TW202304991A

TW202304991A - 穩定的多重特異性分子及其利用

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Publication number: TW202304991A
Application number: TW111111586A
Authority: TW
Inventors: 中山麻紀子; 中村健介; 古薗信二; 松元亮太
Original assignee: 日商第一三共股份有限公司
Priority date: 2021-03-29
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2023-02-01
Also published as: BR112023017510A2; CO2023012529A2; MX2023011127A; AU2022248779A1; EP4317435A1; KR20230162597A; CA3214264A1; IL305818A; US20240182569A1; WO2022210485A1; JPWO2022210485A1

Abstract

提供一種穩定的雙重特異性分子。一種Fab，其會與CD3特異性地結合，且包含下列CDRH1～3及CDRL1～3：由序列識別號32所示胺基酸序列構成的CDRH1；由序列識別號33所示胺基酸序列構成的CDRH2；由序列識別號34所示胺基酸序列構成的CDRH3；由序列識別號35所示胺基酸序列構成的CDRL1；由序列識別號36所示胺基酸序列構成的CDRL2；及由序列識別號37所示胺基酸序列構成的CDRL3。

Description

穩定的多重特異性分子及其利用

本發明有關於會辨識2個以上之抗原的多重特異性抗體、多重特異性分子、其構成要素等。

作為會與複數個標的結合之分子，關於以1分子與2種以上不同的抗原結合之抗體(雙重特異性抗體或多重特異性抗體)的研究正進行中。

就雙重特異性抗體的活用例而言，可舉出T細胞重定向(T cell redirecting)雙重特異性抗體，其係藉由以1分子來辨識T細胞上的CD3與在癌細胞表面表現的標的抗原，而橋接T細胞與癌細胞，誘導藉由T細胞之對癌細胞的細胞毒殺。為代表例的博納吐單抗(Blinatumomab)係由BiTE(商標)型(scFv-scFv型)而成之會與CD3與CD19結合之雙重特異性抗體，在美國被認可作為成人及小兒的再發或難治性的B細胞性非何杰金氏淋巴瘤及急性淋巴性白血病之治療藥。但是，博納吐單抗由於是BiTE(商標)型而半衰期短，與作為其它醫藥品而被認可的抗體相比，於一定的實驗條件下，高分子量物種(high molecular weights species(HMWS))多，被暗示有穩定性上的課題(非專利文獻1)。

在醫藥品的臨床前試驗(preclinical test)，期望是使用動物、尤其是為高等靈長類的石蟹獼猴來進行。於使用了抗CD3抗體的候補醫藥品之情形，期望可活用能夠與人類與石蟹獼猴雙方的CD3結合之抗CD3抗體。創造出會與人類與石蟹獼猴雙方的CD3結合，且會辨識藉由X射線結構分析而鑑定之新穎抗原決定位的抗CD3抗體，而組合該抗CD3抗體與針對各標的抗原之抗體而成的雙重特異性抗體係對於表現標的抗原之癌細胞顯示細胞毒殺活性(專利文獻1及2)。又，針對該抗CD3抗體的一部分而創造出變異體等(專利文獻3)。為了創造出由多樣的型式(format)而成的多重特異性抗體或多重特異性分子作為醫藥品，而期望創造出各樣的種類之抗CD3抗體片段。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]國際公開第2018/117237號 [專利文獻2]國際公開第2018/147245號 [專利文獻3]國際公開第2019/244107號 [非專利文獻]

[非專利文獻1]Journal of Chromatography B 1065-1066 (2017) 35-43

[發明欲解決之課題]

本發明之目的為提供一種雙重特異性分子，其溶液穩定性優異，在以溶液狀態保存之情形，可減少包含二聚體之高分子量物種(HMWS)。 [用以解決課題之手段]

本發明人等為了解決上述課題而專心致力進行研究，創造出包含抗CD3scFv或抗CD3Fab之新穎的雙重特異性分子，完成了本發明。

亦即，本發明包含以下發明。 [1]　一種Fab，其會與CD3特異性地結合，且包含下列CDRH1～3及CDRL1～3：由序列識別號32所示胺基酸序列構成的CDRH1；由序列識別號33所示胺基酸序列構成的CDRH2；由序列識別號34所示胺基酸序列構成的CDRH3；由序列識別號35所示胺基酸序列構成的CDRL1；由序列識別號36所示胺基酸序列構成的CDRL2；及由序列識別號37所示胺基酸序列構成的CDRL3。 [2]　如[1]之Fab，其包含由序列識別號1所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號2所示胺基酸序列之胺基酸編號1～107構成的輕鏈可變區。 [3]　如[1]或[2]之Fab，其包含由序列識別號1所示胺基酸序列構成的多肽、及由序列識別號2所示胺基酸序列構成的輕鏈。 [4]　一種多重特異性分子，其包含如[1]～[3]中任一者之Fab，且會與並非癌症-睪丸抗原肽(cancer-testis antigen peptide)和主要組織相容性複體(MHC)的複合體之標的分子特異性地結合。 [5]　如[4]之多重特異性分子，其中該MHC為人類白血球抗原(HLA)。 [6]　如[4]或[5]之多重特異性分子，其包含會與該標的分子特異性地結合之抗體或其抗原結合片段。 [7]　如[4]～[6]中任一者之多重特異性分子，其為多重特異性抗體。 [8]　如[4]～[7]中任一者之多重特異性分子，其包含scFv-Fab-異二聚體Fc。 [9]　如[4]～[8]中任一者之多重特異性分子，其為三重特異性抗體。 [10]　如[4]～[8]中任一者之多重特異性分子，其為雙重特異性抗體。 [11]　如[4]～[10]中任一者之多重特異性分子，其中標的分子為GPRC5D、CD98或Trop2。 [12]　如[4]～[11]中任一者之多重特異性分子，其包含選自下列(i)至(iii)的一個多肽群組： (i)包含由序列識別號29之第20～718個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號12之第21～233個胺基酸殘基構成的胺基酸序列之多肽； (ii)包含由序列識別號30之第20～717個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號12之第21～233個胺基酸殘基構成的胺基酸序列之多肽； (iii)包含由序列識別號31之第20～713個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號12之第21～233個胺基酸殘基構成的胺基酸序列之多肽。 [13]　一種多核苷酸，其包含編碼如[4]～[12]中任一者之多重特異性分子所包含的胺基酸序列之鹼基序列。 [14]　一種載體，其包含如[13]之多核苷酸。 [15]　一種細胞，其包含如[13]之多核苷酸或如[14]之載體、或者會生產如[4]～[12]中任一者之多重特異性分子。 [16]　一種如[4]～[12]中任一者之多重特異性分子的製造方法，其包含培養如[15]之細胞的步驟。 [17]　一種多重特異性分子，其藉由如[16]之方法而獲得。 [18]　一種包含如[1]～[3]中任一者之Fab、如[4]～[12]或[17]中任一者之多重特異性分子、如[13]之多核苷酸、[14]之載體、或如[15]之細胞之組成物。 [19]　一種scFv，其會與CD3特異性地結合，且重鏈可變區及輕鏈可變區進行雙硫鍵結而成，並包含下列CDRH1～3及CDRL1～3：由序列識別號32所示胺基酸序列構成的CDRH1；由序列識別號33所示胺基酸序列構成的CDRH2；由序列識別號34所示胺基酸序列構成的CDRH3；由序列識別號35所示胺基酸序列構成的CDRL1；由序列識別號36所示胺基酸序列構成的CDRL2；及由序列識別號37所示胺基酸序列構成的CDRL3。 [20]　如[19]之scFv，其包含由序列識別號3所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號3所示胺基酸序列之胺基酸編號134～240構成的輕鏈可變區。 [21]　如[19]或[20]之scFv，其由序列識別號3所示胺基酸序列構成。 [22]　如[19]之scFv，其包含由序列識別號39所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號39所示胺基酸序列之胺基酸編號134～240構成的輕鏈可變區。 [23]　如[19]或[22]之scFv，其由序列識別號39所示胺基酸序列構成。 [24]　一種多重特異性分子，其包含如[19]～[23]中任一者之scFv，且會與並非癌症-睪丸抗原肽和主要組織相容性複體(MHC)的複合體之標的分子特異性地結合。 [25]　如[24]之多重特異性分子，其中該MHC為人類白血球抗原(HLA)。 [26]　如[24]或[25]之多重特異性分子，其包含會與該標的分子特異性地結合之抗體或其抗原結合片段。 [27]　如[24]～[26]中任一者之多重特異性分子，其為多重特異性抗體。 [28]　如[24]～[27]中任一者之多重特異性分子，其包含taFv-異二聚體Fc。 [29]　如[24]～[28]中任一者之多重特異性分子，其為三重特異性抗體。 [30]　如[24]～[28]中任一者之多重特異性分子，其為雙重特異性抗體。 [31]　如[24]～[30]中任一者之多重特異性分子，其中標的分子為GPRC5D、CD98或Trop2。 [32]　如[24]～[31]中任一者之多重特異性分子，其包含選自下列(i)～(iii)的一個多肽群組： (i)包含由序列識別號21之第20～744個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽； (ii)包含由序列識別號23之第20～743個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽； (iii)包含由序列識別號25之第20～739個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽。 [33]　一種多核苷酸，其包含編碼如[24]～[32]中任一者之多重特異性分子所包含的胺基酸序列之鹼基序列。 [34]　一種載體，其包含如[33]之多核苷酸。 [35]　一種細胞，其包含如[33]之多核苷酸或如[34]之載體、或者會生產如[24]～[32]中任一者之多重特異性分子。 [36]　一種如[24]～[32]中任一者之多重特異性分子的製造方法，其包含培養如[35]之細胞的步驟。 [37]　一種多重特異性分子，其藉由如[36]之方法而獲得。 [38]　一種包含如[19]～[23]中任一者之scFv、如[24]～[32]或[37]中任一者之多重特異性分子、如[33]之多核苷酸、如[34]之載體、或如[35]之細胞之組成物。 [39]　一種Fab，其會與CD3特異性地結合，且包含下列CDRH1～3及CDRL1～3：由序列識別號40所示胺基酸序列構成的CDRH1；由序列識別號41所示胺基酸序列構成的CDRH2；由序列識別號42所示胺基酸序列構成的CDRH3；由序列識別號43所示胺基酸序列構成的CDRL1；由序列識別號44所示胺基酸序列構成的CDRL2；及由序列識別號45所示胺基酸序列構成的CDRL3。 [40]　如[39]之Fab，其包含由序列識別號46所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號47所示胺基酸序列之胺基酸編號1～109構成的輕鏈可變區。 [41]　如[39]或[40]之Fab，其包含由序列識別號46所示胺基酸序列構成的多肽、及由序列識別號47所示胺基酸序列構成的輕鏈。 [42]　一種多重特異性分子，其包含如[39]～[41]中任一者之Fab，且會與並非癌症-睪丸抗原肽和主要組織相容性複體(MHC)的複合體之標的分子特異性地結合。 [43]　如[42]之多重特異性分子，其中該MHC為人類白血球抗原(HLA)。 [44]　如[42]或[43]之多重特異性分子，其包含會與該標的分子特異性地結合之抗體或其抗原結合片段。 [45]　如[42]～[44]中任一者之多重特異性分子，其為多重特異性抗體。 [46]　如[42]～[45]中任一者之多重特異性分子，其為雙重特異性抗體。 [47]　一種多核苷酸，其包含編碼如[42]～[46]中任一者之多重特異性分子所包含的胺基酸序列之鹼基序列。 [48]　一種載體，其包含如[47]之多核苷酸。 [49]　一種細胞，其包含如[47]之多核苷酸或如[48]之載體、或者會生產如[42]～[46]中任一者之多重特異性分子。 [50]　一種如[34]～[38]中任一者之多重特異性分子的製造方法，其包含培養如[49]之細胞的步驟。 [51]　一種多重特異性分子，其藉由如[50]之方法而獲得。 [52]　一種包含如[39]～[41]中任一者之Fab、如[42]～[46]中任一者之多重特異性分子、如[47]之多核苷酸、如[48]之載體、或如[49]之細胞之組成物。 [53]　一種scFv，其會與CD3特異性地結合，且重鏈可變區及輕鏈可變區進行雙硫鍵結而成，並包含下列CDRH1～3及CDRL1～3：由序列識別號40所示胺基酸序列構成的CDRH1；由序列識別號41所示胺基酸序列構成的CDRH2；由序列識別號42所示胺基酸序列構成的CDRH3；由序列識別號43所示胺基酸序列構成的CDRL1；由序列識別號44所示胺基酸序列構成的CDRL2；及由序列識別號45所示胺基酸序列構成的CDRL3。 [54]　如[53]之scFv，其包含由序列識別號48所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號48所示胺基酸序列之胺基酸編號134～242構成的輕鏈可變區。 [55]　如[53]或[54]之scFv，其由序列識別號48所示胺基酸序列構成。 [56]　如[53]之scFv，其包含由序列識別號49所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號49所示胺基酸序列之胺基酸編號134～242構成的輕鏈可變區。 [57]　如[53]或[56]之scFv，其由序列識別號49所示胺基酸序列構成。 [58]　一種多重特異性分子，其包含如[53]～[57]中任一者之scFv，且會與並非癌症-睪丸抗原肽和主要組織相容性複體(MHC)的複合體之標的分子特異性地結合。 [59]　如[58]之多重特異性分子，其中該MHC為人類白血球抗原(HLA)。 [60]　如[58]或[59]之多重特異性分子，其包含會與該標的分子特異性地結合之抗體或其抗原結合片段。 [61]　如[58]～[60]中任一者之多重特異性分子，其為多重特異性抗體。 [62]　如[58]～[61]中任一者之多重特異性分子，其為雙重特異性抗體。 [63]　一種多核苷酸，其包含編碼如[58]～[62]中任一者之多重特異性分子所包含的胺基酸序列之鹼基序列。 [64]　一種載體，其包含如[63]之多核苷酸。 [65]　一種細胞，其包含如[63]之多核苷酸或如[64]之載體、或者會生產如[58]～[62]中任一者之多重特異性分子。 [66]　一種如[58]～[62]中任一者之多重特異性分子的製造方法，其包含培養如[65]之細胞的步驟。 [67]　一種多重特異性分子，其藉由如[66]之方法而獲得。 [68]　一種包含如[53]～[57]中任一者之scFv、如[58]～[62]中任一者之多重特異性分子、如[63]之多核苷酸、如[64]之載體、或如[65]之細胞之組成物。 [69]　一種醫藥組成物，其包含如[4]～[12]、[24]～[32]、[42]～[46]及[58]～[62]中任一者之多重特異性分子。本說明書包含為本案優先權之基礎的日本專利申請編號2021-055375號、2021-157580號之揭示內容。 [發明之效果]

如按照本發明，則可得到會與CD3結合之scFv且重鏈可變區與輕鏈可變區以雙硫鍵結而結合之scFv或是會與CD3結合之Fab、以及會與並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子結合之新穎的雙重特異性抗體(雙重特異性分子)。該抗體係溶液穩定性高，且能夠不劣化地以溶液狀態保存。

[用以實施發明的形態]

以下，詳細地說明本發明。 1.定義於本發明中，「基因」意指包含編碼蛋白質的胺基酸之鹼基序列的核苷酸鏈或其互補鏈，例如，包含編碼蛋白質的胺基酸之鹼基序列的核苷酸鏈或其互補鏈之多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA、cRNA等包含在「基因」之含意中。該基因為單股、雙股或三股以上之核苷酸，DNA鏈和RNA鏈的締合體、核糖核酸(RNA)與去氧核糖核酸(DNA)於單股的核苷酸鏈上混在一起者、及包含該種核苷酸鏈的雙股或三股以上之核苷酸，亦包含在「基因」之含意中。於本發明中，鹼基序列和核苷酸序列同義。

於本發明中，「多核苷酸」、「核苷酸鏈」、「核酸」及「核酸分子」同義，例如DNA、RNA、探針、寡核苷酸、引子等，亦包含在「多核苷酸」之含意中。該多核苷酸係由單股、雙股或三股以上之鏈構成的多核苷酸，DNA鏈和RNA鏈的締合體、核糖核酸(RNA)與去氧核糖核酸(DNA)於單股的多核苷酸鏈上混在一起者、及包含該種核苷酸鏈的雙股或三股以上之鏈的締合體，亦包含在「多核苷酸」之含意中。

於本發明中，「多肽」、「肽」及「蛋白質」同義。於本發明中，有時會將「抗原」用於「免疫原」之含意。於本發明中，「細胞」中亦包含源自動物個體的各種細胞、繼代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、重組細胞及微生物等。於本發明中，「抗體」係以具有恆定區和可變區的免疫球蛋白之含意使用。並不特別限定抗體為天然物、或為藉由部分或者是完全合成所製造的免疫球蛋白。

基本的4鏈抗體的結構，係由2個相同的輕鏈(L鏈)、及2個相同的重鏈(H鏈)所構成。輕鏈藉由1個雙硫鍵結而與重鏈結合。2個重鏈係因應重鏈的同型(isotype)，藉由1個或複數個雙硫鍵結而彼此結合。各自之輕鏈、重鏈具有持有規律間隔的鏈內雙硫鍵結。於重鏈和輕鏈，係存在胺基酸序列顯示非常高類似性的恆定區和胺基酸序列之類似性低的可變區。輕鏈係於胺基末端具有後接有恆定區(CL)的可變區(VL)。重鏈係於胺基末端具有後接有3個恆定區(CH1/CH2/CH3)的可變區(VH)。VL和VH成對，且CL係與重鏈的第一恆定區(CH1)並排。VL和VH成對，而形成單一之抗原結合部位。

