CN111655731A - 用靶向性4-1bb(cd137)激动剂的组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及采用4‑1BB(CD137)激动剂,特别是含有4‑1BBL三聚体的抗原结合分子与HER‑2靶向剂组合的组合疗法,这些组合疗法用于治疗癌症的用途,和使用该组合疗法的方法。

Description

用靶向性4-1BB(CD137)激动剂的组合疗法
发明领域
本发明涉及采用4-1BB(CD137)激动剂(特别是含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子)和HER-2靶向剂的组合疗法,和这些组合疗法用于治疗癌症的用途和使用该组合疗法的方法。
发明背景
癌症是全世界首要死因之一。尽管有治疗选项的进步,具有晚期癌症的患者的预后仍然较差。因此,对在不引起不可接受的毒性的情况下延长癌症患者的存活的最佳疗法存在持久且迫切的医学需要。最近来自临床试验的结果已经显示免疫疗法能延长癌症患者的总体存活及引起持久的响应。尽管有这些有希望的结果,当前基于免疫的疗法仅仅在一部分患者中有效,而且需要组合策略来改善治疗益处。
人表皮生长因子受体-2(HER-2；ErbB2)是一种受体酪氨酸激酶和跨膜受体的表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员。HER-2在一系列肿瘤类型中过表达,而且它涉及疾病起始和进展。它与较差的预后有关。例如,在大约30％的人乳腺癌中观察到HER-2的过表达,而且它涉及与这些肿瘤有关的攻击性生长和较差的临床结局(Slamon et al.(1987)Science235:177-182)。
人源化抗HER-2单克隆抗体曲妥珠单抗(CAS 180288-69-1,
Figure BDA0002598125050000011
huMAb4D5-8,rhuMAb HER2,Genentech)靶向HER-2的胞外域(US 5677171；US 5821337；US6054297；US 6165464；US 6339142；US 6407213；US 6639055；US 6719971；US 6800738；US7074404；Coussens et al.(1985)Science 230:1132-9；Slamon et al.(1989)Science244:707-12；Slamon et al.(2001)New Engl J Med 344:783-792)。已经显示曲妥珠单抗抑制过表达HER-2的人肿瘤细胞的增殖且是抗体依赖性细胞性细胞毒性(ADCC)的介导物(Hudziak et al.(1989)Mol Cell Biol 9:1165-72；Lewis et al.(1993)Cancer ImmunolImmunother 37:255-63；Baselga et al.(1998)Cancer Res 58:2825-2831；Hotaling etal.(1996)[摘要]Proc Annual Meeting Am Assoc Cancer Res 37:471；Pegram MD etal.(1997)[摘要]Proc Am Assoc Cancer Res 38:602；Sliwkowski et al.(1999)Seminars in Oncology 26(4),Suppl 12:60-70；Yarden Y.and Sliwkowski,M.(2001)Nature Reviews:Molecular Cell Biology,Macmillan Magazines,Ltd.,Vol.2:127-137)。
Figure BDA0002598125050000021
(曲妥珠单抗,Genentech Inc.)在1998年批准用于治疗具有HER2过表达性转移性乳腺癌的患者(Baselga et al.(1996)J Clin Oncol 14:737-744)。在2006年,FDA批准
Figure BDA0002598125050000022
作为含有多柔比星,环磷酰胺和帕利他赛的治疗方案的一部分,用于具有HER2阳性,结阳性乳腺癌的患者的辅助治疗。
曲妥珠单抗-MCC-DM1(T-DM1,曲妥珠单抗美坦新,ado-曲妥珠单抗美坦新,
Figure BDA0002598125050000023
),一种用于治疗HER2阳性乳腺癌的新颖的抗体-药物缀合物(ADC),由经由MCC接头在赖氨酸侧链处与曲妥珠单抗缀合的细胞毒剂DM1(一种含有硫醇的美登木生物碱抗微管剂)构成,平均药物负荷(药物与抗体比率)约3.5。在结合在肿瘤细胞上表达的HER2之后,T-DM1经历受体介导的内在化,导致含有DM1的细胞毒性分解代谢物的胞内释放及随后的细胞死亡。FDA在2013年批准以商标
Figure BDA0002598125050000024
销售的ado-曲妥珠单抗美坦新用于治疗先前接受用曲妥珠单抗和紫杉烷的治疗的具有HER2阳性,转移性乳腺癌的患者。
帕妥珠单抗(也称作重组人源化单克隆抗体2C4,rhuMAb 2C4,
Figure BDA0002598125050000025
Genentech,Inc.,South San Francisco)是另一种靶向HER-2的抗体治疗。帕妥珠单抗是HER二聚化抑制剂(HDI)且发挥抑制HER2与其它HER受体(诸如EGFR/HER1,HER2,HER3和HER4)形成活性异二聚体或同二聚体的能力的功能。见例如Harari and Yarden,Oncogene19:6102-14(2000)；Yarden and Sliwkowski,Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37(2001)；Sliwkowski,Nat Struct Biol 10:158-9(2003)；Cho et al.,Nature 421:756-60(2003)；和Malik et al.,Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7(2003)；US 7560111。
Figure BDA0002598125050000026
首先在2012年批准与曲妥珠单抗和多西他赛组合用于治疗具有高级或晚期(转移性)HER2阳性乳腺癌的患者。使用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合疗法同时还批准用于HER2阳性,局部晚期,炎性,或早期乳腺癌的新辅助(在手术之前)治疗和用于处于复发高风险的HER2阳性早期乳腺癌(EBC)的辅助(在手术之后)治疗。相信Perjeta和Herceptin的作用机制彼此互补,因为二者均结合HER2受体但结合不同位置。认为Perjeta和Herceptin的组合提供对HER信号传导途径的更加全面的双重阻断,如此阻止肿瘤细胞生长和存活。
针对人ErbB2的II,III和IV域的双特异性,二价HER-2抗体公开于WO 2012/143523。称作Herceptarg的包含抗体rhuMab 2C4和hu4D5的优化变体的双特异性HER-2抗体描述于WO 2015/091738。
尽管曲妥珠单抗在乳腺癌中的治疗功效得到较好证明,有许多患者因抗性而没有受益于曲妥珠单抗。鉴于在表达低水平的HER2的特定癌症中缺乏有效的抗HER2疗法,对当前疗法的抗性,和HER-2相关癌症的流行度,需要新的疗法来治疗此类癌症。
TNF受体超家族的一个成员,4-1BB(CD137)最初被鉴定为由激活的T细胞表达的可诱导分子(Kwon and Weissman,1989,Proc Natl Acad Sci USA 86,1963-1967)。随后的研究证明许多其它免疫细胞也表达4-1BB,包括NK细胞,B细胞,NKT细胞,单核细胞,嗜中性细胞,肥大细胞,树突细胞(DC)和非造血起源的细胞,诸如内皮和平滑肌细胞(Vinay andKwon,2011,Cell Mol Immunol 8,281-284)。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多通过各种刺激性信号,诸如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发,以及经由共刺激性分子或促炎性细胞因子的受体诱导的信号传导而可诱导和驱动(Diehl et al.,2002,J Immunol 168,3755-3762；Zhang et al.,2010,Clin Cancer Res 13,2758-2767)。
4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)在1993年鉴定(Goodwin et al.,1993,Eur JImmunol 23,2631-2641)。已经显示4-1BBL的表达局限在专职抗原呈递细胞(APC)上，诸如B细胞,DC和巨噬细胞。4-1BBL的可诱导表达对于包括αβ和γδT细胞子集二者的T细胞,和内皮细胞是特征性的(Shao and Schwarz,2011,J Leukoc Biol 89,21-29)。
经由4-1BB受体(例如通过4-1BBL接合)的共刺激激活T细胞(CD4+和CD8+子集二者)内的多种信号传导级联,强力提升T细胞激活(Bartkowiak and Curran,2015)。与TCR触发组合,激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞的增殖,刺激淋巴因子分泌并降低T淋巴细胞对激活诱导的细胞死亡的敏感性(Snell et al.,2011,Immunol Rev 244,197-217)。这种机制作为癌症免疫疗法中的第一个概念证据得到进一步发展。在一种临床前模型中针对4-1BB的激动性抗体在荷瘤小鼠中的施用导致有力的抗肿瘤效果(Melero et al.,1997,Nat Med3,682-685)。后来,越来越多的证据指示4-1BB通常只在与其它免疫调控性化合物,化疗试剂,肿瘤特异性疫苗接种或放疗组合施用时展现它作为抗肿瘤剂的效力(Bartkowiak andCurran,2015,Front Oncol 5,117)。
TNFR超家族的信号传导需要三聚化配体的交联来与受体啮合,因此需要野生型Fc结合的4-1BB激动性抗体也如此(Li and Ravetch,2011,Science 333,1030-1034)。然而,在小鼠中具有功能性活性Fc域的4-1BB特异性激动性抗体的系统施用导致与肝毒性相关的CD8+T细胞的流入(Dubrot et al.,2010,Cancer Immunol Immunother 59,1223-1233),这在功能性Fc受体缺失下减弱或显著减轻。在临床中,一种Fc胜任的4-1BB激动性抗体(BMS-663513)(NCT00612664)引起4级肝炎,导致试验终止(Simeone and Ascierto,2012,JImmunotoxicol 9,241-247)。因此,需要有效且更加安全的4-1BB激动剂。
已经生成由4-1BB配体的一个胞外域和单链抗体片段(Hornig et al.,2012,JImmunother 35,418-429；Müller et al.,2008,J Immunother 31,714-722)或与重链的C端融合的单个4-1BB配体(Zhang et al.,2007,Clin Cancer Res 13,2758-2767)构成的融合蛋白。WO 2010/010051公开了由彼此连接且与抗体部分融合的三个TNF配体外域组成的融合蛋白的生成。在本发明中,由三聚且因而有生物学活性的4-1BB配体和对肿瘤相关抗原特异性的抗原结合域和Fc无活性域构成的抗原结合分子显示特别稳定且强健。对于经由4-1BB(CD137)的肿瘤特异性共刺激,包含靶向肿瘤基质中的FAP的抗原结合域和4-1BB配体三聚体的分子显示特别有用,以下称作FAP-4-1BBL。通过FAP靶向性特异性交联,FAP抗原结合域替换对Fc介导的毒性(特别是在肝中)负有责任的非特异性FcγR介导的交联,如此降低毒性的风险。
我们在本文中描述一种新颖的用于表达HER-2的肿瘤的组合疗法。
发明概述
本发明涉及4-1BB(CD137)激动剂,特别是含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子,和它们与HER-2靶向疗法组合的用途,特别是它们在一种用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中的用途。已经发现本文中描述的组合疗法在抑制肿瘤生长和消除肿瘤细胞方面比单独用该4-1BB激动剂或已知的HER-2靶向疗法的治疗更加有效。
在一些方面,本发明提供供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂与HER-2靶向剂组合使用且其中该4-1BB激动剂是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
在一些方面,该HER-2靶向剂包含HER-2抗体,双特异性HER-2抗体和/或HER-2抗体药物缀合物。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和曲妥珠单抗美坦新组成的组。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新的组合。在一些方面,该HER-2靶向剂包含选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗和玛格妥昔单抗(margetuximab)组成的组的HER-2抗体。在一个方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。更加特别地,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗。在一些方面,该HER-2靶向是糖工程化HER-2抗体,例如TrasGex。在一些方面,该HER-2靶向剂是双特异性HER-2抗体,例如Herceptarg。在一些方面,该HER-2靶向剂是HER-2抗体药物缀合物,特别是曲妥珠单抗美坦新(ado-曲妥珠单抗美坦新)。
在一些方面,该4-1BB激动剂包含三个4-1BBL外域或其片段。在一些方面,该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段的分子且其中该4-1BBL外域包含选自由SEQ IDNO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在又一些方面,该4-1BB激动剂是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。在一些方面,该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。在一个方面,该肿瘤相关抗原选自由成纤维细胞激活蛋白(FAP)和CEA组成的组。
在又一些方面,该4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。在一些方面,该4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。在一个特定方面,该4-1BB激动剂是包含有降低Fcγ受体结合和/或效应器功能的修饰的Fc域的抗原结合分子。通过肿瘤相关抗原的交联使之有可能避免非特异性FcγR介导的交联和如此可以施用与常用4-1BB抗体相比更高和更加有效剂量的该4-1BB激动剂。
在一些方面,该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗原结合域的抗原结合分子。在一些方面,该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含
(a)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQID NO:18的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面,该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
在一些方面,该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。在一些方面,该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:(a)至少一个能够特异性结合FAP的Fab域,该能够特异性结合FAP的Fab域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP),和(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ IDNO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
在另一个方面,该4-1BB激动剂是包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第二轻链的抗原结合分子。
在一些方面,该4-1BB激动剂是抗FAP/抗4-1BB双特异性抗体。
在另一个方面,该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子。在一些方面,该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含(a)重链可变区(VHCEA)和轻链可变区(VLCEA),该重链可变区(VHCEA)包含(i)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLCEA)包含(iv)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3。
在另一个方面,该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA)。
在另一个方面,该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
在一些方面,该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,该能够特异性结合CEA的Fab域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
在又一个方面,该4-1BB激动剂是抗CEA/抗4-1BB双特异性抗体。
在其它方面,该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。在又一些方面,该4-1BB激动剂与该HER-2靶向剂协同作用。在其它方面,该4-1BB激动剂与该HER-2靶向剂并行,在该HER-2靶向剂前,或在该HER-2靶向剂后施用。
在又一些方面,提供的是一种包含4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合。在一个方面,该组合供作为药物使用,其中该4-1BB激动剂和HER-2靶向剂供同时施用。在其它方面,该组合供作为药物使用,其中该4-1BB激动剂和HER-2靶向剂供顺序施用。
在另一个方面,有提供一种药学产品,其包含(A)包含作为活性组分的4-1BB激动剂和药学可接受载剂的第一组合物；和(B)包含作为活性组分的HER-2靶向剂和药学可接受载剂的第二组合物,供组合,顺序或同时,治疗疾病,特别是癌症中使用的。
在又一个方面,有提供一种包含4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的药学组合物。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和曲妥珠单抗美坦新组成的组。在一些方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新的组合。在又一些方面,有提供供治疗癌症或延迟癌症进展,特别是治疗晚期和/或转移性实体瘤中使用的药学组合物。
在又一个方面,本发明涉及4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合在制造用于治疗增殖性疾病,特别是癌症或延迟增殖性疾病,特别是癌症进展的药物中的用途。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和曲妥珠单抗美坦新组成的组。在一些方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新的组合。
在另一个方面,本发明提供一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包含对该受试者施用有效量的4-1BB激动剂和有效量的HER-2靶向剂。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和曲妥珠单抗美坦新组成的组。在一些方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新的组合。
在一些方面,本发明涉及一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包含对该受试者施用有效量的4-1BB激动剂和有效量的HER-2靶向剂,其中该4-1BB激动剂包含三个4-1BBL外域或其片段。在一些方面,该4-1BB激动剂是本文中提供的任何4-1BB激动剂。在一些方面,该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。在一些方面,该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂静脉内或皮下施用。在一些方面,该4-1BB激动剂与该HER-2靶向剂并行,在该HER-2靶向剂前,或在该HER-2靶向剂后施用。
在又一些方面,本发明涉及供治疗癌症或延迟癌症进展中使用的与HER-2靶向剂或药学组合物组合的4-1BB激动剂,4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合在制造用于治疗增殖性疾病,特别是癌症或延迟增殖性疾病,特别是癌症进展的药物中的用途,或一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其中该癌症是HER-2阳性癌症。在一些方面,该癌症是乳腺癌,卵巢癌,胃癌,胃的癌,食管癌,肺癌,子宫癌,唾液管癌,膀胱癌,子宫内膜癌,胰腺癌,结肠癌,前列腺癌,和/或头和颈癌。
附图简述
图1显示具体FAP-4-1BBL抗原结合分子。在实施例1中更加详细地描述这些分子。深黑色点代表节-入-穴修饰。图1A显示在邻近4-1BBL二聚体和4-1BBL单体的CH1和CL域中有修饰的单价FAP含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子。因为它包含FAP结合物4B9,所以它在本文中命名为mono FAP(4B9)-4-1BBL。图1B显示有结合物FAP(4B9)的二价构建物,称作biFAP(4B9)-4-1BBL。图1C和1D显示非靶向性对照分子(FAP结合物已经用非结合性DP47 Fab替换)。
图2A和2B分别显示杂合替代物FAP-mu4-1BBL(分析物1)对固定化的鼠4-1BB和人FAP或鼠FAP(分析物2)的同时结合。在图2C中显示鼠双特异性FAP-4-1BB抗体muFAP-4-1BB(分析物1)对固定化的鼠4-1BB和鼠FAP(分析物2)的同时结合。
图3显示如实施例4中描述的C57BL/6小鼠中单一注射后muFAP-4-1BB的药动学概况。观察到稳定的PK行为,其提示可以以一周一次进度表施用化合物。
图4A和4B显示如实施例5中描述的huCD16TgScid小鼠的处理进度表和处理组。
图5A显示如用单独的曲妥珠单抗,单独的杂合FAP-mu4-1BBL,或二者的组合处理的小鼠中观察到的肿瘤生长动力学(均值+/-SEM)。所有处理组的每只动物的个别肿瘤生长动力学在图5B(对照组),5C(用单独的曲妥珠单抗处理),5D(用单独的FAP-mu4-1BBL处理)和5E(用组合处理)中显示。标示了研究终止时无肿瘤小鼠的数目。
发明详述
定义
除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域中一般使用的相同的含义。出于解释此说明书的目的,会应用下述定义,而且在适宜时,以单数使用的术语还会包括复数,反之亦然。
如本文中使用的,术语“抗原结合分子”以其最广义指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白。
术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体群体获得的抗体,即构成该群体的抗体个体是同一的和/或结合相同表位,除了可能的抗体变体,例如,含有天然发生的突变的或在单克隆抗体制备物的生成期间产生的,此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比,单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体,每个该位点结合相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意味着抗原结合分子能够特异性结合至少两种截然不同的抗原性决定簇。典型地,双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点,其每个是对不同抗原性决定簇特异性的。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇,特别是在两种截然不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。
如本申请内使用的术语“价”表示抗原结合分子中规定数目的结合位点的存在。照此,术语“二价”,“四价”,和“六价”分别表示抗原结合分子中两个结合位点,四个结合位点,和六个结合位点的存在。
术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指具有与天然抗体结构实质性相似的结构的抗体。“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由成二硫键的两条轻链和两条重链构成。自N端至C端,每条重链具有一个可变区(VH),也称作可变重域或重链可变域,接着是三个恒定域(CH1,CH2,和CH3),也称作重链恒定区。类似地,自N端至C端,每条轻链具有一个可变区(VL),也称作可变轻域或轻链可变域,接着是一个轻链恒定域(CL),也称作轻链恒定区。抗体的重链可指派至五种型之一,称作α(IgA),δ(IgD),ε(IgE),γ(IgG),或μ(IgM),其中一些可进一步分成亚型,例如γ1(IgG1),γ2(IgG2),γ3(IgG3),γ4(IgG4),α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可指派至两种型之一,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)2；双抗体,三抗体,四抗体,交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和单域抗体。关于某些抗体片段的综述,参见Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；还参见WO93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论,参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的,参见例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger et al.,Proc NatlAcad Sci USA90,6444-6448(1993)。Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。单域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术来生成抗体片段,包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成,如本文中描述的。
完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段,称作“Fab”片段,每个含有重和轻链可变域,还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。如此,如本文中使用的,术语“Fab片段”指包含包含轻链的VL域和恒定域(CL)的轻链片段,和重链的VH域和第一恒定域(CH1)的抗体片段。Fab’片段因在重链CH1域的羧基末端增加少数残基而与Fab片段不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab’)2片段。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”指其中重和轻链的可变区或恒定区任一交换的Fab片段。交换Fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中:一方面,Fab重和轻链的可变区交换,即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链,和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(VLVH)。另一方面,当Fab重和轻链的恒定区交换时,交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链,和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一:a)VH-CH1-接头-VL-CL,b)VL-CL-接头-VH-CH1,c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；且其中所述接头是至少30个氨基酸,优选32至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL域和CH1域之间的天然二硫键而稳定化。另外,这些单链Fab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照Kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。
“交换单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一:a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成特异性结合抗原的抗原结合位点,且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。另外,这些x-scFab分子可通过经由半胱氨酸残基的插入(例如依照Kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是以10至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重(VH)和轻(VL)链可变区的融合蛋白。接头经常富含出于柔性的甘氨酸,以及出于溶解性的丝氨酸或苏氨酸,而且可将VH的N端与VL的C端连接,或反之亦然。尽管去除恒定区并引入接头,此蛋白质保留原始抗体的特异性。scFv抗体描述于例如Houston,J.S.,Methods inEnzymol.203(1991)46-96。另外,抗体片段包含具有VH域的特征(即能够与VL域一起装配)或VL域的特征(即能够与VH域一起装配)的单链多肽,VH域与VL域一起装配成功能性抗原结合位点并由此提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的,例如,纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)已经用作抗原结合域的备选支架,参见例如Gebauer and Skerra,Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.CurrOpin Chem Biol 13:245-255(2009)和Stumpp et al.,Darpins:A new generation ofprotein therapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面,支架抗原结合蛋白选自由CTLA-4(Evibody),脂质运载蛋白(Anticalin),蛋白A衍生的分子,诸如蛋白A的Z域(Affibody),A域(Avimer/Maxibody),血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin),抗体轻链或重链的可变域(单域抗体,sdAb),抗体重链的可变域(纳米抗体,aVH),VNAR片段,纤连蛋白(AdNectin),C型凝集素域(Tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变域(VNAR片段),人γ-晶体蛋白或泛素(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型域,微体,诸如来自knottin家族的蛋白质,肽适体和纤连蛋白(adnectin)组成的组。
脂质运载蛋白是一个细胞外蛋白质家族,其转运小的疏水性分子,诸如类固醇,胆红素,类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构,在锥形结构的开口端具有一些环,能改造成结合不同靶抗原。Anticalin的尺寸介于160-180个氨基酸之间,而且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000),US7250297B1和US20070224633。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)衍生自锚蛋白,锚蛋白是介导整合膜蛋白附着至细胞骨架的一个蛋白质家族。单个锚蛋白重复是一个33个残基的基序,由两个α-螺旋和一个β-转角组成。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基,它们能改造成结合不同靶抗原。通过增加模块的数目(亲和力成熟的一种方法)能增加它们的结合界面。进一步的详情参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)和US20040132028A1。
单域抗体是由单个单体可变抗体域组成的抗体片段。第一种单域是自来自骆驼科动物(camelids)的抗体重链的可变域衍生的(纳米抗体或VHH片段)。而且,术语单域抗体包括自主的(autonomous)人重链可变域(aVH)或自鲨鱼衍生的VNAR片段。
与参照分子“结合相同表位的抗原结合分子”指如下的抗原结合分子,抗原结合分子在竞争测定法中将参照分子对其抗原的结合阻断50％或更多,相反,参照分子在竞争测定法中将抗原结合分子对其抗原的结合阻断50％或更多。
术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含与抗原的部分或全部特异性结合且互补的区域的部分。在抗原较大的情况中,抗原结合分子可仅仅结合抗原的特定部分,该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个可变域(也称作可变区)提供。优选地,抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文中使用的,术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义,而且指多肽大分子上的如下位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构造),抗原结合模块与该位点结合,形成抗原结合模块-抗原复合物。有用的抗原性决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上,在病毒感染的细胞的表面上,在其它患病细胞的表面上,在免疫细胞的表面上,游离在血清中,和/或在细胞外基质(ECM)中找到。作为本文中的抗原有用的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。在一个特定实施方案中,抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况中,该术语涵盖“全长”未加工的蛋白质以及源自细胞中的加工的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。
“特异性结合”意味着结合对于抗原是选择性的且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子结合特定抗原的能力可经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施方案中,抗原结合分子对无关蛋白质的结合的程度小于抗原结合分子对抗原的结合的约10％,如通过例如SPR测量的。在某些实施方案中,结合抗原的分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10-8M或更小,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配偶(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力一般可以用解离常数(Kd)来代表,它是解离和结合速率常数(分别是koff和kon)的比。如此,等同的亲和力可包含不同的速率常数,只要速率常数的比保持相同。可以通过本领域已知的常用方法来测量亲和力,包括本文中描述的那些。用于测量亲和力的一种特定方法是表面等离振子共振(SPR)。
术语“肿瘤相关抗原”意指任何由肿瘤细胞或在肿瘤基质中高度表达的抗原。特定的肿瘤相关抗原是CEA或FAP。
术语“成纤维细胞活化蛋白(FAP)”,也称作脯氨酰内肽酶FAP或分离酶(Seprase)(EC 3.4.21),指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。该术语包括“全长”未加工的FAP以及源自细胞中的加工的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,本发明的抗原结合分子能够特异性结合人,小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(版本149,SEQ ID NO:56),或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中显示。人FAP的细胞外结构域(ECD)自氨基酸位置26延伸至760。带His标签的人FAP ECD的氨基酸序列在SEQ ID NO:81中显示。小鼠FAP的氨基酸序列在UniProt登录号P97321(版本126,SEQID NO:58),或NCBI RefSeq NP_032012.1中显示。小鼠FAP的细胞外结构域(ECD)自氨基酸位置26延伸至761。SEQ ID NO:83显示带His标签的小鼠FAP ECD的氨基酸序列。SEQ ID NO:84显示带His标签的食蟹猴FAP ECD的氨基酸序列。优选地,本发明的抗FAP结合分子结合FAP的细胞外结构域。例示性抗FAP结合分子在国际专利申请No.WO 2012/020006 A2中描述。
术语“癌胚抗原(CEA)”,也称作癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5),指来自任何脊椎动物来源的任何天然CEA,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人CEA的氨基酸序列在UniProt登录号P06731(版本151,SEQ ID NO:61)中显示。CEA早已鉴定为肿瘤相关抗原(Gold andFreedman,J Exp Med.,121:439-462,1965；Berinstein N.L.,J Clin Oncol.,20:2197-2207,2002)。最初归类为仅仅在胎儿组织中表达的蛋白质,现在已经在若干正常成体组织中鉴定CEA。这些组织主要是上皮起源的,包括胃肠,呼吸,和泌尿生殖道的细胞,和结肠,子宫颈,汗腺,和前列腺的细胞(Nap et al.,Tumour Biol.,9(2-3):145-53,1988；Nap etal.,Cancer Res.,52(8):2329-23339,1992)。上皮起源的肿瘤以及它们的转移含有CEA作为肿瘤相关抗原。虽然CEA本身的存在不指示转化成癌性细胞,但是CEA的分布是指示性的。在正常组织中,CEA一般在细胞的顶端表面上表达(
Figure BDA0002598125050000161
S.,Semin CancerBiol.9(2):67-81(1999)),使得它对血流中的抗体不可及。与正常组织形成对比,CEA趋于在癌性细胞的整个表面上表达(
Figure BDA0002598125050000162
S.,Semin Cancer Biol.9(2):67-81(1999))。这种表达模式的变化使得CEA变成对于癌性细胞中的抗体结合是可及的。另外,CEA表达在癌性细胞中升高。而且,升高的CEA表达促进细胞间粘附增加,这可导致转移(Marshall J.,Semin Oncol.,30(a Suppl.8):30-6,2003)。CEA表达在各种肿瘤实体中的流行度一般很高。与已发表的数据一致,自己在组织样品中实施的分析确认其高流行度,大约是结肠直肠癌(CRC)中95％,胰腺癌中90％,胃癌中80％,非小细胞肺癌(NSCLC,这种情况中它与HER3共表达)中60％,和乳腺癌中40％；发现小细胞肺癌和成胶质细胞瘤中的低表达。
CEA容易自细胞表面切割并或是直接或是经由淋巴自肿瘤脱落入血流。由于这种特性,血清CEA的水平已用作诊断癌症和筛选癌症,特别是结肠直肠癌复发的临床标志物(Goldenberg D M.,The International Journal of Biological Markers,7:183-188,1992；Chau I.et al.,J Clin Oncol.,22:1420-1429,2004；Flamini et al.,Clin CancerRes.,12(23):6985-6988,2006)。
如本文中使用的“T细胞抗原”指在T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上呈现的抗原性决定簇。
如本文中使用的“T细胞活化性治疗剂”指能够在受试者中诱导T细胞活化的治疗剂,特别是为在受试者中诱导T细胞活化而设计的治疗剂。
如本文中使用的“活化性T细胞抗原”指由T淋巴细胞,特别是细胞毒性T淋巴细胞表达的抗原性决定簇,其在与抗原结合分子相互作用后能诱导或增强T细胞活化。特别地,抗原结合分子与活化性T细胞抗原的相互作用可诱导T细胞活化,其通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联进行。一种例示性活化性T细胞抗原是CD3。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗原结合分子结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区域。一般地,天然四链抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1,H2,H3),三个在VL中(L1,L2,L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基,后者具有最高的序列变异性和/或牵涉抗原识别。例示性高变环发生于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1,CDR-L2,CDR-L3,CDR-H1,CDR-H2,和CDR-H3)发生于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35B(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))。高变区(HVR)也称作互补决定区(CDR),而且在提到可变区中形成抗原结合区的部分时,这些术语在本文中可互换使用。这个特定区域已经由Kabat etal.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins ofImmunological Interest"(1983)和由Chothia et al.,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述,其中定义包括在针对彼此比较时的氨基酸残基的交叠或子集。无论如何,应用任一定义来提及抗体的CDR或其变体意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每一篇参考文献定义的CDR的适宜氨基酸残基在下文表A中作为比较列出。涵盖特定CDR的确切残基编号会取决于CDR的序列和大小而变化。基于抗体的可变区氨基酸序列,本领域技术人员能例行确定哪些残基构成特定CDR。
表A:CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-97
1表A中的所有CDR定义的编号方式依照Kabat等人(见下文)列出的编号规则。
