JP6765974B2 - 多重特異性抗体コンストラクト - Google Patents
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Description
a)式(I):VH−CH1−X−V1のポリペプチド鎖;および
b)式(II):VL−CL−Y−V2のポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子が提供される。
ここで、VHは、重鎖可変ドメインを表し;
CH1は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン1を表し;
Xは、結合またはリンカーを表し;
Yは、結合またはリンカーを表し;
V1は、dsFv、sdAb、scFvまたはdsscFvを表し;
VLは、軽鎖可変ドメインを表し;
CLは、Cκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し;
V2は、dsFv、sdAb、scFvまたはdsscFvを表し;
ここで、V1またはV2の少なくとも1つは、dsFvまたはdsscFvである。
本明細書中で使用される場合、「多重特異性抗体」は、2以上の結合ドメイン、例えば、2または3の結合ドメインを有する本明細書中で記載されるような抗体分子を指す。
1つの態様において、抗体コンストラクトは、三重特異性抗体である。
本明細書中で使用される場合、「三重特異性抗体」は、3つの抗原結合部位を有する抗体分子を指し、これは、独立して、同じまたは異なる抗原を結合し得る。1つの例において、三重特異性抗体分子は、2つの異なる抗原を結合し、すなわち、2つの結合部位は、同じ抗原を結合し、第3の結合部位は、第2の、異なる抗原を結合する。好ましくは、本発明の三重特異性抗体分子の3つの結合部位は、独立して、3つの異なる抗原を結合する。
本明細書中で使用される場合、「二重特異性抗体」は、2つの抗原結合部位を有する分子を指し、これは、同一または異なる抗原を結合し得る。
1つの態様において、ドメインは全て、同一の抗原に結合し、抗原上で同じエピトープを結合すること、または抗原上で異なるエピトープを結合することを含む。
1つの態様において、3つの結合ドメインがあり、3つの結合ドメインのそれぞれは、異なる(区別できる)抗原を結合する。
本明細書中で使用される場合、「抗原結合部位」は、分子の部分を指し、これは、可変領域の1対、特に、標的抗原と特異的に相互作用する同族対を含む。
本明細書中で使用される場合、「特異的に」は、特異的である抗原のみを認識する結合部位または結合ドメイン、または非特異的である抗原と比較して、有意に高い、例えば、5、6、7、8、9、10倍より高い、結合親和性を有する結合部位または結合ドメインを指すことを意図する。
結合親和性は、標準的なアッセイ、例えば、BIAcoreなどの表面プラズモン共鳴によって測定され得る。
VHは、可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメインを表す。1つの態様において、VHは、重鎖可変ドメインを表す。1つの態様において、VHは、キメラ可変ドメインであり、すなわち、それは、少なくとも2つの種、例えば、ヒトフレームワークおよび非ヒトCDRに由来する成分を含む。1つの態様において、VHは、ヒト化される。1つの態様において、VHは、ヒトである。
通常、VHおよびVLは、一緒に抗原結合ドメインを形成する。1つの態様において、VHおよびVLは、同族対(cognate pair)を形成する。
本明細書中で使用される場合、「可変領域」は、CDRおよびフレームワーク、特に適切なフレームワークを含む抗体鎖での領域を指す。
本明細書中で使用される場合、「に由来する」は、使用される配列または使用される配列に非常に類似する配列は、抗体の軽または重鎖などの元の遺伝物質から得られたという事実を指す。
本発明での使用のための可変領域は、本明細書中で上記に記載される場合、VHおよびVLに関して、任意の適切な供給源からであり得、例えば、完全ヒトまたはヒト化であり得る。
1つの態様において、VHおよびVLによって形成される結合ドメインは、第1の抗原に特異的である。
1つの態様において、V1によって形成される結合ドメインは、第2の抗原に特異的である。
1つの態様において、V2によって形成される結合ドメインは、第2または第3の抗原に特異的である。
1つの態様において、CH1ドメインは、抗体重鎖またはその誘導体から自然に発生するドメインである。
1つの態様において、CL断片は、軽鎖において、定常κ配列または定常λ配列またはその誘導体である。
1つの態様において、1つ以上の天然のまたは改変された鎖間(すなわち、軽および重鎖間)ジスルフィド結合は、機能的FabまたはFab’断片に存在する。
1つの態様において、「天然の」ジスルフィド結合は、式(I)および(II)のポリペプチド鎖中のCH1およびCLの間に存在する。
CLドメインが、κまたはλのいずれかに由来する場合、システインを形成する結合のための天然の位置は、ヒトcκおよびcλにおいて214である(Kabat番号第4版1987年)。
任意に、式IおよびIIのポリペプチドのVHおよびVLの間のジスルフィド結合があってもよい。
1つの態様において、本開示に係る多重特異性抗体は、CH1およびCLの間に自然に生じる同等または対応する位置におけるジスルフィド結合を有する。
V2は、dsFv、sdAb、scFv、またはdsscFv、例えば、dsFv、scFvまたはdsscFvを表す。
1つの態様において、V1およびV2は、両方ともdsscFvである。
1つの態様において、V1およびV2は、両方ともdsFvである。V1およびV2の両方が、dsFvの場合、VHまたはVL可変ドメインのいずれか一方は、V1およびV2と同一である。1つの態様において、V1およびV2は、同じVH可変ドメインを有する。別の態様において、V1およびV2は、同じVL可変ドメインを有する。1つの態様において、VHおよびVL可変ドメインは、V1およびV2について同一である。後者は、いくつかの標的にとって望ましい架橋結合を可能にする。
a)式(I):VH−CH1−X−V1のポリペプチド鎖;および
b)式(II):VL−CL−Y−V2のポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子が提供され、
ここで、VHは、重鎖可変ドメインを表し;
CH1は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン1を表し;
Xは、結合またはリンカーを表し;
Yは、結合またはリンカーを表し;
V1は、dsFvまたはdsscFvを表し;
VLは、軽鎖可変ドメインを表し;
CLは、定常領域からのドメイン、例えば、Cκなどの軽鎖定常領域ドメインを表し;
V2は、dsFvまたはdsscFvを表し;
本明細書中で使用される場合、「一本鎖可変断片」または「scFv」は、重鎖可変ドメイン(VH)および軽鎖可変ドメイン(VL)を含む、またはからなる一本鎖可変断片を指し、これは、VHおよびVL可変ドメインの間のペプチドリンカーによって安定化される。VHおよびVL可変ドメインは、任意の適切な配向性であり得、例えば、VHのC末端は、VLのN末端に結合され得る、またはVLのC末端は、VHのN末端に結合され得る。
本明細書中で使用される場合、「ジスルフィド安定化可変断片」または「dsFv」は、VHおよびVLの可変ドメインの間のペプチドリンカーを含まず、代わりに、VHおよびVLの間のドメイン間ジスルフィド結合によって安定化される一本鎖可変断片を指す。
本明細書中で使用される場合、「単一ドメイン抗体」または「sdAb」は、VHまたはVLまたはVHHなどの単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片を指す。
・VH37+VL95C 例えば、Protein Science 6, 781−788 Zhuら(1997年)参照;
・VH44+VL100 例えば、;Biochemistry 33 5451−5459 Reiterら(1994年);またはJournal of Biological Chemistry Vol. 269 No. 28 pp.18327−18331 Reiterら(1994年);またはProtein Engineering, vol.10 no.12 pp.1453−1459 Rajagopalら(1997年)参照;
・VH44+VL105 例えば、J Biochem. 118, 825−831 Luoら (1995年)参照;
・VH45+VL87 例えばProtein Science 6, 781−788 Zhuら(1997年)参照;
・VH55+VL101 例えばFEBS Letters 377 135−139 Youngら(1995年)参照;
・VH100+VL50 例えばBiochemistry 29 1362−1367 Glockshuberら(1990年)参照;
・VH100b+VL49;
