CN114751989A - 包含三聚体tnf家族配体的抗原结合分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含三聚体TNF家族配体的抗原结合分子。本发明涉及TNF家族配体三聚体，其含有(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，(b)包含三个通过(c)肽接头(例如Fc域)彼此连接的TNF配体家族成员(优选OX40L或4‑1BBL)的胞外部分的多肽。还请求保护生成这些分子的方法和使用它们的方法。

Description

包含三聚体TNF家族配体的抗原结合分子
本申请是申请日为2016年3月29日、中国申请号为201680008222.5、发明名称为“包含三聚体TNF家族配体的抗原结合分子”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及新的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。本发明进一步涉及产生这些分子的方法和使用它们的方法。
发明背景
与TNF(肿瘤坏死因子)受体超家族分子相互作用的配体在免疫系统的组织和功能中具有关键作用。在调节正常功能如免疫应答，造血和形态发生的同时，TNF家族配体(也称为细胞因子)在肿瘤发生，移植排斥，脓毒性休克，病毒复制，骨吸收，类风湿性关节炎和糖尿病中起作用(Aggarwal，2003)。它们在免疫中的多样且重要的作用使得它们对于癌症免疫治疗剂的开发而言是感兴趣的(Bremer，2013)。TNF配体家族包括编码19个II型(即细胞内N末端和细胞外C末端)跨膜蛋白的18个基因，其特征在于构成“TNF同源域”(THD)的保守C末端域的存在。这个域负责受体结合，因此对TNF配体家族成员的生物活性至关重要。家族成员之间的序列同一性约为20％-30％(Bodmer，2002)。TNF配体家族的成员以自组装非共价三聚体的形式而发挥其生物学功能(Banner等人，1993)。因此，TNF家族配体形成能够结合并激活TNFR超家族的相应受体的三聚体。TNF配体家族的一些成员对T细胞具有共刺激效果，这意味着它们在初始T细胞活化之后维持T细胞应答(Watts，2005)。4-1BBL，OX40L，GITRL，CD70，CD30L和LIGHT属于这组共刺激TNF家族配体。
在数种共刺激分子中，肿瘤坏死因子(TNF)受体家族成员OX40(CD134)在效应和记忆T细胞的存活和稳态中发挥关键作用(Croft等人，2009)。OX40(CD134)调节针对感染，肿瘤和自身抗原的免疫应答，而且已经证明它在T细胞，NKT细胞和NK细胞以及嗜中性粒细胞的表面上的表达(Baumann等人，2004)且显示出响应多种刺激信号而严格可诱导地或强烈地上调。与T细胞受体触发组合，T细胞上由其天然配体或激动性抗体实现的OX40啮合引起PI3K和NFκB信号传导途径的协同激活(Song等人，2008)。继而，这对活化的T细胞导致增强的增殖，升高的细胞因子受体和细胞因子生成及更好的存活。
TNF受体超家族成员4-1BB(CD137)首先被鉴定为其表达经由T细胞活化诱导的分子(Kwon和Weissman，1989)。随后的研究证实4-1BB在T和B淋巴细胞(Snell等人，2011；Zhang等人，2010)，NK细胞(Lin等人，2008)，NKT细胞(Kim等人)，单核细胞(Kienzle和vonKempis，2000；Schwarz等人，1995)，嗜中性粒细胞(Heinisch等人，2000)，肥大细胞(Nishimoto等人，2005)和树突细胞以及非造血来源的细胞如内皮细胞和平滑肌细胞(Broll等人，2001；Olofsson等人，2008)中表达。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多可由各种刺激信号诱导和驱动，例如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发，以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号转导(Diehl等人，2002；von Kempis等人，1997；Zhang等人，2010)。
4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)的表达受到更多限制，在专职抗原呈递细胞(APC)如B细胞，树突细胞(DC)和巨噬细胞上观察到表达。4-1BBL的诱导表达对于包括αβ和γδT细胞亚群在内的T细胞以及内皮细胞是特征性的(Shao和Schwarz综述，2011)。
已知CD137信号转导刺激NK细胞的IFNγ分泌和增殖(Buechele等人，2012；Lin等人，2008；Melero等人，1998)以及促进DC活化(表现为其存活和分泌细胞因子的能力增加)，并上调共刺激分子(Choi等人，2009；Futagawa等人，2002；Wilcox等人，2002)。然而，CD137最好被表征为调节T细胞的CD4+和CD8+亚群的TCR诱导性活化的共刺激分子。与TCR触发联合，激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞的增殖，刺激淋巴因子分泌并降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(Snell等人综述，2011)。
与4-1BB抗体对体外T细胞的这些共刺激效应一致，在许多实验性肿瘤模型中将其施用于荷瘤小鼠导致有效的抗肿瘤作用(Melero等人，1997；Narazaki等人，2010)。然而，4-1BB通常仅在与其他免疫调节化合物(Curran等人，2011；Guo等人，2013；Morales-Kastresana等人，2013；Teng等人，2009年；Wei等人，2013)，化疗药物(Ju等人，2008；Kim等人，2009)，肿瘤特异性疫苗接种(Cuadros等人，2005；Lee等人，2011)，或放射治疗(Shi和Siemann，2006)联合给予时才显示其作为抗肿瘤剂的效力。体内消耗实验证明，CD8+ T细胞在4-1BB特异性抗体的抗肿瘤作用中起最关键的作用。然而，取决于肿瘤模型或包括抗4-1BB的联合疗法，已经报道了其他类型的细胞如DC，NK细胞或CD4+ T细胞的作用(Melero等人，1997；Murillo等人，2009；Narazaki等人，2010；Stagg等人，2011)。
除了4-1BB激动剂对不同淋巴细胞亚群的直接作用之外，通过4-1BB介导的细胞间粘附分子1(ICAM1)和肿瘤血管内皮上的血管细胞粘附分子1(VCAM1)的上调，4-1BB激动剂还可以诱导肿瘤中活化T细胞的浸润和保留(Palazon等人，2011)。
4-1BB触发还可以逆转由暴露于可溶性抗原诱导的T细胞无反应性的状态，其可能有助于破坏肿瘤微环境中或慢性感染期间的免疫耐受性(Wilcox等人，2004)。
似乎4-1BB激动性抗体在体内的免疫调节特性需要在抗体分子上野生型Fc部分的存在，从而提示Fc-受体结合为此类试剂的药理学活性所需的重要事件，所述试剂被描述为对TNFR超家族的其他的细胞凋亡诱导或免疫调节成员特异的激动性抗体(Li和Ravetch，2011；Teng等人，2009)。然而，在小鼠中，具有功能活性Fc域的4-1BB特异性激动性抗体的全身给药也诱导了与肝毒性相关的CD8+ T细胞扩增(Dubrot等人，2010)，在不存在功能性Fc受体的情况下，肝毒性减弱或显著减轻。在人类临床试验(ClinicalTrials.gov,NCT00309023)中，每三周施用一次的有Fc活性的4-1BB激动性抗体(BMS-663513)持续12周诱导了黑素瘤，卵巢癌或肾细胞癌患者的病情稳定。然而，在另一项试验(NCT00612664)中给予的相同抗体引起4级肝炎，导致试验终止(Simeone和Ascierto，2012)。
总的来说，可用的临床前和临床数据清楚地表明，有效的4-1BB激动剂的临床需求很高。然而，新一代候选药物不仅会有效地使4-1BB接合在造血细胞和内皮细胞的表面上，而且还能通过除了与Fc受体结合之外的机制来实现这种接合，以避免不可控制的副作用。后者可以通过对肿瘤特异性或肿瘤相关模块的优先结合和寡聚化来实现。
已经制造了由4-1BB配体的一个细胞外域和单链抗体片段(Mueller等人，2008；Hornig等人，2012；Kermer等人，2014)或与重链C末端(Zhang等，2007)融合的单个4-1BB配体组成的融合蛋白。EP 1 736 482A1涉及包含天然4-1BBL的整个胞外域和可交联肽域的重组4-1BBL多肽。WO 2010/010051公开了由彼此连接并与抗体模块融合的三个TNF配体胞外域组成的融合蛋白的产生。
然而，需要新的抗原结合分子，其将能够优选地与肿瘤特异性或肿瘤相关靶标结合的模块与能够形成共刺激的TNF家族配体三聚体的模块组合，并且拥有足够的药学上有用的稳定性。本发明的抗原结合分子包含这两者，并且因此可能能够不仅有效触发TNF受体，而且非常选择性地在期望部位触发TNF受体，由此减轻副作用。
发明概述
本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个(任选通过肽接头)彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在另一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽融合至该Fc域的两个亚基之一的N或C端氨基酸，任选经由肽接头。
在一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该TNF配体家族成员共刺激人T细胞活化。因此，该TNF配体家族成员是共刺激性TNF家族配体。具体地说，该共刺激性TNF家族配体选自4-1BBL，OX40L，GITRL，CD70，CD30L和LIGHT，更具体地说，该共刺激性TNF家族配体选自4-1BBL和OX40L。
在一个方面，该TNF配体家族成员是4-1BBL。
在一个另外的方面，该TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:1，SEQ IDNO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:101和SEQ IDNO:102的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:99的氨基酸序列。
在一个特定方面，TNF配体家族成员的胞外域或其片段包含选自SEQ ID NO:1，SEQID NO:2，SEQ ID NO:3，和SEQ ID NO:4的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在又一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，和
(b)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。更具体地说，该多肽包含SEQID NO:5的氨基酸序列。
在另一个方面，该TNF配体家族成员是OX40L。
在一个特定方面，该TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:6和SEQ IDNO:7的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在又一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，和
(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在一个方面，本发明涉及如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在C端氨基酸处融合至该Fc域的亚基之一的N端氨基酸。具体地说，提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，
其中该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在C端氨基酸处融合至该Fc域中的CH2域的N端氨基酸。
在另一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是如下的，其中该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在N端氨基酸处融合至该Fc域的亚基之一的C端氨基酸，例如该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在N端氨基酸处融合至该Fc域中的CH3域的C端氨基酸。
在另一个方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，
其中该能够特异性结合靶细胞抗原的模块没有融合至该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽。
在一个另外的方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块选自抗体，抗体片段和支架抗原结合蛋白。
在一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是抗体。
在另一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是抗体片段。具体地说，抗体片段选自Fab分子，交换Fab分子，单链Fab分子，Fv分子，scFv分子，单域抗体，和VH。
在又一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是支架抗原结合蛋白。
如此，在又一个方面，本发明涉及如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块选自抗体片段，Fab分子，交换Fab分子，单链Fab分子，Fv分子，scFv分子，单域抗体，VH和支架抗原结合蛋白。
在一个特定方面，本发明与如上定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子有关，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。
在另一个方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)，癌胚抗原(CEA)，黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，表皮生长因子受体(EGFR)，CD19，CD20和CD33。
在一个特定方面，靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。在一个方面，本发明提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合FAP的模块包含VH域和VL域，
(a)该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3；或
(b)该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:105的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个方面，该能够特异性结合FAP的模块包含VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3。在另一个特定的方面，该能够特异性结合FAP的模块包含VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR-L3。
在又一个方面，能够特异性结合FAP的模块包含包括SEQ ID NO:16的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列的可变轻链，或其中能够特异性结合FAP的模块包含包括SEQ ID NO:110的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:111的氨基酸序列的可变轻链。
在另一个方面，靶细胞抗原是CEA。在一个方面，本发明提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合CEA的模块包含VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR-L3。具体地说，能够特异性结合CEA的模块包含包括SEQ ID NO:118的氨基酸序列的可变重链和包括SEQ ID NO:119的氨基酸序列的可变轻链。
在还有另一个方面，该靶细胞抗原是CD19。在一个方面，本发明提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合CD9的模块包含VH域和VL域，
(a)该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:121的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR-L3；或
(b)该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:129的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-L3。具体地说，该能够特异性结合CD19的模块包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的可变轻链，或者其中该能够特异性结合FAP的模块包含包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的可变轻链。
在又一个方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域是IgG，特别是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。具体地说，该由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域是IgG1 Fc域。
在另一个方面，本发明涉及如前文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中Fc域包含一个或多个降低与Fc受体尤其是Fcγ受体结合的氨基酸替代。
具体地说，Fc域包含在位置234和235(EU编号方式)和/或329(EU编号方式)处的氨基酸替代。更具体地说，提供了根据本发明的含有三聚体TNF家族配体的抗原结合分子，其包含具有IgG重链中的氨基酸替代L234A，L235A和P329G(EU编号方式)的Fc域。
在一个特定方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该Fc域是IgG1 Fc域且包含在IgG重链的位置234和235(EU编号方式)和329(EU编号方式)处的氨基酸替代。
在另一个方面，提供了单价的如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块。
具体地说，本发明的包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进一步包含(a)能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，其中Fab重链在C端处融合至该Fc域中的CH2域的N端。
而且，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)重链和轻链，二者构成能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，和
(b)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)重链和轻链，二者构成能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，和
(b)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在又一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域，
(ii)轻链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VL域，和
(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH域，(ii)轻链，其包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL域或包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个方面，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH域，(ii)轻链，其包含包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在又一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH域，(ii)轻链，其包含包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的VL域或包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了二价的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够特异性结合靶细胞抗原的模块。
在一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域，
(ii)两条轻链，各自包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VL域，和
(iii)第二重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域和SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH域，(ii)两条轻链，各自包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL域或包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH域和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH域，(ii)两条轻链，各自包含包含SEQ IDNO:119的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH域和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在还有另一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH域，(ii)两条轻链，其包含包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的VL域或包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH域和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和
(iii)多肽，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
更加具体地说，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)重链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，
(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和
(iii)多肽，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
更加具体地说，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)重链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，
(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
根据本发明的另一个方面，提供了编码如前文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸。本发明进一步提供了包含本发明的分离的多核苷酸的载体，尤其是表达载体，和包含本发明的分离的多核苷酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，尤其是哺乳动物细胞。
在另一个方面，提供了产生本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法，该方法包括以下步骤：(i)在适合于表达该抗原结合分子的条件下培养本发明的宿主细胞，以及(ii)回收抗原结合分子。本发明还涵盖通过本发明的方法产生的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
本发明进一步提供了包含本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明还涵盖用作药剂的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，或本发明的药物组合物。在一个方面，提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，或本发明的药物组合物。在具体的实施方案中，提供了用于治疗癌症的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，或本发明的药物组合物。
还提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂尤其是制造用于治疗癌症的药剂中的用途，以及治疗个体疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的药学上可接受的形式的包含本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的组合物。在具体的实施方案中，该疾病是癌症。在任何上述实施方案中，个体优选为哺乳动物，尤其是人。
附图简述
图1A和1B显示了包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的三个胞外结构域或其片段的多肽。图(1A)显示了包含通过肽接头彼此连接的4-1BBL的三个胞外结构域的多肽，图(1B)显示了包含通过肽接头彼此连接的OX40L的三个胞外结构域的多肽。
图2A和2B示意性地示出了本发明的单价的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的变体(2A)和(2B)。三个TNF配体以具有白点的灰色区域表示。具有黑点的白色区域表示Fc部分，粗黑点代表节入穴(knob-into-hole)修饰。
本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的代表性实例是如图3A所示的FAP靶向的三聚体4-1BB配体Fc(kih)P329G LALA融合抗原结合分子。其制备描述于实施例1.1和1.3中。图3B显示了包含DP47 Fab分子和实施例2中制备的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)P329G LALA融合抗原结合分子的“非靶向”变体(对照1)。图3C是实施例4中制备的单体4-1BB Fc(kih)构建体的图。
本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的另一个实例是如图4A所示的FAP靶向的三聚体OX40配体Fc(kih)P329G LALA融合抗原结合分子。其制备描述于实施例6中。图4B显示了包含DP47 Fab分子和实施例7中制备的单链三聚体OX40配体Fc(kih)P329GLALA融合分子的“非靶向”变体。图4C是实施例8中制备的单体OX40 Fc(kih)构建体的图。
图5显示了通过表面等离子体共振评定的FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子(化合物S1)与重组4-1BB Fc(kih)受体的结合。在图5A中，显示了测定的设置，4-1BB Fc(kih)被固定在SA芯片上。图5B显示了与人4-1BB Fc(kih)的结合，图5C为与食蟹猴4-1BB Fc(kih)的结合，图5D为与鼠4-1BB Fc(kih)的结合。
含有DP47的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(对照1)与重组4-1BB Fc kih受体的结合如图6所示。4-1BB Fc(kih)被固定在SA芯片上。图6A显示了与人4-1BB Fc(kih)的结合，图6B为与食蟹猴4-1BB Fc(kih)的结合，图6C为与鼠4-1BB Fc(kih)的结合。
图7展示了重组人4-1BB与FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1)的结合。在图7A中示出了亲合力测量的设置。图7B和7C显示了人4-1BBavi-His标签与FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(FAP靶向的单链三聚体4-1BBL)的结合，图7D和7E显示人4-1BB avi-His标签与含有DP47的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(含有DP47的单链三聚体4-1BBL分子)的结合。
图8显示了通过表面等离子体共振评定的FAP靶向的含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S10)与重组OX40 Fc(kih)受体的结合。在图8A中，显示了测定的设置，OX40 Fc(kih)被固定在SA芯片上。图8B显示了与人OX40 Fc(kih)的结合，图8C为与食蟹猴OX40 Fc(kih)的结合，图8D为与鼠OX40 Fc(kih)的结合。
在图9中，证明了含有DP47的含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合分子(对照3)与重组OX40 Fc kih受体的结合。OX40 Fc(kih)被固定在SA芯片上。图9A显示了与人OX40 Fc(kih)的结合，图9B为与食蟹猴OX40 Fc(kih)的结合，图9C为与鼠OX40 Fc(kih)的结合。
图10显示了重组人OX40与FAP靶向的含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S10)的结合。在图10A中示出了亲合力测量的设置。在图10B中，显示了人OX40 avi-His标签与FAP靶向的含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(FAP靶向的单链OX40配体)的结合，图10C展示了人4-1BB avi-His标签与含有DP47的含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合分子(含有DP47的单链三聚体OX40L)的结合。
4-1BB和OX40在静息(幼稚)的人PBMC上不表达(图11A、11C、11E和11G，图12A和12C)。人PBMC激活后，4-1BB和OX40在CD4+和CD8+ T细胞上被上调，而人CD8+ T细胞显示的4-1BB上调高10倍(图11B、11F、11K和11M以及12B)，但是比CD4+ T细胞上的OX40上调低4倍(图11D、11H、11J和11L以及12D)。如所示，FAP靶向的单链三聚体4-1BBL或OX40L Fc(kih)融合抗原结合分子(实心圆)和含有DP47的(“非靶向的”)单链三聚体4-1BBL和OX40L(空心圆，虚线)显示出相似的与活化CD4+和CD8+ T细胞的结合，但不与幼稚的人T细胞结合。因此，与FAP结合或DP47结合无关，单链三聚体4-1BBL和单链三聚体OX40L两者都显示出相似的与表达人4-1BB或OX40的细胞的结合。在没有表达表达人4-1BB或OX40的细胞的情况下，未能观察到结合(静息的幼稚细胞)。结合被显示为用作第二检测抗体的红色大型藻类藻红蛋白(R-PE)或异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab’)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。x轴显示含FAP或DP47的单链三聚体4-1BBL或OX40L Fc(kih)融合分子的浓度。
图11A至11D涉及FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1，实心圆)或含有DP47的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子(对照1，空心圆)与静息(幼稚)或活化的人PMBC的结合。具体地说，分别在上部两个图中显示与静息(幼稚)或活化的人CD8+ T细胞的结合，在下部两个图中显示与静止(幼稚)或活化的人CD4+ T细胞的结合。
图11E至11H显示了单价靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子与静息和活化的人T细胞的结合。4-1BB在从健康供体的血液分离的静息(幼稚)CD4或CD8 T细胞上不表达。激活后，4-1BB在CD4+(见右下图)和CD8+(见右上图)T细胞上被上调，而CD8+T细胞显示的4-1BB表达比CD4+ T细胞高5-10倍(取决于供体)。如所示，所有单价靶向的单链三聚体4-1BBL Fc(kih)融合分子都与4-1BB+人T细胞的结合相似，与它们的靶向无关。在y轴上显示了R-PE缀合的抗人IgG Fcγ片段特异性F(ab')2山羊IgG片段的平均荧光强度(MFI)。在x轴上指示了不同的靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1、S3和S5)的测试浓度。通过减去空白对照的MFI将这些值进行基线校正。
在图11J至11M中，显示了单价与二价靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子与活化人T细胞的结合。激活后，4-1BB在CD4+(左手侧)和CD8+(右手侧)T细胞上被上调。如所示，所有单价与二价靶向的单链三聚体4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子都与4-1BB+人T细胞的结合相似，与它们的靶向无关。在y轴上显示了R-PE缀合的抗人IgG Fcγ片段特异性F(ab')2山羊IgG片段的平均荧光强度(MFI)。在x轴上指示了不同的靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1、S3、S2和S4)的测试浓度。通过减去空白对照的MFI将这些值进行基线校正。
图12A至12D显示了FAP靶向的含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S10，实心圆)或含有DP47的含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合分子(DP47单链OX40L三聚体，对照3，空心圆)与静息(幼稚)或活化的人PMBC的结合。具体地说，分别在图12A和12B中显示与静息(幼稚)或活化的人CD8+ T细胞的结合，分别在图12C和12D中显示与静止(幼稚)或活化的人CD4+ T细胞的结合。DP47人IgG1 P329G LALA的结合以实心菱形(阴性对照)表示。
图13显示了含有单链TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(分别为化合物S1和S10)与转基因修饰的小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3-huFAP克隆39(图13A)或与表达成纤维细胞激活蛋白(FAP)的人WM266-4细胞系(图13B)的结合。这些细胞表达高水平的人成纤维细胞激活蛋白(huFAP)。结合被显示为用作第二检测抗体的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的荧光强度中位值(MFI)。通过流式细胞术测定MFI。x轴显示FAP靶向的或DP47靶向的(“非靶向的”)的单链三聚体4-1BBL或OX40L抗原结合分子的浓度。在图13A中显示，仅FAP靶向的单链三聚体4-1BBL分子(化合物S1，实心圆)而不是含有DP47的单链三聚体4-1BBL抗原结合分子(空心圆，虚线)与NIH/3T3-huFAP克隆39细胞结合，图13B显示仅FAP靶向的单链三聚体OX40L抗原结合分子(化合物S10，实心圆)而不是含有DP47的单链三聚体OX40抗原结合分子(空心圆，虚线)与WM266-4细胞结合。作为阴性对照，由实心菱形表示的DP47人IgG1 P329G LALA也没有结合。
在图13C和13D中，显示了单价与二价FAP(4B9或28H1)靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子与表达FAP的肿瘤细胞的结合。如所示，FAP(4B9)靶向的分子显示最强的与FAP的结合，具有更低的EC50值。使用强FAP(4B9)结合剂，我们看到在单价与二价靶向的单链三聚体4-1BB配体(kih)融合抗原分子(分别为化合物S3和S2)之间的MFI或EC50仅有非常小的差异。对于较弱的FAP结合剂28H1(化合物S1)，这是不同的。这里，二价结合(显示为二价结合的FAP(28H1)靶向的huIgG1 P329G LALA)产生较低的MFI。DP47非靶向的分子不与FAP+肿瘤细胞结合，因此是真正非靶向的。在y轴上显示了R-PE缀合的抗人IgGFcγ片段特异性F(ab')2山羊IgG片段的平均荧光强度(MFI)。在x轴上指示了不同的靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的测试浓度。
图13E显示了单价与二价CEA靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子与表达CEA的肿瘤细胞系的结合。二价的CEA靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S4)的结合产生比单价的CEA靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S5)的结合更低的MFI。这可以通过在同一时间占据肿瘤细胞表面上的两个CEA分子来解释。DP47非靶向的分子(分别为对照1和2)不与CEA+MKN45肿瘤细胞结合，因此是真正非靶向的。在y轴上显示了PE缀合的抗人IgG Fcγ片段特异性F(ab')2山羊IgG片段的平均荧光强度(MFI)。在x轴上指示了不同的靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的测试浓度。
在图14A和14B中，显示了FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1，实心圆)或含有DP47的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(对照1，空心圆)不与表达小鼠4-1BB的活化的小鼠脾细胞结合。使用抗小鼠CD137特异性人IgG1 P329G LALA抗体(克隆Lob12.3)作为阳性对照(三角形)。通过绘制用作第二检测抗体的R-PE标记的抗人IgG Fcγ特异性山羊IgG F(ab`)2片段的MFI来表征结合，所述MFI是相对于测试的初级4-1BBL三聚体抗原结合分子的浓度nM而言的。通过流式细胞术测量MFI，并通过减去空白对照的MFI来校正基线。
在图15中的方案显示了在实施例11.1.2中描述的使用报告细胞系的NFκB活性测定的一般原理。抗hu IgG1 Fcγ特异性抗体与含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的比率为1到4。
在图16中，显示了通过二级抗体交联的FAP靶向的单链三聚体4-1BBL抗原结合分子(化合物S1，实心圆)或二级抗体交联的含有DP47的单链三聚体4-1BBL分子(对照1，空心圆，虚线)的报告细胞系中的NFκB信号通路的激活。在1到4比率的指定浓度的含有单链4-1BBL三聚体的抗原结合分子与交联的二级多克隆抗huIgG1 Fcγ特异性山羊IgG F(ab)2片段的存在下，将报告细胞培养6小时。如实施例11.1.1中所述评估萤光素酶活性。通过在0.5秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试的单链人4-1BBL三聚体抗原结合分子的nM浓度的印迹来表征活性。URL的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。
在图17中的方案显示了在实施例11.1.3中描述的使用HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc克隆26作为报告细胞系的NFκB介导的萤光素酶活性测定的一般原理。表达FAP的肿瘤细胞与表达人4-1BB的报告细胞的使用比率为5比1。
图18A到18D显示了通过表达FAP的肿瘤细胞系交联的FAP靶向的单链三聚体4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1，实心圆)的报告细胞中的NFκB信号通路的激活。未交联的含有DP47的单链三聚体4-1BBL分子的数据显示为阴性对照(对照1，空心圆，虚线)。在逐步滴加的FAP靶向或含有DP47的单链三聚体4-1BBL分子和交联FAP+肿瘤细胞系的存在下，将报告细胞培养6小时。报告细胞与表达FAP的肿瘤细胞的比率为1:5。通过在0.5秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试的单链三聚体4-1BBL抗原结合分子的nM浓度的印迹来表征NFκB介导的萤光素酶活性。URL的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。通过减去空白对照的URL将这些值进行基线校正。图18A显示了以MV3细胞系作为靶细胞的活化，在图18B中使用细胞系NIH/3T3-人FAP克隆39作为靶细胞。图18C显示了以WM-266-4细胞系作为靶细胞的活化，图18D显示了如果不存在FAP+靶向细胞的测量数据。
图19显示了经由通过单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的FAP靶向的交联介导的4-1BB活化的NK-κB激活。显示了通过表达FAP的肿瘤细胞系交联的FAP靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合分子的HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc克隆26报告细胞中的NFκB信号通路的激活。DP47非靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合分子不诱导NK-κB激活(对照1和2)。单价的FAP靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1和S3)比二价的FAP靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合分子(化合物S2)诱导更强的NFκB激活。在逐步滴加的FAP靶向的或DP47非靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子和交联FAP+肿瘤细胞系的存在下，将HeLa-hu4-1BB-NF-κB-luc报告细胞培养6小时。报告细胞与表达FAP的肿瘤细胞的比率为1:5。通过在0.5秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试的单链三聚体4-1BB配体的nM浓度的印迹来表征NFκB介导的萤光素酶活性。URL的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。通过减去空白对照的URL将这些值进行基线校正。图19A显示了以MV3细胞系作为靶细胞的活化，图19B显示了以WM-266-4细胞系作为靶细胞的活化。图19C显示了如果没有FAP+靶向细胞存在的测量数据。
在图20中，显示了通过表达CEA的肿瘤细胞系交联的CEA(sm9b)靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S4和S5)的HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc克隆26报告细胞中的NFκB信号通路的激活。DP47非靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合分子不诱导NK-κB激活(对照1和2)。单价的CEA(sm9b)靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原分子(化合物S5)比二价的CEA(sm9b)靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S4)诱导更强的N-κB激活。在逐步滴加的CEA(sm9b)靶向的或DP47非靶向的单链三聚体4-1BB配体Fc(kih)融合分子和交联CEA+MKN45肿瘤细胞系的存在下，将HeLa-hu4-1BB-NF-κB-luc报告细胞培养6小时。报告细胞与表达CEA的MKN45肿瘤细胞的比率为1:5。通过在0.5秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试的单链三聚体4-1BB配体的nM浓度的印迹来表征NFκB介导的萤光素酶活性。URL的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。通过减去空白对照的URL将这些值进行基线校正。图20A显示了以MKN45细胞系作为靶细胞的活化，图20B显示了如果不存在CEA+靶向细胞的测量数据。
通过表达FAP的WM266-4肿瘤细胞系交联的FAP靶向的单链三聚体OX40L分子(实心圆，化合物S10)的HeLa-huOX40-NFκB-luc1报告细胞中的NFκB信号传导通路的激活如图21B中所示。未交联的含有DP47的单链三聚体OX40L分子(空心圆，虚线，对照3)显示为阴性对照。在逐步滴加的FAP靶向或含有DP47的单链三聚体OX40L分子和交联FAP+肿瘤细胞系的存在下，将报告细胞培养6小时。报告细胞与表达FAP的肿瘤细胞的比率为1:2.5。通过在0.5秒内测量的释放光的单位数(URL)相对于测试的单链三聚体OX40L抗原结合分子的nM浓度的印迹来表征NFκB介导的萤光素酶活性。URL的发射是由于萤光素酶介导的萤光素氧化为氧化萤光素的缘故。通过减去空白对照的URL将这些值进行基线校正。如图21A所示，如果在没有FAP+靶向细胞存在并且因此没有发生交联的情况下，FAP靶向的单链三聚体OX40L分子(化合物S10，实心圆)和含有DP47的单链三聚体OX40L抗原结合分子(对照3)已经诱导了一定量的NFκB激活。
图22中的方案展示了实施例10.2.2中描述的抗原特异性CD8+ T细胞活化测定的一般原理。
图23和24显示了单链三聚体4-1BBL抗原结合分子对NLV特异性CD8+ T细胞的CD137表达的影响(图23)以及对NLV特异性CD8+ T细胞的IFNγ分泌的影响(图24)。NLV特异性CD8+ T细胞的延长的IFNγ分泌和CD137表达严格依赖于通过NLV-HLA-A2复合物(信号1，图23A和23B和图24A和24B)的识别以及借助于FAP靶向的单链三聚体4-1BBL抗原结合分子(信号2，图23C至23F和图24C至24F)的4-1BB触发的T细胞同时激活。实心圆：FAP靶向的单链三聚体4-1BBL分子(化合物S1)；空心圆：含有DP47的单链三聚体4-1BBL分子(对照3)。4-1BB上调的效应显示在图23A到23F中，而CD8+ T细胞的INFγ表达的效应呈现在图24A到24F中。一直显示总CD8+ T细胞群中的荧光强度中位值(左图)和阳性细胞的频率百分比(右图)。
在图25和26中，显示了NLV特异性CD8+ T细胞的延长的IFNγ分泌和CD137表达严格依赖于通过NLV-HLA-A2复合物(信号1，图25A和25B和图26A和26B和)的识别以及借助于FAP靶向的单链三聚体4-1BB配体(信号2，图25C至25F和图26C至26F)的4-1BB触发的T细胞同时激活。4-1BB上调的效应显示在图25A到25F中，而INFγ表达的效应呈现在图26A到26F中。一直显示总CD8+ T细胞群中的荧光强度中位值(左图)和阳性细胞的频率百分比(右图)，两者是相对于单价或二价的FAP(28H1或4B9)靶向的或DP47非靶向的单链三聚体4-1BB配体(kih)融合抗原结合分子的使用浓度而言的。
图27A至27F表明，在用抗人CD3抗体次最佳刺激的人CD4+(左侧)和CD8+ T细胞(右侧)中，用含有DP47的三聚体单链OX40L分子(空心圆，虚线，对照3)共刺激仅略微促进增殖和诱导增强的活化表型(CD25表达)。通过当前的NIH/3T3-huFAP克隆39细胞，FAP靶向的三聚体单链Ox40L分子的超交联强烈地增加了这种效应(实心圆，化合物S10)。显示了事件计数、增殖(CFSE-低)细胞的百分比或在有活力的CD4+和CD8+ T细胞上的CD25-PerCPCy5.5的MFI。从测试化合物样品中减去仅含有抗人CD3(克隆V9，huIgG1)、静息的人PBMC和NIH/3T3-huFAP克隆39的空白样品的基线值。因此，这里显示了OX40L共刺激的增强作用，但不是次最佳抗CD3刺激本身的作用。
图28A显示了包含通过肽接头彼此连接的4-1BBL的三个胞外结构域的多肽。图28B显示了包含图28A的多肽的本发明的含有二价TNF配体三聚体的抗原结合分子的代表性实例。三个TNF配体以底部的灰色区域表示。具有黑点的白色区域表示Fc部分，粗黑点代表节入穴(knob-into-hole)修饰。
发明详述
定义
除非另外定义，本文中使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中通常使用的相同的含义。出于解释本说明书的目的，以下定义将适用，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
