JP2023551983A - インターロイキン－２２に対する抗体 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ＩＬ２２に結合し、その天然リガンドの１つ又は複数とのその相互作用を阻害する抗体に関する。そのような抗体の具体例が提供される。抗体の治療的使用及びそのような抗体を生成する方法も提供される。

Description

本発明は、抗ＩＬ２２抗体に関する。本明細書で提供されるそのような抗体は、皮膚炎症、特にアトピー性皮膚炎の治療に有用である。
アトピー性皮膚炎（ＡＤ）は、アトピー性湿疹としても公知であり、表皮機能障害及び肥厚、湿疹病変及び掻痒症をもたらす炎症状態である。この状態は、全ての年齢及び民族の人々に一般的であり、障害調整生存年数によって測定される全ての皮膚疾患の中で最大の疾患負荷を有する（Ｌａｕｇｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０２０；Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）。ＡＤは複雑な状態であり、その病態生理学は、遺伝的要因、環境的要因及び免疫学的要因等の複数の要因によって影響される。２型免疫機構はアトピー性皮膚炎の病態において重要であるが、証拠の増加はいくつかの免疫経路の役割を裏付けている。
ＡＤに使用される治療は、シクロスポリン、メトトレキサート、ミコフェノレートモフェチル及びアザチオプリン等の全身免疫抑制剤が含まれる。抗うつ薬及びナルトレキソンを使用して掻痒を制御することができる。２０１６年に、局所ホスホジエステラーゼ－４阻害剤であるクリサボロールが軽度から中等度の湿疹について承認され、２０１７年に、ＩＬ－４Ｒαのモノクローナル抗体アンタゴニストであるデュピルマブが中等度から重度の湿疹を治療することについて承認された。しかしながら、現在の治療選択肢は、一時的、不完全、症候性の軽減しかもたらさない。
ＩＬ２２は、環境状況に応じて、様々な炎症応答及び組織応答において複数の機能を有するＩＬ１０サイトカインファミリのメンバーである。ＩＬ２２は、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞、Ｔｈ１７細胞及びＴｈ２２細胞等のリンパ系細胞、γδ Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び自然リンパ系細胞（ＩＬＣ）３、並びに線維芽細胞、好中球、マクロファージ及び肥満細胞等の非リンパ系細胞によって主に産生される（概要については、Ｌａｎｆｒａｎｃａ ＭＰ，ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（Ｂｅｒｌ）（２０１６）９４（５）：５２３－５３４を参照されたい）。ＩＬ２２は、ＩＬ２２受容体１（ＩＬ２２ＲＡ１又はインターロイキン－２２受容体サブユニットα－１としても知られるＩＬ２２Ｒ１）及びＩＬ－１０受容体２（ＩＬ１０Ｒ２）から構成されるヘテロ二量体膜貫通受容体複合体を介してシグナル伝達し、ＩＬ－１０は、ＩＬ１０Ｒ１及びＩＬ－１０Ｒ２を介してシグナル伝達する。ＩＬ－１０ファミリの他のメンバーと同様に、ＩＬ２２は、Ｊａｋ１、Ｔｙｋ２及びＳＴＡＴ３を含むＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ－１０Ｒ２複合体及びその後のＪＡＫ－シグナル伝達及び転写活性化因子（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＳＴＡＴ）シグナル伝達経路を介してその効果を媒介する。ＩＬ－１０とは対照的に、ＩＬ２２は、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ及びｐ３８等の多数のＭＡＰＫ経路を介してシグナル伝達することも報告されている。皮膚において、ＩＬ２２は、これらの細胞上に発現したＩＬ２２Ｒ１への結合を介してケラチノサイトに作用する。
ＩＬ１０サイトカインファミリの他のメンバーとは異なり、ＩＬ２２は、ＩＬ２２結合タンパク質（ＩＬ２２ＲＡ２又はインターロイキン－２２受容体サブユニットα２としても知られるＩＬ２２ＢＰ）として知られる可溶性分泌受容体を有する。ＩＬ２２ＢＰはＩＬ２２Ｒ１鎖と最も高い構造相同性を共有するが、ＩＬ２２ＢＰはＩＬ２２Ｒ１よりもＩＬ２２に対してはるかに高い親和性を示し、したがってＩＬ２２がＩＬ２２Ｒ１に結合するのを妨げる。
ＩＬ２２に特異的なＩＬ２２ＢＰは、その活性を遮断することが示されている。総ＩＬ２２の阻害は、重度のアトピー性皮膚炎患者又は高いベースラインＩＬ２２発現を有する患者において有効なシグナルを示した（Ｇｕｔｔｍａｎ－Ｙａｓｓｋｙ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１８；７８（５）：８７２－８８１ ａｎｄ Ｂｒｕｎｎｅｒ ＰＭ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１４３（１）：１４２－１５４）。ＩＬ２２Ｒ１の阻害は、ＩＬ－２０及びＩＬ－２４の効果も部分的に遮断するＩＬ２２を阻害する潜在的な治療選択肢としても提案されている。現在までのところ、ＩＬ２２ＢＰに結合していない生物学的に活性なＩＬ２２を特異的に標的とし、したがってＩＬ２２ＢＰの正常な生物学的機能に影響を及ぼさないように設計された治療選択肢は存在しない。
Ｔｈ２２サイトカインＩＬ２２の発現上昇は、アトピー性皮膚炎（ＡＤ）における特徴的な所見である。しかしながら、インビボでのＡＤの病因におけるＩＬ２２の具体的な役割は完全には理解されていない。ＡＤの発症及び維持におけるＩＬ２２の役割は具体的には検討されていないが、皮膚バリア機能、免疫調節不全及び掻痒症を損なうことによって、ＩＬ２２がＡＤの発症において重要な役割を果たすと仮定されている。
米国特許第８９０６３７５号及び米国特許第７９０１６８４号は、ＩＬ２２に結合する抗体及びＡＤの治療におけるそのような抗体の有用性を開示している。米国特許第７７３７２５９号は、乾癬の治療に有用な特異的抗ＩＬ２２抗体を開示している。
本発明は、本明細書中に記載されるような機能的特性及び構造的特性を有する抗ＩＬ－２２抗体を提供することによって、アトピー性皮膚炎の新たな治療の必要性に対処する。
本発明は、ヒトインターロイキン２２（ＩＬ２２）に結合する単離された抗体を提供し、抗体は、ＩＬ２２受容体１（ＩＬ２２Ｒ１）及びＩＬ２２結合タンパク質（ＩＬ２２ＲＡ２）へのＩＬ２２結合を阻害又は減弱することができる。
本発明はまた、特異的ＣＤＲ配列及び／又は可変領域配列のセットによって定義されるヒトＩＬ２２に結合する単離された抗体を提供する。
本発明を、以下の図面を参照して以下に説明する。
抗体１１０４１軽鎖のヒト化を示す図である。その鎖について生成された変異体も示されている。ＣＤＲ配列には下線が引かれている。
抗体１１０４１の重鎖のヒト化を示す図である。その鎖について生成された変異体も示されている。ＣＤＲ配列には下線が引かれている。
抗体１１０７０軽鎖のヒト化を示す図である。その鎖の変異体も示されている。ＣＤＲ配列には下線が引かれている。 抗体１１０７０重鎖のヒト化を示す図である。その鎖について生成された変異体も示されている。ＣＤＲ配列には下線が引かれている。
ＨＤＸ－ＭＳ実験のＩＬ２２ペプチドカバレッジマップを示す図である。
１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ＦａｂのＨＤＸ－ＭＳ分析の結果を示す図である。（Ａ）抗体結合時に有意に低下した重水素取込みを示すペプチドを列挙する。抗体の存在下及び非存在下で類似の交換パターンを示すペプチドは、有意でない重水素取込みを有し、薄い灰色で示される。（Ｂ）決定された１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ＦａｂエピトープをＩＬ２２ ３Ｄ構造上に投影し、黒色で強調する。参照のために、Ｘ線データからのＩＬ２２に対する相対的な１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４Ｆａｂ結合を表示する。
１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ＦａｂのＨＤＸ－ＭＳ分析の結果を示す図である。（Ａ）抗体結合時に有意に低下した重水素取込みを示すペプチドを列挙する。抗体の存在下及び非存在下で類似の交換パターンを示すペプチドは、有意でない重水素取込みを有し、薄い灰色で示される。（Ｂ）１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ＦａｂエピトープがＩＬ２２ ３Ｄ構造上に投影され、黒色で強調されると決定される。
ＩＬ２２に結合する１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ ＦａｂのＸ線分析の結果を示す図である。（Ａ）ＩＬ－２２に結合する１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４Ｆａｂのイラスト表示。（Ｂ）ＩＬ－２２と１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂとの間の相互作用界面に関する詳細図。
１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ分子が、その受容体ＩＬ２２Ｒ１（ＰＤＢ：３ＤＬＱ）との複合体においてＩＬ２２とＩＬ２２Ｒ１受容体（Ａ）ＩＬ－２２との相互作用（表面表示）を妨げることを示す図である。 １１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ軽鎖の軽鎖は、ＩＬ２２とＩＬ２２Ｒ１との間の相互作用部位を遮断する。
フェザキヌマブ及びＦａｂフォーマットの１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ（ＶＲ１１０７０）と複合体を形成したＩＬ－２２のＣｒｙｏ－ＥＭ構造を示す図である。 フェザキヌマブ及び１１０４１Ｆａｂとの複合体におけるＩＬ－２２のモデル（ＶＲ１１０４１）の図である。パネル（Ａ）のｃｒｙｏ－ＥＭ構造上にＩＬ－２２／１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ結晶構造を重ねることによってモデルを作成した。これは、１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ及び１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ ＦａｂがＩＬ－２２上に類似のエピトープを有することを明らかにする。
１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ及びフェザキヌマブＦａｂとの複合体におけるＩＬ－２２のｃｒｙｏ－ＥＭ構造上の、ＩＬ－２２に結合したＩＬ－２２Ｒ１の結晶構造の重ね合わせを示す図である。 ＩＬ－１０Ｒ２との相互作用に寄与することが知られているＩＬ－２２残基の側鎖が棒として示されている。この部位は、フェザキヌマブＦａｂ分子によって占められている。
インビトロヒト初代ケラチノサイトアッセイにおける１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ（ＶＲ１１０４１）活性を示す図である。（Ａ）アッセイにおけるＳ１００Ａ７応答の例。ドナーロット番号４３８Ｚ０１４、幾何平均ｎ＝３／６、刺激：１００ｎｇ／ｍｌにおけるＩＬ－２２、フェザキヌマブＦａｂ及び５０ｎＭにおける１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４Ｆａｂ；（Ｂ）アッセイにおける１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ ＦａｂによるＳ１００Ａ７の阻害率。平均±ＳＤ、ｎ＝２名のドナー、刺激：１００ｎｇ／ｍｌにおけるＩＬ－２２、統計：ｌｏｇ（阻害剤）ｖｓ応答（３つのパラメータ）。
定義
以下の用語は、本明細書全体を通して使用される。
「受容体ヒトフレームワーク」という用語は、本明細書では、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークとして使用される。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する受容体ヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得るか、又はアミノ酸配列変化を含み得る。
「親和性」という用語は、その抗体と標的タンパク質との間の全ての非共有結合相互作用の強度を指す。別途示される場合を除き、本明細書中で使用されるとき、用語「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。その結合パートナーに対する分子の親和性は、一般に解離定数（ＫＤ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。
抗体の文脈における「親和性成熟」という用語は、そのような変化を有さない親抗体と比較して、超可変領域に１つ又は複数の変化を有する抗体を指し、そのような変化は、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす。
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び多重特異性抗体を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。本明細書で使用される抗体という用語は、全（全長）抗体（すなわち、２つの重鎖及び２つの軽鎖の要素を含む）及びその機能的に活性なフラグメント（すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む分子（抗体フラグメント又は抗原結合フラグメントとも呼ばれる））に関する。抗体に関して本明細書に記載される特徴は、文脈が特に指示しない限り、抗体フラグメントにも適用される。抗体は、２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含み得、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、同じ又は異なる標的（例えば、治療標的に結合する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖ、及び例えばアルブミンに結合することによって半減期を延長する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖ）に結合する。そのような抗体は、国際公開第２０１５／１９７７７２号に記載されている。「抗体」という用語は、一価、すなわち、ただ１つの抗原結合ドメイン（例えば、完全長重鎖と、「半抗体」とも呼ばれる相互接続された完全長軽鎖とを含む１アーム抗体）を含む抗体、及び多価抗体、すなわち２つ以上の抗原結合ドメインを含む抗体、例えば二価抗体を包含する。
「参照抗体と同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体とその抗原との結合を５０％以上遮断する抗体を指し、逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体とその抗原との結合を５０％以上遮断する。
「抗体依存性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」という用語は、抗体でコーティングされた標的細胞と、エフェクター細胞上に発現されるＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を介したナチュラルキラー細胞、単球、マクロファージ及び好中球等の溶解活性を有するエフェクター細胞との相互作用に依存する細胞死を誘導する機構である。
用語「抗原結合フラグメント」は、本明細書中で用いる場合、機能的に活性な抗体結合フラグメントを指し、限定されないが、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、二価抗体、三価抗体又は四価抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６－１１３６；Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ ２（３），２０９－２１７を参照されたい）。本明細書で使用される「結合フラグメント」は、ペプチド又は抗原に特異的であるとしてフラグメントを特徴付けるのに十分な親和性で標的ペプチド又は抗原に結合することができるフラグメントを指す。
「抗体変異体」という用語は、ポリペプチド、例えば、本明細書に記載の所望の特徴を有し、参照抗体のＶＨ及び／又はＶＬと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＶＨ及び／又はＶＬを含む抗体を指す。そのような抗体変異体には、例えば、１つ又は複数のアミノ酸残基がＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインに付加されるか、又はＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインから欠失される抗体が含まれる。通常、抗体変異体は、本明細書に記載の抗体と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。場合により、変異体抗体は、本明細書中に提供される抗体配列と比較して１個以下の保存的アミノ酸置換を有し、あるいは、本明細書中に提供される抗体配列と比較して約２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個以下の保存的アミノ酸置換のいずれかを有するであろう。実施形態では、「抗体変異体」は、ＶＨ及び／又はＶＬを含む抗体又はその抗原結合フラグメントを指し、抗体又はその抗原結合フラグメントの非ＣＤＲ領域は、本明細書に記載の抗体と少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、標的抗原と特異的に相互作用する１つ又は複数の可変ドメインの一部又は全部、例えば一対の可変ドメインＶＨ及びＶＬの一部又は全部を含む抗体の一部を指す。本発明の文脈において、この用語は、３つの異なる抗原：ＩＬ１３、ＩＬ２２、及びアルブミンに関連して使用される。したがって、そのような抗原結合ドメインは、「ＩＬ１３結合ドメイン」、「ＩＬ２２結合ドメイン」、及び「アルブミン結合ドメイン」と呼ばれる。結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含み得る。各結合ドメインは一価であり得る。各結合ドメインは、１つ以下のＶＨ及び１つのＶＬを含み得る。
本明細書で使用される「二重特異性」又は「二重特異性抗体」という用語は、２つの抗原特異性を有する抗体を指す。
「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、一般に、抗体が６つのＣＤＲ：ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬに３つ（Ｌ１，Ｌ２，Ｌ３）を含むことを指す。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基３１～３５（ＣＤＲ－Ｈ１）、残基５０～６５（ＣＤＲ－Ｈ２）及び残基９５～１０２（ＣＤＲ－Ｈ３）に位置する。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１－９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ－Ｈ１と等価なループは、残基２６から残基３２まで延びる。したがって、特に指示しない限り、本明細書で使用される「ＣＤＲ－Ｈ１」は、ＫａｂａｔナンバリングシステムとＣｈｏｔｈｉａのトポロジカルループ定義との組合せによって記載される残基２６～３５を指すことが意図される。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４～３４（ＣＤＲ－Ｌ１）、残基５０～５６（ＣＤＲ－Ｌ２）及び残基８９～９７（ＣＤＲ－Ｌ３）に位置する。別段示されない限り、可変ドメイン中のＣＤＲ残基及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、本明細書ではＫａｂａｔに従ってナンバリングされる。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の可変ドメイン（又はその少なくとも一部）が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分（すなわち、定常ドメイン）が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ；ＰＮＡＳ８１，６８５１（１９８４））．キメラ抗体は、例えば、非ヒト可変ドメイン及びヒト定常ドメインを含むことができる。キメラ抗体は、典型的には、組換えＤＮＡ法を用いて産生される。「キメラ抗体」のサブカテゴリは「ヒト化抗体」である。
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更に分割され得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」という用語は、標的結合抗体のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合してこれを活性化し、次いで補体成分Ｃ１ｑが補体カスケードを活性化して標的細胞死をもたらす、細胞死を誘導する機構を指す。
本明細書で使用される「定常ドメイン（複数可）」又は「定常領域」という用語は、可変領域の外側にある抗体のドメイン（複数可）を指すために交換可能に使用される。定常ドメインは、同じアイソタイプの全ての抗体において同一であるが、アイソタイプごとに異なる。典型的には、重鎖の定常領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、３つ又は４つの定常ドメインを含むＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－場合によりＣＨ４によって形成される。
「競合抗体」又は「交差競合抗体」という用語は、特許請求される抗体が、（ｉ）参照抗体が結合する抗原上の同じ位置、又は（ｉｉ）抗体が抗原への参照抗体の結合を立体的に妨げる抗原上の位置のいずれかに結合することを意味すると解釈されるものとする。
本明細書で使用される用語「誘導体」は、反応性誘導体、例えば、マレイミド等のチオール選択的反応基を含むことを意図している。反応性基は、ポリマーに直接又はリンカーセグメントを介して連結されていてもよい。そのような基の残基は、場合によっては、抗体フラグメントとポリマーとの間の連結基として生成物の一部を形成することが理解されるであろう。
可変配列を生成する文脈における「由来する」という用語は、使用される配列又は使用される配列に非常に類似する配列が、抗体の軽鎖又は重鎖等の元の遺伝物質から得られたという事実を指す。
本明細書で使用される「ダイアボディ」という用語は、第１のＦｖのＶＨが第２のＦｖのＶＬに連結され、第１のＦｖのＶＬが第２のＦｖのＶＨに連結されるように、２つのＦｖ間リンカーを有する２つのＦｖ対、第１のＶＨ／ＶＬ対及び更なるＶＨ／ＶＬ対を指す。
本明細書で使用される「ＤｉＦａｂ」という用語は、重鎖のＣ末端を介して連結された２つのＦａｂ分子を指す。
本明細書で使用される「ＤｉＦａｂ’」という用語は、そのヒンジ領域内の１つ又は複数のジスルフィド結合を介して連結された２つのＦａｂ’分子を指す。
本明細書で使用される「ｄｓｓｃＦｖ」又は「ジスルフィド安定化一本鎖可変フラグメント」という用語は、ＶＨ及びＶＬ可変ドメイン間のペプチドリンカーによって安定化され、ＶＨとＶＬとの間のドメイン間ジスルフィド結合も含む一本鎖可変フラグメントを指す（例えば、Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５（３２１－３２９），２０１２、国際公開第２００７１０９２５４号を参照されたい）。
「ＤＶＤ－Ｉｇ」（二重ＶドメインＩｇＧとしても知られる）という用語は、各重鎖及び各軽鎖のＮ末端に１つずつ、４つの更なる可変ドメインを有する完全長抗体を指す。
「エフェクター機能」という用語は、抗体アイソタイプによって異なる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞活性化が含まれる。
本明細書で使用される場合、「エフェクター分子」という用語は、例えば、抗新生物剤、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体フラグメント、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びそのフラグメント、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子及びレポーター基、例えば蛍光化合物又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物を含む。
抗体の文脈における「エピトープ」又は「結合部位」という用語は、抗体のパラトープが結合又は認識する抗原上の部位（又は部分）を指す。エピトープは、連続したアミノ酸（「線状エピトープ」と呼ばれることも多い）又はタンパク質の三次折り畳みによって形成された不連続なアミノ酸（「立体構造エピトープ」と呼ばれることも多い）の両方から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒への曝露時に保持されるが、折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒での処理時に失われる。エピトープは、典型的には、固有の空間的配座で少なくとも３個、より一般的には少なくとも５～１０個のアミノ酸を含む。エピトープは、通常、アミノ酸、糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の３Ｄ構造及び電荷特性を有する。
「ＥＵインデックス」又は「ＫａｂａｔのようなＥＵインデックス」又は「ＥＵナンバリングスキーム」は、ＥＵ抗体のナンバリングを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５）。これは、一般に、抗体重鎖定常領域の残基を指す場合に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に報告されているように）。特に明記しない限り、ＥＵナンバリングスキームは、本明細書に記載の抗体重鎖定常領域中の残基を指すために使用される。
本明細書で使用される「Ｆａｂ」という用語は、軽鎖のＶＬ（可変軽鎖）ドメイン及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖フラグメント、並びに重鎖のＶＨ（可変重鎖）ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体フラグメントを指す。本開示によるＦａｂ’の二量体はＦ（ａｂ’）２を生成し、ここで、例えば、二量体化はヒンジを介してもよい。
本明細書で使用される「Ｆａｂ’－Ｆｖ」という用語は、ＦａｂＦｖに類似しており、Ｆａｂ部分がＦａｂ’に置き換えられている。フォーマットは、そのＰＥＧ化バージョンとして提供され得る。
本明細書で使用される「Ｆａｂ’－ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖又は重鎖のＣ末端にｓｃＦｖが付加されたＦａｂ’分子である。
本明細書で使用される「Ｆａｂ－ｄｓＦｖ」という用語は、Ｆｖ内ジスルフィド結合が添付のＣ末端可変領域を安定化するＦａｂＦｖを指す。フォーマットは、そのＰＥＧ化バージョンとして提供され得る。
本明細書で使用される「Ｆａｂ－Ｆｖ」という用語は、以下の重鎖のＣＨ１及び軽鎖のＣＬのそれぞれのＣ末端に可変領域が付加されたＦａｂフラグメントを指す。フォーマットは、そのＰＥＧ化バージョンとして提供され得る。
本明細書で使用される「Ｆａｂ－ｓｃＦｖ」という用語は、軽鎖又は重鎖のＣ末端にｓｃＦｖが付加されたＦａｂ分子である。
用語「Ｆｃ」、「Ｆｃフラグメント」、及び「Ｆｃ領域」は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含む抗体のＣ末端領域を指すために互換的に使用される。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＧの最後の２つの定常ドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３、又はＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常ドメイン、並びにこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ヒトＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域は、本明細書において、残基Ｃ２２６からそのカルボキシル末端までを含むと定義され、ナンバリングはＥＵインデックスに従う。ヒトＩｇＧ１の文脈において、ＥＵインデックスに従って、下側ヒンジは、位置２２６～２３６を指し、ＣＨ２ドメインは、位置２３７～３４０を指し、ＣＨ３ドメインは、位置３４１～４４７を指す。他の免疫グロブリンの対応するＦｃ領域は、配列アラインメントによって同定することができる。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」という用語は、超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）において以下の配列で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。
本明細書で使用される「全長抗体」という用語は、天然の抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。各重鎖は、Ｉｇクラスに応じて、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、又は４つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４で構成される重鎖定常領域（ＣＨ）と、から構成される。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
用語「Ｆｖ」は、全長抗体の２つの可変ドメイン、例えば、同族対又は親和性成熟可変ドメイン、すなわちＶＨ及びＶＬ対等の協同可変ドメインを指す。
アミノ酸配列の文脈で使用される「非常に類似している」という用語は、その全長にわたって、９６、９７、９８又は９９％の類似等、９５％以上類似しているアミノ酸配列を指すことを意図している。
「ヒト抗体」という用語は、ヒト若しくはヒト細胞によって産生されるか、又はヒト抗体レパートリ若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体のこの定義は、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」という用語は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において最も一般的に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークを指す。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループに由来する。一般に、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ．のようなサブグループである。１－３．いくつかの実施形態では、ＶＬについて、サブグループは、上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．のようにサブグループｋａｐｐａ Ｉである。いくつかの実施形態では、ＶＨについて、サブグループは、のようにサブグループＩＩＩである。いくつかの実施形態では、ＶＨについて、サブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．のようにサブグループＩＶである。
「ヒト化」抗体という用語は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。典型的には、重鎖及び／又は軽鎖は、ドナー抗体（例えば、マウス又はウサギモノクローナル抗体等の非ヒト抗体）由来の１つ又は複数のＣＤＲ（所望であれば、１つ又は複数の修飾ＣＤＲを含む）を含み、受容体抗体（ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフトされる（例えば、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，５３５－５３９，１９９８を参照のこと）。そのようなヒト化抗体の利点は、親非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させることである。全ＣＤＲが移されるのではなく、本明細書中上記で記載されるＣＤＲのいずれか１つに由来する特異性決定残基のうち１つ又は複数のみがヒト抗体フレームワークに移入され得る（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉｅｔａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５－３４を参照）。「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び／又は構造的に明確なループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体可変ドメインの各領域を指す。
