CN109069635B - 人源化抗cd3抗体、偶联物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了人源化抗CD3抗体及其偶联物。这些偶联物可用于治疗诸如前列腺癌的病况。

Description

人源化抗CD3抗体、偶联物及其用途
交叉引用
本申请要求2016年2月4日提交的美国临时申请号62/291,143的权益，所述临时申请通过引用而全文并入。
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2017年5月16日，被命名为41135-759_601_SL.txt，大小为95,476字节。
背景技术
抗体药物偶联物(ADC)是一类利用生物制剂和小分子药物的独特性质的有前景的治疗剂。通过用连接体将抗体与药物栓系，这些偶联物相对于它们的非偶联形式可获得高靶标特异性、增加的血清稳定性或改善的细胞渗透性。调整这些偶联物的性质和功效的关键变量包括连接体附接(在抗体和药物两者上)的化学位点、抗体结构和连接体组成/长度。
在一些癌症中，特异性细胞表面受体的过表达可允许用小分子药物选择性地靶向癌细胞，而对健康细胞的影响最小。例如，靶向前列腺癌特异性膜抗原(PMSA)的2-[3-(1,3-二羧基丙基)-脲基]戊二酸(DUPA)可偶联至T细胞表面抗原(αCD3)结合抗体，从而选择性地募集细胞毒性T细胞以杀死前列腺癌细胞。N-(4-{[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢蝶啶-6-基)甲基]氨基}苯甲酰基)-L-谷氨酸(叶酸)也可用作靶向剂，从而与在FR+癌细胞系上过表达的叶酸受体(FR)抗原结合。
发明内容
在本公开内容的一个方面，提供了抗体药物偶联物(ADC)，其利用小分子靶向表达细胞表面受体如PSMA和FR抗原的癌细胞。进一步提供了对分化簇3(CD3)T细胞共同受体具有特异性的抗体，该抗体可以在ADC中使用，以将T细胞介导的裂解靶向至表达特定细胞表面受体的癌细胞。本文提供的示例性ADC包含与PMSA靶向分子偶联的抗CD3抗体。该类ADC可用于治疗前列腺癌。其他示例性ADC包含与叶酸偶联的抗CD3抗体，因此可用于治疗具有FR+过表达的癌症。
在一个方面，本文提供了一种抗体，其包含：包含SEQ ID NO:74的第一氨基酸序列，和包含SEQ ID NO:54-56中的一个或多个的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51-53中的一个或多个。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:97、59或110中的一个或多个。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQID NO:32。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:114-123中的一个或多个。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:111或112。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87、92、96或124中的一个或多个。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:99-108中的一个或多个。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:86或98。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含轻链恒定域序列，第二氨基酸序列包含轻链恒定域序列，或者第一氨基酸序列和第二氨基酸序列各自均包含轻链恒定域序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含重链恒定域序列，第二氨基酸序列包含重链恒定域序列，或者第一氨基酸序列和第二氨基酸序列各自均包含重链恒定域序列。在一些实施方案中，提供一种组合物，其包含：包含所述抗体的第一部分，和包含第二抗体或抗体片段的第二部分。
在一些实施方案中：(a)第一氨基酸序列中的一个或多个氨基酸是非天然氨基酸；(b)第二氨基酸序列中的一个或多个氨基酸是非天然氨基酸；或者(c)第一氨基酸序列中的一个或多个氨基酸是非天然氨基酸，并且第二氨基酸序列中的一个或多个氨基酸是非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述抗体包含位于以下序列内的非天然氨基酸：第一氨基酸序列的轻链恒定域序列，第二氨基酸序列的重链恒定域序列，或者第一氨基酸序列的轻链恒定域序列和第一氨基酸序列的重链恒定域序列。在一些实施方案中，所述重链恒定域序列包含：(a)选自SEQ ID NO:86和98的氨基酸序列；或者(b)选自SEQ ID NO:99-109中的一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述轻链恒定域序列包含选自SEQ ID NO:111和112的氨基酸；或者(b)选自SEQ ID NO:113-123中的一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，提供了包含抗体和细胞靶向分子的组合物。在一些实施方案中，提供了包含经由非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子的组合物。在一些实施方案中，所述细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)或叶酸受体相互作用。在一些实施方案中，所述组合物包含式(III)化合物及其立体异构体：
其中：
L是
A1选自芳基、5至6元杂芳基、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L1是
A2选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L2是
A3是键、
L3是
X2是
A4选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个R1独立地选自H、烷基和卤代烷基；
每个R2、R21、R22、R23和R24独立地选自H、卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基和杂芳基烷基；
每个R3独立地选自卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、-NO2和NR1R1；
每个G1和G2独立地选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个Z、Z1、Z2和Z3独立地选自键、-O-和-N(R1)-；
Z4选自键、芳基和5至6元杂芳基；
k、k1、k2、k3和k4各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
p为0、1、2、3或4；
X3是 或-S-；
L4是直接附接至修饰的氨基酸的键，或者与修饰的氨基酸结合的连接体，其中所述修饰的氨基酸是所述抗体的一部分；
Q选自：且
E选自：
在另一个方面，本文提供包含第一氨基酸序列的抗体，第一氨基酸序列包含：(a)SEQ ID NO:54-56中的一个或多个；和(b)SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:98或具有以非天然氨基酸替换SEQ ID NO:86中的一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87、92、96或124中的一个或多个。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含第二氨基酸序列，第二氨基酸序列包含：(a)SEQ ID NO:51-53中的一个或多个，(b)SEQ ID NO:97、59、74、110中的一个或多个，或者(c)(a)和(b)的组合。在一些实施方案中，提供包含所述抗体和细胞靶向分子的组合物。在一些实施方案中，所述细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)或叶酸受体相互作用。在一些实施方案中，提供包含所述抗体的组合物，该组合物包含式(III)化合物及其立体异构体：
其中：
L是
A1选自芳基、5至6元杂芳基、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L1是
A2选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L2是
A3是键、
L3是
X2是
A4选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个R1独立地选自H、烷基和卤代烷基；
每个R2、R21、R22、R23和R24独立地选自H、卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基和杂芳基烷基；
每个R3独立地选自卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、-NO2和NR1R1；
每个G1和G2独立地选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个Z、Z1、Z2和Z3独立地选自键、-O-和-N(R1)-；
Z4选自键、芳基和5至6元杂芳基；
k、k1、k2、k3和k4各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
p为0、1、2、3或4；
X3是 或-S-；
L4是直接附接至修饰的氨基酸的键，或者与修饰的氨基酸结合的连接体，其中所述修饰的氨基酸是所述抗体的一部分；
Q选自：且
E选自：
在另一个方面，本文提供了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54-56中的一个或多个的第一氨基酸序列；和(b)非天然氨基酸。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87、92、96或124中的一个或多个。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQID NO:99-108中的一个或多个。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:98。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含所述非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述抗体进一步包含第二氨基酸序列，第二氨基酸序列包含：(a)SEQ ID NO:51-53中的一个或多个，(b)SEQ ID NO:97、59、74或110中的一个或多个，或者(c)(a)和(b)的组合。在一些实施方案中，提供包含所述抗体和细胞靶向分子的组合物。在一些实施方案中，所述细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)或叶酸受体相互作用。在一些实施方案中，提供包含权利要求29-36中任一项所述的抗体的组合物，其包含式(III)化合物及其立体异构体：
其中：
L是
A1选自芳基、5至6元杂芳基、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L1是
A2选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L2是
A3是键、
L3是
X2是
A4选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个R1独立地选自H、烷基和卤代烷基；
每个R2、R21、R22、R23和R24独立地选自H、卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基和杂芳基烷基；
每个R3独立地选自卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基或杂芳基烷基、-NO2和NR1R1；
每个G1和G2独立地选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个Z、Z1、Z2和Z3独立地选自键、-O-和-N(R1)-；
Z4选自键、芳基和5至6元杂芳基；
k、k1、k2、k3和k4各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
p为0、1、2、3或4；
X3是 或-S-；
L4是直接附接至修饰的氨基酸的键，或者与修饰的氨基酸结合的连接体，其中所述修饰的氨基酸是所述抗体的一部分；
Q选自：且
E选自：
在另一个方面，提供一种组合物，其包含：(a)包含SEQ ID NO:51-56中的一个或多个以及非天然氨基酸的氨基酸序列；和(b)经由所述非天然氨基酸与所述氨基酸序列连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于氨基酸序列的重链恒定域序列内。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:87、92、96或124中的一个或多个。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:99-108中的一个或多个。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:98或具有以所述非天然氨基酸替换SEQ ID NO:86中的一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗体包含第二氨基酸序列，第二氨基酸序列包含：(a)SEQ ID NO:51-53中的一个或多个；(b)SEQID NO:97、59、74、110中的一个或多个；或者(c)(a)和(b)的组合。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，所述细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)或叶酸受体相互作用。
附图说明
图1A示出了经由连接体(L)与重链连接的抗-CD3抗体(例如，huL5H2)单突变体DUPA偶联物的示意性合成。
图1B示出了经由两个连接体(L)与重链和轻链均连接的抗-CD3抗体(例如，huL5H2)双突变体DUPA偶联物的示意性合成。
图1C示出了经由连接体(L)与重链和轻链均连接的抗-CD3抗体(例如，huL5H2)双突变体叶酸偶联物的示意性合成。
图1D示出了经由连接体(L)与重链连接的抗-CD3抗体(例如，huL5H2)单突变体叶酸偶联物的示意性合成。
图2示出了抗CD3可变重链和轻链氨基酸序列的比对，其中高变区用LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2和HCDR3表示，分别对应于SEQ ID NO:51-56。VH hu1和VH hu2分别对应于SEQ ID NO:25和26。VL hu1至VL hu 10分别对应于SEQ ID NO:28-37。将编码这些序列的核酸序列分别克隆入pFUSE载体中，处于IL2信号肽序列之下。图2按出现顺序分别公开了作为SEQ ID NO 24和23的鼠抗CD3VH和VL，作为SEQ ID NO:125的IGHV3-73，和作为SEQ IDNO:126的IGLV7-46。
图3示出了在基于荧光的流式细胞术测定中，抗体huL5H2(重链SEQ ID NO:41和轻链SEQ ID NO:39)与人CD3的出色结合，这与人T细胞上的鼠抗CD3相当。
图4示出了在基于荧光的流式细胞术测定中，抗体huL5H2(重链SEQ ID NO:41和轻链SEQ ID NO:39)与人CD3的结合，这与鼠抗CD3与食蟹猴T细胞的结合相当。
图5示出了包含pAcF非经典氨基酸的纯化的抗-CD3抗体(κ＝SEQ ID NO:39、41，λ＝SEQ ID NO:38、41)的SDS-PAGE凝胶。具有包含κ恒定域的Fab的抗CD3抗体产生的表达水平是由λ恒定域组成的Fab的大约4倍。
图6A示出了在通过大小过滤(Amicon，10K和30K)去除过量连接体后，通过QTOF质谱法证实，huL5H2(SEQ ID NO:40、42)与p-TriA的偶联反应的完成。huL5H2-pTriA具有两个DUPA分子(2xDUPA)，一个与每个轻链偶联，而另一个与每个重链偶联。
图6B示出了与p-TriA在重链和轻链处偶联以产生huL5H2(2xDUPA)双突变体之前和之后，纯化的抗-CD3Fab(SEQ ID NO:40、42)的SDS-PAGE凝胶。
图7示出了流式细胞术荧光测定，其中huL5H2(SEQ ID NO:40、42)和UCHT-1(SEQID NO:84、85)抗体与p-TriA(2xDUPA)偶联物(与p-TriA偶联的SEQ ID NO:40、42，“huL5H2-p-TriA(2xDUPA)”)证明了细胞表面分别与Jurkat(人)T细胞和C4-2(PSMA阳性)细胞具有相当的结合，其中与DU145(PSMA阴性)细胞的非特异性结合最小。
图8A示出了在细胞毒性测定中，huL5H2-p-TriA(2xDUPA)和UCHT-1-p-TriA(2xDUPA)抗体偶联物以相当的效力选择性地针对C4-2(PSMA阳性)细胞重定向人PBMC。
图8B示出了huL5H2-和UCHT-1-p-TriA(2xDUPA)抗体偶联物诱导DU145(PSMA-阴性)细胞的最小非特异性杀伤。
图9示出了仅huL5H2-p-TriA(2xDUPA)诱导食蟹猴PBMC对C4-2细胞的裂解，EC50＝60.5pM。
图10A示出了huL5H2和UCHT-1(2xDUPA)的p-TriA偶联物均在PSMA阳性细胞中诱导类似水平的T细胞活化。
图10B示出了p-TriA huL5H2和UCHT-1(2xDUPA)偶联物均在PSMA-阴性细胞中诱导最小T细胞活化。
图11A示出了在流式细胞术测定中，p-TriA huL5H2和UCHT-1(2xDUPA)偶联物均在PSMA阳性细胞中诱导类似的T细胞增殖。
图11B示出了在流式细胞术测定中，p-TriA huL5H2和UCHT-1(2xDUPA)偶联物均在PSMA-阴性细胞中诱导最小的T细胞增殖。
图12A示出了在PSMA阳性C4-2细胞的存在下，p-TriA huL5H2和UCHT-1(2xDUPA)偶联物均诱导相当水平的来自人T细胞的炎性细胞因子。
图12B示出了在PSMA-阴性DU145细胞的存在下，p-TriA huL5H2和UCHT-1(2xDUPA)偶联物均诱导最低水平的来自人T细胞的炎性细胞因子。
图13A示出了在小鼠中用huL5H2-p-TriA(2xDUPA)治疗C4-2异种移植物的实验设置。
图13B示出了在用人T细胞重建的NSG小鼠模型中，huL5H2-p-TriA(2xDUPA)表现出针对C4-2异种移植物的剂量依赖性体内抗肿瘤活性。
图14A示出了用HuL5H2-DUPA(2xDUPA)和活化的T细胞在PCSD1PDX(患者来源的异种移植物)模型中治疗肿瘤的实验设置。
图14B示出了对于PDX小鼠模型，huL5H2-p-TriA(2xDUPA)联合PBMC表现出肿瘤体积的减小。
图15示出了通过Epivax软件在计算机中预测的SEQ ID NO:41的可变重链中四个去免疫突变的引入，其导致免疫原性评分显著降低。当得到的抗体重链被配置为经由pAcF偶联时，其具有SEQ ID NO:43和SEQ ID NO:44。
图16示出了通过大小过滤(Amicon，10K和30K)去除过量连接体后，通过QTOF质谱法证实，去免疫的(DI)DI-HuL5H2(SEQ ID NO:40、44)与p-TriA的偶联反应的完成，生成huL5H2_DI-2xDUPA。
图17A示出了采用huL5H2(SEQ ID NO:40、42)和DI-huL5H2(SEQ ID NO:40、44)观察到对人T细胞的类似结合概况，提示即使在引入去免疫突变之后仍保持对人CD3的交叉反应性。
图17B示出了采用huL5H2(SEQ ID NO:40、42)和DI-huL5H2(SEQ ID NO:40、44)观察到对食蟹猴T细胞的类似结合概况，提示即使在引入去免疫突变之后仍保持对食蟹猴CD3的交叉反应性。
图18示出了huL5H2_DI-1xDUPA(SEQ ID NO:39、44)和huL5H2_DI-2xDUPA(SEQ IDNO:40、44)偶联物以相当的效力(EC50分别为3.2pM、3.1pM)选择性地针对C4-2(PSMA阳性)细胞重定向人PBMC，并且诱导DU145(PSMA阴性)细胞的最小非特异性杀伤。
图19A和图19B分别示出了本文所述的示例性DUPA偶联物的代表性重链和轻链。重链的N端(SEQ ID NO:80)和C端(SEQ ID NO:81)通过经由连接体与DUPA偶联的非经典氨基酸(pAcF)连接。轻链的N端(SEQ ID NO:82)和C端(SEQ ID NO:83)通过经由连接体与DUPA偶联的非天然氨基酸连接。靶向剂抗体偶联物可仅包含偶联的轻链，可仅包含偶联的重链，或者可包含偶联的轻链和偶联的重链。
图19C和图19D分别示出了本文所述的示例性叶酸偶联物的代表性重链和轻链。重链的N端(SEQ ID NO:80)和C端(SEQ ID NO:81)通过经由连接体与叶酸偶联的非天然氨基酸连接。轻链的N端(SEQ ID NO:82)和C端(SEQ ID NO:83)通过经由连接体与叶酸偶联的非天然氨基酸连接。靶向剂抗体偶联物可仅包含偶联的轻链，可仅包含偶联的重链，或者可包含偶联的轻链和偶联的重链。
图20A示出了2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(DUPA)的化学结构。
图20B示出了2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(DUPA)的化学结构的示例性类似物，如((1-羧基-2-巯基乙基)氨基甲酰基)谷氨酸(CMCG)、((2-(叔丁基硫基)-1-羧基乙基)氨基甲酰基)谷氨酸(tBuCMCG)和((1-羧基-3-(1H-四唑-5-基)丙基)氨基甲酰基)谷氨酸(CTCG)。
图20C示出了N-(4-{[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢蝶啶-6-基)甲基]氨基}苯甲酰基)-L-谷氨酸(叶酸/叶酸盐)的化学结构。
图20D示出了N-(4-{[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢蝶啶-6-基)甲基]氨基}苯甲酰基)-L-谷氨酸(叶酸/叶酸盐)的化学结构的示例性类似物，如(4-((1-(2,4-二氨基蝶啶-6-基)乙基)(甲基)氨基)苯甲酰基)谷氨酸(二甲叶酸)和(4-(((2,4-二氨基蝶啶-6-基)甲基)(甲基)氨基)苯甲酰基)谷氨酸(甲氨蝶呤)。
图21A示出了huL5H2_DI-1xDUPA(SEQ ID NO:39、44)和huL5H2_DI-2xDUPA(SEQ IDNO:40、44)偶联物以类似的速率内化到PSMA+细胞中。
图21B和图21C分别示出了L5H2_DI-1xDUPA和L5H2_DI-2xDUPA的内化速率常数(线性拟合斜率)的计算。
图22示出了在PBMC的存在下，huL5H2_DI 1xDUPA和huL5H2_DI 2xDUPA针对PSMA+C4-2细胞(PBMC:C4-2细胞的比率为10:1)均具有细胞毒性。
图23示出了huL5H2_DI 1xDUPA和huL5H2_DI 2xDUPA在C4-2癌细胞中表现出细胞因子释放水平。样品从图22的细胞毒性研究中使用的培养基获得。
图24示出了huL5H2_DI 1xDUPA和huL5H2_DI 2xDUPA在人PBMC中表现出活化标志物CD25/CD69的显著的PSMA+依赖性上调。
图25示出了当使用人PBMC时，huL5H2_DI 1xDUPA和huL5H2_DI 2xDUPA表现出显著的T细胞增殖活性。
图26示出了huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA在VCaP、C4-2和LNCaP细胞系中表现出剂量依赖性细胞毒性。
图27示出了使用22Rv-1细胞系，huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA表现出剂量依赖性细胞毒性。
图28示出了在Jurkat NFAT测定中，在人PBMC和C4-2细胞的存在下，未结合的人PSMA没有显著抑制huL5H2_DI-1xDUPA(批次ID P00925)和huL5H2_DI-2xDUPA(批次IDP00774)对T细胞的活化。
图29示出了使用PBMC供体5053细胞，huL5H2_DI-1xDUPA(批次ID P00925)和huL5H2_DI-2xDUPA(批次ID P00774)显示出没有被未结合的人PSMA显著抑制针对C4-2细胞的细胞毒性。
图30示出了在C4-2细胞的存在下，在基于荧光的Jurkat(NFAT-Luc)测定中，DUPA偶联物的不同批次(ID＝P0####)针对T细胞活化的比较。