就本發明之抗體的恆定區而言，並不特別限定，但就用以治療或預防人類之疾病的本發明之抗體而言，較佳為使用人類抗體的恆定區。就人類抗體的重鏈恆定區而言，可舉出例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、Cε等。就人類抗體的輕鏈恆定區而言，可舉出例如Cκ、Cλ等。

Fab係由重鏈之VH和後接於其的CH1、及輕鏈之VL和後接於其的CL構成。VH與VL包含互補性決定區(CDR)。於VH與CH1、及VL與CL之間，亦可有連接子或連結部。

Fc(亦稱為Fc區)係重鏈之恆定區的羧基末端區域，包含CH2與CH3，為二聚體。本發明之Fc可為天然之序列的Fc，亦可為在天然之序列經有變異之變異型的Fc(稱為「變異型Fc」)，於本發明之多重特異性分子及雙重特異性分子中，較佳的Fc區為變異型Fc，更佳為可形成異二聚體之1組的Fc。就1組的Fc而言，可舉出後述之第1多肽所含的Fc(i)及第2多肽所含的Fc(ii)之組合，但若1組的Fc會締合(異二聚體形成)，則不限定於彼等。

就變異型Fc而言，可例示WO2013/063702所揭示之具有經提升之穩定性的異多聚體中所包含的變異Fc區(異二聚體包含Fc區)、WO96/27011所揭示之異種多聚體中所包含的包含由具有「突起」及「空隙」的IgG抗體所誘導之免疫球蛋白的CH3區之Fc、WO2009/089004所揭示之包含因將1以上之胺基酸殘基取代為帶電胺基酸而在靜電上有利之異二聚體中所包含的CH3結構域之Fc、WO2014/110601所揭示之使用了立體結構變異及/或pI(等電點)變異之異種二聚體中所包含的異種二聚體Fc區、WO2010/151792所揭示之包含含有使對蛋白質A之結合消失或減少的變異之CH3結構域的異二聚體之Fc等，但並不限定於此等。

可變區係由被稱為高度變異區(HVR：hypervariable region)之具有極度的可變性之區域、及藉由該區域所分離的被稱為框架區(FR：Framework region)之比較不變的區域構成。天然之重鏈和輕鏈的可變區包含藉由3個高度變異區所接續的4個FR，各鏈的高度變異區係藉由FR而與其他鏈的高度變異區一起被保持為極靠近，而有助於抗體之抗原結合部位的形成。

已知抗體分子的重鏈及輕鏈中有各自3處的互補性決定區(CDR：Complementarity determining region)。互補性決定區亦稱為高度變異區，於抗體之重鏈及輕鏈的可變區內，為一次結構之變異性特別高的部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈的一次結構上，通常各自分離在3個部位。於本發明中，係針對抗體的互補性決定區，將重鏈的互補性決定區由重鏈胺基酸序列的胺基末端側起標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈的互補性決定區由輕鏈胺基酸序列的胺基末端側起標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等之部位係在立體結構之上彼此鄰近，且決定對於會結合之抗原的特異性。

於本發明中，CDR的位置和長度係藉由IMGT的定義(Developmental and Comparative Immunology 27(2003) 55-77)而決定。

FR為CDR殘基以外的可變區。可變區一般具有FR1、FR2、FR3、FR4的4個FR。

重鏈以及輕鏈中所包含的CDR和FR，係各自由胺基末端朝向羧基末端，依FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4、以及FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4的順序配置。

CDR和FR的位置，可藉由該技術領域中周知的各樣的定義，例如於IMGT以外，還有Kabat、Chothia、AbM、contact等之定義而決定。

於本發明中，抗體所結合之「部位」，亦即抗體所辨識之「部位」，意指抗體所結合或辨識之抗原上的部分肽或部分高次結構。

於本發明中，將該部位亦稱為抗原決定位、抗體之結合部位。於本發明中，「變異抗體」意指具有在原本之抗體所具有的胺基酸序列中胺基酸取代、缺失、附加(附加中包含插入)(以下，總稱為「變異」)而成的胺基酸序列，且會與作為本發明之標的的抗原結合之多肽。該變異抗體中的變異胺基酸之數目為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40或50個。該變異抗體亦包含在本發明之「抗體」中。於本發明中，「1或數個」中的「數個」係指2～10個。

於本說明書中，「分子」係包含上述抗體、抗體之抗原結合片段的分子，進一步包含由抗體或源自彼等的複數個抗原結合片段所形成之為多重特異性的分子。

於本說明書中，「為多重特異性的分子」、「多重特異性(的)分子」及「多重特異性分子」同義，若為能夠與1個分子上的複數個彼此不同的抗原決定位、及/或2個以上之分子上的彼此不同的抗原決定位結合的分子，則不特別限定。就為多重特異性的分子而言，亦包含含重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)的抗體。於本發明中，有時會將這種多重特異性分子亦稱為「多重特異性抗體」、「多重特異性抗體」等。「會辨識2個以上之抗原」，意指「會與1個分子上的複數個彼此不同的抗原決定位結合」或「會與2個以上之分子上的彼此不同的抗原決定位結合」。

於本說明書中，凝集體指蛋白質聚集而生成者，按照粒徑而可檢出的分析法不相同。粒徑100nm左右以下之凝集體可藉由HPLC等之粒徑篩析層析法來評價。粒徑100nm以上之微可見顆粒(Subvisible particles)(粒徑0.1～10μm)或不溶性微粒子(粒徑10μm以上)可使用微流影像(Microflow Imaging)法等來評價。

於本說明書中，「HMWS」為high molecular weight species的縮寫，係總稱藉由使用粒徑篩析層析法等的尺寸份化，而於所得之層析圖中被份化為尺寸比目標蛋白質的主要波峰餾分還大的蛋白質凝集體餾分之用語。「HMWS(%)」意指將包含目標蛋白質的溶液試樣供予HPLC等之粒徑篩析層析法，將溶出型態以檢出波長280nm監測，且將所得之層析圖中之出現在較目標蛋白質的主要波峰餾分為高分子側的波峰餾分之面積占總波峰面積的比例，藉由百分率法而算出之值。

2.抗原 2-1.CD3抗原於本發明中，「CD3」以與CD3蛋白質相同的含意使用。 CD3係作為多分子T細胞受體複合體的一部分而在T細胞上表現，為γ鏈、δ鏈、ε鏈、ζ鏈、η鏈之5種類的多肽(分子量依序為25000-28000、21000、20000、16000、22000)之複合體。

就CD3複合體而言，可舉出γ、δ、ε、ζ、η鏈。此等亦被稱為次單元。抗CD3抗體與T細胞結合，藉此而會透過T細胞活性化來誘導細胞毒殺。許多抗CD3抗體會與CD3ε結合。

編碼人類CD3ε之cDNA的核苷酸序列係以登錄號：NM-000733(NM-000733.3)登錄在NCBI/基因銀行(GenBank)，人類CD3ε的胺基酸序列係以登錄號：NP-000724(NM-000724.1)登錄在NCBI/GenPept。編碼石蟹獼猴CD3之cDNA的核苷酸序列係以登錄號：NM-001283615.1登錄在基因銀行。

2-2.標的分子於本發明中，標的分子若為存在於活體之CD3以外的分子，則不特別限定，但較佳為在治療標的細胞(可例示癌細胞、間質細胞、及抑制性免疫細胞，但並不限定於彼等)的表面表現，且藉由表現CD3之T細胞的重定向而於該癌細胞使細胞毒殺活性發揮的分子，更佳為並非癌症-睪丸抗原肽和主要組織相容性複體(MHC)的複合體。

癌症-睪丸抗原肽為癌細胞表面抗原肽之1種，可舉出例如MAGE肽、XAGE肽、LAGE家族肽等。MHC有人類白血球抗原(HLA)、小鼠H-2等，HLA被分類為第1型與第2型，各自為第1型包含HLA-A、HLA-B及HLA-C，而第2型包含HLA-DR、HLA-DP及HLA-DQ等。作為癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體，可舉出例如為(1)HLA-A2、(2)β2-微球蛋白及(3)MAGE-A3、A4、A10或LAGE肽(例如，UniProtKB-P78358(CTG1B人類)之胺基酸編號157～165)之三者複合體的HLA-A2/MAGE-A3、A4、A10或HLA-A2/LAGE。

於本發明中，作為並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之較佳的標的分子，可舉出較佳為癌抗原肽或癌抗原，具體而言可例示WT1、gp100、p53、KRAS、CD19、CD20、CD33、CD37、CD38、CD98、CD123、EGFR、HER2、HER3、HER4、EpCAM、CEA、PSMA、B7-H3、Trop-2、BCMA、GPRC5D等。就對於間質細胞之標的分子而言，可例示FAP、CDH17、LRRC15等。就對於源自骨髓的免疫抑制細胞(MDSC)之標的分子而言，可例示CD33。

2-3.抗原的調製本發明中使用的上述抗原蛋白質；為CD3及並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子的其他的抗原蛋白質，係可藉由從動物組織(包含體液)、源自該組織的細胞或該細胞培養物之純化及單離、基因重組、生體外轉譯、化學合成等來調製。

該抗原蛋白質的cDNA，係可藉由所謂的PCR法來取得，其係例如以表現該抗原蛋白質的mRNA之臟器的cDNA基因庫作為模板，而使用會特異性地增幅該抗原蛋白質的cDNA之引子來進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(Saiki, R.K., et al., Science(1988) 239, 487-49)。

嚴格條件下會與由與編碼於人類或大鼠的該抗原蛋白質之核苷酸序列互補的核苷酸序列構成的多核苷酸雜交，且編碼具有與該抗原蛋白質同等之生物活性的蛋白質之多核苷酸，亦包含在該抗原蛋白質的cDNA中。再者，為從於人類或大鼠表現之該抗原蛋白質基因座所轉錄的剪接變異體或嚴格條件下會與其雜交之多核苷酸，且編碼具有與該抗原蛋白質同等之生物活性的蛋白質之多核苷酸，亦包含在該抗原蛋白質的cDNA中。

編碼下述蛋白質之核苷酸序列，亦包含在該抗原蛋白質基因的核苷酸序列中：由在人類或大鼠之該抗原蛋白質的胺基酸序列、或從此等之序列除去訊息序列的胺基酸序列中有1至數個胺基酸被取代、缺失或附加之胺基酸序列構成，而具有與該抗原蛋白質同等之生物活性的蛋白質。

下述蛋白質亦包含在該抗原蛋白質中：由從在人類或大鼠的該抗原蛋白質之基因座所轉錄的剪接變異體所編碼之胺基酸序列、或該胺基酸序列中有1或數個胺基酸被取代、缺失或附加之胺基酸序列構成，且具有與該抗原蛋白質同等之生物活性的蛋白質。

並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子，亦可以同樣的手法來調製。

2-4.對抗原蛋白質的結合特異性本發明之多重特異性分子中所包含的抗CD3抗體及其結合片段等會辨識(即結合)CD3抗原。該抗CD3抗體等較佳為會與人類CD3、猴CD3等，更佳為會與人類CD3及石蟹獼猴CD3結合。然而，該較佳的抗CD3抗體並不會與大鼠及/或小鼠的CD3結合。

又，本發明之多重特異性分子中所包含之針對標的分子的抗體及其結合片段等會辨識(即結合)該標的分子，其中該標的分子較佳為並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子

於本發明中，「辨識」亦即「結合」意指非為非特異性的吸附之結合。就是否辨識亦即是否結合的判定基準而言，可舉出例如解離常數(Dissociation Constant：以下，稱為「KD」)。本發明之較佳的抗體等對抗原蛋白質之KD值為1×10 ^-5M以下、5×10 ^-6M以下、2×10 ^-6M以下、1×10 ^-6M以下。

本發明中之抗原和抗體的結合，可藉由SPR法、BLI法等之活體分子間相互作用解析系統、或者是ELISA法、RIA法等來測定或判定。細胞表面上表現之抗原和抗體的結合，可藉由流動式細胞測量術等來測定。

SPR法(表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance)解析法)，係使用作為利用反應動力學的(kinetics)解析而測量結合速率常數(Ka值)與解離速率常數(Kd值)以求出為親和性指標之解離常數(KD值)等的分析手法。就用於SPR解析的機器而言，可例示Biacore(商標)(GE Healthcare公司製)、ProteOn(商標)(BioRad公司製)、SPR-Navi(商標)(BioNavis公司製)、Spreeta(商標)(Texas　Instruments公司製)、SPRi-PlexII(商標)(HORIBA公司製)、Autolab　SPR(商標)(Metrohm公司製)等。

BLI法(生物膜干涉技術(BioLayer Interferometry))係使用生物膜干涉之測量活體分子間相互作用的方法。就用於使用BLI法之相互作用解析的機器而言，可例示Octet系統(Pall ForteBio公司製)等。

ELISA(酵素結合免疫吸附分析(Enzyme-linked ImmunoSorbent Assay))法係以特異抗體或者是抗原捕捉試料溶液中所含的目標之抗原或者是抗體，且同時利用酵素反應來檢出、定量的方法。將經酵素標識的抗原或者是抗體納入反應系統中，檢出酵素活性。於酵素活性的檢出，係使用吸光光譜會因反應而變化的基質，以吸光度測定來進行數值化。

Cell-ELISA係將位於細胞表面的測定對象以整個細胞來捕捉，且同時利用酵素反應來檢出、定量的方法。

RIA法(放射免疫分析(Radio Immunoassay)法)可藉由使用放射性物質標識抗體，且測定來自抗體的放射能，而進行抗體的定量。

流動式細胞測量術係使細胞分散於流體中，該使流體稀薄地流動而將個別的細胞進行光學分析的手法。經螢光色素所標識的抗體藉由抗原抗體反應而與細胞表面抗原結合，且測定來自已與細胞結合之經標識的抗體之螢光強度，藉此而定量抗體的抗原結合性。

3.會與抗原蛋白質特異性地結合之抗體或其結合片段 3-1.會與CD3特異性地結合之抗體或其結合片段本發明之會與CD3特異性地結合之抗CD3抗體及該抗體之抗原結合片段(以下，亦記載為本發明之抗體等)，可為單株抗體及多株抗體之任一者。本發明之單株抗體的同型並不特別限定，可舉出例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等之IgG、IgM、IgA1、IgA2等之IgA、IgD、Ig等。單株抗體的同型及亞型(subclass)可藉由例如歐氏擴散法(Ouchterlony method)、ELISA法、RIA法等來決定。就本發明之單株抗體而言，可舉出源自非人類動物的抗體(非人類動物抗體)、人類抗體、嵌合化抗體(亦稱為「嵌合抗體」)、人類化抗體等，較佳為可使用人類抗體。本發明之抗體的範圍中，亦包含抗體的變異體(後述之「變異抗體」)，例如人類抗體的範圍中，亦包含人類變異抗體。

就非人類動物抗體而言，可舉出源自哺乳類、鳥類等之脊椎動物的抗體等。就源自哺乳類的抗體而言，可舉出小鼠抗體、大鼠抗體等之源自齧齒類的抗體等。就源自鳥類的抗體而言，可舉出雞抗體等。

就嵌合化抗體而言，可舉出使源自非人類動物抗體的可變區與人類抗體(人類免疫球蛋白)恆定區而成之抗體等，但不限定於彼等。

就人類化抗體而言，可舉出將非人類動物抗體之可變區中的CDR移植至人類抗體(人類免疫球蛋白之可變區)者、除了CDR以外亦將非人類動物抗體之框架區的序列一部分移植至人類抗體者、將源自彼等中任一者之非人類動物抗體的1個或2個以上之胺基酸以人類型的胺基酸取代者等，但不限定於彼等。

抗體可利用習知的種種方法來製作。作為習知的方法，可藉由使用融合瘤的方法或細胞免疫法等來製作，且藉由基因重組的手法來製作。又，亦已知取得源自從人類抗體基因庫分選的噬菌體顯示之人類抗體的方法。例如，可使用噬菌體顯示法，其係使人類抗體之可變區作為scFv表現於噬菌體表面，而選擇會與抗原結合之噬菌體。可藉由將因會與抗原結合而被選擇之噬菌體的基因進行解析，而決定編碼會與抗原結合之人類抗體之可變區的DNA序列。若明白了會與抗原結合之scFv的DNA序列，則可藉由製作具有該序列的表現載體，且導入適當的宿主使其表現而取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu. Rev. Immunol(1994)12, 433-455)。

亦可使用如此進行所得之具有高活性的抗體作為先導抗體(lead antibody)，且使編碼該先導抗體的基因變異，而製作更高活性的變異體(後述之「變異抗體」)。

作為本發明之一態樣，而提供本發明之抗體之抗原結合片段(以下，僅稱為「結合片段」)。本發明之抗CD3抗體或針對並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子的抗體的結合片段中，包含嵌合化抗體、人類化抗體、或人類抗體的結合片段。抗體的結合片段，係意指該抗體所具有的功能之中至少保持抗原結合性之片段或其修飾物。就該抗體之功能而言，一般來說可舉出抗原結合活性、調節抗原的活性之活性(例如促效(agonist)活性)、使抗原內在化於細胞內抗原之活性、阻礙或促進與會和抗原進行相互作用之物質的相互作用之活性等。

就抗體之抗原結合片段而言，若為該抗體所具有的活性之中至少保持抗原結合性之該抗體的片段，則不特別限定，但可舉出例如Fab、Fab’、F(ab’) ₂、Fv、以適當的連接子使重鏈及輕鏈之Fv連結而成的單股Fv(scFv)、單域抗體(sdAb)等，但不限定於彼等。如同保有連接子部分之scFv，包含本發明之抗體之抗原結合片段以外的部分的分子亦包含在本發明之抗體之抗原結合片段之含意中。其中又較佳為Fab或scFv。

