ES2750649T3

ES2750649T3 - Construcciones de anticuerpos multiespecíficos

Info

Publication number: ES2750649T3
Application number: ES15732228T
Authority: ES
Inventors: Pallavi Bhatta; Emma Dave; Sam Philip Heywood; David Paul Humphreys
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2020-03-26
Anticipated expiration: 2035-06-25
Also published as: MY176332A; PL3161007T3; SI3161007T1; RU2020115720A3; IL249003B; LT3161007T; US20170204200A1; MY195318A; AU2015279128A1; RS59416B1; CA2951609A1; ES2866398T3; HUE046027T2; EP3556777A1; CY1122175T1; RU2017102193A3; JP6765974B2; ME03539B; US20220267476A1; PT3556777T

Abstract

Una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende o que consiste en: a) una cadena de polipéptido de fórmula (I): VH-CH1-X-V1; y b) una cadena de polipéptido de fórmula (II): VL-CL-Y-V2; en donde: VH representa un dominio variable de la cadena pesada; CH1 representa un dominio de una región constante de cadena pesada, por ejemplo el dominio 1 de la misma; X representa un enlace o conector; Y representa un enlace o conector; V1 representa un dsFv o un dsscFv; VL representa un dominio variable de la cadena ligera; CL representa un dominio de una región constante de la cadena ligera, como Ckappa; V2 representa dsFv o un dsscFv.

Description

DESCRIPCIÓN

Construcciones de anticuerpos multiespecíficos

La presente descripción se refiere a ciertas construcciones de anticuerpos multiespecíficos, formulaciones farmacéuticas que comprenden la construcción, ADN que codifica las construcciones y vectores que comprenden la misma. La descripción también se extiende a un método para expresar las construcciones, por ejemplo en una célula hospedante y a métodos para formular las mismas como una composición farmacéutica. La descripción también se refiere al uso de las construcciones y formulaciones de anticuerpos multiespecíficos en un tratamiento. Existen una serie de planteamientos para generar anticuerpos biespecíficos, muchos de los cuales se basan en un formato originalmente descrito por Morrison et al. (Coloma y Morrison 1997, Nat Biotechnol. 15, 159-163) que implican la fusión de fragmentos variables monocatenarios (scFv) con anticuerpos completos, p. ej., IgG, o con fragmentos de anticuerpos Fab, Schoonjans et al., 2000, Journal of Immunology, 165, 7050-7057.

Mertens et al., 2004, Cáncer Biotherapy and Radiopharmaceuticals, 19, 1, 99-109 describe un fragmento Fab unido a dos moléculas de scFv, conocido como tricuerpo. El documento WO2013/068571 describe un fragmento Fab unido a una sola molécula de dsscFv. El documento US2010/081796 describe una IgG unida a dos moléculas de dsscFv. En el caso de Fab-scFv, los dominios V^hy V^lde los scFv usados en dichas moléculas biespecíficas y triespecíficas en general se mantienen unidos por conectores peptídicos. Sin embargo, para ciertas combinaciones de dominios variables V^hy V^l, los conectores peptídicos no pueden conferir suficiente estabilidad al scFv, dando como resultado "respiración" de dominios variables y emparejamiento intermolecular promiscuo con dominios variables y, por lo tanto, una tendencia a formar multímeros a través de la parte Fv monocatenaria del mismo. Esto se ilustra en la Figura 1 en el contexto de una molécula biespecífica.

Los autores de la presente invención han rediseñado las moléculas de anticuerpos multiespecíficos afectadas para proporcionar moléculas de anticuerpos con funcionalidad equivalente, a la vez que se minimiza la multimerización en la etapa de expresión y/o después de purificación. Esto facilita aumentar el rendimiento del material "monomérico" obtenido y proporciona moléculas de estabilidad adecuada para usar en el tratamiento después de la purificación, concentración y formulación.

Por lo tanto, en un aspecto, se proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende o que consiste en:

a) una cadena de polipéptido de fórmula (I):

V^h-CHⁱ-X-Vⁱ;

y

b) una cadena de polipéptido de fórmula (II):

V^l-C^l-Y-V²;

en donde:

V^hrepresenta un dominio variable de la cadena pesada;

CH1 representa un dominio de una región constante de cadena pesada, por ejemplo el dominio 1 de la misma;

X representa un enlace o conector;

Y representa un enlace o conector;

V1 representa un dsFv o un dsscFv;

V^lrepresenta un dominio variable de la cadena ligera;

C^lrepresenta un dominio de una región constante de la cadena ligera, como Ckappa;

V2 representa dsFv o un dsscFv.

Ventajosamente, las moléculas de anticuerpos multiespecíficos de la presente descripción minimizan la cantidad de agregación observada después de la purificación y maximizan la cantidad de monómero en las formulaciones de la construcción en concentraciones farmacéuticas, incluyendo el mantenimiento de altos niveles de monómero a lo largo del tiempo tras el almacenamiento, por ejemplo el monómero puede estar presente como 50%, 60%, 70% o 75% o más, tal como 80 o 90% o más, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% o más de la proteína total.

Descripción detallada de la invención

"Anticuerpo multiespecífico" como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de anticuerpo como se describe en la presente memoria que tiene dos o más dominios de unión, por ejemplo dos o tres dominios de unión. En una realización, la construcción de anticuerpo es un anticuerpo triespecífico.

"Anticuerpo triespecífico" como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula de anticuerpo con tres sitios de unión al antígeno, que puede unir independientemente el mismo o diferentes antígenos. En un ejemplo, una molécula de anticuerpo triespecífico se une a dos antígenos diferentes, es decir, dos sitios de unión se unen al mismo antígeno y el tercer sitio de unión se une a un segundo antígeno diferente. Preferiblemente, los tres sitios de unión de una molécula de anticuerpo triespecífico de la invención se unen independientemente a tres antígenos diferentes.

En una realización, la construcción es un anticuerpo biespecífico.

"Molécula biespecífica" como se usa en la presente memoria se refiere a una molécula con dos sitios de unión al antígeno, que pueden unir el mismo o diferentes antígenos.

En una realización, todos los dominios se unen al mismo antígeno, que incluye la unión del mismo epítopo en el antígeno o la unión de diferentes epítopos en el antígeno.

En una realización, hay tres dominios de unión y cada uno de los tres dominios de unión se unen a antígenos diferentes (distintos).

En una realización, hay tres dominios de unión y dos dominios de unión se unen al mismo antígeno, que incluye la unión del mismo epítopo o epítopos diferentes en el mismo antígeno, y el tercer dominio de unión se une a un antígeno diferente (distinto).

El "sitio de unión al antígeno" como se usa en la presente memoria se refiere a una parte de la molécula, que comprende un par de regiones variables, en particular un par cognado que interacciona específicamente con el antígeno diana.

Los dominios de unión, como se usa en la presente memoria, incluyen un anticuerpo de dominio único, es decir, una región variable y sitios de unión al antígeno.

"Específicamente", como usa en la presente memoria, se pretende que se refiera a un sitio de unión o dominio de unión que solo reconoce el antígeno para el que es específico o un sitio de unión o dominio de unión que tiene una afinidad de unión significativamente mayor por el antígeno para el que es específico en comparación con la afinidad por antígenos para los que no es específico, por ejemplo, afinidad de unión 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces mayor.

La afinidad de unión se puede medir mediante un ensayo convencional, por ejemplo, resonancia de plasmón superficial, tal como BIAcore.

En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente descripción se proporciona como un dímero de una cadena pesada y ligera de:

Fórmula (I) y (II) respectivamente, en donde la parte V^h-CH1 junto con la parte V^l-C^lforman un fragmento Fab o Fab' funcional.

V^hrepresenta un dominio variable, por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada. En una realización, V^hrepresenta un dominio variable de cadena pesada. En una realización, V^hes un dominio variable quimérico, es decir, comprende componentes derivados de al menos dos especies, por ejemplo, una región armazón humana y CDR no humanas. En una realización, V^hse humaniza. En una realización, V^hes humano.

V^lrepresenta un dominio variable, por ejemplo, un dominio variable de cadena ligera. En una realización, V^lrepresenta un dominio variable de cadena ligera. En una realización, V^les un dominio variable quimérico, es decir, comprende componentes derivados de al menos dos especies, por ejemplo, una región armazón humana y CDR no humanas. En una realización, V^lse humaniza. En una realización, V^hse humaniza. En una realización, V^hes humano

En general, V^hy V^ljuntos forman un dominio de unión al antígeno. En una realización, V^hy V^lforman un par cognado.

"Par cognado" como se usa en la presente memoria se refiere a un par de dominios variables de un único anticuerpo, que se generó in vivo, es decir, el emparejamiento natural de los dominios variables aislados de un hospedante. Un par cognado es, por lo tanto, un par V^hy V^l. En un ejemplo, el par cognado se une al antígeno cooperativamente.

"Región variable" como se usa en la presente memoria se refiere a la región en una cadena de anticuerpo que comprende las CDR y una región armazón, en particular una región armazón adecuada.

Las regiones variables para usar en la presente descripción en general se obtendrán de un anticuerpo, que se puede generar por cualquier método conocido en la técnica.

"Derivado de", como se usa en la presente memoria, se refiere al hecho de que la secuencia empleada o una secuencia muy similar a la secuencia empleada se obtuvo a partir del material genético original, tal como la cadena ligera o pesada de un anticuerpo.

"Muy similar", como se usa en la presente memoria, pretende referirse a una secuencia de aminoácidos que a lo largo de toda su longitud es 95% similar o más, tal como 96, 97, 98 o 99% similar.

Las regiones variables para usar en la presente invención, como se ha descrito antes en la presente memoria para V^hy V^l, pueden ser de cualquier fuente adecuada y pueden ser, por ejemplo, completamente humanas o humanizadas.

En una realización, el dominio de unión formado por V^hy V^les específico para un primer antígeno.

En una realización, el dominio de unión formado por V1 es específico para un segundo antígeno.

En una realización, el dominio de unión formado por V2 es específico para un segundo o tercer antígeno.

En una realización, el dominio CH1 es un dominio 1 natural de una cadena pesada de anticuerpo o un derivado de la misma.

En una realización, el fragmento C^l, en la cadena ligera, es una secuencia constante kappa o una secuencia constante lambda o un derivado de las mismas.

Un derivado de un dominio natural como se usa en la presente memoria pretende referirse a cuando uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos en una secuencia natural se han reemplazado o eliminado, por ejemplo para optimizar las propiedades del dominio, tal como eliminando propiedades indeseables, pero en donde se retiene o retienen la o las propiedades características del dominio.

En una realización, están presentes uno o más enlaces disulfuro entre cadenas naturales o genéticamente modificados (es decir, entre cadena ligera y pesada) en el fragmento Fab o Fab' funcional.

En una realización, un enlace disulfuro "natural" está presente entre un CH1 y C^len las cadenas de polipéptidos de Fórmula (I) y (II).

Cuando el dominio C^lderiva de Kappa o Lambda, la posición natural para una cisteína que forma enlace es 214 en cKappa y cLambda humanos (numeración de Kabat 4a edición, 1987).

La ubicación exacta del enlace disulfuro que forma la cisteína en CH1 depende del dominio particular realmente empleado. Por lo tanto, por ejemplo, en gamma-1 humana, la posición natural del enlace disulfuro se encuentra en la posición 233 (numeración de Kabat, 4a edición, 1987). Se conoce la posición de la cisteína que forma el enlace para otros isotipos humanos tales como gamma 2, 3, 4, IgM e IgD, por ejemplo, la posición 127 para IgM, IgE, IgG2, IgG3, IgG4 humanas y 128 de la cadena pesada de IgD e IgA2B humanas.

Opcionalmente puede haber un enlace disulfuro entre V^hy V^lde los polipéptidos de fórmula I y II.

En una realización, el anticuerpo multiespecífico según la descripción tiene un enlace disulfuro en una posición equivalente o correspondiente a la que se encuentra de forma natural entre CH1 y C^l.

En una realización, una región constante que comprende CH1 y una región constante tal como C^ltienen un enlace disulfuro que está en una posición que no se encuentra de forma natural. Esto se puede modificar genéticamente en la molécula mediante la introducción de cisteína(s) en la cadena de aminoácidos en la posición o posiciones requeridas. Este enlace disulfuro no natural es adicional o uno alternativo al enlace disulfuro natural presente entre CH1 y C^l. La(s) cisteína(s) en posiciones naturales se pueden reemplazar por un aminoácido tal como serina que no es capaz de formar un puente disulfuro.

La introducción de cisteínas genéticamente modificadas se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a mutagénesis con PCR de extensión por solapamiento, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de casete (véase, en general, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993). Están disponibles en el mercado kits de mutagénesis dirigida al sitio, p. ej., el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA). La mutagénesis en casete se puede llevar a cabo según Wells et al., 1985, Gene, 34: 315-323. Alternativamente, los mutantes se pueden hacer por síntesis génica total mediante reasociación, ligado y amplificación por PCR y clonación de oligonucleótidos que solapan.

En una realización, está completamente ausente un enlace disulfuro entre CH1 y Cl, por ejemplo, las cisteínas entre cadenas se pueden reemplazar por otro aminoácido, tal como serina. Por lo tanto, en una realización no hay enlaces disulfuro entre cadenas en el fragmento Fab funcional de la molécula. Descripciones tales como el documento WO2005/003170, describen cómo proporcionar fragmentos Fab sin un enlace disulfuro entre cadenas.

V1 representa un dsFv o un dsscFv.

V2 representa un dsFv o un dsscFv.

En una realización, V1 y V2 son ambos dsscFv.