图31A示出了在基于荧光的Jurkat(NFAT-Luc)测定中，阳性对照PMA和罗奴霉素活化的T细胞。
图31B示出了内部阳性对照重组萤光素酶在DUPA偶联物各批次中产生一致的信号。
图32示出了huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA在不同血清中温育48小时后，根据LCMS-QTOF质谱法，在结构或质量上没有明显变化。
图33A示出了huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA在小鼠或人血清中温育48小时后，在针对C4-2PSMA+细胞的细胞毒性上没有明显变化。
图33B示出了huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA在大鼠或猴血清中温育48小时后，在针对C4-2PSMA+细胞的细胞毒性上没有明显变化。
图34A示出了huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA在小鼠或人血清中温育48小时后，在PSMA+细胞中没有明显的T细胞活化损失(通过细胞因子释放所证明的)。
图34B示出了huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA在大鼠或猴血清中温育48小时后，在PSMA+细胞中没有明显的T细胞活化损失(通过细胞因子释放所证明的)。
图35A示出了在用人T细胞重建的NSG小鼠模型中，采用每日注射huL5H2_DI-2xDUPA或huL5H2_DI-1xDUPA来治疗C4-2异种移植物的实验设置。
图35B示出了在用人T细胞重建的NSG小鼠模型中，每日注射huL5H2_DI-2xDUPA或huL5H2_DI-1xDUPA的方案表现出类似的剂量依赖性体内抗肿瘤活性。
图35C示出了在用人T细胞重建的NSG小鼠模型中，每日注射huL5H2_DI-2xDUPA和huL5H2_DI-1xDUPA的方案在治疗期间表现出显著的体重减轻。
图36A示出了采用QOD(隔日一次)注射时间表，用huL5H2_DI-2xDUPA或huL5H2_DI-1xDUPA治疗C4-2异种移植物的实验设置。
图36B示出了在用人T细胞重建的NSG小鼠模型中，huL5H2_DI-2xDUPA或huL5H2_DI-1xDUPA的QOD注射时间表表现出类似的剂量依赖性体内抗肿瘤活性。
图36C示出了在用人T细胞重建的NSG小鼠模型中，huL5H2_DI-2xDUPA或huL5H2_DI-1xDUPA的QOD注射时间表在治疗期间表现出显著的体重减轻。
图37A示出了在用人T细胞重建的NSG小鼠模型中，对于QD(每日)和QOD(隔日一次)注射时间表，huL5H2_DI-2xDUPA和huL5H2_DI-1xDUPA在治疗期间均表现出显著的细胞因子释放。
图37B示出了在用人T细胞重建的NSG小鼠模型中，对于QD(每日)和QOD(隔日一次)注射时间表，huL5H2_DI-2xDUPA或huL5H2_DI-1xDUPA治疗在治疗期间均表现出显著的小鼠细胞因子释放。
图38A示出了与采用QD(每日)注射时间表的huL5H2_DI-1xDUPA相比，huL5H2_DI-2xDUPA治疗导致更大的体重减轻。
图38B示出了与采用QOD(隔日一次)注射时间表的huL5H2_DI-1xDUPA相比，huL5H2_DI-2xDUPA治疗导致更大的体重减轻。
图38C示出了与不存在肿瘤细胞时的huL5H2_DI-1xDUPA相比，huL5H2_DI-2xDUPA治疗导致更大的体重减轻。
图39A示出了通过每日注射huL5H2_DI-2xDUPA或huL5H2_DI-1xDUPA(不添加人T细胞)治疗C4-2异种移植物的实验设置。
图39B和图39C示出了在不存在T细胞的情况下，huL5H2_DI-2xDUPA和huL5H2_DI-1xDUPA没有表现出显著的体重损失，这提示毒性是由T细胞活化造成的。
图40A、图40B、图40C、图40D和图40E示出了在不存在T细胞的情况下，huL5H2_DI-2xDUPA和huL5H2_DI-1xDUPA没有表现出显著的血液毒性。
图41示出了用于治疗C4-2异种移植物的实验设置，包括T细胞计数和细胞因子水平的处理后分析。
图42示出了在用人PBL重建的NSG小鼠模型中，huL5H2_DI-1xDUPA表现出剂量依赖性的体内抗肿瘤活性，相对于在C4-2异种移植小鼠模型中使用PBMC的实验，其抗肿瘤活性轻微延迟。
图43示出了体重损失是由肿瘤负荷造成的。在没有肿瘤的情况下，PBL和huL5H2_DI-1xDUPA没有表现出显著的体重损失。
图44A、图44B和图44C示出了在用人PBL重建的NSG小鼠模型中，huL5H2_DI-2xDUPA和huL5H2_DI-1xDUPA没有表现出显著的血液毒性。
图45A和图45B示出了采用huL5H2_DI-2xDUPA或huL5H2_DI-1xDUPA的治疗表现出外周人T细胞的减少，这表明向肿瘤的募集。
图45C、图45D和图45E示出了如从血浆样品测量的，采用huL5H2_DI-2xDUPA或huL5H2_DI-1xDUPA的治疗保持了肾功能和肝功能。
图46示出了与小鼠模型中采用huL5H2_DI-1xDUPA相比，huL5H2_DI-2xDUPA表现出延长的暴露。
发明详述
本文公开了人源化抗CD3抗体及其各自的靶向剂抗体偶联物。这些抗体经引入另外的突变而被人源化，以降低在人体中潜在的免疫原性，并优化其与T细胞的结合。本文提供的实施例证明了鼠跨物种反应性抗CD3抗体的人源化、结合优化和免疫原性降低。本文提供的实施例还证明了所得人源化抗体与2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(DUPA)的偶联，DUPA结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)。图1A和图1B中示出了DUPA偶联物的示例性示意图。如此处的异种移植模型所证明的，人源化抗CD3抗体DUPA偶联物可结合T细胞和PSMA阳性细胞两者，从而将T细胞及其细胞毒活性引导至PSMA阳性细胞。这表明这些偶联物可用于治疗人前列腺癌。此外，这些人源化抗CD3抗体可以与用于治疗其他癌症或病况的其他靶向剂(例如，叶酸)偶联。
在一个方面，提供具有来自鼠抗CD3抗体(例如，SEQ ID NO:51-56)的CDR的人源化抗CD3抗体序列。例如，含有轻链变体5和重链变体2的人源化抗体克隆，在本文中称为“huL5H2”(SEQ ID NO：39、41)，表现出与人和食蟹猴T细胞两者的结合活性，该活性相当于鼠抗体与人和食蟹猴T细胞的结合活性。此外，在HuL5H2的重链构架区内引入四个点突变，在本文中称为“huL5H2_DI”或“DI-huL5H2”(SEQ ID NO:39、43)，显著降低了其计算机免疫原性评分(K19R，S41P、K89R，T90A)。这些突变不影响抗体的表达水平、对人和食蟹猴T细胞的结合亲和力或体外活性。与双偶联物(huL5H2_DI-2xDUPA，SEQ ID NO:40、44)相比，与单个DUPA分子偶联的huL5H2_DI(“huL5H2_DI-1xDUPA”，SEQ ID NO:39、44)表现出类似的生物物理和药理学性质。
I.抗体
在一个方面，本文提供抗体和偶联物和/或其融合物。在一个非限制性实例中，抗体是抗CD3抗体，并且还提供了抗CD3抗体的偶联物和融合物。示例性的抗体偶联物包含抗CD3抗体和细胞靶向分子。示例性抗体融合物包含抗CD3抗体和第二氨基酸分子，如另一个抗体或其一部分。在一些实施方案中，抗体融合物包含经由肽连接体与第二氨基酸分子连接的抗CD3抗体的至少一条链。
抗体包括抗体的功能结构域或其他片段，包括：抗原结合(Fab)区、Fab′、F(ab′)2、F(ab′)3、Fab′、片段可结晶(Fc)区、单链可变片段(scFv)、di-scFv、单域免疫球蛋白、三功能免疫球蛋白、化学连接的F(ab′)2及其组合。在一些情况下，提及抗体包括其抗体片段。在一些情况下，抗体片段被称为抗体，例如，Fab或scFv可被称为抗体或抗体片段。抗体片段还包括互补决定区(CDR)、构架区、重链恒定域(例如，CH1、CH2、CH3)、轻链恒定域(CL)或其任何组合。本文提供的抗体的重链恒定域序列的非限制性实例包括SEQ ID NO:86和98-109。本文提供的抗体的轻链恒定域的非限制性实例包括SEQ ID NO:111-123。抗体片段包括抗体的抗原结合片段。
在一些情况下，抗体是哺乳动物抗体或者从哺乳动物抗体衍生或修饰。该抗体可以是嵌合抗体。该抗体可以是工程化抗体。该抗体可以是重组抗体。该抗体可选自人源化的、人工程化的或完全人的抗体。
如本文所用，抗体和免疫球蛋白是可互换的。免疫球蛋白可选自IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY和IgW。
本文提供了人源化抗体。人源化抗体可包括人抗体，其中人抗体的至少一个CDR被来自非人物种中产生的抗体的CDR替换或修饰。人源化抗体可包括人抗体，其中人抗体的至少一个CDR至少部分地被来自非人物种中产生的抗体的CDR替换或修饰。人源化抗体可包括人抗体，其中人抗体的1个CDR至6个CDR至少部分地被来自非人物种中产生的抗体的1个CDR至6个CDR替换或修饰。人源化抗体可包括人抗体，其中人抗体的至少一个CDR至少部分地被来自结合非人物种中的抗原的抗体的CDR替换或修饰。结合非人物种中的抗原的抗体或在非人物种中产生的抗体在本文中可称为“供体抗体”。人抗体和/或供体抗体的CDR可以是轻链CDR(CDRL)。人抗体和/或供体抗体的CDR可以是重链CDR(CDRH)。人抗体和/或供体抗体的CDR可选自CDRL1(例如，SEQ ID NO:51)、CDRL2(例如，SEQ ID NO:52)、CDRL3(例如，SEQ IDNO:53)、CDRH1(例如，SEQ ID NO:54)、CDRH2(例如，SEQ ID NO:55)和CDRH3(例如，SEQ IDNO:56)。人抗体的CDR可以是人λ轻链可变域的CDR。供体抗体可以是跨物种反应性的。供体抗体可以对于两个或更多个物种是跨物种反应性的，举非限制性实例来说，该物种选自：人、小鼠、猴(例如，食蟹猴)、兔、绵羊、大鼠、豚鼠、山羊、驴、鸡和仓鼠。非人物种可以对于小鼠、人和食蟹猴是跨物种反应性的。
本文公开的抗体及其片段可包含λ轻链或其部分。本文公开的抗体和抗体片段可包含κ轻链或其部分。在一些情况下，其部分包括约5个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约10个氨基酸或者5个氨基酸至约15个氨基酸。在一些情况下，其部分包括至少5个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约40个氨基酸和至少约50个氨基酸。本文公开的抗体和抗体片段可包含选自γ重链、δ重链、α重链、μ重链、ε重链及其一部分的重链。本文公开的抗体和抗体片段可包含λ轻链的一部分和κ轻链的一部分的组合。本文公开的抗体和抗体片段可包含人κ轻链可变域和人λ轻链恒定域。本文公开的抗体和抗体片段可包含人λ轻链可变域和人κ轻链恒定域。本文公开的抗体和抗体片段可包含轻链λ可变域的至少一部分和/或轻链κ恒定域的至少一部分。在一些情况下，抗体片段的至少一部分包括至少5个氨基酸、至少约10个氨基酸、至少约15个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、至少约30个氨基酸、至少约35个氨基酸、至少约40个氨基酸和至少约50个氨基酸。
本文提供的抗体或抗体片段可包含两个或更多个氨基酸序列。第一氨基酸序列可组成第一抗体链，并且第二氨基酸序列可组成第二抗体链。第一抗体链可包含第一氨基酸序列，并且第二抗体链可包含第二氨基酸序列。抗体链可以指抗体重链、抗体轻链或者抗体重链的区域或全部与抗体轻链的区域或全部的组合。作为非限制性实例，本文提供的抗体包含重链或其片段，以及轻链或其片段。抗体的两个氨基酸序列，包括两个抗体链，可以通过一个或多个二硫键、化学连接体、肽连接体或其组合连接。化学连接体包括经由非天然氨基酸的连接体。化学连接体包括化学偶联物。肽连接体包括任何连接两个氨基酸序列的氨基酸序列。在一些情况下，肽连接体包含至少约1、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸。在一些情况下，肽连接体可以是任何抗体的一部分，包括抗体的结构域，如可变域、CH1、CH2、CH3和/或CL域。在一些情况下，重链和轻链例如经由肽连接体连接，以得到单链可变片段(scFv)。在一些情况下，重链和轻链例如通过一个或多个二硫键连接。
所述抗体和抗体片段可以对效应细胞上的抗原是反应性的。例如，效应细胞是免疫细胞。然而，传统上不被归类为免疫细胞的细胞(例如成纤维细胞、多能干细胞、脂肪细胞)任选地被(遗传地)修饰，以具有免疫细胞活性(例如，细胞毒活性)。免疫细胞可以能够对另一种细胞发挥细胞毒活性。免疫细胞可以是白细胞。免疫细胞可以是淋巴细胞。免疫细胞可选自巨噬细胞、红细胞、血小板、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或T细胞。免疫细胞可以是T细胞。T细胞可以是细胞毒性T细胞。T细胞可以是自然杀伤T细胞。效应细胞可以是经遗传修饰的细胞。效应细胞可经遗传修饰以具有细胞毒活性。效应细胞可经遗传修饰以具有增强的细胞毒活性。效应细胞可经修饰以具有降低的细胞毒活性。
所述抗体或抗体片段可以与T细胞上的受体相互作用。该受体可以是T细胞受体(TCR)。该TCR可包含TCRα、TCRβ、TCRγ和/或TCRδ。该受体可以是T细胞受体ζ。
所述抗体或抗体片段可以与淋巴细胞、树突细胞、B细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和/或NK细胞上的受体结合。该受体可以是Fc受体。该Fc受体可以是Fc-γ受体、Fc-α受体和/或Fc-ε受体。Fc-γ受体包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)。Fc-α受体包括但不限于FcαRI。Fc-ε受体包括但不限于FcεRI和FcεRII。该受体可以是CD89(IgA受体的Fc片段或FCAR)。靶向剂可选自抗病毒药物、抗生素和抗寄生虫药物。例如，当靶向剂抗体偶联物包含Fc受体结合抗体时，靶向剂抗体偶联物可特异性地结合致病细菌或真菌。
所述抗体或抗体片段可以与T细胞上的分化簇蛋白(CD)相互作用。举非限制性实例来说，该CD可以选自CD3、CD8、CD25、CD45和CD154。
所述抗体或抗体片段可以与T细胞上的共同受体相互作用。该共同受体可选自CD3、CD4和CD8。CD8可包含CD8-α和/或CD8-β链。所述抗体或抗体片段可以与CD3共同受体相互作用。CD3共同受体可选自CD3-γ、CD3-δ和CD3-ε。
所述抗体或抗体片段可结合分化簇3蛋白(CD3)。因此，所述抗体或抗体片段可以是抗CD3抗体或抗CD3抗体片段。该抗CD3抗体或抗CD3抗体片段可以是人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段。该人源化抗CD3抗体片段可以是人源化抗CD3Fab。在哺乳动物中，CD3是四个不同链的蛋白质复合体：一个CD3γ链，一个CD3δ链和两个CD3ε链。除非另有说明，否则CD3包括这些不同链中的任何一个或其组合。因此，所述抗CD3抗体或抗CD3抗体片段可结合选自CD3γ、CD3δ和CD3ε的CD3。该CD3可以是非人CD3。该CD3可选自鼠CD3、猿CD3和人CD3。所述抗CD3抗体或抗CD3抗体片段可以是跨物种反应性的。例如，所述抗CD3抗体或抗CD3抗体片段可结合人CD3以及在另一物种中表达的CD3。
所述抗体或抗体片段可包含轻链，其中该轻链由选自SEQ ID NO:16-18的核苷酸序列编码。所述抗体或抗体片段可包含轻链，其中该轻链由具有至少20个连续核苷酸、至少50个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸、至少200个连续核苷酸、至少300个连续核苷酸、至少400个连续核苷酸、至少500个连续核苷酸或至少600个连续核苷酸的核苷酸序列编码，其中所述连续核苷酸具有在选自SEQ ID NO:16-18的序列中发现的序列。
所述抗体或抗体片段可包含轻链，其中该轻链具有选自SEQ ID NO:38-40的氨基酸序列。所述抗体或抗体片段可包含轻链，其中该轻链由选自SEQ ID NO:38-40的氨基酸序列编码，其中SEQ ID NO:38-40的约1至约5个、约1至约10个或约1至约20个氨基酸已被替代氨基酸置换。
所述抗体或抗体片段可包含轻链可变域，其中该轻链可变域由选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列表示。所述抗体或抗体片段可包含轻链可变域，其中该轻链可变域由SEQ ID NO:32的氨基酸表示。所述抗体或抗体片段可包含轻链可变域，其中该轻链可变域由选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列表示，并且其中SEQ ID NO:28-37的约1至约5个、约1至约10个或约1至约20个氨基酸已被替代氨基酸置换。所述抗体或抗体片段可包含轻链可变域，其中该轻链可变域由SEQ ID NO:32的氨基酸表示，并且其中SEQ ID NO:32的约1至约5个、约1至约10个或约1至约20个氨基酸已被替代氨基酸置换。
所述抗体或抗体片段可包含重链，其中该重链由选自SEQ ID NO:19-22的核苷酸序列编码。所述抗体或抗体片段可包含重链，其中该重链由具有至少20个连续核苷酸、至少50个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸、至少200个连续核苷酸、至少300个连续核苷酸、至少400个连续核苷酸、至少500个连续核苷酸或者至少600个连续核苷酸的核苷酸序列编码，其中所述连续核苷酸具有在选自SEQ ID NO:19-22的序列中发现的序列。
所述抗体或抗体片段可包含重链，其中该重链具有选自SEQ ID NO:41-44的氨基酸序列。所述抗体或抗体片段可包含重链，其中该重链由选自SEQ ID NO:41-44的氨基酸序列编码，其中SEQ ID NO:41-44的约1至约5个、约1至约10个或约1至约20个氨基酸已被替代氨基酸置换。所述抗体或抗体片段可包含重链，其中该重链由SEQ ID NO:41的氨基酸序列表示。该重链可以由SEQ ID NO:41表示，其中至少一个氨基酸被替代氨基酸代替。所述至少一个氨基酸可选自位置19处的赖氨酸(K19)、位置41处的丝氨酸(S41)、位置89处的赖氨酸(K89)和位置90处的苏氨酸(T90)。K19可用精氨酸替换(K19R)。S41可用脯氨酸替换(S41P)。K89可用精氨酸替换(K89R)。T90可用丙氨酸替换(T90A)。该重链可以由SEQ ID NO:41表示，其中可以进行这些替换的任何组合。该重链可以由选自SEQ ID NO:45-48的氨基酸序列表示。该重链可包含选自SEQ ID NO:49-50的氨基酸序列。
所述抗体或抗体片段可包含重链可变域，其中该重链可变域由选自SEQ ID NO:25-27的氨基酸序列表示。所述抗体或抗体片段可包含重链可变域，其中该重链可变域由SEQ ID NO:27的氨基酸表示。所述抗体或抗体片段可包含重链可变域，其中该重链可变域由选自SEQ ID NO:25-27的氨基酸序列表示，并且其中SEQ ID NO:25-27的约1至约5个、约1至约10个或约1至约20个氨基酸已被替代氨基酸置换。所述抗体或抗体片段可包含重链可变域，其中该重链可变域由SEQ ID NO:27的氨基酸表示，并且其中SEQ ID NO:27的约1至约5个、约1至约10个或约1至约20个氨基酸已被替代氨基酸置换。
所述抗体或抗体片段可包含轻链，其中该轻链包含可变域。该可变域可包含CDR1、CDR2和CDR3及其任何组合。该可变域可包含两个CDR之间的区域。两个CDR之间的区域可以是CDR1和CDR2之间的区域，在此被称为“LC Inter-CDR1/2区”。LC Inter-CDR1/2区可以由选自SEQ ID NO:57-61的序列表示。LC Inter-CDR1/2区可以由SEQ ID NO:59的序列表示。LC Inter-CDR1/2区可包含由SEQ ID NO:64表示的肽。LC Inter-CDR1/2区可包含由选自SEQ ID NO:62-68的序列表示的肽。两个CDR之间的区域可以是CDR2和CDR3之间的区域，在此被称为“LC Inter-CDR2/3区”。LC Inter-CDR2/3区可以由选自SEQ ID NO:72-77的序列表示。
LC Inter-CDR1/2区可包含由氨基酸序列QKPDHLFR(SEQ ID NO:64)表示的肽。LCInter-CDR1/2区可包含由氨基酸序列QX1X2DHLFR(SEQ ID NO:65)表示的肽，其中X1是赖氨酸。LC Inter-CDR1/2区可包含由氨基酸序列QX1X2DHLFR(SEQ ID NO:65)表示的肽，其中X1选自极性氨基酸和碱性氨基酸。LC Inter-CDR1/2区可包含由氨基酸序列QX1X2DHLFR(SEQID NO:65)表示的肽，其中X1选自组氨酸和精氨酸。LC Inter-CDR1/2区可包含由氨基酸序列QX1X2DHLFR(SEQ ID NO:65)表示的肽，其中X2是脯氨酸。LC Inter-CDR1/2区可包含由氨基酸序列QX1X2DHLFR(SEQ ID NO:65)表示的肽，其中X2是极性氨基酸。LC Inter-CDR1/2区可包含由氨基酸序列QX1X2DHLFR(SEQ ID NO:65)表示的肽，其中X2选自丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。
LC Inter-CDR1/2区可由SEQ ID NO:66(X1VX2X3X4X5DHLFRGX6X7G)表示。X1可以是色氨酸。X2可以是谷氨酰胺。X3可选自谷氨酰胺和谷氨酸。X4可以是赖氨酸。X5可以是脯氨酸。X6可以是亮氨酸。X7可以是异亮氨酸。LC Inter-CDR1/2区可由SEQ ID NO:67(X1VX2QX3X4DHLFX5GX6X7G)表示。X1可以是色氨酸。X2可以是谷氨酰胺。X3可以是赖氨酸。X4可以是脯氨酸。X5可选自精氨酸和苏氨酸。X6可以是亮氨酸。X7可以是异亮氨酸。LC Inter-CDR1/2区可由SEQ ID NO:68(X1VX2X3X4X5DHLFX6GX7X8G)表示。X1可以是色氨酸。X2可以是谷氨酰胺。X3可选自谷氨酰胺和谷氨酸。X4可以是赖氨酸。X5可以是脯氨酸。X5可选自精氨酸和苏氨酸。X7可以是亮氨酸。X8可以是异亮氨酸。在一些情况下，选自SEQ ID NO:66-68的序列的位置2处的缬氨酸被苯丙氨酸置换。
所述抗体或抗体片段可包含两种或更多种由本文公开的序列表示的肽或多肽的组合。本领域技术人员容易理解，一些氨基酸可被替代氨基酸置换，同时保持抗体或抗体片段的性质。一些氨基酸可以是约1至约5个氨基酸、约1至约10个氨基酸或约1至约20个氨基酸。举非限制性的实例来说，接下来的几段描述了本文公开的抗体或抗体片段，其可包含两种或更多种由本文公开的序列表示的肽或多肽的组合。
所述抗体或抗体片段可包含由选自SEQ ID NO:57-61的序列表示的LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:41-44的氨基酸序列表示的重链。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:41-44的氨基酸序列表示的重链，其中该LCInter-CDR1/2区包含由选自SEQ ID NO:62-68的序列表示的肽。所述抗体或抗体片段可包含由SEQ ID NO:59表示的LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:41-44的氨基酸序列表示的重链。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:41-44的氨基酸序列表示的重链，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由SEQ ID NO:64表示的肽。
所述抗体或抗体片段可包含由选自SEQ ID NO:57-61的序列表示的LC Inter-CDR1/2区；和由选自SEQ ID NO:25-27的氨基酸序列表示的重链可变域。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:25-27的氨基酸序列表示的重链可变域，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由选自SEQ ID NO:62-68的序列表示的肽。所述抗体或抗体片段可包含由SEQ ID NO:59表示的LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:25-27的氨基酸序列表示的重链可变域。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:25-27的氨基酸序列表示的重链可变域，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由SEQID NO:64表示的肽。该重链可变域可以由SEQ ID NO:27的氨基酸序列表示。