本明細書で使用される「ＩＣ５０」という用語は、特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する際の抗体等の物質の有効性の尺度である最大半量阻害濃度を指す。ＩＣ５０は、所与の生物学的プロセスを５０％阻害するために特定の物質がどれだけ必要であるかを示す定量的尺度である。
配列中のアミノ酸間の「同一性」は、整列した配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。
本明細書で使用される「ＩｇＧ－ｓｃＦｖ」という用語は、各重鎖又は各軽鎖のＣ末端にｓｃＦｖを有する完全長抗体である。
本明細書で使用される「ＩｇＧ－Ｖ」という用語は、各重鎖又は各軽鎖のＣ末端に可変ドメインを有する完全長抗体である。
「単離された」という用語は、本明細書を通して、場合によっては、抗体又はポリヌクレオチドが、自然界で生じ得るものとは異なる物理的環境に存在することを意味する。「単離された」核酸という用語は、その自然環境から単離されたか、又は合成的に作製された核酸分子を指す。単離された核酸は、例えば化学処理によって生成された合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらの任意の組合せを含み得る。
「Ｋａｂａｔ残基指定」又は「Ｋａｂａｔ」という用語は、抗体に一般的に使用される残基番号付けスキームを指す。これは、アミノ酸残基の線形ナンバリングと常に直接対応するとは限らない。実際の線状アミノ酸配列は、基本可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域（ＣＤＲ）にかかわらず、構造成分の短縮又は構成成分への挿入に対応する厳密なＫａｂａｔナンバリングよりも少ないか、又は追加のアミノ酸を含み得る。残基の正しいＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基と「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリング配列とのアラインメントによって、所与の抗体について決定され得る。詳細については、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）を参照されたい。別段の指示がない限り、Ｋａｂａｔのナンバリングは本明細書全体にわたって使用される。
本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａ（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）の比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。Ｋｄ及びＫａは、それぞれ特定の抗原－抗体相互作用の解離速度及び会合速度を指す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。
「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、モノクローナル抗体調製物の各個体は、少量存在し得る可能性のある変異（例えば、天然に存在する突然変異）を除いて同一である。それにもかかわらず、翻訳後修飾（例えば、重鎖Ｃ末端リジンの切断、アスパラギン残基の脱アミド化及び／又はアスパルタート残基の異性化）に連結されたタンパク質配列の一定の違いは、組成物中に存在する様々な異なる抗体分子間に存在し得る。ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
本明細書で使用される「マルチパラトピック抗体」という用語は、同じ抗原又は２つの異なる抗原のいずれかからの異なるエピトープと相互作用する２つ以上の異なるパラトープを含む本明細書に記載の抗体を指す。本明細書中に記載されるマルチパラトープ抗体は、ビパラトピック、トリパラトピック、テトラパラトピックであり得る。
本明細書で使用される「多重特異性」又は「多重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの結合ドメイン、すなわち２つ以上の結合ドメイン、例えば２つ又は３つの結合ドメインを有する本明細書に記載の抗体を指し、少なくとも２つの結合ドメインは、同じ抗原上の２つの異なる抗原又は２つの異なるエピトープに独立して結合する。多重特異性抗体は、一般に、各特異性（抗原）に対して一価である。本明細書に記載される多重特異性抗体は、一価及び多価、例えば二価、三価、四価の多重特異性抗体を包含する。
抗体の文脈における「中和すること」（又は「中和する」）という用語は、その標的（標的タンパク質）の生物学的シグナル伝達活性を阻害又は減衰することができる抗体を表す。
「パラトープ」という用語は、抗原を認識し、結合する抗体の領域を指す。
ポリペプチド及び抗体配列に関する「配列同一性（又は類似性）パーセント（％）」という用語は、最大パーセント配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮せずに、比較されるポリペプチド中のアミノ酸残基と同一（又は類似）である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
「ポリクローナル抗体」という用語は、抗原の２つ以上のエピトープに結合する（又は他の方法で相互作用する）異なる抗体分子の混合物を指す。
抗体の文脈における「予防する」という用語は、本明細書では「阻害する」という用語と互換的に使用され、本発明による抗体が特定の生物学的プロセス又は分子相互作用に関して有する効果を示す。
「ｓｃダイアボディ」という用語は、分子が３つのリンカーを含み、ＶＨ及びＶＬ末端がそれぞれ更なるＦｖ対の可変領域の１つに連結されている正常なｓｃＦｖを形成するように、Ｆｖ内リンカーを含むダイアボディを指す。
本明細書で使用される「Ｓｃｄｉａｂｏｄｙ－ＣＨ３」という用語は、例えばヒンジを介してＣＨ３ドメインにそれぞれ連結された２つのｓｃダイアボディ分子を指す。
「Ｓｃダイアボディ－Ｆｃ」という用語は、本明細書で用いる場合、２つのｓｃダイアボディであり、それぞれが、例えばヒンジを介して、定常領域フラグメント－ＣＨ２ＣＨ３のＣＨ２ドメインのＮ末端に付加されている。
本明細書で使用される「一本鎖可変フラグメント」又は「ｓｃＦｖ」という用語は、ＶＨ可変ドメインとＶＬ可変ドメインとの間のペプチドリンカーによって安定化された一本鎖可変フラグメントを指す。
本明細書で使用される「ＳｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ」という用語は、４つのｓｃＦｖを指し、それぞれの１つがＣＨ２ＣＨ３フラグメントの両方の重鎖のＮ末端及びＣ末端に付加されている。
本明細書で使用される「ｓｃＦｖ－ＩｇＧ」という用語は、各重鎖又は各軽鎖のＮ末端にｓｃＦｖを有する完全長抗体である。
本明細書で使用される用語「類似度」は、整列した配列の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似のタイプであることを示す。例えば、イソロイシン又はバリンの代わりにロイシンを用いてもよい。互いに置換され得る他のアミノ酸としては、限定されないが、以下が挙げられる。
－フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
－リジン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
－アスパルタート及びグルタマート（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
－アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
－システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）。
本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」という用語は、単一の単量体可変ドメインからなる抗体フラグメントを指す。単一ドメイン抗体の例としては、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ又はＶ－ＮＡＲが挙げられる。
抗体の文脈で本明細書で用いられる用語「特異的」とは、それが特異的である抗原のみを認識する抗体、又はそれが非特異的である抗原への結合と比較して、それが特異的である抗原に対して有意に高い結合親和性、例えば少なくとも５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性を有する抗体を指すことを意図する。
本明細書で使用される「立体的ブロッキング」又は「立体的に防止する」という用語は、第１のタンパク質への第３のタンパク質の結合によって第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を遮断する手段を指すことを意図している。第１のタンパク質と第３のタンパク質との間の結合は、第２のタンパク質と第３のタンパク質との間の好ましくないファンデルワールス相互作用又は静電相互作用に起因して、第２のタンパク質が第１のタンパク質に結合するのを妨げる。
治療及び診断の文脈における「対象」又は「個体」という用語は、一般に哺乳動物を指す。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサル）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、個体又は対象はヒトである。
本明細書で使用される「タンデムｓｃＦｖ」という用語は、単一のＦｖ間リンカーが存在するように単一のリンカーを介して連結された少なくとも２つのｓｃＦｖを指す。
本明細書で使用される「タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ」という用語は、少なくとも２つのタンデムｓｃＦｖを指し、それぞれが、例えばヒンジを介して、定常領域フラグメント－ＣＨ２ＣＨ３のＣＨ２ドメインのＮ末端に付加される。
本明細書で使用される「標的」又は「抗体標的」という用語は、抗体が結合する標的抗原を指す。
本明細書で使用される「テトラボディ」という用語は、４つのＦｖ及び４つのＦｖ間リンカーを含むダイアボディと同様のフォーマットを指す。
「治療有効量」という用語は、疾患を治療するために対象に投与された場合に、疾患のそのような治療をもたらすのに十分なその抗体の量を指す。治療有効量は、抗体、疾患及びその重症度並びに治療される対象の年齢、体重等に応じて変化する。
本明細書で使用される「トリボディ」（Ｆａｂ（ｓｃＦｖ）２とも呼ばれる）という用語は、軽鎖のＣ末端に第１のｓｃＦｖが付加され、重鎖のＣ末端に第２のｓｃＦｖが付加されたＦａｂフラグメントを指す。
本明細書で使用される「三重特異性又は三重特異性抗体」という用語は、３つの抗原結合特異性を有する抗体を指す。例えば、抗体は、３つの異なる抗原又は同じ抗原上の３つの異なるエピトープに独立して結合する３つの抗原結合ドメイン（三価）を有する抗体であり、すなわち、各結合ドメインは各抗原に対して一価である。三重特異性抗体フォーマットの例の１つはＴｒＹｂｅである。
「予防する」又は「予防」等の用語は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防するという点で予防効果を得ることを指す。したがって、予防することは、疾患に罹りやすい可能性があるが、疾患を有するとまだ診断されていない対象において疾患が生じるのを止めることを包含する。
「治療」、「治療すること」等の用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患の部分的又は完全な治癒及び／又は疾患に起因する有害作用に関して治療的であり得る。したがって、治療は、（ａ）疾患を阻害すること、すなわち、その発生を停止させること；（ｂ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患の退縮を引き起こすことを包含する。
本明細書で使用される「ＴｒＹｂｅ」という用語は、本明細書で使用される２つのｄｓｓｃＦｖｓ．ｄｓＦａｂを含むトリボディを指し、可変領域内ジスルフィド結合を有するＦａｂを指す。
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。完全長の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインは、一般に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つのＣＤＲを含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい）単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって以下の順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。ＣＤＲ及びＦＲは共に可変領域を形成する。慣例により、抗体の重鎖可変領域中のＣＤＲは、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と呼ばれ、軽鎖可変領域中のＣＤＲはＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と呼ばれる。それらは、各鎖のＮ末端からＣ末端の方向に連続して番号付けされる。ＣＤＲは、従来、Ｋａｂａｔによって考案されたシステムに従ってナンバリングされる。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。「ベクター」という用語は、「発現ベクター」を含む。
「ＶＨ」という用語は、重鎖の可変ドメイン（又は配列）を指す。
本明細書で使用される「Ｖ－ＩｇＧ」という用語は、各重鎖又は各軽鎖のＮ末端に可変ドメインを有する完全長抗体である。
「ＶＬ」という用語は、軽鎖の可変ドメイン（又は配列）を指す。
インターロイキン２２（ＩＬ２２）
「インターロイキン－２２」又は「ＩＬ２２」という用語は、ＩＬ２２Ｒ１（ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２２受容体１又はインターロイキン－２２受容体サブユニットα－１としても知られている）及び／又はＩＬ２２Ｒ１とＩＬ１０ＲＡ２との受容体複合体（ＩＬ２２ＢＰ、ＩＬ２２結合タンパク質、又はインターロイキン－２２受容体サブユニットα２としても知られている）に結合することができるクラスＩＩサイトカインを指す。ＩＬ２２は、インターロイキン－１０関連Ｔ細胞由来誘導因子（ＩＬ－ＴＩＦ）としても知られている。この用語は、天然に存在するか、又は内因性の哺乳動物ＩＬ２２タンパク質、及び天然に存在するか、又は内因性の対応する哺乳動物ＩＬ２２タンパク質（例えば、組換えタンパク質、合成タンパク質）のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。したがって、本明細書で定義される場合、この用語は、成熟ＩＬ２２タンパク質、多型又は対立遺伝子変異体、及びＩＬ２２の他のアイソフォーム（例えば、選択的スプライシング又は他の細胞プロセスによって産生される）、並びに上記の改変形態又は非改変形態（例えば、脂質付加、グリコシル化）を含む。天然に存在する又は内因性のＩＬ２２としては、野生型タンパク質、例えば成熟ＩＬ２２、多型又は対立遺伝子変異体、並びに哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類）において天然に存在する他のアイソフォーム及び変異型が挙げられる。これらのタンパク質及び天然又は内因性の対応するＩＬ２２と同じアミノ酸配列を有するこれらのタンパク質は、対応する哺乳動物の名称で呼ばれる。
成熟ヒトＩＬ２２のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸３４～１７９に対応する。組換えヒトＩＬ２２の分析は、多くの構造ドメインを明らかにする。（Ｎａｇｅｍ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１０：１０５１－６２；；米国特許出願公開第２００２／０１８７５１２号）。
ＩＬ２２に結合する抗体
本発明は、ＩＬ２２（標的ポリペプチド）に結合し、本明細書中に更に記載されるような機能的特性及び構造的特性を有する抗ＩＬ２２抗体を提供する。
本開示は、ＩＬ２２に結合する抗体を同定する方法を提供し、当該方法は、
ａ）動物にヒトＩＬ２２を免疫することと、
ｂ）当該動物から生成された抗ＩＬ２２抗体を単離することと、
ｃ） ｉ．ヒト及びカニクイザルＩＬ２２の両方に結合し、
ｉｉ．ＩＬ２２誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化又はＩＬ２２依存性ＩＬ－１０放出を中和し、
ｉｉｉ．ヒトＩＬ２２に結合し、ＩＬ２２Ｒ１の結合を防止する、
抗ＩＬ２２抗体を選択することと、
を含む。
マウス、ラット及びウサギを含む任意の適切な動物を抗ＩＬ２２抗体の作製に使用してもよい。ＩＬ２２への結合及び交差結合測定は、当業者に公知の技術を使用して実施され得る。同定された抗体の中和活性の測定には、標準的なアッセイが利用可能である。そのようなアッセイの例は、本明細書中の例において提供される。
本発明の文脈における抗体には、全抗体及び機能的に活性な抗体フラグメント（すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインを含む分子（抗原結合フラグメントとも呼ばれる））が含まれる。本明細書中に記載される特徴は、文脈が別途指示しない限り、抗体フラグメントにも適用される。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、多価、多重特異性、二重特異性、完全ヒト、ヒト化、又はキメラであり得る（又はそれらに由来し得る）。
参照及び例示のみを目的として更に記載される抗体は、本発明の範囲を限定するものではない。
本発明に従って使用される抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明に従って使用される抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体（例えば、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含むＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、任意の適切な受容体可変領域フレームワーク配列を使用することができる）、ナノボディ、ヒト又はヒト化抗体であり得る。モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方の産生のために、そのような抗体を産生するために使用される動物は、典型的には、ヤギ、ウサギ、ラット又はマウス等の非ヒト哺乳動物であるが、抗体はまた、他の種で産生されてもよい。
ポリクローナル抗体は、目的の抗原による適切な動物の免疫化等の日常的な方法によって産生され得る。その後、血液をそのような動物から取り出し、産生された抗体を精製することができる。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製され得る。モノクローナル抗体を作製するためのいくつかの例示的な方法が本明細書に記載される。
例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒｅｔａｌ．，１９８３，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙＴｏｄａｙ，４：７２）、及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ７７－９６，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８５）を使用して調製することができる。
抗体はまた、例えば国際公開第９２０２５５１号、国際公開第２００４０５１２６８号及び国際公開第２００４１０６３７７号に記載されている方法によって、特異的抗体の産生のために選択された単一リンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニング及び発現することによって、単一リンパ球抗体法を使用して生成され得る。
標的ポリペプチドに対して生成された抗体は、動物の免疫化が必要な場合、周知の慣習的なプロトコルを使用して動物、好ましくは非ヒト動物にポリペプチドを投与することによって得ることができる（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（ｅｄ．），Ｖｏｌ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６）を参照）。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタ等の多くの動物を免疫化することができる。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが一般に使用される。
モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成することもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２：４１－５０），Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８４：１７７－１８６），Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２－９５８），Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ，１９９７ １８７ ９－１８），Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１－２８０）によって開示されているものが挙げられる。特定のファージディスプレイ法では、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２：４３３－４５５（１９９４）．に記載されるように、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別々にクローニングされるか、又はファージライブラリにおいて無作為に組換えられ、抗原結合ファージに対してスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、抗体フラグメントを一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント又はＦａｂフラグメントのいずれかとして提示する。免疫化された供給源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要なしに免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５－７３４（１９９３）に記載されているように、免疫化することなく、ナイーブレパートリをクローニングして（例えば、ヒト由来）、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する単一の抗体源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２７：３８１－３８８（１９９２）によって記載されているように、幹細胞から再編成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再編成を達成することによって、ナイーブライブラリを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリを記載する特許刊行物には、例えば、米国特許第５，７５０，３７３号、及び米国特許第２００５／００７９５７４号、米国特許第２００５／０１１９４５５号、米国特許第２００５／０２６６０００号、米国特許第２００７／０１１７１２６号、米国特許第２００７／０１６０５９８号、米国特許第２００７／０２３７７６４号、米国特許第２００７／０２９２９３６号、及び米国特許第２００９／０００２３６０号が含まれる。
抗体のスクリーニングは、標的ポリペプチドへの結合を測定するアッセイ及び／又は抗体が特定の相互作用を遮断する能力を測定するアッセイを使用して行うことができる。結合アッセイの例は、例えば、プレート上に固定化された標的ポリペプチドの融合タンパク質を使用し、標的に結合した抗体を検出するためにコンジュゲート化二次抗体を使用するＥＬＩＳＡである。ブロッキングアッセイの例は、標的ポリペプチドに結合するリガンドタンパク質のブロッキングを測定するフローサイトメトリに基づくアッセイである。蛍光標識二次抗体を使用して、標的ポリペプチドに結合するそのようなリガンドタンパク質の量を検出する。
抗体は、所望の１つ又は複数の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを作製し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で公知である。
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体又は抗体フラグメントは、ヒト抗体又はヒト抗体フラグメントと見なされる。
抗体は完全長抗体であり得る。より具体的には、抗体はＩｇＧアイソタイプであり得る。より具体的には、抗体はＩｇＧ１又はＩｇＧ４であり得る。
抗体の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案された機能、特に必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭのドメインであり得る。特に、抗体分子が治療用途を意図し、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプを使用することができる。あるいは、抗体分子が治療目的を意図しており、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用してもよい。これらの定常領域ドメインの配列バリアントも使用され得ることが理解されるであろう。抗体が種々の翻訳後修飾を受け得ることも当業者に公知であろう。これらの修飾の種類及び程度は、多くの場合、抗体を発現するために使用される宿主細胞株並びに細胞培養条件に依存する。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化のバリエーションが含まれ得る。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リジン又はアルギニン等）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ，ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ７０５：１２９－１３４，１９９５に記載されている）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リジンは存在しなくてもよい。
あるいは、抗体は抗原結合フラグメントである。
特定の抗原結合フラグメントの総説については、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９－１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖフラグメントの総説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたく、また国際公開第９３／１６１８５号、米国特許第５，５７１，８９４号及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントが米国特許第５，８６９，０４６号に開示されている。
抗原結合フラグメント及びそれらを作製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５－１８１；Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ，２００５．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ ２（３）：２０９－２１７．を参照されたい。Ｆａｂ－Ｆｖフォーマットは国際公開第２００９／０４０５６２号に最初に開示され、そのジスルフィド安定化バージョンであるＦａｂ－ｄｓＦｖは国際公開第２０１０／０３５０１２号に最初に開示され、ＴｒＹｂｅフォーマットは国際公開第２０１５／１９７７７２号に開示されている。
抗体フラグメントを製造するための様々な技術が開発されてきた。そのようなフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導され得る（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１１７（１９９２）ａｎｄ Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。しかしながら、抗体フラグメントはまた、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。例えば、抗体フラグメントは、上記の抗体ファージライブラリから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２））。
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。これは国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；米国特許第５，５８７，４５８号に記載される。抗体フラグメントはまた、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているように、「線状抗体」であってもよい。そのような線状抗体フラグメントは、単一特異性又は二重特異性であり得る。
抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、又はｄｓｓｃＦｖであり得る。抗体は、単一ドメイン抗体又はナノボディ、例えばＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ又はＶＮＡＲであり得る。抗体は、国際公開第２０１１／１１７６４８号、国際公開第２００５／００３１６９号、国際公開第２００５／００３１７０号及び国際公開第２００５／００３１７１号に記載されているＦａｂ又はＦａｂ’フラグメントであり得る。
抗体は、ジスルフィド安定化一本鎖可変フラグメント（ｄｓｓｃＦｖ）であり得る。
可変ドメインＶＨとＶＬとの間のジスルフィド結合は、以下に列挙される残基のうちの２つの間であり得る。
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００、例えば、Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，２５（３２１－３２９），２０１２を参照；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５、例えば、Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８，８２５－８３１ Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照；
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照；
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１、例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５－１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９５）参照；
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２－１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０）を参照；
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９ １３６２－１３６７ Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ（１９９０）を参照；
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６については、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照；
・、ＶＨ１０１＋ＶＬ４６、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６，７８１－７８８ Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ（１９９７）を参照；
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９０ ｐｐ．７５３８－７５４２ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（１９９３）；ｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １９，３５－４７ Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９４）を参照；
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７、例えばＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７７ １３５－１３９ Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ（１９９５）を参照