En una realización, V1 y V2 son ambos dsFv. Cuando tanto V1 como V2 son dsFv, los dominios variables Vh o Vl son los mismos para V1 y V2. En una realización, V1 y V2 tienen el mismo dominio variable Vh. En otra realización, V1 y V2 tienen el mismo dominio variable Vl. En una realización, los dominios variables Vh y Vl son los mismos para V1 y V2. Esto último permite el entrecruzamiento que puede ser deseable para algunos objetivos.

En una realización, V1 es un dsscFv y V2 es un dsFv. En una realización, V1 es un dsFv y V2 es un dsscFv.

a) una cadena de polipéptido de fórmula (I):

V^h-CHⁱ-X-Vⁱ;

y

b) una cadena de polipéptido de fórmula (II):

V^l-C^l-Y-V²;

en donde:

V^hrepresenta un dominio variable de la cadena pesada;

CH1 representa un dominio de una región constante de la cadena pesada, por ejemplo el dominio 1 del mismo; X representa un enlace o conector;

Y representa un enlace o conector;

V1 representa un dsFv o un dsscFv;

V^lrepresenta un dominio variable de la cadena ligera;

C^lrepresenta un dominio de una región constante, por ejemplo, un dominio de región constante de la cadena ligera, tal como Ckappa;

V2 representa dsFv o un dsscFv;

"Fragmento variable monocatenario" o "scFv", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fragmento variable monocatenario que comprende o que consiste en un dominio variable de la cadena pesada (V^h) y un dominio variable de la cadena ligera (V^l) que está estabilizado por un conector peptídico entre los dominios variables V^hy V^l. Los dominios variables V^hy V^lpueden estar en cualquier orientación adecuada, por ejemplo, el extremo C del V^hpuede estar unido al extremo N del V^lo el extremo C del V^lpuede estar unido al extremo N del V^h.

"Fragmento variable monocatenario estabilizado por disulfuro" o "dsscFv" como se usa en la presente memoria se refiere a un fragmento variable monocatenario que está estabilizado por un conector peptídico entre el dominio variable V^hy V^ly también incluye un enlace disulfuro entre dominios entre V^hy V^l.

"Fragmento variable estabilizado por disulfuro" o "dsFv", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fragmento variable monocatenario que no incluye un conector peptídico entre los dominios variables V^hy V^ly, en cambio, está estabilizado por un enlace disulfuro entre dominios entre V^hy V^l.

"Anticuerpo de dominio único" o "sdAb" como se usa en la presente memoria se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio de anticuerpo variable monomérico único, tal como V^ho V^lo VHH.

En una realización, cuando V1 y/o V2 son un dsFv o un dsscFv, el enlace disulfuro entre los dominios variables V^hy V^lde V1 y/o V2 está entre dos de los restos citados a continuación (a menos que el contexto indique lo contrario se usa la numeración de Kabat en la lista a continuación). Dondequiera que se haga referencia a la numeración de Kabat, la referencia relevante es Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Sociales de EE.UU., NIH, EE.UU.

En una realización, el enlace disulfuro está en una posición seleccionada del grupo que comprende:

- V^h37 V^l95C, véase, por ejemplo, Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

- V^h44 V^l100 véase por ejemplo; Biochemistry 335451-5459 Reiter et al (1994); o Journal o Biological Chemistry vol. 269 No. 28 págs. 18327-18331 Reiter et al (1994); o Protein Engineering, vol.10 no.12 pág.1453-1459 Rajagopal et al. (1997);

- Vh44 Vl105 véase por ejemplo J Biochem. 118, 825-831, Luo et al. (1995);

- V^h45 V^l87 véase, por ejemplo, Protein Science 6, 781-788 Zhu et al. (1997);

- V^h55 V^l101 véase, por ejemplo, FEBS Letters 377135-139 Young et al. (1995);

-V ^h100 V^l50 véase, por ejemplo, Biochemistry 291362-1367 Glockshuber et al. (1990);

-VH100b Vl49;

- Vh98 Vl 46 véase, por ejemplo, Protein Science 6, 781-788 Zhu et al. (1997);

-V h101 Vl46;

- V^h105 V^l43 véase por ejemplo; Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 90 págs. 7538-7542 Brinkmann et al. (1993); o Proteins 19, 35-47, Jung et al. (1994),

- V^h106 V^l57 véase, por ejemplo, FEBS Letters 377135-139 Young et al. (1995)

y una posición correspondiente en una pareja de la región variable que se encuentra en la molécula.

En una realización, el enlace disulfuro se forma entre las posiciones Vh44 y Vl100.

Los pares de aminoácidos citados antes están en las posiciones favorables para la sustitución por cisteínas de modo que se puedan formar enlaces disulfuro. Las cisteínas se pueden modificar por ingeniería genética en estas posiciones deseadas mediante técnicas conocidas. Por lo tanto, en una realización, una cisteína genéticamente modificada de acuerdo con la presente descripción se refiere a donde el resto natural en una posición de aminoácido dada se ha sustituido por un resto cisteína.

La introducción de cisteínas genéticamente modificadas se puede llevar a cabo usando cualquier método conocido en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis por PCR de extensión por solapamiento, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de casete (véase, en general, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993). Están disponibles en el mercado kits de mutagénesis dirigida al sitio, p. ej., el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene, La Jolla,

CA). La mutagénesis en casete se puede llevar a cabo según Wells et al., 1985, Gene, 34: 315-323.

Alternativamente, los mutantes se pueden hacer por síntesis génica total mediante reasociación, ligado y amplificación por PCR y clonación de oligonucleótidos que solapan.

Por consiguiente, en una realización cuando V1 y/o V2 son un dsFv o un dsscFv, los dominios variables Vh y Vl de V1 y/o los dominios variables Vh y Vl de V2 pueden estar unidos por un enlace disulfuro entre dos restos cisteína, en donde la posición del par de restos cisteína se selecciona del grupo que consiste en: V^h37 y V^l95, V^h44 y V^l100,

Vh44 y Vl105, Vh45 y Vl87, Vh100 y Vl50, VH100b y Vl49, Vh98 y Vl46, Vh101 y Vl46, Vh1 Vl57.

En una realización cuando V1 y/o V2 son un dsFv o un dsscFv, los dominios variables VHy VLde V1 y/o los dominios variables Vh y Vl de V2 pueden estar unidos por un enlace disulfuro entre dos restos cisteína, uno en Vh y otro en Vl, que están fuera de las CDR en donde la posición del par de restos cisteína se selecciona del grupo que consiste en

V^h37 y V^l95, V^h44 y V^l100, V^h44 y V^l105, V^h45 y V^l87, V^h100 y V^l50, V^h98 y V^l46, V^h105 y V^l43 y V^h106 y V^l57.

En una realización, cuando V1 es un dsFv o un dsscFv, los dominios variables Vh y Vl de V1 están unidos por un enlace disulfuro entre dos restos cisteína genéticamente modificados, uno en la posición Vh44 y el otro en Vl100.

En una realización, cuando V2 es un dsFv o un dsscFv, los dominios variables Vh y Vl de V2 están unidos por un enlace disulfuro entre dos restos cisteína genéticamente modificados, uno en la posición V^h44 y el otro en V^l100.

En una realización, cuando V1 es un dsFv o un dsscFv, el dominio Vh de V1 está unido a X. En una realización, cuando V1 es un dsFv o un dsscFv, el dominio Vl de V1 está unido a X.

En una realización cuando V2 es un dsFv o un dsscFv, el dominio Vh de V2 está unido a Y.

En una realización, cuando V2 es un dsFv o un dsscFv, el dominio Vl de V2 está unido a Y.

El experto apreciará que cuando V1 y/o V2 representan un dsFv, el anticuerpo multiespecífico comprenderá un tercer polipéptido que codifica el correspondiente dominio Vh o Vl libre que no está unido a X o Y. Cuando V1 y V2 son ambos un dsFv entonces el "dominio variable libre" (es decir, el dominio unido por un enlace disulfuro al resto del polipéptido) será común a ambas cadenas. Por lo tanto, mientras que el dominio variable real fusionado o unido por X o Y al polipéptido puede ser diferente en cada cadena de polipéptido, los dominios variables libres emparejados con el mismo en general serán idénticos entre sí.

En una realización, X es un enlace.

En una realización, Y es un enlace.

En una realización, tanto X como Y son enlaces.

En una realización, X es un conector, preferiblemente un conector peptídico, por ejemplo un péptido adecuado para conectar las partes CH1 y V1.

En una realización, Y es un conector, preferiblemente un conector peptídico, por ejemplo un péptido adecuado para conectar las partes Cl y V2.

En una realización, tanto X como Y son conectores. En una realización, tanto X como Y son conectores peptídicos. La expresión "conector peptídico" como se usa en la presente memoria se refiere a un péptido compuesto de aminoácidos. El experto en la técnica conocerá una variedad de conectores peptídicos adecuados.

En una realización, el conector peptídico tiene 50 aminoácidos de longitud o menos, por ejemplo 20 aminoácidos o menos, tal como aproximadamente 15 aminoácidos o menos, tal como 9, 10, 11, 12, 13 o 14 aminoácidos de longitud.

En una realización, el conector se selecciona de una secuencia mostrada en la secuencia 1 a 67.

En una realización, el conector se selecciona de una secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En una realización, X tiene la secuencia SGGGGTGGGGS (SEQ ID NO: 1).

En una realización, Y tiene la secuencia SGGGGTGGGGS (SEQ ID NO: 1).

En una realización, X tiene la secuencia SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 2). En una realización, Y tiene la secuencia SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 2).

En una realización, X tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 e Y tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 2. En una realización, X tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 69 o 70. En una realización, Y tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 69 o 70. En una realización, X tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 69 e Y tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 70.

Tabla 1. Secuencias de conectores bisagra

Tabla 2: Secuencias de conectores flexibles

(S) es opcional en las secuencias 14 a 18.

Los ejemplos de conectores rígidos incluyen las secuencias de péptidos GAPAPAAPAPA (SEQ ID NO: 52), PPPP (SEQ ID NO: 53) y PPP.

En una realización el conector peptídico es un péptido de unión a albúmina.

Se proporcionan ejemplos de péptidos de unión a albúmina en el documento WO2007/106120 e incluyen:

Tabla 3

Ventajosamente el uso de péptidos de unión a albúmina como un conector puede aumentar la semivida de la molécula de anticuerpo multiespecífico.

En una realización cuando V1 es un dsscFv, hay un conector, por ejemplo un péptido adecuado, para conectar los dominios variables Vh y Vl de V1.

En una realización cuando V2 es un dsscFv, hay un conector, por ejemplo un péptido adecuado, para conectar los dominios variables Vh y Vl de V2.

En una realización el péptido conector en el dsscFv tiene una longitud en el intervalo de aproximadamente 12 a 25 aminoácidos, tal como de 15 a 20 aminoácidos.

En una realización cuando V1 es un dsscFv, el conector que conecta los dominios variables Vh y Vl de V1 tiene la secuencia GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 68).

En una realización cuando V2 es un dsscFv, el conector que conecta los dominios variables Vh y Vl de V2 tiene la secuencia GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 68).

En una realización cuando V1 es un dsscFv, el conector que conecta los dominios variables Vh y Vl de V1 tiene la secuencia SGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 69).

En una realización cuando V2 es un dsscFv, el conector que conecta los dominios variables Vh y Vl de V2 tiene la secuencia SGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 69)

En una realización cuando V1 es un dsscFv, el conector que conecta los dominios variables Vh y Vl de V1 tiene la secuencia SGGGGSGGGGTGGGGS (SEQ ID NO: 70).

En una realización cuando V2 es un dsscFv, el conector que conecta los dominios variables Vh y Vl de V2 tiene la secuencia SGGGGSGGGGTGGGGS SEQ ID NO: 70).

Por consiguiente, en un aspecto se proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico, que comprende o consiste en:

a) una cadena de polipéptido de fórmula (I):

V^h-CHⁱ-X-Vⁱ;

y

b) una cadena de polipéptido de fórmula (II):

V^l-C^l-Y-V²;

en donde:

Vh representa un dominio variable de la cadena pesada;

CH1 representa un dominio de una región constante de la cadena pesada, por ejemplo su dominio 1;

X representa un enlace o conector;

Y representa un enlace o conector;

V1 representa un dsFv o un dsscFv;

Vl representa un dominio variable de la cadena ligera;

Cl representa un dominio de una región constante de la cadena ligera, como Ckappa;

V2 representa dsFv o un dsscFv.

La presente descripción también proporciona secuencias que son 80%, 90%, 91%, 92%, 93% 94%, 95% 96%, 97%, 98% o 99% similares a una secuencia descrita en la presente memoria.

La "identidad", como se usa en la presente memoria, indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el resto de aminoácido es idéntico entre las secuencias.

"Similitud", como se usa en la presente memoria, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el resto de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, la leucina puede ser sustituida por isoleucina o valina. Otros aminoácidos que a menudo se pueden sustituir entre sí incluyen, pero no se limitan a:

- fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas);

- lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas);

- aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas);

- asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida); y

- cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre).

Los grados de identidad y similitud se puede calcular fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, el software BLAST™ disponible en NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. y States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. y Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).

Los anticuerpos para usar en las construcciones multiespecíficas de la presente invención se pueden generar por cualquier método adecuado conocido en la técnica.

Los anticuerpos generados contra un polipéptido antigénico se pueden obtener, cuando la inmunización de un animal es necesaria, administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente un animal no humano, usando protocolos conocidos y de rutina, véase, por ejemplo, Handbook of Experimental Immunology, D.M. Weir (ed.), Vol.