所述抗体或抗体片段可包含由选自SEQ ID NO:57-61的序列表示的LC Inter-CDR1/2区；和由选自SEQ ID NO:51-56的氨基酸序列表示的CDR。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:51-56的氨基酸序列表示的CDR，其中该LCInter-CDR1/2区包含由选自SEQ ID NO:62-68的序列表示的肽。所述抗体或抗体片段可包含由SEQ ID NO:59表示的LC Inter-CDR1/2区；和由选自SEQ ID NO:51-56的氨基酸序列表示的CDR。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:51-56的氨基酸序列表示的CDR；其中该LC Inter-CDR1/2区包含由SEQ ID NO:64表示的肽。
所述抗体或抗体片段可包含重链，其中该重链包含可变域。该可变域可包含CDR1、CDR2、CDR3及其任何组合。该可变域可包括两个CDR之间的区域。两个CDR之间的区域可以是CDR1和CDR2之间的区，在本文中称为“HC Inter-CDR1/2区”。HC Inter-CDR1/2区可由选自SEQ ID NO:70-71的序列表示。两个CDR之间的区可以是CDR2和CDR3之间的区，在本文中称为“HC Inter-CDR2/3区”。HC Inter-CDR2/3区可由选自SEQ ID NO:78-79的序列表示。可变域可包含CDR旁边的区域。CDR旁边的区域可以是CDR1的N端的区域，在本文中称为“HC Pre-CDR1”。HC Pre-CDR1区可由SEQ ID NO:69表示。
所述抗体或抗体片段可包含由选自SEQ ID NO:57-61的序列表示的LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:72-77的序列表示的LC Inter-CDR2/3区。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:72-77的序列表示的LC Inter-CDR2/3区，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由选自SEQ ID NO:62-68的序列表示的肽。所述抗体或抗体片段可包含由SEQ ID NO:59表示的LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:72-77的序列表示的LC Inter-CDR2/3区。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和由选自SEQ ID NO:72-77的序列表示的LC Inter-CDR2/3区，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由SEQ ID NO:64表示的肽。
所述抗体或抗体片段可包含由选自SEQ ID NO:57-61的序列表示的LC Inter-CDR1/2区，和可由选自SEQ ID NO:70-71的序列表示的HC Inter-CDR1/2区。所述抗体或抗体片段可包含由选自SEQ ID NO:57-61的序列表示的LC Inter-CDR1/2区，和可由选自SEQID NO:78-79的序列表示的HC Inter-CDR2/3区。所述抗体或抗体片段可包含由选自SEQ IDNO:57-61的序列表示的LC Inter-CDR1/2区，和可由SEQ ID NO:69表示的HC Pre-CDR1区。
所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和可由选自SEQ ID NO:78-79的序列表示的HC Inter-CDR2/3区，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由选自SEQ ID NO:62-68的序列表示的肽。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和可由选自SEQ ID NO:70-71的序列表示的HC Inter-CDR1/2区，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由选自SEQ IDNO:62-68的序列表示的肽。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和可由SEQ IDNO:69表示的HC Pre-CDR1区，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由选自SEQ ID NO:62-68的序列表示的肽。
所述抗体或抗体片段可包含由SEQ ID NO:59表示的LC Inter-CDR1/2区，和可由选自SEQ ID NO:70-71的序列表示的HC Inter-CDR1/2区。所述抗体或抗体片段可包含由SEQ ID NO:59表示的LC Inter-CDR1/2区，和可由选自SEQ ID NO:78-79的序列表示的HCInter-CDR2/3区。所述抗体或抗体片段可包含由SEQ ID NO:59表示的LC Inter-CDR1/2区和可由SEQ ID NO.69表示的HC Pre-CDR1区。
所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和可由选自SEQ ID NO:70-71的序列表示的HC Inter-CDR1/2区，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由SEQ ID NO:64表示的肽。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和可由选自SEQ ID NO:78-79的序列表示的HC Inter-CDR2/3区，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由SEQ ID NO:64表示的肽。所述抗体或抗体片段可包含LC Inter-CDR1/2区，和可由SEQ ID NO:69表示的HC Pre-CDR1区，其中该LC Inter-CDR1/2区包含由SEQ ID NO:64表示的肽。
人源化抗CD3抗体及其片段
所述抗体或抗体片段可以是人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可包含λ轻链或其部分。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可包含κ轻链或其部分。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可包含选自γ重链、δ重链、α重链、μ重链和ε重链的重链。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可包含λ轻链的一部分和κ轻链的一部分的组合。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可包含人κ轻链可变域和人λ轻链恒定域。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可包含人λ轻链可变域和人κ轻链恒定域。
人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可具有由选自SEQ ID NO:3-5的核苷酸序列编码的重链可变区(VH)。VH可由SEQ ID NO:3-5的至少约50个、约100个、约150个、约200个、约250个或约300个连续核苷酸编码。VH可以由类似于SEQ ID NO:3-5的核苷酸序列编码。类似于SEQ ID NO:3-5的核苷酸序列可以是具有约1至约5个、约1至约10个、约1至约20个或约1至约30个核苷酸置换的SEQ ID NO:3-5。该置换可以是SEQ ID NO:3-5中核苷酸的替代核苷酸。
人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可具有由选自SEQ ID NO:25-27的氨基酸序列编码的重链可变区(VH)。该抗体或抗体片段可包含VH，其中该VH由选自SEQ ID NO:25-27的氨基酸序列编码，其中SEQ ID NO:25-27具有1至约10个被替代氨基酸置换的氨基酸。
人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可具有由选自SEQ ID NO:6-15的核苷酸序列编码的轻链可变区(VL)。该VL可由SEQ ID NO:6-15的至少约50个、约100个、约150个、约200个、约250个或约300个连续核苷酸编码。该VL可由类似于SEQ ID NO:6-15的核苷酸序列编码。类似于SEQ ID NO:6-15的核苷酸序列可以是具有约1至约5个、约1至约10个、约1至约20个或约1至约30个核苷酸置换的SEQ ID NO:6-15。该置换可以是SEQ ID NO:6-15中的核苷酸的替代核苷酸。
人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可具有由选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列编码的轻链可变区(VL)。该抗体或抗体片段可包含VL，其中该VL由选自SEQ ID NO:28-37的氨基酸序列编码，其中SEQ ID NO:28-37具有约1至约10个被替代氨基酸置换的氨基酸。
人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可具有由选自SEQ ID NO:16-18的核苷酸序列编码的轻链(LC)。该LC可由SEQ ID NO:16-18的至少约20个连续核苷酸、至少50个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸、至少200个连续核苷酸、至少300个连续核苷酸、至少400个连续核苷酸、至少500个连续核苷酸或至少600个连续核苷酸编码。该LC可由类似于SEQID NO:16-18的核苷酸序列编码。类似于SEQ ID NO:16-18的核苷酸序列可以是具有约1至约10个、约1至约20个、约1至约30个、约1至约40个、约1至约50个或约1至约60个置换的SEQID NO:16-18。该置换可以是SEQ ID NO:16-18中的核苷酸的替代核苷酸。
人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可具有由选自SEQ ID NO:38-40的氨基酸序列编码的轻链(LC)。该抗体或抗体片段可包含LC，其中该LC由选自SEQ ID NO:38-40的氨基酸序列编码，其中SEQ ID NO:38-40具有约1至约5个、约1至约10个或约1至约20个被替代氨基酸置换的氨基酸。
人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可具有由选自SEQ ID NO:19-22的核苷酸序列编码的重链(HC)。该HC可由SEQ ID NO:19-22的至少约20个连续核苷酸、至少50个连续核苷酸、至少100个连续核苷酸、至少200个连续核苷酸、至少300个连续核苷酸、至少400个连续核苷酸、至少500个连续核苷酸或至少600个连续核苷酸编码编码。该HC可由类似于SEQ ID NO:19-22的核苷酸序列编码。类似于SEQ ID NO:19-22的核苷酸序列可以是具有约1至约10个、约1至约20个、约1至约30个、约1至约40个、约1至约50个或约1至约60个置换的SEQ ID NO:19-22。该置换可以是SEQ ID NO:19-22中的核苷酸的替代核苷酸。
人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可具有由选自SEQ ID NO:41-44的氨基酸序列编码的重链(HC)。该抗体或抗体片段可包含HC，其中该HC由选自SEQ ID NO:41-44的氨基酸序列编码，其中SEQ ID NO:41-44具有约1至约5个、约1至约10个或约1至约20个被替代氨基酸置换的氨基酸。
人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可具有由选自SEQ ID NO:17和18的核苷酸序列编码的轻链和由选自SEQ ID NO:21和22的核苷酸序列编码的重链。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段具有由SEQ ID NO:17编码的轻链和由SEQ ID NO:21编码的重链。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段具有由SEQ ID NO:17编码的轻链和由SEQ IDNO:22编码的重链。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段具有由SEQ ID NO:18编码的轻链和由SEQ ID NO:21编码的重链。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段具有由SEQID NO:18编码的轻链和由SEQ ID NO:22编码的重链。
轻链可由类似于SEQ ID NO:17和18的核苷酸序列编码。类似于SEQ ID NO:17和18的核苷酸序列可以是具有约1至约10个、约1至约20个、约1至约30个、约1至约40个、约1至约50个或约1至约60个置换的SEQ ID NO:17和18。该置换可以是SEQ ID NO:17和18中的核苷酸的替代核苷酸。重链可由类似于SEQ ID NO:21和22的核苷酸序列编码。类似于SEQ IDNO:21和22的核苷酸序列可以是具有约1至约10个、约1至约20个、约1至约30个、约1至约40个、约1至约50个或约1至约60个置换的SEQ ID NO:21和22。该置换可以是SEQ ID NO:21和22中的核苷酸的替代核苷酸。
在一个方面，本文公开了一种抗体，其包含含有SEQ ID NO:55和96的氨基酸序列。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中该抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含含有SEQ ID NO:54和55以及SEQ IDNO:87和96中的一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:96的第一氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO:51以及SEQ ID NO:97、59和74中的一个或多个的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:96的第一氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO:59和74中的一个或多个的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54的第一氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO:51以及SEQ ID NO:97、59和74中的一个或多个的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
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在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54和55的第一氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO:97、59和74中的一个或多个的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54和92的第一氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO:97、59和74中的一个或多个的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:55的第一氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO:59和74中的一个或多个的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:92和96的第一氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO:97、59和74中的一个或多个的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54、55、56和96中的一个或多个的第一氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO:59和74中的一个或多个的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：包含SEQ ID NO:51、52和53中的一个或多个以及SEQ ID NO:59和74中的一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQID NO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54、55、56、87、92和96的第一氨基酸序列；和(b)包含SEQ ID NO:51、52、53、97、59和74的第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：包含SEQ ID NO:54-56、69-71、78、79和87-96中的一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:69。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:70。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:71。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:78。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:79。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:88。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:89。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:90。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:91。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:93。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:94。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQID NO:95。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQID NO:60。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:62。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:63。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:64。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:65。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:66。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:67。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQID NO:68。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:72。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:73。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:75。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:76。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:77。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ IDNO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：包含SEQ ID NO:51-53、57-68、72-77和97中的一个或多个的氨基酸序列。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:60。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:62。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:63。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:64。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:65。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:66。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:67。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:68。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:72。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:73。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:75。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:76。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:77。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:69。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:70。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:71。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:78。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:79。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:88。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:89。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:90。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:91。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:93。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:94。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:95。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54、55和56中的一个或多个的氨基酸序列；和(b)非天然氨基酸。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列；和(b)非天然氨基酸。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ IDNO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54、55、56和96中的一个或多个的氨基酸序列；和(b)非天然氨基酸。