CN104411718B - 用于制备包含特异性结合靶的至少一种结合实体的抗体Fc区缀合物的方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文报道了生产抗体Fc区缀合物的方法，所述方法使用用于将抗体Fc区酶促缀合至至少一个结合实体的转肽酶，所述抗体Fc区缀合物包含抗体Fc区作为第一组分和特异性结合靶的至少一个结合实体作为第二组分。

Description

用于制备包含特异性结合靶的至少一种结合实体的抗体Fc区 缀合物的方法及其用途
本文报道了通过使用转肽酶(例如分选酶A)酶促制备抗体Fc区缀合物的方法，所述转肽酶用于将至少一种特异性结合靶的结合实体共价连接至抗体Fc-区；以及这一方法用于生成新的例如单特异性或双特异性抗体的用途。
发明背景
单克隆抗体在当今的医学领域中具有巨大治疗潜能并且发挥重要作用。在最近十年期间，制药业中的一个明显趋势已经是开发单克隆抗体(mAb)和抗体Fc-融合多肽(可结晶片段-融合多肽)作为跨多样临床环境的治疗剂，包括肿瘤学、慢性炎性疾病、移植、传染病、心血管医学或眼科疾病(Carter,J.P.,Nature Reviews Immunology 6(2006)343-357；Chan,A.C.和Carter,J.P.,Nature Reviews Immunology 10(2010)301-316)。
治疗性抗体的临床效率主要依赖于两种官能性：i)由Fv域介导的靶特异性结合，和ii)免疫介导的效应子功能如由抗体Fc区介导的ADCC(抗体依赖的细胞介导细胞毒性)、CDC(补体依赖的细胞毒性)和ADCP(抗体依赖的细胞吞噬作用)。IgG类别的免疫球蛋白的Fc区包含铰链区和两个恒定结构域(CH2和CH3)。Fc区还与新生FcRn受体相互作用并且因而决定抗体在体内的半寿期。铰链区是抗体分子的臂形成Y样结构的区域，所述Y样结构使得分子中在此处的灵活性成为可能。一种或多种IgG亚类在二硫键数目和铰链区长度方面不同。
与抗体Fc区相关的效应子功能随抗体类别和亚类变动并且包括例如抗体通过其Fc区与细胞上特定Fc受体(FcR)结合，这触发多种生物学反应(参见例如Jiang,X.-R.等人,Nature Reviews Drug Discovery 10(2011)101-110；Presta,L.G.,Current Opinion inImmunology 20(2008)460-470)。
构成融合多肽或缀合物的抗体或Fc区的铰链区参与至少部分的抗体功能如抗原结合和Fc区介导的抗体效应子功能。尽管抗原结合(尤其二价亲合抗体结合)取决于特定/天然铰链区的灵活性、长度和空间取向，Fc区介导的效应子功能依赖于抗体的类别和亚类。与其他IgG抗体的二价相比，对一些人IgG4抗体观察到的功能性单价是显示Fc区参与抗原结合特性的另一个例子。
在WO2010/087994中，报道了用于连接的方法及其用途。在WO2010/099536中，报道了针对DOTA螯合物具有高亲和性的改造的蛋白质。
发明简述
已经发现在转肽酶，例如分选酶A，催化的酶促缀合反应中，副反应产物的形成可以被减少或者甚至被消除，如果使用特异性改造的分选酶基序与特异性改造的Fc区的组合。
特别地，
i)基于将产物缀合物中的LPX1TG(SEQ ID NO:01)氨基酸序列识别为底物的逆反应，和/或
ii)封端水解多肽片段(无/切割的LPX1TG识别序列的多肽，通过由水而非寡聚甘氨酸亲核体切割硫代酰基-转肽酶中间体而产生)的生成，
可以在酶促缀合反应中被减少甚至被消除如果使用
i)抗体Fc区，其至少在其N末端之一包含寡聚甘氨酸(Gm，m＝2，或3，或4，或5)，以及
ii)特异性结合靶的结合实体，例如单链抗原结合多肽(例如scFc，scFab和darpin)或多链抗原结合多肽(例如dsFv和Fab-抗体片段)，其在其C末端区域中包含GnSLPX1TG(SEQ ID NO:02,n＝1,2,或3，且其中X1可以是任何氨基酸残基)氨基酸序列。
此外，已经发现通过使用上述C-末端和N-末端氨基酸序列的组合，可以获得改善的反应产量。
本文报道的一个方面是使用用于将抗体Fc区酶促缀合至至少一个结合实体的转肽酶，从专有地重组产生的起始多肽产生抗体Fc区缀合物的方法，所述抗体Fc区缀合物包含含有抗体Fc区的第一重组组分和含有至少一个特异性结合靶的结合实体的第二重组组分。
在一个实施方案中，转肽酶是分选酶A。在一个实施方案中，分选酶A是金黄色葡萄球菌分选酶A。
在一个实施方案中，结合实体彼此独立地选自基于darpin结构域的结合实体、基于抗运载蛋白(anticalin)结构域的结合实体、基于T细胞受体片段样scTCR结构域的结合实体、基于骆驼VH结构域的结合实体、基于第十纤连蛋白3结构域的结合实体、基于生腱蛋白结构域的结合实体、基于钙黏着蛋白结构域的结合实体、基于ICAM结构域的结合实体、基于肌联蛋白结构域的结合实体、基于GCSF-R结构域的结合实体、基于细胞因子受体结构域的结合实体、基于糖苷酶抑制剂结构域的结合实体、基于超氧化物歧化酶结构域的结合实体，或抗体片段如Fab或scFv片段。
在一个实施方案中，靶结合支架选自darpin、血液结合素样分子和抗运载蛋白。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体选自抗体、抗体片段、受体、受体配体、和靶结合支架，条件是受体配体不是肠降血糖素受体配体多肽。
在一个实施方案中，抗体片段选自包含Fv,Fab,Fab',Fab’-SH,F(ab')2,双体抗体,线性抗体,scFv,scFab,和dsFv的组。
在一个实施方案中，受体选自T-细胞受体片段和scTCR。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含由至少一个二硫键连接的两条多肽链。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含两个二硫化物连接的全长重链抗体Fc区，或两个重链抗体Fc区片段，或与同族全长轻链配对的全长抗体重链，以及二硫化物连接的全长重链抗体Fc区，或与全长抗体重链Fc区多肽二硫化物连接的全长抗体重链。
在一个实施方案中，方法包括下列步骤：
—孵育i)特异性结合靶的结合实体，其在其20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TG(SEQ ID NO:02,n＝1,2,或3，且其中X1可以是任何氨基酸残基，以及ii)在至少一个N末端包含寡聚甘氨酸Gm(m＝1,2或3)的抗体Fc区，与酶分选酶A，并从而产生抗体Fc区缀合物。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:03,n＝1,2,或3，且其中X1可以是任何氨基酸残基)。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:04，其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此X2可以是除甘氨酸之外的任何氨基酸残基。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID NO:05，n＝1、2或3且其中X1可以是任何氨基酸残基，n＝1、2或3)，以此X3是氨基酸序列标签。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID NO:06，其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此X2可以是除甘氨酸之外的任何氨基酸残基并且其中X3是氨基酸序列标签。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体在其C末端包含氨基酸序列SEQ IDNO:2，或SEQ ID NO:3，或SEQ ID NO:4，或SEQ ID NO:05或SEQ ID NO:06作为C末端氨基酸残基。
在一个实施方案中，抗体Fc区至少在其N末端之一包含两个甘氨酸残基。
在一个实施方案中，抗体Fc区在其两个N末端都包含两个甘氨酸残基。
在一个实施方案中，抗体Fc区至少在其N末端之一包含氨基酸序列GGCPX4C(SEQID NO:07)，或氨基酸序列GGHTCPX4C(SEQ ID NO:08)，其中X4是S或P。
在一个实施方案中，抗体Fc区在其两个N末端彼此独立地都包含氨基酸序列GGCPX4C(SEQ ID NO:07)，或氨基酸序列GGHTCPX4C(SEQ ID NO:08)，其中X4彼此独立地是S或P。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体特异性结合第一表位或抗原且抗体Fc区包含特异性结合不同于第一表位或抗原的第二表位或抗原的第二结合实体。
本文报道的一个方面是通过本文报道的方法所获得的抗体Fc区缀合物。
本文报道的一个方面是抗体Fc区缀合物，其包含氨基酸序列GnSLPX1TGG(SEQ IDNO:09,n＝1,2或3，且其中X1可以是任何氨基酸残基)。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含氨基酸序列GnSLPX1TGGCPX4C(SEQ IDNO:10,n＝1,2或3),其中X1可以是任何氨基酸残基，且其中X4是S或P。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGCPX4C(SEQ IDNO:11)，其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4是S或P，且其中X2可以是除甘氨酸外的任何氨基酸残基。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含氨基酸序列GnSLPX1TGGHTCPX4C(SEQ IDNO:12,n＝1,2或3)，其中X1可以是任何氨基酸残基，且其中X4是S或P。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGHTCPX4C(SEQID NO:13),其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4是S或P，并且其中X2可以是除甘氨酸外的任何氨基酸残基。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含通过至少一个二硫键共价连接的第一和第二多肽链。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含是全长抗体重链的第一多肽链和是包含氨基酸序列GnSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO:10,n＝1,2或3)的抗体重链的第二多肽链，以此第一和第二多肽链通过至少一个二硫键共价连接，其中X1可以是任何氨基酸残基，且其中X4是S或P。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含是全长抗体重链的第一多肽链和是包含氨基酸序列GnSLPX1TGGHTCPX4C(SEQ ID NO:12,n＝1,2或3)的抗体重链的第二多肽链，以此第一和第二多肽链通过至少一个二硫键共价连接，其中X1可以是任何氨基酸残基，并且其中X4是S或P。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含两条多肽链，其中每条是包含氨基酸序列GnSLPX1TGGHTCPX4C(SEQ ID NO:12,n＝1,2或3)的抗体重链，以此两条多肽链通过至少一个二硫键共价连接，其中X1可以是任何氨基酸残基，且其中X4是S或P。