2如表A中使用的具有小写“b”的“AbM”指如由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将“Kabat编号方式”的这种系统指派给任何可变区序列,不依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中使用的,“Kabat编号方式”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest"(1983)中列出的编号系统。除非另有规定,抗体可变区中具体氨基酸残基位置的编号的提及依照Kabat编号系统。
除了VH中的CDR1之外,CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”或“SDR”,它们是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短CDR或a-CDR的CDR区域中。例示性a-CDR(a-CDR-L1,a-CDR-L2,a-CDR-L3,a-CDR-H1,a-CDR-H2,和a-CDR-H3)发生于氨基酸残基31-34(L1),50-55(L2),89-96(L3),31-35B(H1),50-58(H2),和95-102(H3)(参见Almagro and Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外指明,HVR残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等人,见上文编号。
如本文中使用的,在抗原结合分子(例如抗体)的语境中术语“亲和力成熟的”指如下的抗原结合分子,其例如通过突变而自参照抗原结合分子衍生,与参照抗体结合相同抗原,优选结合相同表位；且对抗原具有比参照抗原结合分子要高的亲和力。亲和力成熟一般牵涉修饰抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基。典型地,亲和力成熟的抗原结合分子与初始参照抗原结合分子结合相同表位。
“框架”或“FR”指除了高变区(HVR)残基之外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成:FR1,FR2,FR3,和FR4。因而,HVR和FR序列一般在VH(或VL)中以下述顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文中的目的,“受体人框架”是包含自如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“自”人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列,或者它可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中,氨基酸变化的数目是10或更少,9或更少,8或更少,7或更少,6或更少,5或更少,4或更少,3或更少,或2或更少。在一些实施方案中,VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列同一。
术语“嵌合”抗体指如下的抗体,其中重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生。
抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,而且其中若干可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个实质性整个如下的可变域,其中整个或实质性整个HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些,而且整个或实质性整个FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可包含自人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指经历人源化的抗体。本发明涵盖的其它形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经自原始抗体的恒定区另外修饰或变化以生成依照本发明的特性,尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些。
“人”抗体是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义专门排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文中的术语“Fc域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基(即自IgG的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“隆起”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的,此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。在一个实施方案中,人IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号系统,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。
“节-入-穴”技术在例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中描述。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得该隆起可放置在该空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与隆起相同或相似大小的补偿性空腔。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个具体实施方案中,节修饰包含Fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代T366W,而穴修饰包含Fc域的两个亚基之另一中的氨基酸替代T366S,L368A和Y407V。在又一个具体实施方案中,Fc域中包含节修饰的亚基另外包含氨基酸替代S354C,而Fc域中包含穴修饰的亚基另外包含氨基酸替代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥,如此进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods248,7-15(2001))。
“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的Fc区的天然发生等位变体以及具有生成替代,添加,或删除的改变但并不实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如,可以自免疫球蛋白的Fc区的N端或C端删除一个或多个氨基酸,生物学功能没有实质性损失。可以依照本领域已知的一般规则来选择此类变体,从而对活性具有最小限度影响(参见例如Bowie,J.U.et al.,Science247:1306-10(1990))。
术语“效应器功能”指那些可归于抗体的Fc区的生物学活性,其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调,和B细胞活化。
“活化性Fc受体”是在受到抗体的Fc区啮合后引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32),和FcαRI(CD89)。一种特定活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637,版本141)。
“外域”是膜蛋白中延伸入细胞外空间(即靶细胞以外的空间)的结构域。外域通常是蛋白质中启动与表面接触的部分,这导致信号转导。如此,如本文中定义的4-1BBL的外域指4-1BBL中延伸入细胞外空间的部分(细胞外结构域),但还包括负责三聚化和结合相应的受体4-1BB的更短部分或其片段。如此,术语“4-1BBL的外域或其片段”指4-1BBL中形成细胞外结构域的细胞外结构域或其仍然能够结合受体的部分(受体结合域)。
“4-1BBL”或“4-1BB配体”或“CD137L”是能够共刺激T细胞的增殖和细胞因子生成的共刺激性TNF配体家族成员。共刺激性TNF家族配体能在与其相应的TNF受体相互作用时共刺激TCR信号,而且与其受体的相互作用导致TNFR相关因子(TRAF)的募集,这启动导致T细胞活化的信号传导级联。4-1BBL是一种II型跨膜蛋白。已经描述了具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的完整或全长4-1BBL在细胞的表面上形成三聚体。通过4-1BBL的外域的特定基序而实现三聚体的形成。所述基序在本文中命名为“三聚化区”。人4-1BBL序列的氨基酸50-254(SEQ ID NO:63)形成4-1BBL的细胞外结构域,但是甚至其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中,术语“4-1BBL的外域或其片段”指具有选自SEQ ID NO:4(人4-1BBL的氨基酸52-254),SEQ ID NO:1(人4-1BBL的氨基酸71-254),SEQ ID NO:3(人4-1BBL的氨基酸80-254),SEQ ID NO:2(人4-1BBL的氨基酸85-254),SEQ ID NO:5(人4-1BBL的氨基酸71-248),SEQ ID NO:6(人4-1BBL的氨基酸85-248),SEQ ID NO:7(人4-1BBL的氨基酸80-248)和SEQ ID NO:8(人4-1BBL的氨基酸52-248)的氨基酸序列的多肽,但是能够三聚化的外域的其它片段也包括在本文中。
如本文中使用的,术语“4-1BB”或“CD137”指来自任何脊椎动物来源的任何天然4-1BB,包括哺乳动物,诸如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。该术语涵盖“全长的”,未加工的4-1BB以及源自细胞中加工的任何形式的4-1BB。该术语还涵盖4-1BB的天然发生变体,例如剪接变体或等位基因变体。一种例示性人4-1BB的氨基酸序列在SEQ ID NO:88(Uniprot登录号Q07011)中显示,一种例示性鼠4-1BB的氨基酸序列在SEQ ID NO:89(Uniprot登录号P20334)中显示且一种例示性食蟹猴4-1BB(来自猕猴(Macaca mulatta))的氨基酸序列在SEQ ID NO:66(Uniprot登录号F6W5G6)中显示。
术语“抗4-1BB抗体”,“抗4-1BB”,“4-1BB抗体”和“特异性结合4-1BB的抗体”指能够以足够的亲和力结合4-1BB,使得抗体可用作靶向4-1BB中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中,抗4-1BB抗体对无关的、非4-1BB蛋白的结合程度小于抗体对4-1BB的结合的约10％,如例如通过放射性免疫测定法(RIA)或流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中,结合4-1BB的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-6M或更少,例如10-68M至10-13M,例如10-8M至10-10M)的解离常数(KD)。
术语“HER-2”(也称作“ErbB2”,“ErbB2受体”,或“c-Erb-B2”)指源自细胞中HER-2前体蛋白的加工的任何天然,成熟HER-2。该术语包括来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人和食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的HER-2,除非另外指明。该术语还包括HER-2的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。例示性人HER-2蛋白的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:95。
术语“肽接头”指包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或在本文中描述。合适的非免疫原性接头肽是例如(G4S)n,(SG4)n或G4(SG4)n肽接头,其中“n”一般是介于1和10之间,典型地介于2和4之间的数目,特别是2,即肽选自由GGGGS(SEQ ID NO:67)GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:68),SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:69)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:70)组成的组,但是还包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:71),(G4S)3(SEQ ID NO:72),(G4S)4(SEQ ID NO:73),GSGSGSGS(SEQ ID NO:74),GSGSGNGS(SEQID NO:75),GGSGSGSG(SEQ ID NO:76),GGSGSG(SEQ ID NO:77),GGSG(SEQ ID NO:78),GGSGNGSG(SEQ ID NO:79),GGNGSGSG(SEQ ID NO:80)和GGNGSG(SEQ ID NO:81)。特别感兴趣的肽接头是(G4S)(SEQ ID NO:67),(G4S)2和GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:68)。
如此申请内使用的术语“氨基酸”表示天然发生羧基α-氨基酸的组,包含丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:A),精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp,D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G),组氨酸(his,H),异亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L),赖氨酸(lys,K),甲硫氨酸(met,M),苯丙氨酸(phe,F),脯氨酸(pro,P),丝氨酸(ser,S),苏氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr,Y),和缬氨酸(val,V)。
“融合”或“连接”意味着各构件(例如多肽和4-1BBL的外域)通过肽键,或是直接地或是经由一个或多个肽接头连接。
关于参照多肽(蛋白质)序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域的技能内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(Washington D.C.,20559),以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(South San Francisco,California)可得到ALIGN-2程序,或者可以自源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统,包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算:
100 乘 分数X/Y
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中打分为同一匹配的氨基酸残基的数目,且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况中,A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。
在某些实施方案中,涵盖本文中提供的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如,可能想要改善抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗原结合分子的氨基酸序列变体可通过将适宜修饰引入编码该分子的核苷酸序列,或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的删除,和/或插入和/或替代。可进行删除,插入,和替代的任何组合来得到最终的构建物,前提是最终的构建物拥有想要的特征,例如抗原结合。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和框架(FR)。保守替代在表B中在标题“优选替代”下提供且在下文中提及氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可将氨基酸替代引入感兴趣的分子并对产物筛选想要的活性,例如保留/改善的抗原结合,降低的免疫原性,或改善的ADCC或CDC。
表B
原始残基 例示性替代 优选替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp,Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
氨基酸可以依照共同的侧链特性来分组:
(1)疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；
(2)中性亲水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；
(3)酸性的:Asp,Glu；
(4)碱性的:His,Lys,Arg；
(5)影响链取向的残基:Gly,Pro；
(6)芳香族的:Trp,Tyr,Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类别。
术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中有氨基酸替代的实质性变体。一般地,为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗原结合分子会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力,降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之,将一个或多个CDR残基突变并将变体抗原结合分子在噬菌体上展示并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。在某些实施方案中,可以在一个或多个CDR内发生替代,插入,或删除,只要此类变化不实质性降低抗原结合分子结合抗原的能力。例如,可以在CDR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如如本文中提供的保守替代)。一种对于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域有用的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085描述的。在此方法中,鉴定残基或靶残基的组(例如带电荷的残基,诸如Arg,Asp,His,Lys,和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。作为替代的候选,可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有想要的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗原结合分子。分子的其它插入变体包括与延长抗原结合分子的血清半衰期的多肽的N或C端的融合。
在某些实施方案中,改变本文中提供的抗原结合分子以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或去除一个或多个糖基化位点来方便地获得分子的糖基化变体。在抗原结合分子包含Fc区的情况中,可改变附着于其的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的双触角寡糖,其一般通过N连接附着至Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright et al.,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可进行抗原结合分子中的寡糖的修饰以创建具有某些改良特性的变体。在一个方面,提供具有缺乏(直接或间接)附着于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的抗原结合分子的变体。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能,参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。本发明的抗原结合分子的别的变体包括那些具有两分的寡糖的,例如,其中附着于Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc两分。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能,参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US2005/0123546(Umana等人)。还提供附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能且在例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中描述。
在某些实施方案中,可能想要创建本发明的抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体,例如“thioMAb”,其中分子的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中,替代的残基出现于分子的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,由此反应性硫醇基团放置在抗体的可及位点且可用于将抗体与其它模块诸如药物模块或接头-药物模块缀合以创建免疫缀合物。在某些实施方案中,可以用半胱氨酸替代任一个或多个下述残基:轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。
在某些方面,可进一步修饰本文中提供的抗原结合分子以含有本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(或是均聚物或是随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇,及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物的数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可基于下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的特定特性或功能,双特异性抗体衍生物是否会用于限定条件下的疗法,等。在另一个方面,提供抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam,N.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长的,而且包括但不限于对普通细胞没有损害,但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。
在另一个方面,可获得本文中提供的含有4-1BBL的抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒剂在内的一个或多个异源分子缀合的抗体。
术语“多核苷酸”指分离的核酸分子或构建物,例如信使RNA(mRNA),病毒衍生的RNA,或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键,诸如在肽核酸(PNA)中找到的)。术语“核酸分子”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段,例如DNA或RNA片段。
“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经自其天然环境移出的核酸分子,DNA或RNA。例如,出于本发明的目的,认为载体中包含的编码多肽的重组多核苷酸是分离的。分离的多核苷酸的别的例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部分或实质性)纯化的多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物,以及正和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件,诸如启动子,核糖体结合位点,或转录终止子。
具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指除了该多核苷酸序列可包括至多该参照核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外,该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列同一。换言之,为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸,参照序列中至多5％的核苷酸可以删除或用另一种核苷酸替代,或者,在参照序列中,总核苷酸的至多5％的数目的多个核苷酸可插入参照序列。参照序列的这些改变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方,或是在参照序列中的残基间个别散布或是以一个或多个连续组在参照序列内散布。实际上,使用已知的计算机程序,诸如上文关于多肽讨论的(例如ALIGN-2),可常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一。
术语“表达盒”指重组或合成生成的多核苷酸,具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列规定核酸元件。重组表达盒可并入质粒,染色体,线粒体DNA,质体DNA,病毒,或核酸片段。典型地,在其它序列以外,表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中,本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建物”同义且指用于将与其可操作联合的特定基因导入靶细胞并指导表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入其已经导入的宿主细胞的基因组的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体容许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体在靶细胞内,则由细胞转录和/或翻译机制生成由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。
术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用且指其中已经导入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体/转化子”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和自其衍生的后代,不管传代的次数。后代在核酸内容方面与亲本细胞可以不是完全同一,但是可含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。宿主细胞是可用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,诸如CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞,和植物细胞,仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。
药剂的“有效量”指在接受其施用的细胞或组织中导致生理变化必需的量。
依照本发明的组合疗法具有协同效应。两种化合物的“协同效应”是如下的,其中两种药剂的组合的效果大于它们个别的效果之和且在统计学上不同于对照和单一药物。在另一个实施方案中,本文中公开的组合疗法具有叠加效应。两种化合物的“叠加效应”是如下的,其中两种药剂的组合的效果是它们个别的效果之和且在统计学上不同于对照和/或单一药物。
药剂(例如药学组合物)的“治疗有效量”指在剂量和时间段方面有效实现想要的治疗或预防结果必需的量。例如,治疗有效量的药剂消除,减轻/减少,延迟,最小化或预防疾病的不利影响。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长类(例如人和非人灵长类,诸如猴),家兔,和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。特定地,个体或受试者是人。
术语“药学组合物”指其为此类形式的制剂,所述形式允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的,而且所述制剂不含另外的对会接受该配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的成分。
“药学可接受载剂”指药学组合物中除了活性组分以外,对受试者无毒的组分。药学可接受赋形剂包括但不限于缓冲剂,稳定剂,或防腐剂。
术语“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书,其含有关于关注此类治疗性产品的使用的适应症,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。
如本文中使用的,“治疗/处理”指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预,而且可以或是为了预防或是在临床病理学的过程中实施的。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。在一些实施方案中,使用本发明的分子来延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理学状况,即增殖性疾病,诸如实体瘤或黑素瘤。“肿瘤”包含一种或多种癌性细胞。如本文中使用的,术语“实体瘤”指通常不含有囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的或恶性的。癌症的例子包括但不限于癌瘤,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤和白血病或淋巴样恶性。此类癌症的更具体例子包括乳腺癌,鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌),肺癌(包括小细胞肺癌,非小细胞肺癌(“NSCLC”),肺腺癌和肺鳞癌),腹膜癌,肝细胞癌,胃的癌或胃癌(包括胃肠癌),胰腺癌,成胶质细胞瘤,宫颈癌,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,肝瘤,结肠癌,直肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜癌或子宫癌,唾液腺癌,肾癌或肾的癌,前列腺癌,外阴癌,甲状腺癌,肝的癌,肛门癌,阴茎癌,及头和颈癌。在一个优选实施方案中,癌症是乳腺癌。在另一个优选实施方案中,癌症是胃癌。
将肿瘤或癌症称为“0期”,“I期”,“II期”,“III期”,或“IV期”和此分类内的各个亚阶段指示使用本领域中已知的总体阶段分组(Overall Stage Grouping)或Roman数字分期(Roman Numeral Staging)方法分类肿瘤或癌症。虽然癌症的实际阶段取决于癌症的类型,但是一般地,0期癌症是原位损伤,I期癌症是小局部化肿瘤,II和III期癌症是展现出局部淋巴结累及的局部晚期肿瘤,而IV期癌症代表转移性癌症。每类肿瘤的特定阶段是熟练内科医生已知的。
术语“转移性乳腺癌”意指癌细胞通过血管或淋巴管自初始部位传播至身体中别处的一个或多个部位以在乳房外的一种或多种器官中形成一个或多个继发性肿瘤的乳腺癌状态。
“晚期”癌症是已经通过局部侵入或转移在起源的部位或器官外部扩散的癌症。因而,术语“晚期”癌症包括局部晚期和转移性疾病两者。“难治性”癌症是即使对癌症患者施用抗肿瘤剂,诸如化学疗法仍进展的癌症。难治性癌症的例子是铂难治的癌症。“复发性”癌症是在响应初始疗法,诸如手术后在初始部位处或在远端部位处已经再生长的癌症。“局部复发性”癌症是与先前治疗的癌症在相同位置中在治疗后复发的癌症。“能施手术的”或“可切除的”癌症是局限于原发性器官并且适合于手术(切除)的癌症。“非可切除的”或“不能切除的”癌症不能通过手术去除(切除)。
“展现HER表达,扩增或活化”的癌症或生物学样品是在诊断测试中表达(包括过表达)HER受体,具有扩增的HER基因,和/或在其它方面表明HER受体的活化或磷酸化的。
术语“HER-2阳性”和“HER-2表达性”在本文中可互换使用。“HER-2阳性”癌症包含具有高于正常的HER-2水平的癌细胞。HER-2阳性癌症的例子包括HER-2阳性乳腺癌和HER2阳性胃癌。任选地,HER-2阳性癌症是HER-2过表达性癌症,而且在某些实施方案中,HER-2阳性癌症具有2+或3+的免疫组织化学(IHC)得分和/或≥2.0的原位杂交(ISH)扩增比率。
原位杂交(ISH)使用与荧光,生色,或银检测系统(即FISH,CISH,或SISH),或CISH和SISH系统的组合(亮场双重ISH(BDISH)或双半抗原,双色ISH(DDISH))偶联的DNA探针测定her2拷贝的数目。可以使用单一探针进行ISH以仅仅枚举每个核的her2拷贝,或作为双探针技术,其中染色体17着丝粒探针(染色体枚举探针17,CEP17)的杂交容许测定her2:CEP17比率。可以作为双色技术(两种探针在相同载片上的共杂交)或作为单色测定法(在连续载片上使用每一种探针)实施两探针办法。her2:CEP17比率有时看作比均值her2拷贝数更好地反映her2扩增状态,因为均值her2拷贝数还取决于其它参数,诸如肿瘤的有丝分裂指数,切片厚度,核截短效应,和异常染色体拷贝数(异数性(aneusomy))。短语“≥2.0的原位杂交(ISH)扩增比”指≥2.0的her2:CEP17比率。关于更多详情,见例如Sauter G,etal.Guidelines for human epidermal growth factor receptor 2testing:biologicand methodologic considerations.J Clin Oncol 2009；27:1323-1333,和综述Hanna etal.Modern Pathology(2014)27,4-18。
在本文中,“患者”或“受试者”是人患者。患者可以是“癌症患者”,即患有或有风险患有癌症,特别是胃癌或乳腺癌的一种或多种症状的患者。
“患者群体”指癌症患者组。可以使用此类群体证明药物,诸如帕妥珠单抗的统计学显著的效力和/或安全性。“复发”患者是在消退后具有癌症的体征或症状的患者。任选地,患者在辅助或新辅助治疗后已经复发。
“新辅助治疗”或“术前疗法”在本文中指在手术前给予的疗法。新辅助治疗的目的是提供即刻系统性治疗,从而潜在根治微转移,所述微转移在其它情况中在遵循手术,继之以系统性疗法的标准顺序时会增殖。新辅助治疗也可以帮助缩小肿瘤大小,从而容许最初不能切除的肿瘤的完全切除或者保留器官及其功能的部分。此外,新辅助治疗允许药物效力的体内评估,其可以指导随后治疗的选择。
“辅助疗法”在本文中指在确定性手术(其中不能检出残余疾病的证据)之后给予的疗法,从而来降低疾病复发的风险。辅助疗法的目标是预防癌症复发,及因此降低癌症相关死亡的机会。辅助疗法在本文中明确排除新辅助治疗。
“化学疗法”是可用于治疗癌症的化学治疗剂的使用。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物,不管作用机制。化疗剂的类别包括但不限于:烷化剂类(alkylating agents),抗代谢物类(antimetabolites),纺锤体毒植物生物碱类(spindle poison plant alkaloids),细胞毒性/抗肿瘤抗生素类(cytotoxic/antitumor antibiotics),拓扑异构酶抑制剂类(topoisomerase inhibitors),抗体类(antibodies),光敏剂类(photosensitizers),和激酶抑制剂类(kinase inhibitors)。
“CD20”指B淋巴细胞抗原CD20,也称作B淋巴细胞表面抗原B1或白细胞表面抗原Leu-16,而且包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD20,包括哺乳动物,诸如灵长类动物(例如人),非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人CD20的氨基酸序列在Uniprot登录号P11836(版本149,SEQ ID NO:85)中显示。CD20是一种疏水性跨膜蛋白,具有大约35kD的分子量,在前B和成熟B淋巴细胞上表达。对应的人基因是跨膜4域,亚家族A,成员1,也称作MS4A1。这种基因编码跨膜4A基因家族的一个成员。这个新生蛋白质家族的成员特征在于共同的结构特征和相似的内含子/外显子剪接边界且在造血细胞和非淋巴样组织间展示独特的表达样式。这种基因编码在B细胞发育和分化成浆细胞中发挥作用的B淋巴细胞表面分子。这个家族成员在一簇家族成员间定位于11q12。这种基因的可变剪接产生编码相同蛋白的两种转录物变体。术语“CD20”涵盖“全长的”,未加工的CD20以及源自细胞中加工的任何形式的CD20。该术语还涵盖CD20的天然发生变体,例如剪接变体或等位基因变体。
术语“抗CD20抗体”和“结合CD20的抗体”指能够以足够的亲和力结合CD20,使得抗体可用作靶向CD20中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中,抗CD20抗体对无关的、非CD20蛋白的结合程度小于抗体对CD20的结合的约10％,如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中,结合CD20的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少,例如10-8M至10-13M,例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中,抗CD20抗体结合在来自不同物种的CD20间保守的CD20表位。
“II型抗CD20抗体”意指具有Cragg et al.,Blood 103(2004)2738-2743；Cragget al.,Blood 101(2003)1045-1052；Klein et al.,mAbs 5(2013),22-33中描述的II型抗CD20抗体的结合特性和生物学活性的抗CD20抗体。II型抗CD20抗体结合CD20上的II类表位,它并不将CD20定位至脂筏,显示ADCC活性,而是低CDC(如果它是IgG1同种型抗体的话),具有与结合I类CD20表位的抗体相比要少的结合B细胞的能力,显示同型聚集和强烈死亡诱导。II型抗CD20抗体的例子包括例如奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)(GA101),托西莫单抗(tositumumab)(B1),人源化的B-Ly1抗体IgG1(一种嵌合的人源化IgG1抗体,如披露于WO2005/044859),11B8 IgG1(如披露于WO 2004/035607)和AT80 IgG1。在一个特定方面,该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)(推荐的INN,WHO药物信息,Vol.26,No.4,2012,p.453)。如本文中使用的,奥滨尤妥珠单抗与GA101同义。商品名称是
Figure BDA0002598125050000341
或
Figure BDA0002598125050000342
这替换所有先前的型式(例如Vol.25,No.1,2011,p.75-76),而且以前称作阿夫土珠单抗(afutuzumab)(推荐的INN,WHO药物信息,Vol.23,No.2,2009,p.176；Vol.22,No.2,2008,p.124)。在一个方面,该II型抗CD20抗体是托西莫单抗(tositumomab)。
例示性的供本发明中使用的4-1BB激动剂
本发明涉及4-1BB激动剂和它们的与HER-2靶向疗法组合的用途,特别是它们在用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中的用途。在一些实施方案中,4-1BB激动剂和它们的与HER-2靶向疗法组合的用途是在一种用于治疗实体瘤或延迟实体瘤进展的方法中。
特别地,与HER-2靶向疗法组合使用的4-1BB激动剂是包含4-1BBL的分子。特别地,在本发明中使用的4-1BB激动剂包含三个4-1BBL外域或其片段。
在一个特定方面,4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段的分子且其中4-1BBL外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
如果它包含对肿瘤相关抗原,特别是癌细胞上的或基质中的靶物特异性的抗原结合域的话,4-1BB激动剂尤其有用。如此,在一个特定方面,4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)或CEA的抗原结合域的抗原结合分子。
在又一个方面,4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域的抗原结合分子,其中能够特异性结合FAP的抗原结合域包含
(a)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H3,轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个特定方面,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H3,轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3。
在又一个方面,4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域的抗原结合分子,其中能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或其中能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。更加特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
在另一个方面,4-1BB激动剂是进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的抗原结合分子。在一个方面,4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。特别地,4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。在一个特定方面,4-1BB激动剂是包含包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G的IgG1 Fc域的抗原结合分子。
在一个方面,4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
在一个特定方面,4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的Fab域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中抗原结合分子特征在于
(i)分别地,第一多肽含有CH1或CL域且第二多肽含有CL或CH1域,其中第二多肽与第一多肽通过CH1和CL域之间的二硫键连接,且其中第一多肽包含通过肽接头彼此且与CH1或CL域连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(ii)分别地,第一多肽含有CH3域且第二多肽含有CH3域,且其中第一多肽包含通过肽接头彼此且与CH3域的C端连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(iii)分别地,第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域,其中第二多肽与第一多肽通过CH1和CL域之间的二硫键连接,且其中第一多肽包含通过肽接头彼此且与VH或VL连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的一个4-1BBL外域或其片段。
