CN106999580B

CN106999580B - 对fap和dr5特异性的双特异性抗体和化疗剂的组合疗法

Info

Publication number: CN106999580B
Application number: CN201580054051.5A
Authority: CN
Inventors: T·弗里斯; O·柯莱特; M·马耶迪; K·瓦尔塔
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2014-10-08
Filing date: 2015-10-06
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2035-10-06
Also published as: US20180064808A1; SG11201702805TA; AU2015330087A1; JP2018502822A; KR20170063946A; JP6810687B2; CA2962124A1; RU2017116020A; IL251203A0; JP2021008476A; CN106999580A; ZA201702050B; WO2016055432A3; EP3204412A2; MX2017004526A; WO2016055432A2; BR112017006468A2; RU2017116020A3; EP3204412B1

Abstract

本发明涉及包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的双特异性抗体，对DR5特异性的抗体，特别是采用此类双特异性抗体和化疗剂的组合疗法，及这些组合疗法用于治疗癌症的用途。

Description

对FAP和DR5特异性的双特异性抗体和化疗剂的组合疗法

发明领域

本发明涉及采用包含对死亡受体5(DR5)特异性的第一抗原结合位点和对成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性的第二抗原结合位点的双特异性抗体和化疗剂的组合疗法，及这些组合疗法用于治疗癌症的用途。

发明背景

单克隆抗体是癌症治疗中有力的治疗剂，因为它们选择性靶向癌症细胞上差异表达的抗原。用激动性单克隆抗体靶向癌细胞上的TRAIL(TNF相关凋亡诱导性配体)死亡受体代表新一代单克隆抗体疗法，因为它们能够直接诱导靶定细胞凋亡。

在结合TRAIL后，TNFR-SF家族的死亡受体诸如DR4和DR5变成三聚化。三聚化诱导外在的凋亡途径和复杂的事件级联，包括胱天蛋白酶活化，其最终导致杀死靶细胞。如果发生DR5超聚簇(即多个三聚体聚簇)的话，凋亡诱导得到进一步增强。虽然死亡受体在多种细胞类型上广泛表达，但是经外在途径的凋亡诱导局限于肿瘤细胞。既然激动性DR4或DR5结合抗体能够交联死亡受体及由此诱导凋亡，那么这些受体就是癌症疗法中感兴趣的靶物。至少八种死亡受体靶向性分子进入了临床开发且已经在临床试验中评估不同适应症的可能治疗，诸如晚期实体瘤，像结直肠或肺癌。另外，已经尝试治疗其它适应症，诸如淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

US 2007/0031414和WO2006/083971中记载的完全人的DR5激动性抗体Drozitumab在高浓度在交联缺失下显示一些体外凋亡活性。然而，体内数据揭示了一种不同的作用模式：在FcγR突变型小鼠中(或当使用FcγR结合受到抑制的抗体变体时)，Drozitumab没有活性，指示这种分子的体内活性主要依赖于FcγR介导的交联。这种分子测试到临床II期，看来是安全的(直到20mg/kg没有达到MTD)，但是没有展现任何显著功效。

EP1922337A中记载的Conatumumab是另一种完全人的DR5激动性抗体。Conatumumab的活性严格依赖于经Fc受体的交联。与Drozitumab形成对比，这种抗体是非配体阻断性的。同样，这种分子在临床试验中只显示非常有限的功效。

嵌合DR5抗体LBY-135展现就交联依赖性活性和非配体阻断性特性而言与Conatumumab类似的特征，而且在单一疗法中没有展现任何显著功效。另外，LBY-135在部分登记I期试验的患者中显示免疫原性的迹象。

DR4和DR5(TRAIL)的重组生产天然配体Dulanermin在临床试验中只显示有限的客观响应。天然配体的使用不知何故是不利的：TRAIL靶向多种受体，包括死亡受体和诱饵受体二者，因此，选择性堪忧。另外，TRAIL具有与单克隆抗DR抗体相比短得多的血液半衰期，这个因素影响剂量和时间表参数。与单克隆抗DR抗体相比，TRAIL很短的血液半衰期要求大和频繁的剂量。另外，重组TRAIL的生产非常困难且冗长。

上文所述三种DR5激动性抗体和配体的开发均已中止。

另外两种完全人的抗体，Mapatumumab(抗DR4)和Lexatumumab(抗DR5)，仍在开发中，虽然这些分子也没有在单一疗法中展现有希望的功效。

Tigatuzumab是一种人源化DR5激动性抗体，据记载在体外在次级交联缺失下(在低浓度已经)有活性，这当然带来系统性毒性问题的风险。然而，正如所有其它记载的激动性DR5抗体，这种分子也至今没有在I/II期研究中展现令人信服的功效，而且最大耐受剂量MTD证明只有8mg/kg。

用分子TAS266，一种四聚体DR5结合性纳米抗体(WO2011/098520)，从事通过靶向死亡受体来诱导凋亡的一种不同办法。由于DR5结合模块的四价构造，认为DR5交联与标准二价抗体相比升高，这可导致活性升高。然而，由于它们的尺寸较小，这些分子具有(与抗体相比)半衰期相当短的缺点。另外，既然这种四聚体分子没有靶向肿瘤，那么系统性毒性的风险升高。

本申请的发明人已经将在双特异性抗体平台中组合DR5抗体Drozitumab与肿瘤抗原结合模块或肿瘤周围的基质中存在的抗原描述为实现两项效果的一种新办法：第一，可以将DR5结合抗体靶向肿瘤部位，这可避免潜在的系统性毒性问题(尤其当使用展现交联不依赖性活性的DR5抗体时)。第二，这种肿瘤或肿瘤基质靶向性模块然后也充当交联单元来诱导DR5超聚簇和随后的肿瘤部位特异性凋亡。已经使用靶向不同肿瘤类型的Drozitumab_scFv融合分子证明了基本概念(参见WO 2011/039126)。

已经提议能够结合DR5和人成纤维细胞活化蛋白(FAP；GenBank登录号AAC51668)的双特异性抗体。人FAP最初是使用单克隆抗体(mAb)F19(记载于WO 93/05804，ATCC编号HB8269)在培养的成纤维细胞中鉴定的。在数个物种中发现了该蛋白质的同系物，包括小鼠(Niedermeyer et al.，Int J Cancer 71，383-389(1997)；Niedermeyer et al.，Eur JBiochem 254，650-654(1998)；GenBank登录号AAH19190)。FAP具有独特的组织分布：发现它的表达在超过90％的所有原发性和转移性上皮肿瘤，包括肺，结直肠，膀胱，卵巢和乳腺癌的反应性基质成纤维细胞上高度上调，而它通常在正常成年组织中缺失(Rettig et al.，Proc Natl Acad Sci USA 85，3110-3114(1988)；Garin-Chesa et al.，Proc Natl AcadSci USA 87，7235-7239(1990))。后续报告显示FAP不仅在基质成纤维细胞中表达，而且在一些类型的上皮起源的恶性细胞中表达，而且FAP表达与恶性表型直接相关(Jin et al.，Anticancer Res 23，3195-3198(2003))。

上文所述常规DR5靶向性分子的活性依赖于Fc受体(FcR)介导的超聚簇，而且受肿瘤中的免疫浸润和活化状态影响(Li和Ravetch，PNAS 2012；Wilson，Cancer Cell 2011；WO2011/098520)。Fc/FcR相互作用可受生理性人IgG水平削弱。因此，常规DR5靶向性分子的活性常常限于少数浸润细胞(Moessner，Blood 2010)。通过使用靶向DR5和FAP二者的双特异性抗体，敏感性肿瘤细胞的百分比可通过经FAP的超交联显著增大，而且针对DR5激动剂的内在抗性的风险降低。新颖的DR5结合模块只在与FAP交联后有活性，这可导致与DR5结合物Drozitumab和Tigatuzumab相比改善的安全性和毒性概况。至今已经测试的DR5激动剂在临床中是安全的，然而这些临床程序受到DR5靶向性分子的低功效阻碍。

找到使用DR5激动性抗体靶向癌症的有效疗法仍然是本领域的一个问题。

发明概述

宽泛地，本发明涉及组合死亡受体5(DR5)靶向性抗原结合位点与靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)的第二抗原结合位点的双特异性抗体及它们与别的化疗剂组合的用途。依照本发明采用的双特异性抗体使得死亡受体变成交联的且对靶定的肿瘤细胞诱导凋亡。胜过常规死亡受体靶向性抗体的优势在于只在表达FAP的部位诱导凋亡的特异性以及这些双特异性抗体因诱导DR5超聚簇所致的更高效力。

因而，在一个方面，本发明提供一种供作为组合疗法在治疗癌症的方法中使用的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体，其中该双特异性抗体与选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂，Bcl-2抑制剂，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂组合使用。

优选地，该化疗剂选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，异磷酰胺或抗VEGF抗体。在一个实施方案中，该双特异性抗体与伊立替康组合使用。在一个此类实施方案中，要治疗的癌症为结直肠癌。在一个实施方案中，该双特异性抗体与抗VEGF抗体组合使用。在一个此类实施方案中，要治疗的癌症为结直肠癌。在一个实施方案中，该双特异性抗体与多柔比星组合使用。在一个此类实施方案中，要治疗的癌症为肉瘤。在一个实施方案中，该双特异性抗体与多柔比星异磷酰胺组合使用。在一个此类实施方案中，要治疗的癌症为肉瘤。

在一个实施方案中，该双特异性抗体与吉西他滨和Abraxane组合使用。在一个此类实施方案中，要治疗的癌症为胰腺癌。

在一个实施方案中，该MDM2抑制剂为RG7388。

在一个实施方案中，该Bcl-2抑制剂为ABT199。

在一个实施方案中，该PARP抑制剂为PJ34。

在一个实施方案中，该PARP抑制剂为Olaparip。

在一个实施方案中，本发明提供一种供作为组合疗法在治疗癌症的方法中使用的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体，其中该癌症为结直肠癌，肉瘤，头和颈癌，鳞状细胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌和间皮瘤。

在一个实施方案中，该癌症为结直肠癌。

在一个实施方案中，该肉瘤为软骨肉瘤，平滑肌肉瘤，胃肠基质肿瘤，纤维肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤或恶性纤维组织细胞瘤。

在一个实施方案中，本发明提供一种供作为组合疗法在治疗癌症的方法中使用的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体，其中该双特异性抗体和化疗剂一起施用，任选作为组合配制剂。

在一个实施方案中，该双特异性抗体和该化疗剂交替施用。

在一个实施方案中，该化疗剂在该双特异性抗体之前施用。

在一个实施方案中，该化疗剂在该双特异性抗体之后施用。

在一个实施方案中，该组合以约一周至三周的间隔施用。

在一些实施方案中，本发明采用一种双特异性抗体，其中对DR5特异性的抗原结合位点包含：

(a)SEQ ID NO.:1的重链CDR1；

(b)SEQ ID NO.:2的重链CDR2；

(c)SEQ ID NO.:3的重链CDR3；

(d)SEQ ID NO.:4的轻链CDR1；

(e)SEQ ID NO.:5的轻链CDR2；和

(f)SEQ ID NO.:6的轻链CDR3。

在一些实施方案中，本发明采用一种双特异性抗体，其中对FAP特异性的抗原结合位点包含：

(a)SEQ ID NO.:9的重链CDR1；

(b)SEQ ID NO.:10的重链CDR2；

(c)SEQ ID NO.:11的重链CDR3；

(d)SEQ ID NO.:12的轻链CDR1；

(e)SEQ ID NO.:13的轻链CDR2；和

(f)SEQ ID NO.:14的轻链CDR3。

在一个实施方案中，该双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含下述氨基酸序列的可变重链和可变轻链：SEQ ID NO.:7和SEQ ID NO.:8。

在一些实施方案中，本发明，该双特异性抗体包含对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含选自下组的氨基酸序列的可变重链和可变轻链：SEQ ID NO.:15和SEQ ID NO.:16。

在一些实施方案中，本发明，该双特异性抗体包含对DR5特异性的抗原结合位点，其包含：(a)SEQ ID NO.:1的重链CDR1；(b)SEQ ID NO.:2的重链CDR2；(c)SEQ ID NO.:3的重链CDR3；(d)SEQ ID NO.:4的轻链CDR1；(e)SEQ ID NO.:5的轻链CDR2；(f)SEQ ID NO.:6的轻链CDR3，和对FAP特异性的抗原结合位点，其包含：(a)SEQ ID NO.:9的重链CDR1；(b)SEQ ID NO.:10的重链CDR2；(c)SEQ ID NO.:11的重链CDR3；(d)SEQ ID NO.:12的轻链CDR1；(e)SEQ ID NO.:13的轻链CDR2；(f)SEQ ID NO.:14的轻链CDR3。

在一个实施方案中，该双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQ ID NO.:7的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO.:8的氨基酸序列的可变轻链，和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。

在一些实施方案中，本发明，该双特异性抗体包含SEQ ID NO:18，19和20的氨基酸序列，或者该双特异性抗体包含SEQ ID NO:17，19和20的氨基酸序列

在本发明的所有方面，有利的是，所述双特异性抗体是人的或人源化的。

在一些实施方案中，该双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段。

在一些实施方案中，该双特异性抗体包含一个Fc域，两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段。

在一些实施方案中，该双特异性抗体对DR5和FAP二者是二价的。

在一些实施方案中，该双特异性抗体包含一个或多个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区是交换的。

在一些实施方案中，该双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

在一些实施方案中，该双特异性抗体包含：

a)一个Fc域，

b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至该Fc域的第一或第二亚基，

c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中该两个Fab片段在可变重链(VH)的N末端处连接至该Fc域的第一或第二亚基。

在一个实施方案中，至少一个所述Fab片段经肽接头连接至该Fc域。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fc域，其包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代。在一个实施方案中，所述一处或多处氨基酸替代在一个或多个选自下组的位置：L234，L235，和P329。在一个实施方案中，该Fc域的每个亚基包含三处消除对活化性或抑制性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G。

在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述双特异性抗体和选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂，Bcl-2抑制剂，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂。在一个实施方案中，该药物组合物包含本文所述双特异性抗体，吉西他滨和帕利他赛或Abraxane。

在一个实施方案中，该MDM2抑制剂为RG7388。

在一个实施方案中，该Bcl-2抑制剂为ABT199。

在一个实施方案中，该PARP抑制剂为PJ34。

在一个实施方案中，该PARP抑制剂为Olaparip。

在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述双特异性抗体和选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂。

在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述双特异性抗体和伊立替康。

在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述双特异性抗体，帕利他赛和吉西他滨或Abraxane。

在又一个方面，本发明提供结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和化疗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该双特异性抗体与选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂，Bcl-2抑制剂ABT199，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂组合使用。在一个方面，本发明提供结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体，帕利他赛和Abraxane的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

在又一个方面，本发明提供结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和化疗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该双特异性抗体与选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂RG7388，Bcl-2抑制剂ABT199，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂PJ34，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂组合使用。

在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：

(i)第一容器，装有包含本文所述双特异性抗体的组合物；和

(ii)第二容器，装有包含选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂，Bcl-2抑制剂，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂的组合物。

在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：

(i)第一容器，装有包含本文所述双特异性抗体的组合物；和

(ii)第二容器，装有包含选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂RG7388，Bcl-2抑制剂ABT199，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂PJ34，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂的组合物。

在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：

(i)第一容器，装有包含本文所述双特异性抗体的组合物；和

(ii)第二容器，装有Abraxane；和

(iii)第三容器，装有吉西他滨。

在又一个方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法，其包括作为组合配制剂或交替地将治疗剂组合施用于哺乳动物，其中该治疗剂组合包含治疗有效量的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和治疗有效量的选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂，Bcl-2抑制剂，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂。

在又一个方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法，其包括作为组合配制剂或交替地将治疗剂组合施用于哺乳动物，其中该治疗剂组合包含治疗有效量的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和治疗有效量的选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂RG7388，Bcl-2抑制剂ABT199，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂PJ34，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂。

在又一个方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法，其包括作为组合配制剂或交替地将治疗剂组合施用于哺乳动物，其中该治疗剂组合包含治疗有效量的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和治疗有效量的Abraxane和治疗有效量的吉西他滨。

在一些实施方案中，该癌症为结直肠癌，肉瘤，头和颈癌，鳞状细胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，结缔组织增生性黑素瘤和间皮瘤。在一个实施方案中，该癌症为结直肠癌。在其它实施方案中，该肉瘤为软骨肉瘤，平滑肌肉瘤，胃肠基质肿瘤，纤维肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤或恶性纤维组织细胞瘤。