及び分子内に位置する可変領域対におけるそれに対応する１つ又は複数の位置。
ジスルフィド結合は、位置ＶＨ４４と位置ＶＬ１００との間に形成され得る。
本明細書に記載の抗原結合フラグメントは、モノクローナル、キメラ、ヒト化、完全ヒト、多重特異性、二重特異性等としても特徴付けられ得、これらの用語の議論もそのようなフラグメントに関することが当業者によって理解されるであろう。
多重特異性抗体
本発明の抗体は多重特異性抗体であり得る。
本開示との関連で使用することも企図される多重特異性抗体又はその抗原結合フラグメントの例としては、二価、三価又は四価抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、バイボディ及びトリボディ（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３（９）：１１２６－１１３６；Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１７（６），１９３－２０２を参照されたい）が挙げられる。
様々な多重特異性抗体フォーマットが生成されている。様々な分類が提案されているが、多重特異性ＩｇＧ抗体フォーマットは、一般に、例えばＳｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５－１０６．に記載されているように、二重特異性ＩｇＧ、付加ＩｇＧ、多重特異性（例えば二重特異性）抗体フラグメント、多重特異性（例えば二重特異性）融合タンパク質、及び多重特異性（例えば二重特異性）抗体コンジュゲートを含む。
抗体は二重特異性抗体であり得る。一態様において、抗体は２つの抗原結合ドメインを含み、一方の結合ドメインはＩＬ２２に結合し、他方の結合ドメインは別の抗原に結合し、すなわち各結合ドメインは各抗原に対して一価である。一実施形態において、抗体は四価二重特異性抗体であり、すなわち抗体は４つの抗原結合ドメインを含み、例えば２つの結合ドメインはＩＬ２２に結合し、他の２つの結合ドメインは別の抗原に結合する。一実施形態では、抗体は三価二重特異性抗体である。
二重特異性抗体を作製するための技術としては、ＣｒｏｓｓＭａｂ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣｒｏｓｓＭａｂ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ １５４（２０１９）２１－３１），Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（例えば、国際公開第１９９６０２７０１１号、国際公開第１９９８０５０４３１号），ＤｕｏＢｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（例えば、国際公開第２０１１１３１７４６号），Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（例えば、国際公開第２０１２０５８７６８号）が挙げられるが、これらに限定されない。二重特異性抗体を作製するための更なる技術が、例えば、Ｇｏｄａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒｍａｔｓ：ａ ｐａｔｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｒｅｖｉｅｗ（１９９４－２０１７），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ，２８：３，２５１－２７６に記載されている。二重特異性抗体には、特にＣｒｏｓｓＭａｂ抗体、ＤＡＦ（ツー・イン・ワン）、ＤＡＦ（フォー・イン・ワン）、ＤｕｔａＭａｂ、ＤＴ－ｌｇＧ、ノブス・イン・ホール共通ＬＣ、ノブス・イン・ホール（Ｋｎｏｂｓ－ｉｎ－ｈｏｌｅｓ）アセンブリ、電荷対、Ｆａｂアーム交換、ＳＥＥＤｂｏｄｙ、Ｔｒｉｏｍａｂ、ＬＵＺ－Ｙ、Ｆｃａｂ、κλ－ｂｏｄｙ及び直交Ｆａｂが含まれる。
抗体構築物は三重特異性抗体であり得る。
抗体は、マルチパラトピック抗体であり得る。
一実施形態において、各結合ドメインは一価である。好ましくは、各結合ドメインは、１つ以下のＶＨ及び１つのＶＬを含む。
付加ＩｇＧは、古典的には、ＩｇＧの重鎖及び／又は軽鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に追加の抗原結合ドメイン又は抗原結合フラグメントを付加することによって操作された全長ＩｇＧを含む。そのような追加の抗原結合フラグメントの例としては、ｓｄＡｂ抗体（例えばＶＨ又はＶＬ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂが挙げられ、付加ＩｇＧ抗体フォーマットとしては、特にＤＶＤ－ＩｇＧ、ＩｇＧ（Ｈ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｈ）ｌｇＧ、ＩｇＧ（Ｌ）－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－（Ｌ）ＩｇＧ、ｌｇＧ（Ｌ，Ｈ）－Ｆｖ、ＩｇＧ（Ｈ）－Ｖ、Ｖ（Ｈ）－ＩｇＧ、ＩｇＣ（Ｌ）－Ｖ、Ｖ（Ｌ）－ＩｇＧ、ＫＩＨ ＩｇＧ－ｓｃＦａｂ、２ｓｃＦｖ－ＩｇＧ、ｌｇＧ－２ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、Ｚｙｂｏｄｙ及びＤＶＩ－ＩｇＧ（フォー・イン・ワン）が挙げられ、例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５－１０６．に記載されている。
多重特異性抗体フラグメントには、例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍａｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（２０１５）：９５－１０６．に記載されるように、ナノボディ、ナノボディ－ＨＳＡ、ＢｉＴＥ、ダイアボディ、ＤＡＲＴ、ＴａｎｄＡｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ、ｓｃ－Ｄｉａｂｏｄｙ－ＣＨ３、Ｄｉａｂｏｄｙ－ＣＨ３、Ｔｒｉｐｌｅ Ｂｏｄｙ、Ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ、ミニボディ、Ｔｒｉ Ｂｉミニボディ、ｓｃＦｖ－ＣＨ３ ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－ＣＨ－ＣＬ－ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）２－ｓｃＦｖ２、ｓｃＦｖ－ＫＩＨ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、四価ＨＣＡｂ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－Ｆｃ、Ｄｉａｂｏｄｙ－Ｆｃ、Ｔａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ－Ｆｃ；及びイントラボディが含まれる。
多重特異性融合タンパク質としては、Ｄｏｃｋ及びＬｏｃｋ、ＩｍｍＴＡＣ、ＨＳａｂｏｄｙ、ｓｃＤｉａｂｏｄｙ－ＨＳＡ、及びＴａｎｄｅｍ ｓｃＦｖ－Ｔｏｘｉｎが挙げられる。
多重特異性抗体コンジュゲートとしては、ＩｇＧ－ＩｇＧ；Ｃｏｖ－Ｘ－ボディ；及びｓｃＦｖ１－ＰＥＧ－ｓｃＦｖ２が挙げられる。
更なる多重特異性抗体フォーマットは、例えばＢｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｍＡｂｓ，９：２，１８２－２１２（２０１７）、特に図２、例えばタンデムｓｃＦｖ、三重体、Ｆａｂ－ＶＨＨ、ｔａＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ４－Ｉｇ、ｓｃＦｖ２－Ｆｃａｂ、ｓｃＦｖ４－ＩｇＧに記載されている。バイオボディ、トリボディ及びこれらを製造する方法は、例えば、国際公開第９９／３７７９１号に開示されている。
本発明で使用するための抗体は、２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂであり得、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは同じ又は異なる標的に結合する（例えば、治療標的に結合する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖ及び１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、例えばアルブミンに結合することによって半減期を延長する）。そのような抗体フラグメントは、国際公開第２０１５／１９７７７２号に記載されている。本発明フラグメントに使用するための別の好ましい抗体は、例えば国際公開第２０１３／０６８５７１号及びＤａｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｂｓ，８（７）１３１９－１３３５（２０１６）に記載されているように、ただ１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含む。
本発明で使用するための別の抗体は、ノブス・イン・ホール抗体（「ＫｉＨ」）である。これは、ヘテロ二量体化のための重鎖ホモ二量体（例えば、二重特異性抗体、多重特異性抗体又は一腕抗体の効率的な産生のために）からなる多重特異性抗体フォーマットである。一般に、そのような技術は、第１のポリペプチド（第１の抗体重鎖中の第１のＣＨ３ドメイン等）の界面に突起（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチド（第２の抗体重鎖中の第２のＣＨ３ドメイン等）の界面に対応する空洞（「ホール」）を導入することを含み、それにより、突起は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように空洞内に配置され得る。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖（第１の抗体重鎖中の第１のＣＨ３ドメイン等）をより大きな側鎖（例えば、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突出部と同一又は類似のサイズの代償的な空洞が、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニン、セリン、バリン、又はトレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチドの境界面（第２の抗体重鎖中の第２のＣＨ３ドメイン等）に作り出される。隆起及び空洞は、例えば部位特異的突然変異誘発又はペプチド合成によって、ポリペプチドをコードする核酸を改変することによって作製することができる。「ノブス・イン・ホール」技術に関する更なる詳細は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号；米国特許第７，６９５，９３６号；国際公開第２００９／０８９００４号；米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号明細書；Ｍａｒｖｉｎ ｍｄ Ｚ ｕ，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｃｉａ（２００５）２６（６）：６４９－６５８；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｃｉａ（２００５）２６：１－９；Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，６１７－６２１（１９９６）；ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）．に記載される。
ヒト化抗体、ヒト抗体及びキメラ抗体並びにそのような抗体を産生する方法
本発明の抗体は、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又はキメラ抗体であり得るが、これらに限定されない。
一実施形態では、抗体はヒト化されている。より詳細には、抗体は、キメラ、ヒト、又はヒト化抗体である。
特定の実施形態において、本明細書中に提供される抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体の例は、例えば米国特許第４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載される。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。更なる例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが、親抗体のクラス又はサブクラスから変更された「クラス切替」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合フラグメントが含まれる。
一実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
ヒト化抗体は、任意に、ＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する１つ又は複数のフレームワーク残基を更に含み得る。ＣＤＲ全体ではなくＣＤＲの特異性決定残基を移入するだけでよいことが理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉｅｔａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５－３４を参照）。
適切には、本発明によるヒト化抗体は、ヒト受容体フレームワーク領域並びに１つ又は複数のＣＤＲを含み、任意に１つ又は複数のドナーフレームワーク残基を更に含む可変ドメインを有する。
したがって、一実施形態では、可変ドメインがヒト受容体フレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む、ヒト化抗体が提供される。
ＣＤＲ又は特異性決定残基がグラフトされる場合、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含む、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、任意の適切な受容体可変領域フレームワーク配列が使用され得る。
本発明において使用され得るヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．）である。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭを重鎖に使用することができ、ＲＥＩを軽鎖に使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭを重鎖及び軽鎖の両方に使用することができる。あるいは、ヒト生殖系列配列を使用してもよく、これらは、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで入手可能である。実施形態では、受容体フレームワークがＩＧＫＶ１Ｄ－１３ヒト生殖系列、ＩＧＨＶ３－６６ヒト生殖系列、ＩＧＫＶ１－１２ヒト生殖系列及び／又はＩＧＨＶ４－３１ヒト生殖系列である。実施形態において、ヒトフレームワークは、１～５、１～４、１～３又は１～２個のドナー抗体アミノ酸残基を含む。
本発明のヒト化抗体において、受容体重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望であれば、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含み得る。
特定の実施形態において、本明細書中に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して産生され得る。
ヒト抗体は、抗体の可変領域又は全長鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、特定の生殖系列配列の「生成物」又はそれに「由来する」重鎖若しくは軽鎖可変領域又は全長重鎖若しくは軽鎖を含む。そのようなシステムには、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを目的の抗原で免疫すること、又はファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリを目的の抗原でスクリーニングすることが含まれる。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「生成物」又はそれに「由来する」ヒト抗体又はそのフラグメントは、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列に配列が最も近い（すなわち、最大％の同一性）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、そのように同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列の「生成物」又はそれに「由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異又は部位特異的変異の意図的な導入に起因して、生殖系列配列と比較してアミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は、典型的には、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較した場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は少なくとも９５％、又は更には少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０個以下のアミノ酸差を示すであろう。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から５個以下、又は更には４個、３個、２個又は１個以下のアミノ酸差を示し得る。
抗体の構造的特徴
本発明の抗体は結合ドメインを含む。結合ドメインは、一般に、３つが重鎖由来であり、３つが軽鎖由来である、６つのＣＤＲを含む。一実施形態では、ＣＤＲはフレームワーク内にあり、共に可変領域を形成する。したがって、抗体は、抗原に特異的な結合ドメインを有し、当該結合ドメインは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明は、ＩＬ２２に結合する抗体であって、
配列番号５を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ３
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメインを含む、抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＩＬ２２に結合する抗体であって、
配列番号５を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメインを含む、抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＩＬ２２に結合する抗体であって、
配列番号８を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号９を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｈ３
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変ドメインを含む、抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＩＬ２２に結合する抗体であって、
配列番号８を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号９を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変ドメインを含む、抗体を提供する。
本発明の抗体分子は、それぞれ相補的軽鎖又は相補的重鎖を含み得る。
したがって、一実施形態において、本発明は、ＩＬ２２に結合する抗体であって、
配列番号５を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変領域と、
配列番号８を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号９を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変領域と、
を含む抗体を提供する。
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２２又は配列番号７２に示される配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２４又は配列番号７４に示される配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２２に示される配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号２４に示される配列を含む重鎖可変領域とを含む。
代替的な実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７２に示される配列を含む軽鎖可変領域と、配列番号７４に示される配列を含む重鎖可変領域とを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、
配列番号５を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変領域と、
配列番号８を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号９を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変領域と、
を含む、Ｆａｂである。
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２６に示される配列を含む軽鎖と、配列番号２８に示される配列を含む重鎖とを含むＦａｂである。
別の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２６に示される配列を含む軽鎖と、配列番号３０に示される配列を含む重鎖とを含むＩｇＧ１である。
別の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２６に示される配列を含む軽鎖と、配列番号３２に示される配列を含む重鎖とを含むＩｇＧ４Ｐである。
代替的な実施形態では、本発明は、ＩＬ２２に結合する抗体であって、
配列番号６５を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６６を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号６７を含むＣＤＲ－Ｌ３
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変ドメインを含む、抗体を提供する。
代替的な実施形態では、本発明は、ＩＬ２２に結合する抗体であって、
配列番号６５を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６６を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号６７を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメインを含む、抗体を提供する。
代替的な実施形態では、本発明は、ＩＬ２２に結合する抗体であって、
配列番号６８を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号６９を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
配列番号７０を含むＣＤＲ－Ｈ３
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変ドメインを含む、抗体を提供する。
代替的な実施形態では、本発明は、ＩＬ２２に結合する抗体であって、
配列番号６８を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号６９を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
配列番号７０を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変ドメインを含む、抗体を提供する。
代替的な実施形態において、本発明は、ＩＬ２２に結合する抗体であって、
配列番号６５を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６６を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号６７を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変領域と、
配列番号６８を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号６９を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
配列番号７０を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変領域と、
を含む抗体を提供する。
代替的な実施形態において、本発明の抗体は、
配列番号６５を含むＣＤＲ－Ｌ１、
配列番号６６を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
配列番号６７を含むＣＤＲ－Ｌ３
を含む軽鎖可変領域と、
配列番号６８を含むＣＤＲ－Ｈ１、
配列番号６９を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
配列番号７０を含むＣＤＲ－Ｈ３
を含む重鎖可変領域と、
を含むＦａｂである。
更に別の代替的な実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７６に示される配列を含む軽鎖と、配列番号７８に示される配列を含む重鎖とを含むＦａｂである。
別の代替的な実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７６に示される配列を含む軽鎖と、配列番号８０に示される配列を含む重鎖とを含むＩｇＧ１である。
別の代替的な実施形態において、本発明の抗体は、配列番号７６に示される配列を含む軽鎖と、配列番号８２に示される配列を含む重鎖とを含むＩｇＧ４Ｐである。
実施形態では、本発明は、配列番号５又は配列番号６５を含むＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６又は配列番号６６を含むＣＤＲ－Ｌ２、配列番号７又は配列番号６７を含むＣＤＲ－Ｌ３を含む軽鎖可変領域と、配列番号８又は配列番号６８を含むＣＤＲ－Ｈ１、配列番号９又は配列番号６９を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び配列番号１０又は配列番号７０を含むＣＤＲ－Ｈ３を含む重鎖可変領域と、を含む抗体を提供する。
一実施形態では、抗体は、重鎖及び軽鎖を含み、重鎖はＣＨ１ドメインを含み、軽鎖はカッパ又はラムダのいずれかのＣＬドメインを含む。
抗ＩＬ２２抗体の機能的特性
一実施形態では、本発明の抗体は中和抗体である。好ましくは、本発明による抗体は、中和ＩＬ２２活性である。特に、抗体は、ＩＬ２２受容体１（ＩＬ２２Ｒ１）に結合するＩＬ２２を中和することができる。本発明の抗ＩＬ２２抗体はまた、ＩＬ２２に結合し、ＩＬ２２結合タンパク質（ＩＬ２２ＲＡ２又はＩＬ２２ＢＰ）へのＩＬ２２の結合を阻害する。好ましくは、抗体は、ＩＬ２２受容体１（ＩＬ２２Ｒ１）及びＩＬ２２結合タンパク質（Ｌ２２ＲＡ２）に結合するＩＬ２２を中和することができる。
本発明の抗ＩＬ２２抗体は、ＩＬ２２Ｒ１と同じＩＬ２２上の領域に結合する。特定の一実施形態では、本発明は、結合がＩＬ２２とＩＬ２２Ｒ１との間の相互作用を立体的に遮断するように、ＩＬ２２上の領域に結合する抗体を提供する。特に、抗体の可変領域は、ＩＬ２２とＩＬ２２Ｒ１との間の相互作用を立体的に遮断し得る。
いくつかの実施形態において、本発明による抗体は、ＩＬ２２ＢＰに結合していないＩＬ２２（「遊離ＩＬ２２」）に結合する。いくつかの実施形態において、本発明による抗体は、ＩＬ２２に結合し、ＩＬ２２がＩＬ２２ＢＰに結合するのを妨げる。
本発明による抗体はＩＬ２２に特異的である。一実施形態では、抗体は、ＩＬ２２Ｒ１と比較してＩＬ２２に対してより強い結合親和性を有する。これは、ＩＬ２２Ｒ１又はＩＬ２２ＢＰよりもＩＬ２２の解離親和定数（ＫＤ）が少なくとも１０倍高いことを特徴とする。具体的には、ＢＩＡＣｏｒｅ技術を用いて測定される。
いくつかの実施形態において、抗体は十分な親和性及び特異性でＩＬ２２に結合する。特定の実施形態では、抗体は、約１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ又は０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）のいずれか１つのＫＤでヒトＩＬ２２に結合し、これらの値の間の任意の範囲を含む。一実施形態では、本発明による抗体は、１００ｐＭ未満のＫＤでヒトＩＬ２２に結合する。
特定の実施形態では、抗体は、約１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ又は０．００１ｎＭ（例えば１０－８Ｍ以下、例えば１０－８Ｍ～１０－１３Ｍ、例えば１０－９Ｍ～１０－１３Ｍ）のいずれか１つのＫＤでカニクイザルＩＬ２２に結合し、これらの値の間の任意の範囲を含む。一実施形態では、本発明による抗体は、１００ｐＭ未満のＫＤでカニクイザルＩＬ２２に結合する。
ＫＤ値は、抗体のフォーマット及び全体構造に応じて異なり得ることが当業者には理解されよう。例えば、抗体のＫＤは、多重特異性抗体、完全長抗体又は抗体フラグメントとの関連で異なり得る。
本発明の抗ＩＬ２２抗体は、細胞からのＩＬ２２誘導性ＩＬ１０放出を阻害することができる。
例によって実証されるように、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、ＩＬ２２媒介ケラチノサイトの増殖及び分化を阻害することができる。
本発明の抗ＩＬ２２抗体はまた、ＩＬ２２誘導性抗菌ペプチド（例えば、Ｓ１００Ａ７等）の放出を阻害することができる。
抗体の親和性、並びに抗体が結合を阻害する程度は、従来の技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．ＫＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０－６７２（１９４９））に記載されている技術を使用して、又はＢＩＡｃｏｒｅ等のシステムを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって当業者が決定することができる。表面プラズモン共鳴の場合、標的分子を固相に固定化し、フローセルに沿って移動する移動相中のリガンドに曝露する。固定化された標的にリガンドが結合すると、局所屈折率が変化してＳＰＲ角が変化し、反射光の強度の変化を検出することによってリアルタイムで監視することができる。ＳＰＲシグナルの変化速度を分析して、結合反応の会合相及び解離相の見かけの速度定数を得ることができる。これらの値の比は、見かけの平衡定数（親和性）を与える（例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：２５６０－６５（１９９３）を参照）。
一実施形態では、本発明による抗ＩＬ２２抗体は、ＩＬ２２結合タンパク質に結合していないＩＬ２２（「遊離ＩＬ２２」）に結合する。より具体的には、本発明による抗体はＩＬ２２に結合し、ＩＬ２２がＩＬ２２結合タンパク質に結合するのを妨げる。
好ましくは、本発明による抗体はＩＬ２２に特異的である。
抗体に関する、特に結合親和性及び結合特異性、並びに活性に関する本明細書の開示は、抗原結合フラグメント及び抗体様分子にも適用可能である。
同じエピトープに結合する抗体
抗体は、ＩＬ２２への結合について、軽鎖、重鎖、軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）又はＣＤＲ配列に関して上で定義したエピトープと競合するか、又は同じエピトープに結合し得る。
特に、本発明は、ＩＬ２２への結合について、配列番号５／６／７／８／９／１０のＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３配列の組合せを含む抗体と競合するか、又は同じエピトープに結合する抗体を提供する。抗体は、配列番号２２／２４のＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ配列対を含む抗体とＩＬ２２への結合について競合するか、又は同じエピトープに結合し得る。抗体は、ＩＬ２２への結合について配列番号２６／２８に示されるＬＣ及びＨＣ配列対を含むＦａｂと競合するか、又は同じエピトープに結合し得る。