・VH98+VL46 例えばProtein Science 6, 781−788 Zhu ら(1997年)参照;
・VH101+VL46;
・VH105+VL43 例えば; Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538−7542 Brinkmannら(1993年);またはProteins 19, 35−47 Jungら(1994年)参照、
・VH106+VL57 例えばFEBS Letters 377 135−139 Youngら(1995年)参照
および分子中に位置する可変領域対におけるそれらに対応する位置。
上記に列記したアミノ酸対は、システインによる置換に寄与する位置にあるので、ジスルフィド結合が形成されることができる。システインは、既知の技術によってこれらの所望の位置に改変されることができる。したがって、1つの態様において、本開示に係る改変されたシステインは、所定のアミノ酸位置での天然の残基が、システイン残基で置換されているところを指す。
1つの態様において、V2がdsFvまたはdsscFvの場合、V2の可変ドメインVHおよびVLは、2つの改変されたシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合され、1つは位置VH44、もう1つはVL100である。
1つの態様において、V1がdsFv、dsscFv、またはscFvである場合、V1のVLドメインは、Xに結合する。
1つの態様において、V2がdsFv、dsscFv、またはscFvである場合、V2のVHドメインは、Yに結合する。
1つの態様において、V2がdsFv、dsscFv、またはscFvである場合、V2のVLドメインは、Yに結合する。
1つの態様において、Yは、結合である。
1つの態様において、XおよびYの両方は、結合である。
1つの態様において、Xはリンカー、好ましくは、ペプチドリンカー、例えば、タンパク質CH1およびV1を結合するのに適したペプチドである。
1つの態様において、Yはリンカー、好ましくは、ペプチドリンカー、例えば、タンパク質CLおよびV2を結合するのに適したペプチドである。
1つの態様において、XおよびYの両方は、リンカーである。1つの態様において、XおよびYの両方は、ペプチドリンカーである。
1つの態様において、ペプチドリンカーは、長さで50アミノ酸以下、例えば、20アミノ酸以下、例えば、約15アミノ酸以下、例えば、長さで9、10、11、12、13または14アミノ酸である。
1つの態様において、リンカーは、配列1〜67で示される配列から選択される。
1つの態様において、Xは、配列SGGGGTGGGGS(配列番号1)を有する。
1つの態様において、Yは、配列SGGGGTGGGGS(配列番号1)を有する。
1つの態様において、Xは、配列SGGGGSGGGGS(配列番号2)を有する。1つの態様において、Yは、配列SGGGGSGGGGS(配列番号2)を有する。
1つの態様において、Xは、配列番号1で与えられる配列を有し、Yは、配列番号2で与えられる配列を有する。
1つの態様において、Xは、配列番号69または70で与えられる配列を有する。1つの態様において、Yは、配列番号69または70で与えられる配列を有する。1つの態様において、Xは、配列番号69で与えられる配列を有し、およびYは、配列番号70で与えられる配列を有する。
剛性リンカーの例としては、ペプチド配列GAPAPAAPAPA(配列番号52)、PPPP(配列番号53)およびPPPが挙げられる。
1つの態様において、ペプチドリンカーは、アルブミン結合ペプチドである・
1つの態様において、V1がscFvまたはdsscFvである場合、例えば、V1の可変ドメインVHおよびVLを結合するための適切なペプチドがある。
1つの態様において、V2がscFvまたはdsscFvである場合、例えば、V2の可変ドメインVHおよびVLを結合するための適切なペプチドがある。
1つの態様において、scFvまたはdsscFvにおいて、ペプチドリカーは、長さで約12〜25のアミノ酸、例えば15〜20のアミノ酸の範囲である。
1つの態様において、V2がscFvまたはdsscFvである場合、V2の可変ドメインVHおよびVLを結合するリンカーは、配列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号68)を有する。
1つの態様において、V1がscFvまたはdsscFvである場合、V1の可変ドメインVHおよびVLを結合するリンカーは、配列SGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号69)を有する。
1つの態様において、V2がscFvまたはdsscFvである場合、V2の可変ドメインVHおよびVLを結合するリンカーは、配列SGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号69)を有する。
1つの態様において、V1がscFvまたはdsscFvである場合、V1の可変ドメインVHおよびVLを結合するリンカーは、配列SGGGGSGGGGTGGGGS(配列番号70)を有する。
1つの態様において、V2がscFvまたはdsscFvである場合、V2の可変ドメインVHおよびVLを結合するリンカーは、配列SGGGGSGGGGTGGGGS(配列番号70)を有する。
a)式(I):VH−CH1−X−V1のポリペプチド鎖;および
b)式(II):VL−CL−Y−V2のポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子が提供され、
ここで、VHは、重鎖可変ドメインを表し;
CH1は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン1を表し;
Xは、結合またはリンカーを表し;
Yは、結合またはリンカーを表し;
V1は、dsFv、sdAb、scFvまたはdsscFvを表し;
VLは、軽鎖可変ドメインを表し;
CLは、Cκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し;
V2は、dsFv、sdAb、scFvまたはdsscFvを表し;
ここで、V1またはV2の少なくとも1つは、dsFvまたはdsscFvである。
本明細書中で使用される場合、「同一性」は、アラインされた配列における任意の特定の位置で、アミノ酸残基は、配列間で同一であることを示す。
フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン(芳香族側鎖を有するアミノ酸);
リシン、アルギニンおよびヒスチジン(塩基側鎖を有するアミノ酸);
アスパラギン酸およびグルタミン酸(酸性側鎖を有するアミノ酸);
アスパラギンおよびグルタミン(アミド側鎖を有するアミノ酸);および
システインおよびメチオニン(硫黄含有側鎖を有するアミノ酸)。
抗原ポリペプチドに対して生じる抗体は、動物の免疫化が必要な場合に、動物、好ましくは、非ヒト動物にポリペプチドを投与することによって、周知で慣習的なプロトコル(例えば、Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England、1986年参照)を使用して、得られうる。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダまたはブタなどの多くの温血動物が免疫され得る。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタおよびラットが、通常最も適している。
モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ技術(Kohler & Milstein, 1975年, Nature, 256:495−497)、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozborら 1983年, Immunology Today, 4:72)およびEBVハイブリドーマ技術(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(モノクロナール抗体および癌療法), pp77−96, Alan R Liss, Inc., 1985年)など、当該分野で公知の任意の方法によって調製され得る。
本明細書中で開示されるヒト化抗体(CDR移植抗体を含む)は、非ヒト種からの領域(CDR)およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を決定する1つ以上の相補性を有する分子を指す(例えば、US 5,585,089;WO91/09967参照)。全体のCDRよりむしろCDRの残基を決定する特異性を移すことが必要であるにすぎないことが理解されるだろう(例えば、Kashmiriら、2005年、Methods, 36, 25−34参照)。ヒト化抗体は、任意に、CDRが由来した非ヒト種由来の1つ以上のフレームワーク残基をさらに含む。