如本文中使用的，术语“抗原结合分子”在其最广义上指的是特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的实例是抗体，抗体片段和支架抗原结合蛋白。
如本文中使用的，术语“能够特异性结合靶细胞抗原的模块”是指与抗原决定簇特异性结合的多肽分子。在一个方面，抗原结合模块能够通过其靶细胞抗原激活信号转导。在一个特定方面，抗原结合模块能够将与其连接的实体(例如，TNF家族配体三聚体)引导至靶位点，例如引导至具有抗原决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质。能够特异性结合靶细胞抗原的模块包括本文中进一步定义的抗体及其片段。另外，能够特异性结合靶细胞抗原的模块包括本文中进一步定义的支架抗原结合蛋白，例如，基于设计的重复蛋白或设计的重复域的结合域(参见例如WO 2002/020565)。
关于抗体或其片段，术语“能够特异性结合靶细胞抗原的模块”是指分子的包含与抗原的部分或全部特异性结合并与其互补的区域的部分。可以例如由一个或多个抗体可变域(也称为抗体可变区)提供能够进行特异性抗原结合的模块。具体地说，能够进行特异性抗原结合的模块包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
在本文中以最广义的方式使用术语“抗体”，其涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，单特异性和多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体的群获得的抗体，即包含该群的单独的抗体是同一的和/或结合同一表位，除了可能的变体抗体之外，例如，含有天然存在的突变的或在单克隆抗体制剂的产生过程中产生的抗体，这样变体通常以少量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体，所述位点各自与相同抗原的相同表位结合。术语“双特异性”意指抗原结合分子能够特异性地与至少两个不同的抗原决定簇结合。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，每个抗原结合位点对于不同的抗原决定簇是特异性的。在某些实施方案中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两个抗原决定簇，尤其是在两个不同细胞上表达的两个抗原决定簇。
在本申请中使用的术语“价”意味着在抗原结合分子中特定数目的结合位点的存在。正因为因此，术语“二价”，“四价”和“六价”分别意味着在抗原结合分子中分别存在两个结合位点，四个结合位点和六个结合位点。
术语“全长抗体”，“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用，指的是具有与天然抗体结构基本相似的结构的抗体。“天然抗体”指的是具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键结合的两条轻链和两条重链组成。从N末端至C末端，每个重链具有可变区(VH)，也称为可变重域或重链可变域，其后是三个恒定域(CH1，CH2，和CH3)，也称为重链恒定区。类似地，从N末端至C末端，每个轻链具有可变区(VL)，也称为可变轻域或轻链可变域，其后是轻链恒定域(CL)，也称为轻链恒定区。抗体重链可被指定为五种类型中的一种，称为α(IgA)，δ(IgD)，ε(IgE)，γ(IgG)，或μ(IgM)，其中一些可以进一步分为亚类，例如γ1(IgG1)，γ2(IgG2)，γ3(IgG3)，γ4(IgG4)，α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，抗体轻链可被指定为两种类型之一，称为卡帕(κ)和兰布达(λ)。
“抗体片段”指的是除了完整抗体之外的分子，其包含与完整抗体所结合的抗原结合的所述完整抗体的一部分。抗体片段的实例包括但不限于Fv，Fab，Fab'，Fab’-SH，F(ab')2；双抗体，三抗体，四抗体，交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和单域抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun，引自The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利Nos.5,571,894和5,587,458。关于包含补救受体结合表位残基并具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab')2片段的讨论，参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的可以是二价或双特异性的抗体片段，参见，例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger等人，ProcNatl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。Hudson等人在Nat Med 9,129-134(2003)中也描述了三抗体和四抗体。单域抗体是包含抗体的全部或模块重链可变域或全部或模块轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术制造抗体片段，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生，如本文中所述。
完整抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个完全相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，其各自含有重链和轻链可变区以及轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。因此，如本文中使用的，术语“Fab片段”是指包含包括轻链的VL域和恒定域(CL)的轻链片段，和重链的VH域和第一恒定域(CH1)的抗体片段。Fab'片段因在重链CHl域的羧基末端增加了少数残基而与Fab片段有所不同，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是其中恒定域的半胱氨酸残基具有游离巯基的Fab'片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab')2片段。
术语“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”是指其中重链和轻链的可变区或恒定区之间被交换的Fab片段。交换Fab分子的两种不同链组成是可能的并且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，Fab重链和轻链的可变区被交换，即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链，以及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链。这种交换Fab分子也被称为CrossFab(VLVH)。另一方面，当Fab重链和轻链的恒定区被交换时，交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的肽链，以及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)组成的肽链。这种交换Fab分子也被称为CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH)，抗体恒定域1(CH1)，抗体轻链可变域(VL)，抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头在N末端至C末端方向具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是具有至少30个氨基酸，优选32至50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段经由CL域和CH1域之间的天然二硫键而被稳定化。另外，通过插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号在可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键，这些单链Fab分子可以进一步被稳定化。
“交换单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变域(VH)，抗体恒定域1(CH1)，抗体轻链可变域(VL)，抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头在N末端至C末端方向具有以下顺序之一：a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成与抗原特异性结合的抗原结合位点，并且其中所述接头是具有至少30个氨基酸的多肽。另外，通过插入半胱氨酸残基(例如根据Kabat编号在可变轻链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键，这些x-scFab分子可以进一步被稳定化。
“单链可变片段(scFv)”是用具有10个至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的融合蛋白。该接头通常富含有关柔性的甘氨酸，以及有关溶解性的丝氨酸或苏氨酸，并且可将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头，但该蛋白质保留了原始抗体的特异性。scFv抗体例如描述于Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)。另外，抗体片段包含具有VH域特征或VL域特征的单链多肽，所述VH域特征即能够与VL域一起组装到功能性抗原结合位点上，所述VL域特征即能够与VH域一起组装到功能性抗原结合位点上，从而提供全长抗体的抗原结合特性。
“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的，例如，纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)已被用作抗原结合域的替代支架，参见例如Gebauer和Skerra,Engineeredprotein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin ChemBiol 13:245-255(2009)和Stumpp等人，Darpins:A new generation of proteintherapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面，支架抗原结合蛋白选自CTLA-4(Evibody)，脂质运载蛋白(Anticalin)，蛋白A衍生的分子，如蛋白A的Z域(Affibody)，A域(Avimer/Maxibody)，血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)，抗体轻链或重链的可变域(单域抗体，sdAb)，抗体重链的可变域(纳米抗体，aVH)，VNAR片段，纤连蛋白(AdNectin)，C型凝集素域(Tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变域(VNAR片段)，人γ-晶体蛋白或泛素(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型域，诸如来自knottin家族的蛋白质的微体，肽适体和纤连蛋白(adnectin)。
CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是主要在CD4+ T细胞上表达的CD28家族受体。其细胞外域具有类似可变域的Ig折叠。可用异源序列取代对应于抗体的CDR的环，以赋予不同的结合特性。经过工程化而具有不同结合特异性的CTLA-4分子也被称为Evibodies(例如，US7166697B1)。Evibodies的大小与抗体(例如，域抗体)的分离可变区大约相同。进一步的详情参见Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。
脂质运载蛋白为细胞外蛋白质家族，其转运小的疏水性分子，如类固醇，胆红素，类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构，在锥形结构的开口端具有可被工程化以结合不同的靶抗原的多个环。Anticalin的大小在160-180个氨基酸之间，并且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)，US7250297B1和US20070224633。
亲和体是衍生自金黄色葡萄球菌蛋白A的支架，其可被工程化以结合抗原。该域由具有约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.2004,17,455-462和EP1641818A1。
Avimers是衍生自A域支架家族的多域蛋白。具有约35个氨基酸的天然域采用定义的二硫键结构。多样性是通过改变A域家族所显示的自然变异产生的。进一步的详情参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion onInvestigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。
转铁蛋白是单体的血清转运糖蛋白。可以通过在允许的表面环中插入肽序列将转铁蛋白工程化以结合不同的靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括Trans-body。进一步的详情参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)衍生自锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白与细胞骨架附着的蛋白质家族。单个锚蛋白重复是由两个α-螺旋和β-转角组成的33个残基的基序。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基，它们可以被工程化以结合不同的靶抗原。通过增加模块的数量(亲和力成熟法)可以增加它们的结合界面。进一步的详情参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)以及US20040132028A1。
单域抗体是由单个单体的可变抗体域组成的抗体片段。第一个单域来源于来自骆驼科动物(camelids)抗体重链的可变域(纳米抗体或VHH片段)。此外，术语单域抗体包括自主的人重链可变域(aVH)或来源于鲨鱼的VNAR片段。
纤连蛋白是一种可以被工程化为与抗原结合的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10个域的天然氨基酸序列的主链组成。可以将β-夹心一端的三个环工程化，使Adnectin能够特异性地识别感兴趣的治疗靶标。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)，US20080139791，WO2005056764和US6818418B1。
肽适体是由恒定骨架蛋白组成的组合识别分子，所述骨架蛋白通常是含有在活性位点插入的约束可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步的详情参见ExpertOpin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。
微体源自长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的实例包括KalataBI以及芋螺毒素和半胱氨酸结肽(knottin)。微蛋白具有可以工程化以包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的整体折叠的环。工程化的半胱氨酸结肽域的更多详情参见WO2008098796。
就参考分子而言“结合相同表位的抗原结合分子”是指在竞争测定中阻断参考分子与其抗原的结合的50％或以上的抗原结合分子，相反地，参考分子在竞争测定中阻断抗原结合分子与其抗原的结合的50％或以上。
术语“抗原结合域”是指抗原结合分子的模块，其包含与抗原的部分或全部特异性地结合且互补的区域。在大抗原的情况下，抗原结合分子可能仅与该抗原的特定模块结合，该模块称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个可变域(也称为可变区)提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文中使用的，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义，并且是指在抗原结合模块与其结合而形成抗原结合模块-抗原复合物的多肽大分子上的位点(例如氨基酸的连续段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构型)。有用的抗原决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上，病毒感染细胞的表面上，其他病变的细胞表面上，免疫细胞表面上发现，在血清中和/或细胞外基质(ECM)中游离。用作本文中的抗原的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在一个具体实施方案中，抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况下，该术语包括“全长”未加工的蛋白质以及通过在细胞中加工产生的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。
“特异性结合”意指结合对于抗原而言是选择性的，并且可以与不需要的或非特异性的相互作用区别开。抗原结合分子与特异性抗原结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，例如，表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))和传统结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施方案中，抗原结合分子与不相关蛋白的结合程度小于该抗原结合分子与抗原结合的约10％，正如通过例如SPR所测量的。在某些实施方案中，与抗原结合的分子具有≤1μM，≤100nM，≤10nM，≤1nM，≤0.1nM，≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，如本文中使用的，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伴侣Y的亲和力通常可以通过解离常数(Kd)来表示，亲和力是解离速率常数与结合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等同亲和力可以包含不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。可以通过本领域已知的常用方法测量亲和力，包括本文所述的那些方法。用于测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
如本文中使用的“靶细胞抗原”是指存在于靶细胞表面上的抗原决定簇，所述靶细胞例如肿瘤中的细胞，如癌细胞或肿瘤基质细胞。在某些实施方案中，靶细胞抗原是肿瘤细胞表面上的抗原。在一个实施方案中，靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)，癌胚抗原(CEA)，黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，表皮生长因子受体(EGFR)，CD19，CD20和CD33。具体地说，靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
术语“成纤维细胞激活蛋白(FAP)”，也称为脯氨酰内肽酶FAP或分离酶(Seprase)(EC 3.4.21)，是指任何脊椎动物来源的任何天然FAP，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)，非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。该术语包括“全长”未加工的FAP以及通过在细胞中加工产生的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然存在的变体，例如，剪接变体或等位基因变体。在一个实施方案中，本发明的抗原结合分子能够特异性结合人，小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列显示在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(版本149，SEQ ID NO:21)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中。人FAP的细胞外域(ECD)从氨基酸位置26延伸至760。带His标签的人FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列分别显示在SEQ ID NO:22和23中。小鼠FAP的氨基酸序列显示在UniProt登录号P97321(版本126，SEQ ID NO:24)，或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP的细胞外域(ECD)从氨基酸位置26延伸至761。SEQ ID NO:25和26分别显示了带His标签的小鼠FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列。SEQ ID NO:27和28分别显示了带His标签的食蟹猴FAP ECD的氨基酸和核苷酸序列。优选地，本发明的抗FAP结合分子与FAP的细胞外域结合。示例性抗FAP结合分子描述于国际专利申请No.WO 2012/020006 A2中。
术语“癌胚抗原(CEA)”，也称为癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)，是指任何脊椎动物来源的任何天然CEA，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)，非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CEA的氨基酸序列显示在UniProt登录号P06731(版本151，SEQ ID NO:29)中。CEA早已被鉴定为肿瘤相关抗原(Gold和Freedman,J Exp Med.,121:439-462,1965；Berinstein N.L.,J Clin Oncol.,20:2197-2207,2002)。最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质，现在已经在若干正常的成人组织中鉴定了CEA。这些组织主要是起源于上皮，包括胃肠道，呼吸道和泌尿生殖道的细胞，以及结肠，子宫颈，汗腺和前列腺的细胞(Nap等人，Tumour Biol.,9(2-3):145-53,1988；Nap等人，Cancer Res.,52(8):2329-23339,1992)。上皮起源的肿瘤及其转移瘤含有作为肿瘤相关抗原的CEA。虽然CEA本身的存在不表明转化为癌细胞，但CEA的分布是指示性的。在正常组织中，CEA通常在细胞的顶端表面上表达(
Figure BDA0003489575460000281
S.,Semin CancerBiol.9(2):67-81(1999))，使血流中的抗体难以接近。与正常组织相反，CEA倾向于在癌细胞的整个表面上表达(
Figure BDA0003489575460000282
S.,Semin Cancer Biol.9(2):67-81(1999))。这种表达模式的改变使CEA在癌细胞中可与抗体结合。另外，CEA表达在癌细胞中增加。此外，增加的CEA表达促进细胞间粘附增加，这可能导致转移(Marshall J.,Semin Oncol.,30(aSuppl.8):30-6,2003)。CEA表达在各种肿瘤实体中的发生率通常很高。根据公开的数据，在组织样品中进行的自身分析证实其高发生率，大约在结肠直肠癌(CRC)中为95％，在胰腺癌中为90％，在胃癌中为80％，在非小细胞肺癌(NSCLC，其与HER3共表达)中为60％，在乳腺癌中为40％；发现在小细胞肺癌和胶质母细胞瘤中为低表达。
CEA容易从细胞表面裂解并直接或通过淋巴管从肿瘤脱落进入血流。由于这种特性，血清CEA水平已被用作癌症诊断和筛选癌症特别是结肠直肠癌复发的临床标志物(Goldenberg D M.,The International Journal of Biological Markers,7:183-188,1992；Chau I.等人，J Clin Oncol.,22:1420-1429,2004；Flamini等人，Clin Cancer Res；12(23):6985-6988,2006)。
术语“黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)”，也称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)，是指任何脊椎动物来源的任何天然MCSP，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)，非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人MCSP的氨基酸序列显示在UniProt登录号Q6UVK1(版本103，SEQ ID NO:30)中。术语“表皮生长因子受体(EGFR)”，也称为原癌基因c-ErbB-1或受体酪氨酸蛋白激酶erbB-1，是指任何脊椎动物来源的任何天然EGFR，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)，非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人EGFR的氨基酸序列显示在UniProt登录号P00533(版本211，SEQ ID NO:31)中。
术语“CD19”是指B淋巴细胞抗原CD19，也称为B淋巴细胞表面抗原B4或T细胞表面抗原Leu-12，包括任何脊椎动物来源的任何天然CD19，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)，非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CD19的氨基酸序列显示在Uniprot登录号P15391(版本160，SEQ ID NO:32)中。该术语涵盖“全长”未加工的人CD19以及通过在细胞中加工产生的任何形式的人CD19，只要本文中报道的抗体与其结合即可。CD19是在人B细胞表面上表达的结构上不同的细胞表面受体，所述细胞包括但不限于前B细胞，早期发育中的B细胞(即未成熟B细胞)，通过终末分化成浆细胞的成熟B细胞和恶性B细胞。由大多数前B型急性淋巴细胞白血病(ALL)，非霍奇金淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，前淋巴细胞性白血病，毛细胞白血病，常见急性淋巴细胞性白血病和一些无标志型急性淋巴细胞性白血病表达CD19。CD19在浆细胞上表达进一步表明它可以在分化的B细胞肿瘤如多发性骨髓瘤中表达。因此，CD19抗原是用于治疗非霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病和/或急性淋巴细胞白血病的免疫治疗的靶标。
术语“CD20”是指B淋巴细胞抗原CD20，也称为跨膜4域亚家族A成员1(MS4A1)，B淋巴细胞表面抗原B1或白细胞表面抗原Leu-16，包括任何脊椎动物来源的任何天然CD20，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)，非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CD20的氨基酸序列显示在Uniprot登录号P11836(版本149，SEQ ID NO:33)中。术语“CD33”是指髓样细胞表面抗原CD33，也称为SIGLEC3或gp67，包括任何脊椎动物来源的任何天然CD33，所述脊椎动物包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)，非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人CD33的氨基酸序列显示在Uniprot登录号P20138(版本157，SEQ ID NO:34)中。
术语“可变区”或“可变域”是指涉及抗原结合分子与抗原结合的抗体重链或轻链的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt等人，Kuby Immunology,6thed.,W.H.Freeman和Co.,第91页(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。
如本文中使用的术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高变/或形成结构上定义的环(“高变环”)的抗体可变域的每个区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1，H2，H3)中，三个在VL中(L1，L2，L3)中。HVR通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或涉及抗原识别。示例性的高变环发生在氨基酸残基26-32(L1)，50-52(L2)，91-96(L3)，26-32(H1)，53-55(H2)，和96-101(H3)处。(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987).)示例性的CDR(CDR-L1，CDR-L2，CDR-L3，CDR-H1，CDR-H2，和CDR-H3)发生在L1的24-34，L2的50-56，L3的89-97，H1的31-35B，H2的50-65，和H3的95-102氨基酸残基处。(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991).)高变区(HVR)也被称为互补决定区(CDR)，并且在提到形成抗原结合区的可变区的模块时，这些术语在本文中可互换地使用。这个特定的区域已经由Kabat等人在U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins ofImmunological Interest"(1983)和Chothia等人在J.Mol.Biol.196:901-917(1987)中描述，其中定义包括当针对彼此进行比较时的氨基酸残基的重叠或子集。然而，提及抗体的CDR或其变体的任一定义的应用预期在本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如以上每一篇引用的参考文献所定义的CDR的适当氨基酸残基在以下表A中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基数将取决于CDR的序列和大小而变化。考虑到抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定的CDR。
表A.CDR定义1
Figure BDA0003489575460000301
Figure BDA0003489575460000311
1表A中所有CDR定义的编号遵循Kabat等人提出的编号规则(见下文)。
2具有如表A中使用的小写“b”的“AbM”是指Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件所定义的CDR。
Kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域的普通技术人员可以将这个“Kabat编号”系统明确地指定给任何可变区序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人在U.S.Dept.ofHealth and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)中提出的编号系统。除非另有说明，抗体可变区中特定氨基酸残基位置编号的提及是根据Kabat编号系统。
除了VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含作为接触抗原的残基的“特异性测定残基”或“SDR”。SDR被包含在称为缩略CDR(或a-CDR)的CDR区域中。示例性的a-CDR(a-CDR-L1，a-CDR-L2，a-CDR-L3，a-CDR-H1，a-CDR-H2，和a-CDR-H3)发生在L1的31-34，L2的50-55，L3的89-96，H1的31-35B，H2的50-58，和H3的95-102氨基酸残基处。(参见Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008).)除非另外指明，在本文中根据上文Kabat等人将可变域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)编号。
如本文中使用的，在抗原结合分子(例如，抗体)的背景下，术语“亲和力成熟”是指例如通过突变而衍生自参考抗原结合分子的抗原结合分子与参考抗体结合相同的抗原，优选结合相同的表位；并且对抗原具有相比于对参考抗原结合分子更高的亲和力。亲和力成熟通常涉及抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基的修饰。通常，亲和力成熟的抗原结合分子与初始参考抗原结合分子结合相同的表位。
“框架”或“FR”是指除了高变区(HVR)残基之外的可变域残基。可变域的FR通常由FR1，FR2，FR3和FR4四个FR域组成。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以下列顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
出于本文的目的，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下所定义。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含相同的氨基酸序列，或者其可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目为10个或更少，9个或更少，8个或更少，7个或更少，6个或更少，5个或更少，4个或更少，3个或更少，或2个或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
术语“嵌合”抗体是指其中一部分重链和/或轻链衍生自特定来源或物种的抗体，同时重链和/或轻链的其余模块衍生自不同的来源或物种。
抗体的“类”是指其重链所具有的恒定域或恒定区的类型。有五大类的抗体：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中几类可进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，和IgA2。对应于不同类型免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α，δ，ε，γ，和μ。
“人源化”抗体是指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个(通常两个)可变域中的基本上所有的可变域，其中所有或基本上所有的HVR(例如，CDR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”是指经过人源化的抗体。本发明涵盖的其他形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经基于原始抗体的恒定区另外加以修饰或改变以产生根据本发明的特性特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些抗体。
“人”抗体是具有这样的氨基酸序列的抗体，所述氨基酸序列对应于人或人细胞产生的抗体或衍生自利用人抗体库或其他的人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这个定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
本文中使用的术语“Fc域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域。人IgG Fc区的“CH2域”通常从约位置231的氨基酸残基延伸至约位置340的氨基酸残基。在一个实施方案中，碳水化合物链与CH2域附接。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。“CH3域”包含在Fc区中的C末端到CH2域的残基段(即从IgG的约位置341的氨基酸残基到约位置447的氨基酸残基)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如，具有在其一条链中引入的“突起”(“节”)和在其另一条链中相应的引入的“腔”(“穴”)的CH3域；参见美国专利5,821,333，将其明确地通过提述并入本文)。如本文中所述，这种变体CH3域可用于促进两个不相同的抗体重链的异源二聚化。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸到重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非在本文中另外说明，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统也称为EU索引进行的，如Kabat等人在Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述。
“节入穴”技术例如描述于US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“节”)并且在第二多肽的界面中引入相应的腔(“穴”)，使得该突起可以定位在该腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或相似大小的补偿腔。可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变，或通过肽合成而产生突起和腔。在具体的实施方案中，节修饰包括Fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代T366W，并且穴修饰包括Fc域的两个亚基中的另一个亚基中的氨基酸替代T366S，L368A和Y407V。在一个另外的具体实施方案中，包含节修饰的Fc域的亚基另外包含氨基酸替代S354C，并且包含穴修饰的Fc域的亚基另外包含氨基酸替代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥，从而进一步稳定该二聚体(Carter,JImmunol Methods 248,7-15(2001))。编号是根据Kabat等人在Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中的EU索引进行的。
“等同于免疫球蛋白Fc区的区域”预期包括免疫球蛋白Fc区的天然存在的等位基因变体，以及具有产生取代，添加或缺失的改变但不实质性地降低免疫球蛋白介导效应器功能(如抗体依赖性细胞毒性)的能力的变体。例如，可以从免疫球蛋白Fc区的N末端或C末端缺失一个或多个氨基酸，而没有生物学功能的实质性丧失。可以根据本领域已知的一般规则来选择这些变体，以便对活性具有最小的影响(参见，例如Bowie,J.U.等人，Science247:1306-10(1990))。
术语“效应器功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，细胞因子分泌，免疫复合物介导的经由抗原呈递细胞的抗原摄取，细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调，和B细胞活化。
“激活性Fc受体”是被抗体Fc区接合之后引出信号转导事件的Fc受体，所述事件刺激带有该受体的细胞履行效应器功能。激活性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a)，FcγRI(CD64)，FcγRIIa(CD32)，和FcαRI(CD89)。特定的激活性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637，版本141)。
术语“TNF配体家族成员”或“TNF家族配体”是指促炎细胞因子。细胞因子，特别是TNF配体家族的成员，通常在免疫系统的刺激和协调中起关键作用。目前，根据序列，功能和结构相似性，已将19种细胞因子鉴定为TNF(肿瘤坏死因子)配体超家族的成员。所有这些配体都是具有C末端细胞外域(胞外域)，N末端胞内域和单个跨膜域的II型跨膜蛋白。称为TNF同源域(THD)的C末端细胞外域在超家族成员之间具有20-30％的氨基酸同一性，并且负责与受体的结合。TNF胞外域还负责TNF配体形成被其特异性受体识别的三聚体复合物。
TNF配体家族的成员选自淋巴毒素α(也称为LTA或TNFSF1)，TNF(也称为TNFSF2)，LT(也称为TNFSF3)，OX40L(也称为TNFSF4)，CD40L(也称为CD154或TNFSF5)，FasL(也称为CD95L，CD178或TNFSF6)，CD27L(也称为CD70或TNFSF7)，CD30L(也称为CD153或TNFSF8)，4-1BBL(也称为TNFSF9)，TRAIL(也称为APO2L,CD253或TNFSF10)，RANKL(也称为CD254或TNFSF11)，TWEAK(也称为TNFSF12)，APRIL(也称为CD256或TNFSF13)，BAFF(也称为CD257或TNFSF13B)，LIGHT(也称为CD258或TNFSF14)，TL1A(也称为VEGI或TNFSF15)，GITRL(也称为TNFSF18)，EDA-A1(也称为外异蛋白A1)和EDA-A2(也称为外异蛋白A2)。该术语是指任何脊椎动物来源的任何天然TNF家族配体，包括哺乳动物，如灵长类动物(例如人)，非人灵长类动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在本发明的具体实施方案中，TNF配体家族成员选自4-1BBL，OX40L，GITRL，CD70，CD30L，CD40L和LIGHT。在特定实施方案中，TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
可以从例如Uniprot(www.uniprot.org)的可公开访问的数据库获得TNF配体家族成员的更多信息，特别是序列。例如，人TNF配体具有以下氨基酸序列：人淋巴毒素α(UniProt登录号P01374，SEQ ID NO:35)，人TNF(UniProt登录号P01375，SEQ ID NO:36)，人淋巴毒素β(UniProt登录号Q06643，SEQ ID NO:37)，人OX40L(UniProt登录号P23510，SEQID NO:38)，人CD40L(UniProt登录号P29965，SEQ ID NO:39)，人FasL(UniProt登录号P48023，SEQ ID NO:40)，人CD27L(UniProt登录号P32970，SEQ ID NO:41)，人CD30L(UniProt登录号P32971，SEQ ID NO:42)，4-1BBL(UniProt登录号P41273，SEQ ID NO:43)，TRAIL(UniProt登录号P50591，SEQ ID NO:44)，RANKL(UniProt登录号O14788，SEQ ID NO:45)，TWEAK(UniProt登录号O43508，SEQ ID NO:46)，APRIL(UniProt登录号O75888，SEQ IDNO:47)，BAFF(UniProt登录号Q9Y275，SEQ ID NO:48)，LIGHT(UniProt登录号O43557，SEQID NO:49)，TL1A(UniProt登录号O95150，SEQ ID NO:50)，GITRL(UniProt登录号Q9UNG2，SEQ ID NO:51)和外异蛋白A(UniProt登录号Q92838，SEQ ID NO:52)。
“胞外域”是延伸到细胞外空间(即靶细胞外的空间)的膜蛋白的域。胞外域通常是引发与表面接触的蛋白质模块，导致信号转导。因此，如本文中定义的TNF配体家族成员的胞外域是指延伸进入细胞外空间(细胞外域)的TNF配体蛋白的模块，还包括负责三聚化和与相应TNF受体结合的较短部分或其片段。因此，术语“TNF配体家族成员的胞外域或其片段”是指形成细胞外域的TNF配体家族成员的细胞外域或其仍然能够与受体结合的模块(受体结合域)。
术语“共刺激TNF配体家族成员”或“共刺激TNF家族配体”是指能够共刺激T细胞的增殖和细胞因子产生的TNF配体家族成员亚型。这些TNF家族配体可以在与其相应的TNF受体相互作用时共刺激TCR信号，并且与其受体的相互作用导致TNFR相关因子(TRAF)的募集，其引发导致T细胞活化的信号级联。共刺激TNF家族配体选自4-1BBL，OX40L，GITRL，CD70，CD30L和LIGHT，更特具体地说，共刺激TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
如前文中所述，4-1BBL是II型跨膜蛋白，并且为TNF配体家族的一个成员。已经描述了在细胞表面上形成三聚体的具有氨基酸序列SEQ ID NO:43的完整或全长4-1BBL。通过4-1BBL的胞外域的特定基序而启动三聚体形成。所述基序在本文中命名为“三聚化区域”。人4-1BBL序列的氨基酸50-254(SEQ ID NO:53)形成4-1BBL的细胞外域，但是即使其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中，术语“4-1BBL的胞外域或其片段”是指具有选自SEQ ID NO:4(人4-1BBL的氨基酸52-254)，SEQ ID NO:1(人4-1BBL的氨基酸71-254)，SEQ ID NO:3(人4-1BBL的氨基酸80-254)，SEQ ID NO:2(人4-1BBL的氨基酸85-254)，SEQID NO:99(人4-1BBL的氨基酸71-248)，SEQ ID NO:100(人4-1BBL的氨基酸85-248)，SEQ IDNO:101(人4-1BBL的氨基酸80-248)和SEQ ID NO:102(人4-1BBL的氨基酸52-254)的氨基酸序列的多肽，但是能够三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。
如前文中所述，OX40L是另一种II型跨膜蛋白，并且为TNF配体家族的另一个成员。完整或全长的人OX40L具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列。人OX40L序列的氨基酸51-183(SEQID NO:6)形成OX40L的细胞外域，但是即使其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中，术语“OX40L的胞外域或其片段”是指具有选自SEQ ID NO:6(人OX40L的氨基酸51-183)或SEQ ID NO:7(人OX40L的氨基酸52-183)的氨基酸序列的多肽，但是能够三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。
术语“肽接头”是指包含一个或多个氨基酸的肽。肽接头包含1-44个氨基酸，更加特别是2-20个氨基酸。肽接头在本领域中是已知的或描述于本文中。适合的非免疫原性接头肽例如是，(G4S)n，(SG4)n或G4(SG4)n肽接头，其中“n”通常为1至10之间的数字，通常为2至4，特别是2，即，这些肽选自GGGGS(SEQ ID NO:136)，GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:54)，SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:55)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:56)，但也包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)，GSGSGSGS(SEQ ID NO:58)，GSGSGNGS(SEQ ID NO:59)，GGSGSGSG(SEQ IDNO:60)，GGSGSG(SEQ ID NO:61)，GGSG(SEQ ID NO:62)，GGSGNGSG(SEQ ID NO:63)，GGNGSGSG(SEQ ID NO:64)和GGNGSG(SEQ ID NO:65)。特别感兴趣的肽接头是(G4S)1或GGGGS(SEQ ID NO:136)，(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:54)和GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)，更具体地为(G4S)2或GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:54)和GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)。
在本申请中使用的术语“氨基酸”表示包含丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)，精氨酸(arg，R)，天冬酰胺(asn，N)，天冬氨酸(asp，D)，半胱氨酸(cys，C)，谷氨酰胺(gln，Q)，谷氨酸(glu，E)，甘氨酸(gly，G)，组氨酸(his，H)，异亮氨酸(ile，I)，亮氨酸(leu，L)，赖氨酸(lys，K)，甲硫氨酸(met，M)，苯丙氨酸(phe，F)，脯氨酸(pro,P)，丝氨酸(ser，S)，苏氨酸(thr，T)，色氨酸(trp，W)，酪氨酸(tyr，Y)和缬氨酸(val，V)的天然存在的羧基α-氨基酸的组。
如本文中使用的“单链融合蛋白”是指由与抗原结合模块或Fc部分的一部分融合的所述TNF配体家族成员的一个或两个胞外域组成的单链多肽。通过经由肽接头将抗原结合模块的N末端或C末端氨基酸直接与所述TNF配体家族成员的胞外域的C末端或N末端氨基酸连接，可以进行融合。