Fab如圖38B所示，為包含重鏈的可變區及恆定區CH1、以及輕鏈的可變區及恆定區CL之抗原結合片段。Fab亦可由完全抗體藉由木瓜酵素等之酵素消化處理而得到。

scFv係藉由將抗體的重鏈可變區與輕鏈可變區以多肽的連接子連結而可獲得的抗體之抗原結合片段(Pluckthun A. The Pharmacology of Monoclonal Antibodies113, Rosenburg及Moore編, Springer Verlag, New York, 269-315(1994), Nature Biotechnology(2005), 23, 1126-1136)。又，亦可使用以多肽連接子使2個scFv結合而製作的串聯scFv作為雙重特異性分子。進而亦可使用由3個以上之scFv而成的三抗體(triabody)等作為多重特異性分子。

scFv可使用噬菌體顯示法(Nature Biotechnology(2005)，23，(9)，p.1105-1116)來取得，其係使抗體之可變區作為單股抗體(scFv)而表現於噬菌體表面，而選擇會與抗原結合之噬菌體。可藉由將因會與抗原結合而被選擇之噬菌體的基因進行解析，而決定編碼會與抗原結合之人類抗體之可變區的DNA序列。若明白了會與抗原結合之scFv的DNA序列，則可藉由製作具有該序列的表現載體，且導入適當的宿主使其表現而取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu. Rev. Immunol (1994)12, p.433-455、Nature Biotechnology (2005)23(9), p.1105-1116)。

於本發明之抗CD3scFv中，重鏈可變區及輕鏈可變區經雙硫鍵結。這種scFv係與重鏈可變區及輕鏈可變區並未雙硫鍵結的scFv同樣地，可使用哺乳類培養細胞來表現。

與藉由IMGT的定義而決定之情形相比，使用與IMGT為不同的定義(例如Kabat、Chothia、AbM，contact等)而決定之情形，輕鏈可變區的位置和長度有時會在藉由IMGT的定義而決定之該輕鏈可變區胺基酸序列的羧基末端，進一步包含1個或2個以上之胺基酸，例如精胺酸或甘胺酸。這種具有輕鏈可變區的抗體或其結合片段，亦包含在本發明之抗體或其結合片段中。

抗CD3抗體或其抗原結合片段，若為會與人類CD3結合之抗體或其結合片段，則不特別限定，但較佳為亦會與石蟹獼猴等之非人類靈長類的CD3結合。就更佳的抗CD3抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含下述而成的抗體或其抗原結合片段：由序列識別號32所表示的胺基酸序列構成的重鏈可變區CDRH1、由序列識別號33所表示的胺基酸序列構成的重鏈可變區CDRH2、由序列識別號34所表示的胺基酸序列構成的重鏈可變區CDRH3、由序列識別號35所表示的胺基酸序列構成的輕鏈可變區CDRL1、由序列識別號36所表示的胺基酸序列構成的輕鏈可變區CDRL2、及由序列識別號37所表示的胺基酸序列構成的輕鏈可變區CDRL3(以上，圖36)。

就包含圖36所示之該CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的更佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含下述而成的抗體或其抗原結合片段：由序列識別號1(圖5)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～118之胺基酸序列構成的C3E-7085重鏈可變區、由序列識別號3(圖7)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～118之胺基酸序列構成的C3E-7096重鏈可變區、由序列識別號39(圖46)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～118之胺基酸序列構成的C3E-7097重鏈可變區。此外，於7096重鏈可變區之胺基酸編號110，係以與C3E-7096輕鏈可變區之胺基酸編號177形成S-S鍵結的方式而有半胱胺酸追加；於7097重鏈可變區之胺基酸編號44，係以與C3E-7097輕鏈可變區之胺基酸編號233形成S-S鍵結的方式而有半胱胺酸追加。

又，就包含圖36所示之該CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的更佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含下述而成的抗體或其抗原結合片段：由序列識別號2(圖6)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～107之胺基酸序列構成的C3E-7085輕鏈可變區、由序列識別號3(圖7)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號134～240之胺基酸序列構成的C3E-7096輕鏈可變區、由序列識別號39(圖46)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號134～240之胺基酸序列構成的C3E-7097輕鏈可變區。此外，於7096輕鏈可變區之胺基酸編號177，係以與7096重鏈可變區之胺基酸編號110形成S-S鍵結的方式而有半胱胺酸追加；於7097輕鏈可變區之胺基酸編號233，係以與C3E-7097重鏈可變區之胺基酸編號44形成S-S鍵結的方式而有半胱胺酸追加。

又，就包含圖36所示之該CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的更佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含下述而成的抗體或其抗原結合片段：由序列識別號1(圖5)所表示的胺基酸編號1～118及序列識別號2(圖6)所表示的1～107構成的C3E-7085重鏈可變區及輕鏈可變區之組合、由序列識別號3(圖7)所表示的胺基酸編號1～118及134～240構成的C3E-7096重鏈可變區及輕鏈可變區之組合、由序列識別號39(圖46)所表示的胺基酸編號1～118及134～240構成的C3E-7097重鏈可變區及輕鏈可變區之組合。

進一步，就包含圖36所示之該CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的更佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示由序列識別號1(圖5)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～216之胺基酸序列和序列識別號2(圖6)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～213之胺基酸序列構成的C3E-7085Fab。

進一步，就包含圖36所示之該CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的更佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示由序列識別號3(圖7)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～240之胺基酸序列構成的C3E-7096scFv、由序列識別號39(圖46)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～240之胺基酸序列構成的C3E-7097scFv。

又，就其他較佳的抗CD3抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含下述而成的抗體或其抗原結合片段：由序列識別號40所表示的胺基酸序列構成的重鏈可變區CDRH1、由序列識別號41所表示的胺基酸序列構成的重鏈可變區CDRH2、由序列識別號42所表示的胺基酸序列構成的重鏈可變區CDRH3、由序列識別號43所表示的胺基酸序列構成的輕鏈可變區CDRL1、由序列識別號44所表示的胺基酸序列構成的輕鏈可變區CDRL2、及由序列識別號45所表示的胺基酸序列構成的輕鏈可變區CDRL3(以上，圖47)。

就包含圖47所示之該CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的較佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含下述而成的抗體或其抗原結合片段：由序列識別號46(圖48)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～118之胺基酸序列構成的C3E-7093重鏈可變區、由序列識別號48(圖50)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～118之胺基酸序列構成的C3E-7098重鏈可變區、由序列識別號49(圖51)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～118之胺基酸序列構成的C3E-7099重鏈可變區。此外，於C3E-7098重鏈可變區之胺基酸編號110，係以與C3E-7098輕鏈可變區之胺基酸編號177形成S-S鍵結的方式而有半胱胺酸追加；於C3E-7099重鏈可變區之胺基酸編號44，係以與C3E-7099輕鏈可變區之胺基酸編號235形成S-S鍵結的方式而有半胱胺酸追加。

又，就包含圖47所示之該CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的較佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含下述而成的抗體或其抗原結合片段：由序列識別號47(圖49)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～118之胺基酸序列構成的C3E-7093輕鏈可變區、由序列識別號48(圖50)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號134～242之胺基酸序列構成的C3E-7098輕鏈可變區、由序列識別號49(圖51)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號134～242之胺基酸序列構成的C3E-7099輕鏈可變區。此外，於C3E-7098輕鏈可變區之胺基酸編號177，係以與C3E-7098重鏈可變區之胺基酸編號110形成S-S鍵結的方式而有半胱胺酸追加；於C3E-7099輕鏈可變區之胺基酸編號235，係以與C3E-7099重鏈可變區之胺基酸編號44形成S-S鍵結的方式而有半胱胺酸追加。

又，就包含圖47所示之該CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的較佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示包含下述而成的抗體或其抗原結合片段：由序列識別號46(圖48)所表示的胺基酸編號1～118及序列識別號47(圖49)所表示的1～109構成的C3E-7093重鏈可變區及輕鏈可變區之組合、由序列識別號48(圖50)所表示的胺基酸編號1～118及134～242構成的C3E-7098重鏈可變區及輕鏈可變區之組合、由序列識別號49(圖51)所表示的胺基酸編號1～118及134～242構成的C3E-7099重鏈可變區及輕鏈可變區之組合。

進一步，就包含圖46所示之該CDRH1～CDRH3及CDRL1～CDRL3的更佳的抗體或其抗原結合片段而言，可例示由序列識別號46(圖48)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～216之胺基酸序列和序列識別號47(圖49)所表示的胺基酸序列之胺基酸編號1～215之胺基酸序列構成的C3E-7093Fab。

又，會與CD3結合之VH與VL經雙硫鍵結的scFv，可於VH與VL之間包含有連接子、連結部、或其它任意部分(portion)，且即使該scFv被本發明之多重特異性分子包含也同樣。例如，可於抗CD3scFv的VH與VL之間，包含有後述之「其他結合部分」、「其他群組」或彼等之一部分。

3-2.會與標的分子結合之抗體或其結合片段會與「2-2.標的分子」結合之抗體或其結合片段，可為單株抗體及多株抗體之任一者。本發明之單株抗體的同型並不特別限定，可舉出例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等之IgG、IgM、IgA1、IgA2等之IgA、IgD、Ig等。單株抗體的同型及亞型，係可藉由例如歐氏擴散法、ELISA法、RIA法等來決定。就本發明之單株抗體而言，可舉出源自非人類動物的抗體(非人類動物抗體)、人類抗體、嵌合化抗體(亦稱為「嵌合抗體」)、人類化抗體等，較佳為可使用人類抗體。本發明之抗體的範圍中，亦包含抗體的變異體(後述之「變異抗體」)，例如人類抗體的範圍中，亦包含人類變異抗體。

就嵌合化抗體而言，可舉出使源自非人類動物抗體的可變區與人類抗體(人類免疫球蛋白)恆定區結合而成之抗體等，但不限定於彼等。

抗體可利用習知的種種方法來製作。作為習知的方法，可藉由使用融合瘤的方法或細胞免疫法等來製作，且藉由基因重組的手法來製作。又，亦已知取得源自從人類抗體基因庫分選的噬菌體顯示之人類抗體的方法。例如可使用噬菌體顯示法，其係使人類抗體之可變區作為scFv表現於噬菌體表面，而選擇會與抗原結合之噬菌體。可藉由將因會與抗原結合而被選擇之噬菌體的基因進行解析，而決定編碼會與抗原結合之人類抗體之可變區的DNA序列。若明白了會與抗原結合之scFv的DNA序列，則可藉由製作具有該序列的表現載體，且導入適當的宿主使其表現而取得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev. Immunol (1994)12, 433-455)。

亦可使用如此進行所得之具有高活性的抗體作為先導抗體，且使編碼該先導抗體的基因變異，而製作更高活性的變異體(後述之「變異抗體」)。

就抗體之抗原結合片段而言，若為該抗體所具有的活性之中至少保持抗原結合性之該抗體的片段，則不特別限定，但可舉出例如Fab、Fab’、F(ab’) ₂、Fv、以適當的連接子使重鏈及輕鏈之Fv連結而成的單股Fv(scFv)、單域抗體(sdAb)等，但不限定於彼等。如同保有連接子部分之scFv，包含本發明之抗體之抗原結合片段以外的部分的分子亦包含在本發明之抗體之抗原結合片段之含意中。

針對並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子的scFv，亦可重鏈可變區及輕鏈可變區經雙硫鍵結。

3-3.抗體或其抗原結合片段的變異體於本發明之抗體或其抗原結合片段的變異體，較佳為可進行對蛋白質的分解或者是氧化之感受性的降低、生物活性、功能的維持、改善或者是降低、變化的抑制、抗原結合能力的改善或者是調節、或理化學性質或功能性質的賦予等。蛋白質係已知位於其表面之特定的胺基酸側鏈變化而該蛋白質的功能或活性會變化，該種例中包含天冬醯胺酸側鏈的脫醯胺化、天冬胺酸側鏈的異構化等。為了防止該種胺基酸側鏈的變化而經取代為別的胺基酸者，亦包含在本發明之變異體的範圍中。

作為本發明之變異體之例，可舉出具有在抗體或其抗原結合片段所具有的胺基酸序列中經保存性胺基酸取代而成之胺基酸序列的抗體或其抗原結合片段。保存性胺基酸取代，係指在與胺基酸側鏈有關聯的胺基酸群內發生之取代。

較佳的胺基酸群係如以下所述：酸性群=天冬胺酸、麩胺酸；鹼性群=離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性群=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及非帶電極性家族=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。其他較佳的胺基酸群如下：脂肪族羥基群=絲胺酸及蘇胺酸；醯胺含有群=天冬醯胺酸及麩醯胺酸；脂肪族群=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；以及芳香族群=苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。該變異抗體中的胺基酸取代，較佳為在不使原本之抗體所具有的抗原結合活性降低的範圍進行。

3-4.抗體或其結合片段的修飾體、複合體本發明提供抗體或其結合片段的修飾體。本發明之抗體或其結合片段的修飾體，意指對本發明之抗體或其結合片段施予化學性或生物學性的修飾而成者。化學性的修飾體係包含對胺基酸骨架的化學部分之鍵結、N-鍵結或O-鍵結碳水化合物鏈的化學修飾體等。生物學性的修飾體係包含經轉譯後修飾(例如，對N-鍵結或O-鍵結之糖鏈附加、胺基末端區域或羧基末端區域的處理(processing)、脫醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化)者、藉由使用原核生物宿主細胞使其表現而甲硫胺酸殘基經附加於胺基末端者等。又，為了能夠進行本發明之抗體或抗原的檢出或單離而經標識者，例如酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含在該修飾物之含意中。這種本發明之抗體或其結合片段的修飾物，係有用於原本之本發明之抗體或其結合片段的穩定性及血中滯留性的改善、抗原性的減少、該抗體或抗原的檢出或單離等。

就化學性修飾體所含的化學部分而言，可例示聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇等之水溶性聚合物。

就生物學性的修飾物而言，可舉出藉由酵素處理或細胞處理等而經施予修飾者、藉由基因重組而經附加標籤等其他之肽而成的融合體、以及以表現內源性或外源性的糖鏈修飾酵素之細胞作為宿主所調製而成者等。

該修飾可於抗體或其結合片段中的任意位置、或於所欲的位置實施，亦可於1個或2個以上之位置進行相同或2種以上之不同的修飾。

但是，此等之重鏈序列的缺失、或者是重鏈或輕鏈序列的修飾，對於抗體的抗原結合能力及效應功能(補體的活性化或抗體依賴性細胞毒殺作用等)並不太會有影響。

因而，可舉出本發明中亦包含受到該缺失或修飾的抗體。例如：於重鏈羧基末端1或2個胺基酸缺失而成的缺失體(Journal of Chromatography A;705;129-134(1995))；重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸的2個胺基酸殘基缺失，且新位於羧基末端之脯胺酸殘基經醯胺化而成的該缺失體(Analytical Biochemistry,360:75-83(2007))；抗體之重鏈或輕鏈的胺基末端之麩醯胺酸或麩胺酸殘基經焦麩胺醯基(pyroglutamyl)化修飾而成的抗體(國際專利公開WO2013/147153號)等(將彼等總稱為「缺失體」)。但是，只要保有抗原結合能力及效應功能，本發明相關之抗體的重鏈及輕鏈之羧基末端的缺失體並不限定於上述種類。本發明相關之抗體包含2股以上之鏈(例如重鏈)之情形，該2股以上之鏈(例如重鏈)可為選自包含完全長及上述缺失體之群組的重鏈之任意一種，亦可為組合任意二種而成者。各缺失體之量比或分子數比會受到生產本發明相關之抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件影響，但就本發明相關之抗體的主成分而言，可舉出在2股的重鏈雙方，羧基末端的1個胺基酸殘基缺失之情形。

再者，即使於本發明之抗體或其抗原結合片段(本發明之分子、多重特異性分子、雙重特異性分子等中所包含之物等)，源自表現載體及/或訊息序列等的1至數個胺基酸被附加在胺基末端及/或羧基末端(且其一部分或全部如前述地經修飾)，若維持著所欲的抗原結合活性，則包含在本發明之抗體的修飾體或其抗原結合片段的修飾體的範圍中，包含該種抗體或抗原結合片段的修飾體之分子，亦包含在本發明之分子的範圍中。

於本發明中，「抗體或其結合片段」係於其含意中亦包含「抗體或其抗原結合片段的修飾體」。又，本發明之分子、多重特異性的分子、雙重特異性的分子等中所包含的「抗體或其抗原結合片段」，係於其含意中亦包含該「抗體或其抗原結合片段的修飾體」。

又，能夠藉由調節與本發明之抗體結合的糖鏈修飾(醣苷化(glycosylation)、脫岩藻醣化(defucosylation)等)，而增強抗體依賴性細胞毒殺活性。就抗體的糖鏈修飾之調節技術而言，已知國際專利公開WO99/54342號、WO00/61739號、WO02/31140號等，但並不限定於此等。

本發明中，亦包含上述抗體與其他分子以連接子連接而成的複合體(Immunoconjugate)。就該抗體與放射性物質或具有藥理作用之化合物(藥物)結合的抗體-藥物複合體之例而言，可舉出ADC(Antibody-Drug Conjugate)(Methods Mol Biol. (2013)1045:1-27; Nature Biotechnology (2005)23, p.1137-1146)。

進一步，本發明中亦包含將此等之抗體與其他功能性多肽連接而成的複合體。就這種抗體-肽複合體之例而言，可舉出該抗體與白蛋白結合多肽之複合體(Protein Eng Des Sel.(2012)(2):81-8)。