在全部方面的一个实施方案中，X1是E。
在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，抗体Fc区是人抗体Fc区或其变体。
在一个实施方案中，人抗体Fc区是人IgG1亚类的，或人IgG2亚类的，或人IgG3亚类的，或人IgG4亚类的。
在一个实施方案中，抗体Fc区是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的人抗体Fc区。
在一个实施方案中，人抗体Fc区包含至少在以下氨基酸位置228、233、234、235、236、237、297、318、320、322、329和/或331中一个处天然存在氨基酸残基向不同残基的突变，其中抗体Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。
在一个实施方案中，人抗体Fc区包含在第329位置处天然存在氨基酸残基的突变和至少一个氨基酸残基向不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸残基选自包含在第228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸残基的组，其中Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。与未修饰的(野生型)Fc区相比，这些特定氨基酸残基的变化导致Fc区的效应子功能改变。
在一个实施方案中，与包含相应野生型IgGFc区的缀合物相比，人抗体Fc区针对人FcγRIIIA、和/或FcγRIIA和/或FcγRI具有减低的亲和力。
在一个实施方案中，人抗体Fc区中第329位置处的氨基酸残基用甘氨酸、或精氨酸、或大到足以摧毁Fc区内部脯氨酸夹层的氨基酸残基置换。
在一个实施方案中，人抗体Fc区中天然存在氨基酸残基的突变是以下至少一种：S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G和/或P331S。
在一个实施方案中，如果抗体Fc区属于人IgG1亚类，则突变是L234A和L235A，或如果抗体Fc区属于人IgG4亚类，则突变是S228P和L235E。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含突变P329G。
在一个实施方案中，抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变T366W并且在第二重链Fc区多肽中包含突变T366S、L368A和Y407V，其中根据Kabat的EU索引编号。
在一个实施方案中，抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变S354C并且在第二重链Fc区多肽中包含突变Y349C。
附图描述：
图1：使用分选酶A生成二价抗体的示意图。
图2：偶联反应流程的SDS-page分析。
图3：具有不同的结合特异性的在VH-CH1重链Fab片段含有三种不同的C末端氨基酸序列(分别为LPETGGSGSHHHHHH(SEQ ID NO:14),GSLPETGGSGSHHHHHH(SEQ ID NO:15)和GGGSLPETGGSGSHHHHHH(SEQ ID NO:16))的两个Fab抗体片段与含有三种N末端不同的Fc链(分别为GGCPPC(SEQ ID NO:17),GGHTCPPC(SEQ ID NO:18),和GGGDKTHTCPPC(SEQ ID NO:19))的三种不同的单臂抗体Fc区(OA-Fc抗体)的分选酶A催化的缀合的转化的比较。
图4具有不同结合特异性的在VH-CH1重链Fab片段含有三种不同的C末端氨基酸序列的两个Fab抗体片段与含有三种N末端不同的Fc链的三种不同的单臂抗体Fc区(OA-Fc抗体)的分选酶A催化的缀合的转化的比较，其被减少为4个时间点，其中对所有组合的值平均以获得结合特异性非依赖性(即Fab非依赖性)值，其中差异仅仅是基于不同的组合。每个值包含4个测量。
本发明的具体实施方式
I.定义
在本说明书和权利要求中，免疫球蛋白重链Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引编号(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)，NIHPublication 91-3242，所述文献通过引用的方式明确并入本文)。
术语“改变”指例如至少包含Fc区的FcRn结合部分的抗体或融合多肽的亲本氨基酸序列中突变、添加或缺失一个或多个氨基酸残基以获得变体抗体或融合多肽。
术语“氨基酸突变”指在亲本氨基酸序列的氨基酸序列中的修饰。示例性修饰包括氨基酸置换、插入和/或缺失。在一个实施方案中，氨基酸突变是置换。术语“在某位置的氨基酸突变”指置换或缺失指定的残基或相邻于指定的残基插入至少一个氨基酸残基。术语“相邻于指定的残基插入”指在一个至两个残基内部插入该残基。插入可以相对于指定的残基是N末端或C末端。
术语“氨基酸序列标签”指通过具有特异性结合特性的肽键彼此连接的氨基酸残基的序列。在一个实施方案中，氨基酸序列标签是亲和标签或纯化标签。在一个实施方案中、氨基酸序列标签选自Arg标签、His标签、FLAG标签、3xFlag标签、链霉亲和素标签、纳米标签、SBP标签、c-myc标签、S标签、钙调蛋白结合肽、纤维素结合结构域、壳多糖结合结构域、GST标签或MBP标签。在一个实施方案中，氨基酸序列标签选自SEQ ID NO:20(RRRRR),或SEQ ID NO:21(RRRRRR),或SEQ ID NO:22(HHHHHH),或SEQ ID NO:23(KDHLIHNVHKEFHAHAHNK),或SEQ ID NO:24(DYKDDDDK),或SEQ ID NO:25(DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK),或SEQ ID NO:26(AWRHPQFGG),或SEQ ID NO:27(WSHPQFEK),或SEQ ID NO:28(MDVEAWLGAR),或SEQ ID NO:29(MDVEAWLGARVPLVET),或SEQ ID NO:30(MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP),或SEQ ID NO:31(EQKLISEEDL),或SEQ IDNO:32(KETAAAKFERQHMDS),或SEQ ID NO:33(KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL),或SEQ IDNO:34(纤维素结合结构域),或SEQ ID NO:35(纤维素结合结构域),或SEQ ID NO:36(TNPGVSAWQVNTAYTAGQLVTYNGKTYKCLQPHTSLAGWEP SNVPALWQLQ),或SEQ ID NO:37(GST-标签)或SEQ ID NO:38(MBP-标签)。
术语“氨基酸置换”指将预先确定的亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基替换为不同的“替换”氨基酸残基。该替换残基或多个残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)并且选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。在一个实施方案中，替换残基不是半胱氨酸。本文的氨基酸置换定义中还涵盖用一种或多种非天然存在的氨基酸残基置换。“非天然存在的氨基酸残基”指除上文所列的那些天然存在氨基酸残基之外，能够共价结合多肽链中相邻(一个或多个)氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的例子包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、aib和其他氨基酸残基类似物，如在Ellman等人,Meth.Enzym.202(1991)301-336中描述的那些。为了产生这类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等人(Science 244(1989)182)和/或Ellman等人(上文)的方法。简而言之，这些方法涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化激活阻抑tRNA，随后体外转录并翻译RNA。也可以通过化学地合成肽并随后使这些肽与重组产生的多肽如抗体或抗体片段融合，将非天然存在的氨基酸掺入肽中。
术语“氨基酸插入”指将至少一个额外的氨基酸残基掺入预先确定的亲本氨基酸序列中。尽管插入通常将由插入一个或两个氨基酸残基组成，但是本申请构思更大的“肽插入”，例如插入约3个至约5个或甚至至多约10个氨基酸残基。插入的(一个或多个)残基可以是如上文定义天然存在或非天然存在的。
术语“氨基酸缺失”指在氨基酸序列中的预定位置处移除至少一个氨基酸残基。
在本申请范围内无论何时提到氨基酸改变，它总是人为的氨基酸改变并且不是随机氨基酸修饰。
术语“抗体依赖的细胞介导细胞毒性”，简写为“ADCC”，指细胞介导的反应，所述反应中表达FcR的非抗原特异性细胞毒细胞(例如天然杀伤细胞(NK细胞)、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)通过与免疫球蛋白Fc区结合识别靶细胞并随后造成靶细胞溶解。用于介导ADCC的主要细胞即NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达汇总于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中。
术语“抗体依赖的细胞吞噬作用”，简写为短“ADCP”，指一种过程，其中通过与免疫球蛋白Fc区结合的吞噬性免疫细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或树突细胞)藉此完整或部分地内化抗体包覆的细胞。
术语“抗体片段”指包含完整抗体的一部分的非完整抗体的分子，其结合与完整抗体结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、单链抗体分子(例如scFv)、和从抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“与Fc受体结合”指例如在BIAcore(R)测定法(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,瑞典)中Fc区与Fc受体结合。
在BIAcore(R)测定法中，Fc受体与表面结合并且通过表面等离子体共振(SPR)测量对分析物(例如包含Fc区的融合多肽或抗体)的结合。结合的亲和力由术语ka(缔合常数：Fc区融合多肽或缀合物缔合以形成Fc区/Fc受体复合体的速率常数)、kd(解离常数；Fc区融合多肽或缀合物从Fc区/Fc受体复合体解离的速率常数)和KD(kd/ka)定义。备选地，可以就共振信号高度和解离行为方面，将SPR传感图的结合信号与参比物的响应信号直接比较。