ドナー残基は、ドナー抗体からの残基、すなわち、CDRがもともと由来する抗体である。ドナー残基は、ヒト受容体フレームワーク(アクセプター残基)に由来する適切な残基で置換され得る。
1つの態様において、本開示の多重特異性抗体は、完全にヒトであり、特に、可変ドメインの1つ以上は、完全にヒトである。
1つの態様において、VH/VL、またはV1またはV2によって形成される抗原結合ドメインによって結合される目的の抗原は、独立して、細胞関連タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、T細胞、B細胞、内皮細胞または腫瘍細胞、および可溶性タンパク質などの細胞上の細胞表面タンパク質から選択される。
1つの態様において、V1およびV2は、同じ抗原に特異的であり、例えば、その中の同じまたは異なるエピトープを結合する。1つの態様において、V1は、ヒト血清アルブミンに特異的である。1つの態様において、V2は、ヒト血清アルブミンに特異的である。1つの態様において、V1およびV2は、2つの異なる抗原に特異的である。
1つの態様において、V1およびV2は、同じ抗原、例えば、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに特異的である。
1つの態様において、VH/VLまたはV1またはV2によって結合される目的の抗原は、補体経路活性化および/またはエフェクター細胞補充などの、エフェクター機能を補充する能力を提供する。
さらに、本開示の多重特異性抗体分子は、核種キレート化剤タンパク質に結合する単一ドメイン抗体により放射性核種をキレート化するために使用され得る。そのような融合タンパク質は、イメージングまたは治療への放射性核種ターゲティグアプローチでの使用である。
本明細書中で使用される場合、「血清担体タンパク質」としては、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α1酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲンおよびアルブミン、またはその任意の断片が挙げられる。
本明細書中で使用される場合、「循環免疫グロブリン分子」としては、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、sIgA、IgMおよびIgD、またはその任意の断片が挙げられる。
1つの態様において、VH/VLが特異性を有する目的の抗原は、ヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体のような血清担体タンパク質である。
1つの態様において、V1が特異性を有する目的の抗原は、ヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体のような血清担体タンパク質である。
1つの態様において、V2が特異性を有する目的の抗原は、ヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体のような血清担体タンパク質である。
1つの態様において、VH/VL、V1またはV2の1つのみが、ヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体のような血清担体タンパク質に特異性を有する。
この文脈において、本明細書中で使用される場合、改善された親和性は、出発分子を超える改善を指す。
他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチドおよび酵素を含む。目的の酵素としては、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トラスフェラーゼが挙げられるが、それらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとしては、免疫グロブリン、アブリン、リシンA、シュードモーナス外毒素、またはジフテリア毒素などの毒、インスリン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲンアクチベーターなどのタンパク質、血栓剤または抗血管新生剤、例えば、アンギオテンシンまたはエンドスタチン、またはリンホカイン、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−2(IL−2)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、神経成長因子(NGF)または他の成長因子および免疫グロブリンなどの生物学的応答修飾物質が挙げられるが、それらに限定されない。
エフェクター分子がポリマーである場合、それは、一般的に、合成または自然に発生するポリマー、例えば、任意に置換された直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマーまたは分枝または非分枝多糖類、例えば、ホモ−またはヘテロ−ポリサッカライドであり得る。
合成ポリマーの特定の例としては、任意に置換された直鎖または分枝鎖ポリ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)ポリ(ビニルアルコール)またはその誘導体、特に、メトキシポリ(エチレングリコール)またはその誘導体など任意に置換されたポリ(エチレングリコール)が挙げられる。
特定の自然に生じるポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲンまたはそれらの誘導体が挙げられる。
適切なポリマーとしては、ポリ(エチレングリコール)または、特に、メトキシポリ(エチレングリコール)またはその誘導体、および特に、約15000Da〜約40000Daの範囲の分子量を有するなどのポリアルキレンポリマーが挙げられる。
PEGリンカーの代替供給源は、GL2−400MA2(ここで、以下の構造中のmは、5である)およびGL2−400MA(ここで、mは2である)を供給するNOFを含み、nは、約450である:
すなわち、各PEGは、約20,000Daである。
1つの態様において、本開示の分子をコードするポリヌクレオチド配列、例えば、DNA配列を提供する。
a)式(I):VH−CH1−X−V1のポリペプチド鎖;および
b)式(II):VL−CL−Y−V2のポリペプチド鎖
ここで、VHは、重鎖可変ドメインを表し;
CH1は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン1を表し;
Xは、結合またはリンカーを表し;
Yは、結合またはリンカーを表し;
V1は、dsFv、sdAb、scFvまたはdsscFvを表し;
VLは、軽鎖可変ドメインを表し;
CLは、Cκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し;
V2は、dsFv、sdAb、scFvまたはdsscFvを表し;
ここで、V1またはV2の少なくとも1つは、dsFvまたはdsscFvである。
当業者は、V1および/またはV2がdsFvを表す場合、多重特異性抗体は、XまたはYに結合しない相当する遊離VHまたはVLをコードする第3のポリペプチドを含むことを理解するだろう。したがって、本発明の多重特性タンパク質は、1以上、2以上または3以上のポリヌクレオチドによってコードされ得、これらは、1以上のベクター中に組み込まれ得る。
また、本発明の多重特異性タンパク質をコードする1以上のDNA配列を含む1以上のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。任意の適切な宿主細胞/ベクター系は、本発明の抗体分子をコードするDNA配列の発現のために使用され得る。細菌、例えば、大腸菌および他の微生物系が使用されてもよく、または真核生物、例えば、哺乳動物、宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞は、CHO、骨髄腫、NSO骨髄腫細胞およびSP2細胞、COS細胞またはハイブリドーマ細胞を含む。
重および軽鎖の両方を含む生成物の生産のために、細胞株は、軽鎖ポリペプチドをコードする第1のベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードする第2のベクターの2つのベクターでトランスフェクトされ得る。あるいは、単一ベクターを使用してもよく、ベクターは、軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。1つの例において、細胞株は、2つのベクターでトランスフェクトされ得、それぞれが、本発明の抗体分子のポリペプチド鎖をコードする。V1および/またはV2はがdsFvである場合、細胞株は、3つのベクターでトランスフェクトされ得、それぞれが、本発明の多重特異性タンパク質のポリペプチド鎖をコードする。