上述抗體的修飾體、糖鏈修飾經調節的抗體、複合體包含在本發明之抗體中，且上述抗體的修飾體、糖鏈修飾經調節的抗體、複合體的結合片段包含在本發明之抗體的結合片段中。

4.抗體或其抗原結合片段的生產方法本發明之抗體或其抗原結合片段，係例如可藉由將編碼重鏈可變區的DNA或編碼輕鏈可變區的DNA插入表現載體，以載體使表現用的宿主細胞轉形，且培養宿主細胞，以作為重組抗體來使細胞生產。

編碼抗體或其抗原結合片段的DNA，係藉由將編碼重鏈可變區的DNA與編碼重鏈恆定區的DNA連結而得到編碼重鏈的DNA，且進一步藉由將編碼輕鏈可變區的DNA與編碼輕鏈恆定區的DNA連結而得到編碼輕鏈的DNA。

本發明之抗體或其抗原結合片段，可將上述編碼重鏈的DNA及編碼輕鏈的DNA插入表現載體，以該載體使宿主細胞轉形，且培養該宿主細胞而使其生產。此時，可將上述編碼重鏈的DNA及編碼輕鏈的DNA導入相同表現載體，且使用該載體來將宿主細胞轉形，亦可將編碼重鏈的DNA與編碼輕鏈的DNA插入個別的載體，且使用2個載體來將宿主細胞轉形。此時，亦可對預先導入了編碼重鏈恆定區的DNA及編碼輕鏈恆定區的DNA之載體導入編碼重鏈可變區及輕鏈可變區的DNA。又，該載體可包含編碼會促進由宿主細胞分泌抗體之訊息肽的DNA。此情形，係先將編碼訊息肽的DNA與編碼抗體或其抗原結合片段的DNA以同框(in-frame)連結好。可藉由在抗體或其抗原結合片段被生產之後將訊息肽去除，而得到為成熟蛋白質之抗體或其抗原結合片段。

此時，可將編碼重鏈可變區的DNA、編碼輕鏈可變區的DNA、連結編碼重鏈可變區的DNA及編碼重鏈恆定區的DNA而成的DNA、連結編碼輕鏈可變區的DNA和編碼輕鏈恆定區的DNA而成的DNA，與啟動子、強化子、多腺苷酸化訊息等之單元進行功能性地連結。此處，功能性地連結係指單元以發揮其功能的方式連結。

表現載體，若為在動物細胞、細菌、酵母等之宿主中能夠複製者，則不特別限定，可舉出例如習知的質體、噬菌體等。就表現載體之構築所使用的物質載體而言，可舉出例如pcDNA(商標)(Thermo Fisher SCIENTIFIC公司)、Flexi(登錄商標)載體(Promega公司)、pUC19、pUEX2(Amersham公司製)、pGEX-4T、pKK233-2(Pharmacia公司製)、pMAM-neo(Clontech公司製)等。就宿主細胞而言，大腸菌、枯草菌等之原核細胞、及酵母、動物細胞等之真核細胞都可使用，但較佳為使用真核細胞。例如，作為動物細胞，如使用為人類胎兒腎細胞株之HEK293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等即可。表現載體如以習知的方法導入宿主細胞，且將宿主細胞轉形即可。可舉出例如電穿孔法、磷酸鈣沉澱法、DEAE-葡聚糖轉染法等。所生產之抗體可使用通常在蛋白質所使用的分離、純化方法來進行純化。例如，如適當選擇親和層析法、其他的層析法、過濾器、超過濾、鹽析、透析等且進行組合即可。

5.多重特異性分子本發明之多重特異性分子，若為包含本發明之會與CD3結合之scFv且重鏈可變區與輕鏈可變區以雙硫鍵結而結合之scFv、或會與CD3結合之Fab(以下，稱為「本發明之CD3抗體」)，且包含會與CD3以外的標的分子結合之部分(moiety)(以下，稱為「其他結合部分」)的分子，則不特別限定，該會與CD3以外的標的分子較佳為並非癌症-睪丸抗原肽和主要組織相容性複體(MHC)的複合體之標的分子，於「本發明之CD3抗體」及「其他結合部分」以外，亦可進一步包含其他群組(group)(以下，稱為「其他群組」)。就「其他結合部分」而言，可例示抗體或其結合片段、非源自免疫球蛋白的蛋白質或肽、核酸適體等之核酸分子、低分子化合物、T細胞受體等。就「其他群組」而言，可例示會發揮生物學活性、藥理作用、治療效果、預防效果、佐劑作用、體內動態調節功能、或標識功能等的化合物(蛋白質、肽、核酸分子、低分子化合物、包含放射性同位素的化合物、包含標識物質的化合物、經人工合成之物、醫藥成分、抗腫瘤劑等)、其前驅物(前藥等)、連接子或連結部與彼等之化合物結合或融合而成者。「本發明之CD3抗體」及「其他結合部分」、以及隨意地「其他群組」可彼此直接結合或融合，亦可透過連接子或連結部而間接地結合或融合。「其他結合部分」如有1個以上即可，亦可為2個、3個、或其以上。「其他群組」可隨意地為1個、2個或其以上。彼等可直線地結合或融合、或分枝而結合或融合，對於結合或融合的順序及分枝的位置等並無任何限定。該種本發明之多重特異性分子為圖38A～F、圖39A及B、圖40A及B、圖41A及B、圖42、圖43A及B、圖44A及B、以及圖45所例示的型式，或可包含所例示的型式，但不限定於彼等。

作為本發明之較佳的多重特異性分子，可例示多重特異性抗體等之多重特異性蛋白質(作為整體由多肽及/或肽所構成之分子)。就多重特異性抗體而言，可舉出雙重特異性抗體、三重特異性抗體、四重特異性抗體。「雙重特異性」(或「三重特異性」、「四重特異性」等)，意指能夠與相同分子的2個(或3個、4個等)彼此不同的抗原決定區或2個分子上(或3個分子上、4個分子上等)之彼此不同的抗原決定區結合，包含具有這種雙重特異性的抗體或抗原結合片段。本發明之雙重特異性分子會與CD3結合，且會進一步與標的分子結合，該標的分子較佳為並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子。作為本發明之多重特異性分子，而可舉出具有以下結構(型式)者。

作為本發明之雙重特異性分子，可舉出使第1抗體之Fab與第2抗體之scFv透過連接子結合於二聚體之Fc的一方而成的雙重特異性分子。此情形，可使Fab結合於Fc且使scFv結合於該Fab，亦可使scFv結合於Fc且使Fab結合於該scFv。較佳為使Fab結合且使scFv結合於該Fab。Fab與scFv之結合，如透過連接子而使scFv結合於Fab之可變區即可。該雙重特異性分子，係在以連接子連接scFv與Fab之下游有經置入會形成異二聚體之變異的Fc締合的型式。將這種雙重特異性分子稱為scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子或scFv-Fab-異二聚體Fc型(圖43B左上)。

於本發明中，如使用例如scFv-Fab-異二聚體Fc型即可，其係由抗CD3 Fab與針對並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子的scFv構成。

又，本發明之雙重特異性分子中所包含的抗CD3scFv，係重鏈可變區與輕鏈可變區藉由雙硫鍵結而結合。再者，針對並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子的scFv，亦可重鏈可變區及輕鏈可變區經雙硫鍵結。

進一步，可舉出一種雙重特異性分子，其係使具有將第1抗體與第2抗體之2種類的scFv以連接子連接之型式的taFv(圖38E)，透過連接子或不透過連接子而直接結合於二聚體之Fc的一方而成。將這種雙重特異性分子稱為taFv-異二聚體Fc型雙重特異性分子或taFv-異二聚體Fc型(圖40B左下)。該雙重特異性分子係經置入會形成異二聚體之變異的Fc在taFv之下游異種締合之型式。taFv中之第1抗體與第2抗體的連結順序並不被限定。

於圖43B左上呈示scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子的結構。又，於圖38A呈示scFv，於圖38B呈示Fab，於圖38E呈示taFv，於圖38F呈示scFv-Fab，於圖40B左下呈示taFv-異二聚體Fc型雙重特異性分子，於圖41B右上呈示taFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子的結構。本發明之雙重特異性分子具有複數個多肽締合之結構。

於本發明中，例如就taFv而言，如使用抗CD3scFv與針對標的分子的scFv之taFv即可，該標的分子較佳為並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子。taFv-異二聚體Fc型雙重特異性分子，係較佳為(a)包含由N末端朝向C末端依下述順序包含會與標的分子特異性地結合之scFv、會與CD3特異性地結合之scFv及免疫球蛋白Fc區(i)而成的第1多肽、與包含免疫球蛋白之鉸鏈區及Fc區(ii)而成的第2多肽，其中該標的分子較佳為並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子；更佳為(b)第1多肽與第2多肽於Fc區(i)與Fc區(ii)締合而成。第1多肽及第2多肽之Fc區包含會形成異二聚體之變異。於圖40B左下呈示taFv-異二聚體Fc型雙重特異性分子之例。如圖40B左下所示，第1多肽之Fc區(i)部分與以塗黑所示之第2多肽之Fc區(ii)部分結合，且第1多肽與第2多肽締合。例如，於圖40B左下，以白色表示的scFv為針對標的分子的scFv，而該標的分子較佳為並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子，以右上斜線表示的scFv為抗CD3scFv(VH與VL之間的黑色棒表示二者經雙硫鍵結。)。

本發明之更佳的taFv-異二聚體Fc型雙重特異性分子中所包含的第1多肽，包含序列識別號3所表示的胺基酸序列。本發明之較佳的taFv-異二聚體Fc型雙重特異性分子中所包含的第2多肽，係包含源自人類抗體的鉸鏈區及野生型或變異型Fc而成。

scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子，係較佳為(a)包含由N末端朝向C末端依下述順序包含會與標的分子特異性地結合之scFv、會與CD3特異性地結合之抗體重鏈的可變區及恆定區CH1以及免疫球蛋白Fc區(i)而成的第1多肽、包含免疫球蛋白之鉸鏈區及Fc區(ii)而成的第2多肽、以及包含由可變區及恆定區構成的抗體輕鏈的第3多肽，其中該標的分子為並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子；更佳為(b)第1多肽與第2多肽於Fc區(i)與Fc區(ii)締合，且第1多肽於抗體重鏈的可變區及恆定區CH1與第3多肽(之抗體輕鏈)締合而成。第1多肽及第2多肽之Fc區可為野生型，亦可包含會形成異二聚體之變異。於圖43B左上呈示scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子之例。圖43B左上的右半部為第1多肽及第3多肽，左半部為第2多肽。如圖43B左上所示，第1多肽之Fc區(i)部分與以塗黑所示之第2多肽之Fc區(ii)部分締合，且第1多肽與第3多肽締合。例如，於圖43B左上，以塗黑所表示的scFv為針對標的分子的scFv，而該標的分子較佳為並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子，以白色及棋盤圖案及橫線表示的Fab為抗CD3 Fab。

就較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子中所包含的第1多肽所包含的胺基酸序列而言，可例示序列識別號1所表示的胺基酸序列。

本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子中所包含的第2多肽，係包含源自人類抗體的鉸鏈區及變異型Fc而成，更進一步較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子中所包含的第2多肽，係包含源自人類抗體的鉸鏈區及野生型或變異型Fc而成。

本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子中所包含的第3多肽，係包含源自人類抗體的輕鏈而成，就更佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子中所包含的第3多肽而言，可例示序列識別號2所示胺基酸序列。

本發明之雙重特異性分子中所包含的1個、2個或3個以上之肽可為前述之「缺失體」，亦即可於其羧基末端、尤其是源自抗體重鏈的羧基末端中，1或2個(或其以上)的胺基酸變異(包含缺失)。例如，本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子之一的RX3-0002中所包含的第1多肽所具有的胺基酸序列之羧基末端，可為以下之之任一者：序列識別號31之第713個Lys、1個胺基酸缺失而成的第712個Gly、包含彼等的混合物。同樣地，本發明之較佳的scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子中所包含的第2多肽所具有的胺基酸序列之羧基末端，可為以下之之任一者：序列識別號9之第246個Lys、1個胺基酸缺失而成的第245個Gly、包含彼等的混合物。

本發明之雙重特異性分子中所包含的scFv及Fab，較佳為人類化抗體或人類抗體之scFv及Fab，Fc較佳為人類抗體之Fc。

於本發明之雙重特異性分子中所包含的可變區中，可自抗體的胺基末端側依重鏈可變區、輕鏈可變區的順序結合，或者亦可依輕鏈可變區、重鏈可變區的順序結合。於兩可變區之間亦可具有連接子(隨意)。又，亦可於胺基末端側的可變區之胺基末端具有甘胺酸殘基(隨意)。在串聯scFv型的雙重特異性分子，亦可連接子、FLAG標籤、及/或His標籤結合於羧基末端側的可變區之羧基末端(隨意)。作為較佳的態樣之一，可例示由胺基末端起依重鏈可變區、第1連接子、輕鏈可變區、第2連接子、FLAG標籤、及His標籤的順序結合者。

連接子亦包含單股多肽或單股寡肽、或者是PEG、核苷酸、糖鏈、化合物等之合成品。其它，若為會結合二個多肽者，則不特別限定，能夠使用習知的連接子。

就連接子的長度而言，例如肽連接子之情形為5～30胺基酸。雙重特異性分子中包含複數個連接子之情形，可全部使用相同長度的肽連接子，亦可使用不同的長度的肽連接子。

就肽連接子而言，可例示例如(Gly･Gly･Gly･Gly･Ser)(序列識別號38)的重複，但亦可1～數個與Gly、Ser不同的胺基酸殘基附加於此等。

如上述的本發明之多重特異性抗體可包含的結構(型式)、尤其是雙重特異性抗體可採用的結構(型式)之中，較佳者為taFv-異二聚體Fc型、及scFv-Fab-異二聚體Fc型，更佳者為scFv-Fab-異二聚體Fc型。就taFv-異二聚體Fc型而言，更進一步較佳為由N末端朝向C末端依針對標的分子的scFv、抗CD3　scFv的順序位置之型(taFv-異二聚體Fc型：圖40B左下)，其中該標的分子較佳為並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子。又，就scFv-Fab-異二聚體Fc型而言，於N末端包含針對標的分子的scFv之scFv-Fab-異二聚體Fc型(圖43B左上)，亦為本發明之雙重特異性抗體可採用的更進一步較佳的型式，其中該標的分子較佳為並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子。

如上述的本發明之多重特異性抗體、尤其是雙重特異性抗體之中，包含scFv-Fab-異二聚體Fc型之較佳者，係包含選自下列的一個之多肽群組：(i)包含由序列識別號29之第20～718個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號12之第21～233個胺基酸殘基構成的胺基酸序列之多肽；(ii)包含由序列識別號30之第20～717個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號12之第21～233個胺基酸殘基構成的胺基酸序列之多肽；(iii)包含由序列識別號31之第20～713個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號12之第21～233個胺基酸殘基構成的胺基酸序列之多肽。

如上述的本發明之多重特異性抗體、尤其是雙重特異性抗體之中，包含taFv-異二聚體Fc型之較佳者，係包含選自下列的一個之多肽對：(i)包含由序列識別號21之第20～744個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽；(ii)包含由序列識別號23之第20～743個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽；(iii)包含由序列識別號25之第20～739個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽。

又，就本發明之多重特異性分子可採用的型式而言，除了圖38～45所例示者及其它本案揭示者以外，亦可例示Godar人等Expert Opinion on Therapeutic Patents　28卷 (3號)251-276頁(2018年)、Brinkmann及Knotermann MABS 9卷(2號)182-212頁(2017年)、以及Wu及Demarest Methods 154卷3-9頁(2019年)所記載之各種型式。彼等之文獻的全記載亦包含在本案之揭示中。

本發明中，亦包含下述分子，其包含與本發明之分子所包含的胺基酸序列90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%以上相同之胺基酸序列，且會與CD3結合，進一步亦會與並非癌症-睪丸抗原肽和人類白血球抗原(HLA)的複合體之標的分子結合。

本發明之多重特異性抗體，具備優異的生物學性活性、物理化學性質(以下稱為「物性」。)、安全性、體內動態等。生物醫藥品(biopharmaceuticals)中所含的雜質，由於涉及醫藥品的安全性，因此被要求適切地將在製造時及保存中的增加之有無予以規格設定且進行管理。其中有以凝集物為主要的雜質之一，由於亦涉及免疫原性風險或藥效的降低等，因此為應特別嚴格地管理的項目。(Guidance for Industry Immunogenecity Assessment for Therapeutic Protein Products, U.S. Department of Health and Human Services/Food and Drug Administration/Center for Drug Evaluation and Research(CDER)/Center for Biologics Evaluation and Research(CBER), August 2014, p.15-16)。雜質的管理不僅只在製造時，亦包含製造步驟中或製造後之經時性的穩定性(增加之有無)而有實施評價之必要。由於是基於長期穩定性試驗的結果來設定醫藥品的有效期間，因此經時性地穩定的抗體可設定更長的有效期間。是以，就成為以生物醫藥品為目標而挑選較佳的抗體之際之指標的本發明中之物理化學性質而言，可舉出溶液穩定性、振動穩定性等。選擇了溶液穩定性、振動穩定性等有疑慮的多重特異性抗體作為醫藥品之情形，由於用以使凝集物的量減少之純化步驟的追加(因此而無法避免產率降低)或難以產生凝集物之處方的確立等需要龐大的資源或費用，因此較佳為選擇此等之疑慮少的抗體。

溶液穩定性，係例如可將檢體調製為20mg/mL，藉由粒徑篩析層析法來測定在40℃保存1天、7天、14天之後的HMWS之含有量(%)，以進行評價。HMWS(%)的增加率相對較低的檢體，可判定為溶液穩定性相對較高。

