF- KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW DKTHT) GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLS SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK
THT 17 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.2+CH1- QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS HT160pAF+ KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW DKTHT) GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALpAFSGVHTFPAVLQSSGLYSLS
SVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDK
THT 18 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWV (vL1.2+CL- QQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTL LL157pAF) SGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAA
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NApAFQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 19 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWV (vL1.2+CL- QQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTL LK172pAF) SGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAA
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSpAFDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 20 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWV (vL1.2+CL- QQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTL LS205pAF) SGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAA
PSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK
VYACEVTHQGLpAFSPVTKSFNRGEC
[0242] Três cadeias leves (LL157pAF, LK172pAF e LS205pAF) variantes de pAF, (SEQ. ID. NOs: 18 a 20), bem como 3 variantes de pAF duplo ((HK129pAF+LL157pAF); (SEQ. ID. NOs: 16 e 18)); ((HK129pAF+LK172pAF); (SEQ. ID. NOs: 16 e 19)), e ((HK129pAF+LS205pAF) (SEQ. ID. NOs: 16 e 20)) foram modificados. SEQ. ID. NOs: 10 a 13 representam as variantes de pAF de cadeia pesada sem uma extensão C-terminal de cadeia pesada de 5-aa - DKTHT.
[0243] Fermentação de E. coli: O processo de fermentação para a produção de Fab-pAF anti-CD3 consiste em duas etapas: (i) preparação do inóculo e (ii) produção do fermentador. O inóculo é iniciado a partir de um único frasco de glicerol, descongelado, diluído 1:1000 (v/v) em 50 ml de meio de semente definido em um frasco Erlenmeyer de 250 ml com saliências e incubado a 37 °C e 250 rpm. Antes de usar, o fermentador é limpo e autoclavado. Uma quantidade especificada de meio basal é adicionada ao fermentador e esterilizada a vapor. Quantidades especificadas de solução de sulfato de canamicina, meio de alimentação e antiespumante P2000 são adicionados ao meio basal antes da inoculação. Todas as soluções adicionadas ao fermentador após a autoclavagem são filtradas por 0,2 µm ou autoclavadas antes da adição asséptica.
[0244] O fermentador de produção é inoculado a uma OD600 alvo de 0,0004 por transferência asséptica do conteúdo do inóculo. Após a inoculação, a cultura é amostrada em intervalos apropriados para determinação de OD600. Temperatura, pH e oxigênio dissolvido são monitorados e controlados nos pontos de ajuste especificados de 37 °C, 7,0 e > 30%, respectivamente. O pH é controlado pela adição de solução de hidróxido de amônio ou ácido sulfúrico. O oxigênio dissolvido é controlado pela variação da velocidade de agitação e pelo aumento da composição do oxigênio na mistura de ar pulverizado/oxigênio. O antiespumante é adicionado durante o processo de fermentação para controlar a formação de espuma.
[0245] Quando a densidade celular atinge uma OD600 de > 25, um bolus de meio de alimentação é adicionado. Quando a densidade celular atinge um OD 600 de > 50, um meio de alimentação é adicionado a uma taxa de fluxo constante de 0,094 ml/volume inicial L/minuto por 32 horas até que seja reduzido para 0,052 ml/volume inicial L/minuto até o fim da fermentação. Imediatamente após o início da alimentação, uma quantidade especificada de aminoácido codificado de forma não natural, (por exemplo, p AF), solução é adicionada assepticamente para permitir a incorporação do aminoácido não natural na sequência de aminoácidos da proteína. Simultaneamente, a temperatura é deslocada de 37 °C, usada durante o crescimento, para 27 °C para produção. A produção é controlada pelo promotor phoA e começa quando os níveis de fosfato no meio estão esgotados. A colheita é iniciada aproximadamente 48 horas após a indução.
EXEMPLO 7
[0246] Purificação e conjugação a Folato e PEG-Folato : Os Fabs anti-CD3 da presente invenção são produzidos em células de E. coli e recuperados do sobrenadante de lisado de célula inteira (WCL). A lise celular é realizada a 4 °C. As células são lisadas em ácido acético 100 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, pH 3,5, em um volume igual ao volume de fermentação original, resultando em um pH pós-lise de 4,1-4,2.
[0247] Após a lise, a WCL é centrifugada a 15.900 xg por 30 minutos a 4 °C e filtrada (0,8/0,2 mícron) para remover a proteína precipitada e os resíduos celulares. A cromatografia de troca catiônica Capto S é então usada para capturar Fab anti-CD3 do sobrenadante WCL de E. coli. Após a coluna Capto S, a cromatografia de interação hidrofóbica Butyl HP (HIC) é usada como uma coluna de polimento para isolar Fab anti- CD3 intacto de impurezas relacionadas ao produto presentes no pool de eluição Capto S. O pool de eluição de Butil HP contendo Fab anti-CD3 intacto é então trocado por tampão em acetato 50 mM, trealose a 5%, pH 4,0 e concentrado para se preparar para a conjugação com folato ou PEG-folato. Esta etapa é realizada a 4 °C e utiliza a celulose regenerada Amicon Ultracel 10K (15 ml) dispositivo centrífugo.
[0248] Após a troca do tampão e concentração em acetato 50 mM, 5% de trealose, pH 4, o Fab anti-CD3 é conjugado com folato ou PEG-folato para direcionar os receptores de folato nas células cancerosas. A reação de conjugação é realizada a 28 o C, pH 4 por 24-48 horas. Após a conjugação com Folato, o Fab-Folato anti-CD3 é trocado por tampão em tampão de formulação, Histidina 50 mM, NaCl 100 mM, Trehalose 5%, pH 6,0. Essa etapa é realizada a 4 °C e utiliza o dispositivo centrífugo Amicon Ultracel 10K de celulose regenerada (15 ml). Após a conjugação com PEG-Folato, a cromatografia de troca catiônica Toyo SP 5PW é usada para separar os folatos Fab-PEG- PEG anti-CD3 não conjugados, conjugados simples e duplos.
[0249] Fab CD3 Folato-5KPEG, Fab CD3 Folato-10KPEG, Fab CD3 Folato- 20KPEG, Fab CD3 Folato-(5K2PEG, Fab CD3 Folato-(10K)2PEG, os compostos foram geradas. Ao Fab CD3 em solução tampão (acetato a 50 mM, trealose a 5% em pH 4), o folato-PEG desejado, (5K, 10K, 20K, 5K2 ou 10K2PEG), foi adicionado a 28 oC. Após uma hora, a mistura foi purificada por cromatografia de troca catiônica (Toyo SP 5PW) e formulada com histidina a 50 mM, NaCl a 100 mM, trealose a 5%, tampão de pH 6,0 usando Filtro Centrífugo (c/o 10K) para obter as composições de CD3 Fab-Folato- PEGuilado. Estruturas, química e conjugação de conjugados de Fab-Folato CD3 são aqui descritos e ilustrados nas Figuras 12A-12D.
[0250] Além disso, foram gerados conjugados de CD3 Fab Folato-PEGuilado C- terminal. Ao Folato CD3 (8,0 mg) em PBS (2,0 ml), foram adicionados EDTA (6,7 ul, 0,5 M, pH 8) e DTT (0,4 mg) e a solução incubada a 37 oC por 30 min. As misturas foram purificadas por uma coluna de dessalinização com 5 mmol de EDTA em eluente PBS. À mistura foi adicionado Mal-PEG em várias concentrações, (4,2 mg 5K, 8,2 mg 10K ou 16 mg 20K), à temperatura ambiente. Após 2 horas, a mistura foi purificada por cromatografia de troca catiônica Toyo SP 5PW para obter o conjugado CD3 Fab folato- (PEG5K)2C-terminal, conjugado de CD3 Fab folato-(PEG10K)2 C-terminal e conjugado de CD3 Fab folato-(PEG20K)2 C-terminal. Estruturas, química e conjugação de conjugados de PEG C-terminal são descritos no presente documento e ilustrados nas Figuras 12E-12F.
EXEMPLO 8
[0251] Ensaios de ligação e eliminação in vitro: Os Fabs anti-CD3 humanizados purificados com folato conjugado em vários locais da cadeia pesada (HA114, HS115, HK129, HT160) foram inicialmente testados para ligação a CD3 humano e cyno com proteínas não conjugadas correspondentes tendo pAF nessas posições, bem como a proteína WT como controles. A Tabela 6 descreve o EC50 de proteínas anti-CD3 Fab1 modificados purificados a partir de células de E. coli de PBMC humanos e Cyno activados. Como mostrado na Tabela 6, nem o pAF nem o folato conjugado nos diferentes locais interferiram significativamente na sua ligação ao CD3.
Tabela 6. Ligação de proteínas Fab1 anti-CD3 modificadas Moléculas de Fab1 EC50 de ligação EC50 de ligação Modificadas (nM) (nM) PBMC humano PBMC Cyno Fab1-WT 0,93 0,75 Fab1-HA114-pAF1 1,35 1,33 Fab1-HS115-pAF1 1,26 1,76 Fab1-HK129-pAF1 1,14 1,15 Fab1-HA114-Folato 1,27 1,37 Fab1-HS115-Folato 1,41 1,37 Fab1-HK129-Folato 1,69 2,05
[0252] A citotoxicidade desses Fabs anti-CD3 conjugados com folato foi testada com PBMCs humanos e cyno ativados com células SKOV-3 em E:T = 10:1 com e sem 50 nM de ácido fólico no soro (SFA). O ensaio de citotoxicidade foi realizado conforme descrito anteriormente (consulte, por exemplo, Angew Chem Int Ed Engl, 52 (46):12101- 12104, 2013). Resumidamente, as células efetoras (PBMC ativadas ou PBMC não ativadas) e células alvo (SKOV-3, KB etc.) em várias razões E:T foram co-incubadas em placas de 96 poços com fundo em U com concentrações variáveis de anti CD3 Fab-Folato de um dia para o outro ou conforme indicado. A quantidade de LDH liberada no meio de cultura foi usada como um índice de citotoxicidade e foi medida com um kit de ensaio de citotoxicidade não radioativo da Promega de acordo com as instruções do fabricante.
[0253] Como mostrado na Tabela 7, não houve diferença significativa na morte de EC50 entre os locais de conjugação do folato. No entanto, foi observada uma diminuição de cerca de 15-60 vezes na EC50 citotóxica quando SFA 50 nM estava presente em comparação com nenhum SFA devido à inibição competitiva pelo SFA livre. Além disso, o cyno EC50 foi cerca de 10 vezes mais elevada do que o humano EC50 para cada variante.
Tabela 7 - Citotoxicidade de proteínas Fab1 anti-CD3 modificadas para células SKOV-3 Moléculas de Fab1 Modificadas EC50 de EC50 de Eliminação Eliminação (pM) (pM) PBMC humano PBMC Cyno Sem Acido Fólico Sérico (SFA) Fab1-HA114-Folato 0,148 2,5 Fab1-HS115-Folato 0,267 4,1 Fab1-HK129-Folato 0,124 1,0
Com ácido fólico sérico a 50 nM (SFA) Fab1-HA114-Folato 9,9 139 Fab1-HS115-Folato 9,2 67 Fab1-HK129-Folato 3,3 33 EXEMPLO 9
[0254] Citotoxicidade de variantes anti-CD3-Folato contra várias linhas de células tumorais FOLRα que abrigam vários níveis do Receptor de Folato (FRα): A atividade de três diferentes conjugados de Fab-Folato anti-CD3 foi testada em locais HA114, HS115 e HK129 por ensaio de citotoxicidade in vitro com 6 linhas celulares diferentes tendo níveis variáveis de superexpressão de FRα em sua superfície celular ( Tabela 8). Os números de FRα variaram de 5.700 por célula em uma linhagem celular A549 de carcinoma de células epiteliais basais alveolares a 1.630.000 por célula em uma linhagem celular de câncer nasofaríngeo. As células foram co-cultivadas com células mononucleares de sangue periférico humano ativadas (PBMCs; razão 1:10 de células alvo:efetoras) e tratadas com várias concentrações de Fab-Folato anti-CD3 na presença de SFA 50 nM. A citotoxicidade foi quantificada medindo os níveis de LDH liberados das células lisadas e com ensaios de toxicidade com base em CellTiter-Glo e FACS.
Tabela 8 - Citotoxicidade de variantes de anti-CD3-Folato contra várias linhas de células tumorais FRα Linhagem Fab1-HA114- Fab1- Fab1- Receptor Celular Folato, HS115- HK129- de EC50 (pM) Folato, Folato, FOLRα EC50 (pM) EC50 (pM) No A549 Sem Sem Sem 5.700 atividade atividade atividade
OV-90 81,8 34,0 22,2 10.200 OVCAR- 10,6 7,5 4,9 15.400 3 SKOV-3 18,9 16,3 10,7 21.800 N87 Não testado Não testado 26,7 21.600 KB Não testado Não testado 0,72 1.630.000
[0255] Os conjugados de Fab-Folato anti-CD3 em todos os três locais diferentes de conjugação demonstraram morte eficiente de todas as 5 linhas celulares com FRα acima de 10K. No entanto, nenhuma eliminação foi observada com a linhagem celular A549 com quaisquer conjugados de local tendo FRα de 5.700. Parece haver um limite de cerca de 10.000 FRα para morte eficiente; no entanto, a atividade de matar parece ser independente dos números de FRα acima desse valor limite de 10K. Desde EC50 de eliminação in vitro não variou significativamente no local de conjugação de folato no anticorpo, a posição HK129 foi escolhida como um local de conjugação de folato para outros experimentos.
EXEMPLO 10
[0256] Este exemplo demonstra os efeitos na afinidade de ligação in vitro e na atividade citotóxica de várias moléculas anti-CD3 Fab1-HK129-pAF após a conjugação Folato-PEG em um único local ou adição de um segundo Folato (BiFolato).
[0257] Efeitos da conjugação de folato-PEG: A Tabela 9 mostra os efeitos sobre a ligação e a citotoxicidade da Tabela 10 após a conjugação de uma molécula de PEG linear 5K ou 20K com Folato usando um ligante bi-funcional como aqui descrito. Uma redução modesta (1,7 a 8,4 vezes) na ligação foi observada para PBMCs humanos e cyno ativados, dependendo do tamanho de PEG 5K ou 20K. Mas a atividade citotóxica foi drasticamente reduzida com PEG 20K em comparação com PEG 5K (3,7 a 5,6 vezes vs 50 a 58 vezes) para PBMCs humanos e cyno. Com base nesta experiência, 5K PEG em vez de 20K PEG foi usado para extensão da meia-vida.
Tabela 9 - Ligação de CD3 Moléculas de Fab1 EC50 de Redução EC50 de Redução modificadas ligação de em vezes ligação de em vezes PBMC na PBMC Cyno na humano (nM) ligação (nM) ligação Fab1-HK129-Folato 2,78 - 1,41 - Fab1-HK129-5KPEG- 5 1,9 2,46 1,7 Folato Fab1-HK129-20KPEG- 12 4,3 11,81 8,4 Folato Tabela 10- Citotoxicidade Moléculas de Fab1 PBMC Redução PBMC Cyno Redução modificadas humano em vezes EC50 de em vezes EC50 de na Eliminação na Eliminação eliminaçã (pM) eliminaçã (pM) Fab1-HK129-Folato 6,69 - 15,6 - Fab1-HK129-5KPEG- 37,1 5,6 57,9 3,7 Folato Fab1-HK129-20KPEG- 335 50 904 58 Folato
[0258] Efeitos da conjugação de Folato duplo (BiFolato): A Tabela 11 mostra os efeitos de uma segunda conjugação de Folato em dois locais da cadeia leve (LL157 e LK172) em combinação com o local HK129 da cadeia pesada na ligação in vitro e a Tabela 12 mostra a citotoxicidade. Esperançosamente, um aumento modesto na afinidade de ligação e na atividade citotóxica foi observado com variantes BiFolato em relação à molécula de Folato única de HK129. O aumento modesto na citotoxicidade de moléculas de folato duplo vs simples também foi evidente com a presença ou ausência de SFA 50 nM. Com base nesta experiência, o local LL157 sobre o local LK172 foi usado em combinação com o local HK129 para estudos futuros.
Tabela 11 - Ligação de CD3 Células Moléculas de PBMC humano Aumento SKOV-3 (com Aumento Fab1 EC50 de em vezes SFA a 50 nM); em vezes modificadas ligação (nM) de ligação EC50 de de ligação Ligação (nM) Fab1-HK129- 2,45 - 44,5 - Folato Fab1-HK129- 1,93 1,3 19,8 2,2 LL157-BiFolato Fab1-HK129- 2,85 0,86 10 4,4 LK172-BiFolato Tabela 12 - Citotoxicidade PBMC Aumento
PBMC humano, em vezes Aumento em humano, SFA a 50 na vezes na Moléculas de sem SFA; nM; EC50 potência potência (folato Fab1 modificadas EC50 de de (folato simples vs Eliminação Eliminação simples duplo) (pM) (pM) vs duplo) Fab1-HK129- 11,41 - 0,195 - Folato Fab1-HK129- 1,76 6,5 0,067 2,9 LL157-BiFolato Fab1-HK129- 4 2,9 0,044 4,4 LK172-BiFolato
[0259] Resumo da afinidade de ligação e citotoxicidade in vitro: A Tabela 13 resume os efeitos na ligação e atividades citotóxicas de vários Fabs anti-CD3 devido à PEGuilação e segunda conjugação de Folato. Uma diminuição modesta na afinidade de ligação a CD3 e FRα resulta em uma diminuição significativa na potência e está correlacionada com o tamanho do PEG. A conjugação de moléculas BiFolato aumentou a afinidade para FRα e, assim, a potência citotóxica, apesar de alguma redução na afinidade de ligação a CD3. Apesar de uma diminuição na afinidade para ambos os alvos devido à conjugação de PEG, o EC50 de morte in vitro de todas as moléculas de CD3- Fab-Folato manteve alta potência na faixa de 37 a 335 pM.
