ES2926019T3

ES2926019T3 - Estructuras de anticuerpos para reducir la agregación de anticuerpos multiespecíficos

Info

Publication number: ES2926019T3
Application number: ES17837952T
Authority: ES
Inventors: Pallavi Bhatta; David Paul Humphreys
Original assignee: UCB Biopharma SRL
Current assignee: UCB Biopharma SRL
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2017-12-18
Publication date: 2022-10-21
Anticipated expiration: 2037-12-18
Also published as: JP7016367B2; BR112019011150A2; EP3555140B1; EA201991510A1; EP3555140A1; CN110114372A; GB201621591D0; CA3045553A1; US20210324111A1; JP2020502181A; WO2018114795A1

Abstract

La presente invención proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión cada uno con una región pesada variable VH y una región ligera variable VL, donde cada dominio de unión es específico para un antígeno y comprende 6 CDR, caracterizado porque al menos un dominio de unión comprende una región pesada variable, VHA, que tiene un marco que comprende valina en la posición (5), lisina en la posición (13), alanina en la posición (24) y treonina en la posición (96) con la condición de que CDRH3 en VHA no sea RYYSAMPFAY (SEQ ID NO:29) y una región ligera variable, VLA, que tiene un marco que comprende leucina en la posición (11) y glutamina en la posición (103). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Estructuras de anticuerpos para reducir la agregación de anticuerpos multiespecíficos

La presente descripción se refiere a una molécula de anticuerpo que comprende una estructura con una propensión reducida a la agregación, y un método para generar la misma. La descripción también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de anticuerpo de la presente descripción y el uso de cualquiera de las mismas en un tratamiento. La descripción se amplía además a las moléculas de anticuerpo obtenidas del método.

Antecedentes

A través de la unión simultánea a dos antígenos, los anticuerpos biespecíficos pueden invocar una biología novedosa y pueden ofrecer una mayor eficacia clínica a través de una mejor selección del objetivo de los fármacos. Fv y scFv son dominios de unión al antígeno discretos que se han fusionado con armazones de Fab o IgG para conferir multiespecificidad en una amplia variedad de formatos (revisado en Spiess et al., 2015). La conversión de Fv a scFv a través de la introducción de un conector polipeptídico entre vH y vL se llevó a cabo originalmente para estabilizar la interfase vH-vL relativamente débil, pero el intercambio dinámico de dominios ("respiración") entre monómeros de scFv proximales puede dar como resultado niveles variables de monómero, dímero y multímeros de orden superior (Weatherill et al., 2012). Los altos niveles de formación de multímeros durante la expresión de proteínas darán como resultado, en última instancia, bajos rendimientos generales de proteínas terapéuticas.

La formación de un enlace disulfuro (ds) en scFv entre vH y vL evita que el dominio variable "respire" dentro del scFv purificado y, por lo tanto, fija las proporciones monómero:multímero para permitir la purificación de productos monoméricos (Weatherill, et al., 2012). La introducción de un enlace disulfuro vH-vL bloquea irreversiblemente todas las formas multiméricas durante la expresión/purificación y, por lo tanto, facilita la separación de las especies deseables (monoméricas) de las indeseables (multiméricas) mediante purificación. Así, la presencia del enlace disulfuro no optimiza la cantidad de monómero expresado. El documento WO2014/206561 describe estructuras de cadenas ligeras de anticuerpos humanos quiméricos con el objetivo de reducir la propensión a la agregación, en el contexto de los scFv monoespecíficos.

Sin embargo, existe una necesidad continua en la técnica de proporcionar nuevos medios para mejorar la producción de monómeros de anticuerpos multiespecíficos.

Sumario de la descripción

La presente descripción proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión, cada uno con una región pesada variable VH y una región ligera variable VL, donde cada dominio de unión es específico de un antígeno y comprende 6 CDR, caracterizado porque al menos un dominio de unión comprende:

a. una región pesada variable, VH^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 1 para FR1, SEQ ID NO: 3 para FR2, SEQ ID NO: 4 para FR3 y SEQ ID NO: 5 para FR4, con la condición de que CDRH3 en VH^asea distinta de RYYSAMPFAY (SEQ ID NO: 129) y una región ligera variable, VL^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 6 para FR1, SEQ ID NO: 7 para FR2, SEQ ID NO: 8 para FR3 y SEQ ID NO: 10 para FR4; o

b. una región pesada variable, VH^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 16 para FR1, SEQ ID NO: 18 para FR2, SEQ ID NO: 19 para F^r3 y SEQ ID NO: 20 para FR4, con la condición de que CDRH3 en VH^asea distinta de RYYSAMPFAY (SEQ ID NO: 129) y una región ligera variable, VL^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 11 para FR1, SEQ ID NO: 12 para FR2, SEQ ID NO: 13 para FR3 y SEQ ID NO: 15 para FR4;

y en donde al menos una región variable VH^ay la al menos una región variable VL^aestán presentes en un dsscFv, y donde la molécula de anticuerpo multiespecífico es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2.

La descripción se resumirá en los siguientes párrafos:

1. Una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión, cada uno con una región pesada variable VH y una región ligera variable VL, donde cada dominio de unión es específico de un antígeno y comprende 6 CDR, caracterizada porque al menos un dominio de unión comprende:

a. una región pesada variable, VH^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 1 para FR1, SEQ ID NO: 3 para FR2, SEQ ID NO: 4 para F^r3 y SEQ ID NO: 5 para FR4, con la condición de que CDRH3 en VH^asea distinta de RYYSAMPFAY (SEQ ID NO: 129) y una región ligera variable, VL^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 6 para FR1, SEQ ID NO: 7 para FR2, SEQ ID NO: 8 para FR3 y SEQ ID NO: 10 para ^fR4; o

b. una región pesada variable, VH^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 16 para FR1, SEQ ID NO: 18 para FR2, SEQ ID NO: 19 para FR3 y SEQ ID NO: 20 para FR4, con la condición de que CDRH3 en VH^asea distinta de RYYSAMPFAY (SEQ ID NO: 129) y una región ligera variable, VL^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 11 para FR1, SEQ ID NO: 12 para FR2, SEQ ID NO: 13 para FR3 y SEQ ID NO: 15 para FR4;

2. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según el párrafo 1, en donde VL^acomprende SEQ ID NO: 99 y VH^acomprende SEQ ID NO:101.

3. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según el párrafo 2, en donde un dominio de unión comprende SEQ ID NO:106.

4. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según el párrafo 1, en donde VL^acomprende SEQ ID NO: 103 y VH^acomprende SEQ ID NO:105.

5. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según el párrafo 4, en donde un dominio de unión comprende SEQ ID NO:111.

6. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según cualquiera de los párrafos 1 a 5, en donde la VHA comprende 3 CDR de la cadena pesada que tienen la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 143 para CDRH1, SEQ ID NO: 144 para CDRH2 y SEQ ID NO: 145 para CDRH3.

7. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según cualquiera de los párrafos 1 a 6, en donde la VL^acomprende 3 CDR de la cadena ligera que tienen la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 146 para CDRL1, SEQ ID NO: 147 para CDRL2 y SEQ ID NO: 148 para CDRL3.

8. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según cualquier párrafo anterior, en donde las CDR tienen un origen no humano.

9. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según cualquier párrafo anterior, en donde la molécula de anticuerpo es biespecífica o triespecífica, tal como biespecífica.

10. Una estructura aceptora para minimizar la agregación en un anticuerpo multiespecífico que comprende SEQ ID NO: 22 y 24, donde XXX en cada una de las posiciones de CDR representan independientemente de 1 a 35 aminoácidos, y donde SEQ ID NO: 22 y 24 están presentes en un dsscFv, y donde el anticuerpo multiespecífico es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2.

11. Un método para mejorar los niveles de expresión de monómero de una molécula de anticuerpo que tiene al menos un dominio de unión con una región pesada variable y una región ligera variable donde cada región variable tiene una estructura y 3 CDR, comprendiendo dicho método la etapa de cambiar una estructura de una región variable a una estructura seleccionada del grupo que comprende o consiste en:

i) una estructura (tal como una estructura de la región VH) que comprende SEQ ID NO: 1 para FR1, SEQ ID NO: 3 para FR2, SEQ ID NO: 4 para FR3 y SEQ ID NO: 5 para FR4,

ii) una estructura (tal como una estructura de la región VH) que comprende SEQ ID NO: 16 para FR1, SEQ ID NO: 18 para FR2, S^eQ ID NO: 19 para FR3 y SEQ ID NO: 20 para FR4,

iii) una estructura (tal como una estructura de la región VL) que comprende SEQ ID NO: 6 para FR1, SEQ ID NO: 7 para FR2, SEQ ID NO: 8 para FR3 y SEQ ID NO: 10 para FR4,

iv) una estructura (tal como una estructura de la región VL) que comprende VL1, SEQ ID NO: 11 para FR1, SEQ ID NO: 12 para FR2, SEQ ID NO: 13 para FR3 y SEQ ID NO: 15 para FR4,

v) combinaciones de las mismas y,

donde la estructura i), ii), iii), iv) o las combinaciones de las mismas están presentes en un dsscFv, y donde la molécula de anticuerpo es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2.

Sumario de las figuras

Figura 1 Es una tabla que establece el formato incluido en el "conjunto 1"

Figura 2 Establece las secuencias según la presente invención.

Figura 3 Conjunto 1. Títulos de expresión de Fabs y BYbes (estructuras afines) expresados en células ExpiHEK, n = 2

Figura 4 % de monómero de Fabs y BYbes del conjunto 1 (pares afines)

Figura 5 SDS-PAGE de Fabs del Conjunto 1. Fab completo (a) y cadenas ligeras y pesadas (b)

Figura 6 SDS-PAGE de BYbes del Conjunto 1

Figura 7 Muestra los formatos de Fab-dsFv y Fab-dsscFv y las formas de monómero y dímero

Figura 8 Muestra los formatos de Fab-2x dsscFv y Fab-dsscFv-dsFv

Descripción detallada

Los presentes inventores han investigado la influencia sobre la multimerización de la estructura de dsscFv (FW) y los residuos de CDR mediante el injerto de una gama de Fab-dsscFv con "intercambio" de Fv FW/CDR. Sorprendentemente, descubrieron que ciertas estructuras pueden afectar positivamente a los niveles de monómero logrados.

La presente descripción proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión, cada uno con una región pesada variable VH y una región ligera variable VL, donde cada dominio de unión es específico de un antígeno y comprende 6 CDR, caracterizado porque al menos un dominio de unión comprende una región pesada variable, VH^a, que tiene una estructura que comprende:

a. SEQ ID NO: 1 para FR1, SEQ ID NO: 3 para FR2, SEQ ID NO: 4 para FR3 y SEQ ID NO: 5 para FR4, con la condición de que CDRH3 en VH^asea distinta de RYYSAMPFAY (SEQ Id NO: 129) y una región ligera variable, VL^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 6 para FR1, SEQ ID NO: 7 para FR2, SEQ ID NO: 8 para FR3 y SEQ ID NO: 10 para FR4; o

b. una región pesada variable, VH^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 16 para FR1, SEQ ID NO: 18 para FR2, SEQ ID NO: 19 para Fr 3 y SEQ ID NO: 20 para FR4, con la condición de que CDRH3 en VH^asea distinta de RYYSAMPFAY (SEQ ID NO: 129) y una región ligera variable, VL^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 11 para FR1, SEQ ID NO: 12 para FR2, SEQ ID NO: 13 para FR3 y SEQ ID NO: 15 para FR4;

Las moléculas de anticuerpos multiespecíficos que tienen las VH^ay VL^a, los residuos estructurales y las secuencias, como se describe en la presente invención, pueden comprender cualquier residuo de CDR adecuado. En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico comprende 3 CDR de la cadena pesada en VH^aque tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 143 para CDRH1, SEQ ID NO: 144 para CDRH2 y SEQ ID NO: 145 para CDRH3. En otra realización, comprende 3 CDR de la cadena ligera en VL^aque tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:146 para CDRL1, SEQ iD NO:147 para CDRL2 y SEQ ID NO:148 para CDRL3. En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico comprende 3 CDR de la cadena pesada en VH^aque tiene la secuencia dada en SEQ ID NO: 143 para CDRH1, SEQ ID ⁿO: 144 para CDRH2 y SEQ iD NO: 145 para CDRH3 y 3 CDR de la cadena ligera en VL^aque tiene la secuencia dada en SEQ ID NO:146 para CDRL1, SEQ ID NO:147 para CDRL2 y SEQ ID NO:148 para CDRL3.

En otra realización de la presente invención, el anticuerpo multiespecífico comprende 497 secuencias estructurales (las de SEQ ID NO: 1,3-8 y 10).