4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Se pueden inmunizar muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos o cerdos. Sin embargo, los ratones, conejos, cerdos y ratas son generalmente los más adecuados.

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por cualquier método conocido en la técnica, tal como la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al. 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de hibridoma de EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, pág. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

Los anticuerpos también se pueden generar usando métodos de anticuerpos de linfocitos individuales clonando y expresando ADNc de la región variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al 1996, Proc . Natl. Acad. Sci. USA 93 (15): 7843-78481; WO92/02551; WO2004/051268 y WO2004/106377.

Los anticuerpos para usar en la presente descripción también se pueden generar usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica e incluyen los descritos por Brinkman et al. (en J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol.

1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 1879-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) y documentos WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; y US 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743; 5.969.108 y WO20011/30305.

En una realización, las moléculas multiespecíficas según la descripción se humanizan.

Humanizado (que incluye anticuerpos injertados con CDR) como se usa en la presente memoria se refiere a moléculas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una especie no humana y una región armazón de una molécula de inmunoglobulina humana (véase, p. ej., los documentos US 5.585.089; WO91/09967). Se apreciará que puede ser necesario solo transferir los restos determinantes de la especificidad de las CDR en lugar de la CDR completa (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Opcionalmente, los anticuerpos humanizados pueden comprender además uno o más restos de la región armazón derivados de la especie no humana de la que derivaron las CDR.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "molécula de anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula de anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDR (que incluyen, si se desea, una o más CDR modificadas) de un anticuerpo donador (p. ej. un anticuerpo monoclonal murino) injertadas en una región armazón de la región variable de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (p. ej., un anticuerpo humano). Para una revisión, véase Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. En una realización, en lugar de transferir la CDR completa, solo se transfieren uno o más de los restos determinantes de la especificidad de una cualquiera de las CDR descritas anteriormente en la presente memoria a la región armazón del anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una realización, solo se transfieren los restos determinantes de la especificidad de una o más de las CDR descritas anteriormente en la presente memoria a la región armazón del anticuerpo humano. En otra realización, solo se transfieren los restos determinantes de la especificidad de cada una de las CDR descritas anteriormente en la presente memoria a la región armazón del anticuerpo humano.

Cuando se injertan las CDR o los restos determinantes de la especificidad, se puede usar cualquier secuencia de región armazón de la región variable aceptora adecuada, teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donador del que derivan las CDR, que incluyen regiones armazón de ratón, primate y humana. Adecuadamente, el anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones armazón de aceptor humanas, así como una o más de las CDR proporcionadas en la presente memoria.

Ejemplos de regiones armazón humanas que se pueden usar en la presente descripción son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al. véase antes). Por ejemplo, KOL y NEWM se pueden usar para la cadena pesada, REI se puede usar para la cadena ligera y EU, lAy y POM se pueden usar tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Alternativamente, se pueden usar secuencias de línea germinal humana; estas están disponibles en: http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php.

En una molécula de anticuerpo humanizado de la presente descripción, las cadenas pesadas y ligeras del aceptor no necesitan necesariamente proceder del mismo anticuerpo y pueden, si se desea, comprender cadenas compuestas que tengan regiones armazón derivadas de diferentes cadenas.

Las regiones armazón no necesitan tener exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los restos inusuales se pueden cambiar a restos más frecuentes para esa clase o tipo de cadena de aceptor. Alternativamente, los restos seleccionados en las regiones armazón del aceptor se pueden cambiar de modo que correspondan al resto encontrado en la misma posición en el anticuerpo donador (véase Reichmann et al 1998, Nature, 332, 323-324). Dichos cambios deben mantenerse al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donador. En el documento WO91/09967 se expone un protocolo para seleccionar restos en las regiones armazón del aceptor que puede ser necesario cambiar.

Los derivados de las regiones armazón pueden tener 1, 2, 3 o 4 aminoácidos sustituidos por un aminoácido alternativo, por ejemplo por un resto del donador.

Los restos del donador son restos del anticuerpo donador, es decir, el anticuerpo del que derivaron originalmente las CDR. Los restos del donador se pueden sustituir por un resto adecuado derivado de una región armazón de receptor humano (restos del aceptor).

En una realización, los anticuerpos multiespecíficos de la presente descripción son completamente humanos, en particular uno o más de los dominios variables son completamente humanos.

Las moléculas completamente humanas son aquellas en las que las regiones variables y las regiones constantes (cuando están presentes) tanto de las cadenas pesadas como ligeras son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos completamente humanos pueden incluir anticuerpos producidos, por ejemplo, por métodos de presentación en fagos descritos anteriormente y anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de la región variable y opcionalmente la constante de la inmunoglobulina murina se han sustituido por sus homólogos humanos, p. ej., como se describe en términos generales en los documentos EP0546073, US5.545.806, US5.569.825, US5.625.126, US5.633.425, US5.661.016, US5.770.429, EP 0438474 y EP0463151.

En una realización, las moléculas de anticuerpos multiespecíficos de la descripción se pueden unir selectivamente a dos, tres o más antígenos diferentes de interés.

En una realización, los antígenos de interés unidos por el dominio de unión al antígeno formado por Vh/Vl, o V1 o V2 se seleccionan independientemente de una proteína asociada a la célula, por ejemplo, una proteína de la superficie celular en células tales como células bacterianas, células de levaduras, células T, células B, células endoteliales o células tumorales, y una proteína soluble.

Los antígenos de interés también pueden ser cualquier proteína médicamente relevante tal como las proteínas reguladas por aumento durante la enfermedad o infección, por ejemplo receptores y/o sus ligandos correspondientes. Los ejemplos particulares de antígenos incluyen receptores de superficie celular tales como receptores de señalización de células T o células B, moléculas coestimuladoras, inhibidores de punto de control, receptores de linfocitos citolíticos naturales, receptores de inmunoglobulina, receptores de la familia TNFR, receptores de la familia B7, moléculas de adhesión, integrinas, receptores de citoquinas/quimioquinas, GPCR, receptores de factor de crecimiento, receptores de quinasa, antígenos específicos de tejido, antígenos de cáncer, receptores de reconocimiento de patógenos, receptores de complemento, receptores hormonales o moléculas solubles tales como citoquinas, quimioquinas, leucotrienos, factores de crecimiento, hormonas o enzimas o canales iónicos, epítopos, fragmentos y sus formas de modificación postraduccional.

En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico de la descripción se puede usar para alterar funcionalmente la actividad del(de los) antígeno(s) de interés. Por ejemplo, la proteína de fusión de anticuerpo puede neutralizar, antagonizar o agonizar la actividad de dicho antígeno, directa o indirectamente.

En una realización, V1 y V2 son específicos para el mismo antígeno, por ejemplo, se unen al mismo o a un epítopo diferente en el mismo. En una realización, V1 es específico para la albúmina de suero humano. En una realización, V2 es específico para albúmina de suero humano. En una realización, V1 y V2 son específicos para dos antígenos diferentes.

En una realización, V1 y V2 son específicos para los mismos antígenos, por ejemplo, los mismos o diferentes epítopos en el mismo antígeno.

En una realización, un antígeno de interés unido por Vh/Vl o V1 o V2 proporciona la capacidad de reclutar funciones efectoras, tales como la activación de la ruta del complemento y/o el reclutamiento de células efectoras.

El reclutamiento de la función efectora puede ser directo en cuanto que la función efectora está asociada con una célula, teniendo dicha célula una molécula de reclutamiento en su superficie. El reclutamiento indirecto puede ocurrir cuando la unión de un antígeno a un dominio de unión al antígeno (tal como V1 o V2) en la molécula de acuerdo con la presente descripción a un polipéptido de reclutamiento produce la liberación de, por ejemplo, un factor que a su vez puede reclutar directa o indirectamente la función efectora, o puede ser a través de la activación de una ruta de señalización. Los ejemplos incluyen IL2, IL6, IL8, IFN^y, histamina, C1q, opsonina y otros miembros de las cascadas de activación del complemento clásicas y alternativas, tales como C2, C4, C3-convertasa y C5 a C9.

Como se usa en la presente memoria, "un polipéptido de reclutamiento" incluye un F^cyR tal como F^cyRI, F^cyRII y FcyRIII, una proteína de la ruta del complemento tal como, pero sin limitación, C1q y C3, una proteína marcadora de CD (marcador de Grupo de Diferenciación) o un fragmento del mismo que retiene la capacidad de reclutar la función efectora mediada por células directa o indirectamente. Un polipéptido de reclutamiento también incluye moléculas de inmunoglobulina tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgA que tienen función efectora.

En una realización, un dominio de unión al antígeno (tal como V1 o V2 o Vh/Vl) en la molécula de anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente descripción tiene especificidad para una proteína de la ruta del complemento, siendo particularmente preferida C1q.

Además, las moléculas de anticuerpos multiespecíficos de la presente descripción se pueden usar para quelar radionucleidos en virtud de un anticuerpo de dominio único que se une a una proteína quelante de nucleidos. Dichas proteínas de fusión son útiles en la obtención de imágenes o en planteamientos de tratamiento con radionúclidos. En una realización, un dominio de unión al antígeno dentro de una molécula de acuerdo con la descripción (tal como V1 o V2 o Vh/Vl) tiene especificidad para una proteína transportadora del suero, una molécula de inmunoglobulina en la circulación o CD35/CR1, por ejemplo para proporcionar una semivida prolongada al fragmento de anticuerpo con especificidad para dicho antígeno de interés mediante la unión a dicha proteína transportadora en el suero, molécula de inmunoglobulina en la circulación o CD35/CR1.

Como se usa en la presente memoria, las "proteínas transportadoras del suero" incluyen proteína de unión a tiroxina, transtiretina, a1-glicoproteína ácida, transferrina, fibrinógeno y albúmina, o un fragmento de cualquiera de las mismas.

Como se usa en la presente memoria, una "molécula de inmunoglobulina en la circulación" incluye IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, sIgA, IgM e IgD, o un fragmento de cualquiera de las mismas.

CD35/CR1 es una proteína presente en los glóbulos rojos que tienen una semivida de 36 días (intervalo normal de 28 a 47 días; Lanaro et al., 1971, Cáncer, 28 (3): 658-661) .

En una realización, el antígeno de interés para el cual V^h/V^ltiene especificidad es una proteína transportadora del suero, tal como un transportador del suero humano, tal como seroalbúmina humana.

En una realización, el antígeno de interés para el que V1 tiene especificidad es una proteína transportadora del suero, tal como un transportador del suero humano, tal como seroalbúmina humana.

En una realización, el antígeno de interés para el cual V2 tiene especificidad es una proteína transportadora del suero, tal como un transportador del suero humano, tal como seroalbúmina humana.

En una realización, solo uno de Vh/Vl, V1 o V2 tiene especificidad para una proteína transportadora del suero, tal como un transportador del suero humano, tal como seroalbúmina humana.

En una realización, un sitio de unión en la construcción de la presente descripción comprende 6 CDR, por ejemplo, SEQ ID NO: 71 para CDRH1, SEQ ID NO: 72 para CDRH2, SEQ ID NO: 73 para CDRH3, SEQ ID NO: 74 para CDRL1, SEQ ID NO: 75 para CDRL2 y SEQ ID NO: 76 para CDRL3.

En una realización, dichas 6 CDR de SEQ ID NO: 71 a 76 están en la posición de V^h/V^len las construcciones de la presente descripción. En una realización, dichas 6 CDR de SEQ ID NO: 71 a 76 están en la posición de V1 en las construcciones de la presente descripción. En una realización, dichas 6 CDR de SEQ ID NO: 71 a 76 están en la posición de V2 en las construcciones de la presente descripción. En una realización, dichas 6 CDR de SEQ ID NO: 71 a 76 están en la posición de V1 y V2 en las construcciones de la presente descripción. En una realización, dichos 6 CDR de SEQ ID NO: 71 a 76 están en la posición de Vh/Vl y V1 en las construcciones de la presente descripción. En una realización, dichas 6 CDR de SEQ ID NO: 71 a 76 están en la posición de Vh/Vl y V2 en las construcciones de la presente descripción.

En una realización, el sitio de unión de albúmina en una construcción de la presente descripción comprende un dominio variable pesado seleccionado de SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78 y un dominio variable de la cadena ligera seleccionado de SEQ ID NO: 79 y SEQ ID NO: 80, en particular SEQ ID ⁿO: 77 y 79 o SEQ ID NO: 78 y 80 para la cadena pesada y ligera, respectivamente. En una realización, estos dominios están en la posición de Vh/Vl en las construcciones de la presente descripción. En una realización, estos dominios variables están en la posición de V1. En una realización, estos dominios variables están en la posición de V2. En una realización, estos dominios variables están en la posición de V1 y V2. En una realización, estos dominios variables están en la posición de Vh/Vl y V1 en las construcciones de la presente descripción. En una realización, estos dominios variables están en la posición de Vh/Vl y V2 en las construcciones de la presente descripción. Cuando los dominios variables están en dos ubicaciones en las construcciones de la presente descripción, el mismo par de dominios variables puede estar en cada ubicación o se pueden usar dos pares diferentes de dominios variables.

En una realización, las moléculas de anticuerpos multiespecíficos de la presente descripción se procesan para proporcionar una afinidad mejorada por un antígeno o antígenos diana. Dichas variantes se pueden obtener mediante una serie de protocolos de maduración de afinidad que incluyen la mutación de las CDR (Yang et al. J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), barajado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), barajado de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), presentación en fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al. Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al (véase antes) describen estos métodos de maduración de afinidad.

