CN113056487A - 抗tnfr2抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

公开了与特定人TNFR2表位结合的抗TNFR2抗体、包含该抗TNFR2抗体的治疗组合物，以及使用此类抗体和组合物治疗癌症的方法。

Description

抗TNFR2抗体及其用途
相关申请
本申请要求于2018年9月18日提交的美国临时申请第62/732,846号；2018年11月13日提交的美国临时申请第62/760,777号；以及2019年3月1日提交的美国临时申请第62/812,859号的优先权和权益。前述申请的内容通过引用并入本文。
背景技术
最近的研究表明，通过调节免疫应答来增强人体自身抵抗疾病的能力，是传统治疗平台的一种有吸引力的替代性方案和/或补充。例如，研究表明，增强针对T淋巴细胞的活性以靶向和治疗各种疾病(例如，癌症或传染病)在治疗上是有益的。抑制T调节性细胞(Tregs)以抑制T淋巴细胞活性的能力是增加针对疾病的免疫反应的一种潜在机制。
肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)，也称为TNFRSF1B和CD120b，是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的共同刺激成员，其中包括GITR、OX40、CD27、CD40和4-1BB(CD137)等蛋白质。TNFR2是在T细胞上表达的细胞表面受体，已被证明可以增强效应T(Teff)细胞的活化并减少Treg介导的抑制。通过调节TRAF2/3和NF-kB信号传导，TNFR2可以介导促进细胞存活和增殖的基因的转录。TNFR2可以在癌细胞、肿瘤浸润性Tregs和效应T细胞上表达。鉴于对针对诸如癌症的疾病的改进策略的持续需求，从增强的免疫应答(特别是T细胞应答)、调节Treg活性的新型试剂和方法中获益是非常需要的。
发明内容
本文提供了分离的抗体，诸如重组单克隆抗体(例如人抗体)，其与TNFR2(例如人TNFR2)上的特定表位特异性结合并且具有治疗所需特性。因此，本文所述的抗体可用于例如抑制肿瘤生长、治疗癌症、治疗自身免疫性疾病、治疗移植物抗宿主疾病、促进移植物存活和/或减少移植物排斥。
在一个实施方案中，本文提供了抗体(例如分离的单克隆抗体)，其结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基23-54的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的55-77(例如不结合60-77、65-77、70-77、75-77、55-75、55-70、55-65或55-60内的一个或多个氨基酸残基)内的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，抗体不结合人TNFR2(SEQID NO:1)的78-118、120-143和/或161-200内的一个或多个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其表现出与突变型人TNFR2结合的降低(例如，结合降低至少50％、结合降低至少60％、结合降低至少70％、结合降低至少80％或结合降低至少90％)，该突变型人TNFR2在人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基48或氨基酸残基68上包含取代(例如，非保守氨基酸取代(例如丙氨酸取代))。在一些实施方案中，抗体不表现出与突变型人TNFR2结合的降低(例如，结合降低不超过20％或结合降低不超过10％)，该突变型人TNFR2包含一个或多个氨基酸残基上的取代(例如，非保守氨基酸取代(例如丙氨酸取代))，该氨基酸残基选自由残基37、39、42、49、51、56、65、66、69、86、89和91组成的群组。在其他实施方案中，抗体不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基97-118、120-143和/或161-200。在其他实施方案中，通过酵母表面展示评估，抗体与突变型TNFR2结合的降低。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其与TNFR2嵌合体3(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12)结合，并且不结合TNFR2嵌合体0(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6)。在一些实施方案中，抗体不以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD结合TNFR2嵌合体0。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-54(例如，不结合23-44、23-36、23-30、23-25、25-44、30-44、35-44或40-44内的一个或多个氨基酸残基)内的一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，抗体不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基97-118、120-143和/或161-200。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其与野生型人TNFR2(SEQ ID NO:1)相比，表现出与突变型人TNFR2结合的降低(例如，结合降低至少50％、结合降低至少60％、结合降低至少70％、结合降低至少80％或结合降低至少90％)，该突变型人TNFR2包含一个或多个氨基酸残基上的取代(例如，非保守氨基酸取代(例如丙氨酸取代))，该氨基酸残基选自由以下组成的群组：(i)人TNFR2(SEQ ID NO:1)的残基37、44、51、52、55、58、59、61、62、72、74、76、78和87，或(ii)人TNFR2(SEQ ID NO:1)的残基55和72。在一些实施方案中，抗体不表现出与突变型人TNFR2结合的降低(例如，结合降低不超过20％或结合降低不超过10％)，该突变型人TNFR2包含一个或多个氨基酸残基上的取代(例如，非保守氨基酸取代(例如丙氨酸取代))，该氨基酸残基选自由残基39、41、80、112和113组成的群组。在其他实施方案中，抗体不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基97-118、120-143和/或161-200。在其他实施方案中，通过酵母表面展示评估，抗体与突变型人TNFR2的结合降低了至少约50％。在其他实施方案中，通过酵母表面展示评估，抗体与突变型TNFR2结合的降低。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合TNFR2嵌合体7(SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20)(例如，以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体7)，并且不结合TNFR2嵌合体4(SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14)(例如，不以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体4)。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77内的一个或多个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合TNFR2嵌合体1(SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8)，并且不结合TNFR2嵌合体2(SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10)(例如，不以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体2(SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10))。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基120-257的全部或部分，并且不会显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2(例如，诸如本文所述的那些)，其中相对于未修饰形式的相同抗体，该抗体进行了修饰以增强效应子功能，例如通过引入增强效应子功能的氨基酸取代。在一些实施方案中，相对于未修饰形式的相同抗体，该抗体表现出增强的抗肿瘤活性。在其他实施方案中，抗体表现出以下之一：(a)结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基23-54的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ IDNO:1)的55-77内的一个或多个氨基酸残基；(b)结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且抑制至少约50％的TNF-α与人TNFR2的结合；(c)结合人TNFR2(SEQID NO:1)的氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77或119-200内的一个或多个氨基酸残基；或(d)结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基120-257的全部或部分，不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的78-118内的一个或多个氨基酸残基，并且不抑制TNF-α与人TNFR2的结合。
在一些实施方案中，本文所述的抗体激动TNFR2活性。在其他实施方案中，本文所述的抗体抑制肿瘤生长与其激动TNFR2信号传导的能力无关和/或与其抑制TNF-α与TNFR2结合的能力无关。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含重链和轻链可变区的重链和轻链CDR，该重链和轻链可变区分别包含以下阐述的氨基酸序列：(a)SEQID NO:71和SEQ ID NO:72，(b)SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:86，(c)SEQ ID NO:170和SEQ IDNO:171，(d)SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:149或(e)SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:127。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含(a)分别包含SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，(b)分别包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，(c)分别包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，(d)分别包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，(e)分别包含SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156和SEQ ID NO:157的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，(f)分别包含SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:163的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，(g)分别包含SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，(h)分别包含SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，或(i)分别包含SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ IDNO:113的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在一些实施方案中，抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含选自由SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:126、SEQID NO:148和SEQ ID NO:170组成的群组的氨基酸序列；或与选自由SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:170组成的群组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，和/或轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ IDNO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ IDNO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:127、SEQID NO:149和SEQ ID NO:171组成的群组的氨基酸序列，或与选自由SEQ ID NO:72、SEQ IDNO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:171组成的群组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含有包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含重链和轻链可变区序列，该序列与SEQ ID NO:71和SEQID NO:72中阐述氨基酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含有包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含重链和轻链可变区序列，该序列与SEQ ID NO:74和SEQID NO:86中阐述氨基酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含重链和轻链可变区序列，该序列与SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171中阐述氨基酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含有包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包含重链和轻链可变区序列，该序列与SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:127中阐述氨基酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)相同。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含重链和轻链可变区序列，该序列与SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102中阐述氨基酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)或100％相同。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含重链和轻链可变区序列，该序列与SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:151中阐述氨基酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)或100％相同。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含重链和轻链可变区序列，该序列与SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129中阐述氨基酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)或100％相同。
在另一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2并且包含重链和轻链可变区序列，该序列与SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107中阐述氨基酸序列至少80％(例如，至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)或100％相同。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是激动性抗体。例如，抗体激活NF-κB信号传导、促进T细胞增殖(例如CD4+和CD8+T细胞)和/或共刺激T细胞。在其他实施方案中，抗体降低了调节性T细胞的丰度(例如，在T细胞区室中)。在其他实施方案中，抗体诱导长期抗癌作用，例如通过诱导抗癌记忆T细胞的发育。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体。在其他实施方案中，抗体包含变体Fc区。在其他实施方案中，相对于相应的非变体Fc区观察到的结合，变体Fc区增加了与Fcγ受体(例如FcγRIIb受体)的结合。在其他实施方案中，相对于相应的非变体Fc区，变体Fc区增加了抗体聚集。在其他实施方案中，抗体共刺激T细胞(例如CD8+T细胞)。在其他实施方案中，变体Fc区是变体IgG1 Fc区。在其他实施方案中，变体IgG1Fc区包含选自由以下组成的群组的一个或多个取代：(a)S267E、(b)S267E/L328F、(c)G237D/P238D/P271G/A330R、(d)E233D/P238D/H268D/P271G/A330R、(e)G237D/P238D/H268D/P271G/A330R和(f)E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R。
在一些实施方案中，本文所述的抗体结合TNFR2上的不连续表位。在其他实施方案中，本文所述的抗体是单克隆抗体。在其他实施方案中，本文所述的抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在其他实施方案中，本文所述的抗体是多特异性抗体(例如双特异性抗体)或包含本文所述的抗TNFR2抗体的抗原结合结构域(例如可变区或重链和轻链)的免疫缀合物。在其他实施方案中，抗体选自由单链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv或结构域抗体组成的群组。
在一些实施方案中，本文所述的抗体结合人TNFR2上的以下位置的一个或多个(根据SEQ NO:104编号)：Y24、Q26、Q29、M30和K47。
在一些实施方案中，本文提供了抗体，其与本文所述的抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的相同表位。在其他实施方案中，本文提供了抗体，其与本文所述的抗TNFR2抗体竞争结合人TNFR2。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是由命名为ABV3、ABV4、ABV7、ABV12、ABV13、ABV14、ABV15、ABV18和/或ABV19的杂交瘤产生的抗体。在一些实施方案中，杂交瘤抗体已被人源化。在其他实施方案中，抗体包含由杂交瘤产生的抗体的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列，该杂交瘤命名为ABV3、ABV4、ABV7、ABV12、ABV13、ABV14、ABV15、ABV18或ABV19。
另一方面，本文提供了核酸，其编码本文所述抗体的重链和/或轻链可变区。还提供了表达载体，其包含用表达载体转化的核酸和细胞(例如宿主细胞)。
另一方面，本文提供了组合物(例如药物组合物)，其包含本文所述的抗体和载体(例如药学上可接受的载体)。还提供了包含本文所述抗体的试剂盒和使用说明书。
另一方面，本文提供了在受试者中增加T细胞增殖、共刺激效应T细胞和/或减少或消耗调节性T细胞数量的方法，该方法包含向受试者施用有效量的本文所述的抗体，以实现T细胞增殖的增加、效应T细胞的共刺激和/或调节性T细胞数量的减少或消耗。
另一方面，本文提供了治疗癌症的方法，包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的抗TNFR2抗体。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗TNFR2抗体在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，或本文所述的抗TNFR2抗体在用于治疗患有癌症的受试者中的用途。
另一方面，本文提供了治疗癌症的方法，包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的抗TNFR2抗体，其中抗体具有效应子功能并且不显著抑制TNF-α与TNFR2的结合。在一些实施方案中，提供了抗TNFR2抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，或抗TNFR2抗体在用于治疗患有癌症的受试者中的用途，其中抗体具有效应子功能并且不显著抑制TNF-α与TNFR2的结合。
另一方面，本文提供了治疗癌症的方法，包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的抗TNFR2抗体，其中抗体具有效应子功能并且激动TNFR2受体信号传导。在一些实施方案中，提供了抗TNFR2抗体在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，或抗TNFR2抗体在用于治疗患有癌症的受试者中的用途，其中抗体具有效应子功能并且激动TNFR2受体信号转导。
另一方面，本文提供了治疗癌症的方法，包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的抗TNFR2抗体，其中抗体具有效应子功能。在一些实施方案中，提供了抗TNFR2抗体在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，或抗TNFR2抗体在用于治疗患有癌症的受试者中的用途，其中抗体具有效应子功能。
在一些实施方案中，待治疗的癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌或结肠直肠癌。
在一些实施方案中，在上述治疗癌症的方法中施用一种或多种另外的治疗剂(例如免疫调节药物、细胞毒性药物、靶向治疗剂、癌症疫苗)。在其他实施方案中，本文所述的方法、用途或抗体诱导长期抗癌作用。在其他实施方案中，本文所述的方法、用途或抗体诱导抗癌记忆T细胞的发育。
另一方面，本文提供了治疗自身免疫性疾病或障碍的方法，包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的抗TNFR2抗体。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗TNFR2抗体在制备用于治疗患有自身免疫性疾病或障碍的受试者的药物中的用途，或本文所述的抗TNFR2抗体在用于治疗患有自身免疫性疾病或障碍的受试者中的用途。
在一些实施方案中，待治疗的自身免疫性疾病或障碍是移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、结肠炎、银屑病、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解症或1型糖尿病。在其他实施方案中，在治疗自身免疫性疾病或障碍的方法中施用一种或多种另外的治疗剂。
另一方面，本文提供了用于在已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥的方法，包含向受试者施用有效量(例如治疗有效量)的本文所述的抗TNFR2抗体，以促进移植物存活或减少移植物排斥。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗TNFR2抗体在制备用于促进已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者的移植物存活或减少移植物排斥的药物中的用途，或本文所述的抗TNFR2抗体在促进已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者的移植物存活或减少移植物排斥中的用途。
在一些实施方案中，移植物是同种异体移植物(例如细胞、组织或器官同种异体移植物)。在其他实施方案中，移植物排斥是在已接受或将接受细胞、组织或器官同种异体移植物的受体中。在其他实施方案中，在促进移植物存活或减少移植物排斥的方法中施用一种或多种另外的治疗剂。
另一方面，本文提供了治疗、预防或减少已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者的移植物抗宿主病的方法，包含向受试者施用有效量(例如治疗有效量)的本文所述的抗TNFR2抗体。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗TNFR2抗体在制备用于治疗、预防或减少已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者的移植物抗宿主病的药物中的用途，或本文所述的抗TNFR2抗体在用于治疗、预防或减少已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者的移植物抗宿主病中的用途。在其他实施方案中，在治疗、预防或减少移植物抗宿主病的方法中，施用一种或多种另外的治疗剂。
本文还提供了检测TNFR2(例如人TNFR2)的方法，包含在允许抗体和TNFR2蛋白之间形成复合物的条件下，使样品(例如生物学样品)与本文所述的抗TNFR2抗体接触，并检测复合物的形成。在一些实施方案中，提供了本文所述的抗TNFR2抗体用于检测样品(例如生物学样品)中的TNFR2(例如人TNFR2)的用途，包含在允许抗体和TNFR2蛋白之间形成复合物的条件下，使样品与抗TNFR2抗体接触，并检测复合物的形成。
附图说明
图1是人和小鼠TNFR2氨基酸序列的比对。
图2A是示出了指定的抗小鼠TNFR2抗体在过表达TNFR2的CHO细胞上的细胞上结合的图。图2B是示出了指定的抗小鼠TNFR2抗体在野生型CHO细胞上的结合的图。
图3是示出了使用ForteBio测定的指定的抗体(单价KD)与his标记小鼠TNFR2的结合亲和力的图。
图4是示出了通过ELISA评估的指定的抗小鼠TNFR2抗体阻断TNF与TNFR2结合的能力的图。
图5A是概述用于表位作图的小鼠和人TNFR2的嵌合受体的结构的示意图。图5B是示出了指定的抗小鼠TNFR2抗体与每种嵌合体(深色阴影：结合；无阴影：不结合)的结合的示意图。
图6是与小鼠TNF(带状模型)结合的小鼠TNFR2(空间填充模型)的同源性模型。绘制了M3结合被突变显著破坏的氨基酸位置(-，黑色；+，深灰色)。
图7A是示出了指定的抗小鼠TNFR2抗体对CT26小鼠模型中肿瘤生长的影响的图。图7B示出了随机化后第18天肿瘤大小的直方图表示。图7C是示出了基于肿瘤大小由到达人类终点的时间确定的动物存活情况的存活曲线。图7D是示出了用CT26肿瘤细胞再激发的先前治愈的小鼠的存活情况的存活曲线。
图8A是示出了1mg或0.3mg M36(在有或没有影响效应子功能的突变的情况下)对CT26小鼠模型中肿瘤生长的影响的图。图8B示出了随机化后第18天肿瘤大小的直方图表示。图8C是示出了0.3mg M3(在有或没有影响效应子功能的突变的情况下)对CT26小鼠模型中肿瘤生长的影响的图。图8D示出了随机化后第18天肿瘤大小的直方图表示。6周龄的雌性Balb/c小鼠(7只小鼠/组)皮下接种CT26细胞(5*10E5)。
图8E-8J是示出了3*0.3mg Y9(在有或没有影响效应子功能的突变的情况下)对CT26(图8E-8G)或Wehi164(图8H-8J)小鼠模型中肿瘤生长的影响的图。
图9A是示出了指定的抗小鼠TNFR2抗体对CT26小鼠模型中肿瘤生长的影响的图。图9B示出了随机化后第18天的肿瘤大小的直方图表示。
图10A-10I是示出了1mg(图10A-10F)或0.3mg(图10G-10I)的指定抗体对EMT6小鼠模型中肿瘤生长的影响的图。
图11A和11B是示出了抗体Y9和抗PD-1抗体对抗PD-1抗性(MBT-2)和抗PD-1敏感(Sa1/N)的肿瘤模型的抗肿瘤应答的图。
图12示出了在各种同系模型(WEHI164、Sa1/N、MBT2、CT26和EMT6)中单独的抗体Y9、单独的抗PD-1抗体以及Y9和抗PD-1抗体的组合的抗肿瘤活性的一系列图。
图13是示出了抗体Y9和抗CTLA4抗体对健康小鼠体重的影响的图。
图14是示出了抗体Y9和抗CTLA4抗体对健康小鼠的脾脏重量的影响的图。
图15A和15B是示出了抗体Y9和抗CTLA4抗体对健康小鼠中丙氨酸氨基转移酶(ALT；图15A)水平和天冬氨酸氨基转移酶(AST；图15B)水平的影响的图。
图16A-16D示出了抗体Y9和抗CTLA4抗体对从皮肤引流淋巴结分离的外周血淋巴细胞和树突状细胞的免疫细胞表型的影响。图16A是示出了指定治疗对CD4+T细胞增殖的影响的图。图16B是示出了指定治疗对CD8+T细胞增殖的影响的图。图16C示出了描述流式细胞术的门控策略的一系列点状图。图16D是示出了指定治疗对CD86(B7.2)表达的影响的图，该CD86(B7.2)是对T细胞的树突状细胞活化很重要的共刺激分子。
图17示出了在CT26同系小鼠肿瘤模型中野生型小鼠、FcGR2BKO小鼠和Fc普通γKO小鼠中抗体Y9的抗肿瘤活性的一系列图。
图18示出了在CT26同系小鼠肿瘤模型中具有不同抗体同种型和变体Fc区的抗体Y9的抗肿瘤活性的一系列图。
图19示出了一系列图，示出了抗体Y9对CD8+T细胞各个方面的影响，包括增殖、CD25+细胞百分比、GrnB+细胞百分比和PD-1+细胞百分比。
图20是与小鼠TNF(带状模型)结合的小鼠TNFR2(空间填充模型)的同源性模型。绘制了Y9结合被突变显著破坏的氨基酸位置(-，黑色)。
图21A-21D是示出了单剂量PBS抗TNFR2抗体(1mg、0.3mg和0.1mg)在具有结肠直肠CT26癌细胞的同系肿瘤模型中的抗肿瘤应答的一系列图。
图22A-22D是示出了单剂量的PBS或抗TNFR2抗体(1mg、0.3mg和0.1mg)在具有EMT6乳腺癌细胞的同系肿瘤模型中的抗肿瘤应答的一系列图。
图23A-23D示出了单剂量的PBS或抗TNFR2抗体(1mg、0.3mg和0.1mg)在具有Wehi64纤维肉瘤细胞的同系肿瘤模型中的抗肿瘤应答的一系列图。
图24A-24D是示出了单剂量的PBS或抗TNFR2抗体(1mg、0.3mg和0.1mg)在具有A20B细胞淋巴瘤细胞的同系肿瘤模型中的抗肿瘤应答的一系列图。
图25是示出了与未治疗的年龄匹配的对照相比，在具有Wehi64纤维肉瘤细胞的同系肿瘤模型中的单剂量抗TNFR2抗体(1mg、0.3mg和0.1mg)持续抗肿瘤应答的图。
图26A和26B是示出了抗体Y9和Y9 DANA对EMT-6同系模型肿瘤和肿瘤引流淋巴结中的CD4+常规T细胞、Tregs和CD8+T细胞中CTLA4表达的影响的图。
图27A-27C是示出了抗体Y9和Y9 DANA对EMT-6同系模型肿瘤中的CD4+常规T细胞、Tregs和CD8+T细胞中GITR(图27A)、GARP(图27B)和PD-1(图27C)表达的影响的图。
图28A-28C是示出了抗体Y9和Y9 DANA对CT26、MC38和WEHI-164同系模型肿瘤中的CD4+常规T细胞(图28A)、Tregs(图28B)和CD8+T细胞(图28C)中TNFR2表达的影响的图。
图29是描述通过ELISA测定的杂交瘤抗体(ABV3、ABV4、ABV7、ABV12、ABV13、ABV14、ABV15、ABV18和ABV19)与嵌合体0(阴影线)、嵌合体3(白色)、小鼠TNFR2(方格)和人TNFR2(黑色)的结合的图。
图30A-30D示出了人源化ABV2抗体重链和轻链可变区序列的比对。
图31是示出了抗体ABV2嵌合体(ABV2c)对NF-kB报告基因活性的剂量依赖性的影响的图。
图32A是示出了ABV2c对卵巢癌腹水培养物中CD4+细胞中Tregs百分比的影响的图。图32B示出了用于图32A中的流式细胞术分析的门控策略。
图33A是示出了ABV2c对人细胞ADCC活性的影响的图，使用了从与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的JJN3(浆细胞骨髓瘤)靶细胞一起培养的健康供体分离的NK细胞。随着靶细胞死亡，CFSE的每细胞荧光降低，这可以通过流式细胞术检测到。图33B示出了用于图33A中的流式细胞术分析的门控策略。
图34A和34B示出了通过嵌合抗人TNFR2抗体ABV2c，在CD4+T细胞上的活化标记和细胞因子的体外扩增、诱导。用5ug/mL平板结合的CD3、1ug/mL可溶性CD28和各种浓度的平板结合同种型对照、抗TNFR2(ABV2c)、抗4-1BB(Urelumab)或抗GITR(TRX518)mAb刺激初始型CD45RA+CD8+或CD4+T细胞4天。图34A和34B示出了来自3个个体的数据，并且将其标准化为在不存在任何抗TNFRSF抗体的情况下刺激的样品。星号示出了同种型和ABV2c之间的统计显著性。
图35示出了嵌合抗人TNFR2抗体ABV2c对异种GvHD模型中存活的影响。
图36A是示出了通过流式细胞术评估的人TNFR2的CRD1区中的各种突变对嵌合抗人TNFR2抗体ABV2c的结合的影响的图。通过流式细胞术评估与人TNFR2的结合。使用四参数剂量响应拟合结合曲线。图36B是结构模型，其中导致抗体ABV2c不与人TNFR2结合的突变(Y24、Q26、Q29、M30和K47；基于没有前导序列的人TNFR2编号)以黑色突出显示(人TNFR2为白色，而TNF为灰色)。
图37A是示出了通过流式细胞术评估的小鼠TNFR2的CRD1区中的各种突变对小鼠抗TNFR2抗体Y9的结合的影响的图。通过流式细胞术评估与小鼠TNFR2的结合。使用四参数剂量响应拟合结合曲线。图37B和37C是示出了通过流式细胞术评估的小鼠TNFR2的CRD1区(Y25T、K28E和M31A)中的另外的突变对小鼠抗TNFR2抗体Y9的结合的影响的图。使用四参数剂量响应拟合结合曲线。图37D是同源性模型，其中R27和N47以黑色突出显示(人TNFR2为白色，而TNF为灰色)。图37E是同源性模型，其中导致与小鼠TNFR2结合的Y9抗体丧失的所有五个突变(Y25、R27、K28、M31和N47)以黑色突出显示(人TNFR2为白色，而TNF为灰色)。
图38是示出了嵌合抗人TNFR2抗体ABV2c在人源化小鼠的患者源性的异种模型中的抗肿瘤活性的图。示出的是具有平均值和平均值标准误差的肿瘤生长动力学(N＝每臂9只动物)。在研究结束时的第72天，使用ANOVA和Tukey的诚实显著性差异程序进行多重比较校正，评估统计显著性。
图39A-39C是示出了抗体ABV2c、ABV2.13和ABV2.7对CD4+T细胞增殖(图39A)、CD4+T细胞扩增(如活细胞总数反映的(图39B))，以及PD-1阳性的CD4+T细胞百分比(如通过流式细胞术评估(图39C))的影响的图。示出的数据来自单个供体，代表2个个体供体。
图40A和40B是示出了通过流式细胞术评估的，抗体ABV2c、ABV2.13和ABV2.7对细胞内IFN-γ(图40A)和细胞内IL-2(图40B)呈阳性的CD4+T细胞百分比的影响的图。数据来自单个供体，代表2个个体供体。
图41A-41G是示出了用Luminex平台评估的，抗体ABV2c、ABV2.13和ABV2.7对受刺激的CD4+T细胞产生的Th-1相关细胞因子(图41A：IL-2，图41B：IFN-γ，图41C：TNF，图41D：GM-CSF)和Th2相关细胞因子(图41E：IL-4，图41F：IL-5，图41G：IL-13)的数量的影响的图。数据来自单个供体，代表2个个体供体。
图42是示出了抗体ABV2c、ABV2.13、ABV2.15和ABV2.7对人TNFR2报告基因细胞系中NF-κB报告基因活性的影响的图。
图43A-43E是示出了抗体ABV2.1、ABV2.15和现有技术的对照抗体A-C对CD4+T细胞增殖(图43A和43B)、CD4+T细胞扩增(图43C)、百分比PD-1阳性的CD4+T细胞(图43D)和NF-kB活性(图43E)的影响的图。
具体实施方式
一概述
本文提供了分离的抗体，尤其是重组的单克隆抗体，例如人单克隆抗体，其特异性结合TNFR2(例如人TNFR2)上的特定表位。本文还提供了制备抗体、免疫缀合物和多特异性分子的方法以及包含该抗体的药物组合物，以及使用抗体抑制肿瘤生长、治疗癌症、治疗自身免疫性疾病、治疗移植物抗宿主病和促进移植物存活和/或减少移植物排斥的方法。
二定义
为了本说明书可更易于理解，首先定义某些术语。在整个详细说明中阐述了另外的定义。
术语“肿瘤坏死因子受体2”、“TNFR2”、“CD120b”、“p75”、“p75TNFR”、“p80TNF-α受体”、“TBPII”、“TNFBR”、“TNFR1B”、“TNF-R75”和“TNFR80”在本文中可互换使用，包括所有家族成员、突变型、等位基因、片段和物种，并且是指具有下文阐述氨基酸序列(人和小鼠)的蛋白质。TNFR2的胞外结构域包括四个半胱氨酸富集结构域(CRD1-CRD4)，其序列汇总于表1。表1中CRD区的编号基于具有前导序列(即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3)的人和小鼠TNFR2。图1提供了小鼠和人TNFR2氨基酸序列的比对。
人TNFR2(NP_001057)(前导序列带有下划线)：
MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPG
QHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTC
RPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICR
PHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTS
FLLPMGPSPPAEGSTGDFALPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVIMTQVKKKPLCLQREAKV
PHLPADKARGTQGPEQQHLLITAPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGVEASGAGE
ARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTMGDTDSSPSESPKDEQ
VPFSKEECAFRSQLETPETLLGSTEEKPLPLGVPDAGMKPS(SEQ ID NO:1)
小鼠TNFR2(NP_035740)(前导序列带有下划线)：
MAPAALWVALVFELQLWATGHTVPAQVVLTPYKPEPGYECQISQEYYDRKAQMCCAKCPP
GQYVKHFCNKTSDTVCADCEASMYTQVWNQFRTCLSCSSSCTTDQVEIRACTKQQNRVCA
CEAGRYCALKTHSGSCRQCMRLSKCGPGFGVASSRAPNGNVLCKACAPGTFSDTTSSTDV
CRPHRICSILAIPGNASTDAVCAPESPTLSAIPRTLYVSQPEPTRSQPLDQEPGPSQTPS
ILTSLGSTPIIEQSTKGGISLPIGLIVGVTSLGLLMLGLVNCIILVQRKKKPSCLQRDAK
VPHVPDEKSQDAVGLEQQHLLTTAPSSSSSSLESSASAGDRRAPPGGHPQARVMAEAQGF
QEARASSRISDSSHGSHGTHVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASATVGDPDAKPSASPKD
EQVPFSQEECPSQSPCETTETLQSHEKPLPLGVPDMGMKPSQAGWFDQIAVKVA
(SEQ ID NO:3)
表1：
半胱氨酸富集结构域(CRD) 小鼠氨基酸残基A 人氨基酸残基B
CRD1 39-77 39-76
CRD1 A1 40-55 40-53
CRD1 B2 56-76 54-75
CRD2 78-120 77-118
CRD2 A1 79-94 78-93
CRD2 B2 97-119 96-118
CRD3 120-164 119-162
CRD3 A2 121-139 120-137
CRD3 B1 145-163 143-161
CRD4 165-203 163-201
CRD4 A1 166-180 164-179
CRD4 B1 187-202 185-200
A-小鼠TNFR2(UniProt ID：P25119)
B–人TNFR2(UniProt ID：P20333)
TNFR2与TNFR1一起介导TNFα的活性。TNFR1是55kD的膜结合蛋白，而TNFR2是75kD的膜结合蛋白。TNFR2可以调节TNFα与TNFR1的结合，因此可调节刺激NF-kB作用所必需的TNFα的水平。TNFR2也可以被金属蛋白酶切割(或进行选择性剪接)，从而产生维持对TNFα亲和力的可溶受体。
如本文所用，“TNFR2嵌合体”是指人TNFR2蛋白，其胞外结构域内的某些区被相应的小鼠TNFR2序列取代。图5A提供了示例性TNFR2嵌合体的示意图，表2提供了有关交换结构域的细节。
如本文可互换使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(抗原结合部分)或其单链同源物。“抗体”包含至少一条重(H)链和一条轻(L)链。例如，在天然存在的IgG中，这些重链和轻链通过二硫键相互连接，并且有两个成对的重链和轻链，这两个也通过二硫键相互连接。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可进一步细分为超突变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区，称为框架区(FR)或连接(J)区(分别为JH或JL重链和轻链)。每个VH和VL由三个CDR、三个FR和一个J结构域组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、J。重链和轻链的可变区与抗原结合。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)或体液因子诸如经典补体系统的第一组分(CIq)。已表明全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。表示为抗原结合部分或抗体片段的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；(v)dAb，其包括VH和VL结构域；(vi)dAb片段(Ward等人.(1989)自然(Nature)341,544-546)，其由VH结构域组成；(vii)dAb，其由VH和VL结构域组成；(viii)分离的互补决定区(CDR)；或(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，其可以任选地通过合成接头连接。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，从而使它们成为一条蛋白链，其中VL和VH区配对形成单价分子(免疫球蛋白片段的此类单链同源物称为单链Fv(scFv))。此类单链抗体也意在涵盖在术语“抗体”之内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得抗体片段，并以与完整抗体相同的通用方式筛选片段的效用。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或完整的免疫球蛋白的酶促或化学裂解来产生。除非另有说明，否则本文所述抗体中氨基酸位置的编号(例如Fc区中的氨基酸残基)和目标区(例如CDR)的识别均使用Kabat系统(Kabat,E.A.等人(1991)免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第五版，美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Healthand Human Services)，NIH出版号91-3242)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从大体上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变以外，包含该群体的单个抗体是相同的。此类免疫球蛋白的抗原结合片段(包括scFv)也被如本文所用的术语“单克隆抗体”涵盖。单克隆抗体针对单个抗原位点具有高度特异性。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。可以使用任何本领域公认的技术和本文所述的那些技术来制备单克隆抗体诸如，例如杂交瘤方法、转基因动物、重组DNA方法(参见，例如美国专利第4,816,567号)，或使用噬菌体抗体文库，其使用例如美国专利第7,388,088号和美国专利申请序列第09/856,907号(PCT国际公开第WO 00/31246号)。单克隆抗体包括嵌合抗体、人抗体和人源化抗体，并且可天然存在或重组产生。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。
术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，诸如(a)从针对免疫球蛋白基因(例如人免疫球蛋白基因)转基因或转染色体的动物(例如小鼠)分离的抗体或由此制备的杂交瘤，(b)从转化为表达该抗体的宿主细胞中分离的抗体，例如从转染瘤中，(c)使用噬菌体展示从重组组合抗体文库(例如含有人抗体序列的抗体)中分离的抗体，和(d)通过涉及免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因)与其他DNA序列剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体可具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体可以进行体外诱变，因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然源自人种系VH和VL序列并与之相关的序列，但可能不天然存在于体内的人抗体种系库中。
术语“嵌合免疫球蛋白”或“嵌合抗体”是指其可变区源自第一物种而其恒定区源自第二物种的免疫球蛋白或抗体。嵌合免疫球蛋白或抗体可以例如通过基因工程由属于不同物种的免疫球蛋白基因区段构建。
术语“人源化抗体”是指包括至少一条人源化抗体链(即，至少一条人源化轻链或重链)的抗体。术语“人源化抗体链”(即“人源化免疫球蛋白轻链”)是指具有可变区的抗体链(即分别为轻链或重链)，该可变区包括大体上来自人抗体的可变框架区和大体上来自非人抗体的互补决定区(CDR)(例如至少一个CDR、两个CDR或三个CDR)。在一些实施方案中，人源化抗体链还包括恒定区(例如在轻链的情况下，一个恒定区或其一部分，在重链的情况下，优选三个恒定区)。
如本文所用，术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中，例如Kabat等人所述，框架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列。(参见Kabat等人(1991)免疫目的的蛋白质序列(Sequences of proteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生和公共服务部，NIH出版号91-3242)。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。人抗体可包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”意在不包括其中衍生自另一哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列移植到了人框架序列上的抗体。
人抗体可以具有至少一个或多个被氨基酸残基替换的氨基酸，例如不被人种系免疫球蛋白序列编码的活性增强氨基酸残基。通常，人抗体可以具有多达二十个位置被不属于人种系免疫球蛋白序列一部分的氨基酸残基替换。在一个特定的实施方案中，这些替换在CDR区内，如下文详细描述的。
“双特异性”或“双功能抗体”是具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点的人工杂合抗体。可以通过多种方法产生双特异性抗体，包括杂交瘤的融合或Fab'片段的连接。参见例如Songsivilai&Lachmann，临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)79:315-321(1990),Kostelny等人，免疫学杂志(J.Immunol.)148,1547-1553,(1992)。
如本文所用，“分离的”意在指大体上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。另外，分离的抗体通常大体上不含其他细胞物质和/或化学物质。
“效应子功能”是指抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用或由此产生的生化事件。示例性的“效应子功能”包括CIq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、FcγR介导的效应子功能，诸如ADCC和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，以及细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调。此类效应子功能通常需要将Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合。
“Fc区”、“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C端区。因此，Fc区包含抗体的除了第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的恒定区(例如CH1或CL)
“抗原”是抗体结合的实体(例如，蛋白质实体或肽)，例如TNFR2。
术语“特异性结合(specific binding、specifically binds)”、“选择性结合(selective binding、selectively binds)”是指抗体对特定抗原或表位表现出可观的亲和力，并且通常不与其他抗原和表位表现出显著的交叉反应性。“可观的”或优选的结合包括以10-7、10-8、10-9或10-10M或更高的KD结合。抗体抗原相互作用的KD(亲和常数)表示50％的抗体和抗原分子结合在一起的抗体浓度。因此，在合适的固定抗原浓度下，与达到与较低亲和力抗体相同百分比结合所需的抗体浓度相比，50％的较高(即较强)亲和力抗体将以较低的抗体浓度结合抗原分子。因此，较低的KD值表示较高(较强)的亲和力。如本文所用，“更好”的亲和力是比它们的对照物更强的亲和力，并且数值更低，其中10-7M的KD数值更低，因此表现出比10-6M的KD更好的亲和力。通常优选亲和力比10-7M更好(即，具有更低的KD值，因此更强)，优选比10-8M更好。还考虑了本文阐述那些的中间值，并且优选的结合亲和力可以表示为亲和力的范围，例如，本文公开的抗TNFR2抗体的优选结合亲和力为10-7至10-12M，更优选10-8至10-12M。“不表现出显著的交叉反应性”或“不以生理相关的亲和力结合”的抗体是不会显著结合脱靶抗原(例如非TNFR2蛋白)或表位的抗体。例如，在一个实施方案中，特异性结合TNFR2的抗体与例如除TNFR2以外的蛋白质相比，将对TNFR2表现出至少两个、优选三个、或四个或更多数量级的更好结合亲和力(即，表现出两个、三个或四个或更多数量级的更低KD值的结合)。可以根据本领域公知的用于确定此类结合的任何方法来确定特异性或选择性结合，包括例如根据本文所述的Scatchard分析、Biacore分析、生物层干涉测量法和/或竞争(competitive、competition)结合测定法。
如本文所用，术语“KD”意在指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数或抗体对抗原的亲和力，其由kd与ka的比率(即，kd/ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域公知的方法确定。在一些实施方案中，当在BIACORE 3000仪器中用PallForteBio Octet RED96生物层干涉测量系统或表面等离子体共振(SPR)技术，使用重组TNFR2作为分析物以及抗体作为配体进行生物层干涉技术确定时，抗体以约小于10-7M，诸如大约小于10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的亲和力(KD)结合抗原，并且结合预定抗原的亲和力比其结合预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力至少高两倍。用于确定KD的其他方法包括经由流式细胞术(FACS)或使用
Figure BDA0003069622250000201
技术在溶液中与表达TNFR2的活细胞平衡结合。如本文所用，KD值是指单价KD。
如本文所用，术语“kassoc”或“ka”意在指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而如本文所用，术语“kdis”或“kd”意在指特定抗体与抗原相互作用的解离速率。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位既可以由连续氨基酸(通常为线性表位)形成，也可以由蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸(通常为构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常但不总是在暴露于变性溶剂中时保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。用于确定给定抗体结合哪些表位的方法(即表位作图)是本领域公知的，并且包括例如免疫印迹和免疫沉淀测定法，其中检测了重叠或连续的肽与给定抗体的反应性。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术，例如，x射线晶体学、2维核磁共振和HDX-MS(参见例如分子生物学方法表位作图试验指南(Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology)，第66卷，G.E.Morris编辑.(1996))。术语“表位作图”是指识别用于抗体-抗原识别的分子决定簇的过程。
关于两种或更多种抗体的术语“结合相同表位”是指抗体结合氨基酸残基的相同片段，如通过给定方法所确定的。用本文所述的抗体确定抗体是否与“TNFR2上的相同表位结合”的技术包括例如表位作图方法，诸如对抗原:抗体复合物的晶体进行x射线分析，其提供了表位和氢/氘交换质谱(HDX-MS)的原子分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段的结合或抗原的突变变异，其中通常认为由于抗原序列内氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失是表位成分的指示。另外，也可以使用用于表位作图的计算组合方法。这些方法依赖于目标抗体从组合噬菌体展示肽文库中亲和分离特定短肽的能力。具有相同的VH和VL或相同的CDR1、CDR2和CDR3序列的抗体有望与相同的表位结合。
“与另一种抗体竞争结合靶标的抗体”是指抑制(部分或完全)另一种抗体与靶标的结合的抗体。两种抗体是否彼此竞争结合靶标，即，一种抗体是否以及在何种程度上抑制另一种抗体与靶标的结合，可使用已知的竞争实验确定。在某些实施方案中，抗体与另一抗体竞争并抑制另一抗体与靶标的结合至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抑制或竞争的水平可能会有所不同，取决于哪种抗体是“封闭抗体”(即首先与靶标孵育的冷抗体)。竞争测定可以按照例如以下进行：Ed Harlow和David Lane，冷泉港实验室实验方案(Cold Spring Harb Protoc)；2006；doi:10.1101/pdb.prot4277或EdHarlow和David Lane，“抗体使用(Using Antibodies)”(1999)的第11章，美国纽约州冷泉港市冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。竞争抗体结合相同的表位、重叠的表位或相邻的表位(例如通过位阻证明)。其他竞争结合测定包括：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见Stahli等人，酶学方法(Methods in Enzymology)9:242(1983))；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等人.免疫学杂志,137:3614(1986))；固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见Harlow和Lane，抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)(1988)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)25(1):7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，病毒学(Virology)176:546(1990))；以及直接标记RIA(Moldenhauer等人,斯堪的纳维亚免疫学杂志(Scand.J.Immunol.)32:77(1990))。
如本文所用，术语“核酸分子”意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可是单链或双链的，但优选是双链DNA。
如本文所用，术语“分离的核酸分子”是指编码抗体或抗体片段(例如VH、VL、CDR3)的核酸，意在指其中核苷酸序列基本不含其他基因组核苷酸序列的核酸分子，例如，那些编码与除TNFR2以外的抗原结合的抗体的序列，这些其他序列可自然地位于人基因组DNA的核酸侧面。
如本文所用，术语“修饰(modifying或modification)”是指改变抗体或其抗原结合部分中或重组TNFR2蛋白上的一个或多个氨基酸(例如用于表位作图)。可以通过在一个或多个位置上添加、取代或删除氨基酸产生该改变。可以使用已知技术(诸如PCR诱变)产生该改变。例如，在一些实施方案中，可以修饰使用本文提供的方法识别的抗体或其抗原结合部分，从而改变抗体或其抗原结合部分对TNFR2的结合亲和力。
抗体序列中的“保守氨基酸取代”是指核苷酸和氨基酸序列修饰，其不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原(例如TNFR2)的结合。保守氨基酸取代包括一类氨基酸被同一类别的氨基酸取代，其中一类定义为共同的物理化学氨基酸侧链特性和在自然界发现的同源蛋白质的高取代频率，取决于例如，标准的Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵。氨基酸侧链分为六大类，包括：I类(Cys)；II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III类(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV类(His、Arg、Lys)；V类(Ile、Leu、Val、Met)；和VI类(Phe、Tyr、Trp)。例如，用Asp替换另一个III类残基，诸如Asn、Gln或Glu，是保守的替换。因此，优选将抗TNFR2抗体中预测的非必需氨基酸残基替换为同一类别的另一个氨基酸残基。识别不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域公知的。
术语“非保守氨基酸取代”是指一类氨基酸被另一类氨基酸取代；例如，II类残基Ala被III类残基诸如Asp、Asn、Glu或Gln取代。
另选地，在另一个实施方案中，可以沿抗TNFR2抗体编码序列的全部或部分随机引入突变(保守或非保守)，诸如通过饱和诱变，并且可以筛选所得修饰的抗TNFR2抗体的结合活性。
如本文所用，术语“载体”意在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。一种载体是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA片段。另一种载体是病毒载体，其中可以将另外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其已经引入的宿主细胞(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离基因的哺乳动物载体)中自主复制。在导入宿主细胞后，其他载体(例如，非游离基因的哺乳动物载体)可以融入宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。术语“质粒”和“载体”可以互换使用。然而，也可以考虑发挥等效功能的其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)意在指已将重组表达载体引入其中的细胞。应当理解，此类术语不仅意在指特定的对象细胞，而且还指此细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代中可能发生某些修饰，所以此种后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“连接的(linked)”是指两个或更多个分子的结合。连接可以是共价的或非共价的。连接也可以是遗传的(即，重组融合)。可以使用多种本领域公认的技术实现此类连接，诸如化学缀合和重组蛋白生产。
还提供了本文阐述的序列的“保守序列修饰”，即不消除由核苷酸序列编码或含有氨基酸序列的抗体与抗原的结合的氨基酸序列修饰。此类保守序列修饰包括保守的核苷酸和氨基酸取代，以及核苷酸和氨基酸的添加和缺失。例如，可以通过本领域已知的标准技术，诸如定点诱变和PCR介导的诱变，将修饰引入表10中的序列。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选抗TNFR2抗体中预测的非必需氨基酸残基被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于识别不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域公知的(参见例如Brummell等人,生物化学(Biochem.)32:1180-1187(1993),Kobayashi等人.蛋白质工程(Protein Eng.)12(10):879-884(1999)；和Burks等人.美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94:412-417(1997))。另选地，在另一个实施方案中，可以沿抗TNFR2抗体编码序列的全部或部分随机引入突变，诸如通过饱和诱变，并且可以筛选所得修饰的抗TNFR2抗体的结合活性。
对于核酸，术语“大体上同源性”表示当与合适的核苷酸插入或缺失最佳比对和比较时，两个核酸或其指定的序列有至少约80％的核苷酸，通常至少约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的核苷酸是相同的。另选地，当片段将在选择性杂交条件下与链的互补序列杂交时，存在大体上同源性。
对于多肽，术语“大体上同源性”表示当与合适的氨基酸插入或缺失最佳比对和比较时，两个多肽或其指定的序列有至少约80％的氨基酸，通常至少约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的氨基酸是相同的。
两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数量的函数(即，同源性％＝相同位置数/位置总数*100)，考虑到空位的数量和每个空位的长度，其需要引入以实现两个序列的最佳比对。如以下非限制性实例中所述，可以使用数学算法来完成序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序确定，使用NWSgapdna.CMP矩阵和空位权重40、50、60、70或80，以及长度权重1、2、3、4、5或6。两个核苷酸或两个氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller(CABIOS,4:11-17(1989))算法确定，使用PAM120残基量表、空位长度罚分12和空位罚分4。另外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(48):444-453(1970))算法确定，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，空位权重16、14、12、10、8、6或4，以及长度权重1、2、3、4、5或6。
本文所述的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，以对公共数据库进行搜索以例如识别相关序列。可以使用Altschul等人(1990)分子生物学杂志215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)执行此类搜索。可以用NBLAST程序、得分＝100、字长＝12进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序、得分＝50、字长＝3进行BLAST蛋白搜索，以获得与本文所述蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人(1997)核酸研究(NucleicAcids Res.)25(17):3389-3402中所述的使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
如本文所用，术语“抑制”是指生物学活性的任何统计学上显著的降低，包括活性的部分和全部阻断。例如，“抑制”可以指生物活性在统计上显著降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
如本文所用，短语“抑制TNFR2配体与TNFR2的结合”是指相对于在不存在抗体(对照)的情况下TNFR2配体的结合，抗体在统计学上显著降低TNFR2配体(例如TNFα)与TNFR2的结合的能力。换句话说，在存在抗体的情况下，相对于对照(无抗体)，与TNFR2结合的TNFR2配体的量在统计学上显著降低。在本文公开的抗TNFR2抗体存在下，与TNFR2结合的TNFR2配体的量可以相对于不存在抗体(对照)时的量降低至少约10％、或至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或约100％。TNFR2配体结合的降低可以使用本领域公认的技术来测量，该技术在存在或不存在(对照)抗体的情况下测量标记的TNFR2配体(例如放射性标记的TNFα)与表达TNFR2的细胞的结合水平。
如本文所用，术语“抑制肿瘤的生长”包括肿瘤生长的任何可测量的降低，例如，肿瘤生长被抑制至少约10％，例如至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约99％、或约100％。
如本文所用，术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指本文所述的治疗或预防措施。“治疗”的方法为向患有肿瘤或癌症的受试者或易患此种疾病或障碍的受试者施用本文所述的抗TNFR2抗体(例如抗人TNFR2抗体)，以预防、治疗、延迟、降低或改善该疾病或障碍或复发疾病或障碍的一种或多种症状，或延长受试者的生存期，使其超过不进行此类治疗时的预期生存期。
术语“癌症”和“癌性的”是指或描述哺乳动物体内通常以不受控制的细胞生长为特征的的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、神经胶质细胞瘤诸如胶质母细胞瘤和神经纤维瘤病、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer、renalcancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝细胞癌和各类头颈癌。
如本文所用，短语“长期抗癌效果”是指在用抗体进行初始治疗后，抗体诱导抑制癌症生长持续一段时间(例如至少6个月或更长时间)的能力。可例如通过测量肿瘤生长或通过定期检测缓解期受试者的血液样品中原发癌的记忆T细胞(例如检测对原发活检样品的反应性)的存在来评估持续的抗癌作用。
术语“有效剂量(effective dose或effective dosage)”定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以在已患有该疾病的患者中治愈或至少部分阻止该疾病及其并发症的量。该用途的有效量将取决于所治疗障碍的严重程度以及患者自身免疫系统的总体状态。
术语“治疗剂”意在涵盖具有以下能力的任何和所有化合物：减少或抑制疾病或障碍的症状的严重程度、或增加疾病或障碍中无症状或症状减轻期的频率和/或持续时间、或抑制或预防由于疾病或障碍痛苦导致的损伤或残疾、或抑制或延迟疾病或障碍的进展、或抑制或延迟疾病或障碍的发作、或抑制或预防感染性疾病或障碍中的感染。治疗剂的非限制性实例包括有机小分子、单克隆抗体、双特异性抗体、重组工程生物制剂、RNAi化合物和市售抗体。
如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任何一种，将包含治疗剂的组合物物理引入受试者。本文所述抗体的示例性施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”是指通常通过注射而不是肠内和局部施用的施用方式，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病变内、囊内、眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、椎管内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及活体电穿孔。另选地，本文所述的抗体可以通过非肠胃外途径施用，诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。施用也可以例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行。
术语“患者”包括接受预防性治疗或治疗性治疗的人类和其他哺乳动物受试者。
术语“受试者”包括任何哺乳动物。例如，本文公开的方法和组合物可以用于治疗患有癌症的受试者。在一个特定的实施方案中，受试者是人。
术语“样品”是指取自患者或受试者的组织、体液或细胞(或前述任何物质的一部分)。通常，将从患者体内取出组织或细胞，但是也可以考虑进行体内诊断。在实体瘤的情况下，可以从手术切除的肿瘤中获取组织样品，并通过常规技术为检测做准备。在淋巴瘤和白血病的情况下，可获得淋巴细胞、白血病细胞或淋巴组织(例如来自血液的白血病细胞)并适当地制备。其他样品，包括尿液、泪液、血清、血浆、脑脊液、粪便、痰液、细胞提取物等，也可用于特定癌症。
如本文所用，术语“约”是指指定值的正负10％。
如本文所用，术语“和/或”包括相关列出项目的一个或多个的任何和所有组合。例如，短语“A、B和/或C”意在涵盖A；B；C；A和B；A和C；B和C；和A、B和C。
如在本发明的说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一(a、an)”和“该”也意在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。
本公开的各个方面将在以下小节中进一步详述。
三抗TNFR2抗体
本文公开的抗TNFR2抗体(例如抗人TNFR2抗体)及其抗原结合片段可以通过特定的功能特征或特性来表征。例如，抗体结合人TNFR2的胞外结构域。抗TNFR2抗体还可诱导长期抗癌作用或抗癌记忆T细胞的发育。
在一些实施方案中，抗体结合人TNFR2的一个或多个半胱氨酸富集结构域(CRD)的一部分或全部。表1总结了对应于人和小鼠TNFR2 CRD的氨基酸残基。
因此，一方面，本文提供了抗TNFR2抗体，其与人TNFR2(SEQ ID NO:1)氨基酸残基23-54的全部或部分结合，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的55-77内的一个或多个氨基酸残基。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基23-54的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的55-77、60-77、65-77、70-77、75-77、55-75、55-70、55-65或55-60内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基23-54的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQID NO:1)的55-77、78-118、120-143或161-200内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基23-54的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的55-77、78-118、120-143和161-200内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基23-54的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的55-77、78-118、120-143和161-200内的氨基酸残基。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合大于50％(例如，大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、或大于95％)，如通过ELISA评估的(例如，如实例3所述))。
另一方面，本文提供了抗TNFR2抗体，其结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)氨基酸残基55-96的全部或部分，并且不显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如通过例如ELISA(例如，如实例3中所述)评估的，抑制TNF-α与人TNFR2的结合小于50％)。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-54内的一个或多个氨基酸残基。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQID NO:1)的23-54、23-44、23-36、23-30、23-25、25-54、30-54、35-54或40-54内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-54、97-118、120-143或161-200内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-54、97-118、120-143和161-200内的一个或多个氨基酸残基。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQID NO:1)的23-54、97-118、120-143和161-200内的氨基酸残基。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且与野生型人TNFR2相比，表现出与突变型人TNFR2的结合降低，该突变型人TNFR2包含一个或多个氨基酸残基上的取代(例如非保守取代)，该氨基酸残基选自由人TNFR2的(SEQ ID NO:1)的37、44、51、52、55、58、59、61、62、72、74、76、78和87组成的群组。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体不显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合小于50％，如通过ELISA评估的(例如，如实例3所述))。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体表现出TNFR2激动剂活性(例如，用至少50％的TNF-α效能诱导Treg细胞(例如，如实例10所述)中IKBa降解)。
另一方面，本文提供了抗TNFR2抗体，其与野生型人TNFR2相比，表现出与突变型人TNFR2的结合降低(例如，结合降低至少50％、结合降低至少80％或结合降低至少90％)，该突变型人TNFR2包含一个或多个氨基酸取代，该氨基酸取代选自由人TNFR2(SEQ ID NO:1)的G37D、E44A、Q51A、M52A、S55A、S58A、P59A、Q61A、H62A、D72A、V74A、D76A、S78A和W87A组成的群组。在一些实施方案中，抗TNFR2抗体不表现出与突变型人TNFR2的结合降低(例如，不表现出结合降低大于50％、结合降低大于40％、结合降低大于30％、结合降低大于25％、结合降低大于20％、结合降低大于15％、结合降低大于10％、或结合降低大于5％)，该突变型人TNFR2包含一个或多个氨基酸取代，该氨基酸取代选自由T39A、R41A、L42A、R43A、K64A、V65A、K69A、T70A、S71A、E79A、D80A、R112A和/或E113A组成的群组。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体不显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合小于50％，如通过ELISA评估的(例如，如实例3所述))。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体表现出TNFR2激动剂活性(例如，用至少50％的TNF-α效能诱导Treg细胞(例如，如实例10所述)中IKBa降解)。
另一方面，本文提供了抗TNFR2抗体，其在一个或多个氨基酸残基上结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)，该氨基酸残基选自由G37、E44、Q51、M52、S55、S58、P59、Q61、H62、D72、V74、D76、S78和W87组成的群组。在一些实施方案中，抗TNFR2抗体在氨基酸残基S55和D72上结合人TNFR2。在一些实施方案中，抗TNFR2抗体在氨基酸残基T39、R41、D80、R112和/或E113上不结合人TNFR2。在一些实施方案中，抗TNFR2抗体在氨基酸残基T39、R41、L42、R43、K64、V65、K69、T70、S71、E79、D80、R112和/或E113上不结合人TNFR2。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体不显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合小于50％，如通过ELISA评估的(例如，如实例3所述))。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体表现出TNFR2激动剂活性(例如，用至少50％的TNF-α效能诱导Treg细胞(例如，如实例10所述)中IKBa降解)。