“融合”或“连接”意指组分(例如多肽和所述TNF配体家族成员的胞外域)通过肽键直接连接或经由一个或多个肽接头连接。
相对于参考多肽(蛋白质)序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在序列比对和引入空位(如果需要的话，达到最大序列同一性百分比，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守取代)之后候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。以本领域技术人员熟知的各种方法可实现为了确定氨基酸序列同一性百分比的比对，例如，利用可公开获得的计算机软件，如BLAST，BLAST-2，ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需要的任何算法。然而，出于本文的目的，通过使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成了氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司创作，并且源代码已在美国版权局(U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559)与用户文件一起备案，在美国版权局以美国版权登记号TXU510087登记。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech公司公开获得，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译为供在包括数字UNIX V4.0D在内的UNIX操作系统上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设定且没有变化。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情形下，给定氨基酸序列A相对于(与，或针对)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可表述为给定氨基酸序列A相对于(与，或针对)给定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)计算如下：
100乘以分数X/Y
其中X为通过序列比对程序ALIGN-2在A与B的程序比对中评定为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y为B中的氨基酸残基的总数。应当理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A相对于B的氨基酸序列同一性％不会等于B相对于A的氨基酸序列同一性％。除非另外特别说明，否则使用ALIGN-2计算机程序如前一段所述获得在本文中使用的所有氨基酸序列同一性％值。
在某些实施方案中，考虑了本文提供的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如，可能希望改善含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其他生物学性质。含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可以通过向编码所述分子的核苷酸序列引入适当的修饰，或通过肽合成来制备。这些修饰包括，例如，抗体氨基酸序列中的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失，插入和取代的任何组合以得到最终的构建体，条件是最终构建体具有期望的特征，例如抗原结合。取代型诱变的感兴趣部位包括HVR和框架(FR)。在表B中的标题“优选取代”下提供了保守取代，并且在下文中参照氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步加以描述。可以将氨基酸替代引入感兴趣的分子中，并筛选出具有期望活性的产物，所述活性例如保留/增强的抗原结合，降低的免疫原性，或增强的ADCC或CDC。
表B
Figure BDA0003489575460000381
Figure BDA0003489575460000391
可以根据常见的侧链性质将氨基酸分组：
(1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守取代需要将这些类之一的成员替换为另一类。
术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中存在氨基酸替代的实质性变体。通常，经过选择用于进一步研究的所得变体相对于亲本抗原结合分子在某些生物学特性(例如，增加的亲和力，降低的免疫原性)方面将具有改变(例如提高)和/或将具有基本上保留的亲本抗原结合分子的某些生物学特性。示例性的取代变体是亲和力成熟抗体，可以方便地例如使用例如本文所述的那些基于噬菌体展示的亲和力成熟技术来产生所述抗体。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并且将变体抗原结合分子展示在噬菌体上并针对特定的生物活性(例如结合亲和力)进行筛选。在某些实施方案中，取代，插入或缺失可以在一个或多个HVR内进行，只要这些改变基本上不降低抗原结合分子结合抗原的能力即可。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如本文中提供的保守取代)。用于鉴定可能被靶向诱变的抗体残基或区域的有用方法被称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在该方法中，鉴定残基或一组靶残基(例如，带电残基，如Arg，Asp，His，Lys和Glu)，并用中性或带负电的氨基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替换，以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在针对初始取代显示功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的取代。替代地，或另外地，抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。这样的接触残基和相邻残基可以作为取代候选物被靶向或消除。可以筛选变体以确定它们是否具备期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列间插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰残基的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。分子的其他插入变体包括与多肽的N末端或C末端的融合，以增加含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的血清半衰期。
在某些实施方案中，改变本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子以增加或降低抗体被糖基化的程度。通过改变氨基酸序列从而产生或去除一个或多个糖基化位点，可以方便地获得分子的糖基化变体。当含有TNF配体三聚体的抗原结合分子包含Fc区时，附着于其上的碳水化合物可能被改变。由哺乳动物细胞产生的天然抗体通常包含支链的双触角(biantennary)寡糖，其通常通过N键与Fc区的CH2域的Asn297连接。参见，例如Wright等人，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖，N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，半乳糖和唾液酸，以及与在双触角寡糖结构的“茎”中的GlcNAc附接的岩藻糖。在一些实施方案中，可以在含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进行寡糖修饰，以产生具有某些改良特性的变体。在一个方面，提供了具有缺乏与Fc区附接(直接或间接)的岩藻糖的碳水化合物结构的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的变体。这样的岩藻糖基化变体可具有增强的ADCC功能，参见，例如美国专利公开Nos.US 2003/0157108(Presta,L.)或US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的其他变体包括具有二等分寡糖的那些，例如，其中与Fc区附接的双触角寡糖被GlcNAc二等分。这些变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或增强的ADCC功能，参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供了与Fc区附接的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。这样的抗体变体可以具有增强的CDC功能，并被描述于例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些实施方案中，可能希望产生本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的半胱氨酸工程化的变体，例如“thioMAb”，其中该分子的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基出现在分子的可接近位置。通过用半胱氨酸取代那些残基，由此反应性硫醇基团被定位在抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其他模块(例如药物模块或接头-药物模块)缀合以产生免疫缀合物。在某些实施方案中，任何一个或多个以下残基可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；和重链Fc区的S400(EU编号)。可以按照例如美国专利No.7,521,541中的描述产生半胱氨酸工程化的抗原结合分子。
在某些方面，本文中提供的含有TNF家族的配体三聚体的抗原结合分子可进一步被修饰，以含有另外的本领域已知并且易于获得的非蛋白质模块。适用于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊环，聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/马来酸酐共聚物，聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而具有在制造方面的优点。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链或非支链的。与抗体附接的聚合物的数量可以变化，并且如果附接一种以上的聚合物的话，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数量和/或类型可以基于以下考虑事项来确定，包括但不限于，待改进的抗体的特定性质或功能，是否将双特异性抗体衍生物在限定的条件下用于治疗中，等等。在另一个方面，提供了可通过暴露于辐射而选择性加热的抗体与非蛋白质模块的缀合物。在一个实施方案中，非蛋白质模块是碳纳米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以具有任何波长，并且包括但不限于不损害普通细胞的波长，但所述波长将非蛋白质模块加热到杀死抗体-非蛋白质模块附近的细胞的温度。
在另一个方面，可以获得本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒性剂在内的一个或多个异源分子缀合的抗体。
术语“多核苷酸”是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)，病毒来源的RNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如，可见于肽核酸(PNA)中的酰胺键)。术语“核酸分子”是指任何一个或多个核酸区段，例如，存在于多核苷酸中的DNA或RNA片段。
关于“分离的”核酸分子或多核苷酸，意指已经从其天然环境中移出的核酸分子，DNA或RNA。例如，编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸出于本发明的目的被认为是分离的。分离的多核苷酸的另外的例子包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液形式的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子的细胞中所含的多核苷酸分子，但多核苷酸分子在染色体外存在或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物，以及正链和负链形式以及双链形式。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，例如启动子，核糖体结合位点或转录终止子。
关于具有至少例如与本发明的参考核苷酸序列95％“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指除了该多核苷酸序列可以包括至多该参考核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外，所述多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得具有与参考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中至多5％的核苷酸可以被缺失或被另一个核苷酸取代，或者，在参考序列中，总核苷酸的至多5％的多个核苷酸可被插入参考序列。参考序列的这些改变可以发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何位置，独立散布在参考序列的残基之间或在参考序列内的一个基团或多个连续的基团中。实际情况是，使用例如上面针对多肽所讨论的已知的计算机程序(例如ALIGN-2)，可以常规地确定任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。
术语“表达盒”是指重组或合成产生的多核苷酸，其具有一系列允许特定核酸在靶细胞中转录的特定核酸元件。重组表达盒可以掺入质粒，染色体，线粒体DNA，质体DNA，病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列之外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中，本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。
术语“载体”或“表达载体”与“表达构建体”是同义的，并且是指用于将与其可操作地相关联的特定基因引入靶细胞中并且指导所述特定基因的表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及组入其已被引入的宿主细胞中的基因组中的载体。本发明的表达载体包括表达盒。表达载体允许大量稳定的mRNA的转录。一旦表达载体进入靶细胞内，则通过细胞转录和/或翻译机制产生由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。
术语“宿主细胞”，“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指在其中引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸含量方面与亲本细胞可能不完全相同，而可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物活性的突变体后代。宿主细胞是可用于产生本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞系统。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞，例如CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6细胞或杂交瘤细胞，酵母细胞，昆虫细胞和植物细胞，在此仅列举少数，还有包括在转基因动物，转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。
药剂的“有效量”是指导致其所施用的细胞或组织的生理变化所必需的量。
药剂(例如药物组合物)的“治疗有效量”是指在剂量和时间段方面有效实现期望的治疗或预防结果所需的量。例如，治疗有效量的药剂消除，减少，延迟，最小化或预防疾病的不利影响。
“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如母牛，绵羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如人类和非人灵长类动物如猴子)，兔，和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。具体地说，个体或受试者是人。
术语“药物组合物”是指其为这样的形式的制剂，所述形式允许其中所含的活性成分的生物活性是有效的，并且所述制剂不含另外的对该制剂所施用的受试者具有不可接受的毒性的组分。
“药学上可接受的赋形剂”是指药物组合物中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的赋形剂包括但不限于缓冲剂，稳定剂或防腐剂。
术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这种治疗产品的适应症，用法，剂量，给药，联合疗法，禁忌症和/或警告的信息。
如本文中使用的，“治疗”(“treatment”)(及其语法变化例如“治疗”(“treat”)或“治疗”(“treating”))是指试图改变被治疗个体的自然病程的临床干预，所述临床干预可用于预防或在临床病理过程中进行。期望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发，症状减轻，疾病的任何直接或间接病理结果的削减，预防转移，降低疾病进展速度，改善或减轻疾病状态，以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的分子用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文中使用的术语“癌症”是指增殖性疾病，例如淋巴瘤，癌，淋巴瘤，母细胞瘤，肉瘤，白血病，淋巴细胞性白血病，肺癌，非小细胞肺癌(NSCL)，支气管肺泡细胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内黑素瘤，子宫癌，卵巢癌，直肠癌，肛门区癌，胃癌，胃癌，结肠直肠癌(CRC)，胰腺癌，乳腺癌，三阴性乳腺癌，子宫癌，输卵管癌，子宫内膜癌，子宫颈癌，阴道癌，外阴癌，霍奇金病，食道癌，小肠癌，内分泌系统的癌症，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，软组织肉瘤，尿道癌，阴茎癌，前列腺癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾细胞癌，肾盂癌，间皮瘤，肝细胞癌，胆道癌，中枢神经系统(CNS)肿瘤，脊索瘤，脑干神经胶质瘤，多形性胶质母细胞瘤，星形细胞瘤，神经鞘瘤，室管膜瘤，成神经管细胞瘤，脑膜瘤，鳞状细胞癌，垂体腺瘤和尤文氏肉瘤，黑素瘤，多发性骨髓瘤，B细胞癌(淋巴瘤)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，毛细胞白血病，慢性髓细胞性白血病，包括任何上述癌症的难治性形式，或上述一种或多种癌症的组合。
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
本发明提供了具有特别有利的性质的含有新型TNF家族配体三聚体抗原结合分子，所述性质例如可生产性、稳定性、结合亲和力、生物活性、靶向效率和降低的毒性。
如此，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个(任选通过肽接头)彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在一个方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在另一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽融合至该Fc域的两个亚基之一的N或C端氨基酸，任选经由肽接头。
在一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该TNF配体家族成员共刺激人T细胞活化。因此，该TNF配体家族成员是共刺激性TNF家族配体。具体地说，该共刺激性TNF家族配体选自4-1BBL，OX40L，GITRL，CD70，CD30L和LIGHT，更具体地说，该共刺激性TNF家族配体选自4-1BBL和OX40L。
在一个方面，该TNF配体家族成员是4-1BBL。
在一个另外的方面，该TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:1，SEQ IDNO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:101和SEQ IDNO:102的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:99的氨基酸序列。
在一个特定方面，TNF配体家族成员的胞外域或其片段包含选自SEQ ID NO:1，SEQID NO:2，SEQ ID NO:3，和SEQ ID NO:4的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在又一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，和
(b)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。更具体地说，该多肽包含SEQID NO:5的氨基酸序列。
在另一个方面，该TNF配体家族成员是OX40L。
在另一个方面，该TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在又一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，和
(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段直接或用合适的化学接头，诸如二硫化物，酯或醚桥彼此连接。
在另一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段通过肽接头彼此连接，该肽接头是相同的或不同的且选自GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:54)，SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:55)和GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:56)，但是还包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)，GSGSGSGS(SEQ ID NO:58)，GSGSGNGS(SEQ ID NO:59)，GGSGSGSG(SEQ ID NO:60)，GGSGSG(SEQ ID NO:61)，GGSG(SEQ ID NO:62)，GGSGNGSG(SEQ ID NO:63)，GGNGSGSG(SEQ ID NO:64)和GGNGSG(SEQ ID NO:65)。具体地说，该肽接头是相同的且选自(G4S)2(SEQ ID NO:54)和GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:57)。更具体地说，本发明涉及如上文定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段通过(G4S)2接头彼此连接。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在C端氨基酸处融合至该Fc域的亚基之一的N端氨基酸。在一个特定方面，该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在C端氨基酸处融合至该Fc域中的CH2域的N端氨基酸。在又一个方面，该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在C端氨基酸处通过肽接头连接至该Fc域的N端氨基酸。
在另一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在N端氨基酸处融合至该Fc域的C端氨基酸。在一个特定方面，该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在N端氨基酸处融合至该Fc域中的CH3域的C端氨基酸。在又一个方面，该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在N端氨基酸处通过肽接头连接至该Fc域的C端氨基酸。
在另一个方面，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，
其中该能够特异性结合靶细胞抗原的模块没有融合至该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽。
在一个另外的方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块选自抗体，抗体片段和支架抗原结合蛋白。
在一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是抗体。
在另一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是抗体片段。具体地说，抗体片段选自Fab分子，交换Fab分子，单链Fab分子，Fv分子，scFv分子，单域抗体，和VH。
在又一个方面，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是支架抗原结合蛋白。
如此，在又一个方面，本发明涉及如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块选自抗体片段，Fab分子，交换Fab分子，单链Fab分子，Fv分子，scFv分子，单域抗体，VH和支架抗原结合蛋白。如此，在一个特定方面，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗体片段，其选自Fab分子，交换Fab分子，单链Fab分子，Fv分子，scFv分子，单域抗体，VH和支架抗原结合蛋白，(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。在一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)一个能够特异性结合靶细胞抗原的抗体片段，其选自Fab分子，交换Fab分子，单链Fab分子，Fv分子，scFv分子，单域抗体，VH和支架抗原结合蛋白。
在一个特定方面，本发明与如上定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子有关，其中能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。如此，本发明提供了含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的，(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
在另一个方面，提供了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)，癌胚抗原(CEA)，黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，表皮生长因子受体(EGFR)，CD19，CD20和CD33。
在又一个方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域是IgG Fc域，特别是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。具体地说，该由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域是IgG1 Fc域。在一个特定方面，该Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。
降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc结构域修饰
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域由包含免疫球蛋白分子的重链结构域的一对多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc结构域是二聚体，其每个亚基包含IgG重链恒定结构域CH2和CH3。Fc结构域的两个亚基能够彼此稳定联合。
Fc结构域对本发明的抗原结合分子赋予有利的药代动力学特性，包括有助于靶组织中良好积聚的长血清半衰期和有利的组织-血液分配比。如此，Fc域有利地促进抗原结合分子的药代动力学参数(PK数据)，诸如清除率、分布容积或消除半衰期(t1/2)。然而，与此同时，可能导致本发明的双特异性抗体不期望地靶向表达Fc受体的细胞而不是优选的抗原携带细胞。因此，在特定方面，与天然IgG1 Fc结构域相比，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域表现出降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个方面，该Fc基本上不与Fc受体结合和/或不诱导效应器功能。在一个特定方面，该Fc受体是Fcγ受体。在一个方面，该Fc受体是人Fc受体。在一个具体方面，该Fc受体是激活性人Fcγ受体，更具体地说是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地说是人FcγRIIIa。在一个方面，该Fc结构域不诱导效应器功能。降低的效应器功能可以包括但不限于以下一者或多者：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)、降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌减少、免疫复合物介导的经由抗原呈递细胞的抗原摄取减少、与NK细胞的结合减少、与巨噬细胞的结合减少、与单核细胞的结合减少、与多形核细胞的结合减少、直接信号转导诱导性细胞凋亡减少、降低的树突细胞成熟、或减少的T细胞引发。
在某些方面，可以在本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置上含有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
在一个方面，本发明涉及如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够与靶细胞抗原特异性结合的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc结构域，其中Fc结构域包含一个或多个降低与Fc受体尤其是Fcγ受体结合的氨基酸替代。
在一个方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域包含一个或多个降低Fc结构域与Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，在Fc结构域的两个亚基的每一个中存在相同的一个或多个氨基酸突变。具体地说，Fc结构域包含在位置E233、L234、L235、N297、P331和P329(EU编号)处的氨基酸替代。具体地说，Fc结构域包含在IgG重链的位置234和235(EU编号)和/或329(EU编号)处的氨基酸替代。更具体地说，提供了根据本发明的含有三聚体TNF家族配体的抗原结合分子，其包含具有在IgG重链中的氨基酸替代L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”，EU编号)的Fc结构域。氨基酸替代L234A和L235A是指所谓的LALA突变。氨基酸替代的“P329G LALA”组合几乎完全消除了人IgG1 Fc结构域的Fcγ受体结合，并被描述于国际专利申请公开No.WO 2012/130831 A1中，该文献还描述了制备这种突变体Fc结构域的方法以及用于确定其特性诸如Fc受体结合或效应器功能的方法。“EU编号”是指根据Kabat等人在Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中的EU索引的编号。
具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc结构域还包含具有一个或多个Fc结构域残基238、265、269、270、297、327和329的取代的Fc结构域(美国专利No.6,737,056)。这样的Fc突变体包括具有在两个或多个氨基酸位置265、269、270、297和327处的取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其残基265和297被替代为丙氨酸(美国专利No.7,332,581)。
在另一个方面，Fc结构域为IgG4 Fc结构域。与IgG1抗体相比，IgG4抗体展现出对Fc受体的降低的结合亲和力和降低的效应器功能。在更具体的方面，Fc结构域是包含在位置S228(Kabat编号)处的氨基酸替代具体地为氨基酸替代S228P的IgG4 Fc结构域。在更具体的方面，Fc结构域是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G(EU编号)的IgG4 Fc结构域。这样的IgG4 Fc结构域突变体及其Fcγ受体结合特性也描述于WO 2012/130831中。
可以使用本领域熟知的遗传学或化学方法通过氨基酸缺失、取代、插入或修饰来制备突变体Fc结构域。遗传学方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。可以通过例如测序来验证正确的核苷酸变化。
可以例如通过ELISA或通过使用诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的标准仪器的表面等离子体共振(SPR)容易地确定与Fc受体的结合，并且可以例如通过重组表达获得Fc受体。适合的此类结合测定描述于本文中。或者，可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系例如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估Fc结构域或包含Fc结构域的细胞活化性双特异性抗原结合分子针对Fc受体的结合亲和力。
可以通过本领域已知的方法测量Fc结构域或包含Fc结构域的本发明的双特异性抗体的效应器功能。适合的用于测量ADCC的测定法描述于本文中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其他实例描述于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等人，Proc.NatlAcad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者，可以采用非放射性测定方法(参见，例如ACTITM non-radioactivecytotoxicity assay for flow cytometry(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；CytoTox
Figure BDA0003489575460000511
non-radioactive cytotoxicity assay(Promega,Madison,WI))。用于这种测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地，或另外地，可以在体内，例如，在Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性。
在一些实施方案中，Fc结构域与补体成分特别是C1q的结合减少。因此，在其中将Fc结构域工程化以具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定以确定本发明的双特异性抗体是否能够与C1q结合并因此具有CDC活性。参见，例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见，例如Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie,Blood103,2738-2743(2004))。
在一个特定方面，Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基联合的修饰。
促进异源二聚化的Fc结构域修饰
Fc域包含与Fc结构域的两个亚基中的一个或另一个融合的不同模块，所述亚基通常包含在两个不相同的多肽链(“重链”)中。这些多肽的重组共表达和随后的二聚化导致两个多肽的若干可能的组合。为了在重组生产中提高含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的产率和纯度，因此在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域中引入促进期望多肽的联合的修饰将是有利的。
因此，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域包含促进Fc结构域的第一和第二亚基的联合的修饰。人IgG Fc结构域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc结构域的CH3结构域中。因此，所述修饰具体地在Fc结构域的CH3结构域中。
在一个具体方面，所述修饰是所谓的“节入穴”修饰，包括在Fc结构域的两个亚基之一中的“节”修饰和Fc结构域的两个亚基的另一个中的“穴”修饰。因此，在一个特定方面，本发明涉及如前文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包括IgG分子，其中第一重链的Fc模块包含第一个二聚化模块，并且第二重链的Fc模块包含允许IgG分子的两条重链异二聚化的第二个二聚化模块；根据节入穴技术，第一个二聚化模块包括节，第二个二聚化模块包括穴。
“节入穴”技术例如描述于US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人Prot Eng9,617-621(1996)and Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“节”)并且在第二多肽的界面中引入相应的腔(“穴”)，使得该突起可以定位在该腔中，从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或相似大小的补偿腔。
因此，在特定方面，在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，将氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在第一亚基的CH3结构域内产生可定位于第二亚基的CH3结构域内的腔中的突起；并且在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，将氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸酸残基，由此在第二亚基的CH3结构域内产生可将第一亚基的CH3结构域内的突起定位在其中的腔。
可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变、或通过肽合成而产生突起和腔。
在一个具体方面，在Fc结构域的第一亚基的CH3结构域中，第366位的苏氨酸残基替换为色氨酸残基(T366W)，而在Fc结构域的第二亚基的CH3结构域中，第407位酪氨酸残基替换为缬氨酸残基(Y407V)。更具体地说，在Fc结构域的第二亚基中，另外将366位的苏氨酸残基替换为丝氨酸残基(T366S)，将368位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(L368A)。更具体地说，在Fc结构域的第一亚基中，另外将第354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基(S354C)，而在Fc结构域的第二亚基中，第349位酪氨酸残基替换为半胱氨酸残基(Y349C)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc结构域的两个亚基之间形成二硫桥。二硫桥进一步使该二聚体稳定(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个替代方面，促进Fc结构域的第一和第二亚基的联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰，例如，如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常，这种方法包括通过将两个Fc结构域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电氨基酸残基，使得在静电方面不利于同二聚体形成，但在静电方面有利于异二聚化。
特定的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子
在另一个方面，提供了单价的如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块。
具体地说，本发明的包含(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进一步包含(a)能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，其中Fab重链在C端处融合至该Fc域中的CH2域的N端。
而且，本发明提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)重链和轻链，二者构成能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，和
(b)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在又一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域，
(ii)轻链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VL域，和
(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH域，(ii)轻链，其包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL域或包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个方面，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH域，(ii)轻链，其包含包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在又一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH域，(ii)轻链，其包含包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的VL域或包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了二价的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够特异性结合靶细胞抗原的模块。
在一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域或VL域，
(ii)两条轻链，各自包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VL域或VH域，和
(iii)第二重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域或VL域和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域，
(ii)两条轻链，各自包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VL域，和
(iii)第二重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域和SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个特定方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH域，(ii)两条轻链，各自包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL域或包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH域和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在另一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH域，(ii)两条轻链，各自包含包含SEQ IDNO:119的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH域和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在还有另一个方面，该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH域，(ii)两条轻链，其包含包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的VL域或包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的VL域，和(iii)第二重链，其包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH域和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个方面，提供了依照本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)重链和轻链，该重链包含VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，该轻链包含VL域，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3，和
(b)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在又一个方面，本发明提供依照本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)能够特异性结合FAP的模块，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL域，和
(b)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和
(iii)多肽，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)重链和轻链，二者构成能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，和
(b)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在一个方面，提供了依照本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)重链和轻链，该重链包含VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，该轻链包含VL域，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3，和
(b)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在又一个方面，本发明提供了依照本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)能够特异性结合FAP的模块，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL域，和
(b)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和
(iii)多肽，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
在一个特定方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是FAP
在一个特定方面，靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。在一个方面，本发明提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合FAP的模块包含VH域和VL域，
(a)该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:10的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3；或