En consecuencia, la presente descripción proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión, cada uno con una región pesada variable y una región ligera variable, donde cada dominio de unión es específico de un antígeno y comprende 6 CDR, caracterizado porque al menos una región variable, VH^a, tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 1 para FR1, SEQ ID n O: 3 para FR2, SEQ ID NO: 4 para FR3 y SEQ ID NO: 5 para FR4 con la condición de que CDRH3 en VH^asea distinta de RYYSAMPFAY (SEQ ID NO: 129), en el que la VH^aestá emparejada con VL^a, y donde VL^atiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 6 para FR1, SEQ ID NO: 7 para Fr 2, SEQ ID NO: 8 para FR3 y SEQ ID NO: 10 para FR4, en el que la región variable VH^ay la región variable VL^aestán presentes en un dsscFv, y donde la molécula de anticuerpo multiespecífico es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2.

En una realización de la presente descripción, se proporcionan estructuras aceptoras para minimizar la agregación que comprenden SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, donde XXX en cada una de las posiciones de CDR representan independientemente de 1 a 35 aminoácidos, y donde SEQ ID NO : 22 y 24 están presentes en un dsscFv, y donde el anticuerpo multiespecífico es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2.

En una realización de la presente descripción, se proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión, cada uno con una región pesada variable y una región ligera variable, en donde cada dominio de unión es específico de un antígeno y comprende 6 CDR, caracterizado porque una región variable, VH^a, está emparejada con la región variable VL^aque tiene una de las siguientes combinaciones de secuencias de aminoácidos de VH^ay VL^ade la Tabla 3:

Tabla 3:

En un aspecto, la presente descripción proporciona un anticuerpo dsscFv que comprende SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 107 en el que el anticuerpo dsscFv es parte de un anticuerpo multiespecífico BYbe o TrYbe.

En una realización alternativa de la presente invención, al menos un dominio de unión con una región pesada variable VH^ay una región ligera variable VL^aque comprende secuencias estructurales 2109 como se describe a continuación (las de SEQ ID NO: 16, 18-20, 11-13 y 15).

En una realización adicional de este aspecto de la presente invención, el anticuerpo multiespecífico comprende las secuencias flanqueantes 2109. En consecuencia, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión, cada uno con una región pesada variable y una región ligera variable, donde cada dominio de unión es específico de un antígeno y comprende 6 CDR, caracterizado porque al menos una región variable, VH^a, tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 16 para FR1, SEQ ID NO: 18 para FR2, SEQ ID NO: 19 para FR3 y SEQ ID NO: 20 para FR4, con la condición de que CDRH3 en VH^asea distinta de RYYSAMPFAY (SEQ ID NO: 129) o PPQYYEGSIYRLWFAH (SEQ ID NO: 117), en donde la VH^aestá emparejada con VL^a, y donde VL^atiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 11 para FR1, SEQ ID NO: 12 para FR2, ^sE^qID NO: 13 para FR3 y SEQ ID NO: 15 para FR4 con la condición de que CDRL3 en VL^asea diferente de QQNYDFPLT (SEQ ID NO: 136) o QQTWSDPWT (SEQ ID NO: 120), en donde la región variable VH^ay la región variable VL^aestán presentes en un dsscFv, y donde la molécula de anticuerpo multiespecífico es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2.

En una realización no cubierta por la invención reivindicada, la presente descripción proporciona estructuras aceptoras para minimizar la agregación que comprenden SEQ ID NO: 26 y 28, donde XXX en cada una de las posiciones de CDR representan independientemente de 1 a 35 aminoácidos, y donde SEQ ID NO: 26 y 28 están presentes en un dsscFv, y donde el anticuerpo multiespecífico es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2.

En una realización del segundo aspecto, la presente descripción proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión, cada uno con una región pesada variable y una región ligera variable, en donde cada dominio de unión es específico de un antígeno y comprende 6 CDR, caracterizado porque una región variable, VH^a, está emparejada con la región variable VL^aque tiene una de las siguientes combinaciones de secuencias de aminoácidos de VH^ay VL^ade

Tabla 4:

En un aspecto, la presente descripción proporciona un anticuerpo dsscFv que comprende SEQ ID NO: 111 o SEQ ID NO: 112, en el que el anticuerpo dsscFv es parte de un anticuerpo multiespecífico BYbe o TrYbe.

El anticuerpo multiespecífico de la presente invención puede contener los residuos o secuencias de la estructura 497 como se definió anteriormente en uno o más, como dos, dominios de unión. El anticuerpo multiespecífico de la presente invención puede contener los residuos o secuencias de la estructura 2109 como se definió anteriormente en uno o más, como dos, dominios de unión. El anticuerpo multiespecífico de la presente invención puede contener los residuos o secuencias de la estructura 497 como se definió anteriormente en un dominio de unión y los residuos o secuencias de la estructura 2109 como se definió anteriormente en otro dominio de unión.

En consecuencia, la presente invención proporciona las siguientes combinaciones de estructuras de la Tabla 5 como se define en los aspectos primero y segundo de la presente invención para anticuerpos multiespecíficos que comprenden dos o más dominios de unión.

Tabla 5:

En cualquiera de los aspectos primero y segundo anteriores de la presente descripción, las regiones variables de la presente descripción no comprenden una o más, como todas, las siguientes CDR del Anticuerpo 1

CDRH1: GFTFSDYNMA (SEQ ID NO: 115)

CDRH2: TITYEGRNTYYRDSVKG (SEQ ID NO: 116)

CDRH3: PPQYYEGSIYRLWFAH (SEQ ID NO: 117)

CDRL1: RADESVRTLMH (SEQ ID NO: 118)

CDRL2: LVSNSEI (SEQ ID NO: 119)

CDRL3: QQTWSDPWT (SEQ ID NO: 120)

En cualquiera de los aspectos primero y segundo anteriores de la presente descripción, las regiones variables de la presente descripción no comprenden una o más, como todas, las siguientes CDR del Anticuerpo 2:

CDRH1: GVIFSDYYMA (SEQ ID NO: 121)

CDRH2: SINFNADISYYRESVKG (SEQ ID NO: 122)

CDRH3: DANRQNYDWFAY (SEQ ID NO: 123)

CDRL1: KASESVSSSMYSYMH (SEQ ID NO: 124)

CDRL2: RASNLES (SEQ ID NO: 125)

CDRL3: QQSWTAPRT (SEQ ID NO: 126)

En cualquiera de los aspectos primero y segundo anteriores de la presente descripción, las regiones variables de la presente descripción no comprenden una o más, como todas, las siguientes CDR del Anticuerpo 3:

CDRH1: GYTFTDNYIH (SEQ ID NO: 127)

CDRH2: YINPSSAYAHYNEKFKT (SEQ ID NO: 128)

CDRH3: RYYSAMPFAY (SEQ ID NO: 129)

CDRL1: RASEDIYSGLA (SEQ ID NO: 130) o

RASEDIYNGLA (SEQ ID NO: 131)

CDRL2: DSSTLHT (SEQ ID NO: 132), o

NSNTLHT (SEQ ID NO: 133), o

NSSTLHT (SEQ ID NO: 134), o

DSNTLHT (SEQ ID NO: 135)

CDRL3: QQNYDFPLT (SEQ ID NO: 136)

El dominio variable según la presente descripción no tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 149.

El dominio variable según la presente descripción no tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 150.

El dominio variable según la presente descripción no tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 151.

El dominio variable según la presente descripción no tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 152.

El dominio variable según la presente descripción no tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 153.

En los anticuerpos multiespecíficos de la descripción, las regiones variables no comprenden las CDR del Anticuerpo 1 definidas anteriormente, las CDR del Anticuerpo 2 definidas anteriormente o las CDR del Anticuerpo 3 definidas anteriormente.

En una realización, al menos un dominio de unión, tal como un dominio de unión en la molécula de anticuerpo multiespecífico, no comprende una estructura de la presente descripción.

Ventajosamente, el uso de las secuencias estructurales de la presente descripción en regiones variables propensas a la agregación, por ejemplo a través del proceso dinámico denominado respiración, puede proporcionar un rendimiento de monómero mejorado y/o una propensión reducida a la agregación.

La presente invención también proporciona un método para mejorar los niveles de expresión de monómeros de una molécula de anticuerpo que tiene al menos un dominio de unión con una región pesada variable y una región ligera variable donde cada región variable tiene una estructura y 3 CDR, comprendiendo dicho método la etapa de cambiar una estructura de una región variable a una estructura seleccionada del grupo que comprende o consiste en:

iii) una estructura (tal como una estructura de la región VL) que comprende SEQ ID NO: 6 para FR1, SEQ ID NO: 7 para FR2, SEQ ID NO: 8 para FR3 y SEQ ID NO: 10 para ^fR4.

iv) una estructura (tal como una estructura de la región VL) que comprende VL1, SEQ ID NO: 11 para FR1, SEQ ID NO: 12 para FR2, SEQ ID NO: 13 para FR3 y SEQ ID NO: 15 para F^r4,

v) las combinaciones de la estructura VH y la estructura VL, y donde la estructura i), ii), iii), iv), o las combinaciones de las mismas, están presentes en un dsscFv, y donde la molécula de anticuerpo es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2. En una realización, se proporciona un método de acuerdo con la presente descripción en el que la estructura VH se cambia a una estructura que comprende SEQ ID NO: 1 para FR1, SEQ ID NO: 3 para FR2, SEQ ID NO: 4 para FR3 y SEQ ID NO: 5 para FR4.

En una realización, se proporciona un método de acuerdo con la presente descripción en el que la estructura VH se cambia a una estructura que comprende SEQ ID NO: 16 para FR1, SEQ ID NO: 18 para F^r2, SEQ ID NO: 19 para FR3 y SEQ ID NO: 20 para FR44.

En una realización, se proporciona un método de acuerdo con la presente descripción en el que la estructura VL se cambia a una estructura que comprende SEQ ID NO: 6 para FR1, SEQ ID NO: 7 para FR2, SEQ ID NO: 8 para FR3 y SEQ ID NO: 10 para FR4.

En una realización, se proporciona un método de acuerdo con la presente descripción en el que la estructura VL se cambia a una estructura que comprende VL1, SEQ ID NO: 11 para FR1, SEQ ID NO: 12 para FR2, SEQ ID NO: 13 para FR3 y SEQ ID NO: 15 para FR4.

En una realización, se proporciona un método de acuerdo con la presente descripción, en el que los niveles de monómero de la molécula de anticuerpo se analizan antes de cambiar la estructura o estructuras.

En una realización, se proporciona un método según la presente descripción en el que la molécula de anticuerpo es una molécula de anticuerpo multiespecífico, como biespecífico o triespecífico, como biespecífico.

En una realización, se proporciona un método según la presente descripción en el que la molécula de anticuerpo multiespecífico comprende al menos dos dominios de unión, y el método comprende la etapa adicional de cambiar la posición relativa de los dominios de unión dentro de la molécula de anticuerpo.

En una realización, al menos un dominio de unión del anticuerpo multiespecífico no emplea una estructura con una propensión reducida a agregarse, como se describe en la presente memoria.

En una realización, la secuencia aceptora de la línea germinal de la cadena pesada empleada en la presente descripción es generalmente la JH4 VH3 1 -U 3-15 humana (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) y la secuencia aceptora de la línea germinal de la cadena ligera elegida fue la JK1 o 4 VK1 2-1 -(1) L4, L18, O2 o 012 humana (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/).

En una realización, las CDR injertadas de la secuencia donante a la aceptora son como las define Kabat, con la excepción de CDR-H1 donde se usa la definición combinada de Chothia/Kabat.

Este sistema de numeración se establece en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., NIH, EE. UU. (en adelante, "Kabat et al. [anteriormente mencionado]"). Este sistema de numeración se usa en la presente memoria descriptiva excepto donde se indique lo contrario.

Las designaciones de residuos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más que en la estricta numeración de Kabat correspondiente a un acortamiento o inserción en un componente estructural, ya sea una estructura o una región determinante de la complementariedad (CDR), de la estructura del dominio variable básico. La numeración correcta de Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado alineando los residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar".

Las CDR del dominio variable de la cadena pesada están ubicadas en los residuos 31 -35 (CDR-H1), los residuos 50 65 (CDR-H2) y los residuos 95-102 (CDR-H3) según el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, según Chothia (Chothia, C. y Lesk, AM. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), el bucle equivalente a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 hasta el residuo 32. Por lo tanto, "CDR-H1", como se usa en la presente memoria, comprende los residuos 26 a 35, como se describe mediante una combinación del sistema de numeración de Kabat y la definición de bucle topológico de Chothia.