Tabela 13 - Atividades de ligação e citotóxicas de vários Fabs anti-CD3 PEGuilados.
Afinida Razão EC50 Afinidad Mudanç de de de de e de Moléculas de Fab1 a de ligação afinid Modificação Elimin ligação modificadas potênci de ade ação de FRα a CD3 (FRα: pM (nM) (nM) CD3) Fab1-HK129- Líder de 3-15 - 1,69 59,6 35 Folato Folato Diminui Fab1-HK129- ção de 5KPEG 37 5 129 26 5KPEG-Folato 5,6 vezes Diminui Fab1-HK129- ção de 20KPEG 335 12 310 26 20KPEG-Folato 50 vezes Aument Fab1-HK129- BiFolato 1,8 o de 6,5 1,93 19,8 10 LL157-BiFolato vezes
Aument Fab1-HK129- BiFolato 4 o de 2,9 2,85 10 3,5 LK172-BiFolato vezes Exemplo 11
[0260] Efeitos de várias razões de células efetoras para células-alvo (E:T) na citotoxicidade de células SKOV-3 por moléculas de Fab1 anti-CD3: Para testar os efeitos das razões E:T na citotoxicidade de células SKOV-3, os ensaios de citotoxicidade de 3 moléculas Fab1 anti-CD3 foram realizados em razões E:T de 10:1, 5:1, 1:1, 1:5 e 1:10 na presença de SFA 50 nM. Como esperado e mostrado na Tabela 14, as razões E:T correlacionadas com a potência de morte in vitro. Em um E:T = 1:1, foi observado um aumento de 2 vezes na EC50 para molécula de BiFolato ao passo que uma diminuição de 8 vezes foi observada com uma molécula de 5KPEG-folato. Todas as três moléculas permaneceram altamente potentes com EC50 de 1,69 a 175 pM dentro das razões E:T de 10:1 a 1:10. Tabela 14 - Razões entre células Efetoras e Alvo (E:T) na citotoxicidade in-vitro Razão de Fab1-HK129- Fab1-HK129-5KPEG- Fab1-HK129-LL157-Bi- E:T Folato Folato Folato EC50 citotóxico EC50 citotóxico (pM) EC50 Citotóxico (pM) (pM) 10:1 4,22 22,1 1,69 5:1 6,68 28,4 3,08 1:1 10,50 83,5 5,37 1:5 13,93 210,4 10,4 01:10 13,82 175,2 26,16 Exemplo 12
[0261] PEGilação de moléculas Fab1 anti-CD3 para estender a meia-vida plasmática: As propriedades farmacocinéticas dos conjugados Fab1-Folato anti-CD3 com e sem conjugação de PEG em ratos foram examinadas. Foram utilizados ratos Sprague Dawley machos (cerca de 7 semanas de idade). No dia da administração, o peso de cada animal foi medido. 1 mg por kg de peso corporal das amostras de anticorpos anti-CD3 não conjugados e conjugados foram cada uma injetada por via intravenosa na veia da cauda de três ratos. Em diferentes momentos após a injeção, 500 μl de sangue foram retirados de cada rato sob anestesia com CO 2. As amostras de sangue foram armazenadas em temperatura ambiente por 1,5 horas seguidas do isolamento do soro por centrifugação (4ºC, 18000 xg por 5 minutos). As amostras de soro são armazenadas a - 80ºC até o dia da análise. A quantidade de anticorpo anti-CD3 ativo nas amostras de soro foi quantificada pelo ensaio de atividade in vitro do anticorpo anti-CD3 após descongelamento das amostras em gelo.
[0262] Como mostrado na Figura 3, a concentração sérica diminuiu rapidamente para dois Fab1-Folatos anti-CD3 e o Fab1 anti-CD3 não conjugado correspondente na mesma taxa com uma meia-vida sérica de menos de uma hora. Em contraste, a meia- vida sérica de dois Fab1s anti-CD3 conjugados com PEG foi significativamente estendida para 6,1 horas e 10,6 horas para 5KPEG e Bi5KPEG, respectivamente. A Tabela 15 mostra vários parâmetros PK após a administração IV de várias moléculas Fab1 anti-CD3 em ratos. Estes dados ilustram que Bi5KPEG-BiFolato estende T1/2 e aumenta a AUC significativamente (13,2 vezes sobre Fab1-Folato e 3,9 vezes sobre Fab1-5KPEG- Folato), (Tabela 15).
Tabela 15 - Farmacocinética de várias moléculas de Fab1 em ratos Grupo 1 2 3 4 5 Dose (mg/kg) 1 1 1 1 1 Fab1-HK129- Fab1- Fab1-HK129- Fab1-HK129- Fab1-HK129- LL157- Molécula HK129- 5KPEG- pAF LL157-BiFolato Bi5KPEG- Folato Folato BiFolato Parâmetro PK Médio SD Médio SD Médio SD Médio SD Médio SD C0 (ng/ml) 18500 2350 18400 2940 19500 3960 22600 2590 40600 31800 Cmax (ng/ml) 13700 1070 14100 1450 17400 2610 16400 1720 28800 15300 Tmax (h) 0,0833 0 0,0833 0 0,0833 0 0,0833 0 0,0833 0 AUClast (ng*h/ml) 6150 491 7880 550 27400 472 9050 666 107000 7980 Tlast (h) 6 0 6 0 40 13,9 6 0 72 0 AUCinf (ng*h/ml) 6160 486 8180 1020 27500 451 9070 667 108000 8030 Cl (ml/h/kg) 163 12,4 124 14,6 36,4 0,593 111 8,13 9,33 0,681 Vss (ml/kg) 55,1 5,91 92,9 70,1 81,9 11,4 44,6 5,02 59,2 3,86 T1/2 (h) 0,618 0,0699 0,865 0,394 6,1 2,99 0,596 0,00115 10,6 2,64 % de AUC Extrap 0,21 0,176 3,22 5,21 0,313 0,0816 0,121 0,000553 0,398 0,0974 Rsq 0,819 0,0645 0,73 0,238 0,921 0,0423 0,904 0,0119 0,964 0,0445 EXEMPLO 13
[0263] Este exemplo demonstra a geração e teste por variantes de anticorpos anti-CD3 de baixa afinidade em células HEK293.
[0264] Deconvolução do dorso do rato e mutações da linhagem germinativa Resíduos de arcabouço de camundongo (mutações reversas) para ambas as sequências vH e vL obtidas durante a humanização do anticorpo anti-CD3 foram examinados revertendo-os de volta aos resíduos da linhagem germinativa humana um por vez para consulte seus efeitos na ligação de antígeno (deconvolução). Para a sequência de vH, 4 resíduos de arcabouço de camundongo (mutações reversas) nas posições Kabat 30, 49, 77 e 93 foram previstos para desempenhar papéis críticos na ligação de antígeno
(Tabelas 2-3 e 16-17). Da mesma forma, para a sequência vL, 5 resíduos de arcabouço de camundongo (mutações reversas) nas posições Kabat 36, 46, 49, 57 e 58 também foram previstos para desempenhar papéis críticos na ligação de antígeno.
Tabela 16 - Posições de retro-mutação e da linhagem germinativa da cadeia leve Fab1 anti-CD3 Posição Kabat 36 46 49 53 57 58 Camundongo AA V G G K G V AA humano F T Y W T Linha germinativa de camundongo AA N ID de LC # Ciclo# vL1.0 R0 F T Y K W T vL1.1 R0 V G G K G V vL1.2 R0 V G G K G T vL2.1 R1 F G G K G V vL2.2 R1 V T G K G V vL2.3 R1 V G Y K G V vL2.4 R1 V G G K W V vL2.5 R2 F G G K W V vL3.1 R2 V G G N G T Tabela 17 - Posições de retro-mutação e mutação da linhagem germinativa e da cadeia pesada de Fab1 anti-CD3.
Posição Kabat 30 35 49 52c 77 93 Camundongo AA N N A Y I V AA humano S G S A Linha germinativa de camundongo AA H S M ID de HC# Ciclo# vH1.0 R0 N N G Y S V vH1.1 R0 N N A Y S V vH1.2 R0 N N A Y I V vH2.1 R1 S N A Y I V vH2.2 R1 N N G Y I V vH2.3 R1 N N A Y I A vH2.4 R2 S N G Y S V vH2.5 R2 N N G Y S A vH2.6 R2 S N G Y S A vH3.1 R2 N H A Y I V vH3.2 R2 N N A S I V vH3.3 R2 N H A S I V
[0265] Para avaliar os efeitos na ligação de antígeno (deconvolução), 4 novos plasmídeos vL (vL2.1 a vL2.4) e 3 novos vH (vH2.1 a vH 2.3) (plasmídeos Rodada 1 nas Tabelas 16-17) foram gerados. Estes plasmídeos vH e vL foram usados com os plasmídeos vH e vL originais descritos nos Exemplos acima (plasmídeos Rodada 0 nas Tabelas 16-17) em uma experiência de co-transfecção com células HEK293. Um total de 35 transfecções transitórias foram realizadas na triagem da Rodada 1 e os sobrenadantes da cultura de células foram usados diretamente para a triagem da ligação conforme descrito abaixo e nos Exemplos acima.
[0266] Com base nos resultados da triagem da Etapa 1, três (3) plasmídeos vH adicionais (vH2.4 a 2.6) (plasmídeos da Etapa 2 nas Tabelas 16-17) foram gerados para avaliar os efeitos aditivos de mutações individuais anteriores. De forma semelhante, um novo plasmídeo para vL (vL2.5) foi gerado pela combinação de duas mutações nas costas do rato. Além disso, as mutações da linhagem germinativa de camundongos encontradas nos CDRs de vH e vL foram analisadas para conferir ligação reduzida nesta rodada. Para este fim, 3 novos plasmídeos vH (vH3.1 a 3.3) (plasmídeos da Rodada 2 nas Tabelas 16-17) foram gerados alterando os aminoácidos na posição Kabat N35 em HC-CDR1 e em Y52c em HC-CDR2. De um modo semelhante, um plasmídeo vL (vL3.1) (plasmídeos da Rodada 2 nas Tabelas 16-17) foi gerado alterando o aminoácido na posição Kabat K53 em LC-CDR2. A experiência de triagem da Rodada 2 foi realizada com um total de 43 transfecções combinando seletivamente vários pares de plasmídeo vL/vH.
[0267] Rastreamento para ligação de CD3 humano e cyno: Os sobrenadantes da cultura HEK293 foram usados diretamente para testar a ligação ao CD3 humano na fase de triagem. No experimento da Rodada 1, inicialmente 35 clones foram testados quanto à ligação ao CD3 humano em três concentrações de proteína diferentes, e 13 foram selecionados para ensaios de ligação detalhados para CD3 humano e cyno. Uma curva de titulação de ligação de 11 pontos foi gerada tanto para humanos (Figura 4A) e cyno CD3 (Figura 4B) para cada clone. Com base nos dados, Fabs 7 a 10 foram selecionados como candidatos de baixa afinidade para avaliação posterior (Figuras 4A-4B). Da mesma forma, 43 clones foram selecionados no experimento da Rodada 2. Após a triagem de dois estágios, conforme descrito acima para a Rodada 1, foram obtidas 11 variantes de baixa afinidade, das quais 4 são representadas como mostrado nas Figuras 5A-5B.
[0268] Estas 15 variantes de Fab anti-CD3 de baixa afinidade (Fabs 7-10 da Rodada 1 e Fabs 11-21 da Rodada 2) foram então transicionadas para o sistema de expressão de E. coli para incorporação de aminoácidos não naturais (UAA) e testes adicionais conforme descrito em Exemplos abaixo. Figura 6A mostra os conjugados Fab- Folato dos mesmos Fabs de tipo selvagem como mostrado na Figura 4A. Conjugados Fab-Folato representativos dos Fabs de tipo selvagem obtidos na triagem da Rodada 2 estão representados na Figura 6B. A Tabela 18 mostra a lista de mutações de baixa afinidade, bem como suas HC, LC e Fab IDs. Como mostrado, tanto as retro-mutações de arcabouço de camundongo quanto as mutações de CDR de linhagem germinativa desempenharam papéis significativos em conferir ligação reduzida a CD3 humano e cyno. Na cadeia leve variável (vL), 5 resíduos do dorso do camundongo nas posições Kabat V36, G46, G49, G57 e V58 e um resíduo da linha germinal do camundongo na posição Kabat K53 em LC-CDR2 estiveram envolvidos na ligação reduzida. Na cadeia pesada variável (vH), 4 resíduos de camundongo nas posições Kabat N30, A49, I77 e
V93 e dois resíduos de linhagem germinativa de camundongo na posição Kabat N35 em HC-CDR1 e na posição Y52c em HC-CDR2 estavam envolvidos na ligação reduzida. Tabela 18 - Lista de mutações em variantes de Fab anti-CD3 humanizado de baixa afinidade No de ID de ID de Mutação(ões) de LC Mutação(ões) de HC Fab LC HC Fab1 vL1.2 V36/G46/G49/G57/V58T vH1.2 N30/A49/I77/V93 Fab7 vL2.4 V36/G46/G49/G57W/V58 vH2.3 N30/A49/I77/V93A Fab8 vL2.1 V36F/G46/G49/G57/V58 vH2.2 N30/A49G/I77/V93 Fab9 vL2.1 V36F/G46/G49/G57/V58 vH1.0 N30/A49G/I77S/V93 Fab10 vL2.1 V36F/G46/G49/G57/V58 vH2.1 N30S/A49/I77/V93 Fab11 vL1.0 V36F/G46T/G49Y/G57W/V58T vH2.4 N30S/A49G/I77S/V93 Fab12 vL2.1 V36F/G46/G49/G57/V58 vH2.4 N30S/A49G/I77S/V93 Fab13 vL2.5 V36F/G46/G49/G57W/V58 vH2.4 N30S/A49G/I77S/V93 Fab14 vL2.1 V36F/G46/G49/G57/V58 vH2.5 N30/A49G/I77S/V93A Fab15 vL2.2 V36/G46T/G49/G57/V58 vH2.5 N30/A49G/I77S/V93A Fab16 vL2.1 V36F/G46/G49/G57/V58 vH2.6 N30S/A49G/I77S/V93A Fab17 vL2.5 V36F/G46/G49/G57W/V58 vH1.0 N30/A49G/I77S/V93 Fab18 vL2.5 V36F/G46/G49/G57W/V58 vH2.2 N30/A49G/I77/V93 Fab19 vL1.2 V36/G46/G49/G57/V58T vH3.1 N30/N35H/A49/Y52c/I77/V93 Fab20 vL3.1 V36/G46/G49/K53N/G57/V58T vH3.1 N30/N35H/A49/Y52c/I77/V93 Fab21 vL3.1 V36/G46/G49/K53N/G57/V58T vH3.2 N30/N35/A49/Y52cS/I77/V93 Tabela 19 - Sequências de aminoácidos de cadeias pesadas (vH+CH1), (vH+CH1-DKTHT) e leves (vL+CL) anti-CD3 humanizadas usadas na triagem para variante de baixa afinidade de Fabs em células HEK293 SEQ. SEQUÊNCI ID. NO. A DE
CADEIA
21 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.3+CH QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK 1-DKTHT) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 22 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.2+CH QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS 1-DKTHT) KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWG
QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV
PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 23 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.1+CH QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK 1-DKTHT) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 24 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.4+CH QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS 1-DKTHT) KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW
GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 25 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.5+CH QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS 1-DKTHT) KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYW
GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 26 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.6+CH QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS 1-DKTHT) KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYW
GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 27 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVR (vH3.1+CH QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK 1-DKTHT) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 28 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH3.2+CH QAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK
1-DKTHT) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 29 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVR (vH3.3+CH QAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK 1-DKTHT) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ
GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 30 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.3+CH) QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK
NILYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 31 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.2+CH) QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS
KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKD YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTV
PSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 32 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.1+CH) QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK
NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 33 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.4+CH) QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS
KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 34 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.5+CH) QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS
KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 35 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.6+CH) QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS
KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 36 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVR (vH3.1+CH) QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK
NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 37 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH3.2+CH) QAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK
NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 38 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVR (vH3.3+CH) QAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK
NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP
SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 39 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL2.3+CL) QKPGQAPRGLIYGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLS
GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0269] SEQ. ID. NOs: 21 a 29 representam sequências de aminoácidos de cadeias pesadas com uma extensão C-terminal 5-aa - DKTHT usado na triagem de Fabs variantes de baixa afinidade. SEQ. ID. NOs: 30 e 38 representam essas sequências de aminoácidos de cadeia pesada humanizada sem uma extensão C-terminal de cadeia pesada 5-aa. SEQ. ID. NO: 39 representam a sequência de aminoácidos de uma cadeia leve usada na triagem de Fabs variantes de baixa afinidade em células HEK293. EXEMPLO 14
[0270] Este exemplo demonstra a construção, expressão, purificação e teste de variantes de Fab anti-CD3 humanizado de baixa afinidade produzidas a partir de células de E. coli com mutação âmbar de HK129 de cadeia pesada.
[0271] Clonagem em vetor de expressão de E. coli: Genes sintéticos foram projetados para todas as variantes de baixa afinidade reveladas na Tabela 20, SEQ. ID NOs: 40-62 com a arquitetura de cassete de expressão STII-LC-Spacer-STII-HC com códon de parada Amber TAG inserido na posição HK129 da cadeia pesada e clonado no vetor de expressão de E. coli proprietário conforme descrito nos Exemplos acima. As sequências de aminoácidos de ambas as cadeias pesada e leve usadas para manipular esses Fabs são mostradas como SEQ. ID. NOs: 40 a 62. SEQ. ID. NOs: 40 a 48 representam as variantes de pAF de HK129 de cadeia pesada humanizada com uma extensão C-terminal de cadeia pesada 5 aa - DKTHT usada em testes. SEQ. ID. NOs: 49 e 57 representam estas variantes de pAF de HK129 de cadeia pesada humanizada sem uma extensão C-terminal de cadeia pesada 5 aa - DKTHT. SEQ. ID. NOs: 58-62 representam sequências de cadeia leve usadas em combinação com as variantes HK129pAF-DKTHT de SEQ. ID. NOs: 40 a 48 que foram expressos em E. coli e posteriormente caracterizados.