术语“C1q”指包含免疫球蛋白Fc区的结合位点的多肽。C1q连同两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1一起形成复合物C1，补体依赖细胞毒性(CDC)途径的第一组分。人C1q可以例如从加利福尼亚州圣迭戈Quidel商购。
术语“CH2结构域”指抗体重链多肽的约从EU位置231延伸至EU位置340的部分(根据Kabat的EU编号体系)。在一个实施方案中，CH2结构域具有氨基酸序列APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO:39)。CH2结构域的独特性在于它不与另一个结构域紧密配对。相反，两个N连接的分枝的糖链间插在完整天然Fc区的两个CH2结构域之间。已经推测糖可以提供结构域-结构域配对作用的替代并且有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。
术语“CH3结构域”指抗体重链多肽的约从EU位置341延伸至EU位置446的部分。在一个实施方案中，CH3结构域具有氨基酸序列GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:40)。
术语抗体的“类别”指其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。人类中存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
术语“补体依赖的细胞毒性”，简写为“CDC”，指引起细胞死亡的机制，其中结合靶的Fc区融合多肽或缀合物的Fc区激活一系列酶促反应，以靶细胞膜中形成孔为终结。一般，抗原-抗体复合物如抗体包覆的靶细胞上的那些，结合并激活补体组分C1q，后者转而激活补体级联，导致靶细胞死亡。补体活化还可以导致补体组分沉积在靶细胞表面上，这通过结合白细胞上的补体受体(例如，CR3)促进ADCC或ADCP。
术语“效应子功能”指归因于抗体Fc区的那些生物活性，这些活性随抗体亚类变动。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬(ADCP)；下调细胞表面受体(例如，B细胞受体)；和B细胞活化。这种功能可以例如通过Fc区与具有吞噬活性或溶解活性的免疫细胞上的Fc受体结合或通过Fc区与补体系统的组分结合来实现。
术语“减少的效应子功能”指与对照分子(例如具有野生型Fc区的多肽)相比，减少与分子相关的特定效应子功能(例如ADCC或CDC)至少20％。术语“强烈减少的效应子功能”指与对照分子相比，减少与分子相关的特定效应子功能(例如ADCC或CDC)至少50％。
术语“Fc区”指免疫球蛋白的C末端区域。Fc区是包含两个二硫键连接的抗体重链片段(重链Fc区多肽链)的二聚体分子。Fc区可以通过木瓜蛋白酶消化或IdeS消化或胰蛋白酶消化完整(全长)抗体产生或可以重组产生。
从全长抗体或免疫球蛋白可获得的Fc区至少包含全长重链的残基226(Cys)至C末端，并且因此包含一部分铰链区和2个或3个恒定结构域，即CH2结构域、CH3结构域和IgE类和IgM类抗体上的另外/额外的CH4结构域。从US 5,648,260和US 5,624,821已知，修饰Fc区中限定的氨基酸残基产生表型效应。
构成两个相同或不相同抗体重链片段的二聚体Fc区的形成由所包含的CH3结构域的非共价二聚化介导(对于涉及的氨基酸残基，参见例如Dall'Acqua,Biochem.37(1998)9266-9273)。通过在铰链区中形成二硫键，共价地稳定Fc区(参见例如Huber等人,Nature264(1976)415-420；Thies等人,J.Mol.Biol.293(1999)67-79)。为了破坏CH3-CH3结构域相互作用的二聚化而在CH3结构域内部引入氨基酸残基变化并未不利地影响新生Fc受体(FcRn)结合，原因在于参与CH3-CH3结构域二聚化的残基的位置在CH3结构域的内界面上，而参与Fc区-FcRn相互作用的残基位于CH2-CH3结构域外部。
与Fc区的效应子功能相关的残基位于如对全长抗体分子所测定的铰链区、CH2结构域和/或CH3结构域中。Fc区相关/介导的功能是：
(i)抗体依赖的细胞毒性(ADCC)，
(ii)补体(C1q)结合、激活和补体依赖的细胞毒性(CDC)，
(iii)吞噬/清除抗原-抗体复合物，
(iv)在一些情况下释放细胞因子，和
(v)抗体和抗原-抗体复合物的半寿期/清除率。
通过Fc区与效应子功能特异性分子或受体相互作用，启动Fc区相关的效应子功能。大多数情况下，IgG1亚类抗体可以实现受体激活，而IgG2亚类和IgG4亚类抗体不具有效应子功能或具有有限的效应子功能。
激发效应子功能的受体是Fc受体类型(和亚型)FcγRI、FcγRII和FcγRIII。可以通过在下部铰链区中引入参与FcγR和C1q结合的特定氨基酸变化如L234A和/或L235A，减少与IgG1亚类相关的效应子功能。另外，某些氨基酸残基，尤其位于CH2结构域和/或CH3结构域中的残基，与抗体分子或Fc区融合多肽在血流中的循环半寿期相关。循环半寿期由Fc区与新生Fc受体(FcRn)的结合决定。
Fc区糖结构上存在的唾液酸残基参与Fc区的抗炎介导活性(参见例如Anthony,R.M.等人,Science 320(2008)373-376)。
抗体恒定区中氨基酸残基的编号根据Kabat的EU索引进行(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)，NIH Publication 913242)。
术语“人抗体Fc区”指人源免疫球蛋白重链的C末端区域，其至少含有一部分的铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人IgG抗体重链Fc区从约Glu216、或从约Cys226或从约Pro230延伸至重链的羧基端。然而，抗体Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。
术语“变体Fc区”指因至少一个“氨基酸改变/突变”而与“天然”或“野生型”Fc区氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一个实施方案中，与天然Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸突变，例如从约1个至约10个氨基酸突变，并且在一个实施方案中，在天然Fc区中的或在亲本多肽的Fc区中具有约1个至约5个氨基酸突变。在一个实施方案中，(变体)Fc区与野生型Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％同源性，并且在一个实施方案中，变体Fc区具有至少约90％同源性，在一个实施方案中，变体Fc区具有至少约95％同源性。
如本文中报道的变体Fc区由所含的氨基酸改变定义。因此，例如，术语P329G指相对于亲本(野生型)Fc区在氨基酸位置329处具有脯氨酸至甘氨酸突变的变体Fc区。野生型氨基酸的身份可以是未指定的，在这种情况下前述变体称作329G。对于在本发明中讨论的全部位置，根据EU索引进行编号。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引指EU抗体的编号(Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1969)78-85，因而通过引用的方式完整并入)。改变可以是添加、缺失或突变。术语“突变”指天然存在氨基酸的变化以及非天然存在氨基酸的变化，参见例如US 6,586,207、WO 98/48032、WO 03/073238、US 2004/0214988、WO2005/35727、WO 2005/74524，Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124(2002)9026-9027；Chin，J.W.和Schultz，P.G.，ChemBioChem 11(2002)1135-1137；Chin，J.W.等人，PICAS UnitedStates of America 99(2002)11020-11024；以及Wang，L.和Schultz，P.G.，Chem.(2002)1-10(全部文献均通过引用的方式完整并入本文)。
IgG1亚类的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：41).
带有突变L234A、L235A的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：42).
带有T366S、L368A和Y407V突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：43).
带有T366W突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：44).
带有L234A、L235A和T366S、L368A及Y407V突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：45).
带有L234A、L235A和T366W突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：46).
带有P329G突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：47).
带有L234A、L235A和P329G突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：48).
带有P239G和T366S、L368A和Y407V突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：49).
带有P329G和T366W突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：50).
带有L234A、L235A、P329G及T366S、L368A和Y407V突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：51).
带有L234A、L235A、P329G和T366W突变的IgG1亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：52).
IgG4亚类的野生型人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO：53).
带有S228P和L235E突变的IgG4亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO：54).
带有S228P、L235E和P329G突变的IgG4亚类的变体人Fc区的多肽链具有以下氨基酸序列：
CPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：55).