La afinidad mejorada como se usa en la presente memoria en este contexto se refiere a una mejora frente a la molécula de partida.

Si se desea, una construcción de anticuerpo multiespecífico para usar en la presente descripción se puede conjugar con una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una sola molécula efectora o dos o más de dichas moléculas unidas de manera que formen un resto único que se puede unir a los anticuerpos de la presente invención. Cuando se desea obtener un fragmento de anticuerpo unido a una molécula efectora, este se puede preparar por procedimientos químicos o de ADN recombinante convencionales en los que el fragmento de anticuerpo se une directamente o mediante un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar dichas moléculas efectoras con anticuerpos son bien conocidas en la técnica (véase, Hellstrom et al. Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., 1987, pág. 623-53; Thorpe et al. 1982, Immunol. Rev., 62: 119-58 y Dubowchik et al. 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos WO93/06231, WO92/22583, WO89/00195, WO89/01476 y WO03031581. Alternativamente, cuando la molécula efectora es una proteína o polipéptido, la unión se puede lograr usando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en los documentos WO86/01533 y EP0392745.

La expresión "molécula efectora" como se usa en la presente memoria incluye, por ejemplo, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o naturales, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo, ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionucleidos, en particular radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos informadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que se pueden detectar por espectroscopía de RMN o ESR. Otras moléculas efectoras pueden incluir radionucleidos quelados tales como 111In y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252, Iridio192 y Tungsteno188/Renio188; o fármacos tales como, pero no limitados a alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero no se limitan a enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero no se limitan a inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica, una proteína tal como la insulina, interferón a, interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador de plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, p. ej., angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfoquina, interleuquina-1 (lL-1), interleuquina-2 (IL- 2), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otros factores de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, en el diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nucleidos radiactivos, metales emisores de positrones (para usar en tomografía por emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase en general el documento US 4.741.900 para iones metálicos que se pueden conjugar con anticuerpos para usar en diagnósticos. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aequorina; y los nucleidos radiactivos adecuados incluyen 1251, 131I, 111In y 99Tc.

En otra realización, la molécula efectora puede aumentar la semivida del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o mejorar el suministro de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmunitario. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como los descritos en el documento WO05/117984.

Cuando la molécula efectora es un polímero, puede ser, en general, un polímero sintético o natural, por ejemplo, un polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido o un polisacárido ramificado o no ramificado, p. ej., un homo o heteropolisacárido.

Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.

Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen polietilenglicol de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, polipropilenglicol poli(alcohol vinílico) o derivados de los mismos, en especial polietilenglicol opcionalmente sustituido tal como metoxipolietilenglicol o derivados del mismo.

Los polímeros naturales específicos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de los mismos. "Derivados" como se usa en la presente memoria pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo grupos reactivos selectivos de tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar unido directamente o a través de un segmento conector al polímero. Se apreciará que el resto de dicho grupo formará en algunos casos parte del producto como el grupo conector entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.

El tamaño del polímero puede variar según se desee, pero en general estará en un intervalo de peso molecular medio de 500 Da a 50.000 Da, por ejemplo de 5.000 a 40.000 Da tal como de 20.000 a 40.000 Da. El tamaño del polímero se puede seleccionar en particular de acuerdo con el uso previsto del producto, por ejemplo, la capacidad de localizar ciertos tejidos como tumores o prolongar la semivida en la circulación (para una revisión, véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Así, por ejemplo, cuando el producto está destinado a salir de la circulación y penetrar en el tejido, por ejemplo para usar en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular pequeño, por ejemplo con un peso molecular de alrededor de 5.000 Da. Para aplicaciones donde el producto permanece en la circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo, que tenga un peso molecular en el intervalo de 20.000 Da a 40.000 Da. Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno, tal como un polietilenglicol o, en especial, un metoxipolietilenglicol o un derivado del mismo, y en especial con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15.000 Da a aproximadamente 40.000 Da.

En una realización, los anticuerpos para usar en la presente descripción están unidos a restos de polietilenglicol (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG se pueden unir a través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional del aminoácido terminal situado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Dichos aminoácidos se pueden encontrar de forma natural en el fragmento de anticuerpo o se pueden modificar genéticamente en el fragmento usando métodos de ADN recombinante (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.219.996; US 5.667.425; WO98/25971, WO2008/038024). En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en donde la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. Adecuadamente, los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno o más restos de cisteína a los que se puede unir la molécula efectora. Se pueden usar múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG.

Adecuadamente, las moléculas de PEG están unidas covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un resto de cisteína situado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado se puede unir covalentemente al átomo de azufre de un resto de cisteína situado en el fragmento. El enlace covalente en general será un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono. Cuando se usa un grupo tiol como el punto de unión de moléculas efectoras activadas de forma adecuada, por ejemplo, se pueden usar derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína. Se puede usar un polímero activado como material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpos modificados con polímero como se ha descrito antes. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo con tiol tal como un ácido o éster a-halogenocarboxílico, p. ej. yodoacetamida, una imida, p. ej., maleimida, una vinilsulfona o un disulfuro. Dichos materiales de partida se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE.UU.) o se pueden preparar a partir de materiales de partida disponibles en el mercado usando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen metoxi-PEG-amina 20K (que se puede obtener de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (que se puede obtener de Nektar, anteriormente Shearwater).

En una realización, un F(ab')2, Fab o Fab' en la molécula está PEGilado, es decir, tiene PEG (polietilenglicol) unido covalentemente al mismo, p. ej., de acuerdo con el método descrito en el documento EP 0948544 o EP1090037 [véase también "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington ^dC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531-545]. En una realización, el PEG está unido a una cisteína en la región bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido covalentemente a un solo grupo tiol en una región bisagra modificada. Un resto de lisina se puede unir covalentemente al grupo maleimida, y a cada uno de los grupos amina en el resto de lisina se puede unir un polímero de metoxipolietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000Da. Por lo tanto, el peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab puede ser de aproximadamente 40.000Da.

Las moléculas de PEG particulares incluyen 2-[3-(N-maleimido)propionamido]etil-amida de lisina modificada con N,N'-bis(metoxipolietilenglicol) PM 20.000), también conocida como PEG2MAL40K (que se puede obtener de Nektar, anteriormente Shearwater).

Las fuentes alternativas de conectores de PEG incluyen NOF que suministra GL2-400MA2 (en donde m en la siguiente estructura es 5) y GL2-400MA (donde m es 2) y n es aproximadamente 450:

mes 2 o 5

Es decir, el PEG es de aproximadamente 20.000 Da.

Moléculas efectoras de PEG alternativas adicionales del siguiente tipo:

están disponibles en Dr Reddy, NOFF y Jenkem.

En una realización, se proporciona una molécula de anticuerpo que está PEGilada (por ejemplo, con un PEG descrito en la presente memoria), unida a través de un resto de aminoácido cisteína en o aproximadamente el aminoácido 226 en la cadena, por ejemplo el aminoácido 226 del cadena pesada (por numeración secuencial). En una realización, se proporciona una secuencia de polinucleótido que codifica una molécula de la presente descripción, tal como una secuencia de ADN.

En una realización, se proporciona una secuencia de polinucleótido que codifica uno o más, tal como dos o más, o tres o más componentes de polipéptidos de una molécula de la presente descripción, por ejemplo:

a) una cadena de polipéptido de fórmula (I) :

V^h-CHⁱ-X-Vⁱ;

y

b) una cadena de polipéptido de fórmula (II):

V^l-C^l-Y-V²;

en donde:

Vh: representa un dominio variable de la cadena pesada;

CH1: representa un dominio de la región constante de la cadena pesada, por ejemplo su dominio 1;

X: representa un enlace o conector;

Y: representa un enlace o conector;

V1: representa un dsFv o un dsscFv;

Vl: representa un dominio variable de la cadena ligera;

Cl: representa un dominio de una región constante de la cadena ligera, tal como Ckappa;

V2: representa dsFv o un dsscFv.

En una realización, el polinucleótido, tal como el ADN, está comprendido en un vector.

El experto apreciará que cuando V1 y/o V2 representan un dsFv, el anticuerpo multiespecífico comprenderá un tercer polipéptido que codifica el dominio V^ho V^llibre correspondiente que no está unido a X o Y. Por consiguiente, la proteína multiespecífica de la presente invención puede ser codificada por uno o más, dos o más o tres o más polinucleótidos y estos se pueden incorporar en uno o más vectores.

Los métodos generales por los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la materia. En relación con esto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York y el Maniatis Manual producido por Cold Spring Harbor Publishing.

También se proporciona una célula hospedante que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican una proteína multiespecífica de la presente invención. Se puede usar cualquier sistema de célula hospedante/vector adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Se pueden usar sistemas bacterianos, por ejemplo, E. coli, y otros sistemas microbianos o eucariotas, por ejemplo, sistemas de expresión de células hospedante de mamíferos. Las células hospedantes de mamífero adecuadas incluyen CHO, mieloma, células de mieloma NSO y células SP2, células COS o células de hibridoma.

La presente descripción también proporciona un proceso para la producción de una proteína multiespecífica de acuerdo con la presente descripción que comprende cultivar una célula hospedante que contiene un vector de la presente invención en condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteína a partir de ADN que codifica la proteína multiespecífica de la presente invención, y aislar la proteína multiespecífica.

Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular se puede transfectar con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de la cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de la cadena pesada. Alternativamente, se puede usar un solo vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada. En un ejemplo, la línea celular se puede transfectar con dos vectores, cada uno de los cuales codifica una cadena de polipéptido de una molécula de anticuerpo de la presente invención. Cuando V1 y/o V2 son un dsFv, la línea celular se puede transfectar con tres vectores, cada uno de los cuales codifica una cadena de polipéptido de una proteína multiespecífica de la invención. En una realización, la línea celular se transfecta con dos vectores cada uno de los cuales codifica un polipéptido diferente seleccionado de:

a) una cadena de polipéptido de fórmula (I) :

V^h-CHⁱ-X-Vⁱ;

y

b) una cadena de polipéptido de fórmula (II):

V^l-C^l-Y-V²;

en donde:

Vh: representa un dominio variable de la cadena pesada;

CH1 : representa un dominio de una región constante de la cadena pesada, por ejemplo su dominio 1;

X: representa un enlace o conector;

Y: representa un enlace o conector;

V1 : representa un dsFv o un dsscFv;

V^l: representa un dominio variable de la cadena ligera;

C^l: representa un dominio de una región constante de la cadena ligera, tal como Ckappa;

V2: representa dsFv o un dsscFv.

En una realización, cuando V1 es un dsFv y el dominio Vh de V1 está unido a X, la línea celular se puede transfectar con un tercer vector que codifica el dominio Vl de V1.

En una realización cuando V1 es un dsFv y el dominio Vl de V1 está unido a X, la línea celular se puede transfectar con un tercer vector que codifica el dominio Vh de V1.

En una realización, cuando V2 es un dsFv y el dominio Vh de V2 está unido a Y, la línea celular se puede transfectar con un tercer vector que codifica el dominio Vl de V2.

En una realización, cuando V2 es un dsFv y el dominio Vl de V2 está unido a Y, la línea celular se puede transfectar con un tercer vector que codifica el dominio Vh de V2.

En una realización, cuando tanto V1 como V2 son un dsFv y el dominio Vl de V2 está unido a Y y el dominio Vl de V1 está unido a X, la línea celular se puede transfectar con un tercer vector que codifica el dominio común Vh de V1 y V2. En una realización, cuando V1 y V2 son un dsFv y el dominio Vh de V2 está unido a Y y el dominio Vh de V1 está unido a X, la línea celular se puede transfectar con un tercer vector que codifica el dominio común Vl de V1 y V2.

Se apreciará que la proporción de cada vector transfectado en la célula hospedante puede variar con el fin de optimizar la expresión del producto de anticuerpo multiespecífico. En una realización en donde se usan dos vectores, la relación de vectores puede ser 1:1. En una realización donde se usan tres vectores, la relación de vectores puede ser 1:1:1. Se apreciará que la persona experta puede encontrar una relación óptima mediante pruebas rutinarias de los niveles de expresión de proteínas después de la transfección. Alternativamente o además, los niveles de expresión de cada cadena de polipéptido de la construcción multiespecífica de cada vector se pueden controlar usando los mismos o diferentes promotores.

Se apreciará que dos o más, o cuando estén presentes, tres de los componentes de polipéptidos pueden estar codificados por un polinucleótido en un solo vector. También se apreciará que cuando dos o más, en particular tres o más, de los componentes de polipéptidos están codificados por un polinucleótido en un solo vector, la expresión relativa de cada componente de polipéptido se puede variar usando diferentes promotores para cada polinucleótido que codifica un componente de polipéptido de la presente descripción.

En una realización, el vector comprende una única secuencia de polinucleótido que codifica dos o, cuando están presentes, tres cadenas de polipéptidos de la molécula de anticuerpo multiespecífico de la presente invención bajo el control de un solo promotor.

En una realización, el vector comprende una sola secuencia de polinucleótido que codifica dos, o cuando están presente, tres cadenas de polipéptidos de la molécula de anticuerpo multiespecífico de la presente descripción en donde cada secuencia de polinucleótido que codifica cada cadena de polipéptido está bajo el control de un promotor diferente.

Las proteínas multiespecíficas de acuerdo con la presente descripción se expresan con buenos niveles a partir de células hospedante. Por lo tanto, las propiedades de los anticuerpos y/o fragmentos parecen estar optimizadas y propicias para el procesamiento comercial.