Las CDR del dominio variable de la cadena ligera se ubican en los residuos 24-34 (CDR-L1), los residuos 50-56 (CDR-L2) y los residuos 89-97 (CDR-L3) según el sistema de numeración de Kabat.

"Anticuerpo multiespecífico", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una molécula de anticuerpo como se describe en la presente memoria que tiene dos o más dominios de unión, por ejemplo, dos o tres dominios de unión. En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico de la presente descripción tiene solo dos sitios de unión al antígeno.

En una realización, la construcción es un anticuerpo biespecífico. "Molécula biespecífica", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a una molécula con dos sitios de unión al antígeno, que pueden unirse a antígenos iguales o diferentes. En una realización, la molécula biespecífica se une a dos antígenos diferentes. En una realización, todos los dominios se unen al mismo antígeno, incluida la unión al mismo epítopo del antígeno o la unión a diferentes epítopos del mismo antígeno.

"Sitio de unión al antígeno", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una parte de la molécula, que comprende un par de regiones variables, en particular un par afín, que interactúan específicamente con el antígeno objetivo, es decir, la parte de la molécula que reconoce específicamente la región, forma, área, epítopo en otra proteína/polipéptido.

"Específicamente", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a un sitio de unión que solo reconoce el antígeno para el que es específico o un sitio de unión que tiene una afinidad de unión significativamente mayor por el antígeno para el que es específico en comparación con la afinidad que tiene por los antígenos para los que no es específico, por ejemplo, una afinidad de unión 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces mayor.

La afinidad de unión se puede medir mediante ensayos estándar, por ejemplo, resonancia de plasmones superficiales, como BIAcore.

En una realización, se proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico según la presente descripción, en donde la molécula de anticuerpo es biespecífica o triespecífica, tal como biespecífica.

En una realización, los formatos multivalentes incluyen los conocidos en la técnica y los descritos en la presente memoria (incluidas las descripciones en la sección de definiciones de la memoria descriptiva), en los que el formato de la molécula se selecciona del grupo que comprende o consiste en: Fab-dsscFv (también denominado BYbe), Fab-(dsscFv)2, que se analizan con más detalle a continuación. Fab-dsscFv (BYbe) también se muestra en la Figura 7. Los formatos de Fab-(dsscFv)2 también se muestran en la Figura 8 y también se conocen como formato TrYbe.

En una realización, las regiones VH^ay VL^aque tienen los residuos o secuencias de la estructura como se describe en la presente invención están presentes en un dsscFv. El dsscFv es parte de una molécula de anticuerpo multiespecífico en donde el dsscFv es parte de una molécula de anticuerpo BYbe o TrYbe.

En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico comprende o consiste en:

a) una cadena polipeptídica de fórmula (Ia):

VH-CH1-X-V1;

b) una cadena polipeptídica de fórmula (IIa):

V^l-C^l;

donde

VH representa un dominio variable de la cadena pesada;

CH1 representa un dominio de una región constante de la cadena pesada, por ejemplo, el dominio 1 de la misma; X representa un enlace o enlazador;

V1 representa un dsscFv;

V^lrepresenta un dominio variable, por ejemplo, un dominio variable de la cadena ligera;

C^lrepresenta un dominio de una región constante, por ejemplo, un dominio de región constante de la cadena ligera, tal como Ckappa.

En una realización, se proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende o consiste en: a) una cadena polipeptídica de fórmula (Ib):

VH-CH1;

b) una cadena polipeptídica de fórmula (IIb):

V^l-C^l-Y-V²;

donde V^h, CH1, V^l, C^lson como se definieron anteriormente y;

donde Y representa un enlace o enlazador y;

donde V2 representa un dsscFv.

En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico según la presente descripción es un BYbe (es decir, una molécula de anticuerpo de fórmula (Ia y IIa) o (Ib y IIb) también como se muestra en la Figura 7.

En el método según la presente invención, en una realización la estructura o estructuras insertadas/reemplazadas están en un dsscFv donde el dsscFv es parte de un BYbe.

En una realización, la estructura insertada está en el componente dsscFv de un BYbe.

En una realización, la molécula de anticuerpo multiespecífico de acuerdo con la presente descripción se proporciona como un dímero de una cadena pesada y una cadena ligera (juntos, un par se denomina en la presente memoria "monómero") de:

• fórmula (I) y (II) respectivamente, donde la porción VH-CH1 junto con la porción V^l-C^lforma un fragmento funcional Fab o Fab'; o

• fórmula (Ia) y (IIa) respectivamente, donde la porción VH-CH1 junto con la porción V^l-C^lforma un fragmento funcional Fab o Fab'; o

• fórmula (Ib) y (Ilb) respectivamente, donde la porción Vh-CHi junto con la porción Vl-Cl forma un fragmento funcional Fab o Fab'.

En un aspecto de la presente invención, la molécula de anticuerpo multiespecífico se proporciona como un dímero que comprende o consiste en:

a) una cadena polipeptídica de fórmula (I):

VH1-CH1-X-V1; y

b) una cadena polipeptídica de fórmula (II):

Vl1-Cl-Y-V2;

donde:

V^h1 representa un dominio variable de la cadena pesada;

Y representa un enlace o enlazador;

VI representa un dsscFv;

VII representa un dominio variable de la cadena ligera;

C^lrepresenta un dominio de una región constante de la cadena ligera, como Ckappa;

V2 representa un dsscFv.

V1 es un dsscFv y V2 es un dsscFv que también puede denominarse Fab-(dsscFv)2. VI y/o V2 pueden contener las secuencias flanqueantes de VHA y ^vL^asegún la presente invención.

V^hrepresenta un dominio variable. En una realización, V^hrepresenta un dominio variable de la cadena pesada. En una realización, Vh es un dominio variable quimérico, es decir, comprende componentes derivados de al menos dos especies, por ejemplo, una estructura humana y CDR no humanas. En una realización, V^hestá humanizado. En una realización, la V^hes completamente humana.

V^lrepresenta un dominio variable. En una realización, V^lrepresenta un dominio variable de la cadena ligera. En una realización V^les un dominio variable quimérico, es decir, comprende componentes derivados de al menos dos especies, por ejemplo, una estructura humana y CDR no humanas. En una realización, Vl está humanizado. En una realización, la Vl es completamente humana.

Generalmente, Vh y Vl juntos forman un dominio de unión al antígeno. En una realización, Vh y Vl forman un par afín. "Par afín", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a un par de dominios variables de un solo anticuerpo, que se generó in vivo, es decir, el emparejamiento natural de los dominios variables aislados de un huésped. Un par afín es por lo tanto un par Vh y Vl . En un ejemplo, el par afín se une al antígeno de manera cooperativa. Los pares afines suelen ser ventajosos porque la maduración de la afinidad por el antígeno se produce en el huésped y puede estar muy optimizada y ser muy específica de dicho antígeno.

"Región variable", como se emplea en la presente memoria, se refiere a la región de una cadena de anticuerpo que comprende las 3 CDR y una estructura adecuada. Las regiones variables para el uso en la presente descripción generalmente derivarán de un anticuerpo (tal como un anticuerpo aislado de un huésped), que puede generarse mediante cualquier método conocido en la técnica.

"Derivado de", como se emplea en la presente memoria, se refiere al hecho de que la secuencia empleada o una secuencia muy similar a la secuencia empleada se obtuvo del material genético original, tal como la cadena ligera o pesada de un anticuerpo.

"Muy similar", tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos que en toda su longitud es similar en un 95% o más, tal como un 96, 97, 98 o 99% similar.

En una realización, el dominio de unión formado por V^hy V^les específico de un primer antígeno.

En una realización, el dominio CH1 es un dominio 1 de origen natural de una cadena pesada o un derivado del mismo, por ejemplo, la secuencia de CH1 de IgG1 proporcionada en SEQ ID NO: 108 o la secuencia CH1 de IgG4 proporcionada en SEQ ID NO: 109.

En una realización, el fragmento C^l, en la cadena ligera, es una secuencia kappa constante o una secuencia lambda constante o un derivado de cualquiera de las mismas, por ejemplo, la secuencia kappa proporcionada en SEQ ID NO: 110.

Un derivado de un dominio de origen natural como se emplea en la presente memoria se refiere a cuando uno, dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos de una secuencia de origen natural han sido reemplazados o eliminados, por ejemplo, para optimizar las propiedades del dominio, como eliminar propiedades indeseables pero en las que se retienen la(s) característica(s) del dominio.

En una realización, uno o más enlaces disulfuro naturales o modificados entre cadenas (es decir, entre cadenas ligeras y pesadas) están presentes en el fragmento Fab o Fab' funcional.

En una realización, un enlace disulfuro "natural" está presente entre un CH1 y C^len las cadenas polipeptídicas de las construcciones de la presente descripción, por ejemplo la fórmula (I) y (II); o la fórmula (Ia) y (IIa); o la fórmula (Ib) y (I Ib).

Cuando el dominio C^lderiva de Kappa o Lambda, la posición natural para una cisteína formadora de enlaces es 214 en cKappa y cLambda humanos (numeración de Kabat, 4a edición, 1987).

La ubicación exacta del enlace disulfuro que forma la cisteína en CH1 depende del dominio particular realmente empleado. Así, por ejemplo, en la gamma-1 humana, la posición natural del enlace disulfuro se encuentra en la posición 233 (numeración de Kabat, 4a edición, 1987). Se conoce la posición de la cisteína que forma el enlace para otros isotipos humanos como gamma 2, 3, 4, IgM e IgD, por ejemplo la posición 127 para IgM humana, IgE, IgG2, IgG3, IgG4 y 128 de la cadena pesada de IgD humana e IgA2B.

Puede haber un enlace o enlace(s) disulfuro en la región constante de la molécula además del enlace disulfuro entre el par de dominios variables V^hy V^l.

En una realización, el anticuerpo multiespecífico según la descripción tiene un enlace disulfuro en una posición equivalente o correspondiente a la que se produce de forma natural entre CH1 y C^l.

En una realización, una región constante que comprende CH1 y una región constante como C^ltiene un enlace disulfuro que no se encuentra en una posición natural. Esto se puede diseñar en la molécula introduciendo cisteína(s) en la cadena de aminoácidos en la posición o posiciones requeridas. Este enlace disulfuro no natural se suma o es una alternativa al enlace disulfuro natural presente entre CH1 y C^l.

La introducción de cisteínas manipuladas puede realizarse utilizando cualquier método conocido en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, mutagénesis por solapamiento mediante extensión con PCR, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis con casete (véase, en general, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993). Los kits de mutagénesis dirigida al sitio están disponibles comercialmente, p. ej. El kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene, La Jolla, CA). La mutagénesis con casete se puede realizar basándose en Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323. Alternativamente, se pueden producir mutantes mediante la síntesis total de genes mediante hibridación, ligadura y amplificación por PCR y clonación de oligonucleótidos solapantes.

"Fragmento variable de cadena sencilla" o "scFv", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento variable de cadena sencilla que está estabilizado por un conector peptídico entre los dominios variables V^hy V^l.

"Fragmento variable de cadena sencilla estabilizado con disulfuro" o "dsscFv", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento variable de cadena sencilla que está estabilizado por un conector peptídico entre los dominios variables V^hy V^l, y también incluye un enlace disulfuro entre dominios entre V^hy V^l.

En una realización, el enlace disulfuro entre los dominios variables V^hy V^lde V1 o V2 está entre dos de los residuos enumerados a continuación (a menos que el contexto indique lo contrario, se emplea la numeración de Kabat en la lista a continuación). Dondequiera que se haga referencia a la numeración de Kabat, la referencia relevante es Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. UU., NIH, EE. UU.

En una realización, el enlace disulfuro está en una posición seleccionada del grupo que comprende:

• V^h37 V^l95C véase por ejemplo Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997);

• V^h44 V^l100 véase por ejemplo; Biochemistry 335451-5459 Reiter et al (1994); o Journal of Biological Chemistry vol. 269 n.° 28 págs. 18327-18331 Reiter et al (1994); o Protein Engineering, vol.10 n.° 12 págs.1453-1459 Rajagopal et al (1997);

• V^h44 V^l105 véase por ejemplo J Biochemistry. 118, 825-831 Luo et al (1995);

• V^h45 V^l87 véase por ejemplo Protein Science 6, 781 -788 Zhu et al (1997);

• V^h55 V^l101 véase por ejemplo FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995);

• V^h100 V^l50 véase por ejemplo Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990);

• V^h100b V^l49;

• V^h98 V^l46 véase por ejemplo Protein Science 6, 781 -788 Zhu et al (1997);

• V^h101 V^l46;

• V^h105 V^l43 véase por ejemplo; Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 90 págs. 7538-7542 Brinkmann et al (1993); o Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994),

• V^h106 V^l57 véase por ejemplo FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)

y una posición o posiciones correspondientes a las mismas en un par de regiones variables ubicadas en la molécula.