[0272] Tabela 20 - Sequências de aminoácidos de sequências de cadeia leve e pesada de Fab-HK129pAF anti-CD3 de baixa afinidade expressas em E. coli. Também são reveladas todas as sequências na tabela abaixo, em que pAF é substituído por qualquer outro aminoácido não natural.
SEQ. ID. CADEIA SEQUÊNCIA NO. 40 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.3+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK - HK129pAF- NILYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ DKTHT) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 41 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.2+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS
- HK129pAF- KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWG DKTHT) QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLV
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 42 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.0+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS - HK129pAF- KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW DKTHT) GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 43 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.1+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK - HK129pAF- NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ DKTHT) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 44 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.4+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS - HK129pAF- KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW DKTHT) GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 45 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.5+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS - HK129pAF- KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYW DKTHT) GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 46 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.6+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS - HK129pAF- KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYW DKTHT) GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 47 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVR (vH3.1+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK - HK129pAF- NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ DKTHT) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 48 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH3.2+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK - HK129pAF- NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ DKTHT) GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHT 49 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.3+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK - HK129pAF) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 50 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.2+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS - HK129pAF) KNILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLV
KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 51 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH1.0+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS - HK129pAF) KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 52 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.1+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK - HK129pAF) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 53 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.4+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS - HK129pAF) KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 54 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH2.5+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS - HK129pAF) KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV
VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 55 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVR (vH2.6+CH1 QAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDS - HK129pAF) KNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYW GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCL
VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
56 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMHWVR (vH3.1+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK - HK129pAF) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 57 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVR (vH3.2+CH1 QAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSK - HK129pAF) NILYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQ GTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSpAFSTSGGTAALGCLVK
DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC 58 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL2.4+CL ) QKPGQAPRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLS
GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 59 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQ (VL2.1+CL) QKPGQAPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLS
GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 60 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWFQ (vL2.5+CL) QKPGQAPRGLIGGTNKRAPWVPARFSGSLLGGKAALTLS
GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA
CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 61 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL2.2+CL) QKPGQAPRTLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTLSG
AQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACE
VTHQGLSSPVTKSFNRGEC 62 LC QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQ (vL3.1+CL) QKPGQAPRGLIGGTNNRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLS
GAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYA CEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0273] Fermentação, purificação e conjugação com folato: A fermentação de E.
coli, purificação, conjugação com folato e purificação pós-conjugação foram realizadas como descrito nos Exemplos acima.
[0274] Ligação de Fabs conjugados com folato a CD3 humano e cyno: A ligação de E. coli produzida e variantes de baixa afinidade conjugadas com folato de Fabs anti- CD3 humanizados foi realizada como descrito nos Exemplos acima. As Figuras 6A-6B mostra as afinidades de ligação ao CD3 humano para dois subconjuntos de variantes de Fab de baixa afinidade de Fab-HK129-Folato anti-CD3 juntamente com o Fab1 de controle positivo. Dos Fabs de baixa afinidade testados, 10 falharam em se ligar significativamente ao CD3 humano, mesmo na concentração testada mais alta (1000 nM). A EC50 de ligação do restante 4 Fabs (Fabs 7 a 10; descritos na Tabela 18) variou de 23,4 nM a 83,6 nM em comparação com o controlo Fab1 que é a 2,31 nM. Fab 21 mostrou fraca atividade de ligação que não saturou mesmo a 1000 nM conc. Um perfil de ligação muito semelhante foi observado para a ligação de CD3 cyno como mostrado nas Figuras 7A-7B.
[0275] Ensaio de citotoxicidade de Fabs conjugados com folato com PBMC humano e cyno: A citotoxicidade dos Fabs de baixa afinidade foi realizada conforme descrito nos Exemplos acima. Figura 8 mostra os dados de citotoxicidade de PBMC humanos ativados com células SKOV-3. Como mostrado, todos os 4 Fabs com afinidade de ligação reduzida de 10 a 36 vezes para CD3 humano (Figuras 6A-6B) mostrou atividade de morte comparável em comparação com o controle Fab1 (Figura 8). Três Fabs (Fabs 11, 19 e 20) não mostraram qualquer atividade citotóxica (dados não mostrados). Todos os outros 8 Fabs mostraram atividade de morte considerável, embora eles não conseguissem se ligar mesmo a uma concentração de 1000 nM. Perfil citotóxico muito semelhante foi observado com cyno PBMC ativado (Figura 9).
EXEMPLO 15
[0276] Este exemplo demonstra a ativação de células T e ensaios de liberação de citocinas de variantes de anticorpos anti-CD3 humanizados de baixa afinidade.
[0277] Ensaios de ativação de células T/liberação de citocinas: Células T humanas purificadas e PBMCs humanas depletadas de células T foram isoladas do mesmo volume de sangue total por EasySep Human T cell Enrichment Kit e EasySep Human CD3 Positive Selection Kit (STEMCELL Technologies Inc), respectivamente. A pureza das células T isoladas e das células acessórias foi confirmada por citometria de fluxo. Para monitorar seletivamente a ativação de células T na presença de células acessórias, as células T purificadas foram marcadas com o kit de marcação de células Cellvue Lavender (eBioscience), de acordo com o protocolo do fabricante, antes de misturar com PBMCs humanos depletados de células T. Os PBMCs reconstituídos resultantes foram incubados com células alvo na presença de variantes de Fab anti-CD3.
Após 48 h, as células foram marcadas com CD25 anti-humano conjugado com APC-Cy7 (Biolegend) ou CD69 anti-humano conjugado com PE (BD Biosciences) e analisadas por citometria de fluxo. A liberação de IFNγ e TNFα no sobrenadante cultivado foi medida pelo kit de ensaio imunoenzimático (ELISA) (R&D System).
[0278] Conforme mostrado nas Figuras 10A-10B, a ativação significativa de células T (por marcadores de células T CD25 e CD 69) alcançada na presença de células SKOV-3 é fortemente dependente da dose de várias moléculas de Fab-HK129-Folato anti-CD3 de baixa afinidade. Correlação semelhante foi observada para ensaios de liberação de citocina para IFNγ Figuras 11A-11B na ausência e presença de células tumorais SKOV-3 respectivamente e TNFα Figuras 11C-11D na ausência e presença de células tumorais SKOV-3, respectivamente.
[0279] Resumo da caracterização de variantes de baixa afinidade: A Tabela 21 resume os dados de ligação e citotoxicidade, (CD3 humano e cyno), bem como ativação de células T (marcadores CD25 e CD69) e liberação de citocinas (IFNγ e TNFα), ensaios para 12 Fab anti-CD3 de baixa afinidade variantes com modificação de HK129-Folato.
Como mostrado, existe uma correlação geral entre a força de ligação de CD3, potencial citotóxico, ativação de células T e liberação de citocina. Tabela 21 - Sumário da ligação de CD3, citotoxicidade in vitro, ativação de células T e liberação de citocina por várias variantes de baixa afinidade de Fab-HK129-Folato anti-CD3.
Ativação Moléculas de Citotoxicidade Ligação em Liberação Citotoxicidade com de Fab com PBMC CD3, EC50 de PBMC cyno células modificadas humano (nM) citocina
T EC50 Diminuição EC50 Diminuição CD25 e IFNγ + Humano/Cyno (pM) em vezes (pM) em vezes CD69 TNFα Fab1-HK129- 14,03 32,95 2,31/3,3 +++ +++ Folato Fab7-HK129- 29,6 2,1 38,56 1,2 23,4/20,2 +++ +++ Folato Fab8-HK129- 221 15,8 173,3 5,3 78,3/129,9 +++ ++ Folato Fab9-HK129- 250 17,8 295,4 9,0 69,1/93,1 ++ ++ Folato Fab10-HK129- 311,1 22,2 590,15 17,9 83,6/99,5 ++ + Folato Fab12-HK129- 1299,6 92,6 1280,4 38,9 Mínimo ++ + Folato Fab13-HK129- 339,6 24,2 647,2 19,6 Mínimo ++ ++ Folato Fab15-HK129- 1153,3 82,2 437,2 13,3 Mínimo ND +/- Folato Fab16-HK129- 1019,2 72,6 261,6 7,9 Mínimo ND +/- Folato Fab17-HK129- 2380 169,6 994,2 30,2 Mínimo ND +/-
Folato Fab18-HK129- 2161 154,0 543,6 16,5 Mínimo ND +/- Folato Fab21-HK129- 91,32 6,5 42,9 1,3 ND ND +++ Folato
[0280] Com base no conjunto de dados, três variantes de baixa afinidade Fab9, Fab10, Fab21, foram selecionadas juntamente com a molécula parental Fab1 para caracterização in vitro detalhada, incluindo testes in vivo em camundongos. A Tabela 22 mostra a comparação entre essas variantes no que diz respeito à citotoxicidade e produção de duas citocinas. Como mostrado, a produção de citocina tem muito mais elevado do que aqueles EC50 para a activação de células T e morte. Assim, pode ser possível identificar uma gama de concentrações de Fab anti-CD3 em que a liberação de citocinas não representa problemas de segurança significativos, mas a potência de eliminação e a ativação de células T não estão comprometidas. Esta abordagem de afinidade de afinidade de anticorpo anti-CD3 pode permitir o desacoplamento desses dois eventos opostos e alcançar um melhor perfil de segurança sem comprometer a eficácia.
[0281] Tabela 22 - Caracterização de 3 variantes selecionadas de baixa afinidade com modificação de HK129-Folato Citotoxicidade Citotoxicidade Moléculas de Fab Liberação de Liberação de com PBMC com PBMC modificadas IFNγ TFNα humano cyno EC50 (pM) EC50 (pM) EC50 (pM) EC50 (pM) Fab1-HK129- 14,03 32,95 235 84,5 Folato Fab9-HK129- 250 295,4 1833 1164 Folato Fab10-HK129- 311,1 590,15 3274 797 Folato Fab21-HK129- 91,32 42,9 5276 691 Folato
EXEMPLO 16:
[0282] Análise de imunogenicidade in-silico de Fab1, 9 e 10 anti-CD3: Para avaliar a potencial imunogenicidade, as sequências de aminoácidos de Fab1, Fab9 e Fab10 anti-CD3 foram escaneadas in-silico para a presença de epítopos restritos de classe II de antígeno leucocitário humano putativo (HLA), também conhecidos como epítopos de células T auxiliares (Th) baseado na plataforma Epibase da Lonza usando as configurações 'HLA class II - Global v4.0' (Lonza, Reino Unido). As especificidades de ligação de HLA de todos os possíveis peptídeos 10-mer derivados de uma sequência alvo foram analisadas. O perfilamento foi realizado no nível de alótipo para 43 DRB1, 8 DRB3/4/5, 22 DQ e 12 DP, ou seja, 85 alótipos HLA classe II no total. Os peptídeos correspondentes a peptídeos próprios foram tratados separadamente como peptídeos "filtrados pela linhagem germinativa". Como uma visão geral dos resultados, a Tabela 23 mostra o número de ligantes fortes correspondentes aos genes DRB1, DRB3/4/5, DQ e DP (contagens de epítopos). Como na resposta humoral levantada contra um antígeno, a ativação/proliferação de células Th observada é geralmente interpretada em termos da especificidade de DRB1. Os resultados na Tabela 23 mostram que Fab 1, Fab9 e Fab10 corresponderam a fortes ligantes potenciais de DRB1 13, 11 e 13, respectivamente. A Tabela 24 mostra as pontuações de risco de DRB1 para cada um destes 3 Fabs na população global são comparáveis aos dos anticorpos terapêuticos humanizados. Dos 3 Fabs, Fab9 é o menos imunogênico.
Tabela 23. Ligantes de HLA correspondentes aos genes DRB1, DRB3/4/5, DQ e DP (contagens de epítopos).
Sequência DRB1 DRB3/4/5 DQ DP Fab1-HC 6 2 2 2 Fab1-LC 7 0 1 4 Fab1-Total 13 2 3 6 Fab9-HC 4 2 2 2 Fab9-LC 7 0 2 4 Fab9-Total 11 2 4 6 Fab10-HC 6 1 1 2 Fab10-LC 7 0 2 4 Fab10-Total 13 1 3 6 Tabela 24. Pontuações de risco DRB1 dos 3 Fabs na população global.
Fab LC HC Total Fab1 477,5 748,6 1226,1 Fab9 521,4 488,1 1009,5 Fab10 521,4 720 1241,4 Exemplo 17
[0283] Projeto e síntese de ligantes de PEG-Folato bifuncionais ilustrados nas Figuras 12A-12F. Este exemplo demonstra as rotas e estruturas sintéticas de vários compostos ligantes de PEG-Folato.
[0284] Este exemplo demonstra rotas sintéticas para a síntese do composto 10.
[0285] Ácido N10-trifluoroacetilpteroico (2). A 1,0 g de ácido Pteroico (1) em um frasco de fundo redondo foram introduzidos 10 ml de anidrido trifluoroacético sob azoto, em gotas, durante 10 minutos.
A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas ao abrigo da luz.
A solução marrom escura foi filtrada através de um bloco de celite e evaporada.
O óleo marrom viscoso resultante foi triturado com éter e o precipitado separado foi recolhido por filtração, lavado com éter e seco sob vácuo de um dia para o outro para proporcionar o intermediário em bruto como um pó marrom claro. O material acilado bruto foi ressuspenso em THF anidro e tratado com gelo. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 10 horas; precipitado marrom claro separado durante este tempo. A mistura de reação foi diluída com éter e o precipitado foi coletado por filtração, lavado com éter e seco sob vácuo de um dia para o outro para se obter ácido N 10 - trifluoroacetilpteroico ( 2 ) (1,45 g em bruto ) como um pó marrom claro que foi usado na próxima reação sem purificação adicional.
[0286] Éster OSu de Ácido N10-trifluoroacetilpteroico (3). A solução de ácido N10-trifluoroacetilpteroico (2) em DMSO anidro foi tratada com N-hidroxisuccinimida (0,43 g), seguido por EDCI-HCl (2,04 g) em uma porção à temperatura ambiente. A solução escura resultante foi agitada durante 24 horas à temperatura ambiente e diluída com água gelada (40 ml). O precipitado fino marrom separado foi recolhido por centrifugação, lavado com água fria, seco ao ar de um dia para o outro e sob vácuo durante 1 dia para obter o composto ( 3 ) como pó marrom, MS (ESI) m/z 506 (M + H) +.
[0287] Fmoc-Glu-OtBu-Lys(Boc)-O-tBu(7). A uma mistura de Fmoc-Glu-OtBu (4), (4,26 g) e N-hidroxissuccinimida (1,15 g) em THF anidro (40 ml) foi adicionado DCC (2,06 g) em uma porção à temperatura ambiente. A solução resultante foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente e, em seguida, os sólidos foram filtrados e lavados com THF. Filtrado combinado foi evaporado até à secura e secou-se sob vácuo para gerar origem a Fmoc-Glu (OSu)-O-tBu (5), (5,3 g) como uma espuma branca Este material foi re-dissolvido em THF (20 ml) e adicionado na sala temperatura a uma mistura de H-Lys (Boc) -OtBu-HCl ( 6 ), (3,39 g) e DIPEA (3,5 ml) em THF anidro (50 ml). A mistura resultante foi agitada durante 4 horas à temperatura ambiente, até que a reação foi considerada completa por análise de HPLC e o solvente removido sob vácuo. O resíduo foi redissolvido em acetato de etila (100 ml), lavado com ácido cítrico aquoso a 10% (50 ml), água (50 ml) e salmoura (50 ml) e seco sobre sulfato de sódio. Após a remoção dos solventes sob vácuo, o resíduo foi triturado com 5% de éter/hexanos (50 ml). O produto sólido branco separado foi filtrado, lavado com hexanos, e secou-se sob vácuo para se obter Fmoc-Glu-OtBu-Lys(Boc)-O-tBu (7).
[0288] H-Glu-OtBu-Lys(Boc)-O-tBu(8). Uma soolução de Fmoc-Glu-OtBu- Lys(Boc)-O-tBu(7) em DCM foi tratada com dietil amina. A solução resultante foi agitada durante 4 horas à temperatura ambiente, até que a desproteção foi considerada completa por análise de HPLC. Todos os solventes foram removidos sob vácuo e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica eluindo primeiro com diclorometano, em seguida, 5-10% de MeOH em diclorometano para proporcionar H-Glu- O t Bu-Lys (Boc) -O t Bu ( 8 ) como óleo incolor.
[0289] Composto 9: Uma solução de amina 8 em DMF anidro foi tratada com éster de OSu de ácido N10-trifluoroacetilpteroico (3) em uma porção. A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 24 horas, enquanto monitorizada por análise de HPLC para conclusão. A mistura de reação foi diluída com acetato de etilo e filtrada através de um bloco de gel de sílica eluindo com metanol a 10% em acetato de etilo.
Filtrado combinado foi evaporado até à secura, redissolveu-se em acetato de etilo e lavou-se sequencialmente com ácido cítrico aquoso a 10%, água, NaHCO3 saturado, e salmoura. O extrato foi seco sobre sulfato de sódio, evaporado e seco sob vácuo de um dia para o outro para fornecer 9 em bruto como um sólido marrom.
[0290] Composto 10: O composto em bruto 9 foi dissolvido em uma mistura 1:1 (v/v) de ácido trifluoroacético e diclorometano. A solução resultante foi deixada repousar à temperatura ambiente durante 2 horas até a desproteção global estar completa conforme avaliado por análise de HPLC. Todos os solventes foram removidos sob vácuo, e o óleo marrom residual foi triturado com éter dietílico e brevemente sonicado. O precipitado pálido separado foi recolhido por filtração, completamente lavado com éter e seco sob vácuo durante um dia para proporcionar o produto 10 como um pó amarelo pálido.