振動穩定性，係例如可將檢體調製為2mg/mL，以2500rpm振動1～2小時，並實施粒徑篩析層析法，算出各檢體之波峰面積及HMWS(%)，以進行評價。但是，以該方法而作為HMWS被檢出的凝集體係直徑10～100nm左右者，粒徑100nm以上之微可見顆粒(粒徑0.1～10μm)或不溶性微粒子(粒徑10μm以上)無法檢出。為了確認該種尺寸之粒子形成之有無，而例如使用振動前及振動2小時處理的檢體，藉由使用FlowCAM8100(DKSH Japan製)等的微流影像法來評價粒子數。若在振動前後之粒子數增加，則可視為因振動劣化而從目標蛋白質之單體經由HMWS而形成粒子。因而，於振動穩定性的評價中，係基於(1)HMWS(%)的增加率、(2)波峰面積的減少率、及/或(3)利用微流影像法之粒子數增減的結果來解釋且進行評價。例如，即便某檢體之HMWS(%)的增加率比其他檢體還大之情形，在該檢體之波峰面積的減少率及/或利用微流影像法之粒子數增加比該其他檢體還小之情形，可評價為該檢體的振動穩定性比該其他檢體還高。其理由是：該其他檢體之HMWS的增加率(%)低，可認為是相當於HMWS的凝集體締合且進一步形成大的多聚體，而以粒徑篩析層析法並無法檢出的緣故。此外，從在振動前幾乎未含有的凝集體在振動後增加，而可確認凝集體係由目標蛋白質所構成。

本發明之多重特異性分子，例如為taFv-異二聚體Fc型且抗CD3scFv的重鏈可變區與輕鏈可變區藉由雙硫鍵結而結合之雙重特異性抗體、及為scFv-Fab-異二聚體Fc型之雙重特異性抗體，係以溶液狀態於長期間不易產生包含二聚體之HMWS，溶液穩定性高。較佳為例如，於0137段落所例示之溶液穩定性的評價方法中，溶液穩定性比為taFv-異二聚體Fc型且抗CD3scFv的重鏈可變區與輕鏈可變區並未藉由雙硫鍵結而結合之雙重特異性抗體還高。

又，本發明之多重特異性分子，例如為taFv-異二聚體Fc型且抗CD3scFv的重鏈可變區與輕鏈可變區藉由雙硫鍵結而結合之雙重特異性抗體、及為scFv-Fab-異二聚體Fc型之雙重特異性抗體，係基於除了包含二聚體之(1)HMWS的增加率、(2)波峰面積的減少率以外、及/或(3)利用微流影像法之粒子數增減的結果來解釋，而振動穩定性高。較佳為例如，於0138段落所例示之振動穩定性的評價方法中，振動穩定性比為taFv-異二聚體Fc型且抗CD3scFv的重鏈可變區與輕鏈可變區並未藉由雙硫鍵結而結合之雙重特異性抗體還高。

本發明提供包含抗CD3抗體、其抗原結合片段或者是其修飾體、及/或包含彼等之多重特異性分子(以下，稱為「抗CD3抗體等」。)的醫藥組成物。

於本發明中，疾病的治療及/或預防包含該疾病之發病的預防、病況惡化或加重的抑制或阻礙、罹患該疾病之個體呈現的一個或二個以上之症狀的減輕、病況惡化或加重的抑制或緩解、二次性疾病的治療或預防等，但不限定於彼等。就疾病而言，例如包含多重特異性分子的醫藥組成物之情形，可舉出癌症。

本發明之醫藥組成物中，除了對治療或預防有效之量的抗CD3抗體等以外，可含有藥學上所容許的稀釋劑、擔體、助溶劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑。

「對治療或預防有效之量」意指對於特定的疾病、投予形態及投予路徑會發揮治療或預防效果之量。

本發明之醫藥組成物中，可含有用以使pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、該組成物或其所包含的抗體之穩定性、溶解性、緩釋性、吸收性、滲透性、劑型、強度、性狀、形狀等變化、或維持、或保持的物質(以下，稱為「製劑用之物質」)。就製劑用之物質而言，若為藥理學上可容許的物質，則不特別限定。例如，為非毒性或低毒性，係製劑用之物質較佳地具備的性質。

作為製劑用之物質，可舉出例如以下之物，但並不限定於此等；甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸等之胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等之抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、Tri-鹽酸(Tris-Hcl)溶液等之緩衝劑、甘露醇或甘胺酸等之填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等之螫合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精等之錯化劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等之增量劑、單醣類、雙醣類或葡萄糖、甘露糖或糊精等之其他碳水化合物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等之親水聚合物、低分子量多肽、鹽形成對離子、氯化苄烷銨、安息香酸、水楊酸、乙汞硫柳酸鈉、苯乙醇、對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸甲丙酯、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等之防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等之溶劑、甘露醇或山梨醇等之糖醇、懸浮劑、PEG、山梨醇酐酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯、曲拉通(triton)、胺基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等之界面活性劑、蔗糖或山梨醇等之穩定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀、甘露醇或山梨醇等之彈性增強劑、輸送劑、稀釋劑、賦形劑、及/或藥學上的輔助劑。

此等之製劑用之物質的添加量，係相對於抗CD3抗體等之重量為0.001至1000倍，較佳為0.01至100倍，更較佳為0.1至10倍。

含有使微脂體中含有抗CD3抗體等而成之免疫微脂體、抗體與微脂體結合而成之抗體修飾體(美國專利第6214388號等)的醫藥組成物，亦包含在本發明之醫藥組成物中。

賦形劑和擔體通常為液體或固體，若為注射用的水、生理食鹽水、人工腦脊隨液、其他經口投予或非經口投予用之製劑中使用的物質，則不特別限定。就生理食鹽水而言，可舉出中性者、包含血清白蛋白者等。

就緩衝劑而言，可例示：以醫藥組成物之最終pH成為7.0至8.5之方式所調製的Tris緩衝液；同樣地以成為4.0至5.5之方式所調製的乙酸緩衝液；同樣地以成為5.0至8.0之方式所調製的檸檬酸緩衝液；同樣地以成為5.0至8.0之方式所調製的組胺酸緩衝液等。

本發明之醫藥組成物為固體、液體、懸浮液等。可舉出冷凍乾燥製劑。為了將冷凍乾燥製劑成型，可使用蔗糖等之賦形劑。

就本發明之醫藥組成物的投予路徑而言，可為經腸投予、局部投予及非經口投予之任一者，如依對象之疾病來選擇較佳的投予路徑即可。具體而言，可舉出靜脈內投予、動脈內投予、肌肉內投予、皮內投予、皮下投予、腹腔內投予、經皮投予、骨內投予、關節內投予等。

該醫藥組成物之組成，可因應投予方法、抗體之CD3蛋白質結合親和性等來決定。

抗CD3抗體等之投予量，可因應個體物種、疾病種類、症狀、性別、年齡、宿疾、該抗體之CD3蛋白質結合親和性或其生物活性、其他的要素而適當決定，但通常可將0.01至1000mg/kg、較佳為將0.1至100mg/kg於1至180天投予1次、或1天投予2次或3次以上。就醫藥組成物之形態而言，可例示注射劑(包含冷凍乾燥製劑、點滴劑)、栓劑、經鼻型吸收製劑、經皮型吸收製劑、舌下劑、膠囊、錠劑、軟膏劑、顆粒劑、氣霧劑、丸劑、散劑、懸浮劑、乳劑、點眼劑、活體植入型製劑等。

抗CD3抗體等可與其他藥劑組合而使用。抗CD3抗體等、或包含其作為有效成分的醫藥組成物，可與其他藥劑同時或者是各別投予，該其他藥劑即包含抗CD3抗體等以外的藥劑作為有效成分的醫藥組成物。例如，可於投予其他藥劑之後投予包含抗CD3抗體等作為有效成分的醫藥組成物、或於投予包含抗CD3抗體等作為有效成分的醫藥組成物之後投予其他藥劑、或是將包含抗CD3抗體等作為有效成分的醫藥組成物與其他藥劑同時投予。於單一之醫藥組成物中包含抗CD3抗體等及其他藥劑之雙方的有效成分之情形、與兩有效成分被分開包含在複數個醫藥組成物之情形中任一者，皆於本發明中稱為「包含抗CD3抗體等及其他藥劑的醫藥組成物」。於本發明中，該「醫藥組成物」係與「將抗CD3抗體等與其他藥劑組合而投予之醫藥組成物」同義。

於本發明中，將抗CD3抗體等與其他藥劑「組合而投予」意指於某期間中，抗CD3抗體等與其他藥劑被攝入至被投予對象的體內。可投予抗CD3抗體等與其他藥劑被包含在單一製劑中的製劑，還可各自被分別製劑化且分別進行投予。被分別製劑化之情形、其投予的時期並不特別限定，可同時進行投予，亦可隔開時間而在不同時間、或在不同天進行投予。抗CD3抗體等與其他藥劑在各自不同時間或天進行投予之情形，其投予的順序並不特別限定。通常，各自之製劑按照各自之投予方法而進行投予，因此彼等的投予有為相同次數之情形，亦有為不同次數之情形。又，各自被分別製劑化之情形，各製劑的投予方法(投予路徑)可相同，亦可以不同的投予方法(投予路徑)進行投予。又，抗CD3抗體等與其他藥劑並無同時存在於體內之必要，如在某一定期間(例如一個月，較佳為1週，進一步較佳為數日，進一步更佳為1天)之中被攝入至體內即可，在任一者的投予時，另一方的有效成分亦可從體內消失。

就「將抗CD3抗體等與其他藥劑組合而投予之醫藥組成物」的投予形態而言，可舉出例如：1)包含抗CD3抗體等與其他藥劑的單一之製劑的投予；2)將抗CD3抗體等與其他藥劑分別製劑化而得之2種製劑之以相同投予路徑的同時投予；3)將抗CD3抗體等與其他藥劑分別製劑化而得之2種製劑之以相同投予路徑隔開時間差的投予；4)將抗CD3抗體等與其他藥劑分別製劑化而得之2種製劑之以不同的投予路徑的同時投予；5)將抗CD3抗體等與其他藥劑分別製劑化而得之2種製劑之以不同的投予路徑隔開時間差的投予等。「將抗CD3抗體等與其他藥劑組合而投予之醫藥組成物」之投予量、投予間隔、投予形態、製劑等係按照含有抗CD3抗體的醫藥組成物之彼等，但不限定於彼等。

該醫藥組成物，在其被作成2種不同的製劑之情形，可為包含彼等之套組。

於本發明中，抗CD3抗體等及其他藥劑之「組合」意指將抗CD抗體等及其他藥劑「組合而投予」。

本發明之組合或醫藥組成物中，可進一步使用其他醫藥。

本發明亦提供有關CD3之疾病的治療方法或預防方法、本發明之抗體用以調製該疾病的治療用或預防用醫藥組成物之用途、本發明之抗體用以治療或預防該疾病之用途。包含本發明之抗體的治療用或預防用套組亦包含在本發明中。 [實施例]

藉由以下實施例而具體地說明本發明，但本發明不因此等之實施例而受到限定。

(參考例1)C3E-7085之溶液穩定性評價使用國際公開第2018/117237號中記載的C3E-7085純化蛋白質(為具有國際公開第2018/117237號之序列表的序列識別號64、圖72所示胺基酸序列的scFv。)，評價溶液穩定性。C3E-7085係以Amicon Ultra-4(Millipore公司)進行離心濃縮，進行緩衝液交換為25mM乙酸鈉、5%山梨醇、pH5.5後，將濃度調製為10mg/mL，在4℃保存2週或在40℃保存2週。保存後的試樣，係進行使用了TSK凝膠UP-SW3000 2μm 4.6X 300mm的粒徑篩析層析法(SEC)。移動相係使用3XPBS，以流速0.2mL/min進行分析(檢出波長280nm)。將各試樣中所含的HMWS(%)進行波峰解析，利用面積百分率法來算出，將結果記載於表1。

[表1]

C3E-7085保存條件	HMWS(%)
40℃、2週	24
40℃、2週	22

C3E-7085在4℃、40℃都保存2週後，尤其是HMWS中的二聚體波峰增加至20%(數據不表示)。又，所形成的二聚體由於具有因稀釋而返回單體之可逆的性質(數據不表示)，因此認為產生包含二聚體之HMWS為在溶液穩定性之課題。

(實施例1)抗CD3抗體片段-異二聚體Fc型分子之溶液穩定性評價 2)-1　抗CD3抗體片段之胺基酸序列的設計設計C3E-7085-Fab(序列識別號1、圖5)及C3E-7085-LC(序列識別號2、圖6)，作為以C3E-7085之溶液穩定性中之物性改善為目標而變更了型式之C3E-7085 Fab型式的胺基酸序列。又，參考文獻(Proteins, 1994, May;19(1):35-47)而設計經加入雙硫(disulfide)導入鍵結而成的scFv，命名為C3E-7096(序列識別號3、圖7)。

2)-2　抗CD3抗體片段-異二聚體Fc表現載體的製作設計以pcDNA3.1、pcDNA3.3或者是pcDNA3.4 (Thermo Fisher Scientific公司)為骨架之各種抗CD3抗體片段-異二聚體Fc表現用載體。抗CD3抗體片段係使用C3E-7085(WO2018/117237)及2)-1中設計的抗CD3抗體片段。異二聚體Fc序列(以下記載為HC-h及HC-k)，係使用文獻(Nat Biotechnol.1998Jul;16(7)677-81.)所報告之物。

製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-HC-h」，該胺基酸序列為由經導入使異多聚體形成之變異的Fc(HC-h)構成之多肽所包含的胺基酸序列

製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-C3E-7085-HC-k」，該胺基酸序列為對C3E-7085之羧基末端附加經導入使異多聚體形成之變異的Fc區而成之多肽所包含的胺基酸序列。

製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-C3E-7085-Fab-HC-k」，該胺基酸序列為依C3E-7085的重鏈可變區、及源自人類IgG的CH1區、經導入使異多聚體形成之變異的Fc區的順序附加而成之多肽所包含的胺基酸序列。又製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-C3E-7085-LC」，該胺基酸序列為源自人類IgLabmda的CL區附加於C3E-7085輕鏈可變區之羧基末端而成之多肽所包含的胺基酸序列。

製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-C3E-7096-HC-k」，該胺基酸序列為對C3E-7096之羧基末端附加經導入使異多聚體形成之變異的Fc區而成之多肽所包含的胺基酸序列。

p-HC-h的核苷酸序列係進行再解析，且HC-h全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號4(圖8)所示核苷酸序列。

p-C3E-7085-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且C3E-7085-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號5(圖9)所示核苷酸序列。

p-C3E-7085-Fab-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且C3E-7085-Fab-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號6(圖10)所示核苷酸序列。

p-C3E-7085-LC的核苷酸序列係進行再解析，且C3E-7085-LC全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號7(圖11)所示核苷酸序列。

p-C3E-7096-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且C3E-7096-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號8(圖12)所示核苷酸序列。

又，由上述核苷酸序列確認了該序列所編碼之HC-h、C3E-7085-HC-k、C3E-7085-Fab-HC-k、C3E-7085-LC、C3E-7096-HC-k全長的胺基酸序列。

HC-h全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號9(圖13)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個之胺基酸序列為訊息序列，第20個至第246個之胺基酸序列為HC-h。

C3E-7085-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號10(圖14)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個之胺基酸序列為訊息序列，第21個至第260個之胺基酸序列為C3E-7085，第261個至第262個之胺基酸序列為連接子，第263個至第494個之胺基酸序列為HC-k。

C3E-7085-Fab-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號11(圖15)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個之胺基酸序列為訊息序列，第20個至第137個之胺基酸序列為C3E-7085-重鏈可變區。又，第138個至第467個之胺基酸序列為恆定區。

C3E-7085-LC全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號12(圖16)所示胺基酸序列。第1個至第20個之胺基酸序列為訊息序列，第21個至第127個之胺基酸序列為可變區，第128個至第233個之胺基酸序列為恆定區。

C3E-7096-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號13(圖17)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個之胺基酸序列為訊息序列，第21個至第260個之胺基酸序列為C3E-7096，第261個至第262個之胺基酸序列為連接子，第263個至第494個之胺基酸序列為HC-k。

2)-3　抗CD3抗體片段-異二聚體Fc之表現 Expi293F細胞(Thermo Fisher Scientific公司)係按照手冊進行繼代、培養。將處於對數增殖期之Expi293F細胞培養液以Expi293表現培養基(Thermo Fisher Scientific公司)稀釋，使其成為2.5×10 ⁶個細胞/mL，用於各種抗CD3抗體片段-異二聚體Fc的生產。進行300mL培養之情形，係將1.44mg之聚乙烯亞胺(polyethylenimine)(Polyscience #24765)溶解於5mL之Opti-Pro SFM(Thermo Fisher Scientific公司)，接著將0.3mg之將使用NucleoBond Xtra Midi套組(TAKARA BIO公司)調製的載體p-C3E-7085-HC-k、p-HC-h混合而成的載體混合物，添加於5mL之Opti-Pro SFM(Invitrogen公司)。將5mL之表現載體/Opti-Pro SFM混合液加入5mL之聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合液而溫和地攪拌，於進一步放置5分鐘之後添加至Expi293F細胞。將在37℃、8%CO ₂培養箱以135rpm振動培養6天所得之培養上清液以0.2μm過濾器(Thermo Fisher Scientific公司)過濾，得到抗CD3抗體片段-異二聚體Fc(C3E-0002)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及10(圖14)呈示使構成C3E-0002之各載體表現而得之胺基酸的序列。