另一方面，本文提供了分离的抗体，其表现出与突变型人TNFR2结合的降低(例如，结合降低至少50％、结合降低至少60％、结合降低至少70％、结合降低至少80％或结合降低至少90％)，该突变型人TNFR2在人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基48或氨基酸残基68上包含取代(例如，非保守氨基酸取代(例如丙氨酸取代))。在一个实施方案中，本文提供了分离的抗体，其结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基48和/或氨基酸残基68的全部或部分。在一些实施方案中，抗体不表现出与突变型人TNFR2结合的降低(例如，结合降低不超过20％或结合降低不超过10％)，该突变型人TNFR2包含一个或多个氨基酸残基上的取代(例如，非保守氨基酸取代(例如丙氨酸取代))，该氨基酸残基选自由残基37、39、42、49、51、56、65、66、69、86、89和91组成的群组。在一些实施方案中，抗体不结合一个或多个氨基酸残基，该氨基酸残基选自由残基37、39、42、49、51、56、65、66、69、86、89和91组成的群组。在一些实施方案中，抗体不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基97-118、120-143和/或161-200。在一些实施方案中，通过酵母表面展示评估抗体与突变型TNFR2结合的降低。
另一方面，本文提供抗TNFR2抗体，其结合氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77或119-200内的一个或多个氨基酸。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77、23-75、23-70、23-65、23-60、23-55、23-50、23-45、23-35、23-30、23-25或119-120内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:X)的23-77、119-120、120-143或161-200内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77、119-120、120-143或161-200内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77、119-120、120-143和161-200内的氨基酸。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合大于50％(例如大于60％、大于70％、大于80％、大于90％或大于95％)，如通过ELISA评估的(例如，如实例3所述))。
另一方面，本文提供了抗TNFR2抗体，其(1)结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)氨基酸残基120-257的全部或部分，并且(2)不显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(SEQ ID NO:1)。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体(1)结合氨基酸残基120-257的全部或部分，(2)不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的78-118内的一个或多个氨基酸(例如，人TNFR2(SEQ ID NO:1)的78-118、78-115、78-110、78-105、78-100、78-95、78-90、78-85、78-80或23-77内的一个或多个氨基酸)，并且(3)不显著抑制TNF-α与人TNFR2(SEQ ID NO:1)的结合。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体(1)结合氨基酸残基120-257的全部或部分，(2)不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77或78-118内的一个或多个氨基酸，并且(3)不显著抑制TNF-α与人TNFR2(SEQ ID NO:1)的结合。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体(1)结合氨基酸残基120-257的全部或部分，(2)不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77和78-118内的一个或多个氨基酸，并且(3)不显著抑制TNF-α与人TNFR2(SEQ ID NO:1)的结合。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体(2)结合氨基酸残基120-257的全部或部分，(2)不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77和78-118内的氨基酸，并且(3)不显著抑制TNF-α与人TNFR2(SEQ ID NO:1)的结合。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体不显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合小于50％，如通过ELISA评估的(例如，如实例3所述))。
另一方面，本文提供了抗TNFR2抗体，其结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)氨基酸残基120-257的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的78-118内的一个或多个氨基酸残基。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)氨基酸残基120-257的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的78-118、78-115、78-110、78-105、78-100、78-95、78-90、78-85、78-80或23-77内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基120-257的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77或78-118内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基120-257的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77和78-118内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基120-257的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77和78-118内的氨基酸。
另一方面，本文提供了抗TNFR2抗体，其结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合23-77内的一个或多个氨基酸。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77、23-75、23-70、23-65、23-60、23-55、23-50、23-45、23-40、23-35、23-30或23-25内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的161-200内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体(1)结合人TNFR2(SEQID NO:1)的氨基酸残基78-118的全部或部分，(2)结合氨基酸残基120-143的全部或部分，并且(3)不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的161-200内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的120-143或161-200内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的120-143和161-200内的一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的120-143或161-200内的氨基酸。
本文所述的抗TNFR2抗体(例如抗人TNFR2抗体)的特征还在于它们与包含人TNFR2胞外结构域的多个嵌合受体之一结合，其中胞外结构域中的某些区被相应的小鼠TNFR2区(即“TNFR2嵌合体”)的部分取代。表2总结了示例性的TNFR2嵌合体，其可以任选地与抗体Fc区融合(例如，当用于结合测定中时；嵌合体-Fc融合体的序列提供于表5中)。图5A提供了TNFR2嵌合体的示意图。
表2
Figure BDA0003069622250000321
Figure BDA0003069622250000331
因此，另一方面，本文提供了抗人TNFR2抗体，其结合TNFR2嵌合体3(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12)(例如，以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，并且不结合TNFR2嵌合体0(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6)(例如，不以小于1*10- 5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD结合)。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体与TNFR2嵌合体3(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12)的结合亲和力比抗TNFR2抗体与TNFR2嵌合体0(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6)的亲和力高至少十倍(例如，至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少2000倍、至少5000倍或至少10,000倍)。
结合嵌合体3但不结合嵌合体0的示例性小鼠抗人TNFR2抗体包括由杂交瘤ABV3、ABV4、ABV7、ABV12、ABV13、ABV14、ABV15、ABV18和ABV19产生的抗体。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV3产生的抗体。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体包含杂交瘤ABV3产生的抗体的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV3产生的抗体的人源化或嵌合形式。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV4产生的抗体。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体包含杂交瘤ABV4产生的抗体的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV4产生的抗体的人源化或嵌合形式。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV7产生的抗体。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体包含杂交瘤ABV7产生的抗体的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV7产生的抗体的人源化或嵌合形式。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV12产生的抗体。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体包含杂交瘤ABV12产生的抗体的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV12产生的抗体的人源化或嵌合形式。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV13产生的抗体。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体包含杂交瘤ABV13产生的抗体的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV13产生的抗体的人源化或嵌合形式。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV14产生的抗体。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体包含杂交瘤ABV14产生的抗体的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV14产生的抗体的人源化或嵌合形式。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV15产生的抗体。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体包含杂交瘤ABV15产生的抗体的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV15产生的抗体的人源化或嵌合形式。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV18产生的抗体。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体包含杂交瘤ABV18产生的抗体的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV18产生的抗体的人源化或嵌合形式。
在一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV19产生的抗体。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体包含杂交瘤ABV19产生的抗体的VHCDR1-3和VLCDR1-3序列。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体是杂交瘤ABV19产生的抗体的人源化或嵌合形式。
在一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体结合TNFR2嵌合体3、4、5、7和/或9(分别为SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:12、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:24))(例如，以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10- 7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，但不结合TNFR2嵌合体0、1、2、6和/或8(分别为SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21(或SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22))(例如，不以小于1*10-5M、小于1*10- 6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD结合)。在另一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体3、4、5、7和9(分别为SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQID NO:15、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24))。在另一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体3、4、5、7和9(分别为SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:24))，但不以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体0、1、2、6和8(SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21(或SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22)。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合大于50％(例如，大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、或大于95％)，如通过ELISA评估的(例如，如实例3所述))。
另一方面，本文提供了抗人TNFR2抗体，其结合TNFR2嵌合体7(SEQ ID NO:19或SEQID NO:20)(例如，以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，但不结合TNFR2嵌合体4(SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14)(例如，不以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD结合)。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体与TNFR2嵌合体7(SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20)的结合亲和力比抗TNFR2抗体与TNFR2嵌合体4(SEQID NO:13或SEQ ID NO:14)的亲和力高至少十倍(例如，至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少2000倍、至少5000倍或至少10,000倍)。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体不显著抑制TNF-α与人TNFR2(SEQ ID NO:1)的结合小于约50％(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合(SEQ ID NO:1)，如通过例如ELISA评估的(例如，如实例3所述))。在另一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体结合TNFR2嵌合体5、7和/或9(分别为SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20和SEQ IDNO:24))(例如，以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，但不结合TNFR2嵌合体0、1、2、3、4、6和/或8(分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21(或SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22))(例如，不以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD结合)。在另一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体5、7和9(分别为SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24))。在另一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体结合TNFR2嵌合体5、7和9(分别为SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:19和SEQ IDNO:23(或SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24))(例如，以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，但不以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体0、1、2、3、4、6和8(分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:21(或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22)。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体不显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合小于50％，如通过ELISA评估的(例如，如实例3所述))。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体表现出TNFR2激动剂活性(例如，用至少50％的TNF-α效能诱导Treg细胞(例如，如实例10所述)中IKBa降解)。
另一方面，本文提供了抗人TNFR2抗体，其结合TNFR2嵌合体1(SEQ ID NO:7或SEQID NO:8)(例如，以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，但不结合TNFR2嵌合体2(SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10)(例如，不以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD结合)。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体与TNFR2嵌合体1(SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8)的结合亲和力比抗TNFR2抗体与TNFR2嵌合体2(SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:10)的亲和力高至少十倍(例如，至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、至少1000倍、至少2000倍、至少5000倍或至少10,000倍)。在一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体结合TNFR2嵌合体0、1和/或5(分别为SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:15(或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:16))(例如，以小于1*10- 5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，但不结合TNFR2嵌合体2、3、4、6、7、8和/或9(分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24))(例如，不以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD结合)。在另一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体0、1和5(分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:15(或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16))。在另一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体结合TNFR2嵌合体0、1和5(分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:15(或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:16))(例如，以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，但不以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体2、3、4、6、7、8和9(分别为SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:24)。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合大于50％(例如，大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、或大于95％)，如通过ELISA评估的(例如，如实例3所述))。
另一方面，本文提供了抗人TNFR2抗体，其结合TNFR2嵌合体0、1、2、5和/或8(SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:21(或SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:22))(例如，以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，但不结合TNFR2嵌合体3、4、6、7和/或9(分别为SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24))(例如，不以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD结合)。在一个实施方案中，抗TNFR2抗体不抑制TNF-α与人TNFR2(SEQ ID NO:1)的结合。在另一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体0、1、2、5和8(分别为SEQ ID NO:5、SEQID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:21(或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:22))。在一些实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体结合TNFR2嵌合体0、1、2、5和8(分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:15和SEQ ID NO:21(或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:16和SEQID NO:22))(例如，以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，但不以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体3、4、6、7和9(分别为SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24))。在一些实施方案中，抗体不以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD结合TNFR2嵌合体8。在该方面的一些实施方案中，抗TNFR2抗体不显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合(例如，抑制TNF-α与人TNFR2的结合小于50％，如通过ELISA评估的(例如，如实例3所述))。
另一方面，本文提供了抗人TNFR2抗体，其结合TNFR2嵌合体0、1、2、5和/或8(SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:21(或SEQ ID NO:6、SEQID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:22))(例如，以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M、小于1*10-8M或小于1*10-9M的KD)，但不结合TNFR2嵌合体3、4、6、7和/或9(分别为SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:24))(例如，不以小于1*10-5M、小于1*10-6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD结合)。在一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体0、1、2、5和/或8(分别为SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:21(或SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:22))。在一些实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体结合TNFR2嵌合体0、1、2、5和8(分别为SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:21(或SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:22))，但不以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体3、4、6、7和9(SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:23(或SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:24))。
本文公开的抗TNFR2抗体还可以表征为特定的功能和结构特征(例如，CDR、可变区、重链和轻链)。
因此，在一个实施方案中，该抗体结合人TNFR2并且包含重链和轻链可变区对的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，该重链和轻链可变区对分别包含以下阐述的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72，(b)SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:86，(c)SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171，(d)SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:149或(e)SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:127。在一些实施方案中，使用Kabat编号来定义CDR序列。在其他实施方案中，使用Chothia编号来定义CDR序列。在其他实施方案中，使用IMGT编号定义CDR序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:47、SEQID NO:48和SEQ ID NO:49的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:50、SEQID NO:51和SEQ ID NO:52的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:53、SEQID NO:54和SEQ ID NO:55的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:56、SEQID NO:57和SEQ ID NO:58的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:59、SEQID NO:60和SEQ ID NO:61的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:62、SEQID NO:63和SEQ ID NO:64的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:65、SEQID NO:66和SEQ ID NO:67的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:68、SEQID NO:69和SEQ ID NO:70的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156和SEQ ID NO:157的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:163的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137和SEQ ID NO:138的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140和SEQ ID NO:141的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:143和SEQ ID NO:144的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118和SEQ ID NO:119的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其包含分别包含SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:121和SEQ ID NO:122的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:125的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体包含上述重链CDR序列和恒定区，例如人IgG恒定区(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体)。在其他实施方案中，可以将包含上述重链CDR序列的重链可变区连接至恒定结构域以形成重链(例如，全长重链)。类似地，可以将包含上述轻链CDR序列的轻链可变区连接至恒定区以形成轻链(例如，全长轻链)。全长重链(C端赖氨酸(K)除外，或C端甘氨酸和赖氨酸(GK)除外，其可能缺失或被去除)和全长轻链结合形成全长抗体。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含选自由SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:170组成的群组的氨基酸序列。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQID NO:100、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:171组成的群组的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TNFR2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区包含选自由SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ IDNO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:170组成的群组的氨基酸序列，并且轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:171组成的群组的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区和/或轻链可变区序列与上述重链和/或轻链可变区序列(例如，SEQ ID NO:71-100、SEQ IDNO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171)至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同。在其他实施方案中，重链和/或轻链可变区序列(例如，SEQ ID NO:71-100、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171)具有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸取代(例如,保守氨基酸取代)。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体包含任何SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:126、SEQID NO:148和SEQ ID NO:170的重链可变区序列和恒定区，例如人IgG恒定区(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体)。在其他实施方案中，任何SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:170的重链可变区序列可以连接至恒定结构域以形成重链(例如全长重链)。类似地，任何SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:171的轻链可变区序列可以连接至恒定区以形成轻链(例如全长轻链)。全长重链(C端赖氨酸(K)除外，或C端甘氨酸和赖氨酸(GK)除外，其可能缺失或被去除)和全长轻链结合形成全长抗体。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体包含重链和轻链可变区序列，其分别与SEQ IDNO:71和/或SEQ ID NO:72所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体包含有包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体包含重链和轻链可变区序列，其分别与SEQ IDNO:74和/或SEQ ID NO:86所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体包含有包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体包含重链和轻链可变区序列，其分别与SEQ IDNO:170和/或SEQ ID NO:171所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体包含有包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体包含重链和轻链可变区序列，其分别与SEQ IDNO:148和/或SEQ ID NO:149所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体包含有包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体包含重链和轻链可变区序列，其分别与SEQ IDNO:126和/或SEQ ID NO:127所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体包含有包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，上述重链和/或轻链可变区序列具有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)。
在一些实施方案中，包含本文所述的重链和轻链CDR序列或重链和轻链可变区序列的抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体(例如，重组人、人源化抗体或嵌合抗体)。