(b)该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:105的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR-L3。
在一个方面，该能够特异性结合FAP的模块包含VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3。在另一个特定的方面，该能够特异性结合FAP的模块包含VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR-L3。
在又一个方面，能够与FAP特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:17的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：由SEQID NO:16的氨基酸序列组成的VH结构域和由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的VL结构域。
在又一个特定方面，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的轻链。在一个具体方面，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含：由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO:19的氨基酸序列组成的轻链。
在另一个方面，能够与FAP特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:110的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:111的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:111的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：由SEQ ID NO:110的氨基酸序列组成的VH结构域和由SEQ ID NO:111的氨基酸序列组成的VL结构域。
在一个方面，提供了单价的如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含一个能够与FAP特异性结合的模块。
在一个特定方面，提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在又一个特定方面，提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在另一个特定方面，提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了二价的如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与FAP特异性结合的模块。
在一个特定方面，提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:140的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:142的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:141的氨基酸序列。
含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CEA
在另一个方面，靶细胞抗原是CEA。在一个方面，本发明提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合CEA的模块包含VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR-L3。
在又一个方面，能够与CEA特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:118的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:119的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与CEA特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ IDNO:119的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：由SEQ ID NO:118的氨基酸序列组成的VH结构域和由SEQ ID NO:119的氨基酸序列组成的VL结构域。
在一个方面，提供了单价的如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含一个能够与CEA特异性结合的模块。
在一个特定方面，提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了二价的如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与CEA特异性结合的模块。
在一个特定方面，提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:146的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:148的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:147的氨基酸序列。
含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原是CD19
在还有另一个方面，该靶细胞抗原是CD19。在一个方面，本发明提供了如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合CD9的模块包含VH域和VL域，
(a)该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:121的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR-L3；或
(b)该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ IDNO:129的氨基酸序列的CDR-H2，和(iii)包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-L2，和(vi)包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-L3。
在又一个方面，能够与CD19特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:126的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:127的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在另一个方面，能够与CD19特异性结合的模块包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:134的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:135的氨基酸序列具有至少约95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个特定方面，能够与CD19特异性结合的模块包含：包含SEQID NO:126的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的轻链可变区。在一个具体方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：由SEQ ID NO:118的氨基酸序列组成的VH结构域和由SEQ ID NO:119的氨基酸序列组成的VL结构域。在另一特定方面，能够与CD19特异性结合的模块包含：包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ IDNO:135的氨基酸序列的可变轻链。在一个具体方面，能够与FAP特异性结合的模块包含：由SEQ ID NO:134的氨基酸序列组成的VH结构域和由SEQ ID NO:135的氨基酸序列组成的VL结构域。
在一个方面，提供了单价的如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含一个能够与CD19特异性结合的模块。
在一个特定方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在又一个特定方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
在另一个方面，提供了二价的如上文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够与CD19特异性结合的模块。
在一个特定方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:154的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列。
在又一个特定方面，提供了如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:158的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列，和
(iii)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:159的氨基酸序列。
多核苷酸类
本发明进一步提供了编码如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸或其片段。
编码本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸可以表述为编码整个抗原结合分子的单个多核苷酸或共表达的多个(例如两个或更多个)多核苷酸。由共表达的多核苷酸编码的多肽可以通过例如二硫键或其他手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如，免疫球蛋白的轻链模块可以由与免疫球蛋白的重链模块分开的多核苷酸编码。重链多肽将在共表达时与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。
在一些方面，分离的多核苷酸编码如本文中描述的根据本发明的完整的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在其它实施方案中，分离的多核苷酸编码包含在如本文中描述的根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中的多肽。
在一个方面，本发明涉及编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与靶细胞抗原特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的三个胞外域或其片段的多肽的序列，和(c)编码由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的序列。
在另一个方面，提供了编码含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与靶细胞抗原特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的4-1BB的三个胞外域或其片段的多肽的序列，和(c)编码由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的序列。
在又一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含编码包含三个4-1BBL片段的多肽的序列，所述4-1BBL片段包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101或SEQ ID NO:102所示氨基酸序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的氨基酸序列。在一个方面，提供了分离的多核苷酸，其包含编码包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的多肽的序列。
在另一个方面，提供了编码含有OX40配体三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)编码能够与靶细胞抗原特异性结合的模块的序列，(b)编码包含通过肽接头彼此连接的OX40L的三个胞外域或其片段的多肽的序列，和(c)编码由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的序列。
在又一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含编码包含三个OX40L片段的多肽的序列，所述OX40L片段包含与SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列具有至少约90％、95％、98％或100％同一性的氨基酸序列。在一个方面，提供了分离的多核苷酸，其包含编码包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽的序列。
在另一个方面，提供了分离的多核苷酸，其编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该多核苷酸包含(a)编码能够特异性结合靶细胞抗原的模块的序列，(b)编码包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段且在C端氨基酸处融合至该Fc域中的CH2域的N端氨基酸的多肽的序列，(c)编码由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的序列。在又一个方面，提供了分离的多核苷酸，其编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该多核苷酸包含(a)编码能够特异性结合靶细胞抗原的模块的序列，(b)编码包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段且在N端氨基酸处融合至该Fc域中的CH3域的C端氨基酸的多肽的序列，和(c)编码由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域的序列。
在一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含编码IgG1 Fc域的序列。在一个特定方面，该分离的多核苷酸包含编码在位置234，235和/或329(EU编号方式)处具有氨基酸替代的Fc域的序列。
在另一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:66所示核酸序列具有至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的序列。在又一个方面，提供了分离的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO:87所示核酸序列具有至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的序列。
在又一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该多核苷酸包含编码重链和轻链的序列，该重链和轻链二者构成能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，和SEQ ID NO:66的核酸序列。在又一个方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该多核苷酸包含编码重链和轻链的序列，该重链和轻链二者构成能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，和SEQ ID NO:87的核酸序列。
在一个方面，提供了编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(a)重链和轻链，该重链包含VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，该轻链包含VL域，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3，和(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
在另一个方面，提供了编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(a)重链和轻链，该重链包含VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR-H3，该轻链包含VL域，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR-L3，和(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
在又一个方面，提供了编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(a)重链和轻链，该重链包含VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR-H3，该轻链包含VL域，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR-L3，和(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
在还有另一个方面，提供了编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(a)重链和轻链，该重链包含VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR-H3，该轻链包含VL域，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR-L3，和(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
在又一个方面，提供了编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(a)重链和轻链，该重链包含VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR-H3，该轻链包含VL域，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-L3，和(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
在又一个方面，本发明提供编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(a)能够特异性结合FAP的模块，其包含由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的VH域和由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的VL域，和(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
在一个特定方面，本发明提供编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(i)重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和(iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的融合蛋白。
在又一个方面，本发明提供编码含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(a)能够特异性结合FAP的模块，其包含由SEQ ID NO:110的氨基酸序列组成的VH域和由SEQ ID NO:111的氨基酸序列组成的VL域，和(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
在一个特定方面，本发明提供编码含有4-1BBL三聚体抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(i)重链，其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列，(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列，和(iii)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的融合蛋白。
在另一个方面，提供了编码含有OX40L三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(a)重链和轻链，该重链包含VH域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，该轻链包含VL域，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3，和(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽。
在又一个方面，本发明提供编码含有OX40L三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(a)能够特异性结合FAP的模块，其包含由SEQ ID NO:16的氨基酸序列组成的VH域和由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成的VL域，和(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽。
在一个特定方面，本发明提供了编码含有OX40L三聚体的抗原结合分子的分离的多核苷酸，其中该多核苷酸包含编码下述各项的序列：(i)重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，(ii)轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含SEQ IDNO:20的氨基酸序列。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在其他实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如呈信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链或双链的。
重组方法
可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生产获得本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。对于重组生产，分离一个或多个编码例如上文所述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸，并将其插入到一个或多个载体中用于进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。可以使用常规程序容易地分离这样的多核苷酸并将其测序。在本发明的一个方面，提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的载体，优选表达载体。可使用本领域技术人员熟知的方法构建包括含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子(片段)的编码序列以及适当的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如描述于Maniatis等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)中的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包括将编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即，编码区)与启动子和/或其他转录或翻译控制元件以可操作地关联的方式克隆到其中的表达盒。如本文中使用的，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸模块。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但如果存在的话，它可被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5'和3'非翻译区等不是编码区的一部分。在单个多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上，或在单独的多核苷酸构建体中，例如，在单独的(不同的)载体上可以存在两个或更多个编码区。此外，任何载体可以包含单个编码区，或者可以包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一个或多个多肽，其通过蛋白水解切割在翻译后或以共翻译方式分离成最终的蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，所述异源编码区与编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能结构域。可操作地关联是指这样一种方式：基因产物例如多肽的编码区与一个或多个调节序列相关联以使基因产物的表达在调节序列的影响或控制下进行。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则所述两个DNA片段(例如多肽编码区和与其关联的启动子)是“可操作地关联的”。因此，如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录，则启动子区与该核酸可操作地关联。启动子可以是仅在预定细胞中指导实质性DNA转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻抑物和转录终止信号，可与多核苷酸可操作地关联以指导细胞特异性转录。
本文中公开了适合的启动子和其他转录控制区。许多转录控制区是本领域中的技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子，与内含子A结合)、猿猴病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(如，例如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括衍生自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔α珠蛋白的那些转录控制区，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。另外的适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，许多翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及衍生自病毒系统的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。表达盒还可以包括诸如复制起点的其他特征、和/或诸如逆转录病毒长末端重复序列(LTR)或腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)的染色体整合元件。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌肽或信号肽的编码区相关联，所述分泌肽或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果希望分泌含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段，则编码信号序列的DNA可以位于编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，所述信号肽或分泌前导序列在起始生长蛋白质链输出穿过粗面内质网后被从成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道，脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有与多肽的N末端融合的信号肽，其被从翻译的多肽切割下来以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，使用了天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽、或该序列的功能衍生物，所述衍生物保留了指导与其可操作地相关联的多肽分泌的能力。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以替代为人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列。
编码可用于促进后续纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的DNA可以包括在编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。
在本发明的一个另外的方面，提供了包含一个或多个本发明的多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供了包含一个或多个本发明的载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可分别掺入关于核苷酸和载体的单一或组合地在本文中描述的任何特征。在一个方面，宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的(一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的，术语“宿主细胞”是指可以被工程化以产生本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞系统。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域熟知的。可以使用特定的表达载体适当地转染或转导这样的细胞，并且可以培养大量含有载体的细胞用于接种大规模发酵罐以获得足够量的用于临床应用的抗原结合分子。适合的宿主细胞包括原核微生物，如大肠杆菌，或各种真核细胞，如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等。例如，尤其是在不需要糖基化时，可以在细菌中产生多肽。表达后，可以从菌体糊分离出作为可溶性级分的多肽，并可将其进一步纯化。除了原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物是编码多肽的载体的适合克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”的导致产生具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)，和Li等人，Nat Biotech24,210-215(2006)。
用于表达(糖基化)多肽的适合宿主细胞也源自多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞结合使用尤其是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如美国专利Nos.5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978、和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于在悬液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是经SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾细胞系(例如，在Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977))中描述的293或293T细胞；仓鼠婴肾细胞(BHK)；小鼠sertoli细胞(如在Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)所述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；Buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562)；TRI细胞(如在Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中描述)；MRC 5细胞和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于适用于蛋白质产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞，在此仅列举少数，还有包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，人胚胎肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在这些系统中表达外源基因的标准技术在本领域中是已知的。可以将表达包含免疫球蛋白重链或轻链的多肽的细胞工程化，以便也表达另一个免疫球蛋白链，使得所表达的产物是具有重链和轻链两者的免疫球蛋白。
在一个方面，提供了产生本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的方法，其中所述方法包括在适于表达本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的条件下培养在本文中提供的包含编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主细胞，并从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段。
在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中，多个组分(能够与靶细胞抗原特异性结合的至少一个模块，一个多肽包含TNF配体家族成员的三个胞外域或其片段，和Fc域)在遗传上不全部彼此融合。多肽被设计成使得其组分(TNF配体家族成员的三个胞外域或其片段和其他成分如Fc域的CH2和CH3)直接地或通过接头序列彼此融合。可以根据本领域熟知的方法测定接头的组成和长度，并且可以测试其效果。本发明的抗原结合分子的不同组分之间的接头序列的实例见本文中提供的序列。如果需要的话，还可以包括另外的序列，例如内肽酶识别序列，以便组入切割位点来分离融合蛋白的各个组分。
在某些实施方案中，形成抗原结合分子的一部分的能够与靶细胞抗原特异性结合的模块(例如Fab片段)至少包含能够与抗原结合的免疫球蛋白可变区。可变区可以形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分并且自其衍生。产生多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域熟知的(参见例如Harlow和Lane,"Antibodies,a laboratory manual",ColdSpring Harbor Laboratory,1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成来构建，可以重组产生(例如，如美国专利No.4,186,567中所述)，或者可以通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合文库而获得(参见授予McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
任何动物物种的免疫球蛋白都可用于本发明。可用于本发明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠、灵长类、或人来源的。如果预期融合蛋白用于人类使用，则可以使用免疫球蛋白的嵌合形式，其中免疫球蛋白的恒定区域来自人。还可以根据本领域熟知的方法制备免疫球蛋白的人源化或完全人形式(参见例如授予Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法来实现，包括但不限于(a)将非人(例如，供体抗体)CDR移植到人(例如受体抗体)框架和具有或不具有关键框架残基(例如，对于保留良好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)保留的恒定区，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)移植到人框架和恒定区，或(c)移植整个非人可变结构域，但通过替换表面残基用类似于人的区段将其“遮盖”。人源化抗体及其制备方法综述于，例如，Almagro和Fransson,Front Biosci 13,1619-1633(2008)中，并且进一步描述于例如Riechmann等人，Nature 332,323-329(1988)；Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337、7,527,791、6,982,321、和7,087,409；Jones等人，Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison和Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods36,25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等人，Methods 36,43-60(2005)(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36,61-68(2005)和Klimka等人，Br J Cancer 83,252-260(2000)(描述用于FR改组的“导向选择”办法)。根据本发明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体和人可变区。人抗体通常描述于van Dijk和van de Winkel,Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)以及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人可变区可以形成通过杂交瘤方法制备的人单克隆抗体的一部分并且可以从其衍生(参见，例如，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人抗体和人可变区还可以通过向转基因动物施用免疫原加以制备，所述转基因动物已经被修饰以产生响应抗原攻击的完整人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见，例如，Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005)。也可以通过分离选自人衍生的噬菌体展示文库的Fv克隆可变区序列来产生人抗体和人可变区(参见，例如，Hoogenboom等人，引自Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien等人编辑，Human Press,Totowa,NJ,2001)；和McCafferty等人，Nature 348,552-554；Clackson等人，Nature 352,624-628(1991))。噬菌体通常以单链Fv(scFv)片段或Fab片段的形式展示抗体片段。
在某些方面，根据例如PCT公开WO 2012/020006(参见有关亲和力成熟的实例)或美国专利申请公开No.2004/0132066中公开的方法，将包含在本发明的抗原结合分子中的能够与靶细胞抗原特异性结合的模块(例如Fab片段)工程化，以具有增强的结合亲和力。本发明抗原结合分子与特异性抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术来测量，例如，表面等离子体共振技术(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000)))和传统结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。可使用竞争测定法鉴定与参考抗体竞争结合特定抗原的抗原结合分子。在某些实施方案中，这种竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与参考抗原结合分子结合的相同。用于抗原结合分子所结合的表位作图的详细的示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。在示例性竞争测定中，将固定抗原在包含与抗原结合的第一经标记的抗原结合分子和第二未标记的抗原结合分子的溶液中温育，测试第二未标记的抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合该抗原的能力。第二抗原结合分子可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定抗原在包含第一经标记的抗原结合分子但不包含第二未标记的抗原结合分子的溶液中温育。在允许第一抗体与抗原结合的条件下温育之后，除去过量未结合的抗体，并测量与固定抗原结合的标记物的量。如果在测试样品中与固定抗原结合的标记物的量相对于对照样品显著降低，则表明第二抗原结合分子与第一抗原结合分子竞争结合该抗原。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
可以通过本领域已知的技术如高效液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶电泳、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法等来纯化如本文中描述制备的本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子。用于纯化特定蛋白质的实际条件将部分地取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，并且对于本领域技术人员将是显而易见的。对于亲和色谱法纯化，可以使用与含有TNF配体三聚体的抗原结合分子结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，为了本发明的融合蛋白的亲和色谱法纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以基本上如实施例中描述依次使用蛋白A或G亲和色谱法和尺寸排阻色谱法分离抗原结合分子。含有TNF配体三聚体的抗原结合分子或其片段的纯度可以通过各种熟知的分析方法中的任何一种加以测定，包括凝胶电泳、高压液相色谱法等。例如，正如通过还原和非还原性SDS-PAGE证实，如通过实施例中描述表达的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子被显示为是完整且正确组装的。
测定法
可以通过本领域已知的各种测定法来鉴定、筛选或通过其物理/化学性质和/或生物活性来表征在本文中提供的抗原结合分子。
1.亲和力测定
根据实施例中提出的通过表面等离子体共振(SPR)的方法，使用标准仪器如BIAcore仪器(GE Healthcare)、以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白，可以测定在本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的TNF受体的亲和力。通过表面等离子体共振(SPR)，使用标准仪器如BIAcore仪器(GE Healthcare)、以及可以通过诸如重组表达获得的受体或靶蛋白，也可以测定含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与靶细胞抗原的亲和力。在实施例4中描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和示例性实施方案。根据一个方面，使用
Figure BDA0003489575460000741
T100仪(GE Healthcare)通过表面等离子体共振在25℃测量KD。
2.结合测定和其他测定
例如通过流式细胞术(FACS)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系，可以评价在本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的受体表达细胞的结合。在一个方面，在结合测定中使用表达TNF受体的新鲜外周血单核细胞(PBMC)。在分离后(幼稚PMBC)或刺激后(活化的PMBC)直接使用这些细胞。在另一个方面，使用活化的小鼠脾细胞(表达TNF受体分子)来证明本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子与相应的TNF受体表达细胞的结合。
在又一个方面，使用表达靶细胞抗原(例如FAP)的癌细胞系来证明抗原结合分子与靶细胞抗原的结合。
在另一个方面，可以使用竞争测定来鉴定与特异性抗体或抗原结合分子分别竞争结合靶标或TNF受体的抗原结合分子。在某些实施方案中，这种竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与特异性抗靶标抗体或特异性抗TNF受体抗体结合的相同。用于抗体所结合的表位的作图的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope MappingProtocols,”in Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中。
3.活性测定
在一个方面，提供了用于鉴定与特异性靶细胞抗原和具有生物活性的特异性TNF受体结合的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的测定法。生物活性可以包括例如通过表达靶细胞抗原的细胞上的TNF受体的激动性信号转导。还提供了通过测定法鉴定为具有这样的体外生物活性的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
在某些方面，测试了本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的这种生物活性。用于检测本发明分子的生物活性的测定法是实施例6中所述的那些。此外，用于检测细胞裂解的测定法(例如通过测量LDH释放)、诱导的凋亡动力学(例如通过测量半胱天冬酶3/7活性)或凋亡(例如使用TUNEL测定)是本领域熟知的。另外，可以通过评估复合物对各种淋巴细胞亚群如NK细胞、NKT细胞或γδT细胞的存活、增殖和淋巴因子分泌的影响，或评估其调节抗原呈递细胞如树突细胞、单核细胞/巨噬细胞或B细胞的表型和功能的能力来评估此类复合物的生物活性。
药物组合物、制剂和给药途径
在又一个方面，本发明提供了包含本文中提供的任一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的药物组合物，以供例如在任何下列治疗方法中使用。在一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，药物组合物包含本文中提供的任一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种另外的例如如下文所述的治疗剂。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种溶解或分散在药学上可接受的赋形剂中的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。短语“药学的或药学上可接受的”是指在采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒的分子实体和组合物，即在适当施用于动物时例如人时不产生不利的、过敏的或其他不良的反应。根据本公开内容，包含至少一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和任选地另外的活性成分的药物组合物的制备将是本领域技术人员已知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences第18版，Mack PrintingCompany,1990所例示，通过提述将其并入本文。具体地说，组合物是冻干制剂或水溶液。如本文中使用的，正如本领域普通技术人员已知，“药学上可接受的赋形剂”包括溶剂、缓冲剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、盐、稳定剂中任一种和全部及其组合。