在另一个方面,4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的Fab域,能够特异性结合FAP的Fab域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中抗原结合分子特征在于第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成的组的氨基酸序列且在于第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
在一个特定方面,4-1BB激动剂是选自由下述各项组成的组的抗原结合分子:
a)一种分子,其包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ IDNO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第二重链和包含SEQID NO:44的氨基酸序列的第二轻链；和
b)一种分子,其包含包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ IDNO:46的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的第二重链和包含SEQID NO:48的氨基酸序列的第二轻链。
特别地,4-1BB激动剂是包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第二轻链的抗原结合分子。
在另一个方面,4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,和
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽。
在一个方面,4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽,和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽与Fc域的两个亚基之一的N或C端氨基酸融合,任选经由肽接头。
特定的双特异性抗体描述于PCT公开号WO 2016/075278 A1或PCT公开号WO 2016/156291A1。
在又一个方面,4-1BB激动剂是抗FAP/抗4-1BB双特异性抗体。
在另一个方面,4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子,其中能够特异性结合CEA的抗原结合域包含重链可变区(VHCEA)和轻链可变区(VLCEA),重链可变区(VHCEA)包含(i)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列的CDR-H3,轻链可变区(VLCEA)包含(iv)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3。
在又一个方面,4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子,其中能够特异性结合CEA的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA)。
在另一个方面,4-1BB激动剂是进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的抗原结合分子。在一个方面,4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。特别地,4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。在一个特定方面,4-1BB激动剂是包含包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G的IgG1 Fc域的抗原结合分子。
在一个方面,4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
在一个特定方面,4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中抗原结合分子特征在于
(i)分别地,第一多肽含有CH1或CL域且第二多肽含有CL或CH1域,其中第二多肽与第一多肽通过CH1和CL域之间的二硫键连接,且其中第一多肽包含通过肽接头彼此且与CH1或CL域连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(ii)分别地,第一多肽含有CH3域且第二多肽含有CH3域,且其中第一多肽包含通过肽接头彼此且与CH3域的C端连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(iii)分别地,第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域,其中第二多肽与第一多肽通过CH1和CL域之间的二硫键连接,且其中第一多肽包含通过肽接头彼此且与VH或VL连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的一个4-1BBL外域或其片段。
在另一个方面,4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,能够特异性结合CEA的Fab域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中抗原结合分子特征在于第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成的组的氨基酸序列且在于第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
在一个特定方面,4-1BB激动剂是包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第二轻链的抗原结合分子。
在另一个方面,4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,和
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽。
在一个方面,4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽,和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽与Fc域的两个亚基之一的N或C端氨基酸融合,任选经由肽接头。
在又一个方面,4-1BB激动剂包含抗CEA/抗4-1BB双特异性抗体。
靶向HER-2的药剂
在本发明的各方面,本文中描述的4-1BB激动剂与HER-2靶向疗法组合使用。
在本发明的一些方面,4-1BB激动剂与HER-2靶向剂组合使用。在一些实施方案中,该药剂与HER-2相互作用。在一些实施方案中,该药剂是HER-2拮抗剂。在一些方面,该HER-2靶向剂包含HER-2抗体,双特异性HER-2抗体和/或HER-2抗体药物缀合物。在一些实施方案中,该药剂是抗体或抗原结合片段,特别是抗HER-2抗体。在一些实施方案中,该药剂是双特异性HER-2抗体。在一些实施方案中,该药剂是抗体-药物缀合物。
在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和曲妥珠单抗美坦新组成的组。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新的组合。在一些方面,该HER-2靶向剂包含选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗和玛格妥昔单抗组成的组的HER-2抗体。在一个方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。更加特别地,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗。在一些方面,该HER-2靶向剂是糖工程化HER-2抗体,例如TrasGex。在一些方面,该HER-2靶向剂是双特异性HER-2抗体,例如Herceptarg。在一些方面,该HER-2靶向剂是HER-2抗体药物缀合物,特别是曲妥珠单抗美坦新(ado-曲妥珠单抗美坦新)。
在一些方面,该HER-2靶向剂包含包含SEQ ID NO:96的重链可变域(VH)和SEQ IDNO:97的轻链可变域(VL)的抗体。在一些方面,该HER-2靶向剂包含包含SEQ ID NO:98的重链可变域(VH)和SEQ ID NO:99的轻链可变域(VL)的抗体。
在一些实施方案中,和对于本文中描述的任何用途,该药剂包含曲妥珠单抗(CAS180288-69-1,
Figure BDA0002598125050000411
huMAb4D5-8,rhuMAb HER2,Genentech),帕妥珠单抗(rhuMAb 2C4,
Figure BDA0002598125050000412
Genentech,Inc,South San Francisco)或曲妥珠单抗美坦新(曲妥珠单抗-MCC-DM1,T-DM1,ado-曲妥珠单抗美坦新,
Figure BDA0002598125050000413
)。在一些实施方案中,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些实施方案中,该HER-2靶向剂选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和曲妥珠单抗美坦新组成的组。在一些实施方案中,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新的组合或由其组成。在一些实施方案中,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合或由其组成。更加特别地,该药剂是曲妥珠单抗。
曲妥珠单抗是一种重组DNA衍生的,IgG1κ单克隆抗体,其是在基于细胞的测定法中以高亲和力(Kd＝5nM)选择性结合HER-2的胞外域的鼠抗HER-2抗体(4D5)的人源化型式。曲妥珠单抗是一种具有鼠4D5抗体(ATCC CRL 10463,依据布达佩斯条约于1990年5月24日保藏于美国典型培养物保藏中心,12301Parklawn Drive,Rockville,Md.20852)的或自其衍生的抗原结合残基的抗体。例示性的人源化4D5抗体包括huMAb4D5-1,huMAb4D5-2,huMAb4D5-3,huMAb4D5-4,huMAb4D5-5,huMAb4D5-6,huMAb4D5-7和huMAb4D5-8
Figure BDA0002598125050000414
如US 5821337中的。
帕妥珠单抗是一种基于人IgG1(K)框架生成的重组人源化单克隆抗体,见例如US7560111。帕妥珠单抗与曲妥珠单抗的区别在于轻链(12个氨基酸差异)和重链(30个氨基酸差异)的表位结合区。作为这些差异的结果,帕妥珠单抗结合HER2受体上完全不同的表位。帕妥珠单抗对人上皮细胞上的HER2受体的结合阻止它与HER受体家族的其它成员形成复合物(Agus et al.,Cancer Cell 2:127-137(2002))。通过阻断复合物形成,帕妥珠单抗阻止配体对复合物的生长刺激效果(例如EGF和调蛋白)。
曲妥珠单抗美坦新是一种抗体-药物缀合物,其中曲妥珠单抗经由接头模块MCC连接至美登木生物碱类药物模块DM1(US 5208020；US 6441163)。药物对抗体比或药物载荷范围为1至约8的整数值。曲妥珠单抗-MCC-DM1包括各种加载和附着的抗体-药物缀合物的所有混合物,其中1,2,3,4,5,6,7,和8个药物模块共价附着至抗体曲妥珠单抗(US 7097840；US 2005/0276812；US 2005/0166993)。平均药物载荷是约3.5。
曲妥珠单抗,帕妥珠单抗和曲妥珠单抗美坦新可以以任何组合使用。在一些实施方案中,HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。
如本文中使用的,术语“HER-2靶向疗法”,“HER-2靶向剂”和“与HER-2相互作用的药剂”指靶向HER-2(ErbB2)受体酪氨酸激酶的一种或多种药剂。特别地,该术语指选择性结合HER-2的一种或多种药剂。该药剂可以是抗体,特别是单克隆抗体。在一些情况中,该药剂以高亲和力选择性结合HER-2,例如在nM或pM范围中。在一些情况中,该药剂结合HER-2受体的胞外域。药剂可以引起:下调HER-2受体表达,抑制过表达HER-2蛋白质的人肿瘤细胞增殖,增强针对过表达HER-2蛋白质的肿瘤细胞的免疫募集和ADCC,和/或下调血管发生因子。在一些方面,HER-2靶向剂是糖工程化HER-2抗体,例如TrasGex。在一些方面,HER-2靶向剂是双特异性HER-2抗体,例如Herceptarg。术语“抗HER-2抗体”或“结合人HER-2的抗体”或“特异性结合人HER-2的抗体”或“拮抗性抗HER2”指特异性结合人HER-2的抗体。抗体可以以<10nM,<5nM,<2nM,<1nM,<0.5nM,或更低的Kd值的结合亲和力结合人HER-2抗原。结合亲和力可以用标准结合测定法测定,诸如表面等离振子共振技术(
Figure BDA0002598125050000421
GE-HealthcareUppsala,Sweden)。
供本发明中使用的双特异性抗体的制备
在某些方面,组合中使用的治疗剂包含多特异性抗体,例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面,结合特异性针对不同抗原。在某些方面,结合特异性针对同一抗原上的不同表位。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。
用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein and Cuello,Nature 305:537(1983)),WO 93/08829,和Traunecker et al.,EMBO J.10:3655(1991)),和“节-入-穴”工程化(见例如美国专利No.5,731,168)。也可以通过用于生成抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(WO 2009/089004A1)；交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利No.4,676,980,和Brennan et al.,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如Kostelny et al.,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(见例如Gruber et al.,J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如Tutt et al.,J.Immunol.147:60(1991)中所描述的,制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。
本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体,包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576A1)。
本文中的抗体或片段还包括包含结合两种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”(见例如US 2008/0069820)。本文中还包括“Crossmab”抗体(参见例如WO2009/080251,WO2009/080252,WO2009/080253,或WO2009/080254)。
用于生成双特异性抗体片段的另一种技术是“双特异性T细胞衔接器”(engager)或
Figure BDA0002598125050000431
办法(参见例如WO2004/106381,WO2005/061547,WO2007/042261,和WO2008/119567)。这种办法利用在单一多肽上排列的两种抗体可变域。例如,单一多肽链包括两个单链Fv(scFv)片段,每个具有由多肽接头分开的一个可变重链(VH)域和一个可变轻链(VL)域,多肽接头的长度足以容许两个域之间的分子内联合。此单一多肽进一步包括两个scFv片段之间的多肽间隔物序列。每个scFv识别不同的表位,而且这些表位可以是不同细胞类型特异性的,使得当每种scFv啮合其关联表位时两种不同细胞类型的细胞变成紧密接近或系留。这种办法的一个具体实施方案包括识别由免疫细胞表达的细胞表面抗原(例如T细胞上的CD3多肽)的scFv连接识别由靶细胞(诸如恶性或肿瘤细胞)表达的细胞表面抗原的另一scFv。
因为它是单一多肽,所以双特异性T细胞衔接器可以使用本领域已知的任何原核或真核细胞表达系统(例如CHO细胞系)来表达。然而,特定纯化技术(参见例如EP1691833)对于分开单体双特异性T细胞衔接器与其它多聚体种类(其可能具有与单体的预定活性不同的生物学活性)可能是必需的。在一种例示性纯化方案中,首先对含有分泌多肽的溶液进行金属亲和层析,并用咪唑浓度的梯度洗脱多肽。使用阴离子交换层析进一步纯化此洗出液,并使用氯化钠浓度的梯度洗脱多肽。最后,对此洗出液进行大小排阻层析以分开单体与多聚体种类。在一个方面,在本发明中使用的双特异性双特异性抗体由包含通过肽接头的彼此融合的两个单链Fv片段(scFV)的单一多肽链构成。
降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰
本发明的抗原结合分子的Fc域由包含免疫球蛋白分子的重链域的一对多肽链组成。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体,其每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。
Fc域对本发明的抗原结合分子赋予有利的药动学特性,包括有助于较好的在靶组织中的积累的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。然而,与此同时,这可能导致不想要的本发明的双特异性抗体对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。因而,在特定方面,与天然IgG1 Fc域相比,本发明的抗原结合分子的Fc域展现降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个方面,Fc并不实质性结合Fc受体和/或并不诱导效应器功能。在一个特定方面,Fc受体是Fcγ受体。在一个方面,Fc受体是人Fc受体。在一个具体方面,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面,Fc域并不诱导效应器功能。降低的效应器功能可包括但不限于下述一种或多种:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,降低的对NK细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的树突细胞成熟,或降低的T细胞引发。
在某些方面,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的抗体的Fc区,由此生成Fc区变体。Fc区变体可包含包含一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4 Fc区)。
在一个特定方面,本发明提供一种抗体,其中Fc域包含一处或多处降低对Fc受体,特别是对Fcγ受体的结合的氨基酸替代。
在一个方面,本发明的抗体的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。典型地,在Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。特别是,Fc域包含位置E233,L234,L235,N297,P331和P329(EU编号方式)处的氨基酸替代。特别是,Fc域包含IgG重链的位置234和235(EU编号方式)和/或329(EU编号方式)处的氨基酸替代。更特别地,提供的是依照本发明的抗体,其包含具有IgG重链中的氨基酸替代L234A,L235A和P329G(“P329G LALA”,EU编号方式)的Fc域。氨基酸替代L234A和L235A指所谓的LALA突变。“P329G LALA”氨基酸替代组合几乎完全消除人IgG1 Fc域的Fcγ受体结合且在国际专利申请公开号WO 2012/130831 A1中描述,其还描述了制备此类突变体Fc域的方法及用于测定其特性诸如Fc受体结合或效应器功能的方法。
具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有一个或多个Fc域残基238,265,269,270,297,327和329的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括具有两个或更多个氨基酸位置265,269,270,297和327处的替代的Fc突变体,包括具有残基265和297替代变成丙氨酸的替代的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。
在另一个方面,Fc域是IgG4 Fc域。与IgG1抗体相比,IgG4抗体展现降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。在一个更具体方面,Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代S228P的IgG4 Fc域。在一个更具体方面,Fc域是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G(EU编号方式)的IgG4 Fc域。此类IgG4 Fc域突变体和其Fcγ受体结合特性也在WO 2012/130831中描述。
突变体Fc域可使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,插入或修饰来制备。遗传方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱变,PCR,基因合成,等等。正确的核苷酸变化可例如通过测序来验证。
对Fc受体的结合可例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GEHealthcare)的表面等离振子共振(SPR),和Fc受体(诸如可通过重组表达获得的)容易地测定。或者,Fc域或包含Fc域的细胞活化性抗体对Fc受体的结合亲和力可使用已知表达特定Fc受体的细胞系,诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估。
Fc域或包含Fc域的本发明的抗体的效应器功能可通过本领域已知方法来测量。一种合适的用于测量ADCC的测定法在本文中描述。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子在美国专利No.5,500,362；Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom et al.,Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann et al.,J Exp Med 166,1351-1361(1987)中描述。或者,可采用非放射性测定法方法(参见例如ACTITMnon-radioactive cytotoxicity assayfor flow cytometry(CellTechnology,Inc.,Mountain View,CA)；和CytoTox
Figure BDA0002598125050000451
non-radioactive cytotoxicity assay(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可以在体内,例如在动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性,诸如Clynes et al.,Proc Natl Acad Sci USA95,652-656(1998)中公开的。
在一些方面,Fc域对补体成分,具体是C1q的结合降低。因而,在其中将Fc域工程化改造成具有降低的效应器功能的一些实施方案中,所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定来确定本发明的双特异性抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性(参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为了评估补体活化,可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；和Cragg and Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
促进异二聚化的Fc域修饰
本发明的双特异性抗原结合分子包含与Fc域的两个亚基之一或另一融合的不同抗原结合位点,如此Fc域的两个亚基可以包含在两条非相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和后续的二聚化导致两条多肽的数种可能组合。为了改善重组生成中本发明的双特异性抗体的产率和纯度,在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域中引入促进想要的多肽的联合的修饰如此会是有利的。
因而,在特定方面,本发明涉及如下的双特异性抗原结合分子,其包含
(a)至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中抗原结合分子特征在于第一多肽包含通过肽接头彼此连接的4-1BBL的两个外域或两个其片段且在于第二多肽包含所述4-BBL的仅仅一个外域或其片段,和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此,在一个方面,所述修饰在Fc域的CH3域中。
在一个具体方面,所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰,包含Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。如此,本发明涉及一种抗原结合分子,其包含(a)至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中抗原结合分子特征在于第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或两个其片段且在于第二多肽包含仅仅一个4-1BBL外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中依照节入穴方法,Fc域的第一亚基包含节且Fc域的第二亚基包含穴。在一个特定方面,Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W(EU编号方式)且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。
“节-入-穴”技术在例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中描述。一般地,方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得隆起可放置在空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与隆起相同或相似大小的补偿性空腔。
因而,在一个方面,在本发明的双特异性抗原结合分子的Fc域的第一亚基的CH3域中将氨基酸残基用具有较大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的CH3域内生成隆起,其可放置在第二亚基的CH3域内的空腔中,并且在Fc域的第二亚基的CH3域中将氨基酸残基用具有较小侧链体积的氨基酸酸残基替换,由此在第二亚基的CH3域内生成空腔,其内可放置第一亚基的CH3域内的隆起。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成隆起和空腔。在一个具体方面,在Fc域的第一亚基的CH3域中将位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),并且在Fc域的第二亚基的CH3域中将位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个方面,在Fc域的第二亚基中另外将位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)并将位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)。
在还有又一个方面,在Fc域的第一亚基中另外将位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C),并且在Fc域的第二亚基中另外将位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc域的两个亚基之间形成进一步稳定化二聚体的二硫桥(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。在一个特定方面,Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W(EU编号方式)且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个备选方面,促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰,例如如PCT公开文本WO 2009/089004中描述的。一般地,这种方法牵涉将两个Fc域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基用带电荷氨基酸残基替换,使得同二聚体形成变成在静电方面不利但异二聚化在静电方面有利。
本文中报告的双特异性抗体的重链的C末端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C末端。重链的C末端可以是缩短的C末端,其中已经去除一个或两个C末端氨基酸残基。在一个优选的方面,重链的C末端是以PG结束的缩短的C末端。在本文中报告的所有方面的一个方面,本文中规定的包含包括C末端CH3域的重链的双特异性抗体包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat EU索引)。在本文中报告的所有方面的一个实施方案中,本文中规定的包含包括C末端CH3域的重链的双特异性抗体包含C末端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat EU索引)。
Fab域中的修饰
在一个方面,本发明涉及一种含有4-1BBL的抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合肿瘤相关抗原的Fab片段,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中抗原结合分子特征在于第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或两个其片段且在于第二多肽包含仅仅一个4-1BBL外域或其片段,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中在Fab片段之一中可变域VH和VL或恒定域CH1和CL任一是交换的。双特异性抗体依照Crossmab技术来制备。
具有一个结合臂中的域替换/交换的多特异性抗体(CrossMabVH-VL或CrossMabCH-CL)详细记载于WO2009/080252和Schaefer,W.et al.,PNAS,108(2011)11187-1191。它们清楚地减少由针对第一抗原的轻链与错误的针对第二抗原的重链错配引起的副产物(与没有此类域交换的办法相比)。
在一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)能够特异性结合肿瘤相关抗原的第一Fab片段,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中抗原结合分子特征在于第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或两个其片段且在于第二多肽包含仅仅一个4-1BBL外域或其片段,且其中它们中每一个与CH1或CL域连接,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中邻近4-1BBL的恒定域CL和CH1彼此替换使得CH1域是轻链的一部分且CL域是重链的一部分。
在另一个方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其包含(a)包含两个能够特异性结合4-1BB的Fab片段和Fc域的抗体的两条轻链和两条重链,和(b)两个能够特异性结合肿瘤相关抗原的另外的Fab片段,其中所述另外的Fab片段每一个经由肽接头与(a)的重链的C端连接。在一个特定方面,另外的Fab片段是Fab片段,其中可变域VL和VH彼此替换使得VH域是轻链的一部分且VL域是重链的一部分。
在另一个方面,及为了进一步改善正确配对,包含(a)能够特异性结合肿瘤相关抗原的第一Fab片段,(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,其中抗原结合分子特征在于第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或两个其片段且在于第二多肽包含仅仅一个4-1BBL外域或其片段,且其中它们中每一个与CH1或CL域连接,和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的双特异性抗原结合分子可含有带不同电荷的氨基酸替代(所谓的“带电荷的残基”)。在交叉或非交叉CH1和CL域中引入这些修饰。在一个特定的方面,本发明涉及一种双特异性抗原结合分子,其中在CL域之一中位置123(EU编号方式)处的氨基酸被精氨酸(R)替换且位置124(EU编号方式)处的氨基酸被赖氨酸(K)替代且其中在CH1域之一中位置147(EU编号方式)处的和位置213(EU编号方式)处的氨基酸被谷氨酸(E)替代。
更加特别地,本发明涉及一种双特异性结合分子,其包含Fab,其中在与4-1BBL邻近的CL域中位置123(EU编号方式)处的氨基酸被精氨酸(R)替换且位置124(EU编号方式)处的氨基酸被赖氨酸(K)替代,且其中在与4-1BBL邻近的CH1域中位置147(EU编号方式)处的和位置213(EU编号方式)处的氨基酸被谷氨酸(E)替代。
多核苷酸
本发明进一步提供分离的多核苷酸,其编码如本文中描述的抗体或其片段。
分离的编码本发明的抗体的多核苷酸可以作为编码整个抗原结合分子的单一多核苷酸或作为共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如,免疫球蛋白的轻链部分与免疫球蛋白的重链部分可以由分开的多核苷酸编码。当共表达时,重链多肽会与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。
在一些方面,分离的多核苷酸编码整个依照如本文中描述的发明的抗体。在其它实施方案中,分离的多核苷酸编码依照如本文中描述的发明的抗体中包含的多肽。
在某些实施方案中,多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中,本发明的多核苷酸是RNA,例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链的或双链的。
重组方法
如本发明中使用的双特异性抗体可通过例如固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生成来获得。对于重组生成,分离编码例如如上文描述的抗体或其多肽片段的一种或多种多核苷酸并插入一个或多个载体供进一步克隆和/或宿主细胞中的表达。此类多核苷酸可使用常规规程容易地分离和测序。在本发明的一个方面,提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的载体,优选表达载体。可使用本领域技术人员公知的方法来构建含有抗体(片段)的编码序列连同适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如Maniatis et al.,MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)中描述的技术。表达载体可以是病毒,质粒的部分,或者可以是核酸片段。表达载体包括其中与启动子和/或其它转录或翻译控制元件可操作联合地克隆编码抗体或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)的表达盒。如本文中使用的,“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(TAG,TGA,或TAA)不翻译成氨基酸,但是如果存在的话,它可考虑作为编码区的一部分,但是任何侧翼序列,例如启动子,核糖体结合位点,转录终止子,内含子,5’和3’非翻译区,等等不是编码区的部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建物中,例如在单个载体上,或在分开的多核苷酸构建物中,例如在分开的(不同的)载体上。而且,任何载体可含有单个编码区,或者可包含两个或更多个编码区,例如,本发明的载体可编码一种或多种多肽,其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译地分开成最终的蛋白质。另外,本发明的载体,多核苷酸,或核酸可编码异源编码区,或是与编码本发明的抗体或其多肽片段,或其变体或衍生物的多核苷酸融合或是不融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序,诸如分泌信号肽或异源功能域。可操作联合是这样一种方式,当基因产物,例如多肽的编码区与一种或多种调节序列这样联合时,将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码想要的基因产物的mRNA转录的话且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力的话,两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其联合的启动子)是“可操作联合的”。如此,如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录的话,启动子区与核酸会是可操作联合的。启动子可以是仅仅在预定细胞中指导DNA实质性转录的细胞特异性启动子。在启动子以外,其它转录控制元件,例如增强子,操纵基因,阻抑物,和转录终止信号可与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。
本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员知道的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区,诸如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子,连同内含子A),猿病毒40(例如早期启动子),和逆转录病毒(诸如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因诸如肌动蛋白,热休克蛋白,牛生长激素和兔α珠蛋白衍生的,以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,多种翻译控制元件是本领域普通技术人员知道的。这些包括但不限于核糖体结合位点,翻译起始和终止密码子,和自病毒系统衍生的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES,也称作CITE序列)。表达盒还可包括其它特征,诸如复制起点,和/或染色体整合元件,诸如逆转录病毒长末端重复(LTR),或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌或信号肽(其指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌)的编码区联合。例如,如果想要分泌抗体或其多肽片段的话,可以将编码信号序列的DNA放置在编码本发明的抗体或其多肽片段的核酸的上游。依照信号假说,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,其在一旦启动生长中的蛋白质链输出穿过粗面内质网时自成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽的N端融合的信号肽,其自翻译的多肽切割下来以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中,使用天然信号肽,例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或序列保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者,可使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如,野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原活化物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替代。
编码可用于推动稍后纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的DNA可以包括在编码本发明的抗体或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。
在本发明的又一个方面,提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中,提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体分别可单一地或组合地并入本文中关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面,宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的抗体(的一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的,术语“宿主细胞”指可以工程化改造以生成本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域公知的。可以用特定的表达载体适当地转染或转导此类细胞,并且可以培养大量的含有载体的细胞供接种大规模发酵罐以获得足够数量的抗原结合分子供临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物,诸如大肠杆菌,或各种真核细胞,诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,昆虫细胞,等等。例如,特别是在不需要糖基化时,可以在细菌中生成多肽。表达后,多肽可以在可溶性级分中自细菌细胞糊分离且可以进一步纯化。在原核生物以外,真核微生物诸如丝状真菌或酵母对于编码多肽的载体是合适的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已经“人源化”,导致生成具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004),和Li et al.,Nat Biotech 24,210-215(2006)。