在一些实施方案中，抗人TNFR2抗体包含上述重链可变区序列和恒定区，例如人IgG恒定区(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体)以形成重链(例如，全长重链)。类似地，可以将包含上述轻链可变区序列的轻链可变区连接至恒定区以形成轻链(例如，全长轻链)。全长重链(C端赖氨酸(K)除外，或C端甘氨酸和赖氨酸(GK)除外，其可能缺失或被去除)和全长轻链结合形成全长抗体。
在一些实施方案中，本文提供抗TNFR2抗体，其包含重链和轻链序列，其分别与SEQID NO:101和/或SEQ ID NO:102所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
在一些实施方案中，本文提供抗TNFR2抗体，其包含重链和轻链序列，其分别与SEQID NO:150和/或SEQ ID NO:151所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
在一些实施方案中，本文提供抗TNFR2抗体，其包含重链和轻链序列，其分别与SEQID NO:128和/或SEQ ID NO:129所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
在一些实施方案中，本文提供抗TNFR2抗体，其包含重链和轻链序列，其分别与SEQID NO:106和/或SEQ ID NO:107所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同。
在一些实施方案中，上述重链和/或轻链序列具有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体以例如10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M或10- 9M至10-7M的KD结合TNFR2(例如人TNFR2)或特定人TNFR2表位(诸如以上讨论的那些)的胞外结构域，如通过例如生物层干涉仪所评估的。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的不连续表位。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体不抑制TNFR2配体(例如TNFα)与TNFR2的结合。在一些实施方案中，抗TNFR2抗体部分抑制TNFR2配体(例如TNFα)与TNFR2的结合。在一些实施方案中，抗TNFR2抗体抑制TNFR2配体(例如TNFα)与TNFR2的结合。在一些实施方案中，相对于对照抗体(例如，不结合TNFR2的抗体)，抗TNFR2抗体抑制TNFR2配体(例如TNFα)与TNFR2的结合至少10％，例如至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。
在其他实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体激活细胞中的TNFR2信号传导途径(即激动剂抗体)。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体增加NF-kB活性，例如，如通过NF-kB报告基因细胞系(例如，经工程改造以表达人TNFR2的NF-kB报告基因细胞系)所评估的。在其他实施方案中，相对于对照(例如，同种型对照抗体或不表达人TNFR2的NF-kB报告基因细胞系)，抗TNFR2抗体将NF-kB活性提高例如，至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍。
在一些实施方案中，相对于对照(例如，没有抗体对照或同种型抗体对照)，抗TNFR2抗体降低了CD4+T细胞区室内的调节性T细胞(Treg)的百分比。在一些实施方案中，相对于对照(例如，没有抗体对照或同种型抗体对照)，抗TNFR2抗体将CD4+T细胞区室中Treg细胞的百分比降低约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％或约80％。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体在NK细胞存在下诱导ADCC。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体增强T细胞活化。在一些实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体增强CD4+和CD8+T细胞的激活，例如，如通过例如流式细胞术评估的激活标志物(例如，CD25、PD1)的表达增加所反映的。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体增加T细胞增殖。在一些实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体增加CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖。
在一些实施方案中，例如，如在移植物抗宿主病(GvHD)模型中所评估的，抗TNFR2抗体减少(保护)移植物排斥。可以例如通过与对照比较来评估减少的移植物排斥(例如，相对于用对照抗体或溶媒或无关抗体治疗，存活延长)。
在一些实施方案中，相对于对照疗法，抗TNFR2抗体抑制肿瘤生长，例如，抑制10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多或95％或更多。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体抑制肿瘤生长与激动TNFR2信号传导的能力无关。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体抑制肿瘤生长与抑制TNF-α与TNFR2结合的能力无关。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体诱导长期抗癌作用(例如，在用抗TNFR2抗体治疗后的持续时间段内抑制肿瘤生长)。在一个特定的实施方案中，与对照(例如，未用抗TNFR2抗体治疗的受试者)相比，抗TNFR2抗体诱导抗癌记忆T细胞的发育。
本文还提供了诱导长期抗癌作用的方法，包含向患有癌症的受试者施用本文所述的抗TNFR2抗体。
在一个实施方案中，可以在人类癌症的小鼠模型(例如，转基因模型、人源化模型和/或嵌合、同种异体移植物和异种移植物模型)中测量长期抗癌作用。在用抗TNFR2抗体初治后表现出肿瘤消退的小鼠中，可以监测例如至少6个月的肿瘤复发(或抑制)。在其他实施方案中，可以监测肿瘤复发(或抑制)至少1年或更长时间或至少2年或更长时间。
在另一个实施方案中，为了确定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是否已经发育成记忆T细胞，可以在肿瘤消退后的不同时间点将不同剂量的相同肿瘤细胞重新接种到肿瘤消退的小鼠中，然后监测受者小鼠中的肿瘤生长。野生型小鼠可以接种与对照相同的肿瘤。为了确定肿瘤退化的小鼠中肿瘤特异性记忆T细胞的频率，可以使用特定的癌细胞抗原作为靶标进行体外细胞毒性测定。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体是单克隆抗体，例如单克隆人抗体。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如根据本领域已知的方法和本文所述的方法所确定的，表现出上述一种或多种功能特性(例如，生物化学、免疫化学、细胞、生理或其他生物活性等)的抗体应理解为涉及相对于不存在抗体(例如，或存在无关特异性的对照抗体时)所见的，特定活性具有统计上的显著差异。优选地，抗TNFR2抗体诱导的测量参数的增加在统计上显著增加了测量参数的至少10％，更优选地增加了至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％(即2倍)、3倍、5倍或10倍。相反，抗TNFR2抗体诱导的测量参数(例如，肿瘤体积、与TNFR2结合的TNFα)的降低在统计上显著降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体的VH结构域连接至恒定结构域以形成重链，例如全长重链。在其他实施方案中，VH结构域连接至人IgG(例如,IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)或其变体(例如，包含具有增强的效应子功能的Fc区的变体)的恒定结构域。类似地，本文所述的抗TNFR2抗体的VL结构域连接至恒定结构域以形成轻链，例如全长轻链。
本文公开的抗体包括所有已知形式的抗体和具有抗体样特性的其他蛋白质支架。例如，抗体可以是人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、免疫缀合物、嵌合抗体或具有抗体样特性的蛋白支架，诸如纤连蛋白或锚蛋白重复序列。抗体也可以是Fab、Fab’2、scFv、AFFIBODY、avimer、纳米抗体或结构域抗体。抗体也可以具有任何同种型，包括以下任何同种型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE。可以使用标准重组DNA技术和编码所需恒定区序列的核酸由VH和VL序列制备全长抗体，该序列将有效连接至可变区序列。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的以下位置的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或所有五个位置)(根据SEQ ID NO:104编号)：Y24、Q26、Q29、M30和K47。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的表位，该表位由人TNFR2上的以下位置的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或所有五个位置)组成(根据SEQ ID NO:104编号)：Y24、Q26、Q29、M30和K47。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的表位，该表位跨越人TNFR2的氨基酸位置24-47、位于其之间，和/或与其重叠(根据SEQ ID NO:104编号)。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体与本文所述的抗TNFR2抗体结合TNFR2上相同的表位。在其他实施方案中，抗体与本文所述的抗TNFR2抗体竞争结合TNFR2。
在一些实施方案中，相对于未修饰形式的相同抗体，修饰抗TNFR2抗体以增强效应子功能。在其他实施方案中，相对于未修饰形式的相同抗体，抗TNFR2抗体表现出提高的抗肿瘤活性。
因此，抗TNFR抗体的可变区可以连接至非天然存在的Fc区，例如，与一种或多种活化Fc受体(FcγI、FcγIIa或FcγIIIa)结合增强的Fc。通常，本文所述的可变区可连接至包含一种或多种修饰(例如，氨基酸取代、缺失和/或插入)的Fc，通常是为了相对于亲本Fc序列(例如未修饰的Fc多肽)，增强抗体的一种或多种功能特性，诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖的细胞的吞噬作用(ADCP)。此外，可对抗体进行化学修饰(例如，可以将一个或多个化学部分连接至抗体)，或者对其进行修饰以改变其糖基化，从而改变抗体的一种或多种功能特性。下面详细讨论了这些实施方案中的每一个实施方案。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。
治疗性抗体的Fcγ受体接合对其抗肿瘤活性可能是重要的(Clynes等人，自然医学(Nat Med)2000；6:443-6)。小鼠和人类都具有激活的Fcγ受体(例如，小鼠中的mFcγRI、mFcγRIII或mFcγRIV，人类中的hFcγRI、hFcγRIIa、hFcγRIIc、mFcγRIIIa或mFcγRIIIb)和抑制性Fcγ受体(小鼠中的mFcγRIIb和人类中的hFcγRIIb)(Nimmerjahn等人，自然评论免疫学(Nat Rev Immunol)2008；8:34-47)。Fcγ受体接合可以表明：1)抗体的效应子功能的贡献，诸如经由激活Fcγ受体的抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)、调理作用或抗体依赖的细胞的吞噬作用(ADCP)(Dahan等人，癌细胞(Cancer Cell)2015；28:285-95)；或2)经由在表达Fcγ受体的细胞类型上聚集抗体增强激动作用(Nimmerjahn等人，免疫学趋势(Trends in Immunology)2015；36:325-36)。因此，在一些实施方案中，本文提供了抗TNFR2抗体，其介导T细胞的激动活性和共刺激。对于增强的激动作用，抑制性Fcγ受体FcγRIIb描述为对促进激动作用最重要(参见，例如Dahan等人，癌细胞，2016；29:820-31)。
各种抗体IgG同种型对于结合某些Fcγ受体具有不同的偏好(Bruhns等人，血液(Blood)2012；119:5640-9)。在人类中，IgG1抗体是介导效应子功能(诸如ADCC或ADCP)的优选同种型，因为它们对激活Fcγ受体具有高亲和力。已经描述了抗体Fc的各种突变，其改变了与各种Fcγ受体的结合特性，因此可以调节抗体的活性。N297A突变(NA)、D265A/N297A突变(DANA)或D265A/N297G突变(DANG)减少或消除与所有Fcγ受体的结合(Lo等人，生物化学杂志(J Biol Chem)2017；292:3900-8)，因此降低了效应子功能的能力或增强了激动作用。L234A/L235A突变(LALA)减少或消除了与所有Fcγ受体的结合(Arduin等人，分子免疫学(Mol Immunol)2015；63:456-63)。类似地，已描述了与FcγRIIb结合增强并因此提高的激动活性的突变(参见，例如Dahan等人，癌细胞2016；29:820-31)，诸如S267E突变(SE)、S267E和L328F突变(SELF)、G237D/P238D/P271G/A330R突变(V9)、E233D/P238D/H268D/P271G/A330R突变(V10)、G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变(V11)或E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变(V12)(Mimoto等人，蛋白质工程设计与选择(Protein Eng DesSel)2013；26:589-98)。
因此，抗TNFR2抗体可包含变体Fc区(例如,变体IgG1 Fc区)。在一些实施方案中，相对于用Fc区的相应非变体版本观察到的结合，变体Fc区增加了与Fcγ受体的结合(例如，如果变体Fc区是变体IgG1 Fc区，则相应的非变体版本是野生型IgG1 Fc区)。在一些实施方案中，变体Fc区(例如，变体IgG1 Fc区)增加了与FcγRIIb受体的结合。在一些实施方案中，变体Fc区相对于相应的野生型Fc区增加抗体聚集。在一些实施方案中，抗体包含变体Fc区并且相对于具有相应非变体版本的Fc区的抗体表现出提高的激动活性。在一些实施方案中，抗体共刺激T细胞。在一些实施方案中，变体Fc区是变体IgG1 Fc区。在一些实施方案中，Fc区具有267E突变(SE)、S267E/L328F突变(SELF)、G237D/P238D/P271G/A330R突变、E233D/P238D/H268D/P271G/A330R突变、G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变或E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R突变。下文描述了用于改变效应子功能的Fc区的其他示例性修饰。
可以在Fc区进行修饰以生成Fc变体，该Fc变体相对于亲本Fc(a)具有增加的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，(b)具有增加的抗体依赖的细胞的细胞吞噬作用(ADCP)，(c)具有增加的补体介导的细胞毒性(CDC)，(d)具有增加的CIq亲和力和/或(e)具有增加的Fc受体亲和力。此类Fc区变体通常将在Fc区中包含至少一种氨基酸修饰。结合氨基酸修饰被认为是特别需要的。例如，变体Fc区可在其中包括两个、三个、四个、五个等取代，例如本文确定的特定Fc区位置的取代。
在一些实施方案中，通过用不同的氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基替换，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。需改变亲和力的效应配体可以是例如，Fc受体或补体的C1成分。这种方法详细描述于Winter等人的美国专利第5,624,821号和第5,648,260号中。
在一些实施方案中，可通过修饰以下位置的一个或多个氨基酸来修饰Fc区以增加抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或增加对Fcγ受体的亲和力：234、235、236、238、239、240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。示例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。取代的示例性组合包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F/324T。用于增强FcyR和补体相互作用的其它修饰包括但不限于取代298A、333A、334A、326A、247I、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I和396L。这些和其他修饰在Strohl等人，生物技术近期述评(CurrentOpinion in Biotechnology)2009；20:685-691中进行了评审。
增加与Fcγ受体结合的Fc修饰包括在Fc区的以下氨基酸位置的任何一个或多个的氨基酸修饰：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、279、280、283、285、298、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、312、315、324、327、329、330、335、337、3338、340、360、373、376、379、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439，其中Fc区的残基编号是Kabat(WO00/42072)中的EU指数的编号。
也可使用增强对抑制性受体FcyRllb亲和力的Fc变体。此类变体可提供Fc融合蛋白，该Fc融合蛋白具有与FcγRIIb+细胞(包括例如B细胞和单核细胞)相关的免疫调节活性。在一个实施方案中，相对于一种或多种活化受体，Fc变体提供对FcγRIIb选择性增强的亲和力。根据EU指数，改变与FcyRllb结合的修饰包括在选自由234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332组成的群组中的位置的一个或多个修饰。用于增强FcyRllb亲和力的示例性取代包括但不限于234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。用于增强与FcyRllb结合的其他Fc变体包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F。
Fc区对其配体的亲和力和结合特性可通过本领域已知的多种体外测定方法(基于生物化学或免疫学的测定)来确定，包括但不限于平衡方法(例如，酶联免疫吸附测定法(ELISA)或放射免疫测定法(RIA))或动力学(例如BIACORE分析)，以及其他方法诸如间接结合测定、竞争抑制测定、荧光共振能量转移(FRET)、凝胶电泳和色谱法(例如，凝胶过滤)。这些和其他方法可利用被检查的成分的一个或多个上的标记和/或采用各种检测方法，包括但不限于显色、荧光、发光或同位素标记。结合亲和力和动力学的详细描述可以在Paul，W.E.编辑的基础免疫学(Fundamental Immunology)，第4版，Lippincott-Raven，费城(1999)中找到，其重点是抗体-免疫原相互作用。
在某些实施方案中，抗体被修饰以增加其生物半衰期。例如，这可通过突变以下残基中的一个或多个来增加Fc区对FcRn的结合亲和力来完成：252、254、256、433、435、436，如美国专利第6,277,375所述。具体的示例性取代包括以下一种或多种：T252L、T254S和/或T256F。另选地，为了增加生物半衰期，可在CH1或CL区内将抗体改变成含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人在美国专利第5,869,046号和第6,121,022号中所述。增加与FcRn的结合和/或提高药动学特性的其他示例性变体包括在位置259、308、428和434处的取代，包括例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M。增加Fc与FcRn结合的其他变体包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004，生物化学杂志，279(8):6213-6216；Hinton等人，2006，免疫学杂志176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，生物化学杂志，2001，276(9):6591-6604)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(Dall Acqua等人，免疫学杂志，2002，169:5171-5180，Dall’Acqua等人，2006，生物化学杂志，281:23514-23524)。用于调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung等人，2010，免疫学杂志，182:7663-7671中。
绘制了人IgG1上FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并描述了结合提高的变体(参见Shields，R.L.等人(2001)生物化学杂志，276:6591-6604)。第256、290、298、333、334和339位的特定突变显示提高FcγRIII结合。另外，以下组合突变显示提高FcγRIII结合和ADCC活性：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A(Shields等人，见前文)。已识别与FcγRIIIa结合极为增强的其他IgG1变体，包括具有S239D/I332E和S239D/I332E/A330L突变的变体，这些变体显示，在食蟹猴中，对FcγRIIIa的亲和力增加最大，FcγRIIb结合减少以及细胞毒活性强(Lazar等人，2006)。将三重突变引入抗体诸如阿仑单抗(CD52特异性)、曲妥珠单抗(HER2/neu特异性)、利妥昔单抗(CD20特异性)和西妥昔单抗(EGFR特异性)在体外转化为大大增强的ADCC活性，并且S239D/I332E变体显示出增强的猴子B细胞消耗能力(Lazar等人，2006)。此外，在B细胞恶性肿瘤和乳腺癌模型中，在表达人FcγRIIIa的转基因小鼠中，已识别含有L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L突变的IgG1突变体，其表现出与FcγRIIIa的结合增强以及伴随增强的ADCC活性(Stavenhagen等人；2007；Nordstrom等人，2011)。可使用的其他Fc突变体包括：S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L和M428L/N434S。
在另一个实施方案中，抗体的糖基化被修饰。例如，可以制备无糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内糖基化位点的一个或多个来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除该位点的糖基化。此种方法在Co等人的美国专利第5,714,350号和第6,350,861号中进一步详细描述。在一个实施方案中，可通过将N297残基突变为另一个残基例如N297A和/或通过突变相邻的氨基酸例如298来防止N297上的恒定区的糖基化，从而减少N297上的糖基化。
另外地或另选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，诸如具有减少的岩藻糖基残基量的次岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明此类改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞已经在本领域中进行了描述，并且可以用作其中表达重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体的宿主细胞。在一些实施方案中，可以进行突变以恢复无糖基化抗体中的效应子功能，例如，如美国专利第8,815,237号中所述。示例性突变包括E269D、D270E、N297D、N297H、S298A、S298G、S298T、T299A、T299G、T299H、K326E、K326I、A327E、A327Y、L328A和L328G。
变体Fc区还可包含序列改变，其中涉及二硫键形成的氨基酸被去除或被其他氨基酸替换。此类去除可以避免与用于产生抗体的宿主细胞中存在的其他含半胱氨酸的蛋白质反应。即使在去除半胱氨酸残基时，单链Fc结构域仍可以形成非共价结合在一起的二聚体Fc结构域。
四与抗TNFR2抗体结合相同表位或与之竞争的抗体
还提供了与本文所述的抗TNFR2抗体结合TNFR2上相同表位的抗体。在一些实施方案中，本文提供了抗体，该抗体与本文所述的抗TNFR2抗体竞争结合TNFR2。
可以使用标准结合测定法(例如，ELISA、Biacore)，基于与本文所述的抗TNFR2抗体交叉竞争的能力来筛选交叉竞争的抗体。
用于确定与本文所述抗体“在TNFR2上的相同表位”结合的抗体的技术包括抗原:抗体复合物晶体的x射线分析，其提供了表位的原子分辨率。其他方法监测抗体与抗原片段或抗原突变变体的结合，其中由于抗原序列内氨基酸的修饰而导致的结合丧失表明了表位成分。方法也可依赖于目标抗体从组合噬菌体展示肽文库或靶蛋白的蛋白酶消化物中亲和分离特定短肽(天然三维形式或变性形式)的能力。这些肽视为对应于用于筛选肽文库的抗体的表位定义的前导。对于表位作图，还开发了计算算法，已表明对构象不连续的表位进行作图。
还可以通过筛选与跨越TNFR2的一系列重叠肽的结合来识别表位或包含表位的区。另选地，Jespers等人(1994)生物技术(Biotechnology)12:899的方法可用于指导选择具有相同表位并因此具有与本文所述的抗TNFR2抗体相似特性的抗体。使用噬菌体展示，首先，将抗TNFR2抗体的重链与一系列(例如人的)轻链配对以选择TNFR2结合抗体，然后将新的轻链与一系列(例如人的)重链配对，以选择具有与本文所述的抗TNFR2抗体相同的表位或表位区的(例如人的)TNFR2结合抗体。另选地，可以通过诱变编码抗体重链和轻链的cDNA序列来获得本文所述抗体的变体。
丙氨酸扫描诱变(如Cunningham&Wells(1989)科学(Science)244:1081所述)或TNFR2中氨基酸残基的一些其他形式的点诱变也可用于确定抗TNFR2抗体的功能表位。
被特异性抗体结合的表位或表位区(“表位区”是包含表位或与表位重叠的区)也可通过评估抗体与包含TNFR2片段的肽的结合来确定。可以合成涵盖TNFR2序列的一系列重叠肽，并筛选结合，例如在直接ELISA、竞争性ELISA(在其中评估了该肽防止抗体与结合在微量滴定板孔上的TNFR2结合的能力)中，或在芯片上。此类肽筛选方法可能不能检测某些不连续的功能表位，即涉及沿TNFR2多肽链的主要序列不连续的氨基酸残基的功能表位。
也可通过基于MS的蛋白质足迹诸如HDX-MS和蛋白质快速光化学氧化(FPOP)来识别表位。可进行HDX-MS例如，如在Wei等人(2014)今日药物发现(Drug Discovery Today)19:95中进一步描述的那样，其方法通过引用特别地并入本文。可进行FPOP例如，如Hambley&Gross(2005)美国质谱学会杂志(J.American Soc.Mass Spectrometry)16:2057中所述，其方法通过引用特别并入本文。
抗TNFR2抗体结合的表位还可通过结构方法来确定，诸如X射线晶体结构测定(例如，WO2005/044853)、分子建模和核磁共振(NMR)光谱法，包括当TNFR2中的不稳定酰胺氢游离时以及结合在带有目标抗体的复合物中时，TNFR2中不稳定酰胺氢H-D交换律的NMR测定(Zinn-Justin等人(1992)生物化学(Biochemistry)，31:11335；Zinn-Justin等人(1993)生物化学，32:6884)。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的以下位置的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或所有五个位置)(根据SEQ ID NO:104编号)：Y24、Q26、Q29、M30和K47。例如，在一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q26。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q29。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置M30。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24和Q26。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24和Q29。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24和M30。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q26和Q29。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q26和M30。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q26和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q29和M30。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q29和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置M30和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24、Q26和Q29。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24、Q26和M30。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24、Q26和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24、Q29和M30。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24、Q29和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24、M30和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q26、Q29和M30。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q26、Q29和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q29、M30和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24、Q26、Q29和M30。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24、Q26、Q29和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Q26、Q29、M30和K47。在另一个实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的位置Y24、Q26、Q29、M30和K47。
在一些实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的表位，该表位由人TNFR2上的以下位置的一个或多个(例如，一个、两个、三个、四个或所有五个位置)组成(根据SEQ ID NO:104编号)：Y24、Q26、Q29、M30和K47。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体结合人TNFR2上的表位，该表位跨越人TNFR2的氨基酸位置24-47、位于其之间，和/或与其重叠(根据SEQ ID NO:104编号)。
五核酸分子
本文还提供了编码本文所述抗体的核酸分子。核酸可以完整细胞、细胞裂解物或部分纯化或大体上纯的形式存在。本文所述的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可包含或可不包含内含子序列。在某些实施方案中，核酸是cDNA分子。可以使用标准分子生物学技术获得本文所述的核酸。对于由杂交瘤表达的抗体(例如，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤，如下文进一步所述)，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如，使用噬菌体展示技术)，可以从文库中回收编码抗体的核酸。
在一些实施方案中，本文提供了编码本文所述的任何抗TFNR2抗体的VH和/或VL序列，或重链和/或轻链序列的核酸分子。本文涵盖包含本文所述核苷酸序列(例如，核酸分子)的宿主细胞。
一旦获得了编码VH和VL片段的DNA片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转换为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段可操作连接至编码另一种蛋白质(诸如抗体恒定区或柔性接头)的另一种DNA片段。如本上下文所用，术语“可操作连接”意在指将两个DNA片段连接在一起，使得由两个DNA片段编码的氨基酸序列保持在框内。
通过将编码VH的DNA与编码重链恒定区(铰链、CH1、CH2和/或CH3)的另一个DNA分子可操作连接，可以将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.等人(1991)免疫目的的蛋白质序列(Sequencesof Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生与公众服务部，NIH出版号91-3242)，并且涵盖这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。
通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子可操作连接，可以将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域已知的(参见例如，Kabat，E.A.等人(1991)免疫目的的蛋白质序列，第五版，美国卫生与公众服务部，NIH出版号91-3242)，并且涵盖这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
本文还提供了具有保守取代的核酸分子，该保守取代在核酸分子翻译时不会改变所得的氨基酸序列。
六用于筛选和产生抗体的方法
本文提供的抗TNFR2抗体(例如，抗人TNFR2抗体)通常通过标准重组DNA技术制备。另外，可以使用多种已知技术来产生单克隆抗体，诸如标准体细胞杂交技术、B淋巴细胞的病毒或致癌转化，或使用人抗体基因文库的酵母或噬菌体展示技术。在特定的实施方案中，抗体是全人单克隆抗体。
在一个实施方案中，本文提供了用于生成单克隆抗人TNFR2抗体的方法。单克隆抗体可使用公知的技术容易地制备(参见例如抗体：实验室手册，冷泉港实验室，1988；通过引用并入本文)。通常，该技术涉及用缀合至载体蛋白(例如KLH、牛血清白蛋白)的所选多肽(例如人TNFR2的胞外结构域或包括目标人TNFR2表位的多肽)免疫合适的动物。
以有效刺激抗体产生细胞的方式施用免疫组合物。啮齿类动物诸如小鼠和大鼠是优选的，然而，也可以使用兔、绵羊和青蛙细胞。使用大鼠可能具有某些优势(Goding，1986，第60-61页；通过引用并入本文)，但是小鼠是优选的，最优选BALB/c小鼠，因为这是最常规使用的并且通常具有更高的稳定融合百分比。免疫后，选择B淋巴细胞(B细胞)用于抗体生成方案。这些细胞可从活检的脾脏、扁桃体或淋巴结、或从外周血样品中获得。通常对一组动物进行免疫，去除抗体滴度最高的动物的脾脏，并通过用注射器匀浆脾脏获得脾淋巴细胞。然后将来自免疫动物的产生抗人TNFR2抗体的B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞的细胞融合，该细胞通常是与所免疫动物相同物种的细胞。适用于产生杂交瘤的融合程序的骨髓瘤细胞系优选不产生抗体，具有高融合效率和酶缺陷，使得不能在仅支持所需融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基中生长。示例性骨髓瘤细胞包括，例如，P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul(用于小鼠)；R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F、4B210或以上列出的用于大鼠的小鼠细胞系之一；U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6可用于人类细胞融合。
产生杂交瘤
用于生成抗体产生的脾脏或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包含：在促进细胞膜融合的一种或多种药剂(化学或电学)的存在下，将体细胞与骨髓瘤细胞以4:1的比例混合(尽管该比例可分别从约20:1至约1:1变化)。使用仙台病毒或聚乙二醇(PEG)，诸如37％(v/v)PEG的融合方法是本领域已知的。使用电诱导融合方法也是合适的。
通过在选择培养基中培养，将有活力的融合杂交体与亲本未融合细胞区别开，该选择性培养基通常含有阻断组织培养基中核苷酸从头合成的药剂。示例性的药剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤和重氮丝氨酸。如果使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤，则在培养基中添加次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。如果使用重氮丝氨酸，则在培养基中添加次黄嘌呤。当使用HAT培养基时，只有能够操作核苷酸补救途径的细胞才能在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶例如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)，因此无法存活。能够在选择性培养基中存活的唯一细胞是那些由骨髓瘤和B细胞形成的杂交体。该培养过程提供了从中选择特定杂交瘤的杂交瘤群体。通常，杂交瘤的选择是通过在微量滴定板中通过单克隆稀释培养细胞，然后检测各个克隆上清液(约两到三周后)是否具有所需的抗人TNFR2反应性来进行的。示例性测定包括放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、菌斑测定、斑点免疫结合测定、生物层干涉技术等。