En una realización, el enlace disulfuro se forma entre las posiciones V^h44 y V^l100.

Los pares de aminoácidos enumerados anteriormente están en las posiciones que conducen al reemplazo por cisteínas de manera que se pueden formar enlaces disulfuro. Las cisteínas pueden introducirse mediante ingeniería genética en estas posiciones deseadas mediante técnicas conocidas. En una realización, por lo tanto, una cisteína introducida mediante ingeniería genética según la presente descripción se refiere a que el residuo natural de una posición de aminoácido dada ha sido reemplazado por un residuo de cisteína.

La introducción de cisteínas mediante ingeniería genética puede realizarse utilizando cualquier método conocido en la técnica. Estos métodos incluyen, pero sin limitación, mutagénesis por solapamiento mediante extensión con PCR, mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis con casete (véase, en general, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausbel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing & Wiley-Interscience, NY, 1993). Los kits de mutagénesis dirigida al sitio están disponibles comercialmente, p. ej. El kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagen, La Jolla, CA). La mutagénesis con casete se puede realizar basándose en Wells et al., 1985, Gene, 34:315-323.

Alternativamente, los mutantes se pueden hacer mediante la síntesis total de genes mediante hibridación, ligadura y amplificación por PCR y clonación de oligonucleótidos solapados.

En consecuencia, en una realización los dominios variables V^hy V^lde V1 o V2 pueden estar unidos por un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína, donde la posición del par de residuos de cisteína se selecciona del grupo que comprende o consiste en: V^h37 y V^l95, V^h44 y V^l100, V^h44 y V^l105, V^h45 y V^l87, V^h100 y V^l50, VH100b y V^h98 y V^l46, V^h101 y V^l46, V^h105 y V^l43 y V^h106 y V^l57.

En una realización, los dominios variables V^hy V^lde V1 o V2 pueden estar unidos por un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína, uno en V^hy uno en V^l, que están fuera de las CDR, por ejemplo, donde la posición del par de residuos de cisteína se selecciona del grupo que consiste en V^h37 y V^l95, V^h44 y V^l100, V^h44 y V^l105, V^h45 y V^l87, V^h100 y V^l50, V^h98 y V^l46, V^h105 y V^l43 y V^h106 y V^l57.

En una realización, los dominios variables V^hy V^lde V1 están unidos por un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína introducidos mediante ingeniería genética, uno en la posición V^h44 y el otro en V^l100.

En una realización, los dominios variables V^hy V^lde V2 están unidos por un enlace disulfuro entre dos residuos de cisteína introducidos mediante ingeniería genética, uno en la posición V^h44 y el otro en V^l100.

En una realización, el dominio variable de la cadena pesada del V1 de dsscFv está unido a X, o el dominio variable de la cadena pesada del V2 de dsscFv está unido a Y.

En una realización, el dominio variable de la cadena ligera de V1 de dsscFv está unido a X, o el dominio variable de la cadena ligera de V2 de dsscFv está unido a Y.

En una realización, el dominio V^hde V1 está unido a X, por ejemplo, está unido a CH1. En una realización, el dominio V^lde V1 está unido a X, por ejemplo, está unido a CH1. En una realización, el dominio V^hde V2 está unido a Y, por ejemplo, está unido a CKappa. En una realización, el dominio V^lde V2 está unido a Y, por ejemplo, está unido a CKappa. En una realización, X es un enlace. En una realización, Y es un enlace. En una realización, tanto X como Y son enlaces.

En una realización, X es un enlazador, por ejemplo, un péptido adecuado para conectar las porciones CH1 y V1. En una realización, Y es un enlazador, por ejemplo, un péptido adecuado para conectar las porciones C^ly V2. En una realización, tanto X como Y son enlazadores.

En una realización, el enlazador peptídico tiene una longitud de 50 aminoácidos o menos, por ejemplo, 20 aminoácidos o menos, como 19, 10, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ,6 , 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácido.

En una realización, el enlazador se basa en unidades repetitivas de G4S (es decir, GGGGS, SEQ ID NO: 42), por ejemplo 1, 2, 3, 4 o 5 unidades del mismo, como SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (S^eQ ID NO: 45). En una realización, un enlazador empleado en una construcción de la presente descripción tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 46, por ejemplo, la secuencia se puede emplear cuando X o Y es un enlazador.

Por supuesto, existen al menos tres ubicaciones posibles para los enlazadores en las construcciones de la presente descripción, X, Y y en el componente scFv.

En una realización, el enlazador se selecciona de una secuencia que se muestra en la presente memoria, por ejemplo, la secuencia 29 a 97. En una realización, el enlazador se selecciona de una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 29 o SEQ ID NO: 30. En una realización, X tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 29. En una realización, Y tiene la secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 30. Las secuencias de la bisagra se muestran en SEQ ID NO: 31 a 39. Las secuencias enlazadoras flexibles se muestran en SEQ ID NO: 40 a 80, donde (S) es opcional en las secuencias 42 a 47. Tabla 6:

Los ejemplos de enlazadores rígidos incluyen las secuencias peptídicas que se muestran en SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 y PPP.

En una realización, el enlazador peptídico es un péptido de unión a albúmina.

Se proporcionan ejemplos de péptidos de unión a albúmina en el documento WO2007/106120, e incluyen los enlazadores de S^eQ ID NO: 83 a 96.

Ventajosamente, el uso de péptidos de unión a albúmina como enlazadores puede aumentar la semivida de la molécula de anticuerpo biespecífico.

En una realización, hay un enlazador (por ejemplo, un enlazador peptídico adecuado) que conecta los dominios variables VH y VL de V1 (es decir, entre VH y VL). En una realización, hay un enlazador (por ejemplo, un enlazador peptídico adecuado) que conecta los dominios variables V^hy V^lde V2 (es decir, entre V^hy V^l).

En una realización, el enlazador que conecta los dominios variables V^hy V^lde V1 tiene la secuencia GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 97).

En una realización, el enlazador que conecta los dominios variables V^hy V^lde V2 tiene la secuencia GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 97).

La expresión "fragmento Fab", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende un fragmento de la cadena ligera que comprende un dominio VL (ligero variable) y un dominio constante de una cadena ligera (CL), y un dominio VH (pesado variable) y un primer dominio constante (CH1) de una cadena pesada.

El Fv se refiere a dos dominios variables, por ejemplo, dominios variables cooperativos, como un par afín o dominios variables madurados por afinidad, es decir, un par VH y VL.

Los dominios variables cooperativos como se emplean en la presente memoria son dominios variables que se complementan entre sí y/o ambos contribuyen a la unión al antígeno para hacer que el Fv sea específico del antígeno en cuestión.

El término "Fv de cadena simple" o abreviado como "scFv", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fragmento de anticuerpo que comprende los dominios de anticuerpo VH y VL unidos (por ejemplo, mediante un conector peptídico) para formar una cadena polipeptídica única. Las regiones constantes de la cadena pesada y ligera se omiten en este formato.

El término "anticuerpo de dominio simple", como se usa en la presente memoria, se refiere a un fragmento de anticuerpo que consiste en un único dominio de anticuerpo monomérico variable. Los ejemplos de anticuerpos de un solo dominio incluyen V^ho V^lo V^hH. Estos términos se usan indistintamente en la presente memoria.

Diacuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a dos pares de Fv VH/VL y un par de VH/VL adicional que tienen dos enlazadores inter-Fv, de modo que la VH de un primer Fv está unida a la VL del segundo Fv y la VL del primer Fv está unida a la VH del segundo Fv.

Triacuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un formato similar al diacuerpo que comprende tres Fvs y tres enlazadores inter-Fv.

Tetracuerpo, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un formato similar al diacuerpo que comprende cuatro Fvs y cuatro enlazadores inter-Fv.

El scFv en tándem, como se emplea en la presente memoria, se refiere a dos scFv enlazados a través de un solo enlazador, de modo que hay un solo enlazador inter-Fv.

El scFv-Fc en tándem, como se emplea en la presente memoria, se refiere a dos scFv en tándem, en donde cada uno está unido al extremo N de un dominio CH2, por ejemplo a través de una bisagra, del fragmento de la región constante -CH2CH3.

FabFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un fragmento Fv con una región variable añadida al extremo C-terminal de cada uno de los siguientes, el CH1 de la cadena pesada y el CL de la cadena ligera. El formato puede proporcionarse como una versión PEGilada del mismo.

Fab'Fv, como se emplea en la presente memoria, es similar a FabFv, en el que la porción Fab se reemplaza por un Fab'. El formato puede proporcionarse como una versión PEGilada del mismo.

FabdsFv, como se emplea en la presente memoria, se refiere a un FabFv en el que un enlace disulfuro intra-Fv estabiliza las regiones variables C-terminales añadidas. El formato puede proporcionarse como una versión PEGilada del mismo.

Fab-scFv, como se emplea en la presente memoria, es una molécula Fab con un scFv añadido en el extremo C-terminal de la cadena ligera o pesada.

Fab'-scFv, como se emplea en la presente memoria, es una molécula Fab' con un scFv añadido en el extremo C-terminal de la cadena ligera o pesada.

DiFab, como se emplea en la presente memoria, se refiere a dos moléculas Fab unidas a través de su extremo C-terminal de las cadenas pesadas.

DiFab', como se emplea en la presente memoria, se refiere a dos moléculas Fab' unidas a través de uno o más enlaces disulfuro en la región bisagra de las mismas.

Como se emplea en la presente memoria, scdiacuerpo es un diacuerpo que comprende un enlazador intra-Fv, tal que la molécula comprende tres enlazadores y forma un scFv normal cuyos terminales VH y VL están cada uno enlazado a una de las regiones variables de un par Fv adicional.

Scdiacuerpo-Fc, como se emplea en la presente memoria, son dos scdiacuerpos, en el que cada uno se une al extremo N-terminal de un dominio CH2, por ejemplo a través de una bisagra, del fragmento de región constante -CH2CH3.

ScFv-Fc-scFv, tal como se emplea en la presente memoria, se refiere a cuatro scFv, en los que cada uno se une al extremo N-terminal y al extremo C-terminal de la cadena pesada y ligera de un fragmento -CH2CH3.

Scdiacuerpo-CH³, como se emplea en la presente memoria, se refiere a dos moléculas de scdiacuerpos, cada una unida, por ejemplo, a través de una bisagra a un dominio CH3.

IgG-scFv, como se emplea en la presente memoria, es un anticuerpo de longitud completa con un scFv en el extremo C-terminal de cada una de las cadenas pesadas o cada una de las cadenas ligeras.

scFv-IgG, como se emplea en la presente memoria, es un anticuerpo de longitud completa con un scFv en el extremo N-terminal de cada una de las cadenas pesadas o cada una de las cadenas ligeras.

V-IgG, como se emplea en la presente memoria, es un anticuerpo de longitud completa con un dominio variable en el extremo N-terminal de cada una de las cadenas pesadas o cada una de las cadenas ligeras.

IgG-V, como se emplea en la presente memoria, es un anticuerpo de longitud completa con un dominio variable en el extremo C-terminal de cada una de las cadenas pesadas o cada una de las cadenas ligeras.

DVD-Ig (también conocido como IgG de dominio V dual) es un anticuerpo de longitud completa con 4 dominios variables adicionales, uno en el extremo N-terminal de cada cadena pesada y cada cadena ligera.

La presente descripción también proporciona secuencias que son un 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 % 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % o 99 % similares a una secuencia descrita en la presente memoria.

"Identidad", como se usa en la presente memoria, indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es idéntico entre las secuencias.

"Similitud", tal como se usa en la presente memoria, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, la leucina puede sustituirse por isoleucina o valina. Otros aminoácidos que a menudo se pueden sustituir entre sí incluyen, entre otros:

- fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas);

- lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas);

- aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas);

- asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida); y

- cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre).

Los grados de identidad y similitud se pueden calcular fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991, el software B^lA^sT™ disponible del NCBI (Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. y States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T. L. et al., 1996, Met. Enzimol. 266:131-141; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. y Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).

En una realización, se proporciona una molécula de anticuerpo multiespecífico según la presente descripción, en donde las CDR tienen un origen no humano, en particular mamífero, por ejemplo, de rata, ratón, conejo, camélido, oveja, cabra o similar. En una realización, las CDR son humanas.

