KR101516823B1 - 안정화된 폴리펩티드 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 적어도 부분적으로, 안정화된 scFv로 구성되거나 이를 포함하는 안정화된 결합 분자의 개발, 및 그러한 안정화된 분자의 제조 방법에 기초한다.

Description

안정화된 폴리펩티드 조성물{STABILIZED POLYPEPTIDE COMPOSITIONS}
관련 출원
본 출원은 각기 모든 목적을 위해 전적으로 본원에 참조 인용되는 하기 미국 특허 가출원들에 대해 우선권의 이익을 주장한다:
1) 미국 특허 가출원 제60/783,622호(2006년 3월 17일 출원; 발명의 명칭: "STABILIZED POLYPEPTIDES AND METHODS FOR EVALUATING AND INCREASING THE STABILITY OF SAME");
2) 미국 특허 가출원 제60/812,688호(2006년 6월 9일 출원; 발명의 명칭: "STABILIZED POLYPEPTIDES AND METHODS FOR EVALUATING AND INCREASING THE STABILITY OF SAME");
3) 미국 특허 가출원 제60/873,502호(2006년 12월 8일 출원; 발명의 명칭 "METHODS FOR EVALUATING AND ENHANCING BIOPHYSICAL PROPERTIES OF POLYPEPTIDES"); 및
4) 미국 특허 가출원 제60/873,996호(2006년 12월 8일 출원; 발명의 명칭: "STABILIZED POLYPEPTIDE COMPOSITIONS").
본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 임의의 특허, 특허출원 및 참조문헌의 내용은 전적으로 본원에 참조 인용된다.
단백질 안정성은 이제 단백질, 예를 들어 항체 분자의 개발 및 규모 확장(scale-up)을 위한 중요 관건으로 인식된다. 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 서열은 선택적 압력을 받고, 항체 간에 서열이 유의적으로 다양할 수 있다(문헌 [Wu 및 Kabat, 1970]). 인간 게놈 내에 삽입된 수많은 기능성 배아세포주(germline) 가변 중(~40; 문헌 [Tomlinson 등, 1992]; 문헌 [Tomlinson 등, 1994]; 문헌 [Matsuda 및 Honjo, 1996]), 가변 카파(~40; 문헌 [Meindl 등, 1989; Cox 등, 1994]; 문헌 [Barbie 및 Lefranc, 1998]) 및 가변 람다(~30; 문헌 [Williams 등, 1996]; 문헌 [Kawasaki 등, 1997]) 유전자가 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 배아세포주의 많은 조합을 생성시키는 면역계의 능력은 항체 다양성을 발생시키기 위한 한 기작이다(문헌 [Edelman, 1959]; 문헌 [Franek, 1961]). 부가적 다양성은 가변 도메인과 불변 도메인 사이에 가변 연결 펩티드 영역, J-연결 펩티드 (및 중쇄를 위한 D-연결 펩티드)를 삽입함으로써 유도된다(문헌 [Leder, 1982]). 특이적 항원에 대한 배아세포주 항체 선택에 후속하여, 선택된 가변 도메인 배아세포주 및 (D-)J-연결 펩티드와 함께 단열 항체를 발현하는 B-세포는 가변 중쇄 및 경쇄 도메인 내 과체세포 돌연변이 과정을 겪어, 항체에 대한 항체 친화도를 증가시킨다(문헌 [Leder, 1982]; 문헌 [Tomlinson 등, 1996]). 과체세포 돌연변이보다 빈도가 훨씬 더 낮기는 하나, 가변 도메인 내 과체세포 삽입 또는 결실이 또한 통상 관찰된다(문헌 [de Wildt 등, 1999]). 이에 따라, 특별한 항원에 대해 선택된 성숙 항체는 안정성에 대해 반드시 최적화되지는 않는 매우 독특한 가변 도 메인 서열을 가질 것이다.
좋지 않은 안정성은 항체 또는 항체 도메인이 각종 세포내 시스템 내, 예를 들어 세균 또는 포유동물 발현 시스템 내 발현될 때 적절히 폴딩하는 능력에 영향을 미칠 수 있다. 미스폴딩 또는 좋지 않은 안정성은 또한 비작용성 물질(Martsev 등, 1998), 및/또는 치료적으로 사용될 때 잠재적으로 위험하거나 면역원성인 큰 가용성 응집체를 형성하는 경향을 갖는 항체의 부분 집단을 초래할 수 있다. 다른 안정성 문제에는 저해된 리폴딩, 분해, 손상된 결합력, 응집, 또는 저장 후의 활성 손실이 포함된다.
안정성 문제가 천연 발생 항체에 국한되지 않으며, 또한 조작된 항원 결합 분자, 예컨대 재조합 항체 라이브러리(문헌 [Hoogenboom, 2005]), 항체 단편(문헌 [Holt 등, 2003]; 문헌 [Todorovska 등, 2001]; 문헌 [Worn 및 Pluckthun, 2001]; 문헌 [Reiter 및 Pastan, 1996]), 및 제조 및 임상적 목적을 위해 조작되거나 인간화된 치료적 항체(문헌 [Ewert 등, 2004]; 문헌 [Carter 및 Merchant, 1997])에서도 일어날 수 있다. 또한, 다가 형태의 항체, 예컨대 이중특이적 분자는 안정성 문제를 가질 수 있다. 이중특이적 항체가 그것의 인간에서의 치료적 용도로 인해 바람직하나, 그 생산이 예측불허이다. 예를 들어, 이중특이적 항체는 열 안정성, 생성물 수율, 또는 저분자량 응집체의 형성의 상당한 감소를 초래할 수 있다.
VH 및 VL 도메인으로의 비천연적 변화가 또한 설치류 항체를 인간화할 때 일어날 수 있다. 인간화는 일반적으로 가장 유사한 인간 배아세포주 가변 도메인에 설치류 상보성 결정 영역(CDR)을 그라프팅함으로써 수행된다(문헌 [Hurle 및 Gross, 1994]). 인간화를 위해 선택되는 배아세포주는 면역계에 의한 큰 빈도로 사용되지 않을 수 있고, 인간 프레임워크 내의 변화는 종종 적당한 항원 결합의 달성을 위해 필요하다.
불안정 단백질은 하기와 같은 문제들 중 하나 이상을 비롯한 많은 문제들을 가지고 있다: 바이오리액터에서의 스캐일-업 생산에 대한 부적합성(이는 예를 들어, 낮은 수율, 유의적 수준의 비조립 생성물과 같은 원치 않는 부산물 및/또는 응집된 물질로 인한 문제임), 단백질 정제의 곤란성, 및 약학적 제제 및 용도에 대한 비적합성(이는 예를 들어, 유의적 수준의 파괴 생성물, 좋지 않는 생성물 품질 및/또는 바람직하지 않은 약물동태학적 성질로 인한 문제임). 항체, Fab, Fv 또는 단쇄 Fv(scFv)의 가변 도메인 내의 불안정성은 상기 문제들 중 많은 문제를 초래할 수 있다. scFv 구성체는 특히 안정성, 용해성, 발현, 응집, 파괴 생성물, 및 세균과 포유동물 발현 시스템 모두에 있어 전체 제조능과 관련된 문제를 나타냈다(문헌 [Worn 및 Pluckthun, 2001] 참조). 부가적으로, scFv 분자를 다른 방식으로 안정한 재조합 항체 생성물의 도입할 경우, 종종 신규 재조합 설계에 상기와 같은 일반적으로 바람직하지 못한 특색을 부가한다.
따라서, 단백질, 예컨대 항체의 안정성을 예측하기 위한 향상된 방법, 및 규모조정가능한(scalable) 생성을 위해 적당한, 향상된 안정 항원 결합 분자가 필요하다. 또한 약학적 용도를 위해 적당한 안정한 항원 결합 분자의 집단의 규모 조정가능한 생성을 위한 향상된 방법이 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 적어도 부분적으로는, 향상된 안정성을 갖는 scFv 분자를 포함하는 이로 구성된, 향상된 폴리펩티드 조성물, 예를 들어 향상된 결합 분자의 개발, 및 이 분자의 제조 방법에 기초한다.
한 측면에서, 본 발명은 안정화된 scFv 분자가
i) VH 및 VL 도메인이 VH 도메인 내의 아미노산과 VL 도메인 내의 아미노산 사이의 디술피드 결합에 의해 연결되고, scFv 분자의 VH 및 VL 도메인이 55℃ 초과의 Tm 값을 가지는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 scFv 링커; 또는
ii) VH 및 VL 도메인이 VH 도메인 내의 아미노산과 VL 도메인 내의 아미노산 사이의 디술피드 결합에 의해 연결되고, scFv 분자가 49℃ 초과의 T50 값을 가지는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 scFv 링커
를 포함하는, 안정화된 scFv 분자의 집단에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
i) VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 (Gly4Ser)n을 갖는 scFv 링커(여기에서, VH 및 VL 도메인은 VH 아미노산 44와 VL 아미노산 100 사이의 디술피드 결합에 의해 연결됨);
ii) 분자가
a) VH의 카밧 위치 13에 있는 아미노산의 치환;
b) VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의 치환;
c) VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의 치환;
d) VL의 카밧 위치 49에 있는 아미노산의 치환;
e) VL의 카밧 위치 50에 있는 아미노산의 치환;
f) VL의 카밧 위치 49 및 50에 있는 아미노산의 치환;
g) VH의 카밧 위치 101에 있는 아미노산의 치환;
h) VH의 카밧 위치 20에 있는 아미노산의 치환;
i) VH의 카밧 위치 48에 있는 아미노산의 치환;
j) VL의 카밧 위치 3에 있는 아미노산의 치환;
k) 카밧 위치 55에 있는 아미노산의 치환;
l) VH의 카밧 위치 67에 있는 아미노산의 치환;
m) VH의 카밧 위치 6에 있는 아미노산의 치환;
n) VH의 카밧 위치 32에 있는 아미노산의 치환;
o) VH의 카밧 위치 49에 있는 아미노산의 치환;
p) VH의 카밧 위치 43에 있는 아미노산의 치환;
q) VH의 카밧 위치 72에 있는 아미노산의 치환;
r) VH의 카밧 위치 79에 있는 아미노산의 치환;
s) VL의 카밧 위치 50에 있는 아미노산의 치환;
t) VL의 카밧 위치 75에 있는 아미노산의 치환;
u) VL의 카밧 위치 80에 있는 아미노산의 치환;
v) VL의 카밧 위치 83에 있는 아미노산의 치환
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 가지는 VH 도메인 및 VL 도메인; 또는
iii) 분자가 직접적으로 계면 내에 있는 아미노산 위치 및/또는 VH와 VL 사이의 상호작용의 골격이 되는(scaffolding) 아미노산 위치에서 하나 이상의 치환을 가지는, scFv의 VH와 VL 사이의 안정화된 계면을 갖는 VH 도메인 및 VL 도메인(여기에서, 하나 이상의 아미노산 위치는 카밧 넘버링에 준해 47H, 37H, 45H, 46H, 51H, 59H, 109H, 14H, 26H, 27H, 4OH, 69H, 103H, 29H, 38H, 44H, 49H, 55H, 63H, 54H, 68H, 72H, 74H, 79H, 82bH, 8H, 32H, 39H, 41H, 62H, 85H, 91H, 24H, 6OH, 37L, 36L, 44L, 59L, 57L, 64L, 46L, 48L, 63L, 67L, 68L, 39L, 45L, 47L, 54L, 56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L, 83L, 89L 및 104L로 이루어진 군으로부터 선택됨)
를 포함하고, 치환이 결여된 scFv 분자의 T50보다 큰 T50을 가지는 안정화된 scFv 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 (Gly4Ser)4 scFv 링커(여기에서, VH 및 VL 도메인은 VH 도메인 내 아미노산과 VL 도메인 내 아미노산 사이의 디술피드 결합에 의해 연결됨)를 포함하는 안정화된 scFv 분자에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
a) VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환, VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의, 예를 들어 리신으로의 치환;
b) VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환; VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의, 예를 들어 리신으로의 치환; 및 VH의 카밧 위치 55에 있는 아미노산의, 예를 들어 글리신으로의 치환; 및
c) VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환; VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의, 예를 들어 리신으로의 치환; VH의 카밧 위치 55에 있는 아미노산의, 예를 들어 글리신으로의 치환; 및 VH의 카밧 위치 101에 있는 아미노산의 치환, 예를 들어 아스파르트산으로의 치환
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환의 하나 이상의 세트를 가지는, VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 안정화된 scFv 분자에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 안정화된 scFv 분자는 열 자극 조건 하에서 종래의 Fab 단편의 안정성과 동등한 안정성을 가진다.
한 실시양태에서, 안정성은 표적 분자에 결합하는 능력을 측정함으로써 평가된다.
한 실시양태에서, scFv 분자는 서열 번호 9, 14, 16 및 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, scFv 분자는 10, 15, 17 및 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 안정화된 scFv 분자를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 융합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 안정화된 결합 분자가 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 scFv 링커를 포함하는 하나 이상의 안정화된 scFv 분자를 포함하고(여기에서, VH 및 VL 도메인은 VH 도메인 내 아미노산과 VL 도메인 내 아미노산 사이의 디술피드 결합에 의해 연결됨), 안정화된 결합 분자의 집단이, 10% 이하가 응집된 형태로 존재하는 단량체성의 가용성 단백질을 포함하는, 안정화된 다가 항원 결합 분자의 집단에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 안정화된 다가 항원 결합 분자가 CHO 또는 NSO 세포 내에서 발현된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 각 다가 항원 결합 분자가
i) VH 및 VL 도메인이 VH 도메인 내 아미노산과 VL 도메인 내 아미노산 사이의 디술피드 결합에 의해 연결되고, 하나 이상의 scFv 분자의 VH 및 VL 도메인이 55℃ 초과의 Tm을 가지는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 scFv 링커를 포함하는 하나 이상의 scFv 분자; 또는
ii) VH 및 VL 도메인이 VH 도메인 내 아미노산과 VL 도메인 내 아미노산 사이의 디술피드 결합에 의해 연결되고, 다가 항원 결합 분자의 하나 이상의 scFv 분자가 49℃ 초과의 T50을 가지는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 scFv 링커를 포함하는, 안정화된 다가 항원 결합 분자의 집단에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
i) 각기 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 (Gly4Ser)n scFv 링커를 포함하고, 상기 VH 및 VL 도메인은 디술피드 결합에 의해 연결된, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자;
ii) 각기 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 아미노산 서열(Gly4Ser)n을 갖는 scFv 링커를 포함하고, 상기 VH 및 VL 도메인은 VH 아미노산 44와 VL 아미노산 100 사이의 디술피드 결합에 의해 연결된, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자;
iii) 각기
a) VH의 카밧 위치 13에 있는 아미노산의 치환;
b) VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의 치환;
c) VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의 치환;
d) VL의 카밧 위치 49에 있는 아미노산의 치환;
e) VL의 카밧 위치 50에 있는 아미노산의 치환;
f) VL의 카밧 위치 49 및 50에 있는 아미노산의 치환;
g) VH의 카밧 위치 101에 있는 아미노산의 치환;
h) VH의 카밧 위치 20에 있는 아미노산의 치환;
i) VH의 카밧 위치 48에 있는 아미노산의 치환;
j) VL의 카밧 위치 3에 있는 아미노산의 치환;
k) VH의 카밧 위치 55에 있는 아미노산의 치환;
l) VH의 카밧 위치 67에 있는 아미노산의 치환;
m) VH의 카밧 위치 6에 있는 아미노산의 치환;
n) VH의 카밧 위치 32에 있는 아미노산의 치환;
o) VH의 카밧 위치 49에 있는 아미노산의 치환;
p) VH의 카밧 위치 43에 있는 아미노산의 치환;
q) VH의 카밧 위치 72에 있는 아미노산의 치환;
r) VH의 카밧 위치 79에 있는 아미노산의 치환;
s) VL의 카밧 위치 50에 있는 아미노산의 치환;
t) VL의 카밧 위치 75에 있는 아미노산의 치환;
u) VH의 카밧 위치 80에 있는 아미노산의 치환;
v) VH의 카밧 위치 83에 있는 아미노산의 치환
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자; 또는
iv) 분자가 직접적으로 계면 내에 있는 아미노산 위치 및/또는 VH와 VL 사이의 상호작용의 골격이 되는 아미노산 위치에서 하나 이상의 치환을 가지는, scFv의 VH와 VL 사이의 안정화된 계면을 갖는 VH 도메인 및 VL 도메인(여기에서, 하나 이상의 아미노산 위치는 카밧 넘버링에 준해 47H, 37H, 45H, 46H, 51H, 59H, 109H, 14H, 26H, 27H, 4OH, 69H, 103H, 29H, 38H, 44H, 49H, 55H, 63H, 54H, 68H, 72H, 74H, 79H, 82bH, 8H, 32H, 39H, 41H, 62H, 85H, 91H, 24H, 6OH, 37L, 36L, 44L, 59L, 57L, 64L, 46L, 48L, 63L, 67L, 68L, 39L, 45L, 47L, 54L, 56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L, 83L, 89L 및 104L로 이루어진 군으로부터 선택됨)
을 포함하는, 안정화된 다가 항원 결합 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
i) VH 및 VL 도메인이 VH 도메인 내 아미노산과 VL 도메인 내 아미노산 사이의 디술피드 결합에 의해 연결된, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 (Gly4Ser)4 scFv 링커를 포함하는 하나 이상의 안정화된 scFv 분자;
ii) VH 및 VL 도메인이 VH 아미노산 44과 VL 아미노산 100 사이의 디술피드 결합에 의해 연결된, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 아미노산 서열(Gly4Ser)n을 갖는 scFv 링커를 포함하는 하나 이상의 안정화된 scFv 분자; 또는
iii) a) VL의 카밧 위치 3에 있는 아미노산(예를 들어, 글루타민)의, 예를 들어 알라닌, 세린, 발린, 아스파르트산 또는 글리신으로의 치환;
b) VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산(예를 들어, 세린)의, 예를 들어 루이신으로의 치환;
c) VL의 카밧 위치 49에 있는 아미노산(예를 들어, 세린)의, 예를 들어 티로신 또는 세린으로의 치환;
d) VL의 카밧 위치 50에 있는 아미노산(예를 들어, 세린 또는 발린)의, 예를 들어 세린, 트레오닌, 및 아르기닌, 아스파르트산, 글리신 또는 리신으로의 치환;
e) VL의 카밧 위치 49에 있는 아미노산(예를 들어, 세린) 및 VL의 카밧 위치 50에서의 (예를 들어, 세린)의 각각 티로신 및 세린; 티로신 및 트레오닌; 티로신 및 아르기닌; 티로신 및 글리신; 세린 및 아르기닌; 또는 세린 및 리신으로의 치환;
f) VL의 카밧 위치 75에 있는 아미노산(예를 들어, 발린)의, 예를 들어 이소루이신으로의 치환;
g) VL의 카밧 위치 80에 있는 아미노산(예를 들어, 프롤린)의, 예를 들어 세린 또는 글리신으로의 치환;
h) VL의 카밧 위치 83에 있는 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌)의, 예를 들어 세린, 알라닌, 글리신 또는 트레오닌으로의 치환;
i) VH의 카밧 위치 6에 있는 아미노산(예를 들어, 글루탐산)의, 예를 들어 글루타민으로의 치환;
j) VH의 카밧 위치 13에 있는 아미노산(예를 들어, 리신)의, 예를 들어 글루탐산염으로의 치환;
k) VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산(예를 들어, 세린)의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환으로의 치환;
l) VH의 카밧 위치 20에 있는 아미노산(예를 들어, 발린)의, 예를 들어 이소루이신으로의 치환;
m) VH의 카밧 위치 32에 있는 아미노산(예를 들어, 아스파라긴)의, 예를 들어 세린으로의 치환;
n) VH의 카밧 위치 43에 있는 아미노산(예를 들어, 글루타민)의, 예를 들어 리신 또는 아르기닌으로의 치환;
o) VH의 카밧 위치 48에 있는 아미노산(예를 들어, 메티오닌)의, 예를 들어 이소루이신 또는 글리신으로의 치환;
p) VH의 카밧 위치 49에 있는 아미노산(예를 들어, 세린)의, 예를 들어 글리신 또는 알라닌으로의 치환;
q) VH의 카밧 위치 55에 있는 아미노산(예를 들어, 발린)의, 예를 들어 글리신으로의 치환;
r) VH의 카밧 위치 67에 있는 아미노산(예를 들어, 발린)의, 예를 들어 이소루이신 또는 루이신으로의 치환;
s) VH의 카밧 위치 72에 있는 아미노산(예를 들어, 글루탐산)의, 예를 들어 아스파르트산염 또는 아스파라긴으로의 치환;
t) VH의 카밧 위치 79에 있는 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌)의, 예를 들어 세린, 발린 또는 티로신으로의 치환; 및
u) VH의 카밧 위치 101에 있는 아미노산(예를 들어, 프롤린)의, 예를 들어 아스파르트산으로의 치환
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자를 포함하는 안정화된 다가 항원 결합 분자에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환, 및 VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의, 예를 들어 리신으로의 치환;
b) VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환; VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의, 예를 들어 리신으로의 치환; 및 VH의 카밧 위치 55에 있는 아미노산의, 예를 들어 글리신으로의 치환; 및
c) VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환; VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의, 예를 들어 리신으로의 치환; VH의 카밧 위치 55에 있는 아미노산의, 예를 들어 글리신으로의 치환; 및 VH의 카밧 위치 101에 있는 아미노산의, 예를 들어 아스파르트산으로의 치환
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치환의 하나 이상의 세트를 포함하는, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자를 포함하는 다가 항원 결합 분자에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자는 항체에 유전적으로 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 안정화된 scFv 분자는 항체에 유전적으로 융합된다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자는 항체의 경쇄 또는 중쇄의 카르복시 말단에 유전적으로 융합된다.
한 실시양태에서, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자는 항체의 경쇄 또는 중쇄의 아미노 말단에 유전적으로 융합된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 암 세포 상에 우선적으로 발현된 분자에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 scFv 분자의 VH 도메인은 BHA10 항체로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 scFv 분자의 VL 도메인은 BHA10 항체로부터 유래된다. 한 실시양태에서 본 발명의 결합 분자는 HER1, HER3, CD80, CD86, PD-1, CTLA4, B7-H4, RON, CD200, CD4, BAFR, EGFR, IGFR, VEGFR, TNF 패밀리의 수용체의 구성원, 타이(Tie) 수용체, MET, IGF1, IGF2, TNF, TNF 리간드, IL-6, TWEAK, Fn14, CD20, CD23, CRIPTO, HGF, 알파4베타1 인테그린, 알파5베타1 인테그린, 알파6베타4 인테그린 및 알파V베타6 인테그린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자에 대해 특이적인 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 면역 반응을 조절하는 것과 관련된 분자에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 한 실시양태에서, 분자는 Fc 수용체이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 혈관신생(angiogenesis)을 조절하는 것과 관련된 분자에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VEGF 또는 안지오포이틴에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 신경학적 표적에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 포함한다
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 다중특이적이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 이중특이적이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 TNF 수용체 패밀리의 2개 구성원에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 LTβR 및 Trail R2에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 14A2 항체에 유전적으로 융합된 BHA10 scFv 분자를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53 및 서열 번호 55로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 중쇄를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 청구항 제4항 내지 제8항, 제11항, 제12항 및 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항의 분자의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 안정화된 scFv 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자, 또는 본 발명의 안정화된 scFv 분자를 포함하는 결합 분자에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 핵산 분자는 벡터이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 그러한 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포, 예를 들어 CHO 세포 또는 NSO 세포이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 종래의 scFv 분자를 포함하는 결합 분자의 집단을 발현하는 숙주 세포에 비해 10% 이상 더 적은 응집체를 가지는, scFv 분자를 포함하는 결합 분자의 집단에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 안정화된 결합 분자가 생성되도록 하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 안정화된 결합 분자의 생성 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 숙주 세포 배양 배지 리터 당 10 mg 이상의 안정화된 결합 분자가 생성되고, 이 때 결합 분자의 10% 이하가 응집체 형태로 존재한다.
한 측면에서, 본 발명은 결합 분자를 대상에게 투여하여 치료가 일어나도록 하는 단계를 포함하는, 본 발명의 결합 분자를 이용한 치료로 이익을 받게 되는 대상의 치료 방법에 관한 것이다
한 실시양태에서, 대상은 암, 자가면역 질병 또는 장애, 및 신경학적 질병 또는 장애로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병 또는 장애를 앓고 있다.
한 측면에서, 본 발명은 (Gly4Ser)n scFv 링커를 이용하여 VH 도메인 및 VL 도메인을 유전적으로 융합하는 단계, 및 아미노산 44에서 시스테인을 포함하도록 VH 도메인을 조작하고, 아미노산 100에서 시스테인을 포함하도록 VL 도메인을 조작하여 안정화된 scFv 분자를 형성시키는 단계를 포함하는, scFv 분자의 안정화 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 항체 분자의 경쇄 또는 중쇄의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에 안정화된 scFv 분자를 유전적으로 융합하는 단계를 포함하는, 안정화된 scFv 분자를 포함하는, 안정화된 다가 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 scFv 분자의 VH/VL 계면 내 하나 이상의 아미노산 및/또는 scFv 분자의 VH/VL 계면의 골격이 되는 하나 이상의 아미노산을 치환하는 단계(여기에서, 상기 치환(들)은 종래의 scFv 분자에 비해, scFv 분자의 VH 및 VL 도메인 모두의 열 안정성을 동시에 향상시킴)를 포함하는 안정화된 scFv 분자의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 계면에 있는 2개 이상의 아미노산과 공변하는 VH 도메인 또는 VL 도메인 내의 하나 이상의 아미노산을 치환하는 단계를 포함하는, 안정화된 scFv 분자의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 scFv 분자의 VH/VL 계면 내 하나 이상의 아미노산 및/또는 scFv 분자의 VH/VL 지지 내 하나 이상의 아미노산을 치환하는 단계, 및 scFv 분자를 폴리펩티드에 유전적으로 융합함으로써 안정화된 융합 단백질을 제조하는 단계를 포함하는, scFv 분자를 포함하는 안정화된 융합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 안정화 돌연변이를 하나 이상의 scFv 분자에 도입함으로써 다가 분자의 안정성을 향상시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 scFv 분자를 포함하는 다가 분자의 안정성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 안정화 돌연변이를 scFv 분자에 도입함으로써 scFv 분자의 안정성을 향상시키는 단계를 포함하는, scFv 분자의 안정성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) scFv 분자의 열 안정성 시험을 수행하여, 후보 scFv 분자의 열 안정성을 결정하는 단계;
(b) 후보 scFv 분자의 열 안정성을 적당한 대조군과 비교하여, 대조군에 비해 증가된 열 안정성을 갖는 안정화된 scFv 분자를 확인하는 단계,
(c) 단계 (b)에서 확인된 안정화된 scFv 분자를 선택하는 단계;
(d) 하나 이상의 안정화된 scFv 분자를 단백질에 유전적으로 융합시켜, 안정화된 융합 단백질을 형성시키는 단계;
(e) 포유동물 숙주 세포에 안정화된 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 형질감염하는 단계,
(g) 안정화된 융합 단백질이 발현되도록 하는 조건 하에서 단계 (f)의 숙주 세포를 배양하는 단계(여기에서, 안정화된 융합 단백질은 10 L 이상의 배양 배지에서 성장할 때 10% 이하 단백질 응집으로 발현됨)
를 포함하는, 안정화된 융합 단백질의 대규모 제조 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
a) 폴리펩티드의 Ig 폴드에 상응하는 서열의 큐레이팅된(curated) 기준 세트의 정렬을 제공하는 단계;
b) 정렬의 서열의 아미노산 잔기들 간의 공변을 계산하여, 공변 데이터를 생성시키는 단계;
c) 공변 데이터 내 공변으로부터 후보 서열 내 아미노산 위치에 대한 서열 위치 특이적 공변 스코어를 결정하는 단계; 및
d) 폴리펩티드의 안정성의 척도로서 아미노산 위치 특이적 서열 공변 스코어를 조장하거나 출력하는 단계
를 포함하는, 아미노산의 후보 서열을 포함하는 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리 폴리펩티드로부터 단백질 폴드의 열 안정성을 결정하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 방법은 복수개의 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리 폴리펩티드를 위해 적어도 단계 c) 및 d)를 반복하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 방법 후보 서열의 서열 위치 특이적 공변 스코어에 기초하여, 그 복수개의 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리 폴리펩티드들 중, 생성을 위한 Ig 수퍼패밀리 폴리펩티드를 선택하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 선택된 Ig 수퍼패밀리 폴리펩티드를 생성시키는 단계 및 그것을 치료적 용도를 위해 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, Ig 수퍼패밀리 폴리펩티드는 면역글로불린 또는 이의 항원-결합 단편, 면역글로불린 수용체, 세포 부착 단백질, 인테그린, 알레르기원, T-세포 수용체, 및 주 조직적합 복합체(MHC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된다.
한 실시양태에서, Ig 수퍼패밀리 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역(VH), 경쇄 가변 영역(VL), 및 단쇄 항체(scFv)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, Ig 폴드는 V-클래스 폴드, I-클래스 폴드, C1-클래스 폴드, 및 C2-클래스 폴드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 큐레이팅된 기준 세트 또는 정렬은 50% 이상의 다양성을 가진다.
한 실시양태에서, 정렬의 각 서열은 정렬의 모든 다른 서열과 90% 미만의 일치도를 가진다.
또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 서열이 포유동물 종으로부터 비롯되고, 하나 이상의 서열이 포유동물외 종으로부터 비롯된다.
한 실시양태에서, 후보 서열의 잔기가 정렬에서의 상응하는 위치에서 발견되는 양성 공변을 충족하기 위해 양성 위치 특이적 공변 스코어로 지정된다.
한 실시양태에서, 후보 서열의 잔기는 정렬에서의 상응하는 위치에서 발견되는 음성 공변을 충족하기 위해 음성 위치 특이적 공변 스코어로 지정된다.
한 실시양태에서, 양성 공변이 약 +0.25 내지 약 +1.0의 파이 연관 계수(Φ)를 가진다.
한 실시양태에서, 음성 공변은 약 -0.25 내지 약 -1.0의 파이 연관 계수(Φ)를 가진다.
한 실시양태에서, 정렬은 구조-기재 서열 정렬, 서열-기재 서열 정렬, 및 구조-기재 구조 정렬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 위치 특이적 공변 스코어는 정렬의 각 잔기 위치에 있는 모든 가능한 잔기 쌍에 대해 결정된다.
한 실시양태에서, 정렬은 (i) 초기 정렬로부터 은닉 마르코프 모델(Hidden Markov Model)(HMM)을 생성시킴; (ii) HMM과 함께 부가 서열을 획득함; 및 (iii) 초기 정렬과 함께 부가 서열을 정렬함으로써 수득된다.
한 측면에서, 본 발명은 수행 시에 프로세서가 본 발명의 방법을 수행하도록 하는, 프로세서에 의해 수행가능한 지시사항 세트를 가지는, 컴퓨터 프로그램 또는 컴퓨터 프로그램 산물 또는 컴퓨터 판독가능 매체에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법의 정렬에 상응하는 데이터를 포함하는 전자 장치에 사용하기에 적당한 컴퓨터 프로그램 또는 컴퓨터 프로그램 산물 또는 컴퓨터 판독가능 매체에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법의 공변 데이터를 포함하는 전자 장치에 사용하기에 적당한 컴퓨터 프로그램 또는 컴퓨터 프로그램 산물 또는 컴퓨터 판독가능 매체에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위해 배치된 장치에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은
(i) 초기 서열 수집 공정;
(ii) 청구항 제58항 내지 제74항 중 어느 한 항의 정렬로부터 서열 데이터를 보유할 수 있는 저장 위치;
(iii) 공변 데이터를 수득하기 위해 정렬 내 잔기 쌍 사이의 공변을 프로그램에 의해 분석하는 분석 설비;
(iv) 상기 공변 데이터를 출력하는, 상기 전자 장치와 경계를 이루는 출력 장치
를 포함하는 전산 장치(computing device) 내 시스템에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법의 단계들 중 임의의 단계를 포함하는 방법을 수행하기 위해 수행가능한 단계를 보유하는 전산 장치 내 매체에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 잔기 사용 빈도 데이터의 표시는 (i) 폴리펩티드 서열에 상응하는 인접한 잔기 위치; 및 (ii) 각 잔기 위치에 있는 잔기 유형에 대한 잔기 사용 빈도를 포함하는 행렬을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 잔기 사용 빈도는 부호를 이용하여 표시된다.
한 실시양태에서, 모든 20종의 천연 아미노산, 갭 및 모호한 잔기가 나와 있다.
한 실시양태에서, 잔기 사용 빈도는 부호 크기와 상관된다.
한 실시양태에서, 잔기 사용 빈도는 부호 크기와 양의 관계로 상관된다.
한 실시양태에서, (i) 잔기 위치는 열에 표시되고; 및 (ii) 잔기 사용 빈도는 행에 표시된다.
또 다른 실시양태에서, 공변성 잔기들 중 공변은 네트워크 오버레이에 의해 표시된다.
한 측면에서, 본 발명은
(i) 폴리펩티드 서열의 기준 세트에 대한 잔기 사용 빈도 데이터의 수집을 포함하는 그리드 레이아웃(grid layout); 및
(ii) 공변 오버레이의 그래픽 표시
를 포함하는 그래픽 사용자 인터페이스에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 계면은 (iii) 관심 서열의 표시를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은
a) 폴리펩티드의 Ig 폴드에 상응하는 서열의 큐레이팅된 기준 세트의 정렬을 제공하는 단계;
b) 공변 잔기를 확인하기 위해 정렬의 서열의 잔기들 간의 공변을 계산하는 단계; 및
c) 공변을 충족하지 못하는 폴리펩티드의 잔기를 정렬 내 상응하는 위치에 있는 공변하는 잔기로 치환하는 단계
를 포함하는, 향상된 생물물리학적 성질을 갖는 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리 폴리펩티드의 생성 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 생물물리학적 성질은 열 안정성, pH 언폴딩 프로파일, 글리코실화의 안정한 제거, 용해성, 생물화학적 기능, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 생물화학적 기능은 단백질 표적 또는 화학적 부분(여기에서, 화학적 부분은 인산염, 메틸, 아세틸, 지질, 계면 활성제, 금속 이온, 할로겐, RNA, DNA, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드로 이루어진 군으로부터 선택됨)의 인식으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, Ig 수퍼패밀리 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 면역글로불린 수용체, 세포 부착 단백질, 인테그린, 알레르기원, T-세포 수용체, 및 주 조직적합 복합체(MHC) 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질로부터 유래된다.
한 실시양태에서, Ig 수퍼패밀리 폴리펩티드는 중쇄 가변 영역(VH), 경쇄 가변 영역(VL), 및 단쇄 항체(sFv)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, Ig 폴드는 V-클래스 폴드, I-클래스 폴드, C1-클래스 폴드, 및 C2-클래스 폴드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, Ig 수퍼패밀리 폴리펩티드는 도메인 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 인간외 단클론성 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, scFv-함유 항체, 및 도메인-결실 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형된 항체이다.
한 실시양태에서, 공변 잔기는 디술피드 결합, 염 가교, 리간드 결합 포켓 또는 표면의 일부, 및 반데르발스, 수소 결합 및/또는 전하-전하 상호작용의 네트워크로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조적 특성의 일부이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
a) 실험적으로 안정한 것으로 입증된 주형 항체의 고해상도 구조적 모델을 제공하는 단계;
b) 구조적 모델을 이용하여 VH/VL 계면 및/또는 주형 항체 내 계면 골격 잔기를 확인하는 단계;
c) 상동성 모델을 이용하여 계면을 안정화하는 데 중요한 항체 또는 변형된 항체의 상응하는 VH/VL 계면 잔기를 확인하는 단계; 및
d) 항체 또는 변형된 항체 내 상응하는 VH/VL 계면 잔기를 주형 단백질로부터의 계면 잔기로 치환하는 단계
를 포함하는, 향상된 안정성을 갖는 항체 또는 변형된 항체의 생성 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 주형 단백질의 계면 잔기는 계면에서 10 Å2 이상의 표면적을 매립한다.
한 실시양태에서, 변형된 항체는 도메인 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 인간외 단클론성 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, scFv-함유 항체, 및 도메인-결실 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성된 폴리펩티드에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드는 열 안정성, pH 언폴딩 프로파일, 글리코실화의 안정한 제거, 용해성, 생물화학적 기능, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물물리학적 성질의 향상을 나타낸다.
한 실시양태에서, 생물화학적 기능은 리간드 결합 친화성 또는 특이성이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) scFv 분자가 가변 도메인 서열에 상응하는 서열의 기준 세트를 제공하는 단계;
(b) 기준 세트 내 상응하는 위치에서 부재하거나 낮은 빈도로 관찰되는, 가변 도메인 내의 아미노산을 확인하는 단계;
(c) 이 정보를, 기준 세트에서 낮은 빈도로 확인된 아미노산을 변형시킴이 가변 도메인 내 기존 공변 제약을 충족할 수 있음을 제시하는 공변 데이터와 조합하는 단계; 및
(d) 단계 (b)의 아미노산을 후보 안정화 아미노산으로 치환함으로써 안정화된 scFv 분자를 포함하는 라이브러리를 생성하는 단계
를 포함하는, 안정화된 scFv 분자를 포함하는 라이브러리의 생성 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 단계 (b)의 아미노산은 0.5 미만의 일치 스코어를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (b)의 아미노산은 기준 세트 내 서열의 10% 미만으로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 단계 (b)의 아미노산은 비일치 잔기이다.
한 실시양태에서, 후보 안정화 아미노산은 기준 세트 내 상응하는 위치에서 발견된다.
또 다른 실시양태에서, 후보 안정화 아미노산은 일치 아미노산이다.
한 실시양태에서, 후보 안정화 아미노산은 가변 영역 서열의 3-D 구조의 분석에 의해 확인된다. 또 다른 실시양태에서, 안정화 아미노산은 측쇄 리팩킹(repacking) 계산에 의해 확인된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) 청구항 제56항의 방법에 따라 설계된 scFv 라이브러리를 제공하는 단계,
(b) 열 자극 검정으로 scFv 라이브러리를 선별하여, 후보 scFv 분자를 확인하는 단계, 및
(c) scFv 라이브러리의 후보 scFv 분자의 열 안정성을 적당한 대조군과 비교하는 단계(이로써, 대조군 대비 후보 scFv 분자의 열 안정성의 증가는 후보 scFv 분자가 안정화된 scFv 분자임을 확인시킴)
를 포함하는, 안정화된 scFv 분자의 생성 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 확인된 안정화된 scFv 분자, 또는 본 발명의 안정화된 scFv 분자를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) 후보 단백질의 후보 도메인 서열에 상응하는 아미노산 서열의 기준 세트를 제공하는 단계;
(b) 시험 도메인 서열 내의 개별 아미노산 위치에서의 잔기 빈도를 결정하여, 일치 스코어를 수득하는 단계; 및
(c) 일치 스코어를 이용하여 후보 단백질의 안정성을 예측하는 단계(여기에서, 일치 스코어는 후보 단백질의 안정성과 상관됨)
를 포함하는, 후보 도메인 서열을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 후보 단백질의 안정성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) 후보 단백질의 시험 도메인 서열에 상응하는 서열의 기준 세트를 제공하는 단계;
(b) 시험 도메인 서열 내 개별 아미노산 위치에서의 잔기 빈도를 결정하여, 일치 스코어를 수득하는 단계; 및
(c) 일치 스코어를 이용하여 후보 단백질의 안정성을 예측하는 단계(여기에서, 일치 스코어는 후보 단백질의 안정성과 상관됨)
를 포함하는, 후보 단백질의 안정성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 후보 단백질의 시험 도메인 서열에 상응하는 서열의 기준 세트를 제공하는 단계;
(b) 시험 도메인 서열 내 아미노산 위치에서의 잔기 빈도를 결정하여, 일치 스코어를 수득하는 단계; 및
(c) 기준 세트의 서열 내 상응하는 아미노산 위치에서의 잔기 빈도를 결정하여, 평균 일치 스코어를 결정하는 단계;
(d) 일치 스코어를 평균 일치 스코어와 비교하여 서열 스코어를 결정하는 단계; 및
(e) 서열 스코어를 이용하여 후보 단백질의 안정성을 예측하는 단계(여기에서, 일치 스코어는 후보 단백질의 안정성과 직접적으로 상관됨)
를 포함하는, 후보 단백질의 안정성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 후보 항체 또는 변형된 항체의 시험 VH 도메인 서열에 상응하는 VH 도메인 서열의 기준 세트를 제공하는 단계;
(b) 시험 VH 도메인 서열 내 아미노산 위치에서의 잔기 빈도를 결정하여, 일치 스코어를 수득하는 단계;
(c) 기준 세트의 서열 내 상응하는 아미노산 위치에서의 잔기 빈도를 결정하여, 평균 일치 스코어를 결정하는 단계;
(d) 일치 스코어를 평균 일치 스코어와 비교하여 서열 스코어를 결정하는 단계; 및
(e) 서열 스코어를 이용하여 후보 항체 또는 변형된 항체의 안정성을 예측하는 단계(여기에서, 일치 스코어는 후보 항체 또는 변형된 항체의 안정성과 직접적으로 상관됨)
를 포함하는, 후보 항체 또는 후보 변형된 항체의 안정성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 기준 세트는 후보 단백질로서 동일한 부류의 단백질 폴드를 갖는 단백질로부터의 단백질 서열을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 기준 세트는 오르소로거스(orthologous) 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 기준 세트는 예를 들어 동일한 카밧 부류의, 인간 서열, 예를 들어 인간 VH 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 기준 세트는 인간 VH 배아세포주 서열을 포함한다.
한 실시양태에서, 시험 도메인 서열은 후보 단백질의 도메인 서열의 일부이다.
한 실시양태에서, 일치 스코어는 시험 서열의 각 위치에 대해 결정되고, 여기에서 총 일치 스코어는 단백질 안정성과 상관된다.
또 다른 실시양태에서, 총 일치 스코어는 하기 식을 이용하여 계산된다:
Figure 112008072289549-pct00001
(여기에서,
c i (r)는 일치 서열의 일치 아미노산 위치에서의 일치 잔기 빈도이고,
h i (r)은 시험 서열의 아미노산 위치의 시험 잔기 빈도이며,
i는 시험 서열 내 아미노산 위치의 범호임).
한 실시양태에서, 단백질의 안정성은 후보 단백질의 일치 스코어를 적당한 대조군의 일치 스코어와 비교함으로써 결정된다.
또 다른 실시양태에서, 단백질의 안정성은 후보 단백질의 일치 스코어를 후보 단백질의 완벽한 일치 스코어와 비교함으로써 결정된다.
또 다른 실시양태에서, 안정성은 후보 단백질의 서열 스코어와 적당한 대조군을 비교함으로써 결정된다.
또 다른 실시양태에서, 안정성은 후보 항체 또는 변형된 항체의 서열 스코어와 적당한 대조군을 비교함으로써 결정된다.
한 실시양태에서, 단백질은 다중-도메인 단백질이고, 표적 도메인 서열은 다중-도메인 단백질의 가장 덜 안정한 도메인으로부터 유래된다.
또 다른 실시양태에서, 단백질은 카멜리드(camelide) 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 인간외 단클론성 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, scFv-함유 항체, 및 도메인-결실 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 변형된 항체이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 후보 단백질의 안정성을 결정하는 단계(여기에서, 일치 스코어 또는 서열 스코어가 높은 안정성을 예측하는 경우에 후보 단백질이 발현에 대해 선택됨)를 포함하는, 발현을 위한 후보 단백질을 선택하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 후보 단백질의 안정성을 결정하는 단계(여기에서, 서열 위치 특이적 공변 스코어가 높은 안정성을 예측하는 경우에 후보 단백질이 발현에 대해 선택됨)를 포함하는, 발현을 위한 후보 단백질을 선택하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 후보 서열의 안정성을 결정하는 단계(여기에서, 서열 스코어가 높은 안정성을 예측하는 경우에 후보 서열이 선택됨)를 포함하는, 도너 항체의 인간화에 사용하기 위한 어셉터 면역글로불린 가변 영역 시험 서열을 선택하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 후보 서열의 안정성을 결정하는 단계(여기에서, 위치 특이적 공변 스코어가 높은 안정성을 예측하는 경우에 후보 서열이 선택됨)를 포함하는, 도너 항체의 인간화에 사용하기 위한 어셉터 면역글로불린 가변 영역 시험 서열을 선택하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 시험 서열은 인간 배아세포주 서열이다.
도 1A는 (Gly4Ser)3 링커(굵은 체로 표시됨)를 포함하는 종래의 BHA10 scFv 구성체를 코딩하는 DNA 서열(서열 번호 3)을 보여준다. 도 1B는 종래의 BHA10 scFv 구성체의 아미노산 서열(서열 번호 4)을 보여준다.
도 2는 BHA10의 정제된 종래의 Fab 또는 scFv 단편을 이용한 시차 주사 열량계(DSC) 측정의 결과를 나타낸다. 도 2A는 BHA10의 종래의 Fab 및 scFv 단편의 언폴딩을 비교하는 DSC 연구의 결과를 나타낸다. 도 2B는 1℃/분 및 2℃/분의 스캔 속도에서의 정제된 BHA10 scFv의 DSC 스캔의 결과를 나타낸다.
도 3A는 (Gly4Ser)3 링커(굵은 체로 표시됨)를 포함하는 안정화된 VH44/VL100 디술피드-안정화 BHA10 scFv 구성체를 코딩하는 DNA 서열(서열 번호 9)을 나타낸다. 도 3B는 VH44/VL100 디술피드-안정화 BHA10 scFv 구성체의 아미노산 서열(서열 번호 10)을 보여준다. VH44/VL100 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기가 굵은 이탤릭 체로 표시된다.
도 4A는 (Gly4Ser)4 링커(굵은 체로 표시됨)를 포함하는 안정화된 BHA10 scFv를 코딩하는 DNA 서열(서열 번호 14)을 나타낸다. 도 4B는 (Gly4Ser)4 BHA10 scFv 구성체의 아미노산 서열(서열 번호 15)을 보여준다. 주석은 도 4A에서와 동일하다.
도 5A는 (Gly4Ser)5 링커(굵은 체로 표시됨)를 포함하는 BHA10 scFv를 코딩하는 DNA 서열(서열 번호 16)을 나타낸다. 도 5B는 (Gly4Ser)5 BHA10 scFv 구성체의 아미노산 서열(서열 번호 17)을 보여준다. 주석은 도 5A에서와 동일하다.
도 6은 종래의 BHA10 scFv(레인 1) 및 본 발명의 안정화된 BHA10 scFv 분자(레인 2 내지 4)의 발현 수준을 비교하는 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸다. 각 샘플을 환원(좌측 패널) 및 비환원(우측 패널) 조건 하 모두에서 전기천공되었다.
도 7A는 (Gly4Ser)4 링커(굵은 체로 표시됨)를 포함하는 VH44/VL100 디술피드-안정화 BHA10 scFv를 코딩하는 DNA 서열(서열 번호 18)을 나타낸다. 도 7B는 VH44/VL100 디술피드+(Gly4Ser)4 -안정화 BHA10 scFv의 아미노산 서열(서열 번호 19)을 나타낸다. 주석은 도 7A에서와 동일하다. VH44/VL100 디술피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기가 굵은 이탤릭 체로 표시된다.
도 8은 본 발명의 안정화된 BHA10 scFv 분자의 열 안정성을 종래의 BHA10 scFv 분자의 열 안정성과 비교한 열 자극 검정의 결과를 나타낸다. scFv 분자의 50%가 그 결합 활성을 보유하는 온도(T50)가 도면 설명에 나와 있다.
도 9는 종래의 BHA10 scFv 및 BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv를 이용하여 수행된 시차 주사 열량계(DSC) 분석의 결과를 나타낸다.
도 10은 소수성 형광 염료 1-아닐리노-8-나프탈린 술포네이트(ANS)의 종래의 BHA10 scFv, BHA10 (Gly4Ser)4 scFv, 및 BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv에의 결합의 결과를 나타낸다.
도 11은 BHA10 VH 및 VL 도메인의 잔기 빈도 분석의 결과를 보여준다. 도 11A는 IgG 가변 도메인 서열의 잔기 빈도 분석에 기초한 선별을 위한 BHA10 VH 라이브러리 위치를 열거한다. 도 11B는 IgG 가변 도메인 서열의 잔기 빈도 분석에 기초한 선별을 위한 BHA10 VL 라이브러리 위치를 열거한다.
도 12는 열 안정성 및 안정화 돌연변이의 부가성에 대한 안정화 BHA10 scFv 돌연변이의 영향을 평가한 열 자극 검정의 결과를 나타낸다. (GS3은 (G4S)3을 나타내고, GS4는 (G4S)4를 나타내며; SS는 디술피드 결합을 나타냄).
도 13은 본 발명의 예시적 안정화된 LTβR/TRAIL-R2 이중특이적 항체("헤르큘레스(Hercules)" 항체)를 나타낸다. 헤르큘레스 항체는 본 발명의 안정화된 BHA10 scFv 분자를 14A2 IgG 항체에 융합함으로써 형성된다. scFv 분자는 중쇄 (C-헤르큘레스 또는 NH-헤르큘레스)의 C-말단 또는 N-말단, 또는 경쇄 (NL-헤르큘레스)의 N-말단에 융합될 수 있다.
도 14는 종래 및 조작된 BHA10 scFv를 14A2 중쇄의 아미노 말단(도 14A) 또 는 카르복실 말단(도 14B)에 융합하기 위해 사용되는 순차적 PCR 반응을 나타내는 모식도이다.
도 15A는 신호 펩티드(밑줄로 표시됨)를 포함하는 키메라 14A2 경쇄의 DNA 서열(서열 번호 28)을 나타낸다. 도 15B는 키메라 14A2 경쇄의 아미노산 서열(서열 번호 29)을 보여준다.
도 16은 종래의 BHA10 scFv NH-헤르큘레스의 중쇄의 DNA 서열(서열 번호 30)을 나타낸다.
도 17은 종래의 BHA10 scFv NH-헤르큘레스의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 31)을 나타낸다.
도 18은 BHA 10 scFv(Gly4Ser)4 NH-헤르큘레스의 중쇄의 DNA 서열(서열 번호 32)을 나타낸다.
도 19는 BHA 10 scFv(Gly4Ser)4 NH-헤르큘레스의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 33)을 나타낸다.
도 20은 BHA10 scFv VH44: VL100 N-헤르큘레스의 중쇄의 DNA 서열(서열 번호 34)을 나타낸다.
도 21은 BHA10 scFv VH44: VL100 NH-헤르큘레스의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 35)을 나타낸다.
도 22는 BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 NH-헤르큘레스의 중쇄의 DNA 서열 (서열 번호 36)을 나타낸다.
도 23은 BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 NH-헤르큘레스의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 37)을 나타낸다.
도 24는 종래의 BHA10 scFv C-헤르큘레스의 중쇄의 DNA 서열(서열 번호 44)을 나타낸다.
도 25는 종래의 BHA10 scFv C-헤르큘레스의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 45)을 나타낸다.
도 26은 BHA10 scFv(Gly4Ser)4 C-헤르큘레스의 중쇄의 DNA 서열(서열 번호 46)을 나타낸다.
도 27은 BHA10 scFv(Gly4Ser)4 C-헤르큘레스의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 47)을 나타낸다.
도 28은 BHA10 scFv VH44: VL100 C-헤르큘레스의 중쇄의 DNA 서열(서열 번호 48)을 나타낸다.
도 29는 BHA10 scFv VH44: VL100 C-헤르큘레스의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 49)을 나타낸다.
도 30은 BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 C-헤르큘레스의 중쇄의 DNA 서열(서열 번호 50)을 나타낸다.
도 31은 BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 C-헤르큘레스의 중쇄의 아미노산 서열(서열 번호 51)을 나타낸다.
도 32는 CHO 세포 내 일시 발현된 C-및 NH-헤르큘레스 이중특이적 항체의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 보여준다. 좌측 패널은 비환원 조건 하에서 분석된 것이고, 우측 패널은 환원 조건 하에서 분석된 것이다.
도 33은 본 발명의 안정화된 헤르큘레스 항체의 LTβR 수용체에의 결합 활성을 평가하기 위한 ELISA의 결과를 나타낸다. 도 33A는 안정화된 C-헤르큘레스 항체를 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 도 33B는 안정화된 NH 헤르큘레스 항체를 이용한 경우의 결과를 나타낸다. "wt"은 종래의 NH 헤르큘레스 항체이다. "GS4"는 안정화된 (Gly4Ser)4 scFv를 포함하는 안정화된 NH 헤르큘레스 항체이다. "ds"는 VH44/VL100 디술피드 링커를 포함한 안정화된 scFv를 포함하는 안정화된 NH 헤르큘레스 항체이다.
도 34는 본 발명의 안정화된 헤르큘레스 항체의 TRAIL R2 수용체에의 결합 활성을 평가하기 위한 ELISA의 결과를 나타낸다. 도 34A는 안정화된 C-헤르큘레스 항체를 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 도 34B는 안정화된 NH 헤르큘레스 항체를 이용한 경우의 결과를 나타낸다. "wt"은 종래의 NH 헤르큘레스 항체이다. "GS4"는 안정화된 (Gly4Ser)4 scFv를 포함하는 안정화된 NH 헤르큘레스 항체이다. "ds"는 VH44/VL100 디술피드 링커를 포함한 안정화된 scFv를 포함하는 안정화된 NH 헤르큘레스 항체이다.
도 35는 단백질 A 크로마토그래피 후의 안정화된 C-헤르큘레스 이중특이적 항체의 SEC 분석의 결과를 보여준다.
도 36은 정제된 안정화된 헤르큘레스 이중특이적 항체의 SDS-PAGE 분석의 결과를 나타낸다. 도 36A는 NH-헤르큘레스 이중특이적 항체를 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 도 36B는 C-헤르큘레스 이중특이적 항체를 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 5 ug 샘플을 각 레인에 로딩하였다.
도 37는 정제된 안정화된 N-헤르큘레스 이중특이적 항체의 분석적 SEC 분석의 결과를 보여준다. 패널 A는 단백질 A 크로마토그래피 후의 VH44:VL100 BHA10 scFv를 갖는 N-헤르큘레스의 프로파일을 도시하고, 패널 B는 분취 SEC 후의 상기 프로파일을 보여준다. 패널 C는 단백질 A 크로마토그래피 후의 VH44:VL100/(G4S)4 BHA10 scFv를 갖는 N-헤르큘레스의 프로파일을 도시하고, 패널 D는 분취 SEC 후의 상기 프로파일을 보여준다.
도 38은 정제된 안정화된 N-헤르큘레스 이중특이적 항체의 분석적 SEC 분석의 결과를 보여준다. 패널 A는 단백질 A 크로마토그래피 후의 VH44:VL100 BHA10 scFv를 갖는 C-헤르큘레스의 프로파일을 도시하고, 패널 B는 분취 SEC 후의 상기 프로파일을 보여준다. 패널 C는 단백질 A 크로마토그래피 후의 VH44:VL100/(G4S)4 BHA10 scFv를 갖는 C-헤르큘레스의 프로파일을 도시하고, 패널 D는 분취 SEC 후의 상기 프로파일을 보여준다.
도 39는 VH44:VL100/(G4S)4 BHA10 scFv를 갖는 C-헤르큘레스 및 종래의 BHA10 scFv를 갖는 C-헤르큘레스를 이용하여 수행된 시차 주사 열량계(DSC) 분석의 결과를 보여준다.
도 40은 본 발명의 안정화된 헤르큘레스 항체의 TRAIL-R2 및 LTβR Ig 수용체에의 이중특이적 결합 활성을 평가하는 ELISA의 결과를 나타낸다. "N-"헤르큘레스" Cys 및 C-"헤르큘레스" Cys는 VH44/VL100 디술피드 결합을 갖는 NH- 또는 C-말단 scFv를 포함하는 헤르큘레스 항체이다. "N-"헤르큘레스" Cys 및 N-"헤르큘레스" DM"은 VH44/VL100 디술피드 및 (Gly4Ser)4 링커를 포함한 NH- 또는 C-말단 scFv을 포함하는 포함하는 헤르큘레스 항체이다. CBE11 오량체는 단일특이적 LTβR 결합 활성을 갖는 대조군 항체이다.
도 41은 안정화된 N-및 C-헤르큘레스 이중특이적 및 단일특이적 항체의 종양 세포 성장에 대한 영향을 나타낸다. 도 41A 내지 41D는 각기 WiDr 종양 세포, Me180 종양 세포, MDA231 종양 세포 및 HUVEC 세포의 성장에 대한 영향을 나타낸다.
도 42는 안정화된 scFv를 포함하는 안정화된 2개 사슬 2량체성 미니보디(minibody)의 개략적 다이어그램을 나타낸다. 예시적 미니보디는 TRAIL R2 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 안정화된 scFv를 포함하는 제1 사슬 부분, 및 LTβR 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 안정화된 scFv를 포함하는 제2 사슬 부분을 함유한다. scFv 내 VH 및 VL 도메인의 배향이 변화할 수 있고, 각각의 결합 특이성이 변경될 수 있다.
도 43은 아미노 말단에 부착된 본 발명의 안정화된 scFv 단편을 포함하는 예시적 안정화된 이중특이적 2개 사슬 2량체성 4가 미니보디(안정화된 이중특이적 N-scFv 4가 미니보디)의 개략적 다이어그램을 나타낸다. 예시적 안정화된 2가의 4가 미니보디는 TRAIL R2 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안정화된 scFv를 포함하는 제1 사슬 부분, 및 LTβR 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안정화된 scFv를 포함하는 제2 사슬 부분을 함유한다. 다른 구조도 또한 가능하고, 예를 들어 이중특이적 4가 미니보디가 또한 각 사슬 부분이 상이한 특이성을 갖는 2개의 안정화된 scFv 단편을 함유하도록 작제될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, scFv 내 VH 및 VL 도메인의 배향이 변화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, scFv 중 전부보다 적은 일부가 안정화된다.
도 44는 2가 미니보디의 양 카르복실 말단에 부착된 안정화된 scFv 단편을 포함하는 예시적 안정화된 이중특이적 1개의 사슬 2량체성 4가 미니보디(안정화된 이중특이적 C-scFv 4가 미니보디)의 개략적 다이어그램을 나타낸다. 예시적 안정화된 2가 4가 미니보디는 TRAIL R2 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안정화된 scFv를 포함하는 제1 사슬 부분, 및 LTβR 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안정화된 scFv를 포함하는 제2 사슬 부분을 함유한다. 다른 구조도 또한 가능하고, 예를 들어 이중특이적 2개 사슬 2량체성 4가 미니보디가 또한 각 사슬 부분이 상이한 특이성을 갖는 2개의 안정화된 scFv 단편을 함유하도록 작제될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, scFv 내 VH 및 VL 도메인의 배향이 변화할 수 있다. 또 다른 실 시양태에서, scFv 중 전부보다 적은 일부가 안정화된다.
도 45는 본 발명의 안정화된 scFv를 포함하는 안정화된 이중특이적 4개 사슬 2량체성 디아보디(diabody)의 개략적 다이어그램을 보여준다. 다른 구조도 또한 가능하고, 예를 들어 이중특이적 2개 사슬 2량체성 4가 미니보디가 또한 각 사슬 부분이 상이한 특이성을 갖는 2개의 안정화된 scFv 단편을 함유하도록 작제될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, scFv 내 VH 및 VL 도메인의 배향이 변화할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, scFv 중 전부보다 적은 일부가 안정화된다.
도 46은 CH3의 카르복실 말단에 부착된 안정화된 scFv 및 힌지 연결 펩티드를 포함하는 안정화된 이중특이적 4개 사슬 2량체성 4가 scFv 항체(안정화된 C-scFv 4가 항체)의 개략적 다이어그램을 보여준다. 안정화된 scFv 내 VH 및 VL 도메인의 배향이 변화할 수 있다. 대안적으로, 안정화된 scFv 단편은 중쇄 또는 경쇄 부분의 아미노 말단에 부착되어, NH-scFv 4가 항체 또는 NL-scFv 4가 항체를 각기 형성할 수 있다.
도 47은 CH3의 카르복실 말단에 부착된 안정화된 scFv 및 힌지 연결 펩티드를 포함하는 안정화된 4개 사슬 4가 scFv CH2 도메인 결실 이중특이적 항체(안정화된 C-scFv 4가 CH2 도메인 결실 이중특이적 항체)의 개략적 다이어그램을 보여준다. 이중특이적 항체의 각 중쇄 부분은 TRAIL R2 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 Fv 영역, 및 LTβR 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 안정화된 scFv 영역을 함유한다. 안정화된 scFv 내 VH 및 VL 도메인의 배향이 변화할 수 있고, 각각의 항원 결 합 특이성이 변경될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, scFv 중 전부보다 적은 일부가 안정화된다.
도 48은 VH의 아미노 말단에 부착된 안정화된 scFv을 포함하고, 힌지 연결 펩티드를 포함하는 안정화된 4개 사슬 4가 scFv CH2 도메인 결실 이중특이적 항체(안정화된 NH-scFv 4가 CH2 도메인 결실 이중특이적 항체)의 개략적 다이어그램을 보여준다. 이중특이적 항체의 각 중쇄 부분은 TRAIL R2 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 Fv 영역, 및 LTβR 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 안정화된 scFv 영역을 함유한다. 안정화된 scFv 내 VH 및 VL 도메인의 배향이 변화할 수 있고, 각각의 항원 결합 특이성이 변경될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, scFv 중 전부보다 적은 일부가 안정화된다.
도 49는 VL의 아미노 말단에 부착된 안정화된 scFv을 포함하고, 힌지 연결 펩티드를 포함하는 안정화된 4개 사슬 4가 scFv CH2 도메인 결실 이중특이적 항체(안정화된 NL-scFv 4가 CH2 도메인 결실 이중특이적 항체)의 개략적 다이어그램을 보여준다. 이중특이적 항체의 각 중쇄 부분은 TRAIL R2 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 Fv 영역, 및 LTβR 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 안정화된 scFv 영역을 함유한다. 안정화된 scFv 내 VH 및 VL 도메인의 배향이 변화할 수 있고, 각각의 항원 결합 특이성이 변경될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, scFv 중 전부보다 적은 일부가 안정화된다.
도 50은 야생형 BHA10 scFv(폐쇄형 원) 대 VL_S46L(도 50A, 개방형 원), VHJ/55G(도 50B, 개방형 원), 및 VH P101D(개방형 원)(도 50C) 안정화 돌연변이를 함유하는 BHA10 scFv의 T50 곡선을 나타낸다.
도 51은 야생형 VH-(GS)4-VL-6His BHA10 scFv(회색선) 대 VL S46L(흑색선)(도 51A) 및 VH V55G(흑색선)(도 51B) 안정화 돌연변이를 함유하는 BH10 scFv의 DSC 곡선을 나타낸다.
도 52는 야생형 VH-(GS)4-VL-6His BHA10 scFv(회색선) 대 VH_P101D 안정화 돌연변이(흑색선)를 함유하는 BH10 scFv의 DSC 곡선을 나타낸다.
도 53은 야생형("WT(G4S)X3") 및 안정화된 돌연변이 scFv의 SDS-Page 분석을 나타낸다. 모든 돌연변이 scFv는 N-말단 VH와 C-말단 VL 사이의 식 (Gly4Ser)4(의 gly-ser 연결 펩티드"(G4S)X4")를 함유한다. 각 레인 내의 scFv의 실체가 나타난다. 레인 12 내지 14는 VH44와 VL100 사이에 디술피드 결합을 가지는 BHA10 scFv를 함유한다. (G4S)X4/디술피드 안정화된 scFv는 '이중 돌연변이'에 대해 'DM'로 나타내어진다. 최종의 2개 레인은 디술피드로 연결된 scFv에 대해서도 안정화된, 설계된 돌연변이를 함유한다.
도 54A는 야생형("VH-(GS)4-VL-6His") BHA10 scFv(파선), VH S16E 돌연변이 scFv(얇은 회색선), VL S46L 돌연변이 scFv(얇은 흑색선), VH V55G 돌연변이 scFv(두꺼운 회색선), 및 VH P101D 돌연변이 scFv(두꺼운 흑색선)의 DSC 곡선을 나타낸다. 도 54B는 PBS 내(개방형 원), 또는 야생형("VH-(GS)4-VL-6His") BHA10 scFv(폐쇄형 회색 원), VH S16E 돌연변이 scFv(마름모), VL S46L 돌연변이 scFv(사 각형), VH V55G 돌연변이 scFv(역삼각형), 및 VH P101D 돌연변이 scFv(삼각형)의 존재 하에서의 10 mM ANS의 온도 의존성 형광도를 나타낸다. 곡선을 통과하는 선은 2-상태 언폴딩 모델에 맞춰진다.
도 55는 야생형 및 돌연변이 scFv의 존재 하, 15℃에서의 ANS 형광도를 나타낸다. 각 scFv에 의해 유도된 ANS 형광도는 DSC에 의해 결정되는 동일한 scFv의 VH 도메인의 TM에 대해 플로팅되고(도 55A), ANS 형광도의 온도-의존성 증가는 각 scFv의 언폴딩 전이로 인한 것이다(도 55B).
도 56은 6개 시점(T=0, T=1주, T=2주, T=1개월, T=2개월 및 T=3개월) 및 저온(2 내지 8℃)에서의 높은 농도의 안정화된 N-헤르큘레스(XWU028; BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 N-헤르큘레스; 도 56A), 안정화된 C-헤르큘레스(XWU036; (BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 C-헤르큘레스; 도 56B) 및 야생형 BHA10 항체(도 56C)의 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 나타낸다. x-축은 시간(분)이고, y-축은 280 nm에서의 mAU(흡광도 단위)이다. 시간 경과에 따라 용출 프로파일에 있어 유의적 변화가 없음이 관찰되었다.
도 57은 2 내지 8℃에서 3개월 저장하기 전 및 후의 XWU028 및 XWU036의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 패널 A. 샘플이 환원되지 않음("NR"로 표시). 예상 MW인 ~200 kDa가 이중특이적 샘플에서 관찰된다. BHA10은 예상 MW인 ~150 kDa에서 실험된다. 레인 1 내지 4는 XWU028 샘플이다. 레인 5 내지 8은 XWU036 샘플이다. 레인 9 및 10은 BHA10 IgG 샘플이다. 패널 B. 샘플이 DTT로 환원됨(환원된 것에 대해 "Red"로 표시함). 중쇄의 예상 MW인 ~75 kDa, 경쇄의 예상 MW인 ~25 kDa가 환원 조건 하에서 이중특이적 샘플에 대해 관찰된다. BHA10 중쇄 및 경쇄가 각기 환원 조건 하에서 각기 예상 MW 50 kDa 및 25 kDa에서 관찰된다. 레인 1, 2, 6 및 7은 XWU028 샘플이다. 레인 3, 4, 8 및 9는 XWU036 샘플이다. 레인 5 및 10은 BHA10 IgG 샘플이다.
도 58은 T=0, T= 1개월 및 T=3개월에서의 XWU028(패널 A) 및 XWU036(패널 B)의 비변형(intact) 질량 분석을 나타낸다. CH2 내 N-연결 탄수화물의 각종 수준의 시알릴화로 인해 각 단백질에 대해 다수 피크가 관찰된다. 이중특이성을 갖는 것의 탄수화물 분포가 표준 IgG1 단백질의 전형적 특징이다.
도 59는 TRAIL-R2 및 LTβR 수용체에 대한 N-말단 헤르큘레스(XWU028; 도 56A) 또는 C-말단 헤르큘레스(XWU036; 도 56B) 함유의 혈청 샘플의 이중특이적 결합을 특정하는 샌드위치 ELISA 검정의 결과를 나타낸다.
도 60은 종양 이종이식 마우스 모델에 대한 안정화된 이중특이적 항체(XWU028(마름모) 및 XWU036(개방형 사각형)), 단독 투여되는 단일특이적 항체(hCBE11(폐쇄형 삼각형), hBHA10(역삼각형) 및 ch14A2(마름모)) 및 이들의 조합(개방형 삼각형)의 상대적 생체내 활성의 실험 평가의 결과를 나타낸다. 투여를 13일째에 시작하였다. hCBE11 v. VC: P<0.001; hBHA10 v. VC: P<0.001; ch14A2 v. VC: P<0.01; 헤르큘레스-II XWU028 v. VC.: P<0.001; 헤르큘레스-II XWU028 v.hBHA10: P<0.05; 헤르큘레스-II XWU028 v. ch14A2: P<0.005; 헤르큘레스-II XWU036 v. VC: P<0.001; 헤르큘레스-II XWU036 v. hBHA10: P<0.01; 헤르큘레스-II XWU036 v. ch14A2: P<0.05; combo v. V.C.: P<0.001
도 61은 C-헤르큘레스 BHA10 scFv VH S16E+VL S46L 이중특이적 항체에 대한 중쇄 DNA 서열(서열 번호 52)을 나타낸다.
도 62는 C-헤르큘레스 BHA10 scFv VH S16E+VL S46L 이중특이적 항체에 대한 중쇄 아미노산 서열(서열 번호 53)을 나타낸다.
도 63은 C-헤르큘레스 BHA10 scFv VH44-VL100/VH S16E+VL S46L 이중특이적 항체에 대한 중쇄 DNA 서열(서열 번호 54)을 나타낸다.
도 64는 C-헤르큘레스 BHA10 scFv VH44-VL100/VH S16E+VL S46L 이중특이적 항체에 대한 중쇄 아미노산 서열(서열 번호 55)을 나타낸다.
도 65는 안정화된 VH S16E+VL S46L BHA10 scFv를 갖는 C-헤르큘레스(XWU054) 및 종래("WT") BHA10 scFv를 갖는 C-헤르큘레스를 포함하는 상등액으로부터의 단백질 A 용출물의 분석적 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 결과를 나타낸다
도 66은 VH S16E+VL S46L BHA10 scFv을 갖는 정제된 C-말단 헤르큘레스(도 66A), 및 VH44:VL100/VH S16E+VL S46L BHA10 scFv를 갖는 정제된 C-말단 헤르큘레스(도 66B)의 SDS-PAGE 겔을 나타낸다.
도 67은 초기 단백질 A 정제 단계에 후속하여 VH S16E+VL S46L BHA10 scFv을 갖는 C-말단 헤르큘레스(도 67A) 및 VH44:VL100/VH S16E+VL S46L BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스(도 67B)의 분석적 SEC 용출 프로파일을 보여준다.
도 68은 VH S16E+VL S46L BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스(XWU054) 및 VH44:VL100/VH S16E+VL S46L BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스(XWU055)의 활성의 시험관내 종양 세포 증식 검정의 결과를 보여준다. MDA231(도 68A) 및 WiDr 세포(도 68B) 모두에 항체를 투여하였다. 양 헤르큘레스 항체 모두에 대한 활성을, 단독으로 또는 조합하여 투여된, 안정화된 XWU036 이중특이적 항체 및 상응하는 단일특이적 항체(hBHA10 및 ch14A2)에 대해 비교하였다.
도 69A는 나머지 18 BIIB 인간(화) 항체에 대해 사용된 조건과 동일한 조건 하에서 얻어진 BIIB7 IgG1의 DSC 언폴딩 곡선을 나타낸다(솔리드 선). DSC 곡선에서 분명한 개별 Fab, CH2 및 CH3 전이가 표지화되고, 점선으로 그려진다. 도 69B는 IgG1 및 IgG4 포맷 모두의 BIIB7 항체의 DSC 언폴딩 곡선을 나타낸다.
도 70은 4개의 인간(화) IgG1 항체, BIIB16, BIIB6, BIIB4 및 BIIB1의 열적 언폴딩 곡선을 나타낸다. 4개 모두의 IgG1 구성체에 대한 CH2 및 CH3 도메인의 언폴딩 전이가 일치하고, 한편 Fab 언폴딩 전이는 매우 가변적이다.
도 71은 182개 인간 항체 가변 도메인 기준 서열 및 개별 하위부류 일치 서열에 대한 일치 스코어링 결과를 나타낸다. A. 포유동물 VH 데이터베이스에 대한 잔기 빈도 분석에 의해 유도된 VH 하위부류 서열 스코어. B. NCBI로부터 선택된 기준 VH 서열로부터의 스코어 분포. VH 서열 스코어를 하위부류에 따라 군으로 분류하였다. C. 포유동물 VK 데이터베이스에 대한 잔기 빈도 분석에 의해 유도된 VK 하위부류 서열 스코어. D. NCBI로부터 선택된 기준 VK 서열로부터의 스코어 분포. VK 서열 스코어를 하위부류에 따라 군으로 묶었다.
도 72는 DSC에 의해 측정되는, 18 BIIB 항체에 대한 서열 스코어를 상응하는 Fab Tm과 비교하는 2-차원 플롯을 나타낸다. 도 72A는 Fab Tm에 대해 플로팅된 BIIB1-18 VH 스코어를 나타낸다. 각 점의 실체는 표 20에서 확인될 수 있다. BHB 15 및 BIIB16의 VH는 이의 CDR에서의 비통상적 삽입/결실을 함유한다. BIIB15 및 BIIB16에 대한 결과가 사각형으로 표시된다. BIIB18의 TM은, 그 자체의 TM가 발현 결여로 인해 측정불가능하기 때문에, 57.2℃(BIIT 17로부터의 최저 측정 TM에 부합함)으로 인위적으로 표지된다. BIIB18의 TM은 극히 낮은 서열 스코어 및 발현 불능에 기초하여 훨씬 더 낮기 쉽다. BIIB18에 대한 Fab 결과는 삼각형으로 표시된다. 나머지 BIIB 항체 VH 결과는 원으로 표시된다. 도 72B는 Fab Tm에 대해 플로팅된 BIIB1-18 VK 스코어를 나타낸다. 스코어가 VK에 대한 것임을 제외하고는, 부호는 플롯(A)에 대해 기재된 부호와 동일하다.
도 73은 V-클래스, C-클래스 및 I-클래스의 Ig 폴드에 대한 대표적 구조를 나타낸다.
도 74은 SCOP로부터 수득된 V-, I-, C1-, 및 C2-클래스 Ig-폴드의 서열 길이의 히스토그램을 나타낸다.
도 75는 C-클래스 데이터세트 내 모든 잔기 조합에 대해 계산된 f-값 상관 계수의 히스토그램을 나타낸다.
도 76은 공변 분석이 오버레이되는 정렬 플랫폼의 부분을 포함하는 NAPMAP 비쥬얼 툴(Visual Tool)의 출력을 보여준다. 플랫폼은 V 영역(잔기 위치 #) 내 각 위치에 대한 갭(잔기 유형)을 포함하는 모든 아미노산을 함유하는 열(column)을 표시한다.
도 77은 NAPMAP 주형으로의 Ig-폴드 공변 통계치의 오버레이를 나타낸다. 관심 서열은 관련 아미노산을 통해 곡선으로 도시된다. 공변은 관련 공변 아미노산 잔기 사이에 직선형 막대로 도시된다.
도 78은 카밧 위치 36(잔기 위치 # 48)에서의 Tyr과 실시예 7에 기재된 바와 같은 카밧 위치 46(잔기 위치 # 67)에서의 돌연변이 Ser→Leu 사이의 공변을 강하게 나타내는 BHA10 VL의 공변 분석으로부터의 상세 내용을 보여준다.
도 79은 카밧 위치 67(잔기 위치 # 100)에서의 Val, 카밧 위치 70(잔기 위치 # 104)에서의 Thr, 카밧 위치 80(잔기 위치 # 116)에서의 돌연변이 Met→Leu 사이의 상응하는 공변을 나타내는 BHA10 VH의 공변 분석으로부터의 상세 내용을 보여준다.
도 80(서열 번호 63)은 종래의 scFv를 포함하는 중쇄 C-말단 4가 PRIMATIZED ® p5E8 항체의 단일 가닥의 DNA 서열을 보여준다.
도 81(서열 번호 64)은 종래의 scFv를 포함하는 중쇄 C-말단 4가 PRIMATIZED® p5E8 항체의 아미노산 서열을 보여준다.
도 82A(서열 번호 65)는 PRIMATIZED® p5E8 경쇄의 단일 가닥의 DNA 서열을 보여준다. 신호 펩티드 서열은 밑줄 표시되어 있다. 도 82B(서열 번호 66)는 PRIMATIZED® p5E8 경쇄의 아미노산 서열을 보여준다.
도 83A(서열 번호 67)는 종래의 PRIMATIZED® p5E8(VL/VH) scFv의 단일 가닥의 DNA 서열을 보여준다. 신호 펩티드 서열은 밑줄 표시되어 표시된다. 도 83B(서열 번호 68)는 종래의 PRIMATIZED® p5E8(VL/VH) scFv의 아미노산 서열을 보여준다.
도 84A(서열 번호 69)는 종래의 PRIMATIZED® p5E8(VH/VL) scFv의 단일 가닥의 DNA 서열을 보여준다. 도 84B(서열 번호 70)는 종래의 PRIMATIZED® p5E8(VH/VL) scFv의 아미노산 서열을 보여준다.
도 85는 종래의 p5E8(VH/VL) scFv(채워진 원) 대 종래의 p5E8(VL/VH) scFv(개방형 원)의 T50 곡선을 나타낸다.
도 86은 인간 유방암의 종양 이종이식 마우스 모델(MDA-MB-231)에 대한, 단독 투여된 안정화된 이중특이적 "헤르큘레스-II"항체(XWU036(폐쇄형 원형)) 및 단일특이적 항체(hBHA10(폐쇄형 역삼각형) 및 ch14A2(폐쇄형 마름모)) 및 조합 투여된 단일특이적 항체(개방형 역삼각형)의 상대적 생체내 활성을 평가하는 실험의 결 과를 나타낸다.
도 87은 계면 유지를 위해 중요한 공변 네트워크와 관련된 VH 잔기(도 87A) 및 VH 도메인의 표면에 직접 매핑되고, VH/VL 계면과의 직접 접촉을 일으킴과 관련된 계면 잔기(도 87B)를 나타낸다. 화살표는 공변 분석에 의해 VH/VL 상호작용의 안정화 및 VH/VL 안정성을 위해 중요한 것으로 나타나는 실제 계면 외측의 잔기 위치를 가리킨다. VH와 VL 사이의 계면에서의 직접 접촉을 일으키는 초가변 CDR3 잔기의 위치가 상자 안에 포함된다.
도 88은 계면 유지를 위해 중요한 공변 네트워크와 관련된 VL 잔기(도 88A) 및 VL 도메인의 표면에 직접 매핑되고, VH/VL 계면과의 직접 접촉을 일으킴과 관련된 계면 잔기(도 88B)를 나타낸다. 화살표는 공변 분석이 VH/VL 상호작용의 안정화 및 VH/VL 안정성을 위해 중요하다는 것을 알려주는 실제 계면 외측의 잔기 위치를 표시한다. VH와 VL 사이의 계면에서의 직접 접촉을 일으키는 초가변 CDR3 잔기의 위치가 상자 안에 포함된다.
도 89는 본 발명의 한 실시양태를 수행하는 데 적당한 한 예시적 환경을 나타낸다.
도 90은 폴리펩티드의 안정성의 척도로 사용될 수 있는 서열 공변 스코어를 결정하기 위해 본 발명의 실시양태가 후속될 수 있는 단계의 예시적 순서의 흐름도이다.
도 91은 후보 단백질의 안정성을 예측하기 위해 일치 스코어를 결정하고 사용하기 위해 본 발명의 실시양태가 후속될 수 있는 단계의 예시적 순서의 흐름도이 다.
도 92는 후보 단백질의 안정성의 척도로서 평균 일치 스코어를 결정하고 사용하기 위해 본 발명의 실시양태가 후속될 수 있는 단계의 예시적 순서의 흐름도이다.
도 93은 폴리펩티드의 향상된 서열을 결정하기 위해 폴리펩티드의 대체 잔기를 사용하기 위해 본 발명의 실시양태가 후속될 수 있는 단계의 예시적 순서의 흐름도이다.
도 94A 및 94B는 S46L(VL) 안정화 돌연변이를 함유하는 안정화된 BHA10 scFv의 아미노산 서열(서열 번호 137) 및 V55G(VH) 안정화 돌연변이를 함유하는 안정화된 BHA10 scFv의 아미노산 서열(서열 번호 138)을 보여준다. 안정화 돌연변이는 상자 내 포함된 잔기로 표시된다. 리더(leader) 서열, gly/ser 연결 펩티드 및 CH1 도메인은 각기 밑줄 표시, 굵은 체 표시, 이탤릭 체 표시의 잔기에 의해 나타내어진다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 적어도 부분적으로, 안정화된 scFv 분자로 구성되거나 이를 포함하는 안정화된 표적 결합 분자의 개발, 및 그러한 안정화된 결합 분자의 제조 방법에 기초한다. 또한, 본 발명은 안정한 단백질, 예컨대 항체 분자의 설계 방법을 제공한다.
본 발명의 안정화된 scFv 분자는 안정한 다중특이적, 예를 들어 이중특이적 분자의 생성에 특히 유용하다. 본 발명의 안정화된 결합 분자, 예를 들어 다중특이 적 결합 분자는 배양물 내에서 안정하게 발현될 수 있고, 대규모 생성에 적당하고, 생체내 안정하다.
본 발명은 또한 적어도 부분적으로, 안정화된 scFv 분자로 구성되거나 이를 포함하는 안정화된 결합 분자의 개발, 및 그러한 안정화된 분자의 제조 방법에 기초한다. 또한, 본 발명은 안정한 단백질의 설계 방법, 및 단백질, 예컨대 항체 분자의 안정성 예측 방법을 제공한다.
본 발명을 더욱 설명하기 전에, 편의를 위해 이하 특정 용어를 설명한다:
I. 정의
본원에 사용되는 용어 "scFv 분자" 1개의 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 이의 일부, 및 1개의 중쇄 가변 도메인(VH) 또는 이의 일부로 구성된 결합 분자를 포함하고, 여기에서 각 가변 도메인 (또는 이의 일부)은 동일하거나 상이한 항체로부터 유래된다. scFv 분자는 바람직하게는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 scFv 링커를 포함한다. scFv 분자가 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 [미국 특허 제5,892,019호(Ho 등, 1989). Gene 77:51; Bird 등 1988 Science 242:423; Pantohano 등 1991. Biochemistry 30: IQ117; Milenic 등 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen 등 1991. Protein Engineering 4:837]에 기재되어 있다.
본원에 사용되는 "scFv 링커"는 scFv의 VL 도메인과 VH 도메인 사이에 삽입된 부분을 지칭한다. scFv 링커는 바람직하게 항원 결합 구조에 scFv 분자를 유지시킨다. 한 실시양태에서, scFv 링커는 scFv 링커 펩티드를 포함하거나 이로 구성된다. 특정 실시양태에서, scFv 링커 펩티드는 gly-ser 연결 펩티드를 포함하거나 이로 구성된다. 다른 실시양태에서, scFv 링커는 디술피드 결합을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "gly-ser 연결 펩티드"는 글리신 및 세린 잔기로 구성된 펩티드를 지칭한다. 예시적 gly/ser 연결 펩티드는 아미노산 서열(Gly4Ser)n을 포함한다. 한 실시양태에서, n=1이다. 한 실시양태에서, n=2이다. 또 다른 실시양태에서, n=3이다. 한 바람직한 실시양태에서, n=4, 즉 (Gly4Ser)4이다. 또 다른 실시양태에서, n=5이다. 또 다른 실시양태에서, n=6이다. 또 다른 예시적 gly/ser 연결 펩티드는 아미노산 서열 Ser(Gly4Ser)n를 포함한다. 한 실시양태에서, n=1이다. 한 실시양태에서, n=2이다. 한 바람직한 실시양태에서, n=3이다. 또 다른 실시양태에서, n=4이다. 또 다른 실시양태에서, n=5이다. 또 다른 실시양태에서, n=6이다.
본원에 사용되는 용어 "디술피드 결합"은 두 황 원자 사이에 형성된 공유 결합을 지칭한다. 아미노산 시스테인은 디술피드 결합을 형성하거나 제2 티올기와 가교를 형성할 수 있는 티올기를 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "종래의 scFv 분자"는 안정화된 scFv 분자가 아닌 scFv 분자를 지칭한다. 예를 들어, 전형적인 종래의 scFv 분자는 안정화 돌연변이가 결여되어 있고 (G4S)3 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함한다.
본 발명의 "안정화된 scFv 분자"는 scFv 분자의 안정화를 초래하는, 종래의 scFv 분자 대비의 하나 이상의 변화 또는 변경을 포함하는 scFv 분자를 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 "안정화 돌연변이"는 증진된 단백질 안정성(예를 들어, 열 안정성)을 scFv 분자, 및/또는 상기 scFv 분자를 포함하는 보다 큰 단백질에게 부 여하는 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 안정화 돌연변이는 탈안정화 아미노산을, 증진된 단백질 안정성을 부여하는 치환 아미노산(본원에서 "안정화 아미노산"으로 칭해짐)으로 치환하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 안정화 돌연변이는 scFv 링커의 길이가 최적화된 돌연변이이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 안정화 돌연변이는 scFv 분자의 VH 및 VL 계면의 안정성의 증가를 초래하는, 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 아미노산은 계면 내에 있다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산은 VH와 VL 사이의 상호작용의 골격이 되는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 안정화 돌연변이는 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 계면에 있는 2개 이상의 아미노산과 공변하는 VH 도메인 또는 VL 도메인 내의 하나 이상의 아미노산을 치환하는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 안정화 돌연변이는 하나 이상의 시스테인 잔기가 도입되어(즉, VH 또는 VL 도메인의 하나 이상으로 조작되어), VH 및 VL 도메인이 VH 도메인 내의 아미노산과 VL 도메인 내의 아미노산 사이의 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 연결되도록 하는 것이다. 특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 scFv 링커의 양 길이가 최적화되고, 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환되고/되거나, VH 및 VL 도메인이 VH 도메인 내 아미노산과 VL 도메인 내 아미노산 사이의 디술피드 결합에 의해 연결된 것이다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 안정화 돌연변이들 중 하나 초과가 scFv 분자 내에서 생길 수 있다.
한 실시양태에서, scFv 분자에 대해 일어나는 하나 이상의 안정화 돌연변이는 종래의 scFv 분자에 비해 scFv 분자의 양 VH 및 VL 도메인 모두의 열 안정성을 동시에 향상시킨다.
바람직하게, 본 발명의 안정화된 scFv 분자들 중 하나 이상의 집단은 단량체성의 가용성 단백질의 집단으로 표시된다. 한 실시양태에서, 10% 이하가 응집된 형태로 존재한다. 한 실시양태에서, 집단의 안정화된 scFv 분자는 동일한 안정화 돌연변이 또는 안정화 돌연변이의 조합을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 집단의 개별 안정화된 scFv 분자는 상이한 안정화 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명의 안정화된 scFv 분자는 단독으로 사용되어 표적 분자에 결합하거나, 또 다른 폴리펩티드에 연결되어 안정화된 scFv 분자를 포함하는 안정화된 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자는, 항체와 같은, 예를 들어 표적 결합 특이성을 부여하는 제2 scFv 분자 또는 비-scFv 분자에 연결된 scFv 분자를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "단백질 안정성"은 환경적 조건(예를 들어, 상승된 온도 또는 감소된 온도)에 대한 반응으로 단백질의 하나 이상의 물리적 성질을 유지하기 위한, 당업계에서 인식된 척도를 지칭한다. 한 실시양태에서, 물리적 성질은 단백질의 공유 구조의 유지(예를 들어, 단백질분해 절단, 바람직하지 않은 산화 또는 탈아민화의 부재)이다. 또 다른 실시양태에서, 물리적 성질은 적절히 폴딩된 상태의 단백질의 존재(예를 들어, 가용성 또는 불용성 응집체 또는 석출물의 부재)이다. 한 실시양태에서, 단백질의 안정성은 단백질의 생물물리학적 성질, 예를 들어 열 안정성, pH 언폴딩 프로파일, 글리코실화의 안정한 제거, 용해성, 생물화학적 기능(예를 들어, 단백질(예를 들어, 리간드, 수용체, 항원 등) 또는 화학적 부분 등에의 결합 능력) 및/또는 이들의 조합을 검정함으로써 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 생물화학적 기능은 상호작용의 결합 친화도에 의해 입증된다. 한 실시양태에서, 단백질 안정성의 척도는 열 안정성, 즉 열 자극에 대한 내성이다. 안정성은 당업계에 공지되고/되거나 본원에 기재된 방법을 이용하여 측정될 수 있다.
scFv 분자의 VL 및 VH 도메인은 하나 이상의 항체 분자로부터 유래된다. 본 발명의 scFv 분자의 가변 영역은 이것이 유래되는 기원의 항체 분자로부터의 아미노산 서열이 다양하도록 변형될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 보존적 치환 또는 아미노산 잔기에서의 변화를 초래하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환이 (예를 들어, CDR 및/또는 프레임워크 잔기에서) 일어날 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 돌연변이가 CDR 아미노산 잔기에 대해 일어나, 당업계에서 인식된 기법을 이용하여 항원 결합을 최적화할 수 있다. 본 발명의 결합 분자는 항원에 대한 결합능을 유지한다.
본원에 사용되는 용어인, 표시된 단백질"로부터 유래된"은 폴리펩티드의 기원을 지칭한다. 한 실시양태에서, 특별한 출발 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 가변 영역 서열(예를 들어, VH 또는 VL) 또는 이와 관련된 서열(예를 들어 CDR 또는 프레임워크 영역)이다. 한 실시양태에서, 특별한 출발 폴리펩티드로부터 유래된 아미노산 서열은 인접하고 있지 않다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR이 출발 항체로부터 유래된다. 한 실시 양태에서, 특별한 출발 폴리펩티드 또는 아미노산 서열로부터 유래된 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 출발 서열 또는 이의 부분의 아미노산 서열과 본질적으로 일치하는 아미노산 서열을 가지고, 상기 부분은 적어도 3 내지 5개의 아미노산, 5 내지 10개의 아미노산, 적어도 10 내지 20개의 아미노산, 적어도 20 내지 30개의 아미노산, 또는 적어도 30 내지 50개의 아미노산으로 이루어지고, 이는 이와 다른 경우에는 출발 서열 내 그 기원을 가지는 것으로 당업자에게 확인가능하다.
안정화된 scFv 분자 또는 이의 부분을 코딩하는 단리된 핵산 분자는, 유래의 기원이 되는 종래의 scFv 분자 또는 면역글로불린의 뉴클레오티드 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실을 도입함으로써 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 코딩된 단백질에 도입되도록 생성될 수 있다. 돌연변이는 표준 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 한 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 하나 이상의 비필수 아미노산 잔기에서 일어난다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것이다. 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소루이신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 비롯한, 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에서 정의되었다. 이에 따라, 면역글 로불린 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 아미노산의 열(string)은 측쇄 패밀리 구성원의 순서 및/또는 조성이 상이한, 구조적으로 유사한 열로 치환될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 시스테인 분자를 VH 도메인 및 VL 도메인에 도입함으로써 디술피드 결합을 scFv 분자에 도입하기 위해 돌연변이가 도입된다. 또 다른 실시양태에서, 종래의 scFv 분자의 아미노산은 유사한 물리적(예를 들어, 공간) 또는 기능성 성질을 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게, 종래의 scFv 분자 내로 치환된 아미노산은 VL/VH 계면의 일체성, CDR 구조, 및 VH 및/또는 VL 폴딩과 상용적이다.
대안적으로, 또 다른 실시양태에서, 돌연변이는 면역글로불린 코딩 서열의 모두 또는 일부를 따라 무작위로 도입될 수 있다.
본 발명의 안정화된 scFv 분자, 또는 그 안정화된 scFv 분자를 포함하는 폴리펩티드는 결합 분자인데, 즉 이들은 관심 표적 분자, 예를 들어 항원에 결합된다. 본 발명의 안정화된 scFv 분자가 제2 분자에 융합될 때, 그 제2 분자가 또한 융합 단백질에 결합 특이성을 부여할 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 scFv 분자(예를 들어, scFv 링커에 의해 회합된 VH 및 VL 도메인)로 구성되거나, 본 발명의 안정화된 scFv 분자를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 단가인데, 즉 (예를 들어, scFv 분자의 경우에서와 같이) 하나의 표적 결합 부위를 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 다가인데, 즉 하나 초과의 표적 결합 부위를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 분자는 2개 이상의 결합 부위를 포함한다. 한 실시양태에서, 결합 분자는 2개의 결합 부위를 포함한다. 한 실시양태에서, 결합 분자는 3개의 결합 부위를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 분자는 4개의 결합 부위를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 분자는 4개 초과의 결합 부위를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 단량체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 다량체이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 2량체이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 2량체는 2개의 일치하는 단량체성 서브유닛을 포함하는 동종2량체이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 2량체는 2개의 일치하지 않는 단량체성 서브유닛을 포함하는 이종2량체이다. 2량체의 서브유닛은 하나 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 2량체는 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 한 실시양태에서, 2량체는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 2량체는 (예를 들어, 항체 분자에서와 같이) 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다.
본원에 사용되는 용어 "가(valency)"는 폴리펩티드 내의 잠재적 표적 결합 부위의 수를 가리킨다. 각 표적 결합 부위는 하나의 표적 분자에, 또는 표적 분자 상의 특정 부위에 특이적으로 결합한다. 폴리펩티드가 하나 초과의 표적 결합 부위를 포함할 때, 각 표적 결합 부위는 동일하거나 상이한 분자에 특이적으로 결합할 수 있다(예를 들어, 상이한 분자, 예를 들어 상이한 항원, 또는 동일한 분자 상의 상이한 에피토프에 결합할 수 있음).
용어 "특이성"은 소정의 표적에 특이적으로 결합하는 (예를 들어, 그것과 면역작용하는) 능력을 지칭한다. 폴리펩티드는 단일특이적이고 표적에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 함유하거나, 폴리펩티드가 다중특이적(예를 들어, 이중특이적 또는 삼중특이적)이고 동일하거나 상이한 표적에 특이적으로 결합하는 2개 이상의 결합 부위를 함유한다. 특이적 결합이 본 발명의 안정화된 scFv 분자 및/또는 본 발명의 안정화된 scFv 분자가 연결되어 있는 비scFv 부분에 의해 부여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 다중특이적이다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 2개 이상의 표적, 예를 들어 하나 초과의 표적 분자 또는 동일한 표적 분자 상의 하나 초과의 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 이중특이적 분자[예를 들어, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자를 포함하는, 항체, 미니보디, 도메인 결실 항체, 또는 융합 단백질, 단일 도메인 항체(예를 들어, 카멜리드, 상어, 인간)]이다. 한 실시양태에서, 다중특이적 분자는 감소 또는 제거를 위해 표적화된 분자 및 세포 상의 표적 분자에 대해 특이적인 하나 이상의 결합 부위를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 다중특이적 분자는 감소 또는 제거를 위해 표적화된 분자 및 약물에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 결합 부위를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 다중특이적 분자는 감소 또는 제거를 위해 표적화된 분자 및 프로드러그에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 결합 부위를 가진다.
한 실시양태에서, 다중특이적 분자는 가용성 분자에 대한 하나의 특이성 및 세포 표면 분자에 대한 하나의 특이성을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 다중특 이적 분자는 하나 이상의 가용성 분자 상에 존재하는 2개의 표적에 대한 2개의 결합 특이성을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 다중특이적 분자는 (하나 이상의 세포 상에 존재할 수 있는) 하나 이상의 세포 표면 분자 상에 존재하는 2개의 표적에 대한 2개의 결합 특이성을 가진다.