在一些实施方案中，该双特异性抗体和该化疗剂一起施用，任选作为组合配制剂。或者，该双特异性抗体和该化疗剂可以交替施用，或是该化疗剂在该双特异性抗体之前施用，或是该化疗剂在该双特异性抗体之后施用。该组合可以依照临床实践来施用，例如以约一周至三周的间隔施用。

现在会参考附图通过举例而非限制的方式描述本发明的实施方案。然而，鉴于本公开文本，本发明的各种别的方面和实施方案对于本领域技术人员会是显而易见的。

“和/或”在本文中使用时要视为具体公开两个规定特征或组件的每一个，具有或没有另一个。例如，“A和/或B”要视为具体公开(i)A，(ii)B和(iii)A和B中的每一个，就像在本文中单独列出每一个一样。

除非上下文另有规定，上文列出的特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方案，而且同等地应用于所描述的所有方面和实施方案。

附图简述

图1。FAP-DR5双特异性抗体分子设计和作用模式的示意性呈现。

图2。对于单独的和与10μM伊立替康组合的多种浓度的DR5抗体+FC，3天时HT29CRC细胞的％抑制(细胞存活力测定法)的图。

图3。对于单独的和与20nM Abraxane(Nab-帕利他赛)组合的多种浓度的DR5抗体+FC，3天时BxPC3细胞的％抑制(细胞存活力测定法)的图。

图4。对于单独的和与20nM硼替佐米组合的多种浓度的DR5抗体+FC，3天时Capan2PDAC细胞的％抑制(细胞存活力测定法)的图。

图5。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(1和10mg/kg)或Drozitumab LALA(10mg/kg)任一处理的携带DLD-1CRC异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。第9至20天动物用DR5-FAP双特异性抗体处理4次，并用Drozitumab LALA处理一周一次。DR5-FAP处理的肿瘤生长抑制分别计算为89％(10mg/kg)和79％(1.0mg/kg)。

图6。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)，伊立替康(15mg/kg)或DR5-FAP双特异性抗体和伊立替康的组合任一处理的携带DLD-1CRC异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物用DR5-FAP双特异性抗体一周一次处理5次，并每5天用伊立替康处理总共3次。DR5-FAP和伊立替康组合处理的肿瘤消退计算为72％。

图7。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)，伊立替康(15mg/kg)或平行或顺序应用的DR5-FAP双特异性抗体和伊立替康的组合任一处理的携带DLD-1CRC异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物自第7天起一周一次用DR5-FAP双特异性抗体静脉内处理5次(第7，14，21，28，35天)，并5天每天用伊立替康腹膜内处理总共3个周期(第7-11，19-23，33-36天)

图8。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)，伊立替康(15mg/kg)或DR5-FAP双特异性抗体和伊立替康的组合任一处理的携带HCT116CRC异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物自第7天起一周一次用DR5-FAP双特异性抗体处理3次，并每5天用伊立替康处理总共2次。DR5-FAP处理的肿瘤生长抑制计算为46％，而且含伊立替康的组合诱导肿瘤消退(TGI>100％)。

图9。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)，奥沙利铂(5mg/kg)或DR5-FAP双特异性抗体和奥沙利铂的组合任一处理的携带HCT116CRC异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物自第7天起一周一次用DR5-FAP双特异性抗体处理3次(第7，14，21天)，并用奥沙利铂腹膜内处理总共2个周期(第7-10，21-23天)。DR5-FAP和奥沙利铂组合处理的肿瘤生长抑制计算为67％。

图10。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)或Drozitumab LALA(10mg/kg)任一处理的携带LOX-IMVI结缔组织增生性黑素瘤异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物第13至20天用DR5-FAP双特异性抗体或Drozitumab LALA处理两次。DR5-FAP处理的肿瘤生长抑制计算为超过100％，而Drozitumab LALA处理计算为65％。

图11。用媒介或DR5-FAP双特异性抗体(30mg/kg)任一处理的携带患者衍生Co5896CRC异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物第18至34天用DR5-FAP双特异性抗体处理6次。DR5-FAP处理的肿瘤生长抑制计算为76％。

图12。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(30mg/kg)，伊立替康(15mg/kg)或DR5-FAP双特异性抗体和伊立替康的组合任一处理的携带患者衍生Co5896 CRC异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物一周一次用DR5-FAP双特异性抗体处理4次，并第15-19天用伊立替康处理。DR5-FAP和伊立替康组合处理在所有动物中导致完全肿瘤消退(10/10)。

图13。显示携带患者衍生Co5896 CRC异种移植物的小鼠中的FAP+基质的IHC图像。

图14。用媒介或DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)任一处理的携带患者衍生Sarc4605肉瘤异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物第10至31天用DR5-FAP双特异性抗体处理4次。DR5-FAP处理的肿瘤生长抑制计算为超过100％。

图15。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)，Ang2/VEGF双特异性抗体(10mg/kg)或DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)和Ang2/VEGF双特异性抗体(10mg/kg)的组合任一处理的携带DLD-1CRC异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。两种抗体均在第8，15和22天一周一次给予。虽然DR5-FAP抗体作为单一药剂的处理导致显著的肿瘤生长抑制(TGI 87％)，含抗Ang/VEGF单抗的组合具有叠加的功效并将肿瘤生长抑制提高至94％。单独的Ang2/VEGF抗体处理以75％抑制肿瘤生长。

图16。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)或多柔比星(5mg/kg)或DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)和多柔比星(5mg/kg)的组合任一处理的携带LOX-IMVI结缔组织增生性黑素瘤异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物第8至15天用DR5-FAP双特异性抗体或组合处理两次。虽然DR5-FAP抗体(10mg/kg，第8和15天)作为单一药剂的处理导致肿瘤停滞(TGI 97％)，含多柔比星的组合具有大于叠加的功效并引起明显的肿瘤消退(93％)。单独的多柔比星处理以77％抑制肿瘤生长。

图17。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)，多柔比星(5mg/kg)，或DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)和多柔比星(5mg/kg)的组合任一处理的携带患者衍生Sarc4605肉瘤异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物第20至41天用DR5-FAP双特异性抗体或组合处理4次。虽然DR5-FAP抗体(10mg/kg，第20，27，34和41天)作为单一药剂的处理导致肿瘤停滞(TGI 99％)，含多柔比星的组合具有大于叠加的功效并引起明显的肿瘤消退(83％)。单独的多柔比星处理以77％抑制肿瘤生长。

图18。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)，吉西他滨(40mg/kg)，吉西他滨(40mg/kg)和nab-帕利他赛(6mg/kg)，或DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)和吉西他滨(40mg/kg)和nab-帕利他赛(6mg/kg)的组合任一处理的携带患者衍生PA1178PDAC异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物第32至81天用DR5-FAP双特异性抗体或组合处理7次。虽然DR5-FAP抗体作为单一药剂的处理导致96％的肿瘤生长抑制，三重组合是有效的，实现完全肿瘤消退。

图19。用媒介，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)，异磷酰胺(100mg/kg)，或DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)和异磷酰胺(100mg/kg)的组合任一处理的携带患者衍生Sarc4605肉瘤异种移植物的小鼠中体内中值肿瘤体积随时间的变化的图。动物第20至41天用DR5-FAP双特异性抗体或组合处理4次，DR5-FAP双特异性抗体(10mg/kg)与烷化药物异磷酰胺(100mg/kg，q7dx2)组合。单独的DR5-FAP抗体(10mg/kg，q7dx8)处理导致较强的肿瘤消退(96％及80％无肿瘤)，而含异磷酰胺的组合具有略微更高的功效(86％无肿瘤)。另外，组合中的肿瘤消退的动力学更快。

图20。在用单一药剂双特异性DR5-FAP抗体(10mg/kg；DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)处理之后的Luminex数据。双特异性DR5-FAP抗体针对DLD-1/3T3异种移植物诱导较强的时间相关肿瘤细胞凋亡。在抗体处理之后不久(6小时)观察到较强的效果。

图21。在用单一药剂双特异性DR5-FAP抗体(10mg/kg；DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)或与多柔比星(10mg/kg)组合处理之后的Luminex数据。双特异性DR5-FAP抗体以时间相关方式强烈诱导肿瘤细胞凋亡。双特异性DR5-FAP抗体与多柔比星一起的组合处理的肿瘤细胞凋亡诱导是卓越的。A：诱导受到切割的胱天蛋白酶-3(效应器胱天蛋白酶)的分析。B：诱导活化的胱天蛋白酶-8(外在的凋亡途径)的分析。C：诱导活化的胱天蛋白酶-9(内在的凋亡途径)的分析。

图22。在用单一药剂双特异性DR5-FAP抗体(10mg/kg；DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)或与伊立替康(15mg/kg)或奥沙利铂(5mg/kg)组合处理之后的Luminex数据。双特异性DR5-FAP抗体以时间相关方式强烈诱导肿瘤细胞凋亡。双特异性DR5-FAP抗体与伊立替康或奥沙利铂一起的组合处理的肿瘤细胞凋亡诱导是卓越的。A：诱导受到切割的PARP的分析。B：诱导胱天蛋白酶-3(效应器胱天蛋白酶)的分析。C：诱导活化的胱天蛋白酶-9(内在的凋亡途径)的分析。D：诱导活化的胱天蛋白酶-8(外在的凋亡途径)的分析。

发明详述

I.定义

出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少，9或更少，8或更少，7或更少，6或更少，5或更少，4或更少，3或更少，或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。

“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。

“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。

术语“特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体”指如下的双特异性抗体，其能够以足够亲和力结合DR5和FAP，使得该抗体可用作靶向表达DR5和FAP的细胞的诊断剂和/或治疗剂。具体而言，“特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体”指靶向肿瘤细胞上的DR5和所述肿瘤周围的基质中的FAP的双特异性抗体。在一个实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体结合无关非FAP或非DR5蛋白质的程度小于该抗体对DR5或FAP的结合的约10％，如例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)，基于表面等离振子共振(SPR)的测定法(例如Biacore)或流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10^-8M或更少，例如10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^- ¹³M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体结合在来自不同物种的DR5或FAP间保守的DR5或FAP表位。优选地，所述双特异性抗体结合人和猕猴DR5及人，猕猴和小鼠FAP。

术语“特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体”指如下的抗体，其能够以足够亲和力结合DR5，使得该抗体可用作靶向表达DR5的细胞的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体结合无关非DR5蛋白质的程度小于该抗体对DR5的结合的约10％，如例如通过放射免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM，或≤0.001nM(例如10^-8M或更少，例如10^-8M至10^-13M，例如，10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_d)。在某些实施方案中，特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体结合在来自不同物种的DR5间保守的DR5表位。优选地，所述抗体结合人和猕猴DR5。术语“特异性结合死亡受体5(DR5)的抗体”还涵盖能够结合DR5和第二抗原的双特异性抗体。

本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中的如下部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv，Fab，Fab’，Fab’-SH，F(ab’)₂；双抗体；cross-Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，scFv抗体记载于Huston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96。另外，抗体片段包含具有VH域或VL域的特征(即能够与VL域或VH域一起装配成功能性抗原结合位点，并且由此提供全长抗体的抗原结合特性)的单链多肽。

如本文中使用的，“Fab片段”指包含轻链片段(其包含VL域和轻链恒定域(CL))及VH域和重链第一恒定域(CH1)的抗体片段。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含至少一个Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。由于可变区或恒定区任一的交换，所述Fab片段也称作“cross-Fab”片段或“xFab”片段或“交换Fab”片段。交换Fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，Fab重和轻链的可变区是交换的，即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的一条肽链及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的一条肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab_(VLVH)。另一方面，当Fab重和轻链的恒定区交换时，交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的一条肽链及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的一条肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab_(CLCH1)。包含交换Fab片段的双特异性抗体型式已有描述，例如在WO 2009/080252，WO 2009/080253，WO 2009/080251，WO 2009/080254，WO2010/136172，WO 2010/145792和WO 2013/026831中。

“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH)，抗体恒定域1(CH1)，抗体轻链可变域(VL)，抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头N端至C端方向具有下述次序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；且其中所述接头是至少30个氨基酸，优选介于32和50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1和d)VL-CH1-接头-VH-CL经CL域和CH1域之间的天然二硫键稳定化。另外，通过经插入半胱氨酸残基(例如可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100，依照Kabat编号方式)生成链间二硫键可以进一步稳定化这些单链Fab分子。术语“N端”表示N端最后一个氨基酸，术语“C端”表示C端最后一个氨基酸。

“融合”或“连接”表示各成分(例如Fab分子和Fc域亚基)是通过肽键相连接的，或是直接的或是经由一个或多个肽接头。

如本文中使用的，术语“接头”指肽接头且优选是具有长度为至少5个氨基酸，优选长度为5-100个，更优选10-50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(G_xS)_n或(G_xS)_nG_m，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3，4，5或6且m＝0，1，2或3)或(x＝4且n＝2，3，4或5且m＝0，1，2或3)，优选地x＝4且n＝2或3，更优选地x＝4且n＝2。在一个实施方案中，所述肽接头是(G₄S)₂。

术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称为可变重域或重链可变域，接着是3个恒定域(CH1，CH2和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻(CL)域(也称为轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称为α(IgA)，δ(IgD)，ε(IgE)，γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ₁(IgG₁)，γ₂(IgG₂)，γ₃(IgG₃)，γ₄(IgG₄)，α₁(IgA₁)和α₂(IgA₂)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。

与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。

术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含特异性结合部分或整个抗原并与部分或整个抗原互补的区域的部分。在抗原较大的情况中，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。

术语“嵌合”抗体指其中重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体，其通常通过重组DNA技术来制备。包含家兔可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是那些其中恒定区已经自初始抗体的恒定区修饰或改变以生成依照本发明的特性(特别地关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结合)的。此类嵌合抗体又称为“类转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。用于生成嵌合抗体的方法牵涉常规的重组DNA和基因转染技术，其是本领域中公知的。参见例如Morrison,S.L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专利No.5,202,238和5,204,244。

在用于本文时，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于：放射性同位素(例如At²¹¹，I¹³¹，I¹²⁵，Y⁹⁰，Re¹⁸⁶，Re¹⁸⁸，Sm¹⁵³，Bi²¹²，P³²，Pb²¹²和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)，阿霉素(adriamicin)，长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)，长春碱(vinblastine)，依托泊苷(etoposide))，多柔比星(doxorubicin)，美法仑(melphalan)，丝裂霉素(mitomycin)C，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌，真菌，植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。

“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。

如本文中使用的，术语“工程化”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列，糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰，以及这些办法的组合。

如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代，缺失，插入和修饰。可以进行取代，缺失，插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特性，例如降低的对Fc受体的结合，或与另一种肽的增加的联合。氨基酸序列缺失和插入包括氨基和/或羧基端缺失和氨基酸插入。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如Fc区的结合特征，特别优选非保守性的氨基酸替代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸，3-甲基组氨酸，鸟氨酸，高丝氨酸，5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变，PCR，基因合成等。通过与遗传工程化不同的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如，从Fc域第329位脯氨酸到甘氨酸的取代可指示为329G，G329，G₃₂₉，P329G或Pro329Gly。

药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。

本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称为EU索引，如记载于Kabat等,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991的。如本文中使用的，Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如，IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。

“促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或Fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的，具体地，促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个Fc域亚基的联合。例如，促进联合的修饰可以改变一种或两种Fc域亚基的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此，异二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生，其在融合至每个亚基的别的组分(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中，促进联合的修饰包含在Fc域中的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中，促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。

“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1，FR2，FR3，和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

术语“全长抗体”，“完整抗体”，和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fc区的重链的抗体。

术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”，和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。

“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。正如关于依照本发明的嵌合和人源化抗体也提及的，如本文中使用的，术语“人抗体”也包含恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性的此类抗体，尤其在C1q结合和/或FcR结合方面，例如通过“类转换”即Fc部分的改变或突变(例如自IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。

如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备，表达，创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或者自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或抗体而言转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然自人种系VH和VL序列衍生及与其相关，但可以不天然存在于体内的人抗体种系全集内的序列。

“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中的恒定区已经另外自初始抗体的恒定区进行过修饰或改变以生成依照本发明的特性(特别地关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结合)的。

在用于本文时，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1，H2，H3)，且三个在VL中(L1，L2，L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2和CDR-H3)存在于氨基酸残基24-34(L1)，50-56(L2)，89-97(L3)，31-35B(H1)，50-65(H2)，和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。高变区(HVR)也称作互补决定区(CDR)，而且这些术语在述及形成抗原结合区的可变区部分时在本文中可交换使用。此特定区域已由Kabat等,U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(1983)及由Chothia等,J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表A中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基编号将随着CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定CDR。