术语“Fc受体”，简写为“FcR”，指与Fc区结合的受体。在一个实施方案中，FcR是天然序列人FcR。另外，在一个实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(Fcγ受体)并且包括受体FcγRI、FcγRII、和FcγRIII亚类，包括其等位变体及备选地包括其剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，它们具有主要在其胞质结构域内不同的相似氨基酸序列。激活性受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如M.，Annu.Rev.Immunol.15(1997)203-234)。FcR综述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492，Capel等人，Immunomethods 4(1994)25-34，de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341中。本文中的术语“FcR”涵盖其他FcR，包括将来待鉴定的那些。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责母源IgG转移至胎儿(参见例如Guyer等人，J.Immunol.117(1976)587；Kim等人，J.Immunol.24(1994)249)。
术语“Fcγ受体”，简写为“FcγR”，指结合IgG抗体Fc区并且由FcγR基因编码的蛋白家族的任何成员。在人类中，这个家族包括但不局限于FcγRI(CD64)，包括同工型FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC；FcγRII(CD32)，包括同工型FcγRIIA(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIB(包括FcγRIIB-1和FcγRIIB-2)和FcγRIIC，以及FcγRIII(CD16)，包括同工型FcγRIIIA(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIB(包括同种异型FcγRIIB-NA1和FcγRIIB-NA2)(参见例如Jefferis等人，Immunol.Lett.82(2002)57-65，通过引用的方式完整并入)，以及任何未发现的人FcγRs或FcγR同工型或同种异型。FcγR可以来自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同工型或同种异型。参与Fc区-FcγR相互作用的氨基酸残基是234-239(下部铰链区)、265-269(B/C环)、297-299(D/E环)和327-332(F/G)环(Sondermann等人，Nature 406(2000)267-273)。导致FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB和/或FcγRIIIA的结合/亲和力降低的氨基酸突变包括N297A(同时伴随降低的免疫原性和延长的半寿期结合/亲和力)(Routledge等人,Transplantation 60(1995)847；Friend等人,Transplantation 68(1999)1632；Shields等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)、残基233-236(Ward和Ghetie,Ther.Immunol.2(1995)77；Armour等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613-2624)。US 7,355,008和US 7,381,408中描述了一些示例性氨基酸置换。
术语“新生Fc受体”，简写为“FcRn”，指结合IgG抗体Fc区并且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知，有功能的FcRn蛋白包含两种多肽，经常称作重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白并且重链由FcRn基因编码。除非本文中另外指出，否则FcRn或FcRn蛋白指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。Fc区与FcRn的相互作用的氨基酸残基在CH2结构域和CH3结构域的交界附近。Fc区-FcRn接触残基均在单条IgG重链内部。涉及的氨基酸残基是248、250-257、272、285、288、290-291、308-311和314(全部在CH2结构域中)和氨基酸残基385-387、428和433-436(全部在CH3结构域中)。导致对FcRn的结合/亲和力增加的氨基酸突变包括T256A、T307A、E380A和N434A(Shields等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
术语“全长抗体”指具有与天然抗体结构基本上相同的结构和氨基酸序列的抗体以及包含如本文中报道的Fc区的多肽。
术语“全长抗体重链”指以N末端至C末端方向包含抗体可变结构域、第一恒定结构域、抗体重链铰链区、第二恒定结构域和第三恒定结构域的多肽。
术语“全长抗体轻链”指以N末端至C末端方向包含抗体可变结构域和恒定结构域的多肽。
术语“铰链区”指抗体重链多肽的部分，所述部分在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域，例如根据Kabat的EU编号体系从约位置216至约位置230，或根据Kabat的EU编号体系从约位置226至约位置230。可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对，确定其他IgG亚类的铰链区。
铰链区正常情况下是由具有相同氨基酸序列的两条多肽组成的二聚体分子。铰链区通常包含约25个氨基酸残基并且是柔性的，允许抗原结合区独立地移动。铰链区可以再划分成三个结构域：上部、中部和下部铰链结构域(参见例如Roux等人，J.Immunol.161(1998)4083)。
在一个实施方案中，铰链区具有氨基酸序列DKTHTCPX4CP(SEQ ID NO:56),其中X4是S或P。在一个实施方案中，铰链区具有氨基酸序列HTCPX4CP(SEQ ID NO:57),其中X4是S或P。在一个实施方案中，铰链区具有氨基酸序列CPX4CP(SEQ ID NO:58),其中X4是S或P。
术语Fc区的“下部铰链区”指C末端紧邻于铰链区的一段氨基酸残基，即根据Kabat的EU编号Fc区残基233至239。
术语“野生型Fc区”指与自然界中存在的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc区包含天然人IgG1Fc区(非A同种异型和A同种异型)，天然人IgG2Fc区、天然人IgG3Fc区和天然人IgG4Fc区及其天然存在的变体。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为比对序列并根据需要引入空位以实现最大序列同源性百分数并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的部分之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分数。为了确定氨基酸序列同一性百分数的比对可以按本领域能力范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.授权，并且源代码已经随用户文档提交至华盛顿特区美国版权办公室，在那里它以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序从Genentech,Inc.,South San Francisco,加利福尼亚州可公开获得或可以从源代码汇编。应当将ALIGN-2程序汇编在UNIX操作系统(包括数字式UNIX V4.0D)上使用。全部序列比较参数由ALIGN-2程序设定并且不变动。
在使用ALIGN-2比较氨基酸序列的情况下，如下计算给定氨基酸序列A与、同或针对给定氨基酸序列B(这可以备选地描述为与、同或针对给定氨基酸序列B具有或包含某个氨基酸序列同一性％的给定氨基酸序列A)的氨基酸序列同一性％是：
100乘以分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对结果中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将可以理解在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A相对于B的氨基酸序列同一性％将不等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别声明，否则本文所用的全部氨基酸序列同一性值％如紧接前段中所述那样使用ALIGN-2计算机程序获得。
术语“位置”指氨基酸残基在多肽的氨基酸序列中的位置。可以将位置依次或根据建立的格式(例如用于抗体编号的Kabat的EU索引)编号。
术语“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性指与亲本多肽(例如包含野生型Fc区的多肽)相比，具有增强或削弱的FcR结合活性和/或ADCC活性的多肽。与FcR“具有增加的结合”的变体多肽以比亲本或野生型多肽更低的解离常数(即更好/更高的亲和力)结合至少一种FcR。与FcR“具有降低的结合”的变体多肽以比亲本或野生型多肽更高的解离常数(即更差/更低的亲和力)结合至少一种FcR。显示降低的FcR结合的这类变体可以拥有极少或不可评估的FcR结合，例如，与野生型或亲本IgG Fc区相比0–20％的FcR结合。
与亲本或野生型多肽相比以“减少的亲和力”结合FcR的多肽是当多肽变体和亲本多肽的量在结合测定法中(基本上)大致相同时，与亲本多肽相比，以(实质地)减少的结合亲和力结合上文鉴定的任一种或多种FcR的多肽。例如，与其中测定FcR结合亲和力的亲本多肽相比，FcR结合亲和力减少的多肽变体可以在FcR结合亲和力方面显示1.15倍至约100倍、例如1.2倍至约50倍减少。
在人效应细胞存在下比亲本多肽更低效地“介导抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)”的包含变体Fc区的多肽是这样的多肽，其中当测定法中所用的变体多肽和亲本多肽的量(基本上)大致相同时，所述多肽在体外或在体内在介导ADCC方面(实质地)更低效。通常，将使用如本文中公开的体外ADCC测定法鉴定这类变体，但是构思了用于确定ADCC活性的其他测定法或方法，例如在动物模型中确定等。在一个实施方案中，变体在介导ADCC方面(例如在本文中公开的体外测定法中)比亲本更低效约1.5倍至约100倍，例如约2倍至约50倍。
术语“受体”指能够结合至少一种配体的多肽。在一个实施方案中，受体是具有胞外配体结合结构域和任选地其他结构域(例如跨膜结构域、胞内结构域和/或膜锚定物)的细胞表面受体。本文所述的测定法中待评价的受体可以是完整受体或者其片段或衍生物(例如包含受体的结合结构域与一种或多种异源多肽融合的融合蛋白)。另外，待评价其结合特性的受体可以存在于细胞中或是分离的并任选地包被在测定法平板或某些其他固体相上。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的活性成分的生物活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的对象不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分之外的对对象无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
II.用于生产如本文报道的抗体Fc区缀合物的方法
本文报道了用于产生包含抗体Fc区和特异性结合靶的结合实体的抗体Fc区缀合物的方法，其包括下列步骤：
—孵育i)特异性结合靶的结合实体，其在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TG(SEQ ID NO:02,n＝1,2,或3，X1可以是任何氨基酸残基，以及ii)在至少一个N末端包含寡聚甘氨酸(Gm；m＝1,2或3)的抗体Fc区，与酶分选酶A，并从而产生抗体Fc区缀合物。
本发明是基于这样的发现，通过使用(i)特异性结合靶的结合实体，其在其C末端区内包含氨基酸序列GnSLPX1TG(SEQ ID NO:02,n＝1,2,或3，且其中X1可以是任何氨基酸残基)，以及ii)至少在其N末端之一包含寡聚甘氨酸(Gm；m＝1,2或3)的抗体Fc区，与(iii)酶分选酶A，可以在酶促缀合中以高产量获得包含抗体Fc区和特异性结合靶的结合实体的缀合物。
利用试剂的这一组合，在增加的反应时间中通常发生的
i)将产物缀合物中的LPX1TG(SEQ ID NO:01)氨基酸序列识别为底物的逆反应，和/或
ii)封端水解多肽片段(具有/没有切割的LPX1TG(SEQ ID NO:01)识别序列的多肽，通过由水而非Gm-抗体Fc区亲核体切割硫代酰基结合实体分选酶A中间体而产生)的生成，
可以被减少甚至被消除。
已经测试了C末端和N末端氨基酸序列组合的不同组合(参见例如图3)。
更详细地，作为示例性结合实体，使用抗体Fab片段，并且作为示例性抗体Fc区，使用单臂抗体Fc区(OA-Fc区＝一对全长抗体重链及其同族轻链和重链抗体Fc区多肽)。使用示例性转肽酶分选酶A分别在抗体Fab片段VH-CH1重链的C末端和在OA-Fc区N末端缀合三种不同序列。获得9种不同缀合物。在不同时间点确定偶联反应的进程/效率。为此目的，通过SDS-PAGE分析转肽反应的等分试样。在72h反应时间时从凝胶以密度测定方式估计连接的效率。下表1中给出结果。
表1.