한 실시양태에서, 결합 분자는, 생물학적 효과를 매개하는 (예를 들어, 세포내 활성화를 (예를 들어, 세포 표면 수용체에 대한 결합, 및 이에 따른 활성화 또는 억제 신호의 전달 또는 억제를 초래함으로써) 조절하는 분자에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 결합 부위를 가지고, 이는 (예를 들어, 세포 신호 유도 경로에 의해, 보체 고정화에 의해, 또는 결합 분자 상에 존재하는 패이로드(payload)에 대한 노출에 의해) 세포 사멸을 초래하거나, (예를 들어, 세포 사멸의 매개 또는 촉진, 피브린 응괴의 용해 촉진 또는 응괴 형성의 촉진, 또는 (예를 들어, 대상 내 TNFα와 같은 리간드의 양을 증진 또는 감소시킴으로써) 생체이용가능한 물질의 양의 조절에 의해) 대상에서의 질병 또는 장애를 조절한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는, 예를 들어 세포 표면 수용체, 예컨대 TNF 패밀리 수용체에의 결합에 의해, 세포에 신호를 전달하는 하나 이상의 표적에 결합한다. "신호를 전달한다"란, 세포에 결합함으로써, 결합 분자가, 예를 들어 신호 전달 경로의 조절에 의해, 세포 표면 수용체에 대한 세포외 전달을 세포내 반응으로 전환시킴을 의미한다.
한 실시양태에서, 결합 분자는 감소 또는 제거를 위해 표적화된 분자에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 결합 부위, 예를 들어 세포 표면 항원 또는 가용성 항 원에 결합한다. 한 실시양태에서, 결합 분자의 표적에의 결합은 표적이, 예를 들어 조직 또는 순환으로부터 감소 또는 제거되도록 한다. 또 다른 실시양태에서, 결합 분자는 표적 분자(예를 들어, 오염물질 검출 또는 상태 또는 장애의 진단을 위한) 표적 분자의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있는 분자에 대해 특이적인 하나 이사의 결합 부위를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 대상 내의 특이적 부위(예를 들어, 종양 세포 또는 혈액 응괴)에 대해 결합 분자를 표적으로 하는 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.
한 바람직한 실시양태에서, 다중 특이적 분자는 4개 결합 부위를 가지는 4가 항체이다. 4가 분자는 이중특이적이고, 각 특이성에 대해 2가일 수 있다. 예시적 이중특이적 분자의 추가적 설명이 하기 제공되어 있다.
본 발명의 바람직한 결합 분자는 인간 아미노산 서열로부터 유래된 프레임워크 및 불변 영역 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, 결합 폴리펩티드는 또 다른 포유동물 종으로부터 유래된 프레임워크 및/또는 불변 영역 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 쥐 서열을 포함하는 결합 분자는 특정 용도를 위해 적절할 수 있다. 한 실시양태에서, 영장류 프레임워크 영역(예를 들어, 인간외 영장류), 중쇄 부분, 및/또는 힌지 부분이 본 발명의 결합 분자 내에 포함될 수 있다. 한 실시양태에서, 하나 이상의 쥐 아미노산이 결합 폴리펩티드의 프레임워크 영역 내에 존재할 수 있는데, 예를 들어 인간 또는 인간외 영장류 프레임워크 아미노산 서열이, 상응하는 쥐 아미노산 잔기가 존재하고/하거나, 출발 쥐 항체에서 발견되지 않은 상이한 아미노산 잔기에 하나 이상의 돌연 변이를 포함할 수 있는 하나 이상의 아 미노산 복귀 돌연변이를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 결합 분자는 쥐 항체보다 더 적은 면역원성을 가진다.
"융합" 또는 키메라 단백질은, 제1 아미노산 서열이 본래 천연적으로 연결되지 않은 제2 아미노산 서열과 연결된 제1 아미노산 서열을 가리킨다. 아미노산 서열은 정상적으로 융합 폴리펩티드내 함께 있는 분리된 단백질 내에 존재할 수 있거나, 정상적으로 동일한 단백질 내에 존재할 수 있으나 융합 폴리펩티드 내 새로운 배치로 놓이지 않을 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들어 화학적 합성에 의해, 또는 펩티드 영역이 원하는 관계로 코딩되는 폴리뉴클레오티드를 생성시키고 번역함으로써 생성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 적용되는 용어 "이종성"은, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 비교 대상이 되는 실체의 것과 유전자형으로 구분되는 실체로부터 유래됨을 의미한다. 예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오티드 또는 항원은 한 개체의 상이한 종, 상이한 세포 유형, 또는 구분된 개체들의 동일하거나 상이한 유형의 세포로부터 유래될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "리간드 결합 도메인" 또는 "리간드 결합 부분"은 적어도 정성적인 리간드 결합능, 및 바람직하게는 상응하는 본연의 수용체의 생물학적 활성을 보유하는 임의의 본연의(native) 수용체(예를 들어, 세포 표면 수용체) 또는 임의의 영역 또는 이의 유도체를 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "수용체 결합 도메인" 또는 "수용체 결합 부분"은 적어도 정성적인 수용체 결합능, 및 바람직하게는 상응하는 본연의 리간드의 생물학 적 활성을 보유하는 임의의 본연의 리간드 또는 임의의 영역 또는 이의 유도체를 지칭한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 안정화된 "항체" 또는 "면역글로불린" 분자, 예를 들어 천연 발생 항체 또는 면역글로불린 분자(또는 이의 항원 결합 단편), 또는 항체 분자와 유사한 방식으로 항원에 결합하고 본 발명의 scFv 분자를 포함하는 유전조작된 항체 분자이다. 본원에 사용되는 용어 "면역글로불린"은 임의의 관련 특이적 면역반응성을 가지는 것과 상관없이 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄의 조합을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "항체"는 관심 항원(예를 들어, 종양 관련 항원)에 대해 유의적인 공지 특이적 면역반응성 활성을 갖는 조립체를 지칭한다. 항체 및 면역글로불린은 사슬간 공유 연결기를 사이에 가지거나 가지지 않는 경쇄 및 중쇄를 포함한다. 척추동물계에서의 기본 면역글로불린 구조는 비교적 잘 이해된다.
이하 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 포괄적 용어 "면역글로불린"은 생물화학적으로 구별될 수 있는 4가지 구분된 부류를 포함한다. 4가지 모든 부류의 항체들은 본 발명의 범주 내에 속하고, 하기 논의는 일반적으로 IgG 부류의 면역글로불린 분자에 관한 것이다. IgG와 관련하여, 면역글로불린은 분자량이 대략 23,000 달톤인 2개의 동일한 폴리펩티드 경쇄, 및 분자량이 53,000 내지 70,000인 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 4개 사슬은 "Y" 구조에서 디술피드 결합에 의해 결합되고, 여기에서 경쇄는 "Y"의 입구에서 시작하고 가변 영역을 통해 계속되는 중쇄를 일괄한다.
경쇄 및 중쇄는 모두 구조적 상동성 및 기능성 상동성으로 구분된다. 용어 "불변" 및 "가변"은 기능적으로 사용된다. 이와 관련하여, 경쇄(VL) 및 중쇄(VH) 부분 모두의 가변 도메인이 항원 인식 및 특이성을 결정한다는 것이 인지될 것이다. 그와 반대로, 경쇄(CL) 및 중쇄(CH1, CH2 또는 CH3) 모두의 불변 도메인은 분비, 태반 이동, Fc 수용체 결합, 보체 결합 등과 같은 중요한 생물학적 성질을 부여한다. 규약에 따라, 불변 영역 도메인의 넘버링은 항체의 항원 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 멀어질수록 증가한다. N-말단은 가변 영역이고, C-말단은 불변 영역이며; CH3 및 CL 도메인은 실제로 각기 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 포함한다.
scFv 분자에 대한 안정화 돌연변이가 CDR 및/또는 scFv 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄의 프레임워크 영역 내의 아미노산에 대해 일어날 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "가변 영역 CDR 아미노산 잔기"는 CDR, 즉 서열 또는 구조 기재의 방법을 이용하여 확인된 상보성 결정 영역 내의 아미노산을 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "CDR", 즉 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 모두의 가변 영역 내에서 발견되는 인접하지 않은 항원 조합 부위를 의미한다. 이 특별한 영역은 Kabat 등의 [J. Biol. Chem. 252, 6609-6616(1977)] 및 Kabat 등의 [Sequences of Protein of immunological interest.(1991)], 및 Chothia 등의 [J. Mol. Biol. 196:901-917(1987)] 및 MacCallum 등의 [J. Mol. Biol. 262:732-745(1996)]에 기재되어 있고, 여기에서 정의는 상호에 대해 비교할 때 아미노산 잔기의 부분집합 및 중복을 포함한다. 각각의 상기 인용된 참조문헌에 의해 정의되는 CDR을 포괄하는 아미노산 잔기가 비교를 위해 나와 있다. 바람직하게, 용어 "CDR"은 서열 비교에 기초하여 카밧에 의해 정의되는 CDR이다.
CDR 정의
Kabat1 Chothia2 MacCallum3
VH CDR1 31-35 26-32 30-35
VH CDR2 50-65 53-55 47-58
VH CDR3 95-102 96-101 93-101
VL CDR1 24-34 26-32 30-36
VL CDR2 50-56 50-52 46-55
VL CDR3 89-97 91-96 89-96
1 잔기 넘버링은 [Kabat 등, 이하 상기와 동일함]의 명명법을 따름
2 잔기 넘버링은 [Chothia 등, 이하 상기와 동일함]의 명명법을 따름.
3 잔기 넘버링은 [MacCallum 등, 이하 상기와 동일함]의 명명법을 따름.
본원에 사용되는 용어 "가변 영역 프레임워크(FR) 아미노산 잔기"는 Ig 사슬의 프레임워크 영역 내 아미노산을 지칭한다. 본원에 사용되는 "프레임워크 영역" 또는 "FR 영역"은 가변 영역의 일부이나 CDR의 일부는 아닌 아미노산 잔기를 포함한다(예를 들어, CDR의 카밧 정의를 이용함). 그러므로, 가변 영역 프레임워크는 길이가 약 100 내지 120개 아미노산이고, CDR의 외측에 있는 아미노산만을 포함한다. 중쇄 가변 영역의 구체예 및 Kabat 등에 의해 정의되는 CDR에 대해, 프레임워크 영역 1은 아미노산 1-30을 포괄하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 프레임워크 영역 2 는 아미노산 36-49를 포괄하는 가변 영역의 도메인에 상응하며; 프레임워크 영역 3은 아미노산 66-94를 포괄하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 프레임 워크 영역 4는 아미노산 103 내지 가변 영역 말단에 이르는 가변 영역의 도메인에 상응한다. 경쇄에 대한 프레임워크 영역은 경쇄 가변 영역 CDR의 각각에 의해 유사하게 분리된다. 마찬가지로, Chothia 등 또는 McCallum 등에 의한 CDR의 정의를 이용하여, 프레임워크 영역 경계부가 상기 기재된 바와 같은 각각의 CDR 말단에 의해 분리된다. 바람직한 실시양태에서, CDR은 카밧에 의해 정의된 바와 같다.
천연 발생 항체에서, 항체가 수성 환경에서 3차원 구조를 나타내므로, 각 단량체성 항체 상에 존재하는 6개의 CDR은 항원 결합 부위를 형성하기 위해 특정 배치되는 아미노산의 짧고 인접하지 않은 서열이다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인의 나머지는 아미노산 서열에 있어 보다 적은 분자 간 가변성을 나타내고, 프레임워크 영역으로 칭해진다. 프레임워크 영역은 대체로 β-시이트 구조를 채택하고, CDR은 β-시이트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 그 구조의 부분을 형성하는 루프를 형성한다. 이에 따라, 이 프레임워크 영역은 사슬간 비공유 상호작용에 의한 올바른 배향의 6개 CDR을 위치시키기 위해 제공되는 지지체(scaffold)를 형성하는 작용을 한다. 위치한 CDR에 의해 형성된 항원 결합 부위는 면역반응성 항원 상의 에피토프에 대해 상보적인 표면을 한정한다. 이 상보적 표면은 면역반응성 항원 에피토프에 대한 항체의 비공유 결합을 촉진한다. CDR의 위치는 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
과거 나타낸 바와 같이, 각종 면역글로불린 부류의 불변 영역의 서브유닛 구조 및 3차원 구조가 공지되어 있다. 본원에 사용되는 용어 "VH 도메인"은 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "VL 도메 인"은 면역글로불린 경쇄의 아미노 말단 가변 도메인을 포함한다.
용어 "단편"은 비변형 또는 완전 폴리펩티드보다 보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 항체 사슬)의 일부 또는 부분을 지칭한다. 용어 "항원-결합 단편"은 항원 결합(즉, 특이적 결합)을 위해 비변형 항체(즉, 면역글로불린 또는 항체가 유래되도록 하는 비변형 항체)와 경쟁하거나 항원에 결합하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 항체 분자의 "단편"은 항체의 항원-결합 단편, 예를 들어 항체 경쇄(VL), 항체 중쇄(VH), 단쇄 항체(scFv), F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, 및 단일 도메인 항체 단편(DAb)을 포함한다. 예를 들어 비변형 또는 완전 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리에 의해, 또는 재조합 수단에 의해, 단편이 수득될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "결합 부위"는 관심 표적 분자(예를 들어, 항원, 리간드, 수용체, 기질 또는 억제제)에 선택적으로 결합하는 원인이 되는 폴리펩티드의 영역을 포함한다. 결합 도메인은 하나 이상의 표적 결합 부위를 포함한다. 예시적 결합 도메인은 항체 가변 도메인, 리간드의 수용체 결합 도메인, 수용체의 리간드 결합 도메인, 또는 효소적 도메인을 포함한다.
본 발명의 결합 분자는 당업계에 공지된 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 "재조합에 의해 생성"되는데, 즉 재조합 DNA 기법을 이용하여 생성된다. 그러한 분자의 제조를 위한 예시적 기법이 이하 더욱 상세히 논의된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 안정화된 scFv 분자가 융합된 천연 발생 항체이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 안정화된 scFv 분자가 융합된 변형된 항체이다. 본원에 사용되는 용어 "변형된 항체"에는 천연 발생되지 않도록 변경된 합성 형태의 항체가 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 하나 이상의 scFv 분자를 포함하는 융합 단백질이다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 인간에서 유해한 면역 반응을 나타내지 않을 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 불변 영역, 예를 들어 중쇄 불변 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 그러한 불변 영역은 야생형 불변 영역 대비 변형된다. 즉, 본원에 개시된 본 발명의 폴리펩티드는 3개의 중쇄 불변 도메인(CH1, CH2 또는 CH3) 및/또는 경쇄 불변 영역 도메인(CL) 중 하나 이상에 대해 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 예시적 변형에는 하나 이상의 도메인 내의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환이 포함된다. 그러한 변화는 기능, 반감기 등을 최적화하기 위해 포함될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "악성"은 비양성 종양 또는 암을 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 "암"에는 비제어 또는 비조절 세포 성장을 특징으로 하는 악성이 포함된다. 예시적 암에는 암종, 육종, 백혈병 및 림프종이 포함된다. 용어 "암"에는 일차적 악성 종양(예를 들어, 세포가 원 종양의 부위외의 대상의 신체 내 부분으로 이동하지 않은 종양), 및 이차 악성 종양(예를 들어, 원 종양의 부위와 다른 2차 부위로 종양 세포가 이동하는 전이에서 생기는 종양)이 포함된다.
본원에 사용되는 용어 "조작된"은 합성 수단(예를 들어, 재조합 기법, 시험관내 펩티드 합성, 펩티드의 효소적 또는 화학적 커플링, 또는 이 기법들 중 일부의 조합)에 의한 핵산 또는 폴리펩티드 분자의 조작을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 결합 분자는 그러한 방법을 이용하여 만들어진다.
본원에 사용되는 용어 "연결된," "융합된" 또는 "융합"은 상호 혼용된다. 이 용어들은, 화학적 접합 또는 재조합 수단 등의 그 수단을 불문하고 2개 이상의 요소 또는 성분들을 함께 결합시키는 것을 지칭한다. 바람직하게, 융합된 폴리펩티드는 유전적으로 융합되는데, 즉 재조합 DNA 기법을 이용하여 융합된다. "인-프레임(in-frame) 융합"은 2개 이상의 개방해독틀(open reading frame)(ORF)을, 그 원래의 ORF의 바른 해독틀을 유지하도록 하는 방식으로 결합시켜, 연속적인 보다 긴 ORF을 형성하는 것을 지칭한다. 이에 따라, 수득된 융합 단백질은 원 ORF에 의해 코딩된 폴리펩티드에 상응하는 2개 이상의 세그먼트를 함유하는 단일 단백질이다(여기에서, 세그먼트는 정상적으로는 성질상 결합되지 않음). 해독틀이 이에 따라 융합된 세그먼트 전반에 걸쳐 연속적으로 되나, 세그먼트는 물리적으로 또는 공간적으로, 예를 들어 인-프레임 scFv 링커 서열에 의해 분리될 수 있다.
폴리펩티드의 문맥에서, "선형 서열" 또는 "서열"은, 서열 내 서로 이웃하는 잔기가 폴리펩티드의 일차 구조에서 인접하는 아미노에서 카르복시 말단으로의 폴리펩티드의 아미노산 순서이다.
본원에 사용되는 어구 "결합 분자의 투여로부터 이익을 보게 보는 대상"에는, 예를 들어 결합 분자에 의해 인식되는 항원의 검출을 위해(예를 들어, 진단 절 차를 위해) 사용된 결합 분자의 투여로부터, 및/또는 결합 분자를 이용한 처리로써 결합 분자에 의해 인식되는 표적을 감소 또는 제거함으로써 이익을 보게 되는, 포유동물 대상과 같은 대상들이 포함된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 대상은 순환 또는 혈청(예를 들어, 독소 또는 병원체)로부터의 가용성 또는 입상 분자의 감소 또는 제거; 또는 표적 발현 세포(예를 들어, 종양 세포)의 집단의 감소 또는 제거로부터 이익을 볼 수 있다. 본원에 더욱 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 결합 분자는 접합되지 않은 형태로 사용되거나, 예를 들어 검출가능 부분, 약물, 프로드러그, 동위원소에 접합될 수 있다.
용어 "TNF 수용체" 또는 "TNF 수용체 패밀리 구성원"은 종양 괴사 인자("TNF") 수퍼패밀리의 수용체에 속하는 임의의 수용체를 지칭한다. TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원("TNFRSF")은 시스테인 노트(knot)로서 배치된 2개 이상의 시스테인-풍부 도메인(각기 ~40개 아미노산)을 갖는 세포외 영역을 그 특징으로 한다(문헌 [Dempsey 등, Cytokine Growth Factor Rev .(2003). 14(3-4): 193-209] 참조). 그의 동족 TNF 리간드의 결합 시에 TNF 수용체는 TRAF(TNF 수용체 회합 인자)로 알려진 세포질 어댑터 단백질과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용함으로써 신호를 전달한다. TRAF는 NF-카파B, JNK, ERK, p38 및 PI3K와 같은 신호 전달 경로의 활성화를 궁극적으로 초래하는 수가지 키나제 캐스케이드의 활성화를 유도할 수 있는데, 상기 경로는 다시 면역 기능 및 조직 분화에서 아포프토시스에 이르는 세포내 과정들을 제어하게 된다.
수가지 TNF 수용체 패밀리 구성원의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 당업 계에 공지되어 있고, 이에는 하기와 같은 29가지 이상의 인간 유전자들이 포함된다: TNFRSF1A(TNFR1, 이는 또한 DR1, CD120a, TNF-R-I p55, TNF-R, TNFRI, TNFAR, TNF-R55, p55TNFR, p55R 또는 TNFR60로도 알려짐, 유전자은행 GI No. 4507575; 또한 US 5,395,760 참조)), TNFRSF1B(CD120b, 이는 또한 p75, TNF-R, TNF-R-II, TNFR80, TNFR2, TNF-R75, TNFBR 또는 p75TNFR로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 4507577), TNFRSF3(림포톡신(Lymphotoxin) 베타 수용체(LTβR), 이는 또한 TNFR2-RP, CD18, TNFR-RP, TNFCR 또는 TNF-R-III로도 알려짐; GI No. 4505038 및 No. 20072212), TNFRSF4(OX40, 이는 또한 ACT35, TXGPlL 또는 CD134 항원으로도 알려짐; GI No. 4507579 및 No. 8926702), TNFRSF5(CD40, 이는 또한 p50 또는 Bp50으로도 알려짐; GI No. 4507581 및 No. 23312371), TNFRSF6(FAS, 이는 또한 FAS-R, DcR-2, DR2, CD95, APO-1 또는 APT1로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 4507583, No. 23510421, No. 23510423, No. 23510425, No. 23510427, No. 23510429, No. 23510431 및 No. 23510434)), TNFRSF6B(DcR3, DR3; 유전자은행 GI No. 4507569, No. 23200021, No. 23200023, No. 23200025, No. 23200027, No. 23200029, No. 23200031, No. 23200033, No. 23200035, No. 23200037, 및 No. 23200039), TNFRSF7(CD27, 이는 또한 Tp55 또는 S152로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 4507587), TNFRSF8(CD30, 이는 또한 Ki-1 또는 D1S166E로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 4507589 및 No. 23510437), TNFRSF9(4-1-BB, 이는 또한 CD137 또는 ILA로도 알려짐; GI No. 5730095 및 No. 728738), TNFRSF10A(TRAIL-R1, 이는 또한 DR4 또는 Apo2로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 21361086), TNFRSF10B(TRAIL-R2, 이는 또한 DR5, KILLER, TRICK2A 또는 TRICKB로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 22547116 및 No. 22547119), TNFRSF10C(TRAIL-R3, 이는 또한 DcR1, LIT 또는 TRID로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 22547121), TNFRSF10D(TRAIL-R4, 이는 또한 DcR2 또는 TRUNDD로도 알려짐), TNFRSF11A(RANK; 유전자은행 GI No. 4507565; US 특허 제6,562,948호; 제6,537,763호; 제6,528,482호; 제6,479,635호; 제6,271,349호; 및 제6,017,729호 참조), TNFRSF11B(오스테오프로테게린(Osteoprotegerin)(OPG), 이는 또한 OCIF 또는 TR1로도 알려짐; GI No. 38530116, No. 22547122 및 No. 33878056), TNFRSF12(위치 재배열 사슬-회합 막단백질(TRAMP), 이는 또한 DR3, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3, Fn14 또는 TWEAKR로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 7706186; US 특허 출원공보 제2004/0033225A1호), TNFRSF12L(DR3L), TNFRSF13B(TACI; GI No. 6912694), TNFRSF13C(BAFFR; GI No. 16445027), TNFRSF14(헤르페스 바이러스 엔트리 매개자(Herpes Virus Entry Mediator)(HVEM), 이는 또한 ATAR, TR2, LIGHTR 또는 HVEA로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 23200041, No. 12803895 및 No. 3878821), TNFRSF16(저친화도 신경 성장 인자 수용체(LNGFR), 이는 또한 뉴로트로핀(Neurotrophin) 수용체 또는 p75(NTR)로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 128156 및 No. 4505393), TNFRSF17(BCM, 이는 또한 BCMA로도 알려짐; GI No. 23238192), TNFRSF 18(AITR, 이는 또한 GITR로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 4759246, No. 23238194 및 No. 23238197), TNFRSF19(트로이/트레이드(Troy/Trade), 이는 또한 TAJ로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 23238202 및 No.23238204), TNFRSF20(RELT, 이는 또한 FLT14993로도 알려짐; GI No. 21361873 및 No. 23238200), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(SOBa, 이는 또한 Tnfrh2 또는 2810028K06Rik로도 알려짐), 및 TNFRSF23(mSOB, 이는 또한 Tnfrh1로도 알려짐). 기타 TNF 패밀리 구성원에는 EDARl(엑토다이스플라신(Ectodysplasin) A 수용체, 이는 또한 다운리스(Downless)(DL), ED3, ED5, ED1R, EDA3, EDA1R, EDA-A1R로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 11641231; US 특허 제6,355,782호), XEDAR(EDA-A2R로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 11140823); 및 CD39(GI No. 2135580 및 No. 765256)이 포함된다.
용어 "TNF 리간드" 또는 "TNF 리간드 패밀리 구성원"은 종양 괴사 인자(TNF) 수퍼패밀리에 속하는 리간드를 지칭한다. TNF 리간드는 TNF 수용체 수퍼패밀리의 구분된 수용체에 결합하고, 상호에 대해 15 내지 25% 아미노산 서열 상동성을 나타낸다(Gaur 등, Biochem . Pharmacol .(2003), 66(8): 1403-8). 수가지 TNF 수용체(리간드) 슈퍼패밀리("TNFSF") 구성원의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 당업계에 공지되어 있고, 이에는 하기와 같은 16가지 이상의 인간 유전자들이 포함된다: TNFSF1(림포톡신-α(LTA), 이는 또한 TNFβ 또는 LT으로도 알려짐; 유전자 은행 GI No. 34444 및 No. 6806893), TNFSF2(TNF, 이는 또한 TNFα 또는 DIF로도 알려짐; GI No. 25952111), TNFSF3(림포톡신-β(LTB)로도 알려짐, TNFC 또는 p33), TNFSF4(OX-40L, gp34, CD134L 또는 tax-전사 활성화 당단백질 1, 34kD(TXGP1)로도 알려짐; GI No. 4507603), TNFSF5(CD40LG, IMD3, HIGM1, CD40L, hCD40L, TRAP, CDl 54 또는 gp39로도 알려짐; GI No. 4557433), TNFSF6(FasL 또는 APT1LG1로도 알려짐; 유전자은행 GI No. 4557329), TNFSF7(CD70, CD27L 또는 CD27LG로도 알려짐; GI No. 4507605), TNFSF8(CD30LG, CD30L 또는 CD153로도 알려짐; GI No. 4507607), TNFSF9(4-1BB-L 또는 ILA 리간드로도 알려짐; GI No. 4507609), TNFSF10(TRAIL, Apo-2L 또는 TL2로도 알려짐; GI No. 4507593), TNFSF11(TRANCE, RANKL, OPGL 또는 ODF로도 알려짐; GI No. 4507595 및 No. 14790152), TNFSF12(Fn14L, TWEAK, DR3LG 또는 APO3L로도 알려짐; GI No. 4507597 및 No. 23510441), TNFSF13(APRIL로도 알려짐), TNFSF 14(LIGHT, LTg 또는 HVEM-L로도 알려짐; GI No. 25952144 및 No. 25952147), TNFSF15(TL1 또는 VEGI로도 알려짐) 또는 TNFSF16(AITRL, TL6, hGITRL 또는 GITRL로도 알려짐; GI No. 4827034). 기타 TNF 리간드 패밀리 구성원에는 EDAR1 & XEDAR 리간드(ED1; GI No. 4503449; Monreal 등(1998) Am J Hum Genet . 63:380), 트로이/트레이드 리간드, BAFF(알려짐 TALLl로도 알려짐; GI No. 5730097), 및 NGF 리간드(예를 들어, NGF-β(GI No. 4505391), NGF-2/NTF3; GI No. 4505469), NTF5(GI No. 5453808), BDNF(GI No. 25306267, No. 25306235, No. 25306253, No. 25306257, No. 25306261, No. 25306264; IFRD1(GI No. 4504607)).
"전이 온도"로도 칭해지는 용어 "Tm"은 거대 분자, 예를 들어 결합 분자의 50%가 변성되는 온도로서, 단백질의 열 안정성을 설명하기 위한 표준 파라미터로 간주된다.
본원에 사용되는 용어 "골격 잔기(scaffolding residue)"는 계면(예를 들어, VH/VL 계면) 내에 있지 않으나 계면을 유지하는데 중요한 아미노산 잔기 또는 잔기 위치를 지칭한다. 이 아미노산 잔기는 대향 도메인 상의 계면 잔기와 물리적으로 상호작용하거나 계면에 표면적으로 기여하지 않더라도, 계면 잔기를 위해 적절한 구조적 부분을 제공하는 데 중요하다. 그러한 아미노산 잔기는 VH와 VL 사이의 상 호작용의 골격이 된다.
정상적으로 함께 나타나는 후보 폴리펩티드 서열 내의 2개 이상의 아미노산 잔기 위치는 "공변한다(covary)"라고 칭해진다("공변 잔기 위치" 또는 "공변성 잔기 위치"). 2개 이상의 아미노산 위치 사이의 공변은, 제1 아미노산 위치에서 확인되는 아미노산 유형이 또 다른 아미노산 위치에서 확인되는 아미노산의 유형에 의존적일 때 관찰된다. 즉, 하나의 특별한 아미노산이 서열 내 제1 위치에서 발견될 때, 제2의 특별한 아미노산이 통상 서열 내 제2 위치에서 발견된다.
본원에 사용되는 용어 "Ig 폴드"는 단백질의 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 단백질에서 발견되는 단백질 도메인을 포함한다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, Ig 폴드는 면역글로불린 수퍼패밀리를 구분해주는 특징이다(예를 들어, 문헌 [Bork, P., Holm, L. & Sander, C. 1994. Immunoglobulin Fold. J. Mol. Biol. 242, 309-320] 참조). 각 부류의 Ig 폴드에 대한 대표적인 구조가 도 73에 나와 있다.
II . 안정화된 scFv 분자
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 안정화된 scFv 분자이다. 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 scFv 링커(여기에서, VH 및 VL 도메인은 VH 도메인 내 아미노산과 VL 도메인 내 아미노산 사이의 디술피드 결합에 의해 연결됨)를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 최적화 길이를 갖는 링커 또는 조성물을 포함할 수 있다. 또 다 른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 하나 이상의 안정화 아미노산 치환(들)을 갖는 VH 또는 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 상기 안정화 특성들 중 2가지 이상을 포함한다.
본 발명의 안정화된 scFv 분자는 향상된 안정성을 가진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자 또는 이를 포함하는 폴리펩티드의 집단은, 단백질의 자체의 10% 이하가 2량체성, 4량체성 또는 기타의 응집된 형태인, 단량체성의 가용성 단백질로 표현된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자의 집단은 Tm-값이 55℃ 초과인 VH 및 VL 도메인을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자의 집단은 49℃ 초과의 T50을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자의 집단은 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48℃ 초과의 T50을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 또는 49℃ 초과의 T50을 가진다.
본 발명의 scFv 분자는 관심 표적 분자에 결합한다. scFv를 만드는데 사용되는 VH 및 VL 도메인은 동일하거나 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv에 사용하기 위한 VH 또는 VL는 관심 표적에 결합하는 하나 이상의 CDR를 포함할 수 있으나, VH 또는 VL 도메인의 나머지는 상이한 항체로부터 비롯되거나 합성된다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 항체, 예를 들어 관심 표적에 결합하는, 당업계에 공지된 항체의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 소정의 항체의 2개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 소정의 항체의 3개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 소정의 항체의 4개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 소정의 항체의 5개 이상의 CDR을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 소정의 항체의 6개 이상의 CDR을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 항체, 예를 들어 관심 표적에 결합하는, 당업계에 공지된 항체의 하나 이상의 VH 도메인을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 소정의 항체의 하나 이상의 VL 도메인을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 항체, 예를 들어 관심 표적에 결합하는, 당업계에 공지된 항체의 하나 이상의 VH 도메인 및 하나의 VL 도메인을 포함한다. scFv 분자는 VH-링커-VL 배향 또는 VL-링커-VH 배향으로 작제될 수 있다.
본 발명의 scFv 분자 또는 이를 포함하는 융합 단백질의 안정성은 종래의(비안정화된) scFv 분자, 또는 종래의 scFv 분자를 포함하는 생물물리학적 성질(예를 들어, 열 안정성)을 참조하여 평가될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 대조군 결합 분자(예를 들어, 종래의 scFv 분자)보다 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 0.75, 약 1, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10℃ 더 큰 열 안정성을 가진다. 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 하기 VIII 단락에 기재된 바와 같은 본 발명의 방법을 이용하여 확인된 분자들을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 최적화 길이 및/또는 아미노산 조성을 갖는 scFv 링커를 포함한다. 본 발명의 바람직한 scFv 링커는 본 발명의 결합 분자의 열 안정성을 종래의 결합 분자에 비해 적어도 약 2℃ 또는 3℃ 더 크게 향상시킨다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 종래의 결합 분자에 비해 1℃ 향상된 열 안정성을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 종래의 결합 분자에 비해 2℃ 향상된 열 안정성을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 종래의 결합 분자에 비해 4, 5, 6℃ 향상된 열 안정성을 가진다. 예를 들어 본 발명의 scFv 분자와 종래 기술의 방법을 이용하여 제조된 scFv 분자 간의 비교, 또는 scFv VH 및 VL가 유래되는 기원인 항체의 fab 단편과 scFv 분자 간의 비교를 행할 수 있다. 당업계에 공지된 방법을 이용하여 열 안정성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, Tm이 측정될 수 있다. Tm의 측정 방법 및 기타 단백질 안정성의 결정 방법이 이후 더욱 상세히 설명된다.
한 실시양태에서, scFv 링커는 아미노산 서열(Gly4Ser)4로 구성되거나, (Gly4Ser)4 서열을 포함한다. 기타 예시적 링커는 (Gly4Ser)3 및 (Gly4Ser)5 서열을 포함하거나 그것으로 구성된다. 본 발명의 scFv 링커는 다양한 길이를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 scFv 링커는 약 5 내지 약 50개 아미노산의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 scFv 링커는 약 10 내지 약 40개 아미노산의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 scFv 링커는 약 15 내지 약 30개 아미노산의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 scFv 링커는 약 17 내지 약 28개 아미노산의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발 명의 scFv 링커는 약 19 내지 약 26개 아미노산의 길이를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 scFv 링커는 약 21 내지 약 24개 아미노산의 길이를 가진다.
scFv 링커는 당업계에 공지된 기법을 이용하여 폴리펩티드 서열에 도입될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, PCR 돌연변이유발이 사용될 수 있다. DNA 서열 분석에 의해 변형을 확인할 수 있다. 플라스미드 DNA를 사용하여, 생성된 폴리펩티드의 안정한 생성을 위해 숙주 세포를 형질전환할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 VL 도메인 내 아미노산을 VH 도메인 내 아미노산에 연결하는 하나 이상의 디술피드 결합을 포함한다. 시스테인 잔기는 디술피드 결합을 제공할 필요가 있다. 디술피드 결합은 본 발명의 scFv 분자 내에 포함되어, 예를 들어 VL의 FR4 및 VH의 FR2를 연결하거나, VL의 FR2 및 VH의 FR4를 연결할 수 있다. 디술피드 결합을 위한 예시적 위치에는 카밧 넘버링에 준하여, VH의 43, 44, 45, 46, 47, 103, 104, 105 및 106, 및 VL의 42, 43, 44, 45, 46, 98, 99, 100 및 101이 포함된다. 시스테인 잔기에 대해 돌연변이화된 아미노산 위치의 예시적 조합에는 VH44-VL100, VH105-VL43, VH105-VL42, VH44-VL101, VH106-VL43, VH104-VL43, VH44-VL99, VH45-VL98, VH46-VL98, VH103-VL43, VH103-VL44 및 VH103-VL45가 포함된다.
한 실시양태에서, 디술피드 결합은 VH 아미노산 44와 VL 아미노산 100을 연결한다.
VH 및 VL 도메인을 코딩하는 유전자의 변형은 당업계에 공지된 기법, 예를 들어 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 달성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 삽입된 아미노산 서열 (Gly4Ser)4(여기에서, VH 및 VL 도메인은 VH 아미노산 위치 44와 VL 아미노산 위치 100 사이의 디술피드 결합에 의해 연결됨)을 갖는 scFv 링커를 포함한다.
다른 실시양태에서 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 scFv의 가변 도메인(VH 또는 VL) 내 하나 이상의 안정화 돌연변이를 포함한다. 한 실시양태에서, 안정화 돌연변이는
a) VL의 카밧 위치 3에 있는 아미노산(예를 들어, 글루타민)의, 예를 들어 알라닌, 세린, 발린, 아스파르트산 또는 글리신으로의 치환;
b) VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산(예를 들어, 세린)의, 예를 들어 루이신으로의 치환;
c) VL의 카밧 위치 49에 있는 아미노산(예를 들어, 세린)의, 예를 들어 티로신 또는 세린으로의 치환;
d) VL의 카밧 위치 50에 있는 아미노산(예를 들어, 세린 또는 발린)의, 예를 들어 세린, 트레오닌 및 아르기닌, 아스파르트산, 글리신 또는 리신으로의 치환;
e) VL의 카밧 위치 49에 있는 아미노산(예를 들어, 세린) 및 VL의 카밧 위치 50에 있는 아미노산(예를 들어, 세린)의, 각기 티로신 및 세린으로의 치환; 티로신 및 트레오닌으로의 치환; 티로신 및 아르기닌으로의 치환; 티로신 및 글리신으로의 치환; 세린 및 아르기닌으로의 치환; 또는 세린 및 리신으로의 치환;
f) VL의 카밧 위치 75에 있는 아미노산(예를 들어, 발린)의, 예를 들어 이소루이신으로의 치환;
g) VL의 카밧 위치 80에 있는 아미노산(예를 들어, 프롤린)의, 예를 들어 세린 또는 글리신으로의 치환;
h) VL의 카밧 위치 83에 있는 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌)의, 예를 들어 세린, 알라닌, 글리신 또는 트레오닌으로의 치환;
i) VH의 카밧 위치 6에 있는 아미노산(예를 들어, 글루탐산)의, 예를 들어 글루타민으로의 치환;
j) VH의 카밧 위치 13에 있는 아미노산(예를 들어, 리신)의, 예를 들어 글루탐산염으로의 치환;
k) VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산(예를 들어, 세린)의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환;
1) VH의 카밧 위치 20에 있는 아미노산(예를 들어, 발린)의, 예를 들어 이소루이신으로의 치환;
m) VH의 카밧 위치 32에 있는 아미노산(예를 들어, 아스파라긴)의, 예를 들어 세린으로의 치환;
n) VH의 카밧 위치 43에 있는 아미노산(예를 들어, 글루타민)의, 예를 들어 리신 또는 아르기닌으로의 치환;
o) VH의 카밧 위치 48에 있는 아미노산(예를 들어, 메티오닌)의, 예를 들어 이소루이신 또는 글리신으로의 치환;
p) VH의 카밧 위치 49에 있는 아미노산(예를 들어, 세린)의, 예를 들어 글리신 또는 알라닌으로의 치환;
q) VH의 카밧 위치 55에 있는 아미노산(예를 들어, 발린)의, 예를 들어 글리신으로의 치환;
r) VH의 카밧 위치 67에 있는 아미노산(예를 들어, 발린)의, 예를 들어 이소루이신 또는 루이신으로의 치환;
s) VH의 카밧 위치 72에 있는 아미노산(예를 들어, 글루탐산)의, 예를 들어 아스파르트산염 또는 아스파라긴으로의 치환;
t) VH의 카밧 위치 79에 있는 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌)의, 예를 들어 세린, 발린 또는 티로신으로의 치환; 및
u) VH의 카밧 위치 101에 있는 아미노산(예를 들어, 프롤린)의, 예를 들어 아스파르트산으로의 치환
으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
v) 한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 상기 a) 내지 u)에 기재된 안정화 돌연변이들 중 2개 이상을 포함한다. 한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 VL의 카밧 위치 49에 있는 아미노산, 예를 들어 티로신 또는 세린으로의 치환, 및 VL의 카밧 위치 50에 있는 아미노산의, 예를 들어 트레오닌 및 아르기닌, 아스파르트산, 글리신 또는 리신으로의 치환을 포함한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 VH의 카밧 위 치 16에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환, 및 VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의, 예를 들어 리신으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환; VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의, 예를 들어 리신으로의 치환; 및 VH의 카밧 위치 55에 있는 아미노산의, 예를 들어 글리신으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환; VL의 카밧 위치 46에 있는 아미노산의, 예를 들어 리신으로의 치환; VH의 카밧 위치 55에 있는 아미노산의, 예를 들어 글리신으로의 치환; 및 VH의 카밧 위치 101에 있는 아미노산의, 예를 들어 아스파르트산으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 6에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루타민으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 13에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 16에 있는 아미노산의, 예를 들어 글루탐산염 또는 글루타민으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 20에 있는 아미노산의, 예를 들어 이소루이신으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 32에 있는 아미노산의, 예를 들어 세린으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 43에 있는 아미노산의, 예를 들어 리신 또는 아르기닌으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 48에 있는 아미노산의, 예를 들어 이소루이신 또는 글리신으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 치환 49에 있는 아미노산의, 예를 들어 글리신 또는 알라닌으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 55에 있는 아미노산의, 예를 들어 글리신으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 67에 있는 아미노산의, 예를 들어 이소루이신 또는 루이신으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 72에 있는 아미노산의, 예를 들어 아스파르트산염 또는 아스파라긴으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 79에 있는 아미노산의, 예를 들어 세린, 발린 또는 티로신으로의 치환을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 VH의 카밧 위치 101에 있는 아미노산의, 예를 들어 아스파르트산으로의 치환을 포함한다.
또 다른 예시적 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 본원에 기재된 안정화 아미노산 치환들 중 하나 이상, 및 최적화된 길이 또는 조성을 갖는 scFv 링커(예를 들어, (Gly4Ser)4)를 포함한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 분자는 본원에 기재된 안정화 아미노산 치환들 중 하나 이상, 및 VL 도메인 내 아미노산과 VH 도메인 내 아미노산을 연결하는 디술피드 결합(예를 들어, VH44-VL100)을 포함한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 본 발명 의 안정화된 scFv 분자는 본원에 기재된 안정화 아미노산 치환들 중 하나 이상, 최적화된 길이 또는 조성을 갖는 scFv 링커(예를 들어, (Gly4Ser)4), 및 VL 도메인 내 아미노산과 VH 도메인 내 아미노산을 연결하는 디술피드 결합(예를 들어, VH44-VL100)을 포함한다.
안정화된 scFv 분자는 당업계에서 인식된 기법을 이용하여 발현될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 그러한 분자는 세포내 발현 시스템, 예를 들어 세균 또는 포유동물 발현 시스템 내에서 발현하기에 적절한 발현 벡터를 이용하여 발현될 수 있다.
한 실시양태에서, scFv 분자는 예를 들어 세포외질(periplasmic) 발현에 적절한 벡터를 이용하여, E. 콜라이 (E. coli ) 내에서 발현될 수 있다. 부가적 서열이, 예를 들어 신호 서열, 및/또는 scFv의 정제 및/또는 검출을 용이하게 하는 택의 발현을 최적화하기 위해 포함될 수 있다.
한 실시양태에서, 첨가제, 예컨대 1 내지 2% 트리톤(예를 들어, 트리톤 x-100) 또는 1 내지 2% 글리신 또는 이들의 조합(예를 들어, 1% 글리신 및 1% 트리톤)을 첨가하여, 세포외질로부터 매질로의 분비를 용이하게 할 수 있다.
III . 단백질 안정성의 예측/결정 방법
특정 측면에서, 본 발명은 대규모 발현을 위해 선택된 단백질, 예를 들어 치료적 단백질 또는 산업용 효소에 있어서의 선험적인 가능한 생물물리학적 문제의 예측 방법을 제공한다. 특정 예시적 측면에서, 본 발명의 방법은 당업자가, 예를 들어 포유동물 세포에서 재조합에 의해 발현될 때, 고유하게 안정성이 좋지 않은 것으로 예측되는 단백질 서열의 발현을 막도록 한다. 대안적 측면에서, 본 발명의 방법을 이용하여, 향상된 안정성, pH 변화에 대한 향상된 안정성, 및 증진된 생물화학적 기능을 포함하나 이에 국한되지 않는 향상된 생물물리학적 성질을 가지는 것으로 예측되는 단백질 서열의 변이체를 확인할 수 있다.
특정 측면에서, 본 발명은 후보 단백질의 폴리펩티드 서열(예를 들어, 아미노산 서열)에 기초하여, 후보 단백질, 또는 이의 서열 변이체 또는 동종체의 생물물리학적 성질(예를 들어, 열 안정성)을 예측하는 전산 방법을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 후보 단백질의 안정성을 예측하거나, 후보 단백질의 안정성을 향상시키기 위해 사용될 수 있는 공지된 예시적 안정성을 갖는 후보 단백질, 예를 들어 scFv 분자의 동종체 또는 변이체를 확인하기 위해 구조적 모델링을 이용한다.
a. 공변 분석
특정 예시적 측면에서, 본 발명은 생물물리학적 성질(예를 들어, 단백질 안정성)을 예측하기 위한, "공변 분석"으로 칭해지는 향상된 전산 방법을 제공한다. 본원에 사용되는 "공변 분석"은, 정상적으로는 함께 발생하거나, 후보 서열의 동종체 내(여기에서는 "공변 잔기 위치" 또는 "공변성 잔기 위치")에서 공변하는 후보 폴리펩티드 서열 내의 2개 이상의 아미노산 잔기 위치를 확인하는 전산 방법을 지칭한다. 제1 아미노산 위치에서 발견되는 아미노산의 유형이 또 다른 아미노산 위치에서 발견되는 아미노산의 유형에 의존할 때, 2개 이상의 아미노산 위치 사이의 공분산이 관찰된다. 즉, 하나의 특별한 아미노산이 서열 내 제1 위치에서 발견될 때, 제2 특별한 아미노산이 통상 서열 내 제2 위치에서 발견된다.
공변성 잔기가 공진화하기 쉽기 때문에, 공변의 관찰은 정상적으로 공변하는 위치에 있는 아미노산 잔기의 상용성이 기능성 또는 구조적 이유에서 중요할 수 있음을 가리킨다. 따라서, 본 발명의 공변 방법을 사용하여, 폴리펩티드 서열(예를 들어, 후보 폴리펩티드 서열) 내 하나 이상의 공변 잔기 또는 그 잔기의 기(예를 들어, 공변 잔기 쌍)을 확인할 수 있다. 본원에 사용되는, ("연결된 잔기"로도 칭해지는) "공변 잔기"는 폴리펩티드 서열 내 공변 잔기 위치에서 통계학적으로 우세한 아미노산이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 공변 방법을 사용하여, 후보 서열 내 중요한 기능성 잔기를 확인할 수 있다. 또한, 후보 폴리펩티드 내 공변 잔기의 수가 그것의 안정성을 예측하므로, 본 발명의 공변 방법을 사용하여 안정성 후보 단백질을 예측할 수 있다.
다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 공변 방법을 이용하여, 성공적인 단백질 설계를 주도할 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 공변 방법을 사용하여, 후보 서열 내 공변 아미노산을 확인할 수 있다. 공변 잔기가 존재하는 경우, 그 공변 잔기는 바람직하게 단백질 서열의 후속 조작 중에 보유된다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 본 발명의 공변 방법을 사용하여 후보 폴리펩티드 서열 내 비공변 잔기의 아미노산 위치를 확인할 수 있고, 여기에서 다른 단백질(예를 들어, 기준 세트의 서열에 상응하는 단백질) 내 상응하는 아미노산은 정상적으로 공변 아미 노산이다. 비 공변 잔기는 일단 확인되면, 상응하는 공변 잔기로 (예를 들어, 재조합 DNA 방법을 이용하여) 치환되어, 후보 폴리펩티드 서열의 기능 또는 생물물리학적 성질(예를 들어, 안정성)을 증진시킬 수 있다.
공변성 잔기 위치는 관련 폴리펩티드 서열(예를 들어, 정렬된 기준 세트 또는 다중 서열 정렬)의 데이터베이스 내 잔기 위치의 통계학적 분석(예를 들어, 상관 분석)에 의해 확인될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 공변 분석은 동일한 구조적 폴드(예를 들어, Ig 폴드)를 갖는 다양한 폴리펩티드 서열의 큐레이팅된 데이터베이스에 대한 후보 폴리펩티드 서열을 통계학적으로 비교하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 신규 공변 분석에서, 하기 기본 단계들을 이용하여, 후보 폴리펩티드의 안정성을 측정할 수 있다:
1. 후보 폴리펩티드 또는 도메인 또는 이의 일부(본원에서는 "시험 도메인 서열"로 칭함)의 서열에 상응하는 상동성 서열의 세트(본원에서는 "기준 세트"로 칭함)를 제공하는 단계.
2. 기준 세트의 서열을 정렬하여, 상동성 서열의 정렬된 세트((본원에서는 "정렬된 세트"로 칭함)를 발생시키는 단계.
3. 2개 이상의 잔기 위치(예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 쌍) 사이의 공변을 결정하여, 공변 데이터 또는 공변 데이터의 세트("공변 데이터세트")를 제공하는 단계.
4. 공변 데이터를 이용하여, 후보 폴리펩티드의 안정성을 예측하는 단계.
단계 1: 기준 세트의 제공
본 발명의 공변 방법은 관심 서열 또는 "시험 서열"에 상동적인(즉, 관련된) 서열의 세트("기준 세트")를 이용한다. 기준 세트는 시험 서열과 중간 정도 내지 높은 정도의 유사도를 갖는 상동성 서열의 세트를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 기준 세트의 상동성 서열은 중간 정도 내지 높은 정도의 아미노산 서열 유사도를 가진다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 기준 세트의 상동성 서열은 중간 정도 내지 높은 정도의 구조적 유사도를 가진다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 기준 세트의 상동성 서열은 높은 정도의 구조적 유사도를 가진다(예를 들어, 그 서열은 하나 이상의 단백질 도메인 또는 폴드를 공유함). 상동성 서열의 세트는, 합당하게 비편향 선택이 수득되는 한, 클 필요는 없다.
예시적 실시양태에서, 본 발명의 공변 방법은 큐레이팅된 기준 세트를 이용한다. 본원에 사용되는 용어 "큐레이팅된 기준 세트"는, 성분 서열이 특정 선택 기준에 따라 결실 또는 부가 서열을 가지는 기준 세트를 지칭한다. 따라서, 비큐레이팅된 기준은 성분 서열의 비편향 선택에 의해 발생되는 반면, 큐레이팅된 데이터베이스는 편향 선택에 의해 발생된다. 예를 들어, 기준 상동성 서열의 세트가 도태되어, 특정 서열, 예를 들어 중복(redundant) 서열을 제거할 수 있다. 대안적으로, 큐레이팅된 데이터베이스가 확장되어, 예를 들어 적당한 수의 비중복 또는 비동일 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 큐레이팅된 데이터베이스는 100개 이상의 서열(예를 들어, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750개 이상 서열)을 포함한다. 한 실시양태에서, 큐레이팅된 데이터베이스는 1000개 이상의 서열(예를 들어, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000개 이상 서열)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 큐레이팅된 데이터베이스는 10000개 이상의 서열(예를 들어, 10,000, 20,000, 50,000, 100,000, 250,000, 500,000, 750,000개 이상 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 큐레이팅된 데이터베이스는 1,000,000개 이상의 개별 서열(예를 들어, 1,000,000, 2,000,000, 5,000,000, 10,000,000개 이상 서열)을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 공변 방법은 50% 이상의 다양성(예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 다양성, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 다양성)을 가지는 큐레이팅된 기준 세트를 이용하여, 인위적 또는 비정보적 공변을 제거할 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "% 다양성"은 비중복 또는 동일하지 않은 기준 세트 내 서열의 퍼센티지를 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 "비중복"은 기준 세트 내 모든 다른 서열과 100% 미만 일치하는 서열, 즉 기준 세트 내 모든 다른 서열과 적어도 한 아미노산 위치에서 상이한 서열을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 기준 세트 내 모든 다른 서열과 99% 미만, 95% 미만, 90% 미만, 또는 85% 미만의 서열 일치도를 가진다. 바람직한 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 기준 세트 내 모든 다른 서열과 80% 미만의 일치도(예를 들어, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 또는 50% 미만의 서열 일치도)을 가진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 기준 세트의 모든 서열은 기준 세트 내 모든 다른 서열과 80% 미만의 서열 일치도를 가진다. 예시적 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 더 통상적인 서열 유형을 가지는 서열을 도태하는 여과 툴을 이용하여 바람직한 다양성을 가지도록 큐레이팅된다(예를 들어, 헤니코 프(Henikoff) 분류 툴). 두 서열이 길이가 동일할 경우, 헤니코프 중량에 의한 분류에 의해, 희귀한 잔기 유형을 갖는 서열이 보유되는 반면, 더욱 통상적인 잔기 유형을 갖는 서열은 폐기된다(문헌 [Henikoff 등, J. Mol . Biol ., 243: 574-578(1994)]).
다른 바람직한 실시양태에서, 기준 세트는 데이터베이스 내 다른 서열을 코딩하는 유전자가 진화적으로 근접하지 않은 유전자에 의해 코딩되는 서열을 포함한다. 예를 들어, 다양성을 증가시키기 위해, 기준 세트는, 상이한 종(예를 들어, 상이한 포유동물 종)에서 비롯된 것이나 동일하거나 유사한 생물화학적 기능을 가지는 서열인 하나 이상의 오르쏘로그 서열을 포함할 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 기준 세트는 하나의 인간 서열 및 하나 이상의 인간외 서열(예를 들어, 인간외 포유동물 서열)을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 기준 세트는 척추동물 서열(예를 들어, 곤충류(예를 들어, 드로소필라(Drosophila)) 또는 선충류(예를 들어, C. 엘레간스(elegans) 서열), 또는 진균류, 식물, 세균, 또는 바이러스 서열)에서, 포유동물 종(예를 들어, 인간, 침팬지, 개, 소, 돼지, 고양이, 래트 또는 마우스) 및 하나 이상의 포유동물외 서열(예를 들어, 포유동물외 척추동물 서열(예를 들어, 경골어류 또는 조류 서열)을 위한 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 기준 세트는 제1 서열과 동일한 종으로부터 비롯된 것이나 동일하거나 유사한 생물화학적 기능을 가지는 서열 하나 이상의 파라로그(paralog) 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 특정 역치 길이를 초과한다. 바 람직하게, 기준 세트의 서열은 20개 이상의 잔기로 된 길이(예를 들어, 25, 30, 또는 40개 잔기로 된 길이)를 가진다. 더욱 바람직하게는, 기준 세트의 서열은 50개 이상의 잔기로 된 길이(예를 들어, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95개 잔기로 된 길이)를 가진다. 더욱 더 바람직한 것은 100개 이상의 잔기로 된 길이(예를 들어, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180개 이상의 잔기로 된 길이)를 가지는 서열이다. 예시적 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 여과 툴을 이용한 여과(예를 들어, 비-갭 잔기 계수)에 의해 바람직한 길이를 위해 큐레이팅된다. 비-갭 잔기 계수를 감소시킴에 의한 등급화로, 보다 짧은 서열(예를 들어, 갭이 있는 서열)이 보다 긴 서열과 구분되어 여과되도록 확실히 한다.
서열은 당업계에 공지된 서열 데이터베이스(예를 들어, NCBI, TIGR 데이터베이스) 중 임의의 것에 대한 서열-기재 상동성 연구를 통해 수득될 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 디폴트 파라미터를 이용한 표준 BLAST 연구가 시험 서열을 이용하여 수행되어, 상동성 관심 서열을 회수할 수 있다. 시험 서열에 대해 최소 퍼센티지의 서열 일치도 %를 갖는 서열(예를 들어, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 초과의 서열 일치도, 바람직하게는 30% 초과의 서열 일치도)을 갖는 서열이 기준 세트에 포함되도록 선택될 수 있다.
특정 바람직한 실시양태에서, 기준 세트는 동일한 부류의 단백질 폴드를 갖는 단백질(예를 들어, SH3, TPR, GPCR, 세린 프로테아제, 아스파르틸 프로테아제, 글로빈, 면역글로불린, 또는 기타 폴드를 갖는 단백질)로부터의 서열을 포함하도록 큐레이팅된다. 그러한 단백질 또는 구조는 당업계에 공지된 생물정보학 기법(예를 들어, 미국립보건원의 보존 도메인 데이터베이스(CDD)를 이용한 구조-기재 연구)에 의해, 또는 원하는 SCOP 분류를 이용한 ASTRAL 데이터베이스 또는 RCSB 단백질 데이터베이스(PDB)의 연구에 의해, 확인되고 수집될 수 있다. 바람직하게, 서열은 높은 해상도에서, 예를 들어 X-선 결정도에 의해 해상된 3차원 구조를 갖는 단백질로부터 유래된다.
바람직한 실시양태에서, 수집된 구조에 상응하는 서열을 당업계에 인지된 기법을 이용하여 여과함으로써 잘못된 분류, 불완전형, 중복, 또는 도메인 스와핑 구조를 제거한다. 한 실시양태에서, 구조를 비해상 밀도 또는 도메인 스와핑으로 인해 상응하는 서열 내 파단에 대해 (예를 들어, 스위스 PDB(Swiss PDB) 뷰어를 이용하여) 시각적으로 조사한다. 결함 구조의 PDB 파일은 구조의 상응하는 세트로부터 수동 제거한다. 또 다른 실시양태에서, 수집된 구조에 상응하는 서열(예를 들어, FASTA 서열)을 여과하여, 잔여 서열의 100% 일치하거나 완전 부합되는 부분열인 임의의 서열을 제거한다. 또 다른 실시양태에서, 비정상적으로 길거나 짧은 아미노산 서열(잘못된 구조 분류의 특징)을 갖는 PDB 구조가 구조 데이터세트로부터 도태된다. 길이 한도 기준을, 예를 들어 기준 세트의 서열의 모든 서열 길이의 히스토그램을 조사함으로써 결정할 수 있다. 다른 실시양태에서, 구조를 미스폴딩에 대해 (예를 들어, 스위스 PDB 뷰어를 이용하여) 시각적으로 조사한다. 단백질 폴드의 표준 위상기하학에 순응하지 않는 임의의 구조가 바람직하게 폐기된다.
예시적 실시양태에서, 큐레이팅된 기준 세트는 단백질의 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 단백질의 면역글로불린 유형의 폴드("Ig 폴드")에 상응하는 서열 을 포함한다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, Ig 폴드는 면역글로불린 수퍼패밀리의 구분 특징이다(예를 들어, 문헌 [Bork, P., Holm, L. & Sander, C. 1994. Immunoglobulin Fold. J. Mol . Biol . 242, 309-320] 참조). Ig 폴드는 포유동물 단백질에서 종종 보이고, 각종 기능들, 특히 단백질-단백질 상호작용에 대한 기반으로 작용한다. 예를 들어, 모든 면역글로불린 및 대부분의 면역글로불린 수용체가 다중 Ig-폴드 도메인으로 구성된다. Ig 폴드는 C1, C2, I, 및 V를 포함한 수가지 서브패밀리로 하위구분될 수 있다. 모든 서브패밀리의 구성원들이 격자무늬 위상기하학의 2-β 시이트를 포함하나, 이 서브패밀리는 각 시이트 상의 β-가닥의 수 및 β-시이트를 가로지르는 연결에 의해 차이가 난다(예를 들어, 문헌 [AF Williams, Immunology Today, 8, (1987)] 참조). 각 부류의 Ig 폴드의 대표적인 구조가 도 73에 나와 있다.
한 실시양태에서, 기준 세트는 세포 부착 단백질, 인테그린, 알레르기원, T-세포 수용체, 주 조직적합 복합체 단백질(예를 들어, MHC 제I 부류 또는 MHC 제II 부류 단백질), 면역글로불린 수용체(예를 들어, Fc 감마 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRIIa)), 및 면역글로불린(예를 들어, IgG, IgM, IgA, 또는 IgE 면역글로불린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린 수퍼패밀리 단백질의 Ig-폴드 서열을 포함한다.
특정 바람직한 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 모두 Ig-폴드 또는 이의 일부에 상응한다. 한 실시양태에서, Ig-폴드는 C1 폴드이다. 또 다른 실시양태에서, Ig-폴드는 C2-폴드이다. 또 다른 실시양태에서, Ig-폴드는 V-폴드이다. 또 다 른 실시양태에서, Ig-폴드는 I-폴드이다. 또 다른 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 모두 C1 폴드에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 모두 C2-폴드에 상응한다. 또 다른 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 모두 I-폴드에 상응한다. 특정 바람직한 실시양태에서, Ig-폴드 기준 세트의 서열은 약 75 내지 약 150 잔기로 된 길이 내에 속한다.
단계 2: 기준 세트의 정렬
제2 단계에서, 기준 세트의 서열이 정확하게 정렬되어, 서열의 정렬된 세트 (또는 정렬)를 발생시킨다. 한 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 서열 정렬 알고리즘(예를 들어, LALIGN 또는 BLAST 및 상기 기재된 기타 당업계에 인지된 정렬)을 이용하여 정렬되어, 서열의 정렬된 세트(여기에서는, "서열-기재 서열 정렬")를 발생시킨다. 또 다른 실시양태에서, 기준 세트의 서열에 상응하는 구조를 구조 정렬 알고리즘(예를 들어, 슈뢰딩거 구축정렬 팩키지(Schrodinger structalign package)를 이용한 2차 구조 매칭(Secondary Structure Matching(SSM))를 이용하여 정렬하여, 구조의 정렬된 세트(여기에서는, "구조 정렬")를 발생시킨다. 바람직하게, 구조 정렬 알고리즘은 개입 루핑 대신에 각 구조의 코어 영역(예를 들어, β 가닥)이 정렬되도록 확실히 한다. 또 다른 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 구조-기재 방법에 의해(예를 들어, 하나의 중첩된 구조로부터의 아미노산을 폴리펩티드 골격의 α-탄소들 간의 최단 거리에 기초하여 또 다른 중첩된 구조의 아미노산에 매칭함에 의해, 예를 들어 슈뢰딩거 팩키지에 의해) 정렬된다.
또 다른 실시양태에서, 기준 세트의 서열은 서열-기재 및 구조-기재 정렬 알 고리즘 모두에 의해 정렬된다. 바람직하게, 기준 세트의 서열에 상응하는 구조는 먼저 구조-기재 정렬 알고리즘 또는 기타 구조-지정 정렬 툴을 이용하여 정렬된 후, 서열-기재 알고리즘의 상응하는 서열의 정렬이 이어진다. 더욱 바람직하게는, 기준 세트의 서열에 상응하는 구조가 먼저 정렬된 후, 구조-기재 서열 정렬을 이용한 서열의 정렬이 이어진다.
특정 임의적 실시양태에서, 서열의 정렬된 세트는 추가로 큐레이팅된다. 예를 들어, 서열의 정렬된 세트가 (예를 들어, 비-갭 분류 또는 헤니코프 분류에 의해) 확장되어, 그 다양성을 증가시킬 수 있다(이로써, 예를 들어 동일한 폴드를 갖는 균질 서열의 매우 큰 서열을 수득함). 다른 실시양태에서, 서열의 정렬된 세트를 수회 큐레이션에 추가 적용한 후, 임의적으로 추가 정열(예를 들어, 구조-기재 정렬)에 적용할 수 있다.
특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 비교적 적은 수의 서열을 함유하는 정렬된 세트를 큐레이팅하여, 그 다양성을 증진시키는 방법을 제공한다. 정렬 내 서열의 수를 증가시킴으로써 공변 분석의 확고성이 증가된다. 한 실시양태에서, 방법은 발견적 방법으로 유래된 모델 또는 프로파일을 이용하여, 크고 큰 공공연하게 입수가능한 서열 데이터베이스(예를 들어, NCBI에 의해 유지되는 NR 데이터베이스)로부터의 부가적 상동성 서열에 대해 연구할 수 있다. 발견적 방법으로 유래된 모델은 예를 들어 부분최소자승법 회귀, 다중 선형 회귀, 역최소자승 회귀, 주요 성분 회귀, 프로젝션 가변 중요도 등으로부터 선택되는 하나 이상의 회귀-기재 알고리즘을 이용하여 생성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 발견적 방법으로 유래된 모 델은, 예를 들어 히든 마르코프(Hidden Markov) 모델, 스미쓰 워터맨(Smith Waterman) 알고리즘, 신경망, 분류 및 회귀 트리, 다변량 적응 회귀 스플라인 등에서 선택되는 하나 이상의 패턴-기재 알고리즘을 이용하여 생성된다. 한 예시적 실시양태에서, 패턴 인식 알고리즘은 히든 마르코프 모델(Hidden Markov Model; HMM)이다. HMM은, 모델링하는 시스템이 관찰가능한 파라미터를 이용하여 추출되어 패턴 인식의 분석을 위해 이용될 수 있는 히든 파라미터를 포함하는 통계학적 모델이다. 예를 들어, 당업계에 인지된 HMM가 예측된 2차 구조를 이용하여, 순수 서열-기재 관련성을 갖는 항체가 아닌, 소정의 항체로서 동일한 폴드의 항체에 대해 연구할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Proteins 36(1), 68-76] 참조). 메타팜(MetaFam)(Silverstein 등, Nucleic Acids Res 29(1), 49-51(2001)), 인터프로(Interpro)(Apweiler 등, Nucleic Acids Res , 29(1), 37-40(2001)), HMMER(Bateman 등, Nucleic Acids Res 27(1), 260-2(1999))이 예시적 HMM-기재 패턴 인식 툴이다.
특정 부가적 실시양태에서, HMM 알고리즘으로 추출된 서열을, 당업계에 인지된 생체정보학 소프트웨어를 이용하여 적절한 구조 분류 지정에 대해 확인할 수 있다. 예시적 확인 툴은 웰컴 트러스트 생거 인스티튜트(Wellcome Trust Sanger Institute)에 의해 관리되는 PFAM 분류 툴이고, 이는 인터넷 상에서 공공연하게 입수가능하다. 예를 들어, PFAM 툴 'pfamverify'를 각기 추출된 서열에 적용하여, 그것이 구조-기재 구조 정렬로부터 생성된 부류-특이적 HMM에 의해 올바로 분류되었음을 확인할 수 있다(Finn 등, Nucleic Acids Res, 24(데이터베이스판), D247-51, (2006). PFAM 패밀리(또는 단백질의 관련 패밀리, 예를 들어 Ig-폴드 패밀리)에 상응하는 HMM 프로파일을 PFAM 웹사이트로부터 다운로딩하여, 추출된 서열의 스코어링을 용이하게 할 수 있다. 스코어가 권장 한도(cutoff) 미만인, 추출된 서열이 기준 세트로부터 바람직하게 제거된다.
다른 실시양태에서, HMM 알고리즘으로부터 추출된 서열은 또한 HMMC 알고리즘을 이용하여 정렬될 수 있다. 이 HMM 알고리즘은 정확한 구조 정렬에 기초하기 때문에, 이 과정은 부가적 추출된 서열의 구조 지정 정렬을 보장한다. 예를 들어, HMMER 팩키지를 이용하여 FASTA 출력 포맷으로 'mapali' 정렬을 생성시킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 정렬된 세트의 서열과 유사한 서열을 찾을 뿐만 아니라 올바른 코어 영역 정렬을 보장하는 신규 서열을 정렬시키는 신규 HMM을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 신규 HMM 알고리즘은 단일 단백질(예를 들어, 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원) 내 분리된 도메인(예를 들어, Ig-폴드 도메인)을 검색하여, 각 도메인을 분리하여 추출하여, 그것을 서열의 정렬된 세트에 부가할 수 있다. HMM 알고리즘 또는 프로파일은, (예를 들어, 인터넷 상에서, 예를 들어 www.psc.edu에서 공공연하게 입수가능한 HMMER 소프트웨어 팩키지를 이용하여) 구조-기재 서열 정렬로부터 구축될 수 있다. 각 구조-특이적 HMM 검색에 대해, 기준 스코어 역치 위의 히트 서열이 HMM이 사용된 구조적 부류의 후보 구성원으로서 바람직하게 보유된다. 히트 서열의 부분서열인 히트 영역에 대해, 추출 부분서열 히트를 전체 서열로부터 추출할 수 있다.
다른 예시적 실시양태에서, 본 발명은 서열의 정렬된 세트를 큐레이팅하여 그 중복성을 감소시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 구조적으로 정렬된 세트(예를 들어, Ig-폴드 정렬 세트) 내의 다수의 서열이 서열의 풍부한 공급원을 나타내나, 일부 서브패밀리(예를 들어, 특정 Ig-폴드 하위부류)가 매우 과다표시될 수 있고, 한편 다른 것들은 매우 과소표시될 수 있다. 과다표시 또는 과소표시는 근접한 공통 조상으로 인해 유의적 편향을 초래하고, 공변 분석의 전체 유용성을 제한한다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 정렬을 추가 여과 단계에 적용하여, 정렬 중복성을 감소시킨다. 바람직한 실시양태에서, 또 다른 서열에 대한 90% 초과 일치도(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 일치도)을 갖는 하나 이상의 서열을 정렬로부터 제거한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 또 다른 서열과 80% 초과의 서열 일치도(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 87%, 88%, 89%, 또는 90% 서열 일치도)을 갖는 하나 이상의 서열이 정렬로부터 제거된다.
예시적 실시양태에서, 본 발명은 정렬 내 중복성을 감소시키는 신규 방법을 제공한다. 그러한 방법은 발견적 방법의 알고리즘을 이용하여 원하는 서열 일치도 한도의 서열을 찾고 등급화하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 하기 순차적 단계들 중 하나 이상을 포함한다: (1) 정렬 내 모든 쌍에 대한 일치도(%)를 계산하는 단계; (2) 일치도(%)의 하나 이상의 빈(bin)에 일치도 값들을 군으로 분류하는 단계; (3) 비-갭 잔기 계수 및/또는 헤니코프 서열 중량을 감소시킴으로써 각 빈의 서열을 등급화하는 단계; 및 (4) 한도 기준(예를 들어, % 일치도 한도 수준)에 따라 중복 서열을 제거하는 단계.
중복 서열의 제거는 수많은 방식들로 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 등 급화된 서열을 서열 일치도의 다중 빈(예를 들어, 99% 빈, 98% 빈, 97% 빈 등)의 군들로 분류한다. 이어서, 서열을 최고의 % 일치도 빈으로부터의 등급 순에 따라(예를 들어, 먼저 최고의 등급의 서열부터, 즉 99% 빈, 이어서 98% 빈, 이어서 97% 빈 등), 계통적으로 제거한다. 일치도 계산, 군 분류 및/또는 등급화 단계(단계 (1) 내지 (3))를, 한도 기준을 충족하는 최종 빈이 제거될 때까지 각 제거 후에 임의적으로 반복된다. 또 다른 실시양태에서, 등급화된 서열의 단일 빈(bin)을 한도 기준에서 생성시키고, 서열을 빈으로부터 등급화에 의해 계통적으로 제거한다. 일치도 계산 및/또는 등급화 단계(단계 (1) 및 (3))가 각 제거 단계 후에 임의적으로 반복된다.
바람직한 실시양태에서, 한도 기준은 90% 이상(예를 들어, 91%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 일치도)이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 한도 기준은 80% 이상(예를 들어, 81%, 82%, 83%, 84%, 87%, 88%, 89%, 또는 90% 서열 일치도)이다.
또 다른 임의적 단계에서, 정렬된 기준 세트 내 서열의 길이는 절단될 수 있다. 한 실시양태에서, 정렬 내 갭이 있는 영역이 제거되어, 이 정보성이 덜한 영역에 대한 계산을 피할 수 있다. 예를 들어, 서열을 찾는 세 사용되는 HMM 프로파일 내 매치 상태가 아닌 열을 제거할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 정렬의 일치 길이와 중첩되지 않는 정렬 내 서열을 회수하여, 서열의 과잉 부분을 제거한다. 다른 실시양태에서, 중첩 서열이 정렬에서 제거된다.
단계 3: 정렬 세트의 공변 분산
일단 서열의 정렬된 세트가 수집되면, 공변 분석이 정렬 세트 내 아미노산 잔기의 하나 이상의 쌍에 대해 수행된다. 공변 분석에 의해 정렬 내 관련 잔기의 통계학적 유의성을 설명하는 신규 데이터세트(여기에서는, "공변 데이터세트")가 생성된다. 특정 실시양태에서, 공변 데이터세트는 정렬 내 잔기의 모든 가능한 쌍 간의 상관을 열거한다.
바람직한 실시양태에서, 공변의 연산은 컴퓨터 실행 과정(예를 들어, Java-수행가능한 과정)이다. 공변의 연산은 수가지 당업계에 인지된 통계학적 파라미터들을 초래할 수 있다. 한 실시양태에서, 공변의 통계학적 유의성(예를 들어, χ2-값)이 Chi-자승 분석에 의해 계산된다. 또 다른 실시양태에서, 공변의 통계학적 강도(예를 들어, φ 값)가 계산된다. 예를 들어, 음성 φ 값으로 음성 상관을 예측할 수 있다. 즉, 정렬 내 제1 위치에서의 하나의 아미노산의 존재는 제2 위치에서의 또 다른 특이적 아미노산의 부재를 선호한다. 그와 반대로, 양성 φ 값으로 양성 상관을 예측할 수 있는데, 이는 정렬 내 제1 위치에서의 아미노산이 제2 위치에서의 아미노산의 존재를 선호함을 가리킨다.
한 실시양태에서, φ 값은 하기 식 I을 이용하여 계산된다:
Figure 112008072289549-pct00002
(식 중에서,
aibj는 "a" 또는 "b" 유형의 잔기가 각기 위치 i 및 j에서 동일한 서열 내 발견되는 회수이고;
Figure 112008072289549-pct00003
는 양 잔기가 동일한 서열 내에서 부재하는 회수이며;
Figure 112008072289549-pct00004
는 a는 존재하나 b는 부재하는 회수이고;
Figure 112008072289549-pct00005
는 a는 부재하나 b는 존재하는 회수임).
한 실시양태에서, φ 값은 하기 식 II을 이용하여 계산된다:
Figure 112008072289549-pct00006
(식 중에서, c 내지 j는 하기 행렬에 의해 정해지고:
Figure 112008072289549-pct00007
Figure 112008072289549-pct00008
이 때,
Figure 112008072289549-pct00009
임).
특정 실시양태에서, χ2-값은 "발생 빈도"를 이용하여 계산될 수 있다. 다른 실시양태에서, χ2-값은 "이벤트(event)-기재" 식(즉, 발생수)을 이용하여 계산된다. 예시적 이벤트-기재 식은 식 III으로 표시된다:
Figure 112008072289549-pct00010
(식 중에서,
p(i) 및 p(j)는 서열의 정렬된 세트 내 각기 위치 i 및 j에서의 임의의 두 관심 잔기 유형의 잔기 빈도이고;
c(i,j)는 p(i) 및 p(j)가 동일한 서열에서 관찰되는 회수이며;
c(t)는 정렬 내 총 서열의 수임
(여기에서, 잔기 빈도는 잔기 유형이 정렬 내 특이적 위치에서 관찰되는 회수를 정렬 내 서열의 총 수로 나눈 값으로 정의됨).
특정 실시양태에서, 단지 천연 아미노산 잔기만이 공변 계산의 목적을 위한 "잔기 유형"으로 간주된다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 잔기 유형은 또한 구분된 잔기 유형으로서의 갭을 포함할 수 있는데, 이는 갭(특히 루프 부분 내)은 종종 상호 간에 한 모티프를 구별하는 것을 돕기 때문이다.
특정 실시양태에서, 공변 계산은 다양성 가중(weighting) 함수(예를 들어, 헤니코프 가중 방식)을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 서열 평균 일치도(SAI)를 사용하여 공변하는 쌍을 여과해낼 수 있다. 예를 들어, 밀접히 관련된 서열로부터 일어나는 잠재적 인공 공변을 제거하기 위해, SAI를 사용하여 평균 초과의 서열 일치도를 갖는 쌍으로부터 공변을 여과해낼 수 있다. 정렬을 고 일치도 역치(예를 들어, 한도 기준으로서의 80 일치도 %)에 적용한 실시양태에서는 SAI 계산은 바람직하게 불필요하다.
특정 실시양태에서, 공변하는 쌍은, 최소 회수 여기에서는, "이벤트 한도")로 관찰되지 않는 한, 계산에 의해 보고되지 않는다. 한 실시양태에서, 이벤트 한도는 10회 이상 이벤트다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 약 2회 이상 및 10회 미만의 이벤트(예를 들어, 9, 8, 7, 6, 또는 5회 이벤트)의 이벤트 한도를 가진다.
단계 4: 공변 데이터를 이용한 단백질 안정성의 예측
특정 실시양태에서, 공변 데이터세트 내의 통계학적으로 유의적 공변을 사용하여, 후보 또는 시험 서열 내 상응하는 공변을 검색한다. 특히, 후보 또는 시험 서열 내 상응하는 아미노산 위치에서의 기준 세트의 하나 이상의 공변성 아미노산의 보존은, 이 잔기가 기능적으로 중요하고 바람직한 단백질 안정성을 예측함을 가리킨다. 따라서, 후보 또는 시험 서열 내 보존되는 공변성 아미노산의 수를 이용하여, 서열의 안정성을 예측할 수 있다.
특정 예시적 측면에서, 관련 공변을 공변 데이터세트의 분석을 위해 본 발명의 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)(예를 들어, 하기 단락 V에 기재된 NAPMAP 툴)을 이용하여 가시화할 수 있다. 공변 데이터세트 내 데이터의 해석이 번거로울 수 있기 때문에, 그래픽 사용자 인터페이스는 데이터 분석을 용이하게 하고 급속 단백질 설계 및 기능성 분석을 도모할 수 있다.
예시적 실시양태에서, 후보 서열 내 존재하거나 부재하는, 기준 세트 또는 정렬 내 공변성 잔기의 존재 또는 부재를 이용하여, 단백질 안정성과 상관되는 스코어를 확립할 수 있다. 예를 들어, 잔기의 공변성(예를 들어, 양성적으로 공변성) 쌍이 후보 서열 내에 보유되는 것으로 나타나는 제1 스코어(예를 들어, 양성 스코 어)가 후보 서열에 지정될 수 있다. 그와 반대로, 잔기의 공변성(예를 들어, 양성적으로 공변성) 쌍이 후보 서열에 없는 경우, 제1 스코어(예를 들어, 음성 스코어)와 반대되는 표시인 양성 제2 스코어가 후보 서열에 지정될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, 시험 서열 내 잔기의 음성적으로 공변성인 쌍의 부재가 양성 스코어로 지정되는 반면, 잔기의 음성적으로 공변성인 쌍의 존재는 음성 스코어로 지정된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 시험 서열의 잔기의 양성적으로 공변성인 쌍의 존재는 양성 스코어로 지정되는 반면, 시험 서열 잔기의 양성적으로 공변성인 쌍의 부재는 음성 스코어로 지정된다.
특정 실시양태에서, 공변 스코어는 통계학적 유의성의 역치 수준을 충족하는 공변에 대해서만 생성된다. 한 실시양태에서, 공변 스코어는 특정 χ2-값 또는 φ 값 초과 (또는 이하)의 공변에 대해서만 생성된다. 예를 들어, 음성 공변 스코어의 표시 한도는 +0.2 미만(약 +0.2 내지 약 -1.0), 더욱 바람직하게는 -0.2 미만의 파이 연관 계수(Φ)를 갖는 공변일 수 있다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 공변은, 그것이 -0.2 초과의 파이 연관 계수, 바람직하게는 +0.2 초과의 파이 연관 계수를 가질 경우, 양성 공변 스코어로 지정된다. 바람직한 실시양태에서, 음성 공변 스코어는 -0.5 미만(예를 들어, -0.5, -0.6, -0.7, -0.8, -0.9, 또는 -1.0)의 파이 연관 계수(Φ)를 갖는 공변에 대해 지정되고, 양성 공변 스코어는 +0.5 초과(예를 들어, +0.5, +0.6, +0.7, +0.8, +0.9, 또는 +1.0)의 파이 연관 계수(Φ)를 갖는 공변에 대해 지정되며, 한편 다른 모든 공변들은 중성 스코어(예를 들어, 0)을 지정함 으로써 마스킹된다.
특정 실시양태에서, 음성 또는 양성 공변 스코어를 가중하여, 상응하는 공변의 통계학적 유의성 또는 강도를 반영할 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 양성 공변은, 그것의 파이 연관 계수가 또한 높은 경우, 높은 양성 공변 스코어로 지정될 수 있거나, φ 값이 낮은 경우에는 보다 낮은 양성 공변 스코어로 지정될 수 있다. 예를 들어, 각각의 φ 값이 +0.5 및 +1.0인 제1 및 제2 공변을 갖는 후보 서열은, 제1 공변에 대해서는 낮은 양성 공변 스코어(예를 들어, +1)로 지정될 수 있고, 제2 공변에 대해서는 보다 높은 양성 공변 스코어(예를 들어, +2)로 지정될 수 있다.
다른 실시양태에서, 공변 스코어가 단지 계산된 통계학적 유의성 외의 수단에 의해 확인되는 공변에만 지정된다. 수가지 비통계학적 기준들을 사용하여, 계산된 공변이 유의적이고 생물학적으로 의미있음을 확인할 수 있다. 한 실시양태에서, 공변은 상응하는 단백질의 구조적 모델 내 상호에 대해 공변하는 잔기 간의 상관 또는 경향, 및 상호에 대한 근접성의 유무를 조사함으로써 확인된다. 상기 잔기가 구조 내 상호에 대해 근접성(예를 들어, 30 Å 이하, 바람직하게는 10 Å 이하)을 가지는 경우, 예측된 공변은 진정(true) 공변으로 확인된다. 또 다른 실시양태에서, 공변은, 공변하는 아미노산이 기준 세트의 서열에 상응하는 단백질의 부분집합 내에 존재하는 것으로 이미 알려진 연결(예를 들어, 공지된 디술피드 결합)을 형성하는지의 여부를 결정함으로써 확인된다. 예를 들어, 인간 또는 쥐 IgG 가변 중쇄 폴드의 N-말단에 있는 잔기 6-10은 아미노산의 공변하는 쌍의 보존에 기초한 매우 특이적인 구조를 채택하는 것으로 알려져 있다(Ewert 등, Methods, 34:184-199(2004)).
또 다른 실시양태에서, 후보 서열 내 아미노산의 공변 스코어가 가중되어, 만족하는 (또는 위반하는) 기준 세트 또는 정렬 내 공변의 수를 반영할 수 있다. 한 실시양태에서, 후보 서열은 만족되는 기준 세트 또는 정렬 내 각 공변은 양성 공변 스코어로 지정되고, 한편 위반되는 기준 세트 내 각 공변은 음성 공변 스코어로 지정된다. 바람직한 실시양태에서, 시험 서열의 특별한 아미노산에 대한 공변 스코어는 음성 공변 스코어의 합계에 의한 양성 공변 스코어의 합계이다. 예를 들어, 2 음성 공변 및 9 양성 공변이 후보 서열의 아미노산에 상응하는 아미노산 위치에서의 기준 세트 내에서 관찰되는 경우, 후보 서열 아미노산이 7의 총 공변 스코어로 지정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 총 공변 스코어는 후보 서열 내 모든 아미노산 (또는 이의 일부)에 대해 합산하여, "서열 공변 스코어"를 수득한다. 이 서열 공변 스코어를 이용하여, 서열의 안정성을 예측할 수 있다. 일반적으로, 음성 서열 공변 스코어로 낮은 단백질 안정성이 예측되고, 반면 양성 서열 공변 스코어로 높은 단백질 안정성이 예측된다.
b. 일치 스코어링
다른 실시양태에서, 본 발명의 전산 방법은 관련 폴리펩티드 서열의 데이터베이스에 대해 후보 폴리펩티드 서열을 비교하여 잠재적으로 낮은 안정성을 갖는 단백질을 확인하는 "일치-기재 스코어링"으로 일컬어지는 신규 스코어링 기법을 이 용한다. 본원에 사용되는 "일치-기재 스코어링"은 관련 단백질의 서열 수집으로부터 이용가능한 정보에 기초하여 단백질(예를 들어, 시험 단백질) 내 비일치 아미노산의 수를 계산하는 것을 지칭한다. 계산에 의해, 단백질에 대한 "일치 스코어"를 수득한다. 하기 실시예에서 보여지는 바와 같이, 단백질의 일치 스코어는 실험적으로 결정되는 그것의 단백질 안정성과 매우 상관성이 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 일치-기재 스코어링을 이용하여 단백질 안정성을 예측하는 것이다. 일치 서열로부터 시험 단백질 서열의 이탈이 클수록, 일치 스코어가 보다 높을수록, 또한 시험 단백질이 그것의 안정성에 유해한 단백질을 함유할 가능성이 더 커진다.
본원에 기재된 신규 일치 스코어링 접근법에서, 하기 기본 단계들을 취하여, 후보 또는 시험 단백질의 안정성을 예측한다:
1. 후보 단백질의 도메인 (또는 이의 일부)의 서열(여기에서는 "시험 도메인 서열")에 상응하는 상동성 서열의 세트(여기에서는, "기준 세트")를 제공하는 단계.
2. 시험 도메인 서열 (또는 이의 일부) 내 모든 잔기 위치에서의 잔기 빈도를 결정하여 일치 스코어를 수득하는 단계.
3. 일치 스코어를 이용하여 후보 또는 시험 단백질의 안정성을 예측하는 단계.
특정 예시적 실시양태에서, 하기 임의적 단계들을 이용하여 일치 스코어의 예측 값을 증가시킨다:
4. 기준 세트의 모든 서열 (또는 이의 부분집합) 내 모든 상응하는 잔기 위 치에서의 잔기 빈도를 결정하여 평균 스코어를 수득하는 단계.
5. 일치 스코어를 평균 일치 스코어와 비교하여 서열 스코어를 결정하는 단계.
6. 서열 스코어를 이용하여 후보 또는 시험 단백질의 안정성을 예측하는 단계.
단계 1: 기준 세트의 제공
본 발명의 일치 스코어링 기재 방법은 관심 서열 또는 "시험 서열"에 상동적인(즉, 관련된) 서열의 세트("기준 세트")를 이용한다. 기준 세트는 시험 서열과 중간 정도 내지 높은 정도의 유사도를 갖는 상동성 서열의 세트를 포함할 수 있다.
상동성 서열의 세트는 적당한 수의 비중복 서열을 포함하는 것으로 당업자에 의해 결정될 수 있다. 상동성 서열의 세트는 합당히 편향적인 선택이 수득되는 한, 클 필요는 없다. 중요한 것은 서열의 수가 아니라 빈도율이다.
그러한 서열은 당업계에 공지된 서열 데이터베이스(예를 들어, NCBI, TIGR 데이터베이스) 중 임의의 것의 상동성-기재 검색을 통해 수득될 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 디폴트 파라미터를 이용한 표준 BLAST 검색은 시험 서열을 이용하여 수행하여, 상동성 관심 서열을 복원할 수 있다. 기준 세트에 내에 포함되기 위한, 최소 서열 일치도%(예를 들어, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 초과의 서열 일치도, 바람직하게는 30% 초과의 서열 일치도)를 갖는 서열을 선택할 수 있다. 특정 실시양태에서, 높은 정도의 서열 일치도(예를 들어, 85%, 90%, 95%, 또는 98% 초과의 서열 일치도, 바람직하게는 95% 초과의 서열 일치도)를 갖는 서열을 기준 세트에서 제외시켜 편향을 피한다.
특정 실시양태에서, 기준 세트를, 세트 내에 포함되도록 하기 위한 하나 이상의 기준을 충족하는 서열만을 포함하도록 큐레이팅할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 기준 세트는 오르쏘로그 서열(예를 들어, 상이한 종(예를 들어, 상이한 포유동물 종)에서 비롯되나 동일한 생물화학적 기능을 가지는 서열)을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 기준 세트는 인간 서열을 포함한다. 한 예시적 실시양태에서, 상동성 서열의 세트는 포유동물 배아세포주 서열만을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 기준 세트는 시험 단백질(예를 들어, 면역글로불린 유형의 폴드를 갖는 단백질)과 동일한 부류의 단백질 폴드(예를 들어, 유사한 단백질 도메인)를 갖는 단백질로부터의 서열을 포함한다. 그러한 단백질은 당업계에 공지된 생물정보학 기법(예를 들어, 미국립보건원의 보존 도메인 데이터베이스(CDD) 검색)에 의해 확인될 수 있다.
단계 2: 시험 서열의 일치 스코어 결정
일단 기준 세트의 서열이 수집되면, 기준 세트의 일치 서열을 결정하여 본 발명의 일치 스코어링 방법을 도모한다. 본원에 사용되는 용어 "일치 서열"은 서열 내 각 위치에서의 잔기(예를 들어, 아미노산 잔기)가 관련 서열의 정렬된 세트(즉, 기준 세트) 내 위치에 있는 대부분의 공통 잔기에 상응하는 서열을 지칭한다.
일치 서열을 결정하기 위해, 기준 세트 내 서열을 먼저 당업계에 공지된 서열 정렬 알고리즘을 이용하여 정렬시킬 수 있다. 서열의 비교를 위해 이용되는, 한 바람직한 비제한적 예는 문헌 [Karlin 및 Altschul(1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:2264-68]의 알고리즘이며, 이는 문헌 [Karlin 및 Altschul(1993) Proc . Natl. Acad . Sci . USA 90:5858-77]에서와 같이 변형된다. 그러한 알고리즘은 [Altschul, 등(1990) J. Mol . Biol . 215:403-10]의 BLAST 프로그램(버전 2.0)에 도입된다. 또 다른 실시양태에서, 정렬을 적절한 갭을 도입함으로써 최적화하고, 일치도 %를 정렬된 서열(즉, 갭이 있는 정렬) 길이에 대해 결정한다. 비교 목적을 위한 갭이 있는 정렬을 수득하기 위해, 갭 BLAST를 문헌 [Altschul 등, (1997) Nucleic Acids Res . 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 정렬을 적절한 갭을 도입함으로써 최적화하고, 일치도 %를 정렬된 서열(즉, 전체 정렬) 전체 길이에 대해 결정한다. 서열의 전체 비교를 위해 이용되는 수학적 알고리즘의 한 바람직한 비제한적 예는 문헌 [Myers 및 Miller, CABIOS(1989)]의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 팩키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 도입된다. 아미노산 서열의 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 이용할 때, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티, 및 4의 갭 패널티를 사용할 수 있다.
기준의 정렬된 세트의 일치 서열을 결정하기 위해, 기준의 정렬된 세트 내 각 위치에서의 가장 빈번히 발생하는 잔기를 결정한다. 일치 서열을 시각적으로 결정하거나, 공공연하게 입수가능한 생물정보학 프로그램(예를 들어, 미국립보건원의 헬릭스 시스템즈(Helix Systems)로부터 입수가능한 EMBOSS CONS 툴)을 이용하여 전산 분석에 의해 결정할 수 있다.
일치 서열을 본 발명의 방법에 이용하여 일치 스코어를 결정할 수 있다. 특 정 실시양태에서, 일치 스코어는, 일치 서열 내 각 아미노산 위치에서의 일치 잔기의 기준 세트 내 잔기 빈도 또는 발생율(즉, "일치 잔기 빈도")이 시험 서열 내 각 아미노산 위치에서의 일치 잔기의 기준 세트 내 잔기 빈도 또는 발생율(즉, "시험 잔기 빈도")과 일치함을 가리키는 수치값이다. 시험 또는 일치 서열 내 위치에서의 잔기 빈도는 그 위치에서의 아미노산이 정렬된 기준 세트 내 상응하는 위치에 존재하는 회수를 합산하여, 합계를 기준 세트 내 서열의 총수로 나눔으로써 계산된다. 한 예시적 실시양태에서, 각 아미노산 위치에서의 일치 스코어는 시험 잔기 빈도를 일치 잔기 빈도로 나누어 1과 0 사이의 0이 아닌 스코어를 산출함으로써 계산된다. 예를 들어, 그 위치에서의 일치 아미노산과 일치하는 잔기는 1의 완점 스코어로 지정되고, 반면 일치 스코어가 0에 근접할수록 아미노산이 그 위치에 있을 가능성이 덜하다.
특정 바람직한 실시양태에서, 일치 스코어를 시험 서열 (또는 이의 일부)의 각 위치에 대해 합산하여 총 일치 스코어를 수득할 수 있다. 예를 들어, 완점 총 일치 스코어는 시험 서열이 그것의 상응하는 일치 서열과 일치함을 가리키는 시험 서열 내 아미노산의 수이다.
단백질의 총 일치 스코어를 계산하기 위한 한 예시적 식이 이하 나와 있다:
Figure 112008072289549-pct00011
(여기에서,
c i (r)는 일치 서열의 일치 아미노산 위치에서의 일치 잔기 빈도이고,
h i (r)은 시험 서열의 아미노산 위치의 시험 잔기 빈도이며,
i는 시험 서열 내 아미노산 위치의 범호임).
단계 3: 일치 서열을 이용하는 단백질 안정성의 예측
이어서, 일치 스코어를 이용하여 시험 단백질의 안정성을 예측할 수 있다. 일반적으로, 일치 스코어의 값이 높을수록, 시험 단백질이 그의 의도된 사용에 대한 적당한 안정성을 가질 확률이 커진다. 특정 실시양태에서, 시험 단백질의 일치 스코어를 대조군 서열의 스코어와 비교할 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 대조군 서열은 약하거나 원하지 않는 안정성 성질을 가지는 것으로 알려진 단백질로부터 비롯된다(여기에서는, "음성 대조군"). 따라서, 시험 단백질은 그것의 일치 스코어가 음성 대조군의 일치 스코어보다 높을 경우에 향상된 안정성을 가지는 것으로 예측된다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 대조군 서열은 바람직한 안정성 성질을 가지는 것으로 알려진 단백질로부터 비롯된다(여기에서는, "양성 대조군"). 따라서, 시험 단백질은 그것의 일치 스코어가 양성 대조군의 일치 스코어보다 실질적으로 유사하거나 더 높을 경우에 향상된 안정성을 가지는 것으로 예측된다. 다른 실시양태에서, 시험 서열의 일치 스코어를, 시험 서열 내 아미노산의 총수에 상응하는 그 서열의 가설적 완점 일치 스코어와 비교할 수 있다.
단계 4: 기준 세트의 평균 일치 스코어의 결정
특정 실시양태에서, 기준 세트 내 서열의 아미노산 위치의 일부 또는 모두에 서의 평균 일치 스코어를 결정하여, 시험 서열 내 상응하는 위치에서의 일치 스코어와 비교한다. 바람직한 실시양태에서, 기준 세트에 대한 평균 총 일치 스코어를 구하여, 시험 서열의 총 일치 스코어와 비교한다. 기준 세트에 대한 평균 총 일치 스코어는 기준 세트 내 서열의 모든 아미노산 위치에서의 잔기 빈도의 합계를 그 기준 세트 내 서열의 총수로 나눈 것이다.
단계 5: 서열 스코어의 결정
특정 실시양태에서, 서열 스코어는 기준 세트의 평균 일치 스코어를 시험 서열의 일치 스코어와 비교함으로써 결정된다. 이 값의 미분은 시험 서열의 "서열 스코어"(또는 본원에서는 "Δ 스코어"로 지칭됨)이다. 서열 스코어는 평균 일치 스코어로부터 일치 스코어를 뺌으로써 결정될 수 있다.
단계 6: 서열 스코어를 이용한 단백질 안정성의 예측
서열 스코어는 기준 세트의 평균 일치 스코어로부터의 시험 서열의 일치 스코어의 분산의 척도를 제공한다. 하기 실시예는 단백질의 서열 스코어가 단백질의 안정성(예를 들어, 열 안정성)과 매우 상관됨을 입증한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 서열 스코어를 또한 사용하여 단백질의 안정성을 예측할 수 있다. 단백질의 Δ 스코어가 음성 값인 경우(즉, 일치 스코어가 평균 일치 스코어보다 작은 경우), 관심 단백질의 안정성이 기준 세트 내 단백질 대부분보다 안정성이 더 낮은 것으로 예측된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 이용되는 시험 서열은 단일-도메인 단백질이다. 본원에 사용되는 "단일 도메인 단백질"은 각 도메인이 동일한 유형(예를 들어, 가변 중(VH) 도메인)인 하나 이상의 도메인을 포함하는 단백질이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 이용되는 시험 서열은 다중-도메인 단백질이다. 본원에 사용되는 "다중-도메인 단백질"은 2개 이상의 도메인을 포함하는 단백질(여기에서, 도메인 중 2개 이상은 상이한 유형의 것임)이다. 예를 들어, 항체는 전형적으로 6개의 도메인(즉, VH, VL, CL, CH1, CH2 및 CH3)을 포함하는 단백질이다. 바람직한 실시양태에서, 다중-도메인 단백질의 가장 덜 안정한 도메인의 안정성은 본 발명의 방법을 이용하여 예측된다. 하기 실시예는 본 발명의 방법이 다중-도메인 단백질의 가장 덜 안정한 도메인 (또는 이의 일부)(예를 들어, 항체의 VH 도메인)이 시험 서열로 이용될 때 열 안정성을 예측하는 데 특히 유효하다는 것을 입증한다.