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:51、52和53中的一个或多个的氨基酸序列；和(b)非天然氨基酸。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:97、59和74中的一个或多个的氨基酸序列；和(b)非天然氨基酸。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:51、52、53、97、59和74中的一个或多个的氨基酸序列；和(b)非天然氨基酸。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ IDNO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)SEQ ID NO:54、55、56、96、51、52、53、97、59和74中的一个或多个；和(b)非天然氨基酸。在一些实施方案中，所述抗体包含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54-56、69-71、78、79和87-96中的一个或多个的氨基酸序列；和(b)非天然氨基酸。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:69。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:70。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:71。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:78。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:79。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:88。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:89。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:90。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:91。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:93。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:94。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:95。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:60。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:61。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:62。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:63。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:64。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:65。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:66。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:67。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:68。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:72。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:73。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:75。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:76。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:77。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种抗体，其包含：(a)包含SEQ ID NO:51-53、57-68、72-77和97中的一个或多个的氨基酸序列；和(b)非天然氨基酸。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:60。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:62。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:63。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:64。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:65。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:66。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:67。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:68。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:72。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:73。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:75。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:76。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:77。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:69。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:70。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:71。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:78。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:79。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:88。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:89。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:90。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:91。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:93。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:94。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:95。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，所述抗体包含经由所述非天然氨基酸与所述抗体连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述抗体特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述抗体是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述抗体包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的抗体的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的抗体的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的抗体来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种组合物，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54、55和56中的一个或多个的氨基酸序列，以及非天然氨基酸；(b)经由所述非天然氨基酸与所述氨基酸序列连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述组合物还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述组合物特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述组合物是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述组合物包含人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的组合物的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的组合物的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种组合物，其包含：(a)包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列，以及非天然氨基酸；和(b)经由所述非天然氨基酸与所述氨基酸序列连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述组合物特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述组合物是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述组合物包含人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的组合物的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的组合物的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种组合物，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54、55、56和96中的一个或多个的氨基酸序列，以及非天然氨基酸；和(b)经由所述非天然氨基酸与所述氨基酸序列连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述组合物还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述组合物特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述组合物是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述组合物包含人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的组合物的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的组合物的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种组合物，其包含：(a)包含SEQ ID NO:51、52和53中的一个或多个的第一氨基酸序列；(b)包含非天然氨基酸的第二氨基酸序列；和(c)经由所述非天然氨基酸与第二氨基酸序列连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ IDNO:86。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述组合物特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述组合物是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述组合物包含人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的组合物的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的组合物的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种组合物，其包含：(a)包含SEQ ID NO:97、59和74中的一个或多个的第一氨基酸序列；(b)包含非天然氨基酸的第二氨基酸序列；和(c)经由所述非天然氨基酸与第二氨基酸序列连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ IDNO:86。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述组合物特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述组合物是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述组合物包含人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的组合物的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的组合物的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种组合物，其包含：(a)包含SEQ ID NO:51、52、53、97、59和74中的一个或多个的第一氨基酸序列；(b)包含非天然氨基酸的第二氨基酸序列；和(c)经由非天然氨基酸与第二氨基酸序列连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ IDNO:86。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述组合物特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述组合物是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述组合物包含人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的组合物的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的组合物的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种组合物，其包含：(a)包含SEQ ID NO:54-56、69-71、78、79和87-96中的一个或多个的氨基酸序列，以及非天然氨基酸；和(b)经由所述非天然氨基酸与所述氨基酸序列连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:69。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:70。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:71。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:78。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:79。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:88。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:89。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:90。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:91。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:93。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:94。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:95。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:52。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:60。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:62。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:63。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:64。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:65。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:66。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:67。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:68。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:72。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:73。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:74。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:75。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:76。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:77。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ IDNO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第一氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述组合物特异性地结合CD3。在一些实施方案中，所述组合物是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述组合物包含人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的组合物的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的组合物的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗癌症的方法。
在另一个方面，本文公开了一种组合物，其包含：(a)包含SEQ ID NO:51-53、57-68、72-77和97中的一个或多个的氨基酸序列，以及非天然氨基酸；和(b)经由所述非天然氨基酸与所述氨基酸序列连接的细胞靶向分子。在一些实施方案中，该氨基酸序列是第一氨基酸序列，其中所述抗体还包含第二氨基酸序列。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:51。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:52。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:53。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:57。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:60。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:62。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:63。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:64。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:65。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:66。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:67。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:68。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:72。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:73。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:74。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:75。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ IDNO:76。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:77。在一些实施方案中，第一氨基酸序列包含SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:54。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:55。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:56。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:69。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:70。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:71。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:78。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:79。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:88。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:89。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:90。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:91。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ IDNO:92。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:93。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:94。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:95。在一些实施方案中，第二氨基酸序列包含SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，第一氨基酸序列与SEQ ID NO:39具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，第二氨基酸序列与SEQ IDNO:44具有至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸位于第二氨基酸序列的CH1序列内。在一些实施方案中，该CH1序列包含SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是非肽化合物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)相互作用。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是DUPA。在一些实施方案中，所述组合物特异性地结合CD3或其衍生物。在一些实施方案中，该细胞靶向分子是叶酸或其衍生物。在一些实施方案中，所述组合物是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物对于人和猴抗原是跨物种反应性的。在一些实施方案中，所述组合物包含跨物种反应性的CDR。在一些实施方案中，所述组合物包含人源化抗体。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列是连接的。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列作为单一融合序列连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过化学键连接。在一些实施方案中，第一和第二氨基酸序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，本文公开了一种融合抗体，其包含前述实施方案中任一项所述的组合物的至少一部分和另一种抗体的至少一部分。在一些实施方案中，所述融合抗体是包含任一项前述权利要求所述的组合物的Fab结构域和另一种抗体的Fab结构域的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗疾病的方法。在一些实施方案中，本文公开了通过向患者施用前述实施方案中任一项所述的组合物来治疗癌症的方法。