三个氨基酸残基KSC是CH1结构域的最后三个C末端氨基酸残基。
可以看出，通过使用在Fab VH-CH1重链片段中的C末端氨基酸序列GSLPX1TG(SEQID NO:2n＝1并且其中X1可以是任何氨基酸残基)和GGGSLPX1TG(SEQ ID NO:2，n＝3并且其中X1可以是任何氨基酸残基)，与抗体Fc区的N末端氨基酸序列GGCPPC(SEQ ID NO:07其中X4是P,SEQ ID NO:17)的组合，可以获得最佳产量。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:03,n＝1,2,或3，且其中X1可以是任何氨基酸残基)。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGS(SEQ ID NO:04，其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此X2可以是除甘氨酸之外的任何氨基酸残基。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID NO:05，n＝1、2或3且其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此X3是氨基酸序列标签。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGSX3(SEQ ID NO:06，其中X1可以是任何氨基酸残基)，以此X2可以是除甘氨酸之外的任何氨基酸残基并且X3是氨基酸序列标签。
在一个实施方案中，抗体Fc区的N末端中的至少一个包含两个甘氨酸残基。
在一个实施方案中，抗体Fc区至少在其N末端之一包含氨基酸序列GGCPPC(SEQ IDNO:17)。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体是抗原结合单链多肽(scFv,scFab,darpin,来自人、骆驼或鲨鱼的单结构域抗体)或抗原结合多链多肽(Fab,dsFv或双体抗体)。在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体是Fab或scFv。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含通过至少一个二硫键共价连接的第一(抗体重链)和第二多肽(Gm-Fc区，m＝1,2,或3,或4或5)链。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含通过至少一个二硫键共价连接的是全长抗体重链的第一多肽链和是修饰的Gm-Fc区(m＝1,2,或3,或4,或5)重链片段的第二多肽链。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体特异性结合第一表位或抗原且当与相应的同族全长轻链配对时，全长抗体重链特异性结合不同于第一表位或抗原的第二表位或抗原。
本文报道的一个方面是通过本文报道的方法所获得的抗体Fc区缀合物。
本文报道的一个方面是抗体Fc区缀合物，其包含氨基酸序列GnSLPX1TGG(SEQ IDNO:09,n＝1,2或3，且其中X1可以是任何氨基酸残基)。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO:10,n＝1,2或3),其中X1可以是任何氨基酸残基且其中X4是P)。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GnSLPX1TGGHTCPX4C(SEQ ID NO:12,n＝1,2或3),其中X1可以是任何氨基酸残基且其中X4是P)。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO:11，其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4是P)，以此X2可以是除甘氨酸外的任何氨基酸残基。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGCPX4C(SEQ ID NO:13,其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4是P)，以此其中X2可以是除甘氨酸外的任何氨基酸残基。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含特异性结合靶的第二结合实体。
在一个实施方案中，特异性结合靶的结合实体是Fab或scFv。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含通过至少一个二硫键共价连接的第一和第二多肽链。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物包含是全长抗体重链的第一多肽链和包含氨基酸序列GnSLPX1TGGCPPC(SEQ ID NO:10,n＝1,2或3，其中X1可以是任何氨基酸残基，且其中X4是P)的第二抗体重链Fc区多肽，以此第一和第二多肽链通过至少一个二硫键共价连接。
在一个实施方案中，抗体Fc区包含与同族全长轻链配对的全长抗体重链并且特异性结合第一表位或抗原，并且与抗体Fc区缀合的结合实体结合与第一表位或抗原不同的第二表位或抗原。
在全部方面的一个实施方案中，X1是E。
在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，抗体Fc区是人来源的。
通过在抗体Fc区中限定的位置组合两种突变，可以实现Fc区相关的效应子功能的彻底减少。
对激发效应子功能的Fc区的选择依赖于抗体Fc区缀合物的预期用途。
如果想要的用途是功能性中和可溶性靶，则应当选择不激发效应子功能的亚类或变体。
如果想要的用途是移除靶，则应当选择激发效应子功能的亚类或变体。
如果想要的用途是拮抗细胞结合的靶，则应当选择不激发效应子功能的亚类或变体。
如果想要的用途是移除靶呈递细胞，则应当选择激发效应子功能的亚类或变体。
可以通过调节Fc区-FcRn相互作用影响抗体或抗体Fc区缀合物的循环半寿期。
可以通过所谓铰链区氨基酸变化/置换实现抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)和补体依赖的细胞毒性(CDC)的最小化或甚至消除。
可以通过所谓铰链区氨基酸变化/置换实现经典补体级联激活的最小化或甚至消除。
抗体或抗体Fc区缀合物的循环半寿期的增加可以通过增加的对新生Fc受体的结合实现，并且导致改进的功效、减少的剂量或施用频率，或改进的向靶递送。抗体或抗体Fc区缀合物的循环半寿期的减少可以通过减少的对新生Fc受体的结合实现，并且导致减少的全身暴露或改进的靶比非靶结合比例。
通常，如本文中报道的方法适用于产生包含野生型Fc区或改变的/变体Fc区的抗体Fc区缀合物。
在一个实施方案中，Fc区是人Fc区。
在一个实施方案中，Fc区是“观念性的”，并且尽管它不实际存在，但是抗体工程师可以决定待使用的变体Fc区。
在一个实施方案中，改变编码抗体Fc区缀合物的Fc区部分的核酸分以产生编码抗体Fc区缀合物的变体Fc区部分的变体核酸序列。
可以通过本领域已知的多种方法制备编码抗体Fc区缀合物的Fc区部分的氨基酸序列的核酸。这些方法包括，但不限于通过位点定向(或寡核苷酸介导)诱变、PCR诱变和较早制备的编码编码抗体Fc区缀合物多肽的DNA的盒诱变来制备。
Fc区与许多受体或配体相互作用，包括但不限于Fc受体(例如FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA)、补体蛋白C1q和其他分子如蛋白A和蛋白G。这些相互作用是多种效应子功能和下游信号传导事件必需的，包括但不限于抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖细胞毒性(CDC)。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)具有至少一个或更多个以下特性：减少或消除的效应子功能(ADCC和/或CDC和/或ADCP)、减少或消除的对Fc受体的结合、减少或消除的对C1q的结合，或减少或消除的毒性。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)包含具有至少两个氨基酸突变、添加或缺失的野生型Fc区。
在一个实施方案中，与包含野生型人Fc区的抗体或抗体Fc区缀合物相比，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)对人Fc受体(FcγR)和/或人补体受体具有减少的亲和力。
在一个实施方案中，与包含野生型人Fc区的抗体或抗体Fc区缀合物相比，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)包含对人Fc受体(FcγR)和/或人补体受体具有减少的亲和力的Fc区。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)对FcγRI、FcγRII和/或FcγRIIIA至少之一具有减少的亲和力。在一个实施方案中，对FcγRI和FcγRIIIA的亲和力减少。在一个实施方案中，对FcγRI、FcγRII和FcγRIIIA的亲和力减少。
在一个实施方案中，对FcγRI、FcγRIIIA和C1q的亲和力减少。
在一个实施方案中，对FcγRI、FcγRII、FcγRIIIA和C1q的亲和力减少。
在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的抗体或抗体Fc缀合物相比，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)具有减少的ADCC。在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的Fc区融合多肽或缀合物诱导的ADCC相比，ADCC减少至少20％。
在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的抗体Fc区缀合物相比，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)具有降低或消除的Fc区诱导的ADCC和CDC。
在一个实施方案中，与包含野生型Fc区的OA-Fc区缀合物相比，抗体Fc区缀合物(如采用如本文中报道的方法产生的)具有降低的ADCC、CDC和ADCP。
在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物在Fc区中包含至少一个氨基酸置换，所述氨基酸置换选自包含S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G、和P331S的组。
在一个实施方案中，野生型Fc区是人IgG1Fc区或人IgG4Fc区。
在一个实施方案中，除第329位置处的氨基酸残基脯氨酸突变之外，抗体Fc区在Fc区中包含与增加的抗体Fc区缀合物稳定性相关的至少一个其他氨基酸残基添加、突变或缺失。
在一个实施方案中，如果Fc区属于IgG4亚类，则Fc区中的其他氨基酸残基添加、突变或缺失在Fc区的第228和/或235位置处。在一个实施方案中，第228位置处的氨基酸残基丝氨酸和/或第235位置处的氨基酸残基亮氨酸由另一种氨基酸置换。在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物在第228位置处包含脯氨酸残基(丝氨酸残基至脯氨酸残基的突变)。在一个实施方案中，抗体Fc区缀合物在第235位置处包含谷氨酸残基(亮氨酸残基至谷氨酸残基的突变)。
在一个实施方案中，Fc区包含三个氨基酸突变。在一个实施方案中，这三个氨基酸突变是P329G、S228P和L235E突变(P329G/SPLE)。
在一个实施方案中，如果Fc区属于IgG1亚类，则Fc区中的其他氨基酸残基添加、突变或缺失在Fc区的第234和/或235位置处。在一个实施方案中，第234位置处的氨基酸残基亮氨酸和/或第235位置处的氨基酸残基亮氨酸突变成另一种氨基酸。
在一个实施方案中，Fc区在第234位置处包含氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残基突变成丙氨酸氨基酸残基。
在一个实施方案中，Fc区在第235位置处包含氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残基突变成丙氨酸氨基酸残基。
在一个实施方案中，Fc区包含在第329位置处的氨基酸突变，其中脯氨酸氨基酸残基突变成甘氨酸氨基酸残基、在第234位置处的氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残基突变成丙氨酸氨基酸残基，和在第235位置处的氨基酸突变，其中亮氨酸氨基酸残基突变成丙氨酸氨基酸残基。
具有对FcRn增加的亲和力的Fc区变体具有较长血清半寿期，并且这类分子将在治疗哺乳动物的方法中具有可用应用，其中需要所施用的抗体Fc区缀合物的长久全身性半寿期，例如，以治疗慢性疾病或病症。
