JP7032490B2 - 抗体のin vivoでの半減期のin vitroでの予測 - Google Patents
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Description
クラスGのヒト免疫グロブリン(IgG)は、ターゲット抗原に対する特異性を伝達する2つの抗原結合(Fab)領域と、Fcレセプターとの相互作用を担う定常領域(Fc領域)とを含有する([1、2])。ヒトIgGのサブクラス1、2、及び4は、21日の平均血清半減期を有する。この半減期は、他のどの公知の血清タンパク質の半減期よりも長い([3])。この長い半減期は、Fc領域と新生児Fcレセプター(FcRn)との間の相互作用により、主に媒介される([4、5])。これは、IgG又はFc含有融合タンパク質が幅広いクラスの治療薬として使用される理由の1つである。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程a)で決定された保持時間と工程b)で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fab-FcRn相互作用の存在が決定される、
抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fab-FcRn相互作用の存在を決定する方法である。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程a)で決定された保持時間と工程b)で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、in vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-FcRn複合体におけるFab-FcRn相互作用の存在が決定される、
in vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-FcRn複合体におけるFab-FcRn相互作用の存在を決定する方法である。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程a)で決定された保持時間と工程b)で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、抗体は、IgGクラスの標準的/天然の抗体と比較して相対的に短いin vivoでの半減期を有する、
抗体の相対的なin vivoでの半減期を決定する方法である。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、i)工程a)で決定された変異抗体の保持時間が、工程a)で決定されたその親抗体の保持時間より長く、ii)工程a)で決定された変異抗体の保持時間と工程b)で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対して変異抗体のin vivoでの半減期が長くなり、また、これにより、i)工程a)で決定された変異抗体の保持時間が、工程a)で決定されたその親抗体の保持時間より短く、ii)工程a)で決定された変異抗体の保持時間と工程b)で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対して変異抗体のin vivoでの半減期が短くなる、
その親抗体に対する変異抗体のin vivoでの半減期の伸長又は短縮を決定する方法である。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、参照抗体に対して長いin vivoでの半減期を有する抗体を選択する場合には、i)工程a)で決定された参照抗体の保持時間より長い工程a)で決定された保持時間、及び、ii)工程b)で決定された保持時間と実質的に同じ工程a)で決定された保持時間を有する抗体が選択され、また、これにより、参照抗体に対して短いin vivoでの半減期を有する抗体を選択する場合には、i)工程a)で決定された参照抗体の保持時間より短い工程a)で決定された保持時間、及び、ii)工程b)で決定された保持時間と実質的に同じ工程a)で決定された保持時間を有する抗体が選択される、
参照抗体に対して伸長又は短縮したin vivoでの半減期を有する抗体を選択する方法である。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程b)で決定された保持時間と実質的に異ならない工程a)で決定された保持時間を有する抗体が選択され、また、これにより、抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fab-FcRn相互作用を有さない抗体を選択する、
抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fab-FcRn相互作用を有さない抗体を選択する方法である。
a)本明細書に報告された方法により選択された、参照抗体に対して伸長又は短縮したin vivoでの半減期を有する抗体をコードする1つ以上の核酸を含む細胞を提供する工程と、
b)該細胞を培養培地中で培養し、該細胞又は該培養培地から抗体を回収することにより、抗体を製造する工程とを含む、
抗体を製造する方法である。
抗体軽鎖中の27、55、及び94位(Kabatによるナンバリング)の荷電アミノ酸残基を、疎水性又は中性の親水性アミノ酸残基に変化させることにより、抗体のin vivoでの半減期を伸長する工程を含む、
抗体のin vivoでの半減期を伸長する方法である。
a)塩勾配溶出による第1のpH値におけるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
b)塩勾配溶出による第2のpH値におけるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程a)で決定された抗体及び参照抗体の保持時間の比が、工程b)で決定された抗体及び参照抗体の保持時間の比と実質的に異なる場合、抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fab-FcRn相互作用の存在が決定される、
抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fab-FcRn相互作用の存在を決定する方法である。
a)変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定する工程と、
b)高塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、KD値が、最大10倍異なり、変異抗体とその親抗体との間で工程b)で決定された保持時間が実質的に異なる場合、抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fab-FcRn相互作用の存在が決定される、
抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fab-FcRn相互作用の存在を決定する方法である。
a)変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定する工程と、
b)高塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、KD値が、最大10倍異なり、変異抗体の工程b)で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より短い/小さい場合、抗体は、その親抗体と比較して相対的に短いin vivoでの半減期を有し、また、これにより、KD値が、最大10倍異なり、変異抗体の工程b)で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より長い/大きい場合、抗体は、その親抗体と比較して相対的に長いin vivoでの半減期を有する、
抗体の相対的なin vivoでの半減期を決定する方法である。
a)変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定する工程と、
b)高塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、KD値が、最大10倍異なり、変異抗体の工程b)で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より短い/小さい場合、抗体は、その親抗体と比較して短いin vivoでの半減期を有し、また、これにより、KD値が、最大10倍異なり、変異抗体の工程b)で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より長い/大きい場合、抗体は、その親抗体と比較して長いin vivoでの半減期を有する、
抗体のin vivoでの半減期の伸長又は短縮を決定する方法である。
FcRn-mAb(mAb=モノクローナル抗体)相互作用の構造解析の結果を組み合わせることにより、Fvドメイン及び特に軽鎖可変ドメイン(VL)が、FcRn-mAb解離に主な影響を提供するという結論がもたらされる。この発見は、Fvドメインが同じ抗体のFcRn結合部位から離れているため、予測されなかった。
「a」及び「an」という用語は、1又は2又は3又は4又は5又は6、及び最大109を意味する。
のアミノ酸配列を有する。
本発明は、少なくとも一部において、Fvドメイン中の電荷分布が抗体-FcRn結合性に影響を及ぼし、抗体とFcRnとの間の更なる相互作用をもたらすという発見に基づいている。これは、特にpH7.4での抗体-FcRn複合体の解離に関するFcRn結合特性を変化させることにより、抗体のFcRn依存性終末相半減期を短縮する。