所述抗CD3抗体可包含选自SEQ ID NO:24-27、42-50、54-56、69-71和78-81的重链区和选自SEQ ID NO:23、28-40、51-53、57、58-68、72-77和82-83的轻链区。作为非限制性的实例，抗体可包含重链SEQ ID NO:44和轻链SEQ ID NO:39。
所述抗CD3抗体可包含选自本文表35-39中所示序列的序列的任何组合。
偶联位点
所述抗体或抗体片段可包含一个或多个用于与另一个分子例如非免疫球蛋白肽、其他抗体或其他抗体片段、靶向剂、非肽结构或治疗性化合物偶联的位点。所述一个或多个位点可包含赖氨酸或半胱氨酸。在一个实施方案中，所述一个或多个位点可包含一个或多个非天然氨基酸。在一个实施方案中，所述抗体或抗体片段的一个或多个非天然氨基酸由对乙酰基苯丙氨酸(pAcF)组成。任选地，所述抗体或抗体片段的一个或多个非天然氨基酸由硒代半胱氨酸组成。任选地，所述一个或多个非天然氨基酸由以下组成：(a)各种取代的酪氨酸和苯丙氨酸类似物，如O-甲基-L-酪氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、3-硝基-L-酪氨酸、对硝基-L-苯丙氨酸、间甲氧基-L-苯丙氨酸和对异丙基-L-苯丙氨酸；(b)具有可光交联的芳基叠氮和二苯甲酮基团的氨基酸；(c)具有独特化学反应性的氨基酸，包括乙酰基-L-苯丙氨酸、间乙酰基-L-苯丙氨酸、O-烯丙基-L-酪氨酸、O-(2-丙炔基)-L-酪氨酸、对乙基硫代羰基-L-苯丙氨酸和对-(3-氧代丁酰基)-L-苯丙氨酸；(d)用于在X射线晶体学中定相的含重原子的氨基酸，包括对碘-L-苯丙氨酸和对溴-L-苯丙氨酸；(e)氧化还原活性的氨基酸二羟基-L-苯丙氨酸；(f)糖基化的氨基酸，包括b-N-乙酰葡糖胺-O-丝氨酸和a-N-乙酰半乳糖胺-O-苏氨酸；(g)具有萘基、丹酰基和7-氨基香豆素侧链的荧光氨基酸；(h)具有偶氮苯和硝基苄基Cys、Ser和Tyr侧链的可光裂解和可光异构化的氨基酸；(i)磷酸酪氨酸模拟物对羧甲基-L-苯丙氨酸；(j)谷氨酰胺同系物高谷氨酰胺；(k)2-氨基辛酸；(l)和(a)–(k)的任何组合。任选地，所述一个或多个非天然氨基酸由至少一个肟、羰基、二羰基、羟胺、环辛炔、芳基/烷基叠氮化物、降冰片烯、环丙烯、反式环辛烯、四嗪基团及其任何组合组成。所述一个或多个非天然氨基酸可以遗传编码。所述一个或多个非天然氨基酸可并入抗体或抗体片段中。所述一个或多个非天然氨基酸可位点特异性地并入所述抗体或抗体片段中。所述靶向剂抗体偶联物可包含两个或更多个非天然氨基酸。所述靶向剂抗体偶联物可包含三个或更多个非天然氨基酸。所述靶向剂抗体偶联物可包含四个或更多个非天然氨基酸。所述一个或多个非天然氨基酸可代替抗体或抗体片段中的一个或多个氨基酸残基。所述一个或多个非天然氨基酸可代替抗体或抗体片段的重链中的氨基酸残基。所述抗体或抗体片段的一个或多个非天然氨基酸代替该抗体或抗体片段的轻链中的氨基酸残基。所述抗体或抗体片段的一个或多个非天然氨基酸代替该抗体或抗体片段的可变区中的氨基酸残基。
II.靶向剂
在另一个方面，本文提供了抗体偶联物和抗体融合物，其包含本文公开的抗体或抗体片段，或由本文公开的抗体或抗体片段衍生的或以其他方式修饰的抗体或抗体片段。作为非限制性的实例，提供了包含与靶向剂偶联的本文公开的抗体或抗体片段的靶向剂抗体偶联物。应当理解，本文所述的靶向剂可以通过与抗体或抗体片段偶联或者与将靶向剂与抗体或抗体片段连接的连接体偶联而轻微修饰，并且本文公开的靶向剂包括这些轻微修饰的形式，但在结构上和功能上仍类似于本领域已知的治疗剂。该靶向剂可以选自小分子、细胞靶向分子、配体、蛋白质、肽、类肽、DNA适体、肽核酸(PNA)、维生素、底物或底物类似物。该肽可以包括环状肽或线性肽。靶向剂可包含配体。靶向剂可包含配体的至少一部分。该配体可以是化学配体。该配体可以是激素配体。该配体可以是肽配体。该配体可以是蛋白质配体。靶向剂可被衍生化(例如，用天然存在的蛋白质或肽)。靶向剂可以是化合物。靶向剂可以是(非肽)小分子。靶向剂可结合靶细胞。靶向剂可结合细胞上的细胞表面蛋白质或细胞表面标志物。靶向剂可结合蛋白质、肽或生物分子，其中该蛋白质、肽或生物分子不与细胞结合。该蛋白质、肽或生物分子可在血流中循环。该蛋白质、肽或生物分子可以是细胞外基质的组分。该蛋白质可以是酶。该酶可以具有酶活性。举非限制性实例而言，生物分子可选自纤维、生物聚合物(例如胶原)、聚糖、蛋白聚糖、脂质、固醇、碳水化合物、核酸和细胞碎片。
靶向剂抗体偶联物的靶向剂可以具有治疗效果，因为它使细胞毒性效应细胞接近靶细胞。靶向剂抗体偶联物对预期适应症的治疗效果可能是由于靶向剂抗体偶联物将细胞毒性效应细胞募集至靶细胞。靶向剂抗体偶联物对预期适应症的治疗效果可能完全是由于靶向剂抗体偶联物将细胞毒性效应细胞募集至靶细胞。靶向剂抗体构建体对预期适应症的治疗效果可能主要是由于靶向剂抗体偶联物将细胞毒性效应细胞募集至靶细胞。
对预期适应症的治疗效果可能是由于靶向剂抗体偶联物将蛋白质、肽或生物分子募集至靶细胞。对预期适应症的治疗效果可能完全是由于靶向剂抗体偶联物将蛋白质、肽或生物分子募集至靶细胞。对预期适应症的治疗效果可能至少部分是由于靶向剂抗体偶联物将蛋白质、肽或生物分子募集至靶细胞。
单独的靶向剂可以是具有治疗效果的靶向剂(例如，药物)。单独的靶向剂可以不是具有任何治疗效果的靶向剂。单独的靶向剂对靶向剂抗体偶联物的预期适应症可能具有或可能不具有任何治疗效果。在没有偶联抗-CD3抗体或抗体片段的情况下，靶向剂对靶向剂抗体偶联物的预期适应症可能具有或可能不具有治疗效果。当作为靶向剂抗体偶联物的一部分施用以提供治疗效果时的治疗剂的剂量可能具有或可能不具有治疗效果，当治疗剂在此剂量下单独施用时。靶向剂抗体偶联物的靶向剂预计可能具有或可能不具有任何治疗效果，除非将细胞毒性效应细胞募集至靶细胞。靶向剂抗偶联物的靶向剂对靶细胞可能具有或可能不具有治疗效果，其中该治疗效果相对于将细胞毒性效应细胞、蛋白质、肽或生物分子募集至靶细胞的治疗效果而言是可忽略的。靶向剂抗体偶联物的靶向剂对靶细胞可能具有或可能不具有治疗效果，其中该治疗效果低于将细胞毒性效应细胞、蛋白质、肽或生物分子募集至靶细胞的治疗效果。靶向剂与靶细胞的结合可诱导来自靶细胞的非有意的响应。靶向剂与靶细胞的结合除了将细胞毒性效应细胞、蛋白质、肽或生物分子募集至靶细胞的治疗效果之外还可诱导非有意的治疗效果。
靶向剂可结合癌细胞上的细胞表面分子。举非限制性的实例来说，癌细胞可选自乳腺癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、皮肤癌细胞、肺癌细胞、肝癌细胞、胆囊癌、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、子宫癌细胞、骨癌细胞和血癌(白血病)癌细胞。举非限制性的实例来说，细胞表面分子可选自G蛋白偶联受体(GPCR)、激酶受体、细胞因子受体和趋化因子受体。举非限制性的实例来说，细胞表面分子可选自CD20、CD19、CD22、CS1、BCMA、CD123、CD33、CLL-1、GD-2、EGFR、EGRF vIII、间皮素、CD38、Her2/ErbB2、Patched受体(PTCH)、Smoothened受体(SMO)、FKBP-12、雌激素受体、血管内皮生长因子(VEGFR1，VEGFR2)、表皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)、叶酸受体、胆囊收缩素B受体、促性腺激素释放激素受体、生长抑素受体、胃泌素释放肽受体、神经激肽受体、黑皮质素受体、神经降压素受体、神经肽Y受体和整联蛋白。
靶向剂可结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)。结合PSMA的靶向剂可以是2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(DUPA)或其类似物(参见，例如，图20A和20B)。其类似物可以是基于DUPA并保持PSMA结合的部分。DUPA类似物可保持DUPA结构的重要部分。而且，DUPA类似物可以是DUPA的轻微修饰形式，因为其与连接体或抗体/抗体片段偶联。例如，由于DUPA羧基与连接体或抗体/抗体片段偶联，DUPA类似物可经轻微修饰。另外，DUPA可经轻微修饰，因为其与连接体或抗体/抗体片段偶联，但保持其PSMA结合性质。如本文所用，术语“DUPA”包括如上所述的2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸、其类似物及其立体异构体。
靶向剂可结合叶酸受体蛋白(FR)。结合FR的靶向剂可以是N-(4-{[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢蝶啶-6-基)甲基]氨基}苯甲酰基)-L-谷氨酸(叶酸)或其类似物(参见，例如，图20C和20D)。其类似物可以是基于叶酸并保持结合FR的部分。叶酸类似物可保持叶酸结构的重要部分。而且，叶酸类似物可以是轻微修饰形式的叶酸，因为其与连接体或抗体/抗体片段偶联。例如，由于叶酸羧基与连接体或抗体/抗体片段偶联，叶酸类似物可经轻微修饰。此外，叶酸可经轻微修饰，因为其与连接体或抗体/抗体片段偶联，但保持其FR结合性质。如本文所用，术语“叶酸”或“叶酸盐”包括如上所述的N-(4-{[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢蝶啶-6-基)甲基]氨基}苯甲酰基)-L-谷氨酸及其类似物。
III.靶向剂抗体偶联物
在另一个方面，本文提供了靶向剂抗体偶联物，其包含与一个或多个靶向剂偶联的本文公开的抗体和抗体片段。本文公开的靶向剂抗体偶联物可包含一个或多个抗体或抗体片段。本文公开的靶向剂抗体偶联物可包含一个或多个靶向剂，其在本文中可称为多价靶向剂抗体偶联物。例如，靶向剂抗体偶联物可包含具有与轻链偶联的第一靶向剂和与重链偶联的第二靶向剂的抗体和抗体片段(参见，例如，图1A，图1C)。靶向剂抗体偶联物可包含具有与轻链偶联的第一靶向剂和与轻链偶联的第二靶向剂的抗体或抗体片段。靶向剂抗体偶联物可包含具有与重链偶联的第一靶向剂和与重链偶联的第二靶向剂的抗体或抗体片段。靶向剂抗体可包含仅具有与重链偶联的第一靶向剂和未偶联的轻链的抗体或抗体片段(参见，例如，图1B，图1D)。
本文公开的靶向剂抗体偶联物可包含一个或多个天然氨基酸，其中一个或多个靶向剂与所述一个或多个天然氨基酸偶联。举非限制性的实例来说，所述一个或多个天然氨基酸可选自赖氨酸和半胱氨酸。本文公开的靶向剂抗体偶联物可包含一个或多个非天然氨基酸，其中一个或多个靶向剂与所述一个或多个非天然氨基酸偶联。一个或多个靶向剂可经由连接体与所述一个或多个天然或非天然氨基酸偶联。
靶向剂抗体偶联物可使效应细胞接近靶细胞，使得效应细胞可针对靶细胞具有细胞毒活性。靶向剂抗体偶联物可包含与靶向剂偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段。人源化抗CD3抗体片段可以是人源化抗CD3Fab。人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段可包含由选自SEQ ID NO:23-79的序列表示的肽或多肽及其组合。
靶向剂抗体偶联物可使T细胞接近前列腺癌细胞。靶向剂抗体偶联物可包含与结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)的化合物偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段。靶向剂抗体偶联物可包含与结合前列腺特异性膜抗原(PSMA)的肽偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段。靶向剂抗体偶联物可包含与2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲基]戊二酸(DUPA)偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段。靶向剂抗体偶联物可包含与DUPA偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab。靶向剂抗体偶联物可包含与超过一个DUPA偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab。靶向剂抗体偶联物可包含与两个DUPA偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab，其中第一DUPA与人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab的轻链偶联，并且第二DUPA与人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab的重链偶联。靶向剂抗体偶联物可包含与超过一个DUPA和由选自SEQ ID NO:80-83的氨基酸序列表示的肽或蛋白质偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab。靶向剂抗体偶联物可在图1A和图1B中绘出。靶向剂抗体偶联物的部分可在图19A或图19B中绘出。
靶向剂抗体偶联物可包含与结合叶酸受体蛋白(FR)的化合物偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段。靶向剂抗体偶联物可包含与结合叶酸受体蛋白(FR)的肽偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段。靶向剂抗体偶联物可包含与N-(4-{[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢蝶啶-6-基)甲基]氨基}苯甲酰基)-L-谷氨酸偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段。靶向剂抗体偶联物可包含与叶酸偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab。靶向剂抗体偶联物可包含与超过一个叶酸分子偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab。靶向剂抗体偶联物可包含与两个叶酸偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab，其中第一叶酸与人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab的轻链偶联，并且第二叶酸与人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab的重链偶联。靶向剂抗体偶联物可包含与超过一个叶酸和由选自SEQ ID NO:80-83的氨基酸序列表示的肽或蛋白质偶联的人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3Fab。靶向剂抗体偶联物可在图1C和图1D中绘出。靶向剂抗体偶联物的部分可在图19C或图19D中绘出。
DUPA可经由连接体与人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段偶联。DUPA和连接体一起可以是式(VI)化合物：
叶酸可经由连接体与人源化抗CD3抗体或人源化抗CD3抗体片段偶联。叶酸和连接体一起可以是式(VII)化合物：
式(VI)在本文中可称为“p-TriA”或“P-TriA”。P-TriA可经由非天然氨基酸与抗体(例如Fab)偶联。该Fab可包含由选自SEQ ID NO:17和18的核苷酸序列编码的轻链和由选自SEQ ID NO:21和22(DI-huL5H2)或选自SEQ ID NO:19和20(huL5H2)的核苷酸序列编码的重链。所得的跨物种反应性PSMA结合/抗CD3抗体偶联物在本文中被称为huL5H2-P-TriA或DI-huL5H2-P-TriA。huL5H2-P-TriA和DI-huL5H2-P-TriA显示出良好的体外功效和选择性，并且在PSMA阳性C4-2癌异种移植和前列腺癌患者来源的异种移植(PDX)模型中表现出强大的体内抗肿瘤活性(参见，例如，实施例4和5)。
连接体
本文公开的靶向剂抗体偶联物可包含一个或多个连接体。本文公开的靶向剂抗体偶联物可包含两个或更多个连接体。本文公开的靶向剂抗体偶联物可包含三个或更多个连接体。本文公开的靶向剂抗体偶联物可包含4、5、6、7个或更多个连接体。
所述一个或多个连接体可包含官能团。所述一个或多个连接体可包含氨基酸。所述一个或多个连接体可包含肽。所述一个或多个连接体可包含聚合物。该聚合物可以是聚乙二醇。所述一个或多个连接体可包含酰胺。所述一个或多个连接体可包含苯基。
一个或多个连接体可以通过抗体上的氨基酸与已经连接到靶向剂上的连接体进行反应而形成。一个或多个连接体可以通过靶向剂上的氨基酸或另一个反应性官能团与已经连接到抗体上的连接体进行反应而形成。一个或多个连接体可以通过已经连接到抗体上的连接体与另一个已经连接到靶向剂上的连接体进行反应而形成。为了形成已经连接到抗体或靶向剂上的连接体，可以将具有两个正交反应性官能团的双功能连接体偶联到抗体或靶向剂上，使得一个剩余的反应性官能团可用于随后的偶联。反应性官能团可选自叠氮基、炔烃、烯烃、二烯、硝酮、环辛炔、环丙烯、反式环辛烯、降冰片烯、四嗪及其任何组合。
所述一个或多个连接体可以是已经连接到抗体上的连接体和已经连接到靶向剂上的连接体之间的生物正交反应的产物，其非限制性实例在Kim等人,Curr Opin Chem Bio17:412-419(2013)中进行了综述。
已经连接到抗体上的连接体和已经连接到靶向剂上的连接体可经由环加成、复分解、金属介导的交叉偶联反应、自由基聚合、氧化偶联、酰基转移反应和点击化学进行反应而形成连接体。环加成可以是Huisgen-环加成。环加成可以是不含铜[3+2]Huisgen-环加成。环加成可以是Diels-Alder反应。环加成可以是杂Diels-Alder反应。连接体可以是已经连接到抗体上的连接体和已经连接到靶向剂上的连接体之间的酶介导的反应的产物。连接体可以是已经连接到抗体上的连接体和已经连接到靶向剂上的连接体之间的转谷氨酰胺酶介导的反应的产物，其非限制性实例在Lin等人,J.Am.Chem.Soc.128:4542-4543(2006)和WO2013/093809中进行了描述。
所述一个或多个连接体可包含连接两个半胱氨酸残基的二硫桥，如PolyTherics的ThioBridgeTM技术。所述一个或多个连接体可包含连接两个氨基酸残基的马来酰亚胺桥。所述一个或多个连接体可包含连接两个半胱氨酸残基的马来酰亚胺桥。
所述一个或多个连接体可包含可切割的连接体。所述一个或多个连接体可包含不可切割的连接体。所述一个或多个连接体可包含柔性连接体。所述一个或多个连接体可包含非柔性连接体。
靶向剂抗体偶联物可通过调节连接体长度进行优化。所述一个或多个连接体可以是相对较短的。所述一个或多个连接体可以是相对较长的。所述一个或多个连接体可以是约1埃至约120埃/>的长度。所述一个或多个连接体可以是约5埃/>至约105埃/>的长度。所述一个或多个连接体可以是约10埃/>至约100埃/>的长度。所述一个或多个连接体可以是约10埃/>至约90埃/>的长度。所述一个或多个连接体可以是约10埃/>至约80埃/>的长度。所述一个或多个连接体可以是约10埃/>至约70埃/>的长度。所述一个或多个连接体可以是约15埃/>至约45埃/>的长度。所述一个或多个连接体的长度可等于或大于约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、27、30埃或更多埃。所述一个或多个连接体的长度可等于或大于约10埃。所述一个或多个连接体的长度可等于或大于约15埃。所述一个或多个连接体的长度可等于或大于约20埃。所述一个或多个连接体的长度可等于或小于约110、100、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30埃或更小。所述一个或多个连接体的长度可等于或小于约100埃。所述一个或多个连接体的长度可等于或小于约80埃。所述一个或多个连接体的长度可等于或小于约60埃。所述一个或多个连接体的长度可等于或小于约40埃。
本文公开的一个或多个连接体可包含式(II)化合物或其立体异构体：
其中：
L是
A1选自芳基、5至6元杂芳基、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L1是
A2选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L2是
A3是键、
L3是/>
X2是
A4选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个R1独立地选自H、烷基和卤代烷基；
每个R2、R21、R22、R23和R24独立地选自H、卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基和杂芳基烷基；
每个R3独立地选自卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、-NO2和NR1R1；
每个G1和G2独立地选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个Z、Z1、Z2和Z3独立地选自键、-O-和-N(R1)-；
Z4选自键、芳基和5至6元杂芳基；
k、k1、k2、k3和k4各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
p为0、1、2、3或4；
X3是 或-S-；且
L4是直接附接至修饰的氨基酸的键；与修饰的氨基酸结合的连接体，其中所述修饰的氨基酸是所述抗体的一部分。
本文公开的一个或多个连接体可包含式(IIa)化合物：
本文公开的一个或多个连接体可包含式(IIb)化合物：
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，k为1、2、3或4；且Z是键。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，k为4；且Z是键。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A1是-C(O)N(R1)-、6元芳基或5元杂芳基。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A1是-C(O)N(H)-。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A1是