Ventajosamente, las moléculas de anticuerpos multiespecíficos de la presente descripción minimizan la cantidad de agregación observada después de la purificación y maximizan la cantidad de monómero en las formulaciones de la construcción en concentraciones farmacéuticas, por ejemplo, el monómero puede estar presente como 50%, 60%, 70% o 75% o más, tal como 80 o 90% o más, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% o más de la proteína total. En un ejemplo, una muestra purificada de una molécula de anticuerpo multiespecífico de la presente descripción permanece más de 98% o 99% en monómero después de 28 días de almacenamiento a 4°C. En un ejemplo, una muestra purificada de una molécula de anticuerpo multiespecífico de la presente descripción en 5 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) permanece más de 98% en monómero después de 28 días de almacenamiento a 4°C.

Las moléculas de anticuerpo de la presente descripción y las composiciones que las comprenden son útiles en el tratamiento, por ejemplo en el tratamiento y/o profilaxis de una afección patológica.

La presente descripción también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente descripción en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo de la presente descripción para usar en el tratamiento y para la fabricación de un medicamento, en particular para una indicación descrita en la presente memoria.

La composición normalmente se suministrará como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente descripción puede comprender adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La presente descripción también proporciona un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente descripción junto con uno o más de un excipiente, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

La molécula de anticuerpo puede ser el único principio activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede estar acompañada de otros principios activos que incluyen otros ingredientes de anticuerpos, por ejemplo anticuerpos anti-IL-1p, anti-células T, anti-IFNy o anti-LPS o ingredientes que no son anticuerpos, tales como xantinas. Otros ingredientes activos adecuados incluyen anticuerpos capaces de inducir tolerancia, por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4.

En una realización adicional, el anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la descripción se usa en combinación con un agente farmacéuticamente activo adicional.

Las composiciones farmacéuticas comprenden adecuadamente una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de anticuerpo de la invención. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en la presente memoria se refiere a una cantidad de un agente terapéutico, necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección dirigida, o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, normalmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración adecuado y la ruta de administración. Dicha información se puede usar para determinar dosis y vías útiles para la administración en seres humanos.

La cantidad terapéuticamente eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, peso y género del sujeto, la dieta, el tiempo y frecuencia de administración, la o las combinaciones de fármacos, sensibilidades de reacción y tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar por experimentación rutinaria y depende del criterio del médico. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, por ejemplo de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. Alternativamente, la dosis puede ser de 1 a 500 mg al día, tal como de 10 a 100, 200, 300 o 400 mg al día. Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar de manera conveniente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención.

Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente o se pueden administrar en combinación (p. ej., simultáneamente, secuencialmente o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.

La dosis a la que se administra la molécula de anticuerpo de la presente descripción depende de la naturaleza de la afección que se va tratar, la extensión de la inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo se está usando de forma profiláctica o para tratar una afección existente.

La frecuencia de la dosis dependerá de la semivida de la molécula de anticuerpo y la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una semivida corta (p. ej., de 2 a 10 horas), puede ser necesario administrar una o más dosis al día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una semivida larga (p. ej., de 2 a 15 días), puede ser necesario administrar una dosis una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.

El vehículo farmacéuticamente aceptable no debería inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y no debería ser tóxico. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.

Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias de tamponamiento de pH, en dichas composiciones. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas y suspensiones, para que lo ingiera el paciente.

Las formas adecuadas para la administración incluyen formas adecuadas para administración parenteral, p. ej., por inyección o infusión, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede tener la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstituir antes de usar con un líquido estéril adecuado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos que se van a tratar pueden ser animales. Sin embargo, en una o más realizaciones, las composiciones están adaptadas para la administración a sujetos humanos.

En una realización, en formulaciones de acuerdo con la presente descripción, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento, si el pH de la formulación es 7, entonces puede ser adecuado un pI a partir de 8-9 o superior. Sin desear estar limitados por la teoría, se cree que esto en último término puede proporcionar una formulación final con una estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento permanece en solución.

Las composiciones farmacéuticas de esta descripción se pueden administrar por cualquiera de una serie de vías que incluyen, pero no se limitan a, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Los hipopulverizadores también se pueden usar para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como productos inyectables, sea como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. Preferiblemente, las moléculas de anticuerpo de la presente invención se administran por vía subcutánea, por inhalación o por vía tópica.

El suministro directo de las composiciones en general se logrará por inyección, vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o administrado al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en un tejido específico de interés. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple.

Se apreciará que el principio activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, será susceptible a la degradación en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, si la composición se va a administrar por una vía que usa el tracto gastrointestinal, será necesario que la composición contenga agentes que protejan al anticuerpo de la degradación pero que liberen el anticuerpo una vez que ha sido absorbido del tracto gastrointestinal.

Está disponible una descripción detallada de los vehículos farmacéuticamente aceptables en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

En una realización, la formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas que incluyen inhalación.

Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles dosificadores que contienen gases propulsores o soluciones inhalables sin gases propulsores (tales como soluciones o suspensiones nebulizables). Los polvos inhalables de acuerdo con la descripción que contiene la sustancia activa pueden consistir solamente en las sustancias activas mencionadas antes o en una mezcla de las sustancias activas mencionadas antes con un excipiente fisiológicamente aceptable.

Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (p. ej., glucosa o arabinosa), disacáridos (p. ej., lactosa, sacarosa, maltosa), oligo y polisacáridos (p. ej., dextranos), polialcoholes (p. ej., sorbitol, manitol, xilitol), sales (p. ej., cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sí. Se usan adecuadamente mono o disacáridos, el uso de lactosa o glucosa, particularmente pero no exclusivamente en forma de sus hidratos.

Las partículas para la deposición en el pulmón requieren un tamaño de partículas inferior a 10 micrómetros, tal como 1-9 micrómetros, por ejemplo, de 0,1 a 5 pm, en particular de 1 a 5 pm. El tamaño de partículas del agente activo (tal como el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo) es de importancia primordial.

Los gases propulsores que se pueden usar para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la técnica. Los gases propulsores adecuados se seleccionan de entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano y halogenohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores mencionados antes se pueden usar solos o en mezclas de los mismos.

Gases propulsores particularmente adecuados son derivados halogenados de alcanos seleccionados entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados antes, son particularmente adecuados TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y sus mezclas.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor también pueden contener otros ingredientes tales como codisolventes, estabilizantes, agentes tensioactivos (surfactantes), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor de acuerdo con la invención pueden contener hasta 5% en peso de sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, de 0,002 a 5% en peso, de 0,01 a 3% en peso, de 0,015 a 2% en peso, de 0,1 a 2% en peso, de 0,5 a 2% en peso o de 0,5 a 1% en peso de activo.

Alternativamente, las administraciones tópicas al pulmón también pueden ser por administración de una solución líquida o formulación de suspensión, por ejemplo usando un dispositivo como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (p. ej., el nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

En una realización, la formulación se proporciona como ampollas discretas que contienen una dosis unitaria para suministro por nebulización.

En una realización, el anticuerpo se suministra en forma liofilizada, para reconstituciones o alternativamente como una formulación en suspensión.

El anticuerpo de la presente descripción se puede suministrar disperso en un disolvente, p. ej., en forma de una solución o una suspensión. Se puede suspender en una solución fisiológica adecuada, p. ej., solución salina fisiológica, un disolvente farmacológicamente aceptable o una solución tamponada. Las soluciones tamponadas conocidas en la técnica pueden contener de 0,05 mg a 0,15 mg de edetato disódico, 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro y de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml de agua para alcanzar un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Como se mencionó anteriormente, se puede preparar una suspensión, por ejemplo, a partir del anticuerpo liofilizado.

Las suspensiones terapéuticas o formulaciones en solución también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen tampones (p. ej., tampón de citrato, tampón de fosfato, tampón de acetato y tampón de bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (p. ej., seroalbúmina), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las soluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación en general se proporcionará en una forma sustancialmente estéril usando procedimientos de fabricación estériles.

Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración de la solución de disolvente tamponada usada para la formulación, la suspensión aséptica del anticuerpo en la solución de disolvente tamponada estéril y la dispensación de la formulación en receptáculos estériles por métodos familiares para los expertos en la técnica.

La formulación nebulizable de acuerdo con la presente descripción se puede proporcionar, por ejemplo, como unidades de dosis individuales (p. ej., envases de plástico sellados o viales) envasadas en sobres de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, p. ej., de 2 ml, de disolvente/tampón de la solución.

Se cree que los anticuerpos de la presente descripción son adecuados para el suministro por nebulización.

También está previsto que el anticuerpo de la presente invención se pueda administrar mediante el uso de terapia génica. Con el fin de lograr esto, las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesadas y ligeras de la molécula de anticuerpo bajo el control de los componentes de ADN adecuados se introducen en un paciente de manera que las cadenas de anticuerpos se expresan a partir de las secuencias de ADN y se ensamblan in situ.

La afección o trastorno patológico se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en infecciones (virales, bacterianas, fúngicas y parasitarias), choque endotóxico asociado con infección, artritis tal como artritis reumatoide, asma tal como asma grave, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celíaca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, accidente cerebrovascular, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, meningoencefalitis, uveítis autoinmune, trastornos inflamatorios inmunomediados del sistema nervioso central y periférico tales como la esclerosis múltiple, lupus (tal como el lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barr, dermatitis atópica, hepatitis autoinmune, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía por IgA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Meniere, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunes, pancreatitis, traumatismo (cirugía), enfermedad de injerto contra hospedante, rechazo de trasplante, enfermedad cardíaca que incluye enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio así como aterosclerosis, coagulación intravascular, resorción ósea, osteoporosis, osteoartritis, periodontitis e hipoclorhidria.

La presente descripción también proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente invención para usar en el tratamiento o profilaxis del dolor, en particular el dolor asociado con la inflamación.

Por lo tanto, se proporciona un anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente descripción para usar en un tratamiento y métodos de tratamiento que lo usan.

En una realización, se proporciona un procedimiento para purificar un anticuerpo multiespecífico (en particular un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invención).

En una realización, se proporciona un procedimiento para purificar un anticuerpo multiespecífico (en particular un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invención) que comprende los etapas de: llevar a cabo una cromatografía de intercambio aniónico en modo de no unión de modo que las impurezas son retenidas en la columna y el anticuerpo se mantienen en la fracción no unida. La etapa se puede llevar a cabo, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 6-8.

El procedimiento puede comprender además una etapa de captura inicial que usa cromatografía de intercambio catiónico, realizada por ejemplo a un pH de aproximadamente 4 a 5.

El procedimiento puede comprender además etapa o etapas de cromatografía adicionales para asegurar que los productos y las impurezas relacionadas con el procedimiento se resuelven de forma adecuada de la corriente de producto.

El procedimiento de purificación también puede comprender una o más etapas de ultrafiltración, tales como una etapa de concentración y diafiltración.

La forma purificada como se ha usado antes pretende referirse a al menos un 90% de pureza, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% en p/p o más puro.

Sustancialmente exento de endotoxinas en general pretende referirse a un contenido de endotoxinas de 1 UE por mg de producto de anticuerpo o menos tal como de 0,5 o 0,1 UE por mg de producto.

Sustancialmente exento de proteínas o ADN de la célula hospedante en general pretende referirse al contenido de proteínas y/o ADN de la célula hospedante de 400 |jg por mg de producto de anticuerpo o menos tal como 100 |jg por mg o menos, en particular 20 jg por mg, según sea adecuado.

La molécula de anticuerpo de la presente invención también se puede usar en el diagnóstico, por ejemplo, en el diagnóstico in vivo y formación de imágenes de estados patológicos.

En una realización, se proporciona un método para seleccionar una construcción de proteína multiespecífica de acuerdo con la presente invención que comprende:

a) determinar el rendimiento de proteína multiespecífica monomérica cuando V1 o V2 es un dsscFv para un par de regiones variables dado

b) determinar el rendimiento de la proteína multiespecífica monomérica cuando cualquiera de V1 o V2 analizado en (a) es un dsFv para el mismo par de regiones variables y

c) comparar el rendimiento de monómero obtenido en (a) y (b) y seleccionar la proteína multiespecífica con el rendimiento de monómero mayor.

Típicamente, el "par de regiones variables" en la etapa (a) y (b) del método son un par de Vh y Vl. En general, Vh y Vl juntos forman un dominio de unión al antígeno, V1 o V2. Por lo tanto, el método permite que el par de Vh y Vl se ensaye tanto como dsscFv y como dsFv en las construcciones de la presente invención y la construcción más monomérica se selecciona en la etapa (c).

Típicamente en la etapa (a) y (b) del método, el rendimiento se determina después de purificación, tal como después de cromatografía de afinidad. El rendimiento de monómero se puede determinar usando cualquier método adecuado, tal como cromatografía de exclusión por tamaño.

"Comprende" en el contexto de la presente memoria descriptiva se pretende que signifique incluye. Cuando sea técnicamente adecuado, se pueden combinar realizaciones de la invención. Las realizaciones se describen en la presente memoria como que comprenden ciertas características/elementos. La descripción también se extiende a realizaciones separadas que consisten o consisten esencialmente en dichas características/elementos.

Cualquier realización específica y explícitamente mencionada en la presente memoria puede formar la base de una exención de responsabilidad ya sea sola o en combinación con una o más realizaciones adicionales.

La presente descripción se describe además solo a modo de ilustración en los siguientes ejemplos, que se refieren a las figuras adjuntas, en las cuales:

Breve descripción de las figuras

Figura 1: muestra las construcciones Fab-2xdsscFv y Fab-dsscFv-dsFv de la presente descripción.