肠胃外组合物包括通过注射给药而设计的那些，例如皮下、皮内、病灶内、静脉内、动脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射。为了注射，可以将本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子配制在水溶液中，优选在生理学相容的缓冲液如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中。溶液可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，融合蛋白在使用前可处于粉末形式以与适合的载体(例如无菌无热原水)组构。根据需要，通过将在适当溶剂中的本发明融合蛋白以所要求的量并入下文列举的多种其他成分中来制备无菌注射溶液。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和/或其他成分。在用于制备无菌注射溶液，悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，从而产生来自其先前无菌过滤的液体介质的活性成分加上任何其他期望的成分的粉末。必要时应该适当缓冲该液体介质并且在注射之前首先用足够盐水或葡萄糖使液体稀释剂变得等张。在制造和储存条件下该组合物必须是稳定的，并且保持对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。应当理解，内毒素污染应该最低限度地保持在安全水平，例如低于0.5ng/mg蛋白质。适合的药学上可接受的赋形剂包括但不限于：诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其他有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖类、二糖类、和其他碳水化合物类，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬液可含有增加该悬液粘度的化合物，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇、或葡聚糖等。任选地，悬液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的药剂。另外，这些活性化合物的悬液可制备为适当的油性注射悬液。适合的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油)、合成脂肪酸酯(如ethyl cleats或甘油三酯)、或脂质体。
可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合将活性成分包埋在制备的微胶囊中，例如分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或在粗乳液中的羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。这样的技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适合实例包括含有该多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成形物品的形式，例如薄膜、或微胶囊。在特定实施方案中，通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂酸铝、明胶或其组合，可延长注射组合物的吸收。
本文中的示例性药学上可接受的赋形剂还包括诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)的间质药物分散剂，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(
Figure BDA0003489575460000771
Baxter International,Inc.)。在美国专利公开No.2005/0260186和2006/0104968中描述了包括rHuPH20的某些示例性的sHASEGP和使用方法。在一个方面，将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。
示例性的冻干抗体配制剂描述于美国专利No.6,267,958中。水性抗体配制剂包括美国专利No.6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，后一种配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲液。
除前述组合物之外，融合蛋白还可配制为贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给予。因此，例如，融合蛋白可以用适合的聚合材料或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制为微溶的衍生物，例如微溶盐。
包含本发明融合蛋白的药物组合物可以通过常规的混合、溶解、乳化、包封、包埋或冻干过程进行制造。可以使用有利于将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制药物组合物。适当的配制剂取决于所选择的给药途径。
可以将含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子配制成游离酸或碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐是基本保留游离酸或碱的生物活性的盐。这些盐包括酸加成盐，例如由蛋白质组合物的游离氨基形成的或与无机酸例如盐酸或磷酸形成的那些，或与诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸的有机酸形成的那些。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；或诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因的有机碱。与相应的游离碱形式相比，药物盐在水性溶剂和其他质子溶剂中的溶解度更高。
在被治疗的特殊适应症需要时，本文中的组合物还可含有一种以上的活性成分，优选地，所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。这样的活性成分以对预期目的有效的量适当地组合存在。
用于体内给药的制剂通常是无菌的。可以例如通过无菌过滤膜进行过滤而容易地实现无菌性。
治疗方法和组合物
本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子均可在治疗方法中使用。
为了在治疗方法中使用，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体紊乱、被治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、紊乱的原因、药剂的递送部位、给药方法、给药方案、以及执业医师已知的其他因素。
在一个方面，提供了用作药剂的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在另外的方面，提供了在治疗疾病中使用尤其是在癌症治疗中使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面，提供了在治疗方法中使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个方面，本发明提供了用于治疗有需要的个体中的疾病的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面，本发明提供了在治疗患有疾病的个体的方法中使用的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，所述方法包括向个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些方面，待治疗的疾病是癌症。癌症的实例包括实体瘤、膀胱癌、肾细胞癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、肾癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。因此，提供了在癌症治疗中使用的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。需要治疗的受试者、患者或“个体”通常是哺乳动物，更具体地说是人。
在另一个方面，提供了用于治疗感染性疾病尤其是治疗病毒感染的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在又一个方面，提供了用于治疗自身免疫病例如狼疮病的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
在一个方面，提供了根据本发明的用于治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、乳腺癌、结肠直肠癌(CRC)、胰腺癌(PAC)、胃癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和间皮瘤的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中靶细胞抗原为FAP。
在又一个方面，本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗有需要的个体中的疾病的药剂中的用途。在一个方面，所述药剂用于在治疗疾病的方法中使用，所述方法包括向患有疾病的个体施用治疗有效量的药剂。在某些实施方案中，待治疗的疾病是增殖性紊乱，具体地是癌症。因此，在一个方面，本发明涉及本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗癌症的药剂中的用途。癌症的实例包括实体瘤、膀胱癌、肾细胞癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、食道癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、骨癌、肾癌、黑素瘤、B细胞淋巴瘤、B细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病。可以使用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进行治疗的其他细胞增殖紊乱包括但不限于位于腹部、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼、头颈部、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、盆腔、皮肤、软组织、脾脏、胸部、和泌尿生殖系统的肿瘤。还包括癌前状态或病变和癌症转移。在某些实施方案中，癌症选自肾细胞癌、皮肤癌、肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌、头颈癌。技术人员可以认识到，在一些情况下，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可能不能提供治愈，而可能仅提供部分益处。在一些方面，具有一些益处的生理变化也被认为是治疗有益的。因此，在一些方面，提供生理变化的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的量被认为是“有效量”或“治疗有效量”。
在又一个方面，本发明涉及如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗感染性疾病尤其是治疗病毒感染或治疗自身免疫病例如狼疮病的药剂中的用途。
在又一个方面，本发明提供了治疗个体中的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个方面，向所述个体施用呈药学上可接受的形式的包含本发明融合蛋白的组合物。在某些方面，待治疗的疾病是增殖性紊乱。在一个特定方面，该疾病是癌症。在另一个方面，该疾病是感染性疾病或自身免疫病。在某些方面，该方法进一步包括向个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，如果待治疗的疾病是癌症，则为抗癌剂。根据任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物，优选人。
为了预防或治疗疾病，本发明的含有TNF家族配体三聚体抗原结合分子的适当剂量(当单独使用或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时)将取决于待治疗疾病的类型、给药途径、患者的体重、融合蛋白的类型、疾病的严重程度和病程、给予融合蛋白是用于预防还是治疗目的、先前或同时的治疗干预、患者的临床病史、和对融合蛋白的反应、和主治医师的决定。在任何情况下，负责给药的医师将决定组合物中活性成分的浓度和个体受试者的适当剂量。本文中考虑到各种给药方案，包括但不限于在各个时间点上的单次或多次给药、推注给药和脉冲输注。
一次性地或以一系列治疗的方式适当地向患者施用含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以是向患者施用的初始候选剂量，例如无论是通过一次或多次分开给药，还是通过连续输注。取决于上面提到的因素，一个典型的日剂量可能在约1μg/kg至100mg/kg或更高的范围内。对于数天或更长时间的反复给药，根据病情，治疗通常将持续到出现期望的疾病症状的抑制时为止。融合蛋白的一个示例性剂量将在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围内。在其他实例中，剂量还可以包含每次给药从约1μg/kg体重、约5μg/kg体重、约10μg/kg体重、约50μg/kg体重、约100μg/kg体重、约200μg/kg体重、约350μg/kg体重、约500μg/kg体重、约1mg/kg体重、约5mg/kg体重、约10mg/kg体重、约50mg/kg体重、约100mg/kg体重、约200mg/kg体重、约350mg/kg体重、约500mg/kg体重、至约1000mg/kg体重或更多，以及其中可推导的任何范围。在本文中所列数字的可推导范围的实例中，可以基于上述数字以约5mg/kg体重至约100mg/kg体重、约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等范围进行施用。因此，可向患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一个或多个剂量。这样的剂量可以间歇施用，例如，每周或每三周一次(例如使得患者接受约2个至约20个，或例如约6个剂量的融合蛋白)。可以施用初始较高的负荷剂量，然后施用一个或多个较低的剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定法易于监测这种疗法的进展。
通常以有效实现预期目的的量使用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。为了用于治疗或预防疾病状况，以治疗有效量施用或应用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其药物组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是在根据本文中提供的详细公开内容的情况下。
对于全身给药，可以根据体外测定法(例如细胞培养物测定法)初步估计治疗有效剂量。然后可以在动物模型中配制剂量以达到包括在细胞培养中确定的IC50在内的循环浓度范围。这类信息可以用来更精确地确定用于人的剂量。
也可以使用本领域熟知的技术根据体内数据(例如，动物模型)估计初始剂量。根据动物数据，本领域普通技术人员可以容易地优化对人的给药。
可以单独调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的血浆水平。通常注射给药的患者剂量通常为约0.1至50mg/kg/天，一般为约0.5至1mg/kg/天。可以通过每天施用多个剂量来实现治疗有效的血浆水平。可以例如通过HPLC测量血浆中的水平。
在局部给药或选择性吸收的情况下，含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员将能够优化治疗有效的局部剂量而无需过度实验。
本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的治疗有效剂量通常将提供治疗益处而不引起实质性毒性。可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定融合蛋白的毒性和治疗效果。可使用细胞培养物测定法和动物研究来确定LD50(对群体的50％致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，它可以被表示为比率LD50/ED50。表现出较大治疗指数的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是优选的。在一个实施方案中，根据本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子表现出高治疗指数。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制适合于在人类中使用的剂量范围中加以使用。剂量优选地处在循环浓度范围内，其包括具有很小或没有毒性的ED50。取决于多种因素，例如采用的剂型、所用给药途径、受试者的状况等，剂量可以在这个范围内变化。考虑到患者的状况，个体医师可以选择确切的配方、给药途径和剂量(参见，例如Fingl等人，1975,in:The Pharmacological Basis ofTherapeutics,Ch.1,p.1，通过提述将其完整并入本文)。
用本发明的融合蛋白治疗患者的主治医师知道如何并且何时由于毒性、器官功能障碍等而终止、中断或调整给药。相反，如果临床反应不足(排除毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高水平。在感兴趣紊乱的管理中，施用剂量的大小将随着待治疗病症的严重程度、给药途径等而变化。可以例如部分地通过标准预后评价方法来评价病症的严重程度。此外，剂量和剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。
其他药剂和治疗
本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以在治疗中与一种或多种其他药剂联合给药。例如，本发明融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共同给药。术语“治疗剂”涵盖可用于治疗需要这种治疗的个体中的症状或疾病的任何药剂。这种另外的治疗剂可包含任何适合于被治疗的特定适应症的任何活性成分，优选地，所述活性成分具有彼此无不良影响的互补活性。在某些实施方案中，另外的治疗剂是另一种抗癌剂。
此类其他药剂以对预期目的有效的量适当地组合存在。此类其他药剂的有效量取决于所使用的融合蛋白的量、紊乱或治疗的类型、以及以上讨论的其他因素。通常以与本文中所述相同的剂量和给药途径，或本文中所述剂量的约1％至99％，或以在经验/临床上确定为适当的任何剂量并通过任何途径使用含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
上述此类联合疗法涵盖联合给药(其中两种或更多种治疗剂包括在同一个或分开的组合物中)和分开给药，在分开给药的情况下，本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的给药可以发生在给予另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后。
制品
在本发明的另一个方面，提供了含有用于治疗、预防和/或诊断上述紊乱的物质的物品。制品包括容器和标签或在容器上或与容器相关联的包装说明书。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。可以由各种材料如玻璃或塑料形成容器。容器容纳组合物本身或连同另一种有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中至少一种活性剂是本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子。
标签或包装说明书指示该组合物用于治疗选择的病症。而且，制品可以包括(a)其中含有组合物的第一容器，其中该组合物包含本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子；和(b)其中含有组合物的第二容器，其中该组合物包含另外的细胞毒性治疗剂或其他治疗剂。在本发明的这个实施方案中的制品可以进一步包括指示组合物可用于治疗特定病症的包装说明书。
替代地或另外，制品可以进一步包括第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它还可以包括立足于商业和用户立场所需的其他物品，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
表C(序列)：
Figure BDA0003489575460000831
Figure BDA0003489575460000841
Figure BDA0003489575460000851
Figure BDA0003489575460000861
Figure BDA0003489575460000871
Figure BDA0003489575460000881
Figure BDA0003489575460000891
Figure BDA0003489575460000901
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Figure BDA0003489575460000921
Figure BDA0003489575460000931
下面列出本发明的具体实施方案：
·一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，任选通过肽接头，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
·该含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域，其中该包含三个通过肽接头彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽融合至该Fc域的两个亚基之一的N或C端氨基酸，任选经由肽接头。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员共刺激人T细胞活化。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员是4-1BBL。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:99，SEQ ID NO:100，SEQ ID NO:101和SEQ ID NO:102的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:99的氨基酸序列。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，和
(b)包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103的氨基酸序列的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，和
(b)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员是OX40L。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该TNF配体家族成员的胞外域包含选自SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，和
(b)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在C端氨基酸处融合至该Fc域的亚基之一的N端氨基酸。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该包含三个TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽在N端氨基酸处融合至该Fc域的亚基之一的C端氨基酸。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合靶细胞抗原的模块选自抗体片段，Fab分子，交换Fab分子，单链Fab分子，Fv分子，scFv分子，单域抗体，VH和支架抗原结合蛋白。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合靶细胞抗原的模块是能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该靶细胞抗原选自成纤维细胞激活蛋白(FAP)，黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，表皮生长因子受体(EGFR)，癌胚抗原(CEA)，CD19，CD20和CD33。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该靶细胞抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合FAP的模块包含VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合FAP的模块包含VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:108的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列的CDR-L3。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合FAP的模块包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的可变重链和包含SEQID NO:17的氨基酸序列的可变轻链，或其中该能够特异性结合FAP的模块包含包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的可变轻链。
·权利要求1至15任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该靶细胞抗原是CEA。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合CEA的模块包含VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:112的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQID NO:116的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:117的氨基酸序列的CDR-L3。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合CEA的模块包含包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的可变轻链。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该靶细胞抗原是CD19。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合CD19的模块包含
(a)VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:123的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:124的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDR-L3，或
(b)VH域和VL域，该VH域包含(i)包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的CDR-H1，(ii)包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的CDR-H2和(iii)包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的CDR-H3，该VL域包含(iv)包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列的CDR-L1，(v)包含SEQ ID NO:132的氨基酸序列的CDR-L2和(vi)包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列的CDR-L3。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该能够特异性结合CD19的模块包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的可变轻链，或其中该能够特异性结合FAP的模块包含包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的可变轻链。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该Fc域是IgG，特别是IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该Fc域是IgG1 Fc域且包含在IgG重链的位置234和235(EU编号方式)和/或329(EU编号方式)处的氨基酸替代。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域，
(ii)轻链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VL域，和
(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH域，
(ii)轻链，其包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL域或包含SEQ ID NO:111的氨基酸序列的VL域，和
(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH域，
(ii)轻链，其包含包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL域，和
(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH域，
(ii)轻链，其包含包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的VL域或包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列的VL域，和
(iii)第二重链，其包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含两个能够特异性结合靶细胞抗原的模块。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域，
(ii)两条轻链，各自包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VL域，和
(iii)第二重链，其包含能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子的VH域和SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH域，
(ii)两条轻链，各自包含包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL域或包含SEQ IDNO:111的氨基酸序列的VL域，和
(iii)第二重链，其包含包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH域或包含SEQ IDNO:110的氨基酸序列的VH域和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH域，
(ii)两条轻链，各自包含包含SEQ ID NO:119的氨基酸序列的VL域，和
(iii)第二重链，其包含包含SEQ ID NO:118的氨基酸序列的VH域和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
·如上文中定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)第一重链，其包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH域或包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列的VH域，
(ii)两条轻链，其包含包含SEQ ID NO:127的氨基酸序列的VL域或包含SEQ IDNO:135的氨基酸序列的VL域，和
(iii)第二重链，其包含包含SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH域或包含SEQ IDNO:134的氨基酸序列的VH域和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:103或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)重链和轻链，二者构成能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，和
(b)融合蛋白，其包含Fc域和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)重链和轻链，二者构成能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，和
(b)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和
(iii)多肽，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)重链和轻链，二者构成能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，和
(b)融合蛋白，其包含Fc域和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的多肽。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(a)重链和轻链，二者构成能够特异性结合靶细胞抗原的Fab分子，和
(b)融合蛋白，其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该抗原结合分子包含
(i)可变重链，其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，
(ii)可变轻链，其包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，和
(iii)多肽，其包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
·一种分离的多核苷酸，其编码如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
·一种载体，特别是表达载体，其包含如前文描述的分离的多核苷酸。
·一种宿主细胞，其包含如前文描述的分离的多核苷酸或如前文描述的载体。
·一种用于生成如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法，其包括以下步骤：
(i)在适合于表达该抗原结合分子的条件下培养如前文描述的宿主细胞，并
(ii)回收该抗原结合分子。
·一种药物组合物，其包含如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，或如前文描述的药物组合物，其作为药物使用。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，或如前文描述的药物组合物，其在治疗癌症中使用。
·如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子制造用于治疗癌症的药物的用途。
·一种在个体中治疗疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的药学上可接受形式的包含如前文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的组合物。
·如前文描述的治疗疾病的方法，其中所述疾病是癌症。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，根据上面提供的一般描述，可以实践各种其他实施方案。
重组DNA技术
使用标准方法操作DNA，如Sambrook等人在Molecular cloning:A laboratorymanual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。按照制造商的说明使用分子生物试剂。关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息见：Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Ed.,NIH公开No 91-3242。
DNA测序
通过双链测序确定DNA序列。
基因合成
使用适当的模板通过PCR生成或由Geneart AG(Regensburg,Germany)从合成的寡核苷酸和PCR产物通过自动基因合成来合成期望的基因区段。在没有可用的确切基因序列的情况下，基于来自最近同源物的序列设计寡核苷酸引物，并且通过RT-PCR从源自适当组织的RNA分离基因。将侧翼为单个限制性核酸内切酶切割位点的基因区段克隆到标准克隆/测序载体中。从转化的细菌中纯化质粒DNA，并通过紫外光谱法测定浓度。通过DNA测序证实亚克隆基因片段的DNA序列。设计具有适合的限制性位点的基因区段，以允许亚克隆到对应的表达载体中。所有构建体均被设计为具有编码前导肽的5'端DNA序列，所述前导肽靶向在真核细胞中分泌的蛋白质。
细胞培养技术
使用如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(eds.),John Wiley&Sons,Inc.中所述的标准细胞培养技术。
蛋白质纯化
参考标准方案，从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白质。简言之，将抗体施加到蛋白A琼脂糖凝胶柱(GE Healthcare)上并用PBS洗涤。在pH 2.8实现抗体的洗脱，然后立即中和样品。通过尺寸排阻色谱法(Superdex 200,GE Healthcare)在PBS或在20mM组氨酸、150mM NaCl(pH 6.0)中从单体抗体分离聚集的蛋白质。合并单体抗体级分，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩机进行浓缩(如果需要的话)，在-20℃或-80℃冷冻并储存。提供部分样品用于随后例如通过SDS-PAGE、尺寸排阻色谱法(SEC)或质谱法进行蛋白质分析和分析表征。
SDS-PAGE
根据制造商的说明使用
Figure BDA0003489575460001021
Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen)。具体地说，使用10％或4-12％的
Figure BDA0003489575460001022
Bis-TRIS Pre-Cast凝胶(pH 6.4)和
Figure BDA0003489575460001023
MES(还原凝胶，具有
Figure BDA0003489575460001024
抗氧化剂运行缓冲液添加剂)或MOPS(非还原凝胶)运行缓冲液。
分析尺寸排阻色谱法
通过HPLC色谱法进行尺寸排阻色谱法(SEC)，用于测定抗体的聚集和寡聚状态。简言之，将蛋白A纯化的抗体施加到在Agilent HPLC 1100系统上的300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4(pH 7.5)中的Tosoh TSKgel G3000SW柱上，或者在Dionex HPLC系统上的2 x PBS中的Superdex 200柱(GE Healthcare)上。通过UV吸光度和峰面积的积分将洗脱的蛋白质定量。以BioRad凝胶过滤标准151-1901作为标准。
质谱法
本节描述了具有VH/VL交换(VH/VL CrossMabs)的多特异性抗体的表征，重点在于它们的正确装配。通过去糖基化的完整CrossMabs和去糖基化的/纤溶酶消化的或替代地去糖基化的/限制性LysC消化的CrossMabs的电喷雾电离质谱法(ESI-MS)分析预期的一级结构。
在37℃下以1mg/ml的蛋白质浓度将VH/VL CrossMabs用磷酸盐或Tris缓冲液中的N-糖苷酶F进行去糖基化达17个小时。用Tris缓冲液(pH 8)中的100μg去糖基化的VH/VLCrossMabs，分别在室温下进行120小时和在37℃下进行40分钟的纤溶酶或限制性LysC(Roche)消化。在进行质谱分析之前，将样品通过HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在装备有TriVersa NanoMate来源(Advion)的maXis 4G UHR-QTOF MS系统(BrukerDaltonik)上，通过ESI-MS测定总质量。
实施例1
靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备和纯化
1.1单价的FAP(28H1)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1)
根据UniProt登录号P41273(SEQ ID NO:43)，合成了编码人4-1BB配体的胞外结构域部分(氨基酸71-254或71-248)的DNA序列。
克隆了包含各自被(G4S)2接头分开的4-1BB配体的三个胞外结构域的多肽(SEQID NO:54)，如图1A中描述：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
使用具有SEQ ID NO:57的接头(GSPGSSSSGS)，将编码单链三聚体4-1BB配体的多肽与节上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant,Zhu等人，1998)。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆28H1)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴(Carter,2001)的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。FAP结合剂的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2中，通过提述将其并入本文。
根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831 A1中描述的方法，将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的单链配体-Fc节链与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括单链4-1BB配体三聚体和结合FAP的Fab(图3A)。
表1分别显示了FAP(28H1)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表1：FAP(28H1)靶向的含有人4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子(FAP单链4-1BBL三聚体)的序列(化合物S1)
Figure BDA0003489575460001041
Figure BDA0003489575460001051
Figure BDA0003489575460001061
Figure BDA0003489575460001071
Figure BDA0003489575460001081
Figure BDA0003489575460001091
Figure BDA0003489575460001101
将靶向的含有单链TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生靶向的含有单链4-1BBL的Fc(kih)融合抗原结合分子。用1:1:1比率(“载体节链”:“载体穴链”:“载体轻链”)的相应表达载体转染细胞。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，细胞在210x g下离心5分钟，并将上清液替换为预热的CD CHO培养基。将表达载体在20mL CD CHO培养基中混合至DNA最终量为200μg。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL的F17培养基，将细胞培养24小时。转染后1天，加入1mM丙戊酸和7％的含有补充剂的补料。培养7天后，通过在210x g下离心15分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5mL,GE Healthcare)上，并且用含有20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、0.01％(v/v)Tween-20的缓冲液(pH 7.5)加以平衡。通过用至少10个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。用20个以上柱体积到100％的含有20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的缓冲液(pH 2.5)，利用线性pH梯度洗脱结合的蛋白质。然后将柱用10个柱体积的20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、0.01％(v/v)吐温20缓冲液(pH 2.5)洗涤。
通过加入1/40(v/v)的2M Tris(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、150mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温/20的溶液(pH6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用CoomassieSimpleBlueTM SafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过SDS-PAGE来分析靶向的含有TNF配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mMNaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析样品的聚集物含量。
表2总结了FAP靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。
表2：FAP靶向的含有4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的产生的总结
Figure BDA0003489575460001111
Figure BDA0003489575460001121
1.2二价的FAP(4B9)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S2)
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254或71-248，根据P41273合成)的三个胞外结构域的多肽与人IgG1 Fc节链的C末端进行框内亚克隆(Merchant,Zhu等人，1998)，如图28A描绘：人IgG1 Fc节、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节、或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。FAP结合剂的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2中，通过提述将其并入本文。
已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合，如WO 2012/130831 A1中描述。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗FAP huIgG1穴链、含有S354C/T366W突变的抗FAP huIgG1节三聚体配体链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合FAP的Fab(图28B)。
表3分别显示了二价的FAP靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表3：二价的FAP(4B9)靶向的含有单链4-1BBL(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S2)的序列
Figure BDA0003489575460001122
Figure BDA0003489575460001131
Figure BDA0003489575460001141
Figure BDA0003489575460001151
Figure BDA0003489575460001161
Figure BDA0003489575460001171
Figure BDA0003489575460001181
Figure BDA0003489575460001191
Figure BDA0003489575460001201
1.3单价的FAP(4B9)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S3)
将含有被(G4S)2接头分开的4-1BB配体(71-254或71-248，根据P41273合成)的三个胞外结构域的多肽亚克隆，如图1A描绘：人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体、(G4S)2接头、人4-1BB配体。