あるいは、本発明は、ＩＬ２２への結合について、配列番号６５／６６／６７／６８／６９／７０のＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３配列の組合せを含む抗体と競合するか、又は同じエピトープに結合する抗体を提供する。抗体は、配列番号７２／７４のＬＣＶＲ及びＨＣＶＲ配列対を含む抗体とＩＬ２２への結合について競合するか、又は同じエピトープに結合し得る。抗体は、ＩＬ２２への結合について、配列番号７６／７８に示されるＬＣ及びＨＣ配列対を含むＦａｂと競合するか、又は同じエピトープに結合し得る。
一実施形態では、本発明は、ＩＬ２２上のエピトープに結合する抗ＩＬ２２抗体を提供し、当該エピトープは、１つ又は複数の残基ＶＲＬＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭ（配列番号１、ＩＬ２２のアミノ酸配列の残基７２～８５）を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、ポリペプチドＶＲＬＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭ（配列番号９６）に結合する抗ＩＬ２２抗体を提供する。実施形態では、本発明は、配列番号１によって定義されるＩＬ２２のアミノ酸配列の残基７２～８５から選択される少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は全ての残基に結合する抗体を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＩＬ２２上のエピトープに結合する抗ＩＬ２２抗体を提供し、当該エピトープは、４Å未満の接触距離で測定される場合、ヒトＩＬ２２（配列番号１）のＧｌｎ４８、Ｇｌｕ７７、Ｐｈｅ８０、Ｈｉｓ８１、Ｇｌｙ８２、Ｖａｌ８３、Ｓｅｒ８４、Ｍｅｔ８５、Ａｒｇ８８、Ｌｅｕ１６９、Ｍｅｔ１７２、Ｓｅｒ１７３、Ａｒｇ１７５、Ａｓｎ１７６及びＩｌｅ１７９からなるリストから選択される残基の少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、又は全てを含む。実施形態では、本発明は、ＩＬ２２上のエピトープに結合する抗体を提供し、当該エピトープは、抗体とＩＬ２２との間の５Å未満の接触距離で測定される場合、ヒトＩＬ２２（配列番号１）のＬｙｓ４４、Ｐｈｅ４７、Ｇｌｎ４８、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｙ７６、Ｇｌｕ７７、Ｐｈｅ８０、Ｈｉｓ８１、Ｇｌｙ８２、Ｖａｌ８３、Ｓｅｒ８４、Ｍｅｔ８５、Ｓｅｒ８６、Ａｒｇ８８、Ｌｅｕ１６９、Ｍｅｔ１７２、Ｓｅｒ１７３、Ａｒｇ１７５、Ａｓｎ１７６及びＩｌｅ１７９からなるリストから選択される残基の少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、又は全てを含む。
特に、本発明は、以下の表４又は５に列挙される重鎖及び軽鎖の残基を含む抗体とＩＬ２２への結合について競合するか、又は同じエピトープに結合することができる抗体を提供する。より具体的には、本発明の抗体は、配列番号２４の残基９７～１０４、好ましくは残基９９～１０４を含むＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、上で定義したＩＬ２２上のエピトープに結合する。より具体的には、本発明の抗体は、表４又は表５において定義されるようなＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３残基を含み、上記で定義されるようなＩＬ２２上のエピトープに結合する。
より具体的には、本発明は、上記で定義したＩＬ２２上のエピトープに結合する抗ＩＬ２２抗体を提供し、当該抗体は、ＩＬ２２のＩＬ２２Ｒ１及びＩＬ２２ＢＰへの結合を妨げる。より具体的には、抗体の軽鎖は、ＩＬ２２Ｒ１のＩＬ２２への結合を立体的に妨げる。
エピトープは、本発明によって提供される抗体のいずれか１つと組み合わせて、当技術分野で公知の任意の適切な結合部位マッピング方法によって同定することができる。そのような方法の例には、本発明の抗体又はそのフラグメントに結合するための全長標的タンパク質に由来する様々な長さのペプチドをスクリーニングすること、及び抗体によって認識されるエピトープの配列を含む抗体に特異的に結合することができるフラグメントを同定すること、が含まれる。標的ペプチドは、合成的に産生され得る。抗体に結合するペプチドは、例えば、質量分析によって同定することができる。別の例では、ＮＭＲ分光法又はＸ線結晶学を使用して、本発明の抗体が結合したエピトープを同定することができる。典型的には、エピトープ決定をＸ線結晶学によって行う場合、ＣＤＲから４Å以内の抗原のアミノ酸残基は、エピトープのアミノ酸残基部分であると考えられる。一旦同定されると、エピトープは、本発明の抗体に結合するフラグメントを調製するのに役立ち得、必要に応じて、同じエピトープに結合する更なる抗体を得るための免疫原として使用され得る。
一実施形態では、抗体のエピトープは、Ｘ線結晶学によって決定される。
抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するか、又は参照抗体と結合について競合するかどうかは、当技術分野で公知の日常的な方法を使用することによって容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でタンパク質又はペプチドに結合させる。次に、タンパク質又はペプチドに結合する試験抗体の能力を評価する。試験抗体が参照抗体との飽和結合後にタンパク質又はペプチドに結合することができる場合、試験抗体は参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。一方、試験抗体が参照抗体との飽和結合後にタンパク質又はペプチドに結合することができない場合、試験抗体は、本発明の参照抗体によって結合されるエピトープと同じエピトープに結合し得るか、又は参照抗体は、抗原の配座変化を引き起こし、したがって試験抗体の結合を妨げる。
抗体が参照抗体との結合について競合するかどうかを決定するために、上記の結合方法論を２つの異なる実験設定で行う。第１の設定では、参照抗体を飽和条件下で抗原に結合させ、続いて試験抗体の抗原への結合を評価する。第２の設定では、試験抗体を飽和条件下で抗原に結合させ、続いて参照抗体のタンパク質／ペプチドへの結合を評価する。両方の実験設定において、第１の（飽和）抗体のみがタンパク質／ペプチドに結合することができる場合、試験抗体及び参照抗体は抗原への結合について競合すると結論付けられる。当業者には理解されるように、参照抗体と結合について競合する抗体は、必ずしも参照抗体と同一のエピトープに結合するわけではないが、重複又は隣接するエピトープに結合することによって参照抗体の結合を立体的にブロックし得るか、又は結合の欠如をもたらす配座変化を引き起こし得る。
２つの抗体は、各々が抗原への他方の結合を競合的に阻害（遮断）する場合、同じ又は重複するエピトープに結合する。あるいは、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減又は排除するいくつかのアミノ酸変異が他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は重複エピトープを有する。
次いで、試験抗体の結合の観察された欠如が実際に参照抗体と同じ抗原の部分への結合によるものであるかどうか、又は立体的遮断（又は別の現象）が観察された結合の欠如の原因であるかどうかを確認するために、更なる日常的な実験（例えば、ペプチド突然変異及び結合分析）を行うことができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリ、又は当技術分野で利用可能な任意の他の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを使用して行うことができる。
抗体変異体
特定の実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を有する抗体変異体が提供される。置換突然変異誘発のための関心部位としては、ＣＤＲ及びＦＲが挙げられる。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、所望の活性、例えば、保持された／改善された抗原結合、低下した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗ＩＬ２２抗体のアミノ酸配列変異体は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾としては、例えば、抗ＩＬ２２抗体のアミノ酸配列内（例えば、１つ又は複数のＣＤＲ及び／又はフレームワーク配列内、あるいはＶＨ及び／又はＶＬドメイン内）の残基からの欠失及び／若しくは残基への挿入及び／又は残基の置換が挙げられる。最終構築物が所望の特性を有する限り、最終構築物に到達するために、欠失、挿入、及び置換の任意の組合せを行うことができる。
本明細書で提供される変異体ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施形態では、各ＨＶＲは変化していないか、又は１、２若しくは３個以下のアミノ酸置換を含む。
抗体がＩＬ２２に結合し、ＩＬ２２活性を中和する能力を有意に変化させることなく、本発明によって提供されるＣＤＲに対して１つ又は複数のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失が行われ得ることが理解されるであろう。任意のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失の影響を、例えば、本明細書中に記載される方法、特に、例において例示される方法を用いて、ＩＬ２２とその受容体ＩＬ２２Ｒ１及びＩＬ２２結合タンパク質との相互作用のＩＬ２２結合及び阻害を明らかにすることによって、当業者によって容易に試験することができる。
その結果、変異体ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施形態では、各ＣＤＲは、１つ、２つ又は３つ以下のアミノ酸置換を含み、そのようなアミノ酸置換は保存的であり、抗体はＩＬ２２に対するその結合特性を保持し、ＩＬ２２Ｒ１及びＩＬ２２結合タンパク質に対するＩＬ２２の結合を遮断する。
したがって、本発明は、ＣＤＲ－Ｌ１（配列番号５を含む）、ＣＤＲ－Ｌ２（配列番号６を含む）、ＣＤＲ－Ｌ３（配列番号７を含む）、ＣＤＲ－Ｈ１（配列番号８を含む）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号９を含む）及びＣＤＲ－Ｈ３（配列番号１０を含む）から選択される１つ又は複数のＣＤＲを含む抗ＩＬ２２抗体を提供し、１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸は、別のアミノ酸、例えば、本明細書中下で定義される類似のアミノ酸で置換されている。
一実施形態では、本発明は、ＣＤＲ－Ｌ１（配列番号５を含む）、ＣＤＲ－Ｌ２（配列番号６を含む）、ＣＤＲ－Ｌ３（配列番号７を含む）、ＣＤＲ－Ｈ１（配列番号８を含む）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号９を含む）及びＣＤＲ－Ｈ３（配列番号１０を含む）を含む抗ＩＬ２２抗体を提供し、例えば、１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸は、本明細書で以下に定義する類似のアミノ酸等の別のアミノ酸で置換されている。実施形態において、１つ又は複数のＣＤＲにおける１つ又は複数のアミノ酸置換は、遊離システイン残基を置換するか、又は潜在的なアスパラギン脱アミド部位を修飾する。実施形態において、１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸置換は、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾する。実施形態では、１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸置換は、潜在的なＤＰ加水分解部位を除去する。実施形態では、ＣＤＲ－Ｌ３（配列番号７）に関して、置換はＣ９１Ｓ又はＣ９１Ｖ；Ｎ９５Ｄ；Ｓ９６Ａ；又はそれらの組合せであり、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号９）に関して、置換はＤ５４Ｅ、Ｇ５５Ａ、又はそれらの組合せであり、ＣＤＲ－Ｈ３（配列番号９）に関して、置換はＤ１０７Ｅ、又は列挙された置換の組合せである。
一実施形態では、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含み、ＣＤＲ－Ｌ１の配列は、配列番号５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号６に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９８％の同一性又は類似性を有する配列を含み、並びに／あるいはＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号７に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
一実施形態では、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含み、ＣＤＲ－Ｈ１の配列は、配列番号８に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号９に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含み、並びに／あるいはＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号１０に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
一実施形態では、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、配列番号２２に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態において、本発明の抗体は、配列番号２４に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２２に示されるものと少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有する配列を含み、及び／又は重鎖可変領域は、配列番号２４に示されるものと少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む。
一実施形態では、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、それぞれ配列番号６５／６６／６７／６８／６９／７０を含むＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の残りの部分は、それぞれ配列番号７２及び７４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性又は類似性を有する。
一実施形態では、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、それぞれ配列番号５／６／７／８／９／１０を含むＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の残りの部分は、それぞれ配列番号２２及び２４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性又は類似性を有する。
一実施形態において、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、配列番号２６に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む軽鎖と、配列番号２８に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む重鎖とを含むＦａｂである。
一実施形態において、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、それぞれ配列番号５／６／７／８／９／１０に示されるＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３配列を含むＦａｂであり、軽鎖及び重鎖の残りの部分は、それぞれ配列番号２６及び２８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性又は類似性を有する。
一実施形態では、本発明の抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号２２に示される配列を含み、９１、９５及び／又は９６の位置の一又は複数の残基は、別のアミノ酸によって置換されており、重鎖可変領域は、配列番号２４に示される配列を含み、５４、５５及び／又は１０７の位置の１つ又は複数の残基は別のアミノ酸によって置換されている。
本発明は、ＣＤＲ－Ｌ１（配列番号６５を含む）、ＣＤＲ－Ｌ２（配列番号６６を含む）、ＣＤＲ－Ｌ３（配列番号６７を含む）、ＣＤＲ－Ｈ１（配列番号６８を含む）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号６９を含む）及びＣＤＲ－Ｈ３（配列番号７０を含む）から選択される１つ又は複数のＣＤＲを含む抗ＩＬ２２抗体を提供し、１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸は、別のアミノ酸、例えば、本明細書中下で定義される類似のアミノ酸で置換されている。
一実施形態では、本発明は、ＣＤＲ－Ｌ１（配列番号６５を含む）、ＣＤＲ－Ｌ２（配列番号６６を含む）、ＣＤＲ－Ｌ３（配列番号６７を含む）、ＣＤＲ－Ｈ１（配列番号６８を含む）、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号６９を含む）及びＣＤＲ－Ｈ３（配列番号７０を含む）を含む抗ＩＬ２２抗体を提供し、例えば、１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸は、本明細書で以下に定義する類似のアミノ酸等の別のアミノ酸で置換されている。実施形態において、１つ又は複数のＣＤＲにおける１つ又は複数のアミノ酸置換は、遊離システイン残基を置換するか、又は潜在的なアスパラギン脱アミド部位を修飾する。実施形態において、１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸置換は、潜在的なアスパラギン酸異性化部位を修飾する。実施形態では、１つ又は複数のＣＤＲ中の１つ又は複数のアミノ酸置換は、潜在的なＤＰ加水分解部位を除去する。実施形態では、ＣＤＲ－Ｈ２（配列番号６９）に関して、置換はＳ６１Ｔである。
一実施形態では、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、３つのＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを含み、ＣＤＲ－Ｌ１の配列は、配列番号６５に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含み、ＣＤＲ－Ｌ２は、配列番号６６に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含み、並びに／あるいはＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６７に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
一実施形態では、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、３つのＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含み、ＣＤＲ－Ｈ１の配列は、配列番号６８に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号６９に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含み、並びに／あるいはＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号７０に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む。
一実施形態では、本開示の抗ＩＬ２２抗体は、配列番号７２に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本開示の抗体は、配列番号７４に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む。
一実施形態では、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は、配列番号７２に示されるものと少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有する配列を含み、及び／又は重鎖可変領域は、配列番号７４に示されるものと少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性若しくは類似性を有する配列を含む。
一実施形態では、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、それぞれ配列番号６５／６６／６７／６８／６９／７０を含むＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の残りの部分は、それぞれ配列番号７２及び７４と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性又は類似性を有する。
一実施形態において、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、配列番号７６に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む軽鎖と、配列番号７８に示される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性又は類似性を有する配列を含む重鎖とを含むＦａｂである。
一実施形態において、本発明の抗ＩＬ２２抗体は、それぞれ配列番号６５／６６／６７／６８／６９／７０に示されるＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３配列を含むＦａｂであり、軽鎖及び重鎖の残りの部分は、それぞれ配列番号７６及び７８と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは９８％の同一性又は類似性を有する。
配列同一性及び類似性
配列間の同一性及び類似性の程度を容易に計算することができる。「配列同一性％」（又は「配列類似性％」）は、（１）比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列した配列を比較すること（例えば、より長いシーケンスの長さ、より短いシーケンスの長さ、指定されたウィンドウ等である）と、（２）一致した位置の数を得るために、同一の（又は類似の）アミノ酸を含む位置の数を決定すること（例えば、同一のアミノ酸が両方の配列に存在する、類似のアミノ酸が両方の配列に存在する）と、（３）一致した位置の数を比較ウィンドウ（例えば、より長いシーケンスの長さ、より短いシーケンスの長さ、指定されたウィンドウ）内の位置の総数で割ることと、（４）結果に１００を掛けて、配列同一性％又は配列類似性％を得ることと、によって計算される。
比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）、又は手動アラインメント及び目視検査によって（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を参照されたい）行うことができる。
配列同一性パーセント及び配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの好ましい例としては、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９７７）及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されるＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含む。ポリペプチド配列はまた、デフォルトパラメータ又は推奨パラメータを使用してＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最良の重複の領域のアラインメント及びパーセント配列同一性を提供する。
特定の実施形態において、置換、挿入又は欠失は、そのような変化が抗体が標的に結合する能力を実質的に低下させない限り、１つ又は複数のＣＤＲ内で起こり得る。
例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更をＣＤＲにおいて行うことができる。そのような改変は、ＣＤＲ中の抗原接触残基の外側で行われ得る。
保存的置換を、より実質的な「例示的な置換」と共に表６に示す。
抗体変異体の生物学的特性における実質的な修飾は、置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、又は側鎖のバルクの維持に対する効果が有意に異なる置換を選択することによって達成することができる。アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性に従ってグループ化され得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３－７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））。
１つのタイプの置換変異体は、親抗体（ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ又は複数のＣＤＲ領域残基を置換することを含む。一般に、更なる研究のために選択された得られた変異体（複数可）は、親抗体と比較して特定の生物学的特性（例えば、親和性の増加、免疫原性の低下）に変化を有する、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持している。例示的な置換変異体は、親和性成熟抗体であり、例えばファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を使用して簡便に生成することができる。簡潔には、１つ又は複数のＣＤＲ残基を変異させ、変異体抗体をファージ上に提示し、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
例えば、抗体親和性を改善するために、ＣＤＲに変更（例えば、置換）を行うことができる。そのような変化は、ＨＶＲ「ホットスポット、」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異を受けるコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９－１９６（２００８）を参照されたい）、及び／又は抗原と接触する残基において行われ得、得られた変異体ＶＨ又はＶＬは結合親和性について試験される。二次ライブラリの構築及び二次ライブラリからの再選択による親和性成熟は、例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．ｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）．）に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、多様性は、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）のいずれかによって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次に、二次ライブラリが作成される。次いで、ライブラリをスクリーニングして、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定する。
突然変異誘発の標的となり得る抗体の残基又は領域の同定に使用できる方法の１つは、アラニンスキャニング突然変異誘発である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１－１０８５）。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基又は多数の標的残基が同定され、アラニンで置換される。あるいは、又は更に、抗原－抗体複合体のＸ線構造を使用して、抗体とその抗原との間の接触点を同定することができる。変異体をスクリーニングして、所望の特性を含むかどうかを決定することができる。
定常領域変異体
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸修飾が、本明細書中に提供される抗体のＦｃ領域に導入され得、それにより、Ｆｃ領域変異体が作製される。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含み得る。
ＦｃＲへの結合が改善又は減少した特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びＳｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１－６６０４（２００１）．を参照されたい）
半減期が増加し、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合が改善された抗体は、米国特許第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、Ｆｃ領域とＦｃＲｎとの結合を改善する１つ又は複数の置換を有するＦｃ領域を含む。
特定の実施形態では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の２９８、３３３及び／又は３３４の位置の置換（残基のＥＵナンバリング）を有するＦｃ領域を含む。
エフェクター機能が低下した抗体には、Ｆｃ領域残基２３４、２３５、２３７、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１又は複数が置換されたものが含まれる（例えば、米国特許第６、７３７、０５６号を参照されたい）。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸残基がＥＵナンバリングシステムに従ってナンバリングされている、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が含まれる。
ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために、インビトロ及び／又はインビボ細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実施して、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（したがって、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）が、ＦｃＲｎ結合能を保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための初代細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７－４９２（１９９１）に要約される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号、米国特許第５，８２１，３３７号に記載されている。代替において、又は、加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボにおいて、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６５２－６５６（１９９８）に開示されるもの等、例えば、動物モデルにおいて評価され得る。抗体がＣｌｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃｌｑ結合アッセイを行うこともできる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣｌｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ １０１：１０４５－１０５２（２００３）；ａｎｄ Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ Ｍ．Ｉ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３：２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビボでのクリアランス／半減期の決定もまた、当該分野で公知の方法（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ ａｌ，Ｉｎｔ ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）を参照されたい）を用いて行うことができる。