가장 덜 안정한 도메인이 선험적으로 공지되어 있지 않는 경우, 그것은 당업계에 공지되어 있는 실험적 방법을 이용하여(예를 들어, 상기 기재된 방법들 중 임의의 방법, 예컨대 시차 주사 열량계(DSC), 온도 의존성 원편광 이색성(CD), 또는 형광도 측정을 이용하여) 결정될 수 있다. 그러한 방법은, 가장 덜 안정한 도메인이 먼저 언폴딩하거나(도 69A 참조), 협력하여 언폴딩하는 다중도메인 단위의 전체 안정성 역치를 제한하는 다중 열적 언폴딩 전이를 결정하도록 한다(즉, 단일 언폴딩 전이를 나타내는 다중도메인 단백질). 가장 덜 안정한 도메인은 다수의 부가 방식들로 확인될 수 있다. 돌연변이유발은 도메인이 전에 안정성을 제한하는 프로브에 대해 수행될 수 있다. 또한, 다중도메인 단백질의 프로테아제 내성은 가장 덜 안정한 도메인이 DSC 또는 기타 분광법을 통해 본래 언폴딩된 것으로 알려지는 조 건 하에서 수행될 수 있다(문헌 [Fontana 등, Fold . Des ., 2: R17-26, 1997]). 일단 가장 덜 안정한 도메인이 확인되면, 이 도메인을 코딩하는 서열 (또는 이의 부분)이 본 발명의 방법에서 시험 서열로 이용될 수 있다.
특정 예시적 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 평가되는 다중-도메인 단백질은 항체이다. 본 발명의 방법으로써, 당업자는 면역계의 다양성 기작에 의해 생성된 가변 영역 서열의 광위적 풀로부터 부적절한 가변 영역 도메인을 선택하는 것을 배제할 수 있다. 예시적 실시양태에서, 예를 들어 비교적 높은 안정성(예를 들어, 열 안정성)을 갖는 가변 영역(Fv) 도메인을 포함하는 항체 분자 또는 scFv 분자는 본 발명의 방법을 이용하여 확인되어 선택될 수 있다. 다른 예시적 실시양태에서, 허용가능한 안정성을 갖는 인간 면역글로불린 가변 영역(Fv) 도메인은 본 발명의 방법을 이용하여 확인되어, 항체의 인간화에서 어셉터 면역글로불린 사슬로서 사용될 수 있다. 다른 예시적 실시양태에서, 후보 서열을 포함하는 결합 분자의 합성으로 진행하기 전에, 적절한 안정성에 대해 후보 조작된 항체 가변 서열(예를 들어, 인간화 VL 또는 VH 서열)을 선별하기 위해 본 발명의 방법을 이용할 수 있다.
당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 단백질 안정성은 천연 또는 조작된 항체에서의 많은 가능한 변동들에 기초하여 항체별로 다양하다. 예를 들어, 천연 항체의 가변 도메인 내의 다양성을 생성시키는 면역계의 선택적 압력은 재조합 발현 시스템 내 그것의 안정성 또는 폴딩가능성에 부정적 영향을 줄 수 있다(문헌 [Knappik 및 Pluckthun, Protein Engng ., 8:81-89, (1995)]; 문헌 [Wall 및 Pluckthun, Protein Engng, 12: 605-11(1999)]; [Knappik 등, J. Mol . Biol ., 296: 57-86, (2000)]; [Ewert 등, J. Mol . Biol . 3325: 531-33, (2003)]). 항체 치료제에 가장 통상적으로 사용되는, 동일한 이소타입 및 하위부류로 이루어진 항체인 인간 IgG1은, 주로 그것의 가변 도메인 내 차이로 인해 각기 안정성이 다양하며, 이는 그 외 나머지 서열은 동일하기 때문이다. 항체 Fab 단편의 열 언폴딩은 단일의 가시적 전이에서 주로 일어난다. 대부분의 경우들에서, 항체 Fv 영역은 Fv (또는 단일 VH 또는 VL) 안정성이 극히 낮거나 극히 높고, Fv 언폴딩 전이가 CH1/CL 영역의 그러한 전이와 분리되는 드문 경우를 제외하고는, Fab의 전체 열안정성을 제한한다(문헌 [Shimba 등, 1995]; 문헌 [Rothlisberger 등, 2005]).
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 시험 서열로서 항체의 가변 영역 서열을 이용한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 시험 서열로서 중쇄 가변 도메인(VH) (또는 이의 부분)을 이용한다. 하기 실시예는 VH 도메인이 상기 도메인을 포함하는 항체의 안정성을 고도로 예측함을 입증한다.
특정 실시양태에서, 가변 도메인 시험 서열은 가변 도메인 서열을 포함하거나 그 서열로만 이루어진 기준 세트와 비교된다. 상기 가변 도메인 서열은 면역글로불린 서열의 카밧 데이터베이스로부터 수집될 수 있다(문헌 [Kabat 등, "Distribution Files of the Fifth Edition of Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1992]). 특정 바람직한 실시양태에서, 기준 세트는 인간 면역글로불린 서열을 포함하거나 그 서열로 구성될 수 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 기준 세트는 인간 배아세포주 서열을 포함하거나 그 서열만으로 구성될 수 있다. 한 실시양태에서, 기준은 항체 서열의 동일한 카밧 하위부류로부터의 가변 도메인 서열을 포함한다.
다른 실시양태에서, 가변 도메인(예를 들어, VH 도메인)의 부분이 본 발명의 방법에서의 시험 서열로 사용된다. 예시적 가변 도메인 부분은 가변 영역 서열(예를 들어, CDR3 및 FR4를 제거하도록 절단된 VH 서열)의 CDR 또는 프레임워크 영역의 전부 미만을 포함하는 서열이다. 한 실시양태에서, VH 도메인 서열은 VHI 카밧 배아세포주 하위부류의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 가변 도메인 서열은 VH2 카밧 배아세포주 하위부류의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 가변 도메인 서열은 VH3 카밧 배아세포주 하위부류의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 가변 도메인 서열은 VH4 카밧 배아세포주 하위부류의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 가변 도메인 서열은 VH5 카밧 배아세포주 하위부류의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 가변 도메인 서열은 VH7 카밧 배아세포주 하위부류의 것이다.
본 발명의 방법은 당업계에 공지된 단백질에 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 단백질은 항체 또는 이의 일부이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간외 항체(예를 들어, 마우스 단클론성 항체)이다. 다른 실시양태에서, 항체는 단일-도메인 항체(예를 들어, 카멜리드, 상어, 인간)이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 기타 예시적 변형된 항체는 도메인-결실 항체 및 이중특이적 결합 분자를 포함한다. 기타 예시적 항체는 이하 기재되는 scFv-함유 항체 또는 변형된 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 결합 단백질의 안정성은 본 발명의 방법에서 시험 서열로서 그 단백질의 중쇄 가변 서열 (또는 이의 일부)을 이용하여 평가된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 소정의 폴리펩티드에 대해 수득된 데이터가 폴리펩티드의 안정성의 척도로서 저장되거나 출력된다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 복수개의 폴리펩티드에 대해 반복될 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드가 수득된 데이터에 대해 기초하여 선택될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 선택된 폴리펩티드는 치료적 용도를 위해 제형될 수 있다.
IV. 생물물리학적 성질(예를 들어, 단백질 안정성)이 증진된 단백질을 설계/생성시키는 방법
(a) 공변 설계
또 다른 측면에서, 본 발명은 공변 분석의 결과를 이용하여, 유래 기원이 되는 모(parent) 분자에 비해 증진된 생물물리학적 성질을 갖는 단백질 변이체를 설계하는 방법을 제공한다. 공변 데이터가 증진된 단백질 안정성 설계, pH 언폴딩 프로파일의 변형, 글리코실화의 안정한 제거, 및 생물화학적 기능의 변경을 포함하나 이에 한정되지 않는 설계를 용이하기 위해 사용될 수 있는 많은 유형의 단백질 조작 노력들이 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 단락 III의 방법에 따라 증진되거나 감 소된 단백질 안정성을 예측하는 공변 스코어 (또는 공변 그 자체)의 확인에 기초하여, 증진된 안정성을 갖는 단백질을 설계하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 관심 단백질에 속하는 서열이 결실되거나 수가지 핵심 공변을 위반하는 경우, 이를 수정하기 위해 단백질 설계를 수행할 수 있다. 단일 서열 내에 관찰되는 강한 공변의 계산치를 증진시키는 변형도 또한 포함될 수 있다.
BHA10 scFv VH 및 VL 도메인을 안정화하기 위한 수많은 설계들이 개발되었다. 특히, 2개의 scFv BHA10 도메인에 대한 초기 라이브러리 선별 결과는 단백질 안정성 설계를 위한 공변 분석 툴의 능력을 나타낸다. 첫 번째 예는 열 자극 검정에 의해 측정 시, 열 안정성의 유의적 향상(+10℃의 ΔT50)를 부여하는 BHA10 VL 도메인 내의 안정화 돌연변이(S46L)의 성공적 예측과 관련된다. 위치 46(카밧 넘버링 시스템)에서 Ser에서 Leu로의 돌연변이는 잔기 36에서의 기존 Tyr와의 양성 연결을 초래하며, 이는 툴이 Leu 46와 강하게 공변하는 것을 보여준다(도 78). 공변 분석 툴의 유용성에 관한 두 번째 실시예는 BHA10 VH Q6E 돌연변이의 음성 영향의 분석적 일치에 관한 것이다. 단일 잔기 빈도 분석은, 이 위치에서의 더욱 많이 관찰되는 Glu로의 돌연변이가 안정성의 증가를 초래함을 제시하였다. 그러나, 공변 분석 툴은, Glu로의 단일 돌연변이가 BHA10 VH 서열 내에 존재하는 수개의 기존 공변을 위반함을 가리켰다. 안정성을 향상시키기 위해서는, 이 위치에서의 Glu를 우선적으로 안정화하는 수가지 아미노산을 치환해야 한다.
공변 분석 툴의 예측 값에 관한 또 다른 예가 도 79에 나와 있다. Met 80은 단일 잔기 라이브러리 설계의 부분으로서 Leu로 돌연변이화되었다. Leu가 서열 데이터베이스 내 이 위치에서 가장 빈번히 관찰되는 아미노산이기 때문에, 상기 단일 돌연변이가 매우 안정화시킬 것으로 사료되었다. 그러나, 공변 분석은 공변 조화를 달성하기 위해서는 2개의 다른 아미노산이 돌연변이화되어야 함(V67F 및 T70S)을 가리킨다.
(b) 계면 설계
또 다른 측면에서, 본 발명은 합당한 설계를 위해 주형 단백질로서 제1 단백질을 이용하여 제2 또는 후보 단백질(예를 들어, 항체)의 생물물리학적 성질(예를 들어, 단백질 안정성)을 증진시키는 방법을 제공한다.
본원에 사용되는 용어 "주형 단백질"은 생물물리학적 성질의 향상이 역시 바람직한 제2 단백질에서의 동일한 성질을 모델링하기 위해 사용되는 바람직한 생물물리학적 성질(예를 들어, 높은 단백질 열 안정성)을 갖는 단백질을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 주형 단백질은 제2 단백질(예를 들어, 제2 단백질이 항체인 경우, 항체가 주형 단백질로 이용됨)와 동일한 구조적 부류의 것이다.
특정 실시양태에서, 주형 단백질은 본 발명의 방법에 따라 바람직한 생물물리학적 성질(예를 들어, 단백질 안정성)을 가지는 것으로 확인된다. 한 예시적 실시양태에서, 바람직한 안정성 성질을 갖는 주형 단백질은 실시예 15에 기재된 방법과 같은 실험 방법을 이용하여 단백질(예컨대 상기 표 20에 기재된 BIIB1-4)의 군으로부터 확인되었을 수 있다. 이어서, 이 주형 단백질은 설계를 위한 서열 플랫폼으로 작용할 것이다. 한 예시적 실시양태에서, 주형 단백질은 본 발명에서 상기 기 재된 공변 분석 방법에 의해 향상된 생물물리학적 성질(예를 들어 단백질 안정성)을 가지는 것으로 예측된다. 다른 예시적 실시양태에서, 주형 단백질은 상기 기재된 일치 스코어링 방법에 따라 바람직한 단백질(예를 들어, 안정화된 단백질)인 것으로 예측된다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 주형 단백질은 본 발명의 선별 방법에 따라 확인된다.
다른 실시양태에서, 주형 단백질은 본 발명의 방법에 따라 설계된 단백질이다. 한 예시적 실시양태에서, 주형 단백질은 본 발명의 공변 방법에 따라 향상된 생물물리학적 성질(예를 들어, 증진된 단백질 안정성)을 가지도록 설계된다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 주형 단백질은 일치 스코어링 방법에 따라 향상된 생물물리학적 성질을 가지도록 설계된다.
본 발명의 이 측면의 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(1) 주형 단백질 및 후보 단백질의 구조적 모델을 제공하는 단계;
(2) 안정성을 위해 중요한 주형 단백질 내 잔기를 확인하는 단계; 및
(3) 중요한 잔기 주형 단백질에 상응하는 후보 단백질 내 잔기를 치환하는 단계.
한 실시양태에서, 주형 단백질의 구조적 모델은 결정 구조(예를 들어, X-선 결정 구조)이고, 후보 단백질은 주형 단백질의 구조적 모델을 이용한 상동성 모델링에 의해 모델링된다.
또 다른 실시양태에서, 중요한 잔기는 VH/VL 계면 잔기이다. 본원에 사용되는 "계면 잔기"는 단백질 내 또는 단백질 중에서 도메인-도메인 상호작용에 관여하 는 잔기이다. 바람직하게, 계면 잔기는 두 단백질 도메인의 경계부, 즉 "계면"에 있고, 도메인들 중 하나 이상(바람직하게는 양자 모두)에 대한 표면적에 기여한다. 계면에서 다른 것보다 유의적으로 더 큰 표면적을 매립하는 잔기, 즉 폴딩된 단백질의 표면에 유의적으로 더 큰 자체 표면적을 노출하지 않는 잔기는 계면 안정성에 더욱 중요한 것으로 간주된다. 각 잔기가 계면에 기여하는 표면적은 당업계에 인지된 기법(예를 들어, MOLMOL 소프트웨어를 이용한 분석)을 이용하여 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 계면 잔기는 10 Å2 이상(예를 들어, 10 Å2, 15 Å2, 20 Å2, 25 Å2 이상)의 매립된 표면적으로 매립된다.
주형 단백질의 중요한 잔기(예를 들어, 매립된 계면 잔기)의 위치에 상응하는 아미노산 위치에 위치하는 후보 단백질의 잔기는, 그것이 동일하지 않은 유형인 경우, 바람직하게 치환된다. 특정 실시양태에서, 단지 비보존적 치환만이 이루어진다. 다른 실시양태에서, 단지 보존적 치환만이 이루어진다.
예시적 실시양태에서, 주형 및 후보 단백질은 결합 분자(예를 들어, 항체 또는 이의 변이체(예를 들어 scFv 분자))이다. 한 실시양태에서, 하나의 Fc 도메인(예를 들어, 힌지, CH2, 및 CH3)과 또 다른 Fc 도메인 사이에 조사된다. 또 다른 실시양태에서, 계면은 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 형성된 것이다.
바람직한 실시양태에서, 설계는 항체의 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 계면에 초점이 맞추어진다. 생물물리학적 데이터(DSC 데이터 참조-실시예 15)는 VH 및 VL의 상호 친화성이 scFv 포맷에서 주변적임(즉, Fab의 CH1 및 CL 도메인 부재)을 제시한다. 특히, VH 및 VL 상호작용은 항상 충분히 강한 것은 아니다(즉, 협력하여 폴딩된 단일 실체를 야기하도록 하는 충분한 친화성을 가지지 않음). 그러므로, VH/VL 계면의 안정성의 향상(즉, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 친화도의 증가)은 바람직한 항체/scFv 안정성을 증진시키는 바람직한 경로일 수 있다. 계면을 안정화시킴으로써, 항체의 폴딩 전이는 단일 발생으로 전환될 수 있고, 상호 도메인 친화도가 증진되며, (ANS-결합 실험에 의해 관찰되는) 소수성 표면적 노출을 초래할 수 있는 덜 동적인 변동을 허용한다.
또 다른 실시양태에서, 당업자가 VH와 VL 사이의 실제 친화도 증가를 비정량적을 관찰하도록 하는 시차주사열량계(DSC) 실험을 이용하여 설계를 나타낼 수 있다.
(c) 공변 및 계면의 조합 설계
본 발명의 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 2개 이상의 서열 기재 설계 툴이 최적화된 단백질 변이체의 설계를 위해 이용될 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 계면 설계를 공변 분석과 함께 이용하여, 단백질 구조 및 예를 들어 단백질 안정성을 포함하는 기능에 중요한 잔기 또는 잔기 위치를 결정한다. 한 예시적 실시양태에서, 공변 분석을 사용하여, 반대 도메인 상의 계면 잔기와 물리적으로 상호작용하지 않거나 계면에 표면적을 기여하나, 그럼에도 불구하고 계면 잔기를 위한 적절한 구조적 영역을 제공하는데 중요한 계면(여기에서는, "골격 잔기"로 칭해짐) 외부의 잔기 또는 잔기 위치를 결정한다. 예를 들어, 공변 분석이 계면 내에 위치한 잔기 상에 수행되어, 계면 잔기와 공변하는 골격 잔기를 확인할 수 있다. 바람 직하게, 높은 정도의 표면적을 매립하는 계면 잔기(예를 들어, 40 Å2 이상의 표면적을 매립하는 잔기)가 공변 분석을 위해 선택된다. 이어서, 선택된 계면 잔기와 공변하는 골격 잔기가 본 발명의 공변 방법을 이용하여 확인된다. 바람직하게, 강하게 공변하는 (예를 들어, 0.25 이상의 파이 값) 골격 잔기가 선택된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 2개 이상의 계면 잔기(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 계면 잔기)와 공변하는 경우에 골격 잔기가 선택된다. 공변의 수가 클수록, 공변 스코어가 골격 잔기에 의한 것일 가능성이 더 큰데, 이는 공변의 수로 골격 잔기에 의한 VH/VL 계면의 안정화에 대한 기여가 예측되기 때문이다.
본 발명의 이 측면의 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(1) 주형 단백질 및 후보 단백질의 구조적 모델을 제공하는 단계;
(2) 안정성에 중요한 주형 단백질 내 계면 잔기(예를 들어, VH/VL)를 확인하는 단계;
(3) 예를 들어 본원에 기재된 공변 분석 툴을 이용하여, 단계 (2)의 계면 잔기와 공변하는 골격 잔기를 확인하는 단계;
(4) 후보 단백질 내 하나 이상의 계면 잔기 또는 골격 잔기를 단계 (2) 및 (3)에서 확인된 상응하는 잔기 또는 골격 잔기로 치환하는 단계.
주형 단백질의 중요한 잔기(예를 들어, 계면 또는 골격 잔기)의 것에 상응하는 아미노산 위치에 위치하는 후보 단백질의 잔기는, 그것이 동일하지 않은 유형이 아닌 경우, 바람직하게 치환된다. 특정 실시양태에서, 단지 비보존적 치환만이 이 루어진다. 다른 실시양태에서, 단지 보존적 치환만이 이루어진다.
본 발명의 한 실시양태에서, 소정의 폴리펩티드의 향상된 서열이 저장되거나 출력된다. 또 다른 실시양태에서, 선택된 폴리펩티드는 치료적 용도를 위해 제형될 수 있다.
V. 시스템, 인터페이스 및 컴퓨터 실행 방법
본 발명의 한 측면은 본 발명의 선택 및 설계 방법을 실행하기 위한 방법(예를 들어, 컴퓨터 실행 방법), 장치 및 소프트웨어에 관한 것이다. 예시적 실시양태에서, 본 발명은 후보 서열 내 아미노산 잔기(예를 들어, 공변성 아미노산 잔기)를 확인하기 위한 컴퓨터 실행 방법 및 장치를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생물물리학적 성질(예를 들어, 단백질 안정성, 촉매 활성, 치료적 활성, 병원체 또는 독소에 대한 내성, 독성 등)을 예측하는 스코어(예를 들어, 일치 스코어 또는 공변 스코어)에 의한 하나 이상의 시험 또는 후보 서열을 등급화하기 위한 컴퓨터 실행 방법 및 장치를 제공한다.
컴퓨터 실행 방법에 관한 측면은 하기 작동 순서에 의해 기재될 수 있다: (a) 기준 세트 및 시험 서열을 특징분석하는 데이터(예를 들어, 서열 또는 구조적 데이터)를 수용함; (b) 데이터로부터 스코어(예를 들어, 공변 스코어 또는 일치 스코어)를 계산함; (c) 스코어를 등급화하여, 하나 이상의 관심 서열 또는 아미노산 잔기를 확인함.
일부 실시양태에서, 스코어를 등급화하여, 시험 또는 후보 서열 내에 고정된 채로 유지되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 확인한다. 다른 실시양태에서, 스코어 를 등급화하여, 치환을 위한 후보물질인 하나 이상의 아미노산 잔기를 확인한다. 한 예시적 실시양태에서, 컴퓨터 실행 방법은 공변 스코어를 위해 잔기 위치 (또는 특정 위치에 있는 특이적 잔기)를 등급화한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 컴퓨터 실행 방법은 일치 스코어를 위해 후보 서열을 등급화한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 방법을 수행하기 위한 프로그램 사용설명서 및 배치가 제공되어 있는 장치 및 기기-판독성 매체에 관한 것이다. 종종, 프로그램 사용설명서는 특정 방법 작동을 수행하기 위한 규약으로서 제공된다. 본 발명의 특성을 수행하기 위해 데이터를 이용하는 경우, 그 데이터는 데이터 구조, 데이터베이스 표, 데이터 객체, 또는 구체화 정보의 기타 적절한 배치로서 제공된다. 본 발명의 방법 또는 시스템 중 임의의 것은 기기-판독성 매체 상에 제공되는 프로그램 사용설명서 및/또는 데이터에서와 같이 전체적으로 또는 부분적으로 표시될 수 있다.
본 발명의 컴퓨터 실행 방법은 사용자에게 정보를 나타내는 출력 장치(예를 들어, CRT 디스플레이, LCD, 프린터, 통신 장치, 예컨대 모뎀, 오디오 출력 등)를 포함할 수 있다. 또한, 전체적으로 또는 부분적으로 계산을 수행하기 위한 사용설명서(예를 들어, 알고리즘)가 사용설명서를 수행하기 위해 전자 장치에 사용하기에 적당한 매체에 제공될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 방법은 소프트웨어(예를 들어, 컴퓨터 판독성 사용설명서) 및 하드웨어(예를 들어, 컴퓨터, 로봇식 및 칩)를 포함한 고효율 방법에 대해 순응적이다. 컴퓨터 실행 공정은 특별한 컴퓨터 플랫폼, 특별한 프로세서, 또는 특별한 고수준 프로그래밍 언어에 한정되지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 계산은 컴퓨터 프로그래밍 언어(예를 들어, PERL)와 함께 사용하기에 적당한 컴퓨터 알고리즘에 의해 수행된다. 예시적 실시양태에서, 컴퓨터 알고리즘은 (i) 기준 세트의 서열 정렬 및/또는 (ii) 입력으로서의 하나 이상의 시험 서열을 알고리즘을 인식하도록 설계된다.
(i) 컴퓨터 실행 일치 스코어링
본 발명의 한 측면은 컴퓨터 실행 알고리즘을 이용하여 상기 기재된 본 발명의 일치 스코어링 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 실행 방법, 장치 및 소프트웨어에 관한 것이다. 예시적 실시양태에서, 알고리즘은 하기 단계들 중 하나 이상을 수행하기 위해 설계된다: (1) 정렬의 각 잔기 위치를 열로서 잘라내어, 그 위치에서의 일치 잔기 빈도를 계산하는 단계; (2) 시험 서열(들)의 각 잔기 위치를 잘라내어, 그 위치에서의 시험 잔기 빈도를 계산하는 단계, 및 (3) 시험 잔기 빈도를 일치 잔기 빈도로 나누어, 일치 스코어를 수득하는 단계; 및/또는 (4) 각 위치의 일치 스코어를 합산하여, 총 일치 스코어를 수득하는 단계. 다른 실시양태에서, 알고리즘은 하기 부가 단계들 중 하나 이상을 수행하도록 설계될 수 있다: (5) 기준 세트의 평균 일치 스코어 및/또는 (6) 시험 서열의 서열 스코어를 계산하는 단계.
본 발명의 이 측면은 또한 본 발명의 일치 스코어링 방법을 수행하기 위한 시스템에서 구현된다. 시스템은 (a) 기준 세트들의 하나 이상의 집단을 저장할 수 있는 데이터베이스를 포함하는 컴퓨터 및 (b) 시스템 소프트웨어를 포함한다. 시스템 소프트웨어는 컴퓨터 실행 일치 스코어링 방법의 단계 (1) 내지 (6) 중 임의의 단계를 수행하기 위한 하나 이상의 논리 사용설명서를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 일치 스코어링 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 프로그램 산물을 제공한다. 컴퓨터 프로그램 산물은 단계 (1) 내지 (6) 중 임의의 단계를 수행하기 위한 하나 이상의 논리 사용설명서를 갖는 컴퓨터 판독성 매체를 포함한다.
( ii ) 컴퓨터 실행 공변 분석
본 발명의 또 다른 측면은 컴퓨터 실행 알고리즘을 이용하여 상기 본 발명의 공변 분석 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 실행 방법에 관한 것이다. 예시적 실시양태에서, 방법은 하기 단계들 중 하나 이상의 단계를 수행한다: (1) 정렬된 세트의 각 잔기 위치를 열로서 잘라내는 단계; (2) 열을 행렬로 정렬하는 단계; (3) 행렬 내 각종 열들 간의 상관 관계를 계산하여, 상관 조건을 유도하는 단계; (4) 상관 조건을 아미노산 잔기에 상응하는 선형 조건에 부가하여, 확장된 예측자 행렬을 생성시키는 단계; (5) 확장된 예측자 행렬로부터 발견적 방법으로 유래된 모델(예를 들어, 히든 마르코프 모델)을 발생시켜, 중요 상관 관계를 확인하는 단계.
본 발명의 이 측면들은 또한 본 발명의 공변 분석 방법을 수행하기 위한 시스템에서 구현된다. 시스템은 (a) 문자열 라이브러리의 하나 이상의 집단을 저장할 수 있는 데이터베이스를 포함하는 컴퓨터 및 (b) 시스템 소프트웨어를 포함한다. 시스템 소프트웨어는 컴퓨터 실행 방법 공변 스코어링 방법의 단계 (1) 내지 (5) 중 임의의 단계를 수행하기 위한 논리 사용설명서를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 공변 스코어링 방법을 수행하기 위한 컴퓨터 프로그램 산물을 제공한다. 컴퓨터 프로그램 산물은 단계 (1) 내지 (5) 중 임의의 단계 를 수행하기 위한 하나 이상의 논리 사용설명서를 가지는 컴퓨터 판독성 매체를 포함한다.
( iii ) 공변 분석을 위한 그래픽 사용자 인터페이스
특정 예시적 측면에서, 본 발명은 본 발명의 공변 방법과 함께 사용하기 위한 신규 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 제공한다. NAPMAP로 칭해지는 이 공변 분석 툴은 사용자가 서열의 정렬된 세트의 영역에서 공변을 가시화하는 것을 돕는다. 신규 그래픽 사용자 인터페이스는 당업계에 인지된 프로그래밍 언어를 이용하여 (예를 들어 processing.org로부터의 프로세싱 라이브러리 이용 자바(Java) 1.4.2에서) 컴퓨터로 실행된다.
(a) 그리드 레이아웃
한 측면에서, 본 발명의 그래픽 사용자 인터페이스는 정렬(예를 들어, 상기 본 발명의 방법에 따라 생성된 서열 정렬) 또는 이에 상응하는 데이터의 그래픽 표시를 포함한다. 이 표시의 간단한 용어는 그리드 레이아웃이다. 본원에 사용되는 용어 "그리드 레이아웃"(정렬 플랫폼으로도 알려짐)은 정렬의 성질이 나타내어지는 행렬을 지칭한다. 한 실시양태에서, 그리드 레이아웃은 정렬의 서열을 잔기 위치를 그래픽으로 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 그리드 레이아웃은 정렬 내 서열의 잔기 유형을 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 그리드 레이아웃은 정렬 내 잔기 유형의 빈도 (또는 "잔기 사용 빈도")를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, 그리드 레이아웃은 정렬 내 잔기의 하나 이상의 성질(예를 들어, 소수성, 전하, 크기, pKa 등)을 나타낸다.
특정 예시적 실시양태에서, 그리드 레이아웃은 (i) 정렬의 서열에 상응하는 인접한 잔기 위치; 및 (ii) 정렬 서열의 각 잔기 위치에서의 잔기 유형에 대한 잔기 사용 빈도의 대표적 표시를 포함한다. 한 실시양태에서, 잔기 사용 빈도는 부호를 이용하여 (예를 들어, 원형 또는 사각형에 의해) 표시된다. 다른 실시양태에서, 모든 20종의 천연 아미노산, 갭 및 모호한 잔기가 표시된다. 특정 실시양태에서, 잔기 위치는 행에 표시되고, 잔기 사용 빈도는 열에 표시된다. 특정 실시양태에서, 잔기 위치는 열에 표시되고, 잔기 사용 빈도는 행에 표시된다.
한 실시양태에서, 잔기 사용 빈도는 부호 크기(예를 들어, 원의 크기)와 상관(예를 들어, 양성적으로 또는 음성적으로 상관)되므로, 보다 많은 보존 잔기가 보다 덜 빈번하게 관찰되는 잔기와 구별될 수 있다. 예를 들어, 잔기 빈도는 사용 빈도에 비례하는 원형 면적을 갖는 각종 크기의 원으로 표시될 수 있다. 각 원의 반경(R)을 사용하여, 하기 식 (IV)에 따라 계산되는 타원 함수를 이용하여 노드를 그릴 수 있다.
Figure 112008072289549-pct00012
(식 중에서,
A=모든 노드의 요망되는 평균 면적,
N=이 잔기를 이용한 서열의 수,
M=각 잔기를 이용한 서열의 평균 수임)
한 예시적 실시양태에서, 그리드 레이아웃은 인접한 열 및 행의 행렬을 포함하고, 여기에서 (i) 인접한 열은 정렬의 상응하는 인접한 잔기 위치를 그래픽으로 나타내고; (ii) 각각의 인접한 행은 특이적 아미노산 유형을 그래픽으로 나타내며; (iii) 각 잔기 위치에서의 잔기 사용 빈도는 행렬의 각 셀 내에 그래픽으로 표시된다. 바람직하게 모든 잔기 유형(예를 들어, 모든 20종의 아미노산 및/또는 가능한 갭)은 그리드 레이아웃 내 분리된 행으로 표시된다. 더욱 바람직하게는, 정렬의 각 잔기 위치에서의 잔기 사용 빈도는 잔기 사용 빈도와 상관(예를 들어, 양성적으로 상관)되는 크기의 부호(예를 들어, 원형)를 갖는 행렬의 각 셀에 그래픽으로 표시된다. 예시적 그리드 레이아웃이 도 76에 나와 있다.
(b) 공변 오버레이
다른 측면에서, 본 발명의 그래픽 사용자 인터페이스는 하나 이상의 공변(예를 들어, 상기 본 발명의 방법에 따라 확인된 공변) 또는 이에 상응하는 데이터의 그래픽 표시를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 그래픽 사용자 인터페이스는 (i) 그리드 레이아웃; 및 (ii) 하나 이상의 공변 모두의 그래픽 표시를 포함한다. 이 실시양태들에서, 그리드 레이아웃은 공변 데이터의 표시를 위한 정렬 플랫폼으로 작용할 수 있다. 공변 데이터는 예를 들어 공변 데이터로 그리드 레이아웃을 오버레이함으로써 표시될 수 있다. 이러한 방식으로 배치된 공변 데이터는 "공변 오버레이"로 칭해진다. 예를 들어, 공변은 그리드 레이아웃 내에 그래픽으로 표시되는 2개 이상의 공변하는 아미노산을 연결하는 선의 망 또는 선으로 공변 오버레이에 표시될 수 있 다.
공변 오버레이의 선은, 2개 이상의 공변하는 아미노산 사이의 연결이 사용자에게 자명한 한(예를 들어, 도 77(여기에서, 공변은 두 공변하는 아미노산을 연결하는 반투명 막대로 표시됨) 참조), 각종 두께(예를 들어, 얇은 선 또는 막대) 또는 연속성(예를 들어, 파선 또는 솔리드선, 직선 또는 뾰족한 형태의 선)로 표시될 수 있다. 특정 예시적 실시양태에서, 공변의 그래픽 표시는 공변의 통계학적 유의성(예를 들어, 공변의 φ 또는 χ2-값)을 추가로 나타낼 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 공변 오버레이 내의 선의 두께는 공변의 통계학적 유의성에 비례할 수 있다. 예를 들어, 공변 오버레이의 선 두께는 식 V에 따라 φ 값에 비례하여 그려질 수 있다:
Figure 112008072289549-pct00013
(식 중에서,
W=선 두께,
Φ=파이(상관 계수),
N=과장 곱수,
M=최대 선 두께임)
또 다른 예시적 실시양태에서, 양성 및 음성 공변은 (예를 들어 상이한 색의 선 또는 두께에 의해) 상호 그래픽으로 구별될 수 있다. 다른 예시적 실시양태에서, 통계학적 유의성의 특정 역치 수준 초과의 공변만이 사용자에게 표시된다. 예 를 들어, 특정 실시양태에서, φ 값 한도는 원하는 상관 강도를 갖는 공변만을 나타내도록 적용될 수 있다.
(c) 서열 추적
다른 임의적 측면에서, 그래픽 사용자 인터페이스는 단백질 설계 노력으로 보조하는 관심 서열의 그래픽 표시를 포함한다. 관심 서열은 시험 또는 후보 서열(즉, 입력 서열)이거나, 바람직한 공변이 적분된 서열(즉, 출력 서열)일 수 있다. 관심 서열은 선으로서 그래픽으로 표현될 수 있다.
한 실시양태에서, 그래픽 계면은 (i) 관심 서열의 표시; 및 (ii) 그리드 레이아웃(예를 들어, 관심 서열이 그리드 레이아웃 상에 중첩됨)의 양자 모두를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 그래픽 계면은 (i) 관심 서열의 표시; 및 (ii) 공변 오버레이(예를 들어, 관심 서열이 공변 오버레이 상에 중첩됨)의 양자 모두를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 그래픽 계면은 (i) 관심 서열의 표시; (ii) 공변 오버레이; 및 (iii) 그리드 레이아웃(예를 들어, 관심 서열이 공변 오버레이 상에 중첩(예를 들어, 추적)되고, 이는 다시 그리드 레이아웃 상에 중첩됨)의 양자 모두를 포함한다.
관심 서열은 그리드 레이아웃 상에, 예를 들어 그리드 레이아웃 내에 그래픽으로 표시되는 곡선 연결 곡선으로 표시될 수 있다. 이러한 방식으로 표시되는 관심 서열은 "서열 추적"으로 칭해진다. 바람직한 실시양태에서, 서열 추적은 특별한 잔기 위치를 나타내는 그리드 레이아웃의 특별한 행 또는 열에 대해 단지 하나의 셀 (또는 아미노산 유형의 그래픽 표시)을 통해서만 통과하거나 지나가야 한다. 보 다 바람직하게는, 서열 추적은 관심 서열 내 특별한 잔기 위치에서 일어나는 잔기 유형을 그래픽으로 나타내는 셀을 통과한다. 서열 추적은 관심 서열 내 잔기를 나타내는 그리드 레이아웃의 모든 셀을 통과할 수 있거나, 관심 서열의 부분을 나타내는 셀만을 통과할 수 있다. 관심 서열의 예시적 서열 추적은 도 77에 표시되어 있다. 그 안에 표시된 서열 추적(캐트멀-롬 스플라인(catmull-rom spline)을 베지어(bezier) 함수를 이용하여 그렸다. 서열 전이 베지어 곡선을 그리기 위해 2개의 노드가 주어질 경우, 노드 쌍의 전 노드와 후 노드가 앵커 점으로 사용되고, 두 노드 그 자체는 제1 및 제2 대조 점으로 사용된다. (아미노산 서열의 제1 잔기를 나타내는) 제1 열에서의 노드에 대해서는, 제1 대조 점은 그것의 앵커 점의 2배가 되고 마지막 열에서의 노드에 대해서는, 그것의 제2 대조 점은 그것의 앵커 점의 2배가 된다.
바람직한 실시양태에서, 서열 추적 플롯은 사용자에 의한 조작에 대해 상호작용성을 가지게 된다. 예를 들어, 그리드 레이아웃 내의 셀은 사용자에 의한 선택에 대해 상호작용성을 가지게 된다. 한 실시양태에서, 선택된 셀은 특별한 선택 상태(예를 들어, 양성, 중성, 또는 음성 선택 상태)로 지정된다. 한 예시적 실시양태에서, 특별한 잔기를 나타내는 셀은 사용자에 의해 양성적으로 선택될 수 있고, 이에 서열 추적은 선택된 셀을 통과하도록 재추적될 수 있다. 예를 들어, 셀이 사용자에 의해 양성적으로 선택되는 경우, 다중 서열 추적은, 양성적으로 선택된 셀에 의해 나타내어지는 잔기를 이용하는 모든 관심 서열(예를 들어, 기준 세트 또는 정렬 내의 모든 서열)에 대해 생성될 수 있다. 다른 대안적 실시양태에서, 특별한 잔 기를 나타내는 셀은 사용자에 의해 음성적으로 선택될 수 있고, 이에 따라 서열 추적은 선택된 셀을 통과하지 않는다. 따라서, 서열 추적은 음성적으로 선택된 셀에 의해 나타내어지는 잔기를 배제하는 모든 관심 서열(예를 들어, 기준 세트 또는 정렬 내의 모든 서열)에 대해 생성될 수 있다.
다중 관심 서열은, 그것이 (예를 들어, 상이한 선 두께 또는 연속성을 이용하여) 사용자에 의해 구별될 수 있는 한, 그래픽으로 표시될 수 있다. 예를 들어, 상이한 서열 정렬을 비교하기 위해, 2개 이상의 정렬로부터의 다중 관심 서열을 나타내는 서열 추적이 (예를 들어, 상이한 색, 바람직하게는 반대 색으로) 그리드 레이아웃 상에 중첩되어, 대규모로 시차 잔기 사용의 시각화를 가능하게 할 수 있다.
(d) 디스플레이 모드
그래픽 사용자 인터페이스는 임의의 당업계에 인지된 기능성을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 그래픽 사용자 인터페이스는 그리드 레이아웃의 상이한 부분에서의 패닝(panning) 또는 주밍(zooming)이 가능할 수 있다. 예를 들어, 그리드 레이아웃의 뷰포트(viewport) 크기는 사용자의 컴퓨터 스크린 해상도에 따라 변화될 수 있고, 시각화는 초기 뷰포트에서 맞지 않는 정렬을 보기 위해 주밍 또는 패닝될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 예를 들어 데이터 마스킹(masking)을 이용하여 가장 중요한 공변 쌍 및/또는 수개의 쌍들 간의 네트워크를 강조한다. 본 발명의 그래픽 사용자 인터페이스는 공변(예를 들어, 통계학적으로 유의적인 공변)을 보기 위한 하나 이상의 표시 모드를 가질 수 있다. 바람직하게, 상기 표시 모드는 관심 서열 의 서열 추적을 볼 때 상호작용성 플롯에서 이용가능하다. 예시적 뷰어모드는 다음과 같다:
뷰어모드 #1: 관심 서열 내 역시 존재하는 잔기들 간의 공변만이 표시된다. 이 공변은 상응하는 단백질 분자와 함께 보유하는 가설 추정되는 잔기-잔기 상호작용(예를 들어, 통계학적 잔기 쌍 빈도 분석에 의해 발견되는 상호작용)인 것으로 사료될 수 있고, 기능을 위해 중요할 수 있다.
뷰어모드 #2: 유일하게 표시되는 공변은 관심 서열 내 존재하는 잔기 쌍의 하나의 잔기를 갖는 잔기 쌍들 간의 것이다. 이 공변은 보존되는 경향은 있으나 관심 서열 내에 존재하지 않는 잔기-잔기 상호작용이고, 그것의 부재는 단백질 안정성에 유해할 수 있다. 이 뷰어모드는 공변 분석 툴을 단백질 설계를 위해 이용할 때 특히 바람직하다(상기 단락 IV 참조).
뷰어모드 #3: 유일하게 표시되는 공변은 관심 서열 내 존재하는 공변하는 쌍의 어느 아미노산 구성원도 가지지 않는 잔기 쌍들 간의 것이다.
특정 실시양태에서, 모든 뷰어모드는 사용자에게 표시되나, 각기 독특한 표시 포맷으로 표시된다. 또 다른 실시양태에서, 모든 뷰어모드는 분리하여(예를 들어, 분리된 표시 창에서) 표시된다.
도 89는 본 발명의 실시양태를 수행하기 위해 적당한 예시적 환경을 나타낸다. 전산 장치(8900)는 초기 서열 수집 공정(8902) 및 분석 설비(8904)를 지지한다. 전산 장치(8900)는 하나 이상의 프로세서가 장착되어 있고 초기 서열 수집 공정(8902) 및 분석 설비(8904)를 지지하는, 워크스테이션, 서브, 랩탑, 메인프레임, PDA 또는 기타 전산 장치일 수 있다. 전산 장치(8900)는 단일 프로세서 또는 다중 프로세서를 가질 수 있고, 이들 각각의 프로세서는 하나의 코어 또는 다중 코어를 가질 수 있다. 분석 설비(8904)는 소프트웨어에서 수행되고, 정렬 내 잔기의 쌍들 간의 공변을 프로그램에 의해 분석하여 공변 데이터를 수득한다. 전산 장치(8900)는 데이터와 교통하고 이를 출력 디스플레이 장치(8910)에 출력한다. 출력 디스플레이 장치(8910)는 분석 설비(8904)에 의해 생성된 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)(8912)를 표시한다. GUI(8912)는 그리드 레이아웃(8914) 및 공변 오버레이(8916)를 포함할 수 있다. 전산 장치(8900)는 또한 각기 보유 서열 데이터(8932 및 8942)를 포함하는 하나 이상의 저장 위치(8930 및 8940)와 네트워크(8920) 상에서 소통할 수도 있다. 초기 서열 수집 공정(8902)은 사용자 공급 및/또는 예비 결정된 파라미터에 기초하여 서열 데이터(8932) 및(8942)로부터 후보 서열을 프로그램에 의해 복원한다. 복원된 서열 데이터는 분석 설비(8904)에 의해 분석된다. 당업자는 초기 서열 수집 공정(8902) 및 분석 설비(8904)가 도 89에 분리되어 표시되어 있으나, 이들은 통합된 애플리케이션(application), 프로세스(process) 또는 플러그-인(plug-in)의 일부로 수행될 수 있음을 인식할 것이다. 마찬가지로, 초기 서열 수집 공정(8902) 및 분석 설비는 각기 분리하여 태스크(task), 쓰레드(thread), 프로세스, 애플리케이션 또는 플러그-인일 수 있음이 인식될 것이다. 전산 장치(8900)는 다수의 상이한 매체 및 구조를 이용하여, 저장 위치(8930) 및(8940)와 네트워크(8920) 상에서 소통할 수 있다. 예를 들어, 네트워크(8920)는 국소 영역 네트워크(LAN), 광 영역 네트워크(WAN), 인트라넷, 인터넷으로 배치되고/되거나, 무선 네트워크 및/또는 전화선 또는 전산 장치(8900)가 저장 위치(8930 및 8940)와 소통할 수 있도록 하는 기타 유형의 네트워크로서 배치될 수 있다. 저장 위치(8930 및 8940)는 네트워크(8920)에 의해 접근가능한 전산 장치에 의해 운영되는 데이터베이스 또는 일부 기타 유형의 저장 데이터구조일 수 있다. 본 발명의 성분이 도 89에서 특별한 구조로 표시되나, 다른 성분 구조도 또한 본 발명의 범주 내에서 가능함을 주목해야 한다. 예를 들어, 초기 서열 수집 공정(8902) 및 분석 설비(8904)가 분리된 전산 장치에 위치할 수 있고/있거나, 서열 데이터(8932 및 8942)는 전산 장치(8900)에 의해 운영되는 하나 이상의 데이터베이스 상에 위치할 수 있다.
도 90은 폴리펩티드의 안정성의 척도로 사용될 수 있는 서열 공변 스코어를 결정하기 위해 본 발명의 한 실시양태가 후속될 수 있는 단계의 예시적 순서의 흐름도이다. 순서는 폴리펩티드의 Ig 폴드에 상응하는 서열의 큐레이팅된 기준 세트의 정렬을 제공하는 초기 서열 수집 공정(8902)으로 시작한다(단계 9000). 이어서, 분석 설비(8904)는 공변 데이터를 생성시키기 위해 본원에 기재된 바와 같은 정렬의 서열의 잔기들 간의 공변을 계산한다(단계 9002). 분석 설비(8904)는 공변 데이터를 사용하여, 공변 데이터 내 공변으로부터의 후보 서열에 대한 서열 공변 스코어를 결정한다(단계 9004). 결정된 서열 공변 스코어는 폴리펩티드의 안정성의 척도의 지시자를 제공하고, GUI(8912)를 통해, 또는 일부 기타 방식으로 저장되고/되거나 사용자에게 출력될 수 있다(단계 9006).
상술된 바와 같이, 분석 설비(8904)는 또한 일치 스코어의 결정을 위해 사용될 수 있다. 도 91은 일치 스코어를 결정하여 후보 단백질의 안정성을 예측하기 위 해 본 발명의 한 실시양태가 후속될 수 있는 단계의 예시적 순서의 흐름도이다. 순서는 초기 서열 수집 공정(8902)을 사용하여 후보 단백질의 시험 도메인 서열에 상응하는 서열의 기준 세트를 제공하는 것으로 시작된다(단계 9100). 이어서, 분석 설비(8904)는 시험 도메인 내의 아미노산 위치에서의 잔기 빈도를 결정하여 일치 스코어를 결정한다(단계 9102). 이어서, 결정된 일치 스코어는 후보 단백질의 안정성의 예측을 제공하기 위해 저장되고/되거나 사용자에게 출력될 수 있다(단계 9104).
분석 설비(8904)는 또한 평균 일치 스코어의 결정을 위해 사용될 수 있다. 도 92는 후보 단백질의 안정성의 척도로서 평균 일치 스코어를 결정하여 사용하기 위해 본 발명의 한 실시양태가 후속될 수 있는 단계의 예시적 순서의 흐름도이다. 순서는 초기 서열 수집 공정(8902)을 사용하여 후보 단백질의 시험 도메인 서열에 상응하는 서열의 기준 세트를 제공하는 것으로 시작된다(단계 9200). 이어서, 분석 설비(8904)는 기준 세트의 서열 내의 잔기 빈도를 결정하여 평균 일치 스코어를 결정한다(단계 9204). 일치 스코어를 평균 일치 스코어를 비교하여 서열 스코어를 결정하고(단계 9206), 이어서 결정된 서열 스코어는 후보 단백질의 안정성의 예측을 제공하기 위해 저장되고/되거나 사용자에게 출력될 수 있다(단계 9206).
도 93은 폴리펩티드의 향상된 아미노산 서열을 결정하기 위해 공변을 만족하지 못하는 아미노산을 확인하여 정렬 내 상응하는 위치에서 발견되는 공변하는 잔기로 치환하기 위해 본 발명의 한 실시양태가 후속될 수 있는 단계의 예시적 순서의 흐름도이다. 순서는 폴리펩티드의 Ig 폴드에 상응하는 서열의 큐레이팅된 기준 세트의 정렬을 제공하는 초기 서열 수집 공정(8902)으로 시작된다(단계 9300). 이어서, 분석 설비(8904)는 공변 잔기를 확인하기 위해 정렬의 서열의 잔기들 간의 공변을 계산한다(단계 9302). 분석 설비(8904)는 공변을 만족하지 못하고 정렬 내 상응하는 위치에서 발견되는 공변하는 잔기를 치환할 수 있는 특별한 잔기를 확인하여(단계 9304), 폴리펩티드의 서열을 향상시킬 수 있다. 이어서, 향상된 서열은 저장되고/되거나 사용자에게 출력될 수 있다(단계 9306).
본 발명은 하나 이상의 매체 상에 또는 그 매체 내에 하나 이상의 컴퓨터 판독성 프로그램으로서 제공될 수 있다. 매체는 플로피 디스크, 하드 디스크, 컴팩트 디스크, 디지털 다기능 디스크, 플래쉬 메모리 카드, PROM, MRAM, RAM, ROM, 또는 자기 테이프일 수 있다. 일반적으로, 컴퓨터 판독성 프로그램은 임의의 프로그래밍 언어로 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 언어의 일부 예에는 포트란(FORTRAN), C, C++, C#, 파이톤(Python) 또는 자바가 포함된다. 소프트웨어 프로그램은 목적 코드로서 하나 이상의 매체 상에 또는 그 매체 내에 저장될 수 있다. 하드웨어 가속화를 사용될 수 있고, 코드의 전부 또는 부분은 FPGA, ASIP, 또는 ASIC 상에 운용될 수 있다. 코드는 가상 기기 내에서와 같이 가상 환경에서 운용될 수 있다. 코드를 운용하는 다중 가상 기기는 단일 프로세서 상에 있을 수 있다.
VI . 단백질 안정성의 평가 방법
본 발명의 조성물의 안정성 성질은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 당업자에게 허용가능한 안정성 파라미터를 이용할 수 있다. 예시적 파라미터가 이하 더욱 상세히 기재된다. 예시적 실시양태에서, 열 안정성이 평가된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물 발현 수준(예를 들어, %수율로 측정되는 수준)이 평가된다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 응집 수준이 평가된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 안정성 성질은 적당한 대조군의 안정성 성질과 비교된다. 예시적 대조군에는 종래의 scFv 분자가 포함된다. 특히 바람직한 대조군은 (Gly4Ser)3 scFv 분자이다.
한 실시양태에서, 이하 기재되는 하나 이상의 파라미터가 측정된다. 한 실시양태에서, 이 파라미터들 중 하나 이상이 포유동물 세포에서의 발현 후에 측정된다. 한 실시양태에서, 이하 기재되는 하나 이상의 파라미터는 대규모 조건(예를 들어, 생체반응기에서의 scFv 또는 scFv를 포함하는 분자의 발현) 하에서 측정된다.
a) 열 안정성
본 발명의 조성물의 열 안정성은 당업계에 공지된 다수의 비제한적 생물물리학적 또는 생물화학적 기법들을 이용하여 분석될 수 있다. 특정 실시양태에서, 열 안정성은 분석적 분광법에 의해 평가된다.
예시적 분석적 분광법은 시차 주사 열량계(DSC)이다. DSC는 대부분의 단백질 또는 단백질 도메인의 언폴딩을 동반하는 열 흡광도에 민감한 열량계를 이용한다(예를 들어 문헌 [Sanchez-Ruiz 등, Biochemistry, 27:1648-52, 1988] 참조). 단백질의 열 안정성을 결정하기 위해, 단백질의 샘플은 열량계에 삽입되고, Fab 또는 scFv가 언폴딩할 때까지 온도를 올린다. 단백질이 언폴딩하는 온도는 전반적 단백질 안정성을 가리킨다.
또 다른 예시적 분석적 분광 방법은 원편광 이색성(CD) 분광법이다. CD 분광법은 증가하는 온도의 함수로서 조성물의 광학 활성을 측정한다. 원편광 이색성(CD) 분광법은 구조적 비대칭으로 인해 발생하는 최측 편광 대 우측 편광의 흡수 차이를 측정한다. 무질서 또는 언폴딩된 구조는 순차 구조 또는 폴딩된 구조의 CD 스펙트럼과 매우 상이한 CD 스펙트럼을 초래한다. CD 스펙트럼은 증가하는 온도의 변성 영향에 대한 단백질의 민감도를 반영하고, 이에 따라 이는 단백질의 열 안정성을 가리킨다(문헌 [van Mierlo 및 Steemsma, J. Biotechnol ., 79(3):281-98, 2000] 참조).
열 안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시적 분석적 분광 방법은 형광 발광 분광법이다(문헌 [van Mierlo 및 Steemsma, 이하 상기와 동일함] 참조). 열 안정성을 측정하기 위한 또 다른 예시적 분석적 분광 방법은 핵 자기 공명(NMR) 분광법이다(예를 들어, 문헌 [van Mierlo 및 Steemsma, 이하 상기와 동일함] 참조).
다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 열 안정성은 생물화학적으로 측정된다. 열 안정성을 평가하기 위한 예시적 생물화학적 방법은 열 자극 검정이다. "열 자극 검정"에서, 본 발명의 조성물은 일정 시간 동안 상승된 온도 범위에 적용된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 시험 scFv 분자 또는 scFv 분자를 포함하는 분자는 증가된 온도 범위에 예를 들어 1 내지 1.5시간 동안 적용된다. 이어서, 단백질의 활성은 관련 생물화학적 검정에 의해 검정된다. 예를 들어, 단백질이 결합 단백질(예를 들어 본 발명의 scFv 또는 scFv-함유 폴리펩티드)인 경우, 결합 단백질의 결합 활성은 기능적 또는 정량적 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, 그러한 검정은 고효율 포맷으로 행해질 수 있다. 또 다른 실시양태에서, scFv 변이체의 라이브러리는 당업계에 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. scFv 발현이 유도될 수 있고, scFv는 열 자극을 받을 수 있다. 자극된 시험 샘플은 결합에 대해 검정될 수 있고 안정한 상기 scFv는 규모 확대되어 추가로 특징분석될 수 있다.
특정 실시양태에서, 열 안정성은 상기 기법들 중 임의의 기법(예를 들어 분석적 분광 기법)을 이용하여 본 발명의 조성물의 융점(Tm)을 측정함으로써 평가된다. 융점은 조성물의 분자 중 50%가 폴딩된 상태로 있는 열적 전이 곡선의 중간점에 있는 온도이다.
다른 실시양태에서, 열 안정성은 분석적 열량측정 기법(예를 들어 DSC)을 이용하여 본 발명의 조성물의 비열 또는 열용량(Cp)을 측정함으로써 평가된다. 조성물의 비열은 물의 1 몰의 TC, 온도를 상승시키는 데 필요한 에너지(예를 들어 kcal/mol)이다. 큰 Cp는 변성되거나 불활성인 단백질 조성물의 표시이다. 특정 실시양태에서, 조성물의 열용량의 변화량(ΔCp)은 열적 전이의 전 및 후의 조성물의 비열을 결정함으로써 측정된다. 다른 실시양태에서, 열 안정성은 언폴딩의 깁스 자유 에너지(ΔG), 언폴딩의 엔탈피(ΔH), 또는 언폴딩의 엔트로피(ΔS)를 포함한 열동력 안정성의 다른 파라미터를 측정하거나 결정함으로써 평가될 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 생물화학적 검정들 중 하나 이상(예를 들어, 열 자극 검정)을 사용하여, 조성물의 50%가 그 활성(예를 들어, 결합 활성)을 보유하는 온도(즉, Tc 값)를 결정한다.
b) 응집율 %
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 그것의 응집 성향을 측정함으로써 결정된다. 응집은 다수의 비제한적 생물화학적 또는 생물물리학적 기법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물의 응집은 크로마토그래피, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 평가될 수 있다. SEC는 크기에 기초하여 분자를 분리한다. 칼럼을, 이온 및 작은 분자가 안으로 들어가도록 허용하나 큰 것은 들어가지 못하도록 하는 고분자 겔의 반고체 비드로 충전한다. 단백질 조성물을 칼럼의 상단에 적용할 때, 컴팩트하게 폴딩된 단백질(즉, 비응집 단백질)이 큰 단백질 응집체에 이용가능한 보다 큰 체적의 용매를 통해 분배된다. 궁극적으로, 큰 응집체는 칼럼을 통해 보다 빨리 이동하고, 이러한 식으로, 혼합물은 분리되거나 그 성분 안으로 분획화될 수 있다. 각 분획은 겔에서 용출될 때, (예를 들어, 광 산란에 의해) 분리하여 정량화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물의 % 응집율은 분획의 농도를 겔에 적용되는 단백질의 총 농도와 비교함으로써 결정될 수 있다. 안정한 조성물은 본질적으로 단일 분획으로서 칼럼으로부터 용출되어, 용출 프로파일 또는 크로마토그램에서 본질적으로 단일개의 피크로서 나타난다.
바람직한 실시양태에서, SEC는 인-라인 광산란(예를 들어, 정통적 또는 동적 광 산란)과 함께 사용되어, 조성물의 % 응집율을 결정한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 정적 광 산란을 이용하여, 분자 형상 또는 용출 위치와 무관한 각 분획 또는 피크의 질량을 측정한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 동적 광 산란을 이용하 여, 조성물의 수력학적 크기를 측정한다. 단백질 안정성을 평가하기 위한 기타 예시적 방법에는 고속 SEC가 포함된다(예를 들어 문헌 [Corbett 등, Biochemistry. 23(8):1888-94. 1984] 참조).
한 바람직한 실시양태에서, % 응집율은 단백질 샘플 내의 단백질 응집체의 분율을 측정함으로써 결정된다. 한 바람직한 실시양태에서, 조성물의 % 응집율은 단백질 샘플 내의 폴딩된 단백질의 분율을 결정함으로써 측정된다.
c) %수율
다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 단백질의 발현(예를 들어 재조합 발현) 후에 회수된 단백질의 양(여기에서는, "%수율")을 측정함으로써 평가된다. 예를 들어, %수율은 숙주 배양 배지의 모든 ml에 대해 회수된 단백질의 밀리그램(즉, mg/ml의 단백질)을 결정함으로써 측정될 수 있다. 한 바람직한 실시양태에서, %수율은 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포) 내에서의 발현 후에 평가된다.
d) % 손실율
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 한정된 시간 동안 저장한 후 일정 범위의 온도(예를 들어, -80 내지 25℃)에서 단백질의 손실을 모니터링함으로써 평가된다. 회수된 단백질의 양 또는 농도는 당업계에 공지된 임의의 단백질 정량화 방법을 이용하여 결정되어, 단백질의 초기 농도와 비교될 수 있다. 예시적 단백질 정량화 방법은 SDS-PAGE 분석 또는 브래드포드(Bradford) 검정이 포함된다(문헌 [Bradford 등, Anal . Biochem . 72, 248, (1976)]). %손실율을 평가하기 위 한 바람직한 방법은 상기 기재된 분석적 SEC 방법들 중 임의의 방법을 이용한다. %손실율 측정은 임의의 원하는 저장 조건 또는 예를 들어 동결건조 단백질 제제를 비롯한 저장 제형 하에서 결정될 수 있다.
e) % 단백질분해율
다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 표준 조건 하에서 저장된 후 단백질분해되는 단백질의 양을 결정함으로써 평가된다. 한 예시적 실시양태에서, 단백질분해는 단백질의 SDS-PAGE에 의해 결정되고, 여기에서 비변형 단백질의 양이 SDS-PAGE 겔 상에 나타나는 저분자량 단편의 양과 비교된다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 단백질분해는 질량 분광법(MS)에 의해 결정되고, 여기에서 예상 분자량의 단백질의 양은 샘플 내 저분자량 단백질 단편의 양과 비교된다.
f) 결합 친화도
다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 그것의 표적 결합 친화도를 결정함으로써 평가될 수 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 매우 다양한 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 결합 친화도를 결정하기 위한 예시적 방법은 표면 플라즈몬 공명을 이용한다. 표면 플라즈몬 공명은, 예를 들어 비아코어(BIAcore) 시스템(파마시아 바이오센서 AB(Pharmacia Biosensor AB), 스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)을 이용하여 바이오센서 기질 내 단백질 농도의 변경을 검출함으로서 실시간 생물특이적 상호작용의 분석을 허용하는 광학 현상이다. 추가 설명에 대해, 문헌 [Jonsson, U., 등(1993) Ann . Biol . Clin . 51:19-26]; 문헌 [Jonsson, U., 등(1991) Biotechniques 11:620-627]; 문헌 [Johnsson, B., 등(1995) J. Mol . Recognit . 8:125-131]; 및 문헌 [Johnnson, B., 등(1991) Anal . Biochem. 198:268-277]을 참조한다.
g) 기타 결합 연구
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물의 안정성은 표지 화합물의 결합 분자의 변성되거나 언폴딩된 부분에의 결합을 정량화함으로써 평가될 수 있다. 그러한 분자는 바람직하게 소수성이고, 그것은 바람직하게 통상 본연의 단백질의 내부에 매립되어 있으나 변성되거나 언폴딩된 결합 분자에 노출된 아미노산의 큰 소수성 패치와 결합하거나 상호작용한다. 예시적 표지 화합물은 소수성 형광 염료, 1-아닐리노-8-나프탈린 술포네이트(ANS)이다.
VII . 안정한 단백질의 선택 방법
단백질 안정성의 예측을 위한 상기 방법을 이용하여, 추가 사용되어 후보 단백질(예를 들어 항체)을 선택할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 발현을 위한 단백질을 선택한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 변형을 위한 후보 단백질을 선택한다. 예시적 실시양태에서, 본 발명의 예측 방법을 (예를 들어, 어셉터 면역글로불린의 선택들 위해) 인간외 도너 항체의 인간화에 이용할 수 있다.
후보 단백질을, 본 발명의 방법을 이용하여, 본 발명의 방법을 이용하여 결정되는 그것의 총 일치 스코어 또는 서열 스코어에 기초하여 선택될 수 있다. 특정 실시양태에서, 일치 스코어가 적당한 음성 대조군보다 큰(예를 들어, 5% 초과, 바람직하게는 10% 초과, 더욱 바람직하게는 20% 초과)경우에 후보 단백질이 선택된 다. 다른 실시양태에서, 일치 스코어가 적당한 양성 대조군과 실질적으로 유사한(예를 들어, 20%, 10%, 또는 5% 이내) 또는 (예를 들어, 5% 초과, 바람직하게는 10% 초과, 더욱 바람직하게 20% 초과)인 경우에 후보 단백질이 선택된다.
다른 실시양태에서, 일치 스코어가 이상적 또는 완벽한 일치 스코어와 실질적으로 유사한(예를 들어, 30% 이내, 바람직하게는 20% 이내, 더욱 바람직하게는 10% 이내) 경우에 후보 단백질이 선택된다.
다른 실시양태에서, 서열 스코어가 0 초과인 경우에 후보 단백질이 선택된다. 한 실시양태에서, 서열 스코어가 0.5 초과인 경우에 후보 단백질이 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 서열 스코어가 1 초과인 경우에 후보 단백질이 선택된다. 다른 실시양태에서, 서열 스코어가 2 초과인 경우에 후보 단백질이 선택된다. 한 바람직한 실시양태에서, 서열 스코어가 3 초과인 경우에 후보 단백질이 선택된다.
다른 실시양태에서, Δ 스코어가 -3 이상, -2 이상, 또는 -1 이상, 바람직하게는 0 이상, 더욱 바람직하게는 1 이상인 경우에 후보 단백질이 선택된다.
a. 항체 인간화를 위한 수용체 면역글로불린의 선택
인간화 항체는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산될 수 있고, 예를 들어 문헌 [Queen 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, (1989), 86:10029-10033]; 문헌 [Jones 등, Nature , (1986), 321:522-25]; 문헌 [Riechmann 등, Nature , (1988), 332:323-27]; 문헌 [Yerhoeyen 등, Science , (1988), 239:1534-36]; 문헌 [Orlandi 등, Proc. Natl . Acad . Sci . USA, (1989), 86:3833-37]; 미국 특허 제5,225,539호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 및 제6,180,370호를 참조한다. 인간화를 위해 바람직한 인간외 도너 항체를 선택하였을 때, 예를 들어 발현된 인간 항체 유전자의 서열 데이타베이스, 배아세포주 Ig 서열 또는 수개의 인간 항체의 공통서열로부터 적절한 인간 어셉터 항체를 수득할 수 있다. CDR이 유래되도록 하는 기원인 인간외 가변 프레임워크와 동일하거나 유사한 구조를 인간 가변 도메인 프레임워크가 채택되는 경우, 인간 가변 도메인 프레임워크 내로 인간외 CDR를 치환하는 것이 그들의 공간적 배향을 유지시키게 될 가능성이 크다. 이는, 인간 어셉터 항체의 프레임워크 서열이, CDR이 유래되도록 하는 기원인 인간외 가변 프레임워크와 고도한 서열 일치도를 보이는 인간 어셉터 항체로부터 인간 가변 도메인을 수득함으로써 달성된다. 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역은 동일하거나 상이한 인간 항체 서열로부터 유도될 수 있다. 바람직하게, 인간 어셉터 항체는 도너 항체의 정규 잔기 및 계면 잔기를 유지한다. 추가로, 인간 어셉터 항체의 길이는 바람직하게, CDR 루프와 상당 유사하다(문헌 [Kettleborough 등, Protein Engineering 4:773(1991)]; 문헌 [Kolbinger 등, Protein Engineering 6:971(1993)] 및 WO 92/22653(Carter 등) 참조).
도너 항체 및 적절한 인간 어셉터 항체의 CDR를 확인한 후의 다음 단계는 만약 있다면, 이들 성분들로부터의 어떤 잔기가 생성된 인간화 항체의 성질을 최적화하기 위해서 치환되어져야 하는지를 결정하는 것이다. 전형적으로, 항원 결합을 위해 요구되는, 인간외 도너 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 아미노산 중 일부 또는 모두(예를 들어, 하나 이상의 CDR)를 사용하여 인간 어셉터 항체의 경쇄 또는 중쇄로부터의 상응하는 아미노산을 치환한다. 인간 어셉터 항체는 항원 결합을 위해 요구 되지 않는 아미노산 중 일부 또는 모두를 유지한다. 필요한 경우, 인간화 항체의 항원에 대한 결합 친화도를 보존시키기 위하여 인간 프레임워크 영역내 하나 이상의 잔기는 쥐 항체내 상응하는 위치의 잔기로 변이될 수 있다. 이러한 변이는 종종 "복귀 돌연변이"로 명명된다. 인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 특정 아미노산은 그들이 CDR 구조 및/또는 항원에의 결합에 미칠 수 있는 영향력에 기초하여 복귀 돌연변이에 대해 선택된다.
그러나, 일부 경우에서, 인간화 공정은 인간화 항체에 바람직하지 못한 불안정성을 부여하는 가변 도메인에 대한 비천연 변화를 초래한다. 예를 들어, 어셉터 면역글로불린은 낮은 안정성을 부여하는 희귀한 서열 변이를 가질 수 있다. 이는 특히, 면역계에 의한 큰 빈도로 사용되지 않을 수도 있는 특정 배아세포주 서열에서 그러하다.
본 발명의 방법은 향상된 인간화 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 당업자가 후보 어셉터 서열(예를 들어, 배아세포주 서열)의 기준 세트를 갖는 어떠한 시험 서열(예를 들어 시험 배아세포주 서열)이 어셉터 서열의 인간화에 사용하기에 적당히 안정한지를 예측하도록 한다. 허용가능한 안정성을 예측하도록 하는 스코어를 가지는(예를 들어, 기준 세트의 평균 일치 스코어에 비해 높은 일치 스코어를 가지는) 시험 어셉터 서열(예를 들어, 배아세포주 서열)이 어셉터 면역글로불린으로 선택될 수 있다.
VIII . 안정화된 scFv 분자 확인을 위한 라이브러리 기재의 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 향상된 단백질 안정성, 예를 들어 향상된 열 안정성을 갖는 scFv 분자를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, (i) scFv 분자를 포함하는 라이브러리를 제공하는 단계; 및 (ii) 적당한 대조군(예를 들어, 대조군 scFv 분자)에 비해 향상된 단백질 안정성을 갖는 후보 scFv 분자를 확인하기 위해 라이브러리를 선별하는 단계를 포함한다. 본원에 사용되는 "후보 scFv 분자"는 하나 이상의 후보 안정화 돌연변이를 scFv 분자에 도입함으로써 형성되는 scFv 분자이고, 여기에서 scFv 분자의 안정성에 대한 후보 안정화 돌연변이의 영향은 선험적으로 공지되어 있지 않으며, 즉 돌연변이가 도입되어, 그 돌연변이가 증가된 안정성을 갖는 scFv 분자를 초래하는지의 여부를 결정하기 위해 평가되어야 하는 scFv 분자가 공지되어 있지 않다. 한 실시양태에서, 후보 scFv 분자는 하나 이상의 후보 안정화 돌연변이를 종래(즉, 비 안정화된) scFv 분자에 도입함으로써 형성된 분자이다. 또 다른 실시양태에서, 후보 scFv 분자는 하나 이상의 후보 안정화 돌연변이를 상기 단락 II에 기재된 안정화된 scFv 분자 중 하나에 도입함으로써 형성된 분자이다.
본원에서의 "후보 scFv 분자"의 라이브러리는 2개 이상, 바람직하게는 약 10개 이상, 특히 바람직하게는 약 100개 이상, 더욱 특히 바람직하게는 약 1000개 이상의 비중복 후보 scFv 분자(예를 들어, 적어도 약 104, 105, 106, 107 또는 108개의 scFv 분자)를 의미한다. 한 실시양태에서, 라이브러리는 무작위화되고 비특정화 돌연변이가 임의의 위치에서 무작위로 생성된다. 또 다른 실시양태에서, scFv 라이브러리는 부분적으로 무작위화되거나 설계되는데, 즉 특정화 아미노산 잔기 또는 부 류의 아미노산 잔기가 scFv의 임의의 위치에서 무작위로 도입되거나, 특정화 아미노산 위치가 비특정화 아미노산, 특별한 부류의 아미노산, 또는 특정화 아미노산과 함께 돌연변이유발을 위해 선택된다. 한 바람직한 실시양태에서, scFv 라이브러리는 scFv 분자의 선택된 잔기를 한정된 부류의 아미노산, 예를 들어 소수성 아미노산, 염기성 아미노산, 친수성 아미노산, 하전된 아미노산, 입체 편향 (소형 또는 대형) 아미노산, 또는 디술피드 결합 형성이 가능한 시스테인으로 치환함으로써 설계된다.
특정 실시양태에서, scFv 라이브러리는 scFv 분자의 가변 영역(VL 및/또는 VH) 내에 도입되는 후보 안정화 돌연변이(들)를 갖는 후보 scFv 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, scFv 라이브러리는 scFv 분자의 scFv 링커 내에 도입되는 후보 안정화 돌연변이(들)를 갖는 후보 scFv 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, scFv 라이브러리는 scFv 분자의 scFv 링커 내에 도입되는 후보 안정화 돌연변이(들) 및 가변 영역(VL 및/또는 VH) 내에 도입되는 후보 안정화 돌연변이(들)를 갖는 후보 scFv 분자를 포함한다.
a. scFv 라이브러리의 설계
scFv 라이브러리의 설계 방법은 분자 모델링 또는 전산 모델링에 의해 보조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 라이브러리 설계는 컴퓨터 가상으로 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, scFv 라이브러리는 하기 두 단계 방법에 의해 설계될 수 있다:
1) (예를 들어 아미노산 치환에 의한) 돌연변이에 의해 변경될 때, 향상된 scFv 안정성을 초래할 것으로 예측되는 scFv 내 표적 아미노산 잔기를 확인하는 단계(여기에서는 "후보 탈안정화 잔기"); 및
2) 표적 아미노산 잔기를 후보 안정화 아미노산 잔기로 치환하는 단계.
단계 #1: 후보 탈안정화 잔기의 확인
특정 실시양태에서, 후보 탈안정화 아미노산 잔기는 서열-기재 분석에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 후보 탈안정화 아미노산 잔기는, scFv의 가변 영역 서열을 가변 영역 서열, 예를 들어 천연 발생 인간 항체의 가변 영역 서열의 기준 세트와 비교하고, 기준 세트 내 상응하는 아미노산 위치에서 비통상적이거나 희귀하는 scFv의 가변 영역 아미노산 잔기를 선택함으로써 확인될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단지 scFv의 가변 영역 서열의 프레임워크 영역만을 분석하고, 한편 scFv 분자의 결합 활성의 저해를 피하기 위해, 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDR)이 보존된다.
특정 실시양태에서, 후보 탈안정화 아미노산 잔기는 상동성 가변 영역 서열의 기준 세트 내 상응하는 위치에서 부재하거나 낮은 빈도로 발견되는 아미노산 잔기이다. 기준 세트의 수집 방법이 상기 단락 III 내지 V에 기재되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 후보 탈안정화 아미노산 잔기는 기준 세트 내 상응하는 위치에서 서열의 10% 미만 내로 존재하는 아미노산 잔기이다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 후보 탈안정화 아미노산 잔기는 기준 세트 내 상응하는 위치에서 서열의 5% 미만 내로 존재하는 아미노산 잔기이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 후보 탈안정화 아미노산 잔기는 기준 세트 내 상응하는 위치에서 서열의 2% 미만(예를 들어, 0.5%, 0.75%, 또는 1%) 내로 존재하는 아미노산 잔기이다.
또 다른 실시양태에서, 후보 탈안정화 아미노산 잔기는 가변 영역 서열의 기준 세트의 일치 서열(즉, 일치 아미노산 잔기)에서 상응하는 위치에 존재하는 아미노산과 상이한 아미노산 잔기이다. 기준 세트의 일치 서열의 결정 방법이 상기 단락 III 및 V에 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 후보 탈안정화 아미노산 잔기는 낮은 일치 스코어를 가지는 아미노산 잔기이다. 아미노산의 일치 스코어 결정 방법이 상기 단락 III 및 V에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 후보 탈안정화 아미노산 잔기는 일치 스코어가 0.5 미만(예를 들어, 0.4 미만, 0.3 미만, 0.2 미만, 또는 0.1 미만)인 아미노산 잔기이다. 한 바람직한 실시양태에서, 후보 탈안정화 아미노산 잔기는 일치 스코어가 0.3 미만인 아미노산 잔기이다.
단계 #2: 후보 안정화 돌연변이의 선택
하나 이상의 후보 탈안정화 아미노산을 확인한 후, 그 다음 단계는 각 탈안정화 아미노산에 대한 하나 이상의 후보 안정화 돌연변이를 선택하는 것이다. 이어서, scFv 라이브러리는 선택되는 각 후보 안정화 돌연변이에 대한 대표적 후보 scFv 분자를 포함하도록 설계될 수 있다.
특정 실시양태에서, 특별한 탈안정화 아미노산의 모든 천연 아미노산 변이체는 후보 안정화 돌연변이(즉, 모든 탈안정화 아미노산에 대한 19 후보 안정화 돌연변이)로서 선택된다.
더욱 바람직한 실시양태에서, 특별한 탈안정화 아미노산의 천연 아미노산 변 이체의 부분집단이 후보 안정화 돌연변이로서 선택된다(즉, 모든 탈안정화 아미노산에 대한 1-18 후보 안정화 아미노산). 한 실시양태에서, 후보 안정화 돌연변이의 부분집단은 한정된 부류의 아미노산, 예를 들어 소수성 아미노산, 염기성 아미노산, 친수성 아미노산, 하전된 아미노산, 또는 입체 편향 아미노산 (소형 또는 대형) 아미노산을 이용한 치환을 포함한다.
한 실시양태에서, 후보 안정화 돌연변이의 부분집단은 상동성 가변 영역 서열의 기준 세트 내 탈안정화 아미노산의 위치에 상응하는 위치에 높은 빈도로 존재하는 아미노산을 이용한 치환을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 후보 안정화 돌연변이는 10% 초과의 빈도로 데이터베이스 내에 존재하는 아미노산을 이용한 치환을 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 아미노산은 15% 초과의 빈도로 존재한다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 아미노산은 20% 초과의 빈도로 존재한다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 아미노산은 25% 초과의 빈도로 존재한다.
또 다른 실시양태에서, 후보 안정화 돌연변이는 기준 세트 내 탈안정화 아미노산의 위치에서 발견되는 일치 아미노산(즉, 가장 빈번한 잔기)을 이용한 치환이다.
또 다른 실시양태에서, 후보 안정화 돌연변이의 부분집단은 탈안정화 아미노산의 위치에서 상동성 가변 영역 서열의 기준 세트 내에 발견되는 모든 아미노산을 이용한 치환을 포함한다. 따라서, 이어서 scFv 라이브러리는 기준 세트 내에 나타내어지는 각 후보 안정화 돌연변이에 대한 대표적 후보 scFv 분자를 포함하도록 설계될 수 있다.
다른 실시양태에서, 후보 안정화 돌연변이의 부분집단은 scFv 분자의 가변 영역의 3차원 구조 또는 모델의 분석(예를 들어, 시각적 조사 또는 전산 분석)에 의해 선별하기 위해, 확인되거나 우위 지정될 수 있다. 폴리펩티드의 3차원 구조는 그것의 생물학적 활성 및 안정성에 영향을 주고, 그 구조는 다수 방식으로 결정되거나 예측될 수 있다. 3차 구조는 공지된 3차원 구조를 가지는 하나 이상의 상동성 단백질 (또는 단백질 복합체)의 3차원 구조의 모델 구축을 이용하여 예측될 수 있다. X-선 결정학이 아마도 가장 잘 공지되어 있는 단백질 구조의 결정 방법이나(따라서, 용어 "결정 구조"는 용어 "구조" 대신에 사용될 수 있음), 원편광 이색성, 광 산란을 이용하거나, 복사 에너지의 흡수 및 방출을 측정함으로써 평가할 수도 있다. 기타 유용한 기법에는 중성자 회절, 핵 자기 공명(NMR) 및 상동성 모델링이 포함된다. 이 모든 방법들이 당업자에게 공지되어 있고, 표준 문헌들(예를 들어, 문헌 [Physical Chemistry, 4th Ed., W.J. Moore, Prentiss-Hall, N.J., 1972], 또는 문헌 [Physical Biochemistry, K.E. Van Holde, Prentiss-Hall, N.J., 1971] 참조), 및 수많은 발행물들에 기재되었다. 이 기법들 중 임의의 기법을 수행하여, scFv 분자(예를 들어, 항체, Fab, 또는 scFv 분자 그 자체)의 가변 영역을 포함하는 분자의 구조를 결정할 수 있다.
가변 영역의 구조는 컴퓨터 가상으로 모델링될 수 있다. 예를 들어, 후보 안정화 돌연변이의 3차원 구조와의 상용성이 탈안정화 돌연변이의 후보 안정화 돌연변이로의 치환에서 전산적으로 모델링함으로써 분석될 수 있다. 후보 안정화 돌연변이는, scFv 분자의 전체 구조와 상용적인 경우, scFv 라이브러리 내에 포함되도 록 선택될 수 있다. 한 실시양태에서, 후보 안정화 돌연변이가 scFv 분자 또는 이의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)의 가변 영역의 본연의 폴딩 또는 구조를 저해하지 않는 경우에 그 후보 안정화 돌연변이가 선택될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 후보 안정화 돌연변이는, 본연의 VL/VH 계면을 형성하는 가변 영역의 능력을 저해하지 않는 경우에 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 후보 안정화 돌연변이는 가변 영역의 구조(예를 들어, 결정 구조 또는 모델)에 측쇄 리팩킹 기법을 적용함으로써 선택될 수 있다. 측쇄 리팩킹 계산에서, 후보 안정화 잔기는 전산적으로 변형될 수 있고, 생성된 돌연변이의 안정성은 전산적으로 평가된다. 측쇄 리팩킹 계산은 변경된 안정성(즉, 변경된 분자내 에너지)을 가지는 돌연변이의 등급화된 목록을 생성시킨다. 전산적으로 평가되는 단백질 돌연변이의 수는 매우 클 수 있는데, 이는 모든 가변 아미노산 위치들이 모든 20종의 표준 아미노산에서 돌연변이화될 수 있기 때문이다. 전산 분석의 결과를 등급화하는 데 사용되는 예시적 전산 알고리즘은 데드-엔드(dead-end) 제거 및 트리 검색 알고리즘을 포함한다(예를 들어, 문헌 [Lasters 등 (Protein Eng. 8:815-822, 1995)], 문헌 [Looger 및 Hellinga(J. Mol . Biol . 307:429-445, 2001)] 및 [Dahiyat 및 Mayo (Protein Sci. 5:895-903, 1996)] 참조). 따라서, 이어서 scFv 라이브러리는 측쇄 리팩킹 계산에 의해 생성된 등급화된 목록에서의 각각의 상위에 등급화된 후보 안정화 돌연변이에 대한 대표적 후보 scFv 분자를 포함하도록 설계될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적어도 상위에 등급화된 돌연변이가 선택된다(예를 들어, 상위 등급화된 돌연변이, 상위 2개의 등급화된 돌연변이, 상 위 3개의 등급화된 돌연변이, 상위 4개의 등급화된 돌연변이, 또는 상위 5개의 등급화된 돌연변이가 선택됨).
b. scFv 라이브러리의 작제
scFv 라이브러리를 포함하는 후보 안정화 돌연변이를 결정한 후, 각종 이용가능한 방법들 중 임의의 방법을 사용하여, 돌연변이를 포함하는 후보 scFv 분자를 생성시킬 수 있다. 그러한 폴리펩티드는, 예를 들어 재조합 방법에 의해 생성될 수 있다. 또한, 유전 코드의 축퇴성(degeneracy)으로 인해, 각종 핵산 서열을 사용하여 각 원하는 scFv를 코딩할 수 있다.
후보 scFv 분자를 코딩하는 핵산 분자의 제조를 위한 당업계에서 인식된 예시적 방법에는 후보 scFv를 코딩하는 사전 제조된 DNA의 부위-지정 (또는 올리고뉴클레오티드-매개) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
부위 지정 돌연변이유발이 바람직한 치환 변이체의 제조 방법이다. 이 기법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Carter 등 Nucleic Acids Res. 13:4431-4443(1985)] 및 문헌 [Kunkel 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488(1987)] 참조). 간략히, DNA의 부위-지정 돌연변이유발를 수행할 때, 모 DNA를 먼저 원하는 돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 그러한 모 DNA의 단일 가닥에 혼성화함으로써 변경시킨다. 혼성화 후, DNA 중합효소를 사용하여, 프라이머로서 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 주형으로서 모 DNA의 단일 가닥을 사용하여, 전체 두 번째 가닥을 합성한다. 이에 따라, 원하는 돌연변이를 코딩 하는 올리고뉴클레오티드를 생성된 이중 가닥 DNA에 도입하고, 이를 이어서 플라스미드 또는 기타 적당한 벡터에 결찰시킬 수 있다.
PCR 돌연변이유발이 또한 후보 scFv 분자의 제조에 적당하다. 문헌 [Higuchi, in PCR Protocols, pp.177-183(Academic Press, 1990)]; 및 문헌 [Vallette 등, Nuc. Acids Res. 17:723-583(1989)]를 참조한다. 간략히, 소량의 주형 DNA를 PCR에서 출발 물질로 사용할 때, 주형 DNA 내 상응하는 영역과 서열이 약간 상이한 프라이머를 사용하여, 프라이머가 주형과 상이한 위치에서만 주형 서열과 상이한 비교적 다량의 특이적 DNA 단편을 생성시킬 수 있다. 또한 제한 부위를 포함하도록 PCR 프라이머를 설계할 수 있고, 이에 따라 PCR 반응의 DNA 생성물이 이어서 플라스미드 또는 기타 적당한 벡터에 직접 결찰될 수 있게 된다.
변이체의 또 다른 제조 방법인 , 카세트 돌연변이유발이 문헌 [Wells 등, Gene 34:315-323(1985)]에 의해 기재된 기법에 기초한다. 출발 물질은 돌연변이화할 출발 폴리펩티드 DNA를 포함하는 플라스미드 (또는 기타 벡터)이다. 돌연변이화할 모 DNA 내의 코돈(들)이 확인된다. 확인된 돌연변이 부위(들)의 각 측면에 독특한 제한 엔도뉴클레아제 부위가 있어야 한다. 그러한 제한 부위가 존재하지 않는 경우, 그것은 상기 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이유발 방법을 이용하여 생성될 수 있고, 이에 이는 출발 폴리펩티드 DNA 내 적절한 위치에 도입된다. 플라스미드 DNA는 이 부위에서 절단되어, 그것을 선형화한다. 제한 부위들 간의 DNA의 서열을 코딩하나 원하는 돌연변이(들)를 함유하는 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드가 표준 절차를 이용하여 합성되고, 여기에서 올리고뉴클레오티드의 2개 가닥은 분리하여 합성된 후, 표준 기법을 이용하여 함께 혼성화된다. 이 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드는 카세트로 지칭된다. 이 카세트는 플라스미드에 직접적으로 결찰될 수 있도록 하기 위해, 선형화 플라스미드의 말단과 상용적인 5' 및 3' 말단을 가지도록 설계된다.
각각의 후보 scFv 분자에 대한 대표적인 핵산은 상기 방법에 의해 생성될 수 있다. 이어서, 핵산은 발현 벡터 내에 클로닝되어, 발현 벡터 라이브러리를 형성할 수 있다. 이어서, 숙주 세포는 수득된 벡터의 라이브러리로 형질전환될 수 있고, 숙주 세포는 각 후보 scFv 분자를 발현하기에 적절한 조건 하에서 배양된다.
c. 선별 방법
본 발명의 scFv 라이브러리를 검정(예를 들어, 고효율 검정)으로 선별하여, 원하는 단백질 안정성을 갖는 후보 scFv 분자를 확인할 수 있다. 그러한 검정은 상기 단락 VI에 기재된 단백질의 안정성 평가 방법들 중 임의의 방법을 이용할 수 있다. 특히 바람직한 방법은 열 자극 검정이다. 그러한 검정 방법은 일반적으로 후보 scFv 분자의 열 안정성을 적당한 대조군의 열 안정성과 비교하는 단계 및 열 안정성이 대조군의 열 안정성보다 큰 경우에 후보 scFv 분자를 선택하는 단계를 포함한다. 예시적 적당한 대조군에는 종래의 scFv 분자, 예를 들어 (Gly4Ser)3 scFv 분자가 포함된다. 후보 scFv 분자가 대조군보다 약 0.1, 약 0.25, 약 0.5, 약 0.75, 약 1, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10℃ 초과로 더 큰 열 안정성을 가지는 경우에, 그 후보 scFv 분자가 선택 될 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 후보 scFv 분자가 대조군보다 약 3℃ 초과로 더 큰 열 안정성을 가지는 경우에, 그 후보 scFv 분자가 선택된다.
scFv 라이브러리는 상이한 검정 포맷으로 제시될 수 있다. 예를 들어, scFv 분자는 용액 내(예를 들어, [Houghten(1992) Biotechniques 13:412-421]), 비이드(문헌 [Lam(1991) Nature 354:82-84]), 칩(문헌 [Fodor(1993) Nature 364:555-556]), 세균(Ladner, 미국 특허 제5,223,409호), 포자(Ladner, 미국 특허 제5,223,409호), 또는 파지(문헌 [Scott 및 Smith(1990) Science 249:386-390]); 문헌 [Devlin(1990) Science 249:404-406]; 문헌 [Cwirla 등(1990) Proc . Natl . Acad. Sci . 87:6378-6382]; 문헌 [Felici(1991) J. Mol . Biol . 222:301-310]; 문헌 [Ladner, 이하 상기와 동일함]) 상에 존재할 수 있다.
특정 예시적 실시양태에서, 후보 scFv 분자는 용액 포맷으로 검정된다. 한 실시양태에서, 각 샘플은 동일한 후보 안정화 돌연변이 또는 돌연변이를 갖는 후보 scFv 분자를 가지는 분취량의 용액을 포함한다. 그러한 용액은 발현 플라스미드 라이브러리로 형질전환된 숙주 세포의 라이브러리로부터 개별 숙주 세포 콜로니를 단리하고, 숙주 세포 콜로니를 scFv 분자의 발현을 용이하게 하는 조건 하에 적절한 용기 내에서 배양함으로써 생성될 수 있다. 한 실시양태에서, 후보 scFv 분자를 숙주 세포로부터 정제하여, 적절한 검정 용액에 재용해시킬 수 있다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 후보 scFv 분자를 절단가능한 신호 펩티드 서열에 융합하여, scFv 분자가 숙주 세포에 의해 숙주 세포 배양 배지에 분비되도록 한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 후보 scFv 분자가 숙주 세포 단백질과 함께 배지에 해리되도록 하는 조건 하에서 배양될 수 있다.
상기 검정 포맷들 중 임의의 것을 자동화하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 로봇식(robotics)을 이용하여, 급속 연속적으로 (예를 들어, 개별 숙주 세포 콜로니로서의) scFv 라이브러리의 각 구성원을 단리할 수 있고, 이에 따라 그것이 분리된 용기에서 검정될 수 있다. 검정 용기의 예에는 마이크로티터 플레이트(예를 들어, 96-웰 마이크로티터 플레이트), 시험관 및 마이크로-원심관이 포함된다.
d. 안정화된 scFv 분자의 추가 최적화
상기 선별 방법에 의해 확인된 안정한 scFv 분자를 리모델링하고, 추가 최적화하여, 그것의 단백질 안정성을 더욱 향상시킬 수 있다. 이에 따라, 상기 단계는 초기 최적화 수행에서 확인된 안정한 scFv 분자를 이용하여 반복될 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 안정화된 scFv 분자로부터의 안정화 돌연변이를 단일 scFv 분자에서 조합하여, 단백질 안정성을 더욱 향상시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 확인된 안정한 scFv 분자를 추가 최적화할 수 있다. 예를 들어, 하기 부가적 변경들 중 하나 이상을 행할 수 있다. 한 실시양태에서, 안정화된 scFv 분자를 VL 도메인 내의 아미노산을 VH 도메인 내의 아미노산에 연결하는 디술피드 결합을 도입함으로써 추가 안정화할 수 있다. 예시적 디술피드 결합에는 상기 단락 II에 기재된 임의의 디술피드 결합이 포함된다. 특히 바람직한 디술피드 결합은 VH44-VL100이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 확인된 안정한 scFv 분자를, 최적화된 길이 또는 조성을 갖는 scFv 링커를 도입함으로써 추가 최적화한다. 예시적 scFv 링커가 상기 단락 II에 기재되어 있다. 특히 바람직한 scFv 링커는 (Gly4Ser)4이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 확인된 안정한 scFv 분자를, 안정화 돌연변이를 VH 도메인 또는 VL 도메인 중 하나 이상에 도입함으로써 추가 최적화한다.
IX . 결합 분자의 안정화 방법
다른 측면에서, 본 발명은 결합 분자의 안정성 성질을 향상시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 일반적으로 본 발명의 안정화된 scFv 분자를 결합 분자에 도입하거나 부착시키는 단계를 포함한다. 놀랍게도, 본원의 작용 실시예에 나와 있는 바와 같이, 본 발명의 scFv 분자는 그 자체로 안정할 뿐만 아니라, 향상된 안정성을 그 분자가 도입되게 되는 결합 분자에 부여한다. 따라서, 본 발명의 방법은, 좋지 않은 단백질 안정성으로 인해 종종 대규모 제조가 제한되는 상업적으로 가치있는 결합 분자(예를 들어, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체) 및 기타 변형된 항체)의 안정성을 향상시키기 위한 편리하고 신뢰성있는 수단을 제공한다.
안정화된 scFv 분자는 당업계에 공지된 단백질 접합 방법을 이용하여 결합 분자에 도입될 수 있다. 한 실시양태에서, 안정화된 scFv는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 분자의 N-또는 C-말단에 직접 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 비펩티드 링커를 이용하여, 안정화된 scFv를 폴리펩티드의 N-또는 C-말단에 연결한다. 또 다른 실시양태에서, 연결 펩티드를 사용하여, 안정화된 scFv를 폴리펩티드에 연결한다. 한 예시적 실시양태에서, 연결 펩티드는 짧은 gly/ser 풍부 펩티드이다. 예시적 Gly/Ser 풍부 펩티드가 하기 표 1에 열거되어 있다. 기타 예시적 연결 펩티드가 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 국제 PCT 출원 번호 WO 2005/000898 및 WO 2005/000899 참조). 한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv는 S(G4S)3 링커를 이용하여 결합 분자, 예를 들어 항체 분자의 C-말단에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv는 (G4S)5 링커를 이용하여 결합 분자, 예를 들어 항체 분자의 N-말단에 연결된다.
[표 1]
연결 펩티드
Figure 112008072289549-pct00014
한 실시양태에서, 하나 이상의 안정화된 scFv 분자를 항체 분자에 부착시켜, 이중특이적 분자를 제조한다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 안정화된 scFv 분자를 항체 분자에 부착시켜 이중특이적 분자를 제조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 종래의 scFv 분자 또는 종래의 scFv 분자를 포함하는 결합 분자에 비해 증가된 수율을 초래한다. 수율의 평가 방법이 상기 단락 VI에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 안정화된 결합 분자는 안정화되지 않은 결합 분자에 비해 1% 이상의 수율 증가를 가진다. 다른 실시양태에서, 안정화된 결합 분자는 안정화되지 않은 결합 분자에 비해 2% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 또는 100% 이상의 수율 증가를 가진다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 종래의 scFv 분자 또는 종래의 scFv 분자를 포함하는 결합 분자에 비해 감소된 응집을 초래한다. 응집의 평가 방법이 상기 단락 VI에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 안정화된 결합 분자는 안정화되지 않은 결합 분자에 비해 1% 이상의 응집 감소를 가진다. 다른 실시양태에서, 안정화된 결합 분자는 안정화되지 않은 결합 분자에 비해 2% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 또는 100% 이상의 응집 감소를 가진다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 종래의 scFv 분자 또는 종래의 scFv 분자를 포함하는 결합 분자에 비해 증가된 장기 안정성 또는 반감기를 초래한다. 반감기의 평가 방법은 상기 단락 VI에 기재된 % 손실율 또는 % 단백질분해율을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 안정화된 결합 분자는 안정화되지 않은 결합 분자에 비해 1일 이상의 반감기 증가를 가진다. 이는, 결합 분자의 제조가 전날에 제시된 실질적으로 동일한 양의 안정한 결합 분자를 가진다. 다른 실시양태에서, 안정화된 결합 분자는 안정화되지 않은 결합 분자에 비해 2일 이상, 5일 이상, 1주 이상, 2주 이상, 1개월 이상, 2개월 이상, 6개월 이상, 또는 1년 이상의 반감기 증가를 가진다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 종래의 scFv 분자 또는 종래의 scFv 분자를 포함하는 결합 분자에 비해, 예를 들어 특별한 숙주 세포 유형에서 발현될 때, 향상된 안정성을 초래한다. 예시적 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 결합 분자가 숙주 세포, 예를 들어 세균 또는 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 포유동물) 숙주 세포에서 발현될 때, 증가된 안정성(예를 들어, 증가된 수율)을 가지는 결합 분자의 생성을 초래한다. 예시적 포유동물 숙주 세포에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HELA(인간 자궁경부 암종) 세포, CVI(원숭이 신장 세포주) 세포, COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체) 세포, R1610(차이니즈 햄스터 섬유아세포) 세포, BALBC/3T3(마우스 섬유아세포) 세포, HAK(햄스터 신장 세포주) 세포, SP2/O(마우스 골수종) 세포, BFA-1c1BPT 세포(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구) 세포 및 293 세포(인간 신장)이 포함된다. 한 바람직한 실시양태에서, 2개의 안정화된 scFv 분자가 항체 분자에 부착시켜, CHO 세포에서 분비하기 위한 안정화된 이중특이적 분자를 생성시킨다.
다른 실시양태에서, 안정화된 결합 분자를 발현시킬 수 있는 숙주 세포를 선별하여, 높은 수준의 가용화되고 적절히 폴딩된, 안정화된 결합 분자(예를 들어, 10%만의 응집율을 나타내는 결합 분자)를 발현할 수 있는 단일 세포 단리물을 선택할 수 있다. 그러한 방법은 형광-활성화 세포 분류(FACS) 기법을 이용할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Brezinky 등. J Immunol Meth(2003). 277: 141-155] 참조). 한 실시양태에서, 단일 세포 단리물을 무혈청 조건에 적합화하여, 안정한 생산자 세포주를 구축한다. 이어서, 안정한 생산자 세포주를 배양하여, 본 발명의 안정화된 결 합 분자의 대규모 제조를 용이하게 할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여, 큰 체적의 배양 배지에서의 숙주 세포로부터 발현된 결합 분자의 안정성을 향상시킨다. 예시적 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 결합 분자가 1 리터의 배양 배지에서 발현될 때, 증가된 안정성(예를 들어 증가된 수율)을 초래한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여, 2 리터 이상, 10 리터 이상, 20 리터 이상, 50 리터 이상, 75 리터 이상, 100 리터 이상, 200 리터 이상, 또는 500 리터 이상의 배양 배지에서의 숙주 세포로부터 발현될 때, 증가된 안정성(예를 들어, 수율)을 가지는 안정화된 결합 분자를 생성시킨다. 한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여, 모든 리터의 배양 배지에 대해 10 mg 이상의 안정화된 결합 분자를 생성시킨다.