a)式(I):VH−CH1−X−V1のポリペプチド鎖;および
b)式(II):VL−CL−Y−V2のポリペプチド鎖
から選択される異なるポリペプチドを各々がコードする2つのベクターでトランスフェクトされ、
ここで、VHは、重鎖可変ドメインを表し;
CH1は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン1を表し;
Xは、結合またはリンカーを表し;
Yは、結合またはリンカーを表し;
V1は、dsFv、sdAb、scFvまたはdsscFvを表し;
VLは、軽鎖可変ドメインを表し;
CLは、Cκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し;
V2は、dsFv、sdAb、scFvまたはdsscFvを表し;
ここで、V1またはV2の少なくとも1つは、dsFvまたはdsscFvである。
1つの態様において、V1がdsFvであり、V1のVLドメインがXに結合される場合、細胞株は、V1のVHドメインをコードする第3のベクターでトランスフェクトされ得る。
1つの態様において、V2がdsFvであり、V2のVHドメインがYに結合される場合、細胞株は、V2のVLドメインをコードする第3のベクターでトランスフェクトされ得る。
1つの態様において、V2がdsFvであり、V2のVLドメインがYに結合される場合、細胞株は、V2のVHドメインをコードする第3のベクターでトランスフェクトされ得る。
1つの態様において、V1およびV2の両方がdsFvであり、V2のVLドメインがYに結合され、V1のVLドメインがXに結合される場合、細胞株はV1およびV2の両方の共通のVHドメインをコードする第3のベクターでトランスフェクトされ得る。
1つの態様において、V1およびV2の両方がdsFvであり、V2のVHドメインがYに結合され、V1のVHドメインがXに結合される場合、細胞株はV1およびV2の両方の共通のVLドメインをコードする第3のベクターでトランスフェクトされ得る。
1つの態様において、ベクターは、単一プロモーターの制御下で、本発明の多重特異性抗体分子の2つ、または存在する場合3つのポリペプチド鎖をコードする単一ポリヌクレオチド配列を含む。
本開示に係る多重特異性タンパク質は、宿主細胞からの良好なレベルで発現される。したがって、抗体および/または断片の特性は、最適化され、商業的処理につながるようである。
本開示はまた、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体の1つ以上と組み合わせて本開示の抗体分子を含む医薬組成物または診断用組成物を提供する。したがって、特に本明細書中に開示される適用のために、治療での使用および医薬の製造のための本開示の抗体の使用を提供する。
組成物は、通常、薬学的に許容可能な担体を含む滅菌した医薬組成物の一部として供給されるだろう。本開示の医薬組成物は、薬学的に許容可能なアジュバントをさらに含み得る。
抗体分子は、医薬組成物または診断用組成物中の唯一の活性成分であってもよく、または他の抗体成分、例えば、抗IL−1β、抗T細胞、抗IFNγまたは抗LPS抗体、またはキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分を伴ってもよい。他の適切な活性成分として、耐性を誘導することができる抗体、例えば、抗CD3または抗CD4抗体が挙げられる。
さらなる態様において、本開示に係る抗体、断片または組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤と組み合わせて使用される。
本開示の抗体分子が投与される用量は、治療される状態の性質、存在する炎症の程度および抗体分子が予防的にまたは既存の状態を治療するために使用されているか否かに依存する。
投与の頻度は、抗体分子の半減期およびその効果の持続時間に依存するだろう。抗体分子が短い半減期(例えば、2〜10時間)を有する場合、1日に1回以上の投与を与えることが必要であり得る。あるいは、抗体分子が長い半減期(例えば、2〜15日)を有する場合、1日1回、1週間に1回、または1、2ヶ月ごとに1回の投与のみで足り得る。
薬学的に許容可能な塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。
投与のための適切なフォームは、例えば、注射または注入によって、例えば、ボーラス注入法または連続注入による適切な非経口投与のフォームを含む。生成物が注射または注入用である場合、油性または水性賦形剤中の懸濁液、溶液または乳濁液のフォームをとってもよく、懸濁剤、保存剤、安定化剤および/または分散剤などの処方剤を含み得る。あるいは、抗体分子は、適切な滅菌液体との使用前の再構成のために、乾燥フォームであり得る。
1つの態様において、本開示に係る製剤において、最終製剤のpHは、抗体または断片の等電点の値に類似せず、製剤のpHが7である場合、8〜9またはそれ以上のpIが適切であり得る。理論に縛られることを望まないが、これは、最終的に、改善された安定性を有する最終製剤を提供し得ることが考えられ、例えば、抗体または断片が溶液中に残ったままである。
組成物中の活性成分は、抗体分子であることが理解されるだろう。このように、消化管における分解を受けやすいだろう。したがって、組成物が、消化管を使用する経路によって投与される場合、組成物は、分解から抗体を保護するが、消化管から吸収された後に抗体を放出する薬剤を含む必要があるだろう。
1つの態様において、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
適切な吸入可能な製剤は、吸入可能な粉末、噴射剤ガスを含む計量エアロゾルまたは噴射剤ガスを含まない吸入可能な溶液(噴霧可能な溶液または懸濁液など)を含む。活性物質を含む本開示に係る吸入可能な粉末は、上記活性物質単独または生理学的に許容可能な賦形剤との上記活性物質の混合物からなり得る。
肺での沈着のための粒子は、10ミクロン未満、1〜9ミクロン、例えば0.1〜5μm、特に1〜5μmなどを必要とする。活性剤(抗体または抗体断片など)の粒径は、最も重要である。
特に、適切な噴霧ガスは、TG 11、TG 12、TG 134aおよびTG227の間から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、TG 134a(1,1,1,2−テトラフルオロエタン)およびTG227(1,1,1,2,3,3,3−ヘプタフルオロプロパン)およびそれらの混合物が特に適している。
本発明に係る噴霧ガス含有吸入可能なエアロゾルは、活性物質の重量で5%までを含み得る。本発明に係るエアロゾルは、例えば、活性の0.002〜5重量%、0.01〜3重量%、0.015〜2重量%、0.1〜2重量%、0.5〜2重量%または0.5〜1重量%を含む。
あるいは、肺への局所投与は、液体溶液または懸濁製剤の投与によってであり得、例えば、圧縮機に接続される噴霧器(例えば、Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Vaによって製造されるPari Master(登録商標)圧縮機に接続されるPari LC−Jet Plus(登録商標)噴霧器)などのデバイスを使用する。
1つの態様において、抗体は、凍結乾燥のフォームで、再構成のためにまたは懸濁液製剤として代わりに供給される。
本開示の抗体は、例えば、溶液または懸濁液のフォームで、溶媒中に分散されて送達されることができる。適切な生理学的溶液、例えば、生理食塩水、薬学的に許容可能な溶媒または緩衝用溶液に懸濁されることができる。当該分野で公知の緩衝溶液は、水1ml当たり0.05mg〜0.15mgのエデト酸二ナトリウム、8.0mg〜9.0mgのNaCl、0.15mmg〜0.25gのポリソルベート、0.25mg〜0.30mgの無水クエン酸、および0.45mg〜0.55mgのクエン酸ナトリウムを含むので、約4.0〜5.0のpHを達成し得る。上記のように、懸濁液は、例えば、凍結乾燥された抗体から作製されることができる。
これは、製剤に使用される緩衝化溶媒溶液のろ過、滅菌緩衝化溶媒溶液中の抗体の無菌懸濁液、および当業者によく知られている方法による無菌容器への製剤の調剤による生成物および殺菌を含み得る。
本開示の抗体は、噴霧による送達に適していると考えられる。
また、本発明の抗体は、遺伝子治療の使用によって投与され得ると予測される。これを達成するために、適切なDNA成分の制御下で抗体分子の重および軽鎖をコードするDNA配列が、抗体鎖がDNA配列から発現され、その場で組み立てられるように、患者に導入される。
したがって、治療で使用するための本発明に係る多重特異性抗体およびそれを使用する治療の方法を提供する。
1つの態様において、多重特異性抗体(特に、本発明に係る抗体または断片)を精製する方法を提供する。