具有降低的FcRn结合亲和力的抗体Fc区缀合物具有较短血清半寿期，并且这类分子将在治疗哺乳动物的方法中具有可用应用，其中期望所施用的抗体Fc区缀合物的较短全身性半寿期，例如，以避免毒性副作用或用于体内诊断性成像应用。具有降低的FcRn结合亲和力的Fc区融合多肽或缀合物较不可能穿过胎盘，并且因此可以用于治疗怀孕女性中的疾病或病症。
在一个实施方案中，具有对FcRn改变的结合亲和力的Fc区是在以下一个多个氨基酸位置具有氨基酸改变的Fc区：238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439和/或447。
在一个实施方案中，该Fc区是在氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439和/或447具有一个或多个氨基酸改变的Fc区。
在一个实施方案中，显示增加的对FcRn的结合的Fc区在氨基酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424和/或434包含一个或多个氨基酸改变。
在一个实施方案中，Fc区是IgG1亚类的Fc区并且包含氨基酸突变P329G和/或L234A和L235A。
在一个实施方案中，Fc区是IgG4亚类的Fc区并且包含氨基酸突变P329G和/或S228P和L235E。
在一个实施方案中抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变T366W并在第二重链Fc区多肽中包含突变T366S、L368A和Y407V，其中根据Kabat的EU索引编号。
在一个实施方案中抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变S354C并在第二重链Fc区多肽中包含突变Y349C。
使用分选酶A的酶促缀合过程
可通过例如抗体Fc区和单链抗原结合多肽(例如scFv、scFab或darpin)或多链抗原结合复合物(例如dsFv或Fab)的分选酶A介导的体外连接，获得包含一个或多个，例如一个，或两个，或三个，或四个，结合实体的抗体Fc区缀合物。
许多革兰氏阳性细菌使用分选酶以将多种表面蛋白(包括毒力因子)共价地锚定至它们的细胞壁(肽聚糖)上。分选酶是胞外膜结合酶。野生型金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分选酶A(SrtA)是具有N末端跨膜区的206个氨基酸的多肽。在第一步骤中，分选酶A识别含有LPX1TG氨基酸序列基序的底物蛋白并且借助活性位点Cys切割Thr和Gly之间的酰胺键。这种肽切割反应产生分选酶A硫酯中间体。在第二步骤中，通过亲核性攻击含有寡甘氨酸的第二底物多肽(对应于金黄色葡萄球菌中肽聚糖的五甘氨酸单元)的氨基，消除硫酯酰基-酶中间体，导致共价连接的细胞壁蛋白和分选酶A再生。在不存在寡甘氨酸亲核体的情况下，酰基-酶中间体由水分子水解。
分选酶介导的连接/缀合已经开始用于多种蛋白质工程和生物缀合目的。这种新技术能够将天然和非天然官能团引入加LPX1TG标签的重组或化学合成的多肽。例子包括共价接合寡甘氨酸衍生化聚合物(例如PEG)、荧光团、维生素(例如生物素和叶酸)脂质、糖、核酸、合成肽和蛋白质(例如GFP)(Tsukiji,S.和Nagamune,T.,ChemBioChem 10(2009)787-798；Popp,M.W.-L.和Ploegh,H.L.,Angew.Chem.Int.Ed.50(2011)5024-5032)。
已经显示氨基组分的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足够用于SrtA介导的连接步骤(Clancy,K.W.等人,Peptide Science 94(2010)385-396)。
为了酶促缀合，可以使用缺少跨膜区的可溶性截短分选酶A(SrtA；金黄色葡萄球菌SrtA的氨基酸残基60-206)(Ton-That,H.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96(1999)12424-12429；Ilangovan,H.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)6056-6061)。可以在大肠杆菌中产生截短的可溶性分选酶A变体。
至少在其N末端之一包含寡甘氨酸(Gm，m＝2、或3、或4、或5)的抗体Fc区可以从真核细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞)表达并且从其上清液纯化。
在一条多肽链的C末端包含SrtA识别基序的结合实体(例如单链抗原结合多肽如scFv、scFab或darpin，或多链抗原结合多肽如dsFv或Fab)可以从真核细胞(例如HEK293细胞、CHO细胞)表达并且从其上清液纯化。
如本文报道的一个方面是通过使用分选酶A将结合实体缀合至抗体Fc区(Gm-Fc-区)获得的抗体Fc区缀合物，其中分选酶识别序列位于结合实体的C末端，并且其中寡聚甘氨酸(Gm；m＝1、2、或3，或4，或5)位于抗体Fc区链的至少一条链的N末端。
如本文报道的一个方面是药物制剂，其包含如本文报道的抗体Fc区缀合物以及任选地可药用载体。
如本文报道的一个方面是如本文报道的抗体Fc区缀合物，其用作为药物。
如本文报道的一个方面是如本文报道的抗体Fc区缀合物在制备药物中的用途。
III.重组方法
可以使用重组方法和组合物产生抗体Fc区缀合物、特别是单臂抗体变体(OA-Fc区-Gm，m＝1、或2或3)和单链抗原结合多肽(例如scFv、scFab或darpin)或多链抗原结合复合体(例如dsFv或Fab)的连接组分，参见例如US 4,816,567。
在一个方面，提供制备抗体Fc区缀合物的方法，其中该方法包括(i)在适于表达/分泌抗体Fc区的条件下培养包含编码缀合物的抗体Fc区部分的核酸的第一宿主细胞并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收抗体Fc区部分和(ii)在适于表达/分泌结合实体的条件下培养包含编码缀合物的结合实体部分的核酸的第二宿主细胞并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收结合实体部分，和(iii)使用分选酶A介导的转肽，酶促缀合重组产生的部分。
为了重组产生抗体Fc区缀合物的抗体Fc区部分和结合实体部分，将例如如上文所述的编码缀合物的抗体Fc区部分和结合实体部分的核酸分离并插入一种或多种载体中以在宿主细胞中进一步克隆和/或表达/分泌。可以使用常规流程轻易地分离和/或产生这种核酸。
用于克隆或表达/分泌编码多肽的载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生多肽，尤其当不需要糖基化和Fc效应子功能时(参见，例如，US 5,648,237、US 5,789,199和US 5,840,523，Charlton,Methods in MolecularBiology 248(2003)245-254(B.K.C.Lo(编著),Humana Press,Totowa,NJ)，其描述在大肠杆菌中表达抗体片段)。在表达后，多肽可以从细菌细胞糊在可溶性部分中分离或可以从可以溶解的所谓包涵体的不溶性部分分离并再折叠成生物活性形式。此后，可以进一步纯化多肽。
除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母是编码多肽的载体的合适克隆宿主或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的多肽的真菌和酵母菌株(参见例如Gerngross,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414和Li等人,Nat.Biotech.24(2006)210-215)。
用于表达糖基化多肽的合适宿主细胞还源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞一起使用、尤其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒毒株。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主(例如，见US 5,959,177、US 6,040,498、US6,420,548,US 7,125,978和US 6,417,429(描述在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术))。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如，适应于悬浮培育的哺乳动物细胞系可以是有用的。可用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是COS-7细胞系(由SV40转化的猴肾CV1细胞)；HEK293细胞系(人胚肾)；BHK细胞系(幼仓鼠肾)；TM4小鼠支持细胞系(在例如Mather,Biol.Reprod.23(1980)243-251中所述的TM4细胞)；CV1细胞系(猴肾细胞)；VERO-76细胞系(非洲绿猴肾细胞)；HELA细胞系(人宫颈癌细胞)；MDCK细胞系(犬肾细胞)；BRL-3A细胞系(布法罗大鼠肝细胞)；W138细胞系(人肺细胞)；HepG2细胞系(人肝细胞)；MMT060562细胞系(小鼠乳腺瘤细胞)；如在例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所述的TRI细胞系；MRC5细胞系；和FS4细胞系。其他可用的哺乳动物宿主细胞系包括CHO细胞系(中国仓鼠卵巢细胞)，包括DHFR阴性CHO细胞系(Urlaub,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216)；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0细胞系。关于适于产生多肽的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu,Methods inMolecular Biology,Antibody Engineering 248(2004)255-268(B.K.C.Lo,(编著),Humana Press,Totowa,NJ)。
对序列表的描述
SEQ ID NO:01至06 分选酶基序
SEQ ID NO:07至08 Fc区亲核体
SEQ ID NO:09至13 抗体Fc区缀合物中的分选酶基序剩余部分
SEQ ID NO:14至16 示例性结合实体C-端氨基酸序列
SEQ ID NO:17至19 示例性抗体Fc区N末端氨基酸序列
SEQ ID NO:20至38 氨基酸序列标签
SEQ ID NO:39 人CH2域
SEQ ID NO:40 人CH3域
SEQ ID NO:41至55 示例性野生型和变体抗体重链Fc区多肽
SEQ ID NO:56至58 示例性抗体铰链区氨基酸序列
SEQ ID NO:59至74 实施例中使用的序列。
实施例
以下实施例是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般表述，可以实施多种其他实施方案。
虽然已经出于清晰理解目的，以说明和举例方式某种程度地详细描述前述发明，但是这些说明和例子不应当解释为限制本发明的范围。
材料和方法
重组DNA技术
如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989)中所述的标准方法用来操作DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
基因合成
通过化学合成在Geneart GmbH(雷根斯堡，德国)制备想要的基因区段。将合成的基因片段克隆至用于增殖/扩增的大肠杆菌质粒中。通过DNA测序验证亚克隆基因片段的DNA序列。
蛋白质测定
通过使用基于多肽的氨基酸序列计算的摩尔消光系数在280nm测定光密度(OD)，确定纯化的多肽的蛋白质浓度。
实施例1
表达质粒的产生
基本/标准哺乳动物表达质粒的描述
通过瞬时转染人胚肾细胞(HEK293)表达想要的蛋白质。为了表达想要的基因/蛋白质(例如全长抗体重链、全长抗体轻链或在其N末端含有寡甘氨酸的Fc-链)，使用包含以下功能性元件的转录单位：
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子(P-CMV)，包含内含子A，
-人重链免疫球蛋白5'非翻译区域(5’UTR)，
-鼠免疫球蛋白重链信号序列(SS)，
-待表达的基因/蛋白质(例如全长抗体重链)，和
-牛生长激素多聚腺苷化序列(BGH pA)。
除了包含待表达的想要的基因的表达单元/盒之外，基本/标准哺乳动物表达质粒含有
-来自载体pUC18的复制起点，其允许这个质粒在大肠杆菌中复制，和
-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。
构建了编码以下多肽/蛋白质的表达质粒：
-与含有T366W突变的IgG1亚类的人重链恒定区组合的帕妥珠单抗重链可变结构域：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：59).