以同樣的手法，使用p-C3E-7085-Fab-HC-k、p-HC-h及p-C3E-7085-LC，表現、調製抗CD3抗體片段-異二聚體Fc(C3E-0003)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及11(圖15)及12(圖16)呈示使構成C3E-0003之各載體表現而得之胺基酸的序列。

以同樣的手法，使用p-C3E-7096-HC-k、p-HC-h，表現、調製抗CD3抗體片段-異二聚體Fc(C3E-0004)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及13(圖17)呈示使構成C3E-0004之各載體表現而得之胺基酸的序列。

2)-4　抗CD3抗體片段-異二聚體Fc之純化以ProteinA親和層析法與凝膠過濾層析法的2階段步驟，由2)-3中所得之培養上清液純化抗CD3抗體片段-異二聚體Fc。

對經PBS pH7.4平衡化之MabSelectSuRe管柱(Cytiva公司)供予培養上清液，使目標之抗CD3抗體片段-異二聚體Fc吸附。以PBS將非吸附成分去除之後，以乙酸緩衝液pH3.5將吸附成分溶出。溶出餾分係以Tris緩衝液pH9.5將pH調製為中性之後，進行濃縮，供予預先經25mM組胺酸、300mM　NaCl、5%山梨醇、pH5.5平衡化之凝膠過濾管柱Superdex 200 10/300(Cytiva公司)。由凝膠過濾層析法中所得之波峰餾分回收相當於目標之異二聚體的餾分，藉由毛細管電泳(LabChip GX Touch，PerkinElmer公司)而確認了有目標之抗CD3抗體片段-異二聚體Fc形成。純化蛋白質試樣係供予分析用SEC，決定純度與濃度之後，用於評價。

2)-5　抗CD3抗體片段-異二聚體Fc之溶液穩定性評價 2)-4中純化的各試樣係以Amicon Ultra-4(Millipore公司)進行離心濃縮，進行緩衝液交換為PBS後，添加PBS，將試樣濃度調製為20mg/mL，作為評價用試樣。又，各評價用試樣開始時之HMWS(%)，係使用使用了AdvanceBio SEC 300A 2.7μm 4.6×150mm(Agilent公司)的粒徑篩析層析法，利用面積百分率法來算出。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2mL/min進行分析(檢出波長280nm)。各試樣之加速劣化試驗，係在40℃保存1天、7天、14天後，以與上述相同條件實施粒徑篩析層析法，以面積百分率法算出各試樣之HMWS(%)。

將顯示各試樣在40℃保存之際的經時變化之結果呈示於圖1。C3E-0003之14天保存後的HMWS(%)為3%，相較於為15%的C3E-0002，因保存時間經過所致增加顯著地少。C3E-0004之14天保存後的HMWS(%)為13%，相較於C3E-0003雖然增加，但相較於C3E-0002顯示減少傾向。

由以上之結果顯示：相較於使用了C3E-7085之異二聚體Fc型分子，使用了C3E-7085 Fab型式之異二聚體Fc型及使用了C3E-7096之異二聚體Fc型分子係溶液穩定性優良。

(實施例2)抗CD3抗體片段-異二聚體Fc之振動穩定性評價將2)-4中純化的各試樣以Amicon　Ultra-4(Millipore公司)離心濃縮後，調製為2mg/mL，作為評價用試樣。又，各評價用試樣開始時之波峰面積及HMWS(%)，係使用使用了AdvanceBio SEC 300A 2.7μm 4.6×150mm(Agilent公司)的粒徑篩析層析法，利用面積百分率法來算出。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2mL/min進行分析(檢出波長280nm)。振動劣化試驗係使用通用高速攪拌機(Waken製)，於室溫以2500rpm使各試樣經時性地振動1小時、2小時之後，以與上述相同條件實施粒徑篩析層析法，算出各試樣之波峰面積及HMWS(%)。

於圖2A及圖2B呈示各試樣振動後之波峰面積及HMWS(%)。C3E-0002係在振動後1小時的階段顯著地HMWS(%)增加，在振動後2小時處理檢體則波峰面積的99%消失。C3E-0003係相較於C3E-0002，因振動時間經過所致波峰面積的減少及HMWS(%)的增加顯著地少。C3E-0004係相較於C3E-0002，在振動1小時處理檢體的HMWS(%)低，振動2小時處理檢體之波峰面積亦停留在74%消失。此外，在振動前後，於粒徑篩析層析法為了確認無法檢出之尺寸的粒子形成之有無，而使用振動前及振動2小時處理的檢體，以FlowCAM8100(DKSH Japan製)來評價粒子數，從在振動前後之粒子數增加，推測因振動劣化而各檢體從單體經由HMWS而形成粒子。是以，可說HMWS(%)的增加率低者、還有波峰面積的減少率低者係對於振動劣化而穩定性高。

由以上之結果來看，相較於使用了C3E-7085之異二聚體Fc型分子，使用了C3E-7085 Fab型式之異二聚體Fc型及使用了C3E-7096之異二聚體Fc型分子係振動穩定性優異。

(實施例3)taFv-異二聚體Fc型及scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子的製作 4)-1　taFv-異二聚體Fc型雙重特異性分子表現用載體的製作設計以pcDNA3.1、pcDNA3.3或者是pcDNA3.4 (Thermo Fisher Scientific公司)為骨架之taFv-異二聚體Fc型雙重特異性分子表現用載體。抗CD3抗體片段使用了C3E-7085(WO2018/117237)、或者是C3E-7096。異二聚體Fc序列(以下記載為HC-h及HC-k)，係使用(Nat Biotechnol.1998Jul;16(7)677-81.)所報告之物。

作為抗Trop2-CD3雙重特異性分子表現用載體，製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-TX3-0001-HC-k」，該胺基酸序列為對以GGGGS連接子連接國際公開第2018/117237號中記載的HT1-11scFv與C3E-7085而成的taFv之羧基末端附加經導入使異多聚體形成之變異的Fc區而成之多肽所包含的胺基酸序列。又，製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-TX3-0003-HC-k」，該胺基酸序列為對以GGGGS連接子連接HT1-11scFv與C3E-7096而成的taFv之羧基末端附加經導入使異多聚體形成之變異的Fc區而成之多肽所包含的胺基酸序列。

作為抗CD98-CD3雙重特異性分子表現用載體，製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-CX3-0001-HC-k」，該胺基酸序列為對以GGGGS連接子連接日本特開2017-114763號中記載的抗CD98scFv與C3E-7085而成的taFv之羧基末端附加經導入使異多聚體形成之變異的Fc區而成之多肽所包含的胺基酸序列，該抗CD98scFv(以下記載為hM23-H1L1scFv)係將於hM23-H1重鏈可變區的N末端加上甘胺酸之序列與hM23-L1輕鏈可變區透過由3次重複(GGGGS)的序列構成之多肽連接子來連結。又，製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-CX3-0003-HC-k」，該胺基酸序列為對以GGGGS連接子連接hM23-H1L1 scFv與C3E-7096而成的taFv之羧基末端附加經導入使異多聚體形成之變異的Fc區而成之多肽所包含的胺基酸序列。

作為抗GPRC5D-CD3雙重特異性分子表現用載體，製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-RX3-0001-HC-k」，該胺基酸序列為對以GGGGS連接子連接國際公開第2018/147245號中記載的C3022scFv與C3E-7085而成的taFv之羧基末端附加經導入使異多聚體形成之變異的Fc區而成之多肽所包含的胺基酸序列。又，製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-RX3-0003-HC-k」，該胺基酸序列為對以GGGGS連接子連接C3022scFv與C3E-7096而成的taFv之羧基末端附加經導入使異多聚體形成之變異的Fc區而成之多肽所包含的胺基酸序列。

p-TX3-0001-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且TX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號14(圖18)所示核苷酸序列。

p-TX3-0003-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且TX3-0003-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號15(圖19)所示核苷酸序列。

p-CX3-0001-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且CX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號16(圖20)所示核苷酸序列。

p-CX3-0003-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且CX3-0003-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號17(圖21)所示核苷酸序列。

p-RX3-0001-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且RX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號18(圖22)所示核苷酸序列。

p-RX3-0003-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且RX3-0003-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號19(圖23)所示核苷酸序列。

又，由上述核苷酸序列確認了該序列所編碼之TX3-0001-HC-k、TX3-0003-HC-k、CX3-0001-HC-k、CX3-0003-HC-k、RX3-0001-HC-k、RX3-0003-HC-k全長的胺基酸序列。

TX3-0001-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號20(圖24)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個之胺基酸序列為訊息序列，第21個至第510個之胺基酸序列為以GGGGS連接子連接HT1-11scFv與C3E-7085而成的taFv，第511個至第512個之胺基酸序列為連接子，第513個至第744個之胺基酸序列為HC-k。

TX3-0003-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號21(圖25)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個之胺基酸序列為訊息序列，第21個至第510個之胺基酸序列為以GGGGS連接子連接HT1-11scFv與C3E-7096而成的taFv，第511個至第512個之胺基酸序列為連接子，第513個至第744個之胺基酸序列為HC-k。

CX3-0001-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號22(圖26)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個的胺基酸序列為訊息序列，第21個至第509個的胺基酸序列為以GGGGS連接子連接hM23-H1L1scFv與C3E-7085而成的taFv，第510個至第511個的胺基酸序列為連接子，第512個至第743個的胺基酸序列為HC-k。

CX3-0003-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號23(圖27)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個的胺基酸序列為訊息序列，第21個至第509個的胺基酸序列為以GGGGS連接子連接hM23-H1L1scFv與C3E-7096而成的taFv，第510個至第511個的胺基酸序列為連接子、第512個至第743個的胺基酸序列為HC-k。

RX3-0001-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號24(圖28)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個的胺基酸序列為訊息序列，第21個至第505個的胺基酸序列為以GGGGS連接子連接C3022scFv與C3E-7085而成的taFv，第506個至第507個的胺基酸序列為連接子，第508個至第739個的胺基酸序列為HC-k。

RX3-0003-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號25(圖29)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個的胺基酸序列為訊息序列，第21個至第505個的胺基酸序列為以GGGGS連接子連接C3022scFv與C3E-7096而成的taFv，第506個至第507個的胺基酸序列為連接子，第508個至第739個的胺基酸序列為HC-k。

4)-2　taFv-異二聚體Fc型雙重特異性分子之表現以與2)-3同樣的手法，使用p-TX3-0001-HC-k、p-HC-h，表現、調製抗Trop2-CD3taFv-異二聚體Fc(TX3-0001)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及20(圖24)呈示使構成TX3-0001之各載體表現而得之胺基酸的序列。

以同樣的手法，使用p-TX3-0003-HC-k、p-HC-h，表現、調製抗Trop2-CD3taFv-異二聚體Fc(TX3-0003)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及21(圖25)呈示使構成TX3-0003之各載體表現而得之胺基酸的序列。

以同樣的手法，使用p-CX3-0001-HC-k、p-HC-h，表現、調製抗CD98-CD3taFv-異二聚體Fc(CX3-0001)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及22(圖26)呈示使構成CX3-0001之各載體表現而得之胺基酸的序列。

以同樣的手法，使用p-CX3-0003-HC-k、p-HC-h，表現、調製抗CD98-CD3taFv-異二聚體Fc(CX3-0003)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及23(圖27)呈示使構成CX3-0003之各載體表現而得之胺基酸的序列。

以同樣的手法，使用p-RX3-0001-HC-k、p-HC-h，表現、調製抗GPRC5D-CD3taFv-異二聚體Fc(RX3-0001)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及24(圖28)呈示使構成RX3-0001之各載體表現而得之胺基酸的序列。

以同樣的手法，使用p-RX3-0003-HC-k、p-HC-h，表現、調製抗CD98-CD3taFv-異二聚體Fc(RX3-0003)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及25(圖29)呈示使構成RX3-0003之各載體表現而得之胺基酸的序列。

4)-3　taFv-異二聚體Fc型雙重特異性分子之純化 4)-2中所得之各培養上清液係以與2)-4同樣的手法進行純化。純化蛋白質試樣係供予分析用SEC，決定純度與濃度之後，用於各種評價。

4)-4　scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子表現用載體的製作設計以pcDNA3.1、pcDNA3.3或者是pcDNA3.4 (Thermo Fisher Scientific公司)為骨架之scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子表現用載體。抗CD3抗體片段係將C3E-7085(WO2018/117237)變更為Fab型式並使用。異二聚體Fc序列(以下記載為HC-h及HC-k)，係使用(Nat Biotechnol.1998Jul;16(7)677-81.)所報告之物。

作為抗Trop2-CD3雙重特異性分子表現用載體，製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-TX3-0002-HC-k」，該胺基酸序列為依HT1-11scFv、C3E-7085的重鏈可變區、源自人類IgG的CH1區、經導入使異多聚體形成之變異的Fc區的順序附加而成之多肽所包含的胺基酸序列。

作為抗CD98-CD3雙重特異性分子表現用載體，製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-CX3-0002-HC-k」，該胺基酸序列為依hM23-H1L1scFv、C3E-7085的重鏈可變區、源自人類IgG的CH1區、經導入使異多聚體形成之變異的Fc區的順序附加而成之多肽所包含的胺基酸序列。

作為抗GPRC5D-CD3雙重特異性分子表現用載體，製作經併入有編碼下述胺基酸序列之DNA片段的哺乳動物細胞用表現載體，命名為「p-RX3-0002-HC-k」，該胺基酸序列為依C3022scFv、C3E-7085的重鏈可變區、源自人類IgG的CH1區、經導入使異多聚體形成之變異的Fc區的順序附加而成之多肽所包含的胺基酸序列。

p-TX3-0002-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且TX3-0002-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號26(圖30)所示核苷酸序列。

p-CX3-0002-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且CX3-0002-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號27(圖31)所示核苷酸序列。

p-RX3-0002-HC-k的核苷酸序列係進行再解析，且RX3-0002-HC-k全長的核苷酸序列經確認為序列表之序列識別號28(圖32)所示核苷酸序列。

又，由上述核苷酸序列確認了該序列所編碼之TX3-0002-HC-k、CX3-0002-HC-k、RX3-0002-HC-k全長的胺基酸序列。

TX3-0002-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號29(圖33)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個的胺基酸序列為訊息序列，第21個至第265個的胺基酸序列為HT1-11scFv，第266個至第270個的胺基酸序列為連接子，第271個至第388個的胺基酸序列為C3E-7085-重鏈可變區。又，第389個至第718個的胺基酸序列為恆定區。

CX3-0002-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號30(圖34)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個的胺基酸序列為訊息序列，第21個至第264個的胺基酸序列為hM23-H1L1scFv，第265個至第269個的胺基酸序列為連接子，第270個至第387個的胺基酸序列為C3E-7085-重鏈可變區。又，第388個至第717個的胺基酸序列為恆定區。

RX3-0002-HC-k全長的胺基酸序列為序列表之序列識別號31(圖35)所示胺基酸序列。在該序列中，第1個至第19個的胺基酸序列為訊息序列，第21個至第260個的胺基酸序列為C3022scFv，第261個至第265個的胺基酸序列為連接子，第266個至第383個的胺基酸序列為C3E-7085-重鏈可變區。又，第384個至第713個的胺基酸序列為恆定區。

4)-5　scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子之表現以與2)-3同樣的手法，使用p-TX3-0002-HC-k、p-HC-h及p-C3E-7085-LC，表現、調製抗Trop2scFv-CD3Fab-異二聚體Fc(TX3-0002)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及12(圖16)及29(圖33)呈示使構成TX3-0002之各載體表現而得之胺基酸的序列。

以同樣的手法，使用p-CX3-0002-HC-k、p-HC-h及p-C3E-7085-LC，表現、調製抗CD98scFv-CD3Fab-異二聚體Fc(TX3-0002)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及12(圖16)及30(圖34)呈示使構成CX3-0002之各載體表現而得之胺基酸的序列。

以同樣的手法，使用p-RX3-0002-HC-k、p-HC-h及p-C3E-7085-LC，表現、調製抗GPRC5DscFv-CD3Fab-異二聚體Fc(RX3-0002)之培養上清液。於序列表之序列識別號9(圖13)及12(圖16)及31(圖35)呈示使構成RX3-0002之各載體表現而得之胺基酸的序列。

4)-6　scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子之純化 4)-5中所得之各培養上清液係以與2)-4同樣的手法進行純化。純化蛋白質試樣係供予分析用SEC，決定純度與濃度之後，用於各種評價。

(實施例4)taFv-異二聚體Fc型及scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子之溶液穩定性評價使用實施例3中所調製的各試樣，以Amicon Ultra-4(Millipore公司)進行離心濃縮，進行緩衝液交換為PBS後，添加PBS，將試樣濃度調製為20mg/mL，作為評價用試樣。又，各評價用試樣開始時之HMWS(%)，係使用使用了AdvanceBio SEC 300A 2.7μm 4.6×150mm (Agilent公司)的粒徑篩析層析法，利用面積百分率法來算出。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2mL/min進行分析(檢出波長280nm)。各試樣之加速劣化試驗，係在40℃保存1天、7天、14天後，以與上述相同條件實施粒徑篩析層析法，以面積百分率法算出各試樣之HMWS(%)。

將顯示各試樣在40℃保存之際的經時變化之結果呈示於圖3A～C。 RX3-0001之因保存時間經過所致HMWS(%)量增加至13%。然而，RX3-0002及RX3-0003之因保存時間經過所致HMWS(%)量係各自減少為6%、8%(圖3A)。

TX3-0001之因保存時間經過所致HMWS(%)量增加至23%。然而，TX3-0002及TX3-0003之因保存時間經過所致HMWS(%)量係各自減少為10%、11%(圖3B)。