对于表达(糖基化)多肽合适的宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞联合使用,特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的众多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978,和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如,适应在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7),人胚肾细胞系(例如Graham et al.,J Gen Virol 36,59(1977)中描述的293或293T细胞),幼仓鼠肾细胞(BHK),小鼠塞托利(Sertoli)细胞(如例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中描述的TM4细胞),猴肾细胞(CV1),非洲绿猴肾细胞(VERO-76),人宫颈癌细胞(HELA),犬肾细胞(MDCK),牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A),人肺细胞(W138),人肝细胞(Hep G2),小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562),TRI细胞(如例如Mather et al.,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中描述的),MRC 5细胞,和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如YO,NS0,P3X63和Sp2/0。关于适合于蛋白质生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,细菌细胞和植物细胞,在此仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,优选哺乳动物细胞,诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0,NS0,Sp20细胞)。在这些系统中表达外来基因的标准技术是本领域已知的。可以工程化改造表达包含免疫球蛋白重链或轻链任一的多肽的细胞,从而还表达另一条免疫球蛋白链,使得所表达的产物是具有重和轻链二者的免疫球蛋白。
在一个方面,提供一种生成本发明的抗体或其多肽片段的方法,其中方法包含在适于本发明的抗体或其多肽片段表达的条件下培养如本文中提供的包含编码本发明的抗体或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞,和自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收本发明的抗体或其多肽片段。
在某些实施方案中,形成抗原结合分子的一部分的能够特异性结合靶细胞抗原的模块(例如Fab片段)至少包含能够结合抗原的免疫球蛋白可变区。可变区可形成天然或非天然发生的抗体和其片段的一部分且自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域公知的(参见例如Harlow and Lane,"Antibodies,a laboratory manual",ColdSpring Harbor Laboratory,1988)。非天然发生抗体可以使用固相肽合成来构建,可以重组生成(例如如美国专利No.4,186,567中描述的)或可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库来获得(参见例如授予McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
任何动物物种的免疫球蛋白均可在本发明中使用。在本发明中有用的非限制性免疫球蛋白可以是鼠,灵长类,或人起源的。如果融合蛋白旨在供人使用的话,可使用嵌合形式的免疫球蛋白,其中免疫球蛋白的恒定区来自人。还可依照本领域公知的方法制备人源化或完全人形式的免疫球蛋白(参见例如授予Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可通过多种方法来实现,包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上,有或没有保留关键框架残基(例如那些对于保留优秀的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基),(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上,或(c)移植整个非人可变域,但通过替换表面残基用人样区段“遮盖”它们。人源化抗体和生成它们的方法在例如Almagro andFransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中综述,而且在例如Riechmann et al.,Nature 332,323-329(1988)；Queen et al.,Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337,7,527,791,6,982,321,和7,087,409；Jones et al.,Nature 321,522-525(1986)；Morrison et al.,Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison and Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen et al.,Science239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri et al.,Methods 36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua et al.,Methods 36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn et al.,Methods 36,61-68(2005)和Klimka et al.,Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述用于FR改组的“导向选择”办法)中进一步描述。依照本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。人抗体和人可变区可使用本领域已知的多种技术来生成。人抗体在van Dijk and van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)和Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中一般性描述。人可变区能形成通过杂交瘤方法生成的人单克隆抗体的一部分且自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人抗体和人可变区还可以通过将免疫原施用于已经修饰以响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体的转基因动物来制备(参见例如Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。人抗体和人可变区还可以通过分离自人衍生噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变区序列来生成(参见例如Hoogenboom et al.,in Methods in MolecularBiology 178,1-37(O’Brien et al.,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2001)；和McCaffertyet al.,Nature 348,552-554；Clackson et al.,Nature 352,624-628(1991))。噬菌体典型地或是以单链Fv(scFv)片段或是作为Fab片段展示抗体片段。
在某些方面,依照例如PCT公开文本WO 2012/020006(参见关于亲和力成熟的实施例)或美国专利申请公开文本No.2004/0132066中公开的方法工程化改造抗体以具有增强的结合亲和力。本发明抗原结合分子结合特定抗原性决定簇的能力可经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振技术(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(Heeley,EndocrRes 28,217-229(2002))。可使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施方案中,此类竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与参照抗原结合分子结合的相同。用于抗原结合分子结合的表位的作图的详细的例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,in Methods in MolecularBiology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中,在包含结合抗原的第一经标记抗原结合分子和第二未标记抗原结合分子(测试其与第一抗原结合分子竞争结合抗原的能力)的溶液中温育固定化抗原。第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照,在包含第一经标记抗原结合分子但不包含第二未标记抗原结合分子的溶液中温育固定化抗原。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育后,去除过量的未结合的抗体,并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果在测试样品中与固定化抗原联合的标记物的量相对于对照样品实质性降低,那么这指示第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合抗原。参见Harlow and Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manualch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
如本文中所述制备的本发明的抗体可通过本领域已知的技术来纯化,诸如高效液体层析术,离子交换层析术,凝胶电泳,亲和层析术,大小排阻层析术,等等。用于纯化特定蛋白质的实际条件会部分取决于诸如净电荷,疏水性,亲水性等因素,而且对于本领域技术人员会是显而易见的。对于亲和层析术纯化,可使用结合抗原结合分子的抗体,配体,受体或抗原。例如,对于本发明的融合蛋白的亲和层析术纯化,可使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以本质上如实施例中所述使用顺序蛋白A或G亲和层析术和大小排阻层析术来分离抗原结合分子。抗原结合分子或其片段的纯度可通过多种公知的分析方法任一来测定,包括凝胶电泳,高压液体层析术,等等。例如,如实施例中所述表达的含有4-1BBL的抗原结合分子显示是完整的且正确装配的,如通过还原性和非还原性SDS-PAGE证明的。
测定法
本文中提供的抗原结合分子可通过本领域已知的多种测定法来鉴定,筛选,或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.亲和力测定法
本文中提供的双特异性抗原结合分子对相应的受体的亲和力可依照实施例中提出的方法通过表面等离振子共振(SPR),使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare),和受体或靶蛋白(诸如可通过重组表达获得的)来测定。双特异性抗原结合分子对靶细胞抗原的亲和力也可以通过表面等离振子共振(SPR),使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GEHealthcare),和受体或靶蛋白(诸如可通过重组表达获得的)来测定。对于FAP-4-1BBL抗原结合分子,已经在国际专利申请公开号WO 2016/075278 A1中更加详细地描述方法。依照一个方面,于25℃使用
Figure BDA0002598125050000561
T100机器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振测量KD。
2.结合测定法和其它测定法
在一个方面,对本文中报告的FAP-4-1BBL抗原结合分子测试它的抗原结合活性,如国际专利申请公开号WO 2016/075278 A1中更加详细描述的。
3.活性测定法
在一个方面,提供用于鉴定FAP-4-1BBL抗原结合分子的生物学活性的测定法。
在某些实施方案中,在用人免疫效应细胞的体外共培养物测定法中对本文中报告的抗体测试此类生物学活性。
药学组合物,配制剂和施用路径
在又一个方面,本发明提供包含本文中提供的4-1BB激动剂和本文中提供的HER-2靶向疗法或HER-2靶向剂的药学组合物,例如供任何下文治疗方法中使用的。在一些方面,该HER-2靶向剂包含HER-2抗体,双特异性HER-2抗体和/或HER-2抗体药物缀合物。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和曲妥珠单抗美坦新组成的组。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新的组合。在一些方面,该HER-2靶向剂包含选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗和玛格妥昔单抗组成的组的HER-2抗体。在一个方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。更加特别地,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗。在一些方面,该HER-2靶向剂是糖工程化HER-2抗体,例如TrasGex。在一些方面,该HER-2靶向剂是双特异性HER-2抗体,例如Herceptarg。在一些方面,该HER-2靶向剂是HER-2抗体药物缀合物,特别是曲妥珠单抗美坦新(ado-曲妥珠单抗美坦新)。
在一些方面,一种药学组合物包含本文中提供的4-1BB激动剂和至少一种药学可接受赋形剂。在其它实施方案中,一种药学组合物包含本文中提供的4-1BB激动剂和至少一种另外的治疗剂,例如如下文描述的。在一些实施方案中,有提供一种包含HER-2靶向剂和至少一种药学可接受赋形剂的药学组合物。
本发明的药学组合物包含溶解或分散在药学可接受赋形剂,载剂,佐剂或稀释剂中的治疗有效量的一种或多种抗体或药剂。短语“药学或药学可接受”指在采用的剂量和浓度一般对接受者无毒,即在适当施用于动物,诸如例如人时不产生不利的,变应性的或其它不想要的反应的分子实体和组合物。含有至少一种抗体和任选地另外的活性组分的药学组合物的制备会是本领域技术人员根据本公开内容知道的,如由Remington'sPharmaceutical Sciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990例示的,通过援引收入本文。特别地,组合物是冻干配制剂或水溶液。如本文中使用的,“药学可接受赋形剂”包括任何和所有溶剂,缓冲剂,分散介质,包衣,表面活性剂,抗氧化剂,防腐剂(例如抗细菌剂,抗真菌剂),等张剂,盐,稳定剂和其组合,正如本领域普通技术人员会知道的。
胃肠外组合物包括那些为通过注射,例如皮下,皮内,损害内,静脉内,动脉内,肌肉内,鞘内或腹膜内注射的施用而设计的。对于注射,可以在水溶液中,优选在生理学相容缓冲液诸如汉克斯(Hanks)氏溶液,林格(Ringer)氏溶液,或生理盐水缓冲液中配制本发明的抗原结合分子。溶液可含有配制用剂,诸如悬浮,稳定和/或分散剂。或者,融合蛋白可处于粉末形式,供在使用前用合适的媒介,例如无菌无热原水建构。根据需要,通过与下文列举的多种其它组分一起以要求的量在适宜的溶剂中掺入本发明的融合蛋白来制备无菌可注射溶液。无菌性可例如通过穿过无菌滤膜过滤而容易地实现。一般地,通过将多种经过灭菌的活性组分掺入含有基础分散介质和/或其它组分的无菌媒介中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液,悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况中,优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术,其自其先前无菌过滤的液体介质产生活性组分加任何另外的想要的组分的粉末。液体介质在必要时应当适当缓冲且在注射前首先用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂变成等张。组合物在制造和贮存条件下必须是稳定的,而且针对微生物,诸如细菌和真菌的污染作用防腐。会领会的是,内毒素污染应当最低限度保持在安全水平,例如小于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受赋形剂包括但不限于:缓冲剂,诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚,丁或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质,诸如血清清蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖,二糖,和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,诸如EDTA；糖,诸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子,诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂,诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有提高悬浮液的粘度的化合物,诸如羧甲基纤维素钠,山梨醇,右旋糖酐,等等。任选地,悬浮液还可含有合适的稳定剂或提高化合物的溶解度以容许制备高度浓缩溶液的药剂。另外,活性化合物的悬浮液可制备为适宜的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油诸如芝麻油,或合成脂肪酸酯,诸如油酸乙酯或甘油三酯,或脂质体。
可以将活性组分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶体药物投递系统(例如脂质体,清蛋白微球体,微乳液,纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质,所述基质处于成形物品的形式,例如薄膜,或微胶囊。在特定实施方案中,通过在组合物中使用延迟吸收的药剂,诸如例如单硬脂酸铝,明胶或其组合,可带来延长的可注射组合物的吸收。
本文中的例示性药学可接受赋形剂进一步包括间质药物分散剂,诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白,诸如rHuPH20(
Figure BDA0002598125050000591
Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)在美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968中描述。在一个方面,将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性冻干抗体配制剂在美国专利No.6,267,958中描述。水性抗体配制剂包括美国专利No.6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些,后者的配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
在先前描述的组合物以外,抗原结合分子还可配制成贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。如此,例如,融合蛋白可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂,或作为微溶衍生物,例如作为微溶盐配制。
包含本发明的抗原结合分子的药学组合物可依靠常规混合,溶解,乳化,封装,包埋或冻干工艺来制造。可以使用推动将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学可接受载剂,稀释剂,赋形剂或助剂以常规方式配制药学组合物。适当的配制剂取决于所选择的施用路径。
可以以游离酸或碱,中性或盐形式将本发明的抗体配制成组合物。药学可接受盐是实质性保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐,例如那些与蛋白质性质组合物的游离氨基形成的或那些与无机酸诸如例如盐酸或磷酸,或有机酸诸如乙酸,草酸,酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱,诸如例如氢氧化钠,钾,铵,钙或铁；或有机碱,诸如异丙胺,三甲胺,组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比,药学盐趋于在水性和其它质子溶剂中溶解度更高。
在所治疗的特定适应症需要时,本文中的组合物还可含有超过一种活性组分,优选那些具有彼此没有不利影响的互补活性的。此类活性组分以对于预定目的有效的量适当地组合存在。
要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可例如通过穿过无菌滤膜过滤而容易地实现。
4-1BB激动剂和HER-2靶向疗法的施用
可以通过任何合适的手段(包括胃肠外,肺内,和鼻内,及若期望用于局部治疗的话,损伤内施用)来施用4-1BB激动剂和HER-2靶向疗法/HER-2靶向剂二者(均称作本文中的物质)。然而,关于通过胃肠外(特别是静脉内)输注施用的治疗剂,本发明的方法是特别有用的。在一些方面,该HER-2靶向剂包含HER-2抗体,双特异性HER-2抗体和/或HER-2抗体药物缀合物。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和曲妥珠单抗美坦新组成的组。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新的组合。在一些方面,该HER-2靶向剂包含选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗和玛格妥昔单抗组成的组的HER-2抗体。在一个方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。更加特别地,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗。在一些方面,该HER-2靶向剂是糖工程化HER-2抗体,例如TrasGex。在一些方面,该HER-2靶向剂是双特异性HER-2抗体,例如Herceptarg。在一些方面,该HER-2靶向剂是HER-2抗体药物缀合物,特别是曲妥珠单抗美坦新(ado-曲妥珠单抗美坦新)。
胃肠外输注包括肌肉内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的,剂量给药可以通过任何合适的路径(例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射)来进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表,包括但不限于单次施用或在多个时间点上的多次施用,推注施用,和脉冲输注。在一个实施方案中,胃肠外(特别是静脉内)施用治疗剂。在一个特定实施方案中,通过静脉内输注施用治疗剂。
在一些方面,该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂在单一组合物中一起施用。在一些实施方案中,该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂在两种或更多种不同组合物中分开施用。
4-1BB激动剂和HER-2靶向疗法/靶向剂二者会以符合优秀医学实践的方式配制,定剂量,和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂投递部位,施用方法,施用日程表,和医学从业人员知道的其它因素。4-1BB激动剂和HER-2靶向疗法/靶向剂二者无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的治疗剂的量,病症或治疗的类型,和上文讨论的其它因素。这些一般以与本文所述相同的剂量和施用路径使用,或以本文所述剂量的约1-99％使用,或以凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。
对于预防或治疗疾病,4-1BB激动剂和HER-2靶向疗法/靶向剂(当以其组合或与一种或多种其它另外的治疗剂一起使用时)的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型,4-1BB药剂的类型,疾病的严重性和过程,施用这两种药剂是为了预防还是治疗目的,先前的疗法,患者的临床史和对治疗剂的响应,和主治医师的斟酌。每种物质以一次或一系列治疗恰当地施用于患者。取决于疾病的类型和严重性,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的物质可以是对受试者施用的初始候选剂量,例如无论是通过一次或多次分开的施用,还是通过连续输注。取决于上文提到的因素,一个典型的日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长时间的重复施用,取决于状况,治疗一般会持续直至发生期望的疾病症状遏制。每种物质的一个例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此,可以对受试者施用约0.5mg/kg,1.0mg/kg,2.0mg/kg,3.0mg/kg,4.0mg/kg,5.0mg/kg,6.0mg/kg,7.0mg/kg,8.0mg/kg,9.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量。此类剂量可以间歇施用,例如每周,每两周,或每三周(例如,使得受试者接受约2个至约20个,或例如约6个剂量的治疗剂)。可以施用较高的初始加载剂量,接着是一个或多个较低的剂量,或者较低的初始剂量,接着是一个或多个较高的剂量。一种例示性剂量给药方案包含施用约10mg的初始剂量,接着是约20mg治疗剂的两周一次剂量。然而,其它剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定法来监测。
在一个方面,该4-1BB激动剂和该HER-2靶向疗法/靶向剂二者的施用是单次施用。在一些实施方案中,该4-1BB激动剂和该HER-2靶向疗法/靶向剂同时施用。术语“同时”意味着在相同时间或在较短时间段内,通常小于1小时。在某些方面,治疗剂的施用是两次或更多次施用。与一种或多种其它药物“并行”施用的药物在相同治疗周期期间,与一种或多种其它药物在相同治疗日,和任选地与一种或多种其它药物在相同时间施用。例如,对于每3周给予的疗法,在3周周期的第-1天各自施用并行施用的药物。在一个特定方面,每周,每两周,或每三周,特别是每两周施用物质。在一个方面,以治疗有效量施用物质。在一个方面,以约50μg/kg,约100μg/kg,约200μg/kg,约300μg/kg,约400μg/kg,约500μg/kg,约600μg/kg,约700μg/kg,约800μg/kg,约900μg/kg或约1000μg/kg的剂量施用物质。在一个实施方案中,以比该4-1BB激动剂在不施用该Her-2靶向疗法/靶向剂的相应治疗方案中的剂量要高的剂量施用该4-1BB激动剂。在一个实施方案中,以比该HER-2靶向疗法/靶向剂在不施用该4-1BB激动剂的相应治疗方案中的剂量要高的剂量施用该HER-2靶向疗法/靶向剂。在一个方面,该4-1BB激动剂的施用包含第一剂量的该4-1BB激动剂的初始施用,和第二剂量的该4-1BB激动剂的一次或多次后续施用,其中第二剂量比第一剂量要高。在一个方面,该4-1BB激动剂的施用包含第一剂量的该4-1BB激动剂的初始施用,和第二剂量的该4-1BB激动剂的一次或多次后续施用,其中第一剂量不比第二剂量要低。
当顺序共施用两种治疗剂时,在以“特定时间段”分开的两次分开的施用中施用药剂。术语特定时间段意指1小时至15天的任何时间。例如,可以在施用药剂之一约1,2,3,4,5,6或7天或1至24小时内施用另一药剂,而且,在一个实施方案中,特定时间段是1至3天,或2至8小时。
在一个方面,在施用HER-2靶向疗法/靶向剂前施用4-1BB激动剂。在另一个方面,在施用4-1BB激动剂前施用HER-2靶向疗法/靶向剂。
在一些方面,每剂施用的曲妥珠单抗美坦新的初始药学有效量会在约0.3至15mg/kg/天的患者体重的范围中。商业T-DM1配制剂(
Figure BDA0002598125050000621
ado-曲妥珠单抗-美坦新)是一次性管形瓶中的无菌的,白色至灰白色的无防腐剂的冻干粉末。每个管形瓶含有100mg或160mg ado-曲妥珠单抗-美坦新。在重建后,每个一次性管形瓶含有ado-曲妥珠单抗-美坦新(20mg/mL),聚山梨酯20[0.02％(w/v)],琥珀酸钠(10mM),和蔗糖[6％(w/v)],具有pH5.0和1.026g/mL的密度。通过稀释后的静脉内输注施用含有20mg/mL ado-曲妥珠单抗-美坦新的所得溶液。
帕妥珠单抗的商业配制剂(
Figure BDA0002598125050000631
)含有用于IV输注的无防腐剂的溶液形式的帕妥珠单抗420mg/14mL(30mg/mL),而且可以以大约420mg(等同于用于70kg受试者的6mg/kg的剂量),大约525mg,大约840mg,和/或大约1050mg的固定剂量施用。治疗可以以较高的加载剂量(例如840mg,等同于12mg/kg体重)开始。用于治疗用途的一种合适的帕妥珠单抗配制剂在20mM乙酸组氨酸,120mM蔗糖,0.02％聚山梨酯20,pH 6.0中包含30mg/mL帕妥珠单抗。一种备选帕妥珠单抗配制剂包含25mg/mL帕妥珠单抗,10mM组氨酸-HCl缓冲剂,240mM蔗糖,0.02％聚山梨酯20,pH 6.0。
在另一个方面,4-1BB激动剂供与HER-2靶向疗法/靶向剂一起使用,其中在组合治疗前实施用II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗的预治疗,其中预治疗和组合治疗之间的时间段足以响应II型抗CD20抗体,优选奥滨尤妥珠单抗减少个体中的B细胞。
T细胞的活化可导致严重的细胞因子释放综合征(CRS)。在由TeGenero进行的一项1期研究(Suntharalingam et al.,N Engl J Med(2006)355,1018-1028)中,所有6名健康志愿者均在输注不当剂量的T细胞刺激性超激动性抗CD28单克隆抗体后迅速经历接近致死的,严重的细胞因子释放综合征(CRS)。与对受试者施用T细胞活化性治疗剂,诸如本文中描述的4-1BB激动剂有关的细胞因子释放可以通过用II型抗CD20抗体,诸如奥滨尤妥珠单抗预治疗所述受试者来显著降低。
Figure BDA0002598125050000632
预治疗(Gpt)的使用应当有助于快速消减外周血和次级淋巴样器官二者中的B细胞,使得来自T细胞活化性治疗剂所致强烈系统性T细胞活化的高度有关不利事件(AE)的风险(例如CRS)降低,同时支持自剂量给药开始起高得足以介导肿瘤细胞消除的暴露水平的T细胞活化性治疗剂。至今,已经在正在进行的奥滨尤妥珠单抗临床试验中在数以百计的患者中评估和管理奥滨尤妥珠单抗的安全性概况(包括细胞因子释放)。最后,在支持T细胞活化性抗体的安全性概况以外,Gpt还应当有助于阻止针对这些独特分子的抗药物抗体(ADA)形成。
在本发明中,4-1BB激动剂和HER-2靶向疗法/靶向剂的组合可以在疗法中与别的药剂组合使用。例如,可以共施用至少一种另外的治疗剂。在某些方面,另外的治疗剂是免疫治疗剂。在一些实施方案中,另外的治疗剂是化疗剂。合适的化疗剂包括一种或多种:蒽环类抗生素药物,诸如多柔比星和表柔比星
Figure BDA0002598125050000641
紫杉烷药物,诸如帕利他赛
Figure BDA0002598125050000642
和多西他赛
Figure BDA0002598125050000643
氟尿嘧啶(5FU)；环磷酰胺；甲氨蝶呤；顺铂；和卡培他滨。其它另外的治疗剂包括激酶抑制剂拉帕替尼(Tykerb)和纳拉替尼(Nerlynx)。
上文记录的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一配制剂或分开的配制剂中),和分开施用(在该情况中,治疗剂的施用可以在一种或多种另外的治疗剂的施用之前,同时,和/或之后发生)。在一个实施方案中,治疗剂的施用和另外的治疗剂的施用彼此在约1个月内,或在约1,2或3周内,或在约1,2,3,4,5,或6天内发生。
治疗方法和组合物
在一个方面,提供的是一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,该方法包括对受试者施用有效量的本文中描述的4-1BB激动剂和有效量的本文中描述的HER-2靶向剂。在各个方面,该HER-2靶向剂包含HER-2抗体,双特异性HER-2抗体和/或HER-2抗体药物缀合物。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和曲妥珠单抗美坦新组成的组。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新的组合。在一些方面,该HER-2靶向剂包含选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗和玛格妥昔单抗组成的组的HER-2抗体。在一个方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。更加特别地,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗。在一些方面,该HER-2靶向剂糖工程化HER-2抗体,例如TrasGex。在一些方面,该HER-2靶向剂是双特异性HER-2抗体,例如Herceptarg。在一些方面,该HER-2靶向剂是HER-2抗体药物缀合物,特别是曲妥珠单抗美坦新(ado-曲妥珠单抗美坦新)。
在一个此类方面,该方法进一步包含对个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。合适的另外的药剂包括一种或多种:蒽环类抗生素药物,诸如多柔比星和表柔比星
Figure BDA0002598125050000644
紫杉烷药物,诸如帕利他赛
Figure BDA0002598125050000645
和多西他赛
Figure BDA0002598125050000646
氟尿嘧啶(5FU)；环磷酰胺；甲氨蝶呤；顺铂；和卡培他滨。其它合适的另外的治疗剂包括激酶抑制剂拉帕替尼(Tykerb)和纳拉替尼(Nerlynx)。在又一些实施方案中,本文中提供了一种用于肿瘤收缩的方法,该方法包含对受试者施用有效量的4-1BB激动剂和HER-2靶向剂,如本文中描述的。依照任何上述方面的“个体”或“受试者”优选是人。
在一个方面,本发明提供供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂与HER-2靶向剂组合使用。在另一个方面,本发明提供供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法的中使用的4-1BB激动剂和HER-2靶向剂。在一些实施方案中,该4-1BB激动剂和/或该HER-2靶向剂与另外的治疗剂组合。
在又一些方面,提供了一种供癌症免疫疗法中使用的组合物,其包含4-1BB激动剂和HER-2靶向剂。在某些实施方案中,提供了一种包含4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合物,其供癌症免疫疗法的方法中使用。
在又一个方面,本文中提供了包含4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合物在制造或制备药物中的用途。在一些实施方案中,该药物用于治疗癌症。在一些实施方案中,该药物用于治疗实体瘤。在一些实施方案中,该药物供肿瘤收缩的方法中使用,该方法包含对具有实体瘤的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中,该方法进一步包含对个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中,该药物用于治疗实体瘤。
在特定方面,该个别具有HER-2阳性癌症。在一些实施方案中,该癌症可包含过表达HER-2的细胞。在一些实施方案中,该癌症包含实体瘤。在一些实施方案中,该实体瘤是晚期和/或转移性实体瘤。在一些方面,HER-2阳性癌症是乳腺癌,卵巢癌,胃癌,胃的癌,食管癌,肺癌,例如肺的腺癌或非小细胞肺癌(NSCLC),子宫癌,例如子宫浆液性子宫内膜癌,唾液管癌,膀胱癌,子宫内膜癌,胰腺癌,结肠癌,前列腺癌,和/或头和颈癌。在一些方面,该乳腺癌是乳腺癌瘤或乳腺腺癌。在一些方面,该乳腺癌瘤是侵入性导管癌。在一些方面,该肺癌是肺腺癌。在一些实施方案中,该结肠癌是结肠直肠腺癌。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在一些方面,该癌症是HER-2阳性乳腺癌,特别是转移性乳腺癌(IV期乳腺癌)。在一些方面,该癌症是II或III期HER-2阳性乳腺癌。在一些方面,该癌症是HER-2阳性早期乳腺癌。在一些方面,该癌症是HER-2阳性胃癌。
处理可以旨在预防癌症的发生或进展。这样,可以使用本文中描述的4-1BB激动剂和HER-2靶向剂针对疾病状态的发生预防性处理受试者。这可以在疾病状态的症状发作之前发生,和/或可以给予认为处于癌症发生或进展的更大风险的受试者。
在一些实施方案中,该4-1BB激动剂与该HER-2靶向剂协同作用。
上文记录的组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一配制剂或分开的配制剂中),和分开施用,在该情况中,本文中报告的抗体的施用可以在一种或多种另外的治疗剂的施用之前,同时,和/或之后发生。在一个实施方案中,4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的施用和任选的另外的治疗剂的施用彼此在约1个月内,或在约1,2或3周内,或在约1,2,3,4,5,或6天内发生。
可以通过任何合适的手段(包括胃肠外,肺内,和鼻内,及若期望用于局部治疗的话,损伤内施用)来施用本文中描述的4-1BB激动剂和HER-2靶向剂二者(和任何另外的治疗剂)。胃肠外输注包括肌肉内,静脉内,动脉内,腹膜内,或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的,剂量给药可以通过任何合适的路径(例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射)来进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表,包括但不限于单次施用或在多个时间点上的多次施用,推注施用,和脉冲输注。
本文中描述的4-1BB激动剂和HER-2靶向剂二者会以符合优秀医学实践的方式配制,定剂量,和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂投递部位,施用方法,施用日程表,和医学从业人员知道的其它因素。抗体无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量,病症或治疗的类型,和上文讨论的其它因素。这些一般以与本文所述相同的剂量和施用路径使用,或以本文所述剂量的约1-99％使用,或以凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。
制品(试剂盒)
在本发明的另一个方面,提供一种试剂盒,其含有对于治疗,预防和/或诊断上文描述的病症有用的材料。试剂盒包含至少一个容器和在容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,IV溶液袋,等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有本身或与另一种组合物组合有效治疗,预防和/或诊断状况的组合物且可具有无菌存取口(例如,容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。试剂盒中的至少两种活性剂是本发明的4-1BB激动剂和HER-2靶向剂。在一些方面,该HER-2靶向剂包含HER-2抗体,双特异性HER-2抗体和/或HER-2抗体药物缀合物。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。在一些方面,该HER-2靶向剂选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和曲妥珠单抗美坦新组成的组。在一些方面,该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新的组合。在一些方面,该HER-2靶向剂包含选自由曲妥珠单抗,帕妥珠单抗和玛格妥昔单抗组成的组的HER-2抗体。在一个方面,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。更加特别地,该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗。在一些方面,该HER-2靶向剂是糖工程化HER-2抗体,例如TrasGex。在一些方面,该HER-2靶向剂是双特异性HER-2抗体,例如Herceptarg。在一些方面,该HER-2靶向剂是HER-2抗体药物缀合物,特别是曲妥珠单抗美坦新(ado-曲妥珠单抗美坦新)。
在一个特定方面,提供的是一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的试剂盒,其包含包装,包含(A)包含作为活性组分的4-1BB激动剂和药学可接受载剂的第一组合物；(B)包含作为活性组分的HER-2靶向剂和药学可接受载剂的第二组合物,和(C)关于在组合疗法中使用组合物的用法说明书。
标签或包装插页指示组合物如何用于治疗选择的状况及提供关于在组合疗法中使用组合物的用法说明书。此外,试剂盒可包含(a)其中装有组合物的第一容器,其中组合物包含本发明的4-1BB激动剂；和(b)其中装有组合物的第二容器,其中组合物包含本发明的HER-2靶向剂。另外,试剂盒可包含一个或多个其中装有能组合使用的别的活性组分的别的容器。本发明的这个实施方案中的制品可进一步包含指示组合物可用于治疗特定状况的包装插页。
或者/另外,试剂盒可进一步包含第二(或第三)容器,其包含药学可接受缓冲剂,诸如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料,包括其它缓冲剂,稀释剂,滤器,针,和注射器。
表C(序列)
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关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中给出。抗体链的氨基酸依照如上文定义的依照Kabat的编号系统(Kabat,E.A.et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991))进行编号和提及。
本发明的各方面
在下面,列出本发明的一些方面。
1.供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂与HER-2靶向剂组合使用。
2.供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂与HER-2靶向剂组合使用且其中该4-1BB激动剂是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
3.方面1的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。
4.方面1或2的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂包含三个4-1BBL外域或其片段。
5.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段的分子且其中该4-1BBL外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
6.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
7.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗原结合域的抗原结合分子。
8.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含
(a)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQID NO:18的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3。
9.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
10.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。
11.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。
12.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