Los anticuerpos generados contra un polipéptido antigénico pueden obtenerse, cuando es necesaria la inmunización de un animal, administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente a un animal no humano, usando protocolos bien conocidos y rutinarios, véase por ejemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Se pueden inmunizar muchos animales de sangre caliente, como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos o cerdos. Sin embargo, los ratones, conejos, cerdos y ratas son generalmente los más adecuados.

Se conocen métodos para aislar repertorios de anticuerpos humanos a partir de humanos, por ejemplo, el aislamiento a partir de una muestra de sangre periférica, en el que la muestra procede de una persona expuesta previamente a un antígeno relevante (tal como un patógeno).

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica, como la técnica del hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, págs. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).

Los anticuerpos también se pueden generar utilizando métodos de anticuerpos de linfocitos individuales mediante la clonación y expresión de ADNc de la región variable de inmunoglobulinas generadas a partir de linfocitos individuales seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481; documentos WO92/02551; WO2004/051268 y WO2004/106377.

Los anticuerpos para el uso en la presente descripción también pueden generarse usando varios métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica, e incluyen los divulgados por Brinkmann et al. (en J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41 -50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) y los documentos WO90/02809; WO91/10737; WO92/01047; WO92/18619; WO93/11236; WO95/15982; WO95/20401; y US5,698,426; US5,223,409; US5,403,484; US5,580,717; US5,427,908; US5,750,753; US5,821,047; US5,571,698; US5,427,908; US5,516,637; US5,780,225; US5,658,727; US5,733,743; US5,969,108, y WO20011/30305.

En una realización, las moléculas multiespecíficas según la descripción están humanizadas (uno, dos o todos los dominios de unión están humanizados).

Humanizado (lo que incluye los anticuerpos injertados con CDR), como se emplea en la presente memoria, se refiere a moléculas que tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una especie no humana y una región estructural de una molécula de inmunoglobulina humana (véanse, p. ej., los documentos US5,585,089; WO91/09967). Se apreciará que puede ser necesario transferir solamente los residuos determinantes de la especificidad de las CDR en lugar de la CDR completa (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25 34). Los anticuerpos humanizados pueden comprender además opcionalmente uno o más residuos estructurales derivados de la especie no humana de la que derivaron las CDR.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "molécula de anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula de anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDR (incluidas, si se desea, una o más CDR modificadas) de un anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal murino) injertado en una estructura de la región variable de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (p. ej., un anticuerpo humano), véanse, p. ej., los documentos US 5.585.089; WO91/09967. Para una revisión, véase Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. En una realización, en lugar de que se transfiera la CDR completa, se transfieren solamente uno o más de los residuos determinantes de la especificidad de cualquiera de las CDR descritas anteriormente en la presente memoria a la estructura del anticuerpo humano (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una realización, se transfieren solamente los residuos determinantes de la especificidad de una o más de las CDR descritas anteriormente en la presente memoria a la estructura del anticuerpo humano. En otra realización, se transfieren solamente los residuos determinantes de la especificidad de cada una de las CDR descritas anteriormente en la presente memoria a la estructura del anticuerpo humano.

En una realización, las moléculas multiespecíficas según la descripción están humanizadas.

Cuando se injertan las CDR o los residuos determinantes de la especificidad, se puede usar cualquier secuencia estructural de la región variable aceptora adecuada teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donante del que derivan las CDR, incluidas las regiones estructurales de ratón, primate y ser humano. Adecuadamente, el anticuerpo humanizado según la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones estructurales aceptoras humanas así como una o más de las CDR proporcionadas por el anticuerpo donante o descritas en la presente memoria.

En un anticuerpo humanizado de la presente descripción, las regiones estructurales no necesitan tener exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los residuos inusuales pueden cambiarse por residuos que se dan con más frecuencia para esa clase o tipo de cadena aceptora. Alternativamente, los residuos seleccionados en las regiones estructurales aceptoras pueden cambiarse para que correspondan al residuo que se encuentra en la misma posición en el anticuerpo donante (véase Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Dichos cambios deben mantenerse al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. Se proporciona un protocolo para seleccionar los residuos en las regiones estructurales aceptoras que puede ser necesario cambiar en el documento WO91/09967.

El anticuerpo donante, tal como se emplea en la presente memoria, se refiere al anticuerpo original aislado de un huésped o identificado en una biblioteca.

Un residuo donante, como se emplea en la presente memoria, es un residuo que se encuentra en el anticuerpo que donó las CDR. Generalmente, el anticuerpo donante no será humano y, por lo tanto, un residuo donante será de un anticuerpo no humano. En una realización, el residuo donante es un residuo en la misma posición o en una posición correspondiente en el anticuerpo donante a la posición del residuo que se reemplaza en el anticuerpo humanizado.

Los ejemplos de estructuras humanas que pueden usarse en la presente descripción son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al., anteriormente mencionado). Por ejemplo, KOL y NEWM se pueden usar para la cadena pesada, REI se puede usar para la cadena ligera y EU, LAY y POM se pueden usar tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Alternativamente, pueden usarse secuencias de la línea germinal humana; están disponibles en: http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php.

En una molécula de anticuerpo humanizado de la presente descripción, las cadenas pesada y ligera del aceptor no tienen que derivar necesariamente del mismo anticuerpo y, si se desea, pueden comprender cadenas compuestas que tienen regiones estructurales derivadas de cadenas diferentes.

No es necesario que las regiones estructurales tengan exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los residuos inusuales pueden cambiarse por residuos que se dan con más frecuencia para esa clase o tipo de cadena aceptora. Alternativamente, los residuos seleccionados en las regiones estructurales aceptoras pueden cambiarse para que correspondan al residuo que se encuentra en la misma posición en el anticuerpo donante (véase Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Dichos cambios deben mantenerse al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. Se proporciona un protocolo para seleccionar los residuos en las regiones estructurales aceptoras que puede ser necesario cambiar en el documento WO91/09967.

Los residuos donantes son residuos del anticuerpo donante, es decir, el anticuerpo del que derivaron originalmente las CDR. Los residuos donantes pueden ser reemplazados por un residuo adecuado derivado de una estructura receptora humana (residuos aceptores), por ejemplo, residuos de ratón, rata o conejo.

En una realización, los anticuerpos multiespecíficos de la presente descripción son completamente humanos, en particular, uno o más de los dominios variables son completamente humanos.

Las moléculas totalmente humanas son aquellas en las que las regiones variables y las regiones constantes (si están presentes) de las cadenas pesada y ligera son todas de origen humano, o sustancialmente idénticas a las secuencias de origen humano, no necesariamente del mismo anticuerpo. Los ejemplos de anticuerpos totalmente humanos pueden incluir anticuerpos producidos, por ejemplo, mediante los métodos de presentación en fagos descritos anteriormente y anticuerpos producidos por ratones en los que los genes de la región variable y, opcionalmente, constante de la inmunoglobulina murina han sido reemplazados por sus equivalentes humanos, p. ej. como se describe en términos generales en los documentos EP0546073 ; US 5,545,806; US5,569,825; US5,625,126; US5,633,425; US5,661,016; US5,770,429; EP 0438474 y EP0463151.

En una realización, las moléculas de anticuerpos multiespecíficos de la descripción son capaces de unirse selectivamente a dos, tres o más antígenos de interés diferentes.

En una realización, los antígenos de interés se unen mediante el dominio de unión al antígeno formado por VH/VL, o V1 o V2 se seleccionan independientemente de una proteína asociada a células, por ejemplo, una proteína de la superficie celular en células tales como células bacterianas, células de levadura, células T, células endoteliales o células tumorales, y una proteína soluble.

Los antígenos de interés también pueden ser cualquier proteína médicamente relevante, como las proteínas aumentadas durante una enfermedad o infección, por ejemplo, receptores y/o sus correspondientes ligandos. Los ejemplos particulares de proteínas de la superficie celular incluyen las moléculas de adhesión, por ejemplo, las integrinas tales como las integrinas p1, p. ej. VLA-4, E-selectina, P-selectina o L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11 a, CD11 b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD45, CDW52 , CD69, CD134 (OX40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, DPCR1, DPCR1, dudulina2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nectina-like2, NKCC1, PTK7, RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antígeno carcinoembrionario (CEA), globulina de grasa de leche humana (HMFG1 y 2), antígenos del MHC de Clase I y MHC de Clase II y VEGF, y, en su caso, los receptores de los mismos.

Los antígenos solubles incluyen interleucinas como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16, IL-23, antígenos virales, por ejemplo, antígenos del virus sincitial respiratorio o del citomegalovirus, inmunoglobulinas, como IgE, interferones, como interferón a, interferón p o interferón y, factores estimulantes de colonias, como G-CSF o GM-CSF, y factores de crecimiento derivados de plaquetas, como PDGF-a, y PDGF-p y, en su caso, sus receptores. Otros antígenos incluyen antígenos de la superficie de células bacterianas, toxinas bacterianas, virus tales como el de la gripe, EBV, HepA, B y C, agentes de bioterrorismo, radionúclidos y metales pesados, y venenos y toxinas de serpientes y arañas.

En una realización, la molécula de anticuerpo de la descripción puede usarse para alterar funcionalmente la actividad del antígeno de interés. Por ejemplo, la molécula de anticuerpo puede neutralizar, antagonizar o agonizar la actividad de dicho antígeno, directa o indirectamente.

En una realización V1 es específico de la albúmina sérica humana.

En una realización V2 es específico de la albúmina sérica humana.

En una realización V1 o V2 y VH/VL son específicos de dos antígenos diferentes. En una realización V1 o V2 y VH/VL son específicos del mismo antígeno, por ejemplo, uniéndose al mismo epítopo o a un epítopo diferente en el mismo.

En una realización, un antígeno de interés al que se une VH/VL y/o V1 o V2 proporciona la capacidad de reclutar funciones efectoras, como la activación de la vía del complemento y/o el reclutamiento de células efectoras.

El reclutamiento de la función efectora puede ser directo en el sentido de que la función efectora está asociada con una célula, teniendo dicha célula una molécula de reclutamiento en su superficie. El reclutamiento indirecto puede ocurrir cuando la unión de antígeno a un dominio de unión al antígeno (como V1 o V2) de la molécula según la presente descripción a un polipéptido de reclutamiento provoca la liberación, por ejemplo, de un factor que a su vez puede reclutar directa o indirectamente la función efectora, o puede ser mediante la activación de una vía de señalización. Los ejemplos incluyen IL2, IL6, IL8, IFNy, histamina, C1q, opsonina y otros miembros de las cascadas de activación del complemento clásicas y alternativas, como C2, C4, C3-convertasa y C5 a C9.

Como se usa en la presente memoria, "un polipéptido de reclutamiento" incluye un F^cyR tal como F^cyRI, F^cyRII y FcyRIII, una proteína de la vía del complemento tal como, pero sin limitación, C1q y C3, una proteína marcadora de CD (marcador de grupo de diferenciación) tal como, pero sin limitación, CD68, CD115, CD16, CD80, CD83, CD86, CD56, CD64, CD3, CD4, CD8, CD28, CD45, CD19, CD20 y CD22. Otros polipéptidos de reclutamiento que son proteínas marcadoras de CD incluyen CD1, CD1d, CD2, CD5, CD8, CD9, CD10, CD11, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23 , CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD40, CD43, CD44, CD45, CD46, CD49, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d , CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD58, CD59, CD61, CD62, D62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD66e, CD68, CD70, CD71, CD72, CD79, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84 , CD85, CD86, CD88, CD89, CD90, CD94, CD95, CD98, CD106, CD114, CD116, CD117, CD118, CD120, CD122, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD137, CD138, CD141, CD142 , CD143, CD146, CD147, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD162, CD164, CD169, CD184, CD206, CD209, CD257, CD278, CD281, CD282, CD283 y CD304, o un fragmento de cualquiera de ellos que conserve la capacidad de reclutar la función efectora mediada por células, ya sea directa o indirectamente. Un polipéptido de reclutamiento también incluye moléculas de inmunoglobulina tales como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE e IgA que poseen función efectora.

En una realización, un dominio de unión a antígeno (tal como V1 o V2) en la molécula de anticuerpo multiespecífico según la presente descripción tiene especificidad por una proteína de la ruta del complemento, por ejemplo, C1q.

Además, las moléculas de anticuerpos multiespecíficos de la presente descripción pueden usarse para quelar radionúclidos en virtud de un anticuerpo o fragmento que se une a una proteína quelante de nucleidos. Dichas proteínas de fusión son útiles en enfoques terapéuticos de formación de imágenes o de transporte selectivo de radionúclidos. Véase, por ejemplo, Altai et al., Bioconjug Chem, 19 de junio de 2013: 24 (6) 1102-9, incorporado en la presente memoria como referencia.