CX3-0001之因保存時間經過所致HMWS(%)量係反映hM23-H1L1 scFv之溶液穩定性的影響，增加至46%。然而，CX3-0002之因保存時間經過所致HMWS(%)量減少為28%，CX3-0003之HMWS(%)量為43%，相較於CX3-0001顯示微減傾向(圖3C)。

由以上之結果顯示：相較於使用了C3E-7085之taFv-異二聚體Fc型分子，使用了C3E-7085 Fab型式之scFv-Fab-異二聚體Fc型及使用了C3E-7096之taFv-異二聚體Fc型分子係溶液穩定性優良。

(實施例5)taFv-異二聚體Fc型及scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子之振動穩定性評價實施例3中純化的試樣之中，將RX3-0001～0003、CX3-0001～0003及TX3-0001～0003以Amicon　Ultra-4(Millipore公司)離心濃縮後，調製為2mg/mL，作為評價用試樣。又，各評價用試樣開始時之波峰面積及HMWS(%)，係使用使用了AdvanceBio SEC 300A 2.7μm 4.6×150mm(Agilent公司)的粒徑篩析層析法，利用面積百分率法來算出。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2mL/min進行分析(檢出波長280nm)。振動劣化試驗係使用通用高速攪拌機(Waken製)，於室溫以2500rpm使各試樣經時性地振動1小時、2小時之後，以與上述相同條件實施粒徑篩析層析法，算出各試樣之波峰面積及HMWS(%)。

於圖4-1A及B、圖4-2A及B以及圖4-3A及B呈示各試樣振動後之波峰面積及HMWS(%)。RX3-0001係振動2小時處理檢體之波峰面積的殘存率為2%。相對於此，RX3-0002及RX3-0003之波峰面積的殘存率係各自為15%、17%，與RX3-0001比較，為良好的結果。再者，RX3-0001的振動2小時處理檢體之HMWS(%)為30%，但RX3-0002及RX3-0003的振動2小時處理檢體之HMWS(%)皆為5%以下，與RX3-0001相比較，結果RX3-0002及RX3-0003之HMWS(%)較少。

CX3-0001係振動2小時處理檢體之波峰面積的殘存率為6%。相對於此，CX3-0002、CX3-0003之波峰面積的殘存率係各自為11%、26%，與CX3-0001比較，為良好的結果。再者，CX3-0001、CX3-0002、CX3-0003的振動2小時處理檢體之HMWS(%)各自為54%、17%、41%，與CX3-0001相比較，結果CX3-0002及CX3-0003之HMWS(%)較少。

TX3-0001係振動2小時處理檢體之波峰面積的殘存率為22%。又，TX3-0002、TX3-0003係振動2小時處理檢體之波峰面積的殘存率各自為81%、41%，與TX3-0001比較，而關於波峰面積的殘存率得到良好的結果。然而，關於TX3-0001、TX3-0002、TX3-0003的振動2小時處理檢體之HMWS(%)，係各自為7%、21%、13%，TX3-0001之HMWS(%)最少，與其他抗體群組(RX3、CX3)顯示不同的傾向。

於是，對於TX3-0001～0003，於粒徑篩析層析法為了確認無法檢出之大尺寸的粒子形成之有無，而使用振動前及振動後2小時處理的檢體，以FlowCAM8100(DKSH Japan製)來評價粒子數。於表2呈示各試樣之粒子數的經時變化。

[表2]

	TX3-0001	TX3-0002	TX3-0003
初始	63	66	332
1 小時	171340	7107	78992
2 小時	1272905	55243	562921

(個粒子/mL)

TX3-0001係振動2小時處理檢體的粒子數為1272905個/mL。TX3-0002、TX3-0003係振動2小時處理檢體的粒子數各自為55243個/mL、562921個/mL，與TX3-0001比較，顯示因凝集所致微粒子數形成較少。相對於作為HMWS所檢出的凝集體係直徑10～100nm左右，以FlowCAM則會檢出1μm以上之大的多聚體。由於TX3-0001的粒子數與TX3-0002、0003比較而明顯較大，因此推測TX3-0001之HMWS(%)低是因為相當於HMWS的凝集體締合且進一步形成大的多聚體。由以上顯示TX3-0002、TX3-0003係振動穩定性比TX3-0001良好。

由以上之結果來看，相較於使用了C3E-7085之taFv-異二聚體Fc型分子，使用了C3E-7085 Fab型式之scFv-Fab-異二聚體Fc型及使用了C3E-7096之taFv-異二聚體Fc型分子係振動穩定性優異。又，可於上述實施例中，將抗CD3scFv由C3E-7096替換為C3E-7097(具有序列識別號39、圖46所示胺基酸序列。)，而實施試樣調製、試驗及評價等。

(實施例6)抗CD3抗體片段-異二聚體Fc型雙重特異性分子之溶液穩定性評價按照實施例1)-1～2)-4，設計C3E-7093Fab的胺基酸序列(序列識別號46、圖48所示C3E-7093-Fab的胺基酸序列及序列識別號47、圖49所示C3E-7093-LC的胺基酸序列)、及經導入雙硫鍵結的scFv之C3E-7098的胺基酸序列(序列識別號48、圖50所示胺基酸序列)，C3E-7093Fab係以C3E-7093(為具有國際公開第2018/117237號之序列識別號80、圖88所示胺基酸序列的scFv。)之溶液穩定性中之物性改善為目標，而型式經變更為Fab者。接著，製作用以調製包含該Fab及scFv之抗CD3抗體片段-異二聚體Fc型分子的各表現載體，使該兩分子表現，且進行純化。

所得之各試樣係以Amicon Ultra-4 (Millipore公司)進行離心濃縮，進行緩衝液交換為PBS後，添加PBS，將試樣濃度調製為20mg/mL，作為評價用試樣。又，各評價用試樣開始時之HMWS(%)，係使用使用了AdvanceBio SEC 300A 2.7μm 4.6×150mm (Agilent公司)的粒徑篩析層析法，利用面積百分率法來算出。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2mL/min進行分析(檢出波長280nm)。各試樣之加速劣化試驗係在40℃保存1天、7天、14天後，以與上述相同條件實施粒徑篩析層析法，以面積百分率法算出各試樣之HMWS(%)。

藉由比較各試樣在40℃保存之際的經時變化，而顯示：相較於使用了C3E-7093之異二聚體Fc型分子，使用了C3E-7093 Fab型式之異二聚體Fc型及使用了經導入雙硫鍵結的scFv之C3E-7098之異二聚體Fc型分子，係溶液穩定性優良。

(實施例7)抗CD3抗體片段-異二聚體Fc型雙重特異性分子之振動穩定性評價將實施例6中所純化的各試樣以Amicon　Ultra-4(Millipore公司)離心濃縮後，調製為2mg/mL，作為評價用試樣。又，各評價用試樣開始時之波峰面積及HMWS(%)，係使用使用了AdvanceBio SEC 300A 2.7μm 4.6×150mm(Agilent公司)的粒徑篩析層析法，利用面積百分率法來算出。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2mL/min進行分析(檢出波長280nm)。振動劣化試驗係使用通用高速攪拌機(Waken製)，於室溫以2500rpm使各試樣經時性地振動1小時、2小時之後，以與上述相同條件實施粒徑篩析層析法，算出各試樣之波峰面積及HMWS(%)。

藉由比較各試樣振動後之波峰面積及HMWS(%)，而顯示：相較於使用了C3E-7093之異二聚體Fc型分子，使用了C3E-7093 Fab型式之異二聚體Fc型及使用了經導入雙硫鍵結的C3E-7098之異二聚體Fc型分子，係振動穩定性優良。

(實施例8)taFv-異二聚體Fc型及scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子之溶液穩定性評價按照實施例3，而調製包含C3E-7098作為抗CD3scFv之抗Trop2-CD3taFv-異二聚體Fc、抗CD98-CD3taFv-異二聚體Fc及抗GPRC5D-CD3taFv-異二聚體Fc、以及包含C3E-7093　Fab作為抗CD3Fab之抗Trop2scFv-CD3Fab-異二聚體Fc、抗CD98scFv-CD3Fab-異二聚體Fc及抗GPRC5DscFv-CD3Fab-異二聚體Fc。

使用所調製的各試樣，以Amicon　Ultra-4(Millipore公司)進行離心濃縮，進行緩衝液交換為PBS後，添加PBS，將試樣濃度調製為20mg/mL，作為評價用試樣。又，各評價用試樣開始時之HMWS(%)，係使用使用了AdvanceBio SEC 300A 2.7μm 4.6×150mm(Agilent公司)的粒徑篩析層析法，利用面積百分率法來算出。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2mL/min進行分析(檢出波長280nm)。各試樣之加速劣化試驗係在40℃保存1天、7天、14天後，以與上述相同條件實施粒徑篩析層析法，以面積百分率法算出各試樣之HMWS(%)。

藉由比較各試樣在40℃保存之際的經時變化，而顯示：相較於使用了C3E-7093之taFv-異二聚體Fc型分子，使用了C3E-7093 Fab型式之scFv-Fab-異二聚體Fc型及使用了C3E-7098之taFv-異二聚體Fc型分子，係溶液穩定性優良。

(實施例9)taFv-異二聚體Fc型及scFv-Fab-異二聚體Fc型雙重特異性分子之振動穩定性評價將實施例8中所調製的試樣以Amicon Ultra-4(Millipore公司)離心濃縮後，調製為2mg/mL，作為評價用試樣。又，各評價用試樣開始時之波峰面積及HMWS(%)，係使用使用了AdvanceBio SEC 300A 2.7μm 4.6×150mm(Agilent公司)的粒徑篩析層析法，利用面積百分率法來算出。移動相係使用0.2M Ki/200mM KCl/pH7.0，以流速0.2mL/min進行分析(檢出波長280nm)。振動劣化試驗係使用通用高速攪拌機(Waken製)，於室溫以2500rpm使各試樣經時性地振動1小時、2小時之後，以與上述相同條件實施粒徑篩析層析法，算出各試樣之波峰面積及HMWS(%)。

藉由比較各試樣振動後之波峰面積及HMWS(%)，而顯示：相較於使用了C3E-7093之taFv-異二聚體Fc型分子，使用了C3E-7093 Fab型式之scFv-Fab-異二聚體Fc型及使用了C3E-7098之taFv-異二聚體Fc型分子，係振動穩定性優良。

可於實施例6～9中，將抗CD3scFv由C3E-7098替換為C3E-7099(具有序列識別號49、圖51所示胺基酸序列。)，而實施試樣調製、試驗及評價等。 [產業上利用之可能性]

本發明之雙重特異性抗體可利用來作為癌症等之治療劑或預防劑。 [序列表非關鍵詞文字]

序列識別號1：C3E-7085-Fab的胺基酸序列(圖5) 序列識別號2：C3E-7085-LC的胺基酸序列(圖6) 序列識別號3：C3E-7096的胺基酸序列(圖7) 序列識別號4：HC-h全長的核苷酸序列(圖8) 序列識別號5：C3E-7085-HC-k全長的核苷酸序列(圖9) 序列識別號6：C3E-7085-Fab-HC-k全長的核苷酸序列(圖10) 序列識別號7：C3E-7085-LC全長的核苷酸序列(圖11) 序列識別號8：C3E-7096-HC-k全長的核苷酸序列(圖12) 序列識別號9：HC-h全長的胺基酸序列(圖13) 序列識別號10：C3E-7085-HC-k全長的胺基酸序列(圖14) 序列識別號11：C3E-7085-Fab-HC-k全長的胺基酸序列(圖15) 序列識別號12：C3E-7085-LC全長的胺基酸序列(圖16) 序列識別號13：C3E-7096-HC-k全長的胺基酸序列(圖17) 序列識別號14：TX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列(圖18) 序列識別號15：TX3-0003-HC-k全長的核苷酸序列(圖19) 序列識別號16：CX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列(圖20) 序列識別號17：CX3-0003-HC-k全長的核苷酸序列(圖21) 序列識別號18：RX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列(圖22) 序列識別號19：CX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列(圖23) 序列識別號20：TX3-0001-HC-k全長的胺基酸序列(圖24) 序列識別號21：TX3-0003-HC-k全長的胺基酸序列(圖25) 序列識別號22：CX3-0001-HC-k全長的胺基酸序列(圖26) 序列識別號23：CX3-0003-HC-k全長的胺基酸序列(圖27) 序列識別號24：RX3-0001-HC-k全長的胺基酸序列(圖28) 序列識別號25：RX3-0003-HC-k全長的胺基酸序列(圖29) 序列識別號26：TX3-0002-HC-k全長的核苷酸序列(圖30) 序列識別號27：CX3-0002-HC-k全長的核苷酸序列(圖31) 序列識別號28：RX3-0002-HC-k全長的核苷酸序列(圖32) 序列識別號29：TX3-0002-HC-k全長的胺基酸序列(圖33) 序列識別號30：CX3-0002-HC-k全長的胺基酸序列(圖34) 序列識別號31：RX3-0002-HC-k全長的胺基酸序列(圖35) 序列識別號32：C3E-7085重鏈CDRH1胺基酸序列(圖36) 序列識別號33：C3E-7085重鏈CDRH2胺基酸序列(圖36) 序列識別號34：C3E-7085重鏈CDRH3胺基酸序列(圖36) 序列識別號35：C3E-7085輕鏈CDRL1胺基酸序列(圖36) 序列識別號36：C3E-7085輕鏈CDRL2胺基酸序列(圖36) 序列識別號37：C3E-7085輕鏈CDRL3胺基酸序列(圖36) 序列識別號38：肽連接子的胺基酸序列(圖37) 序列識別號39：C3E-7097的胺基酸序列(圖46) 序列識別號40：C3E-7093重鏈CDRH1胺基酸序列(圖47) 序列識別號41：C3E-7093重鏈CDRH2胺基酸序列(圖47) 序列識別號42：C3E-7093重鏈CDRH3胺基酸序列(圖47) 序列識別號43：C3E-7093輕鏈CDRL1胺基酸序列(圖47) 序列識別號44：C3E-7093輕鏈CDRL2胺基酸序列(圖47) 序列識別號45：C3E-7093輕鏈CDRL3胺基酸序列(圖47) 序列識別號46：C3E-7093-Fab的胺基酸序列(圖48) 序列識別號47：C3E-7093-LC的胺基酸序列(圖49) 序列識別號48：C3E-7098的胺基酸序列(圖50) 序列識別號49：C3E-7099的胺基酸序列(圖51) 本說明書中引用的所有刊物、專利及專利申請，係藉由直接引用而編入本說明書中。