[0291] Este exemplo demonstra as rotas sintéticas para a síntese do composto
13.
[0292] Composto 12: A uma solução do composto 10 (0,45 g) e do composto 11 (0,26 g) em DMF (15 ml) foi adicionado DIEA (0,44 ml) à temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro até o consumo completo de 11 ser observado por análise de HPLC. A mistura de reação foi diluída com tampão de acetato de pH 5 (0,5 M) e 1 ml de acetonitrila e purificada por HPLC de fase reversa C18 usando gradiente de 20-90% de acetonitrila/0,05% de TFA como eluente para obter o composto 12 como um sólido branco após a liofilização.
[0293] Composto 13: A uma solução do composto 12 (0,31 g) em DMF (1,5 ml) foi adicionado hidrazina, H 2 0 (0,19 ml) à temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura de reação foi diluída com água (~ 2 ml) e purificada por HPLC de fase reversa C18 usando gradiente de 20- 90% de acetonitrila/0,05% de TFA como eluente para obter o composto 13 como um sólido amarelo após liofilização. MS (ESI) m/z 831 (M + H) +.
[0294] A presente invenção incorpora a síntese de ligante conforme exemplificado abaixo, demonstrando as rotas sintéticas para a síntese do composto 11, (CAS #: 1415328-95-8).
[0295] Composto 16: A uma solução de tetraetilenoglicol 14 em THF anidro adicionou-se sódio em pequenos pedaços à temperatura ambiente e agitou-se até estar completamente dissolvido. O acrilato 15 foi adicionado lentamente ao longo de um período de 15 minutos à solução resultante. A mistura de reação foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 20 horas, depois concentrada sob vácuo e ressuspensa em salmoura, seguida por extração com acetato de etilo. A fase orgânica combinada foi lavada com salmoura e seca sobre sulfato de sódio. A remoção de solventes em vácuo proporcionou o composto 16 como um óleo amarelo claro.
[0296] Composto 17: A uma mistura de álcool 16 e piridina em DCM anidro foi adicionado cloreto de tosila em pequenas porções a 0 o C. A mistura resultante foi agitada durante 30 minutos a 0 o C, depois à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura de reação foi extinta com ácido cítrico a 10%; a camada aquosa foi extraída com acetato de etilo, os orgânicos combinados foram lavados com bicarbonato de sódio saturado, água, salmoura e secos sobre sulfato de sódio. Após a remoção dos solventes, o resíduo foi purificado em sílica gel para se obter o tosilato 17 como um óleo incolor transparente.
[0297] Composto 18: A uma mistura de tosilato 17 e N-hidroxif talimida em DMF foram adicionados DBU à temperatura ambiente. A solução vermelha escura resultante foi aquecida a 90 o C durante 1 hora, em seguida, resfriada, extinta com ácido cítrico a 10% e extraída com acetato de etila. A fase orgânica foi lavada minuciosamente com bicarbonato de sódio aquoso saturado, água e salmoura, seca sobre sulfato de sódio. Após a remoção dos solventes, o resíduo foi purificado em sílica gel para gerar o composto 18 como um óleo incolor.
[0298] Composto 19: O éster t-butílico 18 foi tratado com uma mistura 1:1 de TFA e DCM à temperatura ambiente. Após 3 horas os solventes foram removidos em vácuo, o resíduo foi retomado em diclorometano e lavado cuidadosamente com salmoura e seco sobre sulfato de sódio. Após a remoção do solvente sob vácuo, o ácido carboxílico bruto 19 foi obtido como um óleo transparente amarelado.
[0299] Composto 11: O ácido carboxílico bruto 19 em THF anidro foi tratado com
N- hidroxissuccinimida, seguido por DCC à temperatura ambiente. A agitação continuou durante 6 horas, os sólidos foram removidos por filtração e lavados com THF. O filtrado foi evaporado, o resíduo foi passado através de um bloco de sílica e lavado com EtOAc para gerar o composto 11 como um óleo incolor, que solidificou lentamente em um sólido branco após armazenamento.
[0300] Este exemplo descreve a síntese de ligante ramificado. Por exemplo, rotas sintéticas para a síntese do composto 25 :
[0301] Composto 21: Boc-Lys-OH 20 A uma solução de OSu éster 11 (1,55 g) e Boc-Lys-OH 20 (0,72 g) em DCM (50 ml) foi adicionado DIEA (1,03 ml) a 23 o C. Após 10 min, LCMS mostrou que a reação estava completa. A mistura foi lavada com HCl a 1 N (50 ml), bicarbonato de sódio saturado (50 ml) e salmoura (50 ml). A camada orgânica foi seca com MgSO 4. A remoção de solventes deu ácido 21 em bruto como um sólido branco, que foi usado na etapa seguinte sem purificação.
[0302] Composto 22: O ácido bruto 21 foi dissolvido em THF anidro e tratado com N-hidroxissuccinimida, seguido por DCC à temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente e, em seguida, filtrada para remover DCU, lavada com THF. O produto foi isolado por cromatografia em coluna em gel de sílica usando gradiente de 0-10% de metanol/DCM como eluente para se obter o composto 22 como um sólido branco, MS (ESI) m/z 737 (M + H) +.
[0303] Composto 24: O composto 22 foi dissolvido em DCM e tratado com o composto 23. A mistura resultante foi tratada com DIEA e agitada à temperatura ambiente durante 5 horas. A mistura de reação foi diluída por DCM e lavada com água, salmoura e seca sobre sulfato de sódio. O produto bruto foi purificado por ácido cítrico a 5% (20 ml) e salmoura (50 ml). A camada orgânica foi seca com MgSO 4. O solvente foi removido em vácuo para gerar o composto 24 como um sólido branco. O produto bruto foi usado na próxima etapa sem purificação adicional. MS (ESI) m/z 887 (M + H) +.
[0304] Composto 25: O composto 24 foi dissolvido em THF e tratado com N- hidroxissuccinimida, seguido por DCC à temperatura ambiente. Após 4 horas, a mistura foi filtrada para remover DCU, concentrada em vácuo. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna sobre gel de sílica usando gradiente de 0-6% de metanol/DCM como eluente para se obter o composto 25 como um sólido branco, MS (ESI) m/z 984 (M + H) +.
[0305] Este exemplo divulga rotas sintéticas para a síntese do composto 30.
[0306] Este exemplo divulga a síntese de compostos ramificados de PEG-Folato
30.
[0307] Composto 26: A uma solução do Composto 25 (0,6 g, em bruto) e do composto 10 (0,6 g) em DMF (5 ml) foi adicionado DIEA (0,47 ml) a 23 o C e agitado durante 1 hora. A mistura foi purificada por Prep-LC com gradiente de 5% a 60% de água/90% ACN 0,05% TFA durante 20 min usando coluna C18. As frações contendo o produto foram combinadas e evaporadas em vácuo para gerar o composto 26 como um sólido marrom; MS (ESI) m/z 1535 (M + H) +.
[0308] Composto 27: Ao composto 26 (0,25 g) foi adicionado DCM (3 ml) e TFA (2 ml) a 23 o C e, em seguida, agitado durante 30 min. O solvente foi removido em vácuo.
O resíduo foi dissolvido em DCM (~ 5 ml), e a solução foi gotejada em 45 ml de MTBE em um tubo cônico. O precipitado foi isolado por centrígeno (4000 rpm, 5 min) e seco para gerar o composto 27 como um sólido marrom; MS (ESI) m/z 1434 (M + H) +.
[0309] Composto 29A: A uma solução do composto 27 (0,054 g) e composto 2 8A ( PEG5K-C5-NHS, 0,17 g) em DMF (2 ml) foi adicionado DIEA (0,034 ml) a 23 o C.
Depois de ser agitada durante 5 horas, a mistura foi gotejada em 40 ml de MTBE e centrifugada (5 min, 4000 rpm) para separar o precipitado. Ao precipitado foram adicionados 45 ml de MTBE e centrifugados (5 min, 4000 rpm). O solvente foi decantado e o precipitado branco seco sob alto vácuo de um dia para o outro para gerar o composto 29A como um solo branco em bruto.
[0310] Composto 30A: A uma solução de Composto 29A (0,24 g) em água (10 ml) foi adicionado hidrazina, (0,033 ml) a 23 o C. Depois de ser agitada durante 24 H2O horas, a mistura foi purificada por Prep-LC com gradiente de água de 20% a 100% de ACN e TFA a 0,05% durante 20 min usando coluna C18. As frações contendo o produto foram combinadas e evaporadas. O resíduo foi dissolvido em água (10 ml) e liofilizado para gerar o composto 30A como um sólido amarelo claro. (Veja por exemplo a Figura 12).
[0311] Composto 29B: A uma solução do composto 27 (0,04 g) e composto 28B ( PEG10K-C5-NHS, 0,26 g) em DMF (6 ml) foi adicionado DIEA (0,040 ml) a 23 o C. Após ser agitada durante 16 horas, a mistura foi gotejada em 40 ml de MTBE e centrifugada, (5 min, 4000 rpm), para separar o precipitado. Ao precipitado foram adicionados 45 ml de MTBE, e então centrifugados (5 min, 4000 rpm). O solvente foi decantado e o precipitado branco seco sob alto vácuo de um dia para o outro para gerar o composto 29B como um solo branco em bruto.
[0312] Composto 30B: A uma solução de Composto 29B (0,47 g) em água (6 ml) foi adicionado hidrazina, H2O (0,080 ml) a 23 o C. Após ser agitada 6 horas, a mistura foi purificada por Prep-LC com gradiente de água de 20% a 100% de ACN e TFA a 0,05%
durante 20 min usando coluna C18. As frações contendo o produto foram combinadas e evaporadas. O resíduo foi dissolvido em água (10 ml) e liofilizado para gerar o composto 30B como um sólido amarelo claro.
[0313] Composto 29C : A uma solução do composto 27 (0,040 g) e composto 2 8C ( PEG20K-C5-NHS, 0,51 g) em DMF (8 ml) foi adicionado DIEA (0,040 ml) a 23 o C. Após ser agitada por 16 horas, a mistura foi gotejada em 40 ml de MTBE e centrifugada (5 min, 4000 rpm) para separar o precipitado. Ao precipitado foram adicionados 45 ml de MTBE e centrifugados (5 min, 4000 rpm) novamente. O solvente foi decantado e o precipitado branco seco sob alto vácuo de um dia para o outro para gerar o composto 29C como um solo branco em bruto.
[0314] Composto 30C : A uma solução de Composto 29C (0,67 g, <0,031 mmol) em água (8 ml) foi adicionado hidrazina, (0,060 ml) a 23 o C. Depois de ser agitada H2O durante 6 horas, a mistura foi purificada por Prep-LC com gradiente de água de 20% a 100% de ACN e TFA a 0,05% durante 20 min usando coluna C18. As frações contendo o produto foram combinadas e evaporadas. O resíduo foi dissolvido em água (10 ml) e liofilizado para gerar o composto 30C como um sólido amarelo claro.
[0315] Composto 29D: A uma solução do composto 27 (0,033 g, 0,023 mmol) e composto 2 8D (( PEG10K) 2 -C2-NHS, 0,4 g) em DMF (4 ml) foi adicionado DIEA (0,020 ml) a 23 o C. Após ser agitada durante 18 horas, a mistura foi gotejada em 40 ml de MTBE e centrifugada (5 min, 4000 rpm) para separar o precipitado. Ao precipitado foram adicionados 45 ml de MTBE e centrifugados (5 min, 4000 rpm). O solvente foi decantado e o precipitado branco seco sob alto vácuo de um dia para o outro para gerar o composto 29D como um solo branco em bruto.
[0316] Composto 30D: A uma solução de Composto 29D (0,45 g, <0,021 mmol) em água (8 ml) foi adicionado hidrazina, H2O (0,080 ml) a 23 oC. Depois de ser agitada
48 horas, a mistura foi purificada por Prep-LC com gradiente de água de 20% a 100% de ACN e 0,05% de TFA durante 20 min usando coluna C18. As frações contendo o produto foram combinadas e evaporadas. O resíduo foi dissolvido em água (10 ml) e liofilizado para gerar o composto 30D como um sólido amarelo claro.
[0317] Composto 28E: A uma solução do composto 28E1 ((PEG5K)2-NHS, 0,1 g) e ácido aminovalérico (0,003 g) em DMF (0,5 ml) foi adicionado DIEA (0,010 ml) a 23 o C. Depois de ser agitada durante 1 hora, a mistura foi diluída para 1 ml com água e purificada por coluna de dessalinização. A fração recolhida foi liofilizada para gerar o composto 28E como um solo branco.
[0318] Composto 30E: A uma solução do composto 28E (0,04 g), DMTMMT (0,003 g) e DIEA (0,005 ml) em DMF (2 ml) foi adicionado o composto 27 (0,009 g) a 23 o C. Depois de ser agitado durante 1 hora, LCMS mostrou que a reação estava completa.
A esta mistura (composto bruto 29E) foi adicionado hidrazina, H2O (2 ul) é situ. Depois de ser agitada durante 1 hora, a mistura foi purificada por Prep-LC com gradiente de água de 20% a 100% de ACN e TFA a 0,05% durante 20 min usando coluna C18. As frações contendo o produto foram combinadas e evaporadas. O resíduo foi dissolvido em água (10 ml) e liofilizado para gerar o composto 30E como um sólido amarelo claro.
[0319] Composto 31: Para uma solução de 20K-PEG-amina (0,31 g) e 2,5- Dioxopirrolidin-1-il 2- (bis (2- (2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-1-il) ) etil) amino) acetato (0,003 g) em DMF (1,0 ml) foi adicionado DIEA (0,006 ml) a 23 o C. Após 30 min, a mistura foi purificada com coluna de dessalinização (PD-10) e liofilizada de um dia para o outro para gerar o composto 31 como um sólido branco. Outras variantes de PEG podem ser preparadas usando o mesmo procedimento aqui descrito.
EXEMPLO 18
[0320] Este exemplo demonstra a construção, expressão e purificação de âmbar duplo contendo moléculas principais de Fab anti-CD3 humanizado. Um segundo sítio de incorporação de pAF foi adicionado na posição LL157 da cadeia leve do Fab anti-CD3 em Fab1-HK129pAF, Fab9-HK129pAF e Fab10-HK129pAF, resultando em novas moléculas Fab como Fab1- HK129pAF-LL157pAF, Fab9-HK129pAF-L9157pAF - LL157pAF, respectivamente. Isto permitiu a conjugação de dois Folato mais duas moléculas de 5KPEG em cada Fab usando qualquer um dos ligantes bifuncionais conforme descrito no Exemplo anterior.
[0321] A proteína purificada de CD3-PEG-folato usada para atividade in vitro, eficácia in vivo e estudos de PK foram analisados por eletroforese em gel de SDS (SDS PAGE). O CD3 purificado foi conjugado com 5K ou 10K PEG-folato no local pAF usando química de oxima e, em seguida, purificado, pós-conjugação, utilizando cromatografia de troca catiônica para isolar formas conjugadas não conjugadas, de sítio único e de sítio duplo (Figuras 13A-13B). Após a purificação, as composições foram formuladas em 50 mM de histidina, 100 mM de NaCl, 5% de trealose, pH 6 e esterilizado por filtração.
[0322] Figura 13A mostra 5 µg de cada anticorpo biespecífico CD3-Folato purificado com 5K PEG conjugados. As pistas 3 e 6 representam composições de Fab CD3 não conjugadas com incorporação de pAF simples e dupla, respectivamente. As pistas 4 e 7 representam composições de CD3 Fab com pAF e Folato simples e duplo, respectivamente. As pistas 5 e 8 representam 5KPEG-Folato e Bi5KPEG-BiFolato conjugados, respectivamente.
[0323] Figura 13B mostra resultados de SDS-PAGE sob afecções não redutoras com 10 µg de proteína carregada por poço. As pistas 2 e 7 representam composições de Fab CD3 não conjugadas, as pistas 3 e 4 cada uma representam diferentes composições de Bi5KPEG-BiFolato CD3 de conjugação dupla e as pistas 5 e 6 representam Bi10KPEG-BiFolato duplo conjugado e 10KPEG-Folato, respectivamente. Os dados, (Figuras 13A-B), ilustra alta pureza (> 90%) para todas as amostras com o aumento esperado no peso molecular com base no tamanho do PEG.
[0324] Para aumentar a eficiência da conjugação, as composições de Fab CD3 purificadas foram conjugadas com PEG-folato usando um processo de conjugação de duas etapas. O folato foi conjugado nos locais pAF usando química de oxima seguida por conjugação de PEG com 5K, 10K ou 20K de PEG na cisteína C-terminal de ambas as cadeias pesada e leve usando química de click maleimida-tiol. A Figura13C mostra SDS- PAGE sob afecções não redutoras (pistas 2-5) e redutoras (pistas 7-10) com 10 µg de proteína carregada por poço. As pistas 2 e 7 representam composições não conjugadas BiFolato, as pistas 3 e 8, 4 e 9, 5 e 10 representam cada uma composições BiFolato-C- terminal Bi5KPEG, Bi10KPEG e Bi20KPEG, respectivamente. Os dados da Figura 13C ilustra pureza elevada (> 95%) para todas as amostras com o aumento esperado no peso molecular com base no tamanho do PEG.
EXEMPLO 19
[0325] Este exemplo demonstra os efeitos da conjugação de Bi-Folato e Bi-PEG nas composições de CD3 Fab1 e duas variantes de baixa afinidade Fab9 e Fab10.
Ligação de CD3 humano e citotoxicidade: A Tabela 25 mostra os efeitos de várias modificações, incluindo a conjugação de Bi5KPEG-BiFolato na afinidade de ligação e citotoxicidade da molécula Fab1 na presença de SFA 50 nM.