13.前述方面任一项的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CD19的Fab域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)分别地,该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH1或CL域连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(ii)分别地,该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH3域的C端连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(iii)分别地,该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且该第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与VH或VL连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的一个4-1BBL外域或其片段。
14.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的Fab域,该特异性结合FAP的Fab域包含包含SEQID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
15.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是选自由下述各项组成的组的抗原结合分子:
a)包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
b)包含包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的第二轻链的分子。
16.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽。
17.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽,和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中该包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽与该Fc域的两个亚基之一的N或C端氨基酸融合,任选经由肽接头。
18.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是抗FAP/抗4-1BB双特异性抗体。
19.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子。
20.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含(a)重链可变区(VHCEA)和轻链可变区(VLCEA),该重链可变区(VHCEA)包含(i)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLCEA)包含(iv)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3。
21.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA)。
22.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。
23.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。
24.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
25.前述方面任一项的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)分别地,该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH1或CL域连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(ii)分别地,该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH3域的C端连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(iii)分别地,该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且该第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与VH或VL连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的一个4-1BBL外域或其片段。
26.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,该能够特异性结合CEA的Fab域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
27.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含包含SEQID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQID NO:82的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第二轻链的抗原结合分子。
28.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽。
29.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽,和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中该包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽与该Fc域的两个亚基之一的N或C端氨基酸融合,任选经由肽接头。
30.前述方面的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂是抗CEA/抗4-1BB双特异性抗体。
31.前述方面任一项的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂与HER-2靶向剂组合使用且其中该组合以约一周至三个周的间隔施用。
32.一种药学产品,其包含(A)包含作为活性组分的4-1BB激动剂和药学可接受载剂的第一组合物；和(B)包含作为活性组分的HER-2靶向剂和药学可接受载剂的第二组合物,供组合,顺序或同时,治疗疾病,特别是癌症中使用。
33.一种药学组合物,其包含4-1BB激动剂和HER-2靶向剂。
34.方面32的药学组合物,供治疗实体瘤中使用的。
35.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂包含三个4-1BBL外域或其片段。
36.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段的分子且其中该4-1BBL外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
37.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
38.前述方面任一项的药学组合物,其中该肿瘤相关抗原是FAP。
39.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含
(a)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQID NO:18的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3。
40.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
41.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的抗原结合分子。
42.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。
43.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。
44.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G的IgG1 Fc域的抗原结合分子。
45.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
46.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的Fab域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)分别地,该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH1或CL域连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(ii)分别地,该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH3域的C端连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(iii)分别地,该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且该第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与VH或VL连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的一个4-1BBL外域或其片段。
47.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的Fab域,该能够特异性结合FAP的Fab域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
48.前述方面任一项的药学组合物,其中其中该4-1BB激动剂是选自由下述各项组成的组的抗原结合分子:
a)包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
b)包含包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的第二轻链的分子。
49.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽。
50.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽,和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中该包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽与该Fc域的两个亚基之一的N或C端氨基酸融合,任选经由肽接头。
51.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是抗FAP/抗4-1BB双特异性抗体。
52.前述方面任一项的药学组合物,其中该肿瘤相关抗原是CEA。
53.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含重链可变区(VHCEA)和轻链可变区(VLCEA),该重链可变区(VHCEA)包含(i)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLCEA)包含(iv)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3。
54.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA)。
55.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的抗原结合分子。
56.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。
57.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。
58.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G的IgG1 Fc域的抗原结合分子。
59.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
60.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)分别地,该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH1或CL域连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(ii)分别地,该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH3域的C端连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(iii)分别地,该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且该第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与VH或VL连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的一个4-1BBL外域或其片段。
61.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,该能够特异性结合CEA的Fab域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
62.前述方面任一项的药学组合物,其中其中该4-1BB激动剂是包含包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ IDNO:82的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第二轻链的抗原结合分子。
63.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的4-1BBL外域或其片段的多肽。
64.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽,和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域,其中该包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽与该Fc域的两个亚基之一的N或C端氨基酸融合,任选经由肽接头。
65.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂是抗CEA/抗4-1BB双特异性抗体。
66.前述方面任一项的供使用的4-1BB激动剂或药学组合物,其中该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新中一项或多项。
67.前述方面任一项的供使用的4-1BB激动剂或药学组合物,其中该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗。
68.前述方面任一项的药学组合物,其中该4-1BB激动剂与HER-2靶向剂组合使用且其中该组合以约一周至三周的间隔施用。
69.前述方面任一项的药学组合物,供治疗增殖性疾病,特别是癌症或延迟增殖性疾病,特别是癌症进展中使用。
70.前述方面任一项的药学组合物,供治疗乳腺癌,卵巢癌,胃癌,胃的癌,食管癌,肺癌,子宫癌,唾液管癌,膀胱癌,子宫内膜癌,胰腺癌,结肠癌,前列腺癌,和/或头和颈癌中使用。
71.一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的试剂盒,其包含包装,包含(A)包含作为活性组分的4-1BB激动剂和药学可接受载剂的第一组合物；(B)包含作为活性组分的HER-2靶向剂和药学可接受载剂的第二组合物,和(C)关于在组合疗法中使用该组合物的用法说明书。
72.4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合在制造用于治疗增殖性疾病,特别是癌症或延迟增殖性疾病,特别是癌症进展的药物中的用途。
73.4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合在制造药物中的用途,其中该药物用于治疗实体瘤。
74.一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包含对该受试者施用有效量的4-1BB激动剂和有效量的HER-2靶向剂。
75.一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包含对该受试者施用有效量的4-1BB激动剂和有效量的HER-2靶向剂,其中该4-1BB激动剂是抗原结合分子。
76.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含Fc域的抗原结合分子。
77.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含具有降低Fcγ受体结合和/或效应器功能的修饰的Fc域的抗原结合分子。
78.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段的抗原结合分子。
79.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
80.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段的分子且其中该4-1BBL外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
81.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合FAP的模块的抗原结合分子,其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含
(a)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQID NO:18的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3。
82.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
83.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的抗原结合分子。
84.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。
85.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。
86.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
87.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的Fab域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)分别地,该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH1或CL域连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(ii)分别地,该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH3域的C端连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(iii)分别地,该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且该第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与VH或VL连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的一个4-1BBL外域或其片段。
88.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的Fab域,该能够特异性结合FAP的Fab域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
89.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是选自由下述各项组成的组的抗原结合分子:
a)包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第二轻链的分子；和
b)包含包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的第二轻链的分子。
90.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽。
91.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是抗FAP/抗4-1BB双特异性抗体。
92.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的模块的抗原结合分子,其中该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含
重链可变区(VHCEA)和轻链可变区(VLCEA),该重链可变区(VHCEA)包含(i)包含SEQID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLCEA)包含(iv)包含SEQ IDNO:36的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3。
93.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子,其中该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ IDNO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA)。
94.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是进一步包含由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的抗原结合分子。
95.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。
96.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。
97.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
98.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于
(i)分别地,该第一多肽含有CH1或CL域且该第二多肽含有CL或CH1域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH1或CL域连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CL或CH1域连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(ii)分别地,该第一多肽含有CH3域且该第二多肽含有CH3域,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与该CH3域的C端连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的CH3域的C端连接的一个4-1BBL外域或其片段,或
(iii)分别地,该第一多肽含有VH-CL或VL-CH1域且该第二多肽含有VL-CH1域或VH-CL域,其中该第二多肽通过该CH1和CL域之间的二硫键与该第一多肽连接,且其中该第一多肽包含通过肽接头彼此且与VH或VL连接的两个4-1BBL外域或其片段且其中该第二多肽包含经由肽接头与所述多肽的VL或VH连接的一个4-1BBL外域或其片段。
99.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,该能够特异性结合CEA的Fab域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
100.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:82的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列的第二轻链的抗原结合分子。
101.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)包含通过肽接头彼此连接的三个4-1BBL外域或其片段的多肽。
102.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂是抗CEA/抗4-1BB双特异性抗体。
103.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂与HER-2靶向剂组合使用且其中该组合以约一周至三周的间隔施用。
104.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。
105.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂静脉内或皮下施用。
106.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂与该HER-2靶向剂并行,在该HER-2靶向剂前,或在该HER-2靶向剂后施用。
107.前述方面任一项的方法,其中该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂同时施用。
108.任何前述方面的供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂与HER-2靶向剂组合使用且其中该4-1BB激动剂与该HER-2靶向剂协同作用。
109.供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的4-1BB激动剂,其中该4-1BB激动剂与HER-2靶向剂组合使用且其中在该组合治疗前实施用II型抗CD20抗体的预治疗,其中该预治疗和该组合治疗之间的时间段足以响应该II型抗CD20抗体减少该个体中的B细胞。
110.方面109的供方法中使用的4-1BB激动剂,其中该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。
111.一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包含对该受试者施用有效量的4-1BB激动剂和有效量的HER-2靶向剂的组合,其中在用该组合的治疗前实施用II型抗CD20抗体的预治疗,其中该预治疗和该组合治疗之间的时间段足以响应该II型抗CD20抗体减少该个体中的B细胞。
112.方面111的方法,其中该II型抗CD20抗体是奥滨尤妥珠单抗。
113.一种包含4-1BB(CD137)激动剂和HER-2靶向剂的组合,其中该4-1BB激动剂是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
114.方面113的组合,其中该HER-2靶向剂包含HER-2抗体,HER-2双特异性抗体和/或HER-2抗体药物缀合物。
115.方面113或114的组合,其中该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。
116.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂包含三个4-1BBL外域或其片段。
117.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段的分子且其中该4-1BBL外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
118.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合选自由成纤维细胞激活蛋白(FAP)和CEA组成的组的肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
119.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。
120.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。
121.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗原结合域的抗原结合分子。
122.前述方面任一项的组合,其中该能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域是包含下述各项的能够特异性结合FAP的抗原结合域:
(a)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQID NO:18的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3。
123.前述方面任一项的组合,其中该能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域是能够特异性结合FAP的抗原结合域,该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
124.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
125.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的Fab域,该能够特异性结合FAP的Fab域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
126.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第二轻链的抗原结合分子。
127.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是抗FAP/抗4-1BB双特异性抗体。
128.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子。
129.前述方面任一项的组合,其中该能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域是能够特异性结合CEA的抗原结合域,该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含(a)重链可变区(VHCEA)和轻链可变区(VLCEA),该重链可变区(VHCEA)包含(i)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ IDNO:35的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLCEA)包含(iv)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3。
130.前述方面任一项的组合,其中该能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域是能够特异性结合CEA的抗原结合域,该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含包含SEQ IDNO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA)。
131.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
132.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,该能够特异性结合CEA的Fab域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
133.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂是抗CEA/抗4-1BB双特异性抗体。
134.前述方面任一项的组合,供作为药物使用。
135.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。
136.前述方面任一项的组合,其中该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂供同时施用或顺序施用。
137.前述方面任一项的组合,供治疗HER-2阳性癌症中使用。
实施例
下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践各种其它实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA,如Sambrook et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No 91-3242中给出。
DNA测序
通过双链测序测定DNA序列。
基因合成
想要的基因区段或是使用适宜的模板通过PCR来生成或是由Geneart AG(Regensburg,Germany)自合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动化基因合成来合成。在确切的基因序列不可得的情况中,基于来自最近同源物的序列设计寡核苷酸引物,并通过RT-PCR自源自适宜组织的RNA分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入标准克隆/测序载体。自转化细菌纯化质粒DNA并通过UV光谱术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以容许亚克隆入相应的表达载体。所有构建物均设计成具有编码在真核细胞中将蛋白质靶向分泌的前导肽的5’端DNA序列。
细胞培养技术
使用标准细胞培养技术,如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.(eds.),John Wiley&Sons,Inc.中描述的。
蛋白质纯化
参考标准方案,自经过过滤的细胞培养物上清液纯化蛋白质。简言之,将抗体应用于蛋白A Sepharose柱(GE Healthcare)并用PBS清洗。于pH 2.8实现抗体的洗脱,继以立即中和样品。在PBS中或在20mM组氨酸,150mM NaCl pH 6.0中通过大小排阻层析术(Superdex200,GE Healthcare)将聚集的蛋白质与单体抗体分开。合并单体抗体级分,使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩机浓缩(在需要时),冷冻并贮存于-20℃或-80℃。提供部分样品用于后续蛋白质分析和分析性表征,例如通过SDS-PAGE,大小排阻层析术(SEC)或质谱术。
SDS-PAGE
依照制造商的说明书使用
Figure BDA0002598125050000991
预制凝胶系统(Invitrogen)。特别地,使用10％或4-12％
Figure BDA0002598125050000992
Bis-TRIS预制凝胶(pH 6.4)和
Figure BDA0002598125050000993
MES(还原凝胶,具有
Figure BDA0002598125050000994
抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。
分析性大小排阻层析术
通过HPLC层析术实施大小排阻层析术(SEC),用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之,将经过蛋白A纯化的抗体应用于Agilent HPLC 1100系统上的300mM NaCl,50mMKH2PO4/K2HPO4,pH 7.5中的Tosoh TSKgel G3000SW柱或Dionex HPLC系统上的2x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)。通过UV吸光度和峰面积积分量化洗脱的蛋白质。BioRad凝胶过滤标准品151-1901充当标准品。
质谱术
此节描述具有VH/VL交换(VH/VL CrossMab)的多特异性抗体的表征,重点在于它们的正确装配。通过去糖基化的完整CrossMab和去糖基化的/纤溶酶消化的或替代地去糖基化的/有限LysC消化的CrossMab的电喷雾电离质谱术(ESI-MS)分析预期的一级结构。
将VH/VL CrossMab以1mg/ml的蛋白质浓度用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F于37℃去糖基化多达17小时。纤溶酶或有限LysC(Roche)消化用Tris缓冲液pH 8中的100μg去糖基化的VH/VL CrossMab分别于室温实施120小时和于37℃实施40分钟。质谱术前,将样品在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上经由HPLC脱盐。在配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(Bruker Daltonik)上经由ESI-MS测定总质量。
使用表面等离振子共振(SPR)(BIACORE)测定多特异性抗体对相应抗原的结合和结合亲和力
使用BIACORE仪器(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)通过表面等离振子共振调查所生成的抗体对相应抗原的结合。简言之,为了亲和力测量,将山羊抗人IgG,JIR 109-005-098抗体经由胺偶联固定化在CM5芯片上,用于呈现针对相应抗原的抗体。于25℃(或替代地于37℃)在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES,150mM NaCl,0.005％吐温20,pH 7.4))中测量结合。以溶液中的多种浓度添加抗原(R&D Systems或内部纯化的)。通过80秒至3分钟的抗原注射来测量结合；通过用HBS缓冲液清洗芯片表面3-10分钟来测量解离,并使用1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型来估算KD值。自样品曲线减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线),用于修正系统内在基线漂移和噪声信号降低。使用相应的Biacore评估软件进行传感图的分析和亲和力数据的计算。
实施例1
FAP-41BBL抗原结合分子的制备,纯化和表征
如国际专利申请公开号WO 2016/075278 A1中所述制备FAP靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子。
特别地,生成下面的分子:
a)单价FAP靶向性和非靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子
与节上的人IgG1重链CH2和CH3域同框亚克隆编码与人CL域融合的二聚体4-1BB配体的多肽(Merchant,Zhu et al.,1998,Nature Biotechnol.16,677-681)。将含有一个4-1BB配体外域的多肽与人IgG1-CH1域融合。在构建物2.4中,为了改进链的正确配对,在交叉的CH-CL(带电荷的变体)中另外引入下面的突变。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中,E123R和Q124K,在与人CH1融合的单体4-1BB配体中,K147E和K213E。
与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆编码对FAP特异性的结合物(克隆28H1或克隆4B9)的重和轻链可变区的DNA序列。已经依照WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。二聚体配体-含有S354C/T366W突变的Fc节链,单体CH1融合物,靶向性抗FAP-含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链和抗FAP轻链的组合容许生成异二聚体,其包括装配的三聚体4-1BB配体和FAP结合性Fab(图1A)。已经相应地通过用种系DP47替换FAP结合物制备一种非靶向性型式(图1C)。
表1:单价构建物
Figure BDA0002598125050001011
b)二价FAP靶向性和非靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子
与穴,节的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆编码对FAP特异性的结合物(克隆28H1或克隆4B9)的重和轻链可变区的DNA序列。依照WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。而且,将包含两个4-1BB配体外域的多肽与人IgG1 Fc穴链的C端融合并将包含一个4-1BB配体外域的多肽与人IgG1 Fc节链的C端融合。抗FAP huIgG1穴二聚体配体含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的重链,抗FAP huIgG1节单体配体含有S354C/T366W突变的重链和抗FAP轻链的组合容许生成异二聚体,其包括组装的三聚体4-1BB配体和两个FAP结合性Fab(图1B)。已经相应地通过用种系DP47替换FAP结合物制备一种非靶向性型式(图1D)。
表2:二价构建物
Figure BDA0002598125050001021
FAP靶向性和非靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生成和表征分别在WO 2016/075278,实施例1至6中有详细描述。
实施例2
FAP靶向性小鼠4-1BBL抗原结合分子(杂合替代物)的制备,纯化和表征
如国际专利申请公开号WO 2016/075278 A1中所述制备包含激动性小鼠4-1BB配体及对FAP的单价结合的双特异性抗原结合分子,也称作杂合替代物或FAP-mu4-1BBL。通过用小鼠外域替换人配体,如关于人配体所述制备靶向性小鼠4-1BBL。
依照Uniprot数据库的Q3U1Z9-1序列合成编码小鼠4-1BB配体的部分外域(氨基酸104-309,包括C160S突变)的DNA序列。用于靶向4-1BB配体的FAP结合物是克隆4B9。用于杂合替代物FAP-mu4-1BBL的氨基酸序列可以在表3中找到。
表3:成熟杂合替代物FAP-mu4-1BBL的氨基酸序列
Figure BDA0002598125050001022
Figure BDA0002598125050001031
Figure BDA0002598125050001041
通过使用eviFect(Evitria AG)用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的CHO-K1细胞来生成杂合替代物FAP-mu4-1BBL。以1:1:1:1比(“载体Fc-穴重链”:“载体FAP轻链”:“载体4-1BBL Fc-节重链”:“载体mu4-1BBL轻链”)用相应的表达载体转染细胞。
为了转染,在eviMake培养培养基(Evitria AG)中无血清悬浮培养CHO-K1细胞。于37℃在具有5％CO2气氛的温箱中7天后,收集培养上清液,用于通过离心来纯化并将溶液无菌过滤(0.22mm滤器)并保存于4℃。