X. 안정화된 scFv 분자를 포함하는 안정화된 결합 분자
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 융합 단백질이다. 예를 들어, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 제2 scFv 분자 또는 비scFv 분자에 연결될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자가 연결될 수 있는 비scFv 분자는 하나 이상의 부가적 결합 부위를 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 결합 분자에 포함될 수 있는 예시적 결합 부위는 리간드의 수용체 결합 부분, 수용체의 리간드 결합 부분, 효소의 기질 결합 부분, 기질의 효소 결합 부분, 또는 항체의 하나 이상의 항원 결합 부분을 포함한다. scFv 분자는, 예를 들어 항체 분자에 연결되어 변형된 항체 분자를 형성하거나, 기타 폴리펩티드에 연결되어 융합 단백질을 형성할 수 있다. 일부 예가 이하 기재되어 있다.
A. 변형된 항체 분자
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 항체 또는 이의 단편에 연결되어, 변형된 항체인 안정화된 결합 단백질을 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 scFv는 변형된 항체, 즉 비천연 발생 항체 분자에 연결되어 안정화된 결합 단백질을 형성한다. 바람직한 변형된 항체 구성체가 이하 더욱 상세히 기재된다. 본원에 사용되는 용어 "변형된 항체"는 천연 발생이 아닌 변경된 합성 형태의 항체, 예를 들어 2개 이상의 중쇄 부분을 포함하나 2개의 완전한 중쇄를 포함하지 않는 항체(예컨대 도메인 결실 항체 또는 미니보디); 2개 이상의 상이한 항원 또는 단일 항원 상의 상이한 에피토프에 결합되도록 변경된 다중특이적 형태의 항체(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적 항체 등)를 포함한다. 또한, 용어 "변형된 항체"는 다가 형태의 항체(예를 들어, 동일한 항원의 3개 이상의 복사체에 결합하는 3가, 4가 등의 항체)를 포함한다.
본 발명의 결합 분자를 논의할 때, 본원에 기재된 예시적 결합 특이성은 본 발명의 안정화된 scFv 분자, 본 발명의 scFv 분자를 포함하는 결합 분자, 또는 양자 모두에 의해 부여될 수 있음을 이해할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 단백질은 하나 이상의 종양 항원 또는 면역 장애와 관련된 항원과 면역반응성을 가질 것이다. 예를 들어, 신생물성 장애의 경우, 개시된 결합 분자의 결합 부위(즉, 가변 영역 또는 이의 면역반응성 단편 또는 재조합체)는 악성 종양 부위에서 선택된 종양 관련 항원에 결합한다. 마찬가지로, 한 실시양태에서, 결합 분자는 면역 세포 상에 존재하는 하나 이상의 선 택된 마커에 결합할 수 있다. 소정의 수의 보고된 신생물생성 및 면역 장애 관련 항원 및 소정의 수의 관련 항체에서, 당업자는 본원에 개시된 결합 분자가 이에 따라 다수의 전체 항체 중 임의의 것으로부터 유도될 수 있음을 인식할 것이다. 더욱 일반적으로는, 본 발명에 유용한 폴리펩티드는 선택된 조건과 관련된 분자 또는 마커와 반응하는 임의의 항체(문헌에 과거 보고된 것들을 포함함)로부터 수득될 수 있거나 그로부터 유도될 수 있다. 또한, 본 발명의 안정화된 결합 분자를 생성하기 위해 사용되는 모 항체 또는 전구체 항체, 또는 이의 단편은 쥐, 인간, 키메라, 인간화된 것, 인간외 영장류의 것 또는 영장류화된 것일 수 있다.
본원에 사용되는 "종양 관련 항원"은 일반적으로 종양 세포와 관련된, 예를 들어 종양 세포 상에 발현되는 항원을 포함한다. 더욱 일반적으로, 종양 관련 항원은 분자는 비-악성 세포상에서 그의 발현과는 상관없이, 신생물성 세포에서의 면역반응성 항체의 국소화를 제공하는 항원을 포함한다. 그러한 항원은 비교적 종양 특이성일 수 있고, 그의 발현에 있어 악성 세포의 표면에 제한될 수 있다. 대안적으로, 그러한 항원은 악성 및 비-악성 세포 양자 모두에서 발견될 수 있다. 예를 들어, CD20은 비호지킨 림프종 치료용의 면역요법적 항체에 대하여 극도로 유효한 표적이라고 입증되어진, 악성 및 비-악성 세포 양자 모두에서 발견되는 pan B 항원이다. 이와 관련하여, pan T 세포 항원, 예를 들어 CD2, CD3, CD5, CD6 및 CD7은 또한 본 발명이 의미하는 범위내에서 종양 관련 분자를 포함한다. 추가의 다른 예시적인 종양 관련 분자에는 MAGE-1, MAGE-3, MUC-1, HPV 16, HPV E6 & E7, TAG-72, CEA, L6-항원, CD19, CD22, CD37, CD52, HLA-DR, EGF 수용체 및 HER2 수용체가 포 함되나, 이에 한정되지 않는다. 다수의 경우에 있어, 이들 항원들 각각에 대한 면역반응성 항체는 문헌에 보고되었다. 당업자는 이들 항원들 각각이 본 발명에 따라 본 발명의 항체에 대한 전구체로 작용할 수 있음을 인식할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 바람직하게 상기 종양 또는 면역 관련 항원에 회합하고 결합한다. 따라서, 이하 더 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 종양 관련 분자와 반응하는 다수의 항체들중 어느 하나로부터 유도되거나, 생산되거나, 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 통상의 유전자 조작 기술을 사용하여 유도되는 도메인 결실 항체로서, 이로써 하나 이상의 불변 영역 도메인 중 적어도 일부분이 결실되거나 변경됨으로써, 혈청 반감기 감소와 같은 원하는 생화학적 특징을 제공하게 된다. 더욱 특히, 당업자는 본 발명의 안정화된 결합 분자의 가변 및/또는 불변 영역에 상응하는 유전자 서열을 용이하게 단리시킬 수 있고, 적절한 뉴클레오티드를 결실시키거나 변경시켜 본 발명에 따라 단량체성 서브유니트로서 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드를 제공할 수 있다.
종양 관련 분자와 반응하는, 과거 보고된 항체는 본원에 기재된 바와 같이 안정화되어, 본 발명의 안정화된 결합 분자를 제공할 수 있다. 안정화된 결합 분자를 생성시키거나 유도하기 위한 항원 결합 영역을 제공하는 데 사용될 수 있는 예시적인 항체에는 2B8 및 C2B8(제발린(Zevalin)
Figure 112008072289549-pct00015
및 리툭산(Rituxan)
Figure 112008072289549-pct00016
IDEC 파마슈티칼즈 코포레이션(IDEC Pharmaceuticals Corp., 미국 샌디에고 소재), Lym 1 및 Lym 2(테크니콜론(Techniclone)), LL2(이뮤노메딕스 코포레이션(Immunomedics Corp.), 미국 뉴저지주 소재), HER2(헤르셉틴(Herceptin)
Figure 112008072289549-pct00017
제네테크 인코포레이티드(Genentech Inc.), 미국 남부 샌프란시스코 소재), B1(벡사르(Bexxar)
Figure 112008072289549-pct00018
코울터 파마슈티칼즈(Coulter Pharm.), 미국 샌프란시스코 소재), 캠퍼쓰
Figure 112008072289549-pct00019
(밀레니엄 파마슈티칼즈(Millennium Pharmaceuticals), 미국 켐브리지 소재), 아바고보맙(abagovomab)(이탈리아 메나리니 소재), CEA-스캔(Scan)TM(이뮤노메딕스, 미국 뉴저지주 모리스 플레인스 소재), 카르로맙(capromab)(프로스타신트
Figure 112008072289549-pct00020
, 사이토젠 코포레이션(Cytogen Corp.)), 에드레콜로맙(edrecolomab)(파노렉스(Panorex)
Figure 112008072289549-pct00021
, 죤슨앤드죤슨(Johnson & Johnson), 미국 뉴저지주 브룬스윅 소재), 이고보맙(igovomab)(CIS 바이오 인터내셔널(CIS Bio Intl.), 프랑스 소재), 미투모맙(mitumomab)(BEC2, 임클론 시스템즈(Imclone Systems), 미국 뉴저지주 소머빌 소재), 노페투모맙(nofetumomab)(베를루마(Verluma)
Figure 112008072289549-pct00022
, 베링거 잉겔하임(Boehringer Ingleheim), 미국 코네티컷주 리지필드 소재), 오바렉스(OvaRex)(알타렉스 코포레이션(Altarex Corp.), 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재), 사투모맙(satumomab)(오노신트(Onoscint)
Figure 112008072289549-pct00023
, 사이토젠 코포레이션(Cytogen Corp.)), 세툭시맙(cetuximab)(에르비툭스(Erbitux)
Figure 112008072289549-pct00024
, 임클론 시스템즈, 미국 뉴욕주 뉴욕 소재), 베바시주맙(bevacizumab)(아바스틴 ( AVASTIN )
Figure 112008072289549-pct00025
, 제넨테크 인코포레이티드(Genentech Inc.), 미국 캘리포니아주 남부 샌프란시스코 소재), 아폴리주맙(apolizumab)(레미토겐(REMITOGEN)TM), 프로테인 디자인 랩스(Protein Design Labs), 미국 캘리포니아주 프레몬트 소재), 라베투주맙(labetuzumab)(세아사이드(CEACIDE)TM, 이뮤노메딕스 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 모리스 플레인스 소재), 퍼투주맙(pertuzumab)(옴니타르그(OMNITARG) TM , 제네테크 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 남부 샌프란시스코 소재), MB1, BH3, B4, B72.3(사이토젠 코포레이션(Cytogen Corp.)), CC49(미국립암센터(National Cancer Institute)) 및 5E10(아이오와대학(University of Iowa))이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 결합 분자에 도입될 수 있는 기타 결합 부위에는 오르토클론(Orthoclone)OKT3(CD3), 레오프로(ReoPro)(GpIIb/gIIa), 제나팍스(Zenapax)(C25), 레미케이드(Remicade)(TNF-a), 시물렉트(Simulect)(CD25), 사아니지스(Synagis)(RSV), 마이로타르그(Mylotarg)(CD33) 및 캠퍼쓰(CD52)에서 발견되는 것들이 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 바로 전에 열거된 항체와 동일한 종양에 결합할 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 안정화된 결합 분자는 2B8, C2B8, CC49 및 C5E10와 동일한 항원에서 유래되거나 그 항원에 결합할 것이며, 더욱 더 바람직하게는 CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결여되어 있을 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 하기 항체들 중 하나 이상으로부터 유래된 하나 이상의 결합 부위를 가질 것이다: 토시투모맙(tositumomab)(벡사르
Figure 112008072289549-pct00026
), 무로모납(오르토클론
Figure 112008072289549-pct00027
) 및 이브리투모맙(ibritumomab)(제발린
Figure 112008072289549-pct00028
), 세툭시맙(에르비툭스
Figure 112008072289549-pct00029
, 리툭시맙(마브테라(MABTHERA)
Figure 112008072289549-pct00030
/리툭산
Figure 112008072289549-pct00031
), 인플릭시맙(infliximab)(레미케이드
Figure 112008072289549-pct00032
), 아브시식맙(abciximab)(레오프로(REOPRO)
Figure 112008072289549-pct00033
) 및 바 실릭시맙(basiliximab)(시물렉트(SIMULECT)
Figure 112008072289549-pct00034
), 에팔리주맙(efalizumab)(랍티바(RAPTIVA)
Figure 112008072289549-pct00035
, 베바시주맙(bevacizumab)(아바스틴
Figure 112008072289549-pct00036
), 알렘투주맙(alemtuzumab)(캠퍼쓰
Figure 112008072289549-pct00037
), 트라추주맙(trastuzumab)(헤르셉틴(HERCEPTIN)
Figure 112008072289549-pct00038
), 겜투주맙(gemtuzumab)(마일로타르그(MYLOTARG)
Figure 112008072289549-pct00039
), 팔비주맙(palivizumab)(사이나지스(SYNAGIS)
Figure 112008072289549-pct00040
), 오말리주맙(omalizumab)(졸라이어(XOLAIR)
Figure 112008072289549-pct00041
), 다클리주맙(daclizumab)(제나팍스
Figure 112008072289549-pct00042
), 나탈리주맙(natalizumab)(타이사브리(TYSABRI)
Figure 112008072289549-pct00043
) 및 라니비주맙(ranibizumab)(루벤티스(LUVENTIS)
Figure 112008072289549-pct00044
), 아달리무맙(adalimumab)(후미라(HUMIRA)
Figure 112008072289549-pct00045
) 및 판티투무맙(panitumumab)(벡티빅스(VECTIBIX)
Figure 112008072289549-pct00046
).
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 CD23에 결합한다(미국 특허 제6,011,138호). 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 5E8 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 항-CD23 항체, 예를 들어 5E8 항체로부터의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR)를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 TNF 수용체에 결합한다. 한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 LTβR에 결합한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 TRAIL 수용체에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 항-TRAIL-R2 항체(예를 들어, 쥐 또는 키메라 14A2)로부터의 하나 이상의 CDR(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개 CDR)에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화 된 결합 분자는 항-LTβR 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함한다. 항-LTβR 항체의 예에는 BKA11, CDH10, BCG6, AGH1, BDA8, CBE11 및 BHA10이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 CRIPTO-I 항원에 결합한다(WO02/088170 A2 또는 WO03/083041 A2). 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 B3F6 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 항-CRIPTO-I 항체, 예를 들어 B3F6 항체로부터의 하나 이상의 CDR을 포함한다.
한 실시양태에서, 안정화된 결합 분자는 리툭산
Figure 112008072289549-pct00047
과 동일한 종양 관련 항원에 결합할 것이다. (리툭스맙, IDEC-C2B8 및 C2B8로도 공지되어 있는) 리툭산
Figure 112008072289549-pct00048
은 인간 B-세포 림프종 치료용으로서 FDA로부터 최초로 승인받은 단클론성 항체였다(각기 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제5,843,439호; 제5,776,456호 및 제5,736,137호 참조). Y2B8(9OY 표지 2B8; 제발린
Figure 112008072289549-pct00049
; 이브리투모맙 튜세탄)은 C2B8의 쥐 모체이다. 리툭산
Figure 112008072289549-pct00050
은, 성장 억제성이면서 보고에 따르면 시험관내에서 화학요법제에 의해 아포프토시스시키기 위해 특정 림프종 세포주를 감작시키는 키메라성의 항-CD20 단클론성 항체이다. 항체는 인간 보체에 효율적으로 결합하고, 강력한 FcR 결합성을 갖고, 보체 의존성(CDC) 및 항체-의존성(ADCC) 메카니즘의 양자 모두를 통해 시험관내에서 인간 림프구를 효과적으로 사멸시킬 수 있다(문헌 [Reff 등, Blood 83: 435-445(1994)]). 본 개시 내용에 따라 변형된, C2B8 또는 2B8의 이량체성 변이체(동종이량체 또는 이종이량체)가 CD20+악성 종양을 나타내는 환자를 효과 적으로 치료하기 위해 접합된 형태 또는 비접합 형태로 사용될 수 있다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 더욱 일반적으로, 본원에 개시된 폴리펩티드는 다수의 장애들 중 어느 하나를 효과적으로 치료하기 위해 "네이키드(naked)" 또는 비접합 상태로 사용될 수 있거나, 세포독성제에 접합되어 사용될 수 있다는 것은 반복적으로 언급되어야 한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 CC49와 동일한 종양 관련 항원으로부터 유래되거나 이에 결합할 것이다. CC49는 인간 기원의 특정 종양 세포, 특히 LS174T 종양 세포주의 표면에 결합하는 인간 종양 관련 항원 TAG-72에 결합한다. LS174T[미국 미생물 균주 보관 기관(본원에서 ATCC) 번호 CL 188]은 LS180(ATCC 번호 CL 187) 결장 샘암종 계열의 변이체이다. TAG-72에 대한 결합 특이성을 갖는 다수의 쥐 단클론성 항체가 개발되었다는 것이 추가로 인식될 것이다. B72.3로 표시되는, 상기 단클론성 항체들 중 하나는 하이브리도마 B72.3(ATCC No. HB-8108)에 의해 생산된 쥐 IgG1이다. B72.3은 면역원으로서 인간 유방 암종 추출물을 사용하여 개발된 제1 세대 단클론성 항체이다(문헌 [Colcher 등, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 78:3199-3203(1981)]; 및 각기 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제4,522,918호 및 제4,612,282호 참조). TAG-72에 대하여 지정되는 기타 단클론성 항체는 "CC"(결장암용)로 표시된다. 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제5,512,443호(Schlom 등)에 기재된 바와 같이, CC 단클론성 항체는 B72.3로 정제된 TAG-72를 사용하여 제조된 제2 세대 쥐 단클론성 항체의 한 패밀리이다. TAG-72에 대한 결합 친화도가 우수하기 때문에, 하기의 CC 항체들이 ATCC에 기탁되 었고, 이에 대한 사용은 제한될 것을 요청받았다: CC49(ATCC No. HB 9459); CC 83(ATCC No. HB 9453); CC46(ATCC No. HB 9458); CC92(ATTCC No. HB 9454); CC30(ATCC No. HB 9457); CC11(ATCC No. 9455); 및 CC15(ATCC No. HB 9460). 미국 특허 제5,512,443호는 추가로 예를 들어, 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 마우스 불변 영역을 인간 불변 영역(Fc) 도메인으로 치환함으로써 개시된 항체는 그것의 키메라 형태로 변경될 수 있다는 것을 교시한다. 쥐 및 키메라 항-TAG-72 항체를 개시하는 것외에도, Schlom 등은 또한 역시 본원에 참조 인용되는 PCT/US99/25552에 개시된 바와 같은 인간화된 CC49 항체의 변이체, 및 역시 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제5,892,019호에 개시된 단쇄 구성체를 생산하였다. 당업자는 상기 항체, 구성체 또는 재조합체, 및 그의 변이체들 각각이 본 발명에 따른 폴리펩티드를 제공하기 위해 변형되어 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
상기 논의된 항-TAG-72 항체 외에도, 다양한 단체들이 도메인이 결실된 CC49 및 B72.3 항체의 작제 및 부분적 특징분석을 보고하였다(예를 들어, 문헌 [Calvo 등 Cancer Biotherapy, 8(1):95-109(1993)], 문헌 [Slavin-Chiorini 등, Int. J. Cancer 53:97-103(1993)] 및 문헌 [Slavin-Chiorini 등 Cancer. Res. 55:5957-5967(1995)]).
본 발명의 또 다른 실시양태는 C5E10와 동일한 종양 관련 항원으로부터 유래되거나 그 항원에 결합하는 결합 부위를 포함한다. 동시 계류 중인 출원 제09/104,717호에 기재된 바와 같이, C5E10은 전립선 종양 세포주(예를 들어, DU145, PC3, 또는 ND1)에 대해 특이적인 것으로 보이는, 대략 115 kDa의 당단백질 결정자 를 인식하는 항체이다. 따라서, 본 발명과 관련하여, C5E10 항체에 의해 인식되는 동일한, 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 이중특이성 폴리펩티드(예를 들어, CH2 도메인이 결실된 항체)는 신생물성 질병의 치료를 위해 접합된 형태 또는 비접합된 형태로 생산되고 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 안정화된 결합 분자는 ATCC 승인 번호 PTA-865를 갖는 하이브리도마 세포주로부터 분비된 것과 같은 C5E10 항체의 항원 결합 영역의 전체 또는 그의 일부로부터 유래되거나, 그를 포함할 것이다. 이어서, 본원의 방법에 따라 하기 기술하는 바와 같이, 생성된 결합 분자를 방사능핵종에 접합시켜, 전립선암을 앓는 환자에게 투여할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 본원에, 예를 들어 하기 단락 C에 기재된 결합 특이성 중 하나 이상을 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 본원에, 예를 들어 하기 단락 B 또는 C에 기재된 관심 표적 분자에 결합할 수 있다.
면역-세포 장애(예를 들어, B-세포 장애)와 관련된 과거 보고된 항원은 본원에 기재된 바와 같이 안정화되어, 본 발명의 안정화된 결합 분자를 제공할 수 있다. 개시된 안정화된 결합 분자를 생성시키거나 유도하기 위한 항원 결합 영역을 제공하는 데 사용될 수 있는 예시적인 항체에는 항-TNFα 항체(예를 들어, 인플릭시맙(레미케이드
Figure 112008072289549-pct00051
, 센토코르(Centocor), 미국 펜실베니아주 호샴 소재); MAK195-F(아보트 랩스(Abbott Labs.), 미국 일리노이즈주 아보트 파크); 아달리무맙(후미라
Figure 112008072289549-pct00052
, 아보트 랩스, 미국 일리노이즈주 아보트 파크); 항-CD3 항체(예를 들어, 오 르토클론(OKT3)
Figure 112008072289549-pct00053
, 오르토바이오테크(OrthoBiotech), 미국 뉴저지주 브리지워터 소재); MEDI-500(메디뮨(Medimmune), 미국 메릴랜드주 가이터스버그 소재); 비실리주맙(visilizumab)(누비온(NUVION)
Figure 112008072289549-pct00054
, 프로틴 디자인 랩스(Protein Design Labs)(미국 캘리포니아주 프레몬트 소재)), 항-IgE 항체(예를 들어, 오말리주맙(omalizumab), 졸라이어 ( XOLAIR )
Figure 112008072289549-pct00055
, 제네테크(Genentech), 미국 캘리포니아주 남부 샌프란시스코 소재), 항-VLA-4 항체(예를 들어, 타이사브리( TYSABRI )
Figure 112008072289549-pct00056
, 바이오젠덱(Biogenldec), 미국 메릴랜드주 캠브리지 소재), 항-CD 147 항체(예를 들어, ABX-CBL(바브제닉스(Abgenix), 미국 캘리포니아주 프레몬트 소재)), 항-CD25 항체(예를 들어, 바실릭시맙(basiliximab), 시물렉트(Simulect)
Figure 112008072289549-pct00057
(미국 뉴저지주 이스트 하노버 소재); 이놀리모맙(Inolimomab)(OPI, 프랑스 소재), 항-CD 18 항체(예를 들어, 오둘리모맙(odulimomab), 안틸파(Antilfa)
Figure 112008072289549-pct00058
, 파퇴르 메리욱스(Pateur Meriuex)(프랑스), 항-NCA90(예를 들어, 술래소맙(sulesomab), 류코스캔(Leukoscan)
Figure 112008072289549-pct00059
, 이뮤노메딕스(미국 뉴저지주 모리스 플레인스 소재), 항-GpIIb/gIIa 항체(예를 들어, 아브식시맙(abciximab), 에노츠오(ReoPro)
Figure 112008072289549-pct00060
, 센토코르(미국 펜실베니아주 호샴 소재), 항-C25 항체(예를 들어, 제나팍스), 항-CD33 항체(예를 들어, 마일로타르그), 및 항-CD25 항체[예를 들어, 알렘투주맙, 캠퍼쓰
Figure 112008072289549-pct00061
(밀레니엄 파마슈티칼즈, 미국 메릴랜즈주 캠브리지 소재)]가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자가 상기 직전에 열거된 항체와 동일한 면역-세포 연관 항원에 결합할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 용어 "변형된 항체"는, 불변 영역 도메인의 하나 이상의 적어도 한 분획이 결실되었거나, 비공유 이량체화 능력, 종양 부위에서의 국소화 능력 증가, 또는 대략 동일한 면역원성의 전체의 변경되지 않은 항체와 비교 시에 감소된 혈청 반감기 등의 원하는 생물학적 특성을 제공하도록 다른 방식으로 변경된, 면역글로불린, 항체, 또는 이의 면역반응성 단편 또는 재조합을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는, 면역글로불린 중쇄와 유사한 폴리펩티드 사슬을 포함하나 하나 이상의 중쇄 도메인의 적어도 일부가 결여된 도메인 결실 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 안정화된 결합 단백질의 불변 영역의 하나의 전체 도메인이 결실될 것이다. 또 다른 실시양태에서, CH2 도메인의 전부 또는 일부가 결실될 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 단백질은 미니보디이다. 미니보디는, 각기 안정화된 scFv 분자를 포함하는 2개의 폴리펩티드 사슬(단일 폴리펩티드는 하나 이상의 항원 결합 부위, 예를 들어 연결 펩티드를 통해 CH3 도메인에 융합된 VH 도메인에 가요성 링커에 의해 연결된 VL 도메인을 포함함)로 구성된 2량체성 분자이다.
미니바디는 당업계에 기재된 방법을 이용하여 scFv 성분 및 연결 펩티드-CH3 성분을 이용하여 작제함으로써 제조될 수 있다(예를 들어 미국 특허 제5,837,821호 또는 WO 94/09817 A1 참조). 이 성분은 제한 단편으로서 분리된 플라스미드로부터 단리된 후, 적절한 벡터로 결찰되어 재클로닝될 수 있다. 적절한 어셈블리가 제한 분해 및 DNA 서열 분석에 의해 입증될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 4가 미니보디가 작제될 수 있다. 4가 미니보디는 2개의 scFv 분자가, 예를 들어 아미노산 서열(G4S)4G3AS을 갖는 가용성 링크를 이용하여 연결된 것을 제외하고는 상기 미니보디와 동일한 방식으로 작제될 수 있다.
한 실시양태에서, 4가 항체가 항체를 코딩하는 DNA 서열을 scFv 분자와 조합함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 이 서열은 가요성 링커(예를 들어, (Gly4Ser)3와 같은 gly/ser 링커)를 통해 항체의 CH3 도메인에 N-말단으로 연결되도록 조합된다.
또 다른 실시양태에서, 4가 항체는, 안정화된 scFv 분자를 연결 펩티드에 융합하고, 이를 다시 CH1 도메인에 융합하여 안정화된 scFv-Fab 4가 분자를 작제함으로써 제조될 수 있다(문헌 [Coloma 및 Morrison. 1997. Nature Biotechniques. 15:159]; 및 WO 95/09917).
한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 경쇄의 N-말단에 부착된 scFv를 갖는 4가 또는 이중특이적 4가 항체를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 결합 분자는 중쇄의 N-말단에 부착된 scFv를 갖는 4가 또는 이중특이적 4가 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, N-말단에의 scFv의 부착은 scFv가 카르복시-말단에 부착된 분자에 비해 분자의 응집이 감소되도록 한다.
본 발명의 안정화된 결합 분자에 사용하기 위한 항체 또는 이의 단편은 당업계에서 인식된 프로토콜을 이용하여 수득될 수 있고, 예를 들어 관련 항원(예를 들어, 정제된 종양 관련 항원 또는 그러한 항원을 포함하는 세포 또는 세포 추출물) 및 애주번트를 피하 또는 복막내 다중 주입하여 포유동물에서 항체를 바람직하게 유발시킨다. 이러한 면역화는 전형적으로 활성화된 지라 특이세포(splenocyte) 또는 림프구로부터의 항원-반응성 항체의 생산을 포함하는 면역 반응을 유도한다. 생성된 항체를 동물 혈청으로부터 수거하여 다클론성 제제를 제공할 수 있지만, 종종 비장, 림프절 또는 말초 혈액으로부터 개별 림프구를 단리하여, 단클론성 항체(MAb)의 균질 제제를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 바람직하게는, 림프구는 지라로부터 수득된다.
이러한 공지된 방법(문헌 [Kohler 등, Nature 256:495(1975)])에서, 항원 주사를 맞은 포유동물로부터의 비교적 수명이 짧거나 필멸의 림프구를 불멸 종양 세포주(예를 들어, 골수종 세포주)와 융합시켜 불멸이고 B세포의 유전적으로 코딩된 항체를 생성할 수 있는 하이브리드 세포 즉 "하이브리도마"를 생산한다. 생성된 하이브리드를, 단일 항체 형성을 위한 특이 유전자를 포함하는 각각의 개별 계통으로 선택, 희석, 및 재생장시켜, 단일 유전자 계통으로 단리시킨다. 그들은 원하는 항원에 대한 균질한 항체를 생산하며, 그들의 순수한 유전 혈통과 관련하여, "단클론성"이라 명명한다.
이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를, 바람직하게는 비융합 모 골수종 세포의 생장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적당한 배양 배지내에서 시딩하고 배양한다. 당업자는 하이브리도마의 형성, 선택 및 생장을 위한 시약, 세포주 및 배지가 다수의 공급원으로부터 상업적으로 입수가능하며, 표준화된 프로토콜은 잘 확립되어 있다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로, 원하는 항원에 대한 단클론성 항체 생산에 대해서 하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 검정한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해서 생산된 단클론성 항체의 결합 특이성을 면역침전, 방사면역측정법(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 측정법(ELISA)과 같은 시험관내 분석법으로 측정한다. 하이브리도마 세포가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 활성의 항체를 생산한다는 것을 확인한 후, 클론을 한계 희석 방법으로 서브클로닝하고, 표준 방법으로 배양한다(문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp 59-103(Academic Press, 1986)]). 서브클론에 의해서 분비된 단클론성 항체를, 예를 들어 단백질-A, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적 정제 방법으로 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 단리할 수 있다는 것을 추가로 인식할 것이다.
또 다른 실시양태에서, 통상적 방법을 사용하여(예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함), 원하는 단클론성 항체를 코딩하는 DNA를 용이하게 단리하여 시퀀싱할 수 있다. 단리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 이어서 이것을 다르게는 면역글로불린을 생산하지 않는 E. 콜라이 세포, 유인원 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 원핵생물성 또는 진핵생물성 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 더욱 특히, 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제5,658,570호(Newman 등)(1995년 1월 25일 출원)에 기재되어 있는 바와 같이, 단리된 DNA(본원에 기술하는 바와 같이 합성일 수 있음)를 사용하여, 항체의 제조를 위한 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝할 수 있다. 본질적으로, 이것은 선택한 세포로부터의 RNA 추출, cDNA로의 전환, 및 Ig 특이적 프라이머를 사용하는 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 이러한 목적에 적당한 프라이머는 또한 미국 특허 제5,658,570호에 기재되어 있다. 하기에 더욱 상세하게 논의되는 바와 같이, 원하는 항체를 발현시키는 형질전환된 세포를 비교적 대량으로 성장시켜, 면역글로불린을 임상적 및 상업적 공급량을 제공할 수 있다.
당업자는 또한, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항원 결합 부위)을 코딩하는 DNA는 예를 들어, pd 파지 또는 Fd 파지미드 기술을 사용함으로써 항체 파지 라이브러리로부터 유도될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예시적인 방법은 예를 들어 각기 본원에 참조 인용되는, EP 368 684 B1; 미국 특허 제5,969,108호, 문헌 [Hoogenboom, H.R. 및 Chames. 2000. Immunol . Today 21:371]; 문헌 [Nagy 등, 2002. Nat . Med . 8:801]; 문헌 [Huie 등, 2001. Proc . Natl . Acad . Sci USA 98:2682]; 문헌 [Lui 등, 2002. J. Mol . Biol . 315:1063]에 기재되어 있다. 문헌 [Marks 등, Bio / Technology 10:779-783(1992)]와 같은 수개의 간행물은 큰 파지 라이브러리를 작제하기 위한 전략으로서, 사슬 셔플링(shuffling)뿐만 아니라 복합 감염 및 생체내 재조합에 의한 고친화도 인간 항체의 생산을 기재하였다. 또 다른 실시양태에서, 리보솜 디스플레이를 사용하여 디스플레이 플랫폼으로서 박테리오파지를 대체할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Hanes 등, Nat . Biotechnol . 18:1287(2000)]; 문헌 [Wilson 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98:3750(2001)]; 또는 문헌 [Irving 등, J. Immunol . Methods 248:31(2001)] 참조). 또 다른 실시양태에서, 항체에 대하여 세포 표면 라이브러리를 선별할 수 있다(문헌 [Boder 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:10701(2000)]; 문헌 [Daugherty 등, J. Immunol. Methods 243:211(2000)]). 그러한 절차는 단클론성 항체의 단리 및 그 후의 클로닝에 있어서 전통적인 하이브리도마 기술에 대한 대안을 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자의 결합 부위가 인간 또는 실질적 인간 항체에 의해 제공될 수 있다. 인간 또는 실질적 인간 항체는 내인성 면역글로불린을 생산할 수 없는 트랜스제닉(transgenic) 동물(예를 들어, 마우스)에서 제조될 수 있다(예를 들어, 각기 본원에 참조 인용되는, 미국 특허 제6,075,181호, 제5,939,598호, 제5,591,669호 및 제5,589,369호). 예를 들어, 키메라 및 배아세포주 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역의 동종접합 결실은 내인성 항체 생산을 완전히 저해한다고 기재되어 있다. 인간 면역글로불린 유전자 배열을 그러한 배아세포주 돌연변이 마우스로 전이시킬 경우, 항원 자극(challenge)시 인간 항체를 생산할 것이다. SCID 마우스를 사용하여 인간 항체를 생산하는 또 다른 바람직한 수단이 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제5,811,524호에 기재되어 있다. 이러한 인간 항체와 관련된 유전 물질도 또한 본원에 기재한 바와 같이 단리하여 조작할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
재조합 항체를 생산하기 위한, 매우 효율적인 또 다른 수단이 문헌 [Newman, Biotechnology 10: 1455-1460(1992)]에 개시되어 있다. 특히, 이 기술은 원숭이 가변 도메인 및 인간 불변 서열을 포함하는 영장류화된 항체를 생산한다. 이 참조문 헌의 전적으로 본원에 참조 인용된다. 또한, 이 기술은 또한 공동 양도된, 각기 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제5,658,570호, 제5,693,780호 및 제5,756,096호에 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, 미세조작에 의해서 림프구를 선택하고, 가변 영역을 단리할 수 있다. 예를 들어, 말초 혈액 단핵 세포를 면역화된 포유동물로부터 단리하여, 약 7일 동안 시험관내 배양할 수 있다. 선별 기준을 충족시키는 특이적 IgG에 대하여 상기 배양물을 선별할 수 있다. 양성 웰로부터 세포를 단리할 수 있다. 개별 Ig-생산 B 세포는 FACS에 의해서 또는 보체-매개 용혈판 분석법으로 그들을 확인하여 단리할 수 있다. Ig-생산 B 세포를 관 속으로 미세조작할 수 있고, 예를 들어 RT-PCR을 사용하여 VH 및 VL 유전자를 증폭시킬 수 있다. VH 및 VL 유전자를 항체 발현 벡터로 클로닝하고, 세포(예를 들어, 진핵 세포 또는 원핵 세포) 내로 형질감염시켜, 발현시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 결합 분자의 생산에 유용한 유전 서열은 다수의 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 상기에서 광범위하게 논의된 바와 같이, 다양한 인간 항체 유전자는 공공연하게 입수가능한 기탁물 형태로 이용가능하다. 항체 및 항체-코딩 유전자의 다수의 서열이 공개되어 있고, 적당한 항체 유전자는 당업계에 인식된 기술을 사용하여 상기의 서열로부터 화학적으로 합성될 수 있다. 본 발명의 이러한 일면과 상용적인 올리고뉴클레오티드 합성 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 이는 수개의 상업적으로 입수가능한 자동 합성기들중 임의의 것을 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 여러 유형의 중쇄 및 경쇄를 코딩하 는 DNA 서열은 상업적 DNA 합성 업체의 서비스를 통해 수득될 수 있다. 이어서, 상기 방법들 중 임의의 것을 사용하여 수득한 유전 물질은 본 발명의 폴리펩티드를 제공하고 수득하기 위해서 변경되거나 합성될 수 있다.
대안적으로, 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 항체-생산 세포주를 선택 및 배양할 수 있다. 그러한 기술은 다양한 실험실용 메뉴얼 및 예비 문헌에 기재되어 있다. 이와 관련하여, 하기 기재하는 바와 같이 본 발명에 사용하기 적당한 기술이 본원에 전체적으로 참조 인용되는 문헌 [Current Protocols in Immunology, Coligan 등, Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York(1991)](부록 포함)에 기재되어 있다.
본 발명의 범주내 항원 결합 DNA 서열의 모든 대립유전자, 변이체 및 돌연변이를 포함된다는 것도 추가로 인식될 것이다.
공지되어 있는 바와 같이, RNA는 구아니디늄 이소티오시아네이트 추출 및 석출, 및 이에 후속되는 원심분리 또는 크로마토그래피와 같은 표준 기술에 의해서 본래의 하이브리도마 세포로부터 또는 다른 형질전환 세포로부터 단리될 수 있다. 원하는 경우, 올리고 dT 셀룰로오스에서의 크로마토그래피와 같은 표준 기술에 의해서 전체 RNA로부터 mRNA를 단리할 수 있다. 적당한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
한 실시양태에서, 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 cDNA는 공지되어 있는 방법에 따라 역전사효소 및 DNA 중합효소를 사용하여 동시에 또는 별도로 제조될 수 있다. 일치 불변 영역 프라이머에 의해 또는 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 서열 및 아 미노산 서열에 기초한 더욱 특정의 프라이머에 의해 PCR을 개시할 수 있다. 상기 논의한 바와 같이, PCR은 또한 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 클론을 분리하는데 사용할 수 있다. 이러한 경우, 일치 프라이머 또는 더 큰 상동성 프로브, 예를 들어 마우스 불변 영역 프로브로 라이브러리를 선별할 수 있다.
DNA, 전형적으로 플라스미드 DNA는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 세포로부터 단리하고, 예를 들어 재조합 DNA 기술과 관련된 상기 참조문헌에 상세하게 나타나 있는 공지의 표준 기술에 따라서, 제한 매핑 및 시퀀싱할 수 있다. 물론, DNA는 단리 과정 또는 후속하는 분석 시의 임의의 시점에서 본 발명에 따른 합성의 것일 수 있다. 본 발명의 결합 분자로 사용하기 위한 예시적인 항체 또는 그의 단편은 본원에 기재된 표적을 인식하는 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체의 항원 결합 단편은 당업계에 공지되어 있는 기법을 사용하여 생성될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 완전 항체 분자 및 안정화된 scFv 분자를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 분자 및 안정화된 scFv 분자의 부분을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 항체 및 안정화된 scFv 분자의 단편 또는 부분을 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 도메인 결실 항체 및 안정화된 scFv 분자를 포함할 수 있다. 도메인 결실 항체는 하나 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전부 결실된 항체 부분이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상용적인 안정화된 결합 분자는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 구성체 또는 변이체를 포함할 것이다(ΔCH2 구성체). 다른 바람직한 실시양태의 경우, 결실된 도메인이 짧은 연결 펩티드로 치환됨으로써 가변 영역의 가요성 및 자유로운 운동성을 제공할 수 있다. 당업자는 항체의 대사율을 조절하는 CH2 도메인의 성질에 기인할 때 그러한 구성체가 특히 바람직하다는 것을 인식할 것이다.
도메인 결실 구성체는 IgG1 인간 불변 도메인을 코딩하는 벡터(예를 들어, IDEC 파마슈티칼즈(미국 샌디에고주 소재))를 사용하여 유도될 수 있다(예를 들어, WO 02/060955 A2 및 WO02/096948 A2 참조). 이러한 예시적 구성체를 조작하여 CH3 도메인을 본 발명의 각각의 폴리펩티드의 힌지 영역에 직접 융합시켰다. 다른 구성체에서는, 힌지 영역과 합성 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인은 결실되어 있고, 나머지 CH3 도메인(합성 또는 비합성)은 5 내지 20개의 아미노산 스페이서를 사용하여 힌지 영역에 연결되어져 있는, 상용성 구성체가 발현될 수 있다. 그러한 스페이서를 첨가함으로써, 예를 들어 불변 도메인의 조절 요소가 여전히 유리한 상태로, 접근가능한 상태로 유지되도록 하거나, 힌지 영역이 여전히 가요성인 상태로 유지되도록 할 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인이 짧은 아미노산 스페이서로 치환되어 있고 하부 힌지 영역을 갖는, 도메인 결실 B3F6 구성체(B3F6.ΔCH2 [gly/ser])을 사용할 수 있다. 기타 예시적 연결 펩티드가 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 국제 PCT 출원 번호 WO 2005/000898 및 WO 2005/000899 참조). 이들 연결 펩티드는 본 발명의 결합 분자와 함께 사용될 수 있다. 바람직하게, 연결 펩티드는 CH2 중쇄 도메인 이 결여된 폴리펩티드와 함께 사용된다. 바람직하게, 본 발명과 상용적인 임의의 연결 펩티드는 비교적 비면역원성이고, 본 발명의 폴리펩티드의 비공유 결합을 저해하지 못할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 단량체성 서브유니트 사이의 원하는 공유 또는 비공유 결합을 허용하는 한, 소수의 또는 심지어는 1개의 아미노산의 결실 또는 치환을 갖는 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 예를 들어, CH2 도메인중 선택된 영역에서 1개의 아미노산의 돌연변이도 실질적으로는 Fc 결합을 감소시켜서 종양 국소화를 증가시키기에 충분할 수 있다. 유사하게는, 조정하고자 하는 이펙터 기능(예를 들어, 보체 결합)을 조절하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 간단히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 불변 영역의 그러한 부분적 결실은 항체의 선택된 특성(혈청 반감기)을 향상시키면서, 본 발명의 불변 영역 도메인과 관련된 다른 바람직한 기능은 비변형 상태로 남겨둔다. 또한, 상기에 언급한 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 생산된 구성체의 프로파일을 증진시키는 하나 이상의 아미노산의 치환 또는 돌연변이를 통한 합성일 수 있다. 이와 관련하여, 안정화된 결합 분자의 구조 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지하면서, 보존된 결합 부위(예를 들어, Fc 결합)에 의해서 제공되는 활성은 파괴시킬 수 있다. 추가의 다른 실시양태는, 이펙터 기능과 같은 바람직한 특징을 증진시키거나 더 많은 세포독소 또는 탄수화물 결합을 제공하기 위해서, 불변 영역에 대한 하나 이상의 아미노산 첨가를 포함한다. 그러한 실시양태에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유도된 특이적 서열을 삽입 또는 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
불변 영역이 수개의 이펙터 기능을 매개한다는 것이 당업계에는 공지되어 있다. 예를 들어, 보체의 C1 성분이 항체와 결합하면 보체계가 활성화된다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극시키고, 자가면역 과민증에도 관여할 수 있다. 추가로, 항체는 Fc 영역을 통해 세포에 결합하고, 항체 Fc 영역상의 Fc 수용체 부위는 세포상의 Fc 수용체(FcR)에 결합한다. IgG(감마 수용체), IgE(입실론 수용체), IgA(알파 수용체) 및 IgM(뮤 수용체)를 비롯한, 상이한 부류의 항체에 특이적인 Fc 수용체가 다수 존재한다. 세포 표면상의 Fc 수용체와 항체의 결합은 항체-코팅 입자의 탐식(engulfment) 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 살해 세포에 의한 항체-코팅 표적 세포의 용해(항체-의존성 세포-매개 세포독성, 또는 ADCC로 명명됨), 염증성 매개체의 방출, 면역글로불린 생성의 제어 및 태반 이동을 비롯한 중요하면서도 다양한 생물학적 반응을 다수 유발한다.
한 실시양태에서, 표적 세포를 결실시킬 수 없는 것으로 사료되는 IgG4 항체의 불변 영역을 사용하거나, Fc 변이체(여기에서, 이펙터 기능(들)에 중요한 Fc 영역중의 잔기는 예를 들어, 미국 특허 제5,585,097호와 같이 당업계에 공지된 기술의 사용으로 돌연변이화됨)를 제조함으로써 이펙터 기능은 제거되거나 감소될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화(점 돌연변이 또는 다른 수단을 통해 이루어짐)는 순환하는 안정화된 결합 분자의 Fc 수용체 결합을 저하시킴으로써 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우에는, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시키고, 이로써 혈청 반감기를 저하시키고, 접합 된 세포 독소와의 비특이적 결합을 저하시킬 수 있다. 불변 영역에 대한 추가의 다른 변형을 사용함으로써, 항원 특이성 또는 항체 가요성의 증가에 기인하여 국소화를 증진시킬 수 있는 이황화 결합 또는 올리고당 부위를 변형시킬 수 있다. 더욱 일반적으로, 본원에 기술된 바와 같이 변형된 항체는 용이하게 인식될 수 있거나 인식될 수 없는 미묘한 영향력을 다수 발휘할 수 있다는 것을 당업자는 인식할 것이다. 그러나, 변형에 따른 생성된 생리학적 프로파일, 생체이용성 및 다른 생화학적 효과, 예를 들어 종양 국소화, 생체분포 및 혈청 반감기는 공지된 면역학적 기술을 사용하여, 부당한 실험 없이 용이하게 측정되고 정량화될 수 있다.
한 실시양태에서, 변형된 형태의 항체는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 전(whole) 전구체 또는 모 항체로부터 제조될 수 있다. 예시적인 기법은 하기에 더욱 상세히 논의된다.
B. 변형된 융합 단백질
특정 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 변형된 융합 단백질이다. 한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 수용체, 부착 분자, 리간드, 또는 효소의 리간드-결합 영역에 연결된 안정화된 scFv 분자를 포함하는 융합 단백질이다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 리간드의 수용체 결합 부분에 연결된 안정화된 scFv 분자를 포함하는 융합 단백질이다. 예를 들어 본 발명의 결합 분자는 하기 분자들 중 하나 이상에 안정화된 scFv 분자를 포함하는 융합 단백질이다:
사이토카인 또는 사이토카인 수용체
사이토카인은 림프구의 증식, 분화 및 기능성 활성화에 다면발현성 영향을 미친다. 각종 사이토카인류, 또는 그의 수용체 결합 부분은 본 발명의 융합 단백질에서 사용될 수 있다. 예시적인 사이토카인에는 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, 및 IL-18), 콜로니 자극 인자(CSF)(예를 들어, 과립구 CSF(G-CSF), 과립구 큰포식 CSF(GM-CSF), 및 단핵구 큰포식 CSF(M-CSF)), 종양 괴사 인자(TNF) 알파 및 베타, 및 인터페론, 예를 들어 인터페론-α, β 또는 γ가 포함된다(미국 특허 제4,925,793호 및 제4,929,554호).
사이토카인 수용체는 전형적으로 리간드-특이 알파 사슬 및 공통 베타 사슬로 구성된다. 예시적인 사이토카인 수용체에는 GM-CSF, IL-3(미국 특허 제5,639,605호), IL-4(미국 특허 제5,599,905호), IL-5(미국 특허 제5,453,491호), IFNγ(EP 0240975)에 대한 것, 및 TNF 패밀리의 수용체(예를 들어, TNFα(예를 들어, TNFR-1(EP 417,563), TNFR-2(EP 417,014) 림프독소 베타 수용체)가 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 scFv 분자는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체에 결합할 수 있다.
부착 단백질
부착 분자는 세포가 서로 상호작용할 수 있도록 하는 막에 결합된 단백질이다. 백혈구 귀소(homing) 수용체 및 세포 부착 분자를 비롯한, 또는 그의 수용체 결합 부분의 각종 부착 단백질이 본 발명의 결합 분자 내에 도입될 수 있다. 백혈구 귀소 수용체는 염증시 백혈구 세포 표면상에서 발현되고, 세포외 기질 성분과의 결합을 매개하는 β1-인테그린(예를 들어, VLA-1, 2, 3, 4, 5, 및 6), 및 혈관 내피상의 세포 부착 분자(CAM)에 결합하는 β2-인테그린(예를 들어, LFA-1, LPAM-1, CR3, 및 CR4)을 포함한다. 예시적인 CAM으로는 ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, 및 MAdCAM-1을 포함한다. 다른 CAM으로는 E-셀렉틴, 1-셀렉틴 및 P-셀렉틴을 비롯한 셀렉틴 계의 것들을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 scFv 분자는 부착 단백질 또는 부착 단백질 수용체에 결합할 수 있다.
케모카인
감염 부위로 백혈구가 유주하도록 자극시키는 화학 주성 단백질인 케모카인 또는 이의 케모카인 수용체 결합 부분도 또한 본 발명의 결합 분자 내로 도입될 수 있다. 예시적인 케모카인은 대식세포 염증성 단백질(MIP)(MIP-1-α 및 MIP-1-β), 호중구 주성 인자, 및 RANTES(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 scFv 분자는 케모카인 또는 수용체에 결합할 수 있다.
성장 인자 또는 성장 인자 수용체
성장 인자 또는 그의 수용체 (또는 이의 수용체 결합 부분 또는 리간드 결합 부분) 또는 그와 결합하는 분자가 본 발명의 결합 분자 내에 도입될 수 있다. 예시적인 성장 인자에는 안지오포이에틴, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 그의 아형(미국 특허 제5,194,596호); 표피 성장 인자(EGF); 섬유모 세포 성장 인자(FGF)(aFGF 및 bFGF 포함); 심방 나트륨 이뇨 인자(ANF); 간 성장 인자(HGF)(미국 특허 제5,227,158호 및 제6,099,841호), 신경영양 인자, 예를 들어 골-유래 신경영양 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β 혈소판-유래 성장 인자(PDGF)(미국 특허 제4,889,919호, 제4,845,075호, 제5,910,574호 및 제5,877,016호); 형질전환 성장 인자(TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타(WO 90/14359), 골 형태형성 단백질(BMP)을 포함하는 골유도 인자; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF)-I 및 IGF-II; 미국 특허 제6,403,764호 및 제6,506,874호); 에리트로포에틴(EPO); 줄기-세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(c-MpI 리간드), 및 Wnt 폴리펩티드(미국 특허 제6,159,462호)가 포함된다.
사용될 수 있는 예시적인 성장 인자 수용체로는 EGF 수용체(EGFR); VEGF 수용체(예를 들어, Flt1 또는 Flk1/KDR), PDGF 수용체(WO 90/14425); HGF 수용체(미국 특허 제5,648,273호 및 제5,686,292호); IGF 수용체(예를 들어, IGFR1 및 IGFR2), 및 NGF, BDNF, 및 NT-3에 결합하며, p75NTR 또는 p75로도 명명되는 저친화도 수용체(LNGFR), 및 수용체 티로신 키나제의 trk 패밀리의 구성원인(예를 들어, trkA, trkB(EP 455,460), trkC(EP 522,530)) 고친화도 수용체를 비롯한 신경영양 수용체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, IGFR1 및 VEGF 모두가 표적화된다. 추가의 또 다른 실시양태에서, VLA4 및 VEGF 모두가 표적화된다.
다른 세포 표면 수용체 및/또는 그의 리간드도 또한 표적화될 수 있다(예를 들어, TNF 패밀리의 수용체 또는 그의 리간드(본원에서 더욱 상세하게 기술된 바와 같음)).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 scFv 분자는 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합할 수 있다.
호르몬
본 발명의 결합 분자에서 표적화제로서 사용하기 위해 그에 결합하는 예시적 성장 호르몬 또는 분자에는, 레닌, 인간 성장 호르몬(HGH)(미국 특허 제5,834,598호), N-메티오닐 인간 성장 호르몬; 소 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상샘 호르몬(PTH); 갑상샘 자극 호르몬(TSH); 티록신; 프로인슐린 및 인슐린(미국 특허 제5,157,021호 및 제6,576,608호); 난포 자극 호르몬(FSH), 칼시토닌, 황체 형성 호르몬(LH), 렙틴, 글루카곤; 봄베신; 소마트로핀; 물러관 억제물질; 릴랙신 및 프로릴랙신; 생식샘 자극호르몬-관련 펩티드; 프로락틴; 태반 젖샘 자극 호르몬; OB 단백질; 또는 뮐러관 억제 물질이 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 scFv 분자는 호르몬 또는 호르몬 수용체에 결합할 수 있다.
응고 인자
본 발명의 결합 분자에서 표적화제로서 사용하기 위한 예시적 혈액응고 인자에는 응고 인자(예를 들어, V, VII, VIII, X, LX, XI, XII 및 XIII형 인자, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)); 조직 인자(미국 특허 제5,346,991호, 제5,349,991호, 제5,726,147호 및 제6,596,84호); 트로빈 및 프로트롬빈; 섬유소 및 섬유소원; 플라스민 및 플라스미노겐; 플라스미노겐 활성제, 예로서, 우로키나아제 또는 인간 뇨 또는 조직형 플라스미노겐 활성제(t-PA)가 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 scFv 분자는 응고 인자에 결합할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 단백질은 변형된 이뮤노어드헤신이다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 이뮤노어드헤신은 수용체, 부착 분자, 리간드, 또는 효소의 표적-결합 영역을 항체의 Fc 영역과 조합하는 융합 단백질이다. 예시적 이뮤노어드헤신은 예를 들어 각기 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제5,1 16,964호; 제5,428,130호; 제5,714,147호; 및 제6,406,697호에 기재되어 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 변형된 이뮤노어드헤신은 안정화된 scFv 분자를 이뮤노어드헤신에 연결함으로써 형성된다.
과거 보고된 이뮤노어드헤신은 본원에 기재된 바와 같이 안정화되어, 본 발명의 변형된 이뮤노어드헤신을 제공할 수 있다. 개시된 변형된 이뮤노어드헤신을 생성시키거나 유도하는 데 사용될 수 있는 예시적 이뮤노어드헤신에는 아바테셉트(abatecept)(오렌시아(Orencia)
Figure 112008072289549-pct00062
, 브리스톨-메이어스 스퀴브(Bristol-Meyers Squibb), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재), 알레파셉트(alefacept)(마베바이브(Amevive)
Figure 112008072289549-pct00063
, 바이오젠덱(Biogenldec), 미국 매사츄세츠주 캠브리지 소재), 에타네르셉트(etanercept)(엔브렐(Enbrel)
Figure 112008072289549-pct00064
, 암젠(Amgen), 미국 캘리포니아주 싸우전드 오크스 소재), 스마트(SMART)TM 항-감마 인터페론(프로틴 디자인 랩스(Protein Design Labs), 미국 캘리포니아주 프레몬트 소재), 스마트TM 항-L-셀렉틴(프로틴 디 자인 랩스, 미국 캘리포니아주 프레몬트 소재), 리놀라셉트(rilonacept)(레게네론 파마슈티칼즈 인코포레이티드(Regeneron Pharmaceuticals Inc.), 미국 뉴욕주 태리타운 소재), 레가비루맙(regavirumab)(TI-23, 데이진 아메리카(Teijin America), 미국 뉴욕주 뉴욕 소재), R24(미국립 암센터(미국 매릴랜드주 베쎄스다 소재), 오프렐베킨(Oprelvekin)(뉴메가(NEUMEGA)
Figure 112008072289549-pct00065
, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute), 미국 매사츄세츠주 캠브리지 소재), 온콜리신(ONCOLYSIN) B, 온콜리신 CD6, 온콜리신 M 및 온콜리신 S(이 모두 이뮤노젠 인코포레이티드(ImmunoGen Inc.) 제품임, 미국 매사츄세츠주 캠브리지 소재, USA), 온콜림(ONCOLYM)TM 131(테크니클론 코포레이션(Techniclone Corp.), 미국 캘리포니아주 터스틴 소재), 이뮤레이트(ImmuRAIT)-LL2(이뮤노메딕스 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 모리스 플레인스 소재), IL-4 RA(베이(BAY) 16-9996; 바이엘 코포레이션(Bayer Corp.), 미국 캘리포니아주 버클리 소재), IC14(ICOS 코포레이션(ICOS Corporation), 미국 워싱턴주 보텔 소재), CYT-356-Y-90(온코래드(ONCORAD)
Figure 112008072289549-pct00066
PR, 사이토젠 코포레이션, 미국 뉴저지주 프린스톤 소재), 코타라(COTARA)TM(테크니클론 코포레이션, 미국 캘리포니아주 터스틴 소재), CMB-401(웨이쓰 파마슈티칼즈(Wyeth Pharmaceuticals), 미국 뉴저지주 매디슨 소재), 아비시딘(AVICIDIN)
Figure 112008072289549-pct00067
접합체(네오르스 코포레이션(NeoRx Corp.), 미국 워싱턴주 시애틀 소재) 및 항-CD 18 이뮤노어드헤신(제넨테크 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 남부 샌프란시스코 소재)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 결합 분자에 포함될 수 있는 또 다른 예시적 분자는 면역글로불린 수퍼 패밀리 구성원 9이다(IGSF9; Genomics. 2002. 79:663-70).
C. 결합 특이성
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 세포의 표면 상에 존재하거나 가용성인 표적 분자에 결합한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자의 하나 이상의 결합 특이성은 촉매성이다. 촉매 결합 특이성은 당업계에서 인식된 기법에 의해 이루어질 수 있다(예를 들어 미국 특허 제6,590,080호, 미국 특허 제5,658,753호 참조). 촉매 결합 특이성은 전이 상태를 안정화하기 위한 효소를 확인하는 기작과 유사한 다수의 기초 기작에 의해 작용할 수 있고, 이로써 활성화의 자유 에너지가 감소된다. 예를 들어, 일반 산 및 염기 잔기가 촉매 활성 부위 내 촉매작용에 관여하도록 최적으로 위치할 수 있고; 공유 효소-기질 중간체가 형성될 수 있으며; 촉매 항체는 또한 반응을 위해 적절한 배향으로 있고, 7차원 등급 이상으로 반응물의 유효 농도를 증가시키며(문헌 [Fersht, A. R. 등, Am. Chem. Soc. 90(1968):5833]), 이로써 화학적 반응의 엔트로피가 크게 감소된다. 마지막으로, 촉매 항체는 기질 결합 시에 수득되는 에너지를 전환시켜, 구조 유사 전이 상태쪽으로 반응을 변형시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 산 또는 염기 잔기는 면역원으로서 상보적 하전 분자를 이용함으로써 결합 부위로 도입될 수 있다. 이 기법은 양성적으로 하전된 암 이온을 함유하는 합텐으로 항체를 유도해내는 데 성공적인 것으로 입증되었다(문헌 [Shokat 등, Chem. Int. Ed. Engl. 27(1988):269-271]).
또 다른 접근법에서, 항체는 원하는 반응의 전이 상태의 크기, 형상 및 전화와 유사한 안정한 화합물(즉, 전이 상태 유사체)로 유도해낼 수 있다. 동물을 면역화하기 위한 전이 상태 유사체의 사용 및 촉매 항체의 생성을 기재하고 있는 미국 특허 제4,792,446호 및 미국 특허 제4,963,355호를 참조한다. 이 양자 특허 모두는 본원에 참조 인용된다. 한 실시양태에서, 그러한 분자는 예를 들어 면역원성 담체 분자, 예컨대 KLH와의 면역접합체의 일부로서 투여될 수 있다.
예시적 촉매 결합 특이성은 예를 들어 에스테라제 활성(정전 및 형상 특징이 포스포네이트 구조에 의해 모방될 수 있는 하전된 전이 상태와 연관됨; 문헌 [Jacobs 등, J. Am. Chem. Soc. 109(1987):2174-2176]; 문헌 [Durfor 등, J. Am. Chem. Soc. 110(1988):8713-8714]; 문헌 [Tramontano 등, J. Am. Chem. Soc. 1 10(1988):2282]; 문헌 [Pollack 등, J. Am. Chem. Soc. 1 1 1(1989):5961-5962)]); 펩티다제 또는 아미다제 활성(문헌 [Janda 등, Science 241(1988): 1 188-1 191]; 문헌 [Iverson 등, Science 243 (1989):1184-1188]; 문헌 [Paul 등, Science 244(1989):1158-1162)]; 클라이젠(Claisen) 재정렬(문헌 [Jackson 등, J. Am. Chem. Soc. 110(1988):4841-4842]; 문헌 [Hilvert 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988):4953-4955]; 문헌 [Hilvert 등, J. Am. Chem. Soc. 110(1988):5593-5594)]; 산화환원 반응(문헌 [Shokat 등, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27(1989):269-271)]; 티민 2량체의 광화학 절단(문헌 [Cochran 등, J. Am. Chem. Soc. 110(1988):7888-7890]); 입체특이적 에스테르교환반응 재정렬(문헌 [Napper 등, Science 237(1987): 1041-1043]); 또는 이분자 아미드 합성(문헌 [Benkovic 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988):5355-5358]; 문헌 [Janda 등, Science 241(1988):1188-1191])을 가질 수 있다.
또 다른 접근법에서, 종래의 결합 특이성이 돌연변이화되어, 촉매성이 되도록 할 수 있다.
촉매 항체 활성의 선별 방법이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Reymond, J.L. 2002. Journal of Immunological Methods 269: 125; Mouratou 등 2002. J. of Immunological Methods. 269:147]). 또 다른 실시양태에서, 촉매 B 세포가 예를 들어 미국 특허 제6,590,080호에 기재된 바와 같이 선택될 수 있고, 촉매 B 세포의 선택을 용이하게 하도록 하는 분자를 이용하여 작제될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 촉매 결합 특이성은 두 단계 공정의 일부로서 개발될 수 있다. 촉매 항체는, 두 기가 상호에 대해 반응성 위치에 있도록 하는 방식으로 기질 및 반응성 기 모두를 결합시키는 결합 특성을 나타내는 경우에만 선택될 수 있다. 두 번째로는, 선택된 항체는 항체의 결합 포켓에 반응성 기를 공유 결합시킴으로써 화학적으로 조작될 수 있다.(문헌 [J. Immunol. Methods. 2002. 269:81-98]).
한 실시양태에서, 촉매 결합 특이성은 프로드러그에 대해 특이적이다. 그러한 결합 특이성은 생체내 효과적인 약물로 프로드러그를 전환시키는 것을 촉매하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 촉매화된 반응은 생체내 천연 효소에 의해 달성될 수 없는 반응이다. 항체에 의한 프로드러그 활성화의 예가 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Miyashita 등 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5337] 참조).
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 표적 세포에 대한 하나 이상의 결합 특이성 및 프로드러그에 대한 하나 이상의 결합 특이성을 포함한다. 예를 들어, 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 종양 세포에 대한 하나 이상의 결합 특이성 및 세포독성 약물로 전환될 수 있는 프로드러그에 대한 하나 이상의 결합 특이성을 포함한다. 한 예에서, 본 발명의 안정화된 결합 분자는 카르바메이트 프로드러그 4-[N,N,-비스(2-클로로에틸)]아미노페닐-N-[(1S-(1,3-디카르복시)프로필] 카르바베이트에 대한 결합 특이성을 포함하고, 상응하는 세포독성 질소 머스타드를 생성시킨다(문헌 [Wentworth 등 1996. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 93:799]).
한 실시양태에서, 결합 분자는 프로드러그의 투여 전에 투여되어, 표적 세포의 부위에 축적되도록 한다. 예시적 프로드러그가 당업계에 공지되어 있다. 프로드러그는 또한 예를 들어 알돌라제 활성을 갖는 항체에 의해 촉매되는 순차적 역(retro)-알돌/역 마이클 반응에 의해, 촉매 작용으로 해리되도록 설계된 부분을 도입함으로써 합성될 수 있다. (문헌 [Shabat 등 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7428]). 그러한 약물 마스킹 부분은 예를 들어 약물의 히드록실 또는 티올 기의 변형에 의해 제조될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 다중특이적이고, 즉 표적 분자의 제1 표적 분자 또는 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위 및 제1 표적 분자의 제2의 상이한 표적 분자 또는 제2의 상이한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 제2 결합 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자(예를 들어, 이중특이적 결합 분자)는 본원에, 예를 들어 상기 단락 A에 기재된 항체들 중 임의의 항체로부터의 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 이중특이적이다. 이중특이적 분자는 2개의 상이한 표적 부위에, 예를 들어 동일한 표적 분자 또는 상이한 표적 분자 상에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체의 경우, 이중특이적 분자는 2개의 상이한 에피토프에, 예를 들어 동일한 항원 또는 2개의 상이한 항원 상에 결합할 수 있다. 이중특이적 분자는 예를 들어 진단 및 치료 용도에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이는 면역검정에 사용하기 위한 효소를 고정화하기 위해 사용될 수 있다. 이는 또한 암, 예를 들어 종양 관련 분자 및 검출가능한 마커(예를 들어, 방사능핵종에 단단히 결합하는 킬레이트화제)에 모두 결합함으로써 암의 진단 및 치료에 사용될 수도 있다. 이중특이적 분자는 또한 예를 들어 세포독성을 특이적 표적에 (예를 들어, 병원체 또는 종양 세포, 및 세포독성 촉발 분자, 예컨대 T 세포 수용체 또는 Fcγ 수용체에 결합함으로써) 지정함에 의해 인간 치료법을 위해 사용될 수도 있다. 이중특이적 항체는 또한 예를 들어 섬유소 용해제 또는 백신 보조제(adjuvant)로서 사용될 수도 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자에는 세포-표면 분자에 지정된 하나 이상의 팔(즉, 결합 부위) 및 가용성 분자에 지정된 하나 이상의 팔을 갖는 분자들이 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 항체는 가용성 분자에 결합하는 2개의 결합 부위를 가진다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명 의 다중특이적 항체는 세포 표면 분자에 결합하는 2개의 결합 부위를 가진다.
본 발명의 다중특이적 결합 분자는 각 특이성에 대해 1가이거나, 각 특이성에 대해 다가일 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 제1 표적 분자와 반응하는 1개의 결합 부위, 및 제2 표적 분자(예를 들어, 이중특이적 항체 분자, 융합 단백질, 또는 미니보디)와 반응하는 1개의 결합 부위를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 분자는 제1 표적 분자와 반응하는 2개의 결합 부위, 및 제2 표적 분자(예를 들어, 이중특이적 scFv2 4가 항체, 4가 미니보디 또는 디아보디)와 반응하는 2개의 결합 부위를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자의 하나 이상의 결합 부위는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 항원 결합 영역이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 제1 표적 분자에 지정된 하나 이상의 안정화된 scFv를 함유하는 하나의 팔 및 제2 표적 분자에 지정된 하나 이상의 안정화된 scFv를 함유하는 제2의 팔을 갖는 2가 항체 또는 항체 변이체이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 중쇄의 C-말단에 연결된 하나 이상의 안정화된 scFv(예를 들어, 2, 3, 또는 4개 scFv)를 포함하는데, 여기에서 scFv는 동일하거나 상이한 결합 특이성을 가진다. 이 유형의 예시적 결합 분자("C-헤르큘레스" 항체)가 도 13에 나와 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 중쇄의 N-말단에 연결된 하나 이상의 안정화된 scFv(예 를 들어, 2, 3, 또는 4개 scFv)를 포함하는데, 여기에서 scFv는 동일하거나 상이한 결합 특이성을 가진다. 이 유형의 예시적 결합 분자("NH-헤르큘레스" 항체)가 도 13에 나와 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 경쇄의 N-말단에 연결된 하나 이상의 안정화된 scFv(예를 들어, 2, 3, 또는 4개 scFv)를 포함하는데, 여기에서 scFv는 동일하거나 상이한 결합 특이성을 가진다. 이 유형의 예시적 결합 분자("NL-헤르큘레스" 항체)가 도 13에 나와 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에 연결된 하나 이상의 안정화된 scFv(예를 들어, 2, 3, 또는 4개 scFv), 및 중쇄의 C-말단에 연결된 하나 이상의 안정화된 scFv(예를 들어, 2, 3, 또는 4개 scFv)를 포함하는데, 여기에서 scFv는 동일하거나 상이한 결합 특이성을 가진다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 제1 표적 분자에 지정된 하나 이상의 scFv 단편을 함유하는 하나의 팔 및 제2 표적 분자에 지정된 하나 이상의 scFv를 함유하는 제2의 팔을 갖는 2가 미니보디이다. 예시적 이중특이적 2가 미니보디 구성체가 도 42에 나와 있다. 도 42에서, CH3 도메인은 그것의 N-말단에서 연결 펩티드에 융합되고, 이는 그것의 N-말단에서 VH 도메인에 융합되며, 이는 그것의 N-말단을 통해 (Gly4Ser)n 가요성 링커에 융합되고, 이는 그것의 N-말단에서 VL 도메인에 융합된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 scFv 4가 미니보디로서, 이 scFv 4가 미니보디의 각 중쇄 부분은 제1 및 제2 scFv 단편을 함유하 고, scFv 분자들 중 하나 이상이 안정화되어 있다. 상기 제2 scFv 단편은 제1 scFv 단편의 N-말단에 연결될 수 있다(예를 들어, 이중특이적 NH scFv 4가 미니보디 또는 이중특이적 NL scFv 4가 미니보디). 이중특이적 N-scFv 4가 미니보디의 예가 도 43에 나와 있다. 대안적으로, 제2 scFv 단편은 상기 제1 scFv 단편을 함유하는 상기 중쇄 부분의 C-말단에 연결될 수 있다(예를 들어, 이중특이적 C-scFv 4가 미니보디). 이중특이적 C-scFv 4가 미니보디의 예가 도 44에 나와 있다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 scFv 단편은 동일하거나 상이한 표적 분자에 결합할 수 있다. 이중특이적 4가 미니보디의 제1 중쇄 부분의 제1 및 제2 scFv 단편이 동일한 표적 분자에 결합하는 경우, 이중특이적 4가 미니보디의 제2 중쇄 부분의 제1 및 제2 scFv 단편 중 하나 이상은 상이한 표적 분자에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 이중특이적 디아보디이고, 이 디아보디의 각 팔은 탄뎀 scFv 단편을 포함하고, 이 탄뎀 scFv 단편들 중 하나 이상이 안정화되어 있다. 한 실시양태에서, 이중특이적 디아보디는 제1 결합 특이성을 갖는 제1 팔, 및 제2 결합 특이성을 갖는 제2 팔을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 45 참조). 또 다른 실시양태에서, 디아보디의 각 팔은 제1 결합 특이성을 갖는 제1 scFv 단편, 및 제2 결합 특이성을 갖는 제2 scFv 단편을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 scFv2 4가 항체로서, 이 scFv2 4가 항체의 각 중쇄 부분은 scFv 분자를 함유하고, scFv 분자들 중 하나 이상은 안정화되어 있다. scFv 단편은 중쇄 부분의 가변 영역의 N-말단에 연결될 수 있다(예를 들어, 이중특이적 NH scFv2 4가 항체 또는 이중특이적 NL scFv2 4가 항체). 대안적으로, scFv 단편은 scFv2 4가 항체의 중쇄 부분의 C-말단에 연결될 수 있다(예를 들어, 이중특이적 C-scFv2 4가 항체, 예를 들어 도 46 참조). scFv2 4가 항체의 각 중쇄 부분은 가변 영역 및 동일하거나 상이한 표적 분자에 결합하는 scFv 단편을 가질 수 있다. 이중특이적 scFc2 4가 항체의 제1 중쇄 부분의 scFv 단편 및 가변 영역이 동일한 표적 분자에 결합하는 경우, 이중특이적 4가 미니보디의 제2 중쇄 부분의 제1 및 제2 scFv 단편 중 하나 이상은 상이한 표적 분자에 결합한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 scFv2 4가 도메인-결실 항체로서, 그 scFv2 4가 항체의 각 중쇄 부분은 scFv 단편을 함유하고, scFv 단편들 중 하나 이상은 안정화되어 있다. scFv 단편은 중쇄 부분의 가변 영역의 N-말단에 연결될 수 있다[예를 들어, 이중특이적 NH scFv2 4가 도메인-결실 항체(도 48 참조) 또는 이중특이적 Nu scFv2 4가 항체(도 49 참조)]. 대안적으로, scFv 단편은 scFv2 4가 도메인-결실 항체의 중쇄 부분의 C-말단에 연결될 수 있다(예를 들어, 이중특이적 C-scFv2 4가 도메인 결실 항체, 예를 들어 도 47 참조).
본 발명의 결합 분자가 결합될 수 있는 예시적 세포-표면 분자는 종양 또는 신생물성 세포의 표면 상에 과발현되는 수용체 또는 종양 세포 항원, 및 본원에, 예를 들어 상기 단락 B에 기재된 바와 같은 사이토카인 수용체, 부착 분자, 또는 성장 인자 수용체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예시적 가용성 분자에는, 예를 들어 본원에, 예를 들어 상기 단락 A에 기재된 것들과 같은 항-종양제(예를 들어, 독소, 화학요법제 및 이의 프로드러그), 가용성 효소(예를 들어, 프로드러그 전환 효소), 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 성장 인자 또는 응고 인자)가 포함된다.
그러므로, 종양 세포 항원 및 항-종양제 또는 가용성 효소 모두에 결합하는 이중특이적 분자는 항암제를 상기 종양 세포 항원을 발현하는 종양 세포에 국소화할 수 있고, 이로써 종양 세포에 대한 항암제의 독성 영향을 최대화하고 정상 세포에 대한 항암제의 독성 효과를 최소화할 수 있다.
종양 항원에 대한 하나 이상의 결합 부위 및 독소에 대한 하나 이상의 결합 부위를 갖는 예시적 이중특이적 결합 분자에는 항-사포린/항-Id-1, 항-CD22/항-사포린, 항-CD7/항-사포린, 항-CD38/항-사포린, 항-CEA/항-리신 A 사슬, 항-인터페론-α(IFN-α)/항하이브리도마 특이형(idiotype), 항-CEA/항-빈카 알칼로이드가 포함된다. 세포-표면 분자에 대한 하나 이상의 결합 부위 및 프로드러그 전환 효소에 대한 하나 이상의 결합 부위를 갖는 예시적 이중특이적 결합 분자에는 예를 들어, 항-CD30/항-알칼리성 포스파타제(이는 미토마이신 인산염 프로드러그의 화학요법 미토마이신 알코올로의 전환을 촉매함)가 포함된다
다른 실시양태에서, 이중특이적 결합 분자는 종양 세포 항원 및 진단제 모두에 결합함으로써, 상기 종양제를 상기 종양 세포 항원을 발현하는 종양 세포에 국소화하고, 시험관내 또는 생체내 종양 검출을 용이하게 한다. 예시적 이중특이적 결합 분자에는 항-CEA/항-EOTUBE, 항-CEA/항-DPTA, 항-CEA/항-β-갈락토시다제 및 항-p185HER2/항-합텐이 포함된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 비종양 세포 상의 세포 표면 분자(예를 들어, 면역 세포) 및 가용성 분자(예를 들어 가용성 항원)에 모두 결합한다. 예를 들어, 그것은 표면 가용성 면역 복합체가 면역 세포 상의 세포 표면 수용체를 표적으로 하는 데 사용될 수 있고, 이로써 세포-매개 면역 기작에 의해 신체로부터의 소거가 용이하게 된다. 이 유형의 예시적 이중특이적 분자에는 항-저밀도 지질단백질(LDL)/항-Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII)) 및 감염성 질병의 치료에 사용하기 위한 이중특이적 결합 분자(예컨대, 항-CD3/항-단순 포진 바이러스(HSV), 항-T-세포 수용체:CD3 복합체/항-인플루엔자, 항-FcγR/항-HIV가 포함된다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 세포 표면 수용체 및 이의 가용성 리간드 모두에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 리간드는 TNF 패밀리 수용체의 동족 리간드이다.
이중특이적 결합 분자가 결합할 수 있는 예시적 세포 표면 수용체는 종양 세포 항원 또는 면역 세포 수용체이다. 예시적 세포 표면 수용체에는 또한 본원에, 예를 들어 상기 단락 B에 기재된 바와 같은, 사이토카인 수용체, 부착 분자, 또는 성장 인자 수용체가 포함된다. 예시적 가용성 리간드에는, 예를 들어 상기 단락 B에 기재된 바와 같은 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 성장 인자, 또는 응고 인자가 포함된다.
예시적 이중특이적 결합 분자에는 항-VLA4/항-Mac-1, 항-VLA4/항-VEGF, 항- VLA4/항-안지오포이에틴, 항-VLA4/항-TNFα, 항-IGFR1/항-VEGF, 항-IGFR1/항-안지오포이에틴, 항-IGFR1/항-EGFR, 항-HGF-SF/항-VEGF, 항-HGF-SF/항-안지오포이에틴 및 HGF-SF/임의의 제2 항원이 포함된다(예를 들어, 문헌 [Cao 등 Proc. Natl. Acad. Sci 2001. 98:7443]; 문헌 [Lu 등 2004. J. Biol. Chem. 279:2856] 참조).
다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 제1 가용성 분자(예를 들어, 가용성 리간드)에 대해 지정된 하나 이상의 팔(즉, 결합 부위) 및 제2 가용성 분자(예를 들어, 가용성 리간드)에 대해 지정된 하나 이상의 팔을 갖는 것들이 포함된다. 그러한 이중특이적 결합 분자는 진단용 툴(예를 들어, 항-토끼 IgG/항-페리틴(ferritin), 항-호스래디쉬 퍼옥시다제(horse radish peroxidase)(HRP)/항-호르몬, 항-소마토스타틴/항-물질 P, 항-HRP/항-FITC(문헌 [Nolan 등, 이하 상기와 동일함] 참조) 또는 섬유소 용해제(예를 들어, 항-피브린/항-조직 플라스미노겐 활성화제(tPA), 항-피브린/항-유로키나제 유형의 플라스미노겐 활성화제(uPA))로 이용될 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자가 결합하는 가용성 분자는 TNF 패밀리의 가용성 리간드이다. TNF 패밀리 리간드의 예에는 (TNFR1/TNFRSF1A에 결합하는) LTA, (CD 12ObHWRSF1B에 결합하는) TNF, (LTBR/TNFRSF3에 결합하는) LTB, (OX40/TNFRSF4에 결합하는) OX40L, (CD40/TNFRSF5에 결합하는) CD40L, (Fas/TNFRSF6 및 DcR3/TNFRSF6B에 결합함), CD27/TNFRSF7에 결합하는) CD27L, (CD30/TNFRSF8에 결합하는) CD30L, (4-1-BB/TNFRSF9에 결합하는) 4-1-BB-L, (TRAIL-R1/TNFRSF10A, TRAIL-R2/TNFRSF10B, TRAIL-R3/TNFRSF10C 및 TRAIL-R4/TNFRSF10D에 결합하는) TRAIL, (RANK/TNFRSF11A 및 오스테오프로테그린/TNFRSF11B에 결합하는) RANKL, (APO-3/TNFRSF12 및 DR3L/TNFRSF12L에 결합하는) APO-3L, (TACI/TNFRSF13B에 결합하는) APRIL, (BAFFR/TNFRSF13A에 결합하는) BAFF, (HVEM/TNFRSF14에 결합하는) LIGHT, (LNGFR, 예를 들어 NGF-β, NGF-2/NTF3, NTF5, BDNF, IFRD1에 결합하는) NGF 리간드, (GITR/TNFRSF18에 결합하는) GITRL, EDAR1 & XEDAR 리간드, Fn14 리간드 및 트로이/트레이드 리간드가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
다른 예시적 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 제1 세포-표면 분자에 대한 하나 이상의 결합 부위 및 제2 세포-표면 분자에 대한 하나 이상의 결합 부위를 가진다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 세포-표면 분자는 상이한 세포(예를 들어, 상이한 세포 유형) 상에 위치한다. 예를 들어, 이중특이적 분자는 비종양 세포(예를 들어, 면역 세포) 상의 세포-표면 수용체에 대해 지정된 하나 이상의 팔 및 종양 세포 항원에 대해 지정된 하나 이상의 팔을 가질 수 있다. 이 유형의 예시적 이중특이적 결합 분자에는 종양 세포 항원에 대한 하나 이상의 결합 부위 및 면역 이펙터 세포의 세포독성 촉발 분자(예컨대, 항-FcγRI/항-CD15, 항-p185HER2/FcγRIII(CD16), 항- p185HER2/항-VEGF, 항-CD3/항-악성종양 B-세포(ID10), 항-CD3/항-p185HER2, 항-CD3/항-p97, 항-CD3/항-신장세포 암종, 항-CD3/항-OVCAR-3, 항-CD3/L-Dl(항-결장 암종), 항-CD3/항-멜라닌세포 자극 호르몬 유사체, 항-EGF 수용체/항-CD3, 항-CD3/항-CAMA1, 항-CD3/항-CD19, 항-CD3/MoV18, 항-신경 세포 부착 분자(NCAM)/항-CD3, 항-엽산 결합 단백질(FBP)/항-CD3 및 항-팬 암종 관련 항원(AMOC-31)/항-CD3))에 대해 지정된 하나 이상의 결합 부위를 가지는 것들이 포함된다. 종양 세포 항원 및 세포독성 촉발 분자 모두에 결합하는 이중특이적 분자는 종양 세포를 면역 이펙터 세포와 효과적으로 병렬시킴으로써, 이펙터 세포를 활성화하여 세포-매개 면역 기작에 의해 종양 세포를 파괴할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 이중특이적 결합 분자가 결합할 수 있는 제1 및 제2 세포-표면 분자는 동일한 세포 또는 세포 유형 상에 위치한다. 제1 및 제2 수용체를 동일한 세포 상에 가교함으로써, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 제1 및 제2 수용체 중 하나 또는 양자 모두와 관련된 활성(예를 들어, 신호 전달 활성)을 억제하거나 증진시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 제1 및 제2 세포 표면 분자는 동일한 유형의 것일 수 있다(예를 들어, 동일한 분자 패밀리 내에 속함). 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 및 제2 세포 표면 분자는 구분된 유형의 것이다(예를 들어, 상이한 분자 패밀리에 속함). 이중특이적 결합 분자가 결합하는 예시적 세포 표면 수용체는 종양 세포 항원 또는 면역 세포 수용체를 포함한다. 예시적 세포 표면 수용체는 상기 단락 B에 기재된, 사이토카인 수용체, 부착 분자, 또는 성장 인자 수용체 중 임의의 것이 포함된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자가 결합하는 예시적 표적 분자는 예를 들어, 헤파린 황산염, 성장 인자 또는 이의 수용체(예를 들어, 상피 성장 인자 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 간세포 성장 인자(HGF/SF) 수용체 중 하나 이상의 에피토프를 포함한다(예를 들어, 문헌 [Cao 등 Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. 98:7443]; 문헌 [Lu 등 2004. J. Biol. Chem. 279:2856] 참조).
한 예시적 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자가 결합하는 분자들 중 하나 이상은 TNF 수용체(TNFR) 패밀리의 한 구성원이다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 결합 분자가 결합하는 제1 및 제2 표적 분자는 양자 모두 TNFR 패밀리 구성원이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 TNFR 패밀리 리간드에 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 하나의 TNFR 패밀리 구성원 및 종양 세포의 표면 상에 발현된 항원, 예를 들어 종양 세포 상에 우선적으로 발현된 항원에 결합한다. 단일특이적 TNFR 결합 분자를 이용한 종양의 치료에 있어 제한 인자는, 단지 종양의 부분집단이 종종 상기와 같은 요법에 대해 민감하게 나타난다는 것이다. 다중특이적 TNFR 결합 분자는 특이적으로 TNFR를 활성화하고, 예를 들어 TNFR를 매우 근접하게 함으로써 수용체 신호전달을 증진시킨다. 본 발명은 하나 초과의 TNFR 또는 TNFR 유형에 표적화하고 신호 전달을 증진시킴으로써, 향상된 암 치료 방법을 제공할 수 있는 향상된 이중특이적 TNFR 결합 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, 이중특이적 TNFR 결합 분자는 동일한 유형의 2개 이상의 TNFR에 결합하여 조합되는 TNFR의 수를 증진시킴으로써 신호 강도를 증가시킨다. 또 다른 더욱 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 TNFR 결합 분자는 TNF 패밀리의 2개의 상이한 수용체에 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 이중특이적 TNFR 결합 분자가 결합하는 TNFR 중 하나 이상은 사멸(death) 도메인을 함유한다. 용어 "사멸 도메인"은 TNF 패밀리 수용체에 의해 매개되는 TNF-매개 세포 사멸 또는 아포프토시스 신호전달 및 세포-세포독성 유 도에 관련된 상기 수용체의 세포질 영역을 지칭한다. 이 영역은 어댑터 단백질을 통해 수용체를 카스파제 활성화와 결부시켜, 외인성 사멸 경로가 활성화되도록 한다.
사멸 도메인을 함유하는 TNF 수용체의 예에는 TNFR1(TNFRSF1A), Fas(TNFRSF6), DR-3(TNFRSF6B), LNGFR(TNFRSF16) TRAIL-R1(TNFRSF10A), TRAIL-R2(TNFRSF10B) 및 DR6(TNFRSF21)가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 이 수용체의 아포프토시스 신호 전달은 동족 리간드의 결합 및 하기 수용체-리간드 쌍들 중 임의의 것의 형성 시에 조절된다: TNFR1/TNFα, Fas/FasL, DR-3/DR-3LG, TRAIL-R1 "TRAIL" 또는 TRAIL-R2/TRAIL.
사멸 도메인을 함유하는 TNF 패밀리 수용체를 표적화하는 이중특이적 TNFR 결합 분자가 암 치료에 유용한데, 이는 이 유형의 TNFR가 종종 종양 세포 상에서 과발현되고, 그 수용체의 자극이 종양 세포 아포프토시스를 활성화할 수 있기 때문이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 TNFR 결합 분자가 결합하는 사멸-도메인 함유의 TNFR은 TRAIL-R2이다. TRAIL-R2는 인간 종양 요법에 바람직한데, 이는 그것의 활성화가 간세포 아포프토시스를 촉발하지 않아 감소된 독성을 가지기 때문이다.
사멸 도메인 함유의 수용체, 예를 들어 TNFR1 또는 Fas 중 일부의 활성화가 생체내 용도에서 독성이었으나, 이 수용체를 다른 TNF 수용체에 구속하는 것이 독성을 감소시기 쉽고, 이에 따라 독성 항체의 독성을 감소시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 TNFR 결합 분자는 사멸 도메인을 함 유하는 TNFR에 지정된 하나 이상의 결합 부위 및 사멸 도메인이 결여된 TNFR에 지정된 하나 이상의 결합 부위를 포함한다.
특정 예시적 실시양태에서, 사멸 도메인이 결여된 TNFR에는 조직 분화에 관여하는 TNFR이 포함된다. 이 조직 분화에 관여하는 TNFR 수용체의 예에는 LTβR, RANK, EDAR1, XEDAR, Fn14, 트로이/트레이드 및 NGFR이 포함된다. 조직 분화에 관여하는 TNFR은 동족 리간드의 결합 후 조직 분화에 영향을 미칠 수 있다. 조직 분화에 관여하는 TNFR을 표적으로 하는 TNFR 결합 분자는 수가지 방식으로 종양에 영향을 미칠 수 있다. 먼저, 그것은 세포 사이클 진전을 변경시킴으로써 종양 성장을 직접적으로 감소시키는 가능성을 가진다. 두 번째로, 종양 세포 변환의 부문에 있어서의 조직 분화는 세포 사이클 충돌 및 디폴트 아포프토시스를 초래할 수 있다. 세 번째로, 그러한 충돌 투입으로 세포가 화학요법에 더 민감해질 수 있다.
특정 바람직한 실시양태에서, 조직 분화에 관여하는 TNFR은 림포톡신 β 수용체(LTβR)이다. LTβR은 면역계 내 각종 분화된 기질 세포의 성숙 상태의 조절에 관여하고, 림프절 원기(anlagen)의 기질 성분의 발달 과정 중에 중대한 역할을 한다. 형질전환된 세포 부분에서의 상피 또는 섬유아세포양 세포에서의 발달 프로그램의 활성화가 그 세포의 생존에 유해하고, 이 작용이 LTβR 활성화의 항-종양 활성 중 일부를 설명할 수 있다는 것이 제안되었다. 이 수용체는 또한 케모카인 방출과 관련되거나 면역학적 항-종양 반응을 촉진하는 염증성 프로그램을 개시할 수 있다. 그러한 방출은 종양의 염증성 상태에 영향을 주고/주거나 종양에 대한 면역학적 반응을 촉진하는 림프양 성분의 침투를 촉발할 수 있다. 이에 따라, LTβR에 결 합하는 이중특이적 TNFR 결합 분자는 단독으로 또는 사멸 도메인 함유의 TNF 수용체(예를 들어, TRAIL-R2)와 조합되어 본 발명 내에 포괄될 수 있다.
특정 예시적 실시양태에서, 사멸 도메인이 결여된 TNFR에는 면역 제어에 관여하는 TNFR이 포함된다. 그러한 수용체에는 TNFR2, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, OX40, GITR, TACI, BAFF-R, BCMA 및 RELT가 포함된다. 면역 제어에 관여하는 부가적 TNF 패밀리 수용체에는 TRAIL-R3 및 TRAIL-R4가 포함된다.
종양 형성에 기여하는 기타 표적 TNF 패밀리 수용체는, 각종 종양에 존재하거나 이상적으로 과발현되는 TNF 패밀리 수용체를 한정하도록 하는 각종 세포 유형에서의 수용체 발현의 기존 RNA 데이터베이스를 이용하여 확인될 수 있다. 또한, 기존 RNA 데이터베이스는, 본 발명의 이중특이적 TNFR 결합 분자가 결합하는 TNF 패밀리 수용체의 쌍이 종양 유형 또는 종양의 부분집합 상에 더욱 독특하게 발현되나 정상 조직, 특히 간 및 맥관구조에는 풍부하지 않은 상기 수용체 쌍을 확인함으로써 최적화될 수 있다는 부가적 이점을 제공한다. 그러한 방식으로, 종양에 강한 신호를 전달하여 정상 조직을 이로부터 면하게 하는 수용체 쌍 (또는 그 이상의 것)이 확인된다.
다중특이적 분자의 생성 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 재조합 기법을 사용하여, 다중특이적 분자, 예를 들어 디아보디, 단쇄 디아보디, 탄뎀 scFv 등을 생성시킬 수 있다. 다중특이적 분자의 생성을 위한 예시적 기법이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Kontermann 등 Methods in Molecular Biology Vol. 248: Antibody Engineering: Methods and Protocols. Pp 227-242], US 2003/0207346 A1, 및 이들 문헌 내에 인용된 참조 문헌 참조). 한 실시양태에서, 다량체성 다중특이적 분자는 예를 들어 미국 특허출원 제2003/0207346 A1호 또는 미국 특허 제5,821,333호 또는 미국 특허출원 제US2004/0058400호에 기재된 방법들과 같은 방법을 이용하여 제조된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 결합 분자는 다중특이적 융합 단백질이다. 본원에 사용되는 어구 "다중특이적 융합 단백질"은 2개 이상의 결합 특이성을 갖는 (즉, 리간드 또는 수용체의 결합 도메인을 조합하는) (상기 정의된 바와 같은) 융합 단백질을 나타낸다. 다중특이적 융합 단백질은 본질적으로 WO 89/02922(1989년 4월 6일 공개), EP 314,317(1989년 5월 3일 공개) 및 미국 특허 제5,116,964호(1992년 5월 2일 허여)에 개시되어 있는 바와 같이, 예를 들어 이종이량체, 이종삼량체 또는 이종오량체로서 조립될 수 있다. 바람직한 다중특이적 융합 단백질은 이중특이적이다. 이중특이적 융합 단백질의 예에는 CD4-scFv/TNF수용체-IgG 및 CD4-scFv/L-셀렉틴-IgG가 포함된다. 마지막에 언급된 분자는 림프구 귀환 수용체(LHR, L-셀렉틴)의 림프절 결합 기능을 CD4의 HIV 결합 기능과 조합하고, HIV 감염, 관련 상태의 예방 또는 치료에, 또는 진단제로서 잠재적 용도를 가진다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 공지된 표적에 결합하는 하나 이상의 결합 부위 및 비공지된 표적을 인식하는 하나 이상의 결합 부위가 도입된 다중특이적 안정화된 결합 분자, 예를 들어 이중특이적 결합 분자, 예를 들어 항체(예를 들어, 한 실시양태에서, 이중특이적 분자에는 반합성 항체 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 결합 부위가 도입됨) 및 본 발명의 안정화된 scFv에 관한 것이다,
본 발명의 한 실시양태에서, 당업자는 공지된 특이성을 갖는 단쇄 항체에서 시작하여 당업계에 공지된 기법을 이용하여 Fab 라이브러리를 구축할 수 있거나, 대안적으로는 당업자가 공지된 특이성을 갖는 Fab 단편에서 시작하여 당업계에 공지된 기법을 이용하여 안정화된 단쇄 라이브러리를 구축할 수 있다. 비면역화 공급원에서 비롯되고 V-유전자 서열(바람직하게는 VH와 DH 및 JH의 재조합, 및 VL와 JL 서열과의 재조합)의 합성 재조합에 의해 제조된 라이브러리를 사용하여 항체를 임의의 항원에 단리할 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 특허출원 WO92/01047은, 항체 단편이 박테리오파지의 표면 상에 표시될 수 있고, 그것이 항원에 결합할 것임을 교시한다. 항체 단편(예를 들어, Fab, Fv, scFv 및 VH)은 이 특성을 이용하여 직접적으로 선택될 수 있다. 당업계에 공지된 기타 방법에는 예를 들어 미국 특허 제5,698,426호; 제6,291,159호; 제5,658,727호; 제5,667,988호; 및 제5,969,108호에 교시된 방법들이 포함된다.
또 다른 실시양태에서, 공지된 표적을 인식하는 scFv는 반합성 인간 파지 항체 디스플레이 라이브러리로부터 단리된 scFv로 이량체화될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Kruif 및 Logtenberg 1996. J. Biol. Chem. 271:7630] 참조).
한 실시양태에서, 대상의 다중특이적 분자는 항체 분자를 발현하는 데 사용되는 발현 시스템, 예를 들어 포유동물 세포, 효모, 예컨대 피치아(Picchia), E. 콜라이, 바큘로바이러스 등에서 발현된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 분자는 NEOSPLA 벡터 시스템에서 발현된다(예를 들어, 미국 특허 제6,159,730호 참조). 이 벡터는 사이토메가로바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주요 프로모터, SV40 복제 기원, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 리더 서열을 함유한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 다중특이적 분자는 합성 연결 펩티드를 포함한다.
이 다중특이적 분자는 공지된 표적에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하고, 하나 이상의 결합 부위에서 라이브러리를 발현한다. 그러한 다중특이적 분자는, 예를 들어 공지된 표적에 매우 근접하거나 그에 관련된 분자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 당업자는 검정에 본 발명의 다중특이적 분자를 사용하여, 당업계에 공지된 선별 방법을 이용하여 특별한 반응, 예를 들어 아포프토시스 또는 세포내 활성화를 유도하는 분자들을 선택할 수 있다. 선별되는 반응을 생성하는 것으로 확인된 이중특이적 분자를 이어서 확인하여, 그것의 특이성을 결정할 수 있다. 그러한 방법을 이용하여, 특별한 관심 표적, 예를 들어 T 세포 마커 또는 기타 신호 전달 분자(예컨대, CRIPTO-I, 사멸 도메인 분자, 또는 아포프토시스 관련 분자)와 밀접히 관련된 분자를 확인할 수 있다. "가장 가까운 이웃"으로 새로 확인된 분자와 공지된 표적의 근접성은 면역침전법 또는 당업자에게 공지된 기타 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 이 방법을 이용하여, 특별한 세포내 반응을 조절하기 위한 표적으로서 분자를 확인할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 결합 분자, 특히 다중특이적 항체 또는 항체 변이체의 항원 인식 부위 또는 전체 가변 영역을 포함하는 결합 특이성은 하나 이상의 모 항 체로부터 유래될 수 있다. 모 항체에는 천연 발생 항체 또는 항체 단편, 천연 발생 항체로부터 적합화된 항체 또는 항체 단편, 표적 분자에 특이적인 것으로 공지된 항체 또는 항체 단편의 서열을 이용하여 새로 작제된 항체가 포함된다. 모 항체로부터 유래될 수 있는 서열은 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 및/또는 CDR, 프레임워크 영역 또는 기타 이들의 부분을 포함한다.