表A：CDR定义¹

CDR	Kabat	Chothia	AbM<sup>2</sup>
				V<sub>H</sub> CDR1	31-35	26-32	26-35
V<sub>H</sub> CDR2	50-65	52-58	50-58
				V<sub>H</sub> CDR3	95-102	95-102	95-102
V<sub>L</sub> CDR1	24-34	26-32	24-34
				V<sub>L</sub> CDR2	50-56	50-52	50-56
V<sub>L</sub> CDR3	89-97	91-96	89-97

¹表A中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等(见下文)提出的编号惯例。

²如表A中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。

Kabat等还定义针对可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员可以明确地将此“Kabat编号”系统用于任何可变区序列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等,U.S.Dept.of Health andHuman Services,“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。除非另外说明，提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号系统。

除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)存在于L1的氨基酸残基31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102(见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。

“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛，绵羊，猫，犬，和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)，家兔，和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如Flatman等,J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。

“分离的”的核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。

“编码特异性结合DR5和FAP的双特异性抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。

如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法，和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。

“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。

“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症，用法，剂量，施用，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。

“没有实质性交叉反应性”意指分子(例如，抗体)不识别或特异性结合与该分子的实际靶抗原不同的抗原(例如与靶抗原密切相关的抗原)，特别地在与该靶抗原相比时。例如，抗体可以结合少于约10％至少于约5％的与实际靶抗原不同的抗原，或者可以以由少于约10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.2％，或0.1％组成的量结合所述与实际靶抗原不同的抗原，优选地少于约2％，1％，或0.5％，且最优选地少于约0.2％或0.1％与实际靶抗原不同的抗原。

关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office,Washington D.C.,20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech,Inc.,South San Francisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)，与(with)，或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于，与，或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

术语“药物配制剂”指处于如下的制剂，其形式使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分。

“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂，赋形剂，稳定剂，或防腐剂。

如本文中使用的，术语“死亡受体5(DR5)”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然DR5，除非另外指明。该术语涵盖“全长”，未加工的DR5以及DR5因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖DR5的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。例示性人DR5的氨基酸序列披露于WO 2011/039126。

如本文中使用的，术语“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然FAP，除非另外指明。该术语涵盖“全长”，未加工的FAP以及FAP因细胞中的加工所致的任何形式。该术语还涵盖FAP的天然存在变体，例如剪接变体或等位变体。优选地，本发明的抗FAP抗体结合FAP的胞外域。例示性FAP多肽序列的氨基酸序列，包括人FAP的序列披露于WO 2012/020006。

在用于本文时，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生，减轻症状，减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。

如本文中使用的，术语癌症指增殖性疾病，诸如癌症为结直肠癌，肉瘤，头和颈癌，鳞状细胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌症，非小细胞肺癌，小细胞肺癌和间皮瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。在一个实施方案中，癌症为结直肠癌症，而且，任选的是，化疗剂为伊立替康。如本文中使用的，“肉瘤”指在结缔组织中生长的癌症类型。肉瘤包括胃肠基质肿瘤(在胃和肠中找到的一类软组织肉瘤，通常称作GIST)，软组织肉瘤(例如平滑肌肉瘤，成纤维细胞肉瘤，脂肪肉瘤，卡波西(Kaposi)氏肉瘤(KS)，血管肉瘤，恶性周围神经鞘瘤(MPNST)，滑膜肉瘤，横纹肌肉瘤)和骨的肉瘤(例如软骨肉瘤，骨肉瘤，尤因(Ewing)氏肉瘤，脊索瘤)。

在癌症为肉瘤的实施方案中，任选的是，肉瘤为软骨肉瘤，平滑肌肉瘤，胃肠基质肿瘤，纤维肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤或恶性纤维组织细胞瘤。

术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(见例如Kindt等Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman andCo.,第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano等,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等,Nature 352:624-628(1991)。

术语“抗体的抗原结合位点”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是可变域中那些与本文中定义的高变区残基不同的区。因此，抗体的轻和重链可变域自N至C端包含域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，和FR4。尤其地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大且限定抗体特性的区。CDR和FR区依照Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。

抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。依照本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体是对两种不同抗原特异性，即作为第一抗原的DR5和作为第二抗原的FAP。

如本文中使用的，术语“单特异性”抗体表示抗体具有一个或多个结合位点，每个结合相同抗原的相同表位。

如本文中使用的，术语“双特异性”抗体表示抗体具有至少两个结合位点，每个结合不同抗原或相同抗原的不同表位。

本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体指对至少两种不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。本文中提供双特异性抗体，其具有针对FAP和DR5的结合特异性。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合DR5的两种不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒剂定位于表达DR5的细胞。可以作为全长抗体或抗体片段制备双特异性抗体。

用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))，WO 93/08829，和Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))，和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；及使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；及如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。

本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576A1)。

本文中的抗体或片段还包括包含至少一个结合FAP或DR5以及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(参见例如US 2008/0069820)。

如本申请内使用的，术语“效价”或“价”表示抗体分子中存在指定数目的结合位点。如此，术语“二价”，“四价”，和“六价”分别表示抗体分子中存在两个结合位点，四个结合位点，和六个结合位点。依照本发明的双特异性抗体至少是“二价”的，而且可以是“三价”的或“多价”的(例如“四价”或“六价”)。

本发明的抗体具有两个或更多个结合位点且是双特异性的。就是说，该抗体可以是双特异性的，即使在有超过两个结合位点的情况中(即该抗体是三价或多价的)。本发明的双特异性抗体包括例如多价单链抗体，双抗体和三抗体，以及如下的抗体，该抗体具有全长抗体的恒定域结构，对其经一个或多个肽接头连接别的抗原结合位点(例如单链Fv，VH域和/或VL域，Fab，或(Fab)₂)。所述抗体可以是来自单一物种的全长，或者是嵌合化的或人源化的。

在用于本文时，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及并入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

如本本申请内使用的，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸组，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，脯氨酸(pro，P)，丝氨酸(ser，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)，和缬氨酸(val，V)。

如本文中所使用的，表述“细胞”，“细胞系”，和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不管传代的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容上可能不是正好相同的。包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。

如本文中所使用的，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在表面等离振子共振测定法(SPR,BIAcore,GE-Healthcare Uppsala,Sweden)中抗体对抗原的表位的结合。结合亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)，k_D(解离常数)，和K_D(k_D/ka)限定。结合或特异性结合意指10^-8mol/l或更小，优选10^-9M至10^-13M的结合亲和力(K_D)。

抗体对死亡受体的结合可以通过BIAcore测定法(GE-Healthcare Uppsala,Sweden)来调查。结合亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)，k_D(解离常数)，和K_D(k_D/ka)限定。

术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面聚组，诸如氨基酸，糖侧链，磷酰基，或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是抗原中被抗体结合的区域。

如本文中所使用的，认为特别地具有前缀“糖”的术语“工程化”或“工程化改造”及术语“糖基化工程”包括对天然存在的或重组的多肽或其片段的糖基化样式的任何操作。糖基化工程包括细胞的糖基化机制的代谢工程，包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化工程是糖基转移酶活性的变化。在一个具体的实施方案中，工程化改造导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。

II.组合物和方法

在一个方面，本发明基于包含对TRAIL死亡受体5(DR5)特异性的第一抗原结合位点和对成纤维细胞活化蛋白(FAP)特异性的第二抗原结合位点的双特异性抗体和别的化疗剂的治疗剂组合的用途，例如用于治疗癌症。

A.对FAP和DR5特异性的双特异性抗体的组合疗法

优选地，该化疗剂选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，异磷酰胺或抗VEGF抗体。在一个实施方案中，该化疗剂选自伊立替康，多柔比星或奥沙利铂。在一个实施方案中，该双特异性抗体与伊立替康组合使用。在一个实施方案中，该双特异性抗体与帕利他赛和吉西他滨组合使用。在一个实施方案中，该双特异性抗体与异磷酰胺组合使用。

伊立替康

是一种用于治疗癌症的药物。伊立替康通过抑制拓朴异构酶1来阻止DNA解开。伊立替康是天然生物碱喜树碱的一种半合成类似物，而且名称为[1,4’联哌啶]-1’-羧酸(S)-4,11-二乙基-3,4,12,14-四氢-4-羟基-3,14-二氧代1H-吡喃并[3’,4’:6,7]-中氮茚并[1,2-b]喹啉-9-基-酯。伊立替康具有结构：

多柔比星

是用于治疗一大批癌症的化疗剂。多柔比星插入DNA，导致抑制DNA合成；干扰拓朴异构酶2，阻止DNA复制和提高自由基的生成，促成它的细胞毒性。多柔比星是一种蒽环类抗生素，与天然的柔红霉素密切相关，而且名称为(7S,9S)-7-[(2R,4S,5S,6S)-4-氨基-5-羟基-6-甲基口恶烷-2-基]氧基-6,9,11-三羟基-9-(2-羟基乙酰基)-4-甲氧基-8,10-二氢-7H-并四苯-5,12-二酮。多柔比星具有结构：

奥沙利铂(

Sanofi)是一种用于治疗癌症，特别是结直肠癌的基于铂的化疗药物。在生理学溶液中，奥沙利铂经历非酶促转变，变成活性衍生物，并导致DNA交联，抑制DNA合成和转录。奥沙利铂名称为[(1R,2R)-环己烷-1,2-二胺](乙二酸合-O,O')铂(II)且具有结构：

5-FU(5-氟尿嘧啶)广泛用于治疗癌症。5-FU是尿嘧啶的一种类似物，运输入细胞中并转变成活性代谢物。这些代谢物破坏RNA合成并抑制酶胸苷酸合酶，阻断胸苷合成，胸苷是DNA复制和修复所必需的。5-FU的名称为5-氟-1H,3H-嘧啶-2,4-二酮且具有该结构：

MDM2抑制剂阻断p53-MDM2结合，导致p53途径激活，这导致细胞周期阻滞和/或凋亡。在一个实施方案中，MDM2抑制剂为RG7388。

MDM2抑制剂RG7388是小分子吡咯烷化合物，正在进行治疗癌症的临床调查(Dinget al.,J.Med.Chem.56(14):5979-5983,2013)。MDM2抑制剂RG7388的名称为4-((2R,3S,4R,5S)-3-(3-氯-2-氟苯基)-4-(4-氯-2-氟苯基)-4-氰基-5-新戊基吡咯烷-2-甲酰胺基)-3-甲氧基苯甲酸且具有结构：

在另一个实施方案中，MDM2抑制剂为MK-8242。其它MDM2抑制剂是本领域已知的且记载于例如Swatu Palit Deb and Sumitra Deb:Mutant p53and MDM2in Cancer,Subcellular Biochemistry 85,Springer(ISBN 978-94-017-9211-0)。

Bcl-2(B细胞淋巴瘤2)抑制剂靶向Bcl-2家族蛋白且旨在恢复癌细胞对促凋亡信号的敏感性。在一个实施方案中，Bcl-2抑制剂为ABT199。

Bcl-2抑制剂ABT199，也称作GDC-0199，是一种选择性抑制剂，正在进行治疗癌症的临床调查(Souers et al.,(2013)Nat.Med.19(2):202-208)。它设计成模拟Bcl-2蛋白上存在的BH3结构元件的结合，在凋亡的调节中是重要的。ABT199的名称为(4-(4-{[2-(4-氯苯基)-4,4-二甲基环己-1-烯-1-基]甲基}哌嗪-1-基)-N-({3-硝基-4-[(四氢-2H-吡喃-4-基甲基)氨基]苯基}磺酰基)-2-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-5-基氧基)苯甲酰胺)且具有结构：

紫杉烷(帕利他赛和abraxane)是自太平洋紫杉树Taxus brevifolia的小枝，针叶和树皮衍生的药物。它们已经在多种肿瘤类型中展现抗肿瘤活性。紫杉烷通过超稳定化微管的结构来干扰它们的生长来发挥功能，破坏细胞在细胞分裂期间使用它的细胞骨架的能力并导致异常细胞功能和最终细胞死亡。帕利他赛在称作Cremophor(蓖麻油的一种有毒衍生物)的溶剂中溶解，投递入细胞。清蛋白结合的帕利他赛(商品名Abraxane，也称作nab-帕利他赛)是一种备选配制剂，其中帕利他赛结合至清蛋白纳米颗粒，它是一种备选的，毒性较低的投递剂。帕利他赛的名称为5β,20-环氧基-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫衫-11-烯-9-酮4,10-二乙酸酯2-苯甲酸酯与(2R,3S)-N-苯甲酰基-3-苯基异丝氨酸的13-酯且具有结构：

硼替佐米

是一种用于治疗癌症的治疗性蛋白酶体抑制剂。也称作PS-341，硼替佐米特异性且可逆抑制26S蛋白酶体(一种涉及对癌细胞存活至关重要的多种蛋白的降解的酶复合物)的苏氨酸残基。抑制这些蛋白的降解使细胞对凋亡敏化。硼替佐米的名称为[(1R)-3-甲基-1-[(2S)-3-苯基-2-(吡嗪-2-基甲酰胺基)丙酰胺基]丁基]硼酸且具有结构：

吉西他滨

是一种杀死正在经历DNA合成的细胞的化疗剂。吉西他滨是一个核苷类似物，由核苷激酶代谢成二磷酸和三磷酸核苷。二磷酸吉西他滨抑制核糖核苷酸还原酶(DNA合成所需要的一种酶)，而三磷酸吉西他滨与脱氧胞苷竞争掺入DNA。吉西他滨的名称为4-氨基-1-(2-脱氧-2,2-二氟-β-D-赤式-呋喃戊糖基)嘧啶-2(1H)-酮且具有结构：

环巴胺是一种天然生物碱，正在作为潜在癌症治疗进行调查。hedgehog途径的不当激活与肿瘤形成和生长有关。环巴胺能够通过直接结合受体smoothened来破坏hedgehog信号传导途径来杀死癌细胞。环巴胺的名称为(3β,23R)-17,23-环氧基藜芦-3-醇且具有结构：

PARP抑制剂是酶聚ADP核糖聚合酶(PARP)的一组药理学抑制剂。

在一个实施方案中，PARP抑制剂为PJ34。

PARP抑制剂PJ34引起PARP1不依赖性，p21依赖性有丝分裂阻滞。参见Madison etal.,DNA Repair(Amst).2011Oct 10；10(10):1003-13.doi:10.1016/j.dnarep.2011.07.006.Epub 2011Aug 12。PJ34阻断PARP-1的活性，阻止含有受损DNA的细胞修复单链断裂并导致细胞死亡。PJ34的名称为盐酸N-(5,6-二氢-6-氧代-2-菲啶基)-2-乙酰胺且具有结构：

在一个实施方案中，PARP抑制剂为Olaparip。Olaparip是聚ADP核糖聚合酶(PARP)(一种涉及DNA修复的酶)的一种抑制剂。它在具有遗传性BRCA1或BRCA2突变的人中针对癌症起作用，这包括许多卵巢，乳腺和前列腺癌。Olaparip的名称为4-[(3-[(4-环丙基羰基)哌嗪-4-基]羰基)-4-氟苯基]甲基(2H)酞嗪-1-酮且具有结构：

异磷酰胺是一种用于治疗癌症的氮芥烷化剂，系统名称为N-3-二(2-氯乙基)-1,3,2-氧杂氮杂磷杂环己烷-2-胺-2-氧化物，也称作例如商品名Ifex且具有结构：

异磷酰胺是一种用于治疗不同癌症(包括睾丸癌，肉瘤和一些类型的淋巴瘤)的化疗药物。

含本发明的双特异性DR5-FAP抗体的治疗剂组合中可采用的又一类化疗剂是抗VEGF抗体。抗VEGF抗体的例子包括抗VEGF抗体或靶向血管发生促进性生长因子受体的肽-抗体融合物，例如贝伐珠单抗

(雷尼珠单抗)，西妥昔单抗

拉米鲁珠单抗

伊曲库巴，HuMV833，2C3，阿柏西普

和IMC-1C11。一种优选的抗VEGF抗体是贝伐珠单抗

抗VEGF抗体的又一个例子是WO2010/040508和WO2011/117329中记载的抗VEGF-Ang2双特异性抗体。

在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述双特异性抗体和选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂，Bcl-2抑制剂，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂。

在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述双特异性抗体和选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂RG7388，Bcl-2抑制剂ABT199，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂PJ34，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂。在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本文所述双特异性抗体和Abraxane和吉西他滨。