连续稀释所选的杂交瘤并将其克隆到单个抗人TNFR2抗体产生的细胞系中，然后克隆可以无限增殖以提供单克隆抗体。细胞系可以两种基本方式用于产生单克隆抗体。杂交瘤样品可以注射(通常注射入腹膜腔内)入组织相容性动物中，该动物类型为用于为原始融合提供体细胞和骨髓瘤细胞。所注射动物形成肿瘤，其分泌由融合细胞杂交体产生的特异性单克隆抗体。然后可以利用动物的体液诸如血清或腹水提供高浓度的单克隆抗体。单个细胞系也可以在体外培养，其中单克隆抗体自然分泌到培养基中，可以很容易地从中获得高浓度的单克隆抗体。通过任一方法产生的单克隆抗体通常将被进一步纯化，例如，使用过滤、离心和各种色谱方法诸如HPLC或亲和色谱法，所有这些纯化技术是本领域技术人员公知的。这些纯化技术各自涉及分馏以将所需抗体与混合物的其他成分分离。特别适合于抗体制备的分析方法包括，例如蛋白A琼脂糖和/或蛋白G琼脂糖层析法。
高通量筛选抗TNFR2抗体
本文还提供了高通量筛选与人TNFR2表位(诸如本文所述的那些)结合的分子文库的方法，例如噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示、核糖体展示、mRNA展示和cDNA展示。
在一个实施方案中，本文提供了使用噬菌粒文库筛选抗人TNFR2抗体的方法。示例性噬菌体展示方案可以在例如US7,846,892、US8,846,867、WO1997/002342和WO2007/13291中找到，其通过引用并入本文。现在，重组技术允许由编码一系列抗体的重组基因制备具有所需特异性的抗体。某些重组技术涉及通过免疫筛选组合免疫球蛋白噬菌体表达文库来分离抗体基因，该组合免疫球蛋白噬菌体表达文库由从免疫动物(例如，用人TNFR2的胞外结构域或包括目标人TNFR2表位的肽的免疫的动物)脾脏中分离的RNA制备。对于此类方法，由分离自免疫动物脾脏的RNA制备组合免疫球蛋白噬菌粒文库，并通过表达抗原的细胞和对照细胞盘选来选择表达合适抗体的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优势在于，单轮可以产生和筛选的抗体数量约为104倍，并且通过H和L链组合生成新的特异性，这进一步增加了所生成的合适抗体的百分比。
一种用于在细菌中生成大量多样抗体分子的方法利用噬菌体λ作为载体(Huse等人，1989；通过引用并入本文)。使用λ载体产生抗体涉及将DNA序列的重链和轻链群体克隆到单独的起始载体中。随后将载体随机组合以形成指导重链和轻链共表达形成抗体片段的单个载体。重链和轻链DNA序列是由mRNA通过扩增，优选通过PCR或相关扩增技术获得的，该mRNA从已用所选抗原(例如，人TNFR2或包括目标人TNFR2表位的肽)免疫的动物的脾细胞(或其杂交瘤)中分离出来。通常使用引物扩增重链和轻链序列，该引物将限制性位点并入扩增的DNA片段的末端，从而易于将重链和轻链片段克隆到起始载体中。
用于生成和筛选全部或部分合成的抗体结合位点或互补位的大型文库的另一种方法是利用衍生自丝状噬菌体诸如M13、f1或fd的展示载体。这些丝状噬菌体展示载体被称为“噬菌粒”，产生具有多样和新颖免疫特异性的单克隆抗体的大型文库。该技术使用丝状噬菌体外壳蛋白膜锚定结构域作为在丝状噬菌体复制的组装阶段连接基因产物和基因的手段，并已用于克隆和表达来自组合文库的抗体。通常意义上，该方法提供了使用单个载体系统从抗体基因库同时克隆和筛选预选配体结合特异性的系统。针对预选的配体结合能力对文库的分离成员进行筛选，使得表达的抗体分子的结合能力与从文库中分离编码该成员的基因的便利手段相关。
基于丝状噬菌体的组合抗体文库的多样性可以通过以下方式增加：改组重链和轻链基因、改变文库克隆的重链基因的互补决定区的一个或多个或通过易于出错的聚合酶链反应将随机突变引入文库。用于筛选噬菌粒文库的另外的方法描述于美国专利第5,580,717号；第5,427,908；第5,403,484号；和第5,223,409号，各自通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，本文提供了使用基于细胞的展示技术，诸如酵母展示(Boder等人，自然生物技术(Nat Biotechnol)1997；15:553)和细菌展示来筛选抗人TNFR2抗体的方法。产生和筛选表达含有随机高变区的多肽(诸如单链多肽、抗体或抗体片段)的细菌细胞或酵母细胞文库的既定程序可以在例如美国专利第7,749,501号、US2013/0085072，de Bruin等人，自然生物技术，1999；17:397中找到；其每个观点通过引用并入本文。
在另一个实施方案中，本文提供了使用核苷酸展示技术筛选抗人TNFR2抗体的方法，其使用随机多核苷酸文库的体外翻译，该随机多核苷酸文库编码含有在指定高变区内的突变的单链多肽、抗体或抗原结合片段(参见例如，WO2006/072773，美国专利第7,074,557号)。也可以使用cDNA展示产生抗体，这是一种类似于mRNA展示的技术，不同之处在于使用的是cDNA而不是mRNA。cDNA展示技术描述于例如，Ueno等人分子生物学方法(MethodsMol.Biol.)2012；805:113-135)。
上述体外展示技术也可用于提高本文所述的抗TNFR2抗体的亲和力。例如，可以使用单链多肽、抗体及其抗原结合片段的文库，其在特定抗TNFR2抗体的高变区内的特定位点具有靶向突变。编码这些突变的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可以用于核糖体展示、mRNA展示、cDNA展示，以筛选与目标人TNFR2表位特异性结合的多肽。
还可以筛选多肽的组合文库以识别与目的人TNFR2表位结合的抗TNFR2抗体。可以获得组合多肽文库，诸如抗体或抗体片段文库，例如通过使用本领域公认的基因表达技术在真核或原核细胞中表达编码抗体或其抗原结合片段的随机高变区的多核苷酸。可以使用标准技术从细胞中分离所得的异质抗体混合物，并筛选其与固定在表面的TNFR2衍生的肽结合的能力。使用合适的缓冲液冲洗掉未结合的抗体，并且可以使用基于ELISA的检测方案检测保持结合的抗体。特异性结合TNFR2肽的抗体片段的序列可以通过本领域已知的技术来确定，包括例如埃德曼降解、串联质谱、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)、核磁共振(NMR)和2D凝胶电泳等(参见例如WO 2004/062553)。
用重组DNA技术、宿主细胞转染瘤和转基因动物产生抗TNFR2抗体
本文还提供了使用例如重组DNA技术和本领域已知的基因转染方法的组合在宿主细胞转染瘤中产生抗人TNFR2抗体的方法(Morrison，S.(1985)科学(Science)229:1202)。例如，为了表达抗体或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目的抗体的杂交瘤(诸如上述那些)的PCR扩增或cDNA克隆)获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，然后DNA可以插入表达载体，使得基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。在本文中，术语“可操作地连接”是指将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以使其与所使用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入单独的载体，或两个基因插入相同的表达载体。通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，或如果不存在限制性位点则平端连接)将抗体基因插入表达载体。本文所述抗体的轻链和重链可变区可以用于创建任何抗体同种型的全长抗体基因，通过以下方法：将它们插入已编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH片段可操作地连接载体内的CH片段，并且VL片段可操作地连接载体内的CL片段。
为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达本文所述的抗体，但是最优选在真核细胞，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为此类真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装和分泌适当折叠并且具有免疫活性的抗体。用于表达本文所述重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，如Urlaub和Chasin,(1980)美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，77:4216-4220中所述，其与DHFR选择标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)分子生物学(Mol.Biol.)159:601-621所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体引入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞一段时间(该段时间足以允许抗体在宿主细胞中表达)产生抗体，或更优选地，将抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养基中。可以使用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
在又一个实施方案中，可以使用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠来产生针对人TNFR2上特定表位的人单克隆抗体(参见例如Lonberg和Kay的美国专利第5,545,806号、第5,569,825号、第5,625,126号、第5,633,425号；第5,789,650号；第5,877,397号；第5,661,016号；第5,814,318号；第5,874,299号；和第5,770,429号；Surani等人的美国专利第5,545,807号；Lonberg和Kay的PCT公开第WO 92/03918号、第WO93/12227号、第WO 94/25585号、第WO 97/13852号、第WO 98/24884号和第WO 99/45962号；以及Korman等人的PCT公开第WO01/14424号)。
在另一个实施方案中，可以使用携带转基因和转染色体上的人免疫球蛋白序列的小鼠，诸如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生针对人TNFR2上特定表位的人抗体(参见例如，Ishida等人的PCT公开WO 02/43478)。
更进一步，表达人免疫球蛋白基因的替换性转基因动物系统在本领域中是可用的，并且可以用于产生识别特定人TNFR2表位的抗人TNFR2抗体。例如，可以使用一种称为Xenomouse(Abgenix，Inc.)的另选的转基因系统。此类小鼠描述于例如Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号；第6,075,181号；第6,114,598号；第6,150,584号和第6,162,963号。另一种合适的转基因动物系统是HuMAb小鼠(Medarex，Inc)，其含有人免疫球蛋白基因小基因座，该基因编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及使内源性μ和κ链位点失活的靶向突变(参见例如Lonberg等人(1994)自然，368(6474):856-859)。又另一种合适的转基因动物系统是KM小鼠，其详细描述于PCT公开WO02/43478。
表达人免疫球蛋白基因的另选的转染色体动物系统在本领域中是可用的，并且可以用于产生抗TNFR2抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠。此外，在本领域中已描述了携带人重链和轻链转染色体的牛，它们可用于产生抗TNFR2抗体。
在又一个实施方案中，可以使用产生此类抗体的转基因植物和/或培养的植物细胞(诸如，例如烟草、玉米和浮萍)来制备抗体。例如，表达抗体的转基因烟草叶可以用于例如通过使用诱导型启动子来产生此类抗体。同样，转基因玉米可以用于表达此类抗体及其抗原结合部分。抗体还可以从包括抗体部分诸如单链抗体(scFv's)的转基因植物种子中大量产生，例如使用烟草种子和马铃薯块茎。
在上述实施方案中，用于免疫动物的抗原可以是例如人TNFR2的胞外结构域。当将人TNFR2的胞外结构域用作抗原时，将进一步筛选生成的抗体选择性结合人TNFR2上特定表位的能力，例如人TNFR2的(SEQ ID NO:1)的氨基酸23-54、55-96、78-96和120-257。可以例如使用测定(例如ELISA)来评估与包括目的人TNFR2表位的肽的结合，或使用本文所述的TNFR2嵌合体进行结合测定。然后选择具有本文所述抗TNFR2抗体的表位或TNFR2嵌合体结合特征的抗人TNFR2抗体。
在另一个实施方案中，用于免疫动物的抗原或用于筛选文库的靶标(例如噬菌粒文库、酵母表面展示文库)是包括被本文所述的抗TNFR2抗体识别的人TNFR2表位的肽。被本文所述的抗体识别的人TNFR2的示例性表位包括人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸23-54、55-96、78-96和120-257。使用上面列出的技术，包括这些序列的肽可以用于免疫动物或筛选文库。可以例如使用实例5中所述的方法，筛选使用该方法产生的抗人TNFR2抗体与TNFR2嵌合体的结合，或选择性地与用作免疫原的肽的结合。
产生人源化和/或嵌合的TNFR2抗体
嵌合和/或人源化抗体可以基于鼠单克隆抗体的序列来产生，诸如本文所述的那些。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目的鼠杂交瘤中获得，并使用标准分子生物学技术将其改造成包含非鼠类(例如人)免疫球蛋白序列。
例如，嵌合抗体及其抗原结合片段包含来自两种或更多种不同物种(例如，小鼠和人类)的部分。可以使用本领域已知的方法将鼠可变区连接人恒定区(参见例如，Cabilly等人的美国专利第4,816,567号)，以构建嵌合抗体。以此方式，可以修饰非人抗体以使其更适合于人类临床应用(例如，用于治疗或预防人类受试者癌症的方法)。
另选地，人源化抗体是来自非人类物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人类天然产生的抗体变体的相似性。本公开的单克隆抗体包括非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形式(例如，杂交瘤ABV3、ABV4、ABV7、ABV12、ABV13、ABV14、ABV15、ABV18和/或ABV19产生的抗体的人源化形式)。人源化或CDR移植的mAb特别可用作人类的治疗剂，因为它们没有像小鼠抗体那样迅速地从循环中清除，并且通常不会引起不良免疫反应。
用于制备人源化抗体的方法是本领域公知的。例如，人源化可以基本上按照Winter和同事的方法进行(Jones等人，自然，321:522-525(1986)；Riechmann等人，自然，332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，科学(Science)，239:1534-1536(1988))。另选地，本文所述人源化TNFR2抗体可以使用本领域已知的多种技术产生，包括但不限于CDR移植(参见例如欧洲专利第EP 239,400号；国际公开第WO 91/09967号；和美国专利第4,816,567号；第6,331,415号、第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号，其每一个通过引用并入本文)、镶饰或重塑(参见例如，欧洲专利第EP 592,106号和第EP 519,596号；Padlan，1991，分子免疫学(Molecular Immunology)28(4/5):489-498；Studnicka等人，1994，蛋白质工程，7(6):805-814；和Roguska等人，1994，美国国家科学院学报,91:969-973，其每一个均通过引用并入本文)、链改组(参见例如，美国专利第5,565,332号，其通过引用并入本文)，以及在例如美国专利第6,407,213号、美国专利第5,766,886号、国际公开第WO 9317105号，Tan等人，免疫学杂志，169:1119-25(2002)，Caldas等人，蛋白质工程，13(5):353-60(2000)，Morea等人，方法(Methods)，20(3):267-79(2000)，Baca等人，生物化学杂志，272(16):10678-84(1997)，Roguska等人，蛋白质工程，9(10):895-904(1996)，Couto等人，癌症研究Cancer Res.，55(23Supp):5973s-5977s(1995)，Couto等人，癌症研究(Cancer Res.)，55(8):1717-22(1995)，Sandhu JS，基因(Gene)，150(2):409-10(1994)，和Pedersen等人，生物化学期刊(J.Mol.Biol.)，235(3):959-73(1994)中描述的技术，其每一个均通过引用并入本文。通常，FW区中的框架(FW)残基将被来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变、优选提高抗原结合。通过本领域公知的方法识别这些FW取代，例如通过对CDR和FW残基的相互作用进行建模以识别对抗原结合重要的FW残基，以及通过序列比较以鉴定在特定位置的异常FW残基。(参见例如，Queen等人，美国专利第5,585,089号；和Riechmann等人，1988，自然，332:323，其通过引用整体并入本文。)
在一些实施方案中，非人(例如小鼠)抗体的人源化形式是人抗体(受者抗体)，其中受者抗体的高变(CDR)区残基被来自非人物种的高变区残基(供体抗体)替代，诸如具有所需特异性、亲和力和结合能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区残基也被相应的非人残基代替(所谓的“反向突变”)。另外，噬菌体展示文库可以用于改变抗体序列内所选位置的氨基酸。人源化抗体的特性也受人类框架选择的影响。此外，可以将人源化和/或嵌合抗体修饰以包含在受者抗体或供体抗体中未发现的残基，从而进一步改善抗体特性，诸如例如亲和力或效应子功能。
在此类人源化嵌合抗体中，实质上少于一个完整的人可变结构域被非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些FW残基被来自啮齿动物抗体类似位点的残基所取代的人抗体。抗TNFR2抗体的人源化也可以通过镶饰或重塑来实现(EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991，分子免疫学，28(4/5):489-498；Studnicka等人，蛋白质工程，7(6):805-814(1994)；和Roguska等人，美国国家科学院学报，91:969-973(1994))或链改组(美国专利第5,565,332号，其通过引用整体并入本文。
用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链两者)的选择是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”法，啮齿类抗体的可变结构域的序列针对已知人可变区序列的整个文库进行筛选。然后筛选与啮齿动物最紧密相关的人序列中是否存在特定残基，这些残基可能对预期的人源化mAb的抗原结合、合适的结构形成和/或稳定性至关重要(Sims等人，免疫学杂志，151:2296(1993)；Chothia等人，分子生物学杂志，196:901(1987)，其内容通过引用整体并入本文。将所得的符合所需标准的FW序列用作人源化抗体的人供体FW区。
另一种方法使用来自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定FW。相同的FW可用于几种不同的人源化抗TNFR2抗体(Carter等人，美国国家科学院学报，89:4285(1992)；Presta等人，免疫学杂志，151:2623(1993)，其内容通过引用并入整体本文)。
抗TNFR2抗体可以人源化，同时保留对人TNFR2的高亲和力以及其他有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，人源化抗体通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备。三维免疫球蛋白模型是通常可获得的并且为本领域的技术人员所熟悉。可用计算机程序来图解和示出所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合TNFR2的能力的残基。以这种方式，可以从受者和导入序列中选择并结合FW残基，从而获得所需的抗体特征，例如对TNFR2的亲和力。一般而言，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
使用任何技术(包括本文公开的那些)制备的结合TNFR2的单克隆抗体(或其部分)的结合特异性可以通过以下方法确定：免疫沉淀或体外结合测定(诸如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA))、生物层干涉技术(例如ForteBio测定)和/或Scatchard分析。
在某些实施方案中，可使用本领域公认的技术诸如本文所述的技术，进一步改变或优化使用以上讨论的任何方法产生的抗TNFR2抗体，以实现所需的结合特异性和/或亲和力。
七多特异性抗体
本文提供的多特异性抗体(例如双特异性抗体)至少包括对本文所述的TNFR2(例如，人TNFR2)上的特定表位的结合亲和力，以及至少一种其他结合特异性。在一些实施方案中，非TNFR2结合特异性是针对癌症抗原的结合特异性。多特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2抗体)。
用于制备多特异性抗体的方法是本领域公知的(参见例如，WO 05117973和WO06091209)。例如，全长多特异性抗体的产生可以基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两条链具有不同的特异性。还描述了用于直接从重组细胞培养物中制备和分离多特异性抗体片段的各种技术。例如，可以使用亮氨酸拉链产生多特异性抗体。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备多特异性抗体片段的另一种策略。
在一个特定的实施方案中，多特异性抗体包含第一抗体(或其结合部分)，其与衍生或连接至另一种功能分子例如另一种肽或蛋白质(例如受体的另一种抗体或配体)的TNFR2上的目的表位结合，以生成与TNFR2和另一个目标分子上的表位结合的多特异性分子。抗体可以衍生或连接至多于一个其他功能分子，以生成结合多于两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子。为了产生多特异性分子，本文公开的抗体可以功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)至一个或多个其他结合分子，诸如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生多特异性分子。
因此，考虑包含对TNFR2(例如人TNFR2)上的特定表位具有至少一个第一结合特异性并且对第二非TNFR2靶表位具有第二结合特异性的多特异性分子。在特定的实施方案中，第二靶表位是Fc受体，例如人FcγError！Reference source not found.Error！Referencesource not found.Error！Reference source not found.Error！Reference source notfound.γRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，还提供了能够结合表达效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))的FcγγR、FcαγR或FcεR以及表达TNFR2的靶细胞的多特异性分子。这些多特异性分子将表达TNFR2的细胞靶向效应细胞并触发Fc受体介导的效应细胞活性，诸如表达TNFR2的细胞的吞噬作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或超氧阴离子的生成。
在一个实施方案中，多特异性分子包含至少一种抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv。抗体也可是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，诸如Fv或单链构建体，如Ladner等人，美国专利第4,946,778号所述。
可以使用本领域已知的方法通过缀合成分结合特异性例如抗-FcR和抗TNFR2结合特异性来制备多特异性分子。例如，多特异性分子的每种结合特异性可以分别产生，然后彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻苯撑双马来酰亚胺(oPDM)、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)和磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基SMCC)。优选的结合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(伊利诺伊州罗克福德)获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以经由两条重链的C端铰链区的巯氢基键合缀合。在特别优选的实施方案中，在缀合之前，对铰链区进行修饰以含有奇数个巯氢基残基，优选一个。
另选地，两种结合特异性都可以在相同的载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和组装。当多特异性分子是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2或配体x Fab融合蛋白时，此方法特别有用。多特异性分子可以是包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或是包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。多特异性分子可以包含至少两个单链分子。用于制备多特异性分子的方法描述于例如美国专利第5,260,203号；美国专利第5,455,030号；美国专利第4,881,175号；美国专利第5,132,405号；美国专利第5,091,513号；美国专利第5,476,786号；美国专利第5,013,653号；美国专利第5,258,498号；和美国专利第5,482,858号。
多特异性分子与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白印迹测定来确认。这些测定中的每一种通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体)来检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可以使用例如识别并特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。另选地，可以使用多种其他免疫测定中的任何一种来检测复合物。例如，抗体可以被放射性标记并用于放射免疫测定(RIA)。放射性同位素可以通过使用αγ-β计数器或闪烁计数器的方法或放射自显影来检测。
八免疫缀合物
可以通过将本文所述的抗体(例如，抗人TNFR2抗体)与另一种治疗剂缀合来形成本文提供的免疫缀合物。合适的试剂包括例如细胞毒素剂(例如化学治疗剂)、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)，和/或放射性同位素(即，放射性缀合物)。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒蛋白A链、相思子毒素A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-八叠球菌素、油桐蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、新霉素和单端孢霉烯族化合物。细胞毒素或细胞毒素剂的另外的实例包括，例如，紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷，替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同源物。治疗剂包括但不限于抗代谢药(例如氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氮烯咪胺)、烷化剂(例如氮芥、硫喷妥苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类药物(例如柔红霉素(原来的道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如更生霉素(原来的放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
多种放射性核素可用于生产放射性缀合的抗TNFR2抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
免疫缀合物也可以用于修饰给定的生物学反应，并且药物部分不应理解为限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可是具有所需生物活性的蛋白质或多肽(例如，淋巴因子、肿瘤坏死因子、IFNγ、生长因子)。
免疫缀合物可以使用多种双功能蛋白偶联剂来制备，诸如3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如己二亚胺酸二甲酯盐酸盐)、活性酯(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛(glutareldehyde))、双叠氮化合物(诸如双(对叠重氮苯甲酰)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对二重氮苯甲酰)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯-2,6-二异氰酸酯)，以及双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。碳-14标记的1-异硫氰基苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合至抗体的示例性螯合剂(参见例如，WO94/11026)。
将此类治疗部分与抗体缀合的技术是公知的，参见例如，Arnon等人，“用于癌症疗法中对药物进行免疫靶向的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies For ImmunotargetingOf Drugs In Cancer Therapy)，在单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy)中，Reisfeld等人编辑，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“给药抗体(Antibodies For Drug Delivery)”，在药物控释(Controlled DrugDelivery)(第二版)中，Robinson等人编辑，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体：综述(Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy:A Review)”，在单克隆抗体'84：生物学和临床应用(Biological And Clinical Applications)中，Pinchera等人编辑，第475-506页(1985)；“放射性标记的抗体在癌症治疗中的治疗用途的分析、结果和未来展望(Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of RadiolabeledAntibody In Cancer Therapy)”，在“用于癌症检测和治疗的单克隆抗体(MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy)”中，Baldwin等人编辑，第303-16页(学术出版社(Academic Press)1985年)，和Thorpe等人，“抗体-毒素缀合物的制备和细胞毒性(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates)”，免疫学综述(Immunol.Rev.)，62:119-58(1982)。
九测定
在产生抗体(例如，具有本文公开的抗TNFR2抗体的CDR序列的抗体)之后，可以使用本领域已知的多种测定来筛选或检测它们的各种特性诸如本文所述的那些(例如，与TNFR2的结合)。
在一个实施方案中，使用例如纯化的TNFR2(例如，人TNFR2的纯化胞外结构域或包括人TNFR2中目的表位的肽)和/或TNFR2表达细胞筛选或检测(例如，通过流式细胞术、ELISA、Biacore或生物层干涉技术)抗体与TNFR2的结合。在一些实施方案中，如实例5所述，可以通过使用一组TNFR2嵌合体来筛选抗体结合TNFR2上特定表位的能力。其他方法监测抗体与人TNFR2的抗原片段或突变变体的结合，其中由于抗原序列内氨基酸残基的修饰而导致的结合丧失通常被认为是表位成分的指示。
在一些实施方案中，通过蛋白质印迹筛选或检测抗体与TNFR2的结合。简言之，可以制备来自表达TNFR2(例如，TNFR2的胞外结构域)的细胞的细胞提取物，并对其进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离出的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用血清封闭，并用待检测的单克隆抗体进行探测。可以使用抗IgG碱性磷酸酶检测IgG结合，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.公司，密苏里州圣路易斯)进行发育。
在另一个实施方案中，筛选抗体与配体例如TNFα结合时暴露的表位的结合能力(即，不抑制TNFR2配体与TNFR的结合)。可以通过例如在不存在(对照)或存在抗TNFR2抗体的情况下使表达TNFR2的细胞与标记的TNFR2配体(例如，放射性标记的或生物素化的TNFα)接触来识别此类抗体。如果抗体不抑制TNFα与TNFR2的结合，则相对于不存在抗体的量，没有观察到统计学上显著减少的回收标记量。另选地，如果抗体抑制TNFα与TNFR2的结合，则相对于不存在抗体的量，将观察到统计学上显著减少的回收标记量。
用于分析各种抗TNFR2抗体的结合亲和力、交叉反应性和结合动力学的方法包括本领域已知的标准测定，例如使用BiacoreTM 2000SPR仪器(Biacore AB，乌普萨拉，瑞典)的BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)分析或生物层干涉技术(例如ForteBio测定)，如实例所述。
在一些实施方案中，使用本领域公认的方法，诸如流式细胞术、表面等离子体共振和生物层干涉技术(例如，如实例3所述)，筛选或检测抗TNFR2抗体抑制TNF-α与TNFR2结合的能力。
在一些实施方案中，筛选或检测抗TNFR2抗体的激动剂活性。可以使用报告基因测定，例如NF-kB报告基因测定检测激动剂活性。在一些实施方案中，使抗体与报告基因细胞系接触，并通过流式细胞术(例如，如实例23所述)确定报告活性。在一些实施方案中，通过评估原代分离的T细胞中活化标志物表达的增殖和/或诱导(例如，如实例15、24和26所述)确定抗TNFR2抗体的激动剂活性。
还可以筛选或检测本文所述的抗TNFR2抗体诱导ADCC的能力。简言之，在存在或不存在目的抗体(例如抗TNFR2抗体)和/或对照抗体(例如同种型对照)的情况下，将效应细胞(例如NK细胞)与靶细胞一起培养。然后使用例如，如实例25所述的流式细胞术，例如基于可检测标记的定量(例如，荧光，如果靶细胞被荧光标记)评估靶细胞的死亡。
还可以使用本领域公认的技术，包括Cell Titer-Glo测定、或氚标胸腺嘧啶核苷并入测定、或流式细胞术，检测抗体抑制细胞(体内或体外)诸如肿瘤细胞的增殖或活度的能力。
十组合物
另一方面，本文提供了包含本文公开的抗TNFR2抗体(例如，抗人TNFR2抗体)与药学上可接受的载体一起配制的组合物，例如药物组合物。通过将具有所需纯度的活性成分(例如，本文所述的抗TNFR2抗体)与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(雷明登药学大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第20版)，A.Gennaro编辑，2000年，Lippincott，Williams&Wilkins，宾夕法尼亚州，费城)，使用本领域已知的标准方法制备药物组合物。优选的药物组合物是无菌组合物、适合于注射的组合物，以及适合于通过所需施用途径诸如静脉内注射进行注射的无菌组合物。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体包被在一种材料中，以保护该化合物免受酸和可能使该化合物失活的其他自然条件的作用。
组合物可以单独施用或联合治疗，即与其他药剂联合施用。例如，组合疗法可以包括本文提供的组合物，其具有至少一种或多种另外的治疗剂，例如其他化合物、药物和/或用于治疗癌症的药剂(例如抗癌剂)。抗TNFR2抗体的特定组合也可在有或没有另外的治疗剂的情况下分别或依次施用。
可以通过本领域已知的各种方法施用组合物。如本领域技术人员将了解，施用途径和/或模式将视所需结果而变化。抗体可以与防止抗体快速释放的载体一起制备，诸如控释剂(包括植入物、透皮贴剂和微囊传递系统)。可使用可生物降解、生物相容的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法被授予专利或通常是本领域技术人员已知的。
为了通过某些施用途径施用组合物，可能有必要用材料包被成分，例如抗体，或所述组合物和材料共同施用以防止其失活。例如，可在合适的载体例如脂质体或稀释剂中将组合物施用于受试者。可接受的稀释剂包括盐水和缓冲水溶液。脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规脂质体。
可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域已知的。除非任何常规介质或试剂与抗体不相容，否则考虑将其用于本文提供的组合物中。补充的活性成分也可以并入组合物中。
治疗组合物在制造和储存的条件下通常必须是无菌和稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，其含有，例如水、乙醇，多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散体的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇或氯化钠。在组合物中包括延迟吸收的药剂，例如，单硬脂酸盐和明胶可引起可注射组合物的延长吸收。
无菌注射溶液可通过将所需量的单克隆抗体与所需的以上列举的成分的一种或组合并入适当的溶剂中，然后灭菌微滤来制备。通常，通过将抗体并入无菌媒介物制备分散体，该无菌媒介物含有碱性分散介质和以上列举的那些的所需的其他成分。至于无菌注射溶液的无菌粉末的制备，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干法)，其中可产生活性成分的粉末，以及来自其先前无菌过滤溶液的任何另外的所需成分。
调整剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。例如，人抗体可以通过皮下注射每周一次或两次施用，或通过皮下注射每月一次或两次施用。
以剂量单位形式配制肠胃外组合物以便于施用和剂量均匀是尤其有利的。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理离散单元；每个单元含有预定量的抗体，该抗体经计算可与所需的药物载体结合产生所需的治疗效果。本文提供的剂量单位形式的规格决定于并直接取决于(a)抗体的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及(b)合成此类抗体用于治疗个体敏感性的技术领域固有的局限性。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基苯甲醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