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，m1为0；k1为6或7；且Z1是键。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A2是-C(O)N(H)-；m2为2；k2为2；且Z2是键。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A2是-C(O)N(H)-；m2为3；k2为2；且Z2是键。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A2是-C(O)N(H)-；m2为10；k2为2；且Z2是键。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A3是
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，R3是-NO2；且p为2。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，每个G1和G2独立地选自–C(O)-、-N(H)-、-C(O)N(H)-和-N(H)C(O)-。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A3是
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A3是键。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，m3为0、1、2或3；k3为2；且Z3是-NH-。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，每个R2、R21、R22、R23和R24独立地选自H、F、-CH3或-CF3。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，每个R2、R21、R22、R23和R24是H。
在式(II)、(IIa)或(IIb)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，X2是
IV.靶向剂抗体偶联物生产方法
在另一个方面，本文提供了生产靶向剂抗体偶联物的方法。该方法可包括将本文公开的抗体或抗体片段与本文公开的靶向剂偶联。该方法可包括将靶向剂与抗体或抗体片段的非天然氨基酸偶联。该方法可包括将一个或多个非天然氨基酸并入抗体或抗体片段中。
非天然氨基酸的并入
将一个或多个非天然氨基酸并入抗体或抗体片段中可以包括修饰抗体或抗体片段中的一个或多个氨基酸残基。修饰抗体或抗体片段中的一个或多个氨基酸残基可包括使编码靶向剂的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸突变。使编码靶向剂的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸突变可包括使编码氨基酸的密码子改变为无义密码子。
将一个或多个非天然氨基酸并入抗体或抗体片段中可以包括修饰抗体或抗体片段中的一个或多个氨基酸残基以产生抗体或抗体片段中的一个或多个琥珀密码子。
所述一个或多个非天然氨基酸可响应于琥珀密码子而并入抗体或抗体片段中。所述一个或多个非天然氨基酸可位点特异性地并入抗体或抗体片段中。
将一个或多个非天然氨基酸并入抗体或抗体片段中可以包括使用相对于典型的二十种氨基酸具有正交化学反应性的一个或多个遗传编码的非天然氨基酸，以位点特异性地修饰靶向剂。并入一个或多个非天然氨基酸可包括使用进化的tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶对，以响应于一个或多个琥珀无义密码子而位点特异性地在靶向剂中的限定位点处并入一个或多个非天然氨基酸。
将一个或多个非天然氨基酸并入靶向剂中可包括修饰靶向剂中的一个或多个氨基酸残基。修饰靶向剂中的一个或多个氨基酸残基可包括使编码靶向剂的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸突变。使编码靶向剂的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸突变可包括使编码氨基酸的密码子改变为无义密码子。
将一个或多个非天然氨基酸并入靶向剂中可包括修饰靶向剂中的一个或多个氨基酸残基以产生靶向剂中的一个或多个琥珀密码子。
所述一个或多个非天然氨基酸可响应于琥珀密码子而并入靶向剂中。所述一个或多个非天然氨基酸可位点特异性地并入靶向剂中。
将一个或多个非天然氨基酸并入靶向剂中可包括使用相对于典型的二十种氨基酸具有正交化学反应性的一个或多个遗传编码的非天然氨基酸，以位点特异性地修饰靶向剂。并入一个或多个非天然氨基酸可包括使用进化的tRNA/氨基酰基-tRNA合成酶对，以响应于一个或多个琥珀无义密码子而位点特异性地在靶向剂中的限定位点处并入一个或多个非天然氨基酸。
用于并入非天然氨基酸的其他方法包括但不限于在Chatterjee等人(AVersatile Platform for Single-and Multiple-Unnatural Amino Acid Mutagenesisin Escherichia coli,Biochemistry,2013)、Kazane等人(J Am Chem Soc,135(1):340-6,2013)、Kim等人(J Am Chem Soc,134(24):9918-21,2012)、Johnson等人(Nat Chem Biol,7(11):779-86,2011)和Hutchins等人(J Mol Biol,406(4):595-603,2011)中公开的方法。
连接抗体、抗体片段和/或靶向剂
所述方法可包括连接抗体、抗体片段、靶向剂或其中间体以产生靶向剂抗体偶联物，该靶向剂抗体偶联物包含：(a)抗体或抗体片段；(b)一个或多个连接体；(c)靶向剂，其中所述一个或多个连接体将第一抗体或抗体片段与该靶向剂连接。该方法可进一步包括将所述一个或多个连接体与靶向剂偶联以产生靶向剂-连接体中间体，并将该靶向剂-连接体中间体与抗体或抗体片段偶联。该方法可进一步包括将所述一个或多个连接体与抗体或抗体片段偶联以产生抗体-连接体中间体或抗体片段-连接体中间体，并将该抗体-连接体中间体或抗体片段-连接体中间体与靶向剂偶联。将中间体与抗体、抗体片段或靶向剂偶联可包括形成肟。将中间体与抗体、抗体片段或靶向剂偶联可包括在酸性溶液中形成肟。将中间体与抗体、抗体片段或靶向剂偶联可包括在微酸性溶液中形成肟。将中间体与抗体、抗体片段或靶向剂偶联可括在微中性溶液中形成肟。抗体或抗体片段可包含非天然氨基酸。将抗体或抗体片段与靶向剂-连接体中间体连接可包括在非天然氨基酸和靶向剂-连接体中间体之间形成肟。靶向剂可包含非天然氨基酸。将靶向剂与抗体-连接体中间体或抗体片段-连接体中间体连接可包括在非天然氨基酸和抗体-连接体中间体或抗体片段-连接体中间体之间形成肟。
生产靶向剂抗体偶联物的方法可包括：(a)将第一连接体与抗体或抗体片段偶联以产生抗体-连接体中间体或抗体片段-连接体中间体；(b)将第二连接体与靶向剂偶联以产生靶向剂-连接体中间体；和(c)将两种中间体连接在一起以产生靶向剂抗体偶联物。将连接体与抗体、抗体片段或靶向剂偶联可包括在连接体与抗体、抗体片段或靶向剂之间产生离子键、共价键、非共价键或其组合。可以如Roberts等人,Advanced Drug DeliveryReviews 54:459-476(2002)所述，将连接体与抗体、抗体片段或靶向剂偶联。
本文公开的方法可包括将一个或多个连接体与一个或多个抗体、抗体片段、靶向剂或其组合偶联，以产生一个或多个中间体，诸如抗体-连接体中间体、抗体片段-连接体中间体和/或靶向剂抗体偶联物-连接体中间体。该方法可包括将第一连接体与抗体或抗体片段偶联，以产生抗体-连接体中间体或抗体片段-连接体中间体。该方法可包括将连接体与靶向剂偶联，以产生靶向剂-连接体中间体。
一个或多个连接体与抗体、抗体片段或靶向剂的偶联可同时发生。一个或多个连接体与抗体、抗体片段或靶向剂的偶联可顺序发生。一个或多个连接体与抗体、抗体片段或靶向剂的偶联可在单一反应体积中发生。一个或多个连接体与抗体、抗体片段或靶向剂的偶联可在两个或更多个反应体积中发生。
将一个或多个连接体与抗体、抗体片段和/或靶向分子偶联可包括在连接体与抗体、抗体片段或靶向分子之间形成一个或多个肟。将一个或多个连接体与抗体、抗体片段和/或靶向剂偶联可包括在连接体与抗体、抗体片段或靶向剂之间形成一个或多个稳定的键。将一个或多个连接体与抗体、抗体片段和/或靶向剂偶联可包括在连接体与抗体、抗体片段或靶向剂之间形成一个或多个共价键。将一个或多个连接体与抗体、抗体片段和/或靶向剂偶联可包括在连接体与抗体、抗体片段或靶向剂之间形成一个或多个非共价键。将一个或多个连接体与抗体、抗体片段和/或配体偶联可包括在连接体与抗体、抗体片段或靶向剂之间形成一个或多个离子键。
将一个或多个连接体与抗体或抗体片段偶联可包括将一个或多个连接体与抗体或抗体片段经位点特异性地偶联。位点特异性的偶联可包括将一个或多个连接体与抗体或抗体片段的非天然氨基酸连接。将一个或多个连接体与抗体或抗体片段的非天然氨基酸连接可包括肟的形成。将一个或多个连接体与抗体或抗体片段的非天然氨基酸连接可包括硫化物的形成。举非限制性的实例来说，将一个或多个连接体与抗体或抗体片段的非天然氨基酸连接可包括使一个或多个连接体的羟胺与氨基酸的醛或酮反应。该氨基酸可以是非天然氨基酸。举非限制性的实例来说，将一个或多个连接体与抗体或抗体片段的非天然氨基酸连接可包括使一个或多个连接体的溴衍生物与氨基酸的硫醇反应。该氨基酸可以是非天然氨基酸。
靶向剂抗体偶联物可以是式(I)：X-L-Y，或者式(IA)：Y-L-X，其中：
a.X包含抗体或抗体片段；
b.L包含一个或多个连接体；且
c.Y包含一个或多个DUPA分子。
靶向剂抗体偶联物可包含式(III)化合物及其立体异构体：
其中：
L是
A1选自芳基、5至6元杂芳基、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L1是
A2选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L2是/>
A3是键、
L3是
X2是
A4选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个R1独立地选自H、烷基和卤代烷基；
每个R2、R21、R22、R23和R24独立地选自H、卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基和杂芳基烷基；
每个R3独立地选自卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、-NO2和NR1R1；
每个G1和G2独立地选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个Z、Z1、Z2和Z3独立地选自键、-O-和-N(R1)-；
Z4选自键、芳基和5至6元杂芳基；
k、k1、k2、k3和k4各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
p为0、1、2、3或4；
X3是 或-S-；
L4是直接附接至修饰的氨基酸的键，或者与修饰的氨基酸结合的连接体，其中所述修饰的氨基酸是所述抗体的一部分；
Q选自：且
E选自：
靶向剂抗体偶联物可包含式(IIIa)化合物：
靶向剂抗体偶联物可包含式(IIIb)化合物：
靶向剂抗体偶联物可包含式(IIIc)化合物：
靶向剂抗体偶联物可包含式(IIId)化合物：
靶向剂抗体偶联物可包含式(IIIe)化合物：
/>
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，k为1、2、3或4；且Z是键。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，k为4；且Z是键
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A1是-C(O)N(R1)-、6元芳基或5元杂芳基。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A1是-C(O)N(H)-。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A1是
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，m1为0；k1为6或7；且Z1是键。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A2是-C(O)N(H)-；m2为2；k2为2；且Z2是键。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A2是-C(O)N(H)-；m2为3；k2为2；且Z2是键。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A2是-C(O)N(H)-；m2为10；k2为2；且Z2是键。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A3是
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，R3是-NO2；且p为2。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，每个G1和G2独立地选自
-C(O)-、-N(H)-、-C(O)N(H)-和-N(H)C(O)-。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A3是
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，A3是键。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，m3为0、1、2或3；k3为2；且Z3是-NH-。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，每个R2、R21、R22、R23和R24独立地选自H、F、-CH3和-CF3。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，每个R2、R21、R22、R23和R24是H。
在式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)、(IIId)或(IIIe)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，X2是
在式(III)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，所述化合物选自：
及其立体异构体。
靶向剂抗体偶联物可包含式(IV)化合物及其立体异构体：
其中：
L是
A1选自芳基、5至6元杂芳基、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L1是
A2选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L2是
A3是键、
L3是
每个R1独立地选自H、烷基和卤代烷基；
每个R2、R21、R22和R23独立地选自H、卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基和杂芳基烷基；
每个R3独立地选自卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、-NO2和NR1R1；
每个G1和G2独立地选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个Z、Z1、Z2和Z3独立地选自键、-O-和-N(R1)-；
k、k1、k2和k3各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
p为0、1、2、3或4；
Q选自：
E选自：
在式(IV)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，所述化合物选自：
/>及其立体异构体。
靶向剂抗体偶联物可包含式(V)化合物及其立体异构体：
其中：
L是
A1选自芳基、5至6元杂芳基、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L1是
A2选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
L2是
A3是键、/>
L3是
A4选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个R1独立地选自H、烷基和卤代烷基；
每个R2、R21、R22、R23和R24独立地选自H、卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基和杂芳基烷基；
每个R3独立地选自卤代、-OR1、-CN、-SR1、烷基、环烷基、卤代烷基、芳基烷基、杂芳基烷基、-NO2和NR1R1；
每个G1和G2独立地选自键、-C(O)-、-N(R1)-、-O-、-C(O)N(R1)-、-N(R1)C(O)-、-S(O)1,2N(R1)-和-N(R1)S(O)1,2-；
每个Z、Z1、Z2和Z3独立地选自键、-O-和-N(R1)-；
k、k1、k2、k3和k4各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10；
p为0、1、2、3或4；
Q选自：
E选自：
在式(V)化合物的上文或下文描述的一些实施方案中，所述化合物选自：
及其立体异构体。
在一些实施方案中，所述靶向剂-连接体包含选自以下的化合物：
及其立体异构体。
在一些实施方案中，所述靶向剂-连接体包含选自以下的化合物：及其立体异构体。
IV.药物组合物
本文公开了药物组合物，其包含本文公开的抗体和/或靶向剂抗体偶联物以及药学上可接受的载体或赋形剂。如本文所用的术语“药学上可接受的”是指这样的物质：其不消除本文所述药剂的生物活性或性质，并且是相对无毒的(即，该物质的毒性显著超过该物质的益处)。在一些情况下，可向个体施用药学上可接受的物质而不引起显著的不期望的生物效应或不以有害的方式显著干扰包含它的组合物的任何组分。
本文的药物组合物可使用一种或多种生理上可接受的载体进行配制，该载体包括促进将活性剂加工成药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。适当的配制依赖于所选的给药途径。例如，药物组合物的概述可见于Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania 1975；Liberman,H.A.and Lachman,L.,Eds.,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,New York,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版(Lippincott Williams&Wilkins,1999)。
本文公开的药物组合物可进一步包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。该药物组合物可包含其他医药或药物剂；载体；佐剂；防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂；溶解促进剂；用于调节渗透压的盐；和/或缓冲液。此外，该药物组合物还含有其他在治疗上有价值的物质。
可通过任何适合的给药途径向受试者施用本文公开的药物组合物，该给药途径包括但不限于肠胃外(静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内、血管内、鞘内、玻璃体内、输注或局部)、局部、口服或经鼻给药。适合的给药途径可包括微针装置。
适合于肌肉内、皮下、瘤周或静脉内注射的制剂可包括生理上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重建为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油、克列莫佛等)，它们的合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，通过使用包衣如卵磷脂、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。适合于皮下注射的制剂还含有可选的添加剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。
对于静脉内注射，活性剂可任选地在水性溶液中配制，优选地在生理上相容的缓冲液如Hank溶液、林格液或生理盐水缓冲液中配制。
肠胃外注射任选地包括团注或连续输注。用于注射的制剂任选地以单位剂型例如在安瓿中或在添加有防腐剂的多剂量容器中提供。本文公开的药物组合物可以是作为油性或水性媒介物中的无菌悬浮液、溶液或乳液适合于肠胃外注射的形式，并且含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。用于肠胃外给药的药物制剂包括水溶性形式的活性剂的水性溶液。此外，悬浮液任选地制备为合适的油性注射悬浮液。
本文所述的药物组合物可以是适合于精确剂量的单次给药的单位剂型。在单位剂型中，该制剂可被分成含有适当量的本文公开的活性剂的单位剂量。单位剂量可以是含有离散量的制剂的包装的形式。非限制性实例是包装的片剂或胶囊，以及小瓶或安瓿中的粉末。水性悬浮液组合物可包装在不可再封闭的单剂量容器中。或者，可使用可再封闭的多剂量容器，在这种情况下通常在组合物中包含防腐剂。仅举例而言，用于肠胃外注射的制剂以单位剂型呈现，该单位剂型包括但不限于安瓿，或在添加有防腐剂的多剂量容器中。
药物组合物可以每日一次、每日两次、每日三次或更多次施用。药物组合物可以每周一次、每周两次、每周三次或更多次施用。药物组合物可以两周施用一次。药物组合物可以每月施用一次。药物组合物可以按需施用。
药物组合物可以与治疗性处理(例如，抗炎治疗、抗生素、抗病毒药物、化疗、放疗)共同施用。治疗性处理可包括额外的靶向剂抗体偶联物。
V.治疗用途
本文公开了用本文公开的靶向剂抗体偶联剂或药物组合物治疗受试者的病况的方法。
举非限制性的实例来说，所述病况可以是癌症。举非限制性的实例来说，该癌症可选自前列腺癌、乳腺癌、脑癌、胰腺癌、皮肤癌、肺癌、肝癌、结肠癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫癌、白血病、淋巴瘤和睾丸癌。该癌症可以是前列腺癌。癌症可包括复发性和/或难治性癌症。癌症的实例包括但不限于肉瘤、癌、淋巴瘤或白血病。
癌症可包括神经内分泌癌。癌症可包括胰腺癌。癌症可包括外分泌胰腺癌。癌症可包括甲状腺癌。甲状腺癌可包括甲状腺髓样癌。
癌症可包括前列腺癌。前列腺癌可以是PSMA阳性前列腺癌。PSMA表达可高度上调并限于前列腺癌的某个阶段或全部阶段的癌细胞。癌症可包括激素难治性前列腺癌。
癌症可包括上皮癌。癌症可包括乳腺癌。癌症可包括子宫内膜癌。癌症可包括卵巢癌。卵巢癌可包括基质卵巢癌。癌症可包括宫颈癌。
癌症可包括皮肤癌。皮肤癌可包括新生成血管的皮肤癌。皮肤癌可包括黑色素瘤。
癌症可包括肾癌。
癌症可包括肺癌。肺癌可包括小细胞肺癌。肺癌可包括非小细胞肺癌。
癌症可包括结直肠癌。癌症可包括胃癌。癌症可包括结肠癌。
癌症可包括脑癌。癌症可包括脑瘤。癌症可包括胶质母细胞瘤。癌症可包括星形细胞瘤。
癌症可包括血癌。血癌可包括白血病。白血病可包括髓样白血病。癌症可包括淋巴瘤。淋巴瘤可包括非霍奇金淋巴瘤。
癌症可包括肉瘤。肉瘤可包括尤因肉瘤。
肉瘤是骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症。肉瘤包括但不限于骨癌、纤维肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、双侧前庭神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤(例如，软组织腺泡状肉瘤、血管肉瘤、叶状囊性肉瘤、皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、上皮样肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、神经纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤)。
癌是在上皮细胞中开始的癌症，上皮细胞是覆盖身体表面、产生激素并构成腺体的细胞。举非限制性的实例而言，癌包括乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、脑癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌、口癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、皮肤癌、输卵管癌、头颈癌、胃肠间质癌、腺癌、皮肤或眼内黑色素瘤、肛区癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、肾盂癌、输尿管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、垂体腺癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、脑干神经胶质瘤和脊髓轴肿瘤。在一些情况下，癌症是皮肤癌，诸如基底细胞癌、鳞状癌、黑色素瘤、非黑色素瘤或光化性(日光性)角化病。