新生児Fcレセプター(FcRn)は、in vivoにおけるIgGクラスの抗体の代謝運命に重要である。FcRnは、リボソーム分解経路から野生型IgGを救助するのに機能し、低下したクリアランス及び伸長した半減期をもたらす。FcRnは、2つのポリペプチド:50kDa クラスI主要組織適合性複合体様タンパク質(α-FcRn)と、15kDa β2-ミクログロブリン(β2m)とからなるヘテロ二量体タンパク質である。FcRnは、クラスIgGの抗体の、Fc領域のCH2-CH3部分に、高い親和性で結合する。クラスIgGの抗体とFcRnとの間の相互作用は、pH依存性であり、1:2の化学量論で生じる。すなわち、1つのIgG抗体分子が、その2つの重鎖Fc領域ポリペプチドを介して、2つのFcRn分子に相互作用することができる(例えば、[16]を参照のこと)。
Fc領域の特定の操作は、Fc領域とFcRnとの間の相互作用を変化させることにより、PKパラメータに影響を及ぼすことが公知であり、特定のPK特性を有する治療抗体を設計するのに使用されてきた[33、34]。
ブリアキヌマブは、7.4の生理学的pHにおいて不均一な電荷分布を示す(例えば、ウステキヌマブの公開されている結晶構造[27]及びブリアキヌマブの相同性モデルを参照のこと)。ブリアキヌマブは、Fvドメイン上に大きな正に電荷した領域を示す(図1aを参照のこと)。この領域は、ウステキヌマブには存在しない(図1bを参照のこと)。更に、FcRnは、強力で、広い負に電荷した領域を有する(図1cを参照のこと)。ただし、この領域は、同じ抗体のFc領域結合性に関与しない。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブはそれぞれ、9.7及び9.4の算出等電点を有する。更に、ブリアキヌマブの正味電荷は、pH範囲全体にわたって、わずかにより正である(図1dを参照のこと)。
ブリアキヌマブ及びウステキヌマブの10個の変異体が合成され、FcRn親和性クロマトグラフィーにより、そのFcRn結合特性に関して特徴決定されている(表2を参照のこと)。変異体において、可変領域が改変されており、pH6でのFcRn結合親和性及びFcRn解離について、表面プラズモン共鳴(SPR)及びFcRn親和性クロマトグラフィーをそれぞれ使用して試験されている(表3を参照のこと)。
a)変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定する工程と、
b)高塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、KD値が、最大10倍異なり、変異抗体とその親抗体との間の工程b)で決定された保持時間が、実質的に異なる場合、in vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fc-FcRn複合体における抗体-Fab-FcRn相互作用の存在が決定される、
抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fc-FcRn複合体における抗体-Fab-FcRn相互作用の存在を決定する方法である。
a)変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定する工程と、
b)高塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、KD値が、最大10倍異なり、変異抗体の工程b)で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より短い/小さい場合、抗体は、その親抗体と比較して相対的に短いin vivoでの半減期を有し、また、これにより、KD値が、最大10倍異なり、変異抗体の工程b)で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より長い/大きい場合、抗体は、その親抗体と比較して相対的に長いin vivoでの半減期を有する、
抗体の相対的なin vivoでの半減期を決定する方法である。
a)変異抗体及びその親抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定する工程と、
b)高塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、KD値が、最大10倍異なり、変異抗体の工程b)で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より短い/小さい場合、抗体は、その親抗体と比較して短いin vivoでの半減期を有し、また、これにより、KD値が、最大10倍異なり、変異抗体の工程b)で決定された保持時間が、その親抗体の保持時間より長い/大きい場合、抗体は、その親抗体と比較して長いin vivoでの半減期を有する、
抗体のin vivoでの半減期の伸長又は短縮を決定する方法である。
抗体軽鎖中の27、55、及び94位(Kabatによるナンバリング)の荷電アミノ酸残基を、疎水性又は中性の親水性アミノ酸残基に変化させることにより、抗体のin vivoでの半減期を伸長する工程を含む、
抗体のin vivoでの半減期を伸長する方法である。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性で親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向性に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族性:Trp、Tyr、Phe。
以前の研究において、抗体と内皮細胞表面上の負に電荷した基との間での静電相互作用に影響を及ぼすことにより、正味電荷が、変化した薬物動態特性のための駆動力となることが議論されてきた[35、36]。例えば、Igawa et al,[37]は、可変領域中の操作によるより低い等電点(pI)を有するIgG4抗体が、より遅い速度の流動相飲作用、続けて、低下した除去速度を有することを観察した。更に、Boswell et al.[38]は、pIの差異が、PKに影響を及ぼす少なくとも1つのユニットに必要であったと提案した。
ヒトFcRn-Fc複合体の相同性モデルを、公開されているラットFcRn構造をテンプレートとして使用して生成した。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブのFvドメインの位置を、完全なIgG1(PDBコード 1HZH)の結晶構造に基づいてモデル化した。これらの相同性モデルは、1つの完全なIgG分子上にFcRn(β2mを含むα-FcRn)の2つのコピーを含有する(図4aを参照のこと)。FcRnとFvドメインとの間の距離は、開始構造において40Å超であり、生理学的条件下において、約8Åのデイビー長を超える[32]。FcRn-IgG複合体の動力学を、分子動力学シミュレーションにより、100nsの期間にわたって、顕在する水及び生理学的イオン強度においてシミュレーションした。シミュレーションの経過中に、2つのFab領域の一方が、FcRnの先端に近づき、シミュレーション時間の残りの間この配置で持続した(図4b、c、dを参照のこと)。Fvドメインと相互作用することが見出されたFcRn上の領域は、今までは、IgG結合性に関与するとは説明されていなかった。驚くべきことに、MDシミュレーションにおいて、ブリアキヌマブだけでなくウステキヌマブも、FvとFcRnとが互いに相互作用するコンホーメーションが仮定された(図4b、cを参照のこと)。両複合体において、非対称な開始構造中の2種類の異なるペアのFv及びFcRnドメインが互いに接近したことが見出された。FcRn-Fv相互作用に対する静電的寄与は、ブリアキヌマブにおいて、ウステキヌマブの程度より約2倍高いことが見出された(図4eを参照のこと)。
g.i)種々の塩濃度での正の線形pH勾配による溶出
本明細書において、下記2つの工程:
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含む、方法が報告されている。
1)抗体及び参照抗体は、工程a)及び工程b)において実質的に同じ保持時間を有する。この場合、両抗体のin vivoでの半減期は、実質的に同じであるべきである。すなわち、in vivoでの半減期は、抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受けない。又は
2)抗体及び参照抗体は、工程a)において実質的に同じ保持時間を有するが、工程b)において異なる保持時間を有する。この場合、抗体のin vivoでの半減期は、参照抗体のin vivoでの半減期より短い。すなわち、in vivoでの半減期は、抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受ける。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程a)で決定された保持時間と工程b)で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、in vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fc-FcRn複合体における抗体-Fab-FcRn相互作用の存在が決定される、
in vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fc-FcRn複合体における抗体-Fab-FcRn相互作用の存在を決定するための本明細書に報告された方法の使用である。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程a)で決定された保持時間と工程b)で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、in vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fc-FcRn複合体における抗体-Fab-FcRn相互作用の存在が決定される、
in vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fc-FcRn複合体における抗体-Fab-FcRn相互作用の存在を決定する方法である。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程a)で決定された保持時間と工程b)で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、抗体は、IgG1、IgG3、又はIgG4のサブクラスの標準的/天然の抗体と比較して相対的に短いin vivoでの半減期を有する、
抗体の相対的なin vivoでの半減期を決定する方法である。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程a)で決定された保持時間と工程b)で決定された保持時間とが実質的に異なる場合、抗体は、IgG1、IgG3、又はIgG4のサブクラスの標準的/天然の抗体と比較して相対的に短いin vivoでの半減期を有する、
抗体の相対的なin vivoでの半減期を決定するための本明細書に報告された方法の使用である。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、i)工程a)で決定された変異抗体の保持時間が、工程a)で決定されたその親抗体の保持時間より大きく/長く、ii)工程a)で決定された変異抗体の保持時間と工程b)で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対する変異抗体のin vivoでの半減期が伸長され、また、これにより、i)工程a)で決定された変異抗体の保持時間が、工程a)で決定されたその親抗体の保持時間より小さく/短く、ii)工程a)で決定された変異抗体の保持時間と工程b)で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対する変異抗体のin vivoでの半減期が短縮される、
その親抗体に対する変異抗体のin vivoでの半減期の伸長又は短縮を決定する方法である。
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの変異抗体及びその親抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、i)工程a)で決定された変異抗体の保持時間が、工程a)で決定されたその親抗体の保持時間より大きく/長く、ii)工程a)で決定された変異抗体の保持時間と工程b)で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対する変異抗体のin vivoでの半減期が伸長され、また、これにより、i)工程a)で決定された変異抗体の保持時間が、工程a)で決定されたその親抗体の保持時間より小さく/短く、ii)工程a)で決定された変異抗体の保持時間と工程b)で決定された変異抗体の保持時間とが実質的に同じである場合、その親抗体に対する変異抗体のin vivoでの半減期が短縮される、
その親抗体に対する変異抗体のin vivoでの半減期の伸長又は短縮を決定するための本明細書に報告された方法の使用である。
本明細書において、下記2つの工程:
a)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体の保持時間を決定する工程と、
b)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体のFc領域の保持時間を決定する工程とを含む、方法が報告されている。
1)抗体及びそのFc領域は、実質的に同じ保持時間を有する。この場合、抗体のin vivoでの半減期は、抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受けない。
2)抗体及びそのFc領域は、異なる保持時間を有し、Fc領域の保持時間は、抗体の保持時間より短い。この場合、抗体のin vivoでの半減期は、抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受ける。
1)親抗体(1)、変異抗体(3)、及びそれらのFc領域(2、4)は、実質的に同じ保持時間を有する。この場合、変異抗体のin vivoでの半減期は、i)抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受けず、ii)親抗体のin vivoでの半減期に対応する(図10Aを参照のこと)。
2)変異抗体(3)及びそのFc領域(4)は、異なる保持時間を有し、変異抗体のFc領域の保持時間は、変異抗体の保持時間より短く、親抗体(1)、親抗体のFc領域(2)、及び変異抗体のFc領域(4)は、実質的に同じ保持時間を有する。この場合、変異抗体のin vivoでの半減期は、i)抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受け、ii)親抗体のin vivoでの半減期より短い(図10Bを参照のこと)。
3)親抗体(1)及び変異抗体(3)は、異なる保持時間を有し、変異抗体のFc領域(4)の保持時間は、変異抗体(3)の保持時間と実質的に同じであり、変異抗体の保持時間は、親抗体(1)の保持時間より長い。この場合、変異抗体のin vivoでの半減期は、i)抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受けず、ii)親抗体のin vivoでの半減期より長い(図10Cを参照のこと)。
4)親抗体(1)及び変異抗体(3)は、異なる保持時間を有し、変異抗体のFc領域(4)の保持時間は、変異抗体(3)の保持時間と実質的に同じであり、変異抗体(3)の保持時間は、親抗体(1)の保持時間より短い。この場合、変異抗体のin vivoでの半減期は、i)抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受けず、ii)親抗体のin vivoでの半減期より短い。
5)親抗体(1)及び変異抗体(3)は、異なる保持時間を有し、変異抗体のFc領域(4)の保持時間は、変異抗体(3)の保持時間とは異なり、親抗体(1)及びそのFc領域(2)の保持時間とも異なり、変異抗体のFc領域(4)の保持時間は、変異抗体(3)の保持時間と親抗体(4)の保持時間との間である。この場合、変異抗体のin vivoでの半減期は、i)抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受け、ii)親抗体のin vivoでの半減期とは異なる(図10Dを参照のこと)。
a)同じ溶出条件を使用するFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの、i)抗体(3)、ii)該抗体のFc領域(4)、iii)参照抗体(1)、iv)参照抗体のFc領域(2)、及びv)Fc領域中に突然変異N434Aを有する参照抗体(5)の保持時間を決定する工程と、
b)抗体を選択する工程であって、
b-i)参照抗体(1)、変異抗体(3)、及びそれらのFc領域(2、4)が、実質的に同じ保持時間を有し、抗体の保持時間が、Fc領域中に突然変異N434Aを有する参照抗体(5)の保持時間より短い抗体を選択することにより、in vivoでの半減期が、i)抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受けず、ii)親抗体のin vivoでの半減期に対応する(図12Aを参照のこと)抗体を選択し、
b-ii)抗体(3)及びそのFc領域(4)が、異なる保持時間を有し、該抗体のFc領域(4)の保持時間が、抗体(3)の保持時間より短く、参照抗体(1)又はそのFc領域(2)の保持時間と同じ、又は、参照抗体(1)又はそのFc領域(2)の保持時間より長く、参照抗体(1)、参照抗体のFc領域(2)、及び抗体(3)の保持時間が、Fc領域中に突然変異N434Aを有する参照抗体(5)の保持時間より短い抗体を選択することにより、in vivoでの半減期が、i)抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受け、ii)参照抗体のin vivoでの半減期より短い(図12Bを参照のこと)抗体を選択し、
b-iii)参照抗体(1)及び抗体(3)が、異なる保持時間を有し、抗体のFc領域(4)の保持時間が、抗体(3)の保持時間と実質的に同じであり、抗体(3)の保持時間が、参照抗体(1)の保持時間より長く、抗体(3)の保持時間が、Fc領域中に突然変異N434Aを有する参照抗体(5)の保持時間より短い抗体を選択することにより、in vivoでの半減期が、i)抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受けず、ii)参照抗体のin vivoでの半減期より長い(図12Cを参照のこと)抗体を選択し、