在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：

(i)第一容器，装有包含本文所述双特异性抗体的组合物；和

在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：

(i)第一容器，装有包含本文所述双特异性抗体的组合物；和

在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：

(i)第一容器，装有包含本文所述双特异性抗体的组合物；和

在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含：

(i)第一容器，装有包含本文所述双特异性抗体的组合物；和

(ii)第二容器，装有帕利他赛或Abraxane；和

(iii)第三容器，装有吉西他滨。

在又一个方面，本发明提供结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和化疗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该双特异性抗体与选自伊立替康，多柔比星，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂，Bcl-2抑制剂ABT199，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂，异磷酰胺或抗VEGF抗体的化疗剂组合使用。

在又一个方面，本发明提供结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和化疗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该双特异性抗体与伊立替康组合使用。在一个此类方面，要治疗的癌症为结直肠癌。

在又一个方面，本发明提供结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和化疗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该双特异性抗体与抗VEGF抗体，优选贝伐珠单抗组合使用。在一个此类方面，要治疗的癌症为结直肠癌。

在又一个方面，本发明提供结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和化疗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该双特异性抗体与多柔比星组合使用。在一个此类方面，要治疗的癌症为肉瘤。

在又一个方面，本发明提供结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和化疗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该双特异性抗体与异磷酰胺组合使用。在一个此类方面，要治疗的癌症为肉瘤。

在又一个方面，本发明提供结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和化疗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该双特异性抗体与Abraxane和吉西他滨组合使用。在一个此类方面，要治疗的癌症为胰腺癌。

在一些实施方案中，该癌症为结直肠癌，肉瘤，头和颈癌，鳞状细胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，结缔组织增生性黑素瘤和间皮瘤。在一个实施方案中，该癌症为结直肠癌。在其它实施方案中，该肉瘤为软骨肉瘤，平滑肌肉瘤，胃肠基质肿瘤，纤维肉瘤，骨肉瘤。脂肪肉瘤或恶性纤维组织细胞瘤。

在又一个方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法，其包括作为组合配制剂或交替地将治疗剂组合施用于哺乳动物，其中该治疗剂组合包含治疗有效量的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和治疗有效量的伊立替康。在一个此类方面，要治疗的癌症为结直肠癌。

在又一个方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法，其包括作为组合配制剂或交替地将治疗剂组合施用于哺乳动物，其中该治疗剂组合包含治疗有效量的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和治疗有效量的抗VEGF抗体，例如贝伐珠单抗。在一个此类方面，要治疗的癌症为结直肠癌。

在又一个方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法，其包括作为组合配制剂或交替地将治疗剂组合施用于哺乳动物，其中该治疗剂组合包含治疗有效量的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和治疗有效量的Abraxane和治疗有效量的吉西他滨。在一个此类方面，要治疗的癌症为胰腺癌。

在又一个方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法，其包括作为组合配制剂或交替地将治疗剂组合施用于哺乳动物，其中该治疗剂组合包含治疗有效量的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和治疗有效量的多柔比星。在一个此类方面，要治疗的癌症为肉瘤。

在又一个方面，本发明提供一种用于治疗癌症的方法，其包括作为组合配制剂或交替地将治疗剂组合施用于哺乳动物，其中该治疗剂组合包含治疗有效量的包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点的结合死亡受体5(DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和治疗有效量的异磷酰胺。在一个此类方面，要治疗的癌症为肉瘤。

B.例示性的结合DR5和FAP的双特异性抗体

在一个方面，本发明提供分离的结合DR5和FAP的双特异性抗体。FAP结合模块已经记载于WO 2012/020006，通过援引将其完整收录。下述实施方案中描绘了要在DR5-FAP双特异性抗体中使用的特别感兴趣的FAP结合模块。

在某些实施方案中，结合DR5和FAP的双特异性抗体特异性交联死亡受体且靶细胞的凋亡得以诱导。这些双特异性死亡受体激动性抗体胜过常规死亡受体靶向性抗体的优势在于只在表达FAP的部位诱导凋亡的特异性。如上文描绘的，本发明的发明人开发了与已知的DR5结合物相比具有卓越特性的DR5结合模块，其可并入新颖的且有利的DR5-FAP双特异性抗体中。

在一个方面，本发明提供包含结合DR5和FAP的双特异性抗体的治疗剂组合，该双特异性抗体包含

至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含

(a)SEQ ID NO.:1的重链CDR1；

(b)SEQ ID NO.:2的重链CDR2；

(c)SEQ ID NO.:3的重链CDR3；

(d)SEQ ID NO.:4的轻链CDR1；

(e)SEQ ID NO.:5的轻链CDR2；

(f)SEQ ID NO.:6的轻链CDR3，

和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含

(a)SEQ ID NO.:9的重链CDR1；

(b)SEQ ID NO.:10的重链CDR2；

(c)SEQ ID NO.:11的重链CDR3；

(d)SEQ ID NO.:12的轻链CDR1；

(e)SEQ ID NO.:13的轻链CDR2；

(f)SEQ ID NO.:14的轻链CDR3。

在一个实施方案中，该双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQ ID NO.:7的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO.:8的氨基酸序列的可变轻链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含包含SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区。

在一个优选的实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQ ID NO.:18，SEQID NO.:19和SEQ ID NO.:20。在另一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQ IDNO.:17，SEQ ID NO.:19和SEQ ID NO.:20。

在另一个方面，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.:7的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列，和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含SEQ ID NO.:15的可变重链和SEQ ID NO.:16的可变轻链。

在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的结合DR5和FAP的双特异性抗体保留结合FAP和DR5的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO.:7中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQ ID NO.:7中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。

在另一个方面，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.:8的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)序列，和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含SEQ ID NO.:15的可变重链和SEQ ID NO.:16的可变轻链。

在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的结合DR5和FAP的双特异性抗体保留结合DR5和FAP的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO.:8中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQ ID NO:8中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。

在另一个方面，提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，该双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含SEQ ID NO.:8的可变轻链和SEQ ID NO.:7的可变重链；和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.:15的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的重链可变域(VH)序列。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VH序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的结合DR5和FAP的双特异性抗体保留结合FAP和DR5的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO.:15中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQ ID NO.:15中的VH序列，包括该序列的翻译后修饰。

在另一个方面，提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，该双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点，其包含SEQ ID NO.:8的可变轻链和SEQ ID NO.:7的可变重链，和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其包含与SEQ ID NO.:16的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％序列同一性的轻链可变域(VL)。在某些实施方案中，具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的VL序列相对于参照序列含有替代(例如保守替代)，插入，或删除，但是包含该序列的结合DR5和FAP的双特异性抗体保留结合DR5和FAP的能力。在某些实施方案中，在SEQ ID NO.:16中替代，插入和/或删除总共1至10个氨基酸。在某些实施方案中，替代，插入，或删除发生在HVR以外的区域中(即在FR中)。任选地，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含SEQ ID NO:16中的VL序列，包括该序列的翻译后修饰。

在另一个方面，提供结合DR5和FAP的双特异性抗体，其中该抗体包含上文提供的任何实施方案中的VH和上文提供的任何实施方案中的VL。在一个实施方案中，该抗体包含分别在SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，及SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中的VH和VL序列，包括那些序列的翻译后修饰。

在本发明的又一个方面，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体为单克隆抗体，包括嵌合，人源化或人抗体。在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体为人抗体。

C.结合DR5和FAP的双特异性抗体的例示性型式

在一个实施方案中，结合DR5和FAP的双特异性抗体包含抗体片段，例如Fv，Fab，Fab’，scFv，xFab，scFab，双抗体，或F(ab’)₂片段。在另一个实施方案中，该抗体包含全长抗体，例如完整IgG1抗体或本文中定义的其它抗体类或同种型。

依照本发明的双特异性抗体至少是二价的且可以是三价的或多价的，例如四价的或六价的。

本发明的双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

在另一个实施方案中，该双特异性抗体包含一个Fc域，至少一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和至少一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段经重链(VHCH1)连接至该Fc域的第一或第二亚基。

在任何实施方案中，Fab片段可以直接或经由包含一个或多个氨基酸，通常约2-20个氨基酸的肽接头融合至Fc域或彼此融合。肽接头是本领域已知的，而且本文中有描述。合适的非免疫原性肽接头包括例如(G₄S)_n，(SG₄)_n，(G₄S)_n或G₄(SG₄)_n肽接头。“n”一般为1和10之间，通常2和4之间的数值。一种对于将第一和第二抗原结合模块的Fab轻链彼此融合特别合适的肽接头为(G₄S)₂。一种适合于连接第一和第二抗原结合模块的Fab重链的例示性肽接头为EPKSC(D)-(G₄S)₂。另外，接头可以包含(部分)免疫球蛋白铰链区。特别地，在抗原结合模块融合至Fc域亚基的N末端的情况中，它可以经免疫球蛋白铰链区或其部分融合，有或无另外的肽接头。

优选地，所述双特异性抗体是四价的，具有两个各自分别靶向FAP和DR5的结合位点(2+2型式)。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，具有三个针对DR5的结合位点和一个针对FAP的结合位点(3+1型式)。3+1型式可以例如经由将一个靶向FAP的Fab片段和一个靶向DR5的Fab片段融合至具有两个DR5结合位点的IgG分子的重链的C末端来实现。这在下文更加详细地描绘。

在另一个优选实施方案中，所述双特异性抗体是三价的(2+1型式)，具有两个各自靶向DR5的结合位点和一个靶向FAP的结合位点。2+1型式可以例如经由将一个靶向FAP的Fab片段融合至具有两个DR5结合位点的IgG分子的重链的C末端来实现，其中第一抗体的Fc部分是依照下文描述的节入穴策略修饰的。

在另一个优选实施方案中，所述双特异性抗体是二价的(1+1型式)，即对DR5和FAP每项是单价的。本发明的二价抗体具有一个靶向DR5的结合位点和一个靶向FAP的结合位点。1+1型式可以例如通过Schaefer et al。Proc Natl Acad Sci USA 2011；108:11187-92中描述和下文描绘的Crossmab技术来实现。

其中提供的是包含依照任何上述实施方案的任何序列的结合DR5和FAP的不同双特异性抗体型式。

1.2+2型式的双特异性DR5-FAP抗体

在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含

一个Fc域，

两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，

其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

既然上述双特异性抗体对FAP和DR5二者是二价的，具有各2个针对FAP和DR5的结合位点，那么这种型式也称作“2+2”型式。图1中描绘具有2+2型式的双特异性抗体的例示性结构。由于可变区或恒定区任一的交换，上述Fab片段也称作“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”。

一个Fc域，

两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中全部两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

在另一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含

一个Fc域，

两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，

其中全部两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含

一个Fc域，

两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中全部两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区是交换的。

一个Fc域，

两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，

其中全部两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区是交换的。

由于Fab重和轻链的可变区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段各自包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链，和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这些交换Fab片段也称作CrossFab_(VLVH)且各自包含VLCH1和VHCL链。

一个Fc域，

两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中全部两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的恒定区是交换的。

一个Fc域，

两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

两个各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中全部两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的恒定区是交换的。

由于Fab重和轻链的恒定区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段各自包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链，和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。这些交换Fab片段也称作CrossFab_(CLCH1)且包含VHCL和VLCH1链。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个Fc域，对其两个Fab片段融合至N末端且两个Fab片段融合至C末端，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中，两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的N末端。在一个实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个实施方案中，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。

在一个实施方案中，两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头连接至Fc域。在一个实施方案中，两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头连接至Fc域的第一或第二亚基的C末端。在一个此类实施方案中，所述包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头连接至Fc域的第二亚基(CH3链)的C末端。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体包含

a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(即两个对DR5特异性的Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，和

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，和

b)两个对FAP特异性的Fab片段。

a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，和

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的。

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的。

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，其中两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。

在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链的C末端。在一个实施方案中，所述两个Fab片段在可变重链(VH)的N末端处融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。

在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。

在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链的C末端。在一个实施方案中，所述两个Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。在一个实施方案中，所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。

在又一个优选的实施方案中，两个对FAP特异性的Fab片段通过肽接头，优选具有约10-30个氨基酸的长度的肽接头融合至IgG分子。优选地，所述肽接头为(G₄S)₂或(G₄S)₄接头。

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。

在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链的C末端。在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头在恒定重链(CH1)的C末端处融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。

在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。

在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链的C末端。

在一个实施方案中，所述两个Fab片段通过肽接头在可变重链(VH)的N末端处融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。

在一个实施方案中，该双特异性抗体包含一个Fc域，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段经重链(VHCH1)融合至Fc域的第一或第二亚基。

在一个实施方案中，该双特异性抗体包含：

a)一个Fc域，

b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至Fc域的第一或第二亚基，和

c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中两个Fab片段在可变重链(VH)的N末端处连接至Fc域的第一或第二亚基。

在一个实施方案中，该双特异性抗体包含

a)一个Fc域，

b)两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中所述Fab片段在恒定重链(CH1)的C末端处连接至Fc域的第一亚基的N末端，和

c)两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中两个Fab片段在可变轻链(VL)的N末端处连接至Fc域的第二亚基(CH3)。

在一个实施方案中，所述两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段各自经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域。在一个具体的实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个实施方案中，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。

在一个实施方案中，两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头连接至Fc域。

例示性的具有2+2型式的抗体

a)一个免疫球蛋白G(IgG)分子，该免疫球蛋白G(IgG)分子具有两个对DR5特异性的结合位点，其包含

SEQ ID NO.:1的重链CDR1；

SEQ ID NO.:2的重链CDR2；

SEQ ID NO.:3的重链CDR3；

SEQ ID NO.:4的轻链CDR1；

SEQ ID NO.:5的轻链CDR2；

SEQ ID NO.:6的轻链CDR3；和

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含

SEQ ID NO.:9的重链CDR1；

SEQ ID NO.:10的重链CDR2；

SEQ ID NO.:11的重链CDR3；

SEQ ID NO.:12的轻链CDR1；

SEQ ID NO.:13的轻链CDR2；

SEQ ID NO.:14的轻链CDR3；

其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。

SEQ ID NO.:1的重链CDR1；

SEQ ID NO.:2的重链CDR2；

SEQ ID NO.:3的重链CDR3；

SEQ ID NO.:4的轻链CDR1；

SEQ ID NO.:5的轻链CDR2；和

SEQ ID NO.:6的轻链CDR3；和

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含

SEQ ID NO.:9的重链CDR1；

SEQ ID NO.:10的重链CDR2；

SEQ ID NO.:11的重链CDR3；

SEQ ID NO.:12的轻链CDR1；

SEQ ID NO.:13的轻链CDR2；和

SEQ ID NO.:14的轻链CDR3；

其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。

a)一个免疫球蛋白G(IgG)分子，该免疫球蛋白G(IgG)分子具有两个对DR5特异性的结合位点，其包含SEQ ID NO.:7的可变重链和SEQ ID NO.:8的可变轻链；和

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含包含SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区；其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含包含SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区；其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。

在另一个实施方案中，本发明的所述双特异性抗体包含IgG分子的Fc部分中的修饰，如下文描绘的。

在一个实施方案中，提供具有上文所述2+2型式的双特异性抗体，其包含两个SEQID NO.:18的VH_(DR5)-Fc部分-VH_(FAP)-CL链，两个SEQ ID NO.:19的VL(DR5)-卡帕轻链和两个SEQ ID NO.:20的VLCH1(FAP)链。

在一个实施方案中，提供具有如上所述2+2型式的双特异性抗体，其包含两个SEQID NO.:17的VH_(DR5)-Fc部分-VH_(FAP)-CL链，两个SEQ ID NO.:19的VL(DR5)-卡帕轻链和两个SEQ ID NO.:20的VLCH1(FAP)链。

2.2+1型式的双特异性DR5-FAP抗体

一个Fc域，

两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

既然上述双特异性抗体是三价的，具有一个针对FAP的结合位点和两个针对DR5的结合位点，那么这种型式也称作“2+1”型式。因此，这节中提供的双特异性抗体对DR5是二价的且对FAP是单价的。由于可变区或恒定区任一的交换，上述Fab片段也称作“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”。

一个Fc域，

两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

一个Fc域，

两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区是交换的。

由于Fab重和轻链的可变区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段各自包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链，和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这些交换Fab片段也称作CrossFab_(VLVH)且包含VLCH1和VHCL链。

一个Fc域，

两个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中全部两个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的恒定区是交换的。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个Fc域，对其两个Fab片段融合至N末端。

在一个实施方案中，两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的N末端。在一个实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。