1つの態様において、不純物がカラム上に保持され、抗体が非結合画分で維持されるような非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを実施するステップを含む多重特異性抗体(特に、本発明に係る抗体または断片)を精製する方法を提供する。そのステップは、例えば、pH約6〜8で実施され得る。
本発明の方法は、生成物を確実にする追加のクロマトグラフィーステップ(複数可)をさらに含んでもよく、不純物に関連する方法は、生成物ストリームから適切に分離される。
精製方法はまた、濃縮および透析ろ過ステップなどの、1以上の限外ろ過ステップを含み得る。
上記で使用されるような精製されたフォームは、少なくとも90%の純度、例えば、91、92、93、94、95、96、97、98、99%w/w以上の純度を意味することが意図される。
エンドトキシンを実質的に含まないとは、一般的に、抗体生成物1mg当たり1EU以下、例えば、生成物1mg当たり0.5または0.1EUのエンドトキシン含量を指すことが意図される。
宿主細胞タンパク質またはDNAを実質的に含まないとは、一般的に、適宜、抗体生成物の1mg当たり400μg以下、例えば、1mg当たり100μg以下、特に1mg当たり20μgの宿主細胞タンパクおよび/またはDNA含量を指すことを意図される。
本発明の抗体分子はまた、診断、例えば、インビボ診断および病態の画像化で使用され得る。
a)V1またはV2のいずれかが、所定の可変領域対についてdsscFvである場合に単量体多重特異性タンパク質の収率を決定するステップ
b)(a)において試験されたV1またはV2のいずれかが、同じ可変領域対についてdsFvである場合、単量体多重特異性タンパク質の収率を決定するステップおよび
c)(a)および(b)で得られたモノマーの収率を比較し、最も高い単量体の収率を有する多重特異性タンパク質を選択するステップ。
特許および出願のような技術的参考文献は、参照により本明細書中に組み込まれる。
本明細書中に具体的かつ明確に記載される任意の態様は、単独または1以上のさらなる態様との組み合わせのいずれかでディスクレーマー(「一部除く」)の基礎を形成し得る。
抗原2に対する抗体断片は、標識化#2である。
抗原3に対する抗体断片は、標識化#3である。
抗原4に対する抗体断片は、標識化#4である。
哺乳動物細胞における発現のためのプラスミドの構築
Fab#2−(HC)dsscFv#3、(LC)dsscFv#4およびFab#2−(LC)dsscFv#3、(HC)dsscFv#4の発現のためのプラスミド(図1参照)は、フレキシブルリンカーSGGGGSGGGGS[本明細書中でS、2xG4Sとも呼ばれる](配列番号2)を使用する#2軽鎖のKm3アロタイプヒトκ定常領域のC末端にscFv#3およびscFv#4を融合させることによって、またはフレキシブルリンカーSGGGGTGGGGS[本明細書中S、G4T、G4Sとも呼ばれる](配列番号1)を使用して#2重鎖のγ1アイソタイプヒトγ−1CH1定常領域のC末端にscFv#3およびScFv#4を融合することによって構築された。また、点突然変異が、vL#3/vL#4およびvH#3/vH#4の両方のフレームワーク領域において選択された残基のDNA配列中に導入された。突然変異(重鎖G44Cおよび軽鎖G100C)は、Fv#3の重および軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を作製するために導入された。突然変異(重鎖G44Cおよび軽鎖Q100C)は、Fv#4の重および軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を作製するために導入された。
プラスミドe1:Light#2−(SGGGGSGGGGS[配列番号2]−vL#4−(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS[配列暗号68])−vH#4;
プラスミドf1:Light#2−(SGGGGSGGGGS[配列番号2]−dsvL#4−(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS[配列暗号68])−dsvH#4;
プラスミドe2:Light#2−(SGGGGSGGGGS[配列番号2]−vH#4−(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS[配列暗号68])−vL#4;
プラスミドf2:Light#2−(SGGGGSGGGGS[配列番号2]−dsvH#4−(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS[配列暗号68])−dsvL#4;
プラスミドg1:Heavy#2−(SGGGGTGGGGS[配列番号1]−vL#4−(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS[配列暗号68])−vH#4;
プラスミドh1:Heavy#2−(SGGGGTGGGGS[配列番号1]−dsvL#4−(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS[配列暗号68])−dsvH#4;
プラスミドg2:Heavy#2−(SGGGGTGGGGS[配列番号1]−vH#4−(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS[配列暗号68])−vL#4;
プラスミドh2:Heavy#2−(SGGGGTGGGGS[配列番号1]−dsvH#4−(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS[配列暗号68])−dsvL#4。
pND1プラスミド(Fab#2Heavy−(SGGGGTGGGGS)[配列番号1]−dsvH#3−(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)[配列番号68]−dsvL#3)[プラスミドi]は、すでに入手可能であった。dsHLscFv#3をコードする遺伝子断片は、pND1から切除され、上記で詳述したように軽鎖#2に融合されて:Light#2−(SGGGGSGGGGS)[配列番号2]−dsvH#3−(GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)[配列番号68]−dsvL#3[プラスミドj]。
HEK293細胞は、Invitrogenの293フェクチントランスフェクション試薬をメーカーの説明通り使用して関連するプラスミドでトランスフェクトされた。プラスミドは、表4で示されるように、混合されて異なるコンストラクトを発現した。
約50mlのHEK293上清を、10kDaの分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用して、約2mlへと約25倍に濃縮した。濃縮した上清を、20mMリン酸塩、40mMNal pH7.4中で平衡化された1ml HiTrapプロテイン−G FFカラム(GE Healthcare)に適用した。カラムを20mM リン酸塩、40mM NaCl pH7.4で洗浄し、結合物質を、0.1Mグリシン/HCl pH2.7で溶出した。溶出ピークを集め、2MのTris/HCl pH8.5で約pH7.0に調整した。pH調整された溶出液を濃縮し、10kDaの分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用してPBS pH7.4にbuffer置換した。
サンプル(2μg)を、PBSを用いて、9.75μlの体積に希釈し、3.75μl4×LSDサンプル緩衝液および1.5μl 100mMのN−エチルマレイミド(非還元サンプル)または1.5μlの10×NuPAGE還元剤(還元サンプル)を添加した。サンプルをボルテックスし、70℃で10分間インキュベートし、冷却し、12500rpmで30秒間、遠心分離した。調製したサンプルを4〜20%アクリルアミドTris/グリシンSDSゲル上に充填し、約100分間、125V、一定電圧で流した。SeeBluePlus2(Life Technologies)分子量ラダーを使用した。ゲルをInstant Blueタンパク質染色(Expedeon)で染色し、蒸留水で脱染した。
還元および非還元SDS−PAGE後の予想バンドサイズを表6に示す。
全てのFab−1xdsscFv−1xscFvおよびFab−2xdsscFvタンパク質について、還元SDS−PAGEゲルは、コンストラクトが、約50kDaでダブレットを有する移動位置および染色強度の両方に関して正しく発現されていたことを示したバンドパターンを示した(図2B,D)。さらなる最上部のマイナーバンドは、非還元性全長タンパク質と一致する。予想通り、ジスルフィド結合多量体は、非還元ゲル上で見られ(図2A、C)、これは、還元条件下で消失する(図2B、D)。非還元ゲル上で、約50kDaのマイナーバンド(図2A、C)は、Fab領域での重および軽鎖の間での不完全なdsバンド形成と一致し得る。