使用具有SEQ ID NO:57的接头(GSPGSSSSGS)，将编码单链三聚体4-1BB配体的多肽与节上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant,Zhu等人，1998)。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)(克隆4B9)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节、或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。FAP结合剂的生成和制备描述于WO 2012/020006 A2中，通过提述将其并入本文。
已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合，如WO 2012/130831 A1中描述。
含有S354C/T366W突变的单链配体-Fc节链与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的组合允许产生异二聚体，其包括单链4-1BB配体三聚体和结合FAP的Fab(图3A)。
表4分别显示了单价的FAP(4B9)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表4：单价的FAP(4B9)靶向的含有单链4-1BBL(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S3)的序列
Figure BDA0003489575460001202
Figure BDA0003489575460001211
1.4二价的CEA靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S4)
如1.2中所述制备二价的FAP(4B9)靶向的构建体分子，唯一的区别是抗FAP结合剂被抗CEA结合剂代替。
将编码对癌胚抗原CEA(克隆sm9b)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。由Graff等人2004年在2005/0147614中以及在WO 2014/004694 A1中进一步描述了克隆sm9b，通过提述将这些文献并入本文。
已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合，如WO 2012/130831 A1中描述。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CEA huIgG1穴链、含有S354C/T366W突变的抗CEA huIgG1节三聚体配体链和抗CEA轻链的组合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CEA的Fab(图28B)。
表5分别显示了二价的CEA(sm9b)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表5：二价的CEA(sm9b)靶向的含有单链4-1BBL(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S4)的序列
Figure BDA0003489575460001212
Figure BDA0003489575460001221
Figure BDA0003489575460001231
Figure BDA0003489575460001241
Figure BDA0003489575460001251
Figure BDA0003489575460001261
Figure BDA0003489575460001271
Figure BDA0003489575460001281
Figure BDA0003489575460001291
1.5单价的CEA(sm9b)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S5)
如1.3中所述制备单价的FAP靶向的构建体分子，唯一的区别是抗FAP结合剂被抗CEA结合剂代替。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(CEA)(克隆sm9b)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴(Carter,2001)的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CEA huIgG1穴链、含有S354C/T366W突变的单链配体huIgG1节链和抗CEA轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和一个结合CEA的Fab(图2A)。
表6分别显示了单价的CEA(sm9b)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表6：单价的CEA(sm9b)靶向的含有单链4-1BBL(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S5)的序列
SEQ ID NO: 描述 序列
143 抗CEA(sm9b)Fc穴链的核苷酸序列 参见表5
66 三聚体hu 4-1BBL(71-254)-Fc节链的核苷酸序列 参见表1
145 抗CEA(sm9b)轻链的核苷酸序列 参见表5
146 抗CEA(sm9b)Fc穴链 参见表5
15 三聚体hu 4-1BBL(71-254)Fc节链 参见表1
148 抗CEA(sm9b)轻链 参见表5
1.6二价的CD19靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S6和S7)如1.2中所述制备二价的FAP(4B9)靶向的构建体分子，唯一的区别是抗FAP结合剂被抗CD19结合剂代替。在实施例1.8中描述了CD19克隆的生成。
将编码对CD19特异的结合剂的重链和轻链DNA序列(即,克隆8B8-018和8B8-2B11)的可变区与穴的恒定重链、节或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CD19 hu IgG1穴链、含有S354C/T366W突变的抗CD19 hu IgG1节三聚体配体链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和两个结合CD19的Fab(图28B)。将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合，如WO 2012/130831A1中描述。
表7分别显示了二价的CD19(8B8-018)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表7：二价的CD19(8B8-018)靶向的含有单链4-1BBL(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S6)的序列
Figure BDA0003489575460001301
Figure BDA0003489575460001311
Figure BDA0003489575460001321
Figure BDA0003489575460001331
Figure BDA0003489575460001341
Figure BDA0003489575460001351
Figure BDA0003489575460001361
Figure BDA0003489575460001371
表8分别显示了二价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表8：二价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有单链4-1BBL(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S7)的序列
Figure BDA0003489575460001372
Figure BDA0003489575460001381
Figure BDA0003489575460001391
Figure BDA0003489575460001401
Figure BDA0003489575460001411
Figure BDA0003489575460001421
Figure BDA0003489575460001431
Figure BDA0003489575460001441
Figure BDA0003489575460001451
1.7单价的CD19靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S8和S9)
如1.3中所述制备单价的FAP靶向的构建体分子，唯一的区别是抗FAP结合剂被抗CD19结合剂代替。
将编码对CD19特异的结合剂的重链和轻链DNA序列(即,克隆8B8-018或8B8-2B11)的可变区与穴(Carter,2001)的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的抗CD19 hu IgG1穴链、含有S354C/T366W突变的单链配体hu IgG1节链和抗CD19轻链的结合允许产生异二聚体，其包括组装的三聚体的4-1BB配体和一个结合CD19的Fab(图2A)。
表9分别显示了单价的CD19(8B8-018)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表9：单价的CD19(8B8-018)靶向的含有单链4-1BBL(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S8)的序列
Figure BDA0003489575460001452
Figure BDA0003489575460001461
表10分别显示了单价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表10：单价的CD19(8B8-2B11)靶向的含有单链4-1BBL(71-254)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S9)的序列
SEQ ID NO: 描述 序列
155 抗CD19(8B8-2B11)Fc穴链的核苷酸序列 参见表8
66 三聚体hu 4-1BBL(71-254)-Fc节链的核苷酸序列 参见表1
157 抗CD19(8B8-2B11)轻链的核苷酸序列 参见表8
158 抗CD19(8B8-2B11)Fc穴链 参见表8
15 三聚体hu 4-1BBL(71-254)Fc节链 参见表1
160 抗CD19(8B8-2B11)轻链 参见表8
1.8抗CD19结合剂8B8-018和8B8-2B11的生成
1.8.1抗CD19克隆8B8-018的生成
a)小鼠抗人CD19抗体(杂交瘤)的免疫和生成
将Balb/c小鼠免疫6次，并用CD19转染的HEK293细胞(平均受体密度为每细胞35,000)加强。利用人CD19转染的NIH-3T3细胞上的CD19细胞ELISA，通过检测血清样品来监测免疫应答。使用具有足够的抗人CD19抗体滴度的小鼠的脾细胞通过与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63 Ag8.653融合进行永生化。进行三次融合，通过对人CD19转染的NIH-3T3细胞进行细胞ELISA并且使用Daudi(CD19+)和CD19-细胞进行FACS结合测定来筛选杂交瘤上清液的抗人CD19特异性抗体(参见WO 2011/147834的实施例1)。
b)杂交瘤筛选和抗CD19抗体的细胞生物学功能评价
应用细胞ELISA筛选杂交瘤，并鉴定分泌抗人CD19抗体的杂交瘤。使用人CD19转染的NIH3T3细胞作为阳性细胞；使用未转染的NIH3T3细胞作为阴性对照细胞。为了评估阳性杂交瘤，将转染和未转染的NIH3T3细胞之间的OD比值进行定量。
培养基：DMEM高糖型(4.5mg/ml)、10％FCS、丙酮酸钠、NEAA、谷氨酰胺
抗体阳性对照：抗CD19单克隆抗体(IgG1)Pharmingen目录号555409 c＝1mg/ml
检测抗体：山羊抗小鼠IgG(H+L)HRP缀合物Bio-Rad目录号170-06516
稀释度1：在1x ELISA封闭剂中2000倍
其他试剂：纤连蛋白Roche目录号838039 c＝1mg/ml
戊二醛：25％原液//Grade Agar Scientific#R102终浓度：PBS中0.05％
ELISA封闭剂：10x原液//Roche目录号1112589
TMB底物：Roche目录号11432559
终止液：1M H2SO4
BioRad目录号170-6516稀释度1：在1x ELISA封闭剂中2000倍
第1天：
纤连蛋白包被：PBS中5μg/cm2；96孔板＝32cm2；160μg/板6ml
PBS，50μl/孔
在室温下温育45分钟，吸出包被溶液
以1.25x104个细胞/孔接种于96孔板中的50μl培养液中
在37℃下温育40小时
向板的上半部加入：表达CD19的NIH3T3细胞
向板的下半部加入：未转染的NIH3T3细胞
第3天：
在50μl培养基中加入阳性对照抗体或样品(上清液或小鼠血清)
在4℃下温育2小时
除去培养基，用100μl戊二醛(在PBS中，0.05％)固定细胞
用200μl PBS洗涤两次
加入检测抗体1:2000，50μl/孔
在室温下温育2小时
用200μl PBS洗涤三次
加入50μl TMB，在室温下温育30分钟，
通过加入25μl 1M H2SO4进行终止；读取在450 nm/620 nm处的消光
结果计算：NIH3T3 CD19的OD:未转染NIH3T3的OD的比值
与未转染的NIH3T3细胞相比，选择的抗体显示出与CD19转染的NIH3T3细胞特异性结合(参见WO 2011/147834的实施例2)。
c)抗CD19抗体的人源化
将鼠抗体的CD19结合特异性转移到人接纳体框架上以消除由于被人体识别为外来物的序列段引起的潜在免疫原性问题。这是通过将鼠(供体)抗体的整个互补决定区(CDR)移植到人(接纳体)抗体框架上完成的，称为CDR移植或抗体人源化。
将鼠氨基酸序列与人种系抗体V基因的集合进行比对，并根据序列同一性和同源性进行分选。在选择一个特定的接纳体序列之前，必须确定供体抗体的所谓规范环结构(Morea,V.等人，Methods,Vol 20,Issue 3(2000)267-279)。通过存在于所谓的规范位置处的残基的类型来确定这些规范环结构。这些位置位于(部分地)CDR区之外，并且必须在最终构建体中保持功能等效性，以便保留亲本(供体)抗体的CDR构象。选择人种系序列VBASE_VH1_1作为重链的接纳体，并且选择序列VBASE_VK2_5作为轻链的接纳体。
发现野生型人源化抗人CD19抗体8B8在HVR-L1中具有三个脱酰胺热点：NSNGNT(SEQ ID NO:161)。另外发现HVR-H2中存在另一个脱酰胺热点：KFNG(SEQ ID NO:162)。为了处理HVR-H2中的脱酰胺热点，在位置64(根据Kabat编号)处引入了N(Asn)到Q(Gln)点突变。为了处理轻链中的脱酰胺热点并获得具有改进的脱酰胺稳定性的人源化抗人CD19抗体，在位置27e处(根据Kabat编号)引入了从S(丝氨酸)到P(脯氨酸)的单个突变。因此，生成具有如下表18所示的CDR的克隆8B8-018。
表11：8B8-018与人源化野生型CD19抗体8B8的比较
Figure BDA0003489575460001481
另外，8B8-018保持对食蟹猴CD19的交叉反应性，如下表12所示。
Figure BDA0003489575460001482
Figure BDA0003489575460001491
1.8.2用于噬菌体展示活动的CD19抗原Fc融合物的制备、纯化和表征
为了以单体状态(人CD19参见SEQ ID NO:32)表达和纯化人和食蟹猴CD19胞外结构域，将各个DNA片段与包含“节”突变的人IgG1 Fc基因区段融合(人：SEQ ID NO:163；食蟹猴：SEQ ID NO:165)，并用“Fc穴”(SEQ ID NO:76)对应物进行转染(Merchant等人，1998)。在抗原胞外结构域和Fc节链之间引入IgA切割位点(PTPPTP)。在抗原Fc节链的C末端引入用于定向生物素化的Avi标签，并出于纯化目的将突变H435R和Y436F引入Fc穴中(JendebergL.等人，J.Immunological methods,1997)。含有S354C/T366W突变的抗原-Fc节链(人：SEQID NO:164；食蟹猴：SEQ ID NO:166)与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链(SEQID NO:80)的组合允许产生包括CD19胞外结构域的单拷贝的异二聚体Fc融合片段(类似于图3C中的4-1BB构建体)。表13列出了抗原Fc融合构建体的cDNA和氨基酸序列。
表13：单体的人和食蟹猴CD19抗原Fc(kih)融合分子的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003489575460001492
Figure BDA0003489575460001501
Figure BDA0003489575460001511
Figure BDA0003489575460001521
Figure BDA0003489575460001531
Figure BDA0003489575460001541
Figure BDA0003489575460001551
为了产生单体抗原/Fc融合分子，使用标准方法，用编码融合蛋白的两种成分(节链和穴链)的两个质粒共转染指数生长的悬浮CHO细胞。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)、0.5M氯化钠缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure柱(柱体积CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用线性梯度洗脱结合的蛋白质；步骤1，10个CV的0％至60％的洗脱缓冲液(20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠缓冲液(pH 2.5))；步骤2，2个CV的60％至100％的洗脱缓冲液。对于线性梯度，应用另外2个柱体积的100％的洗脱缓冲液进行分步洗脱。
通过加入1/40(v/v)的2M Tris(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用2mM MOPS、150mM氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
表14总结了单体的人和食蟹猴CD19抗原Fc(kih)融合蛋白的产率和最终单体含量。
表14-单体的人和食蟹猴CD19抗原Fc(kih)融合蛋白的生物化学分析
构建体 单体[％](SEC) 产率[mg/l]
单体的人CD19 Fc(kih)融合蛋白 91 0.2
单体的食蟹猴CD19 Fc(kih)融合蛋白 95 3.56
根据制造商的说明书，使用BirA生物素-蛋白质连接酶标准反应试剂盒(Avidity，目录号BirA500)将部分纯化抗原体外生物素化。相对于相应的食蟹猴CD19构建体的生物素化程度100％，含有人CD19的融合物的生物素化程度为94％。然后将生物素化的蛋白质用于选择、筛选和表征缺乏脱酰胺化热点N27d和N28的亲和力成熟的8B8衍生克隆。生成了2个噬菌体展示文库，其中a)在位置27d和28处的两个天冬酰胺残基都被消除，并且b)重链和轻链的其他CDR被随机化，以便选择具有亲和力提高的8B8变体。
1.8.3缺乏CDR-L1热点的8B8亲和力成熟文库的生成
使用标准方案，通过噬菌体展示进行亲和力成熟的8B8衍生的抗体的生成，所述抗体没有位于CDR-L1中的脱酰胺化位点N27d和N28(Silacci等人，2005)。在第一步，将人源化亲本克隆8B8的VL和VH DNA序列(SEQ ID NO:169和SEQ ID NO:170)克隆到噬菌粒中，然后将其用作随机化的模板。在下一步，生成了两个文库，用于通过噬菌体展示选择有利的克隆。为了消除上述热点位置，对于两个文库，使用在位置27d和28处仅允许氨基酸S T Q E的LCDR1随机化引物(SEQ ID NO:171)。成熟文库1在轻链和重链两者的CDR1和CDR2中都被随机化，而成熟文库2在轻链的CDR1和CDR3以及重链的CDR3中被随机化。为了生成成熟文库1，在轻链和重链的CDR1和CDR2中都加以随机化，通过“重叠延伸剪接”(SOE)PCR组装三个片段并克隆到噬菌体载体中。使用以下引物组合生成文库片段：片段1(LMB3(SEQ ID NO:176)和CD19 L1反向随机(SEQ ID NO:171)、片段2(CD19 L2正向随机(SEQ ID NO:172)和CD19 H1反向随机(SEQ ID NO:173)、和片段3(CD19 H2正向随机(SEQ ID NO:174)和CD19 H3反向恒定(SEQ ID NO:175)(表15)。在装配足够量的全长随机片段后，与相同处理的接纳体噬菌粒载体一起用NcoI/NheI进行消化。将3倍摩尔过量的文库插入物与10μg噬菌粒载体连接。纯化的连接物用于20次转化，得到2×10exp9个转化体。通过PEG/NaCl纯化挽救并纯化展示8B8亲和力成熟文库的噬菌粒颗粒，以备用于选择。
类似地进行在轻链的CDR1和CDR3中以及重链的CDR3中被随机化的第二个文库的生成。使用以下引物组合生成文库片段：片段1(LMB3(SEQ ID NO:176)和CD19 L1反向随机(SEQ ID NO:171)、片段2(CD19 L1正向恒定(SEQ ID NO:177)和CD19 L3反向随机(SEQ IDNO:178)、和片段3(CD19 L3正向恒定(SEQ ID NO:179)和CD19 H3反向随机(SEQ ID NO:180)(表16)。在装配足够量的全长随机片段后，与相同处理的接纳体噬菌粒载体一起用NcoI/KpnI进行消化。将3倍摩尔过量的文库插入物与20μg噬菌粒载体连接。纯化的连接物用于40次转化，得到2×10exp9个转化体。通过PEG/NaCl纯化挽救并纯化展示8B8亲和力成熟文库的噬菌粒颗粒，以备用于选择。
表15：用于8B8亲和力成熟和热点去除文库L1_L2/H1_H2的引物
Figure BDA0003489575460001561
Figure BDA0003489575460001571
Figure BDA0003489575460001581
表16：用于8B8亲和力成熟和热点去除文库L1_L3/H3的引物
Figure BDA0003489575460001582
Figure BDA0003489575460001591
1.8.4缺乏CDR-L1热点N27d和N28的亲和力成熟的8B8衍生克隆的选择
为了选择缺乏CDR-L1热点N27d和N28的亲和力成熟的克隆，通过噬菌体展示进行了两种选择方法：
在第一种方法中，使用两种噬菌体展示文库对人CD19-Fc融合蛋白实施选择。根据以下模式在溶液中进行各轮淘选：1.约1012个噬菌粒颗粒与30nM生物素化的CD19-Fc蛋白质以总体积1ml结合0.5小时；2.通过加入5.4×107个链霉亲和素包被的磁珠捕获生物素化的CD19-Fc蛋白和特异性结合的噬菌体颗粒10分钟；3.使用5x1ml PBS/吐温20和5x1ml PBS洗涤珠子；4.通过加入1ml 100mM TEA洗脱噬菌体颗粒10分钟，并通过加入500μl 1M Tris/HCl pH 7.4进行中和；5.指数生长的大肠杆菌TG1细菌的再感染；以及6.用辅助噬菌体VCSM13感染以及随后的噬菌粒颗粒的PEG/NaCl沉淀，所述噬菌粒颗粒用于随后的选择轮中。使用递减的抗原浓度(30x10-9M、10x10-9M、和3x10-9M)进行3轮以上的选择。在第2和第3轮中，使用中性亲和素板代替链霉亲和素珠进行抗原:噬菌体复合物的捕获。用5 x PBS/吐温20和5 x PBS洗涤中性亲和素板。在第3轮中，将中性亲和素板在2升PBS中温育过夜进行“解离速率”选择，然后从板上洗脱噬菌体。此外，在第2轮中使用食蟹猴CD19-Fc蛋白来富集交叉反应性结合剂。
在第二种选择方法中，对在细胞表面上瞬时表达人或食蟹猴CD19 ECD的细胞实施噬菌体淘选。为了HEK细胞的瞬时转染，生成包含以下蛋白质区段的DNA序列(5'至3')的表达质粒：Flag标签、SNAP标签、人或食蟹猴来源的CD19 ECD、以及血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的跨膜区(SEQ ID NO:227和228)。使用用于检测的抗Flag抗体，通过流式细胞术证实细胞表面上对应蛋白质(SEQ ID NO:229和230)的表达。在第一选择轮中，两个文库都暴露于表达含有人或食蟹猴CD19 ECD的融合蛋白的细胞。对于后续的淘选轮，适当地交替使用CD19 ECD的种类。用无关膜蛋白瞬时转染的细胞用于预清除。
根据以下模式进行各轮淘选：
1.根据前述标准程序，用表达CD19 ECD或无关跨膜蛋白的构建体转染HEK细胞；
2.在5％CO2气氛的培养箱中在37℃下温育细胞总共48h；
3.通过离心分离细胞(在250×g下3分钟)，分别将1×10E7 CD19 ECD阳性细胞和1×10E7阴性细胞重悬于PBS/5％BSA中；
4.通过使用轻轻旋转的管旋转器在4℃下用1×107个CD19阴性细胞温育噬菌体文库60分钟，预先清除非特异性噬菌体；
5.将细胞在250×g下离心3分钟，将上清液转移到新鲜管中，加入1×10E7 CD19阳性细胞，并通过轻轻旋转管旋转器在4℃下温育60分钟；
6.通过在250×g下离心1分钟洗涤细胞，吸出上清液，重悬于1ml PBS(8倍)中；
7.用1ml 100mM TEA进行噬菌体洗脱，在室温下温育5分钟，用500μl 1M Tris-HCl(pH7.6)中和洗脱液；
8.指数生长的大肠杆菌TG1细菌的再感染；和
9.用辅助噬菌体VCSM13感染以及随后的噬菌粒颗粒的PEG/NaCl沉淀，所述噬菌粒颗粒用于随后的选择轮中。进行3轮以上的选择。
对于两种选择方法，通过ELISA如下鉴定特异性结合剂：将100μl 30nM生物素化CD19-Fc蛋白/孔包被在中性亲和素板上。加入含Fab的细菌上清液，使用抗Flag/HRP二抗通过其Flag标签检测结合性Fab。
使用经过用含有人CD19 ECD的表达质粒(SEQ ID NO:227)瞬时转染的细胞，在基于细胞的ELISA中进一步测试在重组人CD19方面为ELISA阳性的克隆。该分析如下进行：转染后48h，收获HEK细胞，在250x g下离心5分钟。然后将细胞重悬于冰冷的PBS BSA 2％中至4x106个细胞/ml，在冰上温育20分钟以阻断非特异性结合位点。将100μl中的4×105个细胞分配到96孔板的每个孔中，并在250x g和4℃下离心3分钟。吸出上清液，将含有可溶性Fab片段的50μl细菌上清液用50μl冰冷的PBS/BSA 2％稀释，加入板中，与细胞混合，在4℃下温育1小时。然后，将细胞用冰冷的PBS洗涤3次，然后每孔加入100μl含有1:2000稀释的抗Fab-HRP抗体的PBS 2％BSA。温育1小时后，用冰冷的PBS反复洗涤细胞3次。为了显色，每孔加入100μl“1步超TMB-ELISA”底物。在温育10分钟之后，将上清液转移到每孔含有40μl H2SO4 1M的新的96孔板中，测量在450nm下的吸光度。使用ProteOn XPR36，借助于SPR分析，对显示超过背景的显著信号的克隆进行动力学筛选实验。
1.8.5通过SPR鉴定亲和力成熟的8B8衍生变体
为了进一步表征ELISA阳性克隆，通过表面等离子体共振测定解离速率，并与亲本人源化克隆8B8进行比较。
对于该实验，通过胺偶联(NaAcetate pH4.5，25μl/min，240s)将7000RU的多克隆抗人Fab抗体固定在GLM芯片的所有6个通道上(垂直取向)。将每种含抗体的细菌上清液过滤并用PBS稀释2倍，然后以25μl/分钟注入360s，以实现垂直取向为100-400响应单位(RU)的固定水平。单体CD19-Fc的注入：对于一步法动力学测量，将注入方向改变为水平取向，同时以50μl/min沿分开的通道1-4注入纯化的单体CD19-Fc的三倍稀释系列(在150和6nM之间的不同浓度范围)，其中结合时间为180秒，解离时间为300秒。在通道5中注入人IgG Fc片段(150nM)，作为与亲和力成熟的CD19变体特异性结合的阴性对照，所述变体与PBS一起注入第6通道，以提供用于参考的“并列”空白。通过以90μl/min(水平取向)进行30秒的10mM甘氨酸pH 1.5和50mM NaOH的两次脉冲进行再生。使用ProteOn Manager v3.1软件中的简单的一对一Langmuir结合模型，通过同时拟合传感图来计算解离速率常数(koff)。鉴定出具有最慢解离速率常数的表达Fab的克隆。对相应噬菌粒的可变结构域进行测序。重要的是，DR-L1中的两个天冬酰胺残基(位置27d和28)都被丝氨酸或苏氨酸替换，表明两个脱酰胺位点都被去除。
表17：在用细菌上清液的筛选分析中获得的亲本8B8和选定克隆2B11的解离常数
Figure BDA0003489575460001611
Figure BDA0003489575460001621
表18分别显示了克隆8B8-018和8B8-2B11的CDR以及可变区VH和VL的氨基酸序列。
表18：克隆8B8-018和8B8-2B11的CDR以及可变区VH和VL的序列
Figure BDA0003489575460001622
Figure BDA0003489575460001631
实施例2
“非靶向的”含有单链4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备和纯化
编码单链三聚体配体的多肽链(图1A)用于制备非靶向的(种系对照，DP47)含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(例如图3B所示的单价对照)，如以上针对FAP靶向的构建体所述。
将FAP结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区用种系对照(DP47)的可变区替换，并与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
如上文对于FAP靶向的构建体的描述，产生非靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子。用1:1:1比率(“载体三聚体配体节链”:“载体DP47 Fab-穴链”:“载体DP47轻链”)的相应表达载体转染细胞。
表19分别显示了单价的含有DP47的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表19：单价的含有DP47的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47单链4-1BBL三聚体)(对照1)的序列
Figure BDA0003489575460001632
Figure BDA0003489575460001641
Figure BDA0003489575460001651
Figure BDA0003489575460001661
Figure BDA0003489575460001671
表20总结了含有DP47的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合分子的产率和最终单体含量。
表20：含有DP47的含有4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合分子的产生的总结
Figure BDA0003489575460001672
表21分别显示了二价的含有DP47的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(对照2)的cDNA和氨基酸序列。
表21：二价的含有DP47的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(DP47单链4-1BBL三聚体)(对照2)的序列
Figure BDA0003489575460001673
Figure BDA0003489575460001681
Figure BDA0003489575460001691
Figure BDA0003489575460001701
Figure BDA0003489575460001711
Figure BDA0003489575460001721
实施例3
靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子及其对照的产生
将如本文中之前所述的靶向和非靶向的三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子的编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBVOriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生靶向的和非靶向的单链三聚体的4-1BB配体的Fc(kih)融合抗原结合分子。用1:1:1比率(“载体节链”:“载体穴链”:“载体轻链”)的相应表达载体转染细胞。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种3亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，细胞在210x g下离心10分钟，并将上清液替换为20mL预热的CD CHO培养基。在20mL CDCHO培养基中混合表达载体(200μg的总DNA)。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL补充有6mM L-谷氨酰胺、5g/L PEPSOY和1.2mM丙戊酸的Excell培养基，将细胞培养24小时。转染后一天，加入12％补料。培养7天后，通过在至少400x g下离心30-40分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用磷酸钠(20mM)、柠檬酸钠(20mM)缓冲液(pH 7.5)平衡的MabSelect Sure柱(CV＝5-15mL，来自GE Healthcare的树脂)上。通过用至少6个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。使用20mM柠檬酸钠、100mM氯化钠、100mM甘氨酸缓冲液(pH 3.0)的线性梯度(20CV)或分步洗脱(8CV)洗脱结合的蛋白质。对于线性梯度，应用另外4个柱体积的分步洗脱。
通过加入1/10(v/v)的0.5M磷酸钠(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、140mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用CoomassieSimpleBlueTM SafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过SDS-PAGE或使用CaliperLabChip GXII(Perkin Elmer)的CE-SDS来分析靶向的三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合物的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM NaCl、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析样品的聚集物含量。
表22总结了靶向的和非靶向的单链三聚体的4-1BBL配体Fc(kih)融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。
表22：靶向的和非靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的生物化学分析
Figure BDA0003489575460001731
Figure BDA0003489575460001741
实施例4
4-1BB的制备、纯化和表征
将编码人、小鼠或食蟹猴4-1BB(表23)的胞外结构域的DNA序列与节上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant et al.,1998)。在抗原胞外结构域和人IgG1的Fc之间引入AcTEV蛋白酶切割位点。将用于定向生物素化的Avi标签引入抗原-Fc节的C末端。含有S354C/T366W突变的抗原-Fc节链与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链的组合允许产生异二聚体，其包括单拷贝的含有4-1BB胞外结构域的链，从而产生单体形式的Fc连接的抗原(图3C)。表24列出了如图3C中描绘的单体抗原Fc(kih)融合分子的cDNA和氨基酸序列。
表23：抗原胞外结构域(ECD)的氨基酸编号及其起源
SEQ ID NO: 构建体 起源 ECD
73 人4-1BB ECD 根据Q07011合成 aa 24-186
74 食蟹猴4-1BB ECD 从食蟹猴血中分离 aa 24-186
75 鼠4-1BB ECD 根据P20334合成 aa 24-187
表24：单体抗原Fc(kih)融合分子(通过一个Fc穴链与一个抗原Fc节链的组合产生)的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003489575460001742
Figure BDA0003489575460001751
Figure BDA0003489575460001761
Figure BDA0003489575460001771
Figure BDA0003489575460001781
Figure BDA0003489575460001791
Figure BDA0003489575460001801
Figure BDA0003489575460001811
将所有4-1BB-Fc-融合物编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA信号序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
为了制备生物素化的单体抗原/Fc融合分子，用编码融合蛋白的两种成分(节链和穴链)以及生物素化反应所必需的酶BirA的三个载体共转染指数生长的悬液HEK293 EBNA细胞。以2:1:0.05的比率使用相应的载体(“抗原ECD-AcTEV-Fc节”:“Fc穴”:“BirA”)。
为了在500ml摇瓶中生产蛋白质，在转染前24小时接种4亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，细胞在210g下离心5分钟，并将上清液替换为预热的CD CHO培养基。将表达载体重悬于含有200μg载体DNA的20mL的CD CHO培养基中。加入540μL聚乙稀亚胺(PEI)后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL的F17培养基，将细胞培养24小时。转染后1天，向培养物中加入1mM丙戊酸和7％的补料。培养7天后，通过将细胞在210g下离心15分钟收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到用40mL的20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠缓冲液(pH 7.5)平衡的HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5mL,GE Healthcare)上。通过用至少10个柱体积的含有20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠的缓冲液(pH 7.5)洗涤除去未结合蛋白质。使用在20个柱体积的20mM柠檬酸钠、0.01％(v/v)吐温20(pH 3.0)上产生的氯化钠的线性pH梯度(0至500mM)洗脱结合的蛋白质。然后将柱用10个柱体积的20mM柠檬酸钠、500mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温20(pH 3.0)洗涤。
通过加入1/40(v/v)的2M Tris(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用2mM MOPS、150mM氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoad Superdex 200柱(GE Healthcare)上。
为了测定对人受体的亲和力，还将人4-1BB的胞外结构域与avi(GLNDIFEAQKIEWHE,SEQ ID NO:84)和六组氨酸标签进行框内亚克隆。如上对Fc融合蛋白所描述进行蛋白质生产。通过螯合色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。第一个色谱步骤在20mM磷酸钠、500nM氯化钠(pH 7.4)中平衡的NiNTASuperflow Cartridge(5ml,Qiagen)上进行。通过施加超过12个柱体积的5％到45％梯度的洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、500nM氯化钠、500mM咪唑，pH 7.4)进行洗脱。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用2mM MOPS、150mM氯化钠、0.02％(w/v)叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoad Superdex 75柱(GE Healthcare)上。
表25：单体人4-1BB His分子的序列
Figure BDA0003489575460001821
Figure BDA0003489575460001831
实施例5
通过表面等离子体共振对FAP靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物化学表征
通过表面等离子体共振(SPR)评估FAP靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子与重组4-1BB的结合。所有SPR实验均在25℃下在Biacore T100上进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore,Freiburg/Germany)。
如图5A所示测定FAP靶向的或“非靶向的”含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子与重组4-1BB(人、食蟹猴和鼠)之间的相互作用的亲合力。数据表明，含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的所有变体(参见例如图5中FAP(28H1)单链4-1BBL三聚体(化合物S1)、以及图6中的“非靶向的”DP47单链4-1BBL三聚体(对照A)的曲线)都与人和食蟹猴4-1BB具有相当的亲合力，但与小鼠同源物的亲合力可忽略不计。
使用标准偶联指导(Biacore,Freiburg/Germany)将重组生物素化的人、食蟹猴和鼠4-1BB Fc(kih)融合分子直接偶联在SA芯片上。固定化水平为约30个共振单位(RU)。使FAP靶向的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1)或含有DP47的对照以0.9至500nM的浓度范围以30μL/分钟的流速经180秒通过流动池。监测解离180秒。通过减去在空的参考流动池上获得的响应来校正本体折射率差异。
对于亲和力测量(图7)，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)，在pH 5.0的CM5芯片上进行约7200个共振单位(RU)的抗人Fc特异性抗体的直接偶联。在流动池2上以30μl/min的流速捕获50nM的FAP靶向或非靶向的含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子持续60秒。使hu4-1BB avi His的稀释系列(1.95至1000nM)以30μl/min在两个流动池上通过120秒来记录结合相。监测解离相180秒，并通过从样品溶液切换到HBS-EP进行触发。在每次循环后，使用3M MgCl2双重注射60秒使芯片表面再生。通过减去在参考流动池1上获得的响应来校正本体折射率差异。对于靶向的单链三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合抗原结合分子与hu4-1BB avi His之间的相互作用，通过使用Biaeval软件(GEHealthcare)拟合至1:1 Langmuir结合，从速率常数推导出亲和常数。解离常数可见表26。
表26：对1:1 Langmuir结合的拟合和亲和常数
Figure BDA0003489575460001841
实施例6
靶向的含有单链OX40配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备和纯化
根据UniProt登录号P23510(SEQ ID NO:38)，合成了编码人OX40配体的胞外结构域部分(氨基酸51-183)的DNA序列。通过诱变将两个Asn连接的糖基化位点(N90和N114)替换为天冬氨酸(Asp)。
将含有被(G4S)2接头分开的OX40配体的三个胞外结构域的多肽进行克隆，如图1B中描绘：人OX40配体、(G4S)2接头、人OX40配体、(G4S)2接头、人OX40配体。
使用具有SEQ ID NO:57的接头(GSPGSSSSGS)，将编码单链三聚体Ox40配体的多肽与节上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant,Zhu等人，1998)。
将编码对成纤维细胞激活蛋白(FAP)特异的结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区与穴(Carter,2001)的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
根据国际专利申请公开No.WO 2012/130831 A1中描述的方法，已经将Pro329Gly、Leu234Ala和Leu235Ala突变引入节和穴重链的恒定区中，以消除与Fcγ受体的结合。
含有S354C/T366W突变的单链配体-Fc节链与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的靶向的抗FAP-Fc穴链和抗FAP轻链的结合允许产生异二聚体，其包括单链三聚体OX40配体和结合FAP的Fab(图4A)。
表27分别显示了FAP靶向的含有单链OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。使用具有SEQ ID NO:57的接头(GSPGSSSSGS)，将编码单链三聚体Ox40配体的多肽与节(Merchant,Zhu et al.1998)上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆。
表27：FAP(28H1)靶向的含有人OX40配体三聚体的Fc(kih)融合分子(FAP单链OX40L三聚体)(化合物S10)的序列
Figure BDA0003489575460001851
Figure BDA0003489575460001861
Figure BDA0003489575460001871
Figure BDA0003489575460001881
Figure BDA0003489575460001891
Figure BDA0003489575460001901
Figure BDA0003489575460001911
将靶向的含有单链OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
通过使用聚乙烯亚胺以哺乳动物表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生靶向的单链三聚体的OX40配体Fc(kih)融合抗原结合分子。用1:1:1比率(“载体节链”:“载体穴链”:“载体轻链”)的相应表达载体转染细胞。
为了在500mL摇瓶中生产，在转染前24小时接种4亿个HEK293 EBNA细胞。为了转染，细胞在210x g下离心5分钟，并将上清液替换为预热的CD CHO培养基。将表达载体在20mL CD CHO培养基中混合至DNA最终量为200μg。加入540μL PEI后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL的F17培养基，将细胞培养24小时。转染后1天，加入1mM丙戊酸和7％的含有补充剂的补料。培养7天后，通过在210x g下离心15分钟收集上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养上清液中纯化靶向的含有单链OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5mL,GE Healthcare)上，所述柱用含有20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、0.01％(v/v)Tween-20的缓冲液(pH 7.5)加以平衡。通过用至少10个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。用20个以上柱体积到100％的含有20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的缓冲液(pH 2.5)，利用线性pH梯度洗脱结合的蛋白质。然后将柱用10个柱体积的20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、0.01％(v/v)吐温20缓冲液(pH2.5)洗涤。
通过加入1/40(v/v)的2M Tris(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩，然后上样到用20mM组氨酸、150mM氯化钠、0.01％(v/v)吐温/20的溶液(pH 6.0)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来确定蛋白质浓度。在存在和不存在还原剂(5mM 1,4-二硫苏糖醇)并用CoomassieSimpleBlueTM SafeStain(Invitrogen USA)染色的情况下通过SDS-PAGE来分析靶向的含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的纯度和分子量。使用在25mM K2HPO4、125mM氯化钠、200mM L-精氨酸一氢氯化物、0.02％(w/v)NaN3的运行缓冲液(pH 6.7)中平衡的TSKgel G3000 SW XL分析尺寸排阻柱(Tosoh)在25℃分析样品的聚集物含量。