有FAP结合物融合至C末端的2+1型式的双特异性DR5-FAP抗体

在一个实施方案中，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个实施方案中，一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头融合至Fc域的第一或第二亚基的C末端。在一个此类实施方案中，所述包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头融合至Fc域的第二亚基(CH3链)的C末端。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含：

a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，和

b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的。

b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的。

在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含：

b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，其中Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。

在一个实施方案中，b)的所述对FAP特异性的Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基的C末端。在一个实施方案中，b)的所述Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。

b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。

b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，其中Fab片段融合至所述IgG分子的恒定重链。

在一个实施方案中，b)的所述Fab片段对FAP特异性的融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基的C末端。在一个实施方案中，所述Fab片段of b)融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。

有FAP结合物融合至N末端的2+1型式的双特异性DR5-FAP抗体

在另一个实施方案中，一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个实施方案中，另一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段经肽接头融合至IgG分子的包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段的N末端。

a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)和一个对FAP特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为Crossfab片段(即重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的)；和

b)一个对DR5特异性的Fab片段。

a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为CrossFab_(VLVH)片段(即重和轻链的可变区是交换的)；和

b)一个对DR5特异性的Fab片段。

a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为CrossFab_(CLCH1)片段(即重和轻链的恒定区是交换的)；和

b)一个对DR5特异性的Fab片段。

a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为Crossfab片段(即重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的)；和

b)一个对DR5特异性的Fab片段，其中所述Fab片段融合至IgG分子的可变重或轻链的N末端。

a)一个具有一个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中对FAP特异性的Fab片段为CrossFab_(VLVH)片段(即重和轻链的可变区是交换的)；和

在一个实施方案中，b)的对DR5特异性的Fab片段融合至a)的对DR5特异性的Fab片段的可变重或轻链的N末端。

在又一个优选的实施方案中，对DR5特异性的Fab片段通过肽接头融合至IgG分子，优选具有约10–30个氨基酸的长度的肽接头。优选地，所述肽接头为(G₄S)₂或(G₄S)₄接头。

在另一个实施方案中所述本发明的双特异性抗体包含IgG分子的Fc部分中的修饰，如下文描绘的。

3.3+1型式的双特异性DR5-FAP抗体

一个Fc域，

三个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，

既然上述双特异性抗体是四价的，具有一个针对FAP的结合位点和三个针对DR5的结合位点，那么这种型式也称作“3+1”型式。因此，这节中描述的双特异性分子对DR5是三价的且对FAP是单价的。

由于可变区或恒定区任一的交换，上述Fab片段也称作“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”。

一个Fc域，

三个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

一个Fc域，

三个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

由于Fab重和轻链的可变区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链，和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这种交换Fab片段也称作CrossFab_(VLVH)且包含VLCH1和VHCL链。

一个Fc域，

三个各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的恒定区是交换的。

由于Fab重和轻链的恒定区的交换，对FAP特异性的交换Fab片段各自包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链，和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。这种交换Fab片段也称作CrossFab(CLCH1)且包含VHCL和VLCH1链。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个Fc域，对其两个Fab片段融合至N末端且两个Fab片段融合至C末端，其中一个对FAP特异性的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

在一个实施方案中，两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的N末端。在一个实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个实施方案中，两个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。

a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点(Fab片段)的免疫球蛋白G(IgG)分子，

b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的；和

c)一个对DR5特异性的Fab片段。

b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的可变区是交换的；和

c)一个对DR5特异性的Fab片段。

任选地，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含

b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的；和

c)一个对DR5特异性的Fab片段。

c)一个对DR5特异性的Fab片段，

其中b)和c)的Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基的C末端。

在一个实施方案中，b)和c)的所述两个Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第二亚基(CH3)的C末端。

c)一个对DR5特异性的Fab片段，

其中b)和c)的Fab片段融合至所述IgG分子的Fc域的第一或第二亚基。

b)一个对FAP特异性的Fab片段，其中Fab重和轻链的恒定区是交换的，和

c)一个对DR5特异性的Fab片段，

在又一个优选的实施方案中，这节中描述的任何实施方案的b)和c)的两个Fab片段通过肽接头融合至IgG分子，优选具有约10–30个氨基酸的长度的肽接头。优选地，所述肽接头为(G₄S)₂或(G₄S)₄接头。

在另一个实施方案中，所述本发明的双特异性抗体包含IgG分子的Fc部分中的修饰，如下文描绘的。

4.1+1型式的双特异性DR5-FAP抗体

一个Fc域，

一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段，

既然上述双特异性抗体是二价的，具有一个针对FAP的结合位点和一个针对DR5的结合位点，那么这种型式也称作“1+1”型式。因此，这节中描述的双特异性抗体对DR5是单价的且对FAP是单价的。由于可变区或恒定区任一的交换，上述Fab片段也称作“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”。1+1型式的IgG分子也称作Crossmab型式(参见Schaefer et al.,Proc Natl Acad Sci USA 2011；108:11187-92)。

一个Fc域，

一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，和

一个包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段。

一个Fc域，

一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

一个Fc域，

一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

一个Fc域，

一个包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，和

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的所述结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个Fc域，对其两个Fab片段融合至N末端，其中至少一个Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中，两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的N末端。在一个实施方案中，免疫球蛋白铰链区为人IgG1铰链区。在一个实施方案中，包含对DR5特异性的抗原结合位点的Fab片段，包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的部分。在一个特定实施方案中，免疫球蛋白分子为IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，免疫球蛋白为IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白为IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，免疫球蛋白为人免疫球蛋白。在其它实施方案中，免疫球蛋白为嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子的一个臂(Fab片段)的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子的一个臂(Fab片段)的重和轻链的可变区是交换的。这种抗体型式也称作CrossMab_(VHVL)。

在一个实施方案中，IgG分子的包含对FAP特异性的结合位点的一个臂(Fab片段)的重和轻链的可变区是交换的。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子的一个臂(Fab片段)的重和轻链的恒定区是交换的。这种抗体型式也称作CrossMab_(CH1CL)。

在一个实施方案中，IgG分子的包含对FAP特异性的结合位点的一个臂(Fab片段)的重和轻链的恒定区是交换的。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个具有一个对DR5特异性的结合位点和一个对FAP特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中IgG分子的一个臂(Fab片段)的整个VH-CH1和VL-CL域是交换的。这意味着至少一个Fab片段经轻链(VLCL)融合至Fc域的N末端。在一个实施方案中，另一个Fab片段经重链(VHCH1)融合至Fc域的N末端。

这种抗体型式也称作CrossMab_Fab。在一个实施方案中，全部两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至Fc域的N末端。

D.降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰

在一个优选的实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc部分是经过修饰的。经过修饰的Fc部分具有与野生型Fc部分相比降低的对Fcγ受体的结合亲和力。

本发明的双特异性抗体的Fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域是IgG Fc域。在一个具体的实施方案中，Fc域是IgG₁Fc域。在另一个实施方案中，Fc域是IgG₄Fc域。在一个更加具体的实施方案中，Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代，特别是氨基酸替代S228P的IgG₄Fc域。在一个更加具体的实施方案中，Fc域是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G的IgG₄Fc域。此氨基酸替代降低IgG₄抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等,DrugMetabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在又一个具体的实施方案中，Fc域是人的。Fc域赋予本发明的双特异性抗体以有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而，同时它可能导致不想要的本发明的双特异性抗体对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。因而，在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域展现出与天然IgG₁Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中，Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)展现出与天然IgG₁Fc域(或包含天然IgG₁Fc域的本发明的双特异性抗体)相比少于50％，优选少于20％，更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG₁Fc域(或包含天然IgG₁Fc域的本发明的双特异性抗体)相比少于50％，优选少于20％，更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中，Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)没有实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，所述Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIB。在一个实施方案中，效应器功能是CDC，ADCC，ADCP，和细胞因子分泌中的一项或多项。在一个具体的实施方案中，所述效应器功能是ADCC。在一个实施方案中，所述Fc域展现出与天然IgG₁Fc域相比基本相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)展现出超过约70％，特别是超过约80％，更特别是超过约90％的天然IgG₁Fc域(或包含天然IgG₁Fc域的本发明的双特异性抗体)对FcRn的结合亲和力时，实现基本相似的对FcRn的结合。

在某些实施方案中，Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍，至少5倍，或至少10倍。在有超过一处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍，至少20倍，或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化Fc域的本发明的双特异性抗体展现出与包含非工程化Fc域的本发明的双特异性抗体相比少于20％，特别是少于10％，更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcgRIIB。在一些实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更特别是人FcγRIIIa，FcγRI或FcγRIIa，最特别是人FcγRIIIa。优选地，对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中，对补体成分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)展现出非工程化形式的Fc域(或包含所述非工程化形式的Fc域的本发明的双特异性抗体)对FcRn的结合亲和力的超过约70％时，实现基本相似的对FcRn的结合，即保留该Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)，降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，降低的细胞因子分泌，降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，降低的对NK细胞的结合，降低的对巨噬细胞的结合，降低的对单核细胞的结合，降低的对多形核细胞的结合，降低的诱导凋亡的直接信号传导，降低的树突细胞成熟，或降低的T细胞引发。在一个实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的CDC，降低的ADCC，降低的ADCP，和降低的细胞因子分泌中的一项或多项。在一个具体的实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中，所述降低的ADCC小于20％的由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的本发明的双特异性抗体)诱导的ADCC。

在一个实施方案中，所述降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中，Fc域包含在E233，L234，L235，N297，P331和P329位置处的氨基酸替代。在一个更特定的实施方案中，Fc域包含在L234，L235和P329位置处的氨基酸替代。在一些实施方案中，Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG₁Fc域，特别是人IgG₁Fc域。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加特定的实施方案中，氨基酸替代是P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代和在选自以下的位置处的又一处氨基酸替代：E233，L234，L235，N297和P331。在一个更加特定的实施方案中，所述又一处氨基酸替代是E233P，L234A，L235A，L235E，N297A，N297D或P331S。在具体的实施方案中，所述Fc域包含在位置P329，L234和L235处的氨基酸替代。在更具体的实施方案中，所述Fc域包含氨基酸突变L234A，L235A和P329G(“P329G LALA”)。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG₁Fc域，特别是人IgG₁Fc域。

氨基酸替代组合“P329G LALA”几乎完全消除了人IgG₁Fc域的Fcγ受体结合，如记载于WO 2012/130831，其通过提述完整并入本文。WO 2012/130831还描述了制备此类突变体Fc域的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。

IgG₄抗体展现出与IgG₁抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域是IgG₄Fc域，特别是人IgG₄Fc域。在一个实施方案中，所述IgG₄Fc域包含在位置S228处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能，在一个实施方案中，所述IgG₄Fc域包含在位置L235处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代L235E。在另一个实施方案中，所述IgG₄Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代P329G。在一个具体的实施方案中，所述IgG₄Fc域包含在位置S228，L235和P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P，L235E和P329G。此类IgG₄Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性记载于WO 2012/130831，其通过提述完整并入本文。

在一个具体的实施方案中，展现出与天然IgG₁Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸替代L234A，L235A和任选地P329G的人IgG₁Fc域，或包含氨基酸替代S228P，L235E和任选地P329G的人IgG₄Fc域。

在某些实施方案中，已消除Fc域的N-糖基化。在一个此类实施方案中，所述Fc域包含在位置N297处的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸替代。

在上文和WO 2012/130831中描述的Fc域以外，具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238，265，269，270，297，327和329中一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括具有在氨基酸位置265，269，270，297和327中的两个或更多个处的替代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其具有残基265和297变成丙氨酸的替代(美国专利No.7,332,581)。

可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除，替代，插入或修饰来制备突变体Fc域。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变，PCR，基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。

可以容易地测定对Fc受体的结合，例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)进行，并且Fc受体诸如可通过重组表达获得。本文中描述了一种合适的此类结合测定法。或者，可使用已知表达特定Fc受体的细胞系，如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估Fc域或包含Fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。

可通过本领域中已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的本发明的双特异性抗体的效应器功能。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等,ProcNatl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等,J ExpMed 166,1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI^TM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox

非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)的。

在一些实施方案中，Fc域对补体成分(特别是对C1q)的结合是降低的。因而，在Fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可实施C1q结合测定法来测定本发明的双特异性抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等,J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等,Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。

下面的部分描述本发明的双特异性抗体的优选实施方案，其包含降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰。

a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc域展现与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能；和

a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc域包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代；和

a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中所述一处或多处氨基酸替代在L234，L235，和P329中的一个或多个位置处；和

a)一个具有两个对DR5特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性或抑制性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G；和

SEQ ID NO.:1的重链CDR1；

SEQ ID NO.:2的重链CDR2；

SEQ ID NO.:3的重链CDR3；

SEQ ID NO.:4的轻链CDR1；

SEQ ID NO.:5的轻链CDR2；和

SEQ ID NO.:6的轻链CDR3；

其中Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性和抑制性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G；和

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含

SEQ ID NO.:9的重链CDR1；

SEQ ID NO.:10的重链CDR2；

SEQ ID NO.:11的重链CDR3；

SEQ ID NO.:12的轻链CDR1；

SEQ ID NO.:13的轻链CDR2；和

SEQ ID NO.:14的轻链CDR3；

其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。

SEQ ID NO.:1的重链CDR1；

SEQ ID NO.:2的重链CDR2；

SEQ ID NO.:3的重链CDR3；

SEQ ID NO.:4的轻链CDR1；

SEQ ID NO.:5的轻链CDR2；和

SEQ ID NO.:6的轻链CDR3；

其中Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性或抑制性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G；和

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含

SEQ ID NO.:9的重链CDR1；

SEQ ID NO.:10的重链CDR2；

SEQ ID NO.:11的重链CDR3；

SEQ ID NO.:12的轻链CDR1；

SEQ ID NO.:13的轻链CDR2；和

SEQ ID NO.:14的轻链CDR3；

SEQ ID NO.:1的重链CDR1；

SEQ ID NO.:2的重链CDR2；

SEQ ID NO.:3的重链CDR3；

SEQ ID NO.:4的轻链CDR1；

SEQ ID NO.:5的轻链CDR2；

SEQ ID NO.:6的轻链CDR3；

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含

SEQ ID NO.:9的重链CDR1；

SEQ ID NO.:10的重链CDR2；

SEQ ID NO.:11的重链CDR3；

SEQ ID NO.:12的轻链CDR1；

SEQ ID NO.:13的轻链CDR2；和

SEQ ID NO.:14的轻链CDR3；

a)一个免疫球蛋白G(IgG)分子，该免疫球蛋白G(IgG)分子具有两个对DR5特异性的结合位点，其包含SEQ ID NO.:7的可变重链和SEQ ID NO.:8的可变轻链；

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含包含SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。

其中Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性或抑制性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，和

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含包含SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区，

a)一个免疫球蛋白G(IgG)分子，该免疫球蛋白G(IgG)分子具有两个对DR5特异性的结合位点，其包含SEQ ID NO.:7的可变重链和SEQ ID NO.:8的可变轻链；其中Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性或抑制性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G；和

b)两个对FAP特异性的Fab片段，其包含包含SEQ ID NO.:15的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO.:16的氨基酸序列的轻链可变区，其中Fab重和轻链的可变区是交换的，其中两个Fab片段通过肽接头融合至所述IgG分子的恒定重链。

E.促进异二聚化的Fc域修饰

本发明的双特异性DR5-FAP抗体包含不同的抗原结合模块，其融合至Fc域的两个亚基之一个或另一个，如此Fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中本发明的双特异性抗体的产率和纯度，如此在本发明的双特异性抗体的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。

因而，在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc域的CH3域中。

在一个特定的实施方案中，所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰，其包含在Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。节-入-穴技术记载于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,JImmunol Meth 248,7-15(2001)。

一般地，该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。

因而，在一个具体的实施方案中，在本发明的双特异性抗体的Fc域的第一亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，其可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，而且在Fc域的第二亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，其中可安置第一亚基的CH3域内的隆起。

可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。

在一个特定的实施方案中，在Fc域第一亚基的CH3域中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)，而在Fc域第二亚基的CH3域中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中，在Fc域第二亚基中，另外，第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)。

在还有又一个实施方案中，在Fc域的第一亚基中，另外，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)，而在Fc域的第二亚基中，另外，第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥，进一步稳定了二聚体(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。

在一个备选的实施方案中，促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰，例如如记载于WO 2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两个Fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。

在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的结合DR5和FAP的双特异性抗体包含一个免疫球蛋白G(IgG)分子，其具有两个对DR5特异性的结合位点，其中第一重链的Fc部分包含第一二聚化模块且第二重链的Fc部分包含第二二聚化模块，容许IgG分子的两条重链异二聚化。