对于治疗组合物，制剂包括适用于口服、鼻腔、局部(包括颊和舌下)、直肠和肠胃外施用的那些。肠胃外施用是包含抗体的治疗性组合物最常见的施用途径。制剂可方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域中已知的任何方法来制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的抗体的量将根据所治疗的受试者和特定的施用方式而变化。抗体的量通常是将足以产生治疗效果的量。通常，100％中，该量的范围为抗体质量的约0.001％至约90％，优选约0.005％至约70％，最优选约0.01％至约30％。
如本文所用，短语“肠胃外施用(“parenteral administration和administeredparenterally)”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
可用于本文提供的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油诸如橄榄油和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。在本领域中公知的佐剂的具体实例包括，例如，无机佐剂(诸如铝盐，例如磷酸铝和氢氧化铝)、有机佐剂(例如角鲨烯)、油基佐剂、病毒体(例如含有源自流感病毒的膜结合血凝素(heagglutinin)和神经氨酸酶的病毒体)。
通过灭菌程序并通过包括各种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可以确保防止微生物的存在。还可能需要在组合物中包括等渗剂诸如糖和氯化钠等。另外，通过包括一种或多种延迟吸收的药剂诸如单硬脂酸铝或明胶，可实现可注射药物形式的延长吸收。
当组合物作为药物施用于人和动物时，它们可以单独给药或作为含有例如0.001-90％(更优选0.005-70％，诸如0.01-30％)活性成分和药学上可接受的载体的药物组合物给药。
无论选择何种施用途径，本文提供的组合物都可以合适的水合形式使用，并且可通过本领域技术人员已知的常规方法将其配制成药学上可接受的剂型。
可改变本文提供的药物组合物中抗体的实际剂量水平，以获得有效实现特定患者、组合物和施用方式所需治疗反应的活性成分的量，而对患者没有毒性。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所用特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性、施用途径、施用时间、所用特定化合物的排泄速率、治疗持续时间，与所用特定组合物联合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况以及既往病史，以及在医学领域公知的类似因素。具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定和开处方所需组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于达到所需治疗效果所需的水平开始抗体的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。通常，本文提供的组合物的合适的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的抗体量。这种有效剂量通常取决于上述因素。优选以静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用，优选在靶部位附近施用。如果需要，治疗组合物的有效日剂量可全天以适当间隔分别以两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量施用，任选以单位剂型施用。尽管可以单独施用抗体，但是优选以制剂(组合物)的形式施用抗体。
施用的剂量和频率可根据因素而变化，诸如施用途径和所使用的特定抗体，待治疗疾病的性质和严重性以及受试者的大小和一般状况。合适的剂量可以通过相关领域中已知的方法确定，例如，在可能涉及剂量递增研究的临床试验中。
治疗组合物可以与本领域已知的医疗装置一起施用，诸如例如美国专利第5,399,163号、第5,383,851号、第5,312,335号、第5,064,413号、第4,941,880号、第4,790,824号、第4,596,556号、第4,487,603号、第4,486,194号、第4,447,233号、第4,447,224号、第4,439,196号和第4,475,196号中公开的那些。
可以在预测人类肿瘤功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。另选地，可以通过本领域技术人员已知的测定，通过检查化合物抑制此类体外抑制的能力来评估组合物的这种特性。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤的大小，或者以其他方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重程度、以及所选的特定组合物或施用途径之类的因素来确定此类量。
在制备用于治疗与TNFR2依赖性信号传导相关的疾病的药物中，提供了上述抗TNFR2抗体和包含该抗体的组合物的用途。还提供了上述抗TNFR2抗体和组合物用于治疗癌症(或用于制造用于治疗癌症的药物)。在一些实施方案中，癌症是实体瘤。示例性癌症包括但不限于肺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、黑色素瘤、头颈癌、淋巴瘤和结肠直肠癌。
在一些实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体和组合物用于治疗自身免疫性疾病或障碍(或用于制备用于治疗自身免疫性疾病的药物)。示例性自身免疫性疾病和障碍包括但不限于移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、结肠炎、银屑病、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解症和1型糖尿病。
在一些实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体和组合物用于在已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥(或用于制备用于促进移植物存活或减少移植物排斥的药物)。在其他实施方案中，还提供了本文所述的抗TNFR2抗体和组合物用于治疗、预防或减少移植物抗宿主病(或用于制备用于治疗、预防或减少移植物抗宿主病的药物)。
此外，预期的组合物可进一步包括或制备成与另外的治疗剂例如另外的抗癌剂联合治疗的药物。“抗癌剂”是用于治疗肿瘤、癌症、恶性肿瘤等的药物。药物疗法(例如，用本文公开的抗体组合物)可以不经其他治疗或与其他治疗组合地施用。
本文所述的抗TNFR2抗体或组合物的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状的严重性降低、疾病无症状时期的频率和持续时间的增加、或预防由感病性引起的损伤或残疾。在癌症的情况下，治疗有效剂量优选导致存活增加，和/或预防与癌症有关的身体症状的进一步恶化。治疗有效剂量可以预防或延迟癌症的发作，诸如当疾病的早期或初步迹象出现时可能需要的剂量。
十一试剂盒
还提供了试剂盒，其包含任选地含在单个小瓶或容器中的本文公开的抗TNFR2抗体、多特异性分子或免疫缀合物，并且包括例如用于治疗或诊断疾病诸如癌症的说明书。试剂盒可包括标签，其指示试剂盒内容物的预期用途。术语标签包括试剂盒上提供的或随试剂盒一起提供的任何文字、营销材料或记录材料，或试剂盒附带的其他材料。此类试剂盒可以单位剂型包含抗体、多特异性分子或免疫缀合物，诸如在单剂量小瓶或单剂量预载注射器中。
十二抗体使用方法
本文公开的抗体和组合物可用于多种治疗应用和诊断应用，例如治疗癌症(肿瘤学应用)，治疗自身免疫性疾病或障碍，促进移植受者的移植物存活和/或减少移植物排斥，治疗、预防或减少移植物抗宿主病或治疗感染性疾病。
因此，在一个实施方案中，本文提供了一种治疗增殖性障碍例如癌症的方法，其包含以有效量(例如治疗有效量)向受试者施用本文所述的抗TNFR2抗体以治疗该障碍。在一些实施方案中，障碍是癌症。示例性癌症包括但不限于实体瘤，诸如肺癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、肺癌、宫颈癌、前列腺癌、黑色素瘤、头颈癌、淋巴瘤和结肠直肠癌。可以在治疗期间检查受试者，以监测抗TNFR2抗体减缓癌症进展的功效(例如，如减少一种或多种肿瘤的体积所反映的)。
在一些实施方案中，相对于开始抗TNFR2抗体治疗之前的肿瘤体积，本文所述的抗TNFR2抗体能够将肿瘤体积减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或约100％。
在另一个实施方案中，本文提供了抑制肿瘤或肿瘤细胞生长的方法，其包含以有效量(例如，治疗有效量)向受试者施用本文所述的抗TNFR2抗体以抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长。
在一些实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体诱导长期抗癌效果。在其他实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体诱导抗癌记忆T细胞的发育。
在另一个实施方案中，提供了一种增强与人TNFR2的表位(例如本文所述的人TNFR2表位)结合的抗体的抗肿瘤活性的方法，包含修饰抗体以增加其相对于未修饰形式的相同抗体的效应子功能，例如，通过在Fc区引入一个或多个已知增强效应子功能的氨基酸取代。在一些实施方案中，增加的抗肿瘤活性与抗体结合的人TNFR2的表位无关。在其他实施方案中，对肿瘤生长的抑制与抗体激动TNFR2信号传导的能力无关。在其他实施方案中，对肿瘤生长的抑制与抑制TNF-α与TNFR2结合的能力无关。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗癌症的方法，包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的抗TNFR2抗体，其中抗体具有效应子功能并且不显著抑制TNF-α与TNFR2的结合。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗癌症的方法，包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的抗TNFR2抗体，其中抗体具有效应子功能并激动TNFR2受体信号传导。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗癌症的方法，包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的抗TNFR2抗体，其中抗体具有效应子功能。
在本文所述的方法中，抗TNFR2抗体可以单独施用或与一种或多种治疗剂(例如抗癌剂)或标准癌症治疗一起施用，该标准癌症治疗与抗体联合或协同作用以治疗患有肿瘤或癌症的受试者。例如，本文所述的抗TNFR2抗体可以与免疫检查点阻断剂联合使用。与本文所述的抗TNFR2抗体联合使用的合适的免疫检查点阻断剂包括，例如，抗PD1抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIGIT抗体或抗TIM3抗体。
PD-1和PD-L1检查点抑制剂为癌症的治疗提供了重要的前景(Brahmer等人，新英格兰医学杂志(NEJM)2012；366:2455-65；Topalian等人，NEJM 2012；366:2443-54)。不幸的是，他们的活动仍然限于适应症中的部分患者，诸如转移性膀胱癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、黑素瘤和头颈癌，其中许多随着时间的推移而发展(Swaika等人，分子免疫学，2015；67:4-17；Grigg等人，癌症免疫疗法杂志(Journal for ImmunoTherapy of Cancer)，2016；4:48)。已证明与化学疗法或其他免疫疗法(诸如CTLA4抑制剂伊匹单抗)联合使用可提高治疗效果，但与单独使用PD-1抑制剂相比，通常以诸多毒性的显著增加为代价(Weber，肿瘤学家(Oncologist)2016；21:1230-40；Paz-Ares等人，NEJM 2018网络公开发表-PMID：30280635)。如实例12所示，TNFR2激动剂抗体(Y9)与PD-1或PD-L1抑制剂的联合显著提高了抗肿瘤活性，而在长期给药时未用抗CTLA4抗体治疗观察到毒性(参见实例13)。这表明，激动性TNFR2 mAb与PD-1或PD-L1抑制剂的联合具有比PD-1抑制剂与CTLA4抑制剂(诸如伊匹单抗)明显更高的治疗指数。
本文所述的抗TNFR2抗体和联合抗体疗法也可与其他公知的疗法结合使用，这些疗法因其针对被治疗的适应症(例如癌症)的特殊用途而选择。
例如，本文所述的抗TNFR2抗体可以与另外的治疗(诸如放疗、手术、化学疗法(例如，使用喜树碱(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂、阿霉素、伊立替康、紫杉醇、吉西他滨、顺铂、紫杉醇、卡铂-紫杉醇(Taxol)、阿霉素、5-fu或喜树碱+apo2l/TRAIL(6X组合)、一种或多种蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米或MG132)、一种或多种Bcl-2抑制剂(例如BH3I-2’(bcl-xl抑制剂)、吲哚胺双加氧酶-1抑制剂(例如INCB24360、吲哚莫德、NLG-919或F001287)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奥巴克拉)或MCL-1(髓系白血病细胞分化蛋白-1)拮抗剂)、iAP(凋亡蛋白抑制剂)拮抗剂(例如smac7、smac4、小分子smac模拟物、合成smac肽(参见Fulda等人，自然医学，2002；8:808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(组蛋白脱乙酰酶)抑制剂、抗CD20抗体(例如利妥昔单抗)、血管生成抑制剂(例如贝伐单抗)、靶向VEGF和VEGFR的抗血管生成剂(例如阿瓦斯汀)、合成三萜类化合物(参见Hyer等人，癌症研究(Cancer Research)2005；65:4799-808)、c-FLIP(细胞FLICE抑制蛋白)调节剂(例如PPARγ(过氧化物酶增殖体激活受体γ)的天然和合成配体，5809354或5569100)、激酶抑制剂(例如索拉非尼)、曲妥珠单抗、西妥昔单抗、替西罗莫司、mTOR抑制剂(诸如雷帕霉素和西罗莫司)、硼替佐米、JAK2抑制剂、HSP90抑制剂、PI3K-AKT抑制剂、来那度胺、GSK3β抑制剂、IAP抑制剂、基因毒性药物、靶向疗法和/或癌症疫苗。
抗TNFR2抗体也可与用于治疗癌症的治疗性抗体联合使用，诸如
Figure BDA0003069622250000771
(利妥昔单抗)、
Figure BDA0003069622250000772
(曲妥珠单抗)、
Figure BDA0003069622250000773
(托西莫单抗)、
Figure BDA0003069622250000774
(替伊莫单抗)、
Figure BDA0003069622250000775
(阿仑单抗)、
Figure BDA0003069622250000776
(依帕珠单抗)、
Figure BDA0003069622250000777
(贝伐单抗)和
Figure BDA0003069622250000778
(厄洛替尼)，以及靶向TNF和TNFR分子家族成员(配体或受体)的抗体，诸如CD40和CD40L、OX-40、OX-40L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDA1、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFα、LTβR、淋巴毒素α1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY和NGFR。
与本文所述的抗TNFR2抗体联合用于治疗癌症的细胞毒素剂包括烷化剂、抗代谢物和其他本领域公认的抗增殖剂。示例性的烷化剂包括氮芥(nitrogen mustard)、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯，例如乌拉莫司汀、氮芥(Chlormethine)、环磷酰胺(CYTOXANTM)fosfamide、美法仑、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、曲他胺、三亚乙基硫代磷酰胺、白消安、卡莫司汀、环己亚硝脲、链脲佐菌素、达卡巴嗪和替莫唑胺。示例性抗代谢物包括叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，例如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟脲苷、阿糖胞苷、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、培他他汀和吉西他滨。除了本领域已知的其他微管稳定剂之外，与本文所述的抗TNFR2抗体联合使用的其他合适的抗增殖剂包括，例如，紫杉烷类、紫杉醇(紫杉醇可以以TAXOLTM形式商购)、多西紫杉醇、圆皮海绵内酯(DDM)、dictyostatin(DCT)、Peloruside A、埃博霉素、埃博霉素A、埃博霉素B、埃博霉素C、埃博霉素D、埃博霉素E、埃博霉素F、呋喃埃博霉素(furanoepothilone)、脱氧埃博霉素B1、[17]-脱氢脱氧埃博霉素B、[18]脱氢脱氧埃博霉素B、C12,13-环丙基-埃博霉素A、C6-C8桥接埃博霉素A、反式9,10-脱氢埃博霉素D、顺式9,10-脱氢埃博霉素D、16-去甲基埃博霉素B、埃博霉素B10、discoderomolide、帕土匹龙(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(圆皮海绵内酯)、TZT-1027(索利多汀)、ILX-651(tasidotin盐酸盐)、软海绵素B、甲磺酸艾日布林(E-7389)、哈米特林(Hemiasterlin)(HTI-286)、E-7974、Cyrptophycins、LY-355703、美登木素生物碱免疫缀合物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(伊斯平斯)、SB-743921、MK-0731、STA-5312、五加素、17β-乙酰氧基-2-乙氧基-6-氧代-B-高雌甾-1,3,5(10)-三烯-3-醇、cyclostreptin、isoolaulimalide、laulimalide、4-表-7-去羟基-14,16-二去甲基-(+)-圆皮海绵内酯和cryptothilone 1。
如果需要结合本文所述的抗TNFR2抗体或在此之前使用其来使异常增生的细胞静止，激素和类固醇(包括合成类似物)，诸如17a-乙炔雌二醇、己烯雌酚、睾酮、泼尼松、氟甲睾酮、屈他雄酮丙酸酯、睾内酯、醋酸甲地孕酮、甲基强的松龙、甲基睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、氯烯雌醚、羟孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺、托瑞米芬、诺雷德TM也可以施用给患者。当采用本文所述的方法或组合物时，还可以根据需要施用用于临床环境中调节肿瘤生长或转移的其他药剂，诸如抗模拟药。
本文所述的抗TNFR2抗体可与本领域公认的疫苗接种方案(例如，癌症疫苗)联合。设计了许多针对肿瘤的疫苗接种的实验策略(参见Rosenberg,S.，2000，癌症疫苗的开发(Development of Cancer Vaccines)，ASCO继续教育文集·春(ASCO Educational BookSpring)：60-62；Logothetis,C.，2000，继续教育文集·春：300-302；Khayat,D.2000，ASCO继续教育文集·春：414-428；Foon,K.，2000，ASCO继续教育文集·春：730-738；还可参见Restifo,N.和Sznol,M.癌症疫苗(Cancer Vaccines)，第61卷，第3023-3043页，DeVita等人(编)，1997，癌症：肿瘤学原理与实践(Cancer:Principles and Practice of Oncology)，第五版。在一些实施方案中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。当肿瘤细胞被转导表达GM-CSF时，已证明了这些细胞疫苗是最有效的。已经证明GM-CSF是一种有效的肿瘤疫苗抗原呈递激活剂(Dranoff等人(1993)，美国国家科学院学报90:3539-43)。
本文所述的抗TNFR2抗体也可用于治疗自身免疫性疾病和障碍。因此，在一个实施方案中，本文提供了一种治疗自身免疫性疾病和障碍的方法，其包含以有效量(例如，治疗有效量)向受试者施用本文所述的抗TNFR2抗体，以治疗自身免疫性疾病和障碍。利用本文描述的抗TNFR2抗体治疗的示例性自身免疫性疾病和障碍包括，例如，移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、多发性硬化症、结肠炎、牛皮癣、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解和1型糖尿病。可以在治疗期间检查受试者以监测抗TNFR2抗体减轻自身免疫性疾病的症状或病理的功效。可以通过比较施用前后抗体和/或联合治疗的效果监测治疗效果。
本文所述的抗TNFR2抗体可以单独施用或与一种或多种治疗剂一起施用，该治疗剂与抗体联合或协同作用以治疗患有自身免疫性疾病的受试者。例如，本文所述的抗TNFR2抗体可以与皮质类固醇(例如泼尼松、布地奈德、泼尼松龙)、钙调神经磷酸酶抑制剂(例如环孢霉素、他克莫司)；mTOR抑制剂(例如西罗莫司、依维莫司)；EVIDH抑制剂(例如硫唑嘌呤、来氟米特、霉酚酸酯)；生物制剂(例如阿巴西普、阿达木单抗、阿那白滞素、赛妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、英夫利昔单抗、依奇珠单抗、那他珠单抗、利妥昔单抗、苏金单抗、托珠单抗、优特克单抗、维多珠单抗抗)；和单克隆抗体(例如巴利昔单抗、达克珠单抗、莫罗单抗)联合使用。
本文所述的抗TNFR2抗体也可用于移植(例如细胞、组织或器官移植)的情况。因此，在一些实施方案中，本文提供了一种用于在已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者(例如人类移植物受者)中，促进移植物存活或减少移植物排斥的方法，包含向受试者施用有效量(例如治疗有效量)的本文所述抗TNFR2抗体，以促进移植物存活和/或减少移植物排斥。在一些实施方案中，移植物对于受者是自体的、同种异体的或异种的。在其他实施方案中，抗TNFR2抗体(或联合治疗)可以在移植前、移植时和/或移植后施用以促进移植物存活和/或减少移植物排斥。
在一些实施方案中，移植物排斥是在细胞、组织或器官同种异体移植物的受者中。在其他实施方案中，移植物受者是造血细胞或骨髓移植物，胰岛细胞的同种异体移植物或选自由心脏移植物、肾-胰腺移植物、肾移植物、肝移植物、肺移植物和胰腺移植物组成的群组的实体器官移植物的受者。移植物的另外的实例包括但不限于同种异体移植的细胞、组织或器官，诸如血管组织、眼睛、角膜、晶状体、皮肤、骨髓、肌肉、结缔组织、胃肠道组织、神经组织、骨、干细胞、软骨、肝细胞或造血细胞。
在一些实施方案中，与对照受者中观察到的移植物存活相比，促进移植物存活和/或减少移植物排斥的方法使受者中的移植物存活增加至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％或至少约50％。对照受者可是例如移植后不接受治疗或移植后接受单一疗法的移植受者。在某些实施方案中，促进移植物存活的方法促进长期移植物存活(例如，至少约6个月、至少1年、至少5年、至少约10年或更长的移植后存活时间)。
本文还提供了一种治疗、预防或减轻移植物抗宿主病的方法(例如在已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中)，包含向有此需要的受试者施用有效量(例如治疗有效量)本文所述的抗TNFR2用于治疗、预防或减少移植物抗宿主病。抗TNFR2抗体(或联合治疗)可以在移植前、移植时和/或移植后施用，以治疗、预防或减少移植物抗宿主病。
本文所述的抗TNFR2抗体可以单独施用或与一种或多种治疗剂一起施用，该治疗剂与抗体联合或协同作用，以促进移植物存活和/或减少移植物排斥，或治疗、预防或减轻移植物抗宿主病。例如，本文所述的抗TNFR2抗体可以与免疫调节剂或免疫抑制剂联合使用，例如阿霉素、硫唑嘌呤、白消安、布雷青霉素、布喹那、来氟米特(leflunamide)、环磷酰胺、环孢素A、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、6-巯嘌呤、皮质类固醇、非甾体类抗炎药、西罗莫司(雷帕霉素)、他克莫司(FK-506)、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)、莫罗单抗-CD3、OKT3、阿仑单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、利妥昔单抗、抗胸腺细胞球蛋白和IVIg。
在本文所述的联合治疗中，本文所述的抗TNFR2抗体可以在一种或多种另外的药剂之前、之后或同时施用。
本文还提供了一种阻断细胞中TNFα与TNFR2结合的方法，包含使细胞与有效量的本文所述的抗TNFR2抗体接触。
在另一个实施方案中，本文提供了一种活化细胞中TNFR2介导的信号传导的方法，包含使细胞与有效量的本文所述的抗体接触。
在一些实施方案中，本文提供了一种活化细胞或受试者中的NF-κB信号传导的方法，包含使细胞与受试者接触或向其施用有效量的本文所述的抗TNFR2抗体，以活化NF-κB信号传导。
在一些实施方案中，本文提供了一种在体外(例如，在培养物中)或在体内(即在受试者中)促进(例如增加)T细胞增殖(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+T细胞和CD8+T细胞两者)的方法，包含使细胞(例如T细胞)与受试者接触或向其施用有效量的本文所述的抗TNFR2抗体，以促进T细胞增殖。
在一些实施方案中，本文提供了一种在体外(例如在培养物中)或体内(即在受试者中)共刺激T细胞的方法，包含使细胞(例如T细胞)与受试者接触或向其施用有效量的本文所述的抗TNFR2抗体，以共刺激T细胞。
在一些实施方案中，本文提供了一种减少调节性T细胞(例如在T细胞区室中)的丰度的方法，包含使细胞(例如T细胞)与受试者接触或向其施用有效量的本文所述的抗TNFR2抗体，以减少调节性T细胞的丰度。在一些实施方案中，调节性T细胞丰度的减少涉及ADCC。在一些实施方案中，调节性T细胞丰度的减少涉及抑制或减少增殖或诱导细胞死亡。
本文还提供了检测样品中TNFR2的存在的方法。在一些实施方案中，该方法包含在允许抗体和TNFR2蛋白之间形成复合物的条件下，使样品与本文所述的抗TNFR2抗体接触，并检测复合物的形成。在一些实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体可以用于检测细胞培养物中或细胞群体中细胞表面上TNFR2蛋白的存在或表达水平。在另一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体可以用于检测生物样品(例如活检)中TNFR2蛋白的量。在又一个实施方案中，本文所述的抗TNFR2抗体可以用于体外测定(例如免疫测定，诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA)中以检测TNFR2蛋白。本文所述的抗TNFR2抗体也可以用于荧光激活细胞分选(FACS)。
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通过以下实例进一步阐释本发明，而不应理解为进一步限制。在本申请中引用的序列表、附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容在此明确通过引入并入本文。
实例
除非另有说明，否则按照制造商的说明使用以下实例中提及的市售试剂。除非另有注解，否则本发明使用本领域公认的重组DNA技术方案，诸如上文和以下教科书中所述的那些：Sambrook等人，见前文；Ausubel等人，分子生物学实验方法(Current Protocols inMolecular Biology)(Green Publishing Associates和Wiley Interscience，纽约，1989年)；Innis等人，PCR方案：方法和引用的指南(PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications)(学术出版社：1990年，纽约)；Harlow等人，抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)(冷泉港出版社：冷泉港，1988年)；Gait，寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(IRL出版社：牛津，1984年)；Freshney，动物细胞培养(Animal Cell Culture)，1987年；Coligan等人，免疫学实验方法(Current Protocols inImmunology)，1991年。
实例1.抗小鼠TNFR2抗体与小鼠TNFR2的结合
该实例描述了抗小鼠TNFR2抗体与在细胞上表达的小鼠TNFR2的结合。
用小鼠TNFR2质粒瞬时转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，并保持培养。通过流式细胞术测量小鼠TNFR2在CHO细胞上的平均荧光强度(MFI)，并使用FACS Aria筛选细胞以选择表达大于90％的小鼠TNFR2的CHO细胞。在起始浓度2μM的FACS缓冲液中的96孔板中制备50μL的每种抗体的3倍连续稀释液。CHO细胞通过70μm过滤器过滤，并重悬于2*106/mL浓度的FACS缓冲液中。向每个孔中加入十万个细胞，以使小鼠TNFR2抗体的起始浓度为1μM。将抗体和细胞在室温轻轻搅拌下共同孵育2小时。在FACS缓冲液中总共洗涤三次后，向每个孔中加入10μg/mL与Alexa647缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)第二抗体，并在4度温和搅拌下孵育45分钟。再洗涤三次后，将细胞重悬于FACS缓冲液中的碘化丙啶中，并通过流式细胞术确定抗小鼠TNFR2抗体的结合，作为Alexa647的MFI。
图2A和2B示出了抗小鼠TNFR2抗体的过表达TNFR2的CHO细胞(图2A)和野生型CHO细胞(图2B)的细胞上结合的非线性拟合曲线。检测的所有抗体均与过表达TNFR2的CHO细胞强结合，与野生型CHO细胞的非特异性结合可忽略不计。
实例2.抗TNFR2抗体的结合亲和力
在该实例中，使用ForteBio测定(生物层干涉技术)确定抗小鼠TNFR2抗体的结合亲和力(单价KD)。
简言之，IgG Fc捕获传感器尖端在室温下于PBS中水合10分钟。在96孔板中进行动力学测定，并在每个步骤中运行以下时间：a)基线：在PBS中30秒，b)用25μg/mL的抗小鼠TNFR2抗体一式两份加载180秒，c)在PBS中解离60秒，d)与75μg/mL的his标记小鼠TNFR2结合180秒，以及e)在PBS中解离180秒。
如图3所示，所有检测的8种抗体均显示出与小鼠TNFR2的特异性结合。具体而言，抗体Y6、Y9和Y10显示约1nM的单价KD；R2-H5-L10的单价KD为约5nM；Y7、M3和M7的单价KD为约20nM；M36的单价KD为约122nM。
实例3.抗TNFR2抗体的配体阻断
在该实例中，通过ELISA检测了抗小鼠TNFR2抗体阻断TNF与TNFR2结合的能力。
将九十六孔板在4℃下用50μL 2μg/mL his标记小鼠TNFR2蛋白包被过夜。然后将每个孔用不含Pierce蛋白的封闭缓冲液封闭一小时，以防止抗体的非特异性结合，随后用2倍连续稀释的抗小鼠TNFR2抗体从500nM开始孵育2小时。将重组小鼠TNFα孵育1小时，并用生物素化的抗小鼠TNFα检测，随后用链霉亲和素HRP抗体孵育40分钟。确定发光(与小鼠TNFα缀合的过氧化物酶的活性的结果)，并在450nm测量吸光度。在每次孵育之间，使用含有0.05％TWEEN-20的PBS洗涤三次。除非另有说明，否则测定在室温下进行，并且蛋白质在含有0.05％TWEEN-20的PBS中稀释。
图4示出了在所有检测浓度下针对所有抗体归一化后在450nm处的光密度(OD)。抗体M3和R2-H5-L10不与TNFα竞争与TNFR2的结合，Y7和M36部分阻断TNFα与TNFR2的结合，Y6、Y9、Y10和M3完全阻断TNFα与TNFR2的结合。
实例4.抗TNFR2抗体的表位分箱(binning)
该实例描述了使用ForteBio测定的，新产生的抗小鼠TNFR2抗体相对于市售抗体32.4(BioLegend)和54.7(Bioxcell)的表位binning。
简言之，将链霉亲和素捕获传感器尖端在室温下于PBS中水合10分钟。在96孔板中进行动力学测定，并在每个步骤中运行以下时间：a)基线：在PBS中360秒，b)用先前生物素化的30μg/mL 32.4或54.7抗体一式两份加载120秒，c)在PBS中解离10秒，d)与150μg/mLhis标记小鼠TNFR2结合180秒，e)在PBS中解离5秒，以及f)与50μg/mL每种抗小鼠TNFR2抗体结合180秒。
结果总结在表3中。将抗体Y6、Y7、Y10、M7和M36分组到与抗体32.4相同的箱中，将抗体Y9和M3分组到与54.7相同的箱中。有趣的是，抗体H5L10不会与32.4或54.7箱重叠，表明它识别不同于两种市售抗体识别的箱的新箱。
表3
32.4 54.7
Y6 O NO
Y7 O NO
Y9 NO O
Y10 O NO
H5L10 NO NO
M3 NO O
M7 O NO
32.4 O NO
M36 O NO
54.7 NO O
O＝重叠箱；NO＝不重叠的箱
实例5.使用嵌合受体构建体的表位作图
该实例描述了小鼠/人嵌合TNFR2构建体在更具体地定义抗小鼠TNFR2抗体靶向的表位中的用途。
简言之，通过ATUM(加利福尼亚州纽瓦克)合成了小鼠和人TNFR2嵌合受体的Fc融合(图5A)，并使用Expi 293瞬时转染方法生成了每种蛋白，然后进行了蛋白A纯化。将抗-His生物传感器尖端在室温下于PBS中水合10分钟。在96孔板中进行动力学测定，在每个步骤运行以下时间：a)基线：在PBS中60秒，b)用50μg/mL的每种嵌合蛋白(0-9)、小鼠TNFR2和人TNFR2加载180秒，c)在PBS中解离60秒，d)与250nM的每种抗小鼠TNFR2抗体结合180秒，以及e)在PBS中解离180秒。
如图5B所示，所有抗体均与小鼠TFNR2结合，但不结合人TNFR2。基于与每种嵌合构建体的结合模式，更详细地定义了每种抗体靶向的特异性表位区。
实例6.抗体M3的表位作图
该实例描述了使用酵母表面展示的抗体M3的精细表位作图。
通过将羧基末端FLAG表位标签融合到编码小鼠TNFR2的核酸序列上来合成C端flag标记小鼠TNFR2(23-258)。用限制酶XhoI和KasI消化酵母展示载体pMYD1200(Xu等人，单克隆抗体(MAbs)2013；5:237-54)，并使用WIZARD SV Gel和PCR清洁试剂盒(Promega)进行凝胶纯化。使用冷冻EZ酵母转化II试剂盒(Zymoresearch)制备化学感受态EBYZ细胞(Xu等人，同上)，并用500ng插入物和2μg消化载体转化，然后铺板在缺乏色氨酸的CM葡萄糖平板上(Teknova)。选择单个菌落并转移至SDCAA培养基(葡萄糖-20mg/ml、酪蛋白氨基酸-10mg/ml、酵母氮碱-3.4mg/ml、硫酸铵-10mg/ml，Na2HPO4-5.4mg/ml和Na2HPO4-7.4mg/ml)中，在30℃振荡(225rpm)24小时。然后将细胞沉淀并重悬于SDGAA培养基(半乳糖-20mg/ml、酪蛋白氨基酸-10mg/ml、酵母氮碱-3.4mg/ml、硫酸铵-10mg/ml、Na2HPO4-5.4mg/ml和Na2HPO4-7.4mg/ml)中，并在20℃振荡生长另外48小时，以诱导TNFR2在酵母细胞表面上的表达。
按照制造商的说明，使用Alexa Fluor 647标记试剂盒(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific))对M3 IgG进行标记。显示TNFR2点突变的酵母(0.5e6个细胞)与连续稀释的M3/Alexa Fluor 647(0.01-400nM)或1μM抗FLAG M2/Alexa Fluor647(CellSignaling Technology)一起孵育1小时。然后用洗涤缓冲液(PBS，pH 7.4，含有0.5％BSA)洗涤细胞，并使用FACS-CANTO细胞仪(BD Biosciences)测量荧光。为了使M3与每个TNFR2点突变体的展示水平结合正常化，计算M3/抗FLAG的平均荧光强度(MFI)之比，并将其绘制为M3浓度的函数。使用PRISM软件(GraphPad)和单点双曲线拟合对非线性回归进行拟合。
结构域水平作图识别了小鼠TNFR2的CRD1和CRD2区的M3抗体表位(实例5)。精细的表位作图策略用于进一步定义具有氨基酸分辨率的表位(Levy等人，微生物学和生物技术杂志(JMB)2007；365:196-210)。在酵母表面上显示了总共28个TNFR2突变体，每个突变体在表面暴露位置含有单个氨基酸取代。为了评估每个位置对M3结合的贡献，在每个位置上进行了丙氨酸或天冬氨酸的取代(表4)。
表4.TNFR2突变体组套
Figure BDA0003069622250000861
Figure BDA0003069622250000871
A+++，M3结合不减少；++，减少0-50％；+，减少50-90％；–，减少多于90％
测定了所有28个突变体和野生型序列与M3(400nM)的结合等温线(表4)。M3被显著破坏的位置(-和+)作图至小鼠TNFR2的同源性模型中(图6)。与结构域作图结果一致，M3结合的关键位置位于CRD1的B2模块和CRD2的A1模块内。M3表位也位于TNF a结合界面的相对侧，并且与M3不显著抑制配体结合的结果一致。
实例7.中和抗小鼠TNFR2抗体在同系肿瘤模型中的治疗效果
该实例示出了抗小鼠TNFR2抗体在同系小鼠肿瘤模型中的作用。
将6至8周龄的雌性Balb/C小鼠在受控条件下无病原体的环境中饲养。通过将100μL PBS中的5*10E5细胞皮下注射入胁腹(7只小鼠/组)，建立结直肠CT26肿瘤。所有指定的抗体经i.p.注射入带有平均大小为80-90mm3的肿瘤的小鼠体内。使用卡尺监测肿瘤的生长，并且将体积估计为长度乘以宽度平方的乘积的一半。在指定的时间经腹腔内注射总体积200-300μL的抗小鼠TNFR2抗体。在第0、2和4天施用300μg的抗体32.4和54.7。在第0、2、4、6和8天施用1000μg的抗体M3和M36。在第0、2和4天施用1000μg的抗体M7。对肿瘤完全消退的小鼠(治愈的小鼠)进行了再激发实验。在最后一次检测到肿瘤后至少60天，将小鼠的对侧胁腹中再植入2.5*10E5 CT 26细胞。
如图7所示，小鼠TNFR2的商业单克隆抗体(即克隆#32.4和#54.7)在小鼠结直肠癌的CT26模型中显著降低了肿瘤的生长(图7A和7B)。新生成的抗小鼠TNFR2抗体M3、M36和较低程度的M7，在相同模型中显著降低了肿瘤的生长，并治愈了几只动物。先前用M3和M36治疗治愈的小鼠在相反的胁腹受到CT26细胞的再激发，以评估长期的治疗保护作用。用M3和M36治疗治愈的动物(图7A-7C)对相同肿瘤细胞系CT26的再激发具有抗性(图7D)。这些结果共同表明，新生成的抗小鼠TNFR2抗体有效降低了肿瘤的生长，并且在体内建立了长期的保护作用。
实例8.Fc介导的效应子功能增强了同系肿瘤模型中抗小鼠TNFR2抗体的治疗效果
该实例示出了在同系肿瘤模型中Fc效应子功能对抗小鼠TNFR2抗体功效的影响。