[0326] Tabela 25 - Ligações in vitro e atividades citotóxicas de modificações de
Fab1 anti-CD3 Ligação Citotoxicidade Moléculas de Fab1 Modificadas em EC50 (pM) EC50 (nM) Fab1-HK129-pAF 1,92 Sem atividade Fab1-HK129-Folato 2,00 1,63 Fab1-HK129-5KPEG-Folato 5,27 3,98 Fab1-HK129-LL157-BiFolato 2,37 0,56 Fab1-HK129-LL157-BiFolato- 7,50 1,55 Bi5KPEG
[0327] Estudos de citotoxicidade in vitro também foram conduzidos usando anticorpos biespecíficos CD3-Folato com 5K, 10K ou 20K PEG C-terminal conjugados, na presença de 50 nM de SFA, em células KB, OV-90 e SKOV-3 (Figura 13D, Tabela 26 Embora a potência diminua ligeiramente com o aumento do comprimento do PEG, todos os construtos testados retêm atividade citotóxica potente. Os resultados e tendências foram consistentes entre todas as linhas celulares testadas. Com base nesses estudos, postula-se que a ligeira diminuição na potência observada com o aumento do tamanho do PEG seria compensada pelo aumento da exposição da extensão da meia-vida. Tabela 26 - Citotoxicidade in vitro de modificações anti-CD3-Folato C-terminal em várias células Células KB Citotoxicida Citotoxicidad de de e Moléculas de Fab1 Modificadas citotoxicida Células Células de OV-90 SKOV3 EC50 (pM) EC50 (pM) EC50 (pM) Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG 7,8 130,9 67,9
Fab1-HK129-LL157-BiFolato-C-terminal 13,6 155,9 205,5 Bi5KPEG Fab1-HK129-LL157-BiFolato- 88,9 508,2 789,4 Bi10KPEG C-terminal Fab1-HK129-LL157-BiFolato- 90,5 1529,0 1782,0 Bi20KPEG C-terminal
[0328] A Tabela 27 compara as afinidades de ligação do Fab1 parental, bem como duas variantes de baixa afinidade, Fabs 9 e 10, para CD3 humano na presença de SFA 20 nM. Como mostrado, a conjugação de Bi5KPEG-BiFolato usando ligante bi- funcional PEG-Folato, como descrito nos Exemplos acima, levou a uma diminuição na ligação de CD3 humano e potencial citotóxico correspondente para todos os 3 Fabs em comparação com seus controles não conjugados.
Tabela 27 - Caracterização de Fabs 9 e 10 de baixa afinidade
PBMC PBMC Moléculas de Fab Indução Liberação Liberação humano de humano de modificadas de CD69 de IFNγ de TFNα ligação citotoxicidade EC50 (nM) EC50 (pM) EC50 (pM) EC50 (pM) EC50 (pM) Fab1-HK129-LL157- 5,7 8,03 0,38 2,7 5,7 BiFolato-Bi5KPEG Fab9-HK129-LL157- 340 66,8 73 326 228 BiFolato-Bi5KPEG Fab10-HK129-LL157- 6312 1553 724 2420 1960 BiFolato-Bi5KPEG
[0329] Ativação de células T e liberação de citocinas: A Tabela 27 mostra a ativação do marcador de células T CD69 e a liberação de duas citocinas, IFNgamma e TNFα, pelos 3 Fabs modificados. Como mostrado nos exemplos acima, a correlação geral entre a força de ligação de CD3, potencial citotóxico, ativação de células T e liberação subsequente de citocinas é verdadeira em todos os Fabs, mesmo após modificação significativa por conjugação BiFolato-Bi5KPEG. Isso sugere que a eficácia pode ser mantida, minimizando a toxicidade devido à síndrome de liberação de citocinas, reduzindo simultaneamente a afinidade de CD3 e aumentando a afinidade do antígeno associado ao tumor (TAA). Além disso, as propriedades PK, incluindo a extensão da meia-vida (T1/2), foram melhoradas pela PEGilação específica do local usando tecnologia de incorporação de UAA (aminoácido não natural) proprietária. EXEMPLO 20
[0330] Os dados de citotoxicidade in vitro mostram que os anticorpos biespecíficos CD3-Folato matam seletivamente células KB que expressam FOLRα. As células KB foram tratadas com concentração crescente de anticorpos biespecíficos de CD3-Folato na presença de ácido fólico 50 nM, uma concentração fisiologicamente relevante de folato. O anticorpo biespecífico CD3-folato mais potente, Fab1-HK129- LL157-BiFolato, contaiings duas moléculas de ácido fólico, mostraram um valor de IC50 de 1,3 pM (Fig. 14). O folato único contendo o anticorpo biespecífico CD3-Folato, Fab1- HK129-Folato, mostrou um valor IC50 de 40,3 pM, 31 vezes menos potente do que Fab1- HK129-LL157-BiFolato. Estes dados indicam que dois folatos aumentam a potência dos anticorpos biespecíficos CD3-Folato. A adição de 5KPEG diminuiu a potência. Observou- se uma redução de 4,9 vezes na potência entre o anticorpo biespecífico CD3-folato único, Fab1-HK129-folato, e Fab1-HK129-5KPEG-folato com um valor de IC50 de 198 pM.
Observou-se uma diminuição de 37,3 vezes na potência entre Fab1-HK129-LL157- BiFolato e Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-BiFolato com um valor de IC 50 de 48,5 pM. Estes dados mostram que os anticorpos biespecíficos CD3-Folato mantêm potente citotoxicidade in vitro em concentrações fisiologicamente relevantes de folato.
EXEMPLO 21
[0331] Os dados de citotoxicidade in vitro mostram que os anticorpos biespecíficos de CD3-Folato matam seletivamente as células SKOV3 que expressam
FOLRα na presença de ácido fólico 20 ou 50 nM. As células SKOV3 foram tratadas com concentração crescente de anticorpos biespecíficos CD3-Folato em 20 ou 50 nM de ácido fólico, concentrações fisiologicamente relevantes de folato (Figuras 15A e 15B). Os anticorpos biespecíficos CD3-Folato mostraram potência diminuída, 5,6 vezes a 8 vezes, quando a concentração de ácido fólico aumentou de 20 nM para 50 nM, que está perto do topo da concentração fisiologicamente relevante normal para folato. A adição de 5KPEG também resultou na diminuição da potência dos anticorpos biespecíficos CD3- Folato. Foi observada uma diminuição de 5,4 vezes entre o folato único e o anticorpo biespecífico de folato de 5KPEG único e uma diminuição de 22,9 vezes entre o folato duplo e o anticorpo biespecífico de folato de 5KPEG duplo. Nenhuma diferença significativa na potência foi observada entre os anticorpos biespecíficos CD3-Folato peguilados simples e duplos. Os dados, Tabela 28, mostram que os anticorpos biespecíficos CD3-Folato podem matar células que expressam FOLRα na presença de concentrações fisiologicamente relevantes de folato e, embora os anticorpos peguilados tenham potência diminuída em comparação com os anticorpos não peguilados, os anticorpos biespecíficos CD3-Folato podem matar as células que expressam FOLRα.
Tabela 28 - Citotoxicidade in vitro em células SKOV3 Valores de IC50 de citotoxicidade in vitro (pM) usando células SKOV3 Fab1- Fab1-HK129- Fab1-HK129- Fab1-HK129- Fármaco HK129- 5KPEG- LL157-Bi5KPEG- LL157-BiFolato Folato Folato BiFolato Ácido fólico a 34,5 186,3 8,5 194,7 20 nM Ácido fólico a 204 1053 69,2 1239 50 nM
EXEMPLO 22
[0332] Outros estudos de citotoxicidade in vitro foram conduzidos na presença de 5-mTHF 20 ou 50 nM. As células SKOV3 foram tratadas com concentrações crescentes de anticorpos biespecíficos CD3-Folato na presença de 20 ou 50 nM, ( concentrações fisiologicamente relevantes da forma predominante de folato encontrada no soro humano ), 5-metiltetrahidrofolato (5-mTHF), (Figuras 16A e 16B). O 5-mTHF tem uma afinidade de ligação de 1-10 nM ao FOLRα e não se liga tão bem ao FOLRα quanto o folato, que possui uma afinidade de ligação inferior a 1 nM. Os anticorpos biespecíficos CD3-Folato mantiveram valores de IC50 muito potentes entre 0,03 a 0,16 pM e entre 0,1 a 1,5 pM para anticorpos biespecíficos CD3-Folato simples e duplos, respectivamente. Os dados, Tabela 29, mostram que os anticorpos biespecíficos CD3-Folato têm potente citotoxicidade in vitro contra células SKOV3 que expressam FOLRα na presença de concentrações fisiologicamente relevantes de 5-mTHF. Tabela 29 - Citotoxicidade in vitro na presença de 5-mTHF Valores de IC50 de citotoxicidade in vitro (pM) usando células SKOV3 Fab1- Fab1-HK129- Fab1-HK129- Fab1-HK129- Fármaco HK129- LL157- LL157-Bi5KPEG- 5KPEG-Folato Folato BiFolato BiFolato 5-mTHF 0,1 0,5 0,03 0,04 a 20 nM 5-mTHF 0,2 1,5 0,04 0,16 a 50 nM EXEMPLO 23
[0333] Estudo farmacocinético em camundongos em camundongos CD1: Os anticorpos biespecíficos CD3-Folato foram injetados, iv através da veia da cauda do camundongo de camundongos CD-1 a 1 ou 5 mg/kg.
Amostras de sangue foram coletadas em nove pontos no tempo e analisadas por ELISA.
Os dados mostraram claramente que a adição de 5KPEG aumenta as exposições de soro (AUCúltimo),
(Tabelas 30-31 e Figura 17). Fab1-HK129-5KPEG-Folato a 1 mg/kg mostrou melhora de 4,3 vezes sobre Fab1-HK129-Folato e Fab1-HK129-5KPEG-Folato a 5 mg/kg mostrou melhora de 5 vezes sobre Fab1-HK129-Folato.
Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-BiFolato mostrou uma melhoria de 16,25 vezes sobre Fab1-HK129-LL157-BiFolato a 1 mg/kg e Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-BiFolato mostrou uma melhoria de 21,7 vezes em relação a Fab1-HK129-LL157 a 5 mg/kg.
Os dados mostram uma diferença de 3,9 vezes entre
Fab1-HK129-5KPEG-Folato e Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-BiFolato.
Também foi observada uma melhora na meia-vida sérica (T1/2) quando 5KPEG é adicionado aos anticorpos biespecíficos CD3-Folato.
A maior melhoria na meia-vida sérica foi observada com dois 5KPEGs incorporados em anticorpos biespecíficos CD3-Folato.
Fab1-HK129- LL157-Bi5KPEG-BiFolato mostra melhora de 4,2 vezes na meia-vida sérica em relação a Fab1-HK129-LL157-BiFolato a 1 mg/kg, enquanto Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-
BiFolato mostra melhora de 6,25 vezes na metade do soro -vida sobre Fab1-HK129- LL157-BiFolato a 5 mg/kg.
Os dados mostram que a adição de 5KPEG melhora a exposição sérica e a meia-vida sérica de anticorpos biespecíficos CD3-Folato, o que leva a uma dosagem menos frequente para alcançar exposições séricas eficazes in vivo.
Tabela 30 - Análise farmacocinética de camundongo com anticorpo únicoo
Amber biespecífico CD3-Folato
Fab1-HK129- Fab1-HK129- Fab1-HK129- Fab1-HK129- Folato Folato 5KPEG-Folato 5KPEG-Folato Parâmetros 1 mg/kg 5 mg/kg 1 mg/kg 5 mg/kg PK Médio SD Médio SD Médio SD Médio SD
C0 (ng/ml) 7110 589 27600 7240 9120 1100 50300 5960 Cmax (ng/ml) 4240 457 20100 3480 7440 866 41900 4330 Cmax_D (ng/ml)/(mg/kg) 4240 457 4020 697 7440 866 8390 866 AUClast (ng*h/ml) 1530 209 8890 2060 6640 1000 45000 5420 AUClast_D (ng * h/ml)/(mg/kg) 1530 209 1780 411 6640 1000 8990 1080 T1/2 (h) 1,05 0,484 1,38 0,411 1,8 1,19 3,32 0,141 MRTlast (h) 0,444 0,0647 0,557 0,155 1,28 0,253 1,9 0,0841 Cl (ml/h/kg) 660 91 579 120 151 20,9 112 14,3 Vss (ml/kg) 317 65,8 352 29,5 208 34,1 219 26,6 Tabela 31 - Análise farmacocinética de camundongo com anticorpo duplo Amber biespecífico de CD3-Folato Fab1-HK129- Fab1-HK129- Fab1-HK129- Fab1-HK129- LL157- LL157- LL157- LL157- Bi5KPEG- Bi5KPEG- BiFolato BiFolato; BiFolato BiFolato 1 mg/kg 5 mg/kg 1mg/kg 5mg/kg Parâmetros PK Médio SD Médio SD Médio SD Médio SD C0 (ng/ml) 4650 889 34100 12300 6040 925 54900 11900 Cmax (ng/ml) 3280 381 22700 7790 8140 3580 46400 7280 Cmax_D (ng/ml)/(mg/kg) 3280 381 4530 1560 8140 3580 9280 1460 AUClast (ng*h/ml) 1360 200 8140 2710 22100 3060 177000 28000 AUClast_D (ng * h/ml)/(mg/kg) 1360 200 1.630 542 22100 3060 35300 5610 T1/2 (h) 0,715 0,454 0,93 0,355 3,02 0,0597 5,82 0,0842 MRTlast (h) 0,445 0,168 0,358 0,0325 3,92 0,219 4,91 0,222 Cl (ml/h/kg) 764 120 708 366 45,7 5,53 28,9 4,58 Vss (ml/kg) 359 109 269 172 183 17,6 142 16,6 Exemplo 24
[0334] Este exemplo demonstra que anticorpos biespecíficos CD3-folato-folato matam macrófagos M2 humanos: Os macrófagos são populações celulares heterogêneas que desempenham papéis na defesa do hospedeiro. Macrófagos classicamente ativados (macrófagos M1) têm função pró-inflamatória, recrutando linfócitos infiltrantes de tumor e atividade antitumoral, enquanto macrófagos M2 são antiinflamatórios e estão envolvidos na remodelação de tecidos, migração de células cancerosas, invasão e metástase. Os macrófagos M2 humanos estão associados à proliferação de células cancerosas e têm sido associados a um mau prognóstico no câncer de ovário. A inibição do macrófago M2 pode aumentar a atividade de terapias imuno-oncológicas, como os inibidores de checkpoint. Macrófagos M2 humanos expressam FOLRou FR, que ou FR tem afinidades de ligação semelhantes ao folato como FOLRαou FRα. Portanto, as estratégias para aumentar a proporção de macrófagos M1 para M2 por repolarização para macrófagos M1 ou por matar seletivamente macrófagos M2 fornecem abordagens terapêuticas potenciais no tratamento do câncer.
[0335] Estudo 1: Para avaliar os efeitos dos anticorpos biespecíficos CD3-Folato em macrófagos, os seguintes experimentos foram realizados: Fab1-HK129-LL157-pAF, Fab1-HK129-LL157-Folato e Fab1-HK129-LL157-5KPEG folato foram incubados com macrófago M2 humano e células T humanas na presença de ácido fólico 50 nM. Os dados mostram que Fab1-HK129-LL157-folato e Fab1-HK129-LL157-5KPEG-folato morte de macrófagos humano M2 com valores de IC50 de 1,2 pM e 112,1 pM respectivamente (dados n mostrados). Fab1-HK129-LL157-pAF que carece de folato não causa a morte de macrófagos M2 humanos. Os dados suportam que a citotoxicidade de Fab1-HK129- LL157-Folato e Fab1-HK129-LL157-5KPEG-Folato é específica para a ligação a FOLR. Além disso, os dados sugerem que, além de matar células tumorais que expressam FOLRα, os anticorpos biespecíficos CD3-Folato podem matar células de macrófagos M2 e possivelmente outras células inibidoras imunológicas que expressam FOLRα/.
[0336] Estudo 2: Nestes estudos, macrófagos derivados de monócitos foram gerados a partir de sangue humano de doadores saudáveis e tratados com fator estimulador de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) para diferenciação de macrófagos M1 ou fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) para macrófagos M2 diferenciação.
[0337] Antes de conduzir os estudos, a expressão do receptor de folato beta (FOLRouFR-beta) foi inicialmente medida por citometria de fluxo e descobriu-se que aumentava em uma média de 26 vezes em macrófagos M2 do que M1 em termos de intensidade de fluorescência mediana (MFI )
[0338] Macrófagos M1 ou M2 humanos foram semeados em placas brancas de fundo transparente de 96 poços a 9.000 células/poço e incubados de um dia para o outro.
No dia seguinte, 90.000 células de células T humanas foram adicionadas como células efetoras na proporção de células efetoras:alvo (E:T) de 10:1 para os poços contendo macrófagos e incubadas com diluições em série de anticorpos biespecíficos CD3-Folato, (a partir de 0,001 pM a 100 nM), na presença de 20 nM de ácido fólico, a 37 °C, 5% de CO 2 durante 3 dias. A viabilidade relativa dos macrófagos foi medida por CellTiter-Glo (100 ul/poço) após a remoção das células flutuantes e calculada como a porcentagem de controle não tratado.