본 발명의 한 예시적 실시양태에서, 다중특이적 TNFR 결합 분자를 작제하는 데 사용되는 모 항체는 항-TRAIL-R2 항체, 예를 들어 14A2, 및 항-LTβR 항체, 예를 들어 CBE11 또는 BHA10이다. 다가의 다중특이적 항체는 2개 이상의 가변 영역을 포함하는 중쇄 및/또는 하나 이상의 가변 영역을 포함하는 경쇄를 함유할 수 있고, 여기에서 가변 영역들 중 2개 이상은 LTβR의 상이한 에피토프를 인식한다.
다중특이적, 예를 들어 이중특이적 TNFR 결합 분자는 쥐 또는 인간화된 BHA10(문헌 [Browning 등, J. Immunol. 154: 33(1995); Browning 등 J. Exp. Med. 183:867(1996)), 쥐 또는 인간화된 CBE11(각기 미국 특허 제6,312,691호 및 WO 02/30986), 및/또는 모 항-TRAIL-R2 쥐 또는 키메라 14A2를 포함한 모 항-LTβR 항체로부터 유래된 각종 상이한 서열을 이용하여 각종 상이한 방식으로 작제될 수 있다. 본 발명의 이중특이적 TNFR 결합 분자를 위해 사용될 수 있는 항-LTβR 항체의 예에는 BKA11, CDH10, BCG6, AGH1, BDA8, CBE11 및 BHA10 또는 BHA10이 포함된다. 단클론성 항-LT-β-R 항체를 생성하는 하기 하이브리도마 세포주를 사용하여, 항-LTβR 항체를 생성시킬 수 있고, 이 항체로부터 항체 구성체 서열이 유래되고, 이 서열은 과거 부다페스트 조약의 규정에 따라 미국 미생물 균주 보관 기관(ATCC)에 기탁되어, 하기 표시된 ATCC 승인 번호로 지정되었다:
Figure 112008072289549-pct00068
본 발명의 다중특이적 TNFR 결합 분자에 사용될 수 있는 항-TNF 어셉터 항체의 기타 예에는 사멸 도메인을 함유하는 TNF 수용체에 지정된 항체가 포함된다. 사멸 도메인 함유의 TNF 수용체에 대해 수많은 항체들이 생성되었고, 이들은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 항체에는 항-TNF-R1 단클론성 항체(R&D 시스템 항-TNF-R1; Tularik mAb #985, 미국 특허 제6,110,690호; 제6,437,113호), 항-Fas 수용체 mAb CH-11(미국 특허 제6,312,691호; WO 95/10540), 항-DR3 항체(미국 특허 제5,985,547호; 문헌 [Johnson, 등(1984) ImmunoBiology of HLA, ed. Dupont, B.O., Springer, New York]; 미국 특허 제6,462,176호; 제6,469,166호), 및 항-TRAIL-R 항체(미국 특허 제5,763,223호; 제6,072,047호; 제6,284,236호; 제6,521,228호; 제6,569,642호; 제6,642,358호; 및 제6,417,328호)가 포함된다.
수많은 항체들이 또한 조직 분화에 관여하는 TNF 수용체에 제기되었고, 당업계에 공지되어 있다. 조직 분화에 관여하는 TNF 수용체에 대해 특이적인 항-TNF 어셉터 항체의 예에는 항-RANK 단클론성 항체(이뮤넥스(Immunex)-미국 특허 제 6,562,948호; 제6,537,763호; 제6,528,482호; 제6,479,635호; 제6,271,349호; 제6,017,729호; Komed-WO 03/080671), 항-EDAR 다클론성(항-인간) 및 단클론성(항-마우스) 항체(R&D 시스템즈(R&D Systems)-MAB745, BAFl 57; 문헌 [Elomaa 등(2001) Human Molecular Genetics. 10:953]), 항-XEDAR 단클론성 및 다클론성 항체(R&D 시스템즈-MAB 1093 및 AF 1093), 항-Fn14 단클론성 항체(문헌 [Nakayama 등(2003) J. Immunology 170:341]; e바이오사이언스(eBioscience)로부터 입수가능한 ITEM-I, ITEM-2 및 ITEM-4), 항-TROY 항체(시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)로부터 입수가능한 T3323) 및 항-NGFR (항-설치동물) 항체(케미콘(Chemicon) 미국)가 포함된다.
수많은 항체들이 면역 제어에 관여하는 TNF 수용체에 제기되었고, 당업계에 공지되어 있다. 면역 제어에 관여하는 TNF 수용체에 대해 특이적인 항-TNF 어셉터 항체의 예에는 항-HVEM 항체(HGSI-WO 03/086301), 항-CD40 항체(Biogen-WO 97/20063; Chiron-미국 특허 제5,677,165호; 제5,874,082호; 제6,004,552호; 제6,056,959호; 제6,315,998호; 미국 특허출원 공개 제2002/0106371호; 제2003/0059427호; 제2003/0118588A1호; 제2003/0211100A1호; 제2002/020142358A1호; 미국 특허 제6312693호; 제6051228호; (Fanslow 등) 제5801227호), 항-4-1BB(PCT 공개 번호 WO 03/084999; EP 0948353; 미국 특허 제6210669호; Genecraft-WO 03/083069) 및 항-BAFF-R 항체(토끼 다클론성-ProSci 카달로그 #3097)가 포함되고, 이들 중에서 기타 많은 항체들이 면역 제어 수용체에 대해 제기되었다.
각종 기타 다가 항체 구성체가 통상의 재조합 DNA 기법을 이용하여, 예를 들어 PCT 국제 출원 No. PCT/US86/02269; 유럽 특허 출원 No. 184,187; 유럽 특허 출 원 No. 171,496; 유럽 특허 출원 No. 173,494; PCT 국제 출원 공보 No. WO 86/01533; 미국 특허 제4,816,567호; 유럽 특허 출원 No. 125,023; 문헌 [Better 등(1988) Science 240: 1041-1043]; 문헌 [Liu 등(1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:3439-3443]; 문헌 [Liu 등(1987) J. Immunol . 139:3521-3526]; 문헌 [Sun 등(1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84:214-218]; 문헌 [Nishimura 등(1987) Cancer Res . 47:999-1005]; 문헌 [Wood 등(1985) Nature 314:446-449]; 문헌 [Shaw 등(1988) J. Natl . Cancer Inst . 80:1553-1559)]; 문헌 [Morrison(1985) Science 229:1202-1207]; 문헌 [Oi 등(1986) Biotechniques 4:214]; 미국 특허 제5,225,539호; 문헌 [Jones 등(1986) Nature 321:552-525]; 문헌 [Verhoeyan 등(1988) Science 239:1534]; 문헌 [Beidler 등(1988) 7. Immunol . 141:4053-4060]; 및 문헌 [Winter 및 Milstein, Nature , 349, pp. 293-99 (1991)]에 기재된 바와 같이 당업자에 의해 개발될 수 있다. 바람직하게 인간외 항체는 인간외 항원 결합 도메인을 인간 불변 도메인과 연결함으로써 "인간화된다"(예를 들어, Cabilly 등, 미국 특허 제4,816,567호; 문헌 [Morrison 등, Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A., 81, pp. 6851-55(1984)]).
다가 항체 구성체를 제조하는 데 사용될 수 있는 기타 방법이 하기 발행물들에 기재되어 있다: 문헌 [Ghetie, Maria-Ana 등(2001) Blood 97:1392-1398]; 문헌 [Wolff, Edith A. 등(1993) Cancer Research 53:2560-2565]; 문헌 [Ghetie, Maria-Ana 등(1997) Proc . Natl . Acad . Sci . 94:7509-7514]; 문헌 [Kim, J.C. 등(2002) Int. J. Cancer 97(4): 542-547]; 문헌 [Todorovska, Aneta 등(2001) Journal of Immunological Methods 248:47-66; Coloma MJ. 등(1997) Nature Biotechniques 15:159-163]; 문헌 [Zuo, Zhuang 등(2000) Protein Engineering ( Suppl .) 13(5):361-367]; 문헌 [Santos A.D., 등(1999) Clinical Cancer Research 5:3I18s-3123s; Presto, Leonard G.(2002) Current Pharmaceutical Biotechniques 3:237-256]; 문헌 [van Spriel, Annemiek 등, (2000) Review Immunology Today 21(8) 391-397].
XL . 결합 분자의 발현
상기 기재된 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드를 제공하기 위해 분리된 유전 물질을 조작한 후, 전형적으로 원하는 양의 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용될 수 있는 숙주 세포 내로 도입하기 위해 발현 벡터에 유전자를 삽입하여, 최종적으로는 청구하는 결합 분자를 수득한다.
명세서 및 청구 범위의 목정 상, 본원에서 사용되는 용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 본 발명에 따라 사용되는 벡터가 원하는 유전자를 세포 내로 도입하고 세포에서 발현시키기 위한 비히클임을 의미한다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 그러한 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스로 구성된 군으로부터 용이하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 본 발명과 상용적인 벡터는 선별 마커, 원하는 유전자의 클로닝을 촉진시키는 적절한 제한 부위 및 진핵 또는 원핵 세포에서 진입하고/하거나 복제하는 능력을 포함할 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 다수의 발현 벡터 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 부류의 벡터는 예로서 소유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바 이러스, 우두 바이러스, 베큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 사용한다. 다른 것들은 내부 리보솜 결합 부위를 포함하는 폴리시스트론 시스템의 사용을 포함한다. 추가로, 형질감염된 숙주 세포를 선별할 수 있도록 하는 하나 이상의 마커를 도입함으로써 DNA가 그들의 염색체 내로 통합된 세포를 선별할 수 있다. 마커는 영양 요구성 숙주에 원영양성을 제공할 수 있거나, 살생제(예를 들어, 항생제)에 대한 내성, 또는 중금속, 예를 들어 구리에 대한 내성을 제공할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 발현시키고자 하는 DNA 서열에 직접 연결될 수 있거나, 공형질전환에 의해 동일 세포 내로 도입될 수 있다. 최적의 mRNA 합성을 위해 추가의 요소 또한 필요할 수 있다. 이러한 요소로는 신호 서열, 스플라이스 신호뿐만 아니라 전사 프로모터, 인해서, 및 종결 신호를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 클로닝된 가변 영역 유전자는 상기 논의된 바와 같이 합성의 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자(바람직하게, 인간)와 함께 발현 벡터 내로 삽입된다. 바람직하게, 이는 상품명이 NEOSPLA(미국 특허 제6,159,730호)로 칭해지는 IDEC 인코포레이티드(IDEC, Inc.)의 발현 벡터 상품을 사용하여 수행된다. 상기 벡터는 거대세포바이러스 프로모터/인핸서, 마우스 베타 글로빈 주 프로모터, SV40 복제기점, 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 엑손 1 및 엑손 2, 디히드로폴레이트 리덕타제 유전자 및 리더 서열을 포함한다. 하기 실시예에서 나타내는 바와 같이, 이러한 벡터는 가변 및 불변 영역 유전자를 도입하고, CHO 세포에 형질감염시킨 후, G418을 함유하는 배지에서 선택하고, 메토트렉세이트 증폭시켰을 때 항체를 매우 고도한 수준으로 발현시키는 것으로 밝혀졌다. 벡터 시스템은 또한 각기 전문이 본원에 참조 인용되는, 미국 특허 제5,736,137호 및 제5,658,570호에 교시되어 있다. 이러한 시스템은 고도의 발현 수준, 예를 들어 > 30 pg/세포/일을 제공한다. 다른 예시적인 벡터 시스템은 예를 들어, 미국 특허 제6,413,777호에 개시되어 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 예로서, 전적으로 본원에 참조 인용되는, 동시 계류 중인 출원 미국 가출원 제60/331,481호(2001년 11월 16일 출원)에 개시된 것과 같은 폴리시스트론 구성체를 사용함으로써 발현될 수 있다. 이러한 신규 발현 시스템에서, 관심의 대상이 되는 다중 유전자 산물, 예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄는 단일 폴리시스트론 구성체로부터 생산될 수 있다. 이들 시스템은 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 폴리펩티드를 비교적 고수준으로 제공하기 위하여 내부 리보솜 진입 부위(IRES: internal ribosome entry site)를 사용한다. 상용성 IRES 서열은 역시 본원에서 참조 인용되는 미국 특허 제6,193,980호에 개시되어 있다. 당업자는 그러한 발현 시스템을 사용함으로써 본 출원에 개시된 전장의 범위의 폴리펩티드를 효과적으로 생산할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
더욱 일반적으로, 폴리펩티드(예를 들어, 변형된 항체)의 단량체성 서브유니트를 코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 일단 제조되면, 발현 벡터를 적절한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 즉, 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 플라스미드를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 당업자에게 공지되어 있는 다양한 기술에 의해 수행될 수 있다. 이에는 형질감염(전기영동 및 전기천공 포함), 원형질체 융합, 인산칼슘 침착, 외피 보유 DNA와의 세포 융합, 미세 주사, 및 온전한 바이러스에 의한 감염이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 문헌 [Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds.(Butterworths, Boston, Mass. 1988]를 참조한다. 가장 바람직하게, 숙주 내로의 플라스미드 도입은 전기 천공을 통해 이루어진다. 경쇄 및 중쇄 생산에 적절한 조건 하에서 형질전환된 세포를 배양하고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대하여 분석한다. 예시적인 분석 기술은 효소 면역 측정법(ELISA), 방사 면역 측정법(RIA), 또는 형광 활성화 세포 분리기 분석(FACS), 면역 조직 화학법 등을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환"은 광범위한 의미로 사용되어야 하며, 이는 DNA를 수용체 숙주 세포에 도입함으로써 유전자형을 변화시키고, 그 결과 수용체의 세포도 변화시키는 것을 언급한다.
동일 계열을 따라, "숙주 세포"는 재조합 DNA 기술을 사용하여 작제되고 적어도 하나의 이종성 유전자를 코딩하는 벡터로 형질전환된 세포를 언급한다. 재조합 숙주로부터 항체를 분리하는 공정에 대한 설명에서, 용어 "세포" 및 "세포 배양물"은 달리 명확하게 기술되지 않는 한, 항체의 공급원을 나타내기 위해 상호 혼용된다. 즉, "세포"로부터 폴리펩티드의 회수는 회전 침강된 전체 세포로부터, 또는 배지 및 현탁된 세포 양자 모두를 함유하는 세포 배양물로부터의 것일 수 있다.
한 실시양태에서, 단백질 발현을 위해 사용되는 (예를 들어, 다가 결합 분자의) 숙주 세포주는 가장 바람직하게, 포유동물 기원이고; 당업자는 그 안에서 발현 되는 원하는 유전자 산물에 가장 적당한 특정의 숙주 세포를 우선적으로 결정할 수 있는 능력을 갖고 있다고 본다. 예시적인 숙주 세포주에는 DG44 및 DUXB11(차이니즈 햄스터 난소 세포주, DHFR 없음), HELA(인간 자궁경부 암종), CVI(원숭이 신장 세포주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI의 유도체), R1610(차이니즈 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3(마우스 섬유모세포), HAK(햄스터 신장 세포주), SP2/O(마우스 골수종), P3x63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 상피 세포), RAJI(인간 림프구) 및 293(인간 신장)이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. CHO 세포가 특히 바람직하다. 한 실시양태에서, NSO 세포가 사용될 수 있다. 숙주 세포주는 전형적으로 상업적 서비스업체, 미국 미생물 균주 보관 기관, 또는 공개 문헌으로부터 이용가능하다.
시험관내 생산을 규모 확장시킴으로써 다량의 원하는 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 조직 배양 조건 하에서 포유동물 세포를 배양하는 기술은 당업계에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 공수 반응기에서의 또는 연속 교반식 반응기에서의 동종 현탁액 배양, 또는 예를 들어, 중공 섬유 내, 마이크로캡슐 내, 또는 아가로스 마이크로비드 또는 세락믹 카트리지상에서의 고정화 세포 배양 또는 포획 세포 배양을 포함한다. 필요하고/하거나 원하는 경우, 폴리펩티드 용액을 통상의 크로마토그래피 방법, 예를 들어 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로오스상에서의 크로마토그래피 또는 (면역-)친화도 크로마토그래피, 예를 들어 합성 힌지 영역 폴리펩티드의 우선적 생합성 후에 또는 본원에 기술된 HIC 크로마토그래피 전 또는 후의 것을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 또한 포유동물외 세포, 예를 들어 세균 또는 효모 또는 식물 세포에서 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 다양한 단세포의 포유동물외 미생물, 예를 들어 세균도 또한 형질전환될 수 있고; 즉, 배양 또는 발효시 배양될 수 있는 것임을 이해할 것이다. 형질전환되기 쉬운 세균은 엔테로박테리아세(Enterobacteriaceae)의 구성원, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella) 균주; 바실라세아에(Bacillaceae), 예를 들어 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코커스(Pneumococcus); 스트렙토코커스(Streptococcus), 및 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 세균에서 발현될 때 폴리펩티드는 전형적으로 봉입체의 일부가 된다는 것도 이해할 것이다. 폴리펩티드는 분리되고, 정제되된 후, 관능성 분자로 어셈블리되어야 한다. 4가 형태의 항체가 요망되는 경우, 서브유니트는 이어서 4가 항체로 자가-어셈블리될 것이다(WO 02/096948 A2).
원핵생물 이외에도, 진핵 미생물도 사용될 수 있다. 다수의 다른 균주들도 보편적으로 사용될 수 있지만, 진핵미생물들 중에서 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae), 또는 일반 빵 효모가 가장 보편적으로 사용되고 있다. 사카로마이세스에서의 발현에 있어, 예를 들어 플라스미드 YRp7(문헌 [Stinchcomb 등, Nature, 282:39(1979)]; 문헌 [Kingsman 등, Gene, 7:141(1979)]; 문헌 [Tschemper 등, Gene, 10:157(1980)])이 보편적으로 사용된다. 이러한 플라스미드는, 트립토판에서 성장할 수 있는 능력이 부족한 돌연변이 효모 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공하는 TRP1 유전자를 이미 포함하고 있다(문헌 [Jones, Genetics, 85:12(1977)]). 이어서, 효모 숙주 세포 게놈의 특징으로서 trp1 손상의 존재는 트립토판의 부재 하에서의 성장에 의해 형질전환을 검출하기 위한 유효 환경을 제공한다.
XII . 결합 분자의 표지화 또는 접합화
본 발명의 결합 분자를 비-접합된 형태로 사용할 수 있거나, 예를 들어 표적 검출을 촉진시키기 위해, 또는 조영(imaging) 또는 환자의 요법을 위해 적어도 하나의 다양한 이펙터, 즉 관능성 부위에 접합시킬 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 정제 전 또는 후에, 정제를 실시할 때, 표지화되거나 접합화될 수 있고, 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 세포독소(예를 들어, 방사성 동위원소, 세포독성 약물 또는 독소) 치료제, 세포증식 억제제, 생물학적 독소, 프로드러그, 펩티드, 단백질, 효소, 바이러스, 지질, 생물학적 반응 개질제, 약제학적 제제, 면역학적 활성 리간드(예를 들어, 림포카인, 또는 생성된 분자가 신생물성 세포 및 이펙터 세포, 예를 들어 T 세포에 결합하는 다른 항체), PEG, 또는 조영에 유용한 검출가능 부위에 접합될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 종양의 혈관화를 감소시키는 분자에 접합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 개시된 조성물은 약물 또는 프로드러그에 결합되는 본 발명의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 추가의 다른 실시양태는 특이 생체독소 또는 그의 세포독소 단편, 예를 들어 리신, 겔로닌, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 내독소에 접합된 본 발명의 폴리펩티드의 용도를 포함한다. 접합된 폴리펩티드를 사용할지 또는 비접합된 폴리펩티드를 사용할지에 대한 선택은 암의 종류 및 단계, 보조 치료법의 용도(예를 들어, 화학요법 또는 외부 방사선 조사) 및 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 당업자는 본원의 교시를 고려하여 용이하게 선택할 수 있을 것으로 인식될 것이다.
이전 연구에서 동위원소로 표지된 항-종양 항체가 동물 모델의 경우에는 고형 종양뿐만 아니라 림프종/백혈병에서, 인간의 경우에는 일부 사례에서 세포를 성공적으로 파괴시키는데 사용되어 왔다는 것이 인식될 것이다. 예시적인 방사성 동위원소는 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re를 포함한다. 방사능핵종은, 핵 DNA에서 다중 스트랜드를 손상시켜 세포 사멸시키는 전리 방사선을 생산함으로써 작용한다. 치료적 접합체를 생산하기 위하여 사용되는 동위원소는 전형적으로, 경로 길이(path length)가 짧은 고에너지의 α- 또는 β-입자를 생산한다. 그러한 방사능핵종은 핵종과 밀접해 있는 세포, 예를 들어 접합체가 결합하고 있거나 접합체가 진입한 신생물성 세포를 사멸시킨다. 비-국소화 세포에는 영향이 없거나 거의 없다. 방사능핵종은 본질적으로 비-면역원성이다.
본 발명과 함께 방사성 표지 접합체의 용도와 관련하여, 본 발명의 폴리펩티드는 직접 표지될 수 있거나(예를 들어, 요오드화를 통해), 킬레이트화제의 사용을 통해 간접적으로 표지될 수 있다. 본원에서 사용되는 어구 "간접 표지화" 및 "간접 표지화 접근법"의 양자 모두는 킬레이트화제가 결합 분자와 공유 결합하고, 적어도 하나의 방사능핵종이 킬레이트화제와 결합하는 것을 의미한다. 그러한 킬레이트화제는, 그들이 폴리펩티드 및 방사성 동위원소 양자 모두에 결합하기 때문에 전형적 으로 2관능성 킬레이트화제로서 언급된다. 특히 바람직한 킬레이트화제는 1-이소티오시아네이토-3-메틸디오텔렌 트리아민펜타아세트산("MX-DTPA") 및 사이클로헥실 디에틸렌트리아민 펜타아세트산("CHX-DTPA") 유도체를 포함한다. 다른 킬레이트화제는 P-DOTA 및 EDTA 유도체를 포함한다. 간접 표지화를 위해 특히 바람직한 방사능핵종은 111In 및 90Y를 포함한다.
본원에서 사용되는 어구 "직접 표지화" 및 "직접 표지화 접근법"의 양자 모두는 방사능핵종이 폴리펩티드에 직접 공유 결합하는 것(전형적으로 아미노산 잔기를 통해)을 의미한다. 더욱 특히, 이러한 결합 기술은 무작위 표지화 및 부위-지정 표지화를 포함한다. 후자의 경우, 표지화는 폴리펩티드상의 특정 부위, 예를 들어 접합체의 Fc 부분에만 존재하는 N-연결된 당 잔기로 지정된다. 추가로, 다양한 직접 표지화 기술 및 프로토콜이 본 발명과 상용성이다. 예를 들어, 테크네튬-99m 표지 폴리펩티드는 리간드 교환 공정에 의해 제조할 수 있거나, 주석 이온 용액을 사용하여 퍼테크네이트(TcO4 -)를 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스 칼럼상에서 킬레이팅시키고, 폴리펩티드를 칼럼에 가함으로써 제조할 수 있거나, 회분식 표지화 기술에 의해, 예를 들어 퍼테크네이트, 환원제, 예를 들어 SnCl2, 완충액, 예를 들어 나트륨-칼륨 프탈산염-용액, 항체를 항온 배양하여 제조할 수 있다, 임의의 경우에서도, 항체를 직접적으로 표지화하기 위한 바람직한 방사능핵종은 당업계에 공지되어 있고, 특히 직접 표지화를 위해 바람직한 방사능핵종은 티로신 잔기에 의 해 공유 결합된 131I이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 예를 들어, 방사성 요오드화나트륨 또는 요오드화칼륨 및 화학적 산화제, 예를 들어 하이포아염소산나트륨, 클로라민 T 등, 또는 효소 산화제, 예를 들어 락토페록시다제, 글루코스 산화 효소 및 글루코스의 사용으로 유도될 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서는 간접 표지화 접근법이 특히 바람직하다.
킬레이트화제 및 킬레이트화제 접합체와 관련된 특허들이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,831,175호(Gansow)는 다치환된 디에틸렌트리아민펜타아세트산 킬레이트 및 상기를 포함하는 단백질 접합체, 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다. 미국 특허 제5,099,069호, 제5,246,692호, 제5,286,850호, 제5,434,287호 및 제5,124,471호(Gansow)도 또한 다치환된 DTPA 킬레이트에 관한 것이다. 이들 특허들의 전문이 본원에서 인용된다. 상용성 금속 킬레이트화제의 다른 예는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DPTA), 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸, 1,4,8,11-테트라아자테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산, 1-옥사-4,7,12,15-테트라아자헵타데칸-4,7,12,15-테트라아세트산 등이다. 사이클로헥실-DTPA 또는 CHX-DTPA가 특히 바람직하고, 하기에 광범위하게 예시된다. 발견되어질 추가의 것도 포함하여, 추가의 다른 상용성 킬레이트화제는 당업자에 의해 용이하게 식별될 수 있고, 이는 명료히 본 발명의 범주 내에 속한다.
동시 계류 중인 연계 출원 제08/475,813호, 제08/475,815호 및 제08/478,967호에서 킬레이트화를 촉진시키기 위하여 사용되는 특이적인 2관능성 킬레이트화제 를 비롯한 상용성 킬레이트화제는, 3가 금속에 고친화도를 제공하고 종양-대-비종양 비의 증가 및 골 흡수 감소뿐만 아니라, 표적 부위, 즉 B-세포 림프종 종양 부위에서 방사능핵종의 더 많은 생체내 잔류를 나타내도록 바람직하게 선택된다. 그러나, 이러한 특징들 모두를 갖거나 갖지 않는 다른 2관능성 킬레이트화제는 당업계에 공지되어 있고, 이는 또한 종양 요법에 이로울 수 있다.
본원의 교시에 따라 폴리펩티드는 진단 및 치료 용도로 상이한 방사선 표지에 접합화될 수 있다는 것도 인식될 것이다. 이러한 이유에서, 본원에 참조 인용되는, 상기 언급된 동시 계류 중인 출원은 치료적 항체를 투여하기 전에 종양을 진단 "조영"하기 위하여 방사성 표지 치료적 접합체를 개시한다. "In2B8" 접합체는 2관능성 킬레이트화제, 즉 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸-DTPA 및 1-메틸-3-이소티오시아네이토벤질-DTPA의 1:1 혼합물을 포함하는 MX-DTPA(디에틸렌트리아민펜타아세트산)를 통해 111In에 결합된, 인간 CD20 항원에 특이적인 쥐 단클론성 항체, 2B8을 포함한다. 111In은 검출되는 독성없이 약 1 내지 약 10 mCi 사이가 안전하게 투여될 수 있다는 이유에서 진단용 방사능핵종으로서 특히 바람직하고; 조영 데이타는 일반적으로 차후의 90Y-표지 항체 분포의 전조가 된다. 대개의 조영 연구는, 더 낮은 방사선량과 비교해 볼 때 방사선량이 안전하고, 조영 효율을 증가시킨다는 이유에서 5 mCi의 111In-표지 항체를 사용하며, 최적의 조영은 항체 투여 후 3 내지 6일째 형성된다. 예를 들어, 문헌 [Murray, J. Nuc . Med . 26: 3328(1985)] 및 문헌 [Carraguillo 등, J. Nuc . Med . 26: 67(1985)]을 참조한다.
상기 나타낸 바와 같이, 다양한 방사능핵종들이 본 발명에 적용될 수 있고, 당업자는 어떤 방사능핵종이 다양한 환경 하에서 가장 적절한 지를 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 131I이 표적화된 면역요법에 사용되는 것으로서 공지되어 있는 방사능핵종이다. 그러나, 131I의 임상적 유용성은, 8일간의 물리적 반감기; 혈액 및 종양 부위 양자 모두에서 요오드화된 항체의 탈할로겐화; 및 종양내 국소화된 방사선량의 침전에 대하여 차선(suboptimal)일 수 있는 방출 특징(예를 들어, 큰 감마 성분)을 비롯한 수개의 요인에 의해 제한될 수 있다. 우수한 킬레이트화제의 출현과 함께, 금속 킬레이팅 기가 단백질에 결합할 수 있는 기회는 다른 방사능핵종, 예를 들어 111In 및 90Y를 사용할 수 있는 기회를 증가시켰다. Y90는 방사성면역요법 적용에서의 사용에 대한 수개의 이점을 제공하는데, 즉 90Y의 64시간의 반감기는 종양에 의해 항체가 축적될 수 있도록 하는데 충분히 길고, 예를 들어 131I와는 달리, 90Y는 100 내지 1000개의 세포 직경의 조직 범위로, 붕괴 시에 감마 방사선 조사는 수반하지 않는, 고에너지의 순수한 베타 방출기이다. 추가로, 최소량의 관통 방사선을 통해 90Y-표지 항체를 외래 환자에 투여할 수 있다. 추가로, 세포 사멸을 위해서 표지 항체를 내재화할 필요는 없고, 표적 분자가 결여된 인접 종양 세포에 대해서는 전리 방사선의 국소 방출이 치명적이어야 한다.
당업자는 접합시키고자 선택된 제제에 따라 다양한 기술을 사용함으로써 이러한 비-방사성 접합체를 또한 조립할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 바이오틴을 포함하는 접합체는 예를 들어, 활성화된바이오틴 에스테르, 예를 들어 바이오틴 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 폴리펩티드를 반응시킴으로써 제조된다. 유사하게, 형광 마커를 포함하는 접합체는 예를 들어, 상기 열거된 것과 같은 커플링제의 존재하에서 제조될 수 있거나, 이소티오시아네이트, 바람직하게, 플루오레세인-이소티오시아네이트와의 반응에 의해 제조할 수 있다. 세포 증식 억제 물질/세포독소 물질 및 금속 킬레이트를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 접합체는 유사한 방식으로 제조된다.
다수의 이펙터 분자에는, 항체가 연결될 수 있는 적당한 관능기가 결여되어 있다. 한 실시양태에서, 이펙터 분자, 예를 들어 약물 또는 프로드러그는 연결 분자를 통해 항체에 결합된다. 한 실시양태에서, 연결 분자는 특정 위치에서 세포독성을 활성화시킬 수 있는 화학 결합을 포함한다. 적당한 화학 결합이 당업계에 공지되어 있고, 이황화 결합, 산에 불안정한(acid labile) 결합, 빛에 대해 불안정한(photolabile) 결합, 펩티드 분해효소에 대해 불안정한(peptidase labile) 결합, 술프히드릴기 및 말레이미드기 사이에 형성된 티오에테르 결합, 및 에스테르 분해효소에 대해 불안정한(esterase labile) 결합을 포함한다. 가장 바람직하게, 연결 분자는 이황화 결합 또는 티오에테르 결합을 포함한다. 본 발명에 따라, 연결 분자는 바람직하게, 반응성 화학기를 포함한다. 특히 바람직한 반응성 화학기는 N-숙신이미딜 에스테르 및 N-술포숙신이미딜 에스테르이다. 한 바람직한 실시양태에서, 반응성 화학기는 티올기 사이의 이황화 결합을 통해 이펙터에 공유 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 이펙터 분자는 티올기를 포함하도록 개질된다. 당업자는, 티올기가 수소 원자에 결합된 황 원자를 포함하고, 이는 또한 당업계에서 "-SH" 또는 "RSH"로서 표시될 수 있는 술프히드릴기로 언급됨을 인식할 것이다.
한 실시양태에서, 연결 분자를 사용하여 이펙터 분자를 결합 분자와 연결시킬 수 있다. 본 발명의 연결 분자는 절단가능하거나 절단가능하지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 절단가능한 연결 분자는 산화환원-절단가능한 연결 분자로서, 연결 분자는 산화환원 전위가 낮은 환경, 예를 들어 세포질 및 유리 술프히드릴기를 갖는 분자의 농도가 높은 다른 영역에서 절단가능하다. 산화환원 전위의 변화에 기인하여 절단될 수 있는 연결 분자의 예는 이황화물을 포함하는 것을 포함한다. 본 발명의 결합 단백질이 세포내 흡수 시에 세포질의 낮은 산화환원 전위가 연결 분자의 절단을 촉진시킬 경우, 절단 자극이 제공될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, pH 감소는 마이탄시노이드 카고(cargo)의 표적 세포 내로의 방출을 촉발한다. pH 감소는 예를 들어 엔도좀 트래피킹(endosome trafficking), 종양 성장, 염증, 및 심근 허혈과 같은 다수의 생리학적 및 병리학적 과정에 관여한다. pH는 생리학적 7.4에서부터 엔도좀에서는 5-6으로, 또는 리소좀에서는 4-5로 감소한다. 암 세포의 리소좀 또는 엔도좀을 표적하기 위하여 사용될 수 있는 산감작성 연결 분자의 예에는 산-절단가능한 결합, 예컨대 아세탈, 케탈, 오르토에스테르, 히드라존, 트리틸, 시스-아코니틸, 또는 티오카바모일에서 발견되는 것이 포함된다(예를 들어, 문헌 [Willner 등, (1993), Bioconj . Chem ., 4: 521-7]; 미국 특허 제4,569,789호, 제 4,631,190호, 제5,306,809호 및 제5,665,358호 참조). 다른 예시적인 산감작성 연결 분자는 디펩티드 서열 Phe-Lys 및 Val-Lys를 포함한다(문헌 [King 등, (2002), J. Med . Chem ., 45: 4336-43]). pH가 낮은 엔도좀 구획(예를 들어, 리소좀)으로의 세포내 흡수 트래피킹시 절단은 자극받을 수 있다. 다른 예시적인 산-절단가능한 연결 분자는 2개 이상의 마이탄시노이드의 결합에 대한 2개 이상의 산-절단가능한 결합을 포함하는 분자이다[King 등, (1999), Bioconj . Chem ., 10: 279-88; WO 98/19705).
절단가능한 연결 분자는 예를 들어, 리소좀 또는 종양-관련 효소와 같이, 특정 표적 세포와 관련된, 생물학적으로 공급되는 절단제에 감수성일 수 있다. 효소적으로 절단될 수 있는 연결 분자의 예에는 펩티드 및 에스테르가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 효소적으로 절단가능한 연결 분자는 종양-관련 단백질 분해효소, 예컨대 카텝신 B 또는 플라스민에 감수성인 것을 포함한다(문헌 [Dubowchik 등, (1999), Pharm . Ther ., 83:67-123]; 문헌 [Dubowchik 등, (1998), Bioorg. Med . Chem . Lett ., 8: 3341-52]; 문헌 [de Groot 등, (2000), J. Med . Chem., 43: 3093-102]; 문헌 [de Groot 등, (1999), 42: 5277-83]). 카텝신 B- 절단가능한 부위는 디펩티드 서열 발린-시트룰린 및 페닐알라닌-리신을 포함한다(문헌 [Doronina 등, (2003), Nat . Biotech ., 21(7): 778-84]; 문헌 [Dubowchik 등, (2002), Bioconjug . Chem ., 13: 855-69]). 다른 예시적인 효소-절단가능한 부위는 트라우스 단백질 분해효소, 예컨대 호중구, 포식세포, 및 다른 과립구에 의해 우선적으로 방출되는 효소인 티멧 올리고펩티다제(TOP)에 의해 인식되는 4 내지 16개의 아미노산의 올리고펩티드 서열(예를 들어, Suc-β-Ala-Leu-Ala-Leu)에 의해 형성되는 것들이 포함된다.
다른 한 실시양태에서, 연결 분자는 본 발명의 결합 분자를 하기 식의 연결 분자와 반응시킴으로써 형성된다:
X-Y-Z
(여기에서, X 는 부착 분자이고;
Y는 스페이서 분자이며;
Z는 이펙터 부착 부분임).
용어 "결합 분자 부착 분자"는 연결 펩티드를 본 발명의 결합 분자에 공유 결합할 수 있도록 하는 분자를 포함한다.
부착 분자는 예를 들어 임의로 수소 원자, 및 결합 분자가 그의 의도된 작용을 수행할 수 있도록 하는 다른 치환체로 치환된, 1 내지 60개의 탄소, 산소, 질소, 황 원자의 공유 사슬을 포함할 수 있다. 부착 분자는 펩티드, 에스테르, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 에테르, 티오에테르 등의 관능기를 포함할 수 있다. 바람직하게, 부착 분자는, 하나 이상의 항원 결합 분자를 포함하는 폴리펩티드상의 반응성 관능기와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성할 수 있도록 선택된다. 부착 분자의 예에는 예를 들어, 아미노, 카르복실레이트 및 티올 결합 분자가 포함된다.
아미노 부착 분자는 폴리펩티드상의 아미노기와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성하는 분자를 포함한다. 아미노 부착 분자는 당업계에 공지되어 있다. 아미노 결합 분자의 예에는 활성화된 카바마이드(예를 들어, 결합 분자상의 아미노기 와 반응하여 우레아기를 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있음), 알데히드(예를 들어, 결합 분자상의 아미노기와 반응할 수 있음), 및 활성화된 이소시아네이트(결합 분자상의 아미노기와 반응하여 우레아기를 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있음)이 포함된다. 아미노 부착 분자의 예에는 N-숙신이미딜, N-술포숙신이미딜, N-프탈이미딜, N-술포프탈이미딜, 2-니트로페닐, 4-니트로페닐, 2,4-디니트로페닐, 3-술포닐-4-니트로페닐 또는 3-카르복시-4-니트로페닐 분자가 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
카르복실레이트 부착 분자는 폴리펩티드상의 카르복실레이트기와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성하는 분자를 포함한다. 카르복실레이트 부착 분자는 당업계에 공지되어 있다. 카르복실레이트 부착 분자의 예에는 활성화된 에스테르 중간체 및 활성화된 카보닐 중간체가 포함되나, 이에 한정되지 않으며, 이는 결합 분자상의 COOH기와 반응하여 에스테르기, 티오에스테르기, 또는 아미드기를 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있다.
티올 부착 분자는 폴리펩티드상에 존재하는 티올기와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성하는 분자를 포함한다. 티올 부착 분자는 당업계에 공지되어 있다. 티올 부착 분자의 예에는 활성화된 아실기(결합 분자상의 술프히드릴과 반응하여 티오에스테르를 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있음), 활성화된 알킬기(결합 분자상의 술프히드릴과 반응하여 티오에스테르 분자를 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있음), 마이클(Michael) 수용체, 예를 들어 말레이미드기 또는 아크릴기(결합 분자상의 술프히드릴과 반응하여 마이클-형의 추가 산물을 형성할 수 있음), 산화 환원 반응을 통해 술프히드릴기와 반응하는 기, 활성화된 이황화기(결합 분자상의 술프히드릴기와 반응하여 예를 들어, 이황화 분자를 포함하는 연결 분자를 형성할 수 있음)가 포함된다. 다른 티올 부착 분자는 아크릴아미드, 알파-요오도아세트아미드, 및 사이클로프로판-1,1-디카보닐 화합물을 포함한다. 또한, 티올 부착 분자는 결합 분자상의 티올을 개질시켜 또 다른 반응종을 형성하되, 상기 반응종에 연결 분자가 결합함으로써 본 발명의 결합 분자를 형성할 수 있는 분자를 포함할 수 있다.
스페이서 분자, Y는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있는 공유 결합 또는 원자의 공유 사슬이다. 임의로 수소 원자 또는 생성된 결합 분자가 그의 의도된 작용을 수행할 수 있도록 하는 다른 치환체로 치환된, 0 내지 60개의 탄소, 산소, 황 또는 질소 원자를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, Y는 알킬, 알케닐, 알키닐, 에스테르, 에테르, 카보닐, 또는 아미드 분자를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 결합 분자상의 티올기는 반응기, 예를 들어 반응성 카보닐기, 예를 들어 케톤 또는 알데히드로 전환된다. 이어서, 결합 분자는 케톤 또는 알데히드와 반응하여 본 발명의 원하는 화합물을 형성한다. 카보닐 반응성 결합 분자의 예에는 히드라진, 히드라지드, O-치환 히드록실아민, 알파-베타-불포화 케톤, 및 H2C=CH-CO-NH-NH2가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 결합 분자의 다른 예 및 본 발명의 결합 분자를 형성하기 위하여 사용될 수 있는 티올 분자를 개질시키는 방법은 문헌 [Pratt, M. L. 등, J Am Chem Soc. 2003 May 21;125(20):6149- 59]; 및 문헌 [Saxon, E. Science. 2000 Mar 17;287(5460):2007-10]에 기재되어 있다.
연결 분자는 이펙터 분자 또는 그의 유도체와 반응하여 본 발명의 결합 분자를 형성할 수 있는 분자일 수 있다. 예를 들어, 이펙터 분자는 이황화 결합을 통해 분자의 잔여 부분에 연결될 수 있다. 그러한 경우, 이펙터 분자가 본 발명의 결합 분자에 결합하도록 적절한 이펙터 분자 유도체와 반응할 수 있는 연결 분자가 선택된다. 상기 기술한 바와 같이, 전체로서 연결 분자 및/또는 링커는, 링커가 적절한 환경하에서 절단되도록 선택될 수 있다.
특히 바람직한 연결 펩티드 분자는, 예를 들어 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP)(예를 들어, [Carlsson 등, Biochem. J., 173, 723-737(1978)] 참조), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)부타노에이트(SPDB)(예를 들어, 미국 특허 제4,563,304호 참조), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오)펜타노에이트(SPP)(예를 들어, CAS 승인 번호 341498-08-6 참조), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)(예를 들어, [Yoshitake 등, Eur. J. Biochem., 101, 395-399(1979)] 참조), 및 N-숙신이미딜 4-메틸-4-[2-(5-니트로-피리딜)-디티오]펜타노에이트(SMNP)(예를 들어, 미국 특허 제4,563,304호 참조)를 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용하기에 가장 바람직한 연결 펩티드 분자는 SPP, SMCC 및 SPDB이다. 한 바람직한 실시양태에서, SPDB는 본 발명의 결합 분자에 이펙터 분자를 연결시키기 위하여 사용된다.
본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 세포독성 이펙터 분자는 세포독성 약 물, 특히, 암 요법에 사용되는 것이다. 본원에서 사용되는 "세포독소 또는 세포독성제"는 세포의 성장 및 증식에 유해하고, 세포 또는 악성 종양을 감소시키거나, 저해하거나, 파괴시킬 수 있는 임의의 제제를 의미한다. 예시적인 세포독소에는 방사능핵종, 생체독소, 효소적으로 활성인 독소, 세포 증식 억제제 또는 세포독소 치료제, 프로드러그, 면역학적으로 활성인 리간드 및 생물학적 반응 개질제, 예컨대 사이토카인이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 면역반응성 세포 또는 악성 종양의 성장을 지연시키거나 저속화시키는 작용을 하는 임의의 세포독소는 본 발명의 범주 내에 속한다.
예시적인 세포독소에는 일반적으로, 세포 증식 억제제, 알킬화제, 항대사물질, 항-증식제, 튜불린 결합제, 호르몬 및 호르몬 길항제 등이 포함된다. 본 발명과 상용적인 예시적인 세포 증식 억제제는 알킬화 물질, 예컨대 메클로레타민, 트리에틸렌포스포르아미드, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 클로람부실, 부설판, 멜팔랜 또는 트리아지퀴온, 및 니트로스우레아 화합물, 예컨대 카무스틴, 로무스틴, 또는 세무스틴이 포함된다.
접합에 특히 바람직한 분자는 마이탄시노이드이다. 마이탄시노이드는 원래 메이테누스(Maytenus) 속에 속하는 동아프리카 관목으로부터 분리되었지만, 이후 악티노신네마 프레티오섬(Actinosynnema pretiosum)의 대사물질인 것이 밝혀졌다(예를 들어, 미국 특허 제3,896,111호 참조). 마이탄시노이드에는 마이탄신, 마이탄시놀, 마이탄시놀의 C-3 에스테르, 및 다른 마이탄시놀 유사체 및 유도체가 포함되는 것으로 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호 및 제6,441,163호 참조). 마이탄시놀의 C-3 에스테르는 천연 발생되거나, 합성적으로 유도될 수 있다. 또한, 천연 발생된 C-3 마이탄시놀 에스테르 및 합성 C-3 마이탄시놀 에스테르는 단순 카르복실산과의 C-3 에스테르, 또는 N-메틸-1-알라닌의 유도체와의 C-3 에스테르로 분류될 수 있고, 후자가 전자보다 더욱 세포독성을 지니고 있다. 합성 마이탄시노이드 유사체는 또한 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Kupchan 등, J. Med. Chem., 21, 31-37(1978)]에 기재되어 있다. 따라서, 마이탄시놀 및 그의 유사체 및 유도체를 생성하는 방법이 예를 들어, 미국 특허 제4,151,042호에 기재되어 있다.
항체 접합체로서 사용하기에 적당한 마이탄시노이드는 천연 공급원으로부터 분리될 수 있거나, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 합성적으로 생산될 수 있거나, 반-합성적으로 생산될 수 있다. 최종 접합체 분자에서도 충분한 세포독성이 보존되는 한, 마이탄시노이드는 임의의 적당한 방식으로 개질될 수 있다.
반응성 화학기를 포함하는 연결 분자를 포함하는, 특히 바람직한 마이탄시노이드는 C-3 마이탄시놀 에스테르 및 그의 유사체이고, 여기에서 연결 분자는 이황화 결합을 포함하고, 결합 분자는 N-숙신이미딜 또는 N-술포숙신이미딜 에스테르를 포함한다. 마이탄시노이드상의 다수의 위치는 예를 들어, 이펙터 부착 분자를 통해 연결 분자를 화학적으로 연결시키는 위치로서의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 히드록실기를 갖는 C-3 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 히드록시메틸로 변형된 C-15 위치 및 히드록실기를 갖는 C-20 위치 모두가 유용하다. 연결 분자는 가장 바람직하게 마이탄시놀의 C-3 위치에 연결된다. 가장 바람직하게, 본 발명의 조 성물과 관련하여 사용되는 마이탄시노이드는 N2'-데아세틸-N2'-(-3-머캅토-1-옥소프로필)-마이탄신(DM1) 또는 N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-마이탄신(DM4)이다.
다른 화학 결합을 갖는 연결 분자 또한 다른 마이탄시노이드와 같이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 연결 분자에 도입될 수 있는 다른 화학 결합의 구체예에는 상기 기술된 것들, 예를 들어 산에 불안정한 결합, 티오에테르 결합, 빛에 대해 불안정한 결합, 펩티드 분해효소에 불안정한 결합 및 에스테르 분해효소에 불안정한 결합이 포함된다. 연결 분자 및/또는 이펙터 부착 분자를 갖는 마이탄시노이드 생산 방법이 예를 들어, 미국 특허 제5,208,020호, 제5,416,064호 및 제6,333,410호에 기재되어 있다.
마이탄시노이드의 연결 분자(및/또는 이펙터 부착 분자)는 전형적으로, 그리고 바람직하게, 항체를 마이탄시노이드에 연결시키기 위하여 사용되는 보다 큰 연결 펩티드의 일부분이다. 연결 분자가 마이탄시노이드 및 항체 각각의 특징이 되는 세포독성 및 표적을 유지시키는 한, 임의의 적당한 연결 펩티드 분자는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 연결 분자는 화학 결합(상기 기술된 바와 같음)을 통해 마이탄시노이드를 항체에 연결시킴으로써 마이탄시노이드 및 항체는 상호 간에 화학적으로 결합한다(예를 들어, 공유 결합). 바람직하게, 연결 분자는 이황화 결합 또는 티오에테르 결합을 통해 마이탄시노이드를 항체에 화학적으로 결합시킨다. 가장 바람직하게, 항체는 이황화 결합을 통해 마이탄시노이드에 화학적으로 결합한 다.
다른 바람직한 부류의 세포독성제에는 예를 들어, 안트라사이클린계 약물, 빈카 약물, 미토마이신, 블레오마이신, 세포독소 뉴클레오시드, 프테리딘계 약물, 디이넨 및 포도필로톡신이 포함된다. 특히, 그러한 부류의 유용한 구성원으로서 예를 들어, 아드리아마이신, 카미노마이신, 다우노루비신(다우노마이신), 독소루비신, 아미노프테린, 메토트렉사트, 메토프테린, 미스라마이신, 스트렙토니그린, 디클로로메토트렉사트, 미토마이신 C, 악티노마이신-D, 포르피로마이신, 5-플루오로우라실, 플록수리딘, 프토라푸르, 6-머캅토퓨린, 사이타라빈, 사이토신 아라비노시드, 포도필로톡신, 또는 포도필로톡신 유도체, 예를 들어 에토포시드 또는 에토포시드 인산염, 멜팔랜, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 류노시딘, 빈데신, 류로신 등이 포함된다. 본원의 교시와 상용적인 추가의 다른 세포독소에는 탁솔, 탁산, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬산 에티디움, 에메틴, 테노포시드, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 퓨로마이신, 및 그의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 호르몬 및 호르몬 길항제, 예를 들어 코르티코스테로이드, 예를 들어 프레드니손, 프로게스틴, 예컨대 히드록시프로게스테론 또는 메드로프로게스테론, 에스트로겐, 예를 들어 디에틸스틸베스트롤, 항에스트로겐, 예를 들어 타목시펜, 안드로겐, 예를 들어 테스토스테론, 아로마타제 저해제, 예를 들어 아미노글루테티미드도 또한 본원의 교시와 상용성이다. 앞서 언급한 바와 같이, 당업자는 본 발명의 접합체를 제조하기 위한 목적으로 화합물의 반응을 보다 편리하게 하기 위하여 원하는 화합물을 화학적으로 개질시킬 수 있다.
특히 바람직한 세포독소의 한 예는 칼리케아미신, 에스페라미신 또는 디네마이신을 비롯한, 항-종양 항생제의 엔다이인계 구성원 또는 유도체를 포함한다. 이들 독소는 극도로 효능이 있고, 이는 핵 DNA를 절단함으로써 세포를 사멸시키는 작용을 한다. 생체내에서 절단됨으로써 불활성이지만 면역원성인 다수의 폴리펩티드 단편을 제공할 수 있는 단백질 독소와 달리, 독소, 예를 들어 칼리케아미신, 에스페라미신 및 다른 엔다이인은 본질적으로 비-면역원성인 소분자이다. 이들 비-펩티드성 독소는, 앞서 단클론성 항체 및 다른 분자를 표지하기 위하여 사용되었던 기술에 의해 이량체 또는 4량체에 화학적으로 연결된다. 이러한 연결 기술은 구성체의 Fc 부분상에만 존재하는 N-연결된 당 잔기를 통한 부위-특이적 결합을 포함한다. 그러한 부위-특이적 결합 방법은 구성체의 결합 성질에 대한 가능한 결합 효과를 감소시킨다는 이점을 가진다.
폴리펩티드는 또한 다른 세포독소들 중에서도 생체독소, 예컨대 리신 서브유니트 A, 아브린, 디프테리아 독소, 보툴리눔, 시안기노신, 색시톡신, 시가톡신, 파상풍 독소, 테트로도톡신, 트리코테센, 베르루콜로겐 또는 독성 효소와 결합할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 바람직하게, 그러한 구성체는 항체-독소 구성체를 직접 발현시킬 수 있는 유전 조작 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드와 결합할 수 있는 다른 생물학적 반응 개질제는 사이토카인, 예를 들어 림포카인 및 인터페론을 포함한다. 본 개시와 관련하여, 당업자는 통상의 기술을 사용하여 그러한 구성체를 용이하게 형성할 수 있다는 것이 제시된다.
개시된 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있는 또 다른 부류의 상용성 세포독소는 종양 또는 면역반응성 세포에 효과적으로 지정될 수 있는 방사선 감작성 약물이다. 그러한 약물은 전리 방사선에 대한 감수성을 증진시켜 방사선요법의 효능을 증가시킨다. 종양 세포에 의해 내재화된 항체 접합체는 방사선 감작성이 최대인 핵에 보다 더 근접하게 방사선 감작제를 전달할 것이다. 표적 종양내 남아있는 방사선 감작제는 국소화시키고 정상 조직내에서 최소로 흡수시키면서, 결합하지 않은, 방사선 감작제에 연결된 본 발명의 폴리펩티드는 혈액으로부터 신속하게 제거될 것이다. 혈액으로부터 신속하게 제거된 후, 보조 방사선요법은 3가지 방식: 1.) 종양에 특이적으로 지정되는 외부 빔 방사선 조사, 2.) 종양내 직접적으로 삽입된 방사성, 또는 3.) 동일한 표적 항체를 사용하는 전신 방사선면역요법중 하나로 투여될 수 있다. 본 접근법중 잠재적으로 관심의 대상이 되는 변형은, 치료학적 방사성 동위원소와 방사성 감작된 면역접합체의 결합을 통해 환자자 단일 약물을 용이하게 투여받을 수 있도록 편의를 제공하는 것이다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드의 안정성 또는 효능을 증진시키는 분자가 접합될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, PEG는 본 발명의 폴리펩티드에 접합되어 그의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다(문헌 [Leong, S.R. 등, 2001. Cytokine 16:106; 2002; Adv . in Drug Deliv . Rev . 54:531]; 또는 문헌 [Weir 등, 2002. Biochem. Soc. Transactions 30:512]).
앞서 언급한 바와 같이, 상용성 세포독소는 프로드러그를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "프로드러그"는 모체(parent) 약물과 비교하여 종양 세포 에 대하여 세포독성이 적고, 효소적으로 활성화되거나 더욱 활성인 모형태로 전환될 수 있는 약제학적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 언급한다. 본 발명과 상용적인 프로드러그에는 인산염-함유 프로드러그, 티오인산염-함유 프로드러그, 황산염 함유 프로드러그, 펩티드 함유 프로드러그, β-락탐-함유 프로드러그, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 프로드러그 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드러그, 5-플루오로시토신, 및 더욱 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 다른 5-플루오로우리딘 프로드러그가 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 세포독성제, 예를 들어 마이탄시노이드는 이황화 결합의 가수분해를 통해 유리되는 프로드러그로서 투여된다. 추가로, 본 발명에서 사용하기 위한 프로드러그 형태로 유도화될 수 있는 세포독성제의 예에는 상기 기술된 화학요법제가 포함된다.
XIII . 결합 분자의 투여
본 발명의 결합 분자를 제조하고 투여 대상에게 투여하는 방법은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 본 발명의 결합 분자의 투여 경로는 경구 투여, 비경구 투여, 흡입 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 본원에 사용한 용어 '비경구'는 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 피하, 직장 또는 질내 투여를 포함한다. 비경구 투여의 정맥내, 동맥내, 피하 및 근육내 형태가 일반적으로 바람직하다. 이들 모든 투여 형태가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것임은 명백하지만, 투여를 위한 형태는 주사용 용액, 구체적으로 정맥 내 또는 동맥 내 주사를 위한 용액 또는 점적액이다. 일반적으로, 주사용으로 적당한 약학적 조성물 은 완충액(예를 들어, 아세트산염, 인산염 또는 시트르산염 완충액), 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트), 필요에 따라 안정화제(예를 들어, 인간 알부민) 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본원의 교시와 양립할 수 있는 다른 방법에서, 상기 폴리펩티드는 유해한 세포 군집 부위에 직접 전달되어 치료제에 대한 병든 조직의 노출을 증가시킬 수 있다.
비경구 투여용 제제의 예로는 멸균 수성 용액 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액을 들 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기름, 예를 들어 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레이트를 들 수 있다. 수성 담체의 예로는 물, 알콜/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 들 수 있는데, 염수 및 완충 처리된 매질을 포함한다. 본 발명에서, 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는 0.01 내지 0.1 M 및 바람직하게는 0.05 M 인산염 완충액 또는 0.8% 염수를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 다른 통상적인 비경구 비히클의 예로는 인산나트륨 용액, 링거 덱스트로즈, 덱스트로즈 및 염화나트륨, 락테이트 링거 또는 고정유를 들 수 있다. 정맥 내 비히클의 예로는 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예를 들어 링거 덱스트로즈를 주성분으로 하는 것 등을 들 수 있다. 또한, 보존제 및 다른 첨가제, 예를 들어 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 비활성 기체 등도 존재할 수 있다. 보다 특히, 주사용으로 적당한 약학적 조성물은 멸균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제제용 멸균 분말을 포함한다. 이러한 경우에 있어서, 상기 조성물은 멸균되어야 하며, 용이하게 주사할 수 있을 정도의 유동성이 있어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하며, 미생물, 예를 들어 세균류 및 진균류의 오염 작용에 대해 보존되는 것이 바람직할 것이다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적당한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적당한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 이용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항바이러스제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메르살 등에 의해 달성할 수 있다. 다수의 경우, 등장제, 예를 들어 슈가, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 상기 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 내에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 달성할 수 있다.
임의의 경우에, 멸균 주사 가능한 용액은 본원에 개시한 성분 중 하나 또는 이의 조합물과 함께 필요한 양의 활성 화합물(예를 들어, 폴리펩티드 그 자체 또는 폴리펩티드와 다른 활성 제제와의 병용)을 적당한 용매 내에 도입하고, 필요에 따라 여과 멸균함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본적인 분산 매질 및 본원에 기재한 것 들로부터 선택되는 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에 있어서, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이들 방법은 이의 이미 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분+임의의 추가적인 소정 의 성분의 분말을 생성한다. 주사용 제제는 처리하고, 용기, 예를 들어 앰플, 백, 병, 주사기 또는 바이얼 내로 충전하고, 당업계에 공지된 방법에 따라 무균 조건 하에서 밀봉한다. 또한, 상기 제제들은 각기 본원에 참고 인용하는 동시 계류중인 U.S.S.N. 09/259,337 및 U.S.S.N. 09/259,338에 개시된 것과 같은 키트의 형태로 포장되고 판매될 수 있다. 이러한 제품은, 관련 조성물이 자가면역 또는 신생물 장애로 고통받는 환자 또는 그러한 소인이 있는 대상을 치료하는데 유용하다는 표지나 포장 삽입물이 포함하는 것이 바람직할 것이다.
상기한 상태의 치료를 위한 본 발명의 안정화된 결합 분자의 유효 투여량은 다수의 상이한 요인들, 예를 들어 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적인 상태, 치료 대상이 인간 또는 동물인지의 여부, 투여되고 있는 다른 약물, 및 처치가 예방 목적 또는 치료 목적인지의 여부에 따라 다양하다. 일반적으로, 치료 대상은 인간이지만, 트랜스게닉 포유동물을 포함하는 인간외 포유동물도 치료할 수 있다. 치료 투여량은 안정성과 효능을 최적화하기 위해 당업자에게 공지된 일반적인 방법을 이용하여 적정할 수 있다.
본 발명의 결합 분자를 이용하는 수동 면역에 있어서, 투여량은 예를 들어 숙주 체중 kg을 기준으로 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 보다 일반적으로는 0.01 내지 5 mg/kg(예를 들어, 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg 등) 범위 일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 1 mg/kg 체중 또는 10 mg/kg 체중 또는 1 내지 10 mg/kg 범위 내, 바람직하게는 1 mg/kg 이상일 수 있다. 상기 범위의 중간 투여량도 본 발명의 범주 내에 속한다.
대상에게 상기 투여량을 매일, 격일, 주 단위 또는 실험적인 분석에 의해 결정된 임의의 다른 스케쥴에 따라 투여할 수 있다. 예시적인 치료 방법에서는 장기간, 예를 들어 6개월 이상 동안의 다중 투여를 필요로 한다. 추가의 예시적인 치료 방법에서는 2주마다 1회 또는 월 1회 또는 3 내지 6개월마다 1회의 투여를 필요로 한다. 예시적인 투여 스케쥴의 예로는 매일 1 내지 10 mg/kg 또는 15 mg/kg, 격일로 30 mg/kg 또는 매주 60 mg/kg를 들 수 있다. 일부 방법에서, 상이한 결합 특이성을 가진 2개 이상의 단클론성 항체를 동시에 투여하는데, 이 경우에 투여되는 각 항체의 투여량은 예시한 투여량 범위 내에 포함될 수 있다.
본 발명의 결합 분자는 다중 투여할 수 있다. 단일 투여 사이의 간격은 예를 들어, 일 단위, 주 단위, 월 단위 또는 년 단위일 수 있다. 또한, 투여 대상에서 폴리펩티드의 혈중 농도 또는 표적 분자의 혈중 농도를 측정함으로써 나타나는 바와 같이 불규칙적일 수도 있다. 일부 방법에서, 투여량은 어떤 혈장 결합 분자 또는 독소농도, 예를 들어 1 내지 1000 ㎍/ml 또는 25 내지 300 ㎍/ml를 획득하기 위해 조정된다. 대안적으로, 결합 분자는 서방형 제제로 투여될 수 있는데, 이 경우 투여 빈도는 줄어든다. 투여량과 투여 빈도는 투여 대상 내에서 항체의 반감기에 따라 달라진다. 일반적으로, 인간화 항체가 가장 긴 반감기를 나타내고, 키메라 항체 및 인간외 항체 순으로 반감기가 짧아진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 비접합된 형태로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 접합된 형태로 다수회 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 비접합된 형태, 및 그에 이어 접합된 형태로 투여될 수 있고, 그 반대 의 순서로 투여할 수도 있다.
투여량 및 투여 빈도는 처치가 예방적 처치인지 치료적 처치인지의 여부에 따라 달라질 수 있다. 예방적 용도의 경우, 본 발명의 항체 또는 이의 칵테일을 함유하는 조성물은 아직 질병 상태에 있지 않은 투여 대상에게 투여하여 투여 대상의 내성을 증강시킬 수 있다. 이러한 양은 "예방적 유효량"으로 정의한다. 이러한 용도의 경우, 정확한 양은 투여 대상의 건강 상태 및 일반적인 면역성에 따라 달라지나, 일반적으로 1회 투여 당 0.1 내지 25 mg, 구체적으로 1회 투여 당 0.5 내지 2.5 mg 범위이다. 비교적 낮은 투여량은 장기간 동안 비교적 빈번하지 않은 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그들의 남은 삶 동안 계속 치료받기도 한다.
치료적 용도에서, 질병의 진행이 둔화되거나 정지될 때까지 및 바람직하게는 환자가 질병 징후의 부분적인 완화 또는 완전한 완화를 나타낼 때까지 경우에 따라 비교적 높은 투여량(예를 들어, 방사능면역접합체를 위해 보다 일반적으로 사용되는 5 내지 25 mg의 투여량 및 세포독소-약물 접합 분자를 위한 더 높은 투여량과 함께 1회 투여 당 약 1 내지 400 mg/kg 결합분자, 예를 들어 항체)을 비교적 짧은 간격으로 투여하는 것이 필요하다. 그 후, 환자는 예방적 처치의 투여 방법으로 투여할 수 있다.
한 실시양태에서, 대상은 (예를 들어, 벡터 내의) 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로 치료할 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 경우 투여량은 10 ng 내지 1 g, 100 ng 내지 100 mg, 1 ㎍ 내지 10 mg, 또는 30 내지 300 ㎍ DNA/환자일 수 있다. 감염 바이러스 벡터의 경우 투여량은 1회 투여 당 10 내지 100 또는 그 이상의 비리온일 수 있다.
치료제는 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 비경구, 국소, 정맥 내, 경구, 피하, 동맥 내, 두개골 내, 복강내, 비 내 또는 근육 내 투여할 수 있다. 근육 내 주사 또는 정맥 내 주입이 본 발명의 결합 분자의 투여를 위해 바람직하다. 일부 방법에서, 특별한 치료적 결합 분자는 두개골 내로 직접 주입된다. 일부 방법에서, 결합 분자는 서방형 조성물 또는 장치, 예를 들어 메디패드(Medipad)TM 장치로 투여된다.
본 발명의 제제는 임의적으로 처치(예를 들어, 예방적 처치 또는 치료적 처치)가 필요한 장애 또는 상태를 처치하는데 효과적인 다른 제제와 함께 투여할 수 있다. 바람직한 추가 제제는 당업계에 공지된 제제 및 특별한 장애를 통상 투여되는 제제이다.
본 발명의 90Y-표지 폴리펩티드의 효과적인 단일 처치 투여량(즉, 치료적 유효량)은 약 5 내지 약 75 mCi, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 40 mCi 범위이다. 131I-표지 항체의 효과적인 단일 처치 비골수 상해 투여량(nonmarrow ablative dosage)은 약 5 내지 약 70 mCi, 더 바람직하게는 약 5 내지 약 40 mCi 범위이다. 131I-표지 항체의 효과적인 단일 처치 상해 투여량(즉, 자가 골수 이식이 필요할 수 있음)은 약 30 내지 약 600 mCi, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 약 500 mCi 범위이다. 키메라 변형 항체의 경우, 쥐 항체에 대해 더 긴 순환 반감기로 인해, 131I-표 지 키메라 항체의 효과적인 단일 처치 비골수 상해 투여량은 약 5 내지 약 40 mCi, 더욱 바람직하게는 약 30 mCi 미만의 범위이다. 예를 들어, 111I 표지를 위한 조영 기준(imaging criteria)은 전형적으로 약 5 mCi 미만이다.
131I 및 90Y를 이용하여 괄목할만한 임상적인 경험이 얻어져 왔으나, 다른 방사능 표지도 당업계에 공지되어 있으며 유사한 목적을 위해 사용되어 왔다. 다른 방사성 동위원소도 조영을 위해 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 범위와 양립할 수 있는 추가의 방사성 동위원소의 예로는 123I, 1251, 32P, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113In, 127Cs, 129Cs, 1321, 197Hg, 203Pb, 206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac, 211At 및 213Bi를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 관점에서, 알파, 감마 및 베타 방출자는 모두 본 발명의 범위 내에서 양립가능하다. 또한, 본 발명의 관점에서, 당업자는 어떤 방사능핵종이 선택된 치료 과정과 양립할 수 있는지를 과도한 실험 없이 용이하게 결정할 수 있을 것으로 생각된다. 이를 위해, 임상적 진단을 위해 이미 사용되고 있는 방사능핵종의 예로는 125I, 123I, 99Tc, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga뿐만 아니라 111In을 들 수 있다. 또한, 항체는 표적화 면역요법에서의 잠재적인 용도를 위해 다양한 방사능핵종으로 표지화되어 왔다(Peirersz 등, Immunol . Cell Biol . 65: 111-125 (1987)). 이들 방사능핵종의 예로는 188Re 및 186Re뿐만 아니라 더 적은 양으로 199Au 및 67Cu를 들 수 있다. 본원에 참조 인용되는 미국 특허 제5,460,785호는 이러한 방사능핵종에 관한 추가 정보를 제공한다.
본 발명의 결합 분자가 접합된 형태로 사용되거나 접합되지 않은 형태로 사용되는지의 여부와 상관없이, 본 발명의 중요한 이점은 골수억제 환자에서, 특히 방사능요법 또는 화학요법과 같은 보조 치료법을 받는 중이거나 받은 환자에서 이들 폴리펩티드를 사용할 수 있다는 것일 것이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드(이 역시 접합된 형태이거나 접합되지 않은 형태임)는 화학요법제를 이용하는 병용 치료법에서 사용할 수 있다. 당업자는 이러한 치료 방법이 본원에 개시된 항체 및 하나 이상의 화학요법제의 순차 투여, 동시 투여, 병행 투여 또는 공존 투여를 포함할 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명의 이 측면의 특히 바람직한 실시양태는 독소 접합 결합 분자, 예를 들어 D4 마이탄시노이드와 같은 마이탄시노이드에 접합된 결합 분자의 투여를 포함할 것이다.
결합 분자는 상기 바로 직전에 기재된 바와 같이 투여될 수 있는 반면, 다른 실시양태에서 접합된 폴리펩티드 및 접합되지 않은 폴리펩티드는 제1 라인 치료제로서 건강한 환자에게 투여될 수 있다는 점에 주목하여야 한다. 그러한 실시양태에서, 폴리펩티드는 정상적인 또는 평균적인 적색 골수 잔여물을 보유하는 환자 및/또는 외부 빔 조사 또는 화학요법과 같은 보조 요법을 받고 있지 않은 환자에게 투여할 수 있다.
그러나, 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 선택된 실시양태는 골수억제 환자에게 결합 분자의 투여를 포함하거나, 또는 방사능요법 또는 화학요법과 같은 보 조 요법과의 병행(즉, 병용 요법)을 포함한다. 본원에서 사용되는, 보조 요법과 병용하여 결합 분자를 투여한다는 의미는 병용 요법과 본 발명의 폴리펩티드를 순차적으로, 동시에, 공존하도록, 병행하여, 동시에 작용하도록, 또는 동시에 발생하도록 투여 또는 적용한다는 것이다. 당업자는 병용 치료법의 여러 다양한 성분의 투여 또는 적용의 시간을 어떻게 조절하여야 전체적인 치료의 유효성이 증가되는지 인식할 것이다. 예를 들어, 화학요법제는 널리 공지된 표준 절차에 따라 투여하고, 이어서 수주 내에 본 발명의 방사능면역복합체를 투여할 수 있다. 반대로, 세포독소 결합된 폴리펩티드는 정맥 내로 투여하고, 이어서 종양 국부화된 외부 빔 조사를 수행할 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 1회의 병원 방문으로 1종 이상의 선택된 화학요법제와 함께 투여될 수 있다. 당업자(예를 들어, 숙련된 종양학자)는 선택된 보조 요법 및 본 발명의 개시 내용에 기초하여 과도한 실험 없이 효과적인 치료법을 인식할 수 있을 것이다.
이러한 관점에서, (접합되거나 접합되지 않은) 결합 분자 및 화학요법제의 조합은 환자에게 치료적 이점을 제공하는 임의의 시간 계획 안에서 임의의 순서로 투여할 수 있다. 즉, 화학요법제 및 폴리펩티드는 임의의 순서 또는 동시에 투여할 수 있거나, 한 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 선택된 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 과거 화학요법을 받은 환자에게 투여될 것이다. 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드 및 화학요법제는 실질적으로 동시에 또는 병행하여 투여될 것이다. 예를 들어, 환자는 화학요법을 받는 중에 본 발명의 결합 분자를 투여받을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 결합 분자는 임의의 화학요법제를 투여하거나 또는 화 학요법를 수행하는 1년 내에 투여될 것이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 임의의 화학요법제를 투여하거나 화학요법를 수행하는 10개월, 8개월, 6개월, 4개월 또는 2개월 내에 투여될 것이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 임의의 화학요법제를 투여하거나 화학요법를 수행하는 4주, 3주, 2주 또는 1주 내에 투여될 것이다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 선택된 화학요법제를 투여하거나 화학요법를 수행하는 5주, 4주, 3주, 2주 또는 1주 내에 투여될 것이다. 2개 제제의 투여 또는 2개 처치의 수행은 약간의 시간 또는 분 내에 투여되거나 수행되는 것(즉, 실질적으로 동시에)으로 인식될 것이다.
또한, 본 발명에 따라, 골수억제 환자는 감소된 혈구수를 나타내는 임의의 환자를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 골수억제의 임상 징후로서 통상적으로 사용되는 일부 혈구수 파라미터가 존재하는 것을 이해할 것이고, 또한 골수억제가 환자에게서 발생하는 정도를 용이하게 측정할 수 있다. 당업계에서 인정되는 골수 억제 측정치의 예로는 절대 호중구 수(ANC) 또는 혈소판 수이다. 이러한 골수억제 또는 부분 골수상해는 여러 가지 생화학적 질환 또는 질병의 결과일 수 있거나, 이전의 화학요법 또는 방사능요법의 결과일 수 있다. 이러한 관점에서, 당업자는 전형적인 화학요법으로 치료받은 환자는 일반적으로 감소된 적색 골수 잔여물을 나타낸다는 것을 이해할 것이다. 상기 논의한 바와 같이, 이러한 환자는 종종 허용할 수 없는 부작용, 예를 들어 증가된 사망률과 이환율로 귀착되는 면역억제 및 빈혈과 같은 허용할 수 없는 부작용으로 인해 최적 수준의 세포독소(즉, 방사능핵종)을 이용하여 치료할 수 없다.
더욱 구체적으로, 본 발명의 접합되거나 또는 접합되지 않은 폴리펩티드를 이용하여 약 2000/mm3 미만의 ANC를 나타내거나, 또는 약 150,000/mm3 미만의 혈소판 수를 나타내는 환자를 효과적으로 치료할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 약 1500/mm3 미만, 약 1000/mm3 미만 또는 더욱 더 바람직하게는 약 500/mm3 미만의 ANC를 나타내는 환자를 치료할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 폴리펩티드를 이용하여 약 75,000/mm3 미만, 약 50,000/mm3 미만 또는 약 10,000/mm3 훨씬 미만의 혈소판 수를 나타내는 환자를 치료할 수 있다. 더 일반적인 의미에서, 당업자는 정부 시행 지침이나 절차를 이용하여 환자의 골수억제 시점을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
상기한 바와 같이, 다수의 골수억제 환자는 화학요법, 이식 방사능용법 또는 외부 빔 방사능요법을 포함하는 치료 과정을 경험하였다. 후자의 경우에서, 외부 조사원은 악성 종양의 국소 조사를 위한 것이다. 이식 방사능요법에서, 방사능활성 시약은 수술을 통해 악성 종양 내에 위치시킴으로써 질병 부위를 선택적으로 조사한다. 다른 경우, 본원에 개시된 폴리펩티드를 이용하여 원인과는 무관하게 골수억제를 나타내는 환자의 질환을 치료할 수 있다.
이 관점에서, 본 발명의 폴리펩티드는 생체 내에서 신생물 세포의 성장을 제거, 감소, 억제 또는 조절하는 임의의 화학요법제(들)와 함께 또는 회합하여(예를 들어, 병용 요법을 제공하기 위해) 사용할 수 있음이 추가로 인식될 것이다. 논의 한 바와 같이, 이러한 제제는 종종 적색 골수 잔여물의 감소를 초래한다. 이러한 감소는 전체적으로 또는 부분적으로 그러한 환자에서 종양 형성의 적극적인 치료를 유리하게 허용하는 본 발명의 화합물의 감소된 골소독성에 의해 상쇄될 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 방사능 표지 면역접합체는 방사능핵종에 대한 신생물 세포의 취약성을 증가시키는 방사능감작제와 함께 효과적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 방사능 표지 결합 분자가 혈류로부터 거의 제거되었으나 종양(들) 부위에서는 여전히 치료적으로 유효한 수준으로 존재하는 다음에 방사능감작 화합물이 투여된다.
본 발명의 이러한 측면과 관련하여, 본 발명과 양립할 수 있는 예시적인 화학요법제의 예로는 알킬화제, 빈카 알칼로이드(예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴), 프로카르바진, 메토트렉세이트 및 프레드니손을 들 수 있다. 4-약물 조합물 MOPP(메클레타민(질소 머스타드), 빈크리스틴(온코빈), 프로카르바진 및 프레드니손)가 여러 가지 유형의 림프종을 치료하는데 매우 효과적이고, 본 발명의 바람직한 실시양태를 구성한다. MOPP 내성 환자에서, ABVD(예를 들어, 아드리아마이신, 블레오마이신, 빈블라스틴 및 다카르바진), ChlVPP(클로람부실, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프레드니손), CABS (로무스틴, 독소루비신, 블레오마이신 및 스트렙토조토신), MOPP+ABVD, MOPP+ABV(독소루비신, 블레오마이신 및 빈블라스틴) 또는 BCVPP(카르무스틴, 시클로포스파미드, 빈블라스틴, 프로카르바진 및 프레드니손) 조합을 사용할 수 있다. 문헌 [Arnold S. Freedman 및 Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788(Kurt J. Isselbacher 등, eds., 13th ed. 1994)] 및 문헌 [V. T. DeVita 등 (1997)] 및 이에 인용된 문헌들은 표준 투여 및 스케쥴링을 위한 것이다. 이들 치료법은 특정 환자의 필요에 따라 변화 또는 변경하여 사용할 수 있으며, 본원에 개시된 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드와 병용할 수도 있다.
본 발명의 기술 사상에 유용한 추가적인 방법(섭생법)의 예로는 시클로포스파미드 또는 클로람부실과 같은 단일 알킬화제의 이용, 또는 CVP(시클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), CHOP(CVP 및 독소루비신), CMOPP(시클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진), CAP-BOP(CHOP+프로카르바진 및 블레오마이신), m-BAC0D(CHOP+메톡트렉세이트, 블레오마이신 및 루코보린), ProMACE-MOPP (프레드니손, 메톡트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에포토사이드 및 루코보린+표준 MOPP), ProMACE-CytaBOM(프레드니손, 독소루비신, 시클로포스파미드, 에포토사이드, 시타라빈, 블레오마이신, 빈크리스틴, 메톡트렉세이트 및 루코보린) 및 MACOP-B(메톡트렉세이트, 독소루비신, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 고정 투여량의 프레드니손, 블레오마이신 및 루코보린)과 같은 조합약의 이용을 들 수 있다. 당업자는 이들 각각의 방법을 위한 표준 투여량 및 투여 스케쥴링을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 또한, CHOP는 블레오마이신, 메톡트렉세이트, 프로카르바진, 질소 머스타드, 시토신 아라비노사이드 및 에포토사이드와 병용할 수도 있다. 다른 양립 가능한 화학요법제의 예로는 2-클로로데옥시아데노신(2-CDA), 2'-데옥시코포르마이신 및 플루다라빈을 들 수 있으나, 이로제한되는 것은 아니다.
병세가 완화되지 않거나 병이 재발한, 중간 등급 또는 높은 등급의 NHL을 가진 환자의 경우, 구조 요법(salvage therapy)를 사용한다. 구조 요법은 시토신 아라비노사이드, 시스플라틴, 에포토사이드 및 이포스파미드와 같은 약물을 단독으로 또는 조합하여 사용한다. 어떤 신생물 질환의 재발 형태 또는 활동적인 형태의 경우, 다음과 같은 프로토콜이 종종 사용된다: IMVP-16(이포스파미드, 메톡트렉세이트 및 에포토사이드), MIME(메틸-개그, 이포스파미드, 메톡트렉세이트 및 에포토사이드), DHAP(덱사메타손, 고 투여량의 시타라빈 및 시스플라틴), ESHAP(에포토사이드, 메틸프레디솔론, HD 시타라빈, 시스플라틴), CEPP(B)(시클로포스파미드, 에포토사이드, 프로카르바진, 프레드니손 및 블레오마이신) 및 CAMP(로무스틴, 미톡산트론, 시타라빈 및 프레드니손), 이들 각각은 공지된 투여 속도와 투여 스케쥴로 이용된다.
본 발명의 폴리펩티드와 함께 사용될 수 있는 화학요법제의 양은 환자에 따라 달라질 수 있으며, 당업계에 공지된 방법에 따라 투여될 수 있다. 문헌 [Bruce A Chabner 등, Antineoplastic Agents , in GOODMAN & GlLMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 (Joel G. Hardman 등, eds., 9th ed. 1996)]을 참조할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 예를 들어 예방적 요법으로 초기 종양, 전이 또는 전암 성장 또는 조직을 제거하기 위한 수술을 받았거나, 그러한 수술을 받고 있거나, 그러한 수술을 받을 예정으로 있는 환자에게 투여할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 생물제제와 함께 투여될 수 있다. 암 치료에 유용한 생물제제가 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 결합 분자는 예를 들어 그러한 공지된 생물제제와 함께 투여될 수 있다.
예를 들어, FDA는 유방암의 치료를 위한 하기 생물제제를 승인하였다: 헤르셉틴
Figure 112008072289549-pct00069
(트라추주맙, 제넨테크 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 남부 샌프란시스코 소재; HER2-양성 유방암에서 항종양 활성을 가지는 인간화 단클론성 항체); 팔스록덱스(Faslodex)
Figure 112008072289549-pct00070
(풀베스트란트(fulvestrant), 아스트라제네카 파마슈티칼즈(AstraZeneca Pharmaceuticals), LP, 미국 델라웨어주 윌밍턴 소재; 유방암 치료에 사용되는 에스트로겐-수용체 길항자); 아리이미덱스(Arimidex)
Figure 112008072289549-pct00071
(아나스트로졸(anastrozole), 아스트라제네카 파마슈티칼즈, LP; 에스트로겐 제조에 필요한 아로마타제를 차단하는 효소인 비스테로이드계 아로마타제 억제제); 아로마신(Aromasin)
Figure 112008072289549-pct00072
(엑세메스탄(exemestane), 화이자 인코포레이티드(Pfizer Inc.), 미국 뉴욕주 뉴욕 소재; 유방암 치료에 사용되는 비가역적, 스테로이드계 아로마타제 불활성화제); 페마라(Femara)
Figure 112008072289549-pct00073
(레트로졸, 노바티스 파마슈티칼즈(Novartis Pharmaceuticals), 미국 뉴저지주 이스트 하노버 소재; 유방암 치료를 위해 FDA에 의해 승인된 비스테로이드계 아로마타제 억제제); 및 놀바덱스(Nolvadex)
Figure 112008072289549-pct00074
(타목시펜, 아스트라제네카 파마슈티칼즈, LP; 유방암 치료를 위해 FDA에 의해 승인된 비스테로이드계 항에스트로겐). 본 발명의 결합 분자와 조합될 수 있는 기타 생물제제에는 아바스틴
Figure 112008072289549-pct00075
, 베바시주맙, 제넨테크 인코포레이티드; 혈관신생 억제를 위해 설계된, 처음으로 FDA가 승인한 요법제); 및 제발린
Figure 112008072289549-pct00076
(이브리투모맙 티욱세탄, 비오겐 이디(Biogen Idee), 미국 매사츄세츠주 캠브리지 소재; B-세포 림프종의 치료를 위해 현재 승인된 방사능표지 단클론성 항체)이 포함된다.
또한, FDA는 대장암의 치료를 위한 하기 생물제제들을 승인하였다: 아바스틴TM, 에르비툭스TM(세툭시맙, 임클론 시스템즈 인코포레이티드(ImClone Systems Inc.), 미국 뉴욕주 뉴욕 소재 및 브리스톨-메이어스 스퀴브, 미국 뉴욕주 뉴욕 소재; 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대해 지정된 단클론성 항체); 글리벡(Gleevec)
Figure 112008072289549-pct00077
(이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate); 단백질 키나제 억제제); 및 에르가미솔(Ergamisol)
Figure 112008072289549-pct00078
(레바미솔 염산염, 얀센 파마슈티카 프로덕츠(Janssen Pharmaceutica Products), LP, 미국 뉴저지주 티츠빌 소재; 듀크 C 단계 결장암을 앓는 환자에 있어 외과수술 절제 후 5-플루오로우라실과 함께 병용 처리제로서 1990년도에 FDA에 의해 승인된 면역조절자).
비호지킨 림프종의 치료에 사용하기 위해, 현재 승인된 요법제에는 벡사르
Figure 112008072289549-pct00079
(토시투모맙 및 요오드 I-131 토시투모맙, 글락소스미쓰클라인(GlaxoSmithKline), 미국 노쓰캐롤라이나주 리서치 트라이앵글-파크 소재; 방사능 분자(요오드 I-131)에 연결된 마우스 단클론성 항체(토시투모맙)를 포함하는 다단계 치료); 인트론(Intron)
Figure 112008072289549-pct00080
A(인터페론 알파-2b, 쉐링 코포레이션(Schering Corporation), 미국 뉴저지주 케닐워쓰 소재; 안트라사이클린 함유 병용 화학요법제(예를 들어, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손[CHOP])) 와 병용되는 엽상 비호지킨 림프종의 치료를 위해 승인된 인터페론 유형; 리툭산
Figure 112008072289549-pct00081
(리툭시맙, 제넨테크 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 남부 샌프란시스코 소재, 및 비오겐 이디, 미국 매사츄세츠주 캠브리지 소재; 비호지킨 림프종의 치료를 위해 승인된 단클론성 항체; 온탁(Ontak)
Figure 112008072289549-pct00082
(데니레우킨 디프티톡스(denileukin diftitox), 리간드 파마슈티칼즈 인코포레이티드(Ligand Pharmaceuticals Inc.), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재; 인터류킨-2에 유전적으로 융합된 디프테리아 독소의 단편으로 구성된 융합 단백질); 및 제발린
Figure 112008072289549-pct00083
(이브리투모맙 티욱세탄, 비오겐 이디; B-세포 비호지킨 림프종의 치료를 위해 FDA에 의해 승인된 방사능표지 단클론성 항체)이 포함된다.
백혈병의 치료를 위해, 본 발명의 결합 분자와 조합하여 사용될 수 있는 예시적 생물제제에는 글리벡
Figure 112008072289549-pct00084
; 캠퍼쓰
Figure 112008072289549-pct00085
-1H(알렘투주맙, 베르렉스 라보라토리즈(Berlex Laboratories), 미국 캘리포니아주 리치몬드 소재; 만성 림프구성 백혈병의 치료에 사용되는 단클론성 항체의 유형)이 포함된다. 또한, 제나센스(Genasense)(오블리메르센(oblimersen), 젠타 코포레이션(Genta Corporation), 미국 뉴저지주 버클리 하이츠 소재; 백혈병 치료를 위해 개발 중인 BCL-2 안티센스 요법제가 (예를 들어, 단독으로 또는 하나 이상의 화학요법 약물, 예컨대 플루다라빈 및 시클로포스파미드와 조합하여) 사용될 수 있고, 청구된 결합 분자와 함께 투여될 수 있다.
폐암의 치료를 위해, 예시적 생물제제에는 타르세바(Tarceva)TM 에를로티 닙(erlotinib) HCL, OSI 파마슈티칼즈 인코포레이티드(OSI Pharmaceuticals Inc.), 미국 뉴욕주 멜빌 소재; 인간 상피 성장 인자 수용체 1(HER1) 경로를 표적으로 하도록 설계된 소분자)가 포함된다.
다발성 골수종의 치료를 위해, 예시적 생물제제에는 벨케이드(Velcade)
Figure 112008072289549-pct00086
(브르테조밉, 밀레니엄 파마슈티칼즈, 미국 매사츄세츠주 캠브리지 소재; 프로테아좀 억제제)가 포함된다. 부가적 생물제제에는 탈리도미드(Thalidomid)
Figure 112008072289549-pct00087
(탈리도마이드, 클레젠 코포레이션(Clegene Corporation), 미국 뉴저지주 워렌 소재; 면역조절제이고, 항혈관신생 및 골수종 세포의 성장 및 생존을 억제하는 능력을 포함한 다중 작용을 가지는 것으로 보임)가 포함된다.
기타 예시적 생물제제에는 MOAB IMC-C225(임클론 시스템즈 인코포레이티드(미국 뉴욕주 뉴욕 소재)에 의해 개발됨)가 포함된다.
추가적으로, 본 발명의 결합 분자는 항암 면역 반응을 조절하는 백신 또는 다른 제제(예를 들어, 사이토카인)과 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 멜라사인(Melacine)
Figure 112008072289549-pct00088
(코릭사 코포레이션(Corixa Corporation), 미국 워싱턴주 시애틀 소재)은 T3N0M0 절제된 흑색종의 치료에 효과가 있는 것으로 보고된 동종이계 종양 백신이다. GMK
Figure 112008072289549-pct00089
(프로제니스 파마슈티칼즈 인코포레이티드(Progenies Pharmaceutical, Inc.), 미국 뉴욕주 태리타운 소재)는 흑색종 재발의 고 위험성을 가진 환자에서 III기 보조제로서 투여되는 강글리오사이드 항원이다. 항-가스트린 치료 백신
Figure 112008072289549-pct00090
(아프톤 코포레이션(Aphton Corporation), 미국 플로리다주 마이애미 소재)은 호르몬 G17 및 글리엑스테네드를 중화하며, 결장직장암, 췌장암 및 위암 환자에 대해 3상 임상 시험이 진행되고 있다. 세아박(CeaVac)
Figure 112008072289549-pct00091
(티탄 파마슈티칼즈 인코포레이티드(Titan Pharmaceuticals, Inc.), 미국 캘리포니아주 남부 샌프란시스코 소재)은 결장직장암에서 연구되는 항이디오타입 항체 백신이다. 마지막으로, 테라토프(Theratope)
Figure 112008072289549-pct00092
(바이오미라 인코포레이티드(Biomira Inc.), 캐나다 알버타 에드몬톤 소재)는 전이성 유방암 환자에서 III기 제제로서 연구중인 합성 탄수화물 치료 백신이다(문헌 [Pharmaceutical Research 및 Manufacturers of America, 2000]).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 항혈관신생제, 예를 들어 엔도스타틴(미세혈관 내피 세포 생성을 중지시키는 내인성 종양-유래, 내피-특이성 억제제); 항 VEGF 항체; 탈리도마이드; 또는 혈관 기저막의 합성 및 분해를 억제하는 기질 메탈로프로테이나제 억제제와 함께 투여될 수 있다.
이미 논의된 바와 같이, 본 발명의 결합 분자, 이의 면역반응성 단편 또는 재조합체는 포유동물의 장애의 생체내 치료를 위해 약학적 유효량으로 투여될 수 있다. 이러한 관점에서, 개시된 결합 분자는 투여를 용이하게 하고 활성제의 안정성을 촉진하기 위해 제형화되는 것으로 인식될 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 비독성 멸균 담체, 예를 들어 생리적 염수, 비독성 완충액, 보존제 등을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 치료제와 접합되거나 접합되지 않은, 본 발명의 결합 분자, 이의 면역반응성 단편 또는 재조합체의 약학적 유효량은 예를 들어, 질병 또는 질환의 징후를 경감하거나, 또는 어떤 물질이나 세포를 검출하는 이점을 얻고, 표적에 대한 효과적인 결합을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다. 종양 세포의 경우, 상기 폴리펩티드는 신생물 세포 또는 면역반응성 세포에 대해 선택된 면역반응성 항원과 면역반응하여 이들 세포의 사멸을 증가시킬 수 있는 것이 바람직하다. 물론, 본 발명의 약학적 조성물은 단일 또는 다중 투여량으로 투여하여 약학적 유효량의 상기 폴리펩티드를 제공할 수도 있다.
본 발명의 범주에 벗어나지 않으면서, 본 발명의 폴리펩티드는 치료적 효과 또는 예방적 효과를 발현하기에 충분한 양을 상기한 방법에 따라 인간 또는 다른 동물에게 투여할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 공지된 기법에 따라 본 발명의 결합 분자와 약학적으로 허용가능한 통상적인 담체 또는 희석제와 조합하여 제조된 통상적인 투여 제형으로 인간 또는 다른 동물에게 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 형태 또는 특성은 조합될 활성 성분의 양, 투여 경로 및 잘 알려진 다른 변수에 의해 결정됨을 이해할 것이다. 또한, 당업자는 본 발명의 폴리펩티드의 1종 이상을 포함하는 칵테일이 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있음을 이해할 것이다.
XIV . 사용 방법
본 발명의 분자는 예를 들어 진단 목적이나 치료 목적으로, 안정화된 scFv 분자 또는 그러한 scFv 분자를 포함하는 조성물을 사용하는 것이 바람직한 환경에서 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 당해 처치가 필요한 포유동물 대상, 바람직하게는 인간에게 있어 본 발명의 결합 분자의 투여로부터 이익을 얻게 되는 장애, 예를 들어 신생물 장애의 진단 및/또는 치료를 위한 화합물, 조성물, 키트 및 방법을 제공한다. 바람직하게, 대상은 인간이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 시험관내 종양 항원 검출을 위한 검정, 예를 들어 ELISA 검정에 사용할 수 있다. 예시적인 검정이 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 출원 제20040077025호를 참조한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 조영 기술을 이용하여 종양 항원을 갖는 세포의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 이러한 적용을 위해서는, 결합 분자를 검출가능한 분자, 예를 들어 이하 후술하는 바와 같은 방사능표지에 접합시키는 것이 바람직할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 본 발명의 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프(예를 들어, 크립토의 에피토프 또는 TNF 수용체 패밀리 구성원의 에피토프, 예를 들어 TRAIL-R2 또는 LTβR)을 보유하는 세포를 (예를 들어, 아포프토시스에 의해) 감소 또는 제거하는데 유용하다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 순환에서 가용성 표적 분자의 농도를 감소시키거나 상기 표적 분자를 제거하는데 효과적이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 종양 크기를 감소시키고, 종양 성장을 억제하고/하거나, 종양을 보유하는 개체의 생존 시간을 연장시킨다. 따라서, 본 발명은 또한 효과적인 비독성 양의 폴리펩티드를 종양의 치료가 필요한 인간 또는 동물에게 투여함으로써 인간 또는 동물에서 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당업자는 악성 종양을 치료하기 위해 필요한 폴리펩티드의 효과적인 비독성 양이 어느 정도의 양인지를 통상적인 실험을 통해 결정할 수 있다. 예를 들 어, 폴리펩티드의 치료적 유효량은 질병의 상태(예를 들어 I기 대 IV기), 대상의 연령, 성별, 의료적 복합 문제(예를 들어, 면역억제된 상태 또는 질병) 및 체중, 및 대상에서 원하는 반응을 유발할 수 있는 항체의 능력과 같은 요인에 의해 달라질 수 있다. 투여 방법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들어, 수회 분할하여 매일 투여할 수도 있고, 또는 투여량은 치료 상황의 본질적인 요구에 의해 나타나는 바와 같이 비례적으로 감소할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 유효 투여량은 일일 체중 1 kg 당 약 0.05 내지 100 mg의 범위, 보다 바람직하게는 일일 체중 1 kg 당 약 0.5 내지 10 mg인 것으로 예상된다.