得到靶向的含有单链OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物SC-10)，产率为9.1mg/ml，最终单体含量为87％(SEC)。
实施例7
“非靶向的”含有单链OX40配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的制备和纯化
该“非靶向的”构建体由上述Ox40配体-Fc节链、DP47种系对照-Fc穴链和DP47轻链组成(图4B)，将这些链以1:1:1的比率(“载体节链”:“载体穴链”:“载体轻链”)进行共转染。
如上所述进行靶向的含有单链OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的产生和纯化。将FAP结合剂的重链和轻链DNA序列的可变区用种系对照(DP47)的可变区替换，并与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链进行框内亚克隆。
表28分别显示了含有DP47的含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的cDNA和氨基酸序列。
表28：含有DP47的含有单链OX40配体三聚体的Fc(kih)融合分子(DP47单链OX40L三聚体)(对照3)的序列
Figure BDA0003489575460001921
Figure BDA0003489575460001931
Figure BDA0003489575460001941
Figure BDA0003489575460001951
Figure BDA0003489575460001961
得到含有DP47的含有单链OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(对照3)，产率为7mg/ml，最终单体含量为100％(SEC)。
实施例8
OX40的制备、纯化和表征
将编码人、小鼠或食蟹猴OX40(表11)的胞外结构域的DNA序列与节上的人IgG1重链CH2和CH3结构域进行框内亚克隆(Merchant et al.,1998)。在抗原胞外结构域和人IgG1的Fc之间引入AcTEV蛋白酶切割位点。将用于定向生物素化的Avi标签引入抗原-Fc节的C末端。含有S354C/T366W突变的抗原-Fc节链与含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链的组合允许产生异二聚体，其包括单拷贝的含有OX40胞外结构域的链，从而产生单体形式的Fc连接的抗原(图4C)。表29显示了各个OX40胞外结构域的氨基酸序列。表30显示了如图4C中描绘的单体抗原Fc(kih)融合分子的cDNA和氨基酸序列。
表29：抗原胞外结构域(ECD)的氨基酸编号及其起源
SEQ ID NO: 构建体 起源 ECD
88 人Ox40 ECD 根据P43489合成 aa 29-214
89 食蟹猴Ox40 ECD 从食蟹猴血中分离 aa 29-214
90 鼠Ox40 ECD 根据P47741合成 aa 10-211
表30：单体抗原Fc(kih)融合分子(通过一个Fc穴链与一个抗原Fc节链的组合产生)的cDNA和氨基酸序列
Figure BDA0003489575460001962
Figure BDA0003489575460001971
Figure BDA0003489575460001981
Figure BDA0003489575460001991
Figure BDA0003489575460002001
Figure BDA0003489575460002011
Figure BDA0003489575460002021
Figure BDA0003489575460002031
将所有OX40-Fc-融合物编码序列克隆到质粒载体中，所述质粒载体驱动来自MPSV启动子的插入片段的表达，并含有位于CDS 3'端的合成polyA信号序列。另外，该载体含有用于质粒的附加体维持的EBV OriP序列。
为了制备生物素化的单体抗原/Fc融合分子，用编码融合蛋白的两种成分(节链和穴链)以及生物素化反应所必需的酶BirA的三个载体共转染指数生长的悬液HEK293 EBNA细胞。以2:1:0.05的比率使用相应的载体(“抗原ECD-AcTEV-Fc节”:“Fc穴”:“BirA”)。
为了在500ml摇瓶中生产蛋白质，在转染前24小时接种4亿个HEK293EBNA细胞。为了转染，细胞在210g下离心5分钟，并将上清液替换为预热的CD CHO培养基。将表达载体重悬于含有200μg载体DNA的20mL的CD CHO培养基中。加入540μL聚乙稀亚胺(PEI)后，将溶液涡旋15秒，并在室温下温育10分钟。然后，将细胞与DNA/PEI溶液混合，转移到500mL摇瓶中，并在5％CO2气氛的培养箱中于37℃温育3小时。温育后，加入160mL的F17培养基，将细胞培养24小时。转染后1天，向培养物中加入1mM丙戊酸和7％的补料。培养7天后，通过将细胞在210g下离心15分钟收集细胞上清液。将溶液无菌过滤(0.22μm过滤器)，补充叠氮化钠至终浓度为0.01％(w/v)，并保持在4℃。
通过使用蛋白A的亲和色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。对于亲和色谱，将上清液上样到HiTrap蛋白A HP柱(CV＝5mL,GEHealthcare)上，并且用含有20mM磷酸钠、20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、0.01％(v/v)Tween-20的缓冲液(pH 7.5)加以平衡。通过用至少10个柱体积的相同缓冲液洗涤除去未结合的蛋白质。用12个以上柱体积到100％的含有20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、0.01％(v/v)吐温20的缓冲液(pH2.5)，利用线性pH梯度洗脱结合的蛋白质。然后将柱用10个柱体积的20mM柠檬酸钠、0.5M氯化钠、0.01％(v/v)吐温20缓冲液(pH 2.5)洗涤。
通过加入1/40(v/v)的2M Tris(pH 8.0)调节收集级分的pH。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用2mM MOPS、150mM氯化钠、0.02％叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoadSuperdex 200柱(GE Healthcare)上。
为了测定对人受体的亲和力，还将人OX40的胞外结构域与avi(GLNDIFEAQKIEWHE,SEQ ID NO:84)和六组氨酸标签进行框内亚克隆。序列显示在表31中。
如上对Fc融合蛋白所描述进行蛋白质生产。通过螯合色谱从细胞培养物上清液中纯化分泌的蛋白质，然后进行尺寸排阻色谱。第一个色谱步骤在用具有20mM磷酸钠和500nM氯化钠的溶液(pH 7.4)平衡的NiNTA Superflow Cartridge(5ml,Qiagen)上进行。通过施加超过12个柱体积的5％到45％梯度的含有20mM磷酸钠、500nM氯化钠和500mM咪唑的洗脱缓冲液(pH 7.4)进行洗脱。将蛋白质浓缩并过滤，然后上样到用具有2mM MOPS、150mM氯化钠和0.02％(w/v)叠氮化钠的溶液(pH 7.4)平衡的HiLoad Superdex 75柱(GEHealthcare)上。
表31：单体人OX40 His分子的序列
Figure BDA0003489575460002051
实施例9
通过表面等离子体共振对FAP靶向的含有单链OX40配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物化学表征
通过表面等离子体共振(SPR)评估FAP靶向的含有单链OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子与重组OX40的结合。所有SPR实验均在25℃下在Biacore T100上进行，使用HBS-EP作为运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20，Biacore,Freiburg/Germany)。
如图8A所示测定FAP靶向的或非靶向的含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子与重组OX40(人、食蟹猴和鼠)之间的相互作用的亲合力。数据表明，含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的两种变体(FAP单链OX40三聚体(图8中的化合物S10、和图9中的含有DP47的单链OX40三聚体(对照3))都以相当的亲合力与人和食蟹猴OX40结合，但与小鼠同源物的亲合力可忽略不计。
使用标准偶联指导(Biacore,Freiburg/Germany)将重组生物素化的人、食蟹猴和鼠OX40 Fc(kih)融合分子直接偶联在SA芯片上。固定化水平为约600个共振单位(RU)。使FAP靶向的含有OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子或含有DP47的对照以0.2至500nM的浓度范围以30μL/分钟的流速经120秒通过流动池。监测解离220秒。通过减去在空的参考流动池上获得的响应来校正本体折射率差异。
对于亲和力测量(图10)，使用标准胺偶联试剂盒(GE Healthcare)，在pH 5.0的CM5芯片上进行约7200个共振单位(RU)的抗人Fc特异性抗体的直接偶联。在流动池2上以30μl/min的流速捕获200nM的FAP靶向或非靶向的单链三聚体的Ox40配体Fc(kih)融合分子持续60秒。使huOX40 avi His的稀释系列(31至2000nM)以30μl/min在两个流动池上通过120秒来记录结合相。监测解离相180秒，并通过从样品溶液切换到HBS-EP进行触发。在每次循环后，使用3M MgCl2双重注射60秒使芯片表面再生。通过减去在参考流动池1上获得的响应来校正本体折射率差异。对于靶向的单链三聚体的OX40配体Fc(kih)融合分子与huOx40avi His之间的相互作用，通过使用Biaeval软件(GE Healthcare)拟合至1:1 Langmuir结合，从速率常数推导出亲和常数。解离常数可见表32。
表32：对1:1 Langmuir结合的拟合和亲和常数
Figure BDA0003489575460002071
实施例10
靶向的含有4-1BB配体或OX40配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的功能表征
10.1FAP靶向的含有4-1BB配体或OX40配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子在幼稚的人PBMC与活化的人PBMC上的结合
从Zürich献血中心获得血沉棕黄层。为了分离新鲜的外周血单核细胞(PBMC)，用相同体积的DPBS(Gibco by Life Technologies，目录号14190 326)稀释血沉棕黄层。向50mL聚丙烯离心管(TPP,目录号91050)中提供15mL Histopaque 1077(SIGMA LifeScience，目录号10771、聚蔗糖和泛影酸钠，调节至1.077g/mL密度)并且使该血沉棕黄层溶液在Histopaque 1077上分层。离心管在450x g下离心30分钟。从界面收集PBMC，用DPBS洗涤三次，重悬于由RPMI 1640培养基(Gibco by Life Technology，目录号42401-042)组成的T细胞培养基中，所述RPMI 1640培养基补充有10％胎牛血清(FBS,Gibco by LifeTechnology,目录号16000-044，批号941273，γ照射的，无支原体且在56℃热灭活35分钟)、1％(v/v)GlutaMAX-I(GIBCO by Life Technologies，目录号35050 038)、1mM丙酮酸钠(SIGMA，目录号S8636)、1％(v/v)MEM非必需氨基酸(SIGMA，目录号M7145)和50μMβ-巯基乙醇(SIGMA，M3148)。
在分离后直接使用PBMC(幼稚的、静息的PBMC)或如下刺激PBMC以诱导在T细胞(活化的PBMC)的细胞表面上的4-1BB和OX40表达：在6孔组织培养板中将幼稚的PBMC在补充有200U/mL普留净和2μg/mL PHA-L的T细胞培养基中培养四天。为了再激活，用在补充有200U/mL普留净的T细胞培养基中的10μg/mL抗人CD3(克隆OKT3)和2μg/mL抗人CD28(克隆CD28.2)包被的6孔组织培养板上，在37℃和5％CO2下使细胞进一步活化1天。
为了检测4-1BB结合，将0.1x106个幼稚或活化的PBMC加入到圆底悬浮细胞96孔板(Greiner bio-one,cellstar，目录号650185)的每个孔中。为了检测OX40，将幼稚的人PBMC和活化的人PBMC混合。为了能够鉴别幼稚的人PBMC和活化的人PBMC，使用eFluor670细胞增殖染料(eBioscience，目录号65-0840-85)在结合测定之前标记幼稚细胞。
为了用eFluor670细胞增殖染料进行标记，收获细胞，用预热的(37℃)DPBS洗涤，并在DPBS中调节至1x107个细胞/mL的细胞密度。将eFluor670细胞增殖染料(eBioscience，目录号65-0840-85)加入到幼稚的人PBMC中，终浓度为在DPBS中的2.5mM，最终细胞密度为0.5x107个细胞/mL。然后将细胞在室温下在黑暗中温育10分钟。为了停止标记反应，加入2mL FBS，用T细胞培养基洗涤细胞三次。然后将1x105个幼稚的eFluor670标记的人PBMC和未标记的活化人PBMC的1比1混合物加入到圆底悬浮细胞96孔板(greiner bio-one,cellstar，目录号650185)的每个孔中。
将培养板在400x g下在4℃离心4分钟并拂去上清液。用200μL的4℃冷FACS缓冲液(补充有2％FBS、5mM EDTA pH8(Amresco，目录号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-Aldrich目录号S2002)的DPBS)将细胞洗涤一次。在50μL/孔的含有逐步滴加的FAP靶向的或DP47非靶向的含有单链4-1BB或含OX40配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的4℃冷FACS中，将细胞在4℃下温育120分钟。将培养板用200μL/孔的4℃ FACS缓冲液洗涤四次。
为了检测4-1BB结合，将细胞重悬于含有0.125μg/mL抗人CD4-BV421(克隆RPA-T4，小鼠IgG1 k，BioLegend，目录号300532)、20μL/mL抗人CD3-PerCP/Cy5.5(克隆SK7，小鼠IgG1k，BD Bioscience，目录号332771)、0.25μg/mL抗人CD8a-APC(克隆RPA-T8，小鼠IgG1k，BioLegend，目录号301014)、0.25μg/mL抗人CD56-AF488(克隆HCD56，小鼠IgG1κ，BDPharmingen，目录号338310)、2.5μg/mL抗人Fcγ特异性山羊IgG F(ab)2片段-PE(JacksonImmunoresearch，目录号109 116 098或109-116-170)的50μL/孔4℃冷FACS缓冲液中，并在4℃下在黑暗中温育30分钟。
为了检测OX40结合，将细胞重悬于含有0.255μg/mL抗人CD4-BV421(克隆RPA-T4，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号300532)、0.250μg/mL抗人CD8-BV711(克隆RPa-T8，小鼠IgG1k，BD Bioscience，目录号3010441)、0.250μg/mL抗人CD45-PerCP Cy5.5(克隆HI30，小鼠IgG1k，BioLegend，目录号304028)、和30μg/mL异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109096 098)的50μL/孔4℃冷FACS缓冲液中，并在4℃下在黑暗中温育30分钟。
然后将板用200μL/孔的4℃ FACS缓冲液洗涤两次，最后将细胞重悬于含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec，目录号Sc-3598)的80μL/孔FACS缓冲液中，并在当日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
在某些情况下，细胞在第二天被固定和收获。对于这种方法，在与一级抗体一起温育之前，另外用含有1:1000稀释的用于UV激发的LIVE/DEAD Fixable Blue Dead CellStain Kit(Life Technologies,Molecular Probes，目录号L-23105)的100μL/孔的DPBS在4℃在黑暗中染色30分钟。用二级抗体混合物温育后，用200μL/孔的4℃ FACS缓冲液将板洗涤两次，用含有1％甲醛(Sigma,HT501320-9.5L)的50μL/孔DPBS固定，并在4℃温育过夜。对于流式细胞术分析，将细胞重悬于80μl/孔的FACS缓冲液中。
如图11A至11D和图12A至12D所示，FAP靶向的和含有DP47的这两种含有单链4-1BBL和含OX40L三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子都不与静息的人CD4+ T细胞或CD8+ T细胞结合。相比之下，所有构建体都与活化的CD8+或CD4+ T细胞强结合。与CD8+ T细胞相比，含有单链4-1BBL三聚体的分子显示出与CD4+ T细胞的结合大约低10倍。相反，与CD8+ T细胞相比，含有单链Ox40L三聚体的分子与CD4+ T细胞结合时显示出大约高4倍的特异性荧光强度。这些差异与下列情况相当一致：CD8+人T细胞与CD4+ T细胞相比，其上的4-1BB表达水平高10-20倍，而后者的OX40表达水平与CD8+亚群相比高约4倍。如图11E至11H中所示，单价和二价的FAP(28H1或4B9)靶向或CEA(sm9b)靶向或DP47非靶向的单链三聚体的4-1BB配体Fc(kih)融合分子不与静息的人CD4+或CD8+ T细胞结合，但与活化的CD8+ T细胞强结合，而较少涉及活化的CD4+ T细胞。如图11J至11M可以看出，结合与靶向或二价无关，例如，与单链三聚体4-1BB配体的融合位置无关。
10.2与表达FAP的肿瘤细胞结合
对于表达FAP的细胞上的结合测定，使用表达人成纤维细胞激活蛋白(huFAP)的细胞NIH/3T3-huFAP克隆39或WM266-4细胞(ATCC，目录号CRL-1676)。通过用表达载体pETR4921转染小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞系(ATCC，目录号CRL-1658)生成了NIH/3T3-huFAP克隆39，用于在1.5μg/mL嘌呤霉素选择下表达huFAP。
将DPBS中的0.1x106个NIH/3T3-huFAP克隆39(4-1BBL)或5x104个WM266-4细胞(OX40L)加入到圆底悬浮细胞96孔板的每个孔中。将培养板在400x g下在4℃离心4分钟并拂去上清液。细胞用200μL的DPBS洗涤一次，并通过短暂且轻柔的涡旋将沉淀重悬。对于含有4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的结合分析，加入100μL/孔的含有1:5000稀释的Fixable Viability Dye eFluor 450(eBioscience，目录号65 0863 18)的4℃冷DPBS缓冲液，将平板在4℃下温育30分钟。将细胞用200μL 4℃冷DPBS缓冲液洗涤一次。将所有样品重悬于50μL/孔的含有指定浓度范围的FAP靶向或含有DP47的含有单链4-1BBL或含OX40L三聚体的分子的4℃冷FACS缓冲液中，在4℃下温育1小时。然后，将细胞用200μL 4℃ FACS缓冲液洗涤5次，并通过短暂涡旋重悬。用50μL/孔的含有30μg/mL异硫氰酸荧光素(FITC)缀合的AffiniPure抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(JacksonImmunoResearch，目录号109 096 098)的4℃冷FACS缓冲液将细胞在4℃下进一步染色30分钟。将细胞用200μL 4℃ FACS缓冲液洗涤两次。最后将用含有OX40L三聚体的分子染色的细胞重悬于含有0.2μg/mL DAPI(Santa Cruz Biotec，目录号Sc-3598)的80μL/孔的FACS缓冲液中，并在当日使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
用含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子将细胞染色，通过重悬于含有1％甲醛的50μL/孔的DPBS中将细胞固定。次日，将细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，并使用5激光LSR-Fortessa(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
如图13中所示，含有单链三聚体的4-1BBL(化合物S1，图13A)或OX40L的FAP靶向的分子(化合物S10，图13B)与表达人FAP的细胞高效结合。相比之下，其含有DP47抗体的对应物(对照1和3)未显示这种结合(图13A和13B)。因此，只有FAP靶向的含有单链三聚体的4-1BBL或含OX40L的分子才显示出肿瘤靶向特性。如图13C和13D中所示，单价和二价的FAP(28H1或4B9)靶向的(但不是DP47非靶向的)单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子可以与表达FAP的人黑色素瘤细胞系MV-3和WM-266-4结合。对于表达FAP的肿瘤细胞，FAP结合克隆4B9显示出最强的结合，而克隆28H1显示出较低亲和力。由于亲和力较低，单价的FAP(28H1)靶向的单链三聚体的4-1BBL(kih)融合分子与二价的结合性FAP(28H1)靶向的huIgG1 P329G LALA对照分子之间的差异变得更加明显。二价结合性FAP(28H1)靶向的huIgG1 P329G LALA对照分子显示出较低的MFI(FAP分子的二价占用)和较低的EC50值。
10.3与表达CEA的肿瘤细胞结合
对于在表达CEA的肿瘤细胞上的结合测定，使用以下表达人CEA的肿瘤细胞系：从肝转移癌MKN45收获的人胃癌(胃)细胞系(DMSZ，编号ACC 409)。如实施例10.2中针对表达FAP的MV-3和WM-266-4肿瘤细胞系所述进行测定。
如图13E中所示，单价和二价的CEA(sm9b)靶向的(但不是DP47非靶向的)含有单链4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子可以与表达CEA的人胃癌细胞系MKN45结合。单价的CEA(sm9b)靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合分子(化合物S5)与二价的CEA(sm9b)靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合分子(化合物S4)之间的差异显示为较低的MFI(CEA分子的二价占用)。
10.4与表达小鼠4-1BB的活化小鼠脾细胞结合
将小鼠脾脏收集在3mL PBS中，并使用gentleMACS管(Miltenyi Biotec目录号130-096-334)和gentleMACS Octo Dissociator(Miltenyi Biotec)产生单细胞悬液。然后，将脾细胞通过70μm预分离过滤器(Miltenyi Biotec目录号130-041-407)过滤，并在350x g和4℃下离心7分钟。吸出上清液并将细胞重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAXI、1mM丙酮酸钠、1％(v/v)MEM非必需氨基酸、50μMβ-巯基乙醇和10％青霉素-链霉素(SIGMA，目录号P4333)的RPMI 1640培养基中。以106个细胞/mL在6孔组织培养板上培养2天，所述组织培养板包被有10μg/mL的抗小鼠CD3ε亚美尼亚仓鼠IgG(克隆145-2C11，BioLegend，目录号100331)和2μg/mL的抗小鼠CD28叙利亚仓鼠IgG(克隆37.51，BioLegend，目录号102102)。收集活化的小鼠脾细胞，在DPBS中洗涤，计数，将0.1x106个细胞转移到非组织培养物处理的U型底96孔板的每个孔中。除去上清液，将细胞在含有1:5000稀释的可固定活力染料eF660(Bioscience，目录号65-0864-18)的100μL/孔的DPBS中在4℃下染色30分钟。用DPBS洗涤细胞，并在含有不同浓度的FAP靶向或DP47靶向的单链三聚体的4-1BBL抗原结合分子或抗小鼠CD137人IgG1 P329G LALA mAb(克隆Lob.12.3)的50μl FACS缓冲液中染色。细胞在4℃下温育60分钟。然后将细胞用FACS缓冲液洗涤四次，并在50μL/孔的FACS缓冲液中在4℃下染色30分钟，所述缓冲液含有10μg/mL纯化的抗小鼠CD16/CD32大鼠IgG-Fc-Block(BD Pharmingen，目录号553142，克隆2.4G2)、5μg/mL抗小鼠CD8b大鼠IgG2bκ-FITC(BioLegend，目录号126606，克隆YTS156.7.7)、0.67μg/mL抗小鼠CD3大鼠IgG2bκ-APC-Cy7(BioLegend，目录号100222，克隆17A2)、0.67μg/mL抗小鼠CD4大鼠IgG2bκ-PE-Cy7(BioLegend，目录号100422，克隆GK1.5)、2μg/mL抗小鼠NK1.1小鼠(C3H x BALB/c)IgG2aκ-PerCp-Cy5.5(BioLegend，目录号1082728，克隆PK136)和10μg/mL PE缀合的AffiniPure多克隆F(ab`)2片段山羊抗人IgG(其为Fcγ片段特异性的，与牛、小鼠和兔血清蛋白(JacksonImmunoResearch，目录号109-116-170)交叉反应最小。细胞用200μL/孔的冷FACS缓冲液洗涤两次，用含有1％甲醛的50μL/孔的DPBS固定并在4℃下保存过夜。次日，将细胞重悬于FACS缓冲液中，并使用3激光Canto II流式细胞仪(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
如图14所示，FAP靶向的或含有DP47的单链三聚体的人4-1BBL分子(化合物S1和对照1)不与小鼠4-1BB结合。因此，不能在有免疫能力的小鼠中测试它们的活性。对于体内作用模式研究，必须使用人源化小鼠模型或含有单链三聚体的小鼠4-1BBL的替代物。
实施例11
靶向的含有4-1BB配体或OX40配体三聚体的Fc融合抗原结合分子的生物活性
11.1在表达人4-1BB或OX40的HeLa细胞中的NFκB活化
11.1.1在NFκB增强子区控制下表达人4-1BB和萤光素酶的的HeLa细胞的生成
用表达载体pETR10829转导人乳头瘤病毒18诱导的宫颈癌细胞系HeLa(ATCC，目录号CCL-2)，所述表达载体含有在CMV启动子控制下的人4-1BB序列(Uniprot登录号Q07011,SEQ ID NO:99)和嘌呤霉素抗性基因。将细胞在提供有10％FBS、1％GlutaMAX-I和3μg/mL嘌呤霉素(InvivoGen，目录号ant-pr)的DMEM培养基中培养。通过流式细胞术检测4-1BB转导的HeLa细胞的4-1BB表达：将0.2x106个活细胞重悬于100μL FACS缓冲液中，所述缓冲液含有0.1μg PerCP/Cy5.5缀合的抗人4-1BB小鼠IgG1κ克隆4B4-1(BioLegend目录号309814)或其同种型对照(PerCP/Cy5.5缀合的小鼠IgG1κ同种型对照抗体克隆MOPC21，BioLegend目录号400150)，在4℃下温育30分钟。细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于含有0.06μg DAPI的300μL FACS缓冲液中，并在当日使用5激光LSR-Fortessa收获细胞。通过有限稀释产生单个克隆。为此，将人4-1BB转导的HeLa细胞重悬于培养基中达到10个、5个和2.5个细胞/mL的密度，将200μL细胞悬液转移到组织培养物处理的圆底96孔板(6个板/细胞浓度，TPP目录号92697)中。如上所述收获单个克隆，扩增并检测4-1BB表达。选择具有最高4-1BB表达的克隆(克隆5)，以备进一步用Roche生产的NFκB萤光素酶表达载体5495p Tranlucent HygB进行转染。表达载体5495p Tranlucent HygB将潮霉素B抗性结合到NFκB(1)萤光素酶报告载体(Panomics，目录号LR0051)中。培养人4-1BB HeLa克隆5细胞至70％汇合。将50μg(40μL)线性化(限制酶AseI和SalI)5495p Tranlucent HygB表达载体DNA加入到无菌的0.4cm GenePulser/MicroPulser电击杯(Biorad，目录号165-2081)中。加入400μl无补充剂的DMEM中的2.5x 106个人4-1BB HeLa克隆5细胞，与质粒溶液仔细混合。将电击杯应用到Gene PulserXcell总系统(Biorad，目录号165 2660)中，在以下设置下进行电穿孔转染：指数脉冲，电容500μF，电压160V，电阻∞。在脉冲转染细胞之后立即转移到具有15mL的37℃温热DMEM培养基的75cm2的组织培养瓶(TPP，目录号90075)中，所述培养基补充有10％FBS和1％GlutaMAXI。接种24小时后，加入含有3μg/mL嘌呤霉素和200μg/mL潮霉素B(Roche，目录号10843555001)的选择培养基。然后，将存活的细胞扩增并且如上所述进行有限稀释以产生单个克隆。
如上所述检测克隆的4-1BB表达并且如下检测克隆的NF-κB-萤光素酶活性：在选择培养基中收获克隆，并使用Cell Counter Vi-cell xr 2.03(Beckman Coulter，目录号731050)进行计数。将细胞设定为0.33x106个细胞/mL的细胞密度，并将150μL该细胞悬液转移到具有盖的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio one，目录号655083)的每个孔中并且转移到常规的96孔平底组织培养板(TPP目录号92096)作为对照，次日检测存活和细胞密度。细胞在37℃和5％CO2下温育过夜。次日，将50μL含有不同浓度的重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα,PeproTech，目录号300 01A)的培养基加入到白色96孔板的每个孔中，得到100、50、25、12.5、6.25和0ng/孔的rhTNFα终浓度。将细胞在37℃和5％CO2下温育6小时，然后用200μL/孔的DPBS洗涤3次。向每个孔中加入30μl新鲜制备的报告子裂解缓冲液(Promega，目录号E3971)，并将板在-20℃下保存过夜。次日将冷冻的细胞板和检测缓冲液(Luciferase 1000 Assay System，Promega，目录号E4550)解冻至室温。将100μL的检测缓冲液加入每个孔中，使用SpectraMax M5/M5e酶标仪和SoftMax Pro Software(MolecularDevices)立即检测所述板，其中设置如下：对于萤光素酶(RLU)，500ms积分时间，无滤光片，收集所有波长和顶部读数。取测得的高于对照(未添加rhTNFα)的URL作为萤光素酶活性。选择显示出最高荧光素酶活性和明显4-1BB表达的NF-κB-luc-4-1BB-HeLa克隆26以备进一步使用。
11.1.2与交联抗人IgG1 Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段共培养的表达人4-1BB的HeLa细胞中的NFκB活化
收获NF-κB-萤光素酶人4-1BB HeLa细胞并重悬于补充有10％胎牛血清和1％GlutaMAX I的DMEM培养基中，浓度为0.8x106个细胞/mL。将100μL(8x104个细胞)的该细胞悬液转移到具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio one，目录号655083)的每个孔中，并将平板在37℃和5％CO2下温育过夜。次日，加入50μL/孔的含有逐步滴加的FAP或DP47靶向的单链三聚体的人4-1BBL抗原结合分子的培养基。为了交联，以1:4的比率(二级抗体比一级单链三聚体的人4-1BBL抗原结合分子多4倍)加入50μL/孔的含有二级抗体抗人IgG Fcγ片段特异性山羊IgG F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目录号109-006-098)的培养基。
将板在37℃和5％CO2下温育6小时。如在实施例11.1.1中所述测定萤光素酶活性。测定原理展示在图15中。
如图16中所示，通过FAP靶向的单链三聚体的人4-1BBL(实心圆)或含有DP47的单链三聚体的人4-1BBL(空心圆，虚线)的二级多克隆抗huIgG1 Fcγ特异性山羊IgG F(ab)2片段的交联导致NFκB启动子的相似活化，如通过报告细胞系中萤光素酶表达的水平所评估的。因此，在它们的人工诱导的非特异性寡聚化之后，含有DP47的和FAP靶向的单链三聚体的人4-1BBL分子显示出相当的在细胞表面激动性地接合4-1BB的能力。
11.1.3通过表达FAP的肿瘤细胞在表达人4-1BB的HeLa细胞中的NFκB活化
收获NF-κB-萤光素酶人4-1BB HeLa细胞并重悬于补充有10％FBS和1％GlutaMAXI的DMEM培养基中，浓度为0.2x106个细胞/mL。将100μL(2x104个细胞)的该细胞悬液转移到具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio one，目录号655083)的每个孔中，并将平板在37℃和5％CO2下温育过夜。次日，加入50μL含有逐步滴加的FAP或DP47靶向的单链三聚体的人4-1BBL抗原结合分子的培养基。
将下列表达人FAP的肿瘤细胞重悬于补充有10％FBS和1％GlutaMAX-I的DMEM中，浓度为2x106个细胞/mL：
人黑色素瘤细胞系MV3(首次公开于van Muijen GN等人1991)、
人类女性黑色素瘤WM-266-4细胞系(ATCC No.CRL-1676)、和
用表达载体pETR4921转染以表达人FAP和嘌呤霉素抗性的小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3(ATCC No.CRL-1658)：如实施例10.2中所述的NIH/3T3-huFAP克隆39。
向每个孔中加入50μL表达FAP的肿瘤细胞悬液。在加入交联的表达FAP的肿瘤细胞或培养基(无交联)之后，将板在37℃和5％CO2下温育6小时。如在实施例11.1.1中所述测定萤光素酶活性。逐步增加NFκB-萤光素酶人CD137HeLa细胞和3T3-人FAP克隆39细胞之间的温育时间和比率，并将时间和比率设定为达到荧光素酶激活平台的值。测定原理显示在图17中。
如图18A至18D中所示，FAP靶向的含有单链4-1BBL三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1)(实心圆)可以经由表达FAP的肿瘤细胞而交联，导致报告细胞系中浓度依赖性方式的NFκB介导的萤光素酶活化。相比之下，在相同的实验条件下，含有DP47的单链三聚体的人4-1BBL(对照1)不能使该报告细胞系活化。在缺乏交联的情况下(不添加表达FAP的肿瘤细胞)，两种分子都不能诱导报告细胞系中的NFκB介导的萤光素酶活化。
如图19A至19C中所示，单价或二价的FAP(4B9或28H1)靶向的单链三聚体的4-1BBLFc(kih)融合抗原结合分子可以通过表达FAP的肿瘤细胞而交联，因此可以浓度依赖性方式诱导报告细胞系HeLa-hu4-1BB-NF-κB-luc中的NFκB介导的荧光素酶活化。相比之下，单价或二价的DP47非靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合分子(对照1和2)在没有交联的情况下不能激活报告细胞系。在缺乏交联的情况下(不添加表达FAP的肿瘤细胞)，所有分子均不能诱导报告细胞系中的NFκB介导的萤光素酶活化。单价的FAP靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子比二价的FAP(4B9)靶向的单链三聚体的4-1BB配体(kih)融合分子诱导更强的活化，这也反映出与表达FAP的肿瘤细胞的结合。然而，在4B9和28H1FAP结合性克隆之间的差异不如在针对表达FAP的肿瘤细胞的结合测定中那么强。单价的FAP(4B9)靶向的单链三聚体的4-1BB配体(kih)融合分子仍然显示略低的EC50值，这可以通过对FAP的较高亲和力来解释。
11.1.4通过表达CEA的肿瘤细胞在表达人4-1BB的HeLa细胞中的NFκB活化
使用HeLa人4-1BB-NF-κB-luc报告细胞连同表达CEA的肿瘤细胞系以与11.1.3中所述相同的方式进行了NFκB活化测定，不过将表达FAP的肿瘤细胞替换为已经在本申请的实施例10.3中描述的表达CEA的MKN45肿瘤细胞系。
如图20A和20B中所示，单价和二价的CEA(sm9b)靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子可以通过表达CEA的肿瘤细胞而交联，因此可以浓度依赖性方式诱导报告细胞系HeLa-hu4-1BB-NF-κB-luc中的NFκB介导的荧光素酶活化。相比之下，单价或二价的DP47非靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合分子(对照1和2)在没有交联的情况下不能激活报告细胞系。在缺乏交联的情况下(不添加表达CEA的肿瘤细胞MKN45)，所有分子均不能诱导报告细胞系中的NFκB介导的萤光素酶活化。单价的CEA(sm9b)靶向的单链三聚体的4-1BB配体(kih)融合分子(化合物S5)比二价的CEA(sm9b)靶向的单链三聚体的4-1BB配体(kih)融合分子(化合物S4)诱导更强的活化，这也反映出图13E中所示的与表达CEA的人MKN45肿瘤细胞系的结合的MFI。
11.1.5表达人OX40的HeLa细胞和报告基因NFκB-萤光素酶
OX40与其配体的激动性结合通过NFκB活化诱导下游信号转导(Weinberg等人，2004)。生成了重组报告细胞系HeLa_hOx40_NFκB_Luc1，以便在其表面上表达人OX40。另外，它包含报告基因质粒，所述报告基因质粒含有在NFκB敏感性增强子区控制下的萤光素酶基因。Ox40触发诱导在细胞核中易位的NFκB的剂量依赖性活化，后者在报告基因质粒的NFκB敏感增强子上结合以增加萤光素酶蛋白的表达。萤光素酶催化萤光素氧化，生成发光的氧化萤光素。这可以通过发光计进行定量。一项实验的范围是测试单链三聚体的人OX40L抗原结合分子在HeLa_hOx40_NFκB_Luc1细胞中诱导NFκB活化的能力。
Morris等人表明，通过常规抗Ox40抗体的激动性共刺激依赖于表面固定(Morris等人，2007)。因此，为了实现OX40的更高程度的超交联，使FAP靶向的单链三聚体的人OX40L抗原结合分子与天然表达FAP的WM-266-4肿瘤细胞超交联。
11.1.6通过表达FAP的肿瘤细胞在表达人OX40的HeLa细胞中的NFκB活化
所有离心在4℃下以350x g进行5分钟。为了洗涤细胞，用指示的缓冲液充满管或孔。离心后，吸出上清液，将细胞沉淀重悬于指示的缓冲液中。
使用细胞解离缓冲液(Invitrogen，目录号13151-014)在37℃收获粘附的HeLa_hOX40_NFκB_Luc1细胞和WM-266-4细胞10分钟。用DPBS将细胞洗涤一次。在含有MEM(Invitrogen，目录号22561-021)、10％(v/v)热灭活的FBS、1mM丙酮酸钠和1％(v/v)非必需氨基酸的测定培养基中将HeLa_hOX40_NFκB_Luc1细胞调整至2x105个细胞/mL的细胞密度。将细胞以0.3x105个细胞/孔的密度接种在具有盖子的无菌白色96孔平底组织培养板(greiner bio one，目录号655083)中，并在培养箱(Hera Cell 150)中在37℃和5％CO2下保持过夜。次日，加入含有逐步滴加的FAP靶向的或含有DP47的单链三聚体的人OX40L抗原结合分子的测定培养基将HeLa_hOX40_NFκB_Luc1刺激6小时。对于超交联，将表达人FAP的WM266-4肿瘤细胞在测定培养基中调整至3x106个细胞/mL的细胞密度，并加入细胞至最终密度为0.75x105个细胞/孔。
在培养箱中在37℃和5％CO2下温育6小时后，吸出上清液，用DPBS洗板两次。根据制造商的说明，使用萤光素酶100测定系统和报告基因裂解缓冲液(均来自Promega，目录号E4550和目录号E3971)进行光发射的定量。
通过HeLa_hOX40_NFκB_Luc1细胞的基础发光校正发射的相对光单位(URL)，并使用Prism4(GraphPad Software,USA)针对一级抗体的对数浓度进行印迹。使用内置的S形剂量反应来拟合曲线。
如图21中所示，FAP靶向和含有DP47的单链三聚体的人OX40L Fc(kih)融合分子(实心圆和空心圆)都诱导了可检测的NFκB活化。这与使用没有通过二级抗体进行超交联的显示出没有NFκB诱导活性的单链三聚体的人4-1BBL分子所观察到的相反。通过FAP靶向的单链三聚体的人OX40L Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S10，实心圆)，经由表达FAP的肿瘤细胞WM-266-4的超交联以浓度依赖性方式强烈增加了NFκB介导的荧光素酶表达的诱导。当使用含有DP47的单链三聚体的人OX40L Fc(kih)融合分子时，没有观察到这样的效应。
11.2基于抗原特异性CD8+ T细胞的测定
11.2.1抗原特异性CD8 T细胞的分离和培养
从HLA-A2+的CMV感染志愿者获得新鲜血。通过Ficoll密度离心如实施例10.1中所述分离PBMC。根据制造商的建议，使用阴性选择人CD8 T细胞分离试剂盒(MiltenyiBiotec，目录号130-094-156)从PBMC中纯化CD8 T细胞。将1000万个分离的CD8T细胞重悬于补充有1％(v/v)FBS的1mL无菌DPBS中，其中DPBS还补充有50μL的含有CMV衍生的NLVPMVATV肽(ProImmune，目录号F008-2B，SEQ ID NO:183)的PE标记的HLA-A2-五聚体，并在室温下温育10分钟。用补充有1％(v/v)FBS的3mL无菌DPBS将细胞洗涤两次。将细胞重悬于含有1μg/mL抗人CD8-FITC(克隆LT8，Abcam，目录号Ab28010)的补充有1％(v/v)FBS的1mL DPBS中，并在4℃下温育30分钟。然后，将细胞洗涤两次，以5x106个细胞/mL的浓度重悬于补充有1％(v/v)FBS的DPBS中，并通过30μm预分离尼龙网细胞过滤器(Miltenyi Biotec，目录号130-041-407)过滤。通过使用ARIA细胞分选仪(BD Bioscience，DIVA软件)通过FACS分选分离NLV肽特异性CD8+ T细胞，所述细胞分选仪具有以下设置：100μm喷嘴和纯度分选掩模。将分选的细胞收集在含有补充10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I和400U/mL普留净的5mlRPMI 1640培养基的15ml聚丙烯离心管(TPP，目录号91015)中。将分选的细胞在室温下以350x g离心7分钟，重悬于相同培养基中，浓度为0.53x106个细胞/mL。将该细胞悬液以100μL/孔加入预先准备的具有PHA-L激活的照射的异基因饲养细胞的板的每个孔中。如前所述(Levitsky等人，1998)从PBMC制备饲养细胞，并且使用每孔2x105个饲养细胞分配至96孔培养板。
培养1天后，从每个孔中移出100μL培养基，更换为补充有10％(v/v)FBS和1％(v/v)GlutaMAX-I和400U/mL普留净的新的RPMI 1640培养基。在培养期间定期重复此操作(每2-4天一次)。一旦NLV特异性CD8+ T细胞开始增殖，就将其转移到24孔平底组织培养板(TPP,92024)上。使细胞扩增/分裂，定期地用新的饲养细胞制剂再活化。
11.2.2抗原特异性CD8+ T细胞的活化测定
收获表达人FAP的黑色素瘤细胞系MV3细胞系(描述于实施例11.1.3中)的细胞并用DPBS洗涤，并将2x107个细胞重悬于250μL的PKH-26 Red Fluorescence Cell linkerKit(Sigma，目录号PKH26GL)的C稀释剂中。将1μL PKH26-Red染色溶液用250μL C稀释剂稀释，并加入到MV3细胞悬液中，然后在黑暗中在室温下温育5分钟。加入0.5mL FBS，将细胞温育1分钟，并用由RPMI 1640培养基组成的T细胞培养基洗涤一次，所述RPMI 1640培养基补充有10％(v/v)FBS、1％(v/v)GlutaMAX-I、1mM丙酮酸钠、1％(v/v)MEM非必需氨基酸和50μMβ-巯基乙醇。将1x106个MV3细胞/mL重悬于T细胞培养基中并分到三个管中。加入合成的NLVPMVATV肽(从Thinkpeptides获得，SEQ ID NO:181)至终浓度为1x10-9M或1x10-8M，在37℃和5％CO2下将细胞在旋转下温育90分钟。将MV3细胞用T细胞培养基洗涤一次，并以0.5x106个细胞/mL的密度重悬，分配(100μL/孔)到96孔圆底细胞悬浮板(Greiner bio-one，cellstar，目录号650185)中，在37℃和5％CO2下温育过夜。
次日，加入FAP靶向的和含有DP47的单链三聚体的人4-1BBL分子与50μL的T细胞培养基以达到指示的终浓度。收获NLV特异性CD8 T细胞，洗涤并在每孔中加入50μL培养基(最终肿瘤:CD8 T细胞比率为0.125)。将细胞温育24小时，并向每孔加入50μL/孔的含有2.64μL/mL的Golgi终止液(含莫能菌素的蛋白转运抑制剂，BD Bioscience，目录号554724)的T细胞培养基。将细胞另外温育4小时，用200μL/孔的DPBS洗涤，用含有1:5000稀释的可固定活力染料eF450(eBioscience，目录号65-0864)的100μL DPBS在4℃染色30分钟。用DPBS洗涤细胞并在含有以下荧光染料缀合的抗体的40μL/孔FACS缓冲液中染色：抗人CD137-PerCP/Cy5.5(克隆4B4-1，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号309814)，抗人CD8-BV605(克隆RPA T8，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号301012)和抗人CD25 PE/Cy7(克隆BC96，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号302612)。在4℃下温育30分钟后，用200μL/孔的FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬于50μL/孔新鲜制备的FoxP3 Fix/Perm缓冲液(eBioscience目录号00-5123和00-5223)中，在4℃下温育30分钟。用200μL/孔的Perm-Buffer(补充有2％(v/v)FBS、1％(w/v)皂苷(Sigma Life Science，S7900)和1％(w/v)叠氮化钠(Sigma-Aldrich，S2002)的DPBS)洗板两次，并用50μL/孔的Perm-Buffer(eBioscience，目录号00-8333-56)染色，所述Perm-Buffer含有0.25μg/mL的抗人IFNγ-APC(克隆B27，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号506510)。将板在4℃下温育1小时，用200μL/孔的Perm-Buffer洗涤两次。为了固定，加入含有1％甲醛的50μL/孔的DPBS，细胞在4℃下储存过夜。次日，将细胞重悬于100μL/孔的FACS缓冲液中，并使用5激光Fortessa流式细胞仪(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。测定原理显示在图22中。
如图23A至23F中所示，抗原特异性的经刺激的CD8+ T细胞(而不是未刺激的对照)在FAP靶向的单链三聚体的人4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子(化合物S1，实心圆)存在下表现出表面4-1BB表达水平的增加。三聚体的人4-1BBL的这种作用是剂量依赖性的并且需要FAP靶向，因为添加非靶向的对照分子(对照1)不影响4-1BB表达水平。此外，在较高肽浓度(1x10-8M)下活化的T细胞在FAP靶向单链三聚体的人4-1BBL存在下显示出持续的INFγ分泌(图24A至24F)。值得注意的是，这种作用与FAP靶向的单链三聚体的人4-1BBL对4-1BB上调的作用相比需要更强的初级TCR触发，因为在低的肽浓度时也清楚地观察到后者。总的来说，这些数据表明，FAP靶向的单链三聚体的人4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子以靶向依赖的方式调节抗原特异性T细胞的表面表型和反应性。
如图25和26中所示，用NLV肽(活化信号1)和交联的单价或二价的FAP(28H1或4B9)靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子(活化信号2)共同刺激的抗原特异性CD8+ T细胞(而不是未刺激的对照)表现出表面4-1BB表达和IFNγ分泌水平的增加。这种作用对于NLV肽浓度以及FAP靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子的浓度而言是剂量依赖性的。总的来说，这些数据表明，FAP靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子以靶向依赖的方式调节抗原特异性T细胞的表面表型和反应性。在使用HeLa-hu4-1BB-NK-κB-luc报告细胞系的活化测定中，可以看到单价的FAP(28H1)靶向的和FAP(4B9)靶向的单链三聚体的4-1BB配体(kih)融合分子之间的相同差异，例如，单价的FAP(4B9)靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子显示出较低的EC50值。与HeLa-hu 4-1BB-NK-κB-luc报告细胞系活化测定不同，在单价的和二价的FAP(4B9)靶向的单链三聚体的4-1BB配体(kih)融合分子之间没有看到很大差异。在高NLV肽浓度(10-8M)下，似乎可以看出，二价的FAP(4B9)靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子产生优于单价的FAP(4B9)靶向的单链三聚体的4-1BBL Fc(kih)融合抗原结合分子的活化。