無

圖1為呈示C3E-0002～0004之HMWS(%)的經時變化之圖。圖2中，圖2A為呈示C3E-0002～0004之因振動劣化所致HMWS(%)經時變化之圖，圖2B為呈示C3E-0002～0004之因振動劣化所致波峰面積的經時變化之圖。圖3中，圖3A為呈示RX3-0001～0003之HMWS(%)經時變化之圖，圖3B為呈示CX3-0001～0003之HMWS(%)經時變化之圖，圖3C為呈示TX3-0001～0003之HMWS(%)經時變化之圖。圖4-1中，圖4-1A為呈示RX3-0001～0003之因振動劣化所致HMWS(%)經時變化之圖，圖4-1B為呈示RX3-0001～0003之因振動劣化所致波峰面積的經時變化之圖。圖4-2中，圖4-2A為呈示CX3-0001～0003之因振動劣化所致HMWS(%)經時變化之圖，圖4-2B為呈示CX3-0001～0003之因振動劣化所致波峰面積的經時變化之圖。圖4-3中，圖4-3A為呈示TX3-0001～0003之因振動劣化所致HMWS(%)經時變化之圖，圖4-3B為呈示TX3-0001～0003之因振動劣化所致波峰面積的經時變化之圖。圖5為C3E-7085-Fab的胺基酸序列(序列識別號1) 圖6為C3E-7085-LC的胺基酸序列(序列識別號2) 圖7為C3E-7096的胺基酸序列(序列識別號3) 圖8為HC-h全長的核苷酸序列(序列識別號4) 圖9為C3E-7085-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號5) 圖10為C3E-7085-Fab-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號6) 圖11為C3E-7085-LC全長的核苷酸序列(序列識別號7) 圖12為C3E-7096-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號8) 圖13為HC-h全長的胺基酸序列(序列識別號9) 圖14為C3E-7085-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號10) 圖15為C3E-7085-Fab-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號11) 圖16為C3E-7085-LC全長的胺基酸序列(序列識別號12) 圖17為C3E-7096-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號13) 圖18為TX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號14) 圖19為TX3-0003-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號15) 圖20為CX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號16) 圖21為CX3-0003-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號17) 圖22為RX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號18) 圖23為CX3-0001-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號19) 圖24為TX3-0001-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號20) 圖25為TX3-0003-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號21) 圖26為CX3-0001-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號22) 圖27為CX3-0003-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號23) 圖28為RX3-0001-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號24) 圖29為RX3-0003-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號25) 圖30為TX3-0002-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號26) 圖31為CX3-0002-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號27) 圖32為RX3-0002-HC-k全長的核苷酸序列(序列識別號28) 圖33為TX3-0002-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號29) 圖34為CX3-0002-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號30) 圖35為RX3-0002-HC-k全長的胺基酸序列(序列識別號31) 圖36為C3E-7085重鏈之CDRH1～CDRH3、及輕鏈之CDRL1～L3的胺基酸序列(序列識別號32～37) 圖37為肽連接子(linker)的胺基酸序列(序列識別號38) 圖38A為會與CD3結合之重鏈可變區與輕鏈可變區已雙硫鍵結的scFv(VH與VL之間的黑色棒表示二者經雙硫鍵結。以下相同。)。圖38B為會與CD3結合之Fab。圖38C為呈示一種雙重特異性分子之圖，其包含會與CD3結合之重鏈可變區與輕鏈可變區已雙硫鍵結的scFv(右上斜線)、及會與CD3以外結合之X(「其他結合部分」)。以右上斜線所示之scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域(domain)的連結順序交換的相反之物。已雙硫鍵結的scFv亦可VH與VL不透過連接子而構成。圖38D為呈示一種雙重特異性分子之圖，其包含會與CD3結合之Fab、及會與CD3以外結合之X(「其他結合部分」)。圖38E為呈示一種串聯scFv (tandem scFv，taFv)之圖，其係會與CD3結合之scFv、及會與CD3以外結合之scFv透過連接子而結合。各scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域的連結順序交換的相反之物。圖38F為呈示一種scFv-Fab之圖，其係會與CD3結合之Fab、及會與CD3以外結合之scFv透過連接子而結合而成。各scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域的連結順序交換的相反之物。圖39A為呈示一種多重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之scFv、以及會與CD3以外結合之X(「其他結合部分」)及Y(「其他結合部分」或「其他群組」)而成。以右上斜線所示之scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域的連結順序交換的相反之物。X和Y可為scFv、VHH、Fab等之各種抗體片段、完全抗體之任一者。已雙硫鍵結的scFv亦可VH與VL不透過連接子而構成。Y為「其他結合部分」之情形，係成為三重特異性分子。圖39B為呈示一種多重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之Fab、以及會與CD3以外結合之X(「其他結合部分」)及Y(「其他結合部分」或「其他群組」)而成。X和Y(為「其他結合部分」之情形)可為scFv、VHH、Fab等之各種抗體片段、完全抗體、免疫球蛋白以外的分子之任一者。Y為「其他結合部分」之情形，係成為三重特異性分子。圖40A為呈示一種Fc附加型雙重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之重鏈可變區與輕鏈可變區已雙硫鍵結的scFv(右上斜線)、及會與CD3以外結合之X(「其他結合部分」)而成。Fc為以左上斜線所示之第1多肽及以塗黑所示之第2多肽締合的型式(Fc可為野生型、變異型之任一者)。以右上斜線所示之scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域的連結順序交換的相反之物。此外，各圖中之X及scFv亦可交換位置。圖40B為呈示一種Fc附加型雙重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之重鏈可變區與輕鏈可變區已雙硫鍵結的scFv(右上斜線)、及會與CD3以外結合之Fab或scFv而成。Fc為以左上斜線所示之第1多肽及以塗黑所示之第2多肽締合的型式(Fc可為野生型、變異型之任一者)。各scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域的連結順序交換的相反之物。左下圖亦為呈示taFv-異二聚體Fc型之圖(Fc為異二聚體之情形)。圖41A為呈示一種Fc附加型多重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之重鏈可變區與輕鏈可變區已雙硫鍵結的scFv(右上斜線)、以及會與CD3以外結合之X(「其他結合部分」)及Y(「其他結合部分」或「其他群組」)而成。Fc為以左上斜線所示之第1多肽及以塗黑所示之第2多肽締合的型式(Fc可為野生型、變異型之任一者)。以右上斜線所示之scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域的連結順序交換的相反之物。Y為「其他結合部分」之情形，係成為三重特異性分子。此外，各圖中之X、Y及scFv亦可交換位置。圖41B為呈示一種Fc附加型三重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之重鏈可變區與輕鏈可變區已雙硫鍵結的scFv(右上斜線)、及會與CD3以外結合之2個抗體片段(Fab或scFv)而成。Fc為以左上斜線所示之第1多肽及以塗黑所示之第2多肽締合的型式(Fc可為野生型、變異型之任一者)。各scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域的連結順序交換的相反之物。圖42為呈示一種Fc附加型多重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之scFv、重鏈可變區與輕鏈可變區已雙硫鍵結的scFv(右上斜線)、及會與CD3以外結合之「其他結合部分」或「其他群組」(各自以X、Y及Z表示)而成。Fc為以左上斜線所示之第1多肽及以塗黑所示之第2多肽締合的型式(Fc可為野生型、變異型之任一者)。以右上斜線所示之scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域的連結順序交換的相反之物。X、Y及Z之中2個或3個為「其他結合部分」之情形，係各自成為三重特異性分子或四重特異性分子。此外，各圖中之X、Y、Z及scFv亦可交換位置。圖43A為呈示一種Fc附加型雙重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之Fab、及會與CD3以外結合之X(其他結合部分)而成。Fc為以左上斜線所示之第1多肽及以塗黑所示之第2多肽締合的型式(Fc可為野生型、變異型之任一者)。圖43B為呈示一種Fc附加型雙重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之Fab、及會與CD3以外結合之抗體片段(scFv或Fab)而成。Fc為以左上斜線所示之第1多肽及以塗黑所示之第2多肽締合的型式(Fc可為野生型、變異型之任一者)。左上圖亦為呈示scFv-Fab-異二聚體Fc型之圖(Fc為異二聚體之情形)。各scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域的連結順序交換的相反之物。圖44A為呈示一種Fc附加型多重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之Fab、以及會與CD3以外結合之X(「其他結合部分」)及Y(「其他結合部分」或「其他群組」)而成。Fc為以左上斜線所示之第1多肽及以塗黑所示之第2多肽締合的型式(Fc可為野生型、變異型之任一者)。Y為「其他結合部分」之情形，係成為三重特異性分子。圖44B為呈示一種Fc附加型三重特異性分子(若該2個抗體片段相同，則為雙重特異性分子)之圖，其係包含會與CD3結合之Fab、及會與CD3以外結合之2個抗體片段(scFV或Fab)而成。Fc為以左上斜線所示之第1多肽及以塗黑所示之第2多肽締合的型式(Fc可為野生型、變異型之任一者)。各scFv的配向性，亦可為將VH與VL之結構域的連結順序交換的相反之物。圖45為呈示一種Fc附加型多重特異性分子之圖，其係包含會與CD3結合之Fab、及會與CD3以外結合之「其他結合部分」或「其他群組」(各自以X、Y及Z表示。X、Y及Z的至少1個為「其他結合部分」)而成。Fc為以左上斜線所示之第1多肽及以塗黑所示之第2多肽締合的型式(Fc可為野生型、變異型之任一者)。X、Y及Z之中2個或3個為「其他結合部分」之情形，係各自成為三重特異性分子或四重特異性分子。圖46為C3E-7097的胺基酸序列(序列識別號39) 圖47為C3E-7093重鏈之CDRH1～CDRH3、及輕鏈之CDRL1～L3的胺基酸序列(序列識別號40～45) 圖48為C3E-7093-Fab的胺基酸序列(序列識別號46) 圖49為C3E-7093-LC的胺基酸序列(序列識別號47) 圖50為C3E-7098的胺基酸序列(序列識別號48) 圖51為C3E-7099的胺基酸序列(序列識別號49)

從圖38～45，X、Y及Z看起來與相鄰部分的末端連接，但並無須對末端之結合或融合。例如，X、Y及Z(看起來)與Fc連接之情形，該X、Y及Z可為對Fc的N末端或C末端之結合或融合、與Fc的N末端或C末端以外的部分結合、或與附加於Fc所含的胺基酸之糖鏈結合或融合等之任一者。未與相鄰部分的末端結合或融合之例，並不限定於此等。

無。

Claims

一種Fab，其會與CD3特異性地結合，且包含下列CDRH1～3及CDRL1～3：由序列識別號32所示胺基酸序列構成的CDRH1；由序列識別號33所示胺基酸序列構成的CDRH2；由序列識別號34所示胺基酸序列構成的CDRH3；由序列識別號35所示胺基酸序列構成的CDRL1；由序列識別號36所示胺基酸序列構成的CDRL2；及由序列識別號37所示胺基酸序列構成的CDRL3。
如請求項1之Fab，其包含由序列識別號1所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號2所示胺基酸序列之胺基酸編號1～107構成的輕鏈可變區。
如請求項1或2之Fab，其包含由序列識別號1所示胺基酸序列構成的多肽、及由序列識別號2所示胺基酸序列構成的輕鏈。
一種多重特異性分子，其包含如請求項1至3中任一項之Fab，且會與並非癌症-睪丸抗原肽(cancer-testis antigen peptide)和主要組織相容性複體(MHC)的複合體之標的分子特異性地結合。
如請求項4之多重特異性分子，其中該MHC為人類白血球抗原(HLA)。
如請求項4或5之多重特異性分子，其包含會與該標的分子特異性地結合之抗體或其抗原結合片段。
如請求項4至6中任一項之多重特異性分子，其為多重特異性抗體。
如請求項4至7中任一項之多重特異性分子，其包含scFv-Fab-異二聚體Fc。
如請求項4至8中任一項之多重特異性分子，其為三重特異性抗體。
如請求項4至8中任一項之多重特異性分子，其為雙重特異性抗體。
如請求項4至10中任一項之多重特異性分子，其中標的分子為GPRC5D、CD98或Trop2。
如請求項4至11中任一項之多重特異性分子，其包含選自下列(i)至(iii)的一個多肽群組： (i)包含由序列識別號29之第20～718個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號12之第21～233個胺基酸殘基構成的胺基酸序列之多肽； (ii)包含由序列識別號30之第20～717個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號12之第21～233個胺基酸殘基構成的胺基酸序列之多肽； (iii)包含由序列識別號31之第20～713個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號12之第21～233個胺基酸殘基構成的胺基酸序列之多肽。
一種多核苷酸，其包含編碼如請求項4至12中任一項之多重特異性分子所包含的胺基酸序列之鹼基序列。
一種載體，其包含如請求項13之多核苷酸。
一種細胞，其包含如請求項13之多核苷酸或如請求項14之載體、或者會生產如請求項4至12中任一項之多重特異性分子。
一種如請求項4至12中任一項之多重特異性分子的製造方法，其包含培養如請求項15之細胞的步驟。
一種多重特異性分子，其藉由如請求項16之方法而獲得。
一種包含如請求項1至3中任一項之Fab、如請求項4至12或請求項17中任一項之多重特異性分子、如請求項13之多核苷酸、如請求項14之載體、或如請求項15之細胞之組成物。
一種scFv，其會與CD3特異性地結合，且重鏈可變區及輕鏈可變區進行雙硫鍵結而成，並包含下列CDRH1～3及CDRL1～3：由序列識別號32所示胺基酸序列構成的CDRH1；由序列識別號33所示胺基酸序列構成的CDRH2；由序列識別號34所示胺基酸序列構成的CDRH3；由序列識別號35所示胺基酸序列構成的CDRL1；由序列識別號36所示胺基酸序列構成的CDRL2；及由序列識別號37所示胺基酸序列構成的CDRL3。
如請求項19之scFv，其包含由序列識別號3所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號3所示胺基酸序列之胺基酸編號134～240構成的輕鏈可變區。
如請求項19或20之scFv，其由序列識別號3所示胺基酸序列構成。
如請求項19之scFv，其包含由序列識別號39所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號39所示胺基酸序列之胺基酸編號134～240構成的輕鏈可變區。
如請求項19或22之scFv，其由序列識別號39所示胺基酸序列構成。
一種多重特異性分子，其包含如請求項19至23中任一項之scFv，且會與並非癌症-睪丸抗原肽和主要組織相容性複體(MHC)的複合體之標的分子特異性地結合。
如請求項24之多重特異性分子，其中該MHC為人類白血球抗原(HLA)。
如請求項24或25之多重特異性分子，其包含會與該標的分子特異性地結合之抗體或其抗原結合片段。
如請求項24至26中任一項之多重特異性分子，其為多重特異性抗體。
如請求項24至27中任一項之多重特異性分子，其包含taFv-異二聚體Fc。
如請求項24至28中任一項之多重特異性分子，其為三重特異性抗體。
如請求項24至28中任一項之多重特異性分子，其為雙重特異性抗體。
如請求項24至30中任一項之多重特異性分子，其中標的分子為GPRC5D、CD98或Trop2。
如請求項24至31中任一項之多重特異性分子，其包含選自下列(i)～(iii)的一個多肽對： (i)包含由序列識別號21之第20～744個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽； (ii)包含由序列識別號23之第20～743個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽； (iii)包含由序列識別號25之第20～739個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽、及包含由序列識別號9之第20～246個胺基酸殘基構成的胺基酸序列或於該胺基酸序列之羧基末端中1或2個胺基酸缺失而成的胺基酸序列之多肽。
一種多核苷酸，其包含編碼如請求項24至32中任一項之多重特異性分子所包含的胺基酸序列之鹼基序列。
一種載體，其包含如請求項33之多核苷酸。
一種細胞，其包含如請求項33之多核苷酸或如請求項34之載體、或者會生產如請求項24至32中任一項之多重特異性分子。
一種如請求項24至32中任一項之多重特異性分子的製造方法，其包含培養如請求項35之細胞的步驟。
一種多重特異性分子，其藉由如請求項36之方法而獲得。
一種包含如請求項19至23中任一項之scFv、如請求項24至32或請求項37中任一項之多重特異性分子、如請求項33之多核苷酸、如請求項34之載體、或如請求項35之細胞之組成物。
一種Fab，其會與CD3特異性地結合，且包含下列CDRH1～3及CDRL1～3：由序列識別號40所示胺基酸序列構成的CDRH1；由序列識別號41所示胺基酸序列構成的CDRH2；由序列識別號42所示胺基酸序列構成的CDRH3；由序列識別號43所示胺基酸序列構成的CDRL1；由序列識別號44所示胺基酸序列構成的CDRL2；及由序列識別號45所示胺基酸序列構成的CDRL3。
如請求項39之Fab，其包含由序列識別號46所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號47所示胺基酸序列之胺基酸編號1～109構成的輕鏈可變區。
如請求項39或40之Fab，其包含由序列識別號46所示胺基酸序列構成的多肽、及由序列識別號47所示胺基酸序列構成的輕鏈。
一種多重特異性分子，其包含如請求項39至41中任一項之Fab，且會與並非癌症-睪丸抗原肽和主要組織相容性複體(MHC)的複合體之標的分子特異性地結合。
如請求項42之多重特異性分子，其中該MHC為人類白血球抗原(HLA)。
如請求項42或43之多重特異性分子，其包含會與該標的分子特異性地結合之抗體或其抗原結合片段。
如請求項42至44中任一項之多重特異性分子，其為多重特異性抗體。
如請求項42至45中任一項之多重特異性分子，其為雙重特異性抗體。
一種多核苷酸，其包含編碼如請求項42至46中任一項之多重特異性分子所包含的胺基酸序列之鹼基序列。
一種載體，其包含如請求項47之多核苷酸。
一種細胞，其包含如請求項47之多核苷酸或如請求項48之載體、或者會生產如請求項42至46中任一項之多重特異性分子。
一種如請求項34至38中任一項之多重特異性分子的製造方法，其包含培養如請求項49之細胞的步驟。
一種多重特異性分子，其藉由如請求項50之方法而獲得。
一種包含如請求項39至41中任一項之Fab、如請求項42至46中任一項之多重特異性分子、如請求項47之多核苷酸、如請求項48之載體、或如請求項49之細胞之組成物。
一種scFv，其會與CD3特異性地結合，且重鏈可變區及輕鏈可變區進行雙硫鍵結而成，並包含下列CDRH1～3及CDRL1～3：由序列識別號40所示胺基酸序列構成的CDRH1；由序列識別號41所示胺基酸序列構成的CDRH2；由序列識別號42所示胺基酸序列構成的CDRH3；由序列識別號43所示胺基酸序列構成的CDRL1；由序列識別號44所示胺基酸序列構成的CDRL2；及由序列識別號45所示胺基酸序列構成的CDRL3。
如請求項53之scFv，其包含由序列識別號48所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號48所示胺基酸序列之胺基酸編號134～242構成的輕鏈可變區。
如請求項53或54之scFv，其由序列識別號48所示胺基酸序列構成。
如請求項53之scFv，其包含由序列識別號49所示胺基酸序列之胺基酸編號1～118構成的重鏈可變區、及由序列識別號49所示胺基酸序列之胺基酸編號134～242構成的輕鏈可變區。
如請求項53或56之scFv，其由序列識別號49所示胺基酸序列構成。
一種多重特異性分子，其包含如請求項53至57中任一項之scFv，且會與並非癌症-睪丸抗原肽和主要組織相容性複體(MHC)的複合體之標的分子特異性地結合。
如請求項58之多重特異性分子，其中該MHC為人類白血球抗原(HLA)。
如請求項58或59之多重特異性分子，其包含會與該標的分子特異性地結合之抗體或其抗原結合片段。
如請求項58至60中任一項之多重特異性分子，其為多重特異性抗體。
如請求項58至61中任一項之多重特異性分子，其為雙重特異性抗體。
一種多核苷酸，其包含編碼如請求項58至62中任一項之多重特異性分子所包含的胺基酸序列之鹼基序列。
一種載體，其包含如請求項63之多核苷酸。
一種細胞，其包含如請求項63之多核苷酸或如請求項64之載體、或者會生產如請求項58至62中任一項之多重特異性分子。
一種如請求項58至62中任一項之多重特異性分子的製造方法，其包含培養如請求項65之細胞的步驟。
一種多重特異性分子，其藉由如請求項66之方法而獲得。
一種包含如請求項53至57中任一項之scFv、如請求項58至62中任一項之多重特異性分子、如請求項63之多核苷酸、如請求項64之載體、或如請求項65之細胞之組成物。
一種醫藥組成物，其包含如請求項4至12、24至32、42至46及58至62中任一項之多重特異性分子。