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、抗体分子の提案された機能、特に必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭのドメインであり得る。特に、抗体分子が治療用途を意図し、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプを使用することができる。あるいは、抗体分子が治療目的を意図しており、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用してもよい。これらの定常領域ドメインの配列バリアントも使用され得ることが理解されるであろう。
グリコシル化変異体
特定の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように変更される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が作成又は除去されるようにアミノ酸配列を変更することによって都合よく達成され得る。
ヒト化抗体、ヒト抗体及びキメラ抗体
本発明の抗体は、ヒト化抗体、完全ヒト抗体又はキメラ抗体であり得るが、これらに限定されない。
一実施形態では、抗体はヒト化されている。より具体的には、抗ＩＬ２２抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体又はヒト化抗体である。
特定の実施形態において、本明細書中に提供される抗体は、キメラ抗体である。キメラ抗体の例は、例えば米国特許第４，８１６，５６７；及びＭｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１－６８５５（１９８４））に記載される。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、又は非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。別の例では、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが、親抗体のクラス又はサブクラスから変更された「クラス切替」抗体である。
キメラ抗体は、要素がそれが由来する種の特徴を保持するように、２つの異なる種に由来する要素から構成される。一般に、キメラ抗体は、１つの種由来の可変領域、例えばマウス、ラット、ウサギ、又はヒト等の別の種由来の類似の定常領域を含むであろう。
特定の実施形態では、キメラ抗体はヒト化抗体である。
ＣＤＲ全体ではなくＣＤＲの特異性決定残基を移入するだけでよいことが理解されよう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ，３６，２５－３４を参照）。ヒト化抗体は、任意に、ＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する１つ又は複数のフレームワーク残基を更に含み得る。
適切には、本発明によるヒト化抗体は、ヒト受容体フレームワーク領域並びに１つ又は複数のＣＤＲを含み、任意に１つ又は複数のドナーフレームワーク残基を更に含む可変ドメインを有する。
一実施形態では、抗体はヒト化抗体であり、可変ドメインはヒト受容体フレームワーク領域及び非ヒトドナーＣＤＲを含む。
ＣＤＲがグラフトされる場合、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含む、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプを考慮して、任意の適切な受容体可変領域フレームワーク配列が使用され得る。
本発明において使用され得るヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．）である。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭを重鎖に使用することができ、ＲＥＩを軽鎖に使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭを重鎖及び軽鎖の両方に使用することができる。あるいは、ヒト生殖系列配列を使用してもよく、これらは、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで入手可能である。実施形態では、受容体フレームワークがＩＧＫＶ１Ｄ－１３ヒト生殖系列、ＩＧＨＶ３－６６ヒト生殖系列、ＩＧＫＶ１－１２ヒト生殖系列及び／又はＩＧＨＶ４－３１ヒト生殖系列である。実施形態において、ヒトフレームワークは、１～５、１～４、１～３又は１～２個のドナー抗体アミノ酸残基を含む。
本発明のヒト化抗体において、受容体重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望であれば、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含み得る。
いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で公知の様々な技術を使用して産生され得る。より具体的には、抗ＩＬ２２抗体は、ヒト抗体重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域を含む。
ヒト抗体は、抗体の可変領域又は全長鎖がヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を使用する系から得られる場合、特定の生殖系列配列に由来する重鎖若しくは軽鎖可変領域又は全長重鎖若しくは軽鎖を含む。そのようなシステムには、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを目的の抗原で免疫すること、又はファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリを目的の抗原でスクリーニングすることが含まれる。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来するヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列に配列が最も近い（すなわち、最大％の同一性）ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択することによって、そのように同定することができる。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来するヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異又は部位特異的変異の意図的な導入に起因して、生殖系列配列と比較してアミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、選択されたヒト抗体は、典型的には、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖系列配列）と比較した場合、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、ヒト抗体をヒトであると同定するアミノ酸残基を含有する。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、又は少なくとも９５％、又は更には少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０個以下のアミノ酸差を示すであろう。特定の場合において、ヒト抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から５個以下、又は更には４個、３個、２個又は１個以下のアミノ酸差を示し得る。
ヒト抗体は、当業者に公知の多くの方法によって産生され得る。ヒト抗体は、ヒト骨髄腫又はマウス－ヒトヘテロミエローマ細胞株を使用するハイブリドーマ法によって作製することができる（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ；（１９８４）１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ５１－６３，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ，１９８７）。代替的な方法には、ファージライブラリ又はトランスジェニックマウスの使用が含まれ、その両方がヒト可変領域レパートリを利用する（（Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ；（１９９４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２：４３３－４５５，Ｇｒｅｅｎ ＬＬ，（１９９９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１ １－２３）。ヒト抗体は、例えば、マウス免疫グロブリン可変遺伝子及び場合により定常領域遺伝子が、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号及び米国特許第５，７７０，４２９号に記載されるように、それらのヒト対応物によって置き換えられているマウスによって産生され得る。
エフェクター分子
所望であれば、本発明による抗体は、１つ又は複数のエフェクター分子（複数可）にコンジュゲート化され得る。一実施形態では、抗体はエフェクター分子に結合していない。
エフェクター分子は、本発明の抗体に結合され得る単一部分を形成するように連結された単一のエフェクター分子又は２つ以上のそのような分子を含み得ることが理解されるであろう。エフェクター分子に連結された抗体フラグメントを得ることが望ましい場合、これは、抗体フラグメントが直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結される標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。そのようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせるための技術は、当技術分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３－５３；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９－５８ ａｎｄ Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７－１２３を参照）。特定の化学的手順としては、例えば、国際公開第９３／０６２３１号、国際公開第９２／２２５８３号、国際公開第８９／００１９５号、国際公開第８９／０１４７６号及び国際公開第０３／０３１５８１号に記載されているものが挙げられる。あるいは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、例えば国際公開第８６／０１５３３号及び欧州特許第０３９２７４５号に記載されるように、組換えＤＮＡ手順を使用して連結を達成することができる。
エフェクター分子の例としては、細胞に有害な（例えば、殺傷）任意の薬剤を含む細胞毒又は細胞傷害剤が挙げられ得る。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１－デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそれらの類似体又はホモログが挙げられる。
エフェクター分子には、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシス－ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン）及び抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も含まれるが、これらに限定されない。
他のエフェクター分子としては、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８等のキレート化放射性核種；又は限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミン等の薬物が挙げられ得る。
他のエフェクター分子としては、タンパク質、ペプチド及び酵素が挙げられる。目的の酵素には、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドとしては、限定されないが、免疫グロブリン、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素、タンパク質、例えば、インスリン、腫瘍壊死因子、α－インターフェロン、β－インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓剤又は抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン又はエンドスタチン、又は生物学的応答調節剤、例えば、リンホカイン、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）あるいは他の成長因子及び免疫グロブリンが挙げられる。
他のエフェクター分子は、例えば診断に有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、（陽電子放出断層撮影に使用するための）陽電子放出金属、及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。診断薬として使用するために抗体にコンジュゲートさせることができる金属イオンについては、一般に米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族としては、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンが挙げられ、適切な蛍光材料としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリン；適切な発光材料としては、ルミノールが挙げられ、適切な生物発光材料としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが挙げられ、適切な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃが挙げられる。
別の例では、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を増加させ、及び／又は抗体の免疫原性を低下させ、及び／又は免疫系に対する上皮バリアを横切る抗体の送達を増強し得る。このタイプの適切なエフェクター分子の例としては、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、又は国際公開第２００５／１１７９８４号に記載されているもの等のアルブミン結合化合物が挙げられる。
エフェクター分子がポリマーである場合、それは一般に、合成又は天然に存在するポリマー、例えば任意に置換された直鎖若しくは分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン若しくはポリオキシアルキレンポリマー又は分岐若しくは非分岐多糖、例えばホモ又はヘテロ多糖であり得る。
上記の合成ポリマー上に存在し得る特定の任意選択の置換基としては、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が挙げられる。
合成ポリマーの具体例としては、置換されていてもよい直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に置換されていてもよいポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が挙げられる。
具体的な天然に存在するポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はそれらの誘導体が挙げられる。
一実施形態では、ポリマーは、アルブミン又はそのフラグメント、例えばヒト血清アルブミン又はそのフラグメントである。
ポリマーのサイズは、所望に応じて変えることができるが、一般に、５００Ｄａ～５００００Ｄａ、例えば５０００～４００００Ｄａ、例えば２００００～４００００Ｄａの平均分子量範囲である。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図される用途、例えば腫瘍等の特定の組織に局在する能力又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択され得る（総説については、Ｃｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４，５３１－５４５を参照されたい）。したがって、例えば、生成物が循環を離れ、例えば腫瘍の治療に使用するために組織に浸透することを意図している場合、例えば約５０００Ｄａの分子量を有する低分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が循環中に留まる用途では、例えば２００００Ｄａ～４００００Ｄａの範囲の分子量を有する高分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。
適切なポリマーとしては、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）又は特にメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体、特に約１５０００Ｄａ～約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するものが挙げられる。
一例において、本発明による抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合している。特定の一実施形態では、本発明による抗原結合フラグメント及びＰＥＧ分子は、抗体フラグメント中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して結合され得る。そのようなアミノ酸は、抗体フラグメント中に天然に存在し得るか、又は組換えＤＮＡ法を使用してフラグメントに操作され得る（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号；米国特許第５，６６７，４２５号；国際公開第９８／２５９７１号；国際公開第２００８／０３８０２４号を参照されたい）。１つの例において、本発明の抗体分子は、改変されたＦａｂフラグメントであり、ここで、改変は、エフェクター分子の付着を可能にするためのその重鎖のＣ末端への１つ又は複数のアミノ酸の付加である。適切には、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が結合し得る１つ又は複数のシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を形成する。複数の部位を使用して、２つ以上のＰＥＧ分子を結合することができる。
適切には、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントに位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合している。修飾抗体フラグメントに結合した各ポリマー分子は、フラグメント中に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合していてもよい。共有結合は、一般にジスルフィド結合、又は特に硫黄－炭素結合である。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体等のチオール選択的誘導体を使用することができる。活性化ポリマーは、上記のポリマー修飾抗体フラグメントの調製における出発材料として使用され得る。活性化ポリマーは、α－ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィド等のチオール反応性基を含む任意のポリマーであり得る。そのような出発材料は、商業的に得られてもよく（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡから）、又は従来の化学的手順を使用して商業的に入手可能な出発材料から調製されてもよい。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ－ＰＥＧ－アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから得ることができる）及びＭ－ＰＥＧ－ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから得ることができる）が含まれる。
一実施形態では、抗体は、例えば欧州特許第０９４８５４４号又は欧州特許第１０９００３７号［“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ），Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ ａｎｄ “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ ａｎｄ Ａ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２００２，５４：５３１－５４５も参照されたい］に開示されている方法に従って、ＰＥＧ化されている、すなわちＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））がそれに共有結合している修飾Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント又はｄｉＦａｂである。一例では、ＰＥＧはヒンジ領域内のシステインに結合している。一例では、ＰＥＧ修飾Ｆａｂフラグメントは、修飾ヒンジ領域内の単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リジン残基は、マレイミド基に共有結合していてもよく、リジン残基上の各アミン基に、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合していてもよい。したがって、Ｆａｂフラグメントに結合したＰＥＧの総分子量は、約４０，０００Ｄａであり得る。
一実施形態では、抗体は、その重鎖のＣ末端に、エフェクター分子が結合している少なくとも１つのシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を有する修飾Ｆａｂ’フラグメントである。適切には、エフェクター分子はＰＥＧであり、（国際公開第９８／２５９７１号及び国際公開第２００４０７２１１６号又は国際公開第２００７／００３８９８号に記載されている方法を使用して結合される。エフェクター分子は、国際特許出願国際公開第２００５／００３１６９号、国際公開第２００５／００３１７０号及び国際公開第２００５／００３１７１号に記載されている方法を使用して抗体フラグメントに結合させることができる。
一実施形態では、抗体はエフェクター分子に結合していない。
ポリヌクレオチド及びベクター
本発明はまた、本発明による抗体又はその一部をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明による単離されたポリヌクレオチドは、例えば化学処理によって生成された合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はそれらの任意の組合せを含み得る。
好適な配列の例を本明細書中に提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、７３、７５、７７、７９、８１及び８３に示される配列を含む、抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一実施形態では、本発明は、それぞれ配列番号２９、３１、３３に示される配列を含む本発明の抗体Ｆａｂフラグメント又はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４Ｐ抗体の重鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
配列番号７９、８１、８３にそれぞれ示される配列を含む本発明の抗体Ｆａｂフラグメント又はＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体の軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドも提供される。
別の実施形態において、本発明は、本発明のＦａｂ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、重鎖をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２９又は７９に示される配列を含み、軽鎖をコードするポリヌクレオチドは配列番号２７又は７７に示される配列を含む。
本発明はまた、本明細書に記載の１つ又は複数のポリヌクレオチドを含むクローニング又は発現ベクターを提供する。一例において、本発明によるクローニング又は発現ベクターは、配列番号２３、２５、２７、２９、３１、３３、７３、７５、７７、７９、８１及び８３から選択される配列を含む１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチドを含む。
分子生物学の標準的な技術を使用して、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して完全に又は部分的に合成され得る。部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術が必要に応じて使用され得る。
ベクターを構築することができる一般的な方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者に周知である。この点に関しては、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照されたい。
抗体及びその抗原結合フラグメントを産生するための宿主細胞
本発明による１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチド配列、又は本発明の抗体をコードする１つ又は複数の単離されたポリヌクレオチド配列を含む１つ又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列の発現のために使用することができる。細菌、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び他の微生物系を使用してもよく、又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
更なる実施形態では、そのような核酸（複数可）又はベクター（複数可）を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態では、宿主細胞は、（１）抗ＩＬ２２抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗ＩＬ２２抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗ＩＬ２２抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗ＩＬ２２抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、それらによって形質転換されている）。一実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、宿主細胞は原核細胞、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。一実施形態では、抗ＩＬ２２抗体を作製する方法が提供され、上記の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養すること、及び場合により抗体を宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から回収することを含む方法が提供される。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要でない場合、細菌において産生され得る。細菌における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における抗体フラグメントの発現を記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５－２５４も参照されたい）。発現後、抗体は、可溶性画分で細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母等の真核微生物は、グリコシル化経路が部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす「ヒト化」真菌及び酵母株を含む、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０－２１５（２００６）を参照されたい。
本発明での使用に適した種類のチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）には、ＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用され得るＣＨＯ－ＤＧ４４細胞及びＣＨＯ－ＤＸＢ１１細胞等のｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ及びＣＨＯ－Ｋ１細胞、又はグルタミンシンセターゼ選択可能マーカーと共に使用され得るＣＨＯＫ１－ＳＶ細胞が含まれ得る。抗体の発現に使用される他の細胞型としては、リンパ球系細胞株、例えば、ＮＳ０骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞が挙げられる。宿主細胞は、本発明による単離されたポリヌクレオチド配列又は発現ベクターで安定に形質転換又はトランスフェクトされ得る。
抗体の製造プロセス
本発明はまた、本発明による抗体を産生するのに適した条件下で本発明による宿主細胞を培養すること、及び抗体を単離することを含む、本発明による抗体の産生方法を提供する。
抗体は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含み得、その場合、宿主細胞をトランスフェクトするために重鎖又は軽鎖ポリペプチドコード配列のみを使用する必要がある。重鎖及び軽鎖の両方を含む抗体又はその抗原結合フラグメントの産生のために、細胞株を、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つのベクターでトランスフェクトすることができる。あるいは、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターを使用してもよい。
したがって、宿主細胞を培養し、抗体を発現させ、抗体を単離し、場合により抗体を精製して単離された抗体を提供するためのプロセスが提供される。一実施形態では、プロセスは、単離された抗体にエフェクター分子をコンジュゲートさせる工程を更に含む。
本発明はまた、本発明のベクターを含む宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質の発現をもたらすのに適した条件下で培養すること、及び抗体分子を単離することを含む、本発明による抗体の製造方法を提供する。
抗体分子は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含み得、その場合、宿主細胞をトランスフェクトするために重鎖又は軽鎖ポリペプチドコード配列のみを使用する必要がある。重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物の製造のために、細胞株を、軽鎖ポリペプチドをコードする第１のベクター及び重鎖ポリペプチドをコードする第２のベクターの２つのベクターでトランスフェクトすることができる。あるいは、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターを使用してもよい。
本発明による抗体は、宿主細胞から良好なレベルで発現される。したがって、抗体の特性は、商業的処理のために最適化されていると思われる。
精製抗体
一実施形態では、精製抗体、例えばヒト化抗体、特に本発明による抗体が、エンドトキシン及び／又は宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡから実質的に精製されている、特にエンドトキシン及び／又は宿主細胞タンパク質若しくはＤＮＡを含まない、又は実質的に含まないもので提供される。
エンドトキシンを実質的に含まないとは、一般に、抗体産物１ｍｇ当たり１ＥＵ又はそれ未満、例えば産物１ｍｇ当たり０．５又は０．１ＥＵのエンドトキシン含有量を指すことを意図する。
宿主細胞タンパク質又はＤＮＡを実質的に含まないとは、一般に、必要に応じて、宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含有量が抗体産物１ｍｇ当たり４００μｇ以下、例えば１００μｇ／ｍｇ以下、特に２０μｇ／ｍｇを指すことを意図する。
抗体のインビトロ及びエクスビボ使用
本発明はまた、ＩＬ－２２誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害するインビトロ又はエクスビボ方法を提供し、ケラチノサイト細胞を本発明の抗体と接触させ、インキュベートすることを含む方法を提供する。例えばＨａＣａＴ細胞を含む、任意のケラチノサイト細胞及びそれらの誘導体を使用することができる。