-与人κ轻链恒定区组合的帕妥珠单抗轻链可变结构域：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：60).
-与含有T366S、L368A和Y407V突变的IgG1亚类的人重链恒定区组合的曲妥珠单抗重链可变结构域：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：61).
-与人κ轻链恒定区组合的曲妥珠单抗轻链可变结构域：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：62).
-包含帕妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端GGGSLPETGGSGSHHHHHH氨基酸序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGSLPETGGSGSHHHHHH(SEQ ID NO：63).
-包含帕妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端GSLPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSLPETGGSGSHHHHHH(SEQ ID NO：64).
-包含帕妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端LPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCLPETGGSGSHHHHHH(SEQ ID NO：65).
-包含曲妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端GGGSLPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGGGSLPETGGSGSHHHHHH(SEQ I D NO：66).
-包含曲妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端GSLPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCGSLPETGGSGSHHHHHH(SEQ ID NO：67).
-包含曲妥珠单抗重链可变结构域和含有C末端LPETGGSGSHHHHHH序列的IgG1亚类的人重链恒定区1(CH1)的抗体Fab片段：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCLPETGGSGSHHHHHH(SEQ ID NO：68).
-具有T366S、L368A和Y407V突变的含有N末端GGGDKTHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：69).
-具有T366S、L368A和Y407V突变的含有N末端GGHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
GGHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQID NO：70).
-具有T366S、L368A和Y407V突变的含有N末端GGCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
GGCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：71).
-具有T366W突变的含有N末端GGGDKTHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：72).
-具有T366W突变的含有N末端GGHTCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
GGHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：73).
-具有T366W突变的含有N末端GGCPPC序列的重链Fc区多肽(人IgG1(CH2-CH3))：
GGCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：74).
实施例2
瞬时表达、纯化和分析性表征
通过瞬时转染在F17培养基(Invitrogen Corp.))中培养的(人胚肾细胞系293衍生的)HEK293细胞产生抗体链。为了转染，使用“293-Fectin”转染试剂(Invitrogen)。从三种不同质粒表达抗体链，所述质粒编码全长重链(帕妥珠单抗结或曲妥珠单抗孔)、相应全长轻链和作为结变体或作为孔变体的含有N末端寡甘氨酸序列之一的重链Fc区多肽。转染时，三种质粒以等摩尔质粒比例使用。如制造商的说明书中所述进行转染。转染后7日收获含有抗体Fc区的细胞培养上清液。将上清液冷冻贮藏直至纯化。
将含有抗体Fc区的培养上清液过滤并通过两个层析步骤纯化。使用以PBS(1mMKH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl)pH7.4平衡的HiTrap MabSelectSuRe(GEHealthcare)，通过亲和层析捕获抗体Fc区。通过用平衡缓冲液洗涤移除未结合的蛋白质，并且用pH3.0的0.1M柠檬酸缓冲液回收抗体Fc区。在洗脱后溶液立即用1M Tris-碱，pH9.0中和至pH 6.0。使用Superdex 200TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。大小排阻层析在40mM Tris-HCl缓冲剂，0.15M NaCl，pH7.5中进行。将洗脱的抗体Fc区用配备Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心滤器单元浓缩并贮存在-80℃。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定抗体Fc区的蛋白质浓度。在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE和考马斯亮兰染色，分析纯度和正确的抗体Fc区形成。
实施例3
含有C末端LPX1TG基序的抗体Fab片段的瞬时表达、纯化和分析性表征
通过瞬时转染在F17培养基(Invitrogen Corp.))中培养的(人胚肾细胞系293衍生的)HEK293细胞产生抗体Fab片段。为了转染，使用“293-Fectin”转染试剂(Invitrogen)。从两种不同质粒表达抗体Fab片段，所述质粒编码全长轻链(帕妥珠单抗或曲妥珠单抗)和含有C末端LPX1TG序列之一的相应截短的重链。转染时，两种质粒以等摩尔质粒比例使用。如制造商的说明书中所述进行转染。转染后7日收获含有Fab片段的细胞培养上清液。将上清液冷冻贮藏直至纯化。
将含有Fab片段的培养上清液过滤并通过两个层析步骤纯化。使用以PBS和20mM咪唑(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、20mM咪唑)pH7.4平衡的HisTrap HPNi-NTA柱(GE Healthcare)，通过亲和层析捕获Fab片段。通过用平衡缓冲液洗涤移除未结合的蛋白质。将加组氨酸标签的蛋白质用PBS(1mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、400mM咪唑)中的20mM至400mM线性咪唑梯度以10个柱体积洗脱。使用Superdex200TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。大小排阻层析在40mM Tris-HCl缓冲剂，0.15M NaCl，pH7.5中进行。将Fab片段用配备Biomax-SK膜(Millipore，Billerica，MA)的Ultrafree-CL离心滤器单元浓缩并贮存在-80℃。
通过使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，在280nm测量光密度(OD)确定Fab片段的蛋白质浓度。在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)存在和不存在下通过SDS-PAGE和考马斯亮兰染色，分析纯度和正确的Fab形成。
实施例4
分选酶A介导的抗体Fc区和结合实体(Fab片段)的连接
对于分选酶介导的转肽反应，使用N末端截短的金黄色葡萄球菌分选酶A(Δ1-59)。反应在含有50mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH7.5的缓冲液(分选酶-缓冲液)中进行。在反应中，连接在VH-CH1重链C末端(…KSC)和分选酶基序N末端之间不包含或包含2个不同连接用短氨基酸序列的VH-CH1-重链的C末端处携带分选酶基序(LPETG)(LPETGGSGSHHHHHH，SEQID NO:14、GSLPETGGSGSHHHHHH，SEQ ID NO:15和GGGSLPETGGSGSHHHHHH，SEQ ID NO:16))的Fab片段和在其重链Fc区多肽的N末端携带寡甘氨酸基序和三个不同铰链序列(分别是GGCPPC，SEQ ID NO:17，GGHTCPPC，SEQ ID NO:18和GGGDKTHTCPPC，SEQ ID NO:19)的单臂抗体，产生抗体Fc区缀合物。为了进行反应，将全部试剂均溶解于分选酶缓冲液中。在第一步骤中，混合抗体Fc区和抗体Fab片段，并且通过接着添加分选酶A和5mM CaCl2启动反应。将组分通过抽吸混合并在37℃孵育72小时。随后，通过冷冻反应混合物终止反应并且储存在-20℃直至分析。
摩尔比Fab:单臂抗体:分选酶＝20:4:1
结果
通过分选酶A分别缀合在Fab的C末端和在抗体的N末端的三种不同序列以获得抗体Fc区缀合物的9种不同组合。在不同时间点评价偶联反应的效率。为此目的，通过SDS-PAGE分析转肽反应的等分试样。从SDSPAGE凝胶以密度测定方式估计连接的效率。在表2中对各个序列描述反应72小时后的结果。
表2：Fab片段与单臂抗体的缀合

Claims (47)

1.使用用于将抗体Fc区酶促缀合至至少一个结合实体的分选酶A生产抗体Fc区缀合物的方法，所述抗体Fc区缀合物包含作为第一组分的重组抗体Fc区和作为第二组分的至少一个特异性结合靶的结合实体，方法包括下列步骤：
—孵育i)特异性结合靶的结合实体，其选自包含Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2、双体抗体、线性抗体、scFv、scFab和dsFv的组，所述结合实体在其20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GGGSLPX1TG，其中X1可以是任何氨基酸残基，以及ii)抗体Fc区，其在至少一个N末端包含氨基酸序列GGCPX4C或氨基酸序列GGHTCPX4C，其中X4是S或P，或者所述结合实体在其20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GSLPX1TG，其中X1可以是任何氨基酸残基，以及ii)抗体Fc区，其在至少一个N末端包含氨基酸序列GGCPX4C，其中X4是S或P，与酶分选酶A，并