b-iv)参照抗体(1)及び抗体(3)が、異なる保持時間を有し、抗体のFc領域(4)の保持時間が、抗体(3)の保持時間と実質的に同じであり、抗体(3)の保持時間が、参照抗体(1)の保持時間より短く、抗体(3)の保持時間が、Fc領域中に突然変異N434Aを有する参照抗体(5)の保持時間より短い抗体を選択することにより、in vivoでの半減期が、i)抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受けず、ii)参照抗体のin vivoでの半減期より短い(図12Dを参照のこと)抗体を選択し、
b-v)参照抗体(1)及び抗体(3)が、異なる保持時間を有し、抗体のFc領域(4)の保持時間が、抗体(3)の保持時間とは異なり、参照抗体(1)及びそのFc領域(2)の保持時間とも異なり、抗体のFc領域(3)の保持時間が、抗体(3)の保持時間と参照抗体(1)の保持時間との間であり、抗体(3)の保持時間が、Fc領域中に突然変異N434Aを有する参照抗体(5)の保持時間より短い抗体を選択することにより、in vivoでの半減期が、i)抗体-Fab-FcRn相互作用により影響を受け、ii)参照抗体のin vivoでの半減期とは異なる(図12Eを参照のこと)抗体を選択する工程、とを含む、
抗体を選択する方法である。
本明細書において、下記工程:
a)塩勾配溶出による第1のpH値におけるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
b)塩勾配溶出による第2のpH値におけるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程とを含む、方法が報告される。
a)塩勾配溶出による第1のpH値におけるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
b)塩勾配溶出による第2のpH値におけるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程とを含み、
これにより、工程a)で決定された抗体及び参照抗体の保持時間の比が、工程b)で決定された抗体及び参照抗体の保持時間の比と実質的に異なる場合、抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fab-FcRn相互作用の存在が決定される、
抗体のin vivoでの半減期に影響を及ぼす抗体-Fab-FcRn相互作用の存在を決定する方法である。
CDR中に電荷パッチを有さない別の分子は、LC-CDR中に正の電荷パッチを形成して、この位置での正の電荷が一般的に抗体のFcRn結合親和性に影響を及ぼすという上記で報告された知見を実証するのに選択される。
は、MD目的でFcRnに対するジスルフィド架橋を確立するために、Cysに突然変異させた残基をマークする。
で短縮する。一方、ウステキヌマブの保持時間は、基本的に影響を受けないままである。
1.下記工程:
i)第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
ii)第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
iii)抗体及び参照抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定し、高塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程、又は
iv)抗体及び参照抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定し、線形塩勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程、又は
v)正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vi)高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vii)抗体及びそのFc領域について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定し、高塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
viii)抗体及びそのFc領域について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定し、高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程
を含み、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
d)そのFc領域のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、抗体を選択する方法。
第1の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2の塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程と、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
d)そのFc領域のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程と、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
d)そのFc領域のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
抗体及び参照抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定し、高塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
d)そのFc領域のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
抗体及び参照抗体について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定し、線形塩勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の保持時間を決定する工程と、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
d)そのFc領域のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程と、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
d)そのFc領域のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程と、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
d)そのFc領域のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
抗体及びそのFc領域について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定し、高塩濃度の存在下での正の線形pH勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程と、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
d)そのFc領域のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
抗体及びそのFc領域について、表面プラズモン共鳴を使用して、pH6におけるKD値を決定し、高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRn親和性クロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程と、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体、又は
d)そのFc領域のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択する工程とを含む、抗体を選択する方法。
更に、参照抗体又は参照Fc領域の保持時間を決定し、
a)参照抗体の第1の保持時間より長い第1の保持時間を有し、第2の保持時間と実質的に同じである第1の保持時間を有する抗体、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じであり、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体、又は
d)そのFc領域のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、そのFc領域の保持時間と実質的に同じであり、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体
を選択することによる、実施態様1、6、7、8、及び9のいずれか1つに記載の方法。
更に、参照抗体又は参照Fc領域の保持時間を決定し、
更に、突然変異N434Aを有するIgG Fc領域の保持時間を決定し、
a)参照抗体の第1の保持時間より長い第1の保持時間を有し、実質的に同じであり第1の保持時間と第2の保持時間を有し、突然変異N434Aを有するFc領域の保持時間より短い第1の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に長いin vivoでの半減期を有する抗体を選択し、又は