在一些情况下，癌症是肺癌。肺癌可开始于从气管分支以供给肺(支气管)或肺的小气囊(肺泡)的气道。肺癌包括非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌和间皮瘤。NSCLC的实例包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。间皮瘤可以是肺腔和胸腔的内层(胸膜)或腹部内层(腹膜)的癌肿瘤。间皮瘤可能是由于接触石棉。癌症可以是脑癌，诸如胶质母细胞瘤。
或者，癌症可以是中枢神经系统(CNS)肿瘤。CNS肿瘤可归类为神经胶质瘤或非神经胶质瘤。神经胶质瘤可以是恶性神经胶质瘤、高度神经胶质瘤、弥漫性内部脑桥神经胶质瘤。神经胶质瘤的实例包括星形细胞瘤、少突神经胶质瘤(或少突神经胶质瘤和星形细胞瘤元素的混合)和室管膜瘤。星形细胞瘤包括但不限于，低度星形细胞瘤、未分化的星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、纤维性星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤和室管膜下巨细胞星形细胞瘤。少突神经胶质瘤包括低度少突神经胶质瘤(或少星形细胞瘤)和未分化的少突神经胶质瘤。非神经胶质瘤包括脑膜瘤、垂体腺瘤、原发性CNS淋巴瘤和成髓细胞瘤。在一些情况下，癌症是脑膜瘤。
白血病可以是急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病或慢性髓细胞白血病。其他类型的白血病包括多毛细胞白血病、慢性髓细胞单核细胞白血病和幼年性髓细胞单核细胞白血病。
淋巴瘤是淋巴细胞癌并可从B或T淋巴细胞发展而来。淋巴瘤的两大类型是先前被称为霍奇金病的霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。霍奇金淋巴瘤的标志是Reed-Sternberg细胞的存在。非霍奇金淋巴瘤是那些不是霍奇金淋巴瘤的所有淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤可以是生长缓慢性淋巴瘤和侵袭性淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤包括但不限于，弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜关联淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、纵隔大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、结节边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、结节外边缘区B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤和淋巴瘤样肉芽肿病。
所述一种或多种疾病或病况可以是病原体感染。靶向剂可以与受感染细胞上的细胞表面分子相互作用。靶向剂可以与细菌、病毒或寄生虫上的分子相互作用。病原体感染可由一种或多种病原体引起。在一些情况下，病原体是细菌、真菌、病毒或原生动物。
示例性的病原体包括但不限于：博德特氏菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、梭菌属(Clostridium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、利斯特氏菌属(Listeria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、枝原体属(Mycoplasma)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体属(Rickettsia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)或耶尔森氏菌属(Yersinia)。在一些情况下，由病原体引起的疾病或病况是结核病，并且不均一样品包括衍生自细菌分支杆菌属结核病的外来分子和衍生自受试者的分子。在一些情况下，由细菌引起的疾病或病况是结核病、可由细菌如链球菌属和假单胞菌属引起的肺炎、可由细菌如志贺氏菌属、弯曲杆菌属和沙门氏菌属引起的食物传染疾病或感染如破伤风、伤寒、白喉、梅毒和麻风。疾病或病况可以是细菌性阴道病，一种由天然存在的细菌菌群的不均衡引起的阴道疾病。或者，疾病或病况是细菌性脑膜瘤，一种脑脊膜(例如，覆盖脑和脊髓的保护膜)的细菌性炎症。由细菌引起的其他疾病或病况包括但不限于细菌性肺炎、尿路感染、细菌性胃肠炎和细菌性皮肤感染。细菌性皮肤感染的实例包括但不限于可由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)或酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)引起的脓疱病；由具有淋巴扩散的深层表皮的链球菌属细菌性感染引起的丹毒；以及由正常皮肤菌群或由外源性细菌引起的蜂窝织炎。
病原体可以是真菌，诸如但不限于假丝酵母属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、组织孢浆菌属(Histoplasma)、肺囊虫属(Pneumocystis)和葡萄穗霉属(Stachybotrys)。由真菌引起的疾病或病况的实例包括但不限于股藓、酵母感染、藓菌病和足癣。
病原体可以是病毒。病毒的实例包括但不限于腺病毒(adenovirus)、柯赛基病毒(coxsackievirus)、EB病毒(Epstein-Barr virus)、肝炎(例如，甲型、乙型和丙型肝炎)病毒、单纯疱疹病毒(1和2型)、巨细胞病毒(cytomegalovirus)、疱疹病毒(herpes virus)、HIV、流感病毒(influenza virus)、麻疹病毒(measles virus)、腮腺炎病毒(mumpsvirus)、乳头瘤病毒(papillomavirus)、副流感病毒(parainfluenza virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、人呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、风疹病毒(rubella virus)和水痘-带状疱疹病毒(rubella virus)。由病毒引起的疾病或病况的实例包括但不限于感冒、流感、肝炎、AIDS、水痘、风疹、流行性腮腺炎、麻疹、疣和脊髓灰质炎。
病原体可以是原生动物，诸如但不限于棘变形虫属(Acanthamoeba)(例如，星棘变形虫(A.astronyxis)、卡氏棘变形虫(A.castellanii)、A.culbertsoni、A.hatchetti、A.polyphaga、A.rhysodes、A.healyi、A.divionensis)、Brachiola(例如，B connori,B.vesicularum)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)(例如，小隐孢子虫(C.parvum))、环孢子虫属(Cyclospora)(例如，C.cayetanensis)、脑胞内原虫属(Encephalitozoon)(例如，家兔脑胞内原虫(E.cuniculi)、脑炎微孢子虫(E.hellem)、肠脑炎微孢子虫(E.intestinalis))、内变形虫属(Entamoeba)(例如，痢疾内变形虫(E.histolytica))、肠孢虫属(例如，E.bieneusi)、贾第虫属(Giardia)(例如，表吮贾第虫(G.lamblia))、等孢球虫属(Isospora)(例如，贝氏等孢球虫(I.belli))、微孢子虫属(Microsporidium)(例如，M.africanum、M.ceylonensis)、纳归虫属(Naegleria)(例如，福氏纳归虫(N.fowleri))、微粒子虫属(Nosema)(例如，海藻小孢子虫(N.algerae)、N.ocularum)、具褶孢虫属(Pleistophora)、Trachipleistophora(例如，T.anthropophthera、T.hominis)和角膜微孢子(Vittaforma)(例如，V.corneae)。
疾病或病况可以是自身免疫病或自身免疫相关疾病。自身免疫病可能是身体免疫系统的功能障碍，它引起身体攻击自身的组织。自身免疫病和自身免疫相关的疾病的实例包括但不限于艾迪生病(Addison's disease)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性心肌炎、贝赫切特病(Behcet’s disease)、口炎性腹泻、克罗恩病(Crohn’s disease)、皮肌炎、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、巨细胞动脉炎(颞动脉炎)、古德帕斯丘综合征(Goodpasture’ssyndrome)、格雷夫斯病(Graves'disease)、桥本病(Hashimoto’s disease)、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、幼年性关节炎、糖尿病、幼年型糖尿病、川崎综合征、兰伯特-伊顿综合征、狼疮(SLE)、混合性结缔组织病(MCTD)、多发性硬化、重症肌无力、天疱疮、结节性多动脉炎、I、II和III型自身免疫多腺性综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、银屑病、银屑病关节炎、赖特尔综合征(Reiter’s syndrome)、复发性多软骨炎、类风湿关节炎、结节病、硬皮病、舍格伦综合征、精子和睾丸自身免疫、僵人综合征、高安动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿病。
疾病或病况可以是炎性疾病。炎性疾病的实例包括但不限于肺泡炎、淀粉样变、血管炎、强直性脊柱炎、缺血性坏死、巴泽多病(Basedow's disease)、贝尔麻痹(Bell'spalsy)、滑囊炎、腕管综合征、乳糜泻、胆管炎、髌骨软骨软化、慢性活动性肝炎、慢性疲劳综合症、科根综合征(Cogan's syndrome)、先天性髋关节发育不良、肋软骨炎、克罗恩病、囊性纤维化病、德.奎尔万腱炎、糖尿病相关的关节炎、弥漫性特发性骨质增生、盘状狼疮、埃-当综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、家族性地中海热、筋膜炎、纤维织炎/纤维肌痛、冷冻肩、腱鞘囊肿、巨细胞动脉炎、痛风、格雷夫斯病、HIV相关的风湿性疾病综合征、甲状旁腺功能亢进相关的关节炎、感染性关节炎、炎性肠综合征/肠易激综合症、幼年型类风湿关节炎、莱姆病、马方综合征(Marfan’s Syndrome)、米库利奇病、混合性结缔组织病、多发性硬化、肌筋膜疼痛综合征、骨关节炎、骨软化症、骨质疏松症和皮质类固醇引起的骨质疏松症、佩吉特病(Paget's Disease)、复发性风湿病、帕金森病、普卢默病(Plummer's Disease)、风湿性多肌痛、多肌炎、假痛风、银屑病关节炎、雷诺现象/综合征、赖特尔综合征(Reiter'sSyndrome)、风湿热、类风湿关节炎、结节病、坐骨神经痛(腰椎神经根病)、硬皮病、坏血病、镰状细胞性关节炎、舍格伦综合征(Sjogren's Syndrome)、椎管狭窄、脊椎前移、斯蒂尔病(Still's Disease)、系统性红斑狼疮、高安(无脉)病、腱炎、网球肘/高尔夫球肘、甲状腺相关的关节炎、扳机指、溃疡性结肠炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener's Granulomatosis)和惠普尔病。
实施例
实施例1：人源化CD3抗体候选物的表达和测试
为了在哺乳动物细胞中表达人源化Fab，将如图2所示的VH基因(VH1和VH2)和VL基因(VL1～VL10)分别克隆到pFUSE载体中，在IL2信号肽序列下。根据制造商的方案，使用轻链和重链表达载体共转染Expi293F细胞。在第3天或第4天收获培养基，并通过蛋白G色谱法纯化所分泌的Fab。通过流式细胞术评估人源化候选物对人和食蟹猴T细胞的结合亲和力。简言之，将细胞与人源化Fab在4℃下温育30min，并用染色缓冲液(PBS中的1％BSA)洗涤两次。使用R-藻红蛋白(PE)偶联的抗人κ第二抗体(Southern Biotech)显示经结合的抗体。洗涤数次后，在BD LSR II或BD Accuri C6上获得样品，并使用FlowJo 7.6.2软件进行分析。在每个研究中，将细胞与单独的第二抗体一起温育，并用所观察到的平均荧光强度(MFI)减去背景和非特异性染色。如图3和表1、表2中所示，huL5H2显示出对人CD3的结合亲和力相当于鼠抗CD3对人T细胞(Jurkat)的结合亲和力。此外，huL5H2也显示出对食蟹猴T细胞的良好结合(HSC-F，图4，表3)。
表1
表2
浓度(nM) 鼠 HuL1H1 HuL2H2 HuL3H2 HuL4H2 HuL5H2 HuL6H2 HuL7H2 HuL8H2 HuL9H2 HuL10H2
1000.000 54400 1470 1470 666 650 51800 2203 35400 54600 39400 46300
200.000 50600 1460 1460 643 620 48000 835 28900 42000 27900 31300
40.000 41400 1450 1450 650 620 41600 598 13600 22000 9946 12700
8.000 28500 1450 1450 610 620 31700 573 4241 7673 2756 3274
1.600 10500 1440 1440 610 615 13400 597 2040 2117 986 1608
0.320 3563 1400 1400 600 599 4432 572 1574 837 637 688
0.000 1397 1397 1397 559 559 1397 559 1252 559 559 559
表3
浓度(nM) 鼠 HuL5H2
1000.000 109000 106000
200.000 94400 96900
40.000 84800 84000
8.000 60700 63200
1.600 21100 26300
0.320 5328 7074
0.000 1209 1209
实施例2：HuL5H2Fab在大肠杆菌中的表达(κ轻链与λ轻链的比较)
将具有κ或λ轻链恒定区的huL5H2Fab克隆到pBAD载体中，并用TOP10大肠杆菌(E.coli)感受态细胞表达。简言之，挑取菌落，将其接种到TB培养基(Terrific Broth)(TB，酪蛋白胨12.00g，4.00(mL)甘油，2.31g K2HPO4，12.54g K2HPO4，24.00g Yeastolate)中，并在37℃(200rpm)下生长过夜。第二天，用细胞接种2L烧瓶中的500mL TB表达培养基，并在37℃(200rpm)下进一步培养。在O.D.达到0.8～1时，将阿拉伯糖补充到生长培养基中(最终：0.2％m/v)，并使细胞在26℃(130rpm)下生长48小时。然后将细胞沉淀，以10mL/g的细胞沉淀物悬浮于裂解缓冲液(30mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，20％蔗糖，溶菌酶4mg/g细胞沉淀物)中，并在37℃(200rpm)下裂解。30分钟后，通过离心(15000x g，20min)并且通过过滤(0.22um)去除裂解物中的碎片。通过蛋白G色谱法从裂解物中纯化Fab，并通过SDS-PAGE确认。使用该方法，由κ恒定区组成的Fab所产生的表达水平是由λ恒定区组成的Fab的大约4倍(图5)。
实施例3：食蟹猴交叉反应性抗CD3-双-p-TriA抗体的表达和产生
将在各自轻链(SEQ ID NO:17)和重链Fab(SEQ ID NO:19)上包括κ恒定区的CD3结合Fab的重链和轻链(克隆UCHT-1，SEQ ID NO:84、85；或huL5H2，SEQ ID NO:4、10)克隆到双顺反子pBAD载体中，并使用Quikchange定点突变试剂盒(Quikchange Site-directedMutagenesis Kit)(Stratagene)进行位点特异性突变以在两个不同位置处引入TAG琥珀无义密码子(得到轻链S205TAG(SEQ ID NO:18)和重链K141TAG(SEQ ID NO:20))。抗体在大肠杆菌(E.coli)(具有对乙酰基苯丙氨酸(pAcF)特异性的正交詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)tRNA/氨基酰-tRNA合成酶)中表达，并纯化。使用四极杆飞行时间(QTOF)质谱仪通过SDS-PAGE和质谱法确认纯度和pAcF的并入。将并入pAcF残基的突变抗体(SEQ IDNO:40、42)与30倍摩尔过量的p-TriA在NaOAc(pH 4.5)缓冲液中37℃偶联≥14天。通过QTOF确认偶联反应的完成。使用具有10K和30K截断值的Amicon过滤器通过大小过滤去除过量的未反应的p-TriA(图6A)，并通过SDS-PAGE确认最终产物的大小和纯度(图6B)。
利用流式细胞术测试偶联物与人(Jurkat)和食蟹猴(HSC-F)T细胞上的细胞表面CD3或C4-2细胞上的PSMA的结合。简言之，将细胞与UCHT-1或huL5H2抗体(或相应的p-TriA偶联物)一起温育，并用PE偶联的抗人κ第二抗体(Southern Biotech)显示经结合的抗体。在每个研究中，将细胞与单独的第二抗体一起温育，并用观察到的平均荧光强度(MFI)减去背景和非特异性染色。如图7中所示，huL5H2和UCHT-1抗体和偶联物显示出分别与Jurkat(人)T细胞和C4-2(PSMA阳性)细胞的相当的结合，其中对DU145(PSMA阴性)细胞的非特异性结合最小。值得注意的是，只有由huL5H2Fab组成的抗体结合食蟹猴T细胞(HSC-F)。
实施例4：体外研究
细胞毒性试验
接下来进行体外细胞毒性试验以确定抗CD3-双-p-TriA抗体偶联物是否诱导抗原特异性靶细胞杀伤。简言之，将1 x 105个PBMC(人)和1 x 104个靶细胞(C4-2或DU145)与指定浓度的抗体偶联物共培养24小时。使用Cytotox-96非放射性细胞毒性试验试剂盒(Promega)测量细胞毒性，其对从裂解的细胞释放到上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)的量进行定量。使用以下公式计算裂解活性百分比：(所使用的值表示490nM处的吸光度)细胞毒性％＝100x[((靶细胞+效应细胞+转换)-(靶细胞+仅效应细胞))/((最大靶细胞裂解)-(仅靶细胞))]。如图8A和8B以及相应的表4和5所示，huL5H2-和UCHT-1-p-TriA抗体偶联物以相当的效力(huL5H2-p-TriA，EC50＝18.1pM；UCHT-1-p-TriA，EC50＝22.9pM)选择性地针对C4-2(PSMA阳性)细胞重定向人PBMC。观察到DU145(PSMA阴性)细胞的最小非特异性杀伤。只有huL5H2-p-TriA诱导食蟹猴PBMC对C4-2细胞的裂解(huL5H2-p-TriA，EC50＝60.5pM)(图9，表6)。
表4
表5
表6
活化标志物上调和增殖试验
在靶细胞的存在下评估抗CD3-双-p-TriA抗体偶联物对人T细胞上的活化标志物的上调。在这些研究中，在96孔圆底板上，在1、0.1、0.01或0nM抗体偶联物的存在下，将相等数目(1 x 105)的人PBMC和C4-2(PSMA阳性)或人PBMC和DU145(PSMA阴性)细胞在37℃下共培养24小时。第二天，用PE偶联的抗CD3(OKT3)、AlexaFluor488-偶联的CD25(BC96)和别藻蓝蛋白(APC)偶联的CD69(FN50)抗体(均购自Biolegend)标记培养物。在每项研究中包括适当的同种型对照，以确定背景并排除非特异性染色。获得未染色的和单色的对照，并将其用于补偿。在图10A和图10B以及表7和表8中示出了数据。
还评估了抗CD3-双-p-TriA抗体偶联物对T细胞增殖的影响。将1 x 105个羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的人PBMC和1 x 105个靶细胞在1nM抗偶联合物的存在下共培养72小时。所有实验均在BD Accuri C6上进行，并使用FlowJo 7.6.2软件进行分析。如图11A和图11B所示，两种p-TriA偶联物分别以PSMA依赖性方式诱导类似容量的T细胞活化和增殖。
表7
表8
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细胞因子释放试验
使用BD CBA人Th1/Th2试剂盒II(BD Biosciences)对来自上述活化研究的培养基中的细胞因子进行定量。在BD Accuri C6上获得样品，并使用FCAP Array软件进行分析。如图12A和图12B以及表9和表10中所示，在PSMA阳性C4-2细胞的存在下，两种p-TriA偶联物均诱导相当水平的来自人T细胞的炎性细胞因子。
表9
表10
实施例5：体内研究
异种移植物
在C4-2异种移植模型中确定huL5H2-p-TriA的体内效能。向6至8周龄雄性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下植入基质胶(Matrigel)(Corning)中的1 x 106个C4-2细胞。一旦肿瘤大小约为150-200mm3，即经由腹膜内输注20 x 106个活化T细胞，第二天，用指定剂量的huL5H2-p-TriA进行每日静脉内治疗持续10天。平行地，包括由每天注射PBS的小鼠组成的对照组(仅肿瘤)。使用外部卡尺每两周监测肿瘤生长，并使用下式计算：(l x w x h)/2。如图13A和图13B以及表11-16中所示，在用人T细胞重建的NSG小鼠模型中，huL5H2-p-TriA显示出剂量依赖性的体内抗肿瘤活性。此外，经观察，每日和每隔一日的治疗在根除C4-2肿瘤方面同样有效。
表11
表12
表13
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表14
表15
表16
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实施例6：患者来源的异种移植物
接下来使用来自人前列腺癌股骨转移的原代细胞PCSD1(2)，在患者来源的异种移植(PDX)模型中验证C4-2异种移植模型中的结果。向6至8周龄雄性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下植入2 x 106个PCSD1肿瘤细胞。一旦形成可触及的肿瘤，即经由腹膜内输注约500mm3，20 x 106个活化T细胞，并且在第二天，每天用1mg/kg的huL5H2-p-TriA静脉内治疗，持续10天。平行地，包括其中小鼠每天注射PBS的对照组(仅肿瘤)。使用外部卡尺每两周监测肿瘤生长，并使用下式计算：(l x w2)/2。如图14A和图14B以及表17-19中所示，huL5H2-p-TriA在PDX模型中显示出有前景的功效。
表17
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表18
表19
实施例7：去免疫的huL5H2_DI-2xDUPA抗体偶联物的表达、生成和表征
HuL5H2抗体的计算机免疫原性分析(EpiVax)预测该抗体具有潜在的免疫原性(免疫原性评分＝27.74)，这归因于在重链序列内发现的潜在T细胞表位。如图15所示，引入四个去免疫突变(K19R、S41P、K89R和T90A)以产生去免疫(DI)形式的HuL5H2抗体(DI-HuL5H2)，其具有显著降低的免疫原性评分(-51.19)。使用Quikchange定点诱变试剂盒(Quikchange Site-directed Mutagenesis Kit)(Stratagene)在HuL5H2中引入在重链上位置K19、S41、K89和T90处的位点特异性点突变，并如上述进行表达。将pAcF突变体DI-HuL5H2进一步与30倍摩尔过量的p-TriA在NaOAc(pH 4.5)缓冲液中在37℃下偶联≥14天。通过大小过滤(Amicon，10K和30K)去除过量的p-TriA，并且通过QTOF确认偶联反应的完成(图16)。
利用流式细胞术评估与人(Jurkat)和食蟹猴T细胞上的细胞表面CD3的潜在差异结合，作为“去免疫”过程的结果。如上所述，将细胞与huL5H2或DI-huL5H2抗体一起温育30min，并用R-藻红蛋白(PE)偶联的抗人κ第二抗体(Southern Biotech)显示经结合的抗体。在洗涤数次后，在BD LSRII或BD Accuri C6上获得样品，并使用FlowJo软件进行分析。在这些研究中，使用两种抗体观察到与人和食蟹猴T细胞的类似的结合概况，这提示甚至在引入去免疫突变后仍保留了与人CD3的交叉反应性(图17A和图17B以及表20-21)(Jurkat:huL5H2IC50＝5.9nM且DI-huL5H2IC50＝4.6nM；HSC-F:huL5H2IC50＝3.8nM且DI-huL5H2IC50＝3.4nM)。