En una realización, un dominio de unión al antígeno en una molécula según la descripción (tal como V1 o V2) tiene especificidad por una proteína marcadora de CD, seleccionada del grupo que comprende CD68, CD80, CD86, CD64, CD3, CD4, CD8 CD45, CD16 y CD35.

En una realización, un dominio de unión al antígeno dentro de una molécula según la descripción (tal como V1 o V2) tiene especificidad por una proteína transportadora sérica, una molécula de inmunoglobulina circulante o CD35/CR1, por ejemplo, para proporcionar una semivida prolongada al fragmento de anticuerpo con especificidad por dicho antígeno de interés al unirse a dicha proteína transportadora sérica, molécula de inmunoglobulina circulante o CD35/CR1.

Como se usa en la presente memoria, las "proteínas transportadoras séricas" incluyen una proteína de unión a tiroxina, transtirretina, glicoproteína ácida a1, transferrina, fibrinógeno y albúmina, o un fragmento de cualquiera de los mismos.

Como se usa en la presente memoria, una "molécula de inmunoglobulina circulante" incluye IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, sIgA, IgM e IgD, o un fragmento de cualquiera de las mismas.

CD35/CR1 es una proteína presente en los glóbulos rojos que tiene una semivida de 36 días (rango normal de 28 a 47 días; Lanaro et al., 1971, Cancer, 28(3):658-661).

En una realización, el antígeno de interés para el que VH/VL tiene especificidad es una proteína transportadora sérica, como un transportador sérico humano, como la albúmina, en particular, la albúmina sérica humana.

En una realización, el antígeno de interés para el que V1 tiene especificidad es una proteína transportadora sérica, como un transportador sérico humano, como la albúmina, en particular la albúmina sérica humana.

En una realización, el antígeno de interés para el que V2 tiene especificidad es una proteína transportadora sérica, como un transportador sérico humano, como la albúmina, en particular la albúmina sérica humana.

Generalmente V1 o V2 y VH/VL no tendrán ambos especificidad por una proteína transportadora sérica.

En una realización, las moléculas de anticuerpos multiespecíficos de la presente descripción se procesan para proporcionar una afinidad mejorada por un antígeno o antígenos objetivo. Dichas variantes se pueden obtener mediante una serie de protocolos de maduración por afinidad, incluida la mutación de las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), reordenamiento aleatorio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), reordenamiento aleatorio de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), presentación en fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391,288-291, 1998). Vaughan et al. (anteriormente mencionado) analiza estos métodos de maduración por afinidad.

La afinidad mejorada, como se emplea en la presente memoria en este contexto, se refiere a una mejora sobre la molécula de partida.

Si se desea, una molécula de anticuerpo para el uso en la presente descripción puede conjugarse con una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una única molécula efectora o dos o más de tales moléculas unidas de manera que formen un único resto que pueda unirse a los anticuerpos de la presente invención. Cuando se desee obtener un fragmento de anticuerpo unido a una molécula efectora, éste puede prepararse mediante procedimientos químicos estándar o de ADN recombinante en los que el fragmento de anticuerpo se une directamente o a través de un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar dichas moléculas efectoras con anticuerpos son bien conocidas en la técnica (véase, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, págs. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos WO93/06231, WO92/22583, WO89/00195, WO89/01476 y WO03/031581. Alternativamente, cuando la molécula efectora es una proteína o un polipéptido, el enlace se puede lograr utilizando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en los documentos WO86/01533 y EP0392745.

La expresión "molécula efectora", como se usa en la presente memoria, incluye, por ejemplo, proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polímeros sintéticos o naturales, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, p. ej. ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos, en particular yoduro radiactivo, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopía de RMN o ESR.

Otras moléculas efectoras pueden incluir radionúclidos quelados, como 111In y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252, Iridio192 y Tungsteno188/Renio188; o fármacos tales como, entre otros, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.

Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero sin limitación, enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, entre otros, inmunoglobulinas, toxinas como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica, una proteína como insulina, interferón a, interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador tisular del plasminógeno, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, p. ej. angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biológica como una linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas.

Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, en el diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, nucleidos radiactivos, metales emisores de positrones (para uso en tomografía por emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase en general el documento US4,741,900 para los iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso en el diagnóstico. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina, fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y los nucleidos radiactivos adecuados incluyen 1251, 1311, 111In y 99Tc.

En otra realización, la molécula efectora puede aumentar la semivida del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o potenciar el transporte de un anticuerpo a través de una barrera epitelial al sistema inmunitario. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina tales como los descritos en el documento WO05/117984.

Cuando la molécula efectora es un polímero, puede ser, en general, un polímero sintético o natural, por ejemplo, un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, o un polisacárido ramificado o no ramificado, p. ej. un homo- o hetero-polisacárido.

Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.

Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) poli(alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidos o derivados de los mismos, especialmente poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli(etilenglicol) o derivados de los mismos.

Los polímeros naturales específicos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de los mismos.

"Derivados", tal como se usa en la presente memoria, pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo, grupos reactivos selectivos de tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo se puede unir directamente o a través de un segmento enlazador al polímero. Se apreciará que el residuo de dicho grupo en algunos casos formará parte del producto como grupo de unión entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.

El tamaño del polímero puede variar según se desee, pero generalmente estará en un rango de peso molecular medio de 500 Da a 50.000 Da, por ejemplo de 5000 a 40.000 Da tal como de 20.000 a 40.000 Da. El tamaño del polímero puede seleccionarse en particular basándose en el uso previsto del producto, por ejemplo, la capacidad de localizarse en ciertos tejidos, como tumores, o prolongar la semivida circulante (para una revisión, véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Así, por ejemplo, cuando el producto está destinado a salir de la circulación y penetrar en el tejido, por ejemplo para su uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso utilizar un polímero de bajo peso molecular, por ejemplo, con un peso molecular de alrededor de 5000 Da. Para aplicaciones en las que el producto permanece en circulación, puede ser ventajoso utilizar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo, que tenga un peso molecular en el rango de 20.000 Da a 40.000 Da.

Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno, tal como un poli(etilenglicol) o, especialmente, un metoxipoli(et¡lengl¡col) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el rango de aproximadamente 15.000 Da a aproximadamente 40.000 Da.

En una realización, los anticuerpos para el uso en la presente descripción se unen a restos de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG pueden unirse a través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional de aminoácido terminal ubicado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libres. Dichos aminoácidos pueden encontrarse de forma natural en el fragmento de anticuerpo o pueden incorporarse al fragmento utilizando métodos de ADN recombinante (véanse, por ejemplo, los documentos US5,219,996; US5,667,425; WO98/25971, WO2008/038024). En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en el que la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. Convenientemente, los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno o más residuos de cisteína a los que se puede unir la molécula efectora. Pueden usarse múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG.

Adecuadamente, las moléculas de PEG se unen covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína ubicado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado puede unirse covalentemente al átomo de azufre de un residuo de cisteína ubicado en el fragmento. El enlace covalente será generalmente un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono. Cuando se usa un grupo tiol como punto de unión, se pueden usar moléculas efectoras apropiadamente activadas, por ejemplo, derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína. Se puede usar un polímero activado como material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpos modificados con polímeros como se describió anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo tiol reactivo tal como un ácido o éster a-halocarboxílico, p. ej. yodoacetamida, una imida, p. ej. maleimida, una sulfona de vinilo o un disulfuro. Dichos materiales de partida se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, de Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE. UU.), o se pueden preparar a partir de materiales de partida disponibles comercialmente utilizando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen metoxi-PEG-amina 20K (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater).

En una realización, un Fab o Fab' en las construcciones de la presente descripción está PEGilado, es decir, tiene PEG (poli(etilenglicol)) unido covalentemente al mismo, p. ej. de acuerdo con el método descrito en el documento EP0948544 o EP1090037 [véase también "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. En una realización, el PEG se une a una cisteína en la región bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido covalentemente a un único grupo tiol en una región bisagra modificada. Un resto de lisina se puede unir covalentemente al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amino del resto de lisina se le puede unir un polímero de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. Por tanto, el peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab puede ser de aproximadamente 40.000 Da.

Las moléculas de PEG particulares incluyen 2-[3-(N-maleimido)propionamido]etil amida de lisina modificada con N,N'-bis(metoxipoli(etilenglicol) PM 20.000), también conocida como PEG2MAL40K (que se puede obtener de Nektar, anteriormente Shearwater).

Las fuentes alternativas de enlazadores de PEG incluyen NOF que suministra GL2-400MA2 (donde m en la siguiente estructura es 5) y GL2-400MA (donde m es 2) y n es aproximadamente 450:

Es decir, cada PEG es de unos 20.000 Da.

Otras moléculas efectoras de PEG alternativas del siguiente tipo:

están disponibles en Dr. Reddy, NOF y Jenkem.

En una realización, se proporciona una molécula de anticuerpo de la presente descripción que está PEGilada (por ejemplo, con un PEG descrito en la presente memoria), unida a través de un residuo de aminoácido de cisteína en o alrededor del aminoácido 226 de la cadena, por ejemplo, el aminoácido 226 de la cadena pesada (por numeración secuencial).

En una realización, se proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica una molécula de la presente descripción, tal como una secuencia de ADN. En una realización, se proporciona una secuencia de ADN que codifica una cadena polipeptídica de fórmula (I), (Ia) o (Ib). En una realización hay una secuencia de ADN que codifica una cadena polipeptídica de fórmula (II), (IIa) o (IIb). En una realización, se proporciona una secuencia de polinucleótidos que codifica uno o más, como dos o más componentes polipeptídicos de una molécula de la presente descripción, por ejemplo, se proporciona una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de fórmula (I) y (II), o (Ia) y (IIa) o (Ib) y (IIb).

En una realización, el polinucleótido, tal como el ADN, está contenido en un vector.

En una realización, el vector comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de fórmula (I), (Ia) o (Ib), por ejemplo, el ADN no está directamente unido o conectado a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de fórmula (I), (IIa) y/o (IIb).

En una realización, el vector comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de fórmula (II), (IIa) o (IIb), por ejemplo, y el ADN no está directamente unido o conectado a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de fórmula (I), (Ia) y/o (Ib).

En una realización, el vector comprende ADN que codifica una secuencia de la cadena pesada y ligera de una construcción de anticuerpo de acuerdo con la presente descripción, por ejemplo en la misma cadena de ADN o en una diferente (es decir, ADN conectado o ADN separado), tal como cuando el ADN que codifica las cadenas pesada y ligera se proporciona en un plásmido o vector donde la cadena pesada se proporciona en un plásmido/vector y la cadena ligera se proporciona en un plásmido/vector diferente.

Los métodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son muy conocidos para los expertos en la técnica. En este sentido, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York y el Manual de Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing.

También se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN, descritas en la presente memoria, que codifican un anticuerpo de la presente descripción. Puede usarse cualquier sistema de célula huésped/vector adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Se pueden usar sistemas bacterianos, por ejemplo E. ^coI^í, y otros sistemas microbianos, o también se pueden usar sistemas de expresión en células huésped eucariotas, por ejemplo de mamíferos. Las células huésped de mamíferos adecuadas incluyen las células CHO, de mieloma o de hibridoma.

La presente descripción también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente descripción que comprende cultivar una célula huésped que contiene un vector de la presente invención en condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteína a partir del ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula de anticuerpo.

Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de la cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de la cadena pesada. Alternativamente, se puede usar un solo vector, y el vector incluye secuencias que codifican los polipéptidos de la cadena ligera y de la cadena pesada, por ejemplo, como se describe en la presente memoria. En un ejemplo, la línea celular puede transfectarse con tres vectores, cada uno de los cuales codifica una cadena polipeptídica de una molécula de anticuerpo de la presente invención.

En un ejemplo, la célula se transfecta con dos vectores, cada uno de los cuales codifica un polipéptido diferente de la presente descripción, por ejemplo proporcionado en el mismo vector o en diferentes vectores. En un ejemplo, la célula (línea celular) comprende ADN que codifica un polipéptido de fórmula (Ia) y un polipéptido de fórmula (IIa), por ejemplo, cuando el ADN que codifica cada polipéptido está en el mismo vector o en vectores diferentes. En un ejemplo, la célula (línea celular) comprende ADN que codifica un polipéptido de fórmula (Ib) y un polipéptido de fórmula (IIb), por ejemplo, cuando el ADN que codifica cada polipéptido está en el mismo vector o en vectores diferentes.

Se apreciará que la proporción de cada vector transfectado en la célula huésped puede variar para optimizar la expresión del producto de anticuerpo multiespecífico. En un ejemplo, la relación de vectores es 1:1. Se apreciará que el experto en la materia sea capaz de encontrar una proporción óptima mediante la prueba rutinaria de los niveles de expresión de proteínas después de la transfección.