[0339] Efeito da PEGuilação no anticorpo biespecífico CD3-folato: A Tabela 32 mostra os dados de IC50 para citotoxicidade in vitro dos macrófagos por folato único contendo anticorpos biespecicos CD3-folato na presença de 20 nM de ácido fólico. Fab1- HK129-folato tem uma IC50 média de 85,0 pM (intervalo 53,5-120,0 pM) em M1 de macrófagos e uma IC 50 média de 5:06 (faixa de 13:04-15,0 pM) em M2 macrófagos. Com base na proporção de IC 50, os macrófagos M2 são em média 26 vezes melhorados, (intervalo de 5-42 vezes), em relação a M1) com Fab1-HK129-Folato. Fab1-HK129-5KPEG-Folato mostra IC 50 médio de 616,8 pM (intervalo 198,0-908,9 pM) em macrófagos M1 e um IC 50 médio de 13,4 pM (intervalo 2,3-33,2 pM) em macrófagos M2 com uma razão IC 50 média melhorada entre Os macrófagos M1 e M2 melhoraram em média 69 vezes (variação 23-126 vezes) em macrófagos M2. Estes resultados indicam que o folato único contendo anticorpos biespecíficos de CD3-folato são específicos para morte de macrófagos M2 e PEGilação de folato único contendo anticorpo biespecífico de CD3-folato (Fab1-HK129- 5KPEG-Folato) é mais seletivo para morte de macrófagos M2 do que Fab1-HK129-Folato Tabela 32 - Citotoxicidade de macrófagos in vitro por folato único contendo anticorpos biespecíficos CD3-Folato na presença de ácido fólico 20 nM Fab1-HK129-Folato Fab1-HK129-5KPEG-Folato Doadores IC50 (pM) IC50 (pM) Razão de IC50 (pM) IC50 (pM) Razão de em M1 em M2 IC50 em M1 em M2 IC 50 6007 116,0 2,8 42 607,6 10,8 57 4943 120,0 4,1 30 908,9 23,2 39 6213 79,2 15,0 5 904,9 33,2 27 6081 53,5 4,9 11 288,4 2,3 126 5540 56,5 1,4 41 757,7 11,0 69 Média 85,0 5,6 26 693,5 16,1 64
[0340] Os resultados da citotoxicidade de macrófagos in vitro por um único folato contendo anticorpos biespecíficos CD3-Folato de um doador representativo, doador 6007, estão representados na FIG 18A. A seta e o número denotam diferenças em vezes de IC50 entre macrófagos M1 e M2. As linhas pontilhadas indicam Fab1-HK129-Folato em M1 e M2 e as linhas sólidas indicam Fab1-HK129-5KPEG-Folato em M1 e M2.
[0341] A Tabela 33 mostra os dados de IC50 para citotoxicidade in vitro dos macrófagos por folato duplo contendo anticorpos biespecicos CD3-folato na presença de 20 nM de ácido fólico. Fab1-HK129-LL157-BiFolato tem um IC 50 médio de 29,2 pM
(intervalo de 10,9-42,8 pM) no macrófago M1 e um IC 50 médio de 1,5 pM (intervalo de 0,1 pM-5,5 pM) no macrófago M2 com uma razão média de IC50 entre macrófagos M1 e M2 de diferença de 72 vezes (variação de 6-212 vezes). Fab1-HK129-LL157-BiFolato- Bi5KPEG mostra média 1620,8 pM de IC 50 (faixa de 834,7-2651 pM) em macrófagos M1 e IC 50 médio de 15,7 pM (faixa de 3,6-52,4 pM) em macrófagos M2 com uma razão de IC50 média melhorada entre macrófagos M1 e M2 de 181 vezes (faixa de 49-501 vezes) em macrófagos M2. Esses resultados indicam que o dobro folato contendo anticorpos biespecíficos de CD3-folato são específicos para matar macrófagos M2. Embora a PEGilação de folato duplo contendo anticorpo biespecífico de CD3-folato (Fab1-HK129- LL157-BiFolato-Bi5KPEG) se mostre ter menos potência e mais seletiva para matar macrófagos M2 do que Fab1-HK129-LL157-BiFolato ou Fab1-HK129-5KPEG -Folato conforme mostrado na Tabela XXX.
Tabela 33 - Citotoxicidade de macrófagos in vitro por folato duplo contendo anticorpos biespecíficos CD3-Folato na presença de ácido fólico 20 nM Fab1-HK129-LL157-BiFolato Fab1-HK129-LL157-BiFolato- Bi5KPEG Doadores IC50 (pM) IC50 (pM) Razão de IC50 (pM) IC50 (pM) Razão de em M1 em M2 IC50 em M1 em M2 IC50 6007 31,9 0,7 44 1393,0 8,2 170 4943 42,8 0,8 54 2651 22,3 119 6213 34,3 5,5 6 2543 52,4 49 6081 26,1 0,1 212 834,7 3,6 235 5540 10,9 0,2 45 1027 14,8 69 Média 29,2 1,5 72 1689,7 20,2 128
[0342] A Figura18B mostra os resultados da citotoxicidade de macrófagos in vitro por folato duplo contendo anticorpos biespecíficos CD3-Folato de um doador representativo, doador 6007. A seta e o número denotam diferenças em vezes de IC50 entre macrófagos M1 e M2. As linhas pontilhadas indicam Fab1-HK129-LL157-BiFolato em M1 e M2 e as linhas sólidas indicam Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG em M1 e M2.
[0343] Outros estudos foram conduzidos para simular concentrações fisiológicas relevantes da forma predominante de folato encontrada no soro humano, que variam entre 9,1-45,1 nM. Desta faixa fisiológica, 86,7% (37,5 nM) é 5-metil-tetra-hidrofolato (5- mTHF), o metabólito do ácido fólico primário, e apenas 4% (1,2 nM) é ácido fólico não metabolizado (Pfeiffer et al., Br. J. Nutr., 28 de junho de 2015: 113(12):1965-1977). Como bem conhecido na técnica, a afinidade de ligação do ácido fólico a FR-beta é inferior a 1 nM e a afinidade de 5-mTHF a FR-beta é de 1-10 nM. Com base nessas informações, foi hipotetizado que a concentração ou composição de ácido fólico e 5-mTHF pode impactar a atividade de anticorpos biespecíficos CD3-Folato. Para avaliar isso, o seguinte experimento foi conduzido: Os dados de citotoxicidade de macrófagos in vitro na presença de 5-mTHF de 45 nM são mostrados na Tabela 34 e na Tabela 35. A IC 50 de Fab1-HK129-Folato teve uma média de 9,1 pM e 0,31 pM e a IC 50 de Fab1-HK129- 5KPEG-Folato foi em média 48,5 pM e 1,26 pM em macrófagos M1 ou M2, respectivamente. IC 50 de Fab1-HK129-LL157-BiFolato em média 4,0 pM em M1 e 0,05 pM em M2, e IC 50 de Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG em média de 99,4 pM em M1 e 0,85 pM em M2. Estes dados mostram que os anticorpos biespecíficos CD3-Folato são mais potentes na presença de 5-mTHF do que com ácido fólico (Tabela 32 e Tabela 33). IC 50 rácios entre M1 e M2 em média, 43 vezes e 57 vezes por folato único contendo CD3-folato anticorpos biespecicos e 89 vezes e 212 vezes por folato duplo contendo anticorpos biespecicos CD3-folato. Estes dados indicam que CD3-Folato contendo anticorpos biespecíficos mantêm a morte específica de macrófagos M2 e a PEGuilação fornece mais especificidade em termos fisiologicamente relevantes da concentração de
5-mTHF.
Tabela 34. Citotoxicidade de macrófagos in vitro por folato único contendo anticorpos biespecíficos CD3-Folato na presença de 45 nM 5-mTHF Fab1-HK129-Folato Fab1-HK129-5KPEG-Folato IC50 (pM) IC50 (pM) Razão de IC50 (pM) IC50 (pM) Razão de Doadores em M1 em M2 IC50 em M1 em M2 IC50 6106 8,3 0,26 33 37,6 0,88 43 1474 11,3 0,11 102 93,6 0,71 132 6081 9,2 0,45 21 43,3 0,94 46 5540 7,7 0,44 18 19,5 2,5 8 Média 9,1 0,31 43 48,5 1,26 57 Tabela 35. Citotoxicidade de macrófagos in vitro por folato duplo contendo anticorpos biespecíficos CD3-Folato na presença de 5-mTHF a 45 nM Fab1-HK129-LL157-BiFolato- Fab1-HK129-LL157-BiFolato Bi5KPEG IC50 (pM) IC50 (pM) Razão de IC50 (pM) IC50 (pM) Razão de Doadores em M1 em M2 IC50 em M1 em M2 IC50 6106 2,0 0,03 74 37,4 0,47 80 1474 8,9 0,04 206 276,5 0,41 681 6081 2,8 0,09 32 65,4 0,87 75 5540 2,4 0,05 44 18,3 1,67 11 Média 4,0 0,05 89 99,4 0,85 212
[0344] No geral, os dados indicam que na presença de ácido fólico ou metabólito de 5mTHF, as composições de CD3-Folato PEGuilado duplo mostraram maior especificidade para matar macrófagos M2 do que as composições de CD3-Folato PEGuilado simples. Assim, a seletividade melhorada foi observada com mais PEGylation.
[0345] Outros estudos com anticorpos biespecíficos CD3-Folato também foram conduzidos em células supressoras derivadas de mieloides humanas (MDSCs) para investigar a expressão de FR. As células mononucleares do sangue periférico humanas (PBMCs) de doadores saudáveis foram tratados com Fab1-HK129-5KPEG-folato e Fab1- LL157-Bi5KPEG-BiFolato para testar a sua atividade citotóxica contra as MDSC s mononucleares (mMDSCs) 0, 1, 10 e 100 pM, para cada anticorpo biespecífico de CD3- Folato, foram adicionados a PBMCs e incubados a 37 o C e 5% de CO por 24 horas. 2 Após a incubação, os mMDSCs foram bloqueados pela populaçção de CD3 - /CD33+/CD11b+/CD14+/HLA-DRlow usando citometria de fluxo e a porcentagem (%) de células vivas do controle não tratado foi medida.
[0346] Com base na observação, a porcentagem de mMDSCs diminuiu de maneira dependente da dose. Fab1-HK129-5KPEG-Folato mostrou uma diminuição dependente da dose de 72% para 24% a 10 pM versus 100 pM, respectivamente. Da mesma forma, Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-BiFolato mostrou uma diminuição dependente da dose de 88% para 22% a 10 pM versus 100 pM, respectivamente. Estes resultados demonstram que o tratamento com anticorpos biespecíficos CD3-Folato eliminou seletivamente os mMDSCs, uma vez que os não-MDSCs com alto HLA-DR foram preservados.
[0347] Dado que essas células inibidoras podem expressar o receptor de folato e estão envolvidas na inibição da atividade de drogas imuno-oncológicas, sugere que a terapia de combinação usando inibidores de checkpoint e outras drogas imuno- oncológicas pode ser utilizada como terapêutica para vários cânceres ou afecções/doenças/distúrbios em que o receptor de folato pode ser expresso. Isto suporta a utilização das composições de CD3-Folato da presente invenção como terapêutica valiosa que é significativamente diferente de outras terapias imuno-oncológicas. EXEMPLO 25
[0348] Este exemplo demonstra afinidade de ligação do anticorpo biespecífico
CD3-Folato ao FOLRα em vários tipos de células. Afinidade de ligação do anticorpo biespecífico CD3-Folato a células KB que expressam FOLRα: Como mostrado na Tabela 36, Fab1-HK129-Folato se liga a células KB que expressam FOLRα com uma afinidade de 1,97 nM e, Fab1-HK129-5KPEG-Folato, se liga com uma afinidade de 3,69 nM. Fab1- HK129-LL157-BiFolato se liga a células KB com uma afinidade de 0,85 nM e Fab1- HK129-LL157-Bi5KPEG-BiFolato com uma afinidade de 2,28 nM. Os anticorpos PEGuilados retiveram afinidades de ligação semelhantes aos anticorpos não PEGuilados que estão na faixa de nM baixa para as células KB que expressam FOLRα. Tabela 36 - Afinidade de ligação do anticorpo biespecífico de CD3-Folato para células KB Linhagem Anticorpo Biespecífico Celular Kd (nM) Bmax Fab1-HK129-Folato KB 1,97 100552 Fab1-HK129-5KPEG-Folato KB 3,69 134422 Fab1-HK129-LL157-BiFolato KB 0,85 74439 Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG- KB 2,28 83056 BiFolato
[0349] Afinidades de ligação do anticorpo biespecífico CD3-Folato às células T humanas: Fab1-HK129-pAF, (Fab anti-CD3), não contém folato ou PEG e se liga a células T humanas com uma afinidade de 1,59 nM (Tabela 37). Fab1-HK129-Folato se liga a células T humanas que expressam CD3 com uma afinidade de 1,53 nM e Fab1- HK129-5KPEG-Folato se liga com uma afinidade de 2,34 nM. Estes anticorpos biespecíficos CD3-Folato têm afinidades de ligação semelhantes às células T humanas. Fab1-HK129-LL157-pAF liga-se a células T humanas com uma afinidade de 0,604 nM.
Fab1-HK129-LL157-BiFolato se liga a células T humanas com uma afinidade de 0,669 nM e Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-BiFolato tem uma afinidade de 3,34 nM. Estes dados mostram que os anticorpos biespecíficos CD3-Folato peguilados têm afinidade de ligação cerca de 5 vezes menor para células T humanas do que a versão não peguilada. Estes dados também mostram que os anticorpos biespecíficos CD3-Folato têm afinidades de ligação nM baixas para células T humanas. Tabela 37 - Afinidades de ligação do anticorpo biespecífico de CD3-Folato a células T humanas Espécie de Anticorpo Biespecífico célula T Kd (nM) Bmax Células T Fab1-HK129-pAF humanas 1,59 31998 Células T Fab1-HK129-Folato humanas 1,53 30106 Células T Fab1-HK129-5KPEG-Folato humanas 2,34 23391 Células T Fab1-HK129-LL157-pAF humanas 0,604 27908 Células T Fab1-HK129-LL157-BiFolato humanas 0,669 24553 Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG- Células T BiFolato humanas 3,34 15253
[0350] Afinidades de ligação do anticorpo biespecífico CD3-Folato às células T de macaco Cynomolgus: Como mostrado na Tabela 38, Fab1-HK129-pAF, liga-se a células T de macaco Cynomolgus com uma afinidade de 2,67 nM. Fab1-HK129-Folato se liga a células T de macaco Cynomolgus que expressam CD3 com uma afinidade de 2,69 nM e Fab1-HK129-5KPEG-Folato se liga com uma afinidade de 3,31 nM. Isso demonstra que os anticorpos biespecíficos de CD3-Folato com um único local âmbar têm afinidades de ligação semelhantes às células T de macaco Cynomolgus. Construções de CD3-Folato com locais de âmbar duplo mostraram afinidades de ligação semelhantes em células T de macaco Cynomologus. Como mostrado na Tabela 38, Fab1-HK129-LL157- pAF se liga a células T de macaco Cynomolgus com uma afinidade de 0,995 nM. Fab1- HK129-LL157-BiFolato se liga a células T de macaco Cynomolgus com uma afinidade de 1,0 nM e Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-BiFolato com uma afinidade de 5,01 nM. Assim, os dados mostram ainda que anticorpos biespecíficos CD3-Folato peguilados têm afinidade de ligação cerca de 5 vezes menor para células T de macaco Cynomolgus do que não peguilados. No geral, os dados mostram que os anticorpos biespecíficos de CD3- Folato têm afinidades de ligação nM baixas para células T de macaco Cynomolgus.
Tabela 38 - Afinidades de ligação do anticorpo biespecífico de CD3-Folato a células T de macaco Cynomolgus Anticorpo Biespecífico Espécie de célula T Kd (nM) Bmax Células T de Fab1-HK129-pAF Cynomolgus 2,67 26636 Células T de Fab1-HK129-Folato Cynomolgus 2,69 25704 Células T de Fab1-HK129-5KPEG-Folato Cynomolgus 3,31 19924 Células T de Fab1-HK129-LL157-pAF Cynomolgus 0,955 23436 Células T de Fab1-HK129-LL157-BiFolato Cynomolgus 1 19589 Células T de Fab1-HK129-LL157-Bi5KPEG-BiFolato Cynomolgus 5,01 13175 EXEMPLO 26
[0351] Os seguintes estudos demonstram estudos de segurança e eficácia in vivo em camundongos usando anticorpos CD3 Folato da presente invenção.
[0352] Estudo 1: Anticorpos biespecíficos anti-CD3-Folato foram testados quanto à eficácia antitumoral por administração de dose múltipla em camundongos fêmeas imunocomprometidos com tumores cervicais humanos derivados da linha celular KB.
Anticorpos anti-CD3 não direcionados foram incluídos como controle. Ratinhos NSG 6 fêmeas com tumores cervicais KB, (inoculados com 2,0 x 10 células da passagem 7, inicialmente cultivadas a partir da passagem 3 congelada), foram separados em 5 grupos de 8 animais cada. Quando os tumores tinham aproximadamente 100 mm3 de tamanho, 7,5x10 6 células PanT foram inoculadas em camundongos por via intraperitoneal. Vinte e quatro horas depois, os camundongos foram randomizados nos seguintes grupos de tratamento: G1:controle anti-CD3 Fab1-HK129-pAF (0,05 mpk), G2 e G3 tendo cada um 0,01 mpk e 0,05 mpk, respectivamente, de CD3 Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG, G4: Fab9-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG (0,125 mpk), e G5: Controle de CD3 Fab1- HK129-Folato (0,25 mpk); e o volume do tumor (Figura 19A) e massa/peso corporal (Figura 19B) foram determinados. Todos os camundongos foram administrados por via intravenosa (IV) no dia 7, quando os tumores tinham uma média de aproximadamente ~ 125 mm 3. Os animais foram monitorados quanto ao crescimento do tumor por medição do calibre e peso corporal, duas vezes por semana. Todas as composições biespecíficas de CD3-Folato mostraram eficácia, com o grupo 3 ( Fab1-HK129-LL157-BiFolato- Bi5KPEG, 0,05 mpk), tendo o maior impacto em impedir o crescimento do tumor (TGI = 82%), como mostrado na Figura 19A. Todas as composições, exceto o controle, anticorpo CD3 Fab-HK129-pAF, causaram perda de peso corporal (Figura 19B).