在又一个优选的实施方案中，依照节入穴策略(参见Carter P.；Ridgway J.B.B.；Presta L.G.:Immunotechnology,Volume 2,Number 1,February 1996,pp.73-73(1))，第一二聚化模块包含节且第二二聚化模块包含穴。

F.核酸序列，载体和生产方法

编码能够结合DR5和FAP的双特异性抗体的多核苷酸可用于它的生产。编码本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体的多核苷酸可以作为编码完整双特异性抗原结合分子或完整结合DR5的抗体的单条多核苷酸或作为多条(例如两条或更多条)共表达的多核苷酸来表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性双特异性抗体或结合DR5的抗体。例如，Fab片段的轻链部分可以与双特异性抗体或结合DR5的抗体中包含Fab片段的重链部分，Fc域亚基和任选(部分)另一个Fab片段的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽会与轻链多肽联合以形成Fab片段。又例如，本文中提供的双特异性抗体或结合DR5的抗体中包含两个Fc域亚基中的一个和任选(部分)一个或多个Fab片段的部分可以与本文中提供的双特异性抗体或结合DR5的抗体中包含两个Fc域亚基中的另一个和任选(部分)Fab片段的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，Fc域亚基会联合以形成Fc域。

在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸为DNA。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸为RNA，例如信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链的或双链的。

G.抗体变体

在某些实施方案中，在上文描述的那些以外，还涵盖本文中提供的双特异性抗体或结合DR5的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善双特异性抗体或结合DR5的抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码双特异性抗体或结合DR5的抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备双特异性抗体或结合DR5的抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除，和/或插入和/或替代。可以进行删除，插入，和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。

1.替代，插入，和删除变体

在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表B中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表B中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合，降低的免疫原性，或改进的ADCC或CDC。

表B

初始残基	例示性替代	优选的替代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Val；Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；

(2)中性，亲水性的：Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；

(3)酸性的：Asp,Glu；

(4)碱性的：His,Lys,Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly,Pro；

(6)芳香族的：Trp,Tyr,Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。

一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力，降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。

可以对HVR做出变化(例如，替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(见例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等于Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如，易错PCR，链改组，或寡核苷酸指导的诱变)将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的方法，其中将几个HVR残基(例如，一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。

在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代，插入，或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1，2或3处氨基酸替代。

一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述的。在此方法中，将一个残基或一组靶残基(例如，带电荷的残基诸如Arg，Asp，His，Lys，和Glu)鉴定，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体与抗原间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。

氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。

2.糖基化变体

在某些实施方案中，改变本文中提供的双特异性抗体或结合DR5的抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。

在双特异性抗体或结合DR5的抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的，双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。见例如Wright等TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。

在一个实施方案中，提供了双特异性抗体变体或结合DR5的抗体的变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％，1％至65％，5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如，复合的，杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108 A1,Presta,L；及WO 2004/056312 A1,Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(见例如Yamane-Ohnuki等Biotech.Bioeng.87:614(2004)；Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；及WO2003/085107)。

进一步提供了具有两分型寡糖的双特异性抗体变体或结合DR5的抗体的变体，例如其中附着于双特异性抗体或结合DR5的抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类双特异性抗体变体或结合DR5的抗体的变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)。

3.经半胱氨酸工程化改造的抗体变体

在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的双特异性抗体或结合DR5的抗体，例如，“thioMAb”，其中双特异性抗体或结合DR5的抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于双特异性抗体或结合DR5的抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块，诸如药物模块或接头-药物模块缀合，以创建免疫缀合物。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。

H.重组方法和组合物

可以例如通过固相肽合成(例如Merrifield固相肽合成)或重组生成来获得本发明的双特异性抗体和结合DR5的抗体。对于重组生成，分离一种或多种编码所述双特异性抗体(片段)或结合DR5的抗体(片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易分离并测序此类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选为表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有双特异性抗体(片段)或结合DR5的抗体(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis等,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience,N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒，病毒的一部分或可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中(在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中)克隆编码双特异性抗体(片段)或结合DR5的抗体(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的一部分。尽管“终止密码子”(TAG，TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但可将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但任何侧翼序列例如启动子，核糖体结合位点，转录终止子，内含子，5’和3’非翻译区等，不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如在单一载体上)，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体，多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的双特异性抗体(片段)或结合DR5的抗体(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物例如多肽的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录并且若两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区将是与该核酸可操作联合。启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。

除启动子以外，其它转录控制元件例如增强子，操纵基因，阻遏物和转录终止信号能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，连同内含子-A)，猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因诸如肌动蛋白，热休克蛋白，牛生长激素和家兔a-球蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点，翻译起始和终止密码子以及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，亦称为CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，诸如复制起点和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。

本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌双特异性抗体或结合DR5的抗体，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明双特异性抗体或本发明结合DR5的抗体或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长中的蛋白质链跨越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟的蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。

可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记双特异性抗体或结合DR5的抗体的短蛋白质序列的DNA纳入双特异性抗体(片段)或结合DR5的抗体(片段)编码多核苷酸内或其末端。

在又一个实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明双特异性抗体或结合DR5的抗体(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何种类能工程化改造以生成本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体或其片段的细胞系统。适用于复制双特异性抗体或结合DR5的抗体及支持其表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导此类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足量的双特异性抗体或结合DR5的抗体用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，特别是在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中与细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合多肽编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)，和Li等,Nat Biotech 24,210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham等,J Gen Virol 36,59(1977))，幼仓鼠肾细胞(BHK)，小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)的)，猴肾细胞(CV1)，非洲绿猴肾细胞(VERO-76)，人宫颈癌细胞(HELA)，犬肾细胞(MDCK)，牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL 3A)，人肺细胞(W138)，人肝细胞(Hep G2)，小鼠乳房肿瘤细胞(MMT060562)，TRI细胞(如例如记载于Mather等,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)的)，MRC 5细胞和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr^-CHO细胞(Urlaub等,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如YO，NS0，P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如哺乳动物培养细胞，酵母细胞，昆虫细胞，细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选为哺乳动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0，NS0，Sp20细胞)。

本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域诸如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。

在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体的方法，其中所述方法包括在适合于双特异性抗体或结合DR5的抗体表达的条件下培养包含编码双特异性抗体或结合DR5的抗体的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收双特异性抗体或结合DR5的抗体。双特异性抗体或结合DR5的抗体的组分彼此遗传融合。双特异性抗体或结合DR5的抗体可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法确定接头的组成和长度，并可以测试功效。双特异性抗体不同组分之间的接头序列的例子见于本文中提供的序列。还可包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合物的各个组分(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。

在某些实施方案中，双特异性抗体或结合DR5的抗体的Fab片段形成部分至少包含能够结合抗原性决定簇的抗体可变区。可变区能形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分及自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies,a laboratory manual”,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建，可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。

可以将任何动物种类的抗体，抗体片段，抗原结合域或可变区用于本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体。可用于本发明的非限制性抗体，抗体片段，抗原结合域或可变区可以是鼠，灵长类或人起源的。如果双特异性抗体或结合DR5的抗体意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)，并且还记载于例如Riechmann等,Nature332,323-329(1988)；Queen等,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321和7,087,409；Jones等,Nature 321,522-525(1986)；Morrison等,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison和Oi,AdvImmunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等,Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,MolecImmun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等,Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua等,Methods36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等,Methods 36,61-68(2005)以及Klimka等,Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)以及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分及自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原刺激而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005))。还可以通过分离自人衍生的噬菌体展示库选择的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom等，于Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien等编,HumanPress,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等,Nature 348,552-554；Clackson等,Nature352,624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。

在某些实施方案中，将可用于本发明的Fab片段工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如公开于美国专利申请公开文本No.2004/0132066的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟知的其它技术来测量本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad等,GlycoJ 17,323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体，抗体片段，抗原结合域或可变域。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在Morris(1996)“EpitopeMapping Protocols,”于Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一经标记抗体和测试其与第一经抗体竞争对抗原的结合的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一标记抗体但没有第二未标记抗体。

在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。

可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的双特异性抗体或结合DR5的抗体，所述技术诸如高效液相层析，离子交换层析，凝胶电泳，亲和层析，大小排阻层析等。用于纯化具体蛋白质的实际条件将部分取决于诸如净电荷，疏水性，亲水性等因素，而且对于本领域中的技术人员将是明显的。对于亲和层析纯化，可以使用双特异性抗体或结合DR5的抗体结合的抗体，配体，受体或抗原。例如，对于本发明的双特异性抗体的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以连续使用蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离双特异性抗体，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定双特异性抗体或结合DR5的抗体的纯度，包括凝胶电泳，高压液相层析等。

I.测定法

可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的结合DR5和FAP的双特异性抗体和结合DR5的抗体鉴定，筛选，或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。

1.亲和力测定法

可以依照实施例中提出的方法使用标准的仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)通过表面等离振子共振(SPR)测定本文中提供的双特异性抗体和结合DR5的抗体对DR5和/或FAP的亲和力，而且诸如可以通过重组表达获得受体或靶蛋白。或者，可以例如通过流式细胞术(FACS)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估本文中提供的双特异性抗体和结合DR5的抗体对DR5和/或FAP的结合。

可以通过表面等离振子共振使用

T100仪(GE Healthcare)于25℃测量K_D。为了分析Fc部分与Fc受体之间的相互作用，通过固定化于CM5芯片上的抗五His抗体(Qiagen)来捕捉带His标签的重组Fc受体并将双特异性构建体用作分析物。简言之，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5,GE Healthcare)依照供应商说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗五His抗体用10mM醋酸钠pH 5.0稀释至40μg/ml，接着以5μl/分钟的流速注射以实现约6500响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射配体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。然后，在4或10nM捕捉Fc受体60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体的4倍连续稀释液(范围为约500nM至4000nM)在HBS-EP(GE Healthcare,10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05％表面活性剂P20,pH 7.4)中于25℃以30μl/min的流速注射120秒。

为了测定对靶抗原的亲和力，通过固定化于活化CM5传感器芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)来捕捉双特异性构建体，如对于抗五His抗体所描述的。偶联蛋白质的最终量为约12000RU。双特异性构建体在300nM捕捉90秒。使靶抗原在从250至1000nM的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池达180秒。监测解离达180秒。

通过扣除在参照流动池上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractiveindex)差异。使用稳定态响应通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合来导出解离常数K_D。使用简单的1对1Langmuir结合模型(

T100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k_结合)和解离速率(k_解离)。平衡解离常数(K_D)计算为比率k_解离/k_结合。参见例如Chen等,J Mol Biol 293,865-881(1999)。

2.结合测定法和其它测定法

在一个方面，对本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA，Western印迹，等来进行。

在另一个方面，可使用竞争测定法来鉴定分别与特定抗FAP抗体或特定抗DR5抗体竞争对FAP或DR5的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与特定抗FAP抗体或特定抗DR5抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,Methods inMolecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)。实施例部分描述了别的方法。

3.活性测定法

在一个方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的结合DR5和FAP的双特异性抗体或结合DR5的抗体的测定法。生物学活性可包括例如DNA片段化，诱导凋亡和靶细胞裂解。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。

在某些实施方案中，对本发明的双特异性抗体或结合DR5的抗体测试此类生物学活性。用于检测细胞裂解(例如通过测量LDH释放)或凋亡(例如使用TUNEL测定法)的测定法是本领域公知的。用于测量ADCC或CDC的测定法还记载于WO 2004/065540(参见其中的实施例1)，通过述及将其完整内容收入本文。

J.药物配制剂

通过混合具有期望纯度的此类双特异性抗体或抗体与一种或多种任选的药学可接受载剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980))以冻干配制剂或水性溶液形式制备如本文中所描述的结合DR5和FAP的双特异性抗体或结合DR5的抗体的药物配制剂。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐，和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵，苄索氯铵；酚，丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载剂进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(

Baxter International,Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法，包括rHuPH20记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。

例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。

本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。

活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体，清蛋白微球体，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形物品形式，例如膜，或微胶囊。

要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。

K.治疗性方法和组合物

可以在治疗性方法中使用本文中提供的包含一种或多种结合DR5和FAP的双特异性抗体和别的化疗剂的治疗剂组合。

在一个方面，提供了作为药物使用的结合DR5和FAP的双特异性抗体，用于与别的化疗剂组合使用。在某些实施方案中，提供了用于与别的化疗剂组合使用的结合DR5和FAP的双特异性抗体，用于在治疗方法中使用。在某些实施方案中，本发明提供了用于在治疗具有癌症的个体的方法中使用的结合DR5和FAP的双特异性抗体，该治疗包括对个体施用有效量的结合DR5和FAP的双特异性抗体。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。在一个优选实施方案中，所述癌症是胰腺癌，肉瘤或结直肠癌。在其它实施方案中，该癌症为结直肠癌，肉瘤，头和颈癌，鳞状细胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌或间皮瘤。在该癌症为乳腺癌的实施方案中，该乳腺癌可以是三重阴性乳腺癌。

在又一个方面，本发明提供了包含结合DR5和FAP的双特异性抗体和别的化疗剂的治疗剂组合在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，该药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，该药物用于治疗癌症的方法，其包括对具有癌症的个体施用有效量的该药物。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。

在又一个方面，本发明提供了用于治疗癌症的方法。在一个实施方案中，该方法包括对具有癌症的个体施用有效量的包含结合DR5和FAP的双特异性抗体和别的化疗剂的治疗剂组合。在一个此类实施方案中，该方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。在一个优选实施方案中，所述癌症是胰腺癌，肉瘤或结直肠癌。在其它实施方案中，该癌症为结直肠癌，肉瘤，头和颈癌，鳞状细胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌或间皮瘤。

在又一个方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何结合DR5和FAP的双特异性抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用，和别的化疗剂。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合DR5和FAP的双特异性抗体和药学可接受载剂。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合DR5和FAP的双特异性抗体和至少一种另外的治疗剂，例如如下文所描述的。

可以通过任何合适的手段，包括胃肠外，肺内，和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用来施用双特异性抗体。胃肠外输注包括肌肉内，静脉内，动脉内，腹膜内，或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用，推注施用，和脉冲输注。

双特异性抗体可以以一种符合良好的医学实践的方式配制，确定剂量及施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症，所治疗的特定哺乳动物，患者个体的临床状况，病症的起因，药剂投递的部位，施用的方法，施用进度，以及医学从业人员知道的其它因素。双特异性抗体无需但任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量，病症或治疗的类型，及上文讨论的其它因素。这些药剂通常以本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以约1-99％的本文所述剂量使用，或以凭经验/临床确定为合适的任何剂量并通过任何途径使用。

为了预防或治疗疾病，双特异性抗体的合适剂量会取决于要治疗的疾病的类型，抗体的种类，疾病的严重性和病程，所给予双特异性抗体的预防或治疗目的，之前的疗法，患者的临床史和对双特异性抗体的应答及主治医师的斟酌决定。双特异性抗体适合于在一次或一系列的治疗中施用于患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的双特异性抗体或结合DR5的新颖抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次分开的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一种典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗通常会持续直至出现疾病症状得到期望的抑制为止。双特异性抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用约0.5mg/kg，2.0mg/kg，4.0mg/kg或10mg/kg的一剂或多剂。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周(例如使得患者得到约2-约20剂，或例如约6剂双特异性抗体)。可给予初始较高的加载剂量，接着给予较低的一或多剂。然而，可使用其它剂量方案。通过常规技术和测定法易于监测该疗法的进展。

应当理解，可以替换结合DR5和FAP的双特异性抗体或在结合DR5和FAP的双特异性抗体外使用本发明的免疫缀合物实施任何上述配制剂或治疗性方法。

L.制品

在本发明的另一个方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗，预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶，管形瓶，注射器，IV溶液袋，等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗，预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是双特异性抗体且另外的活性剂是本文所述别的化疗剂。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)其中装有组合物的第一容器，其中组合物包含双特异性抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲液，稀释剂，滤器，针，和注射器。

应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充结合DR5和FAP的双特异性抗体。

III.实施例

下面是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。

虽然出于清楚理解的目的，前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述，但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。

实施例1：DR5-FAP死亡受体激动性双特异性抗体

一种通过死亡受体(如DR5)的交联(除经由肿瘤细胞表达的抗原的交联之外)来诱导凋亡的办法靶向肿瘤周围的基质。在该情况中，靶定抗原不由肿瘤细胞直接展示，而是由第二种不同细胞类型展示。此类抗原的一个例子会是FAP(成纤维细胞活化蛋白)。这种蛋白质在活化的成纤维细胞上表达，正如在肿瘤基质中发现它们那样。