如实例7所述，在小鼠中建立了CT26肿瘤，并向小鼠施用抗体M3和M36(Fc突变的野生型)。Fc突变体具有两个单氨基酸取代D265A和N297G，其可消除Fc介导的效应子功能。6周龄的雌性Balb/c小鼠(7只小鼠/组)皮下接种CT26细胞(5*10E5)。指定的抗体经i.p.注射入带有平均大小为80-90mm3的肿瘤的小鼠体内。在两个不同的剂量方案下对抗体M36(野生型或Fc突变)进行了检测(i)第0、2、4、6和8天为1000μg，或(ii)第0、2、4、6和8天为300μg。在第0、2、4、6和8天以300μg的剂量施用抗体M3。如图8A-8D所示，需要Fc介导的效应子功能以在CT26小鼠模型中达到抗小鼠TNFR2抗体的最大抗癌治疗效果。
另外，使用Y9观察到相似的结果。如实例7所述，在小鼠中建立CT26和Wehi164肿瘤，并将Y9或Fc突变的(D265A和N297A)Y9以每周一次、每次0.3mg的三个剂量经i.p.注射入患有平均大小为60-90mm3的肿瘤的小鼠中(每组n＝15)。如图8E-8J所示，Fc突变严重消除了Y9的抗肿瘤作用。
抗体Y9、M3和M36靶向小鼠TNFR2上不同的表位。另外，M3是非配体竞争者，M36是部分配体竞争者。重要的是，获得了最大的抗癌治疗效果，而这与靶向的表位和配体竞争特性无关。
实例9.靶向同系肿瘤模型中不同表位的抗小鼠TNFR2抗体的治疗效果
该实例证明了靶向小鼠TNFR2上不同表位的几种候选抗小鼠TNFR2抗体的治疗效果。
如实例7所述，在小鼠中建立CT26肿瘤，并在第0天以1mg的剂量施用指定抗体。所有检测的抗体在饱和剂量下均具有同等效力(未显示)，但在次最佳剂量下，抗体Y9和M3在体内显示出最佳的抗肿瘤作用(图9A和9B)，其中Y9更好。
在单独的实验中，如实例7所述，在小鼠中建立EMT6肿瘤，并以1mg(图10A-10F)或0.3mg(图10G-10I)的单剂量施用指定抗体。抗体Y9和M3在体内显示出最佳的抗肿瘤作用，其中Y9还是更好，特别是在较低的剂量水平。
实例10.中和抗小鼠TNFR2抗体在乳腺癌小鼠模型中的治疗效果
该实例示出了抗小鼠TNFR2抗体在乳腺癌小鼠模型中的作用。
如实例8所述，在小鼠中建立乳腺EMT6肿瘤。TNFR2抗体经i.p.注射入带有平均大小为80-90mm3的肿瘤的小鼠体内。使用卡尺监测肿瘤的生长，并且将体积估计为长度乘以宽度平方的乘积的一半。在指定的时间经腹腔内注射总体积200-300μL的抗小鼠TNFR2抗体。在第0、2和4天以300μg施用抗体32.4和54.7。在第0、2、4、6和8天以1000μg施用抗体M3和M36。在第0、2和4天以1000μg施用抗体M7。抗体显著降低了肿瘤的生长。
实例11.抗体Y9在抗PD-1敏感和耐药同系小鼠模型中的治疗效果
该实例比较了抗体Y9和抗PD-1抗体在抗PD-1疗法敏感或有抗性的同系小鼠模型中的功效。
为了评估相对于抗PD-1抗体的抗体Y9的活性，仓鼠抗小鼠PD-1抗体的鼠版本(J43克隆；Agata等人，国际免疫学(Int Immunol.)(1996；8:765-72)通过用具有D265A和N297A取代的鼠IgG2a Fc替代仓鼠Fc而生成。两种抗体均在抗PD-1敏感(SaI/N)和抗性(MBT-2)同系小鼠模型中进行了检测。将6至8周龄的雌性小鼠在受控条件下饲养在无病原体的环境中。通过将200μL PBS中的1*106MBT-2(C3H膀胱)或5*106SaI/N(NCI 1/JCR纤维肉瘤)皮下注射入右胁腹(10-15只小鼠/组)来建立肿瘤。使用卡尺监测肿瘤的生长，并根据以下公式计算体积：π/6*(长*宽*宽)。当肿瘤达到50-100mm3的平均大小时，经i.p.注射300μg抗体，如所示，每周一次，共三周，总体积为200μL。在Sa1/N(抗PD-1敏感)和MBT-2(抗PD-1耐药)模型中，仅抗TNFR2(Y9)治疗在所有治疗的动物中使肿瘤完全消退。然而，用抗PD-1mAb治疗MBT-2膀胱模型只会产生有限的活性(图11)。
实例12.抗体Y9和抗PD-1或抗PD-L1抗体联合治疗在同系小鼠模型中的治疗效果
该实例描述了在各种同系小鼠模型中与抗体Y9和抗PD-1或抗PD-L1抗体的联合疗法。
为了评估用鼠替代抗TNFR2抗体(Y9)的治疗是否可以与抗PD-1或抗PD-L1抗体协同作用，如实例11所述生成了鼠版本J43。通过用D265A和N297A取代的鼠IgG2a Fc替换人Fc，还生成了PD-L1抗体的鼠版本MPDL3280a(Powles等人，自然，2014；515:558-62)。检测了抗体组合在同系小鼠模型中的活性。将6至8周龄的雌性小鼠在受控条件下饲养在无病原体的环境中。通过将200μL PBS中的3*105CT26(Balb/C结肠)、EMT6(Balb/C乳腺)或Wehi164(Balb/C纤维肉瘤)细胞、1*106MBT-2(C3H膀胱)细胞或5*106SaI/N(NCI 1/JCR纤维肉瘤)细胞皮下注射入右胁腹(7-15只小鼠/组)，建立肿瘤。使用卡尺监测肿瘤的生长，并根据以下公式计算体积：π/6*(长*宽*宽)。当肿瘤达到50-100mm3的平均大小时，经i.p.注射300μg抗体，如所示，每周一次，共三周，总体积为200μL。在WEHI164、SaI/N和MBT2模型中，长期生存是由单独的抗TNFR2(Y9)治疗驱动的，而在CT26和EMT6模型中，抗TNFR2(Y9)和抗PD-1的联合治疗显示出最高的长期存活率(图12)。单独或与Y9联合使用，抗PD-L1治疗可获得相似的结果(数据未显示)。
实例13.抗体Y9与抗CTLA4抗体的安全性比较
该实例描述了与抗CTLA4抗体相比抗体Y9的各安全性/毒性参数。
为了比较抗体Y9与抗CTLA4抗体的毒性特征(Quezada等人，2006)，生成了具有小鼠IgG2a Fc的小鼠抗小鼠CTLA-4抗体9D9克隆的重组版本(与抗体Y9相同的同种型)。在二十只6至8周龄的Balb/c雌性小鼠中进行了使用抗体的长期暴露研究。将小鼠饲养在受控条件下的无病原体环境中。总共8周，将1mg抗体(PBS，小鼠IgG2a同种型对照，抗TNFR2(Y9)或抗CTLA4，每组n＝5)经i.p.注射入小鼠，每周一次，每次200μl。每周两次测量小鼠体重，并在整个研究过程中跟踪小鼠的身体健康状况。按照治疗时间表，每周一次从所有组收集隐血，并进行一次预处理放血以作为基线对照。在最后一次(第8次)每周治疗后48小时处死所有小鼠，由此收集脾脏并称重，并通过心脏穿刺收集血液。如图13所示，在治疗的前6周，各组之间均未检测到体重差异，但是在第7剂抗体后，抗CTLA4组迅速失去了体重，而所有其他组均没有体重变化。与Y9或对照组相比，在抗CTLA4抗体治疗的小鼠中观察到脾肿大，反映在抗CTLA4组的脾脏重量显著增加(图14)。
使用Catalyst Dx化学分析仪(IDEXX，缅因州韦斯特布鲁克)评估血液中肝酶的水平。简言之，通过心脏穿刺收集血液样本，并将其转移到肝素锂全血分离器中(IDEXX，#98-14323-00)。使用NSAID 6CLIP(IDEXX，#98-11007-01)分析ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血液水平。尽管所有组均在正常范围内，但在抗CTLA4组中观察到血液ALT(图15A)和AST(图15B)显著增加。
为了描述治疗对免疫细胞表型的影响，通过流式细胞术分析了最终治疗后48小时来自皮肤引流淋巴结的外周血淋巴细胞和树突状细胞(图16A-16D)。为了准备用于流式细胞术的血液，使用ACK裂解缓冲液(Lonza)裂解红细胞，并在流式细胞术缓冲液(含1％FCS和0.02％叠氮化钠的PBS)中洗涤。对于DC分析，按照制造商的说明，使用脾脏解离试剂盒(美天旎(Miltenyi Biotec))消化皮肤引流淋巴结。首先将单细胞悬液用Fc-Block染色，并在4℃下在PBS中进行活/死细胞染色10分钟。然后将细胞在4℃下进行细胞外标记物染色30分钟。为了识别CD4 Treg，按照制造商的说明使用Foxp3染色试剂盒(BioLegend)固定并渗透化细胞，并对Ki-67、Foxp3和CTLA-4进行细胞内染色。Ki-67的表达(除G0外，在细胞周期的所有阶段均表达)用于评估T细胞增殖。在用抗CTLA-4抗体治疗的小鼠中，CD4和CD8 T细胞增殖的频率相对于同种型对照显著增加(图16A和16B)。相比之下，用Y9治疗的小鼠未显示T细胞增殖增加，表明与抗CTLA-4抗体不同，Y9不会引起外周T细胞的自发激活和增殖。与此相一致，Y9不会上调CD86(B7.2)表达(CD86(B7.2)是一种共刺激分子，对T细胞的树突状细胞激活很重要)，而抗CTLA-4抗体却能上调(图16D)。综上所述，这些数据表明施用抗TNFR2抗体Y9不会导致健康小鼠的自发性免疫细胞激活。
实例14.抗体Y9在不同工程小鼠模型中以及不同抗体同种型变体之间的疗效比较
如实例8所述，鼠替代抗TNFR2抗体Y9的Fcγ受体接合对其体内活性很重要。Fcγ受体结合可以表明：1)抗体的效应子功能的贡献，诸如经由激活Fcγ受体mFcγRI、mFcγRIII或mFcγRIV的抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)、或抗体依赖的细胞的吞噬作用(ADCP)；或2)经由在Fcγ受体表达细胞类型上聚集抗体增强激动作用(Nimmerjahn等人，免疫学趋势，2015；36:325-36)。对于后者，抑制性Fcγ受体mFcγRII被认为是促进激动的最重要的因子(参见例如，Dahan等人，癌细胞，2016；29:820-31)。
为了评估哪些Fcγ受体对Y9的功效最重要，使用野生型Fcγ受体(“WT”，Balb/C)、缺少mFcγRII(“FcGR2B KO”；Fcgr2b-579型，Taconic)、或缺少常见Fc-γ链(“Fc常见γ-KO”；Fcer1g-584型，Taconic)的同系小鼠模型。Fc常见γKO小鼠的mFcγRI、mFcγRIII或mFcγRIV表达不足。将6至8周龄的雌性小鼠在受控条件下饲养在无病原体的环境中。通过将200μL PBS中的3*105CT26(结肠)细胞皮下注射入右胁腹(10只小鼠/组)，建立肿瘤。使用卡尺监测肿瘤的生长，并根据以下公式计算体积：π/6*(长*宽*宽)。当肿瘤达到50-100mm3的平均大小时，经i.p.注射300μg Y9抗体或PBS作为对照，如所示，每周一次，共三周，总体积为200μL。如图17所示，FcGR2B KO和Fc常见γKO小鼠的Y9活性均降低。该数据表明，通过Fcγ受体聚集增强的激动活性以及ADCC或ADCP都可能在体内促进Y9的活性。
为了评估哪种抗体同种型经由Fcγ受体的结合而赋予最高的活性，使用不同的Fc同种型和突变的同种型创建了Y9变体：1)对mFcγRI、mFcγRIII和mFcγRIV具有高亲和力的鼠IgG2a；2)对mFcγRII和mFcγRIII具有中等亲和力的鼠IgG1；不结合任何mFcγR的具有D265A和N297A突变的鼠IgG2a(DANA)；以及具有S267E和L328F突变(SELF)的鼠IgG2a，其确实增加了对mFcγRII的亲和力。在CT26(结肠)同系小鼠模型中比较了不同变体的活性。将6至8周龄的雌性小鼠在受控条件下饲养在无病原体的环境中。CT26模型的生成和Y9变体的施用条件如上所述。如图18所示，SELF变体的活性最高，其次是mIgG1同种型，然后是mIgG2a同种型。DANA变体缺乏功效。该数据表明通过聚集增强的激动活性是Fcγ受体介导的活性的主要因素。
实例15.抗体Y9的共刺激活性及其对体外CD8+T细胞增殖和功能的影响
该实例描述了Y9介导的CD8+T细胞的交联对CD8+T细胞的共刺激活性、增殖和功能性的直接影响。
在滴定浓度Y9存在下，在体外用抗CD3/CD28刺激小鼠CD8 T细胞。将96孔平底板在4℃下与滴定量的悬浮在PBS中的功能级抗CD3(克隆17A2；赛默飞世尔科技)和Y9孵育过夜。经由负选择(CD8+T细胞分离试剂盒、小鼠；美天旎)从BALB/c小鼠的脾脏和皮肤引流淋巴结中纯化总CD8+T细胞。然后用5μM CellTrace Violet(英杰(Invitrogen))标记CD8 T细胞。在加入细胞之前，从96孔板中吸取抗体，在室温下用含10％FCS的RPMI封闭孔10分钟，然后再次吸取。每孔加入4*104个CD8+T细胞以及1μg/mL可溶性抗CD28(克隆37.51)，并在37℃孵育72小时。然后对细胞进行活化标记物和细胞内颗粒酶B染色，并通过流式细胞术进行分析。如图19所示，Y9表现出共刺激活性，并在体外增加CD8+T细胞的增殖和功能。示出的数据使用了1.67μg/mL板结合抗CD3、1μg/mL抗CD28和Y9的滴定浓度。增殖定义为细胞经历至少1轮分裂，以CellTrace Violet平均荧光强度的2倍稀释表示。
实例16.抗体Y9的表位作图
该实例描述了使用酵母表面展示的抗体Y9的精细表位作图。
结构域水平作图识别了小鼠TNFR2的CRD1区的Y9抗体表位(实例5)。如实例6所述的精细的表位作图策略用于进一步定义具有氨基酸分辨率的表位(Levy等人，微生物学和生物技术杂志，2007；365:196-210)。在酵母表面上显示了总共十五个TNFR2突变体，每个突变体在表面暴露位置含有单个氨基酸取代。为了评估每个位置对Y9结合的贡献，在每个位置上进行了丙氨酸或天冬氨酸的取代(表5)。
表5.TNFR2突变体组套
取代 Y9结合 相应的人类残基
G37D +++ G37
E39A +++ T39
I42A +++ L42
R49A – Q48
K50A +++ T49
Q52A +++ Q51
K57A +++ K56
H66A +++ V65
F67A +++ F66
N69A – T68
K70A +++ K69
V87A +++ L86
Q90A +++ W89
F91A ++ V90
R92A +++ P91
A+++，Y9结合不减少；++，减少0-50％；+，减少50-90％；–，减少大于90％
测定了所有十五个突变体和野生型序列与Y9(400nM)的结合等温线(表5)。Y9被显著破坏的位置(-)作图至小鼠TNFR2的同源性模型中(图20)。R49与受体/配体界面的接近性与Y9可以与配体竞争结合TNFR2的观察结果一致。
实例17.单剂量抗小鼠TNFR2抗体在同系肿瘤模型中的抗肿瘤作用
该实例证明了单剂量的抗TNFR2抗体在多种同系肿瘤模型中的抗肿瘤应答。将6至8周龄的雌性Balb/C小鼠在受控条件下无病原体的环境中饲养。通过将200μLPBS中的3*105CT26(结肠)、EMT6(乳房)、Wehi64(纤维肉瘤)或A20(B细胞淋巴瘤)细胞皮下注射入右胁腹(6-7只小鼠/组)，建立肿瘤。使用卡尺监测肿瘤的生长，并根据以下公式计算体积：π/6*(长*宽*宽)。当肿瘤达到50-70mm3的平均大小时，经i.p.注射Y9抗体，单剂量(0.1mg、0.3mg或1mg)，总体积为200μL。在所有四种模型中，仅用一剂抗体就能观察到显著的抗肿瘤活性(表6，图21A-21D，22A-22D，23A-23D和24A-24D)。
表6.单剂量抗小鼠TNFR2抗体的抗肿瘤作用
Figure BDA0003069622250000941
PBS：磷酸盐缓冲盐水，PR：部分应答，CR：完全应答
对十一名Wehi64完全应答者进行再激发，以确定是否引发了持久的抗肿瘤应答。在初始接种后的第214天，与初始接种相反，通过将200μL PBS中的3*105的Wehi64细胞皮下注射入左胁腹，对CR小鼠和年龄匹配的对照小鼠(5)进行再激发。如上所述监测肿瘤大小。最初施用0.1、0.3或1mg任一者Y9的小鼠没有肿瘤生长，而年龄匹配的对照组均具有肿瘤生长(图25)。
该实例表明单剂量的抗TNFR2抗体在多种同系肿瘤模型中显示出抗肿瘤作用，并且在肿瘤清除后该作用可以保留。
实例18.抗TNFR2抗体对表面CTLA4表达的影响
该实例描述了抗小鼠TNFR2抗体对T细胞上CTLA4表达的影响。
向C57BL/6小鼠皮下注射3*105的EMT-6细胞。当肿瘤达到200-300mm3的平均大小时，用PBS或300μg Y9或Y9-DANA(即，具有D265A和N297A取代的Fc区的Y9)治疗小鼠。36小时后，收获肿瘤，按照制造商的说明，使用肿瘤解离试剂盒，小鼠(美天旎)进行消化，并对T细胞谱系标记物和CTLA-4(克隆UC10-4B9，BioLegend)染色。如图26A和26B所示，Y9治疗(在较小程度上是Y9 DANA治疗)显著降低了肿瘤中CD4+常规T细胞、Tregs和CD8+T细胞中CTLA4的表面表达，而在肿瘤引流淋巴结中没有观察到变化。
实例19.抗TNFR2抗体对肿瘤中GITR、GARP和PD-1表达的影响该实例描述了抗小鼠TNFR2抗体对肿瘤中GITR、GARP和PD-1表达的影响。
向C57BL/6小鼠皮下注射3*105的EMT-6细胞。当肿瘤达到200-300mm3的平均大小时，用PBS或300μg Y9或Y9-DANA治疗小鼠。36小时后，收获肿瘤，按照制造商的说明，使用肿瘤解离试剂盒小鼠(美天旎)进行消化，并对T细胞谱系标记物GITR(克隆DTA-1，BioLegend)、GARP(克隆F011-5，BioLegend)、LAP(TW7-16B4，BioLegend)和PD-1(RMP1-30，BioLegend)进行染色。用Y9处理后，GITR的表面表达显著降低，用Y9 DANA处理后，表面表达降低程度较小(图27A)。Y9而不是Y9 DANA引起了GARP表达的协同下降，这充当了潜在TGF-b以及与TGF-b相关的LAP(潜伏期相关肽)的停靠站(图27B)。与GITR相似，Y9引起PD-1+效应T细胞的频率降低，以及CD8 T细胞上每细胞表达的显著降低(显示为中值荧光强度)(图27C)。
实例20.抗TNFR2抗体对表面TNFR2表达的影响
该实例描述了抗小鼠TNFR2抗体对肿瘤中TNFR2表达的影响。
向C57BL/6小鼠皮下注射3*105细胞用于CT26、MC38和WEHI-164同系肿瘤模型。当肿瘤达到200-300mm3的平均大小时，用PBS或300μg Y9或Y9-DANA治疗小鼠。36小时(CT26)或24小时(MC38和WEHI-164)后，收获肿瘤，按照制造商的说明，使用肿瘤解离试剂盒小鼠(美天旎)进行消化，并对T细胞谱系标记物和TNFR2(克隆TR75-89，BioLegend)染色。如图28A-28C所示，观察到用Y9治疗后，TNFR2的表面表达显著降低，用Y9 DANA治疗后，表面表达降低程度较小。
实例21.抗人TNFR2抗体和嵌合体结合
在Abveris(马萨诸塞州坎顿)进行小鼠免疫。简言之，将人TNFR2-His用弗氏完全佐剂乳化，并用100μg免疫四只DIVERSIMAB小鼠。在第14、28、42和56天时，在弗氏不完全佐剂中加强注射100μg TNFR2-His。在最后一次免疫后，通过ELISA检测TNFR2反应性的抗体滴度。在第60天进行产生抗体的B细胞和骨髓瘤细胞之间的融合，并铺板在96孔板上。将融合物培养10-14天，然后针对人TNFR2-His、人TNFR2-Fc、cyno TNFR2-Fc和无关的Fc融合蛋白进行筛选。然后使用有限稀释亚克隆所有TNFR2蛋白阳性而非无关Fc蛋白阳性的杂交瘤。再次通过ELISA检测亚克隆的杂交瘤克隆的TNFR2反应性，并扩增阳性克隆以产生抗体。使用Protein G从培养基中纯化抗体。杂交瘤测序在Genscript(新泽西州皮斯卡塔韦)进行。简言之，总RNA从杂交瘤细胞中分离出，并反转录为cDNA。使用RACE扩增抗体序列，并将其克隆到测序载体中进行测序。
表7.抗人TNFR2杂交瘤
Figure BDA0003069622250000951
Figure BDA0003069622250000961
通过ELISA表征了针对人TNFR2的杂交瘤抗体与嵌合体0、嵌合体3、小鼠TNFR2和人TNFR2的结合。简言之，将黑色的384孔微孔板(Grenier Bio-one)在4℃下用在PBS中稀释为1μg/ml的嵌合体0、嵌合体3、小鼠TNFR2-His和人TNFR2-His包被过夜。用PBS/1％BSA封闭板1小时，然后用PBS/0.05％TWEEN 20洗涤。随后将板与含有杂交瘤抗体的培养基一起孵育1小时，然后再次洗涤，然后加入AFFINIPURE山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc.)1小时。洗涤后，将SUPERSIGNAL ELISA Pico化学发光底物(赛默科技)加入孔中，并使用SYNERGY H1酶标仪(BioTek)检测发光。如图29所示，识别了几种与嵌合体3和人TNFR2结合并且不与嵌合体0和小鼠TNFR2结合的小鼠抗体。该实例证实了抗人TNFR2抗体的产生，该抗体结合与人Y9表位同源对应的人TNFR2区。
实例22.抗人TNFR2抗体的人源化
该实例描述了使用实例21中描述的方法产生的小鼠抗人TNFR2抗体ABV2的人源化。通过将ABV2的VH和VL序列与人IgG1和人κ恒定区融合，产生ABV2的嵌合版本(ABV2c)。
表8和表9提供了小鼠亲本ABV2的VH和VL序列以及嵌合体ABV2c的全长序列。
表8
Figure BDA0003069622250000962
Figure BDA0003069622250000971
Figure BDA0003069622250000981
对于ABV2的人源化，使用Schrodinger’s Bioluminate软件将小鼠抗体可变序列作为输入生成同源性模型。使用增强的Chothia命名法定义CDR和框架边界。基于各种序列和结构参数，诸如但不限于总体同一性、相似性、CDR茎几何，选择了来自蛋白质数据库的不同人源化模板。另外，获得了与小鼠亲本抗体序列具有最高同一性的人种系基因序列，并将其用于框架选择。选择了得分最高的人抗体模板，并进行了框架替换，但游标区、标准结构和界面的部分的残基不变(小鼠亲本)。
替换框架后，使用gromos力场将人源化同源性模型的能量最低化，并进一步检测具有很高总能量的残基。将表现出空间冲突的非保守残基突变回相应的亲本小鼠序列，或根据抗体数据库中人抗体序列之间的残基分布统计进行取代。在这些残基变化之后，再次对模型进行能量最小化，并选择具有可接受能量评分的框架进行检测。使用上述工艺产生的ABV2的人源化重链和轻链可变区序列如下所示。图30A-30D提供了人源化序列的比对。
人源化的重链可变区
ABV2 VH_hum#1(HD1)(SEQ ID NO:73)QIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCRASGYTFTTFGMSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQNFQGRFAFTVDTEASTAYMELRSLKSEDSAVYFCARRSNFAYWGQGTTVTVSS
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人源化轻链可变区
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ABV2 VL_hum#10(HD14)(SEQ ID NO:94)
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASESVDSSGNSFMHWYQQKPGKAFKLLIYRASNLESGVPSRFSGSGSRTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPWTFGGGTKVEIK
ABV2 VL_hum#11(HD15)(SEQ ID NO:95)
DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRASESVDSSGNSFMHWYLQKPGQSFQLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSNEDPWTFGGGTKVEIK
ABV2 VL_hum#12(HD17)(SEQ ID NO:96)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDSSGNSFMHWYQQKPGQPFKLLIYR ASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPWTFGGGTKVEIK
ABV2 VL_hum#13(HD25)(SEQ ID NO:97)
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ABV2 VL_hum#14(GBM01)(SEQ ID NO:98)
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ABV2 VL_hum#15(GBM02)(SEQ ID NO:99)
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ABV2 VL_hum#16(GBM03)(SEQ ID NO:100)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASESVDSSGNSFMHWYQQKPGQAPRLLIYR ASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK
实例23.抗人TNFR2抗体在NF-κB报告基因细胞系测定中的体外检测
该实例描述了人TNFR2报告基因细胞系的生成，以评估人抗TNFR2抗体的激动活性。为了在信号测定中检测人抗TNFR2抗体的激动活性，生成了人TNFR2报告基因细胞系。简言之，使用脂质体3000(赛默飞世尔)用全长人TNFR2基因(Origene)转染GloResponseTMNF-κB-RE-luc2p HEK293细胞系(Promega)，并使其在DMEM/10％FBS中恢复。转染后两天，用含有遗传霉素
Figure BDA0003069622250001021
(0.2mg/ml)的培养基替换培养基。在含有遗传霉素的培养基中培养14天后，通过流式细胞术确认人TNFR2的稳定表达。为了测量TNFR2诱导的NF-kB信号传导，将人TNFR2报告基因细胞和载体对照细胞(1*104)与ABV2c(0.14-100nM)在37℃下孵育5小时。然后加入ONE-GloTM荧光素酶试剂，并在SYNERGY H1酶标仪(BioTek)上测量发光。与抗人TNFR2抗体ABV2c孵育后，观察到NF-κB信号传导呈剂量依赖性增加(图31)。
实例24.抗人TNFR2抗体对卵巢癌腹水中Treg细胞的体外影响
据报道，来自卵巢癌患者的Treg细胞具有高水平的TNFR2和高度免疫抑制性。其他研究表明用抗TNFR2抗体治疗会降低腹水Treg细胞的生存力(Torrey等人，科学信号(SciSignal)2017；10:eaaf8608)。该实例描述了抗人TNFR2抗体对卵巢癌腹水中Treg细胞的作用。
获得卵巢癌腹水，并将整个腹水与指定浓度的抗TNFR2抗体ABV2c一起培养48小时。使用流式细胞术确定治疗后CD4+T细胞区室中Treg细胞的相对丰度(图32A和32B)。如图32A所示，ABV2c降低了CD4区室中表达Treg谱系标志物Foxp3的细胞的百分比，表明ABV2c选择性地抑制Treg细胞但不抑制效应CD4 T细胞。
实例25.抗人TNFR2抗体对ADCC的体外影响
该实例描述了使用体外测定的抗人TNFR2抗体ABV2c对ADCC的影响。
如实例8和14所示，在同系小鼠肿瘤模型中，Fcγ-受体结合是小鼠替代抗TNFR2抗体的抗肿瘤活性所必需的。NK细胞是抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)的重要效应子。为了检测ABV2c是否介导人细胞的ADCC，从健康供体的外周血中分离出NK细胞(RosetteSep人NK细胞分选混合物，加拿大干细胞技术有限公司(StemCell))，并用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的JJN3(浆细胞骨髓瘤)靶细胞进行培养，在存在或不存在浓度为5μg/mL的ABV2c的情况下，以5:1的效应子(NK细胞)与靶细胞的比率表达高水平的TNFR2达四小时。随着靶细胞的死亡，细胞膜变得可渗透，胞内蛋白质泄漏出去，导致CFSE的每细胞荧光下降，可以通过流式细胞术对其进行定量。如图33A和33B所示，在存在NK细胞的情况下，与单独使用同种型对照抗体的靶细胞或使用同种型对照抗体的靶细胞加NK相比，ABV2c增加了死亡细胞的数量，表明ABV2c介导人类靶细胞的ADCC。
实例26.人抗TNFR2抗体对CD4+和CD8+T细胞共刺激活性、增殖和功能的作用
如下检测了人抗TNFR2抗体对T细胞功能各个方面的作用。
简言之，在96孔平底板(Corning)上涂上滴定量的功能级抗CD3(克隆OKT3，BioLegend)和人抗TNFR2抗体。在Ficoll-Paque Plus密度梯度(GE Healthcare)上，在50mLSepMate-50管(加拿大干细胞技术有限公司)中分离单核细胞。经由阴性选择(人CD8+T细胞分离试剂盒或初始型CD4+T细胞分离试剂盒II，美天旎)纯化总CD8 T细胞或初始型CD45RA+CD4 T细胞，并用5μM CellTrace Violet(赛默飞世尔科技)标记。每孔加入2-5*104个细胞(通常CD8 T细胞纯度>85％，CD4 T细胞纯度>90％)，以及RPMI 1640(Gibco)中的1μg/mL可溶性抗CD28(克隆CD28.2，BioLegend)，其中补充有10％FBS、5mM HEPES(Gibco)、青/链霉素(Gibco)、50μMβ-ME(G-Biosciences)、2mM左旋谷氨酰胺(Gibco)，并如指定的在37℃下孵育72小时或96小时。在最后的5小时内，将高尔基体抑制剂布雷菲德菌素A(BioLegend)加入CD8+T细胞培养物中。然后对细胞进行活化标记和细胞内细胞因子的染色，并通过流式细胞术进行分析。首先孵育细胞，并用来自BioLegend的以下抗体染色：CD4(OKT4)、CD8(SK1或HIT8a)、CD25(BC96)、PD-1(EH12.2H7)。单细胞悬液首先用Fc阻断剂(生物科学(BDBiosciences))和活/死Ghost Dye red710(安诺伦生物科技有限公司(TonboBiosciences))在PBS中在4℃下孵育10分钟。然后在FACS缓冲液(含1％FBS和0.02％叠氮化钠的PBS)中在4℃下对细胞进行胞外标记物染色30分钟。当对CD8+T细胞的胞内胞浆蛋白进行染色时，使用BioLegend的固定和胞内染色破膜缓冲液对细胞进行破膜。在LSR Fortessa流式细胞仪(BD Biosciences)上运行样品，并使用FlowJo分析软件(Tree Star)10.5.3版分析数据。用实验后Dunnett多重比较使用双向ANOVA对数据进行分析。数据绘图为平均值±S.E.M。指出了与同种型有统计学显著差异(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001)。
如图34A-34C所示，人抗TNFR2抗体ABV2c在体外扩增并诱导CD4+和CD8+T细胞上的活化标记。此外，与抗GITR抗体(TRX518)或抗4-1BB抗体(Urelumab)相比，ABV2c引起激活标记的更大扩增和诱导。
实例27.人抗TNFR2抗体在移植物抗宿主病模型中的作用
使用如下所述异种GvHD模型检测人抗TNFR2抗体的抗病能力。
简言之，向三至六周龄的雌性NSG-SGM3(NOD Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl Tg(CMV-IL-3、CSF2、KITLG)1Eav/MloySz)小鼠i.v.施用来自健康供体的107PBMC，并每天监测体重减轻和身体状况的变化。如果观察到初始体重减轻大于20％或身体状况明显恶化，则对动物实施安乐死。在第14、23和30天，用300μg抗TNFR2(ABV2c)、抗4-1BB(Utomilumab)或同种型对照抗体对小鼠进行i.p.治疗。使用时序检验比较对照组和治疗组。指出了与PBS的统计学显著差异(*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。如图35所示，ABV2c在异种GvHD模型中提高了存活率。保护作用大于激动抗4-1BB抗体(Utomilumab)。
实例28.人和小鼠抗TNFR2抗体的高分辨率表位作图
如下对Y9和ABV2c识别的TNFR2上的表位进行高分辨率作图。
对人和小鼠TNFR2的CRD1区的表面残基进行突变扫描。基于小鼠TNFR2的同源性模型，CRD1中的表面暴露位置突变为丙氨酸或天冬氨酸。对于人TNFR2，引入了更多破坏性氨基酸取代(Grantham，R.(1974).氨基酸的差异配方有助于解释蛋白质进化(Amino AcidDifference Formula to Help Explain Protein Evolution)科学(Science)，185(4154)，862–864)。将野生型人TNFR2 ECD(24-257)、野生型小鼠TNFR2 ECD(23-258)和所有相应的点突变体融合到C端FLAG表位标签，并使用酵母表面展示进行表达。对用抗小鼠TNFR2抗体Y9或抗人TNFR2抗体ABV2c染色的酵母(1e6细胞)进行流式细胞分析。使用抗FLAG抗体(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))标准化表面表达。将用于抗体结合/FLAG检测的MFI比例绘制为PRISM(GraphPad)中抗体浓度的函数。
确定了ABV2c和Y9结合的几个关键位置(分别见图36A和37A)。对于ABV2c，这些位置对应于没有前导序列的人TNFR2的Y24、Q26、Q29、M30和K47(SEQ ID NO:104)。对于Y9，这些位置对应于没有前导序列的小鼠TNFR2的Y25、R27、K28、M31和N47(SEQ ID NO:107)。使用人TNFR2/TNF复合物(PDB:3ALQ)和小鼠TNFR2/TNF复合物的同源性模型，两个抗体表位都相对于TNF结合进行可视化(图36B为ABV2c；图37D和37E为Y9)。值得注意的是，ABV2c和Y9都与人(Y24、Q26和M30)和小鼠(Y25、R27和M31)中的结构等效位置相互作用。ABV2c和Y9表位与人/小鼠TNF结合界面的接近性表明，这些抗体可能通过位阻与TNF竞争。另一种可能性是这些抗体还可通过诱导受体的构象变化防止TNF结合。
实例29.抗人TNFR2抗体在人源化小鼠的患者源性的异种模型中的抗肿瘤活性
为了检测在肿瘤模型中抗人TNFR2抗体的活性，3周龄的NSG-SGM3雌性小鼠(杰克逊实验室)用140cGy照射，然后在同一天i.v.注射来自混合供体(AllCells)的2*104人脐带血CD34+干细胞。静置12周以允许造血干细胞移植并用人免疫系统重建，通过用抗人CD45和抗小鼠CD45的流动抗体染色来筛选外周血中人免疫细胞的移植。当CD45+细胞总数的≥25％来源于人类时，小鼠被认为是人源化的。人源化小鼠经s.c.注射患者来源异种移植细胞系LG1306(杰克逊实验室)的5*106个细胞。当平均肿瘤大小为约75mm3时，将小鼠平均分为3个治疗组，并i.p.注射0.3mg人同种型IgG1(BioXCell)、单独的纳武单抗(抗PD-1IgG1)或纳武单抗加ABV2c(IgG1)的组合，每7天总共注射5次。每2-3天测量一次肿瘤体积。
如图38所示，在同种型对照和纳武单抗加ABV2c臂之间以及纳武单抗与纳武单抗加ABV2c臂之间，观察到了肿瘤体积的统计学显著差异(ANOVA，Tukey的真实显著差异法)。
实例30：抗人TNFR2抗体的亲和力成熟
ABV2 VH_hum#2(HD3)(SEQ ID NO:74)和ABV2 VL_hum#2(HD3)(SEQ ID NO:86)进行亲和力成熟。对大肠杆菌的重链和轻链可变区的氨基酸序列进行优化、合成并克隆到Fab噬菌粒中。市售的Fab噬菌粒的实例是pComb3、pC3C和pADL-23c。使用诱变引物将以下位置(使用Chothia编号)随机化：重链CDR1(26、27、28、29、30、31和32)，重链CDR2(位置50、51、52A、53、54、55、56、57和58)，重链CDR3(95、96、97、98、101和102)，轻链CDR1(24、25、26、27、28、29、30、30A、30B、30C、30D、31、32、33和34)，轻链CDR2(50、51、52、53、54、55和56)和轻链CDR3(89、90、91、92、93、94、95、96和97)。每个引物在重链或轻链可变区的单个CDR中的4个位置均含有简并密码子NNS或VNS。组合引物，并使用基于PCR的诱变创建第一代突变Fab库。在人TNFR2-His上进行两轮淘选后，合并了富集的噬菌体感染细菌克隆，并分离了DNA。进行第二轮PCR诱变，以创建第二代突变Fab库，然后再进行另外的两轮针对抗原的淘选。从板中选择从最终输出噬菌体感染的单个大肠杆菌克隆，并使其在96孔培养物中生长。通过ELISA筛选含有可溶性Fab蛋白的周质提取物的TNFR2-His结合。为了估计Fab的亲和力，同时进行竞争ELISA。将Fab提取物在有或没有可溶性竞争物TNFR2-His(5nM)的条件下孵育1小时，然后在涂有TNFR2的孔中孵育。在竞争者存在下ELISA信号降低的克隆被认为具有更高的亲和力(<5nM)，并被选择用于进一步分析。克隆重链和轻链可变区并在Expi293细胞中表达为人IgG1抗体。表10中提供了这些亲和力成熟抗体(ABV2.7、ABV2.13和ABV2.15)的全长序列、可变区序列和CDR序列。
ABV2.7VH(SEQ ID NO:126)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTFGMSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARRSNFAYWGQGTLVTVSS
ABV2.7VL(SEQ ID NO:127)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESLTASGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYR ASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSRHVNWTFGGGTKVEIK
ABV2.13VH(SEQ ID NO:148)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTFGMSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPHYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARRSNFAYWGQGTLVTVSS
ABV2.13VL(SEQ ID NO:149)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASQTVDSSGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYL GNRLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSNEDPWTFGGGTKVEIK
ABV2.15VH(SEQ ID NO:170)
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTTFGMSWVRQAPGQGLEWMGWINTYSGVPHYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARRSNFAYWGQGTLVTVSS
ABV2.15VL(SEQ ID NO:171)
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESLTASGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYR ASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSRHVNWTFGGGTKVEIK
实例31：亲和力成熟的抗人TNFR2抗体对人TNFR2的结合亲和力
通过生物层干涉技术(BLI)测量实例30中生成的亲和力成熟的抗人TNFR2抗体对人TNFR2的结合亲和力。简言之，在以下条件下，使用抗人Fc捕获(AHC)生物传感器(ForteBio)进行BLI动力学测定：(a)加载抗体(4μg/mL)60秒，(b)基线60秒，(d)与人TNFR2-His(4mg/ml)结合300秒，(e)解离300秒。如表9所示，亲和力成熟的抗体的结合亲和力大大高于亲本抗体(ABV2.1，其具有SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:86的重链和轻链可变区序列)的结合亲和力，ABV2.15对人TNFR2的亲和力最强(KD＝0.158nM)。
表9
抗体 K<sub>D</sub>(nM)
ABV2c 0.689
ABV2.1(ABV2 hum#2HD3) 4.42
ABV2.7 0.3
ABV2.13 1.59
ABV2.15 0.158
实例32：亲和力成熟的抗人TNFR2抗体共同刺激T细胞
使用实例30中生成的亲和力成熟的抗人TNFR2抗体检测了T细胞共刺激的各个方面。
PD1的增殖、扩增和上调
使用人类初始型CD4+T细胞分离试剂盒II(美天旎)经由阴性选择富集来自3名健康供体的人类初始型CD45RA+CD4 T细胞，然后用5mM CellTrace Violet标记。将96孔平底板(Costar)用5mg/mL的抗CD3(克隆OKT3，BioLegend)和滴定量的抗TNFR2在37℃下包被2小时。然后将板用完全RPMI洗涤，在室温下封闭长于10分钟，并加入4*104个细胞以及1mg/mL的可溶性抗CD28(BioLegend)。刺激细胞4天，然后通过流式细胞术分析。评估活的CD4+T细胞的急性激活标记PD-1的增殖、扩增和上调。