[0353] Análise de biomarcador:amostras de sangue foram retiradas de cada animal antes do início dos tratamentos e nos dias 7 e 24 após o início do tratamento. As amostras foram analisadas quanto às porcentagens de CD45 humano/CD45 de camundongo por análise de FACs para determinar se os tratamentos aumentam as populações de células T humanas periféricas, conforme proposto pela ativação/direcionamento de CD3-folato. Na conclusão do estudo, os tumores foram analisados por FACs para a presença de linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), usando o marcador de linfócitos humanos hCD45. Todos os grupos de tratamento com CD3-Folato mostraram eficácia antitumoral e a capacidade de aumentar os níveis sanguíneos de CD45 humano em vários graus - com os níveis mais elevados de CD45 humano e sendo atribuídos ao tratamento pelo anticorpo biespecífico, Fab1-HK129-LL157-BiFolato- Bi5KPEG, a 0,05 mpk (Figura 19C). Este estudo também examinou a inibição do crescimento do tumor e a capacidade das composições de CD3-Folato inventadas para promover linfócitos infiltrantes de tumor (TILs). Além disso, a presença de TILs - uma marca registrada da ativação da vigilância imunológica do tumor, foi encontrada aumentada em todo o tratamento grupos de controle com o grupo 3, (Fab1-HK129- LL157-BiFolato-Bi5KPEG, 0,05 mpk), tendo a maior indução de TILs (Figura 19D).
[0354] Estudo 2: Este estudo examinou a inibição do crescimento tumoral (TGI) e alterações nas porcentagens de CD45 humano no sangue de camundongos/infiltração tumoral em camundongos NCG com tumores KB. Anticorpos biespecíficos anti-CD3- Folato PEGuilados individuais, (Fab1-HK129-LL157-Folato-5KPEG), e duplos, ( Fab1- HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG ), PEGuilados anti-CD3-Folato foram testados para eficácia antitumoral por administração de dose múltipla em mulheres camundongos imunocomprometidos com tumores cervicais humanos derivados da linhagem celular KB. Os anticorpos CD3 não direcionados foram incluídos como controle. 35 camundongos NCG fêmeas portadores de tumores cervicais KB, (inoculados com 2,0 x 10 6 células da passagem 5, inicialmente crescem da passagem congelada 3), foram classificados em 3 grupos de 10 animais cada. Quando os tumores eram de aproximadamente 85-100 mm 3 os ratinhos foram inoculados por via intraperitoneal com 6.0x10 6 células Pant. Vinte e quatro horas depois, os camundongos foram randomizados nos seguintes grupos de tratamento: G1: Controle CD3 Fab1-HK129-pAF, G2: Fab1-HK129-LL157-Folato- 5KPEG, G3: Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG, cada um a 0,025 mpk a cada 5 dias (Figuras 20A e 20B). Todos os camundongos foram inoculados com 6,0 x 10 6 células Pan-T no dia 7 e dosados por via intravenosa (IV) no dia 8, quando os tumores tinham uma média de aproximadamente ~ 100 mm 3. Os animais foram monitorados quanto ao crescimento do tumor (Figura 20A) por medição do calibrador e peso corporal (Figura 20B), duas vezes por semana. Todas as composições de direcionamento de CD3-Folato mostraram vários graus de eficácia, com G2: Fab1-HK129-LL157-Folato-5KPEG
(composição de PEG única) tendo o maior impacto na prevenção do crescimento do tumor (TGI = 85%) e em 5 de 10 camundongos causando regressões tumorais completas (CR) - em comparação com G3: Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG (composição de PEG duplo) que tinha um TGI de 76% e 3 de 10 animais com CR (Figura 20A). Todos os artigos de teste foram tolerados, G3 (composição de PEG duplo) mostrou uma leve perda de peso em alguns camundongos, no entanto, esta não excedeu a perda de 15% (Figura 20B).
[0355] Análise de biomarcador: Amostras de sangue foram retiradas de cada animal no Dia 7 e Dia 14 após o início dos tratamentos conforme descrito acima.
Amostras de sangue foram analisadas quanto a mudanças nas porcentagens de CD45 humano para determinar se os tratamentos aumentam as populações de células T humanas periféricas por meio da ativação/direcionamento de CD3-Folato. Na conclusão do estudo, os tumores foram analisados por FACs para linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), usando o marcador de linfócitos humanos hCD45. Todos os grupos de tratamento com CD3-Folato mostraram eficácia antitumoral e a capacidade de aumentar o sangue (Figura 20C), e tumor (Figura 20D), os níveis de CD45 humano em vários graus - com os níveis mais altos de CD45 humano e TGI sendo atribuídos ao tratamento com a única composição de direcionamento de CD3-Folato PEGuilado. Estudo 3: Mostra resultados semelhantes aos do Estudo 1 e 2. 50 camundongos NSG humanizados fêmeas (CD34 + de laboratórios Jackson) portadores de tumores cervicais KB, (inoculados com 2,0 x 10 6 células da passagem 5, inicialmente crescem da passagem congelada 3), foram classificados em 5 grupos de 10 animais. Quando os tumores eram de aprox. Os tratamentos de 80-100 mm 3 começaram. G1: Controle Fab1-HK129-pAF (0,0125 mpk) G2: Fab1-HK129-BiFolato (0,0025 mpk), G3:Fab1-HK129-BiFolato (0,0125 mpk), G4: Fab1- HK129-BiFolato-Bi5KPEG (0,0025 mpk), G5: Fab1-HK129-BiFolato-Bi5KPEG (0,0125 mpk). Todos os ratos foram administrados por via intravenosa (IV) duas vezes por semana. Os animais foram monitorados quanto ao crescimento do tumor, (Figura 21A), por medição do calibrador e peso corporal, (Figura 21B), duas vezes por semana. A ativação de células T foi analisada em amostras de sangue colhidas de animais no dia 5 dos tratamentos (um dia após a segunda dose). Amostras de sangue foram analisadas quanto às porcentagens de CD45, CD3, CD25 e CD69 humanos por análise de FACs para determinar se as composições de direcionamento de CD3-Folato aumentam a expressão de marcadores de ativação de células T (Figuras 21C-21F). Linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) também foram analisados na conclusão do estudo, com 5 tumores de cada grupo sendo analisados para TILs (CD45, CD3 e CD8) por FACs. Todas as composições de direcionamento de CD3-Folato mostraram vários graus de eficácia - no entanto, em doses semelhantes, todas as composições de direcionamento de CD3- Folato PEGuilado (grupos G4 em 87% TGI e G5 em 91% TGI) superaram suas isoformas não PEGuiladas em doses iguais, (grupos G2 a 51% TGI e G3 a 67% TGI), incluindo a indução de marcadores de ativação de células T CD25/CD69, TILs aumentados e tendo uma maior inibição do crescimento antitumoral. Todos os artigos de teste causaram perda de peso marginal nos camundongos, mas não excederam 15%.
[0356] Estudo 4: Anticorpos biespecíficos CD3-Folato, Fab1-HK129-LL157- BiFolato e Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG foram testados quanto à eficácia antitumoral por administração de dose múltipla em camundongos fêmeas imunocomprometidos com tumores cervicais humanos derivados da linha celular KB.
Anticorpos CD3 não direcionados, (Fab1-HK129-pAF), foram incluídos como controle.
Sessenta e cinco (65) camundongos NSG fêmeas portadores de tumores cervicais KB, (inoculados com 2,0 x 10 6 células da passagem 7, inicialmente crescem da passagem congelada 3), foram classificados em 6 grupos de 10 animais cada. Quando os tumores eram de aproximadamente 85-100 mm 3, 7,5 x 10 6 culas Pant foram inoculados em ratinhos por via intraperitoneal. Vinte e quatro horas depois, os camundongos foram randomizados nos seguintes grupos de tratamento: G1: Controle CD3 Fab1-HK129-pAF, G2: Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG (0,0125 mpk), G3: Fab1-HK129-LL157- BiFolato-Bi5KPEG (0,05 mpk), G4: Fab1-HK129-LL157-BiFolato (0,0125 mpk), G5: Fab1- HK129-LL157-BiFolato (0,05 mpk). Todos os camundongos foram administrados por via intravenosa (IV) no dia 8, quando os tumores tinham uma média de aproximadamente ~ 100 mm 3. Os animais foram monitorados quanto ao crescimento do tumor por medição do calibre e peso corporal, duas vezes por semana. Como mostrado na Figura 22A, todas as composições direcionadas a CD3-Folato mostraram atividade antitumoral, (TGI = G2:92%, G4:55%, G5:90%), com o grupo G3, (Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG a 0,05 mpk ), tendo o maior impacto em impedir o crescimento do tumor (TGI = 99%) e resultando em 6 de 8 camundongos experimentando regressões tumorais completas (CR). Todas as composições de teste, exceto o anticorpo Fab de CD3 de controle, causaram alguma perda de peso corporal, mas não excederam a perda de 15% (Figura 22B). Os resultados deste estudo mostram que há uma resposta dependente da dose que pode ser atribuída às propriedades biofísicas da adição de PEG aos compostos de CD3 Fab-Folato.
[0357] Estudo 5: Os anticorpos biespecíficos CD3-Folato, Fab1-HK129-LL157- BiFolato e Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG, foram testados quanto à eficácia antitumoral por administração de dose múltipla em camundongos fêmeas imunocomprometidos com tumores ovarianos humanos derivados de linhagem celular OV-90 (Figuras 23A e 23B). O OV-90 foi selecionado para determinar se as composições de CD3 Fab-Folato inventadas têm atividade em um modelo de resistência ao padrão de tratamento para câncer de ovário, isto é, terapias baseadas em platina. Anticorpos CD3 não direcionados, (Fab1-HK129-pAF), foram incluídos como controle. Setenta (70) camundongos NSG fêmeas portadores de tumores ovarianos OV-90, (inoculados com 7,5 x 10 6 células da passagem 5, inicialmente crescem da passagem congelada 2), foram classificados em 6 grupos de 10 animais cada. Quando os tumores eram de aproximadamente 100-200 mm 3, 7,5 x 10 6 células PanT foram inoculadas em camundongos por via intraperitoneal. Vinte e quatro horas depois, os camundongos foram randomizados nos seguintes grupos de tratamento: G1: Controle Fab1-HK129- pAF, G2: Fab1-HK129-LL157-BiFolato (0,0125 mpk), G3: Fab1-HK129-LL157-BiFolato (0,05 mpk), G4: Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG (0,0125 mpk), G5: Fab1-HK129- LL157-BiFolato-Bi5KPEG (0,05 mpk), e G6: Carboplatina (100 mpk). Todos os camundongos foram administrados por via intravenosa (IV) no dia 8, quando os tumores tinham uma média de aproximadamente ~ 100 mm 3. Os grupos 1 a 5 foram administrados a cada 5 dias para um total de três doses, enquanto o grupo 6 foi administrado 7 dias depois, (Dia 15), para um total de 2 doses. Os animais foram monitorados quanto ao crescimento do tumor por medição do calibre e peso corporal, duas vezes por semana. Embora o modelo OV-90 seja resistente ao padrão de uso de carboplatina para o tratamento de câncer de ovário (grupo G6), todas as composições de fólio CD3-Fab testadas mostraram vários graus de eficácia, com o grupo G5 (Fab1- HK129-LL157-BiFolato -Bi5KPEG a 0,05 mpk), tendo o maior impacto em impedir o crescimento do tumor (TGI = 81%); Figura 23A. Todas as composições de teste, exceto o anticorpo Fab de CD3 de controle, causaram perda de peso corporal, mas não excederam 20% de perda de peso em cada grupo (Figura 23B).
[0358] Semelhante aos resultados do Estudo 4, o Estudo 5 mostra que os grupos tratados com Fab1-HK129-LL157-BiFolato-Bi5KPEG têm melhor atividade antitumoral quando administrados em concentrações iguais do que os grupos tratados com Fab1-
HK129-LL157-BiFolato. Isto pode ser atribuído às propriedades biofísicas aumentadas resultantes da adição de PEG a composições de CD3 Fab-Folato. É ainda observado que em células de câncer de ovário com baixa cópia do receptor de folato (como OV-90 com ~ 10K cópias por célula), um forte efeito antitumoral ainda é observado. Isto apóia o uso das composições de Fab-Folato de CD3 inventadas como terapêutica de linha de frente para o tratamento de populações de pacientes, sem o pré-requisito de alto número de cópias do receptor de folato. Isto é ainda afirmado pelas análises de citotoxicidade in vitro aqui apresentadas, mostrando que as células com baixos números de cópias do receptor de folato ainda têm valores de EC50 na gama picomolar.
EXEMPLO 27
[0359] Ensaio clínico humano da segurança e eficácia do anticorpo biespecífico anti-CD3 Fab-Folato, (Fab-BiFolato, Fab-Folato-PEG e Fab-BiFolato-BiPEG), composições compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural.
[0360] Objetivo: Para comparar a segurança e a farmacocinética do anticorpo humano recombinante biespecífico anti-CD3 Fab-Folato administrado por via subcutânea compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural com um produto comercialmente disponível específico para o mesmo antígeno alvo.
[0361] Pacientes: Dezoito voluntários saudáveis com idade entre 20-40 anos e pesando entre 60-90 kg estão incluídos no estudo. Os indivíduos não terão valores laboratoriais anormais clinicamente significativos para hematologia ou química do soro e um teste toxicológico de urina negativo, teste de HIV e antígeno de superfície da hepatite B. Eles não devem ter nenhuma evidência do seguinte:hipertensão; uma história de qualquer doença hematológica primária; história de doença hepática, renal, cardiovascular, gastrointestinal, geniturinária, metabólica, neurológica significativa; uma história de anemia ou distúrbio convulsivo; uma sensibilidade conhecida a produtos derivados de bactérias ou mamíferos, PEG ou albumina de soro humano; consumidor habitual e pesado de bebidas que contenham cafeína; participação em qualquer outro ensaio clínico ou teve sangue transfundido ou doado dentro de 30 dias do início do estudo; teve exposição ao anticorpo anti-CD3 dentro de três meses da entrada no estudo; adoeceu sete dias após o início do estudo; e apresentar anormalidades significativas no exame físico pré-estudo ou nas avaliações clínicas laboratoriais dentro de 14 dias da entrada no estudo. Todos os indivíduos são avaliados quanto à segurança e todas as coletas de sangue para análise farmacocinética são coletadas conforme programado. Todos os estudos são realizados com a aprovação do comitê de ética institucional e consentimento do paciente.
[0362] Este será um estudo de Fase I, de centro único, aberto, randomizado, cruzado de dois períodos em voluntárias saudáveis. Dezoito indivíduos são atribuídos aleatoriamente a um de dois grupos de sequência de tratamento (nove indivíduos/grupo).
O anticorpo anti-CD3 é administrado através de períodos de dosagem local ou sistemicamente por qualquer uma das vias normalmente utilizadas para a introdução de um anticorpo a um sujeito, em necessidade, pelo especialista na técnica. As composições de anticorpos anti-CD3 de acordo com a presente invenção podem ser administradas por via subcutânea, intramuscular, intradérmica, intraarticular, intrapleural, intraperitoneal, intra-arterial ou intravenosa, embora a via mais adequada em qualquer caso dependa da natureza e gravidade da doença e/ou afecção a ser tratada. Por exemplo, a administração pode ser ao longo de dois períodos de dosagem separados como um bolus subcutâneo (sc) ou injeção intravenosa usando doses equivalentes do anticorpo biespecífico anti- CD3 Fab-Folato compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural e o produto disponível comercialmente escolhido. A dose e a frequência de administração do produto comercialmente disponível são conforme as instruções no rótulo da embalagem.
Dosagem adicional, frequência de dosagem ou outro parâmetro conforme desejado, usando os produtos comercialmente disponíveis podem ser adicionados ao estudo incluindo grupos adicionais de indivíduos. Cada período de dosagem é separado por um período de eliminação de 14 dias. Os indivíduos são confinados ao centro de estudo pelo menos 12 horas antes e 72 horas após a dosagem para cada um dos dois períodos de dosagem, mas não entre os períodos de dosagem. Grupos adicionais de indivíduos podem ser adicionados se houver dosagem, frequência ou outros parâmetros adicionais a serem testados para o anticorpo anti-CD3 biespecífico PEGuilado também. A formulação experimental do anticorpo anti-CD3 é o anticorpo biespecífico anti-CD3 Fab- Folato compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural.
[0363] Amostra de sangue: O sangue em série é coletado por punção direta da veia antes e após a administração de anticorpo biespecífico anti-CD3 Fab-Folato.
Amostras de sangue venoso (5 ml) para determinação das concentrações séricas de anticorpos anti-CD3 são obtidas em cerca de 30, 20 e 10 minutos antes da dosagem (3 amostras de linha de base) e aproximadamente nos seguintes tempos após a dosagem: 30 minutos e 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 e 72 horas. Cada amostra de soro é dividida em duas alíquotas. Todas as amostras de soro são armazenadas a -20ºC. As amostras de soro são enviadas em gelo seco. Os testes de laboratório clínico em jejum (hematologia, química do soro e urinálise) são realizados imediatamente antes da dose inicial no dia 1, na manhã do dia 4, imediatamente antes da dosagem no dia 16 e na manhã do dia 19.
[0364] Métodos bioanalíticos: Um procedimento de radioimunoensaio (RA) ou kit de ELISA é usado para a determinação das concentrações de anticorpo biespecífico anti- CD3 Fab-Folato sérico.
[0365] Determinações de segurança: Os sinais vitais são registrados imediatamente antes de cada dosagem (Dias 1 e 16) e às 6, 24, 48 e 72 horas após cada dosagem. As determinações de segurança são baseadas na incidência e tipo de eventos adversos e nas alterações nos testes de laboratório clínico desde o início. Além disso, são avaliadas as alterações do pré-estudo nas medições dos sinais vitais, incluindo a pressão arterial e os resultados do exame físico.