通过使用蛋白A的亲和层析,继以大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。为了亲和层析,在用20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠,pH 7.5平衡的蛋白AMabSelectSure柱(GE Healthcare)上加载上清液。通过用含有20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠的缓冲液(pH 7.5)清洗来去除未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠,100mM NaCl,100mM甘氨酸,0.01％Tween20,pH 3.0的氯化钠的线性pH梯度洗脱结合的蛋白质。然后用20mM柠檬酸钠,100mM NaCl,100mM甘氨酸,0.01％Tween20,pH 3.0清洗柱。通过添加1/40(v/v)的2MTris,pH 8.0来调节收集的级分的pH。浓缩并过滤蛋白质,之后在用20mM组氨酸,140mMNaCl,0.01％Tween20,pH 6.0平衡的HiLoad Superdex柱(GE Healthcare)上加载。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过测量280nm处的OD来测定纯化的双特异性构建物的蛋白质浓度。使用LabChipGXII(Caliper)在还原剂(Invitrogen,USA)存在和缺失下通过CE-SDS分析双特异性构建物的纯度和分子量。于25℃使用在25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM L-精氨酸单氢氯化物,0.02％(w/v)NaN3,pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)分析双特异性构建物的聚集体含量。
表4:杂合替代物FAP-mu4-1BBL的生化分析
分子 单体[％] 产量[mg/l] CE-SDS(非还原)
FAP-mu4-1BBL 95 3.2 92
2.1杂合替代物FAP-mu4-1BBL通过表面等离振子共振的功能表征
以如WO 2016/075278 A1中描述的方式通过表面等离振子共振(SPR)评估同时结合鼠4-1BB Fc(kih)和人或鼠FAP的能力。于25℃在Biacore T200上实施所有SPR实验,以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20,Biacore,Freiburg/Germany)。将生物素化鼠4-1BB Fc(kih)直接偶联至链霉亲合素(SA)传感器芯片的流动室。使用高至600个响应单位(RU)的固定化水平。
以200nM的浓度范围以30μl/min的流在90秒里使FAP靶向性mu4-1BBL构建物通行穿过流动室并将解离设定至零秒。以500nM的浓度以30μl/min的流在90秒里作为第二分析物注射人或鼠FAP穿过流动室。监测解离达120秒。通过减去在不固定化蛋白质的参照流动室中获得的响应来修正本体(bulk)折射率差异。
如在图2A和2B的图中可见,杂合替代物FAP-mu4-1BBL能同时结合鼠4-1BB和鼠/人FAP。
实施例3
具有对小鼠4-1BB的二价结合和对FAP的单价结合的双特异性抗原结合分子的制备,纯化和表征
已经与图1类似地制备具有对4-1BB的二价结合和FAP对的单价结合的双特异性激动性小鼠4-1BB抗体,也称作2+1。在这个实施例中,构建物的第一重链HC1由下面的成分构成:抗4-1BB(克隆MU137-1)的VHCH1,继以含有突变Lys392Asp和Lys409Asp的Fc(称作Fc-DD),在其C端融合抗FAP结合物(克隆28H1)的VL,或VH。第二重链HC2构成为抗4-1BB(克隆MU137-1)的VHCH1,继以含有突变Glu356Lys和Asp399Lys的Fc(称作Fc-KK),在其C端融合抗FAP结合物(克隆28H1)的VH,或VL。用于增强抗体Fc异二聚体形成的DDKK突变格外描述于Gunasekaran et al.,J.Biol.Chem.2010,19637-19646。靶向性抗FAP-Fc DD与抗4-1BB-FcKK链的组合容许生成包括FAP结合模块和两个鼠小鼠4-1BB结合性Fab的异二聚体。依照例如Baudino et al.,J.Immunol.(2008),181,6664-6669或WO 2016/030350 A1中描述的方法在重链的恒定区中引入DAPG突变以消除对小鼠Fc伽马受体的结合。简言之,已经在Fc-DD和Fc-KK重链的恒定区中引入Asp265Ala和Pro329Gly突变以消除对Fc伽马受体的结合(编号方式依照Kabat EU索引；即D265A,P329G)。
抗FAP(28H1)VH与Fc-KK融合且VL与Fc-DD链融合的2+1抗4-1BB(MU137-1),抗FAP(28H1)构建物的氨基酸序列分别可以在表5中找到。抗FAP(28H1)VL与Fc-KK融合且VH与Fc-DD链融合的2+1抗4-1BB(MU137-1),抗FAP(28H1)构建物的氨基酸序列分别可以在表6中找到。表5:双特异性,二价抗4-1BB(MU137-1)/抗FAP(28H1)小鼠IgG1 DAPG抗原结合分子(FAPVL与Fc-DD链融合且VH与Fc-KK链融合的构建物,下文也称作Fc-DD-VL)的序列
Figure BDA0002598125050001061
Figure BDA0002598125050001071
Figure BDA0002598125050001081
表6:双特异性,二价抗4-1BB(MU137-1)/单价抗FAP(28H1)小鼠IgG1 DAPG抗原结合分子(FAP VH与Fc DD链融合且VL与Fc KK链融合的构建物,称作Fc-DD-VH)的序列
Figure BDA0002598125050001082
Figure BDA0002598125050001091
通过使用eviFect(Evitria AG)用哺乳动物表达载体共转染悬浮生长的CHO-K1细胞来生成双特异性2+1抗4-1BB抗FAP muIgG1 DAPG。以1:1:1比(“载体Fc-DD重链”:“载体轻链”:“载体Fc-KK重链”)用相应的表达载体转染细胞。
为了转染,在eviMake培养培养基(Evitria AG)中无血清悬浮培养CHO-K1细胞。于37℃在具有5％CO2气氛的温箱中7天后,收集培养上清液,用于通过离心来纯化并将溶液无菌过滤(0.22mm滤器)并保存于4℃。
通过使用蛋白A的亲和层析,继以大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化分泌的蛋白质。为了亲和层析,在用40ml 20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠,pH 7.5平衡的蛋白AMabSelectSure柱(CV＝5mL,GE Healthcare)上加载上清液。通过用至少10个柱体积的含有20mM磷酸钠,20mM柠檬酸钠的缓冲液(pH 7.5)清洗来去除未结合的蛋白质。使用在15个柱体积的20mM柠檬酸钠,100mM NaCl,100mM甘氨酸,pH 3.0上创建的氯化钠的线性pH梯度(自20至100mM)洗脱结合的蛋白质。然后用10个柱体积的20mM柠檬酸钠,100mM NaCl,100mM甘氨酸,pH 3.0清洗柱。通过添加1/40(v/v)的2M Tris,pH 8.0来调节收集的级分的pH。浓缩并过滤蛋白质,之后在用20mM组氨酸,140mM NaCl,pH 6.0平衡的HiLoad Superdex 16/600S200柱(GE Healthcare)上加载。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数,通过测量280nm处的OD来测定纯化的双特异性构建物的蛋白质浓度。使用LabChipGXII(Caliper)在还原剂(Invitrogen,USA)存在和缺失下通过CE-SDS分析双特异性构建物的纯度和分子量。于25℃使用在25mM K2HPO4,125mM NaCl,200mM L-精氨酸单氢氯化物,0.02％(w/v)NaN3,pH 6.7运行缓冲液中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析性大小排阻柱(Tosoh)分析双特异性构建物的聚集体含量。
表7:具有对4-1BB的二价结合和对FAP的单价结合的双特异性抗原结合分子(2+1)抗4-1BB(MU137-1),抗FAP(28H1)小鼠IgG1 DAPG的生化分析
Figure BDA0002598125050001101
3.1小鼠替代物muFAP-4-1BB通过表面等离振子共振的功能表征
以如WO 2016/075278 A1中描述的方式通过表面等离振子共振(SPR)评估同时结合鼠4-1BB Fc(kih)和鼠FAP的能力。于25℃在Biacore T200上实施所有SPR实验,以HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％表面活性剂P20,Biacore,Freiburg/Germany)。将生物素化鼠4-1BB Fc(kih)直接偶联至链霉亲合素(SA)传感器芯片的流动室。使用高至600个共振单位(RU)的固定化水平。
以200nM的浓度范围以30μl/min的流在90秒里使FAP靶向性4-1BB构建物通行穿过流动室并将解离设定至零秒。以500nM的浓度以30μl/min的流在90秒里作为第二分析物注射鼠FAP穿过流动室。监测解离达120秒。通过减去在不固定化蛋白质的参照流动室中获得的响应来修正本体(bulk)折射率差异。如在图2C的图中可见,小鼠替代物muFAP-4-1BB能同时结合鼠4-1BB和鼠FAP。
实施例4
在C57BL/6小鼠中在单次注射后muFAP-4-1BB的药动学概况
将单剂2.5mg/kg muFAP-4-1BB(依照实施例3制备)注射入C57BL/6小鼠。对所有小鼠静脉内注射200μl适宜溶液。为了获得每200μl恰当量的化合物,用组氨酸缓冲液稀释储备溶液(muFAP-4-1BB；1.81mg/mL,在20mM组氨酸,140mM NaCl,pH 6.0中)。在10分钟,1小时,6小时,24小时,48小时,72小时,96小时,6天和9天时对三只小鼠每个时间点采血。通过ELISA分析血清样品中所注射的化合物。将生物素化鼠4-1BB,测试血清样品,用HRP标记的检测抗体抗msIgG逐步添加至96孔链霉亲合素包被的微量滴定板并在每一个步骤后于室温温育1小时。在每一个步骤后将板清洗三次以去除未结合的物质。最后,通过添加ABTS底物溶液以形成有色反应产物来显现过氧化物酶结合的复合物。于405nm处光度法测定反应产物强度(参照波长为490nm)且与血清样品中的分析物浓度成比例。结果在图3中显示。muFAP-4-1BB显示稳定的PK行为,这为功效研究提示一周一次进度表。
实施例5
在体内杂合FAP-mu4-1BBL构建物与曲妥珠单抗组合的抗肿瘤功效
在承载肿瘤的(承载N87的)huCD16TgScid小鼠中进行杂合FAP-mu4-1BBL(抗FAP,小鼠4-1BBL,人IgG骨干)和曲妥珠单抗的组合的首次概念证明。
N87细胞(Her2+人胃癌)最初自ATCC获得并在扩充后保藏于Roche Glycart内部细胞库。在含有10％FCS和1％Glutamax的RPMI中培养细胞。在5％CO2的水饱和气氛中于37℃培养细胞。以>95.0％的存活力在RPMI细胞培养培养基(Gibco)和GFR Matrigel中(1:1,总体积100μl)将5x106个细胞每只动物皮下注射入动物的右体侧。
依照承诺的准则(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时明亮/12小时黑暗的日周期在无特定病原体条件下维持在实验开始时8-10周龄的人FcgRIIIa(CD16)转基因SCID小鼠(其表达鼠FcγRIV阳性巨噬细胞和人FcγRIIIa阳性转基因鼠NK细胞二者作为效应器)(在Charles River,France繁殖)。实验性研究方案得到当地政府审查和批准。到达后,将动物维持一周以习惯新环境和进行观察。定期进行连续健康监测。
依照方案(图4A),如上文描述的对雌性huCD16TgScid小鼠皮下注射肿瘤细胞并当肿瘤尺寸达到大约220mm3时(第28天)一周一次用化合物或PBS(媒介)处理。每周一次对所有小鼠静脉内注射200μl适宜溶液。为了获得每200μl恰当量的化合物,在必要时用组氨酸缓冲液稀释该储备溶液(表1)。对于用曲妥珠单抗和FAP-4-1BBL构建物的组合疗法(组D,图4B),伴随注射疗法。每周两次使用测径器测量肿瘤生长(图5A和5B)并如下计算肿瘤体积:Tv:(W2/2)x L(W:宽度,L:长度)
在8次注射化合物后(在肿瘤细胞注射后第86天)终止研究并处死所有小鼠。图5A和5B显示所有处理组中的肿瘤生长动力学(均值+/-SEM)以及所有组的每只动物的个别肿瘤生长动力学。杂合FAP-mu4-1BBL的单药疗法不显示任何肿瘤生长抑制。作为单药疗法给予的曲妥珠单抗诱导肿瘤停滞(TGI:95且TCR:0.35),一只小鼠在研究终止时无肿瘤。然而,曲妥珠单抗和杂合FAP-mu4-1BBL的组合诱导强烈肿瘤消退(TGI:132且TCR:0.09),导致到第86天60％无肿瘤小鼠。
使用JMP软件进行统计分析:
Figure BDA0002598125050001121
Figure BDA0002598125050001122
基于研究第59天的计算在下文表9中显示。
表8:体内实验中使用的组合物
化合物 配制缓冲液 浓度(mg/mL)
FAP-mu4-1BBL 20mM组氨酸,140mM NaCl,pH6.0 5.33(＝储备溶液)
曲妥珠单抗 20mM组氨酸,140mM NaCl,pH6.0 25(＝储备溶液)
表9:第59天的肿瘤生长抑制(TGI)和TCR
Figure BDA0002598125050001123
Figure BDA0002598125050001131
TGI:肿瘤生长抑制＝>TGI>100意味着肿瘤消退,TGI＝100意味着肿瘤停滞；
TCR:处理对对照比＝>TCR＝1意味着无效果,TCR＝0意味着完全肿瘤消退
实施例6
CEA-4-1BBL抗原结合分子的制备,纯化和表征
如国际专利申请公开号WO 2016/075278 A1中所述制备CEA靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子。
特别地,生成单价CEA靶向性和非靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子。
与节上的人IgG1重链CH2和CH3域同框亚克隆编码与人CL域融合的二聚体4-1BB配体的多肽(Merchant,Zhu et al.1998,Nature Biotechnol.16,677-681)。将含有一个4-1BB配体外域的多肽与人IgG1-CH1域融合。为了改进链的正确配对,在交叉的CH-CL(带电荷的变体)中另外引入下面的突变:在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中,E123R和Q124K,在与人CH1融合的单体4-1BB配体中,K147E和K213E。
与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆编码对CEA特异性的结合物(克隆T84.66-LCHA(CEACAM5))的重和轻链可变区的DNA序列。依照WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。二聚体配体-含有S354C/T366W突变的Fc节链,单体CH1融合物,靶向性抗CEA-含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链和抗CEA轻链的组合容许生成异二聚体,其包括装配的三聚体4-1BB配体和CEA结合性Fab(与图1A类似,抗FAP用抗CEA替换)。
表10:单价构建物
Figure BDA0002598125050001132
Figure BDA0002598125050001141
CEA靶向性和非靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生成和表征分别在WO 2016/075278,实施例11至13中有详细描述。
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 用靶向性4-1BB (CD137)激动剂的组合疗法
<130> P34719-WO
<150> EP18161340.7
<151> 2018-03-13
<160> 99
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
180
<210> 2
<211> 170
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 2
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170
<210> 3
<211> 175
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 3
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170 175
<210> 4
<211> 203
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 4
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200
<210> 5
<211> 178
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 5
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu
<210> 6
<211> 164
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 6
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu
<210> 7
<211> 169
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 7
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
165
<210> 8
<211> 197
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 8
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu
195
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H1
<400> 9
Ser His Ala Met Ser
1 5
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H2
<400> 10
Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H3
<400> 11
Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L1
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L2
<400> 13
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L3
<400> 14
Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr
1 5
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H1
<400> 15
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H2
<400> 16
Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H3
<400> 17
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr
1 5
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L1
<400> 18
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L2
<400> 19
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L3
<400> 20
Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 21
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VH
<400> 21
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VL
<400> 22
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VH
<400> 23
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VL
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体hu 4-1BBL (71-254)
<400> 25
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
370 375
<210> 26
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体hu 4-1BBL (85-254)
<400> 26
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
180 185 190
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
195 200 205
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
210 215 220
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
225 230 235 240
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
245 250 255
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
260 265 270
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
275 280 285
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
290 295 300
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
305 310 315 320
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
325 330 335
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
340 345 350
<210> 27
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体hu 4-1BBL (80-254)
<400> 27
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
180 185 190
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
195 200 205
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
210 215 220
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
225 230 235 240
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
245 250 255
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
260 265 270
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
275 280 285
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
290 295 300
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
305 310 315 320
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
325 330 335
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
340 345 350
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
355 360
<210> 28
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体hu 4-1BBL (52-254)
<400> 28
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser
195 200 205
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro
210 215 220
Gly Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
225 230 235 240
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
245 250 255
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
260 265 270
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
275 280 285
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
290 295 300
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
305 310 315 320
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
325 330 335
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
340 345 350
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
355 360 365
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
370 375 380
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
385 390 395 400
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
405 410 415
<210> 29
<211> 366
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体hu 4-1BBL (71-248)
<400> 29
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
180 185 190
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
195 200 205
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
210 215 220
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
225 230 235 240
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
245 250 255
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
260 265 270
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
275 280 285
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
290 295 300
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
325 330 335
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
340 345 350
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
355 360 365
<210> 30
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体hu 4-1BBL (85-248)
<400> 30
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Asp
165 170 175
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
180 185 190
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
195 200 205
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
210 215 220
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
225 230 235 240
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
245 250 255
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
260 265 270
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
275 280 285
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
290 295 300
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
305 310 315 320
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
325 330 335
Gly Leu
<210> 31
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体hu 4-1BBL (80-248)
<400> 31
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Ser Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe
180 185 190
Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser
195 200 205
Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu
210 215 220
Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu
245 250 255
Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
260 265 270
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala
275 280 285
Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu
290 295 300
His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala
305 310 315 320
Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly
325 330 335
Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
340 345
<210> 32
<211> 404
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的二聚体hu 4-1BBL (52-248)
<400> 32
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro
195 200 205
Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser Pro
210 215 220
Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
225 230 235 240
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
245 250 255
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
260 265 270
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
275 280 285
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
290 295 300
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
305 310 315 320
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
325 330 335
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
340 345 350
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
355 360 365
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
370 375 380
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
385 390 395 400
Pro Ala Gly Leu
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA-HCDR1 (CEACAM5)
<400> 33
Asp Thr Tyr Met His
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA-HCDR2 (CEACAM5)
<400> 34
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA-HCDR3 (CEACAM5)
<400> 35
Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr
1 5 10
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA-LCDR1 (CEACAM5)
<400> 36
Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His
1 5 10 15
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA-LCDR2 (CEACAM5)
<400> 37
Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA-LCDR3 (CEACAM5)
<400> 38
Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 39
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA VH (CEACAM5)
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA VL (CEACAM5)
<400> 40
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 41
<211> 710
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-248) - CL* Fc节链
<400> 41
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
180 185 190
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
195 200 205
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
210 215 220
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
225 230 235 240
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
245 250 255
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
260 265 270
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
275 280 285
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
290 295 300
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
305 310 315 320
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
325 330 335
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
340 345 350
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly
355 360 365
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val
370 375 380
Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
385 390 395 400
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln
405 410 415
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val
420 425 430
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
435 440 445
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
450 455 460
Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
465 470 475 480
Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
485 490 495
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
500 505 510
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
515 520 525
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
530 535 540
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
545 550 555 560
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
565 570 575
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
580 585 590
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
595 600 605
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
610 615 620
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
625 630 635 640
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
645 650 655
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
660 665 670
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
675 680 685
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
690 695 700
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710
<210> 42
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-248) - CH1*
<400> 42
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys
180 185 190
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
195 200 205
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
210 215 220
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
225 230 235 240
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
245 250 255
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
260 265 270
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro
275 280 285
Lys Ser Cys
290
<210> 43
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9) Fc穴链
<400> 43
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 44
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (4B9)轻链
<400> 44
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-254) - CL* Fc节链
<400> 45
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
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Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
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Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
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100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro
385 390 395 400
Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu
405 410 415
Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp
420 425 430
Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp
435 440 445
Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys
450 455 460
Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln
465 470 475 480
Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp
485 490 495
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
500 505 510
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
515 520 525
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
530 535 540
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
545 550 555 560
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
565 570 575
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
580 585 590
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
595 600 605
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
610 615 620
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
625 630 635 640
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
645 650 655
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
660 665 670
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
675 680 685
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
690 695 700
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
705 710 715 720
Gly Lys
<210> 46
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 单体hu 4-1BBL (71-254) -CH1*
<400> 46
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
195 200 205
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu
210 215 220
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
225 230 235 240
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
245 250 255
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
260 265 270
Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
275 280 285
Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
290 295
<210> 47
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP(28H1) Fc穴链
<400> 47
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 48
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP (28H1)轻链
<400> 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 49
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47 Fc穴链
<400> 49
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 50
<211> 834
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与二聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗FAP (4B9) Fc穴链
<400> 50
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
450 455 460
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
465 470 475 480
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
485 490 495
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
500 505 510
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
515 520 525
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
530 535 540
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
545 550 555 560
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
565 570 575
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
580 585 590
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
595 600 605
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
610 615 620
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
625 630 635 640
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu
645 650 655
Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe
660 665 670
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675 680 685
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Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val
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Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu
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Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
740 745 750
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala
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Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu
770 775 780
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785 790 795 800
Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly
805 810 815
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820 825 830
Ser Glu
<210> 51
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与单体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗FAP (4B9) Fc节链
<400> 51
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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625 630 635 640
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与二聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗FAP (28H1) Fc穴链
<400> 52
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340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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545 550 555 560
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser
690 695 700
Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr
705 710 715 720
Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly
725 730 735
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740 745 750
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Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg
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Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu
805 810 815
Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser
820 825 830
Glu
<210> 53
<211> 639
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与单体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗FAP (28H1) Fc节链
<400> 53
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
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260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
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420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
500 505 510
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
515 520 525
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
530 535 540
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
545 550 555 560
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
565 570 575
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
580 585 590
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610 615 620
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
625 630 635
<210> 54
<211> 834
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与二聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的DP47 Fc穴链
<400> 54
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
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275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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325 330 335
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385 390 395 400
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405 410 415
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His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
450 455 460
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
465 470 475 480
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485 490 495
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
500 505 510
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
515 520 525
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
530 535 540
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545 550 555 560
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
565 570 575
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
580 585 590
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
595 600 605
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610 615 620
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
625 630 635 640
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu
645 650 655
Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe
660 665 670
Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser
675 680 685
Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu
690 695 700
Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val
705 710 715 720
Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu
725 730 735
Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
740 745 750
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala
755 760 765
Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu
770 775 780
His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala
785 790 795 800
Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly
805 810 815
Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg
820 825 830
Ser Glu
<210> 55
<211> 640
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与单体hu 4-1BBL (71-254)融合的DP47 Fc节链
<400> 55
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
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545 550 555 560
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
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580 585 590
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
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Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
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<210> 56
<211> 760
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 56
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1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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340 345 350
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385 390 395 400
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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<210> 58
<211> 761
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 58
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<220>
<223> 鼠FAP外域+poly-lys标签+his6标签
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<211> 748
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<223> 食蟹猴FAP外域+poly-lys标签+his6标签
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515 520 525
Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala
530 535 540
Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr
545 550 555 560
Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr
565 570 575
Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile
580 585 590
Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly
625 630 635 640
Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val
645 650 655
Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His
660 665 670
Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala
675 680 685
Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser
690 695 700
Asp Gln Asn His Gly Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr
705 710 715 720
His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly Lys
725 730 735
Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
740 745
<210> 61
<211> 702
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 61
Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr
20 25 30
Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly
35 40 45
Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly
50 55 60
Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile
65 70 75 80
Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser
85 90 95
Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile
100 105 110
Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp
115 120 125
Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu
130 135 140
Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys
145 150 155 160
Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr
165 170 175
Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln
180 185 190
Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn
195 200 205
Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg
210 215 220
Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro
225 230 235 240
Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn
245 250 255
Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn
275 280 285
Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser
290 295 300
Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu
325 330 335
Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr
340 345 350
Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg
355 360 365
Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr
370 375 380
Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser
385 390 395 400
Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp
405 410 415
Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser
435 440 445
Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile
450 455 460
Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn
465 470 475 480
Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val
485 490 495
Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro
500 505 510
Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln
515 520 525
Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser
530 535 540
Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn
545 550 555 560
Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser
565 570 575
Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly
580 585 590
Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly
595 600 605
Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln
610 615 620
Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu
625 630 635 640
Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe
645 650 655
Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile
660 665 670
Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr
675 680 685
Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile
690 695 700
<210> 62
<211> 254
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 62
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 63
<211> 205
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 63
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
35 40 45
Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
50 55 60
Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
65 70 75 80
Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
100 105 110
Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
130 135 140
Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
145 150 155 160
Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
165 170 175
Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
180 185 190
Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200 205
<210> 64
<211> 163
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 64
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln
<210> 65
<211> 256
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 65
Met Gly Asn Asn Cys Tyr Asn Val Val Val Ile Val Leu Leu Leu Val
1 5 10 15
Gly Cys Glu Lys Val Gly Ala Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln
20 25 30
Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys
50 55 60
Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr
65 70 75 80
His Asn Ala Glu Cys Glu Cys Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro
85 90 95
Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr
100 105 110
Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn
115 120 125
Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg
130 135 140
Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Pro Val Val Ser Phe Ser Pro Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu
165 170 175
Gly Gly Pro Gly Gly His Ser Leu Gln Val Leu Thr Leu Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ile Phe Ile Thr Leu Leu Phe
195 200 205
Ser Val Leu Lys Trp Ile Arg Lys Lys Phe Pro His Ile Phe Lys Gln
210 215 220
Pro Phe Lys Lys Thr Thr Gly Ala Ala Gln Glu Glu Asp Ala Cys Ser
225 230 235 240
Cys Arg Cys Pro Gln Glu Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Glu Leu
245 250 255
<210> 66
<211> 254
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 66
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala
180 185 190
Leu Thr Ser Thr Val Val Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg
195 200 205
Phe Ser Val Val Lys Arg Ser Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
210 215 220
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
225 230 235 240
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> G4S肽接头
<400> 67
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 68
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)2
<400> 68
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (SG4)2
<400> 69
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 70
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 71
Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头2
<400> 72
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 73
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头3
<400> 73
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头4
<400> 74
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 75
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头5
<400> 75
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头6
<400> 76
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 77
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头7
<400> 77
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 78
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头8
<400> 78
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头9
<400> 79
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头10
<400> 80
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头11
<400> 81
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 82
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5 Fc穴链
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 83
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5轻链
<400> 83
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 84
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DP47轻链
<400> 84
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 85
<211> 297
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 85
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 86
<211> 766
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> di-mu4-1BBL-CL Fc节链
<400> 86
Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu
1 5 10 15
Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile
20 25 30
Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu
35 40 45
Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Ser Asn Thr Thr Leu Asn Trp His
50 55 60
Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr
85 90 95
Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His
100 105 110
Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val
115 120 125
Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser
130 135 140
Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu
145 150 155 160
Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly
165 170 175
Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr
180 185 190
Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu Gly Gly
195 200 205
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu
210 215 220
Thr Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp
225 230 235 240
Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln
245 250 255
Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu
260 265 270
Ser Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser
275 280 285
Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val
290 295 300
Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser
305 310 315 320
Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu
325 330 335
Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu
340 345 350
Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg
355 360 365
Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val
370 375 380
Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp
385 390 395 400
Glu Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys
405 410 415
Pro Asp Asn Pro Trp Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
420 425 430
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg
435 440 445
Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
450 455 460
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
465 470 475 480
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
485 490 495
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
500 505 510
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
515 520 525
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr
530 535 540
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
545 550 555 560
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
565 570 575
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
580 585 590
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
595 600 605
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
610 615 620