10μg精製タンパク質サンプル(PBSで希釈した0.1mg/mlストックの100μl)を、精製後3日目にTSK Gel G3000SWXL、7.8×300mm、カラム(Tosoh)上に注入し、1ml/分で200mMリン酸塩pH7.0のアイソクラチック勾配を発現させた。シグナル検出は、280nmの吸光度で行った。
全てのサンプルは、アッセイで類似のモノマーレベルを有し、Fvジスルフィドを欠くscFvを含むそれらのサンプルは、動的平衡にある。これは、これらのサンプルに対するアッセイで測定されるモノマー%がサンプルの濃度に依存し、より濃縮されたサンプルは、より高いモノマー%を与え、より濃縮されていないサンプルは、より低いモノマー%を与えることを意味する。対照的に、両方のscFvがジスルフィドを含むサンプルは、安定であり、動的平衡でない。したがって、アッセイで測定された%モノマーは、サンプル濃度の変化と一緒に変化しない。
CHOS細胞を、1Lスケールでエレクトロポレーション法によって関連するプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドを、表7で示されるように混合してタンパク質を発現させた。培養物を、2mMのGlutaMAXを添加したCD−CHO培地で増殖させ、24時間、140rpmで8%CO2と一緒に、37℃でインキュベートし、その後、32℃でさらに13日間インキュベートした。トランスフェクション後4日目に、3mMの最終濃度の酪酸ナトリウムを培養物に添加した。トランスフェクション後14日目に、培養物上清を、遠心分離および滅菌した0.22μmフィルターにより採取した。発現力価を、プロテインG HPLCにより測定した(表8)。
1LのCHO上清を、10kDa分子量カットオフAmicon撹拌セルを使用して約40mlに約25倍濃縮した。濃縮した上清を、ランニング緩衝液としてプロテインGカラムおよびPBSを有するAKTA Express Purificationシステム上に充填した。結合物質を、0.1Mグリシン/HCL pH2.7で溶出し、2M Tris/HCl pH8.5で約pH7.0に調整した。次に、溶出した材料を、10kDaの分子量濃縮器を使用して濃縮し、得られた濃縮物を、ランニング緩衝液としてPBSでゲルろ過のためにSuperdexカラム(GE Healthcare)上に充填した。個々の溶出ピークを収集し、サイズ排除HPLCによって分析して、単量体画分を決定した。最終単量体タンパク質をPBS中5mg/mlに濃縮し、4℃で保存した。
サンプル(2μg)を、9.75μlの体積にPBSで希釈し、3.75μl 4×LDSサンプル緩衝液および1.5μl 100mM N−エチルマレイミド(非還元サンプル)または1.5μl 10×NuPAGE還元剤(還元サンプル)を添加した。サンプルをボルテックスし、70℃で10分間インキュベートし、冷却し、12500rpmで30秒間、遠心分離した。調製したサンプルを4〜20%アクリルアミドTris/グリシンSDSゲル上に充填し、約100分間、125V、一定電圧で流した。Mark12(Life Technologies)分子量ラダーを使用した。ゲルをInstant Blueタンパク質染色(Expedeon)で染色し、蒸留水で脱染した。
還元および非還元SDS−PAGE後の予想されるバンドサイズを、表9に示す。
全てのFab−1xdsscFv−1xscFvおよびFab−2xdsscFvタンパク質について、還元SDS−PAGEゲルは、コンストラクトが単量体であり、移動位置および約50kDaでダブレットを有する染色強度の両方に関して正確に発現されたことを示すバンディングパターンを示した(図8B、D)。さらなる最上部のマイナーバンドは、非還元性全長タンパク質と一致する(図8B、D)。全てのタンパク質について、非還元ゲルは、約100kDaでバンドを示し、完全長タンパク質を示した(図8A、a)。非還元ゲル上で約50kDaのマイナーバンド(図8A、b)は、Fab領域で、重および軽鎖の間の不完全なジスルフィド結合形成と一致し得る。
抗体フォーマットの精製モノマーの5mg/mlを、PBS中4℃で保存し、精製後4日目、14日目および28日目に分析した。サンプルをPBSで10μgに希釈し、TSK Gel G3000SWXL, 7.8x300mm、カラム(Tosoh)上に注入し、1ml/分で200mMリン酸塩pH7.0のアイソクラチック勾配で展開させた。シグナル検出は、280nmの吸光度で行った。結果を表9に示す。精製後4日目に、Fab−2xdsscFvの分析が示すところによれば、タンパク質の大部分が実験開始時に単量体であり(実線)、時間経過にわたって、単量体で安定なままで、多量体(二量体、三量体、高次数および大きな凝集体)として定義されたのは<1%であった。一方、多量体化のより高い発生が、時間の経過とともに直線的に増加することが観察されたFab−1xdsscFv−1xscFvについて検出された(破線)。実際に、多量体化の普及は、VL/VH配向性で非ジスルフィド安定化scFvを含むフォーマットでより顕著であるようであった。しかしながら、Fvジスルフィドを欠くscFvを含むフォーマットは、動的平衡であり、ジスルフィドで安定化されたscFvより保存中の多量体化の傾向がより大きいことが明らかである。実際に、両方ともジスルフィドで安定化されたscFvを含むフォーマットは、所定の製剤中のタンパク質の濃度が増加する場合でも、単量体のままであることが示されている。これは、両方のscFvが、貯蔵期間中に多量体または大きな凝集体の高次を形成する危険性が非常に重要でない必要がある医薬調製物での使用に理想的に適したFvジスルフィドを含むコンストラクトを作製する。
哺乳動物細胞における発現のためのプラスミドの構築
Fab#2−(HC)dsscFv#3、(LC)dsscFv#3の発現のためのプラスミド(図4参照)が、フレキシブルリンカーSGGGGSGGGGS[本明細書中でS、2xG4Sとも呼ばれる](配列番号2)を使用して軽鎖#2のKm3アロタイプヒトκ定常領域のC末端にdsscFv#3を融合することによって、またはフレキシブルリンカーSGGGGTGGGGS[本明細書中でS、G4T、G4Sとも呼ばれる](配列番号1)を使用して重鎖#2のγ1アイソタイプヒトγ−1CH1定常領域のC末端にdsscFv#3を融合することによって、構築された。点突然変異は、vL#3/vL#1およびvH#3/vH#1の両方のフレームワーク領域で選択された残基でDNA配列中に導入された。突然変異(重鎖G44Cおよび軽鎖G100C)が導入され、Fv#3の重および軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合を作製した。
Fab融合フォーマットは、HCMV−MIEプロモーターおよびSV40EポリA配列の制御下、哺乳動物発現ベクター中にクローニングした。
HEK293細胞は、Invitrogenの293フェクチントランスフェクション試薬をメーカーの説明通り使用して関連するプラスミドでトランフェクトされた。プラスミドを、表10で示されるように混合してタンパク質を発現した。
約50ml HEK293の上清を、30kDa分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用して、約2mlへと約25倍に濃縮した。濃縮した上清を精製し、さらに濃縮し、緩衝液を30kDa分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用してPBS pH7.4中に交換した。
サンプル(2μg)を、9.75μlの体積にPBSで希釈し、3.75μl 4×LDSサンプル緩衝液および1.5μl 100mM N−エチルマレイミド(非還元サンプル)または1.5μl 10×NuPAGE還元剤(還元サンプル)を添加した。サンプルをボルテックスし、70℃で10分間インキュベートし、冷却し、12500rpmで30秒間、遠心分離した。調製したサンプルを4〜20%アクリルアミドTris/グリシンSDSゲル上に充填し、約100分間、125V、一定電圧で流した。SeeBluePlus2(Life Technologies)分子量ラダーを使用した。ゲルをInstant Blueタンパク質染色(Expedeon)で染色し、蒸留水で脱染した。還元および非還元SDS−PAGE後の予想されるバンドサイズを、表12に示す。
還元SDS−PAGEゲルは、コンストラクトが、移動位置および約50kDaでダブレットを有する染色強度の両方に関して正確に発現されていたことを示すバンディングパターンを示したが(図4B)、しかしながら、いくつかのさらなるマイナー種がまた、Fabの精製に典型的に使用される標準プロテインG媒介精製方法とは対照的に、おそらくは準最適な精製スキームのために可能に観察された。ジスルフィド結合多量体は、非還元ゲル上で見られ(図4A)、これは、還元条件下で消失する(図4B)。