本発明は更に、ＩＬ－２２誘導性ＩＬ－１０放出を阻害するインビトロ又はエクスビボ方法を提供し、方法は、上皮細胞を本発明による抗体と接触させ、インキュベートすることを含む。より具体的には、ＣＯＬＯ２０５細胞を使用することができる。
ＩＬ２２誘導のｓ１００Ａ７放出を阻害するインビトロ又はエクスビボ方法が提供され、方法は、ケラチノサイトを本発明による抗体と接触させ、インキュベートすることを含む。
異常なケラチノサイト分化及び錯角化症に関連するＩＬ２２誘導性の表皮又は角膜の肥厚を阻害するインビトロ又はエクスビボ方法も提供され、方法は、ケラチノサイト及び真皮線維芽細胞からなる再構成上皮を本発明による抗体と接触させ、インキュベートすることを含む方法。特に、ＩＬ２２によって誘導される表皮／角膜の肥厚及び錯角化症によって実証される異常なケラチノサイトの増殖及び分化が阻害される。
細胞は一般に、抗体がＩＬ２２に結合し、生物学的効果を引き起こすのに十分な時間インキュベートされる。
例は、特定の生物学的効果を達成するために使用することができる抗ＩＬ２２抗体を含む方法の説明を提供する。
抗体の治療的使用
本発明の抗体、その製剤又は医薬組成物は、予防的処置及び／又は治療的処置のために投与され得る。
本発明は、医薬品として使用するための本発明の抗ＩＬ２２抗体又はその医薬組成物を提供する。
予防的適用において、抗体、製剤又は組成物は、本明細書中に記載されるような障害又は状態のリスクがある対象に、その状態又はその症状の１つ若しくは複数のその後の影響を防止するか又は低下させるのに十分な量で投与される。
治療用途では、抗体は、本明細書に記載の障害又は状態に既に罹患している対象に、その状態又はその症状の１つ又は複数を治癒、緩和又は部分的に停止させるのに十分な量で投与される。そのような治療的処置は、疾患症状の重症度の低下、又は無症状期間の頻度若しくは持続期間の増加をもたらし得る。
処置される対象は動物であり得る。好ましくは、本発明による医薬組成物は、ヒト対象への投与に適合されている。
本発明は、本明細書に記載の障害又は状態を治療することを必要とする対象において本明細書に記載の障害又は状態を治療する方法を提供し、方法は、本発明による抗体を対象に投与することを含む。そのような抗体は、治療有効量で投与される。
本発明はまた、本明細書中に記載されるような障害又は状態の治療において使用するための本発明の抗体を提供する。
治療適応症
本発明の抗体は、ＩＬ２２又はＩＬ２２Ｒ１活性に関連する任意の状態、例えば、ＩＬ２２Ｒ１受容体を介したシグナル伝達から全体的又は部分的に生じる任意の状態の治療、予防又は改善において使用され得る。
高レベルのＩＬ２２がヒト乾癬斑において見出されており（Ｂｏｎｉｆａｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４０７－４１５（２００７））、乾癬の病因におけるこのサイトカインの関与が皮膚炎症のマウスモデルにおいて実証されている（Ｖａｎ Ｂｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｊａｎｕａｒｙ １；１８８（１）：４６２－９（２０１２））。ＩＬ２２Ｒ１を介してシグナルを伝達するＩＬ２２等のリガンドは、多くの疾患に関与しており、ＩＬ２２Ｒ１は上皮細胞及び間質細胞で主に発現されるため、重要な疾患は、例えば皮膚の間質及び上皮に影響を及ぼす疾患である。
本発明の抗体及び組成物は、炎症性皮膚状態を治療するために使用することができる。特定の実施形態では、炎症性皮膚状態は、乾癬、乾癬性関節炎、接触性皮膚炎、慢性手湿疹又はアトピー性皮膚炎から選択される。具体的には、炎症性皮膚状態は、アトピー性皮膚炎である。
特に、本発明の抗体及び組成物は、異常なＩＬ２２媒介性ケラチノサイト増殖及び分化を減少させることによって、炎症性皮膚状態と診断された対象における異常なケラチノサイト分化及び錯角化症に関連するＩＬ２２媒介性表皮肥厚を阻害するために使用され得る。
その結果、本発明は、炎症性皮膚状態と診断された対象における皮膚のバリア機能障害、及び／又は錯角化症、並びに／あるいはサイトカイン及び／又は抗菌ペプチドの放出、例えばＳ１００Ａ７を減弱する方法を提供し、方法は、本発明で提供される抗体を当該対象に投与することを含む。
更に別の実施形態では、本発明は、炎症性皮膚状態と診断された対象において、皮膚のバリア機能障害、及び／又は錯角化症、並びに／あるいはサイトカイン及び／又は抗菌ペプチド、例えばＳ１００Ａ７の放出を減衰させるのに使用するための本発明の抗体を提供する。
更に別の実施形態では、本発明は、皮膚炎症性疾患と診断された対象における、皮膚のバリア機能障害、及び／又は錯角化症、並びに／あるいはサイトカイン及び／又は抗菌ペプチド、例えばＳ１００Ａ７の放出を減衰させるための医薬品を製造するための本発明の抗体の使用を提供する。
特に、皮膚の障害されたバリア機能のそのような減衰は、異常なＩＬ－２２媒介ケラチノサイト増殖及び分化を減少させることによって達成される。
本発明の抗体及び組成物は、免疫細胞又は造血細胞（例えば、骨髄系細胞、リンパ系細胞若しくは赤血球系細胞、又はそれらの前駆細胞等）の増殖、分化及び／又は生存を直接的又は間接的に阻害するために使用され得る。
本発明の抗体及び組成物は、様々な免疫障害及び過剰増殖性障害を治療するために使用することができる。
治療することができる免疫障害の例には、自己免疫障害、例えば、関節炎（関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎、狼瘡関連関節炎又は強直性脊椎炎を含む）、強皮症、全身性エリテマトーデス、ＨＩＶ、シェーグレン症候群、血管炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、重症筋無力症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、真性糖尿病（Ｉ型）；例えば、皮膚（例えば、乾癬）、心血管系（例えば、アテローム性動脈硬化症）、神経系（例えば、アルツハイマー病）、肝臓（例えば、肝炎）、腎臓（例えば、腎炎）及び膵臓（例えば、膵炎）の炎症状態；心血管障害、例えば、コレステロール代謝障害、酸素フリーラジカル損傷、虚血；創傷治癒に関連する障害；呼吸器障害、例えば、喘息及びＣＯＰＤ（例えば、嚢胞性線維症）；急性炎症状態（例えば、エンドトキシン血症、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ及びｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、毒素性ショック症候群及び感染性疾患）；移植拒絶反応及びアレルギーが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の抗体及び組成物は、ＩＬ－２２関連障害、例えば、関節炎障害、例えば、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、乾癬性関節炎又は強直性脊椎炎；呼吸器疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））；心血管系（例えば、アテローム性動脈硬化症）、神経系（例えば、アルツハイマー病）、肝臓（例えば、肝炎）、腎臓（例えば、腎炎）、膵臓（例えば、膵炎）及び胃腸器官、例えば大腸炎、クローン病及びＩＢＤ；急性炎症状態、例えば、内毒素血症、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ及びｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、中毒性ショック症候群及び感染症；多臓器不全；呼吸器疾患（ＡＲＤ）；アミロイド症；腎症、例えば、糸球体硬化症、膜性ニューロパシー、腎動脈硬化症、糸球体腎炎、腎臓の線維増殖性疾患、並びに他の腎臓機能不全及び腎腫瘍を治療するために使用することができる。
本発明の抗ＩＬ－２２抗体及び組成物は、上皮癌、例えば癌腫、メラノーマ等を治療するために使用することができる。これらの疾患状態及び他の疾患状態におけるＩＬ－２２阻害は、国際公開第０３／０８３０６２号に開示されている。
本発明の抗体及び組成物は、ヒトの多発性硬化症を治療するために同様に使用され得る。多発性硬化症のマウスモデル（Ｔｕｏｈｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４１：１１２６－１１３０）、Ｓｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８４）１３２：２３９３－２４０１）、及びＴｒａｕｇｏｔｔ（Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８９）１１９：１１４－１２９）では、抗ＩＬ２２抗体によるマウスの処置は、疾患の発症を大いに遅延させ得る。
本発明の抗体及び組成物は、関節リウマチ（ＲＡ）又は他の関節炎疾患を治療するために使用され得る。ＲＡ滑膜生検では、ＩＬ２２タンパク質はビメンチン＋滑膜線維芽細胞及びいくつかのＣＤ６８＋マクロファージで検出され、ＩＬ２２Ｒ１が滑膜線維芽細胞で検出される。ＩＬ２２の阻害剤は、関節リウマチ（国際公開第２００５／０００８９７号；米国特許第６，９３９，５４５号）の症状を改善する。
本発明の抗体及び組成物は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を低下させ、ＩＬ２２に依存する移植拒絶及び関連疾患（例えば、移植片対宿主病）を治療するために使用され得る。ＭＬＲ及び移植モデルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９４；Ｋａｓａｉａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）１６：５５９－５６９））によって記載されている。
本発明の抗体及び組成物はまた、ＩＬ２２応答性細胞及びＩＬ２２Ｒ１／ＩＬ１０Ｒ２応答性細胞の異常な活性に関連する過剰増殖性障害を、対象におけるＩＬ２２及び／又はＩＬ２２Ｒ１及び／又はＩＬ１０Ｒ２応答性細胞の過剰増殖を阻害又は低減するのに十分な量で抗体を投与することによって治療するために使用され得る。
したがって、本発明の抗体は、新生物、例えば、扁平上皮癌、基底細胞癌、移行細胞乳頭腫及び癌腫、腺腫、腺癌、形質膜炎、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、ＶＩＰ産生腫瘍、胆管癌、肝細胞癌、腺様嚢胞癌、虫垂のカルチノイド腫瘍、プロラクチノーマ、膨大細胞腫、ハースル細胞腺腫、腎細胞癌腫、グラウィッツ腫瘍、多発性内分泌腺腫、類内膜腺腫、付属器官及び皮膚付属器官新生物、粘膜類表皮新生物、嚢胞性、粘液性及び漿液性新生物、嚢胞腺腫、偽粘液腫、腹膜、管、小葉及び髄様新生物、腺細胞新生物、複合上皮新生物、ワールチン腫瘍、胸腺腫、特殊性間質新生物、性腺索腫瘍、髄膜腫、顆粒膜細胞腫瘍、男化腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、傍神経節腫、褐色細胞腫、グロムス腫瘍、色素性母斑、悪性黒色腫、黒色腫、結節性黒色腫、異形成性母斑、悪性黒子、表在拡大型黒色腫、又は末端黒子型黒色腫の進行を阻害するために使用され得る。
本発明の抗体及び組成物はまた、対象における急性期応答を低下させるために使用され得る。
本発明の抗体及び組成物はまた、シェーグレン症候群、又は肝癌、脂肪肉腫、口腔扁平上皮癌、結腸及び結腸直腸癌、膵臓癌、小細胞及び大細胞肺癌、乳癌、神経膠芽腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫から選択される癌を治療するために使用され得る。
抗体及びその抗原結合フラグメントの診断的使用
本発明はまた、例えば、皮膚炎症性疾患又はその重症度を診断するための診断活性薬剤としての、又は診断アッセイにおける本発明の抗体の使用を提供する。
診断は、好ましくは、生物学的試料に対して行われ得る。「生物学的試料」は、個体から得られた様々な試料タイプを包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに使用することができる。定義は、脳脊髄液、血漿及び血清等の血液、並びに尿及び唾液等の生物学的起源の他の液体試料、生検標本又は組織培養物等の固体組織試料、又はそれらに由来する細胞及びそれらの子孫を包含する。この定義はまた、例えば、試薬による処置、可溶化、又はポリヌクレオチド等の特定の成分の濃縮等によって、それらの調達後に何らかの方法で操作された試料を含む。
診断試験は、好ましくは、ヒト又は動物の身体と接触していない生物学的試料に対して行われ得る。このような診断試験は、インビトロ試験とも呼ばれる。インビトロ診断試験は、対象から得られた生物学的試料中の遊離ＩＬ２２（例えば、ＩＬ２２ＢＰに結合していない）を検出するインビトロ方法に依存し得る。
医薬組成物及び診断組成物
本発明の抗体は、医薬組成物中に提供され得る。医薬組成物は通常無菌であり、薬学的に許容され得るアジュバント及び／又は担体を更に含み得る。
本発明の抗体は、本明細書中に記載されるような障害又は状態の治療、診断及び／又は予防において有用であるので、本発明はまた、本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントを薬学的に許容され得る担体、賦形剤又は希釈剤の１つ又は複数と組み合わせて含む医薬組成物又は診断組成物を提供する。
特に、抗体又はその抗原結合フラグメントは、１つ又は複数の薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤又は担体を含む医薬組成物として提供される。
これらの組成物は、治療有効成分（複数可）に加えて、薬学的に許容され得る賦形剤、担体、希釈剤、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は非毒性であるべきであり、有効成分の有効性を妨害してはならない。
本発明の抗ＩＬ２２抗体、又は本発明の抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物（医薬製剤を含む）も提供される。特定の実施形態では、組成物は、本発明の１つ若しくは複数の抗体、又は本発明の１つ若しくは複数の抗体をコードする配列を含む１つ若しくは複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野で周知の適切な担体、例えば薬学的に許容され得る賦形剤及び／又は緩衝剤を含むアジュバントを更に含み得る。
本発明の抗体の医薬組成物は、所望の純度を有するそのような抗体を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の１つ又は複数の任意の薬学的に許容され得る担体と混合することによって調製される。
上記の技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓに見ることができる。
薬学的に許容され得る担体は、一般に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝液：アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質複合体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における例示的な薬学的に許容され得る担体としては、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）が更に挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼ等の１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。
有効成分は、例えばコアセルベーション技術によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース、又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
徐放性製剤も調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形物品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般に無菌である。滅菌は、例えば滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成され得る。
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤としては、米国特許第６，１７１，５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン－酢酸緩衝液を含む。
本発明の医薬組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容される塩を含み得る。
薬学的に許容され得る担体は、水性担体又は希釈剤を含む。本発明の医薬組成物に用いられ得る適切な水性担体の例としては、水、緩衝水及び生理食塩水が挙げられる。他の担体の例としては、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物、オリーブ油等の植物油、並びにオレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられる。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物に含めることが望ましい。
医薬組成物は、典型的には、製造及び貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高薬物濃度に適した他の秩序構造物として製剤化することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は唯一の有効成分である。別の実施形態では、本発明の抗体は、１つ又は複数の追加の活性成分と組み合わせられる。あるいは、医薬組成物は、唯一の有効成分である本発明の抗体を含み、他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、連続的に、又は別々に）患者に個別に投与され得る。
担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば経口、静脈内、皮膚又は皮下、経鼻、筋肉内及び腹腔内の経路に依存し得る。例えば、固体経口形態は、活性物質と共に、希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチ又はジャガイモデンプン；潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウム、及び／又はポリエチレングリコール；結合剤、例えば、デンプン、アラビアガム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン；離解剤（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇａｇｅｎｔ）、例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩又はデンプングリコール酸ナトリウム；発泡混合物；染料；甘味料；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩、並びに一般に、医薬製剤に使用される非毒性及び薬理学的に不活性な物質を含有し得る。そのような医薬製剤は、例えば、混合、造粒、打錠、糖衣又はフィルムコーティングプロセスによって公知の方法で製造することができる。
経口製剤には、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常用いられる賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤又は粉末の形態をとり、１０％～９５％、好ましくは２５％～７０％の有効成分を含有する。医薬組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥材料は、投与前に再構成され得る（例えば、懸濁液）。再構成は、好ましくは緩衝液中で行われる。
静脈内投与又は注入のための溶液は、担体として、例えば滅菌水を含有してもよく、又は好ましくは滅菌水性等張食塩水の形態であってもよい。
好ましくは、医薬組成物又は診断組成物は、本発明によるヒト化抗体を含む。
治療有効量及び投与量の決定
本発明による抗体及び医薬組成物は、必要とされる治療有効量を特定するために患者に適切に投与され得る。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかで最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な投与量及び投与経路を決定することができる。
ヒト対象に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ（複数可）、反応感受性及び治療に対する耐性／応答に依存するであろう。組成物は、用量当たり所定量の本開示の活性剤を含有する単位用量形態で好都合に提供され得る。本明細書中に記載される実施形態のいずれかのための用量範囲及びレジメンは、１ｍｇ～１０００ｍｇ単位用量の範囲の用量が含まれるが、これらに限定されない。
本発明の抗体又は医薬組成物の適切な投与量は、当業者によって決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者にとって毒性でなく、特定の患者、組成物、及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るように変化し得る。選択される投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、治療の期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野で周知の同様の因子を含む様々な薬物動態学的因子に依存する。
適切な用量は、例えば、治療される患者の約０．０１μｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には約０．１μｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整され得る。例えば、単回用量を投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少又は増加させてもよい。本明細書で使用される場合、投与単位形態は、治療される対象に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。
医薬組成物又は製剤の投与
本明細書中に記載される抗体又はその製剤若しくは組成物は、予防的処置及び／又は治療的処置のために投与され得る。
本発明の抗体又は医薬組成物は、当技術分野で公知の様々な方法のうち１つ又は複数を使用して、１つ又は複数の投与経路を介して投与され得る。当業者には理解されるように、投与経路及び／又は投与様式は、所望の結果に応じて変化する。本発明の抗体又は医薬組成物の投与経路の例としては、例えば注射又は注入による、静脈内、筋肉内、皮内、眼内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口投与経路が挙げられる。あるいは、本発明の抗体又は医薬組成物は、局所、表皮又は粘膜投与経路等の非経口経路を介して投与され得る。本発明の抗体又は医薬組成物は、経口投与用であり得る。
投与に適した形態としては、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は持続注入による、静脈内、吸入可能又は皮下形態での非経口投与に適した形態が挙げられる。製品が注射又は注入用である場合、それは油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形態をとることができ、懸濁剤、保存剤、安定剤及び／又は分散剤等の追加の薬剤を含有することができる。あるいは、本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントは、使用前に適切な滅菌液で再構成するための乾燥形態であってもよい。注射前の液体ビヒクル中への溶解又は液体ビヒクル中への懸濁に適した固体形態も調製することができる。
製剤化されると、本発明の医薬組成物は対象に直接投与され得る。したがって、医薬品を製造するための本発明による抗体又はその抗原結合フラグメントの使用が本明細書で提供される。
製品及びキット
本開示はまた、本発明の抗ＩＬ２２抗体と、使用説明書と、を含むキット提供する。キットは、１つ又は複数の追加の試薬、例えば上で検討される追加の治療薬又は予防薬を更に含み得る。
本発明は、医薬品を製造するための本発明による抗体又はその医薬組成物の使用を提供する。
本発明はまた、本明細書中に記載されるような障害又は状態を治療するための医薬品を製造するための本発明の抗体の使用を提供する。
特定の実施形態では、製造品又はキットは、本発明の１つ又は複数の抗体又は本明細書に記載される組成物を含有する容器を含む。特定の実施形態では、製造品又はキットは、本明細書に記載の１つ（又は複数）の抗体をコードする核酸（複数可）又は組成物を含有する容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の抗体を産生する細胞又は細胞株を含む。
特定の実施形態では、製品又はキットは、容器と、容器上の又は容器に関連するラベル又は添付文書とを含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、又は治療、予防及び／又は診断に有効な別の組成物と組み合わせて組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してもよい。組成物中の少なくとも１つの薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が炎症性皮膚状態、より具体的にはアトピー性皮膚炎の治療に使用されることを示す。
上記の実施形態は本発明を限定するものではなく例示するものであり、当業者は特許請求の範囲から逸脱することなく多くの代替実施形態を設計することができることに留意されたい。特許請求の範囲において、括弧の間に置かれたいかなる参照符号も、特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
本発明に含まれる配列を表８～１０に示す：









例
例１．治療用抗ＩＬ２２抗体１１０４１及び１１０７０の作製及び選択
異なる種にわたる多数の動物（マウス、ラット及びウサギを含む）を、精製された自家製造ヒトＩＬ２２又は市販のヒトＩＬ２２（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかで免疫した。３～５回の注射の後、動物を屠殺し、ＰＢＭＣ、脾臓、骨髄及びリンパ節を採取した。ＥＬＩＳＡでヒト及びカニクイザルＩＬ２２への結合について血清を監視した。
１１０４１の場合、メモリーＢ細胞培養物を準備し、ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌシステムでのビーズベースのアッセイにおいて、ヒト及びカニクイザルＩＬ２２に結合するそれらの能力について上清を最初にスクリーニングした。これは、Ｓｏｌ－Ｒストレプトアビジンビーズ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）上にコーティングされたビオチン化ヒトＩＬ２２及びビオチン化カニクイザルＩＬ２２並びにリビール剤としてのヤギ抗ウサギＦｃ－ＦＩＴＣコンジュゲートを使用した均一マルチプレックス検定であった。
合計１２×（１６４－４００）プレートＢ培養実験からの一次ミラーボールスクリーニングにおいて、約４５００個のＩＬ２２特異的陽性ヒットが同定された。次いで、このアッセイからの陽性上清を、以下による更なる特徴付けのために進行させた：
・ＥＬＩＳＡ、ヒト及びカニクイザルＩＬ－２２への結合を確認するため、
・中和剤を同定するためのＩＬ２２依存性ＨＡＣＡＴホスホＳＴＡＴ３ ＨＴＲＦ細胞アッセイ（ＣｉｓＢｉｏ）への進行、及び
・オフレートを推定し、中和の作用様式を特徴付けるためのＢＩＡｃｏｒｅにおけるプロファイリング。
中和をビン１又はビン２のいずれかに分類した。ビン１は、ヒトＩＬ２２に結合し、ＩＬ２２Ｒ１の結合を妨げる抗体を表す。ビン２は、ヒトＩＬ２２に結合するがＩＬ２２Ｒ１の結合を可能にする抗体を表す。本発明者らは、ビン１を介して作用する抗体を選択していた。ホスホＳＴＡＴ３ ＨＴＲＦアッセイにおける中和を実証するウェル及び／又は望ましいＢＩＡｃｏｒｅプロファイルを有するウェルを、蛍光フォーカス法を使用してＶ領域回収のために進めた。
骨髄由来の形質細胞もまた、蛍光フォーカス法（１１０７０に関連する）を使用してヒトＩＬ２２に結合するそれらの能力について直接スクリーニングした。ここで、ＩＬ２２特異的抗体を分泌するＢ細胞を、ヤギ抗ラットＦｃ－ＦＩＴＣコンジュゲート明らかにする試薬を使用してストレプトアビジンビーズ上に固定化されたビオチン化ヒトＩＬ２２上に集めた。約３００個の直接焦点を選んだ。
選別された細胞の逆転写（ＲＴ）及びＰＣＲに続いて、抗体のＶ領域をコードする「転写活性ＰＣＲ」（ＴＡＰ）産物を生成し、ＨＥＫ－２９３細胞を一過性にトランスフェクトするために使用した。得られた組換え抗体を含有するＴＡＰ上清を、ヒトＩＬ２２及びカニクイザルＩＬ２２に結合し、ＢＩＡｃｏｒｅにおけるＩＬ２２Ｒ１結合を遮断し、ＨＡＣＡＴホスホＳＴＡＴ３ ＨＴＲＦ細胞アッセイにおいてＩＬ２２を中和する。
次いで、興味深いＴＡＰ産物からの重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子対をウサギ又はマウスＦａｂ抗体としてクローニングし、ＨＥＫ－２９３一過性発現系において再発現させた。合計で１３１個のＶ領域をクローニングし、配列決定した。次いで、組換えクローン化抗体を、ヒト及びカニクイザルＩＬ２２に結合し、ＢＩＡｃｏｒｅにおいてＩＬ２２Ｒ１結合を遮断し、ＣＯＬＯ２０５ ＩＬ－１０ＨＴＲＦ細胞ベースのアッセイ（ＣｉｓＢｉｏ）においてＩＬ２２依存性ＩＬ－１０放出を中和するそれらの能力について再試験した。この特徴付けの後、２つの抗体が基準、すなわちウサギ由来１１０４１及びラット由来１１０７０を満たした。
中和効力、ヒトＩＬ２２及びカニクイザルＩＬ２２の両方に対する親和性、ヒト化移植片におけるドナー含量（下記参照）及び発現データに基づいて、ウサギ由来１１０４１を更なる進行のために選択した。
例２．ヒト、カニクイザル及びマウスＩＬ２２に対するウサギ１１０４１の結合
ヒト、カニクイザル及びマウスＩＬ２２に対する精製１１０４１ウサギＦａｂの親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ウサギ１１０４１ Ｆａｂを固定化抗ウサギＩｇＧＦ（ａｂ’）２に捕捉し、続いて各種由来のＩＬ２２の滴定を行うことによって評価した。アミンカップリング化学を介してＣＭ５センサチップ上に約５０００応答単位（ＲＵ）の捕捉レベルまでＡｆｆｉｎｉｐｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を固定化した。流速１０μＬ／分のランニング緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。固定化ヤギ抗ウサギＦａｂによる捕捉のために、０．５μｇ／ｍＬの１１０４１Ｆａｂの１０μＬ注射を使用した。ヒトＩＬ２２、ＣｙｎｏＩＬ２２及びマウスＩＬ２２を、捕捉した１１０４１Ｆａｂ（０ｎＭ、０．６ｎＭ、１．８ｎＭ、５．５ｎＭ、１６．６ｎＭ及び５０ｎＭで）に対して３０μＬ／分の流速で滴定して親和性を評価した。ヒトＩＬ２２Ｒ１の遮断を、１００ｎＭ ＩＬ－２２を注射し（３０μＬ／分で１８０秒間）、続いてヒトＩＬ２２Ｒ１を注射する（５０ｎＭで１８０秒間）ことによって評価した。
５０ｍＭ ＨＣｌの２×１０μＬ注入によって表面を生成し、１０μＬ／分の流量で５ｍＭのＮａＯＨの１０μＬ注入によって散在させた。バックグラウンド減算結合曲線は、標準的な手順に従ってＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアを使用して分析した。速度論的パラメータをフィッティングアルゴリズムから決定した。ヒト、カニクイザル及びマウスＩＬ２２への精製１１０４１の結合の動態パラメータを表１１に示す。
表１１ ヒト、カニクイザル及びマウスＩＬ２２へのウサギ１１０４１の結合の速度論的パラメータ
例３．１１０４１のヒト化
抗体１１０４１を、ウサギＶ領域からのＣＤＲをヒト生殖系列抗体Ｖ領域フレームワークに移植することによってヒト化した。抗体の活性を回復するために、ウサギＶ領域からの多数のフレームワーク残基もヒト化配列に保持した。これらの残基は、Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（国際公開第９１／０９９６７号）によって概説されたプロトコルを用いて選択した。ウサギ抗体（ドナー）Ｖ領域配列とヒト生殖系列（受容体）Ｖ領域配列とのアラインメントを、設計されたヒト化配列と共に図１及び図２に示す。ドナーから受容体配列に移植されたＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔの組合せ定義が使用されるＣＤＲ－Ｈ１（Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９１／０９９６７号を参照されたい）を除いて、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７）によって定義される通りである。