보다 구체적으로는, "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠용 동물 또는 애완용 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는, 포유 동물로 분류된 임의의 동물을 의미한다. 바람직한 포유동물은 인간이다. 본원에 사용한 용어 "처치(treatment)"는 치료적 처치 및 예방적 처치 둘 다를 의미한다. 처치가 필요한 동물은 질병 또는 장애를 이미 갖고 있는 동물뿐만 아니라 질병 또는 질환의 예방이 요구되는 동물을 의미한다. 따라서, 포유동물은 질병 또는 장애를 보유하는 것으로 진단되었거나, 또는 질병에 걸리기 쉽거나 질병에 취약한 것은
일반적으로, 개시된 조성물은 예방적으로 또는 치료적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 결합 분자에 의한 암 세포의 표적화를 가능하게 하는 마커를 포함하는 임의의 신생물은, 본 발명의 결합 분자를 이용하여 검출 또는 억제(예를 들어 사멸)될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 고형 종양을 처치 하기 위해 사용할 수 있다. 처치할 수 있는 예시적 암에는 전립선암, 위 암종, 예를 들어 결장암, 피부암, 유방암, 난소암, 폐암 및 췌장암이 포함되나, 이에 한정되지 않는다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 카포시 육종, CNS 종양(모세혈관 아세포종, 수막종 및 뇌 전이), 흑색종, 위장관 및 신장암종, 횡문근암종, 신경아세포종(바람직하게는, 다형 신경아세포종), 평활근암종, 망막아종, 난소의 유두 포낭 아데노암종, 윌름 종양 또는 소세포 폐 암종을 처치하기 위해 사용할 수 있다. 적합한 폴리펩티드는 본원의 개시 내용에 기초하여 부당한 실험 없이 상기 신생물 각각과 관련된 종양 관련 분자에 대해 유도될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
본 발명을 이용하여 처치할 수 있는 예시적인 혈액 악성 종양의 예에는 호지킨 및 비호지킨 림프종, 및 ALL-L3(버킷 림프종), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 단구세포 백혈병을 포함한 백별병이 포함된다. 본 발명의 화합물 및 방법은 낮은 등급/낭포성 비호지킨 림프종(NHL), 세포 림프종(FCC), 맨틀 세포 림프종(MCL), 확산 거대 세포 림프종(DLCL), 소 림프구성(SL) NHL, 중간 등급/낭포성 NHL, 중간 등급확산 NHL, 높은 등급 림프구모세포성 NHL, 높은 등급 림프구아세포성 NHL, 높은 등급 소 비절단 세포 NHL, 비대 질병 NHL 및 발덴스트롬 매크로글로불린혈증을 포함하는 다양한 B-세포 림프종을 치료하는데 특히 효과적임을 인식할 것이다. 이들 림프종은 종종 분류 시스템의 변화에 따라 다른 이름으로 명명될 것이며, 상이한 이름으로 분류된 림프종을 가진 환자도 본 발명의 병용 치료법의 이익을 받을 것이라는 점은 당업자에게 명백하다. 상기한 신생물 장애 이외에, 본 발명은 상용적 종양 관련 분자를 보유하는 추가의 악성 종양을 치료하는 데 유리하게 사용될 수 있 음을 인식할 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 종양 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있고 환자에서의 종양 세포의 성장을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양 세포는 뇌, 두부, 목, 전립선, 유방, 고환, 결장, 폐, 난소, 방광, 자궁, 자궁경부, 췌장 및 위 종양 세포이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하고, 항원을 과발현하는 종양 세포의 성장을 억제한다. 한 실시양태에서, 종양 세포는 항원을 과발현하는 세포주, 예를 들어 뇌, 유방, 고환, 결장, 폐, 방광, 자궁, 자궁경부, 췌장 및 위암으로부터 유래한 세포주이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는, 알레르기성 기관지 폐아스페길루스증; 알레르기성 비염 자가면역 용혈성 빈혈; 흑색극세포종; 알레르기성 접촉 피부염; 애디슨씨병; 아토피성 피부염; 원형 탈모증; 전신 탈모증; 아밀로이드증; 아나필락토이드 자반증; 아나필락시스양 반응; 재생불량성 빈혈; 유전성 혈관부종; 특발성 맥관부종; 강직성 척추염; 두개 동맥염; 거대 세포동맥염; 다가야스 동맥염; 두통 측두동맥염; 천식; 혈관확장성 운동실조증; 자가면역 난소염; 자가면역 고환염; 자가면역 다내분비선 부전; 베체트병; 버거스병; 부에거병; 기관지염; 물집천포창; 만성 점막 피부 캔디다증; 카플란 증후군; 심근경색후 증후군; 심낭막절개술후 증후군; 심장염; 비열대성스프루; 챠가스병; 세디아크-히가시 증후군; 처그-스트라우스병; 코간 증후군; 한냉 응집소병; CREST 증후군; 크론씨병; 한냉글로불린혈증; 잠재 섬유성 폐포염; 포진성피부염; 피부근염; 진성 당뇨병; 다이아몬드- 불랙판 증후군; 디조지 증후군; 원판상 홍반성 루푸스; 호산성 근막염; 상공막염; 장기 융기성 홍반; 유연성 홍반; 다형 홍반; 결절 홍반; 가족성 지중해열; 펠티 증후군; 폐섬유화증; 아나필락시스 사구체신염; 자가면역 사구체신염; 연쇄상구균 감염 후 급성 사구체신염; 이식후 사구체신염; 막상 사구체신염; 굿패스츄어 증후군; 면역-매개 과립구감소증; 환상육아종; 알레르기성 육아종증; 육아종성 감염; 그레이브병; 하시모토 갑상선염; 신생아 용혈성 질병; 특발성 혈색소증; 헤노호-쉔라인 자반증; 만성 활성 및 만성 진행성 감염; 조직구증식증 X; 과호산구 증후군; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 잡 증후군; 연소자성 피부근염; 연소자성 류마토이드 관절염(연소자성 만성 관절염); 가와사키병; 각막염; 각결막염; 란드리-길랑-바레-스트롤 증후군; 나종나병; 뢰플러 증후군; 루푸스; 라이엘(Lyell's) 증후군; 라임병; 육아종성 림프종증; 전신 비만세포증; 복합 교원성 질환; 다발성 홑신경염; 머클-웰스 증후군; 점막피부성 림프절 증후군; 점막피부성 림프절 증후군; 다중심 세망조직구증; 다발성 경화증; 중증근무력증; 균상식육종; 전신성 괴사성 혈관염; 신증후군; 중복 증후군; 지방층염; 발작성 한냉 혈색소뇨증; 발작성 야간 혈색소뇨증; 유사천표창; 천포창; 천포창 홍반 루푸스; 낙엽성 천포창; 심상성천포창; 비둘기사육사병; 과민성 폐렴; 결절성 다발동맥염; 다발성근육통; 다발성근염; 특발성 신경염; 포르투갈 가족성 다발성 신경병증; 자간전증/자간증; 원발성 담즙성 경화; 진행성 전신성 경화증(경피증); 건선; 건선 관절염; 폐포 단백증; 폐섬유증, 레이나우드 현상/증후군; 레이델 갑상선염; 라이터 증후군, 재발성 다발연골염; 류마티스열; 류마티스 관절염; 사르코이드증; 공막염; 경화성 담관염; 혈청 병; 세자리 증 후군; 쇼그렌 증후군; 스티븐스-존슨 증후군; 스틸병; 아급성 경화성 범뇌염; 교감눈염증; 전신 홍반 루푸스; 이식거부증; 궤양성 결장염; 미분화 결합 조직병; 만성 두드러기; 한냉 두드러기; 포도막염; 백반증; 웨버-크리스찬 병; 베게너 육아종증 및 비스코트-올드리치 증후군을 포함하나 이에 한정되지 않는 면역 장애들을 치료하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 결합 분자는 예비표적화 용도를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 동일한 이점이 화학요법 약물 전달을 위한 예비 표적화 용도에서 분명할 것이다.
예를 들어, 예비표적화에 있어, 종양은 한편으로는 종양 관련 항원에 대해, 다른 한편으로는 예를 들어 방사능표지 합텐에 대한 친화도를 가지는 결합 구성체로 예비표적화된다. 방사능표지 합텐은 이후에, 바람직하게는 종양 관련 항원에 대한 친화도를 갖는 결합 구성체를 소거한 후에 투여된다(예를 들어, 문헌 [Boerman 등 2003. J. Nuclear Med. 44:400] 참조). 또 다른 예에서, 항체는 비독성이나 결합 분자에 의해 결합될 때에만 독성인 약물 또는 프로드러그와 반응함으로써 유도되었다. 본 실시예에서의 주어진 생체분석 데이터에서, 본 발명의 결합 분자는 예비표적화 용도들에 사용되도록 잘 적합화된다. 한 실시양태에서, 소거제는 본 발명의 결합 분자를 이용함으로써 예비표적화 방법으로 제거될 수 있다.
본 발명은 비제한적인 것으로 간주되지 않는 하기 실시예에 의해 더욱 기술된다. 본원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참조문헌, 특허문헌 및 공개된 특허출원의 내용은 전적으로 본원에 참조 인용된다.
실시예 전반에 걸쳐, 달리 언급되지 않는 한, 하기 물질 및 방법을 사용하였다.
일반 물질 및 방법
일반적으로, 본 발명의 수행은, 달리 나타내지 않는 한, 통상적 기법의 화학, 생물물리학, 분자생물학, 재조합 DNA 기법, 면역학(특히, 예를 들어 항체 기법) 및 전기영동의 표준 기법을 이용한다. 예를 들어 문헌 [Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]; 문헌 [Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr(1996)]; [Antibody Engineering: A Practical Approach(Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr(1996)]; 문헌 [Antibody: A Laboratory Manual, Harlow 등, C.S.H.L. Press, Pub.(1999)]; 및 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel 등, John Wiley & Sons(1992)]을 참조한다.
발현 구성체
일반적으로, 달리나타내지 않는 한, 하기 실시예에서의 scFv에 대한 발현 구성체는 Myc 및 His 택 및 엔테로키나제 절단 부위를 포함하는 C-말단 정제 펩티드 및 N-말단 유전자 III 신호 펩티드를 포함하였다. 각 펩티드에 대한 DNA 서열이 하기에 나와 있다:
N-말단 유전자 III 신호 펩티드 DNA 서열
ATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGT(서열 번호 25)
N-말단 유전자 III 신호 펩티드 DNA 서열
MKKLLFAIPLVVPFYSHS (서열 번호 26)
C-말단 정제 펩티드 DNA 서열
GACGACGACGACAAAAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA(서열 번호 27)
C-말단 정제 펩티드 DNA 서열
DDDDKSFLEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH(서열 번호 58)
항체
특정 실시예에 사용되는 BIIB 항체(BIIB1 - BIIB18)는 각종 특이성의 치료적 항체의 집합체이다. 18개 항체 중 17개가 안정한 벌크 또는 클론성 CHO 세포주에서 발현되었고, 1개의 항체(BIIB13)가 HEK293E 세포에서 일시적 형질감염을 이용하여 발현되었다. 18개의 항체 모두는 카파 경쇄를 함유한다. 대부분의 항체는 인간 IgG1이었으나; BIIB2, BIIB5 및 BIIB11는 인간 IgG4이었다. 18개 항체 중 17개가 인간 또는 인간화된 것이엇다. BIIB15는 PRIMATIZED®이었다(문헌 [Nakamura 등, 2000]). 각 항체에 대한 인간 배아세포주의 일치도를 공공연하게 입수가능한 인간 배아세포주에 대한 BIIB VH 또는 VK 서열의 클러스탈W(ClustalW) 정렬(유럽 생물정보 연구원(European Bioinformatics Institute)의 ClustalW WWW Service, Thompson 등, 1994)로 평가하였다(문헌 [Lefranc 등, 1999]).
18개 총 항체 중 15개가 IgG1 하위부류였고, 나머지 3개는 IgG4(BIIB2, BIIB5 및 BIIB11)이었다. IgG1 및 IgG4 CH1 서열은 10개 아미노산 차이(6개는 보존적임) 및 경쇄와의 교대 디술피드-결합 패턴을 가진다.
Fab 안정성의 IgG 하위부류에 대한 영향을 조사하기 위해, 2중 모사 Fv 영역을 갖는 IgG1 및 IgG4 구성체를 이용가능하였다. IgG1 또는 IgG4 중쇄 불변 영역에 그라프팅된 BIIB7의 VH 영역을 함유한 2개의 구성체를 생성시켰다.
실시예 1. 종래의 BHA10 scFv 및 Fab 단백질의 제조
하기 표 2에 나와 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 중합효소 사슬 반응(PCR)을 이용하여 플라스미드 pXWU034로부터 BHA10 scFv를 서브클로닝하였다. 전방 프라이머 BHA10-01F는 BHA10 N-말단 중 가변 도메인 유전자에 대해 상보적인 서열의 18개 염기가 후속되는 독특한 Sph I 제한 엔도뉴클레아제 부위(밑줄 표시된 서열)를 함유한다. 역방 프라이머, BHA10-01R은 BHA10 C-말단 경 가변 도메인 유전자에 대해 상보적인 서열의 24개 염기, 엔테로키나제 부위에 대해 상보적인 서열의 15개 염기 및 인접한 Hind III 및 Xba I 제한 엔도뉴클레아제 부위(엔도뉴클레아제 부위가 밑줄 표시됨)를 함유한다. PCR 증폭 후, 예상 크기에 상응하는 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 해상분석하고, 절제하였으며, 제조업자의 사용설명서에 따라 밀리포어 울트라프리-DA 추출 키트(Millipore Ultrafree-DA extraction kit)(밀리포어(Millipore); 미국 매사츄세츠주 베드포드 소재)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 Sph I을 이용하여 절단하고, dNTP의 존재 하에 DNA 중합 효소 I로 절단하여 블런트 말단으로 만든 후, Hind III로 절단하였다. 블런트 말단/Hind III 절단 PCR 산물을 Sca I/Hind III 절단 pKJS216에 결찰시켰다. pKJS216는 유도성 ara C 프로모터의 조절 하에 재조합 단백질 발현을 유도하는 E. 콜라이 벡터이다. 결찰 혼합물의 일부를 사용하여, E. 콜라이 균주 XL 1-블루로 형질전환시켰다. 암피실린 약물 내성 콜로니를 선별하였고, DNA 서열 분석으로 최종 pIEH003 구성체의 올바른 서열을 확인하였다. BHA10 scFv의 DNA 서열 및 아미노산 서열이 도 1A 및 1B에 각각 나와 있다.
[표 2]
종래의 BHA10 scFv의 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드.
Figure 112008072289549-pct00093
BHA10 scFv의 발현을 위해, 플라스미드 pIEH003으로 형질전환된 E. 콜라이 균주 W3110(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재, 카달로그 # 27325)의 새로 단리된 콜로니를, 1 L 배플 부착 플라스크 중 50 μg/ml 카르베니실린을 함유하는 4×250 ml SB 배지(테크노바(Teknova), 미국 캘리포니아주 해프문 베이 소재, 카달로그 # S0140) 중에서 성장시켰고(0.02% 아라비노스에 첨가하여 OD600
Figure 112008072289549-pct00094
0.8로 유도되도록 함), 하룻밤 동안 배양하였다. 세균을 원심분리에 의해 수집하였다. 펠렛을 가용화하고, 40 mL B-PER 단백질 추출 시약(카달로그 #78243, 피어스(Pierce))을 이용하여 용해시켰다. 가용화된 scFv를 5 mL Ni-NT A-슈퍼플로우(Superflow) 칼럼(카달로그 # 30410, 키아겐(Qiagen))에 적용하였다. 결합된 scFv를 60 mM 이미다졸(pH 8.0)로 세정하고, 300 mM 이미다졸(pH 8.0)로 용출하였다. 용출된 scFv를 6 mL 단백질 L 아가로스 칼럼(카달로그 #20510, 피어스)에 로딩하였다. 결합된 단백질을 인산염 완충 염수(PBS)로 세정하고, 0.1 M 글리신(pH 3.0)으로 용출하였다. 정제된 scFv를 PBS에 대해 투석하고, -20℃에서 저장하였다. ε280 nm=2.1 mL mg-1 cm- 1를 이용하여 단백질 농도를 결정하였다.
BHA10 Fab의 효소 제제를 위해, BHA10 IgG를 2.4 mg/mL BHA10 IgG1, 100 mM 트리스(Tris)-HCl, 20 mM EDTA(pH 7.0)을 함유하는 8.3 ml 용액 중 4 μl의 농축 파파인 스톡액(0.3 mg/mL, 30 Units/mg-카달로그 #108014, 로쉐(Roche))와 혼합하였다. 반응이 25℃에서 90분 동안 진행되도록 하였다. 절단 용액을 20 mM 아세트산염(pH 5.0)을 이용하여 1:5로 희석하고, 희석 완충액으로 평형화된 6 ml SP-세파로스(Sepharose) FF 칼럼에 로딩하였다. 칼럼을 2 칼럼 체적의 희석 완충액으로 세정하였다. 조질의 Fab 단편을 30 칼럼 체적의 0 내지 200 mM NaCl 선형 구배로 용출하였다. 140 mM NaCl (~24 mL 총) 중심의 광위 피크를 수집하였고, 이 피크는 대부분의 절단된 IgG 물질을 함유하였다. 용출된 체적을 농축에 의해 2 mL로 감소시키고, PBS로 평형화된 분취 G300 SW 토소하스(Tosohaas) SEC 칼럼(109 mL)에 로딩하였다. Fab를 15 mL 초과의 0.8 칼럼 체적으로 용출하였다. 정제된 Fab를 2 내지 11 mg/mL로 농축하였다. ε280 nm=1 내지 5 ml mg-1 cm- 1를 이용하여 Fab 농도를 결정하였다.
실시예 2. 종래의 BHA10 scFv 분자의 열 안정성
시차 주사 열량계(DSC)를 사용하여, 단리된 BHA10 scFv가 본래 그것의 Fab 상대부보다 덜 안정한지의 여부를 시험하였다. 자동화 모세관 시차 주사 열량계(capDSC, MicroCal, LLC)를 이용하여 스캔을 수행하였다. 단백질 및 기준 용액을 로봇식 부착을 이용하여 96-웰 플레이트로부터 자동적으로 샘플링하였다. 단백질 스캔 전에, 샘플 세포에서 2 스캔을 완충액으로 수행하고, 배경 차감을 위해 사용하였다. 모든 단백질 스캔 후 5% 리퀴녹스(Liquinox)를 이용하여 단일 클리닝 스캔을 수행하였다. 모든 스캔 후, 기준 세포 및 샘플 세포 모두를 0.01% 나트륨 아지드 함유의 2 ml 증류 탈이온수를 이용하여 기기 자동화로 3회 린스하였다. 스캔을 증진된 피크 해상도를 위한 배지 피드백 모드를 이용하여 1℃/분으로 수행하였다. 스캔 범위는 20 내지 95℃였다. 단백질 함유의 모든 96-웰 플레이트를 6℃에서 기기 내에 보관하였다.
도 2는 정제된 BHA10 Fab 및 scFv 항체 단편을 이용한 DSC 측정을 나타낸다. 열량계 내에서, Fab 또는 scFv가 언폴딩할 때까지 온도를 상승시킨다. 각 단백질이 언폴딩할 때의 온도(즉, TM 값)는 전반적 안정성을 가리킬 수 있다. BHA10 Fab의 모든 4개의 도메인(VH, VL, CH1 및 CL)은 78℃에서 협력하여 언폴딩한다(도 2A). scFv 도메인에는 CH1 및 CL 도메인이 결여되어 있다. 이 골격이 없을 때, scFv의 도메인은 Fab보다 훨씬 더 낮은 온도에서 언폴딩하고, 도메인의 열량 엔탈피에 있어 유의적 차가 있으며, 이는 안정화 상호작용이 소실됨을 가리킨다. VL 도메인은 68℃의 TM에서 언폴딩하는 반면, VH 도메인은 BHA10 Fab의 언폴딩 전이에 대해 관찰되는 것보다 더 낮은 58℃, 20℃에서 언폴딩한다(도 2B). 또한, TM의 스캔 속도 의존성이 있는데, 이는 스탠 속도가 느려짐에 따라, scFv의 TM을 인위적으로 낮추는 가열 상태 동안에 단백질 응집이 일어남을 제시한다(문헌 [Sanchez-Ruiz 등, Biochemistry, 27: 1648-1652, 1988). 낮은 겉보기 안정성 및 응집 경향은, CHO 세포가 종래의 헤르큘레스 이중특이적 항체 분자와 같은 scFv를 함유하는 안정하고 비응집된 물질을 유의적 양으로 생성시키지 못함에 대한 결정 인자일 수 있다.
실시예 3. 향상된 열 안정성을 갖는 BHA10 scFv 분자의 작제
실시예 2에서 입증되는 바와 같이, BHA10 scFv 도메인은 본질적으로 불안정하다는 것을 알게 된 바, 재조합 DNA 기법을 사용함으로써 scFv를, 열 자극 조건 하에서 열역학적으로 또는 기능적으로 Fab와 동등한 변형된 scFv를 생성하도록 조작함으로써, 이중특이적 항체를 작제하는 데 유용한 scFv 도메인이 수득되는 것으로 가설 추정되었다. 또한, 단리된 scFv 도메인 그 자체가 전체 이중특이적 분자의 성분으로 재도입될 때 임의의 유익한 생물물리학적 성질이 수득되도록 하는 것으로 가설 추정되었다. 그러한 취지에서, E. 콜라이 발현 시스템을 이용하여 BHA10 scFv 도메인의 생물물리학적 안정성을 향상시키고, 열 자극 검정에서 열 내성 scFv 도메인의 리간드로의 결합을 측정함으로서 모니터링되는 안정성 향상을 위한 노력이 시작되었다.
scFv 도메인의 안정화를 위해, 두 방법, 즉 1) BHA10 scFv의 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 디술피드 결합을 도입하는 방법; 및 2) BHA10 scFv의 VH 및 VL 도메인을 연결하는 (Gly4Ser)n 링커의 길이를 최적화하는 방법이 적용되었다.
A. 디술피드-안정화 BHA10 scFv 의 작제
BHA10 scFv 생성 세균 발현 벡터, pIEH003를 모 벡터로서 이용하였다. 퀴체인지(QuickChange) 부위-지정 돌연변이유발 키트(스트라젠(Stratagene); 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 제조업자의 사용설명서에 따라 사용하여, 두 시스테인 잔기를, 하나는 VH에, 두 번째 것은 VL에 도입하였고, 상기 VH 및 VL은 안정화 디술피드 결합의 형성에 관여할 수 있다. 프라이머 쌍 VH44-F 및 VH44-R(표 3)을 사용하여, BHA10 가변 중쇄의 위치 44 (카밧 넘버링 시스템)에서의 Gly 잔기(GGA)를 Cys 잔기(TGC)로 돌연변이유발하였다. 돌연변이유발 산물을 키트 프로토콜에 따라 메틸화 민감성 효소 Dpn I로 절단하여, E. 콜라이 균주 XL10-GOLD
Figure 112008072289549-pct00095
(스트라젠; 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)로 형질전환하였다. 암피실린 약물 내성으로 형질전환된 E. 콜라이 콜로니를 DNA 서열 분석에 의해 올바른 서열 돌연변이에 대해 선별하였다. 수득된 플라스미드인 pIEH004를 이용하여, BHA10 가변 경쇄의 위치 100(카밧 넘버링 시스템)에서의 Gln 잔기(CAG)를 Cys 잔기(TGC)로 프라이머 쌍 VL100-F 및 VL100-R(표 3)을 이용하여 돌연변이화하는 후속 반응을 수행하였다. 전방(VH44-F) 및 역방(VH44-R) 프라이머는 VH 위치 44에서 Gly(GGA)를 Cys(TGC)로 돌연변이화하였다(TGC는 밑줄 표시된 서열로 나타냄). 전방(VL100-F) 및 역방(VL100-R) 프라이머는 VL 위치 100에서의 Gln (CAG)를 Cys (TGC)로 돌연변이화하였다(TGC는 밑줄 표시된 서열로 나타냄).
암피실린 약물 내성으로 형질전환된 XL10-GOLD
Figure 112008072289549-pct00096
E. 콜라이 콜로니를 DNA 서열 분석에 의해 올바른 서열 돌연변이에 대해 선별하였고, 위치 VH44 및 VL100에서 이중 시스테인 돌연변이를 가지는 플라스미드 pIEH006을 확인하였다. VH44/VL100 디술피드-안정화 BHA10 scFv의 DNA 서열 및 아미노산 서열이 도 3A 및 3B에 각기 나와 있다.
[표 3]
VH44/VL100 디술피드-안정화 BHA10 scFv의 작제를 위한 올리고뉴클레오티드.
Figure 112008072289549-pct00097
B. 대안적 ( Gly 4 Ser ) n 링커를 이용한 BHA10 scFv 의 작제
종래의 (Gly4Ser)3 링커를 갖는 huBHA10 scFv를 코딩하는 플라스미드 pIEH003을, 표 4에 기재된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 PCR 증폭에 의해 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)5 링커를 함유하도록 변형시켰다.
pXWU002-F1로 표시되는 전방 5' PCR 프라이머 및 XWU002-R로 표시되는 역방 3' PCR 프라이머를 이용하여 BHA10 scFv(Gly4Ser)4를 조립하였다. 5' VH PCR 프라이머 XW002-F1은 BHA10 VH의 카르복실 말단에 위치한 Btg I 제한 엔도뉴클레아제 부위(밑줄 표시된 서열)을 포함하였고, 이에 후속하여 (Gly4Ser)4 링커를 코딩하는 서열을 포함하였다. 3' VL PCR 프라이머 XW002-R은 Xba I 부위 및 부분적 엔테로키나제 부위를 포함하였다. 부분적 BHA10 VH+(Gly4Ser)4 링커+BHA10 VL 영역은 (실시예 1에 기재된) 플라스미드 DNA pIEH003로부터의 XW002-F1/XW002-R PCR 프라이머 세트를 이용한 PCR 반응에서 증폭되었다. 예상된 크기에 상응하는 부분적 BHA10 scFv-(Gly4Ser)4 링커 유전자 단편을 아가로스 겔 전기영동에 의해 해상분석하고, 절제하였으며, 제조업자의 사용설명서에 따라 밀리포어 울트라프리-DA 추출 키트(밀리포어; 미국 매사츄세츠주 베드포드 소재)를 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 절달하여, Btg I/Xba I 절단 pIEH003 벡터에 클로닝하여, (Gly4Ser)4 링커를 함유한 BHA10 scFv를 코딩하는 플라스미드 pXWU002를 수득하였다. (Gly4Ser)5 링커를 함유 한 BHA10 scFv도 PCR 프라이머 XW003-F 및 XW002-R을 이용하여 이와 유사한 방식으로 작제함으로써, 플라스미드 pXWU003을 생성시켰다. 전방 5' PCR 프라이머(XWU003-F)는 Btg I 부위(밑줄 표시된 서열)을 포함하였고, 이에 이어서 BHA10 VH의 카르복실 말단의 몇개의 아미노산을 코딩하는 서열 및 부분적 (Gly4Ser)5 링커를 코딩하는 서열을 포함하였다. DNA 서열 분석에 의해 올바른 서열을 확인하였다. (Gly4Ser)4 링커를 함유한 BHA10 scFv의 DNA 서열 및 아미노산 서열이 도 4A 및 4B에 각기 나와 있다. (Gly4Ser)5 링커를 함유한 BHA10 scFv의 DNA 서열 및 아미노산 서열이 도 5A 및 5B에 각기 나와 있다.
[표 4]
(Gly44Ser)4 또는 (Gly4Ser)5 링커를 갖는 BHA10 scFv의 작제를 위한 올리고뉴클레오티드.
Figure 112008072289549-pct00098
실시예 4. 향상된 열 안정성을 갖는 BHA10 scFv 분자의 특징분석
A. 조작된 BHA10 scFv 의 발현 및 웨스턴 블롯 분석
조작된 BHA10 scFv의 발현을 위해, E. 콜라이 균주 W3110(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재, 카달로그 # 27325)를 플라스미드 pIEH003, pXWU002, pXWU003 및 pIEH006로 형질전환시키고, 암피실린 내성 콜로니를 선택하여 50 ml 코니칼형 원심분리관 내 50 μg/ml 카르베니실린을 함유하는 10 ml SB 배지(테크노바, 미국 캘리포니아주 해프문 베이 소재, 카달로그 # SO140) 중에서 성장시켜(0.02% 아라비노스에 첨가하여 OD600
Figure 112008072289549-pct00099
0.8로 유도되도록 함), 하룻밤 동안 배양하였다. 세균을 원심분리에 의해 수집하였고, 펠렛을 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA 및 20% 수크로스(w/v)의 1/20 체적의 빙냉 등삼투압 용액에 재현탁시키고, 얼음으로 냉장시켰다. 2 mg/ml 라이소자임(Lysozyme)(시그마(Sigma)) 함유의, 동등 체적의 50 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1 mM EDTA 및 20% 수크로스(w/v)를 세균 현탁액에 첨가하였고, 10분 동안 가끔 혼합하면서 얼음 상에 항온 배양하였다. 세균 현탁액을 10분동안 8000×g 및 4℃에서 원심분리하였고, 세포외질 분획을 보유하도록 하였다.
샘플을 본연의 샘플 완충액 또는 환원제인 디티오트레이톨을 함유하는 샘플 완충액과 혼합하고, 3분 동안 90℃에서 가열하였다. 환원된 샘플 및 비환원된 샘플을 SDS-PAGE 트리스-글리신 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기천공하고, 니트로셀룰로스 막(인비트로겐(Invitrogen), 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재) 상에 전기영동으로 전달하였다. 막을 5% (w/v) 탈지유 및 0.1% 트리톤(Triton) X-100 함유의 PBS로 블로킹하여, 항-인간 카파 항체(로쉐 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 미국 일리노이즈주 인디아나폴리 스 소재)와 함께 항온 배양하였다. 막을 세정한 후, 항-토끼 HRP 항체(아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences), 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)와 함께 항온 배양하였다. 제조업자(아머샴 바이오사이언시스, 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)에 따라 ECL 웨스턴 블로팅 분석 시스템을 이용하여 면역 복합체를 검출하였다.
시험한 3개의 디술피드 쌍 중 하나, 즉 VH44:VL100만이 E. 콜라이에서 발현될 때 적당량의 단백질이 생성되었음이 밝혀졌다(도 6, 레인 2). (시험한 VH44: VL105 및 VH106:VL43 디술피드는 그에 상당하는 다량의 비변형 scFv을 생성하지 않았음). 마찬가지로, (Gly4Ser)n 링커의 길이를 n=4(레인 3) 또는 n=5(미도시)로 확장한 경우에도, E. 콜라이에서 적당량의 단백질이 생성되었다. 실시예 3에 기재된 방법을 이용하여 BHA10 scFv로 VH44:VL100 및 (Gly4Ser)4 링커 변형 모두를 조합한 경우에도, 적당량의 발현된 단백질이 생성되었다(도 6, 레인 4). VH44:VL100 및 (Gly4Ser)4 링커 변형의 조합을 갖는 BHA10 scFv의 DNA 서열 및 아미노산 서열이 도 7A 및 7B에 각기 나와 있다. BHA10 scFv가 VH44:VL100 돌연변이를 함유하는 양 경우 모두에서, scFv가 변성의 비환원 폴리아크릴아미드 겔에서 증가된 이동성으로 이동하는 것으로 나타났으나, 변성의 환원 조건 하에서는 종래의 BHA10 scFv와 유사하게 이동하였다(도 6, 레인 2 및 4). 이 분석은, VH44: VL100 돌연변이를 함유하는 BHA10 scFv 변이체가 비변형 디술피드 결합을 형성하기 쉽고, 보다 밀집된 구조를 달성할 수 있음을 제시한다.
B. 열 변성 검정.
이어서, 종래 및 조작된 BHA10 scFv의 활성을, 열 자극 이벤트 후에 scFv 분자의 50%가 그것의 항원 결합 활성을 보유하는 온도를 결정하기 위해 사용되는 열 자극 검정에서 비교하였다. 이 온도에 상응하는 수치 값을 "T50" 값으로 칭하고 단위는 ℃이다. 이 검정에서, scFv를 종래의 BHA10 scFv의 열적 전이 온도를 포괄하는 온도 범위에 적용하였다.
E. 콜라이 균주 W3110(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재, 카달로그 # 27325)를 유도성 ara C 프로모터의 조절 하에 종래 및 조작된 BHA10 scFv를 코딩하는 플라스미드로 형질전환하였다. 형질전환체를 1% 글리신, 1% 트리톤 X100, 0.02% 아라비노스 및 50 μg/ml 카르베니실린으로 보충된 SB(테크노바, 미국 캘리포니아주 해프문 베이 소재, 카달로그 # S0140)로 구성된 발현 배지에서 37℃ 또는 32℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 세균을 원심분리에 의해 펠렛화하였고, 상등액을 추가 처리를 위해 수거하였다. 배지에 글리신 및 트리톤 X-100을 포함시킴으로써, 세포외질 내용물(본연의 E. 콜라이 단백질 및 scFv)이 배지로 방출된다(문헌 [Yang 등 Applied and Environmental Microbiology. (1998) 64:2869-2874]). 상등액 내 E. 콜라이 단백질의 존재는 이 검정의 성능에 필수적인데, 이는 열적으로 변성된 단백질이 "싱크(sink)"로서 작용하여, 일시적으로 언폴딩된 scFv 분자를 비가역적 불활성 응집체에 포획하기 때문이다.
각 라이브러리를 상등액으로써 열 자극 검정을 이용하여 2중 모사체로 스크리닝하였고, 이 때 하나의 복사체는 처리 조건에 적용하였고, 두 번째 상등액은 비처리 기준으로 작용하였다. 열 변성 검정은 안정성 측정을 위한 단일 온도 또는 온도 범위에서 수행될 수 있다. 써모사이클러 기기는 안정성 측정을 위한 단일 온도 또는 온도 범위에서 수행될 수 있다. 안정한 열 구배를 발생시킬 수 있는 써모사이클러 기기를 사용하여 샘플 상등액을 처리하였다(i사이클러(iCycler), 바이오-래드(Bio-Rad), 미국 매들랜드주 게이써스버그).
자극 온도는 모 BHA10 scFv 변이체의 성질에 따라 다양하였고, 일반적으로 실험적으로 결정된 T50 값보다 2 내지 3℃ 더 높았다. 냉동 마스터 플레이트를 해동시켜, 웰 당 250 μl의 발현 배지를 함유하는 딥-웰 마이크로티터 플레이터에 접종하는데 사용하였고, 배지를 32℃에서 배양하였다. 대조군으로서, 모 플라스미드를 함유하는 배양물을 동일한 조건 하에 성장시켜, 라이브러리와 동시에 가공하였다. 세균을 펠렛화하였고, 50-100 μl 분취량의 시험 상등액을 PCR 스트립관(어플라이트 바이오시스템(Applied Biosystem), 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재, 카달로그 # N801-535) 또는 96-웰 플레이트(어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재, 카달로그 # N801-560)에 두었고, 샘플을 60 내지 90분 동안 가열하였다. 샘플을 96-웰 v-바닥 플레이트(코닝(Coming), 미국 뉴욕주 코닝 소재, 카달로그 # 3357)에 옮겨, 냉장 임상 원심분리기(IEC 모델 8R, 써모 일렉트 론(Thermo Electron), 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재)에서 30분 동안 원심분리하였고, 100 μl의 상등액을 표준 마이크로티터 플레이트(코닝, 미국 뉴욕주 코닝 소재, 카달로그 # 3357)에 옮겼다. 분취량의 상등액을 기준 DELFIA를 위해 보존하였다. 대부분의 라이브러리에 대해, 상등액의 나머지를 함유하는 플레이트를 밀봉하고(날지 넌크(Nalge Nunc), 미국 뉴욕주 로체스터 소재, 카달로그# 235205), 항온배양기 세트에 넣어 적절한 자극 온도로 90분 동안 맞추었다(에코 썸(Echo Therm), 토레이 파인스 사이언티픽(Torrey Pines Scientific), 미국 캘리포니아주 산 마르코 소재). 다중 자극 온도 (또는 75℃ 초과의 온도)를 필요로 하는 선별을 위해, 상등액을 96-웰 PCR 플레이트(어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재, 카달로그 # N801-560)에 옮겨, 원하는 온도에서 90분 동안 항온 배양하였다.
열 자극 후, 샘플을 2,000 RPM에서 원심분리하여, 응집된 물질을 제거하였다. 처리되고 소거된 상등액 내에 남아있는 가용성 BHA10 scFv 샘플을 DELFIA 검정에 의해 동족 LTβR Ig 항원에의 결합에 대해 검정하였다. 96-웰 플레이트(맥시소프(MaxiSorp), 날지 넌크, 미국 뉴욕주 로체스터 소재, 카달로그 # 437111)를 0.1 M 탄산나트륨 완충액(pH 9.5) 중 1 μg/ml으로 인간 Fc 영역에 융합된 LTβ 수용체(LTβR)의 엑토도메인으로 구성된 융합 단백질로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하여, 실온에서 진탕 하에 DELFIA 검정 완충액(DAB, 10 mM 트리스 HCl, 150 mM NaCl, 20 μM EDTA, 0.5 % BSA, 0.02% 트윈(Tween) 20, 0.01% NaN3(pH 7.4)))으로 1시간 동안 블로킹하였다. 플레이트를 BSA(세정 완충액)없이 DAB로 3회 세정하였고, DAB 중에 희석된 시험 샘플을 최종 체적 100 μl로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 진탕 하에 1시간 동안 항온 배양한 후, 세정 완충액으로 3회 세정하여, 비결합 및 기능적 불활성화 scFv 분자를 제거하였다. 웰 당 40 ng/ml의 Eu-표지 항-His6 항체(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사츄세츠주 보스턴 소재, 카달로그 # ADO 109)를 함유하는 100 μl의 DAB를 첨가함으로써, 결합된 BHA10 scFv를 검출하였고, 1시간 동안 진탕 하에 실온에서 항온 배양하였다. 플레이트를 세정 완충액으로 3회 세정하고, 웰 당 100 μl의 DELFIA 강화 용액(퍼킨 엘머, 미국 매사츄세츠주 보스턴 소재, 카달로그 # 4001-0010)을 첨가하였다. 15분 동안 항온 배양한 후, 빅터(Victor) 2(퍼킨 엘머, 미국 매사츄세츠주 보스턴 소재)에서 유로퓸 방법을 이용하여 플레이트를 판독하였다.
검정 데이터를 스팟파이어 디시젼사이트(Spotfire DecisionSite) 소프트웨어(스팟파이어(Spotfire), 미국 매사츄세츠주 소버빌 소재)를 이용하여 처리하였고, 이를 각 클론에 대해 기준 온도에 대한 자극 온도에서 관찰되는 DELFIA 계수의 비로 표시하였다. 모 플라스미드에 대해 관찰되는 값의 2배 이상의 비를 반복적으로 제공한 클론을 히트(hit)로 간주하였다. 이 양성 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 미니-프렙(mini-prep)(위자드 플러스, 프로메가(Promega), 미국 위스콘신주매디슨 소재)에 의해 단리하였고, E. 콜라이 W3110으로 재형질전환하여, 2차 열 자극 검정을 수행하여 확인하였다.
열 구배에 대해, 데이터를 모델로서 가변 기울기를 갖는 S-자형 용량 반응을 이용한 프리즘(Prism) 4 소프트웨어(그래프패드(GraphPad) 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 이용하여 분석하였다. 열적 변성 곡선의 중간점에 대해 수득된 값을 T50 값으로 칭하고, 이는 생물물리학적으로 유래된 Tm 값과 동등한 것으로 간주되지 않는다.
열 자극 검정의 결과가 도 8에 나와 있다. 도 8에 나와 있는 바와 같이, 본 발명의 안정화된 scFv 분자는 모두 종래의 scFv에 비해 결합 활성의 향상(T50 >49℃)을 초래하였다. 특히, BHA10 라이브러리 위치 VL46 scFv (S46L), 라이브러리 위치 VH16 scFv(S16E 및 S 16Q) 및 라이브러리 위치 VL49: VL50 scFv의 T50 값은 종래의 BHA10 scFv에 비해 +3℃ 내지 +12℃ 범위의 열 안정성의 증가를 나타냈다. 또한, BHA10 라이브러리 위치 VL3 scFv(Q3A, Q3G, Q3S, Q3V 및 Q3D), 라이브러리 위치 VH67 scFv(V67I 및 V67L), 라이브러리 위치 VH48 scFv(M48I 및 M48G), 라이브러리 위치 VH20 scFv(V20I) 및 라이브러리 위치 VH 101 scFv (P101D)의 T50 값은 종래의 BHA10 scFv에 비해 +4℃ 내지 +18℃ 범위의 열 안정성의 증가를 나타냈다. 안정화 돌연변이(VL K 13E) 중 하나는 우연히 PCR 오차로부터 비롯되었다. 이 안정화 돌연변이 중 하나를 pIEH009에 도입함으로써 열 안정성이 초래된 것으로 나타났고, 심지어 이 조건 하에서 BHA10 Fab의 열 안정성을 보다 향상시켰다. 중요하게는, 4가 지 설계 방법(VL/VH 계면 상동성 모델링, 일치 스코어링, 전산 모델링 및 공변 분석) 중 하나 이상으로부터 유래된 비공유 VL46, VH101 돌연변이, 및 VH55 돌연변이가 디술피드 돌연변이에서 관찰되는 scFv 열 안정성에 거의 근접하는 scFv 열 안정성의 안정성을 초래하였고, 이는 이 설계 툴의 유용성 및 신규성을 입증한다. 특히, pIEH006 구성체, BHA10 VH44:VL100 scFv(59℃)의 T50는 BHA10 Fab(62℃)와 단지 3℃ 만큼 차이가 났고, 한편 pIEH009 구성체, BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커는 이 조건 하에서 BHA10 Fab와 기능적으로 동등한 것으로 나타났다. 이 결과는, 본 발명의 안정화된 scFv가 열 자극 이벤트 후에 향상된 활성을 가짐을 입증한다.
c. 친화도 측정
등온 적정 열량계(ITC)를 사용하여, BHA10 IgG1 분자의 효소 절단을 이용하여 유래된 BHA10 Fab에 대한 sLTβR의 친화도를 측정하였다. sLTβR은 과거 기재된 바와 같이 제조되었다(문헌 [Eldredge 등, Biochemistry, (2006)]). Fab 및 sLTβR를 아미콘(Amicon) 울트라원심분리 필터 장치(MWCO 10,000)를 이용하여 6.0 및 2.0 mg/mL로 각기 농축하였다. 농축된 스톡액을 PBS에 대해 동시에 투석한 후, ITC 측정을 수행하였다. ITC를 30℃로 설정된 VP-ITC 유닛(마이크로칼(MicroCal) LLC, 미국 매사츄세츠주 노쓰앰프톤 소재)에서 수행하였다. 대략 500 μL의 7 μM sLTβR 용액을 샘플 세포에 넣었고, PBS 투석물을 기준 세포에 넣었다. 총 234 μL의 70 μM BHA10 Fab을 7×10 μL, 12×7 μL, 및 그에 이어 8×10 μL 주입량으로 하여 샘플 세포에 적정 투입하였다. 반응 화학양론은 1:1이었다. 제조업자에 의해 공급 되는 오리진 소프트웨어(Origin Software)를 이용하여 ITC 곡선을 분석하였다.
실시예 3에서 제조되어, 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 발현 및 정제된 바와 같은 종래의 BHA10 scFv, BHA10 (Gly4Ser)4 scFv 및 BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv 제제의 KD 측정을 비아코어(Biacore) 3000 기기(비아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여 수행하였다. 모든 실험들을 HBS-EP 완충액(pH 7.4) 중에 수행하였다. 비오티닐화 PENTA-His 항체(20 μg/mL, 카달로그 #34440, 키아겐)를 대략 1분 동안 10 μl/분의 유속으로 스트렙타비딘 코팅 CM5 칩 상에 고정화하였다. 시험 scFv의 0.1 μM 용액을 10분 동안 5 μl/분의 유속으로 칩상에 주입하고, 고정화된 PENTA-His 항체를 통해 표면 상에 포착하였다. sLTβR과 포착된 scFv 사이의 결합을 조사하기 위해, 일련의 농도의 sLTβR(1, 2, 5, 10, 25, 50, 100 및 200 nM)을 scFv-코팅 표면 상에 30 μl/분의 유속으로 이중 주입하였다. 배경을 완충액만을 함유하는 유세포로부터의 센서그램 데이터 및 PENTA-His 표면으로부터의 센서그램 데이터(여기에서, scFv를 주입한 후, sLTβR 대신에 완충액을 주입함)를 이용한 시험 샘플 센서그램으로부터 차감하였다. 비아에발(BiaEval) 3.0의 제조업자의 소프트웨어를 이용하여 곡선을 분석하였다. 역학 연관 및 해리 곡선을 1:1 랑귀미르(Langmuir) 결합 모델에 맞춤으로써 KD 값을 계산하였다. 0.1 M 글리신(pH 3.0)을 2회 연속하여 10 μL로 주입함으로써 칩 표면을 재생시켰다.
표 5은 비아코어 친화도 검정의 결과를 보여준다. 재조합에 의해 생성된 BHA10 scFv의 결합 친화도는 실시예 1에 기재된 바대로 제조된 BHA10 Fab와 본질적으로 동일하다. 또한, (G4S)4 링커 단독의 도입 또는 안정화 디술피드(VH44:VL100) 하에서의 도입, 또는 이 양자 모두의 조합은 항원에 대한 친화도의 유의적 손실을 전혀 초래하지 않았다.
[표 5]
비아코어 친화도 검정 - LTβR에 대한 결합.
Figure 112008072289549-pct00100
* 등온 적정 열량계에 의해 측정됨
D. 시차 주사 열량계 연구
BHA10 scFv, BHA10 (Gly4Ser)4 scFv 및 BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv 제제에 시차 주사 열량계(DSC) 분석을 수행하였다. 4℃/분의 스캔 속도로 수행하는 것을 제외하고는 상기 기재된 바대로 실험을 수행하여, 초기에 효소에 의해 생성된 Fab에 대해 종래의 scFv를 초기에 비교하였다. BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv는 야생형 scFv에 비해 우수한 열 안정성 성질을 나타냈다. 특히, 두 도메인 중 덜 안 정한 것인 BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv의 VH 도메인이 종래의 BHA10 scFv의 온도보다 대략 5℃ 높은 온도에서 변성하였다(도 9). "융점" 또는 TM의 증가는 두 가지 구분된 인자, 즉 (i) 평형화 폴딩 상태의 열 안정성의 증가, 또는 (ii) 응집 경향의 감소로 인한 것이었을 수 있다. 종래의 BHA10 scFv와 BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv 사이의 ~5℃ 온도 차이는 스캔 속도(0.2 및 4.0℃/분)와 비교적 독립적이었고, 이는 관찰된 TM 변화가 평형 폴딩 상태의 안정화로 인한 것이었음을 제시한다.
E. ANS 결합 연구
소수성 형광 염료 1-아닐리노-8-나프탈린 술포네이트(ANS) 결합능은 종종 단백질의 본연의 상태 또는 온도 처리가 증가될 때 일어나는 부분적으로 언폴딩된 상태에서의 유의적으로 큰 소수성 영역과의 상호작용의 특징이다. 염료의 고유 형광도가 용매 중에서 켄칭되고, 소수성 표면적에 노출될 때 유의적으로 증가한다. 종래의 BHA10 scFv는 BHA10 (Gly4Ser)4 scFv, 또는 BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv보다 훨씬 더 강한 수준으로 본질적으로 ANS에 결합하였고, 이는 부적당한 크기의 링커에 의한 scFv에 강행되는 소수성 노출의 존재를 가리킨다. 보다 긴 링커, 특히 (Gly4Ser)4를 부가함은 이 효과를 매개하는 것으로 나타났다. 종래의 BHA10 scFv에 의한 소수성 표면의 겉보기 노출은 다른 단백질 또는 분자의 존재 하, 또는 심지어 단리된 그 자체의 존재 하에서도 증가된 응집 수준을 초래할 수 있다. BHA10 scFv 를 그것의 TM를 초과하여 가열하는 것이 종래 및 조작된 BHA10 scFv에 대한 ANS 결합을 유도하는 것으로 보였다. 흥미롭게도, 종래의 BHA10 scFv는 증가하는 온도의 함수로서 ANS 결합의 점차적 증가를 나타냈고, 이는 TM 미만의 온도, 예컨대 세균 및 포유동물 세포 배양에 사용되는 온도(즉, 37℃)에서의 소수성 노출이 증가할 수 있음을 제시한다(도 10). 이와 대조적으로, BHA10 (Gly4Ser)4 및 BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv의 양자 모두는 이 성질을 나타내지 않았고, 이는 본 발명에 기재된 안정화 돌연변이가 소수성 표면적의 노출 감소에 기초하는 다른 세포-배양물 단백질 성분과의 회합 또는 자가회합 경향을 감소시킨다.
실시예 5. 향상된 고유의 단백질 안정성을 부여하는 안정화 돌연변이의 확인
(i) 안정화 돌연변이의 확인
각종 서열-기재 방법들(예를 들어, 일치 스코어링, 공변 분석, VH/VL 계면 상동성 모델링)을 사용하여, 향상된 단백질 안정성을 관심 결합 분자에 부여한 안정화 돌연변이를 확인하였다. 이 안정화 돌연변이를 항체 가변 영역 발현 라이브러리의 설계 및 작제에 사용하였다.
A. 공변 분석
단일 서열 내 2개 이상의 잔기에 의해 나타난 강한 공변에 기초하여 BHA10 scFv VH 및 VL 도메인을 안정화하기 위한 수많은 설계들이 개발되었다. 안정화 돌연변이가 실험적 선별을 위한 항체 가변 영역 발현 라이브러리에서 예측되고 포함될 수 있도록 결실 또는 위반 공변을 확인하기 위해, 하기 실시예 17에 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여 BHA10 scFv VH 및 VL 도메인에 대해 공변 분석을 수행하였다.
첫 번째 예로, BHA10 VL 내 위치 46(S46L; 카밧 넘버링 시스템)에서의 Ser에서 Leu로의 돌연변이는, 공변 분석 툴이 Leu 46과 강하게 공변하는 것으로 나타난 잔기 36에서의 기존 Tyr에의 양성 연결을 나타냈다(도 78 참조). 이 돌연변이는 또한 잔기 빈도 분석에 의해 안정화하는 것으로 예측되었다.
S46L에 부가하여, 공변에 의해 안정화하는 것으로 예측된 제2 돌연변이는 BHA10 VH 도메인 내의 V55G 돌연변이였다. 잔기 빈도가 VaI이 이 위치에서 드물게 관찰되는 것으로 나타냈으나, 이 위치는 CDR2 내에 삽입되어 있고, 가변적이다. 그러므로, 부가적 정보 없이, 이 위치에서의 변화가 과거 시도되지 않았다. 그러나, 공변 분석에 의한 조사 시에, 공변 데이터는 이 위치가 BHA10 VH 도메인 내에 이미 존재하는 10종 이상의 다른 아미노산과 강하게 상관됨을 제시하였다. 위치 55에서의 Gly로의 돌연변이는 모든 10 공변을 만족하였다.
공변 분석 툴의 유용성의 또 다른 예는 BHA10 VH Q6E 돌연변이의 예측된 음성 효과이다. 단일 잔기 빈도 분석은, 이 위치에서의 훨씬 더 통상적으로 관찰되는 Glu로의 돌연변이가 안정성의 증가를 초래할 것임을 제시하였다. 그러나, 공변 분석 툴은 Glu로의 단일 돌연변이가 BHA10 VH 서열 내에 존재하는 수가지 기존 공변을 위반함을 가리켰다. 안정성의 향상을 수득하기 위해, 이 위치에서의 Glu를 우선적으로 안정화하는 수가지 아미노산으로 대체해야 한다.
공변 분석 툴의 예측성 값의 또 다른 예가 도 79에 나와 있다. Met 80은 단일 잔기 라이브러리 설계의 일부로서 Leu로 돌연변이화되었다. Leu가 서열 데이터베이스 내 이 위치에서 관찰되는 가장 빈번한 아미노산이기 때문에, 이 단일 돌연변이가 가장 큰 안정화성을 가지는 것으로 사료되었다. 그러나, 공변 분석은 공변 조화를 달성하기 위해서 2종의 다른 아미노산이 돌연변이화되어야 함(V67F 및 T70S)을 가리킨다.
B. 일치 스코어링
scFv의 고유 안정성을 향상시키기 위한 돌연변이유발을 위해 scFv VH 및 VL 영역 내 아미노산 잔기를 확인하는 방법으로서 일치 스코어링을 사용하였다. 스코어링은 과체세포 돌연변이 및 진화 배아세포주 변이로 인한 일치 VH 및 VK 서열로부터의 상대적 부동을 평가한다. 이어서, 이 분석으로부터 유래된 정보를 사용하여, 향상된 안정성을 갖는 scFv 변이체에 대해 선별하기 위한 라이브러리를 설계하였다.
스코어링을 위한 일치 서열을 유도하는 데 사용되는 포유동물 VH 및 VK 카파 서열의 기준 세트 및 각 잔기 위치에서의 개별 아미노산 빈도를 과거 기재된 바대로 수집, 분류 및 도태시켰다(문헌 [Demarest 등, J. Mol . Biol . 335, 41-48(2004)]; 문헌 [Demarest 등, Protein Eng . Des . Sel . In Press , (2006)]). 포유 동물 기준 세트는 종들 간의 진화 부동을 통해 다양성을 수득하기 위해 각종 포유동물들로부터의 V-유전자를 포함하도록 나이브로 작제되었다. VH 포유동물 기준 세트는 일차적으로 총 17가지 상이한 포유동물 종을 나타내는 NCBI 및 TIGR로부터의 61 VH 서열을 함유한다. VK 포유동물 기준 세트는 13종의 상이한 포유동물 종으로부터의 53 VK 서열을 함유한다.
통상의 설계된 IgG 데이터베이스 및 변형된 PERL 스트립트를 이용하여 BHA10 VH 및 VL의 통계학적 분석을 수행하였다(문헌 [Demarest 등, 2004]; 문헌 [Demarest 등, 2006]). BHA10 VH 및 VL 내의 모든 잔기의 아미노산 빈도를 통상의 데이터베이스로부터 계산하였다. 한 개별 서열에서 각 위치 i에 대한 BHA10 VH 및 VL 내의 각 아미노산의 잔기 빈도, S i (r)는, 특별한 잔기 유형(r=A, C, D... V, W, Y)이 데이터세트 내에서 관찰되는 회수를 서열의 총수로 나눔으로써 계산되었다. 도 11은 BHA10 VH 및 VL 잔기 빈도를 데이터베이스 일치 잔기의 잔기 빈도로 나눈 것을 보여준다. 일치 잔기 빈도로 나눔으로써 BHA10 아미노산이 통상의 VH 또는 VL 서열 중에서 드물게 관찰되는 잔기 위치에서의 라이브러리의 생성을 위한 엄격한 한도가 수득됨을 가리킨다. 라이브러리 위치는 잔기 빈도를 가장 빈번한 잔기 빈도로 나눈 것이 <0.3인 것들에 의해 결정되었다(Si(r)/MFRi(r)) < 0.3임). 잔기 빈도 계산의 우항에 열거된 잔기는 공개된 바의 인간 서열에서 통상 발견되는 잔기들이고(문헌 [Chothia 등, J. Mol . Biol . 278, 457-479, (1998)]), 대부분의 안정화 아미노산에 대해 선별하기 위해 라이브러리 포맷으로 특이적으로 표적화될 수 있다. BHA10 VH 및 VL의 CDR은 LTβR과의 상호작용의 잠재적 개입으로 인해 안정성 최적화를 위해 고려되지 않았으나, 2세대 설계를 위해 고려될 수 있을 것이다.
C. VH / VL 계면 동종성 모델링
하기 실시예 15에 기재된 바와 같이, 시차 주사 열량계 분석을 17개 인간 항체에 대해 수행하였다. 상위 후보물질, BIIB1-4은 모두 탁월한 (즉, 매우 높고도 원하는) 안정성 성질을 가졌다. 이 매우 안정한 항체는 낮은 고유의 안정성을 갖는 항체 도메인 또는 scFv의 안정성을 향상시키기 위한 플랫폼으로 사용될 수 있다. 특히, 잠재적으로 보다 큰 수준의 안정성 성질을 제공하기 위해서는 VH와 VL 사이의 계면에 중점을 두어야 한다.
BHA10 Fab를 scFv 포맷으로 전환함으로써, 단일의 보다 높은 온도 언폴딩 전이(Fab)에 의해 관찰되는 완전 협력적 언폴딩 이벤트 내지 2개 개별의 보다 낮은 온도의 언폴딩 전이(scFv)에 의해 관찰되는 대체로 비협력적인 언폴딩 이벤트를 가리키는 DSC 온도기록도에서 변화가 초래되었다. 즉, Fab 포맷에서, 도메인 간 접촉은 모든 도메인을 단일의 보다 높은 온도 언폴딩 전이로 함께 결속시키기에 충분히 강하였다. 일단 CH1 및 CL 도메인을 제거하면, scFv의 VH 및 VL 도메인이 더 이상 언폴딩 전이를 협력적 이벤트로 유도하는 능력을 가지지 않았다. 계면을 안정화함으 로써, VH 및 VL 도메인 모두를 동시에 안정화할 뿐만 아니라, VH/VL 계면의 부착을 촉진하고 응집을 배제할 수 있는 것으로 간주된다.
상위 4개의 가장 안정한 BIIB 항체(BIIB1-4)를 사용하여, 2-단계 절차를 통해 BHA10 scFv로의 안정화 돌연변이를 설계하였다. 먼저, 인간화 BHA10 Fab의 결정 구조를 구조적 분석을 위해 이용하였다. 구체적으로, 결정 구조를 이용하여 VH와 VL 사이의 계면에 있는 모든 잔기를 확인하고, (MOLMOL 소프트웨어를 이용하여) 각 잔기가 계면에 기여하는 표면적의 양을 확인하였다. 계면에 있는 다른 것들보다 유의적으로 더 큰 표면적을 매립하는 잔기가 계면에 더욱 중대한 것으로 간주된다. 임의 한계 우위 지정으로서, 30 Å2와 40 Å2 사이에 매립하는 것들이 중요한 것으로 간주된다. >40 Å2를 매립하는 것들이 결정적인 것으로 간주된다. 이 2개의 카테고리에 상동성 모델링 및 돌연변이유발의 측면에서 최고의 우위가 부여되었다. 각 잔기가 계면에 매립하는 표면적의 양이 표 6에 열거되어 있다. 두 번째로, VH와 VL 사이의 계면에 있는 아미노산 유형을 BIIB1-4 내 동일한 위치에 존재하는 아미노산(즉, 극히 안정한 항체)과 비교하였다. 이 방법을 통해, BHA10 scFv의 안정화를 위한 다수의 현저한 돌연변이의 확인이 가능하였다.
2개의 돌연변이, 즉 VL 내의 S46L 및 VH 내의 P101D가 실시예 8에 기재된 바와 같이 실험적으로 입증되었다. 실제로, 이 2개의 돌연변이는 열 자극 검정에서 시험된 단일의 가장 안정화시키는 돌연변이였다(예를 들어, 도 50A 참조). 양 돌연 변이 모두는 VH 및 VL 도메인 모두를 동시에 안정화하고, 이는 그것들이 도메인들 간의 협력성을 구축하는 것을 돕는다는 것을 제시한다.
[표 6]
BHA10 VHVL 표면적 분석
Figure 112008072289549-pct00101
Figure 112008072289549-pct00102
('*'로 표지된 잔기 위치는, BIIB 1,2,3, 또는 4에서 발견되는 잔기에 대한 돌연변이를 통해, 양호한 안정성 설계를 위한 기회를 가리킴)
D. 전산 분석
전산 방법을 사용하여, 아미노산 치환이 안정성을 향상시킬 수 있도록 하는 위치 상의 이점 달성에 대해 BHA10를 분석하였다. 이 방법은 두 단계, 즉 서열-기재 분석(단계 1); 및 구조-기재 분석(단계 2)으로 구성되었다. 제1 단계 과정 중, 항체의 가변 도메인의 서열의 데이터베이스가 사용되었다. 각 위치에 낮은 빈도(데이터베이스 서열 내 10% 미만)로 존재하는 아미노산 또는 상응하는 일치 아미노산에 부합하지 않은 아미노산을 고빈도 또는 일치 아미노산으로의 치환(후보 돌연변이)을 위해 선택하였다. 제2 단계 과정 중에, 항체의 Fab 단편의 3차원 구조 또는 모델을 사용하였다. 후보 돌연변이를 그 구조적 부문에 있어 평가하였고, 조성적 성질, 상보성 결정 영역(CDR) 구조와의 상용성, VI/VH 계면 팩킹에서의 역할 및 중쇄 및 경쇄의 폴딩에 기초한 실험적 시험을 위해 우위 지정하였다.
BHA10은 경쇄 상의 위치 46에 세린을 가져 비통상적이다. 데이터베이스에서, VL(카파 서브타입) 서열의 대략 1%가 S46을 가지는 반면, VL(카파 서브타입) 서열의 대략 79%가 L46을 가진다. 또한, 인간 일치 KV1은 L46을 가진다. 일단 후보 돌연변이로 확인되면, S46L 치환은 BHA10 Fab의 3차원 모델의 부문에서 평가되었다. 위치 46은 VH의 Y101 및 W103및 VL의 Y36 및 Y55와 접촉하는 VL/VH 계면에 있는 것으로 나타났다. 구조-염기 분석은, S46L 치환이 VL/VH 계면의 일체성, CDR 구조, 및 VL 폴 딩과 상용적임을 나타냈다.
세린은 중쇄의 위치 16에 있는 빈번하지 않은 아미노산이다. 데이터베이스에서, VH 서열의 대략 5%가 S16을 가지고, 25%가 A16을 가지며, 21%가 G16을 가지고, 11%가 E16을 가지며, 대략 10%이 Q16이다. 또한, 인간 일치 HV1은 A16을 가진다. 일단 후보 돌연변이로 확인되면, S16A, G, E 및 Q 치환이 BHA10 Fab의 3차원 모델 부문에서 평가되었다. 위치 16은 VH의 K13 및 S16과 접촉하는 VH/CH1 계면에 인접한 루프에 있는 것으로 나타났다. 구조-염기 분석은, S16A, G, E 및 Q 치환이 VL/VH 계면의 일체성, CDR 구조 및 VH 폴딩과 상용적임을 나타냈다. 또한, E16 및 Q16의 긴 친수성 측쇄가 바람직할 것으로 결론이 나왔다. 따라서, 위치 VL 46 및 VH 16이 라이브러리 설계에 나타내어져 있다.
전산 분석으로의 상보적 접근법은 구조-기재 단백질 조작 기법, 예컨대 로제타(Rosetta)(문헌 [Kuhlman B. 등, PNAS 200198(19): 10687-91]) 및 DEEK(문헌 [Hanf KJ., Ph.D. Thesis, MIT, 2002])를 이용하였다. 단백질 계면의 3차원 구조가 주어지는 경우, 이 방법은 VH의 VL로의 결합에 대한 향상된 ΔΔG(결합 상태와 비결합 상태의 차이) 및/또는 VH 및 VL 폴딩에 대한 ΔΔG(폴딩 상태와 언폴딩 상태의 차이)를 초래하는 아미노산 서열의 돌연변이를 생성시킬 수 있다. 이 방법의 사용은, S46L가 VH의 VL로의 결합을 향상시키는 돌연변이인 반면, S16E는 VH의 폴딩을 향상시키는 돌연변이임을 나타냈다.
E. 계면 및 공변 설계의 조합 접근법
공변 분석을 사용하여, VH와 VL 사이의 계면을 제공하고 지지하며, V H / V L 사이의 강한 친화도를 유지함으로써 scFv 안정성의 증가를 초래하는 데 중요한 잔기 네트워크를 결정하였다. BHA10 scFv의 VH와 VL 사이의 계면에 직접 관련된 잔기를 실시예 5C에 기재된 바와 같이 확인하였고, 이는 상기 표 6에 열거되어 있다. 상기 표 6에 열거된 가장 크게 매립된 잔기와 강하게 공변하는 잔기를 상기 단락 III (a)에 기재된 공변 방법을 이용하여 계산하였다. 공변 분석을 위해 사용된 HMM은 계면에 매립되어 있는 VH 및 VL 도메인 모두의 CDR2 및 CDR3에서의 잔기를 조사하는 능력을 제거한다. 그럼에도 불구하고, 항체가 높은 친화도를 갖는 항원을 인식할 수 있도록 하기 위한 강한 선택적 압력으로 인해 매우 가변적인 상기 잔기 위치로부터 강한 공변이 생기지 않은 것으로 판단된다. 그러므로, 공변 네트워크가 VH 및 VL 사이의 계면을 지지하기 위해 존재하는지의 여부를 결정하기 위해 사용되는 잔기는 하기와 같았다:
Figure 112008072289549-pct00103
V-클래스 서열 정렬 내 겉보기가 상기 열거된 계면 잔기와 상관된 잔기를 파이-값 한도 > 0.25를 이용하여 결정하였다. 잔기가 바로 위에 열거된 계면 잔기들 중 2개 이상과 상관되지 않은 경우, 어떠한 잔기도 VH와 VL 사이의 강한 계면을 유지하기 위해 중요한 것으로 간주되지 않았다. 표 7 및 8은 계면 잔기와 2가지 이상의 상관 관계를 나타내는, 각기 VH 및 VL 도메인 내에 있는 상기 잔기들을 열거한다. 링크수가 클수록, VH와 VL 사이의 계면을 안정화하기 위해 각각의 아미노산 위치의 보다 큰 충격을 가지게 되는 것으로 사료된다.
[표 7]
BHA10 x-선 결정 구조의 계면에서 관찰되는 구조적 잔기에 대한 다중의 강한 상관 관계를 갖는 VH를 갖는 잔기.
Figure 112008072289549-pct00104
굵은 체의 잔기는 계면에 표면적을 매립한다. 이탤릭 체의 잔기는 계면에 표면을 매립한 잔기에 일차 서열이 직접 인접해 있는 잔기이다.
* 특징적 하위부류 구분점
** 일차 잔기와 동일한 많은 잔기와 공변하나, 보다 약한 잔기 빈도로 인해 보다 낮은 상관 수준을 가짐.
[표 8]
BHA10 x-선 결정 구조의 계면에서 관찰되는 구조적 잔기에 대한 다중의 강한 상관 관계를 갖는 VL를 갖는 잔기.
Figure 112008072289549-pct00105
굵은 체의 잔기는 계면에 표면적을 매립한다. 이탤릭 체의 잔기는 계면에 표면을 매립하는 잔기에 일차 서열이 직접 인접해 있는 잔기이다.
* Q50, A89, Y135는 중쇄 및 경쇄 모두에서 보존되나, 공변은 경쇄 위치와 상관하는 것으로 나타나지 않는다.
표 7 및 8로부터의 잔기를 각기 BHA10 VH 및 VL의 표면에 매핑하여, 두 도메 인 사이의 계면에서 직접 접촉하는 실제 잔기와 비교하였다(도 87 및 88 참조). 2가지가 이 분석으로부터 지지되었다. 첫 째로, 공변은 계면에 CDR2 및 CDR3 잔기를 포함하는 네트워크에 대한 (상기 단계에서) 정보를 제공하지 않는다. 두 번째로, 공변은 잔기가 그것의 유지에 중요한 계면 내에서 직접 접촉하는 것뿐만 아니라, 직접적 계면 잔기 외부에 있는 다른 많은 잔기가 계면 잔기의 위치의 골격이 되고 이를 지지하는 데 중요하다는 것을 제시한다. 이 점은, 계면에 표면을 직접 매립하는 잔기를 계산하기 위해 구조를 간단히 이용하여 수득된 표면 상에는 부재하나 공변 네트워크의 표면 상에서는 나타나는 상기 잔기에 의해 설명된다.
이 계면 공변 네트워크 중 몇 가지의 위반은 BHA10 또는 (실시예 21 이하에 기재된) p5E8 scFv:VH 또는 VL 서열 내에 존재하는 것으로 나타났다. 이 위치에서의 본연/비이상적 아미노산의, 표 7 및 8에 기재된 이상적 지지 계면 아미노산 잔기로의 돌연변이가 BHA10 또는 p5E8 scFv: (a) BHA10 VL S46L 및 (b) Idec 152 VH S49G(카밧 및 X-선#) E72D(X-선에 대해서는 73)에 대해 매우 안정화시키는 것으로 나타났다. 이 잔기들 중 하나(S46LVL)는 직접적으로 계면에 있었고, 하나(S49GVH)는 계면에 직접 인접하였고, 다른 하나(E72DVH)는 계면과 떨어져 있었다. 그러나, 3개 모두는 공변 분석에 기초하여 계면에 대해 안정화하는 것으로 예측되었다. 계면의 안정성은 DSC 측정을 이용하여 VH 및 VL 모두의 열 안정성이 증가하는 것으로 관찰될 수 있다.
ii) 향상된 열 안정성을 갖는 BHA10 scFv 라이브러리의 작제 및 선별
A) scFv 라이브러리의 작제
실시예 4, 5 및 6에 기재된 방법을 이용하여 종래의 BHA10 scFv(pXWU002)에서 원하는 아미노산 치환을 가지도록 설계된 scFv 라이브러리를, 표 9에 열거된 올리고뉴클레오티드를 사용하고 제조업자(스트라젠, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)에 의해 제공되는 사용설명서에 따라 퀵체인지(QuikChange) II 부위-지정 돌연변이유발 키트를 사용함으로써 생성시켰다. 종래의 scFv의 DNA 서열이 도 1에 나와 있다.
개별 형질전환된 콜로니를, 400 μl/웰 LB + 50 mg/ml 카르베니실린을 함유하는 딥-웰 96 웰 디쉬(코닝, 미국 뉴욕주 코닝 소재, 카달로그# 3960) 에 취하여, 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 20% 글리세롤을 함유하는 등체적의 LB를 딥-웰 96 웰 디쉬의 각 웰에 부가하고, 50 μl 분취량의 세균 현탁액을 무균 마이크로티터 플레이트(코닝, 미국 뉴욕주 코닝 소재, 카달로그 # 3359)에 옮기고 -80℃에서 저장하기 위해 동결시킴으로써 마스터 플레이트를 생성시켰다.
[표 9]
BHA10 scFv의 안정성 조작을 위한 올리고뉴클레오티드.
Figure 112008072289549-pct00106
Figure 112008072289549-pct00107
돌연변이유발을 위해 표적화된 위치가 밑줄로 표시되어 있다. 모호한 염기는 이하와 같이 약기되어 있다: W=A 또는 T, V=A 또는 C 또는 G, Y=C 또는 T, S=C 또는 G, M=A 또는 C, N=A 또는 C 또는 G 또는 T, R=A 또는 G, K=G 또는 T, B=C 또는 G 또는 T(문헌 [J Biol Chem. 261(1): 13-7(1986)]).
B. 열 자극 검정
이어서, 종래 및 조작된 BHA10 scFv의 활성을, 열 자극 이벤트 후에 scFv 분자들 중 50%가 그것의 항원 결합 활성을 보유하는 온도를 결정하기 위해 사용될 수 있는 열 자극 검정에서 비교하였다. 이 온도에 상응하는 수치 값을 "T50" 값으로 칭하고 단위는 ℃이다. 이 검정에서, scFv를 종래의 BHA10 scFv의 열적 전이 온도를 포괄하는 온도 범위에 적용하였다.
E. 콜라이 균주 W3110(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재, 카달로그 # 27325)를 유도성 ara C 프로모터의 조절 하에 종래 및 조작된 BHA10 scFv를 코딩하는 플라스미드로 형질전환하였다. 형질전환체를 1% 글리신, 1% 트리톤 X100, 0.02% 아라비노스 및 50 μg/ml 카르베니실린으로 보충된 SB(테크노바, 미국 캘리포니아주 해프문 베이 소재, 카달로그 # SO 140)로 구성된 발현 배지에서 37℃ 또는 32℃에서 하룻밤 동안 성장시켰다. 세균을 원심분리에 의해 펠렛화하였고, 상등액을 추가 처리를 위해 수거하였다. 배지에 글리신 및 트리톤 X-100을 포함시킴으로써, 세포외질 내용물(본연의 E. 콜라이 단백질 및 scFv)이 배지로 방출되었다. 상등액 내 E. 콜라이 단백질의 존재는 이 검정의 성능에 필수적인데, 이는 열적으로 변성된 단백질이 "싱크"로서 작용하여, 일시적으로 언폴딩된 scFv 분자를 비가역적 불활성 응집체에 포획하기 때문이다.
각 라이브러리를 상등액으로써 열 자극 검정을 이용하여 2중 모사체로 스크리닝하였고, 이 때 하나의 복사체는 처리 조건에 적용하였고, 두 번째 상등액은 비처리 기준으로 작용하였다. 열 변성 검정은 안정성 측정을 위한 단일 온도 또는 온 도 범위에서 수행될 수 있다. 써모사이클러 기기는 안정성 측정을 위한 단일 온도 또는 온도 범위에서 수행될 수 있다. 안정한 열 구배를 발생시킬 수 있는 써모사이클러 기기를 사용하여 샘플 상등액을 처리하였다(i사이클러, 바이오-래드, 미국 매들랜드주 게이써스버그).
자극 온도는 모 BHA10 scFv 변이체의 성질에 따라 다양하였고, 일반적으로 실험적으로 결정된 T50 값보다 2 내지 3℃ 더 높았다. 냉동 마스터 플레이트를 해동시켜, 웰 당 250 μl의 발현 배지를 함유하는 딥-웰 마이크로티터 플레이터에 접종하는데 사용하였고, 배지를 32℃에서 배양하였다. 대조군으로서, 모 플라스미드를 함유하는 배양물을 동일한 조건 하에 성장시켜, 라이브러리와 동시에 가공하였다. 세균을 2000 rpm에서 원심분리함으로써(IEC 모델 8R, 써모 일렉트론, 미국 매사츄세츠주 왈탐 소재) 딥-웰 플레이트에서 30분 동안 펠렛화하였고, 100 ml의 상등액을 표준 마이크로티터 플레이트(코닝(Coming), 미국 뉴욕주 코닝 소재, 카달로그 # 3357)에 옮겼다. 분취량의 상등액을 기준 DELFIA를 위해 보존하였다. 대부분의 라이브러리에 대해, 상등액의 나머지를 함유하는 플레이트를 밀봉하고(날지 넌크, 미국 뉴욕주 로체스터 소재, 카달로그# 235205), 항온배양기 세트에 넣어 적절한 자극 온도로 90분 동안 맞추었다(에코 썸, 토레이 파인스 사이언티픽(Torrey Pines Scientific), 미국 캘리포니아주 산 마르코 소재). 다중 자극 온도 (또는 75℃ 초과의 온도)를 필요로 하는 선별을 위해, 상등액을 96-웰 PCR 플레이트(어플라이드 바이오시스템즈, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재, 카달로그 # N801-560)에 옮 겨, 원하는 온도에서 90분 동안 항온 배양하였다.
열 자극 후, 응집된 물질을 제거하고, 처리되고 소거된 상등액 내에 남아있는 가용성 BHA10 scFv 샘플을 DELFIA 검정에 의해 동족 LTβR Ig 항원에의 결합에 대해 검정하였다. 96-웰 플레이트(맥시소프(MaxiSorp), 날지 넌크, 미국 뉴욕주 로체스터 소재, 카달로그 # 437111)를 0.1 M 탄산나트륨 완충액(pH 9.5) 중 1 μg/ml으로 인간 Fc 영역에 융합된 LTβ 수용체(LTβR)의 엑토도메인으로 구성된 융합 단백질로 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하여, 실온에서 진탕 하에 DELFIA 검정 완충액(DAB, 10 mM 트리스 HCl, 150 mM NaCl, 20 μM EDTA, 0.5 % BSA, 0.02% 트윈 20, 0.01% NaN3(pH 7.4))으로 1시간 동안 블로킹하였다. 플레이트를 BSA(세정 완충액)없이 DAB로 3회 세정하였고, DAB 중에 희석된 시험 샘플을 최종 체적 100 μl로 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 진탕 하에 1시간 동안 항온 배양한 후, 세정 완충액으로 3회 세정하여, 비결합 및 기능적 불활성화 scFv 분자를 제거하였다. 웰 당 40 ng/ml의 Eu-표지 항-His6 항체(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사츄세츠주 보스턴 소재, 카달로그 # ADO 109)를 함유하는 100 μl의 DAB를 첨가함으로써, 결합된 BHA10 scFv를 검출하였고, 1시간 동안 진탕 하에 실온에서 항온 배양하였다. 플레이트를 세정 완충액으로 3회 세정하고, 웰 당 100 μl의 DELFIA 강화 용액(퍼킨 엘머, 미국 매사츄세츠주 보스턴 소재, 카달로그 # 4001-0010)을 첨가하였다. 15분 동안 항온 배양한 후, 빅터 2(퍼킨 엘머, 미국 매사츄세츠주 보스턴 소재)에서 유로퓸 방법을 이용하여 플레이트를 판독하였다.
검정 데이터를 스팟파이어 디시젼사이트 소프트웨어(스팟파이어, 미국 매사츄세츠주 소버빌 소재)를 이용하여 처리하였고, 이를 각 클론에 대해 기준 온도에 대한 자극 온도에서 관찰되는 DELFIA 계수의 비로 표시하였다. 모 플라스미드에 대해 관찰되는 값의 2배 이상의 비를 반복적으로 제공한 클론을 히트로 간주하였다. 이 양성 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 미니-프렙(위자드 플러스, 프로메가, 미국 위스콘신주매디슨 소재)에 의해 단리하였고, E. 콜라이 W3110으로 다시 재형질전환하여, 2차 열 자극 검정을 수행하여 확인하였다.
열 구배에 대해, 데이터를 모델로서 가변 기울기를 갖는 S-자형 용량 반응을 이용한 프리즘 4 소프트웨어 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)를 이용하여 분석하였다. 열적 변성 곡선의 중간점에 대해 수득된 값을 T50 값으로 칭하고, 이는 생물물리학적으로 유래된 Tm 값과 동등한 것으로 간주되지 않는다.
이 검정으로부터의 일차적 결과 및 확인 결과가 표 10에 나와 있다. 본 발명의 안정화된 scFv 분자들 중 수가지가 종래의 scFv에 비해 결합 활성의 향상(T50 >49℃)을 초래하였다. 특히, BHA10 라이브러리 위치 VL46 scFv(S46L), 라이브러리 위치 VH16 scFv(S16E 및 S16Q) 및 라이브러리 위치 VL49: VL50 scFv의 T50 값은 종래의 BHA10 scFv에 비해 +3℃ 내지 +12℃ 범위의 열 안정성의 증가를 나타냈다. 또한, BHA10 라이브러리 위치 VL3 scFv(Q3A, Q3G, Q3S, Q3V 및 Q3D), 라이브러리 위치 VH67 scFv(V67I 및 V67L), 라이브러리 위치 VH48 scFv(M48I 및 M48G), 라이브러 리 위치 VH20 scFv(V20I) 및 라이브러리 위치 VH 101 scFv (P101D)의 T50 값은 종래의 BHA10 scFv에 비해 +4℃ 내지 +18℃ 범위의 열 안정성의 증가를 나타냈다. 안정화 돌연변이(VL K 13E) 중 하나는 우연히 PCR 오차로부터 비롯되었다. 이 안정화 돌연변이 중 하나를 pIEH009에 도입함으로써 열 안정성이 초래된 것으로 나타났고, 심지어 이 조건 하에서 BHA10 Fab의 열 안정성을 보다 향상시켰다(도 12). 중요하게는, 4가지 설계 방법(VL/VH 계면 상동성 모델링, 일치 스코어링, 전산 모델링 및 공변 분석) 중 하나 이상으로부터 유래된 비공유 VL46, VH101 돌연변이, 및 VH55 돌연변이는 scFv 열 안정성의 안정성을 초래하였고, 이는 디술피드 돌연변이에서 관찰되는 scFv 열 안정성에 거의 근접하고, 이는 이 설계 툴의 유용성 및 신규성을 입증한다.
도 1B는 종래의 BHA10 scFv의 아미노산 서열(서열 번호 4)을 보여주고, 도 94A 및 B는 S46L(VL) 안정화 돌연변이를 각기 함유하는 안정화된 BHA10 scFv의 아미노산 서열(서열 번호 137) 및 V55G(VH) 안정화 돌연변이를 각기 함유하는 안정화된 BHA10 scFv의 아미노산 서열(서열 번호 138)을 보여준다. 야생형 BHA10 scFv(서열 번호 3)의 DNA 서열이 도 1A에 나와 있다. 안정화 돌연변이는 상자 안의 잔기로 표시된다. 리더 서열, gly/ser 연결 펩티드 및 CH1 도메인이 밑줄 표시, 굵은 체, 및 이탤릭 체로 각기 표시된 기에 의해 나타나 있다.
[표 10]
BHA10 VH 및 VL 라이브러리 위치, 라이브러리 조성 및 선별 결과
Figure 112008072289549-pct00108
na=해당사항 없음
표 11은 종래의 scFv에 도입된 각종 개별 및 조합 안정화 돌연변이의 총괄적 열 안정성 분석의 결과를 보여준다. 이 결과는, 활성의 향상이 부가적이고, 본 발명에 기재된 방법이 scFv의 열 안정성 성질을 본연의 Fab의 열 안정성 성질을 심지어 초과하여 향상시킬 수 있음을 입증한다. 심지어 위치 VH44-VL100에 공유 디술피드 결합이 부재할 때에도, 조합 시에 종래의 BHA10 scFv에 비해 +19℃ 내지 +33℃ 범위의 열 안정성 증가를 나타낸 안정화 돌연변이가 확인되었다.
[표 11]
변이체 단백질을 생성하는 데 사용되는 BHA10 구성체의 특징 및 열 자극 검 정으로부터의 T50 결과.
Figure 112008072289549-pct00109
na=해당사항 없음
aa=아미노산
요약
3개의 안정화 돌연변이(VL_S46L, VH_V55G, 및 VH_P101D)를 열 자극(T50) 검정에 의해 실험적으로 입증하였다.
VL_S46L 및 VH_V55G 돌연변이의 양자 모두가 상기 실시예 3에 기재된 공변 분석에 기초하여 개별 VH 및 VL 도메인에 대해 안정화하는 것으로 예측되었다. 도 50A 및 B에 나타난 바와 같이, 이 돌연변이 모두는 BHA10 scFv의 T50을 유의적으로 증가시켰다. 특히, VL_S46L 돌연변이는 ~7 내지 8℃만큼 scFv를 안정화하는 반면, VH V55G 돌연변이는 ~12℃만큼 scFv를 안정화한다. 이 돌연변이 모두는 또한 DSC에 의해 결정되는 바, VH와 VL 사이의 TM 갭을 유의적으로 감축시킨다 (도 51 참조). DSC 데이터는, 양 돌연변이 모두가 scFv에 대한 VH 및 VL 도메인 모두의 TM(열적 언폴딩 전이의 중간점) 및 열량계 엔탈피(즉, 곡선 아래의 면적)의 유의적 증가를 초래한다. 이 값의 증가는, 이 예측된 안정화 돌연변이가 실제로 scFv에 대해 안정화한다는 실험적 입증을 제공한다. 또한, 이 두 돌연변이가 VH 및 VL 도메인 모두를 동시에 안정화하기 때문에, 이들은 가능히 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 협력성을 구축하는데 중요할 것이다. 따라서, VH와 VL 사이의 계면을 강화하는 것이 안정성의 증가를 도울 뿐만 아니라 응집체 형성 경향도 감소시킬 수 있는 것으로 예상된다.
VL_S46L 안정화 돌연변이 및 제3 안정화 돌연변이(VH_P101D)도 또한 상기 실시예 4에 기재된 VH/VL 계면 상동성 모델링에 기초하여 안정화하는 것으로 예측되었다. VH_P101D 안정화 돌연변이는 열 자극 검정에 의해 측정되는 바, ~15℃만큼 scFv를 안정화시켰다(도 50C). 또한, DSC(도 52 참조) 는, 이 안정화 돌연변이가 VH 및 VL 도메인 모두의 TM 및 열량계 엔탈피의 유의적 증가를 초래하고, 이는 이 돌연변이가 또한 가능히 VH/VL 계면을 통해 전반적으로 scFv를 협력적으로 안정화함을 가리킨다.
실시예 6. 안정화 돌연변이를 포함하는 안정화된 BHA10 scFv 의 생물물리학적 특징분석
표 11에 열거된 각종 플라스미드로부터의 V 영역 유전자 서열을 변형된 E. 콜라이 발현 벡터에 서브클로닝하여, 유도성 ara C 프로모터의 조절 하에 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 변이체 BHA10 scFv가 발현되었고, 상기 기재된 방법을 이용하여 정제하였다. VL 도메인의 N-말단에 있는 겉보기 절단 부위는 SDS-Page 분석에 의해 판단 시, 대부분의 scFv 제제에 있어 낮은 수준의 VL를 초래하였다(도 53).
각 scFv의 수력학적 성질을, 정적 광 산란 및 회절지수 검출기(미니돈(MiniDAWN)/ReX, 와트 테크놀로지(Wyatt Technology))를 이용하여 크기 배제 HPLC(아질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies))에 의해 조사하였다. 각 scFv는 우세하게 단량체성인 것으로 나타났으나; 야생형(안정화되지 않은) scFv를 비롯 한 scFv 중 수가지가 낮은 수준의 2량체성 물질을 나타냈다(표 12). 정제된 scFv 중 어느 것도 2량체보다 큰 검출가능한 수준의 올리고머를 가지지 않았다.
[표 12]
scFv의 SEC/광 산란 결과
Figure 112008072289549-pct00110
a 표준 오차 없이 단백질이 한 번에 발현됨.
b n.d. 결정되지 않음.
c 이 값은 분취 SEC를 수행하여 응집체를 감소시킨 후에 결정됨.
궁극적 실험 목적은 설계된 돌연변이가 안정성을 증진시키고 응집 경향을 보다 작게 만드는지의 여부를 조사하는 것이었다. 각 scFv의 열 안정성을 2가지 구분 된 방법을 이용하여 평가하였다. 첫 번째로, scFv의 열적 언폴딩을 DSC를 이용하여 분석하였다(도 54A). 두 번째로, 각 scFv의 열 안정성을 형광 소수성 염료인 1-아닐리노-8-술포네이트의 존재 하에 단백질을 가열함으로써 조사하였다(ANS, 도 54B). ANS는 일반적으로 부분적으로 언폴딩된 단백질 또는 밀착된 언폴딩 상태의 열 변성된 단백질에 결합한다. 노출된 소수성 표면적과 회합 시에, ANS의 형광도는 추정컨대 용매의 켄칭 영향의 격리(sequestration)로 인해 유의적으로 증가한다.
온도 의존성 ANS 곡선을 이하 기재된 바와 같은 2-상태 단백질 언폴딩 전이에 맞추었다. 완충액은 PBS이었고, 모든 실험에 사용된 scFv의 농도는 750 nM이었다. 펠티어(peltier) 가열 장치 및 외부 수조가 장착된 JASCO 모델 812 원편광 이색성 분광편광계에서 형광도 측정을 수행하였다. 형광도를 광로에 수직인 광전자증배관을 포함한 부속물을 이용하여 형광도를 수집하였다. 부속물에 480 nm로 설정된, 조정가능한 단색계를 장착하였다. 감도를 600 V로 설정하였다. 120℃/분의 연속 속도로 가열을 수행하였다. 여기 단색계를 370 nm로 설정하였다.
이 연구에서의 모든 scFv의 열 언폴딩은 ANS 형광도의 증가를 초래하였다. 각 scFv 단백질 도메인의 열적 언폴딩의 중점(즉, TM)을, 제조업자(마이크로칼 인코포레이티드(MicroCal, Inc))에 의해 제공되는 오리진 7.0 소프트웨어를 이용하여 깁스-헬름홀츠 Gibbs-Helmholtz) 방정식에 각 언폴딩 피크를 맞춤으로써 DSC를 이용하여 결정하였다. TM를 또한, 깁스-헬름홀츠 방정식을 칼레이다그래프(KaleighdaGraph)TM에 통상적인 비선형 곡선 맞춤에 도입함으로써 ANS 형광도를 이용하여 유도하였다:
Figure 112008072289549-pct00111
(식 중에서, Δ G U °(T)는 언폴딩 시의 깁스 자유 에너지의 온도-의존성 변화이고, Δ H U °(T)는 언폴딩과 관련된 엔탈피 변화이며, Δ S U °(T)는 언폴딩과 관련된 엔트로피임). 방정식은 하기 식으로 확장될 수 있다:
Figure 112008072289549-pct00112
(식 중에서, TM은 언폴딩 곡선의 중점이고, Δ C P °는 폴딩된 상태 및 언폴딩된 상태 사이의 열 용량의 변화임). 이 방정식은, 형광 강도가 폴딩된 scFv 및 언폴딩된 scFv의 존재 하에서의 고유의 ANS 형광도의 합계라는 전제를 설정함으로써 ANS-형광 강도의 온도-의존성을 유도하기 위해 사용될 수 있다:
Figure 112008072289549-pct00113
(식 중에서, i T (T)는 온도-의존성 총 형광 신호이고, i F 및 i U 는 각기 폴딩된 상태 및 언폴딩된 상태의 형광 강도이며, f F 및 f U 는 각기 소정의 온도에서의 폴딩된 및 언폴딩된 scFv의 분율임). 폴딩된 분율은 평형화 언폴딩 상수 및 언폴딩의 자유 에너지와 관계가 있다:
Figure 112008072289549-pct00114
K U (T) 및 Δ G U °(T)를 방정식 (3)에 대입하고, 폴딩된 scFv 및 언폴딩된 scFv의 존재 하에서의 ANS의 형광 강도는 온도에 대해 일차적 관계(선형)로 의존한다(즉, i F = i 1 + i 2 T 및 i U = i 3 + i 4 T )고 rkwjdgkadmfhTJ, 하기 방정식이 수득되었다:
Figure 112008072289549-pct00115
데이터를 맞추는 데 이용되는 최종 방정식을 수득하기 위해, Δ G P °가 온도와 무관하고, 폴딩된 상태 및 언폴딩된 상태 사이의 용매 노출 표면적의 차이에 비례한다는 전제 하에, 방정식 (2)에서의 Δ G U °(T)에 대한 관계를 방정식 (5)로 치환한다(문헌 [Haynie & Friere, Protein: Struct . Funct . Genet . 16: 115-140, (1993)]; 문헌 [Myers 등, Protein Sci . 4: 2138-2148(1995)]).
DSC 및 ANS-결합 실험에서 유도된 모든 scFv에 대한 열 안정성 측정들이 필적가능하였다. 각 scFv의 언폴딩은 비가역적이었고; 이에 따라 응집은 DSC 또는 ANS-결합에 의해 측정되는 절대 TM 에 영향을 미쳤다. 두 기법은 샘플을 상이하게 또한 상이한 속도로 가열하였기 때문에, TM은 실험 포맷 전반에 걸쳐 동일한 것으로 예상되지 않았다(문헌 [Sanchez-Ruiz 등, Biochemistry , 27:1648-1652(1988)]). 그러나, 각 실험 기법에 대해 관찰되는 경향은 동일하였다(표 13 참조). DSC 실험은 VH와 VL 사이의 언폴딩 전이 사이를 용이하게 구별하였다. ANS-결합 실험은 두 전 이(즉, VH VS. VL 언폴딩)를 정확하게 구별하지 못했고; 이에 따라 단지 겉보기 TM만이 ANS-결합 실험에 제공되었다. ANS-결합에 의해 관찰되는 겉보기 TM은 DSC에 의해 결정되는 바, 돌연변이에 따라 VH 또는 VL를 언폴딩하도록 마지막 도메인의 TM와 잘 상관하는 것으로 보였다. 양 검정 포맷 모두에서 언폴딩된 물질의 응집으로 인해, TM을 언폴딩 등의 scFv 자유 에너지의 부가적 해석없이 각 돌연변이에 의해 제공되는 안정성 증진의 순차 등급화를 위한 지침으로 사용하였다.
[표 13]
각 scFv의 열 안정성 측정.
Figure 112008072289549-pct00116
a 이 특별한 돌연변이들은 단일의 협력적 VH/VL 언폴딩 이벤트를 초래함.
b (G4S)*4 20 아미노산 링커를 이용하여 모든 치환체 scFv를 작제함.
c 다중 전이는 분석을 복잡하게 함.
d VH 대 VL를 구별하지 못함.
요약
모든 설계된 단일 돌연변이는 하기 라이브러리 스크린으로부터 취해졌다: VH S16E, S 16Q, V55G, P101D, 및 VL S46L는 유의적으로 안정화시켰고, VH 도메인은 일부 경우에서는, VL 도메인을 또한 안정화시켰다(도 53). 안정성 증진을 위한 이 위치들의 시험에 바탕을 이루는 이론적 근거는 종종 다중 형태의 분석에서 비롯되었다. 일치 방법은 돌연변이 VH S16E, S 16Q, V55G, P101D 및 VL S46L 모두가 BHA10 scFv를 안정화함을 예측하였다(실시예 3). 그러나, VH V55G 및 P101D(부수적으로, 2개의 가장 안정화하는 돌연변이)는 각기 VH의 CDR2 및 CDR3 내에 위치하였고, 이는 상기 두 위치에서의 돌연변이는 안정화 이벤트를 초래할 수 있음을 제시하는 예측 증거가 수집될 때까지 돌연변이유발을 위해 고려되지 않았다. VH V55G 및 VL S46L 모두는 또한 공변 분석에 기초하여 안정화하는 것으로 예측되었다. 마지막으로, VH P101D 및 VL S46L는 매우 안정한 인간 항체의 계면 조성에 기초하여, VH/VL 계면에 대해 잠재적으로 안정화하는 것으로 예측되었다(실시예 3).
VH/VL 계면에서의 단일 돌연변이는 양 도메인 모두의 안정성을 증가시킨 반면, 계면 외부에 있는 VH 돌연변이는 VH 도메인 그 자체만을 안정화하였다. VH S16E, S16Q, 및 V55G는 계면 외부에 있고, BHA10 VH의 겉보기 TM을 각기 3, 2 및 11℃만큼 증가시켰다. VL 안정성은 이 돌연변이에 의해 비교적 영향을 받지 않았다. VH V55G 돌연변이는 VL 안정성의 검출가능한 증가를 초래하지 않으면서, VL 도메인의 안정성에 부합하도록 VH의 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다. 계면에 있는 양 돌연변이, 즉 VH P101D 및 VL S46L 모두는 양 도메인의 안정성을 유의적으로 증가시켰다. P101D 돌연변이는 특히 VH 및 VL 도메인의 완전 협력적 언폴딩을 초래하였고, 이는 VH와 VL 사이의 계면 및 폴딩 협력성이 유의적으로 강화됨을 가리켰다. 이에 따라, VH/VL 계면에 있는 돌연변이는 안정화된 Fv 영역을 형성하는 가장 효과적인 수단을 제공할 수 있고, Fv 계면 외부에 있는 잔기로 지정되는 설계에 비해 scFv의 VH/VL 계면에 대한 안정성 설계를 우위로 지정하기 위한 이론적 근거를 제공할 수 있다.
VH 돌연변이의 조합은 궁극적으로 VH/VL 언폴딩 사이의 협력성을 차단하도록 하였다(표 13). VH의 TM이 75℃ 초과로 상승했을 때(VH 돌연변이의 조합 결과), VL의 TM이 보다 낮은 온도로 이동하기 시작하였다. 이는, VL 도메인 내 상보 돌연변이에 구축하지 않으면서 VH 도메인이 초안정화됨이 두 도메인 사이의 감소된 폴딩 협력성 및 약화된 상호작용을 초래할 수 있음을 제시한다. (야생형 BHA10 scFv의 TM을 포함한) VH 및 VL 도메인의 TM은 종종 매우 상이하였고, 한편 두 도메인 사이의 계면에 있는 돌연변이가 양 도메인을 동시에 안정화할 수 있다는 증거는, 아마도 VH P101D 안정화 변이체에서의 경우를 제외하고는 단리된 도메인 사이의 겉보기 친화도가 극히 높은 것으로 예상되지 않으나 두 도메인이 상호 어느 정도의 수준으로 상호작용하고 있음을 제시한다(문헌 [Brandts & Lin, Biochemistry . 29:6927-6940, (1990)]).
scFv의 안정성 증가가 상온에서의 소수성 형광 염료 ANS의 고유 결합을 감소시켰다(15℃, 도 55). 야생형 scFv는 ANS에 약하게 결합하고, 이는 단백질은 용매에 영구적으로 또는 일시적으로 소수성 표면적을 노출할 수 있음을 제시한다. 안정화된 scFv는 주변 조건 하에서 ANS에 결합하는 능력을 완전히 소실하는 것으로 나타났고, 즉 가장 안정화된 scFv의 존재 하에서의 ANS의 형광도는 더 이상 용매 중 ANS 단독의 형광도보다 더 크지 않았다. (DSC 또는 온도-의존성 ANS-결합 실험에 의해 측정되는) VH_TM의 플롯 대 15℃에서 폴딩된 단백질의 존재 하에서의 ANS-형광도는, scFv-의존성 ANS 형광도가 scFv 안정성이 증가함에 따라 감소함을 입증한다 (도 55). scFv 안정화에 의한 ANS-결합 감소는, 보다 적은 소수성 표면적이 용매에 노출되게 되고, 안정화된 scFv가 고유의 보다 낮은 응집 경향을 가질 수 있음을 가리킬 수 있다.
비아코어 3000 기기에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 이용하여 각종 개별 및 조합 안정화 BHA10 scFv 돌연변이의 KD 측정을 수행하였다. 표 13은 비아코어 친화도 검정의 결과를 보여준다. 변이체 BHA10 scFv의 결합 친화도는 모 BHA10 scFv의 1X 내지 2.5X의 범위 내였다.
실시예 7. 안정화된 이중특이적 " 헤르큘레스 " 항체의 생성
종래의 BHA10 scFv 및 본 발명의 안정화된 BHA10 scFv 모두를 사용하여 "헤르큘레스"로 칭해지는 이중특이적 항체의 패널을 작제하였다. 헤르큘레스 이중특이적 항체는 TRAIL R2 수용체에 결합하는 키메라 14A2 IgG 항체의 LTβR에 결합하는 BHA10 scFv에의 융합을 포함한다. 헤르큘레스 항체는 N-말단 및 C-말단 BHA10 scFv 융합 모두로서 작제되었다(도 13 참조). N-말단 scFv 융합은 경쇄 및/또는 중쇄 융합(각기 "NL-헤르큘레스" 또는 "NH-헤르큘레스")으로서 조작될 수 있다. 어떠한 아미노 말단 V 영역(중 또는 경)이 scFv 결합에 채택될 지에 대한 선택은 일차적으로, 어떠한 사슬이 제1 표적 항원을 인식할 수 있으나 Fab 도메인의 제2 표적 항원에의 결합을 인식가능하게 간섭하지 않을 수 있는 융합 scFv를 견딜 수 있는 것으로 사료되는 지에 의해 추진된다.