Figura 2: muestra el análisis de SDS-PAGE de proteínas Fab-1xdsscFv, 1xscFv y Fab-2xdsscFv expresadas en HEK293, purificadas con proteína G.

Figura 3: muestra el análisis de SE-HPLC G3000 de proteínas Fab-1xdsscFv, 1xscFv y Fab-2xdsscFv expresadas en HEK293, purificadas con proteína G.

Figura 4: Análisis de SDS-PAGE de proteínas Fab-2xdsscFv#3 expresadas en HEK293, purificadas.

Figura 5: Análisis de SE-HPLC S200 de proteínas Fab-2xdsscFv#3 expresadas en HEK293, purificadas.

Figura 6: muestra el análisis de SDS-PAGE de diversas construcciones de Fab-dsscFv-dsFv purificadas con proteína G de la presente descripción. (A) Muestras de Fab-dsscFv-dsscFv. (B) Muestras de Fab-dsscFv-dsFv Figura 7: muestra el análisis por SE-HPLC G3000 de construcciones Fab-dsscFv-dsFv purificadas con proteína G de la presente descripción.

Figura 8: muestra el análisis de SDS-PAGE de varias construcciones de acuerdo con la presente descripción en condiciones reductoras.

Figura 9: muestra el análisis de evolución temporal de SE-HPLC G3000 de formatos monoméricos de Fab-1xdsscFv-1xscFv y Fab-2xdsscFv

Figura 10: muestra el análisis de SDS-Page de los formatos de Fab-2xscFv y Fab-2xdsscFv expresados en EXPiHEK purificados con proteína G

Ejemplos

Los fragmentos de anticuerpo contra el ANTÍGENO 1 están marcados #1

Los fragmentos de anticuerpo contra el ANTÍGENO 2 están marcados #2

Los fragmentos de anticuerpo contra el ANTÍGENO 3 están marcados #3

Los fragmentos de anticuerpo contra el ANTÍGENO 4 están marcados #4

Ejemplo 1: Fab-2xdsscFv

Construcción de plásmidos para la expresión en células de mamíferos.

Los plásmidos para la expresión de Fab#2-(HC)dsscFv#3, (LC)dsscFv#4 y Fab#2-(LC)dsscFv#3, (HC)dsscFv#4 (véase la Figura 1), se construyeron mediante la fusión de scFv#3 y scFv#4 al extremo C de la región constante kappa humana alotipo Km3 de la cadena ligera #2 usando el conector flexible SGGGGSGGGGS [también denominado en la presente memoria S, 2xG4S] (SEQ ID NO: 2), o mediante la fusión de scFv#3 y scFv#4 al extremo C de la región constante CH1 de gamma-1 humana isotipo y1 de la cadena pesada #2 usando el conector flexible SGGGGTGGGGS [también denominado en la presente memoria S, G4T, G4S] (SEQ ID NO: 1). Además, se introdujeron mutaciones puntuales en las secuencias de ADN en restos seleccionados en la región armazón tanto de vL#3/vL#4 como de vH#3/vH#4. Las mutaciones (G44C de la cadena pesada y G100C de la cadena ligera) se introdujeron para crear un enlace disulfuro entre cadenas, entre las cadenas pesada y ligera del Fv#3. Las mutaciones (G44C de la cadena pesada y Q100C de la cadena ligera) se introdujeron para crear un enlace disulfuro entre cadenas entre las cadenas pesada y ligera del Fv#4.

Los fragmentos de genes que codifican scFv#4 y dsscFv#4 (orientación vHvL y vLvH) se fabricaron químicamente y se fusionaron con Fab#2 como se ha detallado antes para generar:

Plásmido e1: Ligera#2-(SGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 2])-vL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO 68])-vH#4;

Plásmido f1: Ligera#2-(SGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 2])-dsvL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 68])-dsvH#4;

Plásmido e2: Ligera#2-(SGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 2])-vH#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 68])-vL#4;

Plásmido f2: Ligera#2-(SGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 2])-dsvH#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 68])- dsvL#4;

Plásmido g1 Pesada#2-(SGGGGTGGGGS [SEQ ID NO: 1])-vL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 68])-vH#4;

Plásmido h1: Pesada#2-(SGGGGTGGGGS [SEQ ID NO: 1])-dsvL#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 68])-dsvH#4;

Plásmido g2: Pesada#2-(SGGGGTGGGGS [SEQ ID NO: 1])-vH#4-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 68])-vL#4; y

Plásmido h2: Pesada#2-(SGGGGTGGGGS [SEQ ID NO: 1])-dsvH#4-( GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 68])-dsvL#4. El plásmido pND1 (Fab#2 Pesada-(SGGGGTGGGGS SEQ ID NO: 1)-dsvH#3-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 68)-dsvL#3) [Plásmido i] ya estaba disponible. El fragmento de gen que codifica dsHLscFv#3 se escindió a partir de pND1 y se fusionó a la cadena ligera#2 como se ha detallado antes para generar: Ligera#2-(SGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 2)-dsvH#3-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 68)-dsvL#3 [Plásmido j].

Todos los formatos de fusión de Fab se clonaron en vectores de expresión de mamífero bajo el control del promotor de HCMV-MIE y secuencia poliA de SV40E.

Expresión en HEK293 de formatos Fab-lxdsscFv-lxscFv y Fab-2xdsscFv

Las células HEK293 se transfectaron con los plásmidos relevantes usando el reactivo de transfección 293fectin de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos se mezclaron como se muestra en la Tabla 4 para expresar las diferentes construcciones:

Tabla 4

La relación de los plásmidos usados para las transfecciones era 1:1. Se incubó un total de 50 |jg de ADN plasmídico con 125 j l de 293fectin 4,25 ml de medio Optimem durante 20 minutos a t.a. Después la mezcla se añadió a 50 ml de células HEK293 en suspensión con 1 x 106 células/ml y se incubó con agitación a 37°C. Los líquidos sobrenadantes se recogieron el día 10 por centrifugación a 1500g para separar las células y el líquido sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,22 jm. El nivel de expresión se determinó por HPLC de Proteína-G.

La Tabla 5 muestra los resultados del ensayo de HPLC de Proteína G. Como se puede ver, los niveles de expresión de todas las construcciones eran comparables entre sí, cubriendo un intervalo de 11-23 jg/ml. Los indicados con un asterisco (*) se expresaron en una transfección separada, por lo tanto, los niveles de expresión absoluta de LC-scFv#3,HC-scFv#4 no se pueden comparar con HC-scFv#3,LC-scFv#4.

Tabla 5

Purificación con proteína G de los formatos Fab-lxdsscFv-lxscFv y Fab-2xdsscFv expresados en HEK293

Los ~50 ml de líquidos sobrenadantes de HEK293 se concentraron ~25 veces hasta ~2 ml usando concentradores de centrifugación con corte de exclusión de peso molecular lOkDa. Los líquidos sobrenadantes concentrados se aplicaron a una columna HiTrap Protein-G FF de 1 ml (GE Healthcare) equilibrada en fosfato 20 mM, NaCl 40 mM a pH 7,4. La columna se lavó con fosfato 20 mM, NaCI 40 mM a pH 7,4 y el material unido se eluyó con glicina/HCl 0,1 M pH 2,7. El pico de elución se recogió y el pH se ajustó a ~pH 7,0 con Tris/HCl 2 M pH 8,5. Las eluciones ajustadas de pH se concentraron y el tampón se intercambió a PBS pH 7,4 usando concentradores de centrifugación con corte de exclusión de peso molecular de IOkDa.

Análisis de SDS-PAGE de formatos Fab-lxdsscFv-lxscFv y Fab-2xdsscFv expresados en HEK293, purificados con proteína G

Las muestras (2 |jg) se diluyeron con PBS a un volumen de 9,75 jl, a las cuales se añadieron 3,75 j l de 4x tampón de muestra LDS y 1,5 j l de N-etilmaleimida 100 mM (muestras no reducidas) o 1,5 j l de 10x agente reductor NuPAGE (muestras reducidas). Las muestras se agitaron con vórtice, se incubaron a 70°C durante 10 minutos, se enfriaron y se centrifugaron a 12500 rpm durante 30 segundos. Las muestras preparadas se cargaron en un gel de acrilamida al 4-20% Tris/Glicina SDS y se llevó a cabo la separación durante ~100 minutos a 125 V, voltaje constante. Se usó la escala de peso molecular SeeBluePlus2 (Life Technologies). Los geles se tiñeron con el colorante de proteína Instant Blue (Expedeon) y se destiñeron con agua destilada.

Los tamaños de las bandas esperadas después de SDS-PAGE reductora y no reductora se indican en la Tabla 6. Tabla 6:

Para todas las proteínas, se esperaba que el gel no reductor mostrara una banda a ~100 kDa, mientras que se esperaba que los geles reductores mostraran un doblete a ~50 kDa con igual tinción en ambas bandas.

Para todas las proteínas Fab-lxdsscFv-lxscFv y Fab-2xdsscFv, los geles de SDS-PAGE reductores mostraron patrones de bandas que indicaban que las construcciones se estaban expresando correctamente en términos tanto de posición de migración como de intensidad de tinción con un doblete a ~50 kDa (Figura 2B,D). La banda menor más arriba adicional es consistente con la proteína de longitud completa no reducida. Como se esperaba, se observan multímeros unidos por disulfuro en el gel no reductor (Figura 2A,C), que desaparecen en condiciones reductoras (Figura 2B,D). Las bandas menores a ~50kDa en el gel no reductor (Figura 2A,C) pueden ser consistentes con la formación incompleta de enlaces ds entre la cadena pesada y ligera en la región Fab.

Análisis de SE-HPLC G3000 de formatos Fab-lxdsscFv-lxscFv y Fab-2xdsscFv expresados en HEK293, purificados con proteína G

Se inyectaron 10 jg de muestras de proteína purificada (100 j l de disolución madre 0,1 mg/ml diluida en PBS) en una columna TSK Gel G3000SWXL, 7,8x300 mm, (Tosoh) 3 días después de la purificación y se desarrolló con un gradiente isocrático de fosfato 200 mM pH 7,0 a 1 ml/min. La detección de la señal fue por absorbancia a 280 nm. Los resultados se muestran en la Figura 3. Como se puede ver en la Figura 3, después de la purificación con proteína G, los formatos Fab-lxdsscFvlxscFv y Fab-2xdsscFv eran monómeros en 83-89%.

Aunque todas las muestras tienen niveles de monómero similares en el ensayo, las muestras que contienen un scFv que carece del disulfuro de Fv están en un equilibrio dinámico. Esto significa que el % de monómero medido en el ensayo para estas muestras depende de la concentración de la muestra, las muestras más concentradas dan mayor % de monómero y las muestras menos concentradas dan menor % de monómero. En cambio, las muestras donde ambos scFv contienen un disulfuro son estables y no están en equilibrio dinámico. Por lo tanto, el % de monómero medido en el ensayo no cambia con los cambios en la concentración de la muestra.

Como los monómeros y multímeros en los formatos Fab-2xdsscFv son estables y no están en un equilibrio dinámico, las muestras se pueden purificar fácilmente para aumentar el % de monómero. Las muestras monoméricas purificadas también seguirán siendo monoméricas incluso cuando la concentración de la construcción en una formulación dada aumenta, haciendo así que las construcciones sean muy adecuadas para usar en preparaciones farmacéuticas. Por el contrario, Fab-2xscFv después de la purificación como monómero, puede estar sujeto al intercambio de dominio dinámico intermolecular entre vL y vH de los dominios de scFv. Por lo tanto, además de mayor riesgo de formación de dímero, trímero, estructuras de orden superior y agregados, dichas moléculas son difíciles de observar puesto que las formas no agregadas se pueden resolver en monómeros después de las etapas de dilución que se usan durante los métodos analíticos. Por lo tanto, Fab-2xdsscFv proporciona claridad adicional durante el análisis de las composiciones farmacéuticas.

Expresión en CHOS de formatos Fab-lxdsscFv-lxscFv y Fab-2xdsscFv

Células CHOS se transfectaron con los plásmidos relevantes por métodos de electroporación a escala de 1 litro. Los plásmidos se mezclaron como se muestra en la Tabla 7 para expresar la proteína. Los cultivos se cultivaron en medio CD-CHO complementado con GlutaMAX 2 mM y se incubaron a 37°C con 8% de CO2 a 140 rpm durante 24 h y posteriormente se incubaron durante 13 días adicionales a 32°C. En el día 4 después de la transfección, se añadió al cultivo butirato de sodio a una concentración final de 3 mM. El día 14 después de la transfección, se recogieron los líquidos sobrenadantes del cultivo por centrifugación y se esterilizaron por filtración a través de 0,22 pm. Los títulos de expresión se midieron por HPLc de proteína G (Tabla 8).

Tabla 7:

Tabla 8:

Purificación con proteína G de formatos Fab-lxdsscFv-lxscFv y Fab-2xdsscFv expresados en CHO

1 litro de líquidos sobrenadantes de CHO se concentró ~25 veces hasta ~40 ml usando una celda agitada Amicon con corte de exclusión de peso molecular de lOkDa. Los líquidos sobrenadantes concentrados se cargaron en un sistema de purificación AKTA Express con una columna de proteína G y PBS como el tampón de separación. El material unido se eluyó con glicina/HCl 0,1 M pH 2,7 y se ajustó el pH a ~pH 7,0 con Tris /HCl 2 M pH 8,5. Después, el material eluido se concentró usando concentradores con corte de exclusión de peso molecular de lOkDa y el concentrado resultante se cargó en una columna Superdex (GE Healthcare) para filtración en gel con PBS como tampón de separación. Se recogieron picos de elución individuales y se analizaron por HPLC de exclusión por tamaño para determinar la fracción monomérica. La proteína monomérica final se concentró a 5 mg/ml en PBS y se almacenó a 4°C.