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１Ｄ－１３＋ＩＧＫＪ４Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、抗体１１０４１軽鎖ＣＤＲの受容体として選択した。ヒト化グラフト変異体中の軽鎖フレームワーク残基は、いずれもヒト生殖系列遺伝子由来であるが、ドナー残基バリン（Ｖ２）及びバリン（Ｖ３）がそれぞれ保持されている残基２及び３（配列番号３８ ｇＬ１を参照して）を含む群からの残基は、存在しないか、１つ又は２つである。いくつかのヒト化グラフト変異体では、ＣＤＲＬ３の９１位の不対／遊離システイン残基をバリン（Ｃ９１Ｖ）又はセリン（Ｃ９１Ｓ）のいずれかへの変異によって除去した：遊離システイン残基は、システイニル化等の翻訳後修飾を受け得、共有結合性凝集及び安定性の低下に寄与し得る。この残基の突然変異は、表面プラズモン共鳴（表１２、ｇＬ１（Ｃ９１Ｖ）ｇＨ１（４１．９ｐＭ）又はｇＬ１（Ｃ９１Ｓ）ｇＨ１（１２．４ｐＭ）と比較したｇＬ１ｇＨ１（６４２ｐＭ））によって測定した場合、それぞれ、結合親和性の予想外の１５～５０倍の増加をもたらした。いくつかのヒト化グラフト変異体では、ＣＤＲＬ３中の潜在的なアスパラギン脱アミド部位を、位置９５のアスパラギン残基をアスパラギン酸（Ｎ９５Ｄ）で置換することによって、又は位置９６のセリン残基をアラニン（Ｓ９６Ａ）で置換することによって改変した。Ｓ９６Ａ変異による脱アミド部位の修飾は、脱アミドの基礎レベルを有意に低下させた。
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ３－６６＋ＩＧＨＪ４Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、抗体１１０４１の重鎖ＣＤＲの受容体として選択した。多くのウサギ抗体と同様に、抗体１１０４１のＶＨ遺伝子は、選択されたヒト受容体よりも短い。ヒト受容体配列と整列した場合、抗体１１０４１のＶＨ領域のフレームワーク１は、ヒト化抗体に保持されているＮ末端残基を欠く（図２）。１１０４１ウサギＶＨ領域のフレームワーク３はまた、ベータシート鎖ＤとＥとの間のループに２つの残基（配列番号４９ ｇＨ１を参照して、７５及び７６）を欠いている：ヒト化グラフト変異体では、ギャップは選択されたヒト受容体配列からの対応する残基（リジン７５、Ｋ７５；アスパラギン７６、Ｎ７６）で満たされている（図２）。ヒト化グラフト変異体中の重鎖フレームワーク残基は、それぞれドナー残基バリン（Ｖ２４）、イソロイシン（Ｉ４８）、グリシン（Ｇ４９）、セリン（Ｓ７３）及びバリン（Ｖ７８）が保持されている残基２４、４８、４９、７３及び７８（配列番号４９ ｇＨ１を参照して）を除いて、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。ドナー残基Ｖ２４、Ｉ４８、Ｇ４９及びＶ７８の保持は、表面プラズモン共鳴によって測定されるように、ヒトＩＬ－２２に対する最大親和性結合に必須であった。いくつかのヒト化グラフト変異体では、ＣＤＲＨ２中の潜在的なアスパラギン酸異性化部位を、位置５４のアスパラギン酸残基をグルタミン酸（Ｄ５４Ｅ）で置換することによって、又は位置５５のグリシン残基をアラニン（Ｇ５５Ａ）で置換することによって改変した。いくつかのヒト化グラフト変異体では、ＣＤＲＨ３の潜在的加水分解部位を、位置１０７のアスパラギン酸残基をグルタミン酸（Ｄ１０７Ｅ）で置換することによって改変した。
例４．１１０７０のヒト化
抗体１１０７０を、ラットＶ領域からのＣＤＲをヒト生殖系列抗体Ｖ領域フレームワークに移植することによってヒト化した。抗体の活性を回復するために、ラットＶ領域からの多数のフレームワーク残基もヒト化配列に保持した。これらの残基は、Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）（国際公開第９１／０９９６７号）によって概説されたプロトコルを用いて選択した。ラット抗体（ドナー）Ｖ領域配列とヒト生殖系列（受容体）Ｖ領域配列とのアラインメントを、設計されたヒト化配列と共に図３Ａ及び３Ｂに示す。ドナーから受容体配列に移植されたＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔの組合せ定義が使用されるＣＤＲ－Ｈ１（Ａｄａｉｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９１／０９９６７号を参照されたい）を除いて、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７）によって定義される通りである。
ヒトＶ領域ＩＧＫＶ１－１２＋ＩＧＫＪ２ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、抗体１１０７０軽鎖ＣＤＲの受容体として選択した。ヒト化グラフト変異体中の軽鎖フレームワーク残基は、それぞれドナー残基バリン（Ｖ３）、アスパラギン（Ｎ４４）、スレオニン（Ｔ５８）及びセリン（Ｓ６８）が保持されている残基３、４４、５８及び６８（配列番号８８ ｇＬ１を参照して）を含む群の１つ又は複数の残基を除いて、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。ドナー残基Ｎ４４の保持は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、ヒトＩＬ－２２に対する最大親和性結合に必須であった（表１３）。
ヒトＶ領域ＩＧＨＶ４－３１＋ＩＧＨＪ６ Ｊ領域（ＩＭＧＴ、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）を、抗体１１０７０の重鎖ＣＤＲの受容体として選択した。ヒト化グラフト変異体中の重鎖フレームワーク残基は、それぞれドナー残基バリン（Ｖ３７）、セリン（Ｓ４１）、メチオニン（Ｍ４８）、ロイシン（Ｌ６７）、アルギニン（Ｒ７１）、セリン（Ｓ７６）及びバリン（Ｖ７８）が保持されている残基３７、４１、４８、６７、７１、７６及び７８（配列番号８９ ｇＨ１を参照して）を含む群の１つ又は複数の残基を除いて、全てヒト生殖系列遺伝子由来である。ヒトフレームワークの１位のグルタミン残基をグルタミン酸（Ｅ１）で置換して、均一な生成物の発現及び精製を得た：抗体及び抗体フラグメントのＮ末端でのグルタミンからピログルタマートへの変換は広く報告されている。ドナー残基Ｖ３７、Ｌ６７、Ｒ７１及びＶ７８の保持は、表面プラズモン共鳴によって測定した場合、ヒトＩＬ－２２に対する最大親和性結合に必須であった（表１３）。いくつかのヒト化グラフト変異体では、ＣＤＲＨ２中の潜在的なアスパラギン脱アミド部位を、位置６１のセリン残基をトレオニンで置換することによって改変した（Ｓ６１Ｔ）。
例５．変異体のクローニング及び作製
重鎖及び軽鎖Ｖ領域配列の異なる変異体をコードする遺伝子を設計し、ＡＴＵＭによる自動合成アプローチによって構築した（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）。重鎖Ｖ領域及び軽鎖Ｖ領域の更なる変異体は、場合によってはＣＤＲ内の突然変異を含むオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発によってＶＨ遺伝子及びＶＫ遺伝子を改変することによって作製された。哺乳動物細胞における一過性発現のために、ヒト化軽鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトκ鎖定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含むＵＣＢ軽鎖発現ベクターｐＭｈＣＫにクローニングした。ヒト化重鎖Ｖ領域遺伝子を、ヒトγ－１ＣＨ１ヒンジドメインをコードするＤＮＡを含むＵＣＢヒトγ－１Ｆａｂ重鎖発現ベクターｐＭｈＦａｂｎｈにクローニングした。得られた重鎖及び軽鎖ベクターをＥｘｐｉ２９３ＴＭ懸濁細胞に共トランスフェクションすると、ヒト化組換え抗体がヒトＦａｂフォーマットで発現した。変異体ヒト化Ｆａｂ抗体を、親抗体と比較したヒトＩＬ－２２に対するそれらの結合親和性、それらのインビトロアッセイにおける効力、それらの生物物理学的特性及び下流処理に対する適合性について評価した。
例６．ヒト化１１０４１抗体の結合特性
固定化された抗ヒトＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２上に試料を捕捉し、次いで捕捉された表面上のヒトＩＬ２２の滴定によって、１１０４１個の抗体についてのヒト化試料を試験した。アッセイはＢｉａｃｏｒｅ８Ｋ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行い、ＢＩＡ（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ）はＢｉａｃｏｒｅ８０００評価ソフトウェアを使用して行った。アミンカップリング化学を介してＣＭ５センサチップ上に約５０００応答単位（ＲＵ）の捕捉レベルまでＡｆｆｉｎｐｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を固定化した。ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を流速１０μＬ／分のランニング緩衝液として使用した。固定化ヤギ抗ヒトＦａｂ ＩｇＧによる捕捉のために、０．５μｇ／ｍＬの１１０４１抗体のヒト化試料の１０μＬ注入を使用した。ヒトＩＬ２２（５０ｎＭ、１６．７ｎＭ、５．６ｎＭ、１．９ｎＭ及び６１７ｐＭ）を、捕捉された１１０４１個の抗体にわたって３０μＬ／分の流速で滴定した。
表面は、５０ｍＭ ＨＣｌの２×１０μＬ注入によって生成され、１０μＬ／分の流量で５ｍＭ ＮａＯＨの５μＬ注入によって散在された。バックグラウンド減算結合曲線は、標準的な手順に従ってＩｎｓｉｇｈｔ評価ソフトウェアを使用して分析された。速度論的パラメータをフィッティングアルゴリズムから決定した。単一の実験から決定されたＩＬ２２親和性を表１４に示し、１００ｐＭ未満であることが示された。
例７．１１０４１ ＦａｂによるＩＬ２２／ＩＬ２２Ｒ１相互作用の遮断
交差ブロッキングアッセイをＢｉａｃｏｒｅ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施して、１１０４１ウサギ抗体がＩＬ２２Ｒ１と同じ結合部位に結合するかどうかを決定した。
ＥＤＣ／ＮＨＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の混合物の７分間の注射（１０μＬ分－１）で活性化し、続いて酢酸緩衝液ｐＨ５．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中５０μｇ／ｍｌでウサギＦａｂ特異的ヤギＦａｂ’２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の７分間の注射で活性化して、約５５００ＲＵの固定化レベルを達成することによって、ＣＭ５センサチップを調製した。最後に、１Ｍエタノールアミンヒドロクロリド－ＮａＯＨ（ｐＨ８．５）の７分間の注射（１０μＬ／分－１）を行い、表面を不活性化した。ウサギＦｃ特異的捕捉抗体を省いて、参照表面を上記のように調製した。
交差競合は、ＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中２５℃で行った。各分析サイクルは、ウサギＦａｂとしてフォーマットされた可変領域の注射、続いて１００ｎＭでのヒトＩＬ－２２の注射、最後に５０ｎＭでのＩＬ－２２Ｒ１の注射を伴った。緩衝液ブランク及び捕捉対照試料なしを差し引いた後、結合応答を計算した。ＩＬ－２２Ｒ１に対する陽性応答は、１１０４１抗体がＩＬ－２２Ｒ１とは異なるエピトープに結合することを示すであろう。ＩＬ－２２Ｒ１に対する応答の欠如は、ＩＬ－２２上の１１０４１抗体の結合部位がＩＬ－２２Ｒ１結合部位と重複することを示し得る。各サイクルの後、以下の注入によって表面を再生した：６０秒間の５０ｍＭ ＨＣｌ、６０秒間の５ｍＭ ＮａＯＨ及び６０秒間ＨＣｌ、全て１０μＬ／分－１。
表１５に示すように、ヒトＩＬ－２２を１１０４１に注射した場合、明確な結合応答が観察されたが、ＩＬ２２Ｒ１注射については応答が見られなかった。これは、１１０４１抗体及びＩＬ－２２Ｒ１が重複する結合部位を有することを実証する。
例８．ＩＬ２２上のＩＬ２２ＢＰ結合部位の遮断の評価
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００）を使用して、１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４Ｆａｂ（二重特異性抗体の一部として）又はフェザキヌマブがＩＬ２２のＩＬ２２ＢＰ結合部位を遮断できるかどうかを評価した。
ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカップリング化学反応を介してＣＭ５ Ｓｅｎｓｏｒｃｈｉｐ上に約６０００ＲＵのレベルまで固定化した。
各分析サイクルは、１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４Ｆａｂ又はフェザキヌマブ分子を抗Ｆａｂ表面に捕捉すること、２０ｎＭでのＩＬ２２の注射（自社で調製）、続いて１００ｎＭでのＩＬ２２ＢＰの注射、それぞれ３０μｌ／分で１８０秒間注射することからなっていた。各サイクルの終了時に、５０ｍＭのＨＣｌの６０秒間の注射、続いて５ｍＭのＮａＯＨの３０秒間の注射、及び５０ｍＭのＨＣｌの最終６０秒間の注射を使用して、１０μＬ／分の流量で表面を再生した。バックグラウンド結合及びドリフトを、緩衝液捕捉又は緩衝液分析物注入からなる対照サイクルを使用して差し引いた。
ＩＬ２２が表面捕捉１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂに結合した場合、ＩＬ２２ＢＰはＩＬ２２に結合することができなかった。ＩＬ２２が表面捕捉フェザキヌマブに結合したとき、ＩＬ２２ＢＰは依然としてＩＬ２２に結合することができた。結論として、１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ（二重特異性抗体の一部として）はＩＬ２２のＩＬ２２ＢＰ結合部位を遮断するが、フェザキヌマブは遮断しない。
例９．ＩＬ２２の精製。
Ｎａｇｅｍ ｅｔ ａｌ［Ｎａｇｅｍ ｅｔ ａｌＳｔｒｕｃｔｕｒｅ．２００２ Ａｕｇ；１０（８）：１０５１－６２．］によって記載されているように、ＩＬ－２２のＨｉｓタグ付きバージョンを大部分精製した。ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、Ｈｉｓタグ付きＩＬ－２２をコードする発現構築物による熱ショックによって形質転換した。
コードされるタンパク質配列は以下である。
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＥＮＬＹＦＱＧＳＱＧＧＡＡＡＰＩＳＳＨＣＲＬＤＫＳＮＦＱＱＰＹＩＴＮＲＴＦＭＬＡＫＥＡＳＬＡＤＮＮＴＤＶＲＬＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭＳＥＲＣＹＬＭＫＱＶＬＮＦＴＬＥＥＶＬＦＰＱＳＤＲＦＱＰＹＭＱＥＶＶＰＦＬＡＲＬＳＮＲＬＳＴＣＨＩＥＧＤＤＬＨＩＱＲＮＶＱＫＬＫＤＴＶＫＫＬＧＥＳＧＥＩＫＡＩＧＥＬＤＬＬＦＭＳＬＲＮＡＣＩ（配列番号３）
ＴＥＶ切断後のＩＬ－２２タンパク質配列（下記参照）：
ＧＳＱＧＧＡＡＡＰＩＳＳＨＣＲＬＤＫＳＮＦＱＱＰＹＩＴＮＲＴＦＭＬＡＫＥＡＳＬＡＤＮＮＴＤＶＲＬＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭＳＥＲＣＹＬＭＫＱＶＬＮＦＴＬＥＥＶＬＦＰＱＳＤＲＦＱＰＹＭＱＥＶＶＰＦＬＡＲＬＳＮＲＬＳＴＣＨＩＥＧＤＤＬＨＩＱＲＮＶＱＫＬＫＤＴＶＫＫＬＧＥＳＧＥＩＫＡＩＧＥＬＤＬＬＦＭＳＬＲＮＡＣＩ（配列番号４）
細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンの存在下で成長させ、細胞が１の光学密度（６００ｎＭで測定）に達したときに１ｍＭの濃度までＩＰＴＧを添加することによってタンパク質発現を誘導した。４時間後、遠心分離により細胞を回収した。高圧細胞ホモジナイザーによる細胞溶解後、高速遠心分離によりＩＬ－２２を含む封入体を回収した。封入体を５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ及び０．５％（ｗ／ｖ）ＤＯＣ（ｐＨ８）で洗浄し、次いで、洗剤を含まない同じ緩衝液で再び洗浄した。洗浄した封入体を、５０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ及び８Ｍの尿素を含有する緩衝液に４℃で一晩可溶化した。不溶性物質を遠心分離によって分離し、可溶性画分中のＩＬ－２２を希釈によって１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍアルギニン、１ｍＭ還元型グルタチオン及び０．１ｍＭ酸化型グルタチオン中０．１ｍｇ／ｍｌにリフォールディングし、最終ｐＨは８．０であった。４℃で７２時間インキュベートした後、タンパク質を濃縮し、２５ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．４及び１５０ｍＭのＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇカラムでのサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。次いで、更なる使用までタンパク質を－８０℃で凍結した。
ＩＬ－２２タンパク質とＴＥＶプロテアーゼを４℃で一晩インキュベートすることによってＨｉｓタグを除去した。２５ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳ中でタンパク質を希釈した後、切断されたタンパク質を５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐ（商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、フロースルーで回収した。
例１０．１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ及び１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂの存在下でのＩＬ２２のＨＤＸ－ＭＳ
水素重水素交換質量分析（ＨＤＸ－ＭＳ）を、１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ及び１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂに対するＩＬ２２のエピトープマッピングに使用した。
試料調製及びデータ取得
ＨＤＸ－ＭＳ分析のために、３０μＭのＩＬ２２（例９に記載のように調製し、９０μＭの１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ又は１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂのいずれかと複合体化した３０μＭのＩＬ２２を調製し、４℃で１時間インキュベートした。４μｌのＩＬ２２、ＩＬ２２／１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ又はＩＬ２２／１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ複合体を、２５℃で、Ｈ２Ｏ中の５７μＬの１０ｍＭホスファート（ｐＨ７．０）又はＤ２Ｏ中の１０ｍＭホスファート（ｐＤ７．０）に希釈した。次いで、重水素化試料を２５℃で０．５、２、１５及び６０分間インキュベートした。反応後、全ての試料を、１℃でクエンチ緩衝液（４Ｍグアニジン塩酸塩、２５０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、１００ｍＭホスファート）と１：１で混合することによってクエンチした。混合溶液は最終ｐＨ２．５であった。混合物を消化のためにｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＨＤＸモジュール（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）に直ちに注入した。次いで、ペプチド消化を、水中０．２％ギ酸中、２０℃及び１００μＬ／分の流速で、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃオンライン消化カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してオンラインで行った。全ての重水素化された時点及び重水素化されていない対照を、各データ点の間をブランクで実行しながら三連で行った。
次いで、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μＭ ＶＡＮＧＵＡＲＤチルドプレカラムを３分間使用してペプチドフラグメントを捕捉した。次いで、以下の勾配を使用して、ペプチドをチルドＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μＭ １．０×１００に溶出した：０分、５％Ｂ；６分、３５％Ｂ；７分、４０％Ｂ；８分、９５％Ｂ、１１分、５％Ｂ；１２分、９５％Ｂ；１３分、５％Ｂ；１４分、９５％Ｂ；１５分、５％Ｂ（Ａ：Ｈ２Ｏ中０．２％ＨＣＯＯＨ、Ｂ：アセトニトリル中０．２％ＨＣＯＯＨ。ペプチドフラグメントを、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓｉ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）へのポジティブエレクトロスプレーによってイオン化した。データ取得は、ＭＳｅ法（低衝突エネルギー、４Ｖ；高衝突エネルギー：１８Ｖから４０Ｖへのランプ）を使用して、５０～２０００Ｔｈのｍ／ｚ範囲にわたってＴｏＦのみのモードで実行した。Ｇｌｕ－１－フィブリノペプチドＢペプチドを内部ロックマス補正に使用した。
ＨＤＸ－ＭＳデータ処理
ＩＬ２２、ＩＬ２２／１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ又はＩＬ２２／１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ複合体の非重水素化対照試料からのＭＳＥデータを、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｙｎｘ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｒｖｅｒ２．５．１（ＰＬＧＳ）を使用して配列同定に使用した。ペプチド検索を、ＩＬ２２配列のみのデータベースに対して行い、５００カウントの前駆体強度閾値及び割り当てに必要な３つの一致したプロダクトイオンを用いた。３つの対照試料のイオン会計ファイルを、Ｄｙｎａｍｘｖ３．０ソフトウェアにインポートしたペプチドリストに組み合わせた。
ペプチドをＤｙｎａｍＸで更に濾過した。使用したフィルタリングパラメータは、それぞれ４及び２５の最小及び最大ペプチド配列長、１０００の最小強度、２の最小ＭＳ／ＭＳ生成物、０．２のアミノ酸当たりの最小生成物、及び１０ｐｐｍの最大ＭＨ＋誤差閾値であった。ＤｙｎａｍＸ ｖ３．０を使用して、各時点での各ペプチドの重水素取込みから生じる同位体エンベロープを定量した。更に、ｍ／ｚピークの正確な割り当てを確実にするために全てのスペクトルを調べ、視覚的にチェックし、高いシグナル対ノイズ比を有するペプチドのみをＨＤＸ－ＭＳ分析に使用した。
Ｄｙｎａｍｘでの手動濾過の後、統計分析及び濾過を、Ｈｏｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２１４９１４３７）によって公表された統計分析を使用するＤｅｕｔｅｒｏｓ（ｗｗｗ．ａｃａｄｅｍｉｃ．ｏｕｐ．ｃｏｍ／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ａｒｔｉｃｌｅ／３５／１７／３１７１／５２８８７７５）を使用して行った。重水素は、ペプチド長、開始残基及び終了残基、包括的カバレッジ、並びに絶対的取込み（ダルトン単位）であるｙ軸メトリックを表示するウッドプロットを生成する。これは、リガンド（結合）及びアポ形態の存在下での取込みの差である。ウッドプロットは、各時点において全てのペプチドに信頼度フィルタリングを最初に適用する。選択された信頼限界外の重水素化差を有するペプチドは有意ではなく、薄い灰色で示されている。有意なペプチドは、濃い灰色及び黒色として示されている。社内のアルゴリズムを使用して、結果をフィルタリングし、エピトープを同定した。提示されるデータは、０．５分間の重水素化インキュベーション後である。
ＩＬ２２のカバレッジマップ
１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４Ｆａｂ及び１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６Ｆａｂを含むＩＬ２２のＨＤＸ分析を単一の実験で行った。４７個のペプチドからＨＤＸ－ＭＳ実験について合計９１．３％のカバレッジが得られた。フィルタリング及び分析後のペプチドの冗長性は３．４８であった。（図４）
１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂの存在下でのＩＬ２２のＨＤＸ－ＭＳ
抗体結合時に統計的に有意な重水素取込みの減少を示す７つのペプチド（すなわち、潜在的なエピトープ）が観察され、そのうちの６つはＳＰＥＥＤ分析と一致した（図５Ａ、ウッドプロット上で黒色で強調表示されている）：７２ＶＲＬＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳ８４、７２ＶＲＬＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭ８５、７５ＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳ８４、７５ＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭ８５、７６ＧＥＫＬＦＨＧＶＳ８４及び８０ＦＨＧＶＳＭ８５。重水素取込み（すなわち、潜在的な配座変化）の増加が、３つのペプチド：１０１ＥＥＶＬＦＰＱＳＤＲＦ１１１、１０３ＶＬＦＰＱＳＤＲＦＱＰＹＭ１１５及び１０３ＶＬＦＰＱＳＤＲＦＱＰＹＭＱＥ１１７において観察された。１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ ＦａｂエピトープをＩＬ２２の構造上に投射する（図５Ｂ）。配座変化による抗体結合時に保護又は脱保護された他の領域を図５Ｂに示し、濃い灰色で強調している。
結論として、１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂのエピトープ領域を表す保護領域は、残基７２、－８５（ＶＲＬＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭ）である。
１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂの存在下でのＩＬ２２のＨＤＸ－ＭＳ
抗体結合時に統計的に有意な重水素取込みの減少を示す４つのペプチド（すなわち、潜在的なエピトープ）が観察され、そのうちの３つはＳＰＥＥＤ分析と一致した（図６Ａ、ウッドプロット上で黒色で強調表示されている。）：７２ＶＲＬＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭ８５、７５ＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭ８５及び８０ＦＨＧＶＳＭ８５．。重水素取込み（すなわち、潜在的な配座変化）の増加が、２つのペプチド：４３ＤＫＳＮＦＱＱＰＹＩＴＮＲＴＦＭ５８及び１０５ＦＰＱＳＤＲＦＱＰＹＭＱＥ１１７において観察された。１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ ＦａｂエピトープをＩＬ２２の構造上に投射する（図６Ｂ）。配座変化による抗体結合時に保護又は脱保護された他の領域を図６Ｂに示し、濃い灰色で強調している。
結論として、１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６Ｆａｂのエピトープ領域を表す保護領域は、残基７２、－８５（ＶＲＬＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭ）である。
例１１．ＩＬ－２２／１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４複合体の精製及び構造解析
ＩＬ－２２を例９に記載されるように精製した。
切断したＩＬ－２２を１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂと混合し、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．４及び１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＨｉＬｏａｄ（登録商標）２６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）７５ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのサイズ排除クロマトグラフィによって精製した。
ＩＬ－２２／１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ複合体を１０．１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。複合体の結晶化条件を、いくつかの市販の結晶化スクリーンを用いて特定した。これらは、Ｓｗｉｓｓｃｉ９６ウェル２液滴ＭＲＣ結晶化プレート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ、カタログ番号ＭＤ１１－００－１００から供給）を使用して、シッティングドロップ形式で実施した。最初に、Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲ液体処理システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を使用して、リザーバをスクリーン内の各結晶化条件７５μＬで満たした。次いで、３００ｎＬのＩＬ－２２／Ｆａｂ複合体及び３００ｎＬのリザーバ溶液を、Ｍｏｓｑｕｉｔｏリキッドハンドラ（ＴＴＰ ＬａｂＴｅｃｈ）を使用して結晶化プレートのウェルに分注した。初期結晶化条件は、０．１６Ｍ酢酸カルシウム六水和物、０．０８Ｍカコジル酸ナトリウムｐＨ６．５、１４．４％ＰＥＧ８０００及び２０％グリセロールを含有するＮｅｘｔａｌ Ｔｕｂｅｓ ＪＣＳＧ＋スクリーニング（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号：１３０７２０）の条件５９で特定された。この条件を更にＪＣＳＧ＋５９と呼ぶ。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（カタログ番号ＭＤＳＲ－３７－Ｅ１１）から供給されたＪＣＳＧ＋５９に、添加スクリーニング（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号ＨＲ２－１３８）に含まれる塩化イットリウム（ＩＩＩ）六水和物を０．０１Ｍで添加することによって、最適化された結晶を得た。最適化された結晶を、２５０μＬのリザーバ容量及び２μＬのＩＬ－２２／Ｆａｂ複合体と混合した２μＬのリザーバ溶液からなる液滴を使用して、ＭＲＣ Ｍａｘｉ ４８ Ｗｅｌｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ Ｐｌａｔｅｓ（Ｓｗｉｓｓｃｉ）中で成長させた。液体窒素中でのフラッシュ凍結の前に、結晶を４μＬ滴の凍結防止溶液に移した。この溶液は、４０μＬの最適化されたリザーバ溶液を、ＣｒｙｏＰｒｏｔＸ（商標）キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｉｍｅｎｓｉｏｎｓＭＤ１－６１）に含まれる１０μＬの溶液ＣｒｙｏＭｉｘｅｓ（商標）７と混合することによって調製した。ＣｒｙｏＭｉｘｅｓ（商標）７は、１２．５％ｖ／ｖのジエチレングリコール、１２．５％ｖ／ｖのエチレングリコール、２５％ｖ／ｖの１，２－プロパンジオール、１２．５％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド及び１２．５％ｖ／ｖのグリセロールを含有する。