또한, 예를 들어 도 42 내지 49에 표시된, 항체 힌지 영역 또는 CH2 또는 CH3 도메인에 직접 융합된 안정화된 scFv만으로 이루어진 4가 또는 이중특이적 항체를 조작하기 위해 본 발명에 기재된 방법을 이용하는 것도 가능하다. 상기 항체는 전장 Fc 영역(예를 들어, 도 46 참조) 또는 CH2-도메인 결실 Fc 영역(예를 들어, 도 42 참조)을 포함할 수 있다. 다른 예시적 실시양태에서, 2개 이상의 안정화된 scFv 도메인이 중쇄 또는 경쇄의 동일한 말단에 융합될 수 있다(예를 들어, 도 43 참조).
A. 종래의 BHA 10 , ( G 4 S ) 4 , V H 44 ; V L 100 , 및 V H 44 : V L 100 /( Glv 4 Ser ) 4 scFv 를 이용한 "N H -헤 르큘 레스"의 작제
4개의 항-LTβR(BHA10)×항-TRAIL R2(chi14A2) 이중특이적 항체 설계는 종래의 및 변이체 BHA10 scFv를 항-TRAIL R2 항체 중쇄의 아미노 말단에 부착시킴에 기초하였다. 실시예 3에 기재된 BHA10 scFv DNA를 사용하여, 표 14에 기재된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 NH-헤르큘레스 이중특이적 항체의 패널을 작제하였다. (Gly4Ser)5 링커를 사용하여, BHA10 scFv를 chi14A2 중쇄의 성숙 아미노 말단에 연결하였다. 전방 5' VH PCR 프라이머(scFvBHA10-F1)는 클로닝을 위한 Mlu I 제한 엔도뉴클레아제 부위(밑줄 표시된 서열)을 포함하였고, 이에 후속하여 중쇄 신호 펩티드의 마지막 3개 아미노산 및 BHA10 VH의 아미노 말단을 코딩하는 서열을 포함하였다. 2개의 역방 3' PCR 프라이머를 사용하여, BHA10 VL의 카르복실 말단을 코딩하는 내부 역방 프라이머 XWU005-R와 이에 이어 (Gly4Ser)5 링 커, 및 부분적 항-TRAIL R2 VH 영역을 코딩하는 역방 프라이머 scFvBHA10-R1, 및 클로닝을 위한 Bgl II 부위(밑줄 표시된 서열)을 포함하는 PCR 산물을 생성시켰다.
[표 14]
종래의 (Gly4Ser)4, VH44:VL100 및 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv를 갖는 N-헤르큘레스의 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드
Figure 112008072289549-pct00117
BHA10 scFv+(Gly4Ser)5 링커+부분적 항-TRAIL R2 VH 유전자 서열을 도 14A에 나와 있는 바와 같은 (Gly4Ser)5 링커를 코딩하는 통상의 중복 서열을 통한 2가지 순차적 PCR 반응으로 증폭시켜, 플라스미드 DNA pXWU034로부터의 종래의 BHA10 scFv, 플라스미드 pXWU002로부터의 BHA10 scFv(Gly4Ser)4, 플라스미드 pIEH006으로부터의 BHA10 scFv VH44:VL100, 및 플라스미드 pIEH009로부터의 BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4을 제조하였다. 증폭된 BHA10 scFv의 패널로부터의 PCR 산물을, 제조업자의 사용설명서(밀리포어; 미국 매사츄세츠주 베드포드 소재)에 따라 밀리포어 울트라프리-DA 추출 키트를 이용하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 Mlu I/Bgl II 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 사전 변형된 chi14A2 IgG1을 함유하는 Mlu I/Bgl II 절단의 pNSKGl 벡터에 결찰하여, chi14A2 IgG1 코딩 서열 내에 존재하는 내부 Bgl II 부위를 제거하였다. 포유동물 발현 벡터 pN5KG1은 전사적으로 활성인 통합 이벤트를 위해 선택하기 위한 번역 손상된 변형(이트론-함유) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 및 메토트렉세이트로 증폭을 허용하는 쥐 디히드로포레이트 리덕타제 유전자를 함유한다(문헌 [Bamett 등, Antibody Expression and Engineering.(Imanaka, H. Y. W. a. T., ed), pp. 27-40, Oxford University Press, New York, NY, (1995)]).
구성체의 수득된 패널은, 25개 아미노산 (Gly4Ser)5 링커를 통한 항-TRAIL R2 항체 VH 도메인의 아미노 말단으로의 변이체 BHA10 scFv의 융합 단백질을 형성한다. 종래의 BHA10 scFv 유전자 서열의 항-TRAIL R2 항체 중쇄 유전자 서열로의 융합은 플라스미드 pXWU005를 생성시켰다. BHA10 scFv(Gly4Ser)4 유전자 서열의 항-TRAIL R2 항체 중쇄 유전자 서열의 아미노 말단으로의 융합은 플라스미드 pXWU026을 생성시켰다. BHA10 scFv VH44:VL100 유전자 서열의 항-TRAIL R2 항체 중쇄 유전자 서열의 아미노 말단으로의 융합은 플라스미드 pXWU027을 생성시켰다. BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 유전자 서열의 항-TRAIL R2 항체 중쇄 유전자 서열의 아미노 말단으로의 융합은 플라스미드 pXWU028을 생성시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여, E. 콜라이 균주 상위 10개 경쟁 세포(인비트로겐 코포레이션, 미국 캘리포니아 주 칼스배드 소재)를 형질전환하였다. 암피실린 약물 내성으로 형질전환된 E. 콜라 이 콜로니를 삽입물 존재에 대해 선별하였다. DNA 서열 분석으로 최종 구성체의 올바른 서열이 확인되었다.
사용된 키메라 14A2 경쇄는 모든 N-및 C-헤르큘레스 이중특이적 항체들 중에서도 공통되고, DNA 서열(서열 번호 28) 및 아미노산 서열(서열 번호 29)이 도 15A 및 15B에 나와 있다. 키메라 14A2 경쇄는 하기 DNA 서열 및 아미노산 서열을 갖는 N-말단에 신호 펩티드를 갖도록 하여 발현되었다:
ATGGCCTGGACTCCTCTCTTCTTCTTCTTTGTTCTTCATTGCTCAGGGTCTTTCTCC(서열 번호 59)
MAWTPLFFFFVLHCSGSFS (서열 번호60 )
종래의 BHA10 scFv NH-헤르큘레스에 대한 중쇄 DNA 서열(서열 번호 30) 및 아미노산 서열(서열 번호 31)이 도 16 및 17에 각기 나와 있다. BHA10 scFv(Gly4Ser)4 NH-헤르큘레스에 대한 중쇄 DNA 서열(서열 번호 32) 및 아미노산 서열(서열 번호 33)이 도 18 및 19에 각기 나와 있다. BHA10 scFv VH44:VL100 N-헤르큘레스에 대한 중쇄 DNA 서열(서열 번호 34) 및 아미노산 서열(서열 번호 35)이 도 20 및 21에 각기 나와 있다. BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 N-헤르큘레스에 대한 중쇄 DNA 서열(서열 번호 36) 및 아미노산 서열(서열 번호 37)이 도 22 및 23에 각기 나와 있다. 각각의 중쇄는 하기 DNA 서열 및 아미노산 서열을 갖는 N-말단에 신호 펩티드를 갖도록 하여 발현되었다:
ATGGGTTGGAGCCTCATCTTGCTCTTCCTTGTCGCTGTTGCTACGCGTGTCCTGTCC(서열 번호 61)
MGWSLILLFLVAVATRVLS (서열 번호 62)
B. 종래의 BHA 10 , ( G 4 S ) 4 , V H 44 ; V L 100 , 및 V H 44 : V L 100 /( Glv 4 Ser ) 4 scFv 를 이용한 C-scFv " 헤르큘레스 "의 작제
4개의 항-LTβR(BHA10)×항-TRAIL R2(chi14A2) 이중특이적 항체 설계는 종래 및 변이체 BHA10 scFv를 항-TRAIL R2 항체 중쇄의 카르복실 말단에 부착시킴에 기초하였다. 실시예 3에 기재된 BHA10 scFv DNA를 사용하여, 표 15에 기재된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 C-헤르큘레스 이중특이적 항체의 패널을 작제하였다. Ser(Gly4Ser)3 링커를 사용하여, BHA10 scFv를 chi14A2 중쇄의 카르복실 말단에 연결하였다. 전방 5' VH PCR 프라이머 (XWU006-F1)는 클로닝을 위한 BamHI 제한 엔도뉴클레아제 부위(밑줄 표시된 서열)을 포함하였고, 이에 후속하여 Ser(Gly4Ser)3 링커 펩티드의 일부를 코딩하는 서열 및 BHA10 VH의 아미노 말단을 포함하였다. 역방 3' VL PCR 프라이머 (XWU006-R1)는 BHA10 scFv 경쇄를 프라이밍하였고, 종결 코돈 및 이에 이어 클로닝을 위한 BamHI 부위(밑줄 표시된 서열)를 포함하였다. 전방 5' 내부 중첩 PCR 프라이머(XWU006-F2)는 (Gly4Ser)3 링커를 코딩하는 서열을 포함하고, 굵은 체로 나타낸 침묵 돌연변이를 함유한다. 역방 3' 내부 중첩 PCR 프라이머(XWU006- R2)는 (Gly4Ser)3 링커를 코딩하는 서열을 포함하고, BHA10 scFv(Gly4Ser)3 링커 영역에 위치한 BamHI 부위를 제거하는 굵은 체로 나타낸 침묵 돌연변이를 함유하였다.
[표 15]
종래의 BHA10, (G4S)4, VH44;VL100, 및 VH44:VL100/(Glv4Ser)4 scFv를 이용한 C-헤르큘레스의 PCR 증폭을 위한 올리고뉴클레오티드
Figure 112008072289549-pct00118
도 14B에 나타낸 바와 같이, BHA10 scFv 유전자 서열을, BHA10 scFv(Gly4Ser)3 링커 영역 내 BamHI 부위를 제거하도록 설계된 내부 중첩 PCR 프라이머(XWU006-F2 및 XWU006-R2)의 세트 및 5' VH XWU006-F1+3' VL XWU006-R1 PCR 프라이머 세트를 이용하여 2-단계 PCR 반응으로 증폭시켰다. 이 PCR 조건을 사용하여, 플라스미드 pXWU034로부터의 종래의 BHA10 scFv, 플라스미드 pXWU002로부터의 BHA10 scFv(Gly4Ser)4, 플라스미드 pIEH006로부터의 BHA10 scFv VH44:VL100, 및 플라스미드 pIEH009로부터의 BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4을 제조하였다. 증폭된 BHA10 scFv의 패널로부터의 PCR 산물을, 제조업자의 사용설명서(밀리포어; 미국 매사츄세츠주 베드포드 소재)에 따라 밀리포어 울트라프리-DA 추출 키트를 이용하여 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 BamHI 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 사전 조작된 pN5KG1 벡터의 단일 BamHI 부위에 결찰하여, 수가 지 변형을 함유하도록 하였다. 간략히, chi14A2 IgG1을 함유하는 pN5KG1 벡터를 변형시켜, 중쇄 유전자의 3' 말단에 있는 종결 코돈을 제거하고, 클로닝을 위한 (Gly-Ser의 코딩을 위한) BamHI 제한 엔도뉴클레아제 부위 직전에 포함하는 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly을 코딩하는 뉴클레오티드를 도입한다. 마지막으로, chi14A2 VL 영역 내의 목적하지 않은 내부 BamHI 제한 엔도뉴클레아제 부위도 또한 제거하였다.
구성체의 수득된 패널은, 16개 아미노산 Ser(Gly4Ser)3 링커를 통한 항-TRAIL R2 항체 중쇄의 카르복실 말단으로의 변이체 BHA10 scFv의 융합 단백질을 형성한다. 종래의 BHA10 scFv 유전자 서열의 항-TRAIL R2 항체 중쇄 유전자 서열의 카르복실 말단으로의 융합은 플라스미드 pXWU006을 생성시켰다. BHA10 scFv(Gly4Ser)4 유전자 서열의 항-TRAIL R2 항체 중쇄 유전자 서열의 카르복실 말단으로의 융합은 플라스미드 pXWU034를 생성시켰다. BHA10 scFv VH44:VL100 유전자 서열의 항-TRAIL R2 항체 중쇄 유전자 서열의 카르복실 말단으로의 융합은 플라스미드 pXWU035를 생성시켰다. BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 유전자 서열의 항-TRAIL R2 항체 중쇄 유전자 서열의 카르복실 말단으로의 융합은 플라스미드 pXWU036을 생성시켰다.
결찰 혼합물을 사용하여, E. 콜라이 균주의 상위 10개 경쟁 세포(인비트로겐 코포레이션, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 형질전환하였다. 암피실린 약물 내성으로 형질전환된 E. 콜라이 콜로니를 삽입물 존재에 대해 선별하였다. DNA 서 열 분석으로 최종 구성체의 올바른 서열을 확인하였다. 사용된 키메라 14A2 경쇄는 모든 N-및 C-헤르큘레스 이중특이적 항체들 중에서도 공통되고, DNA 서열(서열 번호 28) 및 아미노산 서열(서열 번호 29)이 도 15A 및 15B에 나와 있다. 종래의 BHA10 scFv C-헤르큘레스에 대한 중쇄 DNA 서열 및 아미노산 서열이 각기 도 24 및 25에 나와 있다. BHA10 scFv(Gly4Ser)4 C-헤르큘레스에 대한 중쇄 DNA 서열 및 아미노산 서열이 도 26 및 27에 각기 나와 있다. BHA10 scFv VH44:VL100 C-헤르큘레스에 대한 중쇄 DNA 서열 및 아미노산 서열이 도 28 및 29에 각기 나와 있다. BHA10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 C-헤르큘레스에 대한 중쇄 DNA 서열 및 아미노산 서열이 도 30 및 31에 각기 나와 있다. C-말단 이중특이적 헤르큘레스 구성체의 요약이 표 16에 나와 있다.
[표 16]
'헤르큘레스'를 코딩하는 중간체 및 발현 플라스미드
Figure 112008072289549-pct00119
C. CHO 세포 내 이중특이적 항체의 일시적 발현
플라스미드 DNA pXWU005, pXWU026, pXWU027, pXWU028; 및 Pxwu006, pXWU034, pXWU035 및 pXWU036(표 16)을 사용하여, CHO DG44 세포를 형질전환시켜 항체 단백질을 일시적으로 생성시켰다. 각 20 ug의 플라스미드 DNA를 체적 0.4 ml의 1×PBS에서 4×106개 세포와 조합하였다. 혼합물을 0.4 cm 큐벳(cuvette)(바이오래드)에 첨가하고, 15분 동안 얼음에 두었다. 세포를 유전자 펄서 전기천공기(Pulser electroporator)(바이오래드)를 이용하여 600 uF 및 350 볼트에서 전기천공하였다. 세포를 100 uM 하이포잔틴 및 16 uM 티미딘을 함유하는 CHO-SSFM II 배지에 두고 이를 T-25 플라스크에 넣어, 4일 동안 37℃에서 항온 배양하였다.
이 일시적 CHO 발현 시스템에 의해 생성된 헤르큘레스 단백질을 함유하는 상등액을 수집하여 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 도 32는 VH44:VL100 (ds=디술피드) 또는 VH44:Vu100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv를 함유하는 헤르큘레스 항체가, scFv가 NH- 또는 C-말단에 융합되는지의 여부와 무관하게, 발현 수율을 상당히 향상시켰음을 보여준다(레인 3, 4, 7, 8). 놀랍게도, 야생형 BHA10 scFv 또는 (Gly4Ser)4 링커 BHA10 scFv N-말단 융합을 가지는 어떠한 분비 단백질도 검출되지 않았고, 이는 발현에 대한 scFv 안정화의 이익을 가리킨다(레인 6 및 7). 또한, 종래의 BHA10 scFv 및 (Gly4Ser)4 링커 BHA10 scFv C-말단 융합은, 상당량의 ~55 내지 60 분자량 부산물이, 안정화된 구성체에서 실질적으로 감소되었음을 나타냈고, 이는 scFv 안정화가 생성물 품질을 향상시킬 수 있음을 가리킨다.
D. 이중특이적 결합 ELISA 검정
상등액을 ELISA 검정에서 재조합에 의해 생성된 TRAIL R2 및 LTβR 수용체에 대한 개별 결합 활성에 대해 시험하였다. 양 검정 모두에서, 수용체를 플레이트 상에 고정화하였고, 시험 샘플을 항온 배양하여, 수용체에 결합하도록 하였다. 결합된 샘플을 표지된 항체로 검출하였다.
96-웰 마이크로티터 이뮬론(Immulon) II 플레이트(피셔(Fisher), 카달로그 # 14245-61)를 4℃에서 하룻밤 동안 Na2CO3/NaHCO3 완충액(pH 9.5) 중 100 μl/웰의 2 μg/ml LTβR-Ig로 코팅하고, 200 μl 희석 완충액(PBS 중 0.5% 탈지 건조유 + 0.01% 티메로살)으로 37℃에서 1시간 동안 블록킹하였다. 다음 단계에서, 희석 완충액 중 100 μl 개별 '헤르큘레스' 상등액 또는 정제된 단백질을 2중 모사 웰에 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 수돗물로 세정한 후, 100 μl의 100 ng/ml TRAIL-R2 Fc 6X-His 택의 융합 단백질(R&D 시스템즈, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재)을 웰에 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 세정 후, 펜타(Penta)-His HRP 접합체(키아겐, 카달로그 # 34460)의 100 μl의 1/2000 희석액을 각 웰에 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 항온 배양하였다. 세정 후, 100 μl/웰의 HRPO 기질을 조합한 TMB 퍼옥시다제 기질/퍼옥시다제 용액 B(커드가아드(Kirdgaard) 및 페리 랩스(Perry Labs), 카달로그 50-76-00)를 첨가하였다. 5 내지 10분 후, 100 μl의 2 M H2SO4로 반응을 중단하였다. 몰레큘러 디바이시스(Molecular Devices) 플레이트 리더를 이용하여 450 nm 및 540 nm에서 OD를 측정하였고, 결합 곡선을 생성시켰다.
도 33 및 34는, VH44:VL100(ds=디술피드) 또는 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv를 함유하는 N-말단(도 33A, 34A) 및 C-말단(도 33B, 34B) 헤르큘레스 항체 모두가 종래의 BHA10 scFv(wt)를 함유하는 헤르큘레스에 비해, LTβR(도 33) 및 TRAIL R2(도 34)에 대한 향상된 결합을 각기 나타냄을 보여준다.
E. CHO 세포 내 이중특이적 항체의 안정한 발현, 항체 정제 및 특징분석
플라스미드 DNA pXWU027, pXWU028 및 pXWU006, pXWU035 및 pXWU036(표 16)을 사용하여, 항체 단백질의 안정한 생성을 위해 DHFR-결핍 CHO DG44 세포를 형질전환하였다. 형질감염된 세포를, 10% 투석 우태 혈청(인비트로겐 코포레이션)으로 보충된, 2 mM 글루타민 함유의 알파 결실 MEM 배지에서 성장시키고, 형광 표지 항체 및 반복 형광-활성화 세포 분류(FACS)를 이용하여 안정한 벌크 배양물 풀로서 보강시켰다(Brezinsky, 등 J. Immunol . Methods . 277(1-2): 141-55(2003)). FACS를 또한 사용하여, 개별 세포주를 발생시켰다. 세포 풀 또는 세포주를 무혈청 조건에 적합화하여, 항체 생성을 위해 규모 조정하였다.
1) VH44:VL100 안정화 BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스 및 2) VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스를 발현하는 형질감염된 CHO 세포 풀 또는 세포주, 및 3) VH44:VL100 안정화 BHA10 scFv를 갖는 N-말단 헤르큘레스 및 4) VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv를 갖는 N-말단 헤르큘레스를 발현하는 클론성 CHO 세포주로부터의 상등액을 수집하여, PBS, 10 mM EDTA 유동 완충액을 이용한 단백질 A 세파로스 FF(6 mL) 칼럼을 이용하여 정제하였다. 헤르큘레스 단백질을 0.1 M 글리신(pH 3.0)을 이용하여 용출하였고, 트리스 염기를 이용하여 즉시 pH 7.5 내지 8.5로 중성화하였다. 또한, 종래의 BHA10 scFv를 함유하는 C-헤르큘레스를 발현하였고, 비교를 위해 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 종래의 BHA10 scFv을 함유하는 C-헤르큘레스, VH44:VL100 BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스, 및 VH44: VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv를 갖 는 C-말단 헤르큘레스로부터의 단백질 A 용출물을 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 응집체 존재에 대해 조사하였다(도 35). 종래의 BHA10 scFv를 함유하는 C-헤르큘레스의 크로마토그램 프로파일은 ~40% 응집체를 나타냈다. 대조적으로, VH44:VL100 BHA10 scFv를 함유하는 C-말단 헤르큘레스는 응집체 수준을 20%로 감소시켰고, VH44:VL100/(Gly4Ser) 4 BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스는 응집체 수준을 10%로 감소시킴으로써 추가 안정화를 달성하였다. 응집 수준은 scFv의 성질에 의존하는 것으로 보이나, 그것이 14A2 IgG의 NH- 또는 C-말단에 부착되었는지의 여부에는 의존하지 않는 것으로 보인다(데이터 미도시). 단백질 A 헤르큘레스 용출액을 0.1 M 아세트산염(pH 5.0)으로 투석함으로써 추가 정제하고, 투석액으로 동일한 유동 완충액을 사용하는 모노S(MonoS)(GE 헬쓰케어) 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하였다. 헤르큘레스 단백질을 0.1 M 아세트산염(pH 5.0), 0.5 M NaCl로의 단계 구배를 이용하여 용출하였다. 모노S 용출액을 수집하고 토소하스 분취 SEC 칼럼에 통과시켜, 응집체를 제거하였다.
도 36A 및 36B는 각기 VH44:VL100 안정화 BHA10 scFv를 갖는 정제된 N-말단 헤르큘레스 및 VH44: VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv를 갖는 NH-말단 헤르큘레스, VH44:VL100 안정화 BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스, 및 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스의 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 환원된 레인은 중쇄 및 경쇄 단백질의 예상된 크기를 보여준 다. 중요하게는, 야생형 scFv 도메인을 함유하는 헤르큘레스에서 종종 관찰되었던 분해되거나 원하지 않은 유의적 수준의 저분자량 부산물이 없다.
도 37(패널 A 및 C)은 초기 단백질 A 정제 단계에 후속하여, 각기 VH44:VL100 안정화 BHA10 scFv를 갖는 NH-말단 헤르큘레스 및 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv를 갖는 NH-말단 헤르큘레스의 분석적 SEC 용출 프로파일을 보여준다. 도 37(패널 B 및 D)은 또한 각기 잔류 비단량체성 단백질 오염물질의 분취 SEC 제거 후에 각기 VH44: VL100 안정화 BHA10 scFv를 갖는 NH-말단 헤르큘레스 및 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv를 갖는 NH-말단 헤르큘레스의 분석적 SEC 용출 프로파일을 보여준다. 마찬가지로, 도 38(패널 A 및 C)은 초기 단백질 A 정제 단계에 후속하여 각기 VH44:VL100 안정화 BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스 및 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스의 분석적 SEC 용출 프로파일을 보여준다. 도 38(패널 B 및 D)은 잔류 비단량체성 단백질 오염물질의 분취 SEC 제거 후에 각기 VH44: VL100 안정화 BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스 및 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스의 분석적 SEC 용출 프로파일을 보여준다. 이 연구들은, VH44:VL100 디술피드 또는 VH44:VL100 디술피드 및 (Gly4Ser)4 링커를 부가하여 BHA10 scFv를 안정화함으로써, 보다 높은 수준의 분자량을 갖는 종이 본질적으로 없는, 분취량의 순도 >98% 단량체성 헤르큘레스 이중특이적 항체가 초래됨을 입증한다.
동일한 조건 하에서 수행된 DSC 연구는, VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv를 함유하는 C-헤르큘레스가 종래의 BHA10 scFv를 함유하는 C-헤르큘레스보다 더욱 열 안정성을 가짐을 입증한다(도 39). 종래의 BHA10 scFv를 함유하는 C-헤르큘레스에 대한 변성 프로파일은 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv를 함유하는 C-헤르큘레스에 대해 관찰된 프로파일보다 ~5℃ 더 낮은 온도에서 시작한다. 이 결과는 scFv가 헤르큘레스 분자의 전체 열 안정성을 제한할 수 있음을 제시한다. 이는 종래의 BHA10 scFv의 경우와 대비한 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv에서 관찰되는 5℃ TM 증가분과 상관된다.
이어서, 정제된 형태의 안정화된 헤르큘레스 구성체를 ELISA 검정에서 재조합에 의해 생성된 TRAIL-R2 및 LTβR 수용체에 대한 이중특이적 결합 활성에 대해 시험하였다. 이 검정에서, LTβR Ig 수용체를 플레이트 상에 고정화한 후, 시험 샘플을 항온 배양하여, 수용체에 결합하도록 하였다. 비결합 샘플을 세정에 의해 제거한 후, TRAIL R2-(His)6와 함께 제2 항온배양 단계를 수행하였다. 세정 단계 후, 이배로 결합된 복합체를 표지된 항-(His)β 항체로 검출하였다. 이 연구의 결과 및 각 구성체의 유효 농도(EC50, 단위 μg/ml)이 도 40에 나와 있다. 도 40은 VH44:VL100(ds=디술피드) 또는 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화 BHA10 scFv의 N-말단 및 C-말단 헤르큘레스 항체 모두가 LTβR 및 TRAIL R2 모두에 대한 명료한 이중 특이적 결합을 나타냄을 보여준다. 다가(오량체성) 형태의 LTβR-결합 항체(CBE11)를 대조군으로 사용하여, LTβR 단독의 단일 인식은 결합 검정에서 신호를 유도하지 않음을 입증하였다.
실시예 8: CHO 세포에서 안정화된 이중특이적 "헤르큘레스" 항체의 대량 생산
플라스미드 DNA pXWU028 및 pXWU036으로 안정하게 형질전환된 DHFR-결핍 CHO 세포주(표 16)에 대해서 본 발명의 방법을 사용하여 안정화시킨 가용화되고 적절하게 폴딩된 헤르큘레스 분자를 높은 수준으로 발현할 수 있는 단일 세포 분리주를 선별하기 위하여 스크리닝하였다. 세포 스크리닝 방법은 Brezinky 등(Brezinky 외, J Immunol Meth (2003). 277: 141-155)의 형광물질 활성화 세포 분류법(FACS)을 이용하였다. 간략하게, 형광물질로 태킹된 항헤르큘레스 항체를 이용하여 그 표면에 헤르큘레스 항체를 일시적으로 발현하는 것으로 나타나는 CHO 세포를 표지화하였다. 형광 강도 신호를 나타내는 세포를 그 신호 세포 선별 장치의 게이팅을 맞추어 선별하였다. 그에 따라 높은 생산성을 나타내는 단일 세포를 선별하고 무혈청 조건에 적합화시켜 안정한 생산 세포주를 확립하였다. 이어서 이 생산 세포주를 이중특이적 항체 단백질을 생산 및 정제하기 위하여 대량화하였다.
11일간 생반응기 작업을 통해서 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHAlO scFv(XWU028)를 함유하는 N 말단 헤르큘레스의 상등액 80 L를 회수하고 한외여과시켜서 예비처리하였다. 단백질 A 크로마토그래피를 통해서 이중특이적 항체를 포확하고 1218 mL 부피로 용리하였다. 음이온 교환 크로마토그래피 및 이어서 분취용 크기 배제 크로마 토그래피를 통해서 분획을 2개의 개별 뱃치로 추가 정제하였다. 제1 뱃치는 순도가 98.9%로서 PBS 중 4.85 mg/mL 농도로 825.5 mg을 얻었고 내독소 충진량은 0.13 EU/mg이었다. 제2 뱃치는 순도 99.1%로서 10.3 mg/mL의 농도에 318 mg을 얻었고 내독소 충진량은 2.37 EU/mg이었다. VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHAlO scFv를 함유하는 고순도로 정제된 단량체 N 말단 헤르큘레스를 총 1143.5 mg으로 회수하였다.
11일간 생반응기 작업으로 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHAlO scFv(XWU036)를 함유하는 C 말단 헤르큘레스의 24 L 상등액을 회수하고 한외여과를 통해 예비처리하였다. 미정제 생성물을 포획하기 위한 단백질 A 크로마토그래피와 이어서 음이온 교환 크로마토그래피 및 분취용 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 상기에 기술한 바와 같이 이중특이적 항체를 2개의 개별 뱃치로 정제하였다. 제1 뱃치는 98.5% 순도로 13 mg/mL의 농도에 985.5 mg을 얻었고 내독소 충진량은 0.01 EU/mg이었다. 제2 뱃치는 99% 순도로 11.42 mg/mL의 농도에 570 mg을 얻었고 내독소 충진량은 1.91 EU/mg이었다. VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHAlO scFv를 함유하는 고도로 정제된 단량체 C 말단 헤르큘레스를 총 1555.5 mg으로 회수하였다.
XWU054 이중특이적 항체를 생산하는 CHO 세포주를 분리하였으며, 이는 21.5 mg/L를 생산함을 확인하였다. 이는 연구 등급의 미증폭 CHO 세포주에서 기대되는 범위이고 본 발명자는 생산 세포주를 생산하지 않았다면 보다 높은 생산성을 기대했을 것이다.
이러한 대량 생산 연구는 미증폭 CHO 세포주를 이용하여 수행하였지만, 고품 질의 생물리적으로 안정한 이중특이적 항체의 수율이 1 mg을 넘었다. 아마도 세포주 증폭 방식이 상업적 용도로 적합한 방법의 개발을 가능하게 하는 형질감염된 CHO 세포주의 세포 생산성을 상당히 향상시킨 듯하다. 이러한 연구는 제조업에 적합한 세포주(예를 들어, CHO)에서 안정한 이중특이적 항체를 대량 생산할 수 있는 본 발명에서 기술한 방법의 활용도를 예시적으로 보여주는 것이다.
실시예 9: 이중특이적 "헤르큘레스" 항체의 생물학적 활성
종양세포주 WiDr(ATCC CCL-218), 인간 결장 암종 세포주 Me180(ATCC HTB 33), 인간 경부 상피 암종 세포주 및 MDA231(Dr. Dajun Yang, University of Michigan) 인간 유방 암종 세포주를 10% FCS, 2 mM L-글루타민, l× 불필수 아미노산, 0.5 mM 피브루산나트륨 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 MEM-Earles에 배양하였다. 종양 세포주는 PBS로 1회 세정하고 트립신으로 분해 처리하여 세포를 유리시켰다. 세포를 원심분리로 회수하고 완전 배지에 재현탁시키고, 계측하여 WiDr 및 Me180에 대해서 5000 세포/웰로, MDA231에 대해서 1500 세포/웰로 96 웰 조직 배양 플레이트에 접종하였다. 인간 IFNγ(Biogen Idec, Corp)를 세포 현탁물에 첨가하여서 최종 사이토카인 농도가 WiDr 및 MDA231에 대해서는 80 U/mL이 되도록하였고 Me180에 대해서는 50 U/mL이 되도록하였다. 종양 세포/IFNγ 현탁물 50 ㎕를 완전 배지중에 제조한 시험 항체의 2× 농축된 3배 연속 희석물 50 ㎕와 혼합하였다. 대체로 시험 항체의 최종 농도는 5000 pM∼0.07 pM 범위였다. 세포를 5% CO2 습윤 챔버에 37℃에서 4시간(WiDr&Me180) 또는 3시간(MDA231) 동안 성장시키고 20 ㎕/웰 Promega CellTiter 96 단일 수용액 세포 증식 분석 시약(AQueous One Solution Cell Proliferation Assay reagent)(Promega Corporation, Madison, WI)을 첨가하여 세포 사멸을 평가하였다. 이 플레이트를 마이크로타이터 플레이트 리더(Spectromax Plus, Molecular Devices, Sunnyvale CA)에 490 nM에서 판독하였다. 그 결과를 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Inc, WA)을 이용하여 그래프화하였다.
상기 실험 결과들을 도 41A 내지 41D에 도시하였다. 도 41A에 따르면 14A2 IgG 항체는 WiDr 종양 세포에 대한 성장 억제 활성이 중간 정도인 것으로 나타났고 BHA10 IgG와 함께인 경우에는 BHA10 IgG 단독인 경우와 비교하여 항종양 세포 활성이 약간 증가하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 두 이중특이적 헤르큘레스 항체는 WiDr 세포에 대한 종양 세포 사멸이 증가하는 것으로 나타났다. 도 41B는 무시할 정도가 아니면, 단일 제제로서 또는 병용한 경우 14A2 IgG 및 BHA10 IgG 두 항체가 Me180 종양 세포의 성장을 억제하는 중간 정도의 활성을 나타내었다. 대조적으로, 두 이중특이적 헤르큘레스 항체는 Me180 세포에 대한 종양 세포 사멸을 보여주었다. 도 41C는 14A2 IgG 및 BHA10 IgG의 두 항체가 단일 제제로서는 MDA231 종양 세포의 성장을 억제하는 활성이 무시할 수준이었는데 병용하여 사용하는 경우에는 아마도 어느 정도 활성이 있는 것을 보여준다. 이중특이적 헤르큘레스 항체 XWU036 (VH44:VLl00/(Gly4Ser)4 링커 안정화된 BHAlO scFv를 갖는 C 말단 헤르큘레스)는 종양 세포 MDA231 세포의 세포 사멸을 나타냈다. 도 41D는 어떠한 항체도 배양된 인간 제대정맥 내피 세포(HUVEC) 대조군에 대해서 임의 활성을 나타내지 않음을 보여 주는 것으로서, 이중특이적 항체의 세포 사멸 활성이 무차별적인 것이 아님을 증명하는 것이다. HUVEC은 FACS 분석에 의해서 LTβ 및 TRAIL-R2에 의해 양성 염색되는 것으로 나타났는데(결과는 도시하지 않음) 이는 수용체가 존재한다는 것을 의미하고 이중결합 항체의 활성이 종양 세포의 특이적이거나 고유한 경로 성분을 촉발시키는 것에 의존적일 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 10: 이중특이적 "헤르큘레스" 항체의 안정성 실험
3개월 동안 2∼8℃에서 보관한 N 말단 및 C 말단 이중특이적 항체 샘플 XWU028(BHAlO scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 N-헤르큘레스) 및 XWU036(BHAlO scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 C-헤르큘레스)에 대해 실시간 안정성 실험을 수행하였다. 단백질 품질은 (1) 응집성, (2) 침전성, (3) 폴리펩티드 절단 또는 단백질 가수분해 및 (4) 번역후 변형 예컨대 탈아민화 또는 산화 등에 대해 평가하였다.
이 실험에 사용된 고농도 및 저농도 N 말단 및 C 말단 이중특이적 항체 샘플은 1.8 mg/mL(저농도) 및 10.3 mg/mL(고농도)의 XWU028 및 5.0 mg/mL(저농도) 및 1 1.4 mg/mL(고농도)의 XWU036이다. 항체는 PBS에 제제화하였다. 안정성 실험을 위해서, 초기(T=O), 중간(T= 1주, 2주, 1개월, 2개월) 및 최종(T= 3개월) 시간점의 샘플을 샘플 회수 직후에 분석하였다. 또한, 초기(T=O) 샘플은 동결시켜서 3개월 실험 종료시의 2차 분석을 위해 해동시까지 -70℃에 보관하였다. BHAlO IgG(8.7 mg/mL)를 대조군으로 사용하였고 유사하게 조작처리하였다.
A. 단백질 응집 및 침전 분석
단백질 응집 또는 침전은 인라인 광산란 및 굴절률 검출기(각각, Wyatt Technologies, MiniDawn 및 rEX)에 연결된 분석용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 이용하여 모니터링하였다. SEC/광산란 분석법에 따르면 침전을 통해 일어날 수 있는 응집 또는 물질 손실에 대한 어떠한 증거물도 없는 것으로 나타났다. XWU028, XWU036 및 BHA10 항체에 대한 초기 T=O 및 최종 T= 3개월 시간점의 SEC 용리 프로파일은 거의 동일하였다(각각 도 56A, 56B 및 56C). XWU028 및 XWU036 샘플 둘다 실험 종결까지∼1% 응집된 물질이 축적되었지만, 이러한 응집물의 검출값은 본 방법으로 측정되는 검출 하한치 근방이었다(표 17). 응집물 형성은 단백질 농도와는 무관하였다. 광산란 검출법을 이용하여 측정한 분자량을 기준으로, 시험 샘플중 응집물의 저농도물은 이량체로 전환되는 단량체종일 가능성이 있다. 이들 유형의 응집체가 이 방법을 이용하여 쉽게 관찰되지만, 이중특이적 항체 샘플 XWU028 또는 XWU036은 어떠한 것도 검출가능한 높은 양의 응집체로 축적되지 않았다. BHAlO 항체는 이 실험의 3개월 기간 동안 응집체가 증가하지 않는 것으로 확인되었다(표 17).
[표 17]
분석용 크기 배제 크로마토그래피를 이용해 검출된 단량체의 비율
T=0 T=1주 T=2주 T=1개월 T=2개월 T=3개월
서열번호 49 저농도 99.0 98.7 98.4 98.3 98.2 97.9
서열번호 49 고농도 99.1 99.0 98.9 98.6 98.2 98.1
서열번호 51 저농도 98.8 97.5 97.5 97.4 97.2 96.7
서열번호 51 고농도 98.9 98.8 98.7 98.5 98.1 96.7
BHA10 IgG 97.4 97.5 97.5 97.5 97.3 97.5
B. 단백질 가수분해 및 번역후 변형 분석
단백질 가수분해는 SDS-PAGE 및 액상 크로마토그래피/질량 분광분석 법(LC/MS) 완전 질량 분석법(전기분부 계면을 통해서 Agilent 1100 LC 시스템에 연결된 Agilent LC/MSD TOF)을 이용하여 모니터링하였다. SDS-PAGE 분석을 위해서, 레인 당 5 ㎍을 충진하였다. 환원형 샘플은 5% β-머캅토에탄올을 함유하는 1× 트리스-글리신 샘플 완충액 중에 제조하였다. 비환원형 및 환원형 SDS-PAGE 분석법을 통해서 측정한 바에 따르면 2∼8℃에서 3개월 보관 동안 XWU028 및 XWU036에 대해 어떠한 단백질 가수분해도 확인되지 않았다(도 57A 및 57B). 유사하게, XWU028 및 XWU036은 LC/MS 분석법을 통해서 측정된 바에 따르면 2∼8℃에서 3개월 보관 기간 동안 보다 낮은 분자량의 단백질 가수분해 생성물이 관찰되지 않았다(도 58).
번역후 변형은 LC/MS를 이용하여 모니터링하였다. T=O, T=1개월 및 T=3개월 샘플을 비환원형 및 환원형 둘 다에 대해 분석하였다. 환원형 샘플은 37℃에서 1시간 동안 50 mM DTT/4M 구아니딘 히드로클로라이드 중에서 처리하여 제조하였다. HPLC 완충액 A는 수중 0.03% TFA로 이루어지고 HPLC 완충액 B는 아세토니트릴 중 0.025% TFA를 함유한다. 유속은 분당 100 ㎕로 일정하게 유지하였다. 각 샘플(환원형 및 비환원형) 7.5 ㎍을 2.1×50 mm C4 컬럼에 주입하고 Agilent ESI-TOF를 통해 분석하였다. 결합 및 용리 방법은 비환원형 샘플에 대해 사용하였고 구배 방법은 환원형 샘플에 대해 사용하였다. 분석자를 이용하여 스펙트럼을 얻고 이 장치에 내장된 MaxEnt1 소프트웨어 패키지를 이용하여 디컨볼루팅하였다. T=0, T=1개월 및 T=3개월에서 XWU028 및 XWU036(고농도)의 디컨볼루팅한 질량 스펙트럼은 도 58에 도시하였다. XWU028 또는 XWU036 어떠한 것도 질량 스펙트럼에 어떠한 검출가능한 변화도 확인되지 않았고, 이는 이중특이적 항체의 기능 또는 안정성에 역효과를 줄 가능성이 있는 번역후 변형이 없음을 의미하는 것이다.
이와 함께, 상기 결과는 안정한 scFv 도메인을 함유하는 N 말단 및 C 말단 이중특이적 항체 둘다가 생물학적 약물 생성물에 필요한 것과 같은 장기 보관 조건 하에서 안정하다는 것을 시사한다. 이러한 결과는 이러한 안정성 실험이 최적 제제로 제조된 용액이 아닌 단순 완충액(PBS)에서 제조된 N 말단 및 C 말단 이중특이적 항체를 이용하여 수행하였기 때문에 보다 특히 고무적이다.
실시예 11: 이중특이적 "헤르큘레스" 항체의 생체 내 약물동력학적 활성 및 혈청 안정성
인산 완충 염수(PBS)에 희석한 N 말단 헤르큘레스(XWU028) 또는 C 말단 헤르큘레스(XWU036)의 10 mg/kg(1 mg/mL) 단일 볼러스 주입물을 숫컷 CB17-scid 마우스에 복막 내 투여하였다. 각 이중특이적 항체에 대한 시간점 당 3마리의 마우스를 이용하여 주입 후 0, 0.5, 2, 6, 24, 48, 72, 96, 168, 240 및 336시간에 희생시켰다. 이중특이적 항체의 농도를 정량하기 위한 ELISA 분석을 위해 혈청 샘플을 준비하였다. ELISA 플레이트를 염소 항인간 IgG로 코팅하고, PBS/1%BSA로 블록킹하였으며, 이중특이적 항체를 함유하는 혈청 희석물을 PBS/1%BSA에 연속 희석하여 플레이트에 첨가하고 항온반응시켰다. 포획된 항체는 염소-항인간 카파 사슬-HRP-연결된 항체를 이용하여 검출하였다. 약물동력학적 실험 결과는 표 18에 도시하였다. N 말단 헤르큘레스(XWU028)는 최고 혈청 농도가 85.67 ㎍/mL이고, 10.3일의 배출 반감기(1/2)를 가졌다. C 말단 헤르큘레스(XWU036)는 최고 혈청 농도가 105.67 ㎍/mL이 고, 15.1일로 보다 긴 배출 반감기(t1/2)를 가졌다. 두 분자는 이들 값이 생체이용률에 대해 조정한 것이 아니더라도 유사한 분포용량(Vd)을 가진다.
[표 18]
약물동력학적 파라미터
파라미터 단위 N 말단 헤르큘레스
(XWU028)
수치		 C 말단 헤르큘레스
(XWU036)
수치
T1/2 시 247.9386 362.3607
Cmax ㎍/mL 85.67 105.67
Vd* L/kg 0.1707 0.1748
CI* mL/분/kg 0.008 0.0056
* 생체이용율에 대해 조정하지 않음
혈청 샘플을 또한 실시예 7에 기술한 이중특이적 결합 ELISA에서 분석하였다. 이 분석법에서, 상기 기술한 N 말단 헤르큘레스(XWU028) 또는 C 말단 헤르큘레스(XWU036)를 함유하는 혈청 샘플에 대해서 ELISA 분석법으로, 재조합 생산된 TRAIL-R2 및 LTβR 수용체에 대한 이중특이적 결합 활성을 시험하였다. 도 59A 및 59B에는 N 말단 및 C 말단 헤르큘레스 처리한 마우스 유래의 혈청 샘플이 TRAIL-R2 및 LTβR 둘 다에 이중특이적으로 결합하고 PK 실험에서 관찰된 바와 배출 프로파일이 거의 동일한 항체를 함유하고 이는 이중특이적 항체가 장기간 동안 생리 조건하에서 완전하게 남아있다는 것을 의미하는 것이다.
실시예 12: 이중특이적 "헤르큘레스" 항체의 생체 내 생물학적 활성
(A) 결장암 종양 모델 중에서 이중특이적 "헤르큘레스" 항체의 생체 내 생물학적 활성
125마리의 무흉선 누드 마우스에 WiDr 인간 결장 암종 세포(마우스 당 2×10E6 세포)를 이식하였다. 이들 종양이 대략 100 mg에 도달할 때까지 종양을 성장 시키고, 이 시점에서 총 70 마리의 마우스를 실험용을 선별하고, 10마리씩 7그룹으로 분류하였다. 다음과 같이, 이식 후 13일경에 시작하여, IP 치료물을 투여하였다: 1 그룹 = 무발열원 PBS; 2 그룹 = CBE11, 2 mg/kg, 1x/주; 3 그룹 = hBHA 10, 2 mg/kg, 2x/주; 4 그룹 = ch14A2, 2 mg/kg, 2x/주; 그룹 5 = 헤르큘레스-II XWU028, 2 mg/kg, 1x/주; 6 그룹 = 헤르큘레스-II XWU036; 2 mg/kg, 1x/주; 7 그룹 = hBHA10 + ch14A2, 각각 1 mg/kg, 2x/주. 종양 크기 및 체중은 2주마다 기록하였다. 실험은 비히클 그룹의 평균 종양 크기가 대략 2000 mg에 도달했을 때 종결하였다. 종양 용적은 다음 식(L×W2/2)을 이용하여 산출하였다. XWU028 및 XWU036으로 처리한 마우스의 중간 분석 결과에 따르면 PBS 비히클 대조군과 비교하여 두 이중특이적 항체에 대해 유효한 항종양 활성(p<0.001)을 나타내었다(도 60).
XWU028에 대해, 단일 hBHA10 또는 ch14A2 mAb 처리한 반응과 비교하여 유의한 항종양 반응(p<0.05)이 관찰되었다. XWU036에 대해, ch14A2 mAb 처리한 반응과 비교하여 유의한 항종양 반응(p<0.05)이 관찰되었고, hBHA10 mAb와 비교하여 주목할 정도로, 상당히 유의한 반응(p<0.01)이 관찰되었다. 중요한 것은, 주당 1회만 투여했지만 이중특이적 항체가 상당히 우수한 생체내 항종양 활성을 보여주었는데 이는 본 발명에서 기술한 안정성 향상으로 인해 생리 조건하에서 항체 특성 및 물리적 안정성이 개선되었다는 것을 시사하는 것이다.
(B) 유방암 종양 모델에서 이중특이적 '헤르큘레스" 항체의 생체 내 생물학적 활성
MDA-MA-231 인간 유방 암종 세포를 135 무흉선 누드 마우스에게 피하 이식하였다(마우스 당 2×10E6). 13일까지 종양을 성장시키고 이 시점에서 평균 크기가 대략 168 mg인 75 종량 보유 마우스를 치료 그룹(N=10) 및 비히클 대조군(N=15) 그룹으로 분류하였다. 마우스에게 13일경부터 시작하여 항체 및 비히클 IP를 주입하였다. 예시적인 그룹은 다음과 같다: 1 그룹 = 무발열원 PBS; 1x/주; 2 그룹 = hBHA10, 2 mg/kg, 2x/wk; 그룹 3 = ch14A2, 2 mg/kg, 2x/wk; 4 그룹 = 헤르큘레스-II XWU036, 2 mg/kg, 1x/주; 5 그룹 = hBHA10 + ch14A2, 각각 1 mg/kg, 2x/주. 종양 크기 및 체중은 2주마다 기록하였다. 실험은 비히클 그룹의 평균 종양 크기가 대략 2800 mg에 도달했을 때 종료하였다. 종양 용적은 다음 식(L×W2/2)을 이용하여 산출하였다. XWU036은 hBHA10 또는 ch14A2의 단일 처리 또는 이 두 항체 혼합물의 처리와 비교하여 통계적으로 유의한(p< O.OOl) 항종양 활성을 보여주었다. 중요한 것은, 이중특이적 항체 XWU036이 주당 1회 투여 스케줄로 생체 내 투여시에 양호한 항종양 활성을 나타냈으며 이는 본 발명에서 기술한 안정성 향상으로 생리 조건하에서 항체 특성 및 물리적 안정성이 개선되었다는 것을 시사하는 것이다(도 86 참조).
실시예 13: 비공유 안정화 scFv 돌연변이를 함유한 안정화된 이중특이적 "헤르큘레스" 항체의 제조
비공유적 안정화 돌연변이 단독 및 VH44-VL100 이황화 결합을 함께 함유하는 본 발명의 BHA10 scFv를 사용하여 LTβR에 결합하는 BHA10 scFv와, TRAIL R2 수용 체에 결합하는 키메라 14A2 IgG의 융합체를 포함하는 안정화된 이중특이적 C 헤르큘레스 항체를 제작하였다. 이 이중특이적 항체는 실시예 7에 기술된 방법과 실질적으로 유사하게 C 말단 BHA10 scFv 융합체로서 제작하였다.
A. BHAlO V H S16E + V L S46L 및 V H 44-V L 100/V H S16E + V L S46L scFv를 갖는 C-헤르큘레스 이중특이적 항체의 제작
표 19에 기술한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여, 각각 BHAlO VH S16E + VL S46L 및 VH44-VL100/VH S16E + VL S46L scFv를 함유하는 플라스미드 DNA pIEH-050(고발현 플라스미드 pIEH076의 모플라스미드) 및 pIEH-052(고발현 플라스미드 pIEH080의 모플라스미드)로부터 변이체 BHA10 scFv 유전자 단편을 PCR을 사용해 증폭시켰다. 변이체 BHAlO scFv 유전자 단편을 겔 분리하였다. 플라스미드 pIEH-050 및 pIEH-052의 링커 영역 내 BamHI 부위 덕분에, 이 유전자 단편을 pPuM I 및 Kpn I 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 동일한 제한 엔도뉴클레아제로 분해한 변형 플라스미드 pN5KG1에 결찰시켜서, 16아미노산 Ser(Gly4Ser)3 링커를 통해서 항-TRAILR2(14A2) 항체 CH3 도메인의 카르복실 말단에 융합된 안정화 항-LTβR(BHA10) scFv의 융합 생성물을 제조하였다. 정확한 서열은 DNA 서열 분석을 통해서 확인하였다.
[표 19]
BHA10 VH S16E + VL S46L 및 VH44-VL100/VH S16E + VL S46L scFv의 PCR 증폭용 올리고뉴클레오티드
pXWU006-F1
(서열 번호 56)		 5'-GGGGGTGGATCCGGTGGAGGGGGCTCCGGCGGTGGCGGGTCCCAGGTCCAACTGGTGCAGTCTG-3'
XWU006-R1
(서열 번호 57)		 5'-GTTAACGGATCCTCATTTGATCTCCACCTTGG-3'
항-TRAIL R2 항체 중쇄 유전자 서열의 카르복실 말단에 BHAlO scFv VH S16E + VL S46L 유전자 서열을 융합시켜 플라스미드 pXWU054를 제조하였다. 항-TRAIL R2 항체 중쇄 유전자 서열의 카르복실 말단에 BHAlO scFv VH44-VL100/VH S16E + VL S46L 유전자 서열을 융합시켜 플라스미드 pXWU055를 제조하였다.
결찰 혼합물을 이용하여 E. coli 균주 TOP 10 컴피턴트 세포(competent cell) (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)를 형질전환시켰다. 삽입물 존재에 대해서 암피실린 약물에 내성인 형질전환 E. coli 콜로니를 스크리닝하였다. DNA 서열 분석을 통해서 최종 구성체의 정확한 서열을 확인하였다. 키메라 14A2 경쇄 DNA(서열 번호 28) 및 아미노산 서열(서열 번호 29)을 도 15A 및 15B에 도시하였다. C-헤르큘레스 BHAlO scFv VH S16E + VL S46L 이중특이적 항체의 중쇄 DNA(서열 번호 52) 및 아미노산 서열(서열 번호 53)을 각각 도 61 및 도 62에 도시하였다. C 헤르큘레스 BHA scFv VH44-VL100/VH S16E + VL S46L 이중특이적 항체에 대한 중쇄 DNA(서열 번호 54) 및 아미노산 서열(서열 번호 55)는 각각 도 63 및 64에 도시하였다.
중쇄는 이전에 사용된 것과 동일한 단일 펩티드를 사용하였다.
B. CHO 세포에서 이중특이적 항체의 안정한 발현, 항체 정제 및 특징 규명
플라스미드 DNA pXWU054 및 pXWUO55로 안정하게 형질감염시키고 무혈청 조건에 적응시킨 DHFR 결핍 CHO 세포주를 실시예 8에서 기술한 바와 같이 이중특이적 항체 단백질의 제조를 위해 계량하고 단백질을 정제하였다. 안정화된 VH S16E + VL S46L BHAlO scFv를 갖는 C-헤르큘레스 및 안정화된 VH44-VL100/VH S16E + VL S46L BHAlO scFv를 갖는 C-이중특이적 항체를 함유하는 상등액으로부터의 단백질 A 용리물에 대해서 분석용 크기 배제 크로마토그래피를 통해 응집체의 존재를 조사하였다(도 65 참조). 통상적인 BHA 10 scFv를 함유하는 C-헤르큘레스의 크로마토그램 프로파일은 ∼40% 응집체를 보여주었다. 이와 대조적으로, 안정화된 VH S16E + VL S46L BHAlO scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스는 표준 IgG에서 관찰되는 것에 견줄만한 수준으로 응집체가 유의하게 감소되었다.
도 66A 및 도 66B는 각각 VH S16E + VL S46L BHAlO scFv를 갖는 정제된 C-말단 헤르큘레스 및 VH44:VL100/VH S16E + VL S46L BHAlO scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스의 SDS-PAGE 겔을 도시한 도면이다. 환원형 레인에는 중쇄 및 경쇄 단백질에 대해 예측한 크기로 존재하였다. 중요한 것은, 야생형 scFv 도메인을 함유하는 헤르큘레스에서 종종 관찰되는 분해물 또는 원치않는 저분자량 부산물이 유의한 수준으로 관찰되지 않는다는 것이다.
도 67A 및 67B는 각각 초기 단백질 A 정제 단계를 거친, VH S16E + VL S46L BHAlO scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스 및 VH44:VL100/VH S16E + VL S46L BHAlO scFv 를 갖는 C-말단 헤르큘레스의 분석용 SEC 용리 프로파일을 도시한 도면이다. 이 실험에 의해서 VH S16E + VL S46L 돌연변이만을 부가하고 VH44:VL100 이황화 결합을 함께 조합하여 BHA10 scFv를 안정화시킨 결과 고도의 분자량종이 본질적으로 없는 단량체 헤르큘레스 이중특이적 항체는 분취물 순도가 >98%였다.
실시예 14: 비공유 안정화 scFv 돌연변이를 함유하는 이중특이적 "헤르큘레스" 항체의 생물학적 활성
VH S16E + VL S46L BHAlO scFv(XWU054)를 갖는 C-말단 헤르큘레스 및 VH44:VL100/VH S16E + VL S46L BHAlO scFv(XWUO55)를 갖는 C-말단 헤르큘레스의 시험관 내 생물학적 활성을 실시예 7에 기술한 바와 같은 종양 세포 증식 분석법으로 시험하였다.
상기 실험 결과는 도 68에 도시하였다. 도 68B는 14A2 IgG 항체가 WiDr 종양 세포의 성장을 억제하는 중간 정도의 활성을 가지며 BHA10 IgG와 함께인 경우에는 BHA10 IgG 단독인 경우와 비교하여 항종양 세포 활성이 약간 증가하는 것으로 나타났다. 이와 대조적으로, 이중특이적 헤르큘레스 항체 둘다(XWU054 및 XWUO55)는 실시예 10에 기술한 XWU036 분자(VH44:VL100/(Gly4Ser)4 링커 안정화된 BHAlO scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스)를 이용하여 관찰된 것과 비교하여 WiDr 세포의 종양 세포 사멸이 증가된 것으로 나타났다. 도 68A는 두 항체 14A2 IgG 및 BHAlO IgG는 병용하여 사용했을 때뿐만 아니라 단일 제제로서 사용한 경우에도 MDA231 종양 세포의 성장 억제 활성이 미미한 수준이었다. 이와 대조적으로, 이중특이적 헤르큘레스 항 체(XWU054 및 XWU055)는 실시예 10에 기술한 XWU036 분자(VH44:VLl00/(Gly4Ser)4 링커 안정화된 BHAlO scFv를 갖는 C-말단 헤르큘레스)에서 관찰된 것과 견줄만하게 MDA231 세포의 종양 세포 사멸이 증가된 것으로 나타났다.
실시예 15: 인간 또는 인간화 항체 서열의 열 안정성 측정을 위한 시차 주사 열량측정법(DSC)의 활용
항체의 분명한 안정성 범위를 측정하기 위해서, 17 인간 또는 인간화 BIIB 항체 세트에 대해서 시차 주사 열량측정법(DSC)을 수행하였다.
BIIB 항체를 pH 6.0인 20 mM 시트르산나트륨 및 150 mM 염화나트륨 완충액에 대해 완전하게 투석하였다. 투석물은 각 항체 주사의 기준선을 한정하기 위한 열량 측정기의 기준 세포로 사용하였다. 투석 후, BIIBl-17의 농도를 280 nm 흡광도로 측정하였다(Pace 외, Protein Sci. 4, 241 1-2423, 1995). DSC를 위해 사용된 항체 용액은 일반적으로 이들의 투석물로 농축 스톡을 희석하여 1 mg/mL로 제조하였다.
자동화 모세 시차 주사 열량측정기(capDSC, MicroCal, LLC)를 이용하여 주사를 수행하였다. 단백질 및 기준 용액은 로봇식 연결 장치를 이용하여 96웰 플레이트에 자동적으로 샘플링하였다. 각 단백질 주사전에, 샘플 세포중 완충액을 이용하여 2 주사를 수행하고 배경값 삭감을 위해 사용하였다. 매 단백질 주사 이후에 5% Liquinox를 이용하여 단일 클리닝 주사를 수행하였다. 매 주사 이후에, 기준 세포 및 샘플 세포를 0.01% 나트륨 아지드를 함유하는 3×-2 mL의 증류된 탈이온 H2O를 이용하여 자동 세정하였다. 스캔은 피크 해상도 증가를 위해 중간 피드백 모드를 이용하여 1℃/분으로 수행하였다. 주사 범위는 20∼95℃였다. 단백질을 함유하는 모든 96웰 플레이트는 6℃에 장치내에서 보관하였다.
제조사가 공급하는 Origin 소프트웨어를 이용하여 주사 결과를 분석하였다. 배경값을 뺀 후, 0 이외의 기준선은 3차 다항식을 이용하여 교정하였다. 각 IgG1 도메인의 미폴딩 전이는 3개별 전이에 대해서 다중피크 곡선을 맞추어서 디컨볼루팅하였다. 재조합 IgG1 및 IgG4 Fcγ 도메인을 이용하여 각 전이 내 CH2 및 CH3 피크를 확인하는데 사용하였다. 나머지 전이(들)는 항체의 Fab 부분의 미폴딩부에 상응하는 것으로 가정하였다.
17 항체의 Fab 부분의 대부분은 각 개별 Fv의 고유 특성에 따라서 57∼82℃범위의 열적 미폴딩(TM)의 중간지점을 갖는 분명한 단일 전이로 미폴딩된다. 단 3개의 항체 BIIB 15, BIIB 16 및 BIIB 17만이 4 전이를 나타내었다. 전형적인 IgG1 DSC 트레이스를 도 69A에 도시하였다. Fab 부분에 대한 Cpmax(즉, DSC 피크의 높이)는 일반적으로 CH2 또는 CH3 도메인에 비하여 상당히 크다. 이는 항체 내 Fab 단백질 질량이 CH2 또는 CH3 도메인에 비해 4배 정도 큰 것을 고려하면 타당하며, 항체의 Fab 부분이 또한 그의 각 전이가 단일 단독이량체 계면에서만의 파괴에 관여하는 CH2 및 CH3 도메인과 반대로 4 도메인 사이에 묻혀있는 표면적을 포함한다. 일반적으로 각 IgG1 항체의 CH2 및 CH3 도메인에 대해 관찰되는 전이는 상호에 대해 포개어져있다. 이는 3 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인에 대해서 동일하게 사실이다. 이러한 이유로, 각 IgGl 또는 IgG4 분자의 Fab 전이는 쉽게 확인되었다. 한 항체(BIIB l8)에 대해서는 DSC를 이용하여 실험하지 않았다. BIIB l8은 빈약하게 발현되고 가용성/비응집성 물질을 생성시키지 않았다. 이 항체는 실시예 16에 기술한 서열 분석에 포함시켰다.
항체 중 하나인 BIIB7은 두 인간 IgGl 및 IgG4 형태로 분석하였다. 이러한 열적 미폴딩 전이(TM)의 중간점으로 측정한 바에 따른 IgGl 및 IgG4 형태의 BIIB7의 Fab 열안정성은 매우 유사하였다(도 69B 참조). 불변 영역 서브클래스의 변이는 Fab TM 또는 Fab 열량적 미폴딩 엔탈피에 어떠한 영향도 없었다.
IgG4 Fc의 CH2 및 CH3 도메인에 상응하는 중첩 전이는 IgG1보다 상당히 낮은 온도에서 일어나고 인위적으로 Fab 전이에 대해 IgG4에 비해 ∼1-2℃ 보다 낮아 보이게 만든다. IgG 전이를 완전하게 디컨볼루팅한 경우, Fab TM은 DSC 트레이스에서 나타나는 것에 비해 보다 근접해 있다(△TM < 1℃). IgG1 및 IgG4 형태의 BIIB7의 Fab DSC 곡선이 매우 유사하다는 사실은 IgG1 Fab 및 IgG4 Fab의 열안정성을 직접 비교할 수 있다는 것을 의미한다.
인간화 BIIB 항체 17개를 이용한 DSC 측정 결과는 Fv 영역이 이들 각 Fab의 분명한 안정성에 상당한 영향을 주는 것을 시사한다. 예를 들어, 도 70은 BIIBl, BIIB4, BIIB6 및 BIIB16에 대해서 매우 상이한 DSC 곡선을 보여준다. 모든 4 항체는 IgG1이었고, 이들 간에는 Fv 영역 내 서열 차이만이 존재하였다. 모든 17 항체 의 CH2 및 CH3 DSC 전이의 위치 및 크기는 이들이 결합한 Fab에 비의존적이다(도 70 참조). 표 20에서 상부의 17 항체에 대한 Fab TM 범위는 57.2∼81.6℃(±24.40℃) 범위이고, BIIB1은 가장 높게 뚜렷한 Fab 안정성을 나타냈고 BIIB 17은 가장 낮았다.
가장 낮은 Fab TM 측정치를 나타내는 3개의 항체, BIIB 15, BIIB 16 및 BIIB 17은 Fab 내 도메인 미폴딩 전이 간의 단절을 의미한다(도 70에서 BIIB 16의 DSC 곡선 참조). Fab의 기대 피크는 두개의 개별 전이로 나뉘었다. 보다 낮은 TM 전이는 표 20에 열거하였지만, CH1/CL 구조 단위의 미폴딩을 나타내는 제2 전이는 BIIB 15, BIIB 16 및 BIIB17 각각에 대해서 TM이 74, 72 및 70℃에서 일어났다. BIIB 18은 이 실험에서 발현되지 않고 이의 VH 서열이 공통 서열로부터 상당히 벗어나 있는 항체의 예로서 포함시켰다(실시예 16 참조).
DSC 분석은 개별 Fv 영역의 고유한 특성이 항체의 전체 Fab 부분의 뚜렷한 TM을 상당히 감쇠시킬 수 있는 것을 분명히 보여주고 있다. BIIB 15, BIIB 16 및 BIIB 17의 극한 경우에서, 분명한 Fv 안정성은 Fab 부분 내 도메인의 미폴딩 전이가 상호 비커플링될 정도로 충분히 낮았다. Fab의 모든 4 도메인의 미폴딩을 위한 단일 전이를 유지하기 위해서, 최소한의 전체 TM 한계치(본 발명에서 기술한 주사 조건 하에 IgG1에 대해 > 70℃)가 존재할 수 있으며, 그렇지 않으면 다수의 전이가 나타난다. BIIB 15, BIIB 16 및 BIIB l7의 낮은 온도의 미폴딩 전이는 Fv에 대해 지정하고 두번째, 보다 높은 온도 전이는 CH1/CL 도메인에 대해 지정하는 것이 편리하였다. 하지만 Ewert 및 그의 공동 연구자들에 의하면 VH/VL 도메인 미폴딩이 항상 커플링되지 않는 것은 아니고 하위부류, VH/VL 안정성 및 VH/VL 상보성(Ewert 외, J. MoI. Biol. 325: 531-553, 2003)에 의존적일 수 있다는 것을 보여주었다. 사실, 공통 서열 유도된 골격을 갖는 이들 VH/VL scFv 구조체의 매우 소수만이 협동적인 미폴딩을 나타내었다. 따라서, 전이 미커플링으로서, 미폴딩 시나리오는 Fv 영역 및 CH1/CL 영역을 나타내는 두개의 전이로 단순하게 나뉘는 것보다 더욱 복잡할 수 있다.
BIIB7 IgGl 및 IgG4 Fab에 대해 DSC를 통해 측정되어진 분명한 안정성은 두 하위부류 간 이황화 결합 및 CH1 서열에 실질적으로 고유한 차이가 존재하더라고 매우 유사하다. 이에 대해서는 여러 가능한 설명이 존재하는데 예컨대 (1) Fv의 생물리적 특성은 CH1이 IgGl 또는 IgG4인지에 무관하게 BIIB7의 열안정성 상한치를 정하거나, (2) CH1/CL 영역의 분명한 안정성은 IgGl과 IgG4 간에 동일하거나, 또는 (3) CH1/CL 구조 단위는 DSC 실험의 시간 틀 내에서는 미폴딩되지 않는다는 것 등으로 설명할 수 있다. 단일 TM에서 BIIB7 Fab가 미폴딩되고 IgG1 및 IgG4 두 형태의 열량 엔탈피가 유사하다는 사실은 불변 영역이 아니라 Fv에 대해 가능한 안정성 의존도 가 있다는 것을 의미한다.
[표 20]
Figure 112008072289549-pct00120
실시예 16: 준최적 안정성을 갖는 항체 가변 영역을 확인하기 위한 공통서열 스코어링의 이용
공통서열 스코어링은 Fv 영역 내 유의적으로 큰 수의 비최적 아미노산을 함 유한 BIIB 항체의 확인을 위한 방법으로서 사용되었다. 이 스코어링은 과체세포(hypersomatic) 돌연변이 및 진화적 배선 변이로 인한 공통서열 VH 및 Vκ 서열로부터의 상대적 표류를 평가한다. 17개 항체용 DSC 측정을 사용하여 불량한 항체 안정성을 예견하기 위한 공통서열 스코어링 접근 능력을 부여하였다.
스코어링을 위한 공통 서열을 유도하는데 사용되는 포유류 VH 및 Vκ 카파 서열의 기준 세트 및 각 잔기 위치에서의 개별 아미노산 빈도를 종래에 기술된 바와 같이 수집하고, 분류하고 추려내었다(Demarest 등, J. Mol. Biol. 335: 41-48, 2004). 포유류 기준 세트는 순수하게 구축되어 다양한 포유동물 유래의 V-유전자를 포함하므로써 종 간에 진화 표류를 통해 다양성을 얻었다. VH 포유류의 기준 세트는 주로 총 17개의 상이한 포유류 종을 대표하는 NCBI 및 TIGR 유래의 61개의 VH 서열을 함유한다. Vκ 포유류 기준 세트는 13개의 상이한 포유류 종 유래의 53개의 Vκ 서열을 함유한다.
기준 세트를 구성하기 위한 (또는 테스트 서열로 사용하기 위한) 인간 VH 및 Vκ 서열을 탐색 척도 "호모 사피엔스 항체 가변 중쇄" 및 "호모 사피엔스 항체 카파 가변 경쇄"를 각각 사용하여 NCBI 데이타베이스로부터 수집하였다. 총 182개의 인간 V-유전자 서열, 114개의 VH 및 68개의 Vκ는 포유류 VH 및 Vκ 데이타베이스에 대한 비교를 위하여 NCBI 데이타베이스로부터 반 무작위로 선택되었다. NCBI 데이 타베이스에서 반 무작위로 신중하게 선택되어 얻어진 인간 VH 및 Vκ 서열의 서브클래스 분포는 특정 경로에서 약간의 치우치는 것으로 보이는 자연적인 배선 VH 또는 Vκ 사용법(Guigou 등, 1990)을 기초로 예상된 서브클래스가 형성되고, 서열을 NCBI에서 선택하였다.
이후, 서열을 [Aho's Amazing Atlas of Antibody Anatomy] 웹사이트에서 얻은 서브클래스 공통 서열에 대하여 ClustalW 정렬기를 통해 개별 가변 도메인 서브클래스 (VH1-VH7 및 Vκ1- Vκ4)로 분류하였다. 서브클래스는 공적으로 입수가능한 인간 배선 서열 (Lefranc 등, Nucleic Acids Res. 27, 209-212, 1999)에 대한 정렬을 통해 추가로 확인되었다. 임의의 하나의 다중 서열 NCBI 의뢰로부터의 5개 이하의 인간 서열을 기준 세트 내에 포함시켜 프라이머 세트 또는 항원계 V-유전자를 사용함으로써 도입되는 잠재적인 치우침을 감소시켰다. 상기 수집된 서열을 순수하게 실시하여; 이에 따라 서브클래스 집단화 후 VH3 및 Vκ1 서열의 자연적인 풍부함이 존재하였다. 평균 스코어 및 표준 편차(하기 및 표 20에 기술됨)는 25개의 VH1, 3개의 VH2, 44개의 VH3, 34개의 VH4, 5개의 VH5, 3개의 VH7, 29개의 Vκ1, 4개의 Vκ2, 19개의 Vκ3 및 16개의 Vκ4 인간 서열을 사용하여 각 서브클래스에 대하여 계산되었다. 18개의 항체 중 2개(BIIB5 및 BIIB14) 만이 서브그룹 서열 개체군(즉, VH2, VH5 또는 VH7)이 최소인 VH 도메인을 함유하였다. 18개의 항체 중 4개(BIIB3, BIIB4, BIIB17 및 BIIB18)는 서브클래스가 서열 공간에 과소표시되고 스코어링 정확도가 불확실한 Vκ2 서브클래스 가변 도메인을 함유하였다. 인간 VH 서열 기준 세트 내에 자연적인 VH6 서열이 발견되지 않았다. VH6 도메인을 함유한 BIIB 항체 구성체 중 어느 것도 문제가 되지 않았다.
18개의 BIIB 항체의 가변 도메인 서열 및 NCBI로부터 얻은 182개의 인간 VH 및 Vκ 서열을 포유류 항체 서열의 기준 세트에 대해 스코어링하였다. 모든 VH 및 Vκ 서열을 CDR3 이전에 절단(공통서열 YYC 잔기 후 2개의 잔기)하여 V-(D-)J-C 연결 영역의 극가변 특성을 통해 도입된 예측 불가능성(unpredictability)을 감소시켰다. 포유류 데이타베이스 내 모든 위치에서 잔기 빈도 (pi(r))는 전체 서열의 수에 의해 나누어진 데이타베이스 내 각 잔기 위치에서 발생한 각각의 아미노산 (A,C,D...V,W,Y,-)의 횟수를 합하여 계산되었다. 하기 수학식을 사용하여 각 인간 VH 및 Vκ 테스트 서열에 대한 스코어를 평가하였다:
Figure 112008072289549-pct00121
상기 식에서, ci(r)은 포유류 가변 도메인 데이타베이스의 각 위치에서 공통서열 잔기 빈도와 같고 hi(r)은 인간 가변 도메인 테스트 서열의 각 아미노산의 테스트 잔기 빈도와 같다. 포유류 데이타베이스의 공통 서열에 대해 완벽하게 일치된 스코어는 VH의 경우 104개이고 Vκ의 경우 100개였다.
A. 포유류 V-유전자 데이타베이스를 사용한 스코어링 무작위 V H 및 V κ 서열
VH 및 Vκ 서브클래스 공통 서열을 포유류 데이타베이스 공통서열에 대해 스코어링하고 각각 도 71A 및 71C에 도시하였다. VH3 서브클래스 공통서열은 포유류 데이타베이스 공통서열의 가정상 "완벽한" 스코어보다 낮은 1점 만을 스코어링하여 총 3개의 잔기에 의해 포유류 데이타베이스 공통서열이 상이하였다. 따라서, 이는 포유류 데이타베이스가 VH3 유사 서열로 치우친다는 점이 명백하게 된다. 모든 다른 인간 VH 서브클래스 공통 서열은 유의적으로 낮게 스코어링되었다. 포유류 Vκ 데이타베이스에 대해 Vκ4 서열로 치우치는 것이 관찰되었다(도 71C). 인간 또는 인간화된 BIIB 서열 스코어는 서브클래스와 유사한 인간 NCBI 서열의 성능을 기초로 분석되었다. 개별 VH 서열 스코어의 분포가 도 71B에 도시되고, 개별 Vκ 서열 스코어의 분포가 도 71D에 도시된다.
B. BIIB1 내지 BIIB18에 대한 스코어링 결과
모든 18개의 BIIB 항체에 대한 VH 및 Vκ 스코어는 NCBI 인간 V-유전자 서열 기준 세트로부터 유도된 상대적인 수로 계산되고 비교되었다(표 20). 또한 표 20에 포함된 것은 BIIB V-유전자 스코어와 평균 서브클래스 스코어 간의 차이점이다. 잠재적인 안정성 경향을 검토하는데 사용되는 스코어들 사이의 차이점이다. BIIB1 내지 18은 측정된 Fab 안정성을 하강 순서대로 표지되었다. V-유전자 서브클래스 및 BIIB VH 및 Vκ 유전자에 가장 가까운 개별 인간 배선은 ClustalW 분석을 통해 결정되었다.
공통서열을 기초로 한 스코어는 18개의 BIIB 항체로부터 유도되고 실험적으로 측정된 Fab 열적 언폴딩 프로파일과 비교되었다. BIIB V-유전자 스코어와 이의 평균 서브클래스 스코어 (즉, 가장 낮은 서열 스코어) 간의 차이점이 가장 큰 BIIB 항체는 실시예 15에서 측정된 낮은 Fab TMS와 관련이 있었다(표 20, 도 72A). DSC에 의해 측정된 TMS와 Vκ 스코어가 관련된 경향이 명백하지 않았다(도 72B). 사실상, 가장 낮은 스코어링 Vκ 서열은 두번째로 가장 높이 명백한 Fab 안정성을 갖는 BIIB2에 속하였다.
비통상적인 CDR 아미노산의 삽입 및 결실이 BIIB 15 및 BIIB 16, 마찬가지로 BIIB 18에서 발견되었는데, 이는 모든 BIIB 항체 중 가장 낮은 VH 스코어를 가지며 상당한 수준에서는 발현되지 않는다. VH 스코어링은 BIIB 15 및 BIIB 16에 대한 잠재적 안정성 문제를 보이지 않으나; 이의 Fab TMS는 가장 낮게 테스트된 것 중 2개이다(도 72A). BIIB 15는 비통상적으로 긴 CDR1 (본 발명 세트 중 인간 서열에서 VH3 유사 도메인 본 발명의 포유류 데이타베이스에서 임의의 VH3 유사 도메인보다 2개 더 긴 아미노산이고 길이에 있어서 13개의 아미노산)을 함유하고 BIIB 16은 비통상적으로 짧은 CDR2 (본 발명의 포유류 VH 데이타베이스 및 본 발명의 기준 세트 중 인간 VHS에서 나머지 VH3 CDR2의 유의적인 대다수 보다 짧은 1개의 아미노산이고 길이에 있어서 15개 아미노산)를 함유한다.
C. BIIB Fab의 안정성 예측 및 잔기 빈도 분석을 위한 소형 포유동물 서열 데이타베이스의 유용성
VH 서열의 포유류 데이타베이스에 대하여 BIIB VH 도메인을 스코어링하는 것은 각 VH 도메인 내 비최적 아미노산의 풍부함을 측정하기 위한 유용한 도구가 된다는 것으로 입증되었고, 이는 결국 Fab의 전반적인 안정성을 한정할 수 있다. 생체내 수명이 감소되고 응집률이 증가하는 잠재성 및 낮은 안정성이 있는 Fab를 선택하는데 스코어가 유용하였다. 포유류 V-유전자 데이타베이스에 대해 관찰되는 서브클래스 선입견을 기초로, 본원에 사용된 포유류 데이타베이스와는 대조적으로 공통서열 스코어링을 수행하기 위한 인간 V-유전자 데이타베이스를 엄격하게 사용하는 것이 최적인지를 질문할 수 있다. 하지만, 스코어링이 반영되지 않는 변수, 예컨대 비공통서열 아미노산의 정확한 잔기 위치, VH/VL 상호작용의 강도, V-(D-)J-C 연결의 성질 및 과체세포 삽입 또는 결실의 발생을 결정하는 유의적인 수의 안정성을 기초로, 모든 인간 VH 데이타베이스가 유의적인 향상을 제공한다는 것을 생각하기는 어렵다. 엄격하게 스코어링하는데 사용된 인간 데이타베이스는 또한 유의적으로 거대한 양의 서열을 필요로하여 포유류 데이타베이스 내 자연적으로 포함된 진화적인 다양성과 대응될 수 있다. 포유류 데이타베이스 접근 작업을 가리키는 하나의 데이 타는 인간 서브클래스 공통서열 VH 서열을 이의 유전자 서브클래스의 풍부함과 명백한 서브클래스의 이용을 상승하는 순서로 스코어링하였다(Guigou 등, 1990; Teale 및 Medina, 1992; Tomlinson 등, 1992). 포유류 VH 데이타베이스는 적당하게는 인간 VH 서브클래스의 전반적인 기여에 무게를 두는 것으로 보인다. 각 VH 및 Vκ 서브클래스 공통 서열이 일반적으로 NCBI에서 선택한 대다수의 개별적이고 유일한 인간 서열보다 높게 스코어링된다는 사실은 포유류 데이타베이스가 VH3에 대해 선입견이 존재함에도 불구하고 모든 서브클래스에 대한 공통서열 정보를 포획하고 있다는 것을 시사한다. 따라서, 스코어링이 도입되지 않는 다른 안정성 영향 인자의 존재로 인해, 도 72A에서 관찰된 경향은 스코어링에 사용된 VH 서열 데이타베이스의 미세한 조정에 의해 향상될 것 같지는 않다.
VH 도메인 내 비통상 삽입 또는 결실은 공통서열 스코어링에 의해 반영되지 않은 안정성에 유의적인 효과를 나타낼 것으로 보인다. 비통상적으로 긴 (13개의 아미노산) BIIB15의 CDR1 및 비통상적으로 짧은 (15개의 아미노산) BIIB16의 CDR2는 아마도 원래의 마우스 서열로부터 인간화되었을 것이다. 사실상, BIIB 16 VH 서열은 또한 15개의 아미노산 CDR2를 포함하는 본원의 포유류 데이타베이스 내 2개의 마우스 VH 서열과 근접하게 정렬된다. 인간 골격 상의 비통상적으로 작은 CDR에 힘을 가하는 것은 이 항체의 안정성에 악영향을 미칠 수 있다. BIIB 18은 모든 BIIB 서열 중 가장 낮은 VH 스코어를 나타낼 뿐 아니라 상당히 긴 CDR2(통상 최대 19개의 아미노산과 비교하였을 때 22개의 잔기)를 함유할 수도 있다. 따라서, 미정제된 상청액을 이용하여 극도로 미정제 생물학적 분석과는 다른 어떠한 것도 할 수 있는 발현 수준에 도달할 수 없는 BIIB 18 서열 내 고유의 복합적으로 가능한 문제들을 고려한다는 것에 놀라지 않는다. BIIB15, BIIB 16 및 BIIB 18에 대한 결과는 비통상 VH 삽입 또는 결실이 대부분의 단일 점 돌연변이보다 항체 내열성(thermostability)이 상당한 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다. BIIB 18의 예외적인 불량한 양상은 V-유전자 폴딩 내 엄격하게 보존된 Fv가 함유된 모든 "필수" 아미노산으로서 서열 상에 기계적인 글랜스(glance)를 기초로 예견할 수 없었다. 다소 미세한 빗을 사용하는 곤란한 항체를 선택하는 능력은 가진다는 것은 스코어링 접근의 유용성이 실질적이라는 것이다.
Vκ 스코어에 대한 측정된 Fab 안정성과 비교하였을 때 경향은 명백하지 않았다. Vκ 스코어를 VH 스코어와 조합하는 것은 VH 스코어를 단독으로 관찰된 경향을 단순하게 감소시켰다. VH 스코어링 결과와는 다르게, 인간 Vκ 공통서열 스코어는 자연적으로 풍부한 Vκ 배선 및 유전자 이용과 일치하지 않았고(Guigou 등, 1990; Meindl 등, 1990; Cox 등, 1994); 또한 공통서열이 각 인간 카파 서브클래스 서열보다 양호하게 스코어링된 모든 것을 스코어링하였다(도 72B). Vκ 공통서열 스코어의 예상된 순서에서의 편차는 포유류 데이타베이스의 안정성이 낮은 Vκ 도메인을 정확하게 예측하는 능력을 막을 수 있음이 추측된다. 또한, Vκ2 서브클래스 평균 스코어를 한정하기 위한 Vκ2 서열은 충분하지 않았다. 68개의 인간 Vκ 서열에 대한 서브클래스 분포를 측정한 후, 4개만이 Vκ2 (Vκ2 이용을 상당히 잘 반영함)였다. 비록 이들은 결점이 있으나, Vκ 결과는 여전히 VH 유전자의 보다 큰 서열 다양성이 자주 VH 도메인에 Fab 안정성 결정 성분을 나타낼 수 있음을 시사하며(Demarest 등, 2006); 반대예는 문헌에서 입수가능하다(Roethlisberger 등, 2006).
D. V H 또는 V L 배선 및 V H /V L 쌍 상의 안정성 의존성
18개 중 다수의 항체는 오버랩된 배선 V-유전자를 포함하는데, 이의 CDR 및 과체세포 돌연변이는 달라지며 이의 VH 또는 Vκ 쌍은 동일하거나 상이하였다. 이것은 각 배선에서 유래된 것에 대한 항체 Fab 안정성을 비교할 수 있다. 2개의 가장 안정한 Fab, 즉 BIIB1 및 BIIB2는 동일한 VH1 및 Vκ1 배선 조합을 갖는다. VH 및 Vκ 쌍은 Winter 및 동료에 의한 연구를 기초로 하는 명백한 고유의 선입견을 갖는 것으로 보이지 않지만, "수용체 작동"이 되는 것으로 생각된다(Wildt 등, 1999b). BIIB1 및 BIIB2는 비교적 다른 항원인 CCL2 및 VLA4와 결합하고; 따라서 조합은 무작위적으로 발생하거나 인간화의 결과를 초래하였다. 가장 적게 안정한 Fab의 VH 도메인인 BIIB 17 및 BII18 (즉, 비통상적 삽입을 함유한 낮은 서열 스코어 및 BIIB 18) 내 비최적 아미노산은 명백하게 풍부하다. 이들 항체는 모두 또한 동일한 Vκ2 배선을 포함하지만, 잠재적으로는 스코어링에 의해 확인된 상부의 VΗ계 생성 상에의 경쇄 단백질 안정성 생성을 시사하고 있다. 흥미로운 미래 연구에서는, 상기 특정한 Vκ2가 이들 2개의 항체의 불량한 생물물리학적 양상에 기여자인지에 대한 여부를 측정해야할 것이다. Vκ2 서브클래스는 일반적으로 불량한 Fab 안정성과 관련되지 않는데 그 이유는 BIIB3 및 BIIB4가 또한 Vκ2 서브클래스 유전자를 포함하기 때문이다. ABO19438VH1 배선 (Lefranc 등, 1999)이 4배 수확되었다. 이러한 Fab (BIIB 12, BIIB 11, BIIB7 및 BIIB3)에 대한 TM 값은 71.2∼78.2의 범위였다. 흥미롭게도, 이의 VH 서열 스코어는 뚜렷한 Fab 안정성과 서로 연관이 있었다(BIIB12 < BIIB11 < BIIB7 = BIIB3). 포지티브 VH 스코어링의 상호연관성은 또한 동일한 VH1 배선을 갖는 상기 기술된 BIIB1 및 BIIB2 항체에서 발견되었다. 하지만, VH 스코어링의 명백한 부정확성은 둘다 M99649VH3 배선을 함유하는 BIIB4 및 BIIB6에서 관찰된 네거티브 안정성 상호연관성에 의해 강조되었다.
성인에서 VH 배선 패밀리의 이용이 완전히 무작위로 나타나는 반면, VH3 패밀리는 인간에서 대부분의 구성원을 함유한다. VH3 또는 VH3 유사 유전자는 확률적으로 인간 기준 세트와 포유류 데이타베이스에 더욱 자주 나타났다. Ewert와 Plueckthun의 결론은 공통서열 유래된 인간 VH3 서열이 가장 안정한 공통서열 유래 된 VH 도메인이라는 것을 입증하였다(Ewert 및 Pluckthun, 2003). 이러한 결과는 VH3 서브클래스가 나머지 서브클래스과 비교하였을 때 최적의 공통서열을 생성하는데 공헌하기 위한 더욱 많은 배선 서열을 갖는다는 것을 예상외로 완전하게 고려할 수 없었다. 본 발명자의 안정성 데이타는 IgG 함유 VH3 배선이 일반적으로 보다 높은 Fab TM 값을 제시하지 않는다는 점을 보여준다. 안정성 리스트의 상단과 하단에 모두 VH3 및 VH1 서브클래스 유전자가 있다. 다수의 기타 요인들, 특히 Fv 내 Vκ 다른 한쪽의 성질이 Fab의 전체적인 안정성에 기여하는 반면, 일반적으로 VH3 도메인이 나머지 서브클래스보다 더욱 안정하다면 VH3 서브클래스 배선을 함유하는 것들에 대한 Fab 안정성이 보다 높은 경향이기를 기대할 수 있다. 이는 본원에 기술된 제한적인 안정성 연구로부터의 경우가 되는 것으로 보지 않는다.
실시예 17. Ig-폴드 폴리펩티드의 공변성 분석
A. Ig-폴드 구조의 수집과 여과
다중도메인 단백질로부터의 Ig-폴드 단백질 또는 Ig-폴드 도메인의 구조는 ASTRAL 데이타베이스로부터 수집하였고, 이는 SCOP 분류 체계와 대응되는 도메인 구조를 함유한다. 면역 글로불린 특정 Ig-도메인은 SCOP 분류 체계 내에 다음과 같은 분류 하에 발견되었다: "모든 베타 단백질" --> "면역 글로불린 유사 베타-샌드위치" --> "면역 글로불린". 면역 글로불린 하에, 4개 세트의 구조가 이용가능하였다: "V 세트," "C1 세트," "C2 세트," 및 "I 세트." 4개의 일반적인 다운로드 스크 립트를 개별적으로 작동시켜 "V 클래스", "C1 클래스", "I 클래스", 및 "C2 클래스" pdb 파일을 얻었다.
일단 각 서브패밀리에 대해 구조 파일을 다운로드하면, 일부 여과작업을 수행하여 일탈적으로 카테고리화된 것, 불완전한 것, 군더더기인 것, 또는 도메인 교환 구조를 제거한다(Liu Y, 등, Protein ScL (2002), 1285-1299). 하기 기술된 바와 같이 4개의 주요 여과 단계가 있었다:
단계 #1. 파단부를 가지는 서열 제거
각 서브클래스로부터의 구조는 서열 내 분쇄된 SwissPDB 뷰어를 사용하여 외관상 관찰하였다(도메인 교환으로 인한 미해결된 밀도 또는 손실 부분). 잘못된 구조의 PDB 파일은 V 클래스, C1 클래스, C2 클래스, 및 I 클래스 구조 데이타세트로부터 수동으로 제거되었다.
단계 #2. 100% 동일한 서열 제거
PDB 포멧 구조를 FASTA 포멧 아미노산 서열로 전환하고, 여과하여 잔여 서열과 100% 동일하거나 또는 완전하게 대응되는 서브스트링(substring)인 임의의 서열을 제거하는 것이다.
단계 #3. 이상 길이의 서열 제거
변종적으로 길거나 짧은 아미노산 서열이 있는 PDB 구조는 구조 데이타세트로부터 제거되었다. 길이 절단 변수는 모든 서열의 길이의 막대 그래프를 조사함으로써 결정되었다(도 74). 막대 그래프는 다소 정상적으로 분포되는 것으로 보였다. 수단으로부터 서열 외부의 2개의 표준 편차는 각 서브패밀리 데이타세트로부터 제 거되었다. 면역 글로불린 서브패밀리에 대한 모든 수단의 잔기 수는 106.10이고 표준 편차는 12.19였다. 결과적으로, 사용된 글로벌 절단은 ≤ 81 및 ≥ 131 잔기이다. 평균 길이 및 표준 편차의 결점은 표 21에서 제시한다.
[표 21]
구조 데이타세트의 서열 길이 기준
서브클래스 평균 길이 표준 편차
C1 99.44 8.79
C2 88.07 15.14
I 95.5 4.94
V 111.95 10.62
전체 106.10 12.19
단계 #4. 미스폴딩 서열의 제거
미스폴딩에 대한 구조는 SwissPDB 뷰어를 사용하여 시각적으로 검토되었다.
2개의 베타 시트 샌드위치 위상 기하학에 따르지 않는 임의의 구조를 처분하였다. 5개의 C2 클래스 도메인만이 SCOP로부터 얻어졌기 때문에, C2 클래스 Ig-폴드는 추가로 추적되지 않았다. 이하, C1 클래스는 C 클래스로 언급한다.
B. 구조 배열로부터의 서열 배열 수득
각 개별 유형의 경우, Ig-폴드 구조는 Schroedinger 구조 배열 패키지(초위치를 생성하는 설명서를 위한 Schroedinger Prime 프로그램 문서 참조) 내 2차 구조 대응(SSM)을 사용하여 서로 보충되었다. 초위치는 '모두-대-모두(all-to-all)' 또는 '모두-대-하나(all-to-one)'를 기초로 수행되었다. 각 알고리즘은 유사한 품질의 정렬을 초래하므로, 따라서 '모두-대-하나'가 초위치로 선택되었다. 일부의 보충이 서로 연관되어 각 구조의 주요 영역이 루프 대신에 보충되는 것을 보증하였 다. 이후 이 보충을 사용하여 각 구조적 배열 내 모든 V 클래스, I 클래스 및 C형 서열의 구조를 기초로 하는 서열을 발생시켰다. 서로 상의 각 서열 배열은 Schroedinger 패키지를 사용하여 하나의 서열에서 폴리펩티드 골격의 α-탄소 사이의 가장 짧은 거리를 기준으로 하는 제2 서열의 서열까지의 아미노산을 대응시킴으로써 수행되었다.
C. 큐레이트(curated) Ig-폴드 서열 데이타베이스의 구성
다수의 규정 단계를 생성하여 강력한 공변성 통계를 계산하기 위하여 큐레이트 Ig-폴드 데이타세트를 발생시켰다:
단계 #1. HMM 프로파일의 구성
3가지 Ig-폴드 유형들 중 하나에 대한 구조를 기초로 한 서열 배열을 각각 기초로 3가지 은닉 마르코프 모델(HMM) 프로파일을 만들었다. 상기 프로파일은, 표준 옵션으로 명령어 "hmmbuild" 및 "hmmcalibrate"를 사용하여 HMMER 소프트웨어 패키지(버전 1.8)로 생성되었다. 이후 이러한 HMM을 사용하여 NCBI에서 보유하고 있는 NR-데이타베이스 내 부가적 Ig-폴드 서열을 검출하고 배열시켰다.
단계 #2. 신규 V 클래스, I 클래스, 및 C형 HMM 프로파일을 사용한 NR의 조사.
3가지 유형 특이적 HMM를 사용하여 로컬 NR 데이타베이스 내 유사한 서열을 조사하였다. NR 데이타베이스는 ∼3백만개의 비중복된 단백질 서열을 함유하는 거대한 파일이다. 각각의 V 클래스, I 클래스, 및 C형 HMM의 경우, HMMER 명령어 "hmmsearch"를 사용하여 NR을 조사하였다. 각각의 산출량은 사용된 HMM과 비교한 스코어에 의한 NR 서열을 분류하고, HMM에 의한 영역 히트의 수 및 각 NR 서열 내 히트 영역의 위치에 관한 정보를 제공하였다. 각 Ig-폴드 유형 특이적 HMM 조사의 경우, 권장 척도 스코어 임계값 상의 히트 NR 서열은 HMM이 사용되는 Ig-폴드 유형의 후보 구성원으로서 유지되었다. NR 서열의 부분열인 이러한 영역의 경우, 정확한 NR 부분열 히트는 기존 프로그램을 사용하여 모든 NR 서열로부터 추출되었다.
단계 #3. PFAM을 사용한 Ig-폴드 유형 정렬의 유효화.
PFAM은 단백질 패밀리 및 도메인 분류 도구이며, 개별 단백질 서열로 적용될 수 있는 Wellcome Trust Sanger Institute (Fin, 등, Nuc. Acids. Res., (2006), 34: D247-D251)에서 생성되고 보유되어 있다. Pfam 도구인 'pfamverify'는 상기 단계 2에서 얻어진 Ig-폴드 후보 서열 각각에 적용함으로써, 이것이 구조를 기초로 한 서열 정렬로부터 생성된 Ig-폴드 유형 특이적 HMM에 의해 올바르게 분류되는지를 확인하였다. PFAM의 Ig-clan HMM 프로파일(V 클래스, I 클래스, C1 클래스, C2 클래스, 및 덜 특이적인 Ig HMM을 포함)을 PFAM 웹사이트로부터 다운로드하였다. NR 유래의 각 서열을 Ig-clan HMM에 의해 스코어링하고, 각 PFAM HMM에 얼마나 합치하는지를 밝혀내었다. V 클래스, I 클래스, 또는 C형에 대한 하기 권장된 컷오프(TC1 - PFAM 웹사이트에서 규정됨)가 있는 서열의 스코어는 각 서열 세트로부터 제거되었다. 따라서, PFAM 스코어가 Ig-폴드 유형 배열을 입증하는 경우 단계 2에서 발견되는 후보 유형 특이적 Ig-폴드 서열만이 유지되었다.
단계 #4. 신규 Ig-폴드 서열의 정렬.
HMM 조사를 이용한 NR로부터 당겨지고 상기 단계 3에서 생존한 Ig-폴드 서열 은, 정렬된 유형의 기존 HMM에 후속 정렬되었다. 이러한 HMM이 신중한 구조 정렬을 기초로 하기 때문에, 이러한 공정은 신규 서열의 구조 지도적 정렬을 입증하였다. HMMER 패키지를 사용하여 fasta 산출 포멧에서 'mapali' 정렬을 발생시키고, 하기 기술된 서열 공변성 도구를 사용하였다. 또한 정렬은 'Stockholm' 산출 포멧에서 산출되며, 수동으로 삭제되는 비정상적이거나 정렬되지 않은 서열에 대해 점검하였다. 원래 구조적으로 정렬된 서열 및 NR 유래의 부가된 HMM 정렬 서열로 이루어진 생성 정렬은 다음과 같은 수의 서열을 포함하였다: ∼50,000개의 V 클래스; ∼10,000개의 C형; ∼10,000개의 I 클래스.
단계 #5. 중복되거나 유사한 서열의 제거.
본 출원인은 과소표시된 희귀 서열 및 서열 다양성의 결과적인 마스킹으로서 자주 관찰된 서열에 대해 치우치는 정렬을 예상하였다. 실시예의 경우, 본 출원인은 쥐과 및 인간 면역 글로불린 가변 도메인에 대한 V 클래스 Ig-폴드 서열 정렬 내 거대한 선입견을 예상하였다. 과대표적인 특정 서열 유형이 공변적 분석의 유용성을 제한하기 때문에, 여과 도구를 생성시켜 적용함으로써 정렬 중복성을 제거하였다. 이 도구는 신규한 발견 알고리즘을 사용하여 서로에게 >80% 동일한 서열을 발견하고, 정렬로부터 이들을 제거하였다. 간단히 말하면, 모든 서열 쌍에 대한 백분율 확인을 계산하였다. 이후 확인값은 백분율 확인의 빈(bin)으로 그룹화되었다(즉, 99% 빈, 98% 빈, 97% 빈 등). 각 빈의 환원 동안, 각 빈의 서열은 갭이 없는 잔기 카운트를 감소시킨 후 서열 중량(Henikoff S 및 Henikoff JG, J. Mol. Biol., (1994), 243: 184-199)에 의해 순위를 매겼다. 상기 단계 후, 각 정령 내 잔류하는 다수의 서열은 2,786개의 V 클래스; 1,587개의 I 클래스; 및 518개의 C형이었다.