10μg精製タンパク質サンプル(PBSで希釈した0.1mg/mlストックの100μl)を、精製後3日にSuperdex 200 10/300 GL Tricorn カラム(GE Healthcare)上に注入し、1ml/分で、280nmの吸光度によって連続検出で、PBS pH7.4のアイソクラチック勾配で展開させた。その結果を図5に示す。図5からわかるように、精製後、Fab−2xdsscFv#3フォーマットは、81%モノマーであった。
哺乳動物細胞における発現のためのFab#2−(HC)dsscFv#3−(LC)dsscFv#1およびFab#2−(HC)dsscFv#3−(LC)dsFv#1(LC−vL結合)プラスミドの構築
Fab#2−(HC)dsscFv#3−(LC)dsscFv#1およびFa#2−(HC)dsscFv#3−(LC)dsFv#1(LC−vL結合)の発現のためのFab#2融合タンパク質(図6参照)は、フレキシブルリンカーSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号69)を使用して軽鎖#2のKm3アロタイプヒトκ定常領域のC末端にdsscFv#1(dsvH−4xG4S−dsvL)またはdsvL#1のいずれかを融合することによって構築され、
Light#2−(SGGGGSGGGGSGGGGS[配列番号69])−dsscFv#1[プラスミドb]および
Light#2−(SGGGGSGGGGSGGGGS[配列番号69])−dsvL#1[プラスミドc]を発生させ;および
フレキシブルリンカーSGGGGSGGGGTGGGGS(配列番号70)を使用してHeavy#2のγ1アイソタイプヒトγ−CH1定常領域のC末端にHLdsscFv#3(dsvH−4xG4S−dsvL)を融合することによって構築され、
Heavy#2−(SGGGGSGGGGTGGGGS[配列番号70])−dsscFv#3[プラスミドa]を発生させた。
dsscFv#1およびdsvL#1をコードする遺伝子は、化学的に製造され、軽鎖#2のC末端に融合され、Light#2−(SGGGGSGGGGSGGGGS[配列番号69])−dsscFv#1[プラスミドb]およびLight#2−(SGGGGSGGGGSGGGGS[配列番号69])−dsvL#1#1[プラスミドc]を作製し、全コンストラクトは、HCMV−MIEプロモーターおよびSV40EポリA配列の制御下で哺乳動物発現ベクター中にクローニングされた。
HEK293細胞は、Invitrogenの293フェクチントランスフェクション試薬をメーカーの説明通り使用して関連するプラスミドでトオラスフェクトされた。プラスミドは、混合されて以下の表13で示されるように異なるコンストラクトを発現した。
約50mlのHEK293上清を、10kDaの分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用して、約2mlへと約25倍に濃縮した。濃縮した上清を、20mMリン酸塩、40mM NaCl pH7.4中で平衡化された1mlのHiTrapプロテイン−G FFカラム(GE Healthcare)に適用した。カラムを20mMリン酸塩、40mM NaCl pH7.4で洗浄し、結合物質を、0.1Mグリシン/HCl pH2.7で溶出した。溶出ピークを集め、pHを、2MのTris/HCl pH8.5で約pH7.0に調整した。pH調整された溶出液を濃縮し、緩衝液は10kDaの分子量カットオフ遠心分離濃縮器を使用してPBS pH7.4中に交換した。
サンプル(2μg)を、9.75μlの体積にPBSで希釈し、3.75μl 4×LDSサンプル緩衝液および1.5μl 100mM N−エチルマレイミド(非還元サンプル)または1.5μl 10×NuPAGE還元剤(還元サンプル)を添加した。サンプルをボルテックスし、70℃で10分間インキュベートし、冷却し、12500rpmで30秒間、遠心分離した。調製したサンプルを4〜20%アクリルアミドTris/グリシンSDSゲル上に充填し、約100分間、125V、一定電圧で流した。SeeBluePlus2(Life Technologies)分子量ラダーを使用した。ゲルをInstant Blueタンパク質染色(Expedeon)で染色し、蒸留水で脱染した。
結果を図6に示す。Fab#2−(HC)dsscFv#3−(LC)dsscFv#1について、非還元ゲルは、約100kDaでバンドを示すと予測されたが、還元ゲルは、両方のバンドでほぼ等しい染色を有する約50kDaでダブレットを示すことが予想された。Fab#2−(HC)dsscFv#3−(LC)dsFv#1(LC−vL結合)について、非還元ゲルは、約100kDaでバンドを示すことが予想されるが、還元ゲルは、上方から下方バンドにおおよそ3:2:1の比率の染色で、約50、約36および約13kDaで3つのバンドを示すことが予想された。
10μg精製タンパク質サンプル(PBSで希釈した0.1mg/mlストックの100μl)を、精製後3日目にTSK Gel G3000SWXL、7.8×300mm、カラム(Tosoh)上に注入し、1ml/分で200mMリン酸塩pH7.0のアイソクラチック勾配で展開させた。シグナル検出を、280nmの吸光度によって行った。
dsscFv#1は、特に多量体化する傾向があることが知られている。多量体は、dsscFvリンカーによって(vL#1またはvH#1は、異なるポリペプチド鎖からのvH#1またはvL#1と対にされる)、dsscFv#1をdsFv#1(scFvリンカーを含まない)で置き換えることによって、物理的に結合されると、得られたモノマーの割合が有意に増加した。
したがって、当業者は、多量体化するdsscFvの傾向に依存して、場合によって、dssFvの代わりにdsFvを使用する利益があることを理解するたろう。
Fab#2−(HC)dsHLscFv#3(LC)dsHLscFv#4の相互作用に対する結合親和性および動的パラメーターは、CM5センサーチップ(GE Healthcare Bio−Sciences AB)およびHBS−EP(10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% v/v界面活性剤P20)ランニング緩衝液を使用して、BIAcore T100またはBIAcore 3000上で実施された表面プラズモン共鳴(SPR)によって決定された。全ての実験を25℃で実施した。抗体サンプルを、ヒトF(ab’)2特異的ヤギFab(Jackson ImmunoResearch)または社内で作製した抗ヒトCH1モノクロナール抗体のいずれかを使用して、センサーチップ表面に捕捉した。補足抗体の共有結合的固定は、6000〜7000応答単位(RU)のレベルに標準的なアミンカップリング化学によって達成された。
抗原#2、#3または#4は、捕捉抗体に対して別々に滴定された。各アッセイサイクルは、抗原の3分注入からなる会合相の前に、1分の注入を使用して、抗体サンプルを最初に捕捉することからなり、その後、解離が10分間モニターされた。各サイクルの後、捕捉表面は、40mM HClの2×1分注入、続いて、5mM NaOHの30sで再発生された。使用された流速は、捕捉に対して10μl分−1、会合および解離相に対して30μl分−1、および再発生に対して10μl分−1であった。動力学的パラメーターは、BIAcore T100 Evaluationソフトウェアv2.0.1またはBIAcore 3000 BIAEvaluation v3.2を使用して、標準1:1結合モデルに得られたセンサーグラムの同時のグローバルフィッテイングによって決定された。その結果を表15に示す。抗体は、試験された抗原についてpM−nM範囲内で予想される親和性を示した。
EXpiHEK細胞は、50mlスケールのエレクトロポレーション法によって関連するプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドは、表17に示されるように混合されて、タンパク質を発現した。培養物を、EXpiHEK発現培地中で増殖し、エンハンサー1および2の添加の前に、16〜18時間、120rpmで8%CO2で37℃でインキュベートした。その後、培養物を37℃で、さらに4日間、インキュベートした。培養物上清を、遠心分離および滅菌された0.22μmフィルターによって採取した。発現力価を、プロテインG HPLCによって測定した(表18)。
上清を、10kDa分子量カットオフ濃縮器を使用して、約2mlへと約25倍に濃縮した。濃縮した上清を、リン酸塩緩衝液pH7.4を使用して、プロテインG HPLCによって精製した。結合物質を0.1Mグリシン/HCLpH2.7で溶出し、pHを2M Tris/HCl pH8.5で約7.0に調整した。溶出された物質を10kDa分子量濃度計を使用して濃縮し、緩衝液をPBS中に交換した。精製したタンパク質を、PBS中約4〜5mg/mlに濃縮し、4℃で保存した。