通过噬菌体展示鉴定新颖的DR5结合物。对通过噬菌体展示获得的DR5结合物筛选凋亡诱导，特异性，物种交叉反应性，和表位特异性。选择DR5结合物5E11并转变成四价双特异性分子。这些双特异性抗体含有两种结合模块，各自针对DR5和FAP。FAP结合模块已经记载于WO2012/020006。使用(G₄S)₄连接头将28H1CrossFab域(VHCL)融合至抗DR5重链的C端，提供2+2型式的双特异性抗体。

表1：双特异性，四价DR5-FAP CrossMab分子(均使用(G₄S)₄连接头将28H1CrossFab域(VHCL)融合至抗DR5重链的C端，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)

在瞬时转染的HEK293EBNA细胞中生成DR5-FAP双特异性分子，并经由蛋白A和大小排阻层析来纯化。获得的产物产量在合理范围中(20mg/L左右)。对于所有分子，最后的纯化步骤之后的单体含量在96％以上。

通过表面等离振子共振(Biacore)进行的靶物结合分析揭示了2+2型式的双特异性抗体能够同时结合重组DR5和FAP(人和鼠)。

为了评估DR5-FAP双特异性分子是否能够诱导MDA-MB-231靶细胞系凋亡，用重组人FAP包被96孔板，用于经由随后添加的双特异性抗体来交联靶细胞上的DR5。在添加靶细胞(MDA-MB 231)和温育24小时之后，通过标准DNA片段化ELISA测定法来测定凋亡诱导。DR5-FAP双特异性分子在板上包被的FAP存在下展现凋亡诱导活性，指示此活性依赖于经由重组FAP的交联。

实施例2：DR5-FAP双特异性抗体能够对不同靶细胞诱导凋亡

在含GM05389人FAP⁺成纤维细胞的共培养测定法中在实验中对包含融合至FAP28H1 CrossFab模块的新分离的DR5结合物的2+2型式的DR5-FAP双特异性抗体测试对两种不同细胞系(MDA-MB-231和G401)诱导凋亡的情况。在0.0007–7nM的浓度范围上测试双特异性抗体。DNA片段化测定法的结果显示所测试的双特异性抗体对两种细胞系均展示较好的凋亡诱导活性。依照用MDA-MB-231细胞获得的结果，双特异性2+2型式的抗体在高浓度没有显示活性下降，而是上至最高浓度保持恒定或甚至升高。在含GM05389成纤维细胞的共培养物中有G401细胞的实验中，早在0.07nM的浓度就达到了最大凋亡诱导，然后保持恒定。在这种设置中，所有分子就凋亡诱导水平而言性能相似。

表1a：FAP-DR5双特异性抗体的表征

实施例3：人肿瘤中的FAP流行度

通过IHC评估人肿瘤中FAP的流行度以了解双特异性DR5-FAP抗体的可能临床用途。

在Ventana Benchmark XT上使用来自Vitatex(MABS1001)的大鼠抗人Seprase抗体(IgG2a，克隆D8)免疫染色来自多种肿瘤适应症的2.5μm FFPET切片。对切片进行标准CC1处理，接着是于37℃在Dako抗体稀释液(S3022)中以5μg/mL的浓度的抗体温育60分钟，并使用Ultraview DAB检测系统(Ventana，#760-4456)检测阳性染色。使用匹配的来自Abcam的同种型抗体(ab18450)作为阴性对照。

FAP+基质浸润物存在于不同适应症的人肿瘤中，包括SCLC，标志着双特异性DR5-FAP抗体的潜在感兴趣临床适应症(表2)。

表2：人上皮肿瘤中的FAP流行度

FAP-DR5的另一种感兴趣临床适应症是肉瘤，其中在跨越肉瘤亚型的大约50％的病例中FAP不在基质上表达但在恶性细胞自身上表达(表3)。

表3：人肉瘤亚型中的FAP流行度

实施例4：体外组合研究

为了评估FAP-DR5与不同抗癌药物的组合潜力，在体外使用DR5抗体(drozitumab，记载于US2007/0031414)+经由抗Fc抗体的交联作为在FAP+细胞缺失下的交联的替代。在一个细胞系子集中确认了体外细胞培养物实验中FAP交联和Fc交联之间较好的相关性用于原理证明(数据未显示)。评估一组CRC和PDAC细胞系，并使用与相应肿瘤适应症潜在临床相关的组合配偶来评估组合效果(CRC：伊立替康，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂(RG7388)，Bcl-2抑制剂(ABT199)；PDAC：Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，多柔比星，MDM2i(RG7388)，Bcl2i(ABT199)，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂(PJ34))。结果描述于表4和表5和图2-4。

化合物的IC50值的测定

在具有透明，平坦底的黑色96孔微量板中接种细胞(数目随细胞系而变化)，并于37℃和5％CO₂温育过夜。在检查细胞贴壁/汇合之后，去除培养基并对每个孔添加100μl含有相应化合物的新鲜培养基。每种化合物(n＝3)使用8个浓度的顺序稀释系列(1:4)。使用相应DMSO浓度和单独的培养基作为对照。

在于37℃和5％CO₂培养3天之后，对板添加每孔100μl CellTiter-Glo试剂(Promega)。在于室温摇动30分钟之后测量发光。用XL-Fit软件计算IC50值。一种化合物的每项实验重复至少两次。

DR5抗体组合：

在具有透明，平坦底的黑色96孔微量板中接种细胞(数目随细胞系而变化)，并于37℃和5％CO₂温育过夜。在检查细胞贴壁/汇合之后，去除培养基并对每个孔添加100μl含有相应化合物或组合的新鲜培养基。

在96孔PP-V底微量板中制备Drozitumab/抗人Fc的9个浓度的顺序1:3稀释系列(n＝6)。以等摩尔浓度混合的Drozitumab/抗人Fc的预稀释液，Drozitumab/抗人Fc的范围为0–28nM而化疗剂为800nM。然后将25μl/孔Drozitumab/抗人Fc系列转移至细胞。然后用1xIC50浓度的化合物和7nM或最高浓度200nM任一的Drozitumab/抗人Fc达到终浓度。

在于37℃和5％CO₂温育3天之后，对板给予每孔100μl CellTiter-Glo试剂(Promega)。在于室温摇动30分钟之后测量发光。

对于Drozitumab/抗人Fc和Drozitumab/抗人Fc+化合物的每个浓度，在同一块板上制备一式三份，而且每项实验重复至少两次。

表4：组合筛选PDAC细胞系

表5：组合筛选CRC细胞系

n.s.＝不显著

n.c.＝未计算(因数据不合适)

n.t.＝未测试

实施例5：FAP-DR5与化疗剂组合的体内抗肿瘤功效

可以在移植到裸小鼠上的多种肿瘤起源(例如CRC，胰腺癌，结缔组织增生性黑素瘤和肉瘤)的基于细胞和碎片的患者衍生(PDX)模型中检测双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)的体内抗肿瘤功效。例如，针对CRC异种移植物模型DLD-1和HCT116(基于细胞系的，共注射模型l)和Co5896(基于碎片的)显示了双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ IDNO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)和化疗剂激活内在凋亡途径的组合功效的数据。

测试药剂

作为来自Roche(Penzberg，Germany)的储液提供双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)。抗体缓冲液包括组氨酸。注射前在缓冲液中自储液适当稀释抗体溶液。作为来自Roche(Penzberg，Germany)的储液提供现有技术DR5特异性抗体Drozitumab的一种Fc突变体。这种抗体包含Fc域中消除对活化性或抑制性Fc受体的结合和/或效应器功能的三处氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G。Drozitumab的这种Fc突变体也称作“Drozitumab LALA”。

细胞系和培养条件

DLD-1和HCT116人CRC细胞最初是自ATCC获得的；LOX-IMVI人结缔组织增生性黑素瘤细胞最初是在NCI建立并自ATCC购买的。例行地在水饱和气氛中于37℃和5％CO₂在含1.0mM丙酮酸钠，补充有10％胎牛血清，2.0mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES的DMEM高葡萄糖培养基中培养肿瘤细胞系。每三天用胰蛋白酶/EDTA 1x分瓶实施培养物传代。另外，鼠成纤维细胞NIH3T3购自ATCC，并在含1.0mM丙酮酸钠，10％FCS和2.0mM L-谷氨酰胺的DMEM高葡萄糖中培养。

患者衍生异种移植物模型(PDX)

CRC肿瘤异种移植物Co5896，肉瘤肿瘤异种移植物Sarc4605和胰腺导管腺癌(PDAC)肿瘤异种移植物PA1178和PA3137最初是自患者获得的，并适当传代3-5次，直至建立稳定生长样式。为了后续体内研究，自在裸小鼠中连续传代的异种移植物获得Co5896，Sarc4605，PA1178和PA3137肿瘤碎片。自供体小鼠取出后，将肿瘤切成碎片(4-5mm直径)并放置在PBS中，直至皮下植入。异氟烷麻醉下的小鼠在体侧中接受单侧皮下肿瘤植入物。

动物

裸小鼠购自育种公司(例如Charles River，Sulzfeld，Germany)，并依照提交的指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光照/12小时黑暗的日周期在无特定病原体的条件下维持。实验性研究方案得到当地政府的审查和批准。到达后，将动物在动物房的检疫部分中维持一周适应新环境和进行观察。定期进行连续健康监测。随意提供饮食食物(Provimi Kliba 3337)和水(酸化的pH 2.5-3)。

监测

每天对动物管理临床症状和不利作用检测。对于贯穿实验的监测，记录动物的体重。

对动物的处理

在细胞或碎片移植后当中值肿瘤大小为约100-200mm³时进行动物随机化，此后开始动物处理。作为单一药剂以1.0，10或30mg/kg静脉内施用抗体，一周一次或两次，持续数周，取决于模型。在同一天施用相应媒介。

抗体功效

基于DLD-1和HCT116CRC共注射细胞系的异种移植物模型

研究第9至20天以10和1.0mg/kg的剂量用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VHSEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)处理携带DLD-1CRC异种移植物的小鼠4次。结果是，双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)处理显示剂量相关的显著的抗肿瘤功效，具有较强的针对皮下DLD-1异种移植物的抗肿瘤功效。肿瘤生长抑制(TGI)分别计算为89％(10mg/kg)和79％(1.0mg/kg)。相反，用DR5Fc突变体抗体Drozitumab，LALA(10mg/kg，一周一次)处理后没有注意到抗肿瘤功效(图5)。而且，在一项组合中，用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)(10mg/kg，静脉内，一周一次，5x)和伊立替康(15mg/kg，腹膜内，5天，3x)处理携带DLD-1肿瘤的小鼠。该组合处理展现与相应单一药剂相比卓越的功效并实现72％肿瘤消退(图6)。测试在伊立替康处理之前，之后5天或平行地用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VHSEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)处理携带DLD-1肿瘤的小鼠。平行组合处理展现与两种药剂的顺序处理相比卓越的功效(图7)。在又一项临床前研究中，携带DLD-1肿瘤的小鼠接受双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VHSEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)(10mg/kg)与抗VEGF抗体B20(10mg/kg)或Ang2/VEGF抗体(10mg/kg)一起的组合处理，如记载于WO2011/117329。两种抗体均在第8，15和22天一周一次给予。虽然DR5-FAP抗体作为单一药剂的处理导致显著的肿瘤生长抑制(TGI 87％)，含抗Ang/VEGF单抗的组合具有叠加的功效并将肿瘤生长抑制提高至94％。单独的Ang2/VEGF抗体处理以75％抑制肿瘤生长(图15)。

在第二种基于细胞系的CRC模型(HCT116)中，评估双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)(10mg/kg，静脉内，一周一次，3x)与伊立替康(15mg/kg，腹膜内，5天，2x)和奥沙利铂(5mg/kg)的组合。植入后7天开始处理，而且双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ IDNO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)的单一疗法导致46％TGI。含伊立替康的组合展现卓越的功效并引起肿瘤消退(图8)。而且，双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)与奥沙利铂的组合疗法提高功效至67％TGI(图9)。

基于LOX-IMVI结缔组织增生性黑素瘤细胞系的异种移植物模型

研究第13至20天以10mg/kg的剂量用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)处理携带LOX-IMVI异种移植物的小鼠2次。另一组携带肿瘤的小鼠以10mg/kg(第13和20天)接受DR5靶向性Fc突变体抗体drozitumab LALA的处理。结果是，双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)处理针对皮下LOX-IMVI异种移植物显示显著的强抗肿瘤功效(肿瘤停滞)。肿瘤生长抑制(TGI)对于双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)计算为超过100％(10mg/kg)，而DrozitumabLALA处理功效较低(TGI 65％)(图10)。另外，用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)(10mg/kg)与蒽环类抗生素多柔比星(Adriamycin，5mg/kg，q7d)的组合处理携带LOX-IMVI的小鼠。虽然DR5-FAP抗体(10mg/kg，第8和15天)作为单一药剂的处理导致肿瘤停滞(TGI 97％)，含多柔比星的组合具有大于叠加的功效并引起明显的肿瘤消退(93％)。单独的多柔比星处理以77％抑制肿瘤生长(图16)。

基于Co5896 CRC碎片的患者衍生异种移植物模型(PDX)

研究第18至34天作为单一药剂以30mg/kg的剂量用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ IDNO.:16)处理携带Co5896 CRC异种移植物的小鼠6次(见图11)。结果是，双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VLSEQ ID NO.:16)处理显示显著的抗肿瘤功效，具有较强的针对皮下Co5896患者衍生异种移植物的抗肿瘤功效。肿瘤生长抑制(TGI)计算为76％。另外，在一项组合研究中，自研究第15天起作为单一药剂每周一次给予双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VLSEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)(30mg/kg)(4次)并与伊立替康(15mg/kg，第15-19天)组合。在双特异性DR5-FAP抗体与伊立替康的组合中观察到卓越的功效，在所有动物中导致完全肿瘤消退(10/10无肿瘤)(图12)。

通过IHC确认Co5896患者衍生异种移植物的基质中存在FAP(图13)。

基于Sarc4605肉瘤碎片的患者衍生异种移植物模型(PDX)

研究第10至31天作为单一药剂以10mg/kg的剂量用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ IDNO.:16)处理携带Sarc4605肉瘤异种移植物的小鼠4次(图14)。结果是，双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VLSEQ ID NO.:16)处理显示显著的抗肿瘤功效，具有较强的针对皮下Sarc4605患者衍生异种移植物的抗肿瘤功效(肿瘤停滞)。肿瘤生长抑制(TGI)计算为超过100％。另外，用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ IDNO.:15，VL SEQ ID NO.:16)(10mg/kg)与蒽环类抗生素多柔比星(Adriamycin，5mg/kg，q7d)组合处理携带Sarc4605肿瘤的小鼠。虽然DR5-FAP抗体(10mg/kg，第20，27，34和41天)作为单一药剂的处理导致肿瘤停滞(TGI 99％)，含多柔比星的组合具有大于叠加的功效并引起明显的肿瘤消退(83％)。单独的多柔比星处理以77％抑制肿瘤生长(图17)。

而且，用双特异性抗体DR5-FAP(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)(10mg/kg)与烷化药物异磷酰胺(100mg/kg，q7dx2)组合处理携带Sarc4605肿瘤的小鼠。单独的DR5-FAP抗体(10mg/kg，q7dx8)处理导致较强的肿瘤消退(96％及80％无肿瘤)，而含异磷酰胺的组合具有略微更高的功效(86％无肿瘤)。另外，组合中的肿瘤消退的动力学更快(图19)。

基于PA1178和PA3137PDAC碎片的异种移植物模型(PDX)

研究第32至81天作为单一药剂和与吉西他滨和nab-帕利他赛的组合以10mg/kg的剂量用双特异性DR5-FAP抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)处理携带PA1178异种移植物的小鼠7次(见图18)。作为单一药剂以10mg/kg腹膜内一周一次施用双特异性抗体。在同一天施用相应媒介。一周两次腹膜内以40mg/kg给予吉西他滨数周，并连续4天以6mg/kg静脉内施用nab-帕利他赛两个周期。

结果是，DR5-FAP双特异性抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)作为单一药剂的处理显示显著的抗肿瘤功效，具有较强的针对皮下PA1178患者衍生异种移植物的抗肿瘤功效。与对照相比，肿瘤生长抑制(TGI)计算为96％。而且，与吉西他滨和nab-帕利他赛(abraxane)组合给予DR5-FAP双特异性抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ IDNO.:15，VL SEQ ID NO.:16)。该三重组合是有效的，在所有接受处理的动物中实现完全肿瘤消退，这在吉西他滨/nab-帕利他赛双重组合给药组中没有实现。