단계 #6. 최종 정렬을 생성하기 위한 갭의 제거
최종 정렬에서, 서열을 찾는데 사용되는 HMM 프로파일에서 상태가 대응되지 않는 컬럼(HMMER 매뉴얼 참조)을 제거하였다. 따라서, 다수의 서열은 최종 정렬 길이보다 더 많은 아미노산을 함유하는 한편, 그 길이를 절단하여 정렬의 덜 정보적인 갭 영역 상의 계산을 피하였다. 정렬 내 최종 다수의 잔기(갭 포함)는 144개의 V 클래스, 60개의 I 클래스, 및 111개의 C형이었다.
D. 최종 정렬의 일반적 설명
a) V-클래스
최종 80% 필터를 적용한 후에, 2,786 V-클래스 서열을 다음 3가지 카테고리로 나눌 수 있다: (1) 다양한 면역글로불린의 VH 및 VL 도메인을 모두 포함하는 면역글로불린 가변 유전자 클래스, 49%; (2) 초가변 도메인을 포함하는 T-세포 수용체 V-클래스 유전자, 16%; 및 (3) 다른 V-클래스 유전자, 35%. 면역글로불린 V-클래스 유전자는 연골 어류로부터 영장류에 이르는 매우 다양한 종으로부터 유래한다. 인간 V-클래스 서열(1272 서열 중 537)로의 편향이 있었다. 그러나, 다른 척추동물 종은 오직 최소한으로만 나타내어졌다: 마우스(33), 소(5), 낙타(23), 라마(31), 마카쿠(17), 닭(6) 등. T 세포 수용체 서열 세트는 어류에서 영장류에 이르기까지 거의 다양하며, 인간 종으로의 편향을 포함하지 않았다. "다른" 카테고리는 다수의 다른 종류의 서열을 포함하며, 남은 서열 1∼2%를 포함하는 실제 하위카 테고리는 없었다. "다른" 카테고리는 척색 동물(주로), 연골 어류, 두족류 및 곤충을 포함한 종의 더 넓은 어레이를 포함하였다.
b) C-클래스
최종 80% 필터를 적용한 후에, 518 C-클래스 서열을 다음 3가지 카테고리로 나눌 수 있다: (1) 면역글로불린 불변 도메인, 44%; (2) MHC-형 Ig-폴드, 21%; 및 (3) 다른 C-클래스 Ig-폴드, 35%. 면역글로불린 불변 도메인 카태고리는 연골 어류에서 영장류에 이르는 다양한 서열을 포함하였다. C-클래스 면역글로불린 하위카테고리는 영장류 또는 심지어 포유류 서열에 의해 편향되지 않았다(3 인간 서열만이 필터링되지 않았다: IgE-CH4, 카파 CL, 및 람다 CL). MHC 하위카테고리는 연골 어류에서 영장류에 이르는 범위이며, 하나의 진화 그룹을 향한 편향은 거의 없었다. "다른" C-클래스 카테고리는 여러 미지 단백질, 각종 베타-2-마이크로글로불린의 매우 작은 하위카테고리, 및 하위카테고리에 상당하는 빈도로 관찰되지 않는 여러 다른 단백질을 포함하였다.
c) I-클래스
I-클래스는 임의의 분명한 하위카테고리를 가지지 않았다. 타이탄 또는 타이탄 유사 분자는 세포-유착 또는 세포-유착 유사 분자에서와 같이 일반적으로 나타났다.
E. 공변성 통계 계산
정렬내 모든 가능한 쌍의 아미노산 사이의 상관 강도(φ-값) 및 유의성(χ2- 값)은 당업계에 알려진 방법에 기초하여 계산하였지만, 하기의 변화를 포함하였다: 1) 특징적인 잔기 유형으로서 갭을 포함시켰고; (2) Henikoff 중량 측정법을 실시하지 않았으며; (3) 공변쌍을 필터링해내는 데 Sequence Average Identities(SAI)를 사용하지 않았고; (4) 빈도보다는 사건에 기초한 계수(발생수)를 이용하여 χ2 값을 계산하였으며; (5) 공변쌍은 최소수로 관찰되지 않으면 프로그램에 의해 보고되지 않았다. 2 주요부의 통계가 형성되었는데, 하나는 (더 작은 세트로서) 사건 컷오프가 10이고, 또 하나는 (더 큰 세트로서) 사건 컷오프가 6 사건이다. 임의의 주어진 서열 정렬에 대한 이들 매개변수를 계산하는 능력은 실행 가능한 Java로 코딩하고, Java Runtime Engine(JRE) 버젼 1.4.2로 테스트하였다.
정렬내 위치 수와 각 위치에서 총 23개의 가능한 잔기(갭, B, 및 Z 모호 잔기 포함)에 기초하여, C-클래스에 대해 240만 보정, I-클래스에 대해 70만 보정, V-클래스에 대해 410만 보정이 존재하였다. 도 75는 V-클래스에 대해 계산된 φ 값을 높은 χ2 유의성과 함께 보여준다. φ 값은 -1 내지 +1이다. 양의 φ가 0으로부터 (즉 +1을 향해) 이동함에 따라, 정렬 내 정해진 위치에서 2 아미노산 사이의 상관 강도(즉, 공변성)가 증가한다. φ가 -1을 향해 이동함에 따라 음의 상관(즉, 정렬내 한 위치에서 한 아미노산의 존재가 제2 위치에서 또 다른 특정 아미노산의 부재를 유도함)이 증가한다. 실제 공변수에 대한 컷오프는 다소 임의적이지만, >0.5의 φ값을 가지는 것들은 서로 강하게 상관된다. 따라서, 도 75에 따르면, C-클래스 내 가능한 240만 상관 중 370개만 강한 상관이다. 그러나, 0.3 이상의 상관은 중요한 것으로 보고된 바 있고, 3종 클래스 모두에 대해 관찰된 양의 상관수를 ~10배 증가시킨다. 이들 상관은 추가의 분석, 단백질 디자인 형성 또는 기능적 잔기 위치 예측을 위해 사용되는 매우 작지만, 중요한 데이타세트를 제공한다.
F. 공변성 통계의 인증
Ig-폴드 데이타베이스로부터 유도된 강한 공변성이 계산에 기초한 통계학적 강도와 별도로 유의적이고 의미가 있다는 것을 인증하는데 몇몇 기준이 사용되었다. 먼저, 서로 함께 변하는 잔기와 기지 구조의 Ig-폴드 내의 근접성 사이의 경향이 있는지를 분석하였다. 문헌에 제시된 이전 연구는 - 매우 약하다고 할지라도- 공변 위치와 서로에 대한 근접성 사이의 상관이 존재하지 않는다는 것을 입증하였으며, 이는 우리의 결과와 일치한다. 두번째 기준은 Ig-폴드 공변성 계산이 기지의 Ig-폴드 서브세트 내에 존재하는 것으로 이미 보고된 바 있는 아미노산 위치 사이의 알려진 연결을 형성하는지를 관찰하였다. 하나의 명백한 테스트 사례는 인간/뮤린 IgG 가변성 중쇄 폴드(V-클래스의 일부)의 N-말단에서의 테스트였다. 잔기 6-10은 아미노산의 공변쌍의 보존에 기초한 매우 특별한 구조를 채용하는 것으로 알려져 있다(Ewert S, et al., Methods, (2004), 24: 184-199). 3가지 보고된 아미노산 공변쌍 중 2개는 φ 값이 0.3 이상 - 겉보기 데이타세트 배경보다 높은 값을 가지는 것으로 확인되었다.
실시예 18. 통상적인 p5E8 scFv를 포함하는 PRIMATIZED®p5E8 4가 항체의 제조
PRIMATIZED®p5E8G1은 각각 인간 감마 1 및 카파 불변부에 융합된 마카쿠 중쇄 및 경쇄 가변부를 포함하는 키메라 마카쿠/인간(PRIMATIZED®) 모노클로날 항체 이다. PRIMATIZED®p5E8G1은 IgE (FcεRII)에 대한 저 친화도 수용체인 인간 CD23에 결합한다(Mavromatis and Cheson. 2003. J. Clin. Oncol. 21:1874; US 특허 출원 20030059424). 실시예 1 내지 8에 기재된 바와 유사한 방법을 이용하여 4가 PRIMATIZED®p5E8 항체를 구성하였다. 4가 항체를 구성하는데 사용된 PRIMATIZED®p5E8 scFv는 VL →(Gly4Ser)3 링커 → VH 방향의 짧은 링커에 의해 고정되는 p5E8 VL 및 VH 영역 서열로 이루어지며, 실시예 19에 더욱 상세히 설명되어 있다. 정확한 서열은 DNA 서열 분석으로 확인하였다. 플라스미드 DNA를 이용하여 항체 단백질의 안정한 생성을 위해 CHO DG44 세포를 형질전환시켰다. 도 80은 통상적인 scFv를 포함하는 중쇄 C-말단 4가 PRIMATIZED®p5E8 항체의 DNA 서열을 도시한다. 도 81은 통상적인 scFv를 포함하는 중쇄 C-말단 4가 PRIMATIZED®p5E8 항체의 아미노산 서열을 도시한다. 도 82A는 PRIMATIZED®p5E8 경쇄의 DNA 서열을 도시한다. 도 82B는PRIMATIZED®p5E8 경쇄의 아미노산 서열을 도시한다.
실시예 19. PRIMATIZED® p5E8 scFv 및 Fab 단백질의 제조
양방향(VL→(Gly4Ser)3 링커→VH (VL/VH) 및 VH→(Gly4Ser)3 링커→VL (VH/VL))의 PRIMATIZED®p5E8 scFv를 미국 특허 출원 20050163782에 개시된 플라스미드로부터 PCR 증폭시켜 서브클로닝하였다. 구성에 사용된 올리고뉴클레오티드는 표 22에 도시되어 있다.
PRIMATIZED p5E8 scFv(VL/VH)는, gpIII 리더 서열의 일부를 코딩하는 29개 염기와 이후 p5E8 N-말단 경쇄 가변 도메인 유전자에 상보성인 서열 15개 염기를 포함하는 정방향 프라이머 P5E8-VL01F와, p5E8 C-말단 중쇄 가변 도메인에 상보성인 서열 15개 염기와 이후 고유 인접 Sal I 엔도뉴클레아제 부위(엔도뉴클레아제 부위에는 밑줄로 표시되어 있음)를 포함하는 역방향 프라이머 P5E8-VH01R를 사용한 PCR로 구성하였다. 유사하게, PRIMATIZED p5E8 scFv(VH/VL)는, gpIII 리더 서열의 일부를 코딩하는 29개 염기와 이후 p5E8 N-말단 중쇄 가변 도메인 유전자에 상보성인 서열 18개 염기를 포함하는 정방향 프라이머 P5E8-VH01F와, p5E8 C-말단 경쇄 가변 도메인 유전자에 상보성인 서열 12개 염기와 이후 고유 인접 Sal I 엔도뉴클레아제 부위(엔도뉴클레아제 부위에는 밑줄로 표시되어 있음)를 포함하는 역방향 프라이머 P5E8-VL01R를 사용한 PCR로 구성하였다.
[표 22]
통상적인 PRIMATIZED®p5E8 scFv의 PCR 증폭용 올리고뉴클레오티드
Figure 112008072289549-pct00122
PCR 증폭 후에, 프라이머 P5E8-Leader01를 2차 PCR 반응을 위해 양 반응물에 첨가하였다. 프라이머 P5E8-Leader01는 고유의 Nde I 엔도뉴클레아제 부위와 이어 서 gpIII 리더 서열의 N-말단 부분을 코딩하는 25개 염기와, 이어서 P5E8-VL01F 및 P5E8-VH01F의 5' 말단에 상보적인 22개 염기를 포함하며, 다시 PCR 증폭시켰다. 예상 크기에 해당하는 PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 절제하고, 제조자의 지시에 따라 Millipore Ultrafree-DA 추출 키트(Millipore; 미국 매사츄세츠주 베드포드)를 사용하여 정제하였다. 이어서, 정제된 PCR 생성물을 Nde I 및 Sal I로 분해하고, 유도성 ara C 프로모터의 제어 하에 재조합 단백질 발현을 유도하도록 고안된 변형 이.콜라이 발현 벡터의 Nde I/Sal I부위로 클로닝하였다. 발현 벡터는 BHA10 scFv의 출발 코든과 중첩되는 고유 Nde I 부위를 코딩하는 변형을 포함하였다. 각각의 겔 정제된 PCR 산물로 개별적인 결찰 반응을 실시하고, 각 결찰 혼합물의 일부와 분해된 발현 벡터를 사용하여 이.콜라이 균주 XL1-Blue를 형질전환시켰다. 앰피실린 약물 내성 콜로니를 스크리닝하고, DNA 서열 분석으로 pIEH-162 구성체를 코딩하는 최종 p5E8(VH/VL) 및 pIEH-163 구성체를 코딩하는 p5E8(VL/VH)의 정확한 서열을 확인하였다. p5E8(VL/VH) scFv의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 도 83A 및 83B에 제시되어 있다. p5E8(VH/VL) scFv의 DNA 및 아미노산 서열은 각각 도 84A 및 84B에 제시되어 있다.
통상적인 p5E8 scFv의 발현을 위해서, 플라스미드 pIEH-162 및 pIEH-163으로 형질전환시킨 이.콜라이 균주 W3110(ATCC, 미국 버지니아주 마나사스, Cat. # 27325)의 새로 분리한 콜로니를 배양하고, 배양 상청액 또는 주변세포질 추출물을 실시예 4에 개시한 바와 같이 제조하였다.
PRIMATIZED®p5E8 Fab는 실시예 1에 개시된 방법에 따라 PRIMATIZED®p5E8 IgG의 효소 분해로 제조하였다. 정제된 Fab를 2∼11 ㎎/㎖로 농축하였다. Fab 농도는 ε280 nm = 1.5 ㎖ ㎎-1 cm-1를 이용하여 측정하였다.
실시예 20. 통상적인 p5E8 scFv 항체의 열 안정성
실시예 4 및 5에 개시된 열 자극 분석을 이용하여 얻은 T50 값과 DSC 분석(r2 = 0.93)으로 계산한 Tm 값 사이의 양호한 상관이 관찰되었기 때문에, 열 자극 분석을 이용하여 p5E8(VL/VH) 및 p5E8(VH/VL) scFv의 상대적 열 안정성을 평가하였다. 1 ㎍/㎖의 가용성 CD23 항원을 이용하여 플레이트를 코팅하고, Eu 표지된 항-6 His 항체(Perkin Elmer, 미국 매사츄세츠주 보스톤, Cat. # AD0109)의 농도를 250 ng/㎖로 증가시킨 것 외에는 실시예 4 및 5에 개시된 바와 같이 열 자극 분석을 이용하였다. 이 분석으로부터 얻은 결과는 p5E8(VL/VH)의 T50 값이 38℃이고, p5E8(VH/VL)의 T50 값이 34℃보다 약간 낮은 것으로 측정되었다(도 85). 양 scFv의 T50값이 현저히 낮고, 2개 중 p5E8(VL/VH)이 열 안정성이 약간 더 크다는 관찰 결과를 고려하여, p5E8(VL/VH)를 추가 안정성 공학을 위해 선택하였다.
실시예 21. 열 안정성이 향상된 p5E8 scFv 분자의 구성
실시예 3 및 5에 개시된 방법을 이용하여 통상적인 p5E8(VL/VH) scFv 중에 소정의 아미노산 변위를 포함하도록 고안한 개별 변이체 및 라이브러리를, 표 23에 열거된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이전에 개시된 바와 같이 형성하였다.
표 23에서, 각 올리고뉴클레오티드 명칭은 카뱃 번호매김 시스템에 따라 VH 또는 VL의 위치(들)에서의 아미노산 치환 기준을 제공한다. "이론적 해석"은 사용된 고안법을 의미한다. 상기 방법은 상기 실시예 5에 상세히 설명되어 있다. 돌연변이 잔기는 대문자로 제시되어 있다. VH/VL 이황화물 도입을 위한 올리고뉴클레오티드쌍은 박스로 표시한다. 약어는 다음과 같다: "COMP"- 컴퓨터 분석, "COVAR"- 공변성 분석, "CONS"- 공통 점수, "INTER-VH/VL"-인터페이스 디자인, "SS"- VH/VL 이황화 결합 및 "TBD"- 측정됨.
[표 23]
변이체 p5E8(VL/VH) scFv의 구성을 위한 올리고뉴클레오티드 및 이론적 해석
Figure 112008072289549-pct00123
Figure 112008072289549-pct00124
각 형질전환된 콜로니를 딥-웰 96 웰 디쉬로 꺼내고, 처리하고, 실시예 5에 상세히 설명된 방법에 따라 스크리닝하였다. 0.6% 글리신, 0.6% Triton X100, 0.02% 아라비노스 및 50 ㎍/㎖ 카르베니실린을 보충한 SB(Teknova, 미국 캘리포니 아주 하프 문 베이, Cat. # S0140)로 이루어진 발현 배지에서 37℃ 또는 32℃에서 형질전환체를 밤새 배양하였다.
열 자극 후에, 응집 물질을 원심분리로 제거하고, 실시예 3에 개시된 바와 같이 가용성 CD23 DELFIA에서 분석하였다. Spotfire DecisionSite 소프트웨어(Spotfire, 미국 매사츄세츠주 섬버빌)를 이용하여 분석 데이타를 처리하고, 각 클론에 있어서의 기준 온도에 대한 자극 온도에서 관찰된 DELFIA 계수의 비로서 데이타를 나타내었다. 어버이 플라스미드에 대해 관찰된 것의 2배 이상 큰 비율을 재현가능하게 나타내는 클론은 적중으로 간주하였다. 양성 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 미니-프렙(Wizard Plus, 미국 위스콘신주 매디슨의 Promega)으로 분리하고, DNA 서열 결정 뿐 아니라 2차 열 자극 분석 확인을 위해 이.콜라이 W3110으로 다시 재형질전환시켰다.
이들 분석으로 얻은 1차 및 확인 결과는 표 24에 제시되어 있다. 본 발명의 안정화된 scFv 분자 몇몇은 통상적인 p5E8 scFv과 비교하여 결합 활성(T50 >38℃)의 개선을 나타내었다. 특히, p5E8 라이브러리 위치 VH6(E6Q), 라이브러리 위치 VH49(S49G 및 S49A), 라이브러리 위치 VH43 (Q43K), 라이브러리 위치 VH72 (E72D 및 E72N), 및 라이브러리 위치 VH79 (F79S)의 T50 값은, 통상적인 p5E8 scFv과 비교하여 +4℃ 내지 +5℃ 범위의 열 안정성 증가를 나타내었다. p5E8 라이브러리 위치 VL50(V50D 및 V50S), 라이브러리 위치 VL75(V75I), 라이브러리 위치 VL80(P80S), 및 라이브러리 위치 VL83(F83A, F83G, F83S 및 F83T)의 T50 값은, 통상적인 p5E8 scFv과 비교하여 +3℃ 내지 +7℃ 범위의 열 안정성 증가를 나타내었다.
또한, p5E8 라이브러리 위치 VH32(N32S) 및 라이브러리 위치 VH79(F79Y)의 T50 값은, 통상적인 p5E8 scFv과 비교하여 +2℃의 열 안정성 증가를 나타내었다.
실시예 5에 개시된 고안법 분류를 이용하여 안정화 돌연변이를 확인하였다- VH6(E6Q), VL75(V75I), VL80(P80S) 및 VL83(F83A, F83G, F83S 및 F83T) 돌연변이는 컴퓨터 분석을 사용하여 유도하였고, VH32(N32S) 돌연변이는 공통 점수를 이용하여 유도하였으며, 4개의 돌연변이 VH49(S49G 및 S49A), VH43(Q43K), VH72(E72D 및 E72N), VH79(F79S 및 F79Y) 돌연변이는 공변성 분석을 사용하여 유도하였으며, VL50(V50D 및 V50S) 돌연변이는 VH/VL 인터페이스 분석을 이용하여 유도하였으며, 이들 고안 도구의 유용성 및 신규성을 입증하였다. VH43Q 및 VH32S 돌연변이와 VH49G, VH72D, 또는 VH49A 안정화 돌연변이를 조합하면, p5E8의 열 안정성(T50)을, 통상적인 p5E8 scFv와 비교하여 15℃ 증가인 최대 53℃까지 증가시켰다.
[표 24]
p5E8 VH 및 VL 라이브러리 위치, 라이브러리 조성 및 스크리닝 결과
Figure 112008072289549-pct00125
표 25는 종래의 scFv로 도입된 각종 개별 또는 조합 안정화 돌연변이의 포괄적인 열 안정성 분석 결과를 제시한다. 조합시 통상적인 p5E8 scFv와 비교하여 +10℃ 내지 +15℃ 범위의 안정성 증가를 나타내는 안정화 돌연변이를 확인하였다. 이들 결과는, 실시예 5에 유사하게 제시한 바와 같이, 활성 개선이 부가적이고, 본 발명에 개시된 방법이 방법의 일반적 유용성을 입증하는 제2 테스트 scFv의 열 안정성 특성을 향상시킬 수 있다는 것을 입증한다.
[표 25]
변이 단백질을 생성하는 데 사용된 p5E8 구성체의 특성규명 및 열 자극 분석으로부터의 T50 결과
Figure 112008072289549-pct00126
Figure 112008072289549-pct00127
실시예 22. 안정화된 p5E8 4가 항체의 제조
본 발명의 안정화된 p5E8 scFv를 사용하여 도 13에 도시된 바와 같은 구성과 유사한 N-말단 및 C-말단 scFv 융합체로서의 4가 항체를 구성한다.
A. N H -p5E8 4가 항체의 구성
실시예 21에 개시된 p5E8 scFv DNA를 사용하여 상기 실시예 7에 개시된 바와 유사한 NH-p5E8 4가 항체를 구성한다. (Gly4Ser)5 링커를 사용하여 p5E8 scFv를 PRIMATIZED®p5E8 IgG 중쇄의 성숙 아미노 말단에 연결한다. 분자 구성은 p5E8 scFv-(Gly4Ser)5 링커-PRIMATIZED®p5E8 IgG 중쇄이다. 이 분자를 경쇄와 조립하여 4가 항체를 형성한다. 정확한 서열은 DNA 서열 분석으로 확인할 수 있다. NH-p5E8 4가 항체의 정률증가 생성을 위해 실시예 8에 개시된 바와 같이 CHO 세포를 형질감염시키는데 상기 구성체를 사용할 수 있다. DELFIA 분석으로 고정 CD23 항원에 대한 결합에 대해서 형질감염된 CHO 세포를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 0.1 M 탄산나트륨 완충액 pH 9.5 중 1 ㎍/㎖로 가용성 CD23 항원으로 96-웰 플레이트(MaxiSorp, 미국 뉴욕주 로체스터 Nalge Nunc, Cat. # 437111)를 피복할 수 있다. 플레이트를 밤새 4℃에서 피복하고, 실온에서 진탕하면서 1시간 동안 DELFIA 분석 완충액(DAB, 10 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 20 mM EDTA, 0.5 % BSA, 0.02% Tween 20, 0.01% NaN3, pH 7.4)으로 차단한다. BSA(세척 완충액) 없이 DAB로 플레이트를 3회 세척하고, DAB 중에 희석된 테스트 샘플을 100 ㎕의 최종 부피로 플레이트에 첨가하였다. 실온에서 진탕하면서 1 시간 동안 플레이트를 항온처리하고, 세척 완충액으로 3회 세척하여 미결합 물질을 제거한다. 웰당 Eu-표지된 항-인간 항체(미국 매사츄세츠주 보스톤의 Perkin Elmer, Cat. # 1244-330) 250 ng/㎖를 함 유하는 DAB 100 ㎕를 첨가하여 결합된 항체를 검출하고, 1시간 동안 진탕하면서 실온에서 항온처리한다. 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, DELFIA 증강액(미국 매사츄세츠주 보스톤의 Perkin Elmer, Cat. # 4001-0010)을 웰당 100 ㎕ 첨가한다. 15분간 항온처리한 후에, Victor 2 플레이트 판독기(미국 매사츄세츠주 보스톤의 Perkin Elmer) 상에서 유로퓸 방법을 이용하여 플레이트를 판독한다.
B. C-p5E8 4가 항체의 구성
상기 실시예 21에 개시된 p5E8 scFv DNA를 사용하여 상기 실시예 7에 개시된 바와 같은 C-p5E8 4가 항체를 구성한다. Ser(Gly4Ser)3 링커 펩티드를 사용하여 p5E8 scFv를 PRIMATIZED®p5E8 IgG 중쇄의 카르복시 말단에 연결한다. 분자의 구조는 PRIMATIZED®p5E8 IgG 중쇄-Ser(Gly4Ser)3 링커-p5E8 scFv이다. 이 분자를 경쇄와 조립하여 4가 항체를 형성한다. 정확한 서열은 DNA 서열 분석으로 확인할 수 있다. C-p5E8 4가 항체의 정률증가 생성을 위해 실시예 8에 개시된 바와 같이 CHO 세포를 형질감염시키는데 상기 구성체를 사용할 수 있다. 상기 개시된 바와 같이 형질감염된 CHO 세포를 스크리닝할 수 있다.
등가물
당업자는 다만 일상적인 실험을 이용하여 본원에 개시된 발명의 특정 구체예에 대한 여러 등가물을 인식 또는 확인할 수 있다. 그러한 등가물은 하기 특허청구범위에 포함되는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> BIOGEN IDEC MA INC. <120> STABILIZED POLYPEPTIDE COMPOSITIONS <130> BGN-A242PC <140> PCT/US2007/006883 <141> 2007-03-19 <150> 11/725,970 <151> 2007-03-19 <150> 60/783,622 <151> 2006-03-17 <150> 60/812,688 <151> 2006-06-09 <150> 60/873,502 <151> 2006-12-08 <150> 60/873,996 <151> 2006-12-08 <160> 161 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 cagtagcatg caggtccaac tggtgcag 28 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 gttctagaaa gcttttgtcg tcgtcgtctt tgatctccac cttggtaccc tg 52 <210> 3 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 3 caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120 cctggacagg gacttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180 aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300 gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg tgggggcgga 360 tctgggggcg gcggatccgg tggtggtggt agtgacattc agatgaccca gtctcctagc 420 tccctgtccg cctcagtagg agacagggtc accatcacct gcaaggccag tcagaatgtg 480 ggtattaatg tagcctggta tcaacagaaa ccagggaagg ctcctaaatc actgatttcc 540 tcggcctcct accggtacag tggagtccct tccagattca gcggcagtgg atctgggaca 600 gatttcactc tcaccatcag cagcctccag cctgaagact tcgcaaccta tttctgtcag 660 caatatgaca cctatccatt cacgttcggc cagggtacca aggtggagat caaa 714 <210> 4 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 130 135 140 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val 145 150 155 160 Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 165 170 175 Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg 180 185 190 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 195 200 205 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr 210 215 220 Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 gcaggcccct ggacagtgcc ttgagtggat gggatg 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 catcccatcc actcaaggca ctgtccaggg gcctgc 36 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 cctatccatt cacgttcggc tgcggtacca aggtggagat c 41 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 gatctccacc ttggtaccgc agccgaacgt gaatggatag g 41 <210> 9 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 9 caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120 cctggacagt gccttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180 aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300 gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg tgggggcgga 360 tctgggggcg gcggatccgg tggtggtggt agtgacattc agatgaccca gtctcctagc 420 tccctgtccg cctcagtagg agacagggtc accatcacct gcaaggccag tcagaatgtg 480 ggtattaatg tagcctggta tcaacagaaa ccagggaagg ctcctaaatc actgatttcc 540 tcggcctcct accggtacag tggagtccct tccagattca gcggcagtgg atctgggaca 600 gatttcactc tcaccatcag cagcctccag cctgaagact tcgcaaccta tttctgtcag 660 caatatgaca cctatccatt cacgttcggc tgcggtacca aggtggagat caaa 714 <210> 10 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 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gtggagggtc cggtgggggc ggatctgggg 60 gcggcggatc cggtggtggt ggtag 85 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 ttttgttcta gaaaactttt gtcgtcg 27 <210> 13 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 aagggaccac ggtcaccgtc tcctcaggag ggggcggttc aggcggtgga gggtccggtg 60 ggggcggatc tgggggcggc ggatc 85 <210> 14 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 14 caggtccaac tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cactttcaca acctactatt tgcactgggt gaggcaggcc 120 cctggacagg gacttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180 aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300 gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg cggtggaggg 360 tccggtgggg gcggatctgg gggcggcgga tccggtggtg gtggtagtga cattcagatg 420 acccagtctc ctagctccct gtccgcctca gtaggagaca gggtcaccat cacctgcaag 480 gccagtcaga atgtgggtat taatgtagcc tggtatcaac agaaaccagg gaaggctcct 540 aaatcactga tttcctcggc ctcctaccgg tacagtggag tcccttccag attcagcggc 600 agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tccagcctga agacttcgca 660 acctatttct gtcagcaata tgacacctat ccattcacgt tcggccaggg taccaaggtg 720 gagatcaaa 729 <210> 15 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 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cctggacagg gacttgagtg gatgggatgg atttatcctg gaaatgttca tgctcagtac 180 aatgagaagt tcaagggcag ggtcacaatc actgcagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggagctca gcagcctgag gtctgaagat actgcggtct attactgtgc aagatcctgg 300 gaaggttttc cttactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctcagg agggggcggt 360 tcaggcggtg gagggtccgg tgggggcgga tctgggggcg gcggatccgg tggtggtggt 420 agtgacattc agatgaccca gtctcctagc tccctgtccg cctcagtagg agacagggtc 480 accatcacct gcaaggccag tcagaatgtg ggtattaatg tagcctggta tcaacagaaa 540 ccagggaagg ctcctaaatc actgatttcc tcggcctcct accggtacag tggagtccct 600 tccagattca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctccag 660 cctgaagact tcgcaaccta tttctgtcag caatatgaca cctatccatt cacgttcggc 720 cagggtacca aggtggagat caaa 744 <210> 17 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 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23 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser 20 25 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 25 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 atgaaaaaac tgctgttcgc gattccgctg gtggtgccgt tctatagcca tagt 54 <210> 26 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser 1 5 10 15 His Ser <210> 27 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 gacgacgacg acaaaagctt tctagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc 60 gccgtcgacc atcatcatca tcatcattga 90 <210> 28 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 28 caacttgtgc tcactcagtc atcttcagtc tctttctccc tgggagcctc agcaaaactc 60 acgtgcacct tgagtagtca gcacagtacg tacaccattg aatggtatca gcaacagccc 120 ctcaagcctc ctaagtatgt gatggagctt aagaaagatg gaagccacag cacaggtgat 180 gggattcctg atcgcttctc tggatccagc tctggtgctg atcgctacct tagcatttcc 240 aacatccagc ctgaagatga agcaatatac atctgtggtg tgggtgatac aattaaggaa 300 caatttgtgt atgttttcgg cggtggaacc aaggtcgaaa tcaaacgtac ggtggctgca 360 ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt 420 gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac 480 gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc 540 tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac 600 gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga 660 gagtgttga 669 <210> 29 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 29 Gln Leu Val Leu Thr 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aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1620 ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1680 cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1740 aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1800 accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1860 cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1920 agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1980 cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 2040 agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2100 cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggttga 2139 <210> 31 <211> 712 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln 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construct <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 145 150 155 160 Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu 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tacagtggag tcccttccag attcagcggc 600 agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcc tccagcctga agacttcgca 660 acctatttct gtcagcaata tgacacctat ccattcacgt tcggctgcgg taccaaggtg 720 gagatcaaag gcggtggagg gtccggtgga gggggctctg gagggggcgg ttcagggggc 780 ggtggatcgg ggggaggtgg ctcccagatc cagttggtgc agtctggacc tgagctgaag 840 aagcctggag agacagtcaa gatctcctgc aaggcttctg gttttacctt cacagactat 900 tcaatacact gggtgaaaca ggctccagga aagggtttaa agtggatggg ctggataaac 960 actgagactg gtgagccaac atatacagat gacttcaagg gacgatttgc cttctctttg 1020 gtgacctctg ccaccactgc ctatttgcag atcaacaacc tcaacaatga ggacacggct 1080 acatttttct gtgctagatt catctatgat ccttattggg ggtttgctta ctggggccag 1140 gggactctgg tcactgtctc cgcagctagc accaagggcc catcggtctt ccccctggca 1200 ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca gcggccctgg gctgcctggt caaggactac 1260 ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc 1320 ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc 1380 tccagcagct tgggcaccca gacctacatc tgcaacgtga 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<400> 37 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys 145 150 155 160 Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile 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<211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 gttaacggat cctcatttga tctccacctt gg 32 <210> 42 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc tccggcggtg gcgggtcc 48 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 44 <211> 2115 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 44 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggttt taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaaacaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180 acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300 tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc 1380 tccggcggtg gcgggtccca ggtccaactg gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 1440 gggtcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct tctggctaca ctttcacaac ctactatttg 1500 cactgggtga ggcaggcccc tggacaggga cttgagtgga tgggatggat ttatcctgga 1560 aatgttcatg ctcagtacaa tgagaagttc aagggcaggg tcacaatcac tgcagacaaa 1620 tccaccagca cagcctacat ggagctcagc agcctgaggt ctgaagatac tgcggtctat 1680 tactgtgcaa gatcctggga aggttttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1740 tcctcaggtg ggggcggatc tgggggcggc gggtccggtg gtggtggtag tgacattcag 1800 atgacccagt ctcctagctc cctgtccgcc tcagtaggag acagggtcac catcacctgc 1860 aaggccagtc agaatgtggg tattaatgta gcctggtatc aacagaaacc agggaaggct 1920 cctaaatcac tgatttcctc ggcctcctac 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ataaacactg agactggtga gccaacatat 180 acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300 tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc 1380 tccggcggtg gcgggtccca ggtccaactg gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 1440 gggtcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct tctggctaca ctttcacaac ctactatttg 1500 cactgggtga ggcaggcccc tggacaggga cttgagtgga tgggatggat ttatcctgga 1560 aatgttcatg ctcagtacaa tgagaagttc aagggcaggg tcacaatcac tgcagacaaa 1620 tccaccagca cagcctacat ggagctcagc agcctgaggt ctgaagatac tgcggtctat 1680 tactgtgcaa gatcctggga aggttttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1740 tcctcaggcg gtggagggtc cggtgggggc ggatctgggg gcggcgggtc cggtggtggt 1800 ggtagtgaca ttcagatgac ccagtctcct agctccctgt ccgcctcagt aggagacagg 1860 gtcaccatca cctgcaaggc cagtcagaat gtgggtatta atgtagcctg gtatcaacag 1920 aaaccaggga aggctcctaa atcactgatt tcctcggcct cctaccggta cagtggagtc 1980 ccttccagat tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctc 2040 cagcctgaag acttcgcaac ctatttctgt cagcaatatg acacctatcc attcacgttc 2100 ggccagggta ccaaggtgga gatcaaatga 2130 <210> 47 <211> 709 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 47 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Ile Tyr Asp Pro Tyr Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 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cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggttt taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaaacaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180 acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300 tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc 1380 tccggcggtg gcgggtccca ggtccaactg gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 1440 gggtcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct tctggctaca ctttcacaac ctactatttg 1500 cactgggtga ggcaggcccc tggacagtgc cttgagtgga tgggatggat ttatcctgga 1560 aatgttcatg ctcagtacaa tgagaagttc aagggcaggg tcacaatcac tgcagacaaa 1620 tccaccagca cagcctacat ggagctcagc agcctgaggt ctgaagatac tgcggtctat 1680 tactgtgcaa gatcctggga aggttttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1740 tcctcaggtg ggggcggatc tgggggcggc gggtccggtg gtggtggtag tgacattcag 1800 atgacccagt ctcctagctc cctgtccgcc tcagtaggag acagggtcac catcacctgc 1860 aaggccagtc agaatgtggg tattaatgta gcctggtatc aacagaaacc agggaaggct 1920 cctaaatcac tgatttcctc ggcctcctac cggtacagtg gagtcccttc cagattcagc 1980 ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gcctccagcc tgaagacttc 2040 gcaacctatt tctgtcagca atatgacacc tatccattca cgttcggctg cggtaccaag 2100 gtggagatca aatga 2115 <210> 49 <211> 704 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 49 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 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<211> 2130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 50 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggttt taccttcaca gactattcaa tacactgggt gaaacaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180 acagatgact tcaagggacg atttgccttc tctttggtga cctctgccac cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa caatgaggac acggctacat ttttctgtgc tagattcatc 300 tatgatcctt attgggggtt tgcttactgg ggccagggga ctctggtcac tgtctccgca 360 gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc 1380 tccggcggtg gcgggtccca ggtccaactg gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 1440 gggtcctcag tgaaggtgtc ctgcaaggct tctggctaca ctttcacaac ctactatttg 1500 cactgggtga ggcaggcccc tggacagtgc cttgagtgga tgggatggat ttatcctgga 1560 aatgttcatg ctcagtacaa tgagaagttc aagggcaggg tcacaatcac tgcagacaaa 1620 tccaccagca cagcctacat ggagctcagc agcctgaggt ctgaagatac tgcggtctat 1680 tactgtgcaa gatcctggga aggttttcct tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1740 tcctcaggcg gtggagggtc cggtgggggc ggatctgggg gcggcgggtc cggtggtggt 1800 ggtagtgaca ttcagatgac ccagtctcct agctccctgt ccgcctcagt aggagacagg 1860 gtcaccatca cctgcaaggc cagtcagaat gtgggtatta atgtagcctg gtatcaacag 1920 aaaccaggga aggctcctaa atcactgatt tcctcggcct cctaccggta cagtggagtc 1980 ccttccagat tcagcggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagcctc 2040 cagcctgaag acttcgcaac ctatttctgt cagcaatatg acacctatcc attcacgttc 2100 ggctgcggta ccaaggtgga gatcaaatga 2130 <210> 51 <211> 709 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 51 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn 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acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tccggcgggg gtggatccgg tggagggggc 1380 tccggcggtg gcgggtccca ggtccaactg gtgcagtctg gagctgaggt gaagaagcct 1440 ggggagtcag tgaaggtgtc 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic construct <400> 55 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Thr Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Val Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Asn Asn Glu Asp Thr Ala Thr Phe Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Ile Tyr Asp Pro Tyr Trp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser 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His 290 <210> 139 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 139 Val Lys Leu Thr Val Ser Gln Gly Gln Pro Val Lys Leu Asn Cys Ser 1 5 10 15 Val Glu Gly Glu Glu Pro Asp Ile Gln Trp Val Lys Asp Gly Ala Val 20 25 30 Val <210> 140 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 140 Gln Val Leu Gln Ser Val Ala Gly Gln Thr Leu Thr Val Arg Cys Gln 1 5 10 15 Tyr Pro Pro Thr Gly Ser Leu Tyr Glu Lys Lys Gly Trp Cys Lys Glu 20 25 30 Ala Ser Ala Leu Val Cys Ile Arg Leu Val Thr Ser 35 40 <210> 141 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 141 Leu Lys Ile Gln Ala Tyr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Gln 1 5 10 15 Ala Asn Ser Gln Asn Gln Ser Leu Ser Glu Leu Val Val Phe Trp Gln 20 25 30 Asp Gln Glu Asn Leu Val Leu Asn Glu Val 35 40 <210> 142 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 142 Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val Arg Val Val Gly Thr Glu 1 5 10 15 Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr Asp Gly Pro Ser Glu Gln 20 25 30 Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly Ser Ser Phe Val Glu Leu 35 40 45 Ala Ser Thr 50 <210> 143 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 143 Ala Leu Thr Gln Gln Asp Gly Gly Met Ser Val Ala Glu Gly Gln Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Cys Gly Ala Thr Leu Gly Gly Pro Asn Leu Ser Val 20 25 30 Val Trp Val Ser Pro Arg Gln Glu Asp Leu Val Ala 35 40 <210> 144 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 144 Ser Leu Arg Val Ser Pro Lys Asn Pro Arg Val Pro Lys Ser His Thr 1 5 10 15 Leu Glu Leu His Cys Glu Ser Gln Cys Asp Ser His Leu Lys Tyr Ser 20 25 30 Leu Lys Leu Ser Trp Ser Lys Asp Gly Glu Ala Phe Glu 35 40 45 <210> 145 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 145 Val Val Pro Thr Val His Arg Asn Val Thr Val Ser Arg Gly Glu Pro 1 5 10 15 Val Thr Leu Asn Cys Ser Ile Asn Met Thr Asn Ile Thr Gln Ile Ser 20 25 30 Trp Arg Lys Asp Thr Leu Ile Phe Val Tyr Leu Ala 35 40 <210> 146 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 146 His Gln Gln Gln Ile Gly Val Glu Gly Lys Glu Val Ile Leu Asn Cys 1 5 10 15 Lys Thr His Asp Lys Asp Val Thr Trp Lys Tyr Lys Tyr Asp Thr Gly 20 25 30 Ser Ala Ile Ile Ile Ile Gln 35 <210> 147 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 147 Val Ala Ser Gln Gly Gly His Val Glu Ser Val Tyr Leu Tyr Gly Thr 1 5 10 15 Val Glu Leu Pro Cys Glu Phe Pro Phe Val Thr Gly Pro Gln Asp Leu 20 25 30 Val Met Thr Trp Leu Lys Val Val Gln Asp Ser Glu Asn Val Val Val 35 40 45 His Ser Tyr 50 <210> 148 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 148 Thr Ile Thr Ala Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr Gly Ser Asn 1 5 10 15 Val Thr Met Glu Cys Arg Phe Pro Val Glu Arg Glu Asp Leu Leu Ala 20 25 30 Leu Val Val Tyr Trp Glu Lys Glu Asp Glu Gln Val Ile Gln Phe Val 35 40 45 Ala Gly Glu 50 <210> 149 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 149 Lys Ile Glu Ala Pro Val Asn Val Ile Val Gln Arg Gly Leu Cys Val 1 5 10 15 Leu Ile Pro Cys Asn Phe Thr Val Gly Pro Lys Tyr Asn Leu Thr Lys 20 25 30 Asp Ala Ile Gly Ile Trp Tyr Lys Gly His Pro Asn Asp Pro Val Ala 35 40 45 Ala Ser 50 <210> 150 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 150 Gln Gly Ala Val Pro Glu Glu Leu His Lys His Pro Gly Gln Thr Leu 1 5 10 15 Leu Leu Gln Cys Gln Tyr Ser Pro Lys Arg Gly Pro Tyr Gln Pro Lys 20 25 30 Ser Trp Cys Gln Gln Thr Ser Pro Ser Arg Cys Thr Leu Leu Val Thr 35 40 45 Ser <210> 151 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 151 Ser Leu Ser Asp Ser Val Ser Ser Ala Val Leu Gly Ser Ser Ala Lys 1 5 10 15 Leu Ile Cys Gln Phe Thr Pro Val Val Asp Ala Lys Asn Val Glu Ile 20 25 30 Arg Trp Phe Thr Arg Ser Phe Arg Pro Tyr Val His Gln Tyr 35 40 45 <210> 152 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 152 Val Gly Thr Gln Arg Pro Ile Glu Leu His Leu Gly Glu Leu Arg Gly 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Pro Cys Pro Pro Gly Asp Ser Trp Gly Gly Thr Arg 20 25 30 Arg Leu Trp Cys Arg Val Gly Arg Ser Arg Cys Ile Leu Ile Ala Asp 35 40 45 Thr <210> 153 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 153 Gln Leu Val Pro Val Pro Asn Val Thr Val Ser Pro Gly Glu Thr Ala 1 5 10 15 Ile Leu Ser Cys Leu Val Leu Ser Glu Ala Pro Tyr Asn Leu Thr Trp 20 25 30 Val Arg Asp Trp Arg Val Leu 35 <210> 154 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 154 Met Val Glu Gln Met Asp Asn Lys Thr Val Val Ser Gly Lys Pro Val 1 5 10 15 Thr Phe Leu Cys Asn Tyr Ile Leu Ser Met Arg Val Arg Gln Val Leu 20 25 30 Trp Lys Lys Thr Ala Glu Gln Gly Asp Thr Ala Ile Val Ala Ser 35 40 45 <210> 155 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 155 Ser Gln Met Val Ser Glu Pro Gly Lys Asn Ile Thr Leu Thr Cys Glu 1 5 10 15 Pro Arg Glu Asn His Leu Leu Glu Glu Val Ser Trp Glu Lys Ile Gln 20 25 30 Pro Gln Gln Ile Asp Leu Leu Ile Ser Cys 35 40 <210> 156 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(10) <223> Region may or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(15) <223> Region may 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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 158 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Suc-beta-Ala <400> 158 Ala Leu Ala Leu 1 <210> 159 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 5xHis tag <400> 159 His His His His His 1 5 <210> 160 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (16)..(20) <223> Region may or may not be present <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(25) <223> Region may or may not be present <400> 160 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 161 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 161 Ser Gly Gly Gly 1

Claims (60)

  1. 후보 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인 유래의 안정화된 VH 도메인 및 안정화된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 고안하는 방법으로서,
    (a) 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리 단백질에 속하는 아미노산 서열의 큐레이팅된 기준 세트를 제공하는 단계;
    (b) 기준 세트의 아미노산 서열을 정렬하여 정렬 세트를 형성하는 단계;
    (c) 정렬 세트에서 2 이상의 아미노산 위치 사이의 공변을 계산하여 공변 데이터세트를 생성하는 단계;
    (d) 후보 항체의 VH 도메인 또는 후보 항체의 VL 도메인에서 비공변 아미노산을 동정하는 단계로서, 상기 비공변 아미노산은 공변 데이타세트 내의 1 이상의 공변을 만족하지 못하는 것인 단계; 및
    (e) 상기 후보 항체의 VH 도메인 또는 후보 항체의 VL 도메인 내의 1 이상의 상기 비공변 아미노산을 정렬 세트 내의 상응하는 아미노산 위치에서 발견되는, 공변 데이타세트 내의 공변을 만족하는 아미노산으로 치환하여, 향상된 생물물리학적 성질을 갖는 안정화된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 단계로서, 상기 생물물리학적 성질은 열 안정성, pH 언폴딩 프로파일, 글리코실화의 안정한 제거, 용해성, 생물화학적 기능 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안정화된 VH 도메인 및 안정화된 VL 도메인을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 도메인 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 비인간 단클론성 항체, 키메라 항체, 이중특이적 항체, scFv 분자, scFv 함유 항체, 도메인-결실 항체 및 상기 항체 단편의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, (c)의 공변 데이터세트 내 아미노산은 디술피드 결합, 염 브리지, 리간드 결합 포켓 또는 표면의 일부, 반데르발스 상호작용의 네트워크, 수소 결합 상호작용의 네트워크, 전하-전하 상호작용의 네트워크 및 이들의 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조적 특성의 일부인 방법.
  4. 제1항에 있어서, (b)의 정렬 세트 내 아미노산 서열은 상기 정렬 세트 내 다른 서열과의 서열 동일성이 95% 미만인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열의 큐레이팅된 기준 세트의 구축은
    (a) Ig-폴드 구조 세트를 수집하는 단계로서, 상기 구조는 V-클래스 폴드, I-클래스 폴드, C1-클래스 폴드, C2-클래스 폴드 및 이들의 조합으로 이루어진 Ig 폴드 클래스의 군으로부터 선택되는 Ig 폴드를 포함하는 단계;
    (b) 파단부(breaks), 100% 서열 동일성, 이상(aberrant) 길이, 또는 미스폴딩 토폴로지를 나타내는 서열을 포함하는 Ig 폴드 구조를 버림으로써 Ig 폴드 구조 세트를 필터링하는 단계;
    (c) 구조 정렬을 구축하는 단계로서, 필터링된 Ig 폴드 구조 세트를 상호 중첩시키는 단계;
    (d) 구조 정렬로부터 서열 정렬을 얻는 단계로서, 하나의 구조의 서열로부터의 아미노산은 폴리펩티드 골격의 α-탄소들 사이의 최단 거리에 기초하여 제2 구조의 서열로부터의 아미노산에 매칭되는 것인 단계;
    (e) 상기 Ig 폴드 클래스 중 하나에 대한 구조 기반의 서열에 기초하여, 히든 마르코프 모델(Hidden Markov Models; HMMs)을 구축하는 단계;
    (f) 상기 Ig 폴드 클래스에 특이적인 HMM 중 1 이상을 사용하여 단백질 서열 데이터베이스를 검색하는 단계로서, HMM에 매칭되는 데이터베이스 내 서열을 수집하는 단계; 및
    (g) 단백질 도메인의 주석(annotated) 데이터베이스를 사용하는 (f)에서 수집된 단백질 서열의 Ig 폴드 클래스 할당을 확인하는 단계로서, (f)에서 발견된 후보 Ig 폴드 단백질 서열은 상기 단백질 도메인의 주석 데이터베이스 내 Ig 폴드 클래스에의 할당이 통계학적으로 유의적인 경우에만 유지되는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    (aa) (b)에서 얻어진 상기 서열 정렬로부터 중복되는 아미노산 서열을 한도 기준에 따라 제거하는 단계; 및
    (bb) HMM 프로파일에서 매칭 상태가 아닌 정렬에서 열을 제거하는 단계
    를 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, (c)의 계산은 (i) 특징적인 아미노산 유형인 갭 동정; (ii) 헤니코프(Henikoff) 다양성 가중(diversity weighing) 함수가 아닌 가중 함수; (iii) 공변쌍에 대한 필터링 함수로서, 상기 함수가 서열 평균 일치도(SAI: Sequence Average Identities)를 사용하지 않는 것인 필터링 함수; 또는 (iv) 사건 컷오프로서, 공변쌍은 최소 횟수로 관찰되지 않으면 보고되지 않고, 사건 컷오프는 2 이상의 사건인 사건 컷오프; 및 (v) 이들 특징 중 2 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 특징을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, (c)의 공변 계산은 x2 해석을 이용한 공변의 통계학적 유의성의 계산을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, x2의 값은 사건 기반의 계산식을 이용하여 계산되는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 사건 기반의 계산식은
    Figure 112014029242637-pct00254
    이고, 상기 식에서,
    p(i) 및 p(j)는 정렬된 서열 세트 내 각기 위치 i 및 j에서의 임의의 두 관심 아미노산 유형의 아미노산 빈도이고;
    c(i,j)는 p(i) 및 p(j)가 동일한 서열에서 관찰되는 횟수이며;
    c(t)는 정렬 내 총 서열의 수이며;
    아미노산 빈도는 아미노산 유형이 정렬 내 특이적 위치에서 관찰되는 횟수를 정렬 내 서열의 총 수로 나눈 값으로 정의되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, (c)의 공변 계산은 하기 식을 이용하여 행해지는 상관계수(φ)의 계산을 포함하는 방법:
    Figure 112014029242637-pct00255
    상기 식에서,
    aibj는 a 또는 b 유형의 아미노산이 각기 위치 i 및 j에서 동일한 서열 내 발견되는 횟수이고;
    Figure 112014029242637-pct00256
    는 양 아미노산 유형이 동일한 서열 내에서 부재하는 횟수이며;
    Figure 112014029242637-pct00257
    는 a 유형 아미노산은 존재하나 b 유형 아미노산은 부재하는 횟수이고;
    Figure 112014029242637-pct00258
    는 a 유형 아미노산은 부재하나 b 유형 아미노산은 존재하는 횟수이며;
    상관계수 (φ)는 공변의 통계학적 강도를 측정한다.
  12. 제1항에 있어서, 공변 계산은 역치 x2 값 또는 φ 값 이상 또는 이하의 공변에 대해서만 공변 스코어를 형성하는 것을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 후보 서열의 아미노산 위치는 상관계수 φ가 +0.25 내지 +1.0인 양의 공변에 대하여 양의 공변 스코어로 할당되는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 후보 서열의 아미노산 위치는 상관계수 φ가 -0.25 내지 -1.0인 음의 공변에 대하여 음의 공변 스코어로 할당되는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    (aa) 주형 항체의 VH 또는 VL 도메인 및 후보 항체의 VH 또는 VL 도메인의 구조 모델을 제공하는 단계;
    (bb) 주형 항체의 VH 또는 VL 도메인 중 안정성에 중요한 단백질-단백질 계면 아미노산을 동정하는 단계;
    (cc) (bb)의 계면 아미노산과 공변하는 골격 아미노산을 동정하는 단계;
    (dd) 후보 항체의 VH 또는 VL 도메인 중 1 이상의 계면 아미노산 또는 골격 아미노산을, (bb) 및 (cc)에서 동정된 상응하는 계면 아미노산 또는 골격 아미노산으로 치환하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 주형 항체의 VH 또는 VL 도메인은 Ig 수퍼패밀리 폴드를 포함하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 단백질-단백질 계면 아미노산은 후보 항체의 VH 또는 VL 도메인의 VH/VL 계면에 위치하는 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    (1) 후보 항체의 VH 또는 VL 도메인의 1 이상의 아미노산 위치에 대한 일치(consensus) 기반 스코어를 계산하는 단계; 및
    (2) 일치 기반 스코어 및 공변 데이터의 조합을 기초로, 후보 항체의 VH 또는 VL 도메인을 안정화한다고 예측되는 아미노산 치환을 선택하는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 일치 기반 스코어 계산은
    (i) 면역글로불린 수퍼패밀리에 속하는 폴리펩티드 서열의 큐레이팅된 기준 세트를 제공하는 단계;
    (ii) 기준 세트 서열을 정렬하여 정렬 세트를 형성하는 단계; 및
    (iii) 후보 VH 또는 VL 도메인 내의 각 아미노산 위치에 대하여 시험 아미노산 빈도를 계산하는 단계로서, 상기 빈도는 상기 아미노산 위치에서의 아미노산이 상기 정렬 세트에서 상응하는 위치에 존재하는 횟수를 합계하고, 그 합계 값을 기준 세트 내의 서열의 총 수로 나누어 계산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    (a) 서열 내의 각 위치에서의 아미노산이 정렬 세트의 그 위치에서 가장 일반적인 아미노산에 해당하는 일치 서열을 계산하는 단계;
    (b) 일치 폴리펩티드 서열 내의 각 아미노산 위치에 대하여 일치 아미노산 빈도를 계산하는 단계로서, 상기 빈도는 상기 아미노산 위치에서의 아미노산이 상기 정렬 세트에서 상응하는 위치에 존재하는 횟수를 합계하고, 그 합계 값을 기준 세트 내의 서열의 총 수로 나누어 계산하는 단계; 및
    (c) 시험 아미노산 빈도를 상기 일치 아미노산 빈도로 나누어 일치 스코어를 얻는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US7973140B2 (en) 2004-12-21 2011-07-05 Medimmune Limited Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
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NZ591252A (en) * 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
EP2059533B1 (en) 2006-08-30 2012-11-14 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
CA2677073C (en) * 2007-01-30 2016-03-15 Epivax, Inc. Regulatory t cell epitopes, compositions and uses thereof
EP3492488A1 (en) 2007-08-22 2019-06-05 The Regents of The University of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
US20090130105A1 (en) * 2007-08-28 2009-05-21 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
DK2202245T3 (en) 2007-09-26 2016-11-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd A method of modifying an antibody isoelectric point VIA amino acid substitution in CDR
JP5592792B2 (ja) 2007-09-26 2014-09-17 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 二重特異性抗体の融合体
WO2009043051A2 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
EP2245066A2 (en) * 2008-01-22 2010-11-03 Biogen Idec MA Inc. Ron antibodies and uses thereof
AU2009209251B8 (en) * 2008-01-28 2015-03-26 Medimmune Limited Stabilized Angiopoietin-2 antibodies and uses thereof
WO2009114591A1 (en) * 2008-03-11 2009-09-17 Smithkline Beecham Corporation Method and apparatus for screening drugs for predictors of quantitatively measured events
EP3056513A1 (en) 2008-04-11 2016-08-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to two or more antigen molecules repeatedly
KR20110014607A (ko) * 2008-04-29 2011-02-11 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
EP2297209A4 (en) * 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
KR20110016959A (ko) * 2008-06-03 2011-02-18 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
CN102149825B (zh) * 2008-07-08 2015-07-22 Abbvie公司 前列腺素e2双重可变结构域免疫球蛋白及其用途
WO2010008690A1 (en) * 2008-07-14 2010-01-21 Uchicago Argonne, Llc Methods for systematic control of protein stability
PE20150222A1 (es) 2008-09-03 2015-03-02 Genentech Inc Anticuerpos multiespecificos
WO2010035012A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Ucb Pharma S.A. Biological products
ES2434850T3 (es) * 2008-09-30 2013-12-17 Abbvie Inc. Método mejorado de presentación de ARN
KR20170091801A (ko) * 2008-10-02 2017-08-09 압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨 Ｃｄ86 길항제 다중-표적 결합 단백질
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
AU2010203353B2 (en) 2009-01-12 2016-06-16 Cytomx Therapeutics, Inc Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
EP2398494A4 (en) 2009-02-23 2015-10-28 Cytomx Therapeutics Inc Proproteins and their methods of use
US20120121591A1 (en) 2009-03-20 2012-05-17 Amgen Inc. SELECTIVE AND POTENT PEPTIDE INHIBITORS OF Kv1.3
US8569460B2 (en) * 2009-03-25 2013-10-29 Vet Therapeutics, Inc. Antibody constant domain regions and uses thereof
US10574623B2 (en) * 2009-03-30 2020-02-25 Avaya Inc. System and method for graphically managing a communication session with a context based contact set
WO2010112194A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen-binding polypeptides and multispecific antibodies comprising them
CN102369215B (zh) 2009-04-02 2015-01-21 罗切格利卡特公司 包含全长抗体和单链Fab片段的多特异性抗体
KR20110124368A (ko) 2009-04-07 2011-11-16 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항―ｅｒｂｂ―２／항―ｃ―ｍｅｔ 항체
WO2010115552A1 (en) 2009-04-07 2010-10-14 Roche Glycart Ag Bispecific anti-erbb-3/anti-c-met antibodies
BRPI1010297A2 (pt) 2009-04-07 2017-06-06 Roche Glycart Ag anticorpos biespecíficos trivalentes.
TW201100543A (en) 2009-05-27 2011-01-01 Hoffmann La Roche Tri-or tetraspecific antibodies
EP2435478A1 (en) * 2009-05-28 2012-04-04 Glaxo Group Limited Antigen-binding proteins
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
TW201119673A (en) * 2009-09-01 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
BR112012005893A2 (pt) 2009-09-16 2016-11-22 Genentech Inc hélice enrolada e/ou complexos de proteínas contendo conectores e usos dos mesmos
GB201005063D0 (en) * 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
CA2777242A1 (en) 2009-10-14 2011-04-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecific binding agents targeting igf-1r and erbb3 signalling and uses thereof
PE20121531A1 (es) * 2009-10-15 2012-12-22 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual
UY32979A (es) 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
CA2781532A1 (en) 2009-11-20 2011-05-26 Amgen Inc. Anti-orai1 antigen binding protein that binds the second extracellular loop of orai1
CN102958942A (zh) * 2009-12-29 2013-03-06 新兴产品开发西雅图有限公司 异二聚体结合蛋白及其应用
TW201129384A (en) 2010-02-10 2011-09-01 Immunogen Inc CD20 antibodies and uses thereof
US9616120B2 (en) * 2010-03-04 2017-04-11 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD20
BR112012022342A2 (pt) * 2010-03-04 2017-02-14 Vet Therapeutics Inc anticorpos monoclonais dirigidos a cd52
GB201005064D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
AR080794A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Hoffmann La Roche Anticuerpos bivalentes biespecificos anti- vegf/ anti-ang-2
US20120010388A1 (en) * 2010-04-16 2012-01-12 Gottfried Himmler LeY SPECIFIC BIOTHERAPEUTIC
WO2011131659A2 (en) * 2010-04-21 2011-10-27 Glaxo Group Limited Binding domains
AU2011249783B9 (en) 2010-05-06 2014-11-06 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein -related protein 6 (LRP6) antibodies
AU2011249782B2 (en) 2010-05-06 2014-10-02 Novartis Ag Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein - related protein 6 (LRP6) multivalent antibodies
CN102946858B (zh) * 2010-05-10 2015-09-30 英塔斯制药有限公司 含有免疫球蛋白Fc的多肽的液体制剂
CA2800173C (en) 2010-05-21 2019-05-14 Ulrik Nielsen Bi-specific fusion proteins
WO2012006633A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Biogen Idec Hemophilia Inc. Chimeric clotting factors
CN103052649B (zh) 2010-07-29 2015-12-16 Xencor公司 具有修改的等电点的抗体
AU2011285852B2 (en) 2010-08-03 2014-12-11 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
WO2012019061A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
WO2012021475A2 (en) * 2010-08-12 2012-02-16 Eli Lilly And Company ANTI-N3pGlu AMYLOID BETA PEPTIDE ANTIBODIES AND USES THEREOF
CA2807269A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Roche Glycart Ag Activatable bispecific antibodies
CA2807278A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 F. Hoffmann - La Roche Ag Bispecific antibodies comprising a disulfide stabilized - fv fragment
KR20130139884A (ko) 2010-08-26 2013-12-23 애브비 인코포레이티드 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
PE20140190A1 (es) 2010-08-27 2014-02-10 Stem Centrx Inc Moduladores de proteinas notum y metodos de uso
JP6327855B2 (ja) 2010-09-03 2018-05-23 アッヴィ・ステムセントルクス・エル・エル・シー 新規モジュレータ及びその使用法
TW201302793A (zh) 2010-09-03 2013-01-16 Glaxo Group Ltd 新穎之抗原結合蛋白
CN103339145A (zh) 2010-09-22 2013-10-02 安姆根有限公司 运载体免疫球蛋白及其用途
AR083495A1 (es) * 2010-10-22 2013-02-27 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos estables y solubles
RU2604490C2 (ru) 2010-11-05 2016-12-10 Займворкс Инк. ДИЗАЙН УСТОЙЧИВОГО ГЕТЕРОДИМЕРНОГО АНТИТЕЛА С МУТАЦИЯМИ В Fc ДОМЕНЕ
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
RU2592672C9 (ru) 2010-12-08 2016-11-27 СтемСентРкс, Инк. Новые модуляторы и способы их применения
WO2012085111A1 (en) 2010-12-23 2012-06-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
SA112330278B1 (ar) 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
KR101638224B1 (ko) 2011-02-28 2016-07-08 에프. 호프만-라 로슈 아게 항원 결합 단백질
EP2681240B1 (en) 2011-02-28 2017-08-16 F. Hoffmann-La Roche AG Monovalent antigen binding proteins
JP2014517683A (ja) * 2011-03-11 2014-07-24 アムジェン インコーポレイテッド 治療抗体を改善する相関突然変異分析の方法
EP2502934B1 (en) 2011-03-24 2018-01-17 Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Single chain antigen recognizing constructs (scARCs) stabilized by the introduction of novel disulfide bonds
KR101517320B1 (ko) 2011-04-19 2015-05-28 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 단일특이적 및 이중특이적 항-igf-1r 및 항 erbb3 항체
WO2012170969A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
CA2845536A1 (en) 2011-08-15 2013-02-21 Amplimmune, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and their uses
KR20140054268A (ko) 2011-08-26 2014-05-08 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 탠덤 fc 이중특이적 항체
US20130058947A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc Novel Modulators and Methods of Use
KR101684750B1 (ko) 2011-09-23 2016-12-08 로슈 글리카트 아게 이중특이적 항-egfr/항-igf-1r 항체
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
US10493151B2 (en) 2011-10-18 2019-12-03 Coherus Biosciences, Inc. Etanercept formulations stabilized with sodium chloride
WO2013059410A1 (en) 2011-10-18 2013-04-25 Coherus Biosciences, Inc. Etanercept formulations stabilized with xylitol
EP3431495A1 (en) * 2011-10-20 2019-01-23 ESBATech - a Novartis Company LLC Stable multiple antigen-binding antibody
BR112014010409A2 (pt) 2011-11-04 2017-04-25 Novartis Ag construtos que prolongam a meia-vida de proteína 6 (lrp6) relacionada à lipoproteína de baixa densidade
KR102052774B1 (ko) 2011-11-04 2019-12-04 자임워크스 인코포레이티드 Ｆｃ 도메인 내의 돌연변이를 갖는 안정한 이종이합체 항체 설계
JP6441079B2 (ja) * 2011-12-19 2018-12-19 シンイミューン ゲーエムベーハー 二重特異性抗体分子
AU2012362326A1 (en) 2011-12-30 2014-07-24 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins against IL-13 and/or IL-17
SG10201704849PA (en) * 2012-02-09 2017-07-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified fc region of antibody
EP2812357B1 (en) 2012-02-10 2020-11-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Single-chain antibodies and other heteromultimers
EP2834273B1 (en) 2012-04-05 2018-08-22 F.Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
US9499634B2 (en) 2012-06-25 2016-11-22 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
CN104411718B (zh) 2012-06-27 2018-04-24 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于制备包含特异性结合靶的至少一种结合实体的抗体Fc区缀合物的方法及其用途
CN104395339A (zh) 2012-06-27 2015-03-04 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于选择并产生含有至少两种不同结合实体的定制高度选择性和多特异性靶向实体的方法及其用途
RU2630296C2 (ru) 2012-07-04 2017-09-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела к биотину и способы их применения
SI2869837T1 (sl) 2012-07-04 2016-12-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Protitelesa proti teofilinu in postopki uporabe
NZ701040A (en) 2012-07-04 2017-02-24 Hoffmann La Roche Covalently linked antigen-antibody conjugates
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP2869845B1 (en) 2012-07-06 2019-08-28 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EA029193B1 (ru) 2012-07-09 2018-02-28 Кохерус Байосайенсис, Инк. Составы этанерцепта, отличающиеся заметным уменьшением содержания частиц довидимого диапазона
IN2014DN11157A (ko) 2012-07-13 2015-10-02 Roche Glycart Ag
EP2889376A4 (en) 2012-08-24 2016-11-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTIBODIES Fc SPECIFIC TO FCTRII OF MOUSE
EP2895188B1 (en) 2012-09-11 2017-11-15 Coherus Biosciences, Inc. Correctly folded etanercept in high purity and excellent yield
CA2886422C (en) 2012-10-03 2022-12-13 Jason Baardsnes Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs
AR093311A1 (es) 2012-11-01 2015-05-27 Abbvie Inc Inmunoglobulinas de dominio variable dual contra el factor de crecimiento endotelial vascular (vegf) y el ligando involucrado en la señalizacion celula a celula a traves del receptor notch (dll4)
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
CA3206122A1 (en) 2012-11-28 2014-06-05 Zymeworks Bc Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
KR20150100716A (ko) 2012-12-19 2015-09-02 앰플리뮨, 인크. 항 인간 b7-h4 항체 및 이의 용도
KR20200134340A (ko) 2013-01-10 2020-12-01 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR102391731B1 (ko) 2013-01-14 2022-04-27 젠코어 인코포레이티드 신규한 이형이량체 단백질
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014207549B2 (en) 2013-01-15 2018-12-06 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
CA2900764A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 Stemcentrx, Inc. Novel multispecific constructs
TW201444872A (zh) 2013-03-06 2014-12-01 Merrimack Pharmaceuticals Inc 抗Ｃ－ＭＥＴ串聯Ｆｃ雙特異性抗體
KR102258457B1 (ko) 2013-03-11 2021-05-31 젠자임 코포레이션 조작된 항-tgf-베타 항체 및 항원-결합 단편
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
CA2906927C (en) 2013-03-15 2021-07-13 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
TWI788044B (zh) 2013-03-15 2022-12-21 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ多肽調配物
WO2014150973A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Methods for producing fabs and bi-specific antibodies
KR102049991B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-02 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Her2 이중 특이 항체
KR102074421B1 (ko) 2013-03-29 2020-02-10 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
WO2014163101A1 (ja) 2013-04-02 2014-10-09 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域改変体
WO2014208987A1 (ko) 2013-06-24 2014-12-31 한화케미칼 주식회사 안정성이 개선된 항체-약물 결합체 및 이의 용도
KR20230073341A (ko) 2013-07-05 2023-05-25 젠맵 에이/에스 인간화 또는 키메라 cd3 항체
US11161906B2 (en) 2013-07-25 2021-11-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
CN104341504B (zh) 2013-08-06 2017-10-24 百奥泰生物科技(广州)有限公司 双特异性抗体
RU2711719C2 (ru) * 2013-09-06 2020-01-21 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ улучшения стабильности антител
EP3055329B1 (en) 2013-10-11 2018-06-13 F. Hoffmann-La Roche AG Multispecific domain exchanged common variable light chain antibodies
EP3065769A4 (en) 2013-11-08 2017-05-31 Biogen MA Inc. Procoagulant fusion compound
CA2931356A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2
WO2015085179A1 (en) * 2013-12-06 2015-06-11 The Regents Of The University Of California Alpha-v beta-6 integrin-binding antibody fragments
MX2016007208A (es) 2013-12-20 2016-07-21 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-tau(ps422) humanizados y metodos de uso.
CA2930154A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked helicar-anti-helicar antibody conjugates and uses thereof
CA2930046A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Covalently linked polypeptide toxin-antibody conjugates
EP3960768A1 (en) 2014-01-03 2022-03-02 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
TWI777174B (zh) 2014-03-14 2022-09-11 瑞士商諾華公司 針對lag-3之抗體分子及其用途
US20170335281A1 (en) 2014-03-15 2017-11-23 Novartis Ag Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
KR20230022270A (ko) 2014-03-28 2023-02-14 젠코어 인코포레이티드 Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
EA201692476A1 (ru) 2014-05-28 2017-07-31 Займворкс Инк. Модифицированные антигенсвязывающие полипептидные конструкции и их применение
GB201411320D0 (en) 2014-06-25 2014-08-06 Ucb Biopharma Sprl Antibody construct
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
US10973920B2 (en) 2014-06-30 2021-04-13 Glykos Finland Oy Saccharide derivative of a toxic payload and antibody conjugates thereof
WO2016001810A1 (en) 2014-07-01 2016-01-07 Pfizer Inc. Bispecific heterodimeric diabodies and uses thereof
EP3169706B1 (en) 2014-07-11 2019-12-04 Genmab A/S Antibodies binding axl
WO2016014530A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
KR102612313B1 (ko) 2014-07-21 2023-12-12 노파르티스 아게 인간화 항-bcma 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
CN112481283A (zh) 2014-07-21 2021-03-12 诺华股份有限公司 使用cd33嵌合抗原受体治疗癌症
US11542488B2 (en) 2014-07-21 2023-01-03 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
AU2015292406B2 (en) 2014-07-25 2021-03-11 Cytomx Therapeutics, Inc Anti-CD3 antibodies, activatable anti-CD3 antibodies, multispecific anti-CD3 antibodies, multispecific activatable anti-CD3 antibodies, and methods of using the same
ES2781175T3 (es) 2014-07-31 2020-08-31 Novartis Ag Subconjunto optimizado de células T que contienen un receptor de antígeno quimérico
US10851149B2 (en) 2014-08-14 2020-12-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Treatment of cancer using GFR α-4 chimeric antigen receptor
JP7084138B2 (ja) 2014-08-19 2022-06-14 ノバルティス アーゲー 癌処置に使用するための抗ｃｄ１２３キメラ抗原受容体（ｃａｒ）
US10934362B2 (en) 2014-09-15 2021-03-02 Amgen Inc. Bi-specific anti-CGRP receptor/PAC1 receptor antigen binding proteins and uses thereof
CN114621969A (zh) 2014-09-17 2022-06-14 诺华股份有限公司 用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
MA40035A (fr) 2014-10-14 2016-04-21 Dana Farber Cancer Inst Inc Molécules d'anticorps de pd-l1 et leurs utilisations
EP3220900B1 (en) 2014-11-21 2020-09-23 University of Maryland, Baltimore Targeted structure-specific particulate delivery systems
TN2017000222A1 (en) 2014-11-26 2018-10-19 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
AU2015353409B2 (en) 2014-11-26 2019-05-09 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
US20180334490A1 (en) 2014-12-03 2018-11-22 Qilong H. Wu Methods for b cell preconditioning in car therapy
EP3227332B1 (en) 2014-12-03 2019-11-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
KR20180054923A (ko) 2014-12-19 2018-05-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
WO2016105450A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
CA3224830A1 (en) * 2015-01-08 2016-07-14 Biontech Ag Agonistic tnf receptor binding agents
MA41375A (fr) 2015-01-22 2017-11-28 Lilly Co Eli Anticorps igg bispécifiques et leurs procédés de préparation
EP3816179A3 (en) 2015-02-05 2021-08-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant comprising a modified fcrn-binding domain
TWI733661B (zh) 2015-03-04 2021-07-21 美商健臻公司 以高親合性、結合性及特異性結合轉化生長因子－β１的經修飾ＩｇＧ抗體
TWI726870B (zh) 2015-03-04 2021-05-11 美商健臻公司 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β１的ｓｃＦｖ-Ｆｃ二聚體
WO2016141387A1 (en) 2015-03-05 2016-09-09 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
KR20170132749A (ko) * 2015-03-31 2017-12-04 브이에이치스퀘어드 리미티드 폴리펩티드
CN114958764A (zh) 2015-04-08 2022-08-30 诺华股份有限公司 Cd20疗法、cd22疗法和与cd19嵌合抗原受体（car）表达细胞的联合疗法
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
ES2809728T3 (es) 2015-06-24 2021-03-05 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-tau(pS422) humanizados y procedimientos de uso
EP3319993B1 (en) 2015-07-10 2020-01-15 Genmab A/S Axl-specific antibody-drug conjugates for cancer treatment
PT3317301T (pt) 2015-07-29 2021-07-09 Novartis Ag Terapias de associação compreendendo moléculas de anticorpo contra lag-3
EP3878465A1 (en) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
MA42821A (fr) 2015-09-15 2018-07-25 Amgen Inc Protéines de liaison à l'antigène tétraspécifiques et bispécifiques tétravalentes et utilisations de celles-ci
JP7005019B2 (ja) 2015-10-02 2022-02-04 シルバー・クリーク・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 組織修復のための二重特異性治療用タンパク質
KR20180069839A (ko) 2015-10-08 2018-06-25 자임워크스 인코포레이티드 카파 및 람다 경사슬을 포함하는 항원-결합 폴리펩티드 구조체 및 이의 용도
US11623957B2 (en) 2015-12-07 2023-04-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
EP3390447A1 (en) 2015-12-15 2018-10-24 Amgen Inc. Pacap antibodies and uses thereof
CA3007421A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Combination of c-met inhibitor with antibody molecule to pd-1 and uses thereof
WO2017106656A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Novartis Ag Antibody molecules to pd-1 and uses thereof
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
MA55746A (fr) 2016-01-21 2022-03-02 Novartis Ag Molécules multispécifiques ciblant cll-1
CA3016287A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Novartis Ag Cells expressing multiple chimeric antigen receptor (car) molecules and uses therefore
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
PL3443096T3 (pl) 2016-04-15 2023-06-19 Novartis Ag Kompozycje i sposoby do selektywnej ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych
WO2017205465A2 (en) * 2016-05-24 2017-11-30 Griswold Karl Edwin Antibodies and methods of making same
US20210177896A1 (en) 2016-06-02 2021-06-17 Novartis Ag Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
MX2018015592A (es) 2016-06-14 2019-04-24 Xencor Inc Anticuerpos inhibidores de puntos de control biespecificos.
US10496996B2 (en) * 2016-06-23 2019-12-03 Capital One Services, Llc Neural network systems and methods for generating distributed representations of electronic transaction information
JP7021127B2 (ja) 2016-06-28 2022-02-16 ゼンコア インコーポレイテッド ソマトスタチン受容体２に結合するヘテロ二量体抗体
MX2018015853A (es) 2016-07-14 2019-08-21 Genmab As Anticuerpos multiespecificos frente a los grupos de diferenciacion 40 y 137 (cd40 y cd137).
EP3484455A2 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Novartis AG Treatment and prevention of cytokine release syndrome using a chimeric antigen receptor in combination with a kinase inhibitor
CN118021943A (zh) 2016-07-28 2024-05-14 诺华股份有限公司 嵌合抗原受体和pd-1抑制剂的组合疗法
KR20190036551A (ko) 2016-08-01 2019-04-04 노파르티스 아게 Pro-m2 대식세포 분자의 억제제를 병용하는, 키메라 항원 수용체를 이용한 암의 치료
TW202300168A (zh) 2016-08-05 2023-01-01 日商中外製藥股份有限公司 Il-8相關疾病之治療用或預防用組成物
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
AR110676A1 (es) 2016-10-07 2019-04-24 Novartis Ag Tratamiento del cáncer utilizando receptores de antígenos quiméricos
AU2017342560B2 (en) 2016-10-14 2022-03-17 Xencor, Inc. IL15/IL15Ralpha heterodimeric Fc-fusion proteins
BR112019008702A2 (pt) 2016-11-01 2019-07-16 Genmab B.V. polipeptídeo, método de diminuição de uma função fc efetora de um polipeptídeo, composição, método de tratamento, kit de partes, e, uso de um polipeptídeo ou composição.
MA46753A (fr) 2016-11-14 2019-09-18 Amgen Inc Protéines de liaison à l'antigène bispécifiques ou biparatopiques et utilisations de celles-ci
US20180230218A1 (en) 2017-01-04 2018-08-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
EP4043485A1 (en) 2017-01-26 2022-08-17 Novartis AG Cd28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
MX2019009346A (es) 2017-02-10 2019-10-02 Genmab Bv Variantes de polipeptidos y usos de los mismos.
WO2018160731A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Novartis Ag Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
BR112019018533A2 (pt) 2017-03-09 2020-04-14 Genmab As anticorpo, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, método para tratar uma doença, e, uso de um anticorpo
SG11201908772TA (en) 2017-03-31 2019-10-30 Genmab Holding B V Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3635005A1 (en) 2017-06-07 2020-04-15 Genmab B.V. Therapeutic antibodies based on mutated igg hexamers
AU2018290237A1 (en) 2017-06-22 2020-01-16 Novartis Ag Antibody molecules to CD73 and uses thereof
AU2018292618A1 (en) 2017-06-27 2019-12-19 Novartis Ag Dosage regimens for anti-TIM-3 antibodies and uses thereof
US20200215111A1 (en) * 2017-06-30 2020-07-09 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for adoptive cell therapy for cancer
EP3645122A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Xencor, Inc. Targeted heterodimeric fc fusion proteins containing il-15/il-15ra and antigen binding domains
CA3068636A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Compositions and methods for adoptive cell therapy for cancer
JP7245793B2 (ja) 2017-06-30 2023-03-24 ザイムワークス ビーシー インコーポレイテッド 安定化したキメラＦａｂ
CN111278858A (zh) 2017-07-11 2020-06-12 指南针制药有限责任公司 结合人cd137的激动剂抗体及其用途
US20200172617A1 (en) 2017-07-20 2020-06-04 Novartis Ag Dosage regimens of anti-lag-3 antibodies and uses thereof
JP7117088B2 (ja) * 2017-08-04 2022-08-12 シスメックス株式会社 抗体及びその製造方法、並びに抗体の熱安定性を向上させる方法
MA49753A (fr) 2017-08-04 2020-06-10 BioNTech SE Agents de liaison se liant à pd-l1 et cd137 et leur utilisation
CN111094352A (zh) 2017-08-25 2020-05-01 戊瑞治疗有限公司 B7-h4抗体及其使用方法
MX2020003193A (es) * 2017-09-22 2020-07-29 Hoffmann La Roche Anticuerpos recombinantes mono- o biespecificos multivalentes para fines analiticos.
JP2020536967A (ja) 2017-10-12 2020-12-17 イミュノウェイク インコーポレイテッド Ｖｅｇｆｒ−抗体軽鎖融合タンパク質
EP3694885A1 (en) 2017-10-14 2020-08-19 CytomX Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
WO2019089798A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Novartis Ag Anti-car compositions and methods
EP3706793A1 (en) 2017-11-08 2020-09-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
KR20200089286A (ko) 2017-11-16 2020-07-24 노파르티스 아게 조합 요법
EP3713961A2 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Compass Therapeutics LLC Cd137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
KR20200100098A (ko) 2017-12-19 2020-08-25 젠코어 인코포레이티드 조작된 il-2 fc 융합 단백질
EP3737699A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 Amgen Inc. Pac1 antibodies and uses thereof
JP2021510740A (ja) 2018-01-24 2021-04-30 ゲンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変種およびそれらの用途
US20210038659A1 (en) 2018-01-31 2021-02-11 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US20200411136A1 (en) * 2018-02-26 2020-12-31 Just Biotherapeutics, Inc. Determining impact on properties of proteins based on amino acid sequence modifications
CA3091801A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-h4 antibodies and methods of use thereof
CR20200463A (es) 2018-03-12 2021-03-31 Genmab As Anticuerpos
SG11202009010RA (en) 2018-03-15 2020-10-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use
AU2019247415A1 (en) 2018-04-04 2020-10-22 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
SG11202010163QA (en) 2018-04-18 2020-11-27 Xencor Inc Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
KR20210003814A (ko) 2018-04-18 2021-01-12 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 TIM-3 항원 결합 도메인을 함유하는 TIM-3 표적화 이종이량체 융합 단백질
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3788074A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
TW202003580A (zh) 2018-05-21 2020-01-16 美商坎伯斯治療有限責任公司 用於增強nk細胞對標靶細胞之殺死之組合物及方法
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
EP3801769A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Novartis AG Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
CN112867394A (zh) 2018-06-04 2021-05-28 马萨诸塞州渤健公司 具有降低的效应功能的抗vla-4抗体
EP3806962A1 (en) 2018-06-13 2021-04-21 Novartis AG Bcma chimeric antigen receptors and uses thereof
CN110021348A (zh) * 2018-06-19 2019-07-16 上海交通大学医学院附属瑞金医院 基于RNA-seq数据的肿瘤基因突变检测方法及系统
US20210238268A1 (en) 2018-06-19 2021-08-05 Atarga, Llc Antibody molecules to complement component 5 and uses thereof
EP3810194A1 (en) 2018-06-22 2021-04-28 Genmab Holding B.V. Anti-cd37 antibodies and anti-cd20 antibodies, compositions and methods of use thereof
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
CN108961364A (zh) * 2018-07-10 2018-12-07 麒麟合盛网络技术股份有限公司 一种图片处理方法和装置
GB201811368D0 (en) 2018-07-11 2018-08-29 Ucb Biopharma Sprl Antibody
MX2020013631A (es) 2018-07-13 2021-03-25 Genmab As Variantes de anticuerpo grupo de diferenciacion (cd38) y usos de las mismas.
MA53123A (fr) 2018-07-13 2021-05-19 Genmab As Thérapie à médiation par trogocytose utilisant des anticorps cd38
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
MX2021003765A (es) 2018-10-03 2021-07-15 Xencor Inc Proteínas il-12 de fusión a fc heterodimérico.
KR20210116429A (ko) 2018-10-04 2021-09-27 젠맵 홀딩 비.브이. 이중특이적 항-cd37 항체를 포함하는 제약 조성물
EP3877409A1 (en) 2018-11-06 2021-09-15 Genmab A/S Antibody formulation
CN113166269A (zh) 2018-11-13 2021-07-23 指南针制药有限责任公司 对抗检查点分子的多特异性结合构建体及其用途
AU2019402189B2 (en) 2018-12-20 2023-04-13 Novartis Ag Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
MX2021007391A (es) 2018-12-20 2021-09-23 Novartis Ag Regimenes de baja dosis extendida para inhibidores de mdm2.
EP3924055B1 (en) 2019-02-15 2024-04-03 Novartis AG Substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
KR20210129671A (ko) 2019-02-15 2021-10-28 노파르티스 아게 3-(1-옥소-5-(피페리딘-4-일)이소인돌린-2-일)피페리딘-2,6-디온 유도체 및 이의 용도
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
EP3927371A1 (en) 2019-02-22 2021-12-29 Novartis AG Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
EP3930850A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
SG11202110732XA (en) 2019-03-29 2021-10-28 Atarga Llc Anti fgf23 antibody
CN110164506B (zh) * 2019-04-19 2021-02-26 浙江工业大学 一种基于域间残基接触的多域蛋白结构组装方法
CN113727994A (zh) * 2019-05-02 2021-11-30 德克萨斯大学董事会 提高合成蛋白质稳定性的系统和方法
EP3966241A1 (en) 2019-05-09 2022-03-16 Genmab B.V. Dosage regimens for a combination of anti-dr5 antibodies for use in treating cancer
KR20220016139A (ko) 2019-05-30 2022-02-08 암젠 인크 항체 이량체화를 유도하기 위한 경첩 영역 조작
WO2020264384A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
TW202128166A (zh) 2019-10-21 2021-08-01 瑞士商諾華公司 組合療法
BR112022007179A2 (pt) 2019-10-21 2022-08-23 Novartis Ag Inibidores de tim-3 e usos dos mesmos
US20220411529A1 (en) 2019-11-06 2022-12-29 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
US20220389119A1 (en) 2019-11-08 2022-12-08 Amgen Inc. ENGINEERING CHARGE PAIR MUTATIONS FOR PAIRING OF HETERO-IgG MOLECULES
EP4061838A1 (en) 2019-11-19 2022-09-28 Amgen Inc. Novel multispecific antibody format
JP2023503163A (ja) 2019-11-26 2023-01-26 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体及びその使用
GB201919061D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Multi-specific antibody
GB201919062D0 (en) 2019-12-20 2020-02-05 Ucb Biopharma Sprl Antibody
EP4077389A1 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Novartis AG Combination of anti tim-3 antibody mbg453 and anti tgf-beta antibody nis793, with or without decitabine or the anti pd-1 antibody spartalizumab, for treating myelofibrosis and myelodysplastic syndrome
UY38995A (es) 2019-12-20 2021-06-30 Amgen Inc Constructos de anticuerpo multiespecíficos agonistas de cd40 dirigidos a mesotelina para el tratamiento de tumores sólidos
US20230272105A1 (en) 2020-01-16 2023-08-31 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
CN114980902A (zh) 2020-01-17 2022-08-30 诺华股份有限公司 用于治疗骨髓增生异常综合征或慢性粒单核细胞白血病的包含tim-3抑制剂和低甲基化药物的组合
CN115298322A (zh) 2020-01-17 2022-11-04 贝克顿迪金森公司 用于单细胞分泌组学的方法和组合物
GB202001447D0 (en) 2020-02-03 2020-03-18 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
WO2021155916A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 BioNTech SE Treatment involving antigen vaccination and binding agents binding to pd-l1 and cd137
KR20220147109A (ko) 2020-02-27 2022-11-02 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 발현 세포의 제조 방법
BR112022015572A2 (pt) 2020-03-18 2022-09-27 Genmab As Anticorpo, composição, composição farmacêutica, anticorpo para uso como um medicamento, métodos para tratar uma doença e para produzir um anticorpo, ácido nucléico, um ou mais ácidos nucléicos, célula, e, kit de partes
CN115443147A (zh) * 2020-04-23 2022-12-06 伊莱利利公司 抗体的皮下吸收和生物利用度
JP7314859B2 (ja) * 2020-04-30 2023-07-26 株式会社島津製作所 分析支援装置、分析支援方法および分析支援プログラム
WO2021226351A1 (en) * 2020-05-08 2021-11-11 Rutgers, The State University Of New Jersey Methods and systems for stabilizing proteins using intelligent automation
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
JP2023531676A (ja) 2020-06-23 2023-07-25 ノバルティス アーゲー ３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピぺリジン－２，６－ジオン誘導体を含む投与レジメン
TW202216761A (zh) 2020-07-16 2022-05-01 瑞士商諾華公司 抗β細胞素抗體、其片段及多特異性結合分子
US20230293680A1 (en) 2020-07-23 2023-09-21 Genmab B.V. A composition of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
JP2023536164A (ja) 2020-08-03 2023-08-23 ノバルティス アーゲー ヘテロアリール置換３－（１－オキソイソインドリン－２－イル）ピペリジン－２，６－ジオン誘導体及びその使用
AU2021322046A1 (en) 2020-08-06 2023-02-02 BioNTech SE Binding agents for coronavirus S protein
US11919958B2 (en) 2020-08-19 2024-03-05 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
US20230322955A1 (en) 2020-08-20 2023-10-12 Amgen Inc. Antigen binding proteins with non-canonical disulfide in fab region
EP4204021A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
WO2022043558A1 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Advanced Accelerator Applications International Sa Method of treating psma-expressing cancers
US20230310599A1 (en) 2020-09-02 2023-10-05 Genmab A/S Antibody therapy
BR112023004321A2 (pt) 2020-09-10 2023-04-04 Genmab As Método para tratar linfoma de célula b grande difusa em um sujeito humano
MX2023002546A (es) 2020-09-10 2023-03-14 Genmab As Anticuerpos biespecificos contra cumulo de diferenciacion 3 (cd3) y contra cumulo de diferenciacion 20 (cd20) para tratar leucemia linfocitica cronica.
MX2023003749A (es) 2020-10-02 2023-04-24 Genmab As Anticuerpos capaces de unirse al receptor huerfano 2 similar a tirosina-cinasa receptora (ror2) y anticuerpos biespecificos que se unen a ror2 y al cumulo de diferenciacion 3 (cd3).
WO2022076474A2 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Amgen Inc. Rational selection of building blocks for the assembly of multispecific antibodies
EP4232474A1 (en) * 2020-10-21 2023-08-30 Boehringer Ingelheim International GmbH Bispecific anti-vegf and anti-trkb binding molecules for the treatment of eye diseases
US20240002509A1 (en) 2020-11-06 2024-01-04 Novartis Ag ANTIBODY Fc VARIANTS
TW202233663A (zh) 2020-11-10 2022-09-01 美商安進公司 多特異性抗原結合結構域之新穎的連接子
CA3198447A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
CA3200847A1 (en) 2020-12-07 2022-06-16 UCB Biopharma SRL Multi-specific antibodies and antibody combinations
EP4255925A1 (en) 2020-12-07 2023-10-11 UCB Biopharma SRL Antibodies against interleukin-22
EP4284510A1 (en) 2021-01-29 2023-12-06 Novartis AG Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof
AU2022232375A1 (en) 2021-03-09 2023-09-21 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
EP4305065A1 (en) 2021-03-10 2024-01-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
CN116964085A (zh) 2021-03-12 2023-10-27 根马布股份公司 非激活抗体变体
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
CA3216559A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 Amgen Inc. Balanced charge distribution in electrostatic steering of chain pairing in multi-specific and monovalent igg molecule assembly
EP4334355A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 UCB Biopharma SRL Antibodies
IL308300A (en) 2021-05-07 2024-01-01 Genmab As Pharmaceutical preparations containing bispecific antibodies that bind to B7H4 and CD3
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
IL309319A (en) 2021-06-21 2024-02-01 Genmab As Combined dosage regimen CD137 and PD-L1 binding agents
GB202111905D0 (en) 2021-08-19 2021-10-06 UCB Biopharma SRL Antibodies
KR20240051280A (ko) 2021-09-06 2024-04-19 젠맵 에이/에스 Cd27과 결합할 수 있는 항체, 그의 변이체 및 그의 용도
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023057571A1 (en) 2021-10-08 2023-04-13 Genmab A/S Antibodies binding to cd30 and cd3
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
US20230383010A1 (en) 2022-02-07 2023-11-30 Visterra, Inc. Anti-idiotype antibody molecules and uses thereof
WO2023174521A1 (en) 2022-03-15 2023-09-21 Genmab A/S Binding agents binding to epcam and cd137
WO2023183288A2 (en) * 2022-03-22 2023-09-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Monoclonal antibodies for targeting the cardiac conduction system
US20230368861A1 (en) * 2022-05-10 2023-11-16 Amgen Inc. Machine learning techniques for predicting thermostability
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier
WO2024035761A1 (en) * 2022-08-09 2024-02-15 Board Of Trustees Of Michigan State University Predicting function from sequence using information decomposition
WO2024094660A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Genmab A/S Cd38 antibodies and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003075129A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Maxygen, Inc. Methods, systems, and software for identifying functional bio-molecules

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE87659T1 (de) 1986-09-02 1993-04-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
JPH07501451A (ja) 1991-11-25 1995-02-16 エンゾン・インコーポレイテッド 多価抗原結合タンパク質
US20050038609A1 (en) 1992-03-25 2005-02-17 Benner Steven Albert Evolution-based functional genomics
US6377893B1 (en) 1992-03-25 2002-04-23 Steven Albert Benner Application of protein structure predictions
US5958784A (en) 1992-03-25 1999-09-28 Benner; Steven Albert Predicting folded structures of proteins
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US6482919B2 (en) 1993-02-01 2002-11-19 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
US5747654A (en) * 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
DE4425115A1 (de) 1994-07-15 1996-01-18 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Modifizierung der Stabilität von Antikörpern
US5656730A (en) 1995-04-07 1997-08-12 Enzon, Inc. Stabilized monomeric protein compositions
US6262238B1 (en) 1997-01-14 2001-07-17 Roche Diagnostic, Gmbh Process for modifying the stability of antibodies
AU740904B2 (en) 1997-03-20 2001-11-15 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Recombinant antibodies and immunoconjugates targeted to CD-22 bearing cells and tumors
US20020129889A1 (en) * 2001-03-15 2002-09-19 Anderson Norman G. Method and apparatus for making fibers for sectioned arrays
ES2276735T3 (es) * 2001-09-14 2007-07-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpos fv multimericos de cadena sencilla en tandem.
WO2003099999A2 (en) * 2002-05-20 2003-12-04 Abmaxis, Inc. Generation and selection of protein library in silico
EP1583503A4 (en) 2002-12-20 2006-08-09 Biogen Idec Inc POLYVALENT LYMPHOTOXIN BETA RECEPTOR AGONISTS AND THERAPEUTIC USE THEREOF
NZ544924A (en) 2003-06-27 2009-03-31 Biogen Idec Inc Modified binding molecules comprising connecting peptides
NZ550518A (en) * 2004-03-23 2009-11-27 Biogen Idec Inc Agents that cross link TNF receptors for treating cancer
AR049390A1 (es) 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
WO2006074399A2 (en) * 2005-01-05 2006-07-13 Biogen Idec Ma Inc. Multispecific binding molecules comprising connecting peptides
NZ591252A (en) * 2006-03-17 2012-06-29 Biogen Idec Inc Methods of designing antibody or antigen binding fragments thereof with substituted non-covarying amino acids
US20090130105A1 (en) * 2007-08-28 2009-05-21 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
WO2009043051A2 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003075129A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Maxygen, Inc. Methods, systems, and software for identifying functional bio-molecules

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Molecular Cancer Therapeutics Vol. 1, Pages 79-84(2001).
Nature Biotechnology, Vol. 14, Pages 1239-1245(1996).

Also Published As

Publication number Publication date
AU2007227292A1 (en) 2007-09-27
US8892364B2 (en) 2014-11-18
AU2007227292B2 (en) 2012-04-12
GEP20135917B (en) 2013-09-10
EA200802005A1 (ru) 2009-06-30
IL194120A (en) 2015-03-31
US7960142B2 (en) 2011-06-14
EP2024392A2 (en) 2009-02-18
US20110301331A1 (en) 2011-12-08
EA015992B1 (ru) 2012-01-30
CN103073639A (zh) 2013-05-01
JP5374359B2 (ja) 2013-12-25
KR20080113241A (ko) 2008-12-29
BRPI0709598A8 (pt) 2019-01-08
NO20084339L (no) 2008-12-16
WO2007109254A2 (en) 2007-09-27
US7951918B2 (en) 2011-05-31
JP2013176394A (ja) 2013-09-09
US20090048122A1 (en) 2009-02-19
US20080050370A1 (en) 2008-02-28
MX2008011874A (es) 2009-01-07
JP2009531028A (ja) 2009-09-03
NZ591252A (en) 2012-06-29
IL194120A0 (en) 2011-08-01
WO2007109254A3 (en) 2008-10-23
BRPI0709598A2 (pt) 2011-07-19
CA2646508A1 (en) 2007-09-27
SG170750A1 (en) 2011-05-30

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