b)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有し、突然変異N434Aを有するFc領域の保持時間より短い第1の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に長いin vivoでの半減期を有する抗体を選択し、又は
c)参照抗体の第1の保持時間より短い第1の保持時間を有し、実質的に同じである第1の保持時間と第2の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に短いin vivoでの半減期を有する抗体を選択し、又は
d)参照抗体のKD値とは最大10倍異なるKD値を有し、参照抗体の保持時間より短い保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に長いin vivoでの半減期を有する抗体を選択することによる、実施態様1、6、7、8、及び9のいずれか1つに記載の方法。
a)実施態様1~46のいずれか1つに記載の方法により選択された抗体をコードする1つ以上の核酸を含む細胞を提供する工程と、
b)該細胞を培養培地中で培養する工程と、
c)該細胞又は該培養培地から抗体を回収することにより、抗体を製造する工程とを含む、
抗体を製造する方法。
抗体
実験に使用した抗体は、ウステキヌマブ(CNTO 1275, Stelara(商標)、CAS登録番号815610-63-0、配列番号42及び43の可変ドメイン)と、ブリアキヌマブ(ABT 874, J 695, Ozespa(商標)、配列番号40及び41の可変ドメイン)と、ウステキヌマブ及びブリアキヌマブの10個の変異体及び突然変異体(以下、それぞれmAb1~mAb10と呼ぶ)とした。合計12個のIgGを調査した(表2を参照のこと)。
上記された抗体の発現のために、一過性発現(例えば、HEK293-F)細胞のための変異体の発現プラスミドを、CMV-イントロンAプロモーターによるもしくはよらないcDMA構築、又は、CMVプロモーターによるゲノム構築のいずれかに基づいて適用した。
E.coli中でのこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、
E.coliにアンピシリン抵抗性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子、及び
真核細胞における選択マーカーとしてのMus musculus由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子
を含んだ。
5’端における固有の制限部位、
ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサー及びプロモーター、
続けて、cDNA構築の場合には、イントロンA配列、
ヒト抗体遺伝子の5’-非翻訳領域、
免疫グロブリン重鎖のシグナル配列、
免疫グロブリンエクソン―イントロン構築を伴うcDNA又はゲノム構築のいずれかとしてのヒト抗体鎖、
ポリアデニル化シグナル配列を伴う3’非翻訳領域、及び
3’端における固有の制限部位
標準的な細胞培養技術を、Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Incに記載されているように使用した。
抗体を、(例えば、重鎖と、対応する軽鎖とをコードする)各プラスミドによる一過性トランスフェクションにより、HEK293-F細胞(Invitrogen)を使用して、製造メーカーの説明書に従って生成した。簡潔に述べると、振とうフラスコ又は撹拌発酵槽のいずれかにおいて、血清を含まないFreeStyle(商標)293発現培地(Invitrogen)中で懸濁状に増殖させたHEK293-F細胞(Invitrogen)を、各発現プラスミドと、293 fectin(商標)又はフェクチン(Invitrogen)との混合物によりトランスフェクションした。2L振とうフラスコ(Corning)に対して、HEK293-F細胞を、600mL中に1×106個/mLの密度で播種し、120rpm、8%CO2でインキュベーションした。その翌日、細胞を、約1.5×106個/mLの細胞密度で、A)Opti-MEM(Invitrogen)20mL(各重鎖及び等モル比で対応する軽鎖をコードする、600μg トータルプラスミドDNA(1μg/mL)を含む)と、B)Opti-MEM 20mL+293 fectin又はフェクチン 1.2mL(2μL/mL)との混合物 約42mLによりトランスフェクションした。グルコース消費に従って、グルコース溶液を、発酵の経過中に加えた。分泌された抗体を含有する上清を、5~10日後に収集した。抗体を、上清から直接精製するか、又は、上清を、凍結及び保存するかのいずれかをした。
抗体を、細胞培養上清から、MabSelectSure-Sepharose(商標)(GE Healthcare, Sweden)を使用する親和性クロマトグラフィー、ブチル-セファロース(GE Healthcare, Sweden)を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー、及びSuperdex 200サイズ排除(GE Healthcare, Sweden)クロマトグラフィーにより精製した。
濃度を、3回の測定の平均として提供する。単量体含量を、SECクロマトグラムの積分により決定する。抗体種の純度を、インタクトなmAbのCE-SDSにより、DTT還元後に決定する。疎水性を、低及び高疎水性RSに対して表す。
機能性特定決定には、ブリアキヌマブ及びウステキヌマブが正しく生成され、ターゲットへの結合性も機能しているかを試験するための、ターゲット(ヒトIL-12)との相互作用分析が含まれる。mAb変異体を、Fab領域において改変し、これらの改変がターゲット結合性を変化させるかを試験する。更に、マウスIL-12/-23とのマウスPK研究に使用される抗体の相互作用を、マウス研究におけるターゲット媒介性クリアランス効果を除外するのに分析する。加えて、マウスFcγレセプターI(muFcγRI)に対する結合レベルを測定する。マウスFcγRIに対するより強い結合性は、抗原提示細胞へのより速い取込みによるPK研究におけるより速い減少をもたらす場合があるためである。
ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、及び変異体は、IL-12結合性に影響を及ぼす場合があるFab領域において構造的差異を有するため、全てのmAbの結果を、詳細に提供する。
交差交換を有する変異体(mAb1~6)及び改変された電荷分布を有する変異体(mAb7~10)の吸光度-濃度曲線を、図15及び16それぞれに示す。各mAbの濃度を、ブリアキヌマブ検量線の当てはめを使用して算出し、ブリアキヌマブに対するIL-12結合性(ブリアキヌマブ=100%)を得た。30%以下の結合性の差異を、ブリアキヌマブと同様のIL-12に対する結合性を示すと評価した。30%以上の差異は、IL-12に対する結合性が低下したことを示す。ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、及び交換されたFvドメインを有するmAb(mAb1及びmAb2)は、同様のIL-12結合プロファイルを示す。ブリアキヌマブ、ウステキヌマブ、及びmAb2の結合性は、20%ウインドウの範囲であり、mAb3の結合性は、30%ウインドウの範囲である。交換されたLCを有するmAb(mAb3及びmAb4)と、交換されたCDRを有するmAb(mAb5及びmAb6)は、IL-12に結合しない。
SPRを、ターゲット特異的ELISAの結果を確認するのに使用した。ウステキヌマブ及びブリアキヌマブは、ほぼ同一の会合速度定数(ka)(ka(ブリアキヌマブ)8×105l/Ms vs.ka(ウステキヌマブ)9×105l/Ms)を有する。IL-12とmAbとの解離は、非常に遅いため、解離速度定数(kd)、及びその後の、平行解離定数(KD)の算出は、実際の値とは異なる場合がある。この設定における方法の限界に関わらず、算出値は、一般的な評価を提供することができ、ELISAでの結果を確認するのに使用することができる。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブは、高い親和性でIL-12に結合し、KDは、低いnM範囲(KD(ブリアキヌマブ)=0.2nM vs. KD(ウステキヌマブ)=0.07nM)にある。それぞれ8×105l/Ms、6×10-5l/s、及び70pMのka、kd、及びKD値を有するブリアキヌマブの測定された親和性は、文献データ(ka 5×105l/Ms、kd 5.1×10-5l/s、KD=100pM)と一致している([51])。IL-12に対するウステキヌマブの高い親和性も、文献に記載されている([52])。
KDを、ウステキヌマブに対して算出した(ウステキヌマブ=1.0)。KD値の評価のために、差異が、ウステキヌマブ-FcRn KDに対して小数第一位より小さかった場合、mAbとFcRnとの親和性を、ウステキヌマブ-FcRn親和性と同様であると評価した。KDの差異が、ウステキヌマブ-FcRn KDに対して小数第一位より大きかった場合、KDを、異なると評価した。pH6.0でのFcRn親和性は、全てのmAbについて狭い範囲にあった。ブリアキヌマブは、0.2の相対的なKDを有した。変異体は、1.1の相対的なKDを有したmAb10を除いて、ブリアキヌマブとウステキヌマブとの間の範囲にあった。
FcRnとmAbとの解離を、SPR及びFcRn親和性クロマトグラフィーにより分析した。