Análisis de SDS-PAGE de la fracción monomérica expresada en CHOS, purificada con proteína G de formatos FablxdsscFv-lxscFv y Fab-2xdsscFv

Las muestras (2 |jg) se diluyeron con PBS a un volumen de 9,75 jl, a las que se añadieron 3,75 j l de 4x tampón de muestra LDS y 1,5 pl de N-etilmaleimida 100 mM (muestras no reducidas) o 1,5 pl de 10x agente reductor NuPAGE (muestras reducidas). Las muestras se agitaron con vórtice, se incubaron a 70°C durante 10 minutos, se enfriaron y se centrifugaron a 12.500 rpm durante 30 segundos. Las muestras preparadas se cargaron en un gel de acrilamida al 4-20%-SDS Tris/Glicina y se realizó la separación durante ~100 minutos a 125 V, voltaje constante. Se usó la escala de peso molecular Mark12 (Life Technologies). Los geles se tiñeron con el colorante de proteína Instant Blue (Expedeon) y se destiñeron con agua destilada.

Los tamaños de las bandas esperadas después de SDS-PAGE reductora y no reductora se indican en la Tabla 9. Tabla 9:

Para todas las proteínas Fab-lxdsscFv-lxscFv y Fab-2xdsscFv, los geles de SDS-PAGE reductores mostraron patrones de bandas que indicaban que las construcciones eran monoméricas y se expresaban correctamente en términos tanto de posición de migración como de intensidad de tinción con un doblete a ~50 kDa (Figura 8B, D). La banda menor más arriba adicional es consistente con la proteína de longitud completa no reducida (Figura 8B, D). Para todas las proteínas, el gel no reductor mostraba una banda a ~100 kDa, indicativa de la proteína de longitud completa (Figura 8A, a). Las bandas menores a ~50kDa en el gel no reductor (Figura 8A, b) pueden ser consistentes con la formación incompleta de enlaces disulfuro entre la cadena pesada y ligera en la región Fab.

Análisis de evolución temporal de SE-HPLC G3000 de formatos monoméricos de Fab-lxdsscFv-lxscFv y Fab-2xdsscFv

Se almacenaron 5 mg/ml de monómero purificado de los formatos de anticuerpos a 4°C en PBS y se analizaron el día 4, el día 14 y el día 28 después de la purificación. Las muestras se diluyeron en PBS a 10 |jg y se inyectaron en una columna t Sk Gel G3000SWXL, 7,8x300 mm (Tosoh) y se desarrollaron con un gradiente isocrático de fosfato 200 mM pH 7,0 a 1 ml/min. La detección de la señal fue por absorbancia a 280 nm. Los resultados se muestran en la Figura 9. El día 4 después de la purificación, el análisis de Fab-2xdsscFv indicó que la mayoría de la proteína era monomérica al comienzo del experimento (líneas continuas), y permanecía monomérica y estable a lo largo del tiempo, con <1% definido como multímeros (dímeros, trímeros, órdenes superiores y agregados grandes). Por otra parte, se detectó una mayor aparición de multimerización para Fab-lxdsscFv-lxscFv que se observó que aumentaba de forma lineal con el tiempo (líneas discontinuas). De hecho, la prevalencia de la multimerización parecía que era más pronunciada con formatos que contienen scFv no estabilizados por disulfuro en la orientación Vl/Vh. Sin embargo, está claro que los formatos que contienen un scFv que carece del disulfuro de Fv están en equilibrio dinámico y son más propensos a la multimerización durante el almacenamiento que los scFv que están estabilizados por disulfuro. De hecho, se ha demostrado que los formatos que contienen scFv que están ambos estabilizados por disulfuro permanecen monoméricos incluso cuando aumenta la concentración de la proteína en una formulación dada. Esto hace que las construcciones donde ambos scFv contienen un disulfuro de Fv sean muy adecuadas para usar en preparaciones farmacéuticas donde el riesgo de formar multímeros de órdenes superiores o agregados grandes durante periodos de almacenamiento necesita de forma crítica ser insignificante.

Ejemplo 2: Fab-2xdsscFv (Bivalente con dos dsscFv iguales)

Construcción de plásmidos para expresión en células de mamíferos

Los plásmidos para la expresión de Fab#2-(HC)dsscFv#3,(LC)dsscFv#3 (véase la Figura 4), se construyeron mediante la fusión de dsscFv#3 al extremo C terminal de la región constante kappa humana de alotipo Km3 de la cadena ligera#2 usando el conector flexible SGGGGSGGGGS [también denominado en la presente memoria S, 2xG4S] (SEQ ID NO: 2), o mediante la fusión de dsscFv#3 al extremo C de la región constante CH1 de gamma-1 humana isotipo ^y1 de la cadena pesada #2 usando el conector flexible SGGGGTGGGGS [también denominado en la presente memoria S, G4T, G4S] (SEQ ID NO: 1). Se introdujeron mutaciones puntuales en las secuencias de ADN en restos seleccionados en la región armazón tanto de vL#3/vL#1 como vH#3/vH#1. Las mutaciones (G44C de la cadena pesada y G100C de la cadena ligera) se introdujeron para crear un enlace disulfuro entre cadenas entre las cadenas pesada y ligera del Fv#3.

El plásmido pND1 (Fab#2 Pesada-(SGGGGTGGGGS [SEQ ID NO: 1)-dsvH#3-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 68])-dsvL#3) [Plásmido i] ya estaba disponible. El fragmento de gen que codificaba dsHLscFv#3 se escindió de pND1 y se fusionó a la cadena ligera#2 como se ha detallado antes para generar: Ligera#2-(SGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 2])-dsvH#3-(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 68])-dsvL#3 [Plásmido j].

Los formatos de fusión Fab se clonaron en vectores de expresión de mamífero bajo el control del promotor de HCMV-MIE y la secuencia poliA de SV40E.

Expresión en HEK293 de Fab-2xdsscFv#3

Se transfectaron células HEX293 con los plásmidos relevantes usando el reactivo de transfección 293fectin de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos se mezclaron como se muestra en la Tabla 10 para expresar la proteína:

Tabla 10

La relación de los plásmidos usados para las transfecciones era 1:1. Se incubó un total de 50 |jg de ADN plasmídico con 125 j l de 293fectin 4,25 ml de medio Optimem durante 20 minutos a t.a. Después la mezcla se añadió a 50 ml de células HEK293 en suspensión con 1 x 106 células/ml y se incubó con agitación a 37°C. Los líquidos sobrenadantes se recogieron el día 10 por centrifugación a 1500g para separar las células y el líquido sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,22 jm. El nivel de expresión se determinó por HPLC de Proteína G. La Tabla 11 muestra los resultados del ensayo de HPLC de Proteína G. El nivel de expresión era 20 pg/ml.

Tabla 11

Purificación de Fab-2xdsscFv#3 expresado en HEK293

Los~50 ml de los líquidos sobrenadantes de HEK293 se concentraron ~25 veces hasta ~2 ml usando concentradores de centrifugación con corte de exclusión de peso molecular de 30 kDa. Los líquidos sobrenadantes concentrados se purificaron y se concentraron más y se cambió el tampón a PBS pH 7,4 usando concentradores de centrifugación con corte de exclusión de peso molecular de 30 kDa.

Análisis de SDS-PAGE de Fab-2xdsscFv#3 expresado en HEK293, purificados con proteína G

Las muestras (2 jg ) se diluyeron con PBS a un volumen de 9,75 jl, a las cuales se añadieron 3,75 j l de 4x tampón de muestra LDS y 1,5 j l de N-etilmaleimida 100 mM (muestras no reducidas) o 1,5 j l de 10x agente reductor NuPAGE (muestras reducidas). Las muestras se agitaron con vórtice, se incubaron a 70°C durante 10 minutos, se enfriaron y se centrifugaron a 12.500 rpm durante 30 segundos. Las muestras preparadas se cargaron en un gel de acrilamida al 4-20% Tris/Glicina SDS y se llevó a cabo la separación durante ~100 minutos a 125 V, voltaje constante. Se usó la escala de peso molecular SeeBluePlus2 (Life Technologies). Los geles se tiñeron con el colorante de proteína Instant Blue (Expedeon) y se destiñeron con agua destilada. Los tamaños de las bandas esperadas después de SDS-PAGE reductora y no reductora se indican en la Tabla 12.

Tabla 12:

Se esperaba que el gel no reductor mostrara una banda a ~100 kDa, mientras que se esperaba que el gel reductor mostrara un doblete a ~50 kDa con igual tinción en ambas bandas.

Los geles de SDS-PAGE reductores mostraron patrones de bandas que indicaban que las construcciones se estaban expresando correctamente en términos tanto de posición de migración como de intensidad de tinción con un doblete a ~50 kDa (Figura 4B), sin embargo, también se observaron algunas especies menos importantes adicionales posiblemente debidas al esquema de purificación subóptimo en oposición al método de purificación mediado por proteína G estándar, que se usa típicamente para la purificación de los Fab. Se observan multímeros unidos por disulfuro en el gel no reductor (Figura 4A), que desaparecen en condiciones reductoras (Figura 4B). Análisis de SE-HPLC S200 de Fab-2xdsscFv#3 expresado en HEK293, purificado

Se inyectaron 10 jg de muestras de proteína purificada (100 j l de disolución madre 0,1 mg/ml diluida en PBS) en una columna Superdex 200 10/300 g L Tricorn (GE Healthcare) 3 días después de la purificación y se desarrolló con un gradiente isocrático de PBS a pH 7,4 a 1 ml/min, con detección continua por absorbancia a 280 nm. Los resultados se muestran en la Figura 5. Como se puede ver en la Figura 5, después de la purificación, el formato Fab-2xdsscFv#3 tenían 81% de monómero.

Ejemplo 3: Fab-(HC)dsscFv-(LC)dsFv

Construcción de plásmidos Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 y Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (unido por LC-vL) para la expresión en células de mamífero

Las proteínas de fusión Fab#2 para la expresión de Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 y Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (unido por LC-vL) (véase la Figura 6), se construyeron mediante la fusión de dsscFv#1 (dsvH-4xG4S-dsvL) o dsvL#1 al extremo C de la región constante kappa humana de alotipo Km3 de la cadena ligera#2 usando el conector flexible SGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 69) para generar:

Ligera#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 69])-dsscFv#1 [Plásmido b] y

Ligera#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 69])-dsvL#1 [Plásmido c]; y

mediante la fusión de HLdsscFv#3 (dsvH-4xG4S-dsvL) al extremo C de la región constante CH1 gamma-1 humana de isotipo y1 de la cadena pesada#2 usando el conector flexible SGGGGSGGGGTGGGGS (SEQ ID NO: 70) para generar:

Pesada#2-(SGGGGSGGGGTGGGGS [SEQ ID NO: 70])-dsscFv#3 [Plásmido a].

Se introdujeron mutaciones puntuales (G44C de la cadena pesada y G100C de la cadena ligera) en las secuencias de ADN en restos seleccionados en la región armazón de vL#3, vH#3, vL#1 y vH#1 para crear un enlace disulfuro entre cadenas, entre las cadenas pesada y ligera del Fv#3 y Fv#1. Los genes de fusión de Fab de cadena pesada y ligera se clonaron en vectores de expresión de mamífero bajo el control del promotor de HCMV-MIE y la secuencia poliA de SV40E. Los genes codificantes:

Pesada#2-(SGGGGSGGGGTGGGGS [SEQ ID NO: 70])-dsscFv#3 [Plásmido a] y

dominio libre de dsvH#1 [Plásmido d]

se fabricaron químicamente y se clonaron individualmente en vectores de expresión de mamífero bajo el control del promotor de HCMV-MIE y la secuencia poliA de SV40E.

Los genes que codifican dsscFv#1 y dsvL#1 se fabricaron químicamente y se fusionaron al extremo C de la cadena ligera#2 para crear:

Ligera#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 69])-dsscFv#1 [Plásmido b] y

Ligera#2-(SGGGGSGGGGSGGGGS [SEQ ID NO: 69])-dsvL#1 [Plásmido c]

y las construcciones enteras se clonaron en un vector de expresión de mamífero bajo el control del promotor de HCMV-MIE y la secuencia de poliA de SV40E.

Expresión en HEK293 de:

Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 y

Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (unido por LC-vL)

Las células HEK293 se transfectaron con los plásmidos relevantes usando el reactivo de transfección 293fectin de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los plásmidos se mezclaron de la siguiente manera para expresar las diferentes construcciones como se muestra en la Tabla 13 a continuación:

Tabla 13

Para la combinación de 2 plásmidos, la proporción de los plásmidos usados para las transfecciones era 1:1, mientras que para las combinaciones de 3 plásmidos la proporción era 1:1:1. Se incubó un total de 50 |jg de ADN plasmídico con 125 j l de 293fectina 4,25 ml de medio Optimem durante 20 minutos a t.a. Después la mezcla se añadió a 50 ml de células HEK293 en suspensión a 1 x 106 células/ml y se incubó con agitación a 37°C. Los líquidos sobrenadantes se recogieron el día 10 por centrifugación a 1.500g para separar las células y el líquido sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,22 jm. El nivel de expresión se determinó por HPLC de Proteína-G.