サンプル(2μg)を、9.75μlの体積にPBSで希釈し、これに3.75μl 4×LDSサンプル緩衝液および1.5μl 100mM N−エチルマレイミド(非還元サンプル)または1.5μl 10×NuPAGE還元剤(還元サンプル)を添加した。サンプルをボルテックスし、70℃で10分間インキュベートし、冷却し、12500rpmで30秒間、遠心分離した。調製したサンプルを4〜20%アクリルアミドTris/グリシンSDSゲル上に充填し、約100分間、125V、一定電圧で流した。SeeBlue(Life Technologies)分子量ラダーを使用した。ゲルをInstant Blueタンパク質染色(Expedeon)で染色し、蒸留水で脱染した。
還元および非還元SDS−PAGE後の予想されるバンドサイズを、表19に示す。
全てのFab−2xscFvおよびFab−2xdsscFvタンパク質について、還元SDS−PAGEゲルは、コンストラクトが、移動位置および約50kDaでダブレットを有する染色強度の両方に関して正確に発現されたことを示すバンディングパターンを示した(図10B、a)。さらなる最上部マイナーバンドは、非還元全長タンパク質と一致する(図10B、b)。全てのタンパク質について、非還元ゲルは、約130kDaでバンドを示し、完全長タンパク質を示した(図10A、a)。非還元ゲル上で約50kDaのバンド(図10A、b)は、Fab領域の重および軽鎖の間の不完全なジスルフィド結合と一致し得る。
約5mg/lの精製抗体タンパク質を、分析前に24時間PBS中4℃で保存した。25μgの濃度に相当するサンプルを、TSK Gel G3000SWXL、7.8x300mmカラム(Tosoh)上に注入し、1ml/分で200mM リン酸塩 pH7.0のアイソクラチック勾配で展開した。シグナル検出は、280nmの吸光度で行った。結果を表20に示す。分析は、全てのFab−2xdsscFvタンパク質が、>90%単量体であったことを示した。一方、多量体化のより高い発生が、全てのFab−2xsFvについて検出された。Fvジスルフィドを有するscFvを含むフォーマットは、Fvジスルフィドを欠くscFvと比較してより単量体であることが明らかである。これは、安定した品質を有する治療用分子を選択することに関して、Fvジスルフィドを含むscFvを有するフォーマットを使用することが好ましいことを示し、また製造プロセスにおいて有利であると考えられる。
Claims (27)
- a)式(I):VH−CH1−X−V1のポリペプチド鎖;および
b)式(II):VL−CL−Y−V2のポリペプチド鎖
を含む、またはからなる多重特異性抗体分子であって、
ここで、VHは、重鎖可変ドメインを表し;
CH1は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン1を表し;
Xは、結合またはリンカーを表し;
Yは、結合またはリンカーを表し;
V1は、dsscFvを表し;
VLは、軽鎖可変ドメインを表し;
CLは、Cκなどの軽鎖定常領域からのドメインを表し;
V2は、dsscFvを表す、
多重特異性抗体分子。 - Xがリンカーである、請求項1に記載の多重特異性抗体分子。
- Yはリンカーである、請求項1または2のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
- VH/VL、V1及びV2の何れかが、抗原結合部位を形成し、VH/VL、V1及びV2の何れか1つのみが、血清担体タンパク質に特異性を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
- 前記血清担体タンパク質が、アルブミン、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α1酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノゲンおよびそれらの何れかの断片からなる群から選択される、請求項4に記載の多重特異性抗体分子。
- 前記血清担体タンパク質が、ヒト血清アルブミンであり、前記血清担体タンパク質に特異性を有するVH/VL、V1又はV2は、アルブミン結合部位を形成する、請求項4又は5に記載の多重特異性抗体分子。
- 前記アルブミン結合部位は、CDRH1のための配列番号71、CDRH2のための配列番号72、CDRH3のための配列番号73、CDRL1のための配列番号74、CDRL2のための配列番号75およびCDRL3のための配列番号76を含むか、或いは配列番号77および配列番号78から選択される重鎖可変ドメインおよび配列番号79および配列番号80から選択される軽鎖可変ドメインを含む、請求項6に記載の多重特異性抗体分子。
- 前記配列番号71〜76の6つのCDR、又は前記配列番号77〜80の可変ドメインは、VH/VL、V1、又はV2の位置にある、請求項7に記載の多重特異性抗体分子。
- 前記配列番号78の重鎖可変ドメインおよび前記配列番号80の軽鎖可変ドメインは、V2の位置にあり、前記V2の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインは、例えばペプチド結合を通じてYに結合している、請求項7又は8に記載の多重特異性抗体分子。
- 目的の2つ以上の異なる抗原に選択的に結合することができる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
- V1の軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインは、例えば、ペプチド結合を介して、Xに結合される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
- V2の軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインは、例えば、ペプチド結合を介して、Yに結合される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
- V1の軽鎖および重鎖可変ドメインおよび/またはV2の軽鎖および重鎖可変ドメインは、2つの改変されたシステイン残基の間のジスルフィド結合によって連結される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
- V1および/またはV2の重鎖および軽鎖可変ドメインは、2つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合され、ここで、システイン残基の対の位置は、VH37およびVL95、VH44およびVL100、VH44およびVL105、VH45およびVL87、VH100およびVL50、VH100bおよびVL49、VH98およびVL46、VH101およびVL46、VH105およびVL43、およびVH106およびVL57(Kabatによる番号付け)を含む、またはからなる群から選択され、ここで、VHおよびVL値は、所定のV1またはV2内で独立して選択される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
- 改変されたシステイン残基の対の位置は、VH44およびVL100である、請求項14に記載の多重特異性抗体分子。
- Xは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号1、2、69および70である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
- Yは、ペプチドリンカー、例えば、配列番号1、2、69および70である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
- 三重特異性である請求項1〜17のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
- 3つの結合ドメインは、異なる抗原に結合する、請求項18に記載の三重特異性抗体分子。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項20に記載のポリヌクレオチド(単数)またはポリヌクレオチド(複数)を含むベクター。
- それぞれ請求項20または21の1つ以上のベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子の異なるポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを各々含む2つまたは3つのベクターを含む宿主細胞。
- 請求項22または23に記載の宿主細胞からの多重特異性抗体分子を発現することを含む、抗体分子の製造方法。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子および少なくとも1つの賦形剤を含む医薬組成物。
- 治療に使用するための請求項25に記載の医薬組成物。
- 医薬組成物を調製するための、請求項1〜19のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子の使用。
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