KD値の評価について、1μMを下回るKDを、中程度の親和性を示すと評価し、1~5μMのKDを、弱い親和性を示すと評価し、5μM超のKDを、FcRnに対する結合性を示さないと評価した。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブは、pH6.0において同様の親和性を示した。ウステキヌマブは、pH6.6において非常に弱い親和性を示し、pH6.8において親和性を示さなかった。対照的に、ブリアキヌマブは、pH6.8まで中程度の親和性を示し、pH7.0において弱い親和性を示し、pH7.2において結合性を示さなかった。
F(ab’)2フラグメント及びFc領域フラグメントを、FabRICATOR-キット(GENOVIS, Lund, Sweden)を使用して、37℃で30分間インキュベーションすることにより調製した。得られた開裂生成物であるF(ab’)2及びFc領域を、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム(Superdex 200, GE Healthcare, Zurich, Switzerland)において、AKTA Explorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)を使用して分離し、ピーク画分をプールした。分子量標準を、2つの開裂生成物をその保持時間に基づいて特定するのに、同じカラムに供給した。
抗体のFcRnに対する結合特性を、表面プラズモン共鳴(SPR)技術により、BIAcore T100機器(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)を使用して分析した。このシステムは、分子間相互作用の研究に十分確立されている。それは、リガンド/検体結合の連続的なリアルタイムモニタリングが可能であり、このため、種々のアッセイ設定における反応速度パラメータの決定が可能である。SPR技術は、金でコートしたバイオセンサチップの表面近くでの屈折率の測定に基づいている。屈折率の変化は、固定されたリガンドと溶液中の注入された検体との相互作用による表面での質量変化を示す。分子が表面に固定されたリガンドに結合すると、質量は増大する。解離した場合、質量は減少する。本アッセイ法では、FcRnレセプターを、BIAcore CM5-バイオセンサチップ(GE Healthcare Bioscience, Uppsala, Sweden)上に、アミンカップリングを介して、400応答単位(RU)のレベルで固定化した。このアッセイ法を、ランニング及び希釈バッファーとして、PBS、0.05% Tween20、pH6.0(GE Healthcare Bioscience)を使用して、室温で行った。200nM ネイティブ又は酸化抗体サンプルを、50μL/分の流速で室温において注入した。会合時間を、180秒とし、解離相を、360秒とった。チップ表面の再生を、HBS-P(pH8.0)の短い注入により達成した。SPRデータの評価を、注入後180秒と注入後300秒での生物学的応答シグナルの高さの比較により行った。対応するパラメータを、RU最大レベル(注入後180秒)及び後期安定性(注入終了後300秒)とする。
マウスFcRn α-鎖遺伝子を欠損しているが、ヒトFcRn α-鎖遺伝子について半接合トランスジェニックなB6.Cg-Fcgrttm1DcrTg(FCGRT)276Dcrマウス(muFcRn-/- huFcRn tg+/-、系統276)を、薬物動態研究に使用した[39]。マウスの管理を、特定病原体不在条件下において行った。マウスを、Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)から得た(メス、4~10週齢、投与時体重17~22g)。全ての動物実験について、Government of Upper Bavaria, Germanyにより承認を受け(許可番号55.2-1-54-2532.2-28-10)、AAALAC認定動物施設において、実験動物の管理及び利用に関する欧州連合基準に従って行った。動物を、標準的なケージに収容し、研究期間全体を通して、食餌及び水を自由に摂取できるようにした。
単回用量の抗体を、外側尾静脈を介して、10mg/kgの用量レベルでi.v.注射した。マウスを、3つの群に6匹のマウスずつに分け、合計9回の血清収集時点(投与後0.08、2、8、24、48、168、336、504、及び672時間)をカバーした。各マウスを、Isoflurane(商標)(CP-Pharma GmbH, Burgdorf, Germany)による浅麻酔下において行う後眼窩出血に2回供した。三回目の血液サンプルを、安楽死の時点で収集した。血液を、血清チューブ(Microvette 500Z-Gel, Sarstedt, Numbrecht, Germany)中に収集した。2時間のインキュベーション後、サンプルを、9,300gで3分間遠心分離し、血清を得た。遠心分離後、血清サンプルを、分析まで-20℃で凍結保存した。
マウス血清中のウステキヌマブ、ブリアキヌマブ、mAb8、及びmAb9の濃度を、特異的酵素結合免疫アッセイ法により決定した。抗体に特異的なビオチン化インターロイキン12及びジゴキシゲニン-標識抗-ヒト-Fcマウスモノクローナル抗体(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)をそれぞれ、捕捉及び検出に使用した。ストレプトアビジンコートしたマイクロタイタープレート(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)を、アッセイバッファー(Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)で希釈したビオチン化捕捉抗体で、1時間コートした。洗浄後、血清サンプルを、種々の希釈で加え、続けて、更に1時間インキュベーションした。繰返し洗浄した後、結合したヒト抗体を、検出抗体、続けて、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP:Roche Diagnostics, Penzberg, Germany)にコンジュゲートさせた抗-ジゴキシゲニン抗体とのその後のインキュベーションにより検出した。ABTS(2,2’-アジノ-ジ[3-エチルベンズチアゾリンスルホナート];Roche Diagnostics, Germany)を、HRP基質として使用し、着色反応生成物を形成した。得られた反応生成物の吸光度を、490nmでの参照波長と共に405nmで、Tecan sunriseプレートリーダー(Mannedorf, Switzerland)を使用して読み取った。
薬物動態パラメータを、WinNonlin(商標)1.1.1(Pharsight, CA, USA)を使用する非コンパートメント分析により算出した。
中心を外れた血清濃度を、Nalimov outlier検定を使用して検出し、更なる分析から除外した。
pH依存性正味電荷(「滴定曲線」)を、オープンソースプログラムEMBOSS iepにより、全てのシステインがジスルフィド架橋に関与すると仮定して算出した。
ブリアキヌマブFabフラグメントについての相同性モデルを、テンプレートとしてPDB構造1AQK[41]を使用するモデラー9v7を使用して生成した。ブリアキヌマブ及びウステキヌマブFabについての等ポテンシャル表面を、このモデル(ブリアキヌマブ)又はウステキヌマブの結晶構造(PDB ID 3HMX)からそれぞれ算出した。構造を、DiscoveryStudio Pro, Version 3.5(Accelrys Inc., San Diego, USA)におけるCHARMm force fieldによる「prepare protein」プロトコールを使用して、pH7.4及び0.145M イオン強度においてプロトン化した。静電ポテンシャルを、DiscoveryStudio Proにおける「electrostatic potential」プロトコールを使用して算出した。このプロトコールは、DelPhiプログラムを呼び出す[42]。
完全なIgGとしてのブリアキヌマブ及びウステキヌマブの相同性モデルを、完全なIgG1の結晶構造(PDB ID 1HZH)により、テンプレートとしてグリカンを使用することなく、DiscoveryStudio Pro, Version 3.5を使用して構築した。この簡易化は、適切であったと考えられる。in vitroにおけるグリコシル化は、FcRn結合性に顕著な影響を有さないためである[43]。このテンプレート中のFabドメインを、そのCH1及びCLドメインのアライメント後に、上記されたFab構造により置き換えた。ヒトFcRnの相同性モデルを、テンプレートとしてラットFcRn-Fc複合体(PDB ID 1I1A)を使用して、DiscoveryStudio Proにより構築した。欠けている残基を、DiscoveryStudio Proの「prepare protein」スクリプトにより構築した。ヒトFcRnの相同性モデルを、ブリアキヌマブ及びウステキヌマブIgGモデルの両重鎖に対して、FcRn周囲5Å内にあるラットFcドメインのC-アルファ原子と、ヒトFc領域におけるその相同的な対応物とを重ねることにより、モデル化した。MDシミュレーションについて、FcRn:Fc界面(FcRn中の残基108とFc中の残基255との間、図S1)におけるジスルフィド結合を、シミュレーション中に複合体が解離するのを妨げるために導入した。得られた構造は、FcRn/β2mgヘテロ二量体の2つのコピーを有する完全なIgGを表す。