从而产生抗体Fc区缀合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GSLPX1TGGSGS或GGGSLPX1TGGSGS，且其中X1可以是任何氨基酸残基。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGS，其中X1可以是任何氨基酸残基，X2可以是除甘氨酸之外的任何氨基酸残基。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GSLPX1TGGSGSX3或GGGSLPX1TGGSGSX3，其中X1可以是任何氨基酸残基，X3是氨基酸序列标签。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于特异性结合靶的结合实体在20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGSGSX3，其中X1可以是任何氨基酸残基，X2可以是除甘氨酸之外的任何氨基酸残基并且其中X3是氨基酸序列标签。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于抗体Fc区在其两个N末端彼此独立地都包含氨基酸序列GGCPX4C，其中X4彼此独立地是S或P。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于特异性结合靶的结合实体特异性结合第一表位或抗原且抗体Fc区包含特异性结合不同于第一表位或抗原的第二表位或抗原的第二结合实体。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于抗体Fc区包含由至少一个二硫键连接的两条多肽链。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于抗体Fc区包含两个二硫化物连接的全长重链抗体Fc区，或两个重链抗体Fc区片段，或与同族全长轻链配对的全长抗体重链，以及二硫化物连接的全长重链抗体Fc区，或与全长抗体重链Fc区多肽二硫化物连接的全长抗体重链。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于X1是E。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于抗体Fc区是人抗体Fc区或人抗体Fc区变体。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于人抗体Fc区或人抗体Fc区变体是人IgG1亚类的，或人IgG2亚类的，或人IgG3亚类的，或人IgG4亚类的。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于抗体Fc区是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的人抗体Fc区。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于抗体Fc区包含人抗体Fc区至少在以下氨基酸位置228、233、234、235、236、237、297、318、320、322、329和/或331中一处天然存在氨基酸残基向不同残基的突变，其中抗体Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于抗体Fc区包含在人抗体Fc区第329位置处天然存在氨基酸残基的突变和至少一个氨基酸残基向不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸残基选自包含在第228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸残基的组，其中Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号，与未修饰的或与野生型Fc区相比，这些特定氨基酸残基的变化导致Fc区的效应子功能改变。
16.根据权利要求11所述的方法，其特征在于与包含相应野生型IgGFc区的缀合物相比，人抗体Fc区变体针对人FcγRIIIA、和/或FcγRIIA和/或FcγRI具有减低的亲和力。
17.根据权利要求14所述的方法，其特征在于人抗体Fc区中第329位置处的氨基酸残基用甘氨酸、或精氨酸、或大到足以摧毁Fc区内部脯氨酸夹层的氨基酸残基置换。
18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于人抗体Fc区中天然存在氨基酸残基的突变是以下至少一种：S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G和/或P331S。
19.根据权利要求14所述的方法，其特征在于如果抗体Fc区属于人IgG1亚类，则突变是L234A和L235A，或如果抗体Fc区属于人IgG4亚类，则突变是S228P和L235E。
20.根据权利要求18所述的方法，其特征在于抗体Fc区包含突变P329G。
21.根据权利要求11所述的方法，其特征在于抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变T366W并且在第二重链Fc区多肽中包含突变T366S、L368A和Y407V，其中根据Kabat的EU索引编号。
22.根据权利要求11所述的方法，其特征在于抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变S354C并且在第二重链Fc区多肽中包含突变Y349C。
23.通过权利要求1至22中任一项所述的方法所获得的抗体Fc区缀合物。
24.抗体Fc区缀合物，其包含抗体Fc区和至少一个结合实体，其中i)所述结合实体在其20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GGGSLPX1TG，其中X1可以是任何氨基酸残基，所述抗体Fc区在其至少一个N末端包含氨基酸序列GGCPX4C或氨基酸序列GGHTCPX4C，其中X4是S或P，或者ii)所述结合实体在其20个C末端氨基酸残基内包含氨基酸序列GSLPX1TG，其中X1可以是任何氨基酸残基，所述抗体Fc区在其至少一个N末端包含氨基酸序列GGCPX4C，其中X4是S或P。
25.根据权利要求24所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区缀合物包含氨基酸序列GSLPX1TGGCPX4C或GGGSLPX1TGGCPX4C,其中X1可以是任何氨基酸残基，且其中X4是S或P。
26.根据权利要求24所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区缀合物包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGCPX4C，其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4是S或P，且其中X2可以是除甘氨酸外的任何氨基酸残基。
27.根据权利要求24所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区缀合物包含氨基酸序列GSLPX1TGGHTCPX4C或GGGSLPX1TGGHTCPX4C，其中X1可以是任何氨基酸残基，且其中X4是S或P。
28.根据权利要求24所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区缀合物包含氨基酸序列X2GSLPX1TGGHTCPX4C,其中X1可以是任何氨基酸残基，其中X4是S或P，并且其中X2可以是除甘氨酸外的任何氨基酸残基。
29.根据权利要求24所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区缀合物包含通过至少一个二硫键共价连接的第一和第二多肽链。
30.根据权利要求24所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区缀合物包含是全长抗体重链的第一多肽链和是包含氨基酸序列GSLPX1TGGCPX4C或GGGSLPX1TGGCPX4C的抗体重链的第二多肽链，以此第一和第二多肽链通过至少一个二硫键共价连接，其中X1可以是任何氨基酸残基，且其中X4是S或P。
31.根据权利要求24所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区缀合物包含是全长抗体重链的第一多肽链和是包含氨基酸序列GSLPX1TGGHTCPX4C或GGGSLPX1TGGHTCPX4C的抗体重链的第二多肽链，以此第一和第二多肽链通过至少一个二硫键共价连接，其中X1可以是任何氨基酸残基，并且其中X4是S或P。
32.根据权利要求24所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区缀合物包含两条多肽链，其中每条是包含氨基酸序列GSLPX1TGGHTCPX4C或GGGSLPX1TGGHTCPX4C的抗体重链，以此两条多肽链通过至少一个二硫键共价连接，其中X1可以是任何氨基酸残基，且其中X4是S或P。
33.根据权利要求23至32中任一项所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于X1是E。
34.根据权利要求23至32中任一项所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区是人抗体Fc区或人抗体Fc区变体。
35.根据权利要求34所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于人抗体Fc区或人抗体Fc区变体是人IgG1亚类的，或人IgG2亚类的，或人IgG3亚类的，或人IgG4亚类的。
36.根据权利要求34所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区是人IgG1亚类的或人IgG4亚类的人抗体Fc区。
37.根据权利要求34所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区包含人抗体Fc区至少在以下氨基酸位置228、233、234、235、236、237、297、318、320、322、329和/或331中一处天然存在氨基酸残基向不同残基的突变，其中抗体Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号。
38.根据权利要求37所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区包含在人抗体Fc区第329位置处天然存在氨基酸残基的突变和至少一个氨基酸残基向不同残基的至少一个其他突变，所述至少一个氨基酸残基选自包含在第228、233、234、235、236、237、297、318、320、322和331位置的氨基酸残基的组，其中Fc区中的残基根据Kabat的EU索引编号，与未修饰的或与野生型Fc区相比，这些特定氨基酸残基的变化导致Fc区的效应子功能改变。
39.根据权利要求34所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于与包含相应野生型IgGFc区的缀合物相比，人抗体Fc区变体针对人FcγRIIIA、和/或FcγRIIA和/或FcγRI具有减低的亲和力。
40.根据权利要求37所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于人抗体Fc区中第329位置处的氨基酸残基用甘氨酸、或精氨酸、或大到足以摧毁Fc区内部脯氨酸夹层的氨基酸残基置换。
41.根据权利要求37所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于人抗体Fc区中天然存在氨基酸残基的突变是以下至少一种：S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D、P329G和/或P331S。
42.根据权利要求37所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于如果抗体Fc区属于人IgG1亚类，则突变是L234A和L235A，或如果抗体Fc区属于人IgG4亚类，则突变是S228P和L235E。
43.根据权利要求41所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区包含突变P329G。
44.根据权利要求34所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变T366W并且在第二重链Fc区多肽中包含突变T366S、L368A和Y407V，其中根据Kabat的EU索引编号。
45.根据权利要求34所述的抗体Fc区缀合物，其特征在于抗体Fc区在第一重链Fc区多肽中包含突变S354C并且在第二重链Fc区多肽中包含突变Y349C。
46.药物制剂，其包含根据权利要求23至45中任一项的抗体Fc区缀合物以及任选地可药用载体。
47.根据权利要求23至45中任一项的抗体Fc区缀合物，其用作药物。
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