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
625 630 635 640
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
645 650 655
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
660 665 670
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
675 680 685
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
690 695 700
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
705 710 715 720
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
725 730 735
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
740 745 750
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
755 760 765
<210> 87
<211> 319
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mono-mu4-1BBL-CH1链
<400> 87
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Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln Val Thr Pro Val Ser His Ile
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Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu
35 40 45
Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Ser Asn Thr Thr Leu Asn Trp His
50 55 60
Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr
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Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro Thr Phe Thr Asn Thr Gly His
100 105 110
Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val
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Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser
130 135 140
Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu
145 150 155 160
Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly
165 170 175
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180 185 190
Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro Asp Asn Pro Trp Glu Gly Gly
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Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
225 230 235 240
Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
245 250 255
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260 265 270
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
275 280 285
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
290 295 300
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
305 310 315
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1 (4B9) Fc穴链
<400> 88
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCL(4B9)轻链
<400> 89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 90
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1 (MU137-1)-重链Fc-DD-VL (28H1)
<400> 90
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Tyr Phe
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Asp Ile Pro Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Glu Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Tyr Gly Gly Tyr Ser Glu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340 345 350
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn
355 360 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Ala Glu Asn Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
385 390 395 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405 410 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420 425 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
450 455 460
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu
465 470 475 480
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr
485 490 495
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
500 505 510
Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
515 520 525
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
530 535 540
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro
545 550 555 560
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570
<210> 91
<211> 579
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1 (20H4.9)-重链Fc-KK-VH (28H1)
<400> 91
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Tyr Phe
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Asp Ile Pro Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Glu Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Tyr Gly Gly Tyr Ser Glu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340 345 350
Lys Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn
355 360 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser
385 390 395 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405 410 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420 425 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
450 455 460
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
465 470 475 480
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Ala
485 490 495
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
500 505 510
Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
515 520 525
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
530 535 540
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser
<210> 92
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VLCL-轻链(MU137-1)
<400> 92
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Ser Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Ser Ser Gly Ser Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Arg Leu Gln Val
65 70 75 80
Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Gly Ala Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 93
<211> 579
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1 (MU137-1)-重链Fc-DD-VH (28H1)
<400> 93
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Tyr Phe
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Asp Ile Pro Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Glu Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Tyr Gly Gly Tyr Ser Glu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340 345 350
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn
355 360 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Ala Glu Asn Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
385 390 395 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405 410 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420 425 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
450 455 460
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
465 470 475 480
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His Ala
485 490 495
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
500 505 510
Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
515 520 525
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
530 535 540
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
545 550 555 560
Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser
<210> 94
<211> 571
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VHCH1 (MU137-1)-重链Fc-KK-VL (28H1)
<400> 94
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Tyr Phe
20 25 30
Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Asp Ile Pro Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Glu Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Tyr Gly Gly Tyr Ser Glu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195 200 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210 215 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290 295 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325 330 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340 345 350
Lys Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn
355 360 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser
385 390 395 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405 410 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420 425 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
450 455 460
Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu
465 470 475 480
Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr
485 490 495
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
500 505 510
Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
515 520 525
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro
530 535 540
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro
545 550 555 560
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
565 570
<210> 95
<211> 1245
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 95
Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys
20 25 30
Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His
35 40 45
Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr
50 55 60
Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val
65 70 75 80
Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu
85 90 95
Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr
100 105 110
Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro
115 120 125
Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser
130 135 140
Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln
145 150 155 160
Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn
165 170 175
Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys
180 185 190
His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser
195 200 205
Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys
210 215 220
Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys
225 230 235 240
Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu
245 250 255
His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val
260 265 270
Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg
275 280 285
Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu
290 295 300
Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln
305 310 315 320
Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys
325 330 335
Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu
340 345 350
Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys
355 360 365
Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp
370 375 380
Pro Ala Ser Asn Thr Ala Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu
385 390 395 400
Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln
405 410 415
Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser
420 425 430
Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu
435 440 445
Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu
450 455 460
Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His
465 470 475 480
Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly
485 490 495
Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly
500 505 510
Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln
515 520 525
Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr
530 535 540
Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln
545 550 555 560
Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala
565 570 575
Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser
580 585 590
Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp
595 600 605
Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys
610 615 620
Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro
625 630 635 640
Leu Thr Ser Ile Ile Ser Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val
645 650 655
Leu Gly Val Val Phe Gly Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile
660 665 670
Arg Lys Tyr Thr Met Arg Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu
675 680 685
Pro Leu Thr Pro Ser Gly Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile
690 695 700
Leu Lys Glu Thr Glu Leu Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala
705 710 715 720
Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val
725 730 735
Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys
740 745 750
Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly
755 760 765
Ser Pro Tyr Val Ser Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val
770 775 780
Gln Leu Val Thr Gln Leu Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val
785 790 795 800
Arg Glu Asn Arg Gly Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys
805 810 815
Met Gln Ile Ala Lys Gly Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val
820 825 830
His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His
835 840 845
Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu
850 855 860
Thr Glu Tyr His Ala Asp Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala
865 870 875 880
Leu Glu Ser Ile Leu Arg Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp
885 890 895
Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro
900 905 910
Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly
915 920 925
Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile
930 935 940
Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg
945 950 955 960
Glu Leu Val Ser Glu Phe Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe
965 970 975
Val Val Ile Gln Asn Glu Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser
980 985 990
Thr Phe Tyr Arg Ser Leu Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val
995 1000 1005
Asp Ala Glu Glu Tyr Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro
1010 1015 1020
Asp Pro Ala Pro Gly Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg
1025 1030 1035
Ser Ser Ser Thr Arg Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu
1040 1045 1050
Glu Pro Ser Glu Glu Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser
1055 1060 1065
Glu Gly Ala Gly Ser Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly
1070 1075 1080
Ala Ala Lys Gly Leu Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro
1085 1090 1095
Leu Gln Arg Tyr Ser Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu
1100 1105 1110
Thr Asp Gly Tyr Val Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu
1115 1120 1125
Tyr Val Asn Gln Pro Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg
1130 1135 1140
Glu Gly Pro Leu Pro Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu
1145 1150 1155
Arg Pro Lys Thr Leu Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp
1160 1165 1170
Val Phe Ala Phe Gly Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr
1175 1180 1185
Pro Gln Gly Gly Ala Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe
1190 1195 1200
Ser Pro Ala Phe Asp Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro
1205 1210 1215
Glu Arg Gly Ala Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala
1220 1225 1230
Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Gly Leu Asp Val Pro Val
1235 1240 1245
<210> 96
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH曲妥珠单抗
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 97
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL曲妥珠单抗
<400> 97
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 98
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH帕妥珠单抗
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL帕妥珠单抗
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105

Claims (37)

1.供用于治疗癌症或延迟癌症进展的方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB(CD137)激动剂与HER-2靶向剂组合使用且其中该4-1BB激动剂是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
2.权利要求1的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该HER-2靶向剂包含HER-2抗体,HER-2双特异性抗体和/或HER-2抗体药物缀合物。
3.权利要求1或2的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。
4.权利要求1至3任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂包含三个4-1BBL外域或其片段。
5.权利要求1至4任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段的分子且其中该4-1BBL外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
6.权利要求1至5任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合选自由成纤维细胞激活蛋白(FAP)和CEA组成的组的肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
7.权利要求1至6任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含IgG Fc域,具体是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域的抗原结合分子。
8.权利要求1至7任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含包含一处或多处降低对Fc受体的结合和/或效应器功能的氨基酸替代的Fc域的抗原结合分子。
9.权利要求1至8任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗原结合域的抗原结合分子。
10.权利要求1至9任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂，其中该能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域是能够特异性结合FAP的抗原结合域,该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含
(a)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQ IDNO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3,或
(b)重链可变区(VHFAP)和轻链可变区(VLFAP),该重链可变区(VHFAP)包含(i)包含SEQID NO:15的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLFAP)包含(iv)包含SEQ IDNO:18的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3。
11.权利要求1至10任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域是能够特异性结合FAP的抗原结合域,该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或其中该能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)。
12.权利要求1至11任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的抗原结合域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
13.权利要求1至12任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合FAP的Fab域,该能够特异性结合FAP的Fab域包含包含SEQID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP)或包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VHFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VLFAP),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
14.权利要求1至13任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的第一重链,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的第一轻链,包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的第二重链和包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的第二轻链的抗原结合分子。
15.权利要求1至3或7至11任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是抗FAP/抗4-1BB双特异性抗体。
16.权利要求1至8任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含三个4-1BBL外域或其片段和至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域的抗原结合分子。
17.权利要求1至8或17任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域是能够特异性结合CEA的抗原结合域,该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含(a)重链可变区(VHCEA)和轻链可变区(VLCEA),该重链可变区(VHCEA)包含(i)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-H3,该轻链可变区(VLCEA)包含(iv)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CDR-L3。
18.权利要求1至8或16或17任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域是能够特异性结合CEA的抗原结合域,该能够特异性结合CEA的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA)。
19.权利要求1至8或16至18任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的抗原结合域,和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该第一多肽包含通过肽接头彼此连接的两个4-1BBL外域或其片段且在于该第二多肽包含一个4-1BBL外域或其片段。
20.权利要求1至8或16至19任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是包含下述各项的抗原结合分子:
(a)至少一个能够特异性结合CEA的Fab域,该能够特异性结合CEA的Fab域包含包含SEQID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(VHCEA)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(VLCEA),和
(b)通过二硫键彼此连接的第一和第二多肽,
其中该抗原结合分子特征在于该第一多肽包含选自由SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32组成的组的氨基酸序列且在于该第二多肽包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列。
21.权利要求1至8或17或18任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂是抗CEA/抗4-1BB双特异性抗体。
22.权利要求1至21任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。
23.权利要求1至22任一项的供方法中使用的4-1BB(CD137)激动剂,其中该4-1BB激动剂与该HER-2靶向剂协同作用。
24.一种药学产品,其包含(A)包含作为活性组分的4-1BB(CD137)激动剂和药学可接受载剂的第一组合物,其中该4-1BB激动剂是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子；和(B)包含作为活性组分的HER-2靶向剂和药学可接受载剂的第二组合物,供组合,顺序或同时,治疗疾病,特别是癌症中使用。
25.一种药学组合物,其包含4-1BB激动剂和HER-2靶向剂,其中该4-1BB激动剂是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
26.权利要求25的药学组合物,其中该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。
27.权利要求25或26的药学组合物,供治疗癌症或延迟癌症进展,特别是治疗晚期和/或转移性实体瘤中使用。
28.4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合在制造用于治疗增殖性疾病,特别是癌症或延迟增殖性疾病,特别是癌症进展的药物中的用途,其中该4-1BB激动剂是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
29.权利要求28的4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合的用途,其中该HER-2靶向剂包含曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。
30.一种用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包含对该受试者施用有效量的4-1BB激动剂和有效量的HER-2靶向剂,其中该4-1BB激动剂是包含至少一个能够特异性结合肿瘤相关抗原的抗原结合域的抗原结合分子。
31.权利要求30的用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其中该HER-2靶向剂是曲妥珠单抗,帕妥珠单抗,和/或曲妥珠单抗美坦新。
32.权利要求30或31的用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其中该4-1BB激动剂包含三个4-1BBL外域或其片段。
33.权利要求30至32任一项的用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其中该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂在单一组合物中一起施用或在两种或更多种不同组合物中分开施用。
34.权利要求30至33任一项的用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其中该4-1BB激动剂和该HER-2靶向剂静脉内或皮下施用。
35.权利要求30至34任一项的用于在受试者中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其中该4-1BB激动剂与该HER-2靶向剂并行,在该HER-2靶向剂前,或在该HER-2靶向剂后施用。
36.权利要求1至23或25至27任一项的供使用的4-1BB(CD137)激动剂或药学组合物,权利要求28或29的4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合的用途,或权利要求30至35任一项的方法,其中该癌症是HER-2阳性癌症。
37.权利要求1至23或25至27任一项的供使用的4-1BB(CD137)激动剂或药学组合物,权利要求28或29的4-1BB激动剂和HER-2靶向剂的组合的用途,或权利要求30至35任一项的方法,其中该癌症是乳腺癌,卵巢癌,胃癌,胃的癌,食管癌,肺癌,子宫癌,唾液管癌,膀胱癌,子宫内膜癌,胰腺癌,结肠癌,前列腺癌,和/或头和颈癌。
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