回折データをビームラインＩ０４（Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ，ＵＫ）で収集した。データにインデックスを付け、ＸＤＳ［Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，１２５－１３２（２０１０）］を使用して統合し、続いて［Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌＡｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０１３；６９（Ｐｔ ７）：１２０４－１２１４］を使用してスケーリングした。ＩＬ－２２／Ｆａｂ構造を、Ｐｈｅｎｉｘソフトウェア一式［Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌＭｅｔｈｏｄｓ．２０１１；５５（１）：９４－１０６］においてＰｈａｓｅｒ ［ＭｃＣｏｙ ｅｔ ａｌＪ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．（２００７）．４０，６５８－６７４］を使用する分子置換によって解明した。この手順では、ＩＬ－２２構造１ＹＫＢ［Ｘｕ ｅｔ ａｌＡｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００５ Ｊｕｌ；６１（Ｐｔ ７）：９４２－５０］ ａｎｄ Ｆａｂ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５ＢＶＪ ［Ｒｏｎｄｅａｕ ｅｔ ａｌＭＡｂｓ．２０１５；７（６）：１１５１－６０］を分子置換鋳型として使用した。Ｃｏｏｔ ［Ｐ．Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ（２０１０）．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｄ６６：４８６－５０１］ ａｎｄ ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ ［Ｐ．Ｖ．Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌＡｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ ６８，３５２－６７（２０１２）］を、以下の手動モデル完成及び改良のサイクルで使用した。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ ［Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７：２９３－３１５］を使用して最終モデルの品質を分析した。
３ＩＬ－２２／１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ複合体が結晶非対称単位中に観察される。
図７Ａは、１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ ＦａｂとＩＬ－２２との相互作用を、相互作用界面の詳細図（図７Ｂ）と共に示す。ＣＣＰ４ソフトウェア一式におけるＮＣＯＮＴ［Ｗｉｎｎ ＭＤ ｅｔ ａｌＡｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０１１ Ａｐｒ；６７（Ｐｔ ４）：２３５－４２］を用いて、Ｆａｂ分子によって認識されるＩＬ－２２上のエピトープを決定した。ＩＬ－２２アミノ酸ナンバリングは、ＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢエントリＱ９ＧＺＸ６に基づく。
Ｆａｂ分子との接触距離が４Å未満では、ＩＬ－２２エピトープは、Ｇｌｎ４８、Ｇｌｕ７７、Ｐｈｅ８０、Ｈｉｓ８１、Ｇｌｙ８２、Ｖａｌ８３、Ｓｅｒ８４、Ｍｅｔ８５、Ａｒｇ８８、Ｌｅｕ１６９、Ｍｅｔ１７２、Ｓｅｒ１７３、Ａｒｇ１７５、Ａｓｎ１７６及びＩｌｅ１７９の残基から構成される。
Ｆａｂ分子との接触距離が５Å未満では、ＩＬ－２２エピトープは、Ｌｙｓ４４、Ｐｈｅ４７、Ｇｌｎ４８、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｙ７６、Ｇｌｕ７７、Ｐｈｅ８０、Ｈｉｓ８１、Ｇｌｙ８２、Ｖａｌ８３、Ｓｅｒ８４、Ｍｅｔ８５、Ｓｅｒ８６、Ａｒｇ８８、Ｌｅｕ１６９、Ｍｅｔ１７２、Ｓｅｒ１７３、Ａｒｇ１７５、Ａｓｎ１７６及びＩｌｅ１７９の残基から構成される。
１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ分子は、Ｆａｂ軽鎖がＩＬ２２上の同じ領域に結合するので、ＩＬ－２２とＩＬ２２Ｒ１受容体との相互作用を妨げる。（図８）
例１１．ｃｒｙｏ－ＥＭによるフェザキヌマブ及びＶＲ１１０７０との複合体におけるＩＬ－２２の構造決定
ＩＬ２２／１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４複合体の構造解析を行った後、ｃｒｙｏ－ＥＭ技術を用いて、フェザキヌマブ及び１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ（ＶＲ１１０７０）との複合体におけるＩＬ２２の構造決定を行った。
Ｎ末端ヒトＦｃタグに融合したＥｘｐｉ２９３細胞を用いてＩＬ－２２を発現させた。遠心分離により細胞を除去した後、上清を５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Ｃｙｔｉｖａ）にロードした。ｐＨ２．０でＰＢＳから０．１Ｍクエン酸ナトリウムまでの緩衝液勾配でタンパク質を溶出した。ｈＦｃタグを、ＴＥＶプロテアーゼを使用して切断し、ＩＬ２２を、４ｍｌの充填プロテインＡ樹脂上での重力流による別の通過によって、切断されたタグから分離した。樹脂から溶出した後、ＰＢＳ中で平衡化したＨｉＬｏａｄ２６／６００Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ｐｇカラム（Ｃｙｔｉｖａ）でＩＬ－２２を更に精製した。
１２．１ｍｇ／ｍｌの７０マイクロリットルＶＲ１１０７０Ｆａｂ、１１．５ｍｇ／ｍｌの１５３マイクロリットルのフェザキヌマブＦａｂ、及び１．３６ｍｇ／ｍｌの１５３マイクロリットルＩＬ２２を混合した。５５マイクロリットルを、１０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．４及び１５０ｍＭＮａＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ ５／１５０カラムに注入した。１．７ｍｇ／ｍｌのＩＬ－２２＋ＶＲ１１０７０＋フェザキヌマブ複合体を含む画分を回収し、ｃｒｙｏ－ＥＭグリッドを調製するために使用した。
Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ（登録商標）Ｒ１．２／１．３ホーリーカーボングリッド（ＳＰＴ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用直前にＰｅｌｃｏ ｅａｓｙＧｌｏｗ（商標）中２２ｍＡで４５秒間グロー放電した。ゲル濾過後の１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ及びフェザキヌマブＦａｂを有するＩＬ２２を、Ｖｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中の新鮮なグロー放電グリッドに湿度１００％及び４℃のチャンバ内で２秒間適用した。次いで、力７でグリッドを新しい濾紙に４秒間吸い取り、液体エタンに入れた。２００ｋｅＶで操作し、Ｆａｌｃｏｎ３カメラを装備した社内Ｇｌａｃｉｏｓにおいて、グリッドを最初に氷厚及び粒子分布についてスクリーニングした。次いで、データを、Ｆａｌｃｏｎ４を備えたＣａｍｂｒｉｄｇｅコンソーシアムのＫｒｉｏｓ２で収集し、３００ｋｅＶの加速電圧で操作した。５７００個の動画は、ＥＰＵソフトウェアを使用して、－１から－２．５μｍのデフォーカス範囲、０．６７Åのピクセルサイズ、４９．３６ｅ－／Å２の最終電子束が４２個の画分にわたって分布するための１２．２秒の露光でのカウントモードで自動的に収集された。その後のデータ分析は全て、Ｃｒｙｏｓｐａｒｃ、バージョン２．１５（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ）で行った。動画をパッチモーションを使用して位置合わせし、コントラスト伝達関数パラメータ（ＣＴＦ）をパッチＣＴＦを使用して推定し、粒子を最初にｂｌｏｂピッカーでピッキングし、合計５．５Ｍの粒子を得た。選別された粒子は、３００ピクセルのボックスサイズに２回ビニングされ、異なる特徴を有する４８８，０００個の粒子の選択をもたらした最初の二次元分類に供された。５つの最初のモデルを作製し、そのうちの２つはＩＬ２２のグリコシル化部位で互いに異なっていた。合計２４万個の粒子について、これらの２つのクラスを一緒にプールし、不均一な精密化により、ゴールドスタンダードＦＳＣ０．１４３基準を使用して３．４Åの分解能推定値が得られた。
ＵＣＳＦキメラを使用して、２つのＦａｂ分子及びＩＬ２２構造をｃｒｙｏ－ＥＭ密度に適合させた［Ｐｅｔｔｅｒｓｅｎ，ｅｔ ａｌＪ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２５（１３）：１６０５－１６１２（２００４）．］。Ｃｏｏｔ ［Ｅｍｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｄ６６：４８６－５０１．］を使用して更に手動でモデルを構築した後、Ｐｈｅｎｉｘ ［Ｌｉｅｂｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ７５，８６１－８７７（２０１９）］のＡｕｔｏｓｈａｒｐｅｎ ［Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，．（２０１８）．Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ７４，５４５－５５９．］ツールを使用してマップを鮮明化し、ＰｈｅｎｉｘのＲｅａｌ－ｓｐａｃｅ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ［Ａｆｏｎｉｎｅ ｅｔ ａｌ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ７４，５３１－５４４（２０１８）］ツールを使用してモデルを更に洗練した。
ＣＣＰ４ソフトウェア一式［Ｗｉｎｎ ｅｔ ａｌＡｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２０１１Ａｐｒ；６７（Ｐｔ４）：２３５－４２］中のＮＣＯＮＴを使用して、１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ及びフェザキヌマブＦａｂ分子によって認識されるＩＬ２２上のエピトープを決定した。以下のＩＬ２２アミノ酸ナンバリングは、ＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢエントリＱ９ＧＺＸ６に基づく。
１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ分子との接触距離が４Å未満では、ＩＬ２２エピトープは、残基：Ｇｌｕ７７、Ｌｙｓ７８、Ｈｉｓ８１、Ｓｅｒ８４、Ｍｅｔ８５、Ｓｅｒ８６、Ａｒｇ８８、Ａｓｎ１７６、Ａｌａ１７７から構成される。
１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ分子との接触距離５Å未満では、ＩＬ２２エピトープは、残基：Ｉｌｅ７５、Ｇｌｙ７６、Ｇｌｕ７７、Ｌｙｓ７８、Ｐｈｅ８０、Ｈｉｓ８１、Ｓｅｒ８４、Ｍｅｔ８５、Ｓｅｒ８６、Ａｒｇ８８、Ｌｅｕ１６９、Ｍｅｔ１７２、Ｓｅｒ１７３、Ａｓｎ１７６、Ａｌａ１７７から構成される。
フェザキヌマブＦａｂ分子との接触距離が４Å未満では、ＩＬ２２エピトープは、Ｇｌｎ４９、Ｔｙｒ５１、Ｐｈｅ１０５、Ｓｅｒ１０８、Ａｓｐ１０９、Ｇｌｎ１１２、Ｐｒｏ１１３、Ｔｙｒ１１４、Ｇｌｎ１１６、Ｇｌｕ１１７、Ｐｒｏ１２０、Ａｌａ１２３、Ａｒｇ１２４の残基から構成される。
フェザキヌマブＦａｂ分子との＜５Å接触距離では、ＩＬ２２エピトープは、残基：Ｇｌｎ４９、Ｐｒｏ５０、Ｔｙｒ５１、Ｉｌｅ５２、Ａｒｇ５５、Ｐｈｅ１０５、Ｐｒｏ１０６、Ｓｅｒ１０８、Ａｓｐ１０９、Ｇｌｎ１１２、Ｐｒｏ１１３、Ｔｙｒ１１４、Ｇｌｎ１１６、Ｇｌｕ１１７、Ｖａｌ１１９、Ｐｒｏ１２０、Ｐｈｅ１２１、Ａｌａ１２３、Ａｒｇ１２４から構成される。
構造解析から、１１０７０ ＦａｂはＩＬ－２２上にフェザキヌマブとは異なるエピトープを有することが明らかになる。また、１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂ（ＶＲ１１０７０）は、ＩＬ２２上の１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ（ＶＲ１１０４１）のエピトープと類似している。（図９Ａ及び図９Ｂ）。１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４Ｆａｂと同様に、１１０７０ｇＬ７ｇＨ１６ Ｆａｂは、ＩＬ－２２Ｒ１受容体との相互作用を妨げることによってＩＬ２２シグナル伝達を遮断する（図１０Ａ）。対照的に、フェザキヌマブは、ＩＬ２２とＩＬ１０Ｒ２との相互作用を妨げることによってＩＬ２２シグナル伝達を遮断する（図１０Ｂ）。
例１２．ＣＯＬＯ２０５ ＩＬ－１０放出アッセイ
抗体を、ヒトＩＬ２２に対する活性についてインビトロ細胞アッセイで試験した。ＣＯＬＯ２０５細胞株は、ヒト結腸直腸癌上皮細胞株である。ＩＬ２２は、細胞表面上のＩＬ２２Ｒ１及びＩＬ１０Ｒ２に結合して、ＳＴＡＴ３リン酸化及び下流のサイトカイン放出を誘導する（例えばＩＬ－１０）。このアッセイでは、ＣＯＬＯ２０５細胞を、抗ＩＬ－２２抗体の有無にかかわらずＩＬ２２で刺激する。次いで、得られたＩＬ－１０応答を、均一な時間分解ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）キット（Ｃｉｓｂｉｏ）を使用して細胞培養上清中で測定する。
ＣＯＬＯ２０５細胞を、組織培養処理した平底９６ウェルプレートに２５０００細胞／ウェルで播種した。ヒトＩＬ－２２（最終アッセイ濃度３０ｐＭ）を抗体（最終アッセイ濃度３ｎＭ～１．４ｐＭ）と３７℃で１時間プレインキュベートした。次いで、抗体／サイトカイン複合体をＣＯＬＯ２０５細胞に移し、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。次いで、無細胞細胞培養上清を回収し、－８０℃で保存した。細胞培養上清を氷上で解凍し、ＩＬ－１０のレベルをＨＴＲＦによって決定した。
試料は、単回又は２回のいずれかで実行した。
１１０４１Ｆａｂの結果
結果は、１１０４１ＦａｂがＣＯＬＯ２０５ ＩＬ－１０放出アッセイにおいてＣＯＬＯ２０５細胞のＩＬ－２２誘導性ＩＬ－１０応答を阻害することを確認する。１１０４１ Ｆａｂは、アッセイの２回の幾何平均によって決定されるように、５６．７８ｐＭのＩＣ５０を有していた（表２０）。これらの測定値は、アッセイの各反復において測定されたＩＣ５０の範囲が各例において３倍未満だけ変動することが見出されたので、信頼できると考えられる。
１１０４１ ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂの結果
結果は、１１０４１ ｇＬ１３ｇＨ１４ ＦａｂがＣＯＬＯ２０５ ＩＬ－１０放出アッセイにおいてＣＯＬＯ２０５細胞のＩＬ－２２誘導性ＩＬ－１０応答を阻害することを確認する。１１０４１ ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂは、アッセイの２回の幾何平均によって決定されるように、４２．７ｐＭのＩＣ５０を有していた（表２１）。これらの測定値は、アッセイの各反復において測定されたＩＣ５０の範囲が各例において３倍未満だけ変動することが見出されたので、信頼できると考えられる。
例１３．ヒトＩＬ２２に対する１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂのインビトロヒト初代ケラチノサイト細胞に基づく活性
抗体分子１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂを、ヒトＩＬ－２２（自社製造）の活性に対するインビトロセルアッセイで試験した。包皮由来の初代ヒト新生児表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）をドナー（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ、カタログ番号Ｃ－１２００１）から倫理的に供給し、培養で増殖させ、アッセイに使用した。ＮＨＥＫ細胞は、細胞上清中で検出することができるＳ１００Ａ７（プソリアシン）を含む可溶性分子の分泌によってＩＬ－２２刺激に応答する（図１１Ａ）。Ｓ１００Ａ７を、１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂ活性を評価するためのバイオマーカーとしてアッセイに使用した。
２継代目及び３継代目の２人のドナー由来のＮＨＥＫ細胞を、細胞外マトリックス（ＴｈｅｒｏｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｒ０１１Ｋ）で予めコーティングした４８ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）透明ＴＣ処理プレート、カタログ番号３５４８）中のケラチノサイト成長キット（ＬＧＣ，ｃａ ｎｏ＃ＡＴＣＣ－ＰＣＳ－２００－０４０）を含有する真皮基本培地（ＬＧＣ、カタログ番号＃ＡＴＣＣ－ＰＣＳ－２００－０３０）に１０４細胞／ウェルで播種した。ケラチノサイトをコンフルエンスに達するまで標準的な条件（３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％）で培養した。３日目に、増殖培地を全てのウェルから吸引し、細胞を２００μｌの基底真皮培地で洗浄して、あらゆる死細胞及び増殖因子を除去した。５０ｎＭ～０．０１ｎＭ（２５００－１ｎｇ／ｍｌ）の濃度範囲の抗ＩＬ２２抗体１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂを、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ２２と共に、皮膚基礎培地中、３７℃で３０分間プレインキュベートした。また、５０ｎＭ（２５００ｎｇ／ｍｌ）のＦａｂフォーマットのフェザキヌマブ（抗ＩＬ－２２抗体、自社在庫、バッチ番号＃ＰＢ７４９０）を、１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ２２と共に真皮基底培地中、３７℃で３０分間プレインキュベートした。次いで、４００μｌ／ウェルの抗体／サイトカイン溶液を細胞に移した。４８時間の刺激後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（ＬＳＢｉｏ、カタログ番号ＬＳ－Ｆ５００３１）を用いてＳ１００Ａ７のレベルを測定した。
ＩＬ２２刺激後にＳ１００Ａ７の増加を測定した（図１１Ａ）。５０ｎＭのフェザキヌマブＦａｂは、ＩＬ２２によって誘導されたＳ１００Ａ７シグナルを完全に阻害した。５０ｎＭの１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂもまた、Ｓ１００Ａ７の完全な阻害を示した（図１１Ａ）。１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂは、Ｓ１００Ａ７の濃度依存的阻害を示した（図１１Ｂ）。
結論として、ヒト初代ケラチノサイトアッセイで試験した１１０４１ｇＬ１３ｇＨ１４ Ｆａｂは、ＩＬ－２２依存性バイオマーカーの用量依存的阻害を示した（Ｓ１００Ａ７）。
例１４．ＩＬ２２ホスホＳＴＡＴ３方法
Ｈａｃａｔ細胞を９６ウェル平底組織培養プレートに１００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２ｍＭＬ－グルタミン／ウェルで１５０，０００細胞／ウェルで添加し、３７度及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。抗ＩＬ２２抗体を模擬上清培地で１８．７５ｎＭの最終アッセイ濃度に希釈し、最小シグナル対照として６０μｌを９６ウェルポリプロピレンＶ底プレートのカラム１及び１２に添加した。最大シグナル対照として、６０μｌの模擬上清培地を９６ウェルポリプロピレンＶ底プレートのカラム２及び１１に添加した。試料を模擬上清培地中に１：３で滴定し、９６ウェルポリプロピレンＶ底プレートのカラム３～１０に６０μｌの最終容量を残した。３０μｌのＩＬ２２溶液を全てのウェルに添加して、３０ｎｇ／ｍｌのＦＡＣの最終アッセイ濃度を得た。プレートを３７度で１時間プレインキュベートした。細胞培養プレートからの培養培地７５μｌをプレートに２５μｌ残す。７５μｌの試料滴定／対照＋ｉｌ２２を細胞プレートに移した。これらのプレートを３７度で３０分間インキュベートした。上清を除去した。Ｃｉｓｂｉｏ ＳＴＡＴ３ ＰｈｏｓｐｈｏＹ７０５キットを使用して、残りの細胞を溶解し、各ウェルの溶解物からＨＴＲＦシグナルを生成した。プレートを密封し、室温でシェーカー上で一晩１８時間インキュベートした。ウェル信号は、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｎｅｏ２プレートリーダでＨＴＲＦプロトコルを使用して測定した。１１０４１及び１１０７０の抗体は、ＩＬ２２誘導性ＳＴＡＴ３リン酸化の明確な阻害を示した。
特許、特許出願、論文、教科書等を含む本明細書に引用された全ての参考文献、及びそれらに引用された参考文献は、それらがまだ存在しない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表３ ＜２２３＞ＨｉｓタグＩＬ２２
配列表５～２１ ＜２２３＞ＣＤＲ配列
配列表２２～２３ ＜２２３＞１１０４１ ｇＬ６ Ｃ９１Ｓ Ｓ９６Ａ（ｇＬ１３）Ｖ領域
配列表２４～２５ ＜２２３＞１１０４１ ｇＨ５ Ｄ５４Ｅ（ｇＨ１４）Ｖ領域
配列表２６～２７ ＜２２３＞１１０４１ｇＬ１３軽鎖
配列表２８～２９ ＜２２３＞１１０４１ｇＨ１４ Ｆａｂ重鎖
配列表３０～３１ ＜２２３＞１１０４１ｇＨ１４重鎖（ＩｇＧ１）
配列表３２～３３ ＜２２３＞１１０４１ ｇＨ５ Ｄ５４Ｅ（ｇＨ１４）重鎖（ＩｇＧ４Ｐ）
配列表３４～３５ ＜２２３＞ウサギ１１０４１ ＶＬ領域
配列表３６～３７ ＜２２３＞ウサギ１１０４１ ＶＨ領域
配列表３８ ＜２２３＞１１０４１ ｇＬ１ Ｖ領域
配列表３９ ＜２２３＞１１０４１ ｇＬ１ Ｃ９１Ｓ Ｖ領域
配列表４０ ＜２２３＞１１０４１ ｇＬ１ Ｃ９１Ｖ Ｖ領域（ｇＬ３）
配列表４１ ＜２２３＞１１０４１ｇＬ６ Ｖ領域
配列表４２ ＜２２３＞１１０４１ｇＬ７ Ｖ領域
配列表４３ ＜２２３＞１１０４１ ｇＬ１ Ｎ９５Ｄ Ｖ領域（ｇＬ８）
配列表４４ ＜２２３＞１１０４１ ｇＬ１ Ｓ９６Ａ Ｖ領域（ｇＬ９）
配列表４５ ＜２２３＞１１０４１ ｇＬ１ Ｃ９１Ｓ Ｓ９６Ａ Ｖ領域（ｇＬ１０）
配列表４６ ＜２２３＞１１０４１ ｇＬ６ Ｃ９１Ｓ Ｖ領域（ｇＬ１１）
配列表４７ ＜２２３＞１１０４１ ｇＬ７ Ｃ９１Ｓ Ｖ領域（ｇＬ１２）
配列表４８ ＜２２３＞１１０４１ ｇＬ７ Ｃ９１Ｓ Ｓ９６Ａ Ｖ領域（ｇＬ１４）
配列表４９ ＜２２３＞１１０４１ｇＨ１ Ｖ領域
配列表５０ ＜２２３＞１１０４１ ｇＨ１ Ｇ５５Ａ Ｖ領域（ｇＨ２）
配列表５１ ＜２２３＞１１０４１ ｇＨ１ Ｄ５４Ｅ Ｖ領域（ｇＨ３）
配列表５２ ＜２２３＞１１０４１ ｇＨ１ Ｄ１０７Ｅ Ｖ領域（ｇＨ４）
配列表５３ ＜２２３＞１１０４１ｇＨ５ Ｖ領域
配列表５４ ＜２２３＞１１０４１ｇＨ８ Ｖ領域
配列表５５ ＜２２３＞１１０４１ｇＨ９ Ｖ領域
配列表５６ ＜２２３＞１１０４１ｇＨ１１ Ｖ領域
配列表５７ ＜２２３＞１１０４１ｇＨ１２ Ｖ領域
配列表５８ ＜２２３＞１１０４１ ｇＨ８ Ｄ５４Ｅ Ｖ領域（ｇＨ１５）
配列表５９ ＜２２３＞１１０４１ ｇＨ１１ Ｄ５４Ｅ Ｖ領域（ｇＨ１７）
配列表６０ ＜２２３＞１１０４１ ｇＨ１２ Ｄ５４Ｅ Ｖ領域（ｇＨ１８）
配列表６１～６２ ＜２２３＞ヒトＩＧＫＶ１Ｄ－１３ ＩＧＫＪ４受容体フレームワーク
配列表６３～６４ ＜２２３＞ヒトＩＧＨＶ３－６６ ＩＧＨＪ４受容体フレームワーク
配列表７１ ＜２２３＞１１０７０ ＣＤＲＨ２（変異なし）
配列表７２～７３ ＜２２３＞１１０７０ｇＬ７ Ｖ領域
配列表７４～７５ ＜２２３＞１１０７０ｇＨ１６ Ｖ領域
配列表７６～７７ ＜２２３＞１１０７０ｇＬ７軽鎖
配列表７８～７９ ＜２２３＞１１０７０ｇＨ１６ Ｆａｂ重鎖
配列表８０～８１ ＜２２３＞１１０７０ｇＨ１６ ＩｇＧ１重鎖
配列表８２～８３ ＜２２３＞１１０７０ｇＨ１６ ＩｇＧ４Ｐ重鎖
配列表８４～８５ ＜２２３＞ラットＡｂ １１０７０ ＶＬ領域
配列表８６～８７ ＜２２３＞ラットＡｂ １１０７０ ＶＨ領域
配列表８８ ＜２２３＞１１０７０ｇＬ１ Ｖ領域
配列表８９ ＜２２３＞１１０７０ｇＨ１ Ｖ領域
配列表９０ ＜２２３＞１１０７０ｇＨ１３ Ｖ領域（ｇＨ１ Ｓ６１Ｔ）
配列表９１～９２ ＜２２３＞ヒトＩＧＫＶ１－１２ ＩＧＫＪ２受容体フレームワーク
配列表９３～９４ ＜２２３＞ヒトＩＧＨＶ４－３１ ＩＧＨＪ６受容体フレームワーク
配列表９５ ＜２２３＞ペプチド７２～８４
配列表９６ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド７２～８５
配列表９７ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド７５～８４
配列表９８ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド７５～８５
配列表９９ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド７６～８４
配列表１００ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド８０～８５
配列表１０１ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド１２６～１３９
配列表１０２ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド１０１～１１１
配列表１０３ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド１０３～１１５
配列表１０４ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド１０３～１１７
配列表１０５ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド４３～５８
配列表１０６ ＜２２３＞ＩＬ２２ペプチド１０５～１１７

Claims (36)

  1. インターロイキン２２（ＩＬ２２）に結合し、ＩＬ２２受容体１（ＩＬ２２Ｒ１）へのＩＬ２２の結合を阻害又は減弱する、単離された抗体。
  2. 前記抗体が、ＩＬ２２とＩＬ２２Ｒ１との間の相互作用を立体的に遮断するようにＩＬ２２上の領域に結合する、請求項１に記載の抗体。
  3. ＩＬ２２結合タンパク質（ＩＬ２２ＲＡ２）へのＩＬ２２結合を阻害又は減弱する、請求項１又は２に記載の抗体。
  4. ヒトＩＬ２２及び／又はカニクイザルＩＬ２２に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 前記抗体が、ヒトＩＬ２２について１００ｐＭ未満の解離平衡定数（ＫＤ）を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
  6. 配列番号１によって定義されるＩＬ２２のアミノ酸配列の残基７２～８５に対応するポリペプチドＶＲＬＩＧＥＫＬＦＨＧＶＳＭ（配列番号９６）に特異的に結合する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 前記抗体がヒトＩＬ２２のエピトープに結合し、前記エピトープが、前記抗体とＩＬ２２との間の５Å未満の接触距離で決定される場合、ヒトＩＬ２２（配列番号１）のＬｙｓ４４、Ｐｈｅ４７、Ｇｌｎ４８、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｙ７６、Ｇｌｕ７７、Ｐｈｅ８０、Ｈｉｓ８１、Ｇｌｙ８２、Ｖａｌ８３、Ｓｅｒ８４、Ｍｅｔ８５、Ｓｅｒ８６、Ａｒｇ８８、Ｌｅｕ１６９、Ｍｅｔ１７２、Ｓｅｒ１７３、Ａｒｇ１７５、Ａｓｎ１７６及びＩｌｅ１７９から選択される５つ以上の残基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体。
  8. 前記結合が、Ｘ線結晶学を使用して決定される、請求項７に記載の抗体。
  9. 配列番号５を含むＣＤＲ－Ｌ１、
    配列番号６を含むＣＤＲ－Ｌ２、及び
    配列番号７を含むＣＤＲ－Ｌ３
    を含む軽鎖可変領域と、
    配列番号８を含むＣＤＲ－Ｈ１、
    配列番号９を含むＣＤＲ－Ｈ２、及び
    配列番号１０を含むＣＤＲ－Ｈ３
    を含む重鎖可変領域と、
    を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２２に示される配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。
  11. 前記重鎖可変領域が、配列番号２４に示される配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。
  12. 前記軽鎖可変領域が、配列番号２２に示される配列、又はそれと少なくとも９０％同一の配列を含み、前記重鎖可変領域が、配列番号２４に示される配列、又はそれと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。
  13. 前記抗体が、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
    前記軽鎖可変領域が、配列番号２２に示される配列を含み、９１、９５及び／又は９６の位置の１つ又は複数の残基が別のアミノ酸によって置換されており、
    前記重鎖可変領域が、配列番号２４に示される配列を含み、５４、５５及び／又は１０７の位置の１つ又は複数の残基が別のアミノ酸によって置換されている、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体。
  14. 各ＣＤＲが３つまでのアミノ酸置換を含有し、そのようなアミノ酸置換が保存的である、請求項９に記載の抗体。
  15. 前記軽鎖可変領域及び前記重鎖可変領域の残りの部分が、それぞれ配列番号２２及び２４と少なくとも９０％の同一性を有する、請求項９に記載の抗体。
  16. 完全長抗体である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体。
  17. 抗体フラグメントである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗体。
  18. 前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、又はｄｓｓｃＦｖである、請求項１７に記載の抗体。
  19. 配列番号２６に示される配列を含む軽鎖と配列番号２８に示される配列を含む重鎖とを含むＦａｂである、請求項１８に記載の抗体。
  20. 配列番号５／６／７／８／９／１０でそれぞれ示される配列を含むＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３を含むＦａｂであり、前記軽鎖及び重鎖の残りの部分が、それぞれ配列番号２６及び２８と少なくとも９０％の同一性又は類似性を有する、請求項１８に記載の抗体。
  21. 配列番号２６に示される配列を含む軽鎖と配列番号３０に示される配列を含む重鎖とを含むＩｇＧ１である、請求項１６に記載の抗体。
  22. 前記抗体が、配列番号５／６／７／８／９／１０でそれぞれ示される配列を含むＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３を含むＩｇＧ１であり、前記軽鎖及び重鎖の残りの部分が、それぞれ配列番号２６及び３０と少なくとも９０％の同一性又は類似性を有する、請求項１６に記載の抗体。
  23. 配列番号２６に示される配列を含む軽鎖と配列番号３２に示される配列を含む重鎖とを含むＩｇＧ４Ｐである、請求項１６に記載の抗体。
  24. 前記抗体が、配列番号５／６／７／８／９／１０でそれぞれ示される配列を含むＣＤＲ－Ｌ１／ＣＤＲ－Ｌ２／ＣＤＲ－Ｌ３／ＣＤＲ－Ｈ１／ＣＤＲ－Ｈ２／ＣＤＲ－Ｈ３を含むＩｇＧ４Ｐであり、前記軽鎖及び重鎖の残りの部分が、それぞれ配列番号２６及び３２と少なくとも９０％の同一性又は類似性を有する、請求項１６に記載の抗体。
  25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
  26. 請求項２５に記載のポリヌクレオチドを担持する発現ベクター。
  27. 請求項２６に記載のベクターを含む宿主細胞。
  28. 請求項２７に記載される宿主細胞を、前記抗体の産生を可能にする条件下で培養することと、前記産生された抗体を回収することと、を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体を産生する方法。
  29. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容されるアジュバント又は担体とを含む医薬組成物。
  30. 治療によるヒト又は動物の身体の治療方法において使用するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 医薬品として使用するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体、又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  32. 医薬品を製造するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物の使用。
  33. 炎症性皮膚状態の治療に使用するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物。
  34. 治療有効量の請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、炎症性皮膚状態を治療又は予防する方法。
  35. 炎症性皮膚状態を治療するための医薬品を製造するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗体又は請求項２９に記載の医薬組成物の使用。
  36. 前記炎症性皮膚状態が、乾癬、乾癬性関節炎、接触性皮膚炎、慢性手湿疹又はアトピー性皮膚炎である、請求項３３に記載の抗体若しくは医薬組成物、請求項３４に記載の方法、又は請求項３５に記載の使用。
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