MD軌跡中にFcRnに近づく、FcRnとFabドメインとの間の非結合相互作用に対する静電的寄与を、DiscoveryStudio Proにより算出した。エネルギー算出について、タンパク質を、上記されたのと同じ設定で、pH7.4、145mM イオン強度、及び37℃の温度でプロトン化した。構造を、最大1000ステップの「smart minimizer」プロトコールにより最小化した。その後、相互作用エネルギーを、「calculate interaction energy」プロトコールを使用して、DiscoveryStudio ProにおけるCHARMm force fieldにより算出した。顕在する水及びGBMV静電モデルを使用した。この計算を、軌跡(0ns)の開始時と、1ns間隔で96~100nsとで行った。
FcRn親和性カラムの準備
HEK293細胞中でのFcRnの発現
FcRnを、FcRnとベータ-2-ミクログロブリンとのコード配列を含有する2つのプラスミドによるHEK293細胞のトランスフェクションにより、一過性に発現させた。トランスフェクションされた細胞を、振とうフラスコ中において、36.5℃、120rpm(振とう器振幅5cm)、湿度80%、及び7% CO2で培養した。該細胞を、2~3日毎に、3~4×105個/mLの密度に希釈した。
3mg FcRnを、150mM 塩化ナトリウムを含有する20mM リン酸二水素ナトリウムバッファー 5.3mL中に溶解/希釈し、PBS 250μL及びcomplete protease inhibitor(complete ULTRA Tablets, Roche Diagnostics GmbH) 1錠を加えた。FcRnを、Avidityから入手したビオチン化キットを使用して、製造メーカーの説明書に従って、ビオチン化した(Bulk BIRA, Avidity LLC)。ビオチン化反応を、室温で一晩行った。
ストレプトアビジンセファロースに結合させるために、1グラム ストレプトアビジンセファロース(GE Healthcare, United Kingdom)を、ビオチン化し、透析したFcRnに加え、4℃で一晩インキュベーションした。FcRn誘導体化セファロースを、XKカラム(GE Healthcare, United Kingdom) 1mLに充填した。ついで、FcRnカラムを、140mM 塩化ナトリウムを含有する20mM 2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸(MES)ナトリウム塩バッファー(pH5.5)で平衡化した。
FcRn親和性カラム及びpH勾配を使用するクロマトグラフィー
レセプター誘導体化セファロースを、XKカラム(GE Healthcare) 1mLに充填し、ついで、FcRnカラムを、140mM NaClを含有する20mM 2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸(MES)バッファー(pH5.5)で平衡化した。
カラム寸法: 50mm×5mm
ベッド高さ: 5cm
ローディング: 30μg サンプル
平衡化バッファー: 140mM NaClを含む20mM MES、pH5.5に調整
溶出バッファー: 140mM NaClを含む20mM Tris/HCl、pH8.8に調整
溶出: 7.5CV 平衡化バッファー、120分間に100% 溶出バッファー、10CV 溶出バッファー
FcRn親和性カラム、pH勾配、及び高塩条件を使用するクロマトグラフィー
レセプター誘導体化セファロースを、XKカラム(GE Healthcare) 1mLに充填し、ついで、FcRnカラムを、400mM NaClを含有する20mM 2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸(MES)バッファー(pH5.5)で平衡化した。
カラム寸法: 50mm×5mm
ベッド高さ: 5cm
ローディング: 30μg サンプル
平衡化バッファー: 400mM NaClを含む20mM MES、pH5.5に調整
溶出バッファー: 400mM NaClを含む20mM Tris/HCl、pH8.8に調整
溶出: 7.5CV 平衡化バッファー、120分間に100% 溶出バッファー、10CV 溶出バッファー
FcRn親和性カラム及び塩勾配を使用するクロマトグラフィー
レセプター誘導体化セファロースを、XKカラム(GE Healthcare) 1mLに充填し、ついで、FcRnカラムを、10mM 2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸(MES)バッファー(pH7.8)で平衡化した。
カラム寸法: 50mm×5mm
ベッド高さ: 5cm
ローディング: 30μg サンプル
平衡化バッファー: 10mM MES、pH7.8に調整
溶出バッファー: 250mM NaClを含む10mM MES、pH7.8に調整
溶出: 7.5CV 平衡化バッファー、60分間に100% 溶出バッファー、10CV 溶出バッファー
FcRn親和性カラムを使用するクロマトグラフィー
レセプター誘導体化セファロースを、XKカラム(GE Healthcare) 1mLに充填し、ついで、FcRnカラムを、150mM NaClを含有する20mM 2-(N-モルホリン)-エタンスルホン酸(MES)バッファー(pH5.5)で平衡化した。
カラム寸法: 50mm×5mm
ベッド高さ: 5cm
ローディング: 50μg サンプル
平衡化バッファー: 150mM NaClを含む20mM MES、pH5.5に調整
溶出バッファー: 150mM NaClを含む20mM Tris/HCl、pH8.8に調整
溶出: 7.5CV 平衡化バッファー、30CVの間に100% 溶出バッファー、10CV 溶出バッファー
FcRnカラムにおける保持時間とin vivoでの半減期との相関
in vivoでの半減期を、10mg/kg(n=8)の単回i.v.投与後に、ヒトFcRnトランスジェニックC57BL/6Jマウスにおいて測定し、FcRnカラムにおける保持時間と比較した(表15を参照のこと)。FcRnカラムから遅い溶出を示した抗体は、FcRnトランスジェニックマウスにおいて、より長い半減期を有したことが見出された。
ヒトFcRn、マウスFcRn、及びカニクイザルFcRnの精製
ヘキサヒスタグ付きタンパク質を含有する澄んだ上清を、Ni-NTA親和性クロマトグラフィー樹脂(Qiagen, Hanbrechtikon, Switzerland)に、4℃でロードした。500mM NaClを含む20mM リン酸ナトリウムバッファー、pH7.4と、100mM イミダゾールを含有する20mM リン酸ナトリウムバッファーとのそれぞれによる洗浄工程後、タンパク質を、2mL/分の流速において、300mM イミダゾールを含有する同じバッファーによるバッチ溶出を使用して、AKTA Primクロマトグラフィーシステム(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)で溶出した。画分をプールし、500mM NaClを含有するリン酸ナトリウムバッファー中において、サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex(商標) 200, GE Healthcare, Zurich, Switzerland)で更に精製した。精製タンパク質を、Nanodrop分光計(Nanodrop Technologies, Wilmington, DE)を使用して定量し、SDS PAGEにより、MESバッファー中でのNuPAGE 4~12% Bis-Trisゲルにおいて、変性及び還元条件下で分析した。
マウス及びカニクイザルFcRn親和性カラムクロマトグラフィー
下記表16に、カニクイザル由来のFcRnを含む親和性カラムでの例示的なヒト抗体の保持時間を提供する。データを、下記条件を使用して得た。溶出バッファー:20mM TRIS/HCl、150mM NaCl、pH8.5。更なる説明は、実施例2を参照のこと。YTE-突然変異体という用語は、三重突然変異体M252Y/S254T/T256Eを意味する。
抗体フラグメントの生成
F(ab’)2フラグメント及びFc領域フラグメントを、抗体50μg当たりに1μg IdeSシステインプロテアーゼを加え、37℃で2時間インキュベーションすることにより、100mM Tris(pH8.0)で1:1希釈した全長抗体を開裂させて調製した。得られた開裂生成物であるF(ab’)2及びFcを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラム(Superdex 200, GE Healthcare, Zurich, Switzerland)において、AKTA Explorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)で分離し、ピーク画分をプールした。2つ開裂生成物をその保持時間に基づいて特定するのに、分子量標準を同じカラムに供給した。
ヒトFcRnマウスにおける薬物動態研究
全ての手法を、実験動物ケア評価認証協会(www.aaalac.org)のガイドラインに従って行った。この研究は、Regional Council of Oberbayern, Germanyにより承認された。
ヒトFcRnマウスにおける薬物動態研究
全ての手法を、実験動物ケア評価認証協会(www.aaalac.org)のガイドラインに従って行った。この研究は、Regional Council of Oberbayern, Germanyにより承認された。
FcRnノックアウトマウスにおける10mg/kg ブリアキヌマブのi.v.投与後の各サンプリング時点の血清濃度。ADA-陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤/ADA免疫複合体の形成について、それぞれ*及び**として示す。