[0366] Análise de Dados: Os valores de concentração sérica pós-dose são corrigidos para as concentrações basais de anticorpos anti-CD3 pré-dose subtraindo de cada um dos valores pós-dose a concentração média basal de anticorpos anti-CD3 determinada a partir da média dos níveis de anticorpos anti-CD3 das três amostras coletadas a 30, 20 e 10 minutos antes da dosagem. As concentrações séricas de anticorpos anti-CD3 pré-dose não são incluídas no cálculo do valor médio se estiverem abaixo do nível de quantificação do ensaio. Os parâmetros farmacocinéticos são determinados a partir dos dados de concentração sérica corrigidos para as concentrações basais de anticorpos anti-CD3. Os parâmetros farmacocinéticos são calculados por métodos independentes de modelo em um sistema de computador VAX 8600 da Digital Equipment Corporation usando a versão mais recente do software BIOAVL. Os seguintes parâmetros farmacocinéticos são determinados: pico de concentração sérica (Cmax ); tempo para atingir a concentração sérica máxima (tmax ); área sob a curva de concentração-tempo (AUC) desde o momento zero até o momento da última amostragem de sangue (AUC 0-72 ) calculada com o uso da regra trapezoidal linear; e meia-vida de eliminação terminal (t 1/2 ), calculada a partir da constante de taxa de eliminação. A constante de taxa de eliminação é estimada por regressão linear de pontos de dados consecutivos na região linear terminal do gráfico log-linear de concentração- tempo. A média, o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (CV) dos parâmetros farmacocinéticos são calculados para cada tratamento. A proporção das médias dos parâmetros (formulação preservada/formulação não preservada) é calculada.
[0367] Resultados de segurança: A incidência de eventos adversos é igualmente distribuída entre os grupos de tratamento. Não há alterações clinicamente significativas desde a linha de base ou testes laboratoriais clínicos pré-estudo ou pressões sanguíneas, e nenhuma mudança notável desde o pré-estudo nos resultados do exame físico e medições dos sinais vitais. Os perfis de segurança para os dois grupos de tratamento devem ser semelhantes.
[0368] Resultados farmacocinéticos: Os perfis médios de concentração biespecífica de Fab-Folato do anticorpo anti-CD3 sérico (não corrigidos para os níveis basais de anticorpos anti-CD3) em todos os 18 indivíduos após receberem uma dose única de um ou mais dos produtos comercialmente disponíveis específicos para o mesmo antígeno alvo são comparados com o anticorpo biespecífico anti-CD3 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural em cada ponto de tempo medido. Todos os indivíduos devem ter concentrações basais de anticorpos anti-CD3 pré-dose dentro da faixa fisiológica normal. Os parâmetros farmacocinéticos são determinados a partir dos dados do soro corrigidos para as concentrações basais médias de anticorpos anti- CD3 pré-dose e são determinados Cmax e tmax. A média tmáx para o comparador clínica (s) escolhido é significativamente mais curto do que o tmax para o anticorpo anti-CD3 biespecífica compreendendo o não-naturalmente codificado amino ácido. Os valores de meia-vida terminal são significativamente mais curtos para os produtos de anticorpo anti- CD3 comercialmente disponíveis testados em comparação com a meia-vida terminal para o anticorpo anti-CD3 biespecífico compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural da presente invenção.
[0369] Em conclusão, doses únicas administradas por via subcutânea de anticorpo biespecífico anti-CD3 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural serão seguras e bem toleradas por mulheres saudáveis. Com base em uma incidência comparativa de eventos adversos, valores de laboratório clínico, sinais vitais e resultados de exame físico, os perfis de segurança das formas comercialmente disponíveis de anticorpo anti-CD3 e anticorpo biespecífico de folato anti-CD3 fab compreendendo aminoácido codificado de forma não natural ser equivalente. O anticorpo biespecífico anti-CD3 compreendendo um aminoácido codificado de forma não natural fornece uma grande utilidade clínica para pacientes e profissionais de saúde.
[0370] Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritos são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou mudanças à luz dos mesmos serão sugeridas aos versados na técnica e devem ser incluídos dentro do espírito e âmbito deste pedido e escopo do reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados no presente documento são incorporados no presente documento a título de referência em sua totalidade para todos os fins.
[0371] A presente invenção é descrita adicionalmente pelas seguintes modalidades enumeradas
1. Um anticorpo Fab anti-CD3, que compreende pelo menos um dos SEQ ID NO: 1-61.
2. Um anticorpo Fab anti-CD3 da reivindicação 1, que compreende dois dos SEQ ID NO: 1-61.
3. Uma molécula de ligação biespecífica compreendendo i) um primeiro domínio de ligação e ii) um segundo domínio de ligação, em que o segundo domínio de ligação é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1-61.
4. Um construto de ligação específica a Fab CD3 citotoxicamente ativo, que compreende a sequência de aminoácidos estabelecida em um ou mais dos SEQ ID NOs: 1-61.
5. Um anticorpo Fab anti-CD3, em que o anticorpo anti-CD3 compreende um domínio de ligação compreendendo (a) um domínio VH compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1-3 e (b) um domínio VL compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 4-5.
6. O anticorpo Fab anti-CD3 da reivindicação 4, em que o anticorpo está ligado a uma ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa.
7. O anticorpo anti-CD3 da reivindicação 6, em que a molécula biologicamente ativa é folato.
8. O anticorpo Fab anti-CD3 da reivindicação 1 que tem um aminoácido codificado de forma não natural incorporado.
9. Uma variante do Fab anti-CD3 da reivindicação 6, em que a cadeia pesada compreende adicionalmente uma extensão de aminoácido no terminal C.
10. A variante do Fab anti-CD3 da reivindicação 9, em que a extensão de aminoácido compreende os aminoácidos DKTHT.
11. O anticorpo Fab anti-CD3 da reivindicação 5, em que a sequência de cadeia pesada e cadeia leve compreende resíduos de arcabouço ou mutações da linhagem germinativa em uma ou mais posições para ligação de antígeno.
12. O anticorpo Fab anti-CD3 da reivindicação 6, em que o ligante é um polímero solúvel em água.
13. O anticorpo Fab anti-CD3 da reivindicação 12, em que o polímero solúvel em água é linear ou ramificado.
14. O anticorpo Fab anti-CD3 da reivindicação 6, em que compreende um ou mais folatos e um ou mais poli(etilenoglicol).
15. Um método para otimizar a morte celular em uma célula que expressa números elevados de receptores de folato que compreende um anticorpo Fab anti-CD3 da reivindicação 5, em que o anticorpo compreende um ou mais folatos; e em que um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural são incorporados no anticorpo.
16. O método da reivindicação 15, em que o número de receptor de folato é igual ou maior que 10.000.
17. O anticorpo Fab anti-CD3 da reivindicação 5, em que compreende adicionalmente um ligante de folato de PEG com a estrutura de acordo com o composto
30.
18. Um método para tratar um paciente com uma doença ou afecção em uma célula que expressa um número elevado de receptor de folato, que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo Fab anti-CD3 da reivindicação 17.
19. O anticorpo biespecífico anti-CD3 Fab da reivindicação 3, que compreende dois folato e duas moléculas PEGuiladas.
20. O anticorpo biespecífico anti-CD3 Fab da reivindicação 19, que compreende adicionalmente um local de aminoácido codificado de forma não natural especificamente incorporado.

Claims (44)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de pelo menos um dos SEQ ID NOs: 1-62.
2. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de dois dos SEQ ID NOs: 1-62.
3. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) qualquer um dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57; e b) qualquer um dos SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61, e 62.
4. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende qualquer um dos SEQ ID NOs: 1-6 e qualquer um dos SEQ ID NO: 7-9.
5. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende qualquer um dos SEQ ID NO: 4-6 e qualquer um dos SEQ ID NO: 7-9.
6. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende um IgG, Fv, Fab, (Fab')2, ou Fv de cadeia simples (scFv).
7. Molécula de ligação biespecífica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (i) um primeiro domínio de ligação; e ii) um segundo domínio de ligação, em que o segundo domínio de ligação compreende pelo menos um dos SEQ ID NOs: 1-
62.
8. Molécula de ligação biespecífica, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo domínio de ligação compreende dois dos SEQ ID NOs: 1-62.
9. Molécula de ligação biespecífica, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo domínio de ligação compreende: a) qualquer um dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57; e b) qualquer um dos SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62.
10. Molécula de ligação biespecífica, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que o segundo domínio de ligação compreende qualquer um dos SEQ ID NOs: 1-6 e qualquer um dos SEQ ID NO: 7-9.
11. Construto de ligação específico para CD3 citotoxicamente ativo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um dos SEQ ID NOs: 1-
62.
12. Construto de ligação específico para CD3 citotoxicamente ativo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende dois dos SEQ ID NOs: 1-62.
13. Construto de ligação específico para CD3 citotoxicamente ativo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) qualquer um dos SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, e 57; e b) qualquer um dos SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 18, 19, 20, 39, 58, 59, 60, 61 e 62.
14. Construto de ligação específico para CD3 citotoxicamente ativo, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende qualquer um dos SEQ ID NOs: 1-6 e qualquer um dos SEQ ID NO: 7-9.
15. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente, em que o aminoácido não codificado naturalmente é para-acetil fenilalanina, p-nitrofenilalanina, p- sulfotirosina, p-carboxifenilalanina, o-nitrofenilalanina, m-nitrofenilalanina, p-boronil fenilalanina, o-boronilfenilalanina, m-boronilfenilalanina, p-aminofenilalanina, o- aminofenilalanina-o-fenilalanina, o-aminofenilalanil-aminofenilalanina, p- aminofenilalanina-aminofenilalanina, acinofenilalanina-aminofenilalanina, acanilamilanilalanina-fenilalanina m-acilfenilalanina, p-OMe fenilalanina, o-OMe fenilalanina, m-OMe fenilalanina, p-sulfofenilalanina, o-sulfofenilalanina, m- sulfofenilalanina, 5-nitro His, 3-nitro Tir, 2-nitro Tir, nitro-substituído Leu, nitro substituído His, nitro substituído De, nitro substituído Trp, 2-nitro Trp, 4-nitro Trp, 5-nitro Trp, 6-nitro Trp, 7-nitro Trp, 3-aminotirosina, 2-aminotirosina, O-sulfotirosina, 2 -sulfooxifenilalanina, 3-sulfooxifenilalanina, o-carboxifenilalanina, m-carboxifenilalanina, p-acetil-L- fenilalanina, p-propargil-fenilalanina, O-metil-L-tirosina, L-3-(2-naftil)alanina, 3-metil- fenilalanina, O-4-alil-L-tirosina, 4-propil-L-tirosina, tri-O-acetil-GlcNAcβ-serina, L-Dopa, fenilalanina fluorada, isopropil-L-fenilalanina, p-azido-L-fenilalanina, p-acil-L-fenilalanina, p-benzoil-L-fenilalanina, L-fosfoserina, fosfonoserina, fosfonotirosina, p-iodo-fenilalanina, p-bromofenilalanina, p-amino-L-fenilalanina, isopropil-L-fenilalanina e p-propargiloxi-L- fenilalanina.
16. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido codificado de forma não natural é especificamente incorporado no anticorpo.
17. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15, CARACTERIZADO pelo fato de que está ligado a um ligante, polímero ou molécula biologicamente ativa.
18. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo da reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante ou polímero é um polímero bifuncional ou ligante bifuncional.
19. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 e 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula biologicamente ativa compreende uma pequena molécula.
20. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 15 e 17 a 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula biologicamente ativa compreende uma ou mais moléculas de folato ou análogo ou derivado das mesmas.
21. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 15 e 17 a 20, CARACTERIZADO pelo fato de que o aminoácido não codificado naturalmente está ligado a um polímero solúvel em água.
22. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o polímero solúvel em água compreende um ou mais poli(etilenoglicol) (PEG).
23. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo da reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o PEG está ligado a um aminoácido codificado de forma não natural ou a uma molécula biologicamente ativa.
24. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o PEG é covalentemente conjugado ao domínio de cadeia pesada e/ou leve de C-terminal.
25. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação
24, CARACTERIZADO pelo fato de que o PEG é conjugado ao domínio de cadeia pesada e leve de C-terminal por meio de reticulação por ligação de dissulfeto.
26. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22-25, CARACTERIZADO pelo fato de que PEG é linear ou ramificado.
27. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ou mais folato e uma ou mais moléculas de PEG.
28. Anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de cadeia pesada e cadeia leve compreende resíduos de estrutura e/ou mutações da linhagem germinativa em uma ou mais posições para ligação de antígeno.
29. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de que é para otimização de ligação de antígeno.
30. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente uma estrutura de molécula de ligante de PEG de acordo com o composto 29A, 29B, 29C, 29D, 29E, 30A, 30B, 30C, 30D e 30E.
31. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo, ou fragmento compreende uma ou mais modificações pós-tradução.
32. Anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15 a 31, a molécula de ligação biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 10, ou o construto de ligação específica de CD3 citotoxicamente ativo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 14,
CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso em terapia.
33. Método para otimizar a morte celular em uma célula que expressa números elevados de receptor de folato, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um anticorpo anti-CD3 ou fragmento de anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15 a 31, e a molécula de ligação biespecífica das reivindicações 7 a 10, ou construto de ligação específica para CD3 citotoxicamente ativo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 14, em que o anticorpo, molécula de ligação ou construto de ligação compreende um ou mais folatos; e em que um ou mais aminoácidos não codificados naturalmente são incorporados ao anticorpo.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o número de receptor de folato é igual ou maior que 10.000.
35. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente uma ou mais moléculas de PEG ligadas a um ou mais aminoácidos codificados de forma não natural, ou uma ou mais moléculas de folato, ou C-terminal da cadeia pesada ou leve, ou C-terminal de cadeia tanto pesada quanto leve.
36. Método para tratar um sujeito com uma doença ou afecção em uma célula que expressa um número elevado de receptor de folato, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15 a 31.
37. Método para tratar um paciente com câncer, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15 a 31.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é caracterizado pela alta expressão do receptor alfa de folato (FOLR1), opcionalmente em que o câncer é câncer de ovário.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer de ovário compreende um tumor eptitelial, um tumor estromal, um tumor de células germinativas, um câncer das trompas de Falópio ou um carcinoma peritoneal primário.
40. Método para tratar um paciente com diabetes, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15 a 31.
41. Método para tratar um paciente com AIDs, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15 a 31.
42. Método para tratar um paciente com doenças hereditárias, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15 a 31.
43. Uso do anticorpo Fab anti-CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15 a 31, molécula de ligação biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 10, ou construto de ligação específica de CD3 citotoxicamente ativo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para utilização em uma célula que expressa um número elevado de receptores de folato.
44. Composição farmacêutica de Fab, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e 15 a 31, a molécula de ligação biespecífica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 7 a 10, ou o construto de ligação específico de CD3 citotoxicamente ativo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 14, e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3370771A4 (en) * 2015-11-03 2019-06-19 Ambrx, Inc. ANTI-CD3-FOLATE CONJUGATES AND USES THEREOF
JP7137696B2 (ja) 2019-05-14 2022-09-14 プロヴェンション・バイオ・インコーポレイテッド １型糖尿病を予防するための方法および組成物
WO2021173889A1 (en) * 2020-02-26 2021-09-02 Ambrx, Inc. Uses of anti-cd3 antibody folate bioconjugates
WO2021252917A2 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
WO2024077277A1 (en) 2022-10-07 2024-04-11 Ambrx, Inc. Drug linkers and antibody conjugates thereof

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
EP0052322B1 (de) 1980-11-10 1985-03-27 Gersonde, Klaus, Prof. Dr. Verfahren zur Herstellung von Lipid-Vesikeln durch Ultraschallbehandlung, Anwendung des Verfahrens und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
DE3377484D1 (en) 1982-04-19 1988-09-01 Nissan Motor Method for controlling reduction ratio of continuously variable transmission with acceleration compensation
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3486459D1 (de) 1983-09-26 1997-12-11 Udo Dr Med Ehrenfeld Mittel und Erzeugnis für die Diagnose und Therapie von Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
EP0188256B1 (en) 1985-01-14 1991-08-21 NeoRx Metal radionuclide labeled proteins for diagnosis and therapy
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
CA2103059C (en) 1991-06-14 2005-03-22 Paul J. Carter Method for making humanized antibodies
JP4157160B2 (ja) 1991-12-13 2008-09-24 ゾーマ テクノロジー リミテッド 改変抗体可変領域の調製のための方法
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
ATE375363T1 (de) 1997-07-14 2007-10-15 Bolder Biotechnology Inc Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
DK1034298T3 (da) 1997-12-05 2012-01-30 Scripps Research Inst Humanisering af murint antistof
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
EP1124946B1 (en) 1998-10-30 2007-06-20 Novozymes A/S Glycosylated proteins having reduced allergenicity
US6479470B1 (en) 1999-04-28 2002-11-12 Georgetown University Ligands for metabotropic glutamate receptors and inhibitors of NAALAdase
WO2001062827A2 (en) 2000-02-22 2001-08-30 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
EP2226316B1 (en) 2002-05-30 2016-01-13 The Scripps Research Institute Copper-catalysed ligation of azides and acetylenes
CN1795009B (zh) * 2002-11-07 2014-07-09 伊谬诺金公司 抗-cd33抗体及其用途
AU2005230848B9 (en) 2004-03-31 2011-06-02 Genentech, Inc. Humanized anti-TGF-beta antibodies
US7807619B2 (en) 2004-11-01 2010-10-05 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
WO2006069246A2 (en) 2004-12-22 2006-06-29 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
JP4616237B2 (ja) 2006-11-07 2011-01-19 日本電信電話株式会社 シリコン化合物薄膜の形成方法
JP5773382B2 (ja) 2010-12-29 2015-09-02 株式会社Sumco シリカガラスルツボ及びその製造方法
WO2012166560A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
EP2861262B1 (en) 2012-06-19 2018-11-28 Ambrx, Inc. Anti-cd70 antibody drug conjugates
US10351626B2 (en) 2013-03-14 2019-07-16 The Scripps Research Institute Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
NZ739028A (en) * 2015-07-15 2023-05-26 Genmab As Humanized or chimeric cd3 antibodies
EP3370771A4 (en) * 2015-11-03 2019-06-19 Ambrx, Inc. ANTI-CD3-FOLATE CONJUGATES AND USES THEREOF
CN109069635B (zh) * 2016-02-04 2023-09-26 斯克利普斯研究所 人源化抗cd3抗体、偶联物及其用途

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