在第二种基于碎片的PDAC PDX模型(PA3137)中，作为单一药剂和与吉西他滨(腹膜内，一周一次，40mg/kg)和nab-帕利他赛(6mg/kg，连续四天，静脉内)的组合评估双特异性DR5-FAP抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ IDNO.:15，VL SEQ ID NO.:16)(10mg/kg，腹膜内，一周一次，x8)的功效。植入后31天开始动物处理，直至第66天。单一疗法中双特异性DR5-FAP抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VLSEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)的功效导致40％TGI。双特异性DR5-FAP抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)与吉西他滨和nab-帕利他赛(abraxane)的组合展现较好的功效，大多具有完全肿瘤消退(数据未显示)。

实施例6：临床前药效学生物标志物和组合策略

进行临床前转化研究来证明上靶(on-target)作用模式，确保最大活性及指导药效学(PD)分析以阐明潜在抗性机制。

材料和方法

在与成纤维细胞共注射的基于结直肠癌(CRC)细胞系的异种移植物模型(DLD-1)中设计一项动力学研究。在双特异性DR5-FAP抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)(10mg/kg)单剂处理之后6，16，72和168小时外植肿瘤，并收获进行针对凋亡标志物的基于免疫组织化学(IHC)和ELISA的蛋白质分析，诸如受到切割的胱天蛋白酶3(cc3)，受到切割的PARP和活化的胱天蛋白酶8和9。用用于

平台的凋亡人3-Plex小组(Life technologies)测定受到切割的胱天蛋白酶3水平。使用

MAP 7-Plex来测定磷酸化Akt(Ser473)，JNK(Thr183/Tyr185)，Bad(Ser112)，Bcl-2(Ser70)，p53(Ser46)，活性胱天蛋白酶-8(Asp384)和活性胱天蛋白酶-9(Asp315)的变化。

对于IHC分析，将肿瘤在3.8％缓冲的甲醛溶液中固定最多48小时并在Paraplast中包埋。遵循一种例行的IHC染色方案使用Ventana Discovery XT载玻片染色仪应用针对受到切割的胱天蛋白酶-3的家兔多克隆抗体(Asp175；Cell Signalling)。

为了分析双特异性DR5-FAP抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)(10mg/kg)与多柔比星(5mg/kg)的组合处理，使用一种FAP阳性结缔组织增生性黑素瘤细胞系衍生模型(LOX-IMVI)。在处理之后3，6，16，72和168小时外植肿瘤。

结果

我们通过IHC和ELISA在基质中或直接在肿瘤细胞上表达FAP的异种移植物肿瘤中观察到用双特异性DR5-FAP抗体处理后显著的时间依赖性凋亡诱导。与媒介对照相比在处理之后早期通过IHC观察到水平较高的瞬时的凋亡标志物诸如cc3。通过ELISA对等同组织裂解物的分析还揭示DLD-1CRC异种移植物模型中单一疗法中cc3，受到切割的PARP和活化的胱天蛋白酶8和9的快速诱导，它在LOX-IMVI结缔组织增生性黑素瘤模型中与多柔比星一起给予时是卓越的。通过ELISA对等同组织裂解物的分析揭示DLD-1CRC异种移植物模型中单一疗法中cc3，受到切割的PARP和活化的胱天蛋白酶8和9的快速诱导，它在与伊立替康或奥沙利铂一起给予时是卓越的。

图20显示在用单一药剂双特异性DR5-FAP抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VLSEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)处理之后的Luminex数据(ELISA)。双特异性DR5-FAP抗体针对DLD-1/3T3异种移植物诱导较强的时间相关肿瘤细胞凋亡。在抗体处理之后不久(6小时)观察到较强的效果。

图21显示在用单一药剂双特异性DR5-FAP抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VLSEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)或与多柔比星(10mg/kg)组合处理之后的Luminex数据(ELISA)。双特异性DR5-FAP抗体以时间相关方式强烈诱导肿瘤细胞凋亡。双特异性DR5-FAP抗体与多柔比星一起的组合处理在LOX-IMVI结缔组织增生性黑素瘤模型中的肿瘤细胞凋亡诱导是卓越的。

图22显示在用单一药剂双特异性DR5-FAP抗体(10mg/kg；DR5结合物：VH SEQ IDNO.:7，VL SEQ ID NO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)或与伊立替康(15mg/kg)或奥沙利铂(5mg/kg)组合处理之后的Luminex数据(ELISA)。双特异性DR5-FAP抗体在DLD-1CRC异种移植物模型中以时间相关方式强烈诱导肿瘤细胞凋亡。双特异性DR5-FAP抗体与伊立替康或奥沙利铂一起的组合处理的肿瘤细胞凋亡诱导是卓越的。

我们鉴定了双特异性DR5-FAP抗体(DR5结合物：VH SEQ ID NO.:7，VL SEQ IDNO.:8，FAP结合物：VH SEQ ID NO.:15，VL SEQ ID NO.:16)在体内在注射之后不久强烈诱导肿瘤细胞凋亡，不依赖于FAP是在肿瘤基质上或是在肿瘤细胞处表达，而且发现了最佳药效学标志物和用于采样和分析的时间点。

序列

1.噬菌体展示衍生的DR5结合物的氨基酸序列

2.FAP结合物的氨基酸序列

3.包含噬菌体展示衍生的DR5结合物的双特异性分子的氨基酸序列

虽然显示和描述了本发明当前优选的实施方案，但是要清楚地理解，本发明不限于此而是可以在所述权利要求书的范围内以其它方式多种多样地体现和实施。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann - La Roche AG）

<120> 对FAP和DR5特异性的双特异性抗体和化疗剂的组合疗法

<130> 32336 WO

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5 (5E11)_CDRH1

<400> 1

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5 (5E11)_CDRH2

<400> 2

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5 (5E11)_CDRH3

<400> 3

Gly Val Arg Val Ser Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5 (5E11)_CDRHL1

<400> 4

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5 (5E11)_CDRL2

<400> 5

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5 (5E11)_CDRL3

<400> 6

Gln Gln Gly Thr Thr His Pro Ile Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5 (5E11)_VH

<400> 7

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Val Arg Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5 (5E11)_VL

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Thr His Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1)_CDRH1

<400> 9

Ser His Ala Met Ser

1 5

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1)_CDRH2

<400> 10

Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1)_CDRH3

<400> 11

Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr

1 5

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1)_CDRL1

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1)_CDRL2

<400> 13

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1)_CDRL3

<400> 14

Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr

1 5

<210> 15

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1)_VH

<400> 15

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1)_VL

<400> 16

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 17

<211> 691

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5(5E11)-FAP (28H1) VHCL

<400> 17

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Val Arg Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

465 470 475 480

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

485 490 495

Phe Ser Ser His Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

500 505 510

Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala

515 520 525

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

530 535 540

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

545 550 555 560

Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

565 570 575

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val

580 585 590

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

595 600 605

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

610 615 620

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

625 630 635 640

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

645 650 655

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

660 665 670

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

675 680 685

Gly Glu Cys

690

<210> 18

<211> 689

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5(5E11)-FAP (28H1) VHCL 去除Fc中的C端赖氨酸 P329G/LALA mut.

<400> 18

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Val Arg Val Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

465 470 475 480

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

485 490 495

Ser His Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

500 505 510

Trp Val Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser

515 520 525

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

530 535 540

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

545 550 555 560

Cys Ala Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

565 570 575

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile

580 585 590

Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val

595 600 605

Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys

610 615 620

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

625 630 635 640

Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu

645 650 655

Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr

660 665 670

His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu

675 680 685

Cys

<210> 19

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DR5(5E11) LC

<400> 19

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Thr Thr His Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 20

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP (28H1) _VLCH1

<400> 20

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser

100 105 110

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

115 120 125

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

130 135 140

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

145 150 155 160

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

180 185 190

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

195 200 205

Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210

Claims

1.结合死亡受体5 (DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体和第二治疗剂的组合在制造用于治疗癌症的药物中的用途，其中该第二治疗剂选自伊立替康，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂RG7388，Bcl-2抑制剂ABT199，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂PJ34，异磷酰胺或抗VEGF抗体，其中该双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其中该对DR5特异性的抗原结合位点包含： (a) 如SEQ ID NO.:1所示的重链互补决定区1 (CDR1)； (b) 如SEQID NO.:2所示的重链互补决定区2 (CDR2)； (c)如SEQ ID NO.:3所示的重链互补决定区3(CDR3)； (d) 如SEQ ID NO.:4所示的轻链互补决定区1 (CDR1)； (e)如SEQ ID NO.:5所示的轻链互补决定区2 (CDR2)；和 (f)如SEQ ID NO.:6所示的轻链互补决定区3 (CDR3)，且其中该对FAP特异性的抗原结合位点包含： (a) 如SEQ ID NO.:9所示的重链互补决定区1(CDR1)； (b) 如SEQ ID NO.:10所示的重链互补决定区2 (CDR2)； (c)如SEQ ID NO.:11所示的重链互补决定区3 (CDR3)； (d) 如SEQ ID NO.:12所示的轻链互补决定区1 (CDR1)；(e)如SEQ ID NO.:13所示的轻链互补决定区2 (CDR2)；和 (f)如SEQ ID NO.:14所示的轻链互补决定区3 (CDR3)。

2.权利要求1的用途，其中该癌症为结直肠癌，肉瘤，头和颈癌，鳞状细胞癌，乳腺癌，胰腺癌，胃癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌或间皮瘤。

3.权利要求2的用途，其中该肉瘤为软骨肉瘤，平滑肌肉瘤，胃肠基质肿瘤，纤维肉瘤，骨肉瘤，脂肪肉瘤或恶性纤维组织细胞瘤。

4.权利要求1至3任一项的用途，其中该双特异性抗体和该第二治疗剂一起施用。

5.权利要求4的用途，其中该双特异性抗体和该第二治疗剂作为组合配制剂施用。

6.权利要求1至3任一项的用途，其中该双特异性抗体和该第二治疗剂交替施用。

7.权利要求6的用途，其中该第二治疗剂在该双特异性抗体之前施用。

8.权利要求6的用途，其中该第二治疗剂在该双特异性抗体之后施用。

9.权利要求1至8任一项的用途，其中该组合以一周至三周的间隔施用。

10.权利要求1至9任一项的用途，其中该对DR5特异性的抗原结合位点包含如SEQ IDNO.:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO.:8所示的轻链可变区；且该对FAP特异性的抗原结合位点包含如SEQ ID NO.:15所示的重链可变区和如SEQ ID NO.:16所示的轻链可变区。

11.权利要求1至10任一项的用途，其中该双特异性抗体包含SEQ ID NO：18，19和20的氨基酸序列或该双特异性抗体包含SEQ ID NO：17，19和20的氨基酸序列。

12.权利要求1至11任一项的用途，其中该双特异性抗体包含一个Fc域，各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的两个Fab片段，和各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的两个Fab片段。

13.权利要求12的用途，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

14.权利要求12或13的用途，其中至少一个该Fab片段经肽接头连接至该Fc域。

15.权利要求12至14任一项的用途，其中该Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性或抑制性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，其中该癌症为结缔组织增生性黑素瘤。

16.一种药物组合物，其包含：结合死亡受体5 (DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体，其中该双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其中该对DR5特异性的抗原结合位点包含： (a)如SEQ IDNO.:1所示的重链互补决定区1 (CDR1)； (b)如SEQ ID NO.:2所示的重链互补决定区2(CDR2)； (c)如SEQ ID NO.:3所示的重链互补决定区3 (CDR3)； (d)如SEQ ID NO.:4所示的轻链互补决定区1 (CDR1)； (e)如SEQ ID NO.:5所示的轻链互补决定区2 (CDR2)；和(f)如SEQ ID NO.:6所示的轻链互补决定区3 (CDR3)，且其中该对FAP特异性的抗原结合位点包含： (a)如SEQ ID NO.:9所示的重链互补决定区1 (CDR1)； (b)如SEQ ID NO.:10所示的重链互补决定区2 (CDR2)； (c)如SEQ ID NO.:11所示的重链互补决定区3 (CDR3)；(d)如SEQ ID NO.:12所示的轻链互补决定区1 (CDR1)； (e)如SEQ ID NO.:13所示的轻链互补决定区2 (CDR2)；和 (f)如SEQ ID NO.:14所示的轻链互补决定区3 (CDR3)，和选自伊立替康，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂RG7388，Bcl-2抑制剂ABT199，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂PJ34，异磷酰胺或抗VEGF抗体的第二治疗剂。

17.权利要求16的药物组合物，其中该对DR5特异性的抗原结合位点包含如SEQ IDNO.:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO.:8所示的轻链可变区；且该对FAP特异性的抗原结合位点包含如SEQ ID NO.:15所示的重链可变区和如SEQ ID NO.:16所示的轻链可变区。

18.权利要求16或17的药物组合物，其中该双特异性抗体包含SEQ ID NO：18，19和20的氨基酸序列或该双特异性抗体包含SEQ ID NO：17，19和20的氨基酸序列。

19.权利要求16至18任一项的药物组合物，其中该双特异性抗体包含一个Fc域，各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的两个Fab片段，和各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的两个Fab片段。

20.权利要求19的药物组合物，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

21.权利要求19或20的药物组合物，其中至少一个该Fab片段经肽接头连接至该Fc域。

22.权利要求19至21任一项的药物组合物，其中该Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性或抑制性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，其中该药物组合物用于治疗结缔组织增生性黑素瘤。

23.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包含：第一容器，装有包含结合死亡受体5 (DR5)和成纤维细胞活化蛋白(FAP)的双特异性抗体的组合物，其中该双特异性抗体包含至少一个对DR5特异性的抗原结合位点和至少一个对FAP特异性的抗原结合位点，其中该对DR5特异性的抗原结合位点包含： (a)如SEQ ID NO.:1所示的重链互补决定区1 (CDR1)； (b)如SEQ ID NO.:2所示的重链互补决定区2 (CDR2)； (c)如SEQ ID NO.:3所示的重链互补决定区3 (CDR3)； (d)如SEQ ID NO.:4所示的轻链互补决定区1 (CDR1)； (e)如SEQ ID NO.:5所示的轻链互补决定区2 (CDR2)；和 (f)如SEQ ID NO.:6所示的轻链互补决定区3(CDR3)，且其中该对FAP特异性的抗原结合位点包含： (a)如SEQ ID NO.:9所示的重链互补决定区1 (CDR1)； (b)如SEQ ID NO.:10所示的重链互补决定区2 (CDR2)； (c)如SEQ IDNO.:11所示的重链互补决定区3 (CDR3)； (d)如SEQ ID NO.:12所示的轻链互补决定区1(CDR1)； (e)如SEQ ID NO.:13所示的轻链互补决定区2 (CDR2)；和 (f)如SEQ ID NO.:14所示的轻链互补决定区3 (CDR3)；和第二容器，装有包含选自伊立替康，奥沙利铂，5-FU，MDM2抑制剂RG7388，Bcl-2抑制剂ABT199，Abraxane，帕利他赛，吉西他滨，硼替佐米，环巴胺，PARP抑制剂PJ34，异磷酰胺或抗VEGF抗体的第二治疗剂的组合物。

24.权利要求23的试剂盒，其中该对DR5特异性的抗原结合位点包含如SEQ ID NO.:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO.:8所示的轻链可变区；且该对FAP特异性的抗原结合位点包含如SEQ ID NO.:15所示的重链可变区和如SEQ ID NO.:16所示的轻链可变区。

25.权利要求23或24的试剂盒，其中该双特异性抗体包含SEQ ID NO：18，19和20的氨基酸序列或该双特异性抗体包含SEQ ID NO：17，19和20的氨基酸序列。

26.权利要求23至25任一项的试剂盒，其中该双特异性抗体包含一个Fc域，各自包含对DR5特异性的抗原结合位点的两个Fab片段，和各自包含对FAP特异性的抗原结合位点的两个Fab片段。

27.权利要求26的试剂盒，其中包含对FAP特异性的抗原结合位点的Fab片段的重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。

28.权利要求26或27的试剂盒，其中至少一个该Fab片段经肽接头连接至该Fc域。

29.权利要求26至28任一项的试剂盒，其中该Fc域的每个亚基包含三处降低对活化性或抑制性Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代，其中所述氨基酸替代为L234A，L235A和P329G，其中该癌症为结缔组织增生性黑素瘤。