血清濃度を、1群当たりに6匹の動物に対する、10mg/kgの単回用量i.v.注射の投与後に決定する。ADA-陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤/ADA免疫複合体の形成について、それぞれ*及び**として示す。
血清濃度を、1群当たりに6匹の動物に対する、10mg/kgの単回用量i.v.注射の投与後に決定する。ADA-陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤/ADA免疫複合体の形成について、それぞれ*及び**として示す。
血清濃度を、1群当たりに6匹の動物に対する、10mg/kgの単回用量i.v.注射の投与後に決定する。ADA-陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤/ADA免疫複合体の形成について、それぞれ*及び**として示す。
血清濃度を、1群当たりに6匹の動物に対する、10mg/kgの単回用量i.v.注射の投与後に決定する。ADA-陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤/ADA免疫複合体の形成について、それぞれ*及び**として示す。
血清濃度を、1群当たりに6匹の動物に対する、10mg/kgの単回用量i.v.注射の投与後に決定する。ADA-陽性サンプルを、中程度及び高度な薬剤/ADA免疫複合体の形成について、それぞれ*及び**として示す。
Claims (9)
- 下記工程:
ii)第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
v)正の線形pH勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vi)高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程
を含む、
抗体を選択する方法であって、
該方法は、IgG1、IgG3、又はIgG4サブクラスの抗体と比較して増大している相対的in vivo半減期を有する抗体を選択するためのものであり、
v)及びvi)において、更に、参照抗体又は参照Fc領域の保持時間を決定し、
a)参照抗体の第1の保持時間より長い第1の保持時間を有し、第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じで、参照抗体の保持時間より長い保持時間を有する抗体
を選択することによる、方法(但し、工程ii)を含む場合に、a)を選択することによる態様を除く)。 - 下記工程:
ii)第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
v)正の線形pH勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vi)高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程
を含む、
抗体を選択する方法であって、
該方法は、参照抗体に対する抗体のin vivo半減期の相対的増大又は減少を決定するためのものであり、
v)及びvi)において、更に、参照抗体又は参照Fc領域の保持時間を決定し、
ii)、v)、及びvi)において、更に、突然変異N434Aを有するIgG Fc領域の保持時間を決定し、
a)参照抗体の第1の保持時間より長い第1の保持時間を有し、実質的に同じである第1の保持時間と第2の保持時間を有し、突然変異N434Aを有するFc領域の保持時間より短い第1の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に増大したin vivo半減期を有する抗体を選択することによるか、又は
c)参照抗体の第1の保持時間より短い第1の保持時間を有し、実質的に同じである第1の保持時間と第2の保持時間を有する抗体を選択することにより、相対的に減少したin vivo半減期を有する抗体を選択することによる、方法(但し、工程ii)を含む場合に、a)を選択することによる態様を除く)。 - 下記工程:
ii)第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
v)正の線形pH勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vi)高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程
を含み、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、
抗体を選択する方法であって、
線形塩勾配が、0mMの塩~250mMの塩である、方法(但し、工程ii)を含む場合に、a)を選択することによる態様を除く)。 - 下記工程:
ii)第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
v)正の線形pH勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vi)高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程
を含み、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、
抗体を選択する方法であって、
第1のpH値が、約5.5である、方法(但し、工程ii)を含む場合に、a)を選択することによる態様を除く)。 - 下記工程:
ii)第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
v)正の線形pH勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vi)高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程
を含み、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、
抗体を選択する方法であって、
第2のpH値が、約7.4である、方法(但し、工程ii)を含む場合に、a)を選択することによる態様を除く)。 - 下記工程:
ii)第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
v)正の線形pH勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vi)高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程
を含み、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、
抗体を選択する方法であって、
高pH値が、約pH7.4である、方法(但し、工程ii)を含む場合に、a)を選択することによる態様を除く)。 - 下記工程:
ii)第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
v)正の線形pH勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vi)高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程
を含み、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、
抗体を選択する方法であって、
実質的に異なる保持時間が、少なくとも5%異なる、方法(但し、工程ii)を含む場合に、a)を選択することによる態様を除く)。 - 下記工程:
ii)第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
v)正の線形pH勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vi)高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程
を含み、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、
抗体を選択する方法であって、
実質的に同じ保持時間が、3.5%以下で異なる、方法(但し、工程ii)を含む場合に、a)を選択することによる態様を除く)。 - 下記工程:
ii)第1のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第1の保持時間を決定し、第2のpH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及び参照抗体の第2の保持時間を決定する工程、又は
v)正の線形pH勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程、又は
vi)高pH値での線形塩勾配溶出によるFcRnアフィニティークロマトグラフィーカラムでの抗体及びそのFc領域の保持時間を決定する工程
を含み、
a)第2の保持時間と実質的に同じ第1の保持時間を有する抗体、又は
c)そのFc領域の保持時間と実質的に同じ保持時間を有する抗体
を選択することによる、
抗体を選択する方法であって、
保持時間が実質的に異なる場合、保持時間が、塩濃度の平方根上の1に比例する(~1/SQRT(c(salt)))、方法(但し、工程ii)を含む場合に、a)を選択することによる態様を除く)。
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