11.3 OX40介导的次最佳TCR触发的静息人PBMC的共刺激
人PBMC制剂含有(1)静息OX40阴性CD4+和CD8+ T细胞和(2)在其细胞表面上具有各种Fcγ受体分子的抗原呈递细胞，例如B细胞和单核细胞。人IgG1同种型的抗人CD3抗体可以其Fc部分与Fcγ受体分子结合，并介导静息的OX40阴性CD4+和CD8+ T细胞上的TCR触发，从而在几小时内开始表达OX40。针对OX40的功能性激动性化合物可以通过活化的CD8+和CD4+ T细胞上存在的OX40受体发信号，并支持TCR介导的刺激，从而导致活的CD4+和CD8+ T细胞的更突出的表型变化(例如更高的CD25表达水平)、增殖增强和数量增加。
用HeLa_hOx40_NFκB_Luc1报告细胞系进行的实验表明三聚体单链Ox40L分子具有一定的诱导NFκB表达的内在能力(参见实施例11.1.5)。通过借助于表达FAP的肿瘤细胞的FAP靶向化合物的额外超交联，大大增强了激动作用。因此，在NIH/3T3-huFAP克隆39细胞和含有DP47(非靶向)和FAP靶向的三聚体的单链Ox40L分子的存在下进行静息人PBMC的次最佳TCR刺激，以测试在具有和没有进一步超交联情况下的共刺激活性。
使用细胞解离缓冲液(Invitrogen，目录号13151-014)在37℃收获小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3-huFAP克隆39细胞(参见实施例9.2)10分钟。细胞用DPBS洗涤一次。将NIH/3T3-huFAP克隆39细胞在T细胞培养基中调节至1.6x105的细胞密度，并以每孔0.2x105个细胞的密度接种在无菌96孔圆底粘附组织培养板(TPP，目录号92097)中。将板在培养箱(HeraCell 150)中在37℃和5％CO2下保存过夜，然后在第二天使用4500RAD剂量在xRay辐照仪中照射，以防止人PBMC随后由于该细胞系而生长过度。
如9.1所述通过Ficoll密度离心分离人PBMC并用CFSE标记。然后将细胞以1x106个细胞/mL的细胞密度用[50nm]终浓度的CFDA-SE(Sigma-Aldrich，目录号2188)在37℃下染色10分钟。此后，将细胞用含有FBS(10％v/v)的过量DPBS洗涤两次。将标记的细胞在T细胞培养基中在37℃下静置30分钟。此后，用DPBS通过两个另外的洗涤步骤除去未转化的CFDA-SE。将CFSE标记的静息人PBMC在T细胞培养基中调整至3x106个细胞/mL的细胞密度，并以每孔0.75x105个细胞的密度加入每个孔中。以指定浓度加入FAP靶向的和含有DP47的单链三聚体的Ox40L抗原结合分子，并以10nM的终浓度加入抗人CD3抗体(克隆V9，人IgG1)。将板在37℃和5％CO2下保持四天。48小时后进行一半培养基更换。
4天后，用DPBS洗涤细胞，然后在含有以下荧光染料缀合的抗体的25μL/孔的FACS缓冲液中染色：0.250μg/mL抗人CD4-BV421(克隆RPA-T4，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号300532)、0.250μg/mL CD8-BV711(克隆RPa-T8，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号3010441)、0.250μg/mL抗人CD25-PerCP Cy5.5(克隆M-A251，小鼠IgG1κ，BioLegend，目录号356112)。在4℃下温育30分钟后，用200μL/孔的FACS缓冲液洗涤细胞两次，重悬于50μL/孔新鲜制备的FoxP3 Fix/Perm缓冲液(eBioscience目录号00-5123和00-5223)中，在黑暗中在室温下温育45分钟。将板用200μL/孔的Perm-Wash-(eBioscience，目录号00-8333-56)洗涤三次，然后用5μL/孔的Perm-Buffer(eBioscience，目录号00-8333-56)染色，所述Perm-Buffer含有0.25μg/mL抗人颗粒酶B-PE(克隆GB-11，小鼠IgG1κ，BD Bioscience，目录号561142)和0.60μg/mL抗人Eomes-eFluor 670(克隆WD2918，小鼠IgG1κ，eBioscience，目录号50-4877-42)。将板在黑暗中在室温下温育1小时，用200μL/孔的Perm-Buffer洗涤两次。将细胞重悬于85μL/孔的FACS缓冲液中，并使用5激光Fortessa流式细胞仪(BD Bioscience，DIVA软件)收获细胞。
如图27中所示，在用抗人CD3抗体次最佳刺激的人CD4+(左侧)和CD8+ T细胞(右侧)中，用含有DP47的三聚体的单链Ox40L抗原结合分子共刺激仅略微促进增殖和增强活化细胞表型(CD25表达)。通过NIH/3T3-huFAP克隆39细胞，FAP靶向的三聚体单链Ox40L的超交联强烈地增加了这种效应。这与HeLa_hOx40_NFκB_Luc1细胞中的发现(图21)相反，其中三聚体的单链Ox40L分子本身已经具有强激动性。这可能是由于OX40在报告细胞系中的非生理学高表达的缘故，其最有可能导致低信号转导OX40R寡聚物单元的预装配，从而相比于Ox40+ T细胞降低了报告细胞系中激动性信号传导的阈值。另外，细胞背景很可能决定OX40触发的结果，因为在T细胞中需要通过TCR的伴随信号传导(但在报告细胞系中不需要)，以便观察OX40接合的效应。
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***
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 包含三聚体TNF家族配体的抗原结合分子
<130> P32693-WO
<150> EP15161880.8
<151> 2015-03-31
<160> 183
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 184
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 1
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
180
<210> 2
<211> 170
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 2
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170
<210> 3
<211> 175
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 3
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
165 170 175
<210> 4
<211> 203
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 4
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200
<210> 5
<211> 572
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的三聚体hu 4-1BBL (71-254)
<400> 5
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala
385 390 395 400
Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln
405 410 415
Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly
420 425 430
Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr
435 440 445
Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln
450 455 460
Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala
485 490 495
Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn
500 505 510
Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln
515 520 525
Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp
530 535 540
Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro
545 550 555 560
Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
565 570
<210> 6
<211> 133
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 6
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu
130
<210> 7
<211> 132
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 7
Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr
1 5 10 15
Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp
20 25 30
Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly
35 40 45
Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile
50 55 60
Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys
65 70 75 80
Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp
85 90 95
Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe
100 105 110
His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu
115 120 125
Phe Cys Val Leu
130
<210> 8
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的三聚体huOX40L((51-183)
<400> 8
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr
145 150 155 160
Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp
165 170 175
Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly
180 185 190
Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile
195 200 205
Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys
210 215 220
Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp
225 230 235 240
Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe
245 250 255
His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu
260 265 270
Phe Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
275 280 285
Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu
290 295 300
Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu
305 310 315 320
Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe
325 330 335
Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asn Ile Ser
340 345 350
Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val
355 360 365
Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys
370 375 380
Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His
385 390 395 400
Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe
405 410 415
Cys Val Leu
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H1
<400> 9
Ser His Ala Met Ser
1 5
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H2
<400> 10
Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-H3
<400> 11
Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr
1 5
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L1
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L2
<400> 13
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) CDR-L3
<400> 14
Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr
1 5
<210> 15
<211> 809
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 三聚体hu 4-1BBL(71-254)加Fc节链
<400> 15
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu
195 200 205
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
210 215 220
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
225 230 235 240
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
245 250 255
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
260 265 270
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
275 280 285
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
305 310 315 320
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
325 330 335
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
340 345 350
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
355 360 365
Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala
385 390 395 400
Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln
405 410 415
Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly
420 425 430
Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr
435 440 445
Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln
450 455 460
Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser
465 470 475 480
Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala
485 490 495
Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn
500 505 510
Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln
515 520 525
Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp
530 535 540
Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro
545 550 555 560
Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Ser Pro Gly
565 570 575
Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
580 585 590
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
595 600 605
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
610 615 620
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
625 630 635 640
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
645 650 655
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
660 665 670
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
675 680 685
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
690 695 700
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
705 710 715 720
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
725 730 735
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
740 745 750
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
755 760 765
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
770 775 780
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
785 790 795 800
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
805
<210> 16
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VH
<400> 16
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(28H1) VL
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 18
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP(28H1) Fc穴链
<400> 18
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 19
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP(28H1)轻链
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 20
<211> 656
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 三聚体hu OX40L(51-183)加Fc节链
<400> 20
Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe
1 5 10 15
Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu
20 25 30
Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asp Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp
35 40 45
Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asp
50 55 60
Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys
65 70 75 80
Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys
85 90 95
Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp
100 105 110
Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly
115 120 125
Glu Phe Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr
145 150 155 160
Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp
165 170 175
Glu Ile Met Lys Val Gln Asp Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly
180 185 190
Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asp Ile
195 200 205
Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys
210 215 220
Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp
225 230 235 240
Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe
245 250 255
His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu
260 265 270
Phe Cys Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
275 280 285
Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val Gln Phe Thr Glu
290 295 300
Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln Lys Glu Asp Glu
305 310 315 320
Ile Met Lys Val Gln Asp Asn Ser Val Ile Ile Asn Cys Asp Gly Phe
325 330 335
Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu Val Asp Ile Ser
340 345 350
Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln Leu Lys Lys Val
355 360 365
Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr Tyr Lys Asp Lys
370 375 380
Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu Asp Asp Phe His
385 390 395 400
Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn Pro Gly Glu Phe
405 410 415
Cys Val Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Asp Lys Thr
420 425 430
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
435 440 445
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
450 455 460
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
465 470 475 480
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
485 490 495
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
500 505 510
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
515 520 525
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr
530 535 540
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
545 550 555 560
Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys
565 570 575
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
580 585 590
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
595 600 605
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
610 615 620
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
625 630 635 640
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
645 650 655
<210> 21
<211> 760
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 21
Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His
20 25 30
Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln
325 330 335
Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu
500 505 510
Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe
515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu
725 730 735
Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu
740 745 750
Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 22
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hu FAP外域 + poly-lys标签 + his标签
<400> 22
Arg Pro Ser Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe
20 25 30
Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn
35 40 45
Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Arg Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser
65 70 75 80
Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly
100 105 110
Glu Phe Val Arg Gly Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys
115 120 125
Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile
130 135 140
Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn
145 150 155 160
Gly Arg Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu
165 170 175
Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly
180 185 190
Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile
210 215 220
Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile
225 230 235 240
Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val
245 250 255
Pro Ala Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp
260 265 270
Val Thr Asp Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn
275 280 285
Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp
290 295 300
Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp
305 310 315 320
Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile
325 330 335
Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His
340 345 350
Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys
355 360 365
Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr
370 375 380
Ser Ser Asn Glu Phe Glu Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg
385 390 395 400
Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His
405 410 415
Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr
420 425 430
Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser
435 440 445
Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu
450 455 460
Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu
465 470 475 480
Glu Ile Lys Lys Leu Glu Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met
485 490 495
Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile
500 505 510
Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala
515 520 525
Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala
530 535 540
Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr
545 550 555 560
Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr
565 570 575
Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile
580 585 590
Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly
625 630 635 640
Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val
645 650 655
Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His
660 665 670
Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala
675 680 685
Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser
690 695 700
Asp Gln Asn His Gly Leu Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr
705 710 715 720
His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly Lys
725 730 735
Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
740 745
<210> 23
<211> 2244
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA hu FAP外域 + poly-lys标签 + his标签
<400> 23
cgcccttcaa gagttcataa ctctgaagaa aatacaatga gagcactcac actgaaggat 60
attttaaatg gaacattttc ttataaaaca ttttttccaa actggatttc aggacaagaa 120
tatcttcatc aatctgcaga taacaatata gtactttata atattgaaac aggacaatca 180
tataccattt tgagtaatag aaccatgaaa agtgtgaatg cttcaaatta cggcttatca 240
cctgatcggc aatttgtata tctagaaagt gattattcaa agctttggag atactcttac 300
acagcaacat attacatcta tgaccttagc aatggagaat ttgtaagagg aaatgagctt 360
cctcgtccaa ttcagtattt atgctggtcg cctgttggga gtaaattagc atatgtctat 420
caaaacaata tctatttgaa acaaagacca ggagatccac cttttcaaat aacatttaat 480
ggaagagaaa ataaaatatt taatggaatc ccagactggg tttatgaaga ggaaatgctt 540
gctacaaaat atgctctctg gtggtctcct aatggaaaat ttttggcata tgcggaattt 600
aatgatacgg atataccagt tattgcctat tcctattatg gcgatgaaca atatcctaga 660
acaataaata ttccataccc aaaggctgga gctaagaatc ccgttgttcg gatatttatt 720
atcgatacca cttaccctgc gtatgtaggt ccccaggaag tgcctgttcc agcaatgata 780
gcctcaagtg attattattt cagttggctc acgtgggtta ctgatgaacg agtatgtttg 840
cagtggctaa aaagagtcca gaatgtttcg gtcctgtcta tatgtgactt cagggaagac 900
tggcagacat gggattgtcc aaagacccag gagcatatag aagaaagcag aactggatgg 960
gctggtggat tctttgtttc aacaccagtt ttcagctatg atgccatttc gtactacaaa 1020
atatttagtg acaaggatgg ctacaaacat attcactata tcaaagacac tgtggaaaat 1080
gctattcaaa ttacaagtgg caagtgggag gccataaata tattcagagt aacacaggat 1140
tcactgtttt attctagcaa tgaatttgaa gaataccctg gaagaagaaa catctacaga 1200
attagcattg gaagctatcc tccaagcaag aagtgtgtta cttgccatct aaggaaagaa 1260
aggtgccaat attacacagc aagtttcagc gactacgcca agtactatgc acttgtctgc 1320
tacggcccag gcatccccat ttccaccctt catgatggac gcactgatca agaaattaaa 1380
atcctggaag aaaacaagga attggaaaat gctttgaaaa atatccagct gcctaaagag 1440
gaaattaaga aacttgaagt agatgaaatt actttatggt acaagatgat tcttcctcct 1500
caatttgaca gatcaaagaa gtatcccttg ctaattcaag tgtatggtgg tccctgcagt 1560
cagagtgtaa ggtctgtatt tgctgttaat tggatatctt atcttgcaag taaggaaggg 1620
atggtcattg ccttggtgga tggtcgagga acagctttcc aaggtgacaa actcctctat 1680
gcagtgtatc gaaagctggg tgtttatgaa gttgaagacc agattacagc tgtcagaaaa 1740
ttcatagaaa tgggtttcat tgatgaaaaa agaatagcca tatggggctg gtcctatgga 1800
ggatacgttt catcactggc ccttgcatct ggaactggtc ttttcaaatg tggtatagca 1860
gtggctccag tctccagctg ggaatattac gcgtctgtct acacagagag attcatgggt 1920
ctcccaacaa aggatgataa tcttgagcac tataagaatt caactgtgat ggcaagagca 1980
gaatatttca gaaatgtaga ctatcttctc atccacggaa cagcagatga taatgtgcac 2040
tttcaaaact cagcacagat tgctaaagct ctggttaatg cacaagtgga tttccaggca 2100
atgtggtact ctgaccagaa ccacggctta tccggcctgt ccacgaacca cttatacacc 2160
cacatgaccc acttcctaaa gcagtgtttc tctttgtcag acggcaaaaa gaaaaagaaa 2220
aagggccacc accatcacca tcac 2244
<210> 24
<211> 761
<212> PRT
<213> 小鼠（mus musculus）
<400> 24
Met Lys Thr Trp Leu Lys Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Val Val Ile Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr
20 25 30
Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu
50 55 60
Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn
65 70 75 80
Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys
85 90 95
Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val
100 105 110
Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala
115 120 125
Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr
130 135 140
Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser
145 150 155 160
Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro
165 170 175
Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile
180 185 190
Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr
195 200 205
Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val
210 215 220
Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly
225 230 235 240
Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly
245 250 255
Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro
260 265 270
His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser
275 280 285
Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val
290 295 300
Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile
305 310 315 320
Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln
325 330 335
Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val
340 345 350
Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe
355 360 365
Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val
370 375 380
Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile
385 390 395 400
Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu
405 410 415
Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser
420 425 430
Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys
435 440 445
Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu
450 455 460
Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg
465 470 475 480
Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn
485 490 495
Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys
500 505 510
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515 520 525
Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro
530 535 540
Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr
545 550 555 560
Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly
565 570 575
Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu
580 585 590
Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile
595 600 605
Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser
610 615 620
Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu
625 630 635 640
Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr
645 650 655
Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp
660 665 670
Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr
675 680 685
Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn
690 695 700
Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala
705 710 715 720
Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile
725 730 735
Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe
740 745 750
Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp
755 760
<210> 25
<211> 749
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠FAP外域 + poly-lys标签 + his标签
<400> 25
Arg Pro Ser Arg Val Tyr Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe
20 25 30
Pro Asn Trp Ile Ser Glu Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp
35 40 45
Asn Ile Val Phe Tyr Asn