表20
表21
实施例8：体外研究
细胞毒性试验
在细胞毒性试验中评估huL5H2_DI-2xDUPA偶联物的体外活性。如先前在实施例4中所述，将1 x 105个PBMC(人)和1 x 104个靶细胞(C4-2)与指定浓度的抗体偶联物共培养24小时。通过从裂解的细胞中释放的乳酸脱氢酶(LDH)的量确定细胞毒性。如图18和表22-23所示，huL5H2-和huL5H2_DI-2xDUPA偶联物以相当的效能(huL5H2-p-TriA，EC50＝3.2pM；DI-huL5H2-p-TriA，EC50＝3.1pM)针对C4-2(PSMA阳性)细胞选择性地重定向人PBMC，并诱导DU145(PSMA阴性)细胞的最小非特异性杀伤。
表22
表23
实施例9：huL5H2_DI-2xDUPA和huL5H2_DI-1xDUPA的合成和比较
体外结合比较试验
使用内部仪器通过Octet(ForteBio)测量结合亲和力；使用DUPA-CD3作为配体并使用逆转的相互作用作为分析物来测试相互作用。在PBS中以20μg/mL、15ug/ml、10μg/mL和5μg/mL制备每种配体。将分析物在1 X PBS中从6μg/mL至1μg/mL连续稀释1.2X。还制备了100mM甘氨酸(pH 2.87)再生溶液和用于基线稳定化的1 X PBS。生物传感器、配体和分析物对如下：(1)CH-1–抗体–重组人或食蟹猴CD3δ/ε复合体，(2)Fc-重组人或食蟹猴CD3δ/ε复合体–抗体，(3)CH-1–抗体–重组人或食蟹猴PSMA；和(4)Ni-NTA–重组人或食蟹猴PSMA–抗体。在结合测量之前，将传感器尖端在1×PBS中预水化30分钟，然后进行1个循环的预处理，在甘氨酸(pH 2.87)中浸渍60秒。然后将传感器尖端转移到含配体的孔中，进行180秒的加载步骤。将在1×PBS中基线浸渍120秒后，通过将涂覆配体的传感器浸渍入含有不同浓度的相应分析物的孔中来测量结合动力学。在180秒的缔合期监测结合相互作用，然后在含有新鲜1×PBS的新孔中进行7.5至15min的解离期。huL5H2_DI-2xDUPA和huL5H2_DI-1xDUPA对CD3的结合是相当的，具有10nM的亲和力；由于亲合作用，当使用PMSA作为配体时，huL5H2_DI-2xDUPA表现出显著更高的结合(表24)。两种偶联物对cynoPSMA(食蟹猴PSMA)和cynoCD3(食蟹猴CD3)的结合亲和力分别类似于这两种偶联物对人PSMA和人CD3的结合亲和力。
表24
结合至 捕获 配体 分析物 亲和力
CD3 CH1 L5H2-DI-1X-DUPA hu.CD3d/e-Fc 4.83E-09
CD3 CH1 L5H2-DI-2X-DUPA hu.CD3d/e-Fc 5.13E-09
cynoCD3 CH1 L5H2-DI-1X-DUPA cy.CD3d/e-Fc 3.29E-09
CD3 Fc hu.CD3de-Fc L5H2-DI-1X-DUPA 2.12E-08
CD3 Fc hu.CD3de-Fc L5H2-DI-2X-DUPA 1.10E-08
cynoCD3 Fc cy.CD3d/e-Fc L5H2-DI-1X-DUPA 1.13E-08
PSMA CH1 L5H2-DI-1X-DUPA hu.PSMA 2.36E-11
PSMA CH1 L5H2-DI-2X-DUPA hu.PSMA 9.03E-11
cynoPSMA CH1 L5H2-DI-1X-DUPA hu.PSMA n/a
PSMA Ni-NTA hu.PSMA L5H2-DI-1X-DUPA 2.17E-09
PSMA Ni-NTA hu.PSMA L5H2-DI-2X-DUPA <1.0E-12
cynoPSMA Ni-NTA cyno.PSMA L5H2-DI-1X-DUPA 5.11E-09
huL5H2_DI-1xDUPA的合成
使用PD-10一次性柱将含有单突变Fab形式的人源化抗CD3抗体的缓冲液更换为由50mM NaOAc(pH 4.5)、150mM NaCl和10％甘油组成的偶联缓冲液，并使用Amicon 10K过滤器将其浓缩至30mg/ml。用24～215摩尔过量的前列腺特异性膜抗原(PSMA)结合小分子配体和10mg/ml抗体进行肟连接，并在室温下在18小时内完成该反应，通过液体色谱法-质谱仪进行监测。通过大小过滤(Amicon 10K)去除过量小分子，并将偶联物的缓冲液更换为PBS(pH 7.4)，然后在体外和体内研究之前去除可能由millex GV 0.22um过滤器聚集的。发现DUPA的甲酸盐对于偶联是最佳的，具有99.86％的偶联效率(表25和表26)。
表25
Calibr ID 盐 规模 偶联％ 回收 比值
CBR-001-623-836-1 甲酸 2mg 98.91 90.79 54
CBR-001-623-840-7 甲酸 2mg 99.48 0.4 74
CBR-001-625-095-6 甲酸 2mg 99.86 96.81 68
CBR-001-625-094-5 甲酸 2mg 99.86 92.45 81
表26
蛋白质 小分子批次 盐 偶联％ 比值 备注
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-600-008-1 HCl N/A 215 聚集
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-620-049-0 Na2CO3 93.48 40
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-620-048-9 Li2CO3 74.33 54
huL5H2_DI-1xpAcF WuxiDUPA Li2CO3 90.29 96
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-623-837-2 Li2CO3 90.34 133
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-597-963-2 TFA 99.56 31
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-593-245-3 TFA 99.68 24
huL5H2_DI-1xpAcF TSRI TFA 91.16 57 聚集
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-623-836-1 甲酸 98.91 27
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-623-840-7 甲酸 99.48 37
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-624-015-6 TFA 99.47 37 聚集
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-625-095-6 甲酸 99.86 34
huL5H2_DI-1xpAcF CBR-001-625-094-5 甲酸 99.86 40
PSMA介导的内化的比较
利用流式细胞术确定huL5H2_DI-1xDUPA和-2xDUPA偶联物的内化率(图21A，图21B，图21C)。根据制造商的方案，使用Alexa Fluor 488抗体标记试剂盒(Thermo FisherScientific)将抗体偶联物与Alexa Fluor 488随机偶联。未与DUPA(即1x TAG)偶联的相应抗体用作抗原特异性对照。将25ug的AlexaFluor 488标记的抗体与0.5x106个C4-2(PSMA阳性)细胞在37℃下温育指定的持续时间或在冰上温育30分钟(对照)。停止内化并去除过量的偶联物，随后使用冰冷的染色缓冲液(2％FBS/1mM EDTA/DPBS)洗涤。对于每个时间点，将细胞与抗Alexa Fluor 488抗体(Thermo Fisher Scientific)在冰上温育30分钟或将细胞单独在冰上温育30分钟。在BD FACSCantoTM II上评估猝灭的(Q)细胞和非猝灭的(NonQ)细胞的平均荧光值，并用该平均荧光值如前所述计算内化率(Cancer ImmunolImmunother.2008年12月；57(12):1879-90和Mol Biol Cell.2004年12月；15(12):5268-82)。在这些研究中，huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA偶联物在PSMA阳性细胞上均以相当的速率内化(表27)。
表27
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体外细胞毒性
在细胞毒性试验中评估huL5H2_DI-1xDUPA和-2xDUPA的体外功效。如先前实施例4所述，将1 x 105个PBMC(人)和1 x 104个靶细胞(C4-2，PSMA阳性，或者DU145，PSMA阴性)以10:1(效应细胞:靶细胞)比例与指定浓度的抗体偶联物共培养24小时。通过计算从裂解的靶细胞中释放的乳酸脱氢酶(LDH)的量来确定细胞毒性。如图所示，两种偶联物均针对C4-2细胞选择性地重定向人PBMC，其中与huL5H2_DI-2xDUPA(EC50＝39.9pM)相比，用huL5H2_DI-1xDUPA观察到轻微增加的功效(EC50＝18.5pM)(图22)。两种偶联物均未观察到DU145的脱靶杀伤。
细胞因子释放
使用BD CBA人Th1/Th2试剂盒II(BD Biosciences)对来自上述细胞毒性试验的培养基中的细胞因子进行定量。在BD Accuri C6上获得样品，并使用FCAP Array软件进行分析。如图所示，huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA在PSMA阳性C4-2细胞的存在下均诱导相当的人炎性细胞因子的抗原特异性释放。huL5H2_DI-1xDUPA和-2xDUPA显示出类似的细胞因子概况(图23)。
体外活化和增殖
在PSMA阳性和PSMA阴性靶细胞的存在下，评估huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA抗体偶联物对人PBMC上的活化标志物的上调。在这些研究中，在96孔圆底板上，在1、0.1、0.01或0nM抗体偶联物的存在下，将相等数目(1 x 105)的人PBMC和C4-2(PSMA阳性)或DU145(PSMA阴性)细胞在37℃下共培养24小时。第二天，用PE偶联的抗CD3(OKT3)、AlexaFluor 488-偶联的CD25(BC96)和别藻蓝蛋白(APC)偶联的CD69(FN50)抗体(均购自Biolegend)标记培养物。在每项研究中包括适当的同种型对照以确定背景并排除非特异性染色。获得未染色的和单色的对照，并用于补偿。还评估了huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA抗体偶联物对T细胞增殖的影响。将1 x 105个羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的人PBMC和1 x 105个丝裂霉素处理的靶细胞在1nM抗体偶联物的存在下共培养。72小时后，用抗CD3抗体和7-AAD染料标记培养物，以在BD Accuri C6上评估活的分裂T细胞。如图24和图25所示，两种L5H2_DI抗体偶联物分别以PSMA依赖性方式诱导类似容量的T细胞活化和增殖。
PSMA定量试验
为了比较huL5H2_DI-1xDUPA和-2xDUPA抗体偶联物对具有不同抗原密度的不同癌细胞的体外活性，确立了在不同前列腺癌细胞系上发现的每个细胞的细胞表面PSMA的相对数目(表28)。将细胞系用PE偶联的抗人PSMA抗体(Biolegend)染色，并在BD FACSCantoTM II或BD Accuri C6上获取。通过从使用QuantiBRITE PE荧光定量试剂盒(BD Pharmingen)所产生的标准曲线外推信号强度来确定抗原密度。
表28
前列腺癌细胞系 PSMA相对数目/细胞 ±SD
LNCaP 179620 85951
C4-2 110341 43526
VCap 46738 27521
22Rv-1(分选的) 12217 2935
22Rv-1(母体) 3606 1770
DU145 114 86
在细胞毒性试验中评估huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA抗体偶联物针对具有不同细胞表面PSMA密度的不同癌细胞的体外活性。如先前实施例4中所述，将1 x 105个PBMC(人)和1 x 104个靶细胞(C4-2)与指定浓度的抗体偶联物共培养24小时。通过从裂解的靶细胞中释放的乳酸脱氢酶(LDH)的量来确定细胞毒性。在这些研究中，与huL5H2_DI-2xDUPA相比，用huL5H2_DI-1xDUPA观察到靶细胞杀伤的非显著性增加(图26和图27)。
PSMA竞争试验
为了确定可溶性PSMA是否能负面影响huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA抗体偶联物的活性，使用人PBMC或Jurkat T细胞建立了竞争试验，该人PBMC或Jurkat T细胞稳定地表达由活化T细胞核因子(NFAT)响应元件(Jurkat NFAT-Luc,Invivogen)驱动的萤火虫萤光素酶基因。在使用人PBMC的试验中，将1 x 105个PBMC和1 x 104个靶细胞(C4-2)在20pM huL5H2_DI抗体偶联物和不同浓度的人PSMA(huPSMA，R&D System)的存在下共培养。24小时后，通过测量所释放的乳酸脱氢酶(LDH)的量来确定靶细胞裂解。类似地，将2 x 105个Jurkat NFAT-Luc细胞和2 x 104个C4-2细胞在50pM huL5H2_DI抗体偶联物和不同浓度的人PSMA(huPSMA，R&D System)的存在下共培养24小时。根据制造商的说明，使用GaussiaLuciferase Glow Assay试剂盒(Pierce)测量萤光素酶的产生。在这些研究中，可溶性huPSMA(最高达10nM)不干扰两种huL5H2_DI抗体偶联物针对PSMA阳性细胞重定向人PBMC(图28和图29)。在相同程度上，在含有huL5H2_DI-1xDUPA或huL5H2_DI-2xDUPA的培养物中仅观察到较高浓度的huPSMA(≥1nM)抑制T细胞活化。
Jurkat活化试验
为了验证具有最小试验间变异的huL5H2_DI-1xDUPA或huL5H2_DI-2xDUPA的不同生产批次(DUPA来源列为P0####；化学表明盐状态，图30)的活性，使用稳定的Jurkat T细胞系建立T细胞活化试验，该Jurkat T细胞系表达由六个NFAT响应元件(Jurkat NFAT-Luc,Invivogen)驱动的萤火虫萤光素酶基因。如先前实施例4中所述，将2 x 105个JurkatNFAT-Luc细胞和2 x 104个靶细胞在不同浓度的抗体偶联物的存在下共培养。包括12-肉豆蔻酸13-乙酸佛波醇酯(PMA)和离子霉素(ION)处理的细胞作为对照。24小时后，按照制造商的说明，使用Gaussia Luciferase Glow Assay试剂盒(Pierce)测量萤光素酶产生。将实验值相对于从PMA和ION处理的细胞或重组萤光素酶(重组Lucia，Invivogen)收集的吸光度进行归一化(图31A和图31B)。图31B中的每个柱条表示在含有特殊处理样品的每个板上的含有重组Lucia的两个孔的平均RLU值。该数据表明在读取期间的最小板间变异。
血清稳定性
为了确定血清中的降解、活性损失或增加，将0.5mg/ml偶联物添加至正常CD1小鼠、人(图33A)、大鼠和食蟹猴(图33B)中，然后在培养箱中在37℃下温育最长48小时。如图32所示，通过KappaSelect亲和树脂纯化所述偶联物并在LCMS-QTOF和SDS-PAGE上进行高分辨率质谱法。此外，收集/过滤暴露于各种血清的偶联物，并在小鼠和人血清(图33A)以及大鼠和猴血清(图33B)中使用PMSA阳性前列腺癌细胞C4-2和PSMA阴性DU145细胞来测试细胞毒性。针对小鼠和人血清(图34A)以及大鼠和猴血清(图34B)，测量在前列腺癌细胞的存在下细胞因子从T细胞的释放。对于huL5H2_DI-1xDUPA或huL5H2_DI-2xDUPA抗体偶联物，在48小时内未观察到在结构上的明显变化或活性/功能的损失。
体内：C4-2异种移植模型
向6至8周龄的雄性NOD.Cg-PrkdcscidIL2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠皮下(SC)植入1 x106个在基质胶(Corning)中的C4-2细胞。一旦肿瘤大小达到约150-200mm3，即经由腹膜内(IP)输注20 x 106个人活化T细胞或10 x 106个人PBMC，并且在第二天开始用指定剂量的huL5H2-DI抗体偶联物进行每日静脉内(IV)治疗，并进行10天。使用外部卡尺每3天监测肿瘤生长，并使用下式计算：(1 x w x h)/2。在治疗期间每天和在治疗后每3天使用电子秤测量体重。
为了比较huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA在体内环境中的功效，荷瘤小鼠腹膜内(IP)接受20 x 106个人活化T细胞，并且每日静脉内(IV)注射剂量为0.05mg/kg、0.2mg/kg和1.0mg/kg的抗体偶联物，共10个剂量(图35A)。在此，在用0.2mg/kg或1mg/kg的huL5H2_DI-1xDUPA或huL5H2_DI-2xDUPA治疗的动物中，肿瘤消退是相当的(图35B，箭头表示1mg/kg)。然而，在以1mg/kg的两种抗体偶联物给药的小鼠中观察到显著的体重损失(图35C)。
为了避免以上观察到的显著体重损失，以需要每隔一天给药的替代治疗方案评估huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA的抗肿瘤活性。如先前实施例4中所述，C4-2荷瘤小鼠腹膜内(IP)接受20 x 106个人活化T细胞，并且每日一次(QD)或隔日一次(QOD)静脉内(IV)注射0.2mg/kg的抗体偶联物，共10个剂量。平行地，无肿瘤小鼠也接受相同的治疗方案。在第5次(QD)或第3次(QOD)剂量后收集血浆，以使用BD CBA人Th1/Th2试剂盒II(图37A)和BD CBA小鼠炎症试剂盒(BD Biosciences，图37B)来测量体内细胞因子。在BD Accuri C6上获得样品，并使用FCAP Array软件进行分析。无论治疗日程如何，对于两种huL5H2_DI抗体偶联物，肿瘤消退是相当的(图36B)。图36C示出了在用人T细胞重建的NSG小鼠模型中，huL5H2_DI-2xDUPA或huL5H2_DI-1xDUPA的隔日一次(QOD)注射日程证明了类似的剂量依赖性体内抗肿瘤活性。与huL5H2_DI-1xDUPA相比，观察到huL5H2_DI-2xDUPA导致了更大的体重损失(图38A和图38B)。图38C示出了在没有肿瘤的情况下测量体重损失的对照实验。
为了确定单独的huL5H2_DI抗体偶联物是否在NSG小鼠中引起毒性，无肿瘤动物每日接受0.2mg/kg的huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA注射，共10个剂量(图39A)。最后一次注射后24小时，对动物施以安乐死进行取样。收集血液以供使用scil Vet abc(scil)进行血细胞分析，并使用Spotchem EZ(scil)确定血浆化学谱(血小板；图40A；血细胞，图40B，肾功能，图40C；肝功能，图40D；和混杂分析物，图40E)，并收获指定的器官用于H&E染色(组织处理、染色和由Histotox提供的评分)(表29和表30)。在此，没有观察到体重损失或血细胞数目和血清蛋白质水平的异常，这提示huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA均不会在不存在T细胞的情况下诱导明显的毒性(作为总体重的函数，图39B，和体重损失百分比，图39C)。
表29
表30
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为了比较huL5H2_DI-1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA在使用人PBMC代替活化T细胞的体内环境中的功效，荷瘤小鼠腹膜内(IP)接受10 x 106个人PBMC，并且每日静脉内(IV)注射0.2mg/kg的抗体偶联物，共23个剂量(图41和表31)。在第20次给药后，收集血液并针对CD3、CD4和CD8T细胞进行染色。在最后一次给药后24小时，收集血液以供使用scil Vet abc(scil)进行血细胞分析，并使用Spotchem EZ(scil)进行血浆化学分析(图44A-C，图45A-E)，并且收获指示的器官以用于H&E染色(组织处理、染色和由Histotox提供的评分)(表32和表33，AVG＝平均值)。在此，在C4-2异种移植模型中使用人PBMC代替扩充的T细胞导致延迟的huL5H2_DI1xDUPA和huL5H2_DI-2xDUPA的抗肿瘤活性，其中1xDUPA提供了边际优势(图42)。在仅接受huL5H2_DI-2xDUPA的小鼠中观察到体重损失，这对应于肿瘤消退的开始阶段(每条线＝一只小鼠，图43)。在单独接受PBMC的小鼠中观察到移植物抗宿主病(GvHD)的迹象，这与huL5H2-DI治疗无关。然而，没有明显毒性(即体重损失，血细胞分析和化学异常，以及组织损伤)与huL5H2_DI-1xDUPA治疗相关。
表31
表32
表33
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小鼠PK试验
在时间0点向雄性C57BL/6J小鼠(Jackson实验室)静脉内注射1mg/kg偶联物(n＝3只小鼠/组)。48小时内定期收集血液，并加工为血浆。通过来自Meso Scale Discovery的电化学发光技术对样品进行定量。捕获物为重组人PSMA(R&D System)，并且检测抗体为CaptureSelect生物素抗IgG-CH1偶联物(Life Technologies)。使用Phoenix WinNonlin6.3软件(Certara USA，Inc)通过非房室分析确定药代动力学参数。与huL5H2-DI_1xDUPA相比，huL5H2-DI_2xDUPA显示出延长的暴露(表34和图46)。
表34
t1/2(hr) C最大(ng/mL) AUC最终(ng*hr/mL) AUC无限(ng*hr/mL)
huL5H2-DI_1xDUPA 5.87 18348 14228 14244
huL5H2-DI_1xDUPA 9.08 22789 43950 43980
表35
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表36
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表37
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表38
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表39
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Claims (11)

1.结合CD3的抗体，其包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:32，并且所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:27。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包含SEQ ID NO:111或112的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，其包含SEQ ID NO:86或98的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体，其包含非天然氨基酸。
5.根据权利要求4所述的抗体，其中所述非天然氨基酸位于：轻链恒定域序列，重链恒定域序列，或者所述轻链恒定域序列和所述重链恒定域序列之内。
6.根据权利要求4所述的抗体，其中该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸。
7.根据权利要求1所述的抗体，其包含与SEQ ID NO:44具有至少95％的同一性的重链序列。
8.根据权利要求1或7所述的抗体，其包含与SEQ ID NO:39具有至少95％同一性的轻链序列。
9.一种组合物，其包含根据权利要求1-8中任一项所述的抗体和细胞靶向分子。
10.一种组合物，其包含经由非天然氨基酸与根据权利要求4-6中任一项所述的抗体连接的细胞靶向分子。
11.根据权利要求9或10所述的组合物，其中所述细胞靶向分子与前列腺特异性膜抗原(PSMA)或叶酸受体相互作用。
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