También se apreciará que cuando dos o más de los componentes polipeptídicos están codificados por un polinucleótido en un solo vector, la expresión relativa de cada componente polipeptídico se puede variar utilizando diferentes promotores para cada polinucleótido que codifica un componente polipeptídico de la presente descripción.

Los anticuerpos y fragmentos según la presente descripción se expresan a buenos niveles a partir de células huésped. Por lo tanto, las propiedades de los anticuerpos y/o fragmentos parecen conducir al procesamiento comercial.

Los anticuerpos de la presente descripción son útiles en el tratamiento y/o la profilaxis, por ejemplo, de una afección patológica.

La presente descripción también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente descripción en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables. Por consiguiente, se proporciona el uso de un anticuerpo de la presente descripción o una composición que comprende el mismo para el uso en el tratamiento y para la fabricación de un medicamento.

La composición normalmente se suministrará como parte de una composición farmacéutica estéril que normalmente incluirá un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente descripción también proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente descripción junto con uno o más excipientes, diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.

La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico o puede estar acompañada de otros ingredientes activos que incluyen otros ingredientes de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-1 p, anti-células T, anti-IFNY o anti-LPS, o ingredientes que no son anticuerpos tales como xantinas. Otros ingredientes activos adecuados incluyen anticuerpos capaces de inducir tolerancia, por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4.

En una realización adicional, la molécula de anticuerpo o la composición según la descripción se emplea en combinación con otro agente farmacéuticamente activo, por ejemplo, un corticosteroide (como propionato de fluticasona) y/o un agonista beta-2 (como salbutamol, salmeterol o formoterol) o inhibidores del crecimiento y de la proliferación celular (tales como rapamicina, ciclofosfamida, metotrexato) o, alternativamente, un inhibidor de CD28 y/o CD40. En una realización, el inhibidor es una molécula pequeña. En otra realización, el inhibidor es un agente diagnóstico o terapéutico biológico, por ejemplo, un anticuerpo específico del objetivo.

Las composiciones farmacéuticas comprenden adecuadamente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en la presente memoria, se refiere a una cantidad necesaria de un agente terapéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección específica, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivos celulares o en modelos animales, normalmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también se puede utilizar para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. A continuación, dicha información se puede utilizar para determinar las dosis y las vías útiles para la administración en seres humanos.

La cantidad terapéuticamente eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la(s) combinación(es) de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar mediante experimentación rutinaria, y está dentro del juicio del médico. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, por ejemplo de 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. Alternativamente, la dosis puede ser de 1 a 500 mg por día, como de 10 a 100, 200, 300 o 400 mg por día. Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención.

Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (por ejemplo, simultáneamente, secuencialmente o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.

En una realización, los anticuerpos o las composiciones de la presente descripción se emplean en una terapia de combinación, por ejemplo, una terapia de combinación para tratar el cáncer, en particular cuando la terapia comprende administrar un agente quimioterapéutico y/o administrar radioterapia.

La dosis a la que se administra la molécula de anticuerpo de la presente descripción depende de la naturaleza de la afección a tratar, la extensión de la inflamación presente y si la molécula de anticuerpo se usa profilácticamente o para tratar una afección existente.

La frecuencia de la dosis dependerá de la semivida de la molécula de anticuerpo y la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una semivida corta (por ejemplo, de 2 a 10 horas), puede ser necesario administrar una 0 más dosis al día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una semivida prolongada (p. ej., de 2 a 15 días), puede que solo sea necesario administrar una dosis una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.

El vehículo farmacéuticamente aceptable no debe inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición, y no debe ser tóxico. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.

Pueden usarse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Además, en tales composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias reguladoras del pH. Dichos vehículos permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas y suspensiones, para la ingestión por parte del paciente.

Las formas adecuadas para la administración incluyen las formas adecuadas para la administración parenteral, p. ej. mediante inyección o infusión, por ejemplo mediante inyección rápida o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede adoptar la forma de una suspensión, disolución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso y puede contener agentes de formulación, como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstitución antes de su uso con un líquido estéril apropiado.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales. Sin embargo, en una o más realizaciones, las composiciones se adaptan para la administración a sujetos humanos.

En una realización, en las formulaciones según la presente descripción, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento, ya que si el pH de la formulación es 7 entonces un pI de 8-9 o superior puede ser apropiado. Si bien no se desea ceñirse a la teoría, se cree que esto puede proporcionar en última instancia una formulación final con una estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento permanece en disolución.

Las composiciones farmacéuticas de esta descripción pueden administrarse por varias vías, incluidas, entre otras, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También pueden usarse hipopulverizadores para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar en formas inyectables, ya sea como disoluciones líquidas o suspensiones. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. En una realización, las moléculas de anticuerpo de la presente invención se administran por vía subcutánea.

En una realización, un anticuerpo o una composición según la presente descripción se proporciona precargada en una jeringa, por ejemplo, en un formato adecuado para la autoadministración.

La administración directa de las composiciones generalmente se realizará mediante inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se administrará en el espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en un tejido específico de interés. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple.

Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo de la presente descripción. Como tal, será susceptible de degradación en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, si la composición se va a administrar por una vía que usa el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez que se haya absorbido en el tracto gastrointestinal.

Una discusión detallada de los vehículos farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

En una realización, la formulación se proporciona como una formulación para administración tópica, incluida la inhalación.

Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen los polvos inhalables, aerosoles dosificadores que contienen gases propulsores o disoluciones inhalables sin gases propulsores (como disoluciones o suspensiones nebulizables). Los polvos inhalables según la descripción que contienen la sustancia activa pueden consistir únicamente en las sustancias activas mencionadas anteriormente o en una mezcla de las sustancias activas mencionadas anteriormente con un excipiente fisiológicamente aceptable.

Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (por ejemplo, glucosa o arabinosa), disacáridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa), oligosacáridos y polisacáridos (por ejemplo, dextranos), polialcoholes (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sales (por ejemplo, cloruro de sodio, carbonato de calcio) o sus mezclas. Se usan adecuadamente monosacáridos o disacáridos, el uso de lactosa o glucosa, particularmente pero no exclusivamente en forma de sus hidratos.

Las partículas para el depósito en el pulmón requieren un tamaño de partícula inferior a 10 micras, tal como 1 -9 micras, por ejemplo de 0,1 a 5 pm, en particular de 1 a 5 pm. El tamaño de partícula del agente activo (como el anticuerpo o fragmento de anticuerpo) es de gran importancia.

Los gases propulsores que pueden usarse para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la técnica. Los gases propulsores adecuados se seleccionan entre hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano y halohidrocarburos tales como los derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores antes mencionados pueden utilizarse solos o en mezclas de los mismos.

Los gases propulsores particularmente adecuados son derivados de alcanos halogenados seleccionados entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, son particularmente adecuados TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y las mezclas de los mismos.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor también pueden contener otros ingredientes tales como codisolventes, estabilizantes, agentes tensioactivos (surfactantes), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica.

Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor según la invención pueden contener hasta un 5% en peso de sustancia activa. Los aerosoles según la invención contienen, por ejemplo, del 0,002 al 5 % en peso, del 0,01 al 3 % en peso, del 0,015 al 2 % en peso, del 0,1 al 2 % en peso, del 0,5 al 2 % en peso o del 0,5 al 1 % en peso de sustancia activa.

Alternativamente, las administraciones tópicas al pulmón también pueden ser mediante la administración de una disolución líquida o formulación de suspensión, por ejemplo empleando un dispositivo como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus® conectado a un compresor Pari Master® fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).

En una realización, la formulación se proporciona como ampollas discretas que contienen una dosis unitaria para administración mediante nebulización.

En una realización, el anticuerpo se suministra en forma liofilizada, para reconstituciones o, alternativamente, como una formulación en suspensión.

El anticuerpo de la presente descripción puede administrarse disperso en un disolvente, por ejemplo, en forma de disolución o suspensión. Puede suspenderse en una disolución fisiológica adecuada, por ejemplo, disolución salina fisiológica, un disolvente farmacológicamente aceptable o una disolución tamponada. Las disoluciones tamponadas conocidas en la técnica pueden contener de 0,05 mg a 0,15 mg de edetato disódico, de 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro y de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml de agua para lograr un pH de aproximadamente 4,0 a 5,0. Como se mencionó anteriormente, se puede preparar una suspensión, por ejemplo, a partir de un anticuerpo liofilizado.

Las suspensiones terapéuticas o las formulaciones en disolución también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son muy conocidos en la técnica, e incluyen tampones (por ejemplo, tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, albúmina sérica), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las disoluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables. La formulación generalmente se proporcionará en una forma sustancialmente estéril empleando procesos de fabricación estériles.

Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración de la disolución de disolvente tamponado utilizada para la formulación, la suspensión aséptica del anticuerpo en la disolución de disolvente tamponado estéril y la dispensación de la formulación en recipientes estériles mediante métodos familiares para los expertos en la técnica.

La formulación nebulizable según la presente descripción se puede proporcionar, por ejemplo, como unidades de dosis individuales (por ejemplo, recipientes o viales de plástico sellados) envasadas en sobres de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, p. ej., 2 ml, de disolvente/disolución tampón.

Se cree que los anticuerpos de la presente descripción son adecuados para la administración mediante nebulización.

También se proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula de anticuerpo multiespecífico según la presente descripción y un excipiente, diluyente o vehículo.

La descripción también se extiende a una molécula de anticuerpo multiespecífico o una composición farmacéutica de acuerdo con la presente descripción para el uso en el tratamiento, en particular, para el uso en el tratamiento de una afección o trastorno seleccionado del grupo que consiste en infecciones (virales, bacterianas, fúngicas y parasitarias), choque endotóxico asociado a infección, artritis como la artritis reumatoide, asma como el asma grave, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad pélvica inflamatoria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Peyronie, enfermedad celíaca, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adherencias quirúrgicas, apoplejía, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, meningoencefalitis, uveítis autoinmune, trastornos inflamatorios inmunomediados del sistema nervioso central y periférico tales como esclerosis múltiple, lupus (como lupus eritematoso sistémico) y síndrome de Guillain-Barré, dermatitis atópica, hepatitis autoinmune, alveolitis fibrosante, enfermedad de Grave, nefropatía por IgA, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad de Méniére, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunes, pancreatitis, trauma (cirugía), enfermedad del injerto contra el huésped, rechazo de trasplantes, enfermedades cardíacas que incluyen enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio así como aterosclerosis, coagulación intravascular, reabsorción ósea, osteoporosis, osteoartritis, periodontitis, hipoclorhidria y cáncer, por ejemplo un cáncer epitelial.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "que comprende", en el contexto de la presente memoria descriptiva, debe interpretarse como "que incluye".

Las realizaciones y preferencias pueden combinarse según sea técnicamente apropiado.

La descripción de la presente memoria describe realizaciones que comprenden ciertos números enteros. La descripción también se extiende a las mismas realizaciones que consisten o consisten esencialmente en dichos números enteros.

Ejemplos

Ejemplo 1 Análisis de las variantes de 645 donde se injertan las CDR de 645 en las estructuras 497 o 2109 en un Fab y Fab-dsscFv

Los Fab se diseñaron como formatos de Fab sin bisagra (Fab) y todos los anticuerpos Fab-dsscFv (también denominados BYbes) se construyeron como HC BYbes donde la cadena pesada del Fab (HC) está unida a un scFv estabilizado con disulfuro (ds HL, es decir, VH-enlazador-VL, enlazador = GGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 97) a través de un enlazador basado en G4S (SGGGGSGGGGS SEQ ID NO: 43). Los HC BYbes se construyeron usando el injerto 645 original (gL4gH5), y sus variantes de 645 en las que se injertaron las CDR de 645 en estructuras 497 o 2109. Las variantes de 645 se usaron en la posición de scFv como ds HL, o en la posición de Fab con A26 como scFv estabilizado con disulfuro. Se construyeron los anticuerpos que se muestran en la Figura 1, en los que FW significa estructura.

Métodos

Expresión transitoria en ExpiHEK

Los plásmidos de la cadena ligera y de la cadena pesada en una proporción 1:1 se transfectaron en células ExpiHEK mediante el método de expifectamina a una escala de 50 ml por duplicado, según lo recomendado por el fabricante (Life Technologies). Las transfecciones se incubaron a 37 °C, con agitación a 140 rpm y al 8 % de CO2. Después de 7 días, se recogieron los sobrenadantes, se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm y se determinaron los rendimientos de expresión mediante HPLC de proteína G utilizando un Fab patentado como patrón.