Los resultados se muestran en la Tabla 14. Como se puede ver, los niveles de expresión de ambas construcciones eran comparables entre sí (16-18 jg/ml). Ha habido informes en la bibliografía de que la expresión de regiones Fv que carecen de un conector entre vL y vH o un motivo de dimerización para unir vL y vH entre sí, tienen niveles de expresión sustancialmente más bajos que los Fv conectados. Sorprendentemente, esto no se observa en estos datos donde no se observaron diferencias significativa entre el nivel de expresión de cada tipo de construcción.

Tabla 14:

Purificación con proteína G de Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 y Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (unido por LC-vL) expresados en HEK293

Los ~50 ml de los líquidos sobrenadantes de HEK293 se concentraron ~25 veces hasta ~2 ml usando concentradores de centrifugación con corte de exclusión de peso molecular de lOkDa. Los líquidos sobrenadantes concentrados se aplicaron a una columna HiTrap Protein-G FF de 1 ml (GE Healthcare) equilibrada en fosfato 20 mM, NaCl 40 mM, pH 7,4. La columna se lavó con fosfato 20 mM, NaCl 40 mM a pH 7,4 y el material unido se eluyó con glicina/HCl 0,1 M a pH 2,7. El pico de elución se recogió y el pH se ajustó a ~pH 7,0 con Tris/HCl 2 M pH 8,5. Las eluciones de pH ajustado se concentraron y el tampón se intercambió a PBS pH 7,4 usando concentradores de centrifugación de corte de exclusión de peso molecular de IOkDa.

Análisis de SDS-PAGE de Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC) dsscFv#1 y Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (unido por LC-vL) expresados en HEK293, purificados con proteína G

Las muestras (2 |jg) se diluyeron con PBS a un volumen de 9,75 j l a las cuales se añadieron 3,75 j l de 4x tampón de muestra LDS y 1,5 j l de N-etilmaleimida 100 mM (muestras no reducidas) o 1,5 j l de 10x agente reductor NuPAGE (muestras reducidas). Las muestras se agitaron con vórtice, se incubaron a 70°C durante 10 minutos, se enfriaron y se centrifugaron a 12.500 rpm durante 30 segundos. Las muestras preparadas se cargaron en un gel de acrilamida al 4-20% Tris/Glicina SDS y se llevó a cabo la separación durante ~100 minutos a 125 V, voltaje constante. Se usó la escala de peso molecular SeeBluePlus2 (Life Technologies). Los geles se tiñeron con el colorante de proteína Instant Blue (Expedeon) y se destiñeron con agua destilada.

Los resultados se muestran en la Figura 6. Para Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1, se esperaba que el gel no reductor mostrara una banda a ~100k Da, mientras que se esperaba que el gel reductor mostrara un doblete a ~50k Da con tinción aproximadamente igual en ambas bandas. Para Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (unido por LC-vL), se esperaba que el gel no reductor mostrara una banda a ~100 kDa, mientras que se esperaba que el gel reductor mostrara 3 bandas a ~50, ~36 y ~13k Da con tinción en la proporción aproximada de 3:2:1 de la banda superior a la inferior.

Los geles SDS-PAGE reductores mostraron patrones de bandas que indicaban que las construcciones se estaban expresando correctamente en términos tanto de posición de migración como de intensidad de tinción. Los geles SDS-PAGE no reductores mostraron patrones de bandas significativos de >200 kDa para Fab-2xdsscFv que eran consistentes con la multimerización (Figura 6A, banda 2) pero se observaron menos especies de alto peso molecular en la muestra de Fab-dsscFv-dsFv (Figura 6B, banda 2)

Análisis de SE-HPLC G3000 de Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 y Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (unido por LC-vL) expresados en HEK293, purificados con proteína G

Se inyectaron 10 jg de muestras de proteína purificada (100 j l de disolución madre de 0,1 mg/ml diluida en PBS) en una columna TSK Gel G3000SWXL, 7,8x300 mm, (Tosoh) 3 días después de la purificación y se desarrolló con un gradiente isocrático de fosfato 200 mM a pH 7,0 a 1 ml/min. La detección de la señal fue por absorbancia a 280 nm. Los resultados se muestran en la Figura 7. Después de la purificación con Proteína-G, el Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsFv#1 (unido por LC-vL) era 91% monómero, mientras que Fab#2-(HC)dsscFv#3-(LC)dsscFv#1 era 30% monómero.

Se sabe que dsscFv#1 es particularmente propenso a la multimerización. Dado que los multímeros se unen físicamente por el conector dsscFv (vL#1 o vH#1 se empareja con vH#1 o vL#1 de una cadena de polipéptido diferente), reemplazando dsscFv#1 por dsFv#1 (que no comprende un conector scFv), hubo un aumento significativo en el porcentaje de monómero obtenido.

El experto en la técnica apreciará por lo tanto que, dependiendo de la tendencia del dsscFv a multimerizar, en algunos casos sería ventajoso usar un dsFv en lugar de un dsscFv.

Ejemplo 4

Afinidad por Biacore y demostración de unión simultánea de dianas de antígeno

Las afinidades de unión y los parámetros cinéticos para las interacciones de Fab#2-(HC)dsHLscFv#3(LC) dsHLscFv#4 se determinaron por resonancia de plasmones superficiales (SPR) realizada en un BIAcore T100 o un BIAcore 3000 usando chips sensores CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences AB) y HBS-EP (HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05% en v/v). Todos los experimentos se realizaron a 25°C. Las muestras de anticuerpos se capturaron en la superficie del chip sensor usando un Fab de cabra específico de F(ab')2 humano (Jackson ImmunoResearch) o un anticuerpo monoclonal anti-CH1 humano generado internamente. La inmovilización covalente del anticuerpo de captura se logró mediante química de acoplamiento de amina convencional a un nivel de 6000-7000 unidades de respuesta (RU). El antígeno #2, #3 o #4 se tituló por separado frente al anticuerpo capturado. Cada ciclo de ensayo consistía en capturar primero la muestra de anticuerpo usando una inyección de 1 min, antes de una fase de asociación que consistía en una inyección de antígeno de 3 min, después de lo cual se vigiló la disociación durante 10 minutos. Después de cada ciclo, la superficie de captura se regeneraba con inyecciones 2 x 1 min de HCl 40 mM seguido de 30 s de NaOH 5 mM. Los caudales usados eran 10 pl.min'1 para la captura, 30 pl.min'1 para las fases de asociación y disociación, y 10 pl.min'1 para la regeneración. Los parámetros cinéticos se determinaron por ajuste global simultáneo de los sensogramas resultantes a un modelo de unión estándar 1:1 usando el software BIAcore T100 Evaluation v2.0.1 o BIAcore 3000 BIAEvaluation v3.2. Los resultados se muestran en la Tabla 15. El anticuerpo mostró afinidades esperadas dentro del intervalo pM - nM para los antígenos ensayados.

Tabla 15:

Se evaluó el potencial de Fab#2-(HC)dsHLscFv#3 (LC)dsHLscFv#4 para unirse simultáneamente a los 3 antígenos mediante captura del anticuerpo triespecífico en el chip sensor por el anticuerpo anti-IgG-F(ab')2 humana. Cada antígeno o una disolución mezclada del antígeno #2, #3 y #4 se valoró frente al anticuerpo capturado en inyecciones de 3 min. Las respuestas de unión observadas para las inyecciones independientes y respuestas combinadas se muestran en la Tabla 16. La respuesta de unión para la disolución de antígeno#2/#3/#4 combinado era equivalente a la suma de las respuestas de las inyecciones independientes. Esto confirma que Fab#2-(HC)dsHLscFv#3 (LC)dsHLscFv#4 es capaz de unirse simultáneamente a los 3 antígenos ensayados.

Tabla 16:

Ejemplo 5 - Comparación del rendimiento monomérico entre los formatos Fab-2xscFv y Fab-2xdsscFv

Las células EXpiHEK se transfectaron con los plásmidos relevantes por métodos de electroporación a una escala de 50 ml. Los plásmidos se mezclaron como se muestra en la Tabla 17 para expresar la proteína. Los cultivos se desarrollaron en medio de expresión de ExpiHEK y se incubaron a 37°C con 8% de CO2 a 120 rpm durante 16-18 h, antes de la adición del potenciador 1 y 2. Los cultivos posteriormente se incubaron durante 4 días más a 37°C. Los líquidos sobrenadantes de cultivo se recogieron por centrifugación y se esterilizaron con filtro de 0,22 pm. Los títulos de expresión se midieron por HPLC de proteína G (Tabla 18).

Tabla 17:

Tabla 18:

Purificación con proteína G de formatos Fab-2xscFv y Fab-2xdsscFv expresados en EXpiHEK

Los líquidos sobrenadantes se concentraron ~25 veces hasta ~2 ml usando concentradores de centrifugación con corte de exclusión de peso molecular de lOkDa. Los líquidos sobrenadantes concentrados se purificaron por HPLC de proteína G usando tampón de fosfato a pH 7,4. El material unido se eluyó con glicina/HCl 0,1 M a pH 2,7 y el pH se ajustó a ~pH 7,0 con Tris/HCl 2 M pH 8,5. El material eluido se concentró usando concentradores de centrifugación de corte de exclusión de peso molecular de IOkDa y se intercambió el tampón a PBS. La proteína purificada se concentró a ~4-5 mg/ml en PBS y se almacenó a 4°C.

Análisis de SDS-PAGE de formatos Fab-2xscFv y Fab-2xdsscFv expresados en EXpiHEK, purificados con proteína G

Las muestras (2 pg) se diluyeron con PBS a un volumen de 9,75 pl, a las cuales se añadieron 3,75 pl de 4x tampón de muestra LDS y 1,5 pl de N-etilmaleimida 100 mM (muestras no reducidas) o 1,5 pl de 10x agente reductor NuPAGE (muestras reducidas). Las muestras se agitaron con vórtice, se incubaron a 70°C durante 10 minutos, se enfriaron y se centrifugaron a 12.500 rpm durante 30 segundos. Las muestras preparadas se cargaron en un gel de acrilamida al 4-20% Tris/Glicina SDS y se llevó a cabo la separación durante ~100 minutos a 125 V, voltaje constante. Se usó la escala de peso molecular SeeBlue2 (Life Technologies). Los geles se tiñeron con el colorante de proteína Instant Blue (Expedeon) y se destiñeron con agua destilada.

Los tamaños de las bandas esperadas después de SDS-PAGE reductora y no reductora se indican en la Tabla 19. Tabla 19:

Para todas las proteínas Fab-2xscFv y Fab-2xdsscFv, los geles de SDS-PAGE reductores mostraron patrones de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende o que consiste en:

a) una cadena de polipéptido de fórmula (I):

V^h-CHⁱ-X-Vⁱ;

y

b) una cadena de polipéptido de fórmula (II):

V^l-C^l-Y-V²;

en donde:

Vh representa un dominio variable de la cadena pesada;

CH1 representa un dominio de una región constante de cadena pesada, por ejemplo el dominio 1 de la misma; X representa un enlace o conector;

Y representa un enlace o conector;

V1 representa un dsFv o un dsscFv;

V^lrepresenta un dominio variable de la cadena ligera;

V2 representa dsFv o un dsscFv.

2. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según la reivindicación 1, en donde X es un conector.

3. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde Y es un conector.

4. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde V1 es un dsFv y V2 es un dsFv.

5. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde V1 es un dsscFv y V2 es un dsscFv.

6. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde V1 es un dsscFv y V2 es un dsFv, o en donde V1 es un dsFv y V2 es un dsscFv.

7. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el dominio variable de la cadena ligera o el dominio variable de la cadena pesada de V1 está unido a X, por ejemplo, por un enlace peptídico.

8. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el dominio variable de la cadena ligera o el dominio variable de la cadena pesada de V2 está unido a Y, por ejemplo, por un enlace peptídico.

9. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada de V1 y/o los dominios variables de la cadena ligera y la cadena pesada de V2 están unidos por un enlace disulfuro entre los restos de cisteína genéticamente modificados.

10. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera de V1 y/o V2 están unidos por un enlace disulfuro entre dos restos de cisteína, en donde la posición del par de restos de cisteína se selecciona del grupo que consiste en: Vh37 y Vl95, Vh44 y V l100, Vh44 y Vl105, Vh45 y Vl87, Vh100 y Vl50, VH100b y Vl49, Vh98 y Vl46, Vh101 y Vl46, Vh105 y Vl43 y Vh106 y Vl57 (numeración según Kabat), en donde los valores de Vh y Vl se seleccionan independientemente dentro de un V1 o V2 dado.

11. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según la reivindicación 10, en donde la posición del par de restos de cisteína genéticamente modificados es V^h44 y V^l100.

12. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde X es un conector peptídico.

13. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según la reivindicación 12, en donde X es un conector peptídico seleccionado de SEQ ID NO: 1,2, 69 y 70.

14. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde Y es un conector peptídico.

15. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según la reivindicación 14, en donde Y es un conector peptídico seleccionado de SEQ ID NO: 1,2, 69 y 70.

16. La molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que es triespecífico.

17. La molécula de anticuerpo triespecífico según la reivindicación 16, en donde cada uno de los tres dominios de unión se une a diferentes antígenos.

18. Un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. Un vector que comprende un polinucleótido definido en la reivindicación 18.

20. Una célula hospedante que comprende el polinucleótido o vector de la reivindicación 18 o 19 respectivamente.

21. Una célula hospedante que comprende dos o tres vectores, comprendiendo cada vector un polinucleótidos que codifica una cadena de polipéptido diferente de una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

22. Un procedimiento que comprende expresar una molécula de anticuerpo multiespecífica a partir de una célula hospedante definida en la reivindicación 20 o reivindicación 21.

23. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, y al menos un excipiente.

24. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, o una composición farmacéutica según la reivindicación 23 para usar en un tratamiento.