如图39A-39C所示，尽管在所测试的三种抗体中亲和力最低，但是与ABV2c相比，ABV2.13显示出相似的促进CD4+T细胞增殖、扩增和PD-1上调的能力。
细胞因子产生细胞
用上述的抗CD3/28、滴定量的板结合IgG1同种型、嵌合ABV2c以及人源化变体ABV2.13和ABV2.7刺激来自健康供体的初始型CD4 T细胞。在刺激的最后5小时内，将布雷菲德菌素A加入培养物，以通过流式细胞术评估产生IFN-γ和IL-2的CD4+细胞的百分比。
如图40A和40B所示，ABV2.13使产生细胞的IFN-γ和IL-2的数量增加到与ABV2c和ABV2.7相似的程度。
细胞因子的产生
在体外刺激上述分离的人类初始型CD4 T细胞后(图39A-39C)，收集上清液并使用Luminex平台(赛默飞世尔英杰：Th1/Th2细胞因子18-Plex Human ProcartaPlex Panel1C，18种分析物)测定细胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF、GM-CSF、IL-4、IL-5和IL-13)。
如图41A-41G所示，与ABV2c相比，在用ABV2.13治疗的CD4+T细胞中细胞因子的产生最高。除IL-2诱导外，ABV2.7尽管对所检测抗体具有最高亲和力，但刺激的细胞因子产量最少。
NF-kB活性的刺激
使用GloResponseTMNF-kB-RE-luc2p HEK293细胞(Promega)生成人TNFR2报告基因细胞系，该细胞稳定转染了使用Lipofectamine 3000(赛默飞世尔)的全长鼠TNFR2基因(Origene)或载体对照。将细胞维持在含有遗传霉素(0.2mg/mL)的DMEM/10％FBS中。在37℃下用滴定浓度的抗TNFR2 mAb包被96孔黑壁组织培养板2小时，然后洗涤并用完全培养基封闭。每孔加入50mL体积的4*104的表达TNFR2或对照的HEK293细胞，在37℃下培养5小时，然后每孔加入50mL ONE-Glo荧光素酶试剂。在SYNERGY H1酶标仪(BioTek)上测量发光。
如图42所示，所有抗体在刺激NF-kB活性-ABVc(EC50＝8.6μg/ml)、ABV2.7(EC50＝10.8μg/ml)、ABV2.13(EC50＝4.1μg/ml)和ABV2.15(EC50＝9.3μg/ml)方面均显示出相对相似的EC50(μg/ml)。然而，ABV2.15诱导了最高水平的NF-kB活性。
实例33：相对于对照物现有技术抗体，ABV2抗体对T细胞的共刺激更高
在低亲和力抗人TNFR2抗体(ABV2.1，也称为AVB2human_Dsn3)、亲和力成熟版本(ABV2.15)和对照物现有技术的抗人TNFR2抗体A-C之间比较了T细胞共刺激的各个方面。
如实例32中所述评估了CD4+T细胞的增殖、扩增、PD-1上调和NF-kB活性刺激。ABV2.1和ABV2.15刺激≥50％的CD4+T细胞分裂，相比之下，在检测的最高浓度，对照物A为30％、对照物B为24％、对照物C为32％、同种型对照抗体为15％(图43A)。与同种型对照(1.5倍)相比，通过双向ANOVA确定，20μg/ml的ABV2.1(4.5倍)和ABV2.15(4.8倍)诱导的细胞增殖的平均倍数变化是显著的(p<0.05)。相反，与同种型对照相比，对照物A(2.6倍)，对照物器B(2.0倍)和对照物C(3.3倍)的平均倍数变化不显著(图43B)。
与同种型对照(0.96倍)相比，通过双向ANOVA确定，20μg/ml的ABV2.1(1.8倍)和ABV2.15(2.0倍)诱导的CD4+T细胞扩增的平均倍数变化是显著的(p<0.05)。相反，与同种型对照相比，对照物A(1.2倍)、对照物B(1.2倍)和对照物C(1.5倍)的平均倍数变化不显著(图43C)。
与同种型对照(1.3倍)相比，通过双向ANOVA确定，20μg/ml的ABV2.1(3.4倍)和ABV2.15(3.6倍)诱导的CD4+T细胞上PD-1上调的平均倍数变化是显著的(p<0.01)。相反，与同种型对照相比，对照物A(2.2倍)、对照物B(1.8倍)和对照物C(2.6倍)的平均倍数变化不显著(图43D)。
ABV2.1和ABV2.15分别诱导1.6和5.3μg/ml的EC50的NF-kB活性，并且发现比对照物A(EC50＝9.7μg/ml)，对照物B(EC50＝16.6μg/ml)和对照物C(EC50＝44μg/ml)更活跃(图43E)。
总体而言，ABV2.1及其亲和力成熟版本ABV2.15优于对照物现有技术抗体A-C。
表10序列总结
Figure BDA0003069622250001101
Figure BDA0003069622250001111
Figure BDA0003069622250001121
Figure BDA0003069622250001131
Figure BDA0003069622250001141
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Figure BDA0003069622250001161
Figure BDA0003069622250001171
Figure BDA0003069622250001181
Figure BDA0003069622250001191
Figure BDA0003069622250001201
Figure BDA0003069622250001211
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Figure BDA0003069622250001231
Figure BDA0003069622250001241
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Figure BDA0003069622250001261
Figure BDA0003069622250001271
Figure BDA0003069622250001281
Figure BDA0003069622250001291
Figure BDA0003069622250001301
Figure BDA0003069622250001311
Figure BDA0003069622250001321
Figure BDA0003069622250001331
Figure BDA0003069622250001341
Figure BDA0003069622250001351
Figure BDA0003069622250001361
等同方案：
仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文公开的特定实施方案的许多等同方案。此类等同方案意在由所附权利要求书涵盖。

Claims (116)

1.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基23-54的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的55-77内的一个或多个氨基酸残基。
2.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基23-54的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的60-77、65-77、70-77、75-77、55-75、55-70、55-65或55-60内的一个或多个氨基酸残基。
3.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基23-54的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的70-77内的一个或多个氨基酸残基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体不结合人TNFR2(SEQID NO:1)的78-118、120-143或161-200内的一个或多个氨基酸残基。
5.一种分离的抗体，其结合TNFR2嵌合体3(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12)，并且不结合TNFR2嵌合体0(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6)。
6.根据权利要求5所述的分离的抗体，其中所述抗体以小于1*10-5M的KD(例如，小于1*10-6M、小于1*10-7M或小于1*10-8M的KD)结合TNFR2嵌合体3(SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12)。
7.一种分离的抗体，所述分离的抗体与野生型人TNFR2(SEQ ID NO:1)相比时表现出与突变型人TNFR2的结合降低，所述突变型人TNFR2包含一个或多个氨基酸残基上的取代，所述氨基酸残基选自由人TNFR2(SEQ ID NO:1)的残基48和68组成的群组。
8.根据权利要求7所述的分离的抗体，其中所述取代是非保守取代。
9.根据权利要求7或8所述的分离的抗体，其中通过酵母表面展示评估，所述抗体与所述突变型人TNFR2的结合降低了至少约50％。
10.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且不会显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合。
11.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-54内的一个或多个氨基酸残基。
12.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-44、23-36、23-30、23-25、25-44、30-44、35-44或40-44内的一个或多个氨基酸残基。
13.一种分离的抗体，所述分离的抗体与野生型人TNFR2(SEQ ID NO:1)相比时表现出与突变型人TNFR2的结合降低，所述突变型人TNFR2包含一个或多个氨基酸残基上的取代，所述氨基酸残基选自由人TNFR2(SEQ ID NO:1)的残基37、44、51、52、55、58、59、61、62、72、74、76、78和87组成的群组。
14.根据权利要求13所述的分离的抗体，其中所述取代是非保守取代。
15.根据权利要求13或14所述的分离的抗体，其中通过酵母表面展示评估，所述抗体与所述突变型人TNFR2的结合降低了至少约50％。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的97-118、120-143或161-200内的氨基酸残基。
17.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合TNFR2嵌合体7(SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20)，并且不结合TNFR2嵌合体4(SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14)(例如，不以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体4)。
18.根据权利要求17所述的分离的抗体，其中所述抗体以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体7(SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20)。
19.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77内的一个或多个氨基酸残基。
20.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合TNFR2嵌合体1(SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8)，并且不结合TNFR2嵌合体2(SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10)(例如，不以小于1*10-7M的KD结合TNFR2嵌合体2(SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10))。
21.一种分离的抗体，其结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基120-257的全部或部分，并且不会显著抑制TNF-α与人TNFR2的结合。
22.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中，相对于未修饰形式的相同抗体，对所述抗体进行修饰以增强其效应子功能。
23.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代相对于未修饰形式的相同抗体增强了效应子功能。
24.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2，其中，相对于未修饰形式的相同抗体，对所述抗体已经进行修饰以增强其效应子功能。
25.根据权利要求24所述的分离的抗体，所述分离的抗体包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代相对于未修饰形式的相同抗体增强了效应子功能。
26.根据权利要求24或25所述的分离的抗体，其中，相对于未修饰形式的相同抗体，所述抗体表现出提高的抗肿瘤活性。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基23-54的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的55-77内的一个或多个氨基酸残基。
28.根据权利要求24至26中任一项所述的分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基55-96的全部或部分并且抑制TNF-α与人TNFR2的结合至少约50％。
29.根据权利要求24至26中任一项所述的分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基78-118的全部或部分，并且不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的23-77或119-200内的一个或多个氨基酸残基。
30.根据权利要求20至22中任一项所述的分离的抗体，所述分离的抗体(1)结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基120-257的全部或部分，(2)不结合人TNFR2(SEQ ID NO:1)的78-118内的一个或多个氨基酸残基，并且(3)不抑制TNF-α与人TNFR2的结合。
31.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体激动TNFR2活性。
32.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体抑制肿瘤生长与其激动TNFR2信号传导的能力无关。
33.根据权利要求32所述的分离的抗体，其中所述抗体抑制肿瘤生长与其抑制TNF-α与TNFR2结合的能力无关。
34.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体结合人TNFR2上的不连续表位。
35.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2并且包含重链和轻链可变区的重链和轻链CDR，所述重链和轻链可变区分别包含以下阐述的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171，(b)SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72，(c)SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:86，(d)SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:149或(e)SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:127。
36.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2，所述人TNFR2包含：
(a)分别包含SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:153和SEQ ID NO:154的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156和SEQ ID NO:157的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(b)分别包含SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159和SEQ ID NO:160的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162和SEQ ID NO:163的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(c)分别包含SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165和SEQ ID NO:166的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168和SEQ ID NO:169的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(d)分别包含SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(e)分别包含SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(f)分别包含SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:64的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(g)分别包含SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69和SEQ ID NO:70的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；
(h)分别包含SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:131和SEQ ID NO:132的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134和SEQ ID NO:135的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；或
(i)分别包含SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:110的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，以及分别包含SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:112和SEQ ID NO:113的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。
37.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2，所述人TNFR2包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:126和SEQ ID NO:148组成的群组的氨基酸序列，或与选自由SEQ ID NO:170、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:148组成的群组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
38.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2，所述人TNFR2包含重链可变区和轻链可变区，其中所述轻链可变区包含选自由SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ IDNO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:149组成的群组的氨基酸序列，或与选自由SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85、SEQ IDNO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ IDNO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ IDNO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:149组成的群组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
39.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2，所述人TNFR2包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:84、SEQ IDNO:126和SEQ ID NO:148组成的群组的氨基酸序列，或与选自由SEQ ID NO:170、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:148组成的群组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，并且所述轻链可变区包含选自由SEQ IDNO:171、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:149组成的群组的氨基酸序列，或与选自由SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:72、SEQID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:127和SEQ ID NO:149组成的群组的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。
40.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2，并且包含重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与以下阐述的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同：(a)SEQ ID NO:170和SEQ ID NO:171，(b)SEQ ID NO:71和SEQID NO:72，(c)SEQ ID NO:74和SEQ ID NO:86，(d)SEQ ID NO:148和SEQ ID NO:149或(e)SEQ ID NO:126和SEQ ID NO:127。
41.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2，所述人TNFR2包含：
(a)包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列的轻链可变区；或
(c)包含SEQ ID NO:74的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的轻链可变区；
(d)包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的轻链可变区；或
(e)包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链可变区。
42.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2，并且包含重链和轻链可变区序列，所述重链和轻链可变区序列分别与以下阐述的氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同：(a)SEQ ID NO:150和SEQ ID NO:151，(b)SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129，(c)SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:107，(d)SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102。
43.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2，所述人TNFR2包含：
(a)包含SEQ ID NO:150的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:151的氨基酸序列的轻链可变区；
(b)包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的轻链可变区；
(c)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的重链可变区，以及包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的轻链可变区；或
(d)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的重链，以及包含SEQ ID NO:102的轻链。
44.根据权利要求35-43中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是激动性抗体。
45.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体选自由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或其变体组成的群组。
46.根据权利要求45所述的分离的抗体，其中所述抗体包含变体Fc区。
47.根据权利要求46所述的分离的抗体，其中相对于相应的非变体Fc区观察到的结合，所述变体Fc区增加了与Fcγ受体的结合。
48.根据权利要求47所述的分离的抗体，其中所述Fcγ受体是FcγRIIb受体。
49.根据权利要求46至48中任一项所述的分离的抗体，其中所述变体Fc区相对于相应的野生型Fc区增加抗体聚集。
50.根据权利要求46至49中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体相对于相应的野生型Fc区表现出增加的激动活性。
51.根据权利要求46至50中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体共刺激T细胞。
52.根据权利要求46至51中任一项所述的分离的抗体，其中所述变体Fc区是变体IgG1Fc区。
53.根据权利要求52所述的分离的抗体，其中所述变体IgG1 Fc区包含选自以下组成的群组的一个或多个取代：
(a)S267E，
(b)S267E/L328F，
(c)G237D/P238D/P271G/A330R，
(d)E233D/P238D/H268D/P271G/A330R，
(e)G237D/P238D/H268D/P271G/A330R，和
(f)E233D/G237D/P238D/H268D/P271G/A330R。
54.根据权利要求35至53中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体激活NF-κB信号传导。
55.根据权利要求35至54中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体促进T细胞增殖。
56.根据权利要求35至55中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体共刺激T细胞。
57.根据权利要求35至56中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体促进CD4+和CD8+细胞增殖。
58.根据权利要求35至57中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体降低调节性T细胞的丰度。
59.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体诱导长期抗癌作用。
60.根据前述权利要求中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体诱导抗癌记忆T细胞的发育。
61.根据权利要求1至60中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是单链抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fv或结构域抗体。
62.根据权利要求1至61中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
63.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2上以下位置的一个或多个：Y24、Q26、Q29、M30和K47，其中编号根据SEQ ID NO:104。
64.一种分离的抗体，所述分离的抗体结合人TNFR2上的表位，所述表位与权利要求1至63中任一项所述的抗体相同。
65.一种分离的抗体，所述分离的抗体与权利要求1至64中任一项所述的抗体竞争结合人TNFR2。
66.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含权利要求1至65中任一项所述的抗体的抗原结合区和第二不同的抗原结合区。
67.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含与试剂连接的权利要求1至65中任一项所述的抗体。
68.一种核酸，所述核酸编码权利要求1至65所述的抗体中的任一个的重链和/或轻链可变区。
69.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求68所述的核酸分子。
70.一种细胞，所述细胞用权利要求69所述的表达载体转化。
71.一种组合物，所述组合物包含权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，以及载体。
72.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，以及使用说明书。
73.一种制备抗TNFR2抗体的方法，所述方法包含在权利要求70所述的细胞中表达所述抗体并从所述细胞中分离所述抗体或其抗原结合部分。
74.一种增加受试者T细胞增殖的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，以实现T细胞增殖的增加。
75.一种共刺激效应T细胞的方法，所述方法包含向受试者施用有效量的权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，以实现效应T细胞的共刺激。
76.一种减少或消耗受试者中调节性T细胞数量的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，以实现调节性T细胞数量的减少或消耗。
77.一种治疗癌症的方法，所述方法包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物。
78.一种根据权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
79.根据权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其用于治疗癌症。
80.根据权利要求77至79中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其中所述癌症选自由以下组成的群组：非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌。
81.根据权利要求77至80中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，进一步包含施用一种或多种另外的治疗剂。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述一种或多种另外的治疗剂选自由以下组成的群组：免疫调节药物、细胞毒性药物、靶向治疗剂和癌症疫苗。
83.一种增强结合人TNFR2上表位的抗体的抗肿瘤活性的方法，所述方法包含修饰所述抗体以增加其效应子功能。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述修饰包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代相对于未修饰形式的相同抗体增强了效应子功能。
85.根据权利要求83或84所述的方法，其中增加的抗肿瘤活性与所述抗体结合的人TNFR2的表位无关。
86.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制肿瘤生长与其激动TNFR2信号传导的能力无关。
87.根据权利要求83至85中任一项所述的方法，其中所述抗体抑制肿瘤生长与其抑制TNF-α与TNFR2结合的能力无关。
88.一种治疗癌症的方法，所述方法包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的抗TNFR2抗体，其中所述抗体具有效应子功能并且不显著抑制TNF-α与TNFR2的结合。
89.一种抗TNFR2抗体在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，其中所述抗体具有效应子功能并且不显著抑制TNF-α与TNFR2的结合。
90.一种用于治疗患有癌症的受试者的抗TNFR2抗体，其中所述抗体具有效应子功能并且不显著抑制TNF-α与TNFR2的结合。
91.一种治疗癌症的方法，所述方法包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的抗TNFR2抗体，其中所述抗体具有效应子功能并且激动TNFR2受体信号传导。
92.一种抗TNFR2抗体在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，其中所述抗体具有效应子功能并且激动TNFR2受体信号传导。
93.一种用于治疗患有癌症的受试者的抗TNFR2抗体，其中所述抗体具有效应子功能并且激动TNFR2受体信号传导。
94.一种治疗癌症的方法，所述方法包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的抗TNFR2抗体，其中所述抗体具有效应子功能。
95.一种抗TNFR2抗体在制备用于治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，其中所述抗体具有效应子功能。
96.一种用于治疗患有癌症的受试者的抗TNFR2抗体，其中所述抗体具有效应子功能。
97.根据权利要求77至96中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其中所述癌症选自由以下组成的群组：非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌。
98.根据权利要求77至97中任一项所述的方法、用途或抗体，其中所述方法、用途或抗体进一步包含施用一种或多种另外的治疗剂。
99.根据权利要求77至98中任一项所述的方法、用途或抗体，其中所述抗TNFR2抗体诱导长期抗癌作用。
100.根据权利要求77至99中任一项所述的方法、用途或抗体，其中所述抗TNFR2抗体诱导抗癌记忆T细胞的发育。
101.一种治疗自身免疫性疾病的方法，所述方法包含向有此需要的受试者施用治疗有效量的权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物。
102.根据权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
103.根据权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其用于治疗自身免疫性疾病。
104.根据权利要求101至103中任一项所述的方法，用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其中所述自身免疫性疾病选自由以下组成的群组：移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、克罗恩病、多发性硬化症、结肠炎、牛皮癣、自身免疫性葡萄膜炎、天疱疮、大疱性表皮松解症和1型糖尿病。
105.根据权利要求101至104中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，进一步包含施用一种或多种另外的治疗剂。
106.一种在已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，以促进移植物存活或减少移植物排斥。
107.根据权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物在制备用于在已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥的药物中的用途。
108.根据权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其用于在已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者中促进移植物存活或减少移植物排斥。
109.根据权利要求106至108中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其中所述移植物是同种异体移植物。
110.根据权利要求106至109中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其中所述移植物排斥发生在细胞、组织或器官同种异体移植物的受体中。
111.根据权利要求106至110中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其进一步包含施用一种或多种另外的治疗剂。
112.一种治疗、预防或减少已接受或将接受细胞、组织或器官移植的受试者的移植物抗宿主病的方法，所述方法包含向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，以治疗、预防或减少移植物抗宿主病。
113.一种根据权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物在制备用于治疗、预防或减少移植物抗宿主病的药物中的用途。
114.根据权利要求1至67中任一项所述的抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其用于治疗、预防或减少移植物抗宿主病。
115.根据权利要求112至114中任一项所述的方法、用途或抗体、双特异性抗体或免疫缀合物，其进一步包含施用一种或多种另外的治疗剂。
116.一种检测样品中TNFR2存在的方法，所述方法包含在允许根据权利要求1至65中任一项所述的抗体和TNFR2之间形成复合物的条件下，使样品与所述抗体接触，并检测所述复合物。
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