Purificación de proteínas

Los sobrenadantes se concentraron 40 veces utilizando concentradores Centricon con un MWCO de 10 kDa y posteriormente se cargaron en una columna HiTrap Protein G (GE Healthcare). La columna se lavó con PBS de pH 7,4 seguido de elución del material unido con glicina 0,1 M de pH 2,7. El eluato se neutralizó con Tris-HCl 2 M (pH 8,5) antes del intercambio del tampón en PBS de pH 7,4. Las proteínas eluidas se cuantificaron mediante absorbancia a 280 nm y se diluyeron a 1 mg/ml en PBS de pH 7,4 y se almacenaron a 4 °C durante al menos 16 h antes de realizar más análisis.

Exclusión por tamaño (SE HPLC)

Para la G3000 SE HPLC, las muestras de proteínas purificadas (~20 pg) se cargaron en una columna TSKgel G3000SW, 10 pm, 7,5 mm de d.i. x 300 mm (Tosoh) y se desarrollaron con un gradiente isocrático de fosfato 0,2 M de pH 7 a 1 ml/min. Detección continua mediante la absorbancia a 280 nm.

SDS-PAGE

Se prepararon muestras de proteína purificada (2 pg) para la separación en un gel Novex de SDS-poliacrilamida al 4 20 % con Tris/glicina no reductora y reductora de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Life Technologies). Para los geles no reductores, también se añadió a las muestras 100 mM de N-etil maleimida. Las muestras se cargaron en los geles y se separaron a un voltaje constante de 125 V durante ~ 200 min en tampón de funcionamiento de Tris/glicina. Se usaron escaleras de proteínas SeeBlue2 (Life Technologies) como patrón. Los geles se tiñeron con Instant Blue (Expedeon) y se destiñeron con varios cambios de agua destilada.

Estabilidad térmica

Se utilizó un ensayo Thermofluor para monitorizar la estabilidad térmica de las proteínas purificadas. La mezcla de reacción contenía 5 pl de colorante 30X SYPRO® Orange, diluido con agua de la disolución madre 5000x y 45 pl de la muestra de proteína purificada a 0,11 mg/mL en PBS de pH 7,4. Se dispensaron alícuotas (10 pl) de la mezcla por cuadruplicado en una placa de 384 pocillos ópticos para PCR y se procesaron en un sistema de PCR en tiempo real rápida 7900HT (Agilent). El sistema de ciclos térmicos de efecto Peltier se estableció entre 20 °C y 99 °C con una rampa de 1,1 °C/min. Un dispositivo de carga acoplada (CCD) monitorizó los cambios de fluorescencia en los pocillos. Se trazaron los aumentos de intensidad en la fluorescencia y se usó el punto de inflexión de la(s) pendiente(s) para generar el punto medio de transición de termoestabilidad (Tm).

Resonancia de plasmones superficiales/ensayo de doble afinidad

Las afinidades de unión y los parámetros cinéticos para las interacciones de los anticuerpos se determinaron mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) realizada en un aparato Biacore T100 o Biacore 3000 usando chips sensores CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences AB) y tampón de funcionamiento HBS-EP (HEPES 10 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05% v/v). Todos los experimentos se realizaron a 25 °C. Las muestras de anticuerpos se capturaron en la superficie del chip sensor usando un Fab de cabra específico de F(ab')2 humano (Jackson ImmunoResearch) o un anticuerpo monoclonal anti-CH1 humana generado internamente. La inmovilización covalente del anticuerpo de captura se logró mediante química estándar de acoplamiento de aminas a un nivel de 6000-7000 unidades de respuesta (RU).

Se tituló albúmina humana, ChromPure (Jackson ImmunoResearch) sobre el anticuerpo capturado a partir de 50 nM. Cada ciclo de ensayo consistió en capturar primero la muestra de anticuerpo usando una inyección de 1 min, antes de una fase de asociación que consistía en una inyección de antígeno (albúmina humana) de 3 min, después de lo cual se controló la disociación durante 10 min. Después de cada ciclo, se regeneró la superficie de captura. Los caudales utilizados fueron de 10 pl/min para la captura, 30 pl/min para las fases de asociación y disociación y 10 pl/min para la regeneración. El potencial del anticuerpo biespecífico para unirse simultáneamente a la albúmina sérica humana y al ligando del receptor de células T (antígeno ligando) se evaluó capturando el ligando (anticuerpo biespecífico) en la superficie del chip sensor, antes de realizar inyecciones separadas de 3 min de albúmina sérica humana 5 pM: antígeno ligando 50 nM o una disolución mixta de albúmina sérica humana 5 pM y antígeno ligando 50 nM.

Para los ensayos cinéticos, se realizó una titulación del antígeno (para la albúmina sérica humana normalmente 62,5 nM-2 pM), se utilizó una celda de flujo de blanco para la sustracción de la referencia y se incluyeron inyecciones de blanco del tampón para sustraer el ruido y la deriva del instrumento.

Los parámetros cinéticos se determinaron mediante el ajuste global simultáneo de los sensogramas resultantes a un modelo de unión estándar 1:1 utilizando el software de evaluación Biacore T100 v2.0.1 o Biacore 3000 Biaevaluation v3.2.

Resultados

Expresión transitoria de Fabs y BYbes

Figura 3 Los rendimientos de expresión de Fabs con las estructuras 497 o 2109 (Fig. 3, #2-3) fueron comparables a los del Fab 645 original (Fig. 1, #1). Como HC BYbes con 645 como un scFv HL enlazado por disulfuro, se observó un aumento del doble en la expresión cuando las estructuras del injerto 645 original se sustituyeron por las estructuras 497 o 2109 (Fig. 1, #7-9). Cuando se colocó 645 en la posición de Fab en un formato de HC BYbe, no se observó ningún cambio significativo en la expresión entre el 645 original y la variante BYbes con las estructuras 497 o 2109 (Fig. 3, #10-12).

Análisis biofísico de Fabs y BYbes

HPLC de exclusión por tamaño

Figura 4 Todos los Fab eran altamente monoméricos, independientemente del isotipo de la estructura o las CDR (Fig. 4. #1-6). Como HC BYbes con 645 en la posición de scFv (ds HL), el BYbe 645 original (Fig. 4, n.° 7) era un 59 % monomérico, mientras que cuando las CDR 645 se injertaron en estructuras 2109 (Fig. 4, n.° 9) o estructuras 497 (Fig. 4, # 8), el % de monómero aumentó al 80 % y 93 %, respectivamente, lo que confirma que los residuos de la estructura tienen un impacto significativo en la multimerización. Por otro lado, con 645 en la posición de Fab del formato HC BYbe, las estructuras 497 no tuvieron efecto y tanto el 645 original como esta variante fueron altamente monoméricos (Fig. 4, #10-11). Con las estructuras 2019 (Fig. 4, #12), los residuos de la estructura parecen afectar a la multimerización aunque, como Fab, esta combinación de CDR y estructuras, y el 2109 original (Fig. 4, #3, #6), son altamente monoméricos.

SDS-PAGE

Figura 5 En una SDS-PAGE no reductora y reductora, los Fab de longitud completa (Fig. 5, a) y las cadenas ligera y pesada (Fig. 5, b) migraron a su Mr predicho de ~49 kDa y ~24-26 kDa, respectivamente (Fig. 5, #1 -6).

Figura 6 Mediante SDS-PAGE no reductora, se observó que el producto de BYbe de longitud completa (Fig. 6, a) migraba a ~89 kDa, superior a su Mr predicho (~79 kDa). Se pueden observar bandas menores que representan especies multiméricas y cadenas ligeras y pesadas libres por encima y por debajo de esta banda en todos los carriles, respectivamente. En el gel reductor, las cadenas pesada (Fig. 6, b) y ligera (Fig. 6, c) migraron a sus pesos moleculares predichos.

Estabilidad térmica de Fabs y BYbes. Tabla 7:

Las Tm de los Fab originales 645, 497 y 2109 fueron 83,1 °C, 71,4 °C y 70,8 °C, respectivamente (Tabla 9, #1, #5-6). El injerto de las CDR de 645 en las estructuras 497 o 2019 dio como resultado Tm de 80,2 °C y 79,2 °C, lo que confirma respectivamente la importancia de los residuos de CDR en la determinación de la termoestabilidad. Sin embargo, como HC BYbes donde la variante 645 era un scFv estabilizado con disulfuro unido a la cadena pesada del Fab A26, la Tm de 645CDRs/497FW y 645CDRs/2109FW se redujo significativamente a 15 y 18 °C, respectivamente (Tabla 9, #7-9). Cuando la variante 645 se colocó en la posición de Fab del HC BYbe, las Tm no se vieron tan afectadas cuando 645CDR/2109FW parece ser tan estable como el 645 original (Tabla 9, #10-12).

Afinidad hacia la albúmina de suero humano (HSA)

Tabla 8 - Afinidad del Conjunto 1 hacia la HSA

En términos de orden de magnitud, las velocidades de asociación y disociación y la afinidad de los formatos hacia la HSA en las combinaciones probadas son comparables a los formatos originales.

Tabla resumen 9

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de anticuerpo multiespecífico que comprende al menos dos dominios de unión, cada uno con una región pesada variable VH y una región ligera variable VL, en DONDE cada dominio de unión es específico de un antígeno y comprende 6 CDR, caracterizado porque al menos un dominio de unión comprende:

a. una región pesada variable, VH^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 1 para FR1, SEQ ID NO: 3 para FR2, SEQ ID NO: 4 para FR3 y SEQ ID NO: 5 para FR4, con la condición de que CDRH3 en VHa sea distinta de RYYSAMPFAY (SEQ iD NO: 129), y una región ligera variable, VLa, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 6 para FR1, SEQ iD NO: 7 para FR2, SEQ ID NO: 8 para FR3 y SEQ ID NO: 10 para Fr4; o

b. una región pesada variable, VHa, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 16 para FR1, SEQ ID NO: 18 para FR2, SEQ ID NO: 19 para FR3 y SEQ ID NO: 20 para FR4, con la condición de que CDRH3 en VH^asea distinta de RYYSAMPFAY (SEQ iD NO: 129), y una región ligera variable, VL^a, que tiene una estructura que comprende SEQ ID NO: 11 para FR1, S^eQ ID NO: 12 para FR2, SEQ ⁱD NO: 13 para FR3 y SEQ ID NO: 15 para FR4;

y en donde al menos una región variable VHA y la al menos una región variable VLA están presentes en un dsscFv, y ENdonde la molécula de anticuerpo multiespecífico es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2.

2. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según la reivindicación 1, en donde VLa comprende SEQ ID NO: 99 y VHa comprende SEQ ID NO:101.

3. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según la reivindicación 2, en donde un dominio de unión comprende SEQ ID NO:106.

4. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según la reivindicación 1, en donde VL^acomprende SEQ ID NO: 103 y VHa comprende SEQ iD NO:105.

5. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según la reivindicación 4, en donde un dominio de unión comprende SEQ ID NO:111.

6. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la VHa comprende 3 CDR de la cadena pesada que tienen la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 143 para CDRH1, SEQ ID NO: 144 para CDRH2 y SEQ ID NO: 145 para CDRH3.

7. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la VLa comprende 3 CDR de la cadena ligera que tienen la secuencia proporcionada en SEQ ID NO: 146 para CDRL1, SEQ ID NO: 147 para CDRL2 y SEQ ID NO: 148 para CDRL3.

8. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las CDR tienen un origen no humano.

9. Una molécula de anticuerpo multiespecífico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la molécula de anticuerpo es biespecífica o triespecífica, tal como biespecífica.

10. Una estructura aceptora para minimizar la agregación en un anticuerpo multiespecífico que comprende SEQ ID NO: 22 y 24, en donde XXX en cada una de las posiciones de CDR representan independientemente de 1 a 35 aminoácidos, y donde SEQ ID NO: 22 y 24 están presentes en un dsscFv, y en donde el anticuerpo multiespecífico es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2.

11. Un método para mejorar los niveles de expresión de monómeros de una molécula de anticuerpo que tiene al menos un dominio de unión con una región pesada variable y una región ligera variable donde cada región variable tiene una estructura y 3 CDR, y dicho método comprende la etapa de cambiar una estructura de una región variable a una estructura seleccionada del grupo que comprende o consiste en:

ii) una estructura (tal como una estructura de la región VH) que comprende SEQ ID NO: 16 para FR1, SEQ ID NO: 18 para FR2, SEQ ID NO: 19 para FR3 y SEQ ID NO: 20 para FR4,

v) combinaciones de las mismas y,

en donde la estructura i), ii), iii), iv) o combinaciones de las mismas, están presentes en un dsscFv, y en donde la molécula de anticuerpo es un Fab-dsscFv o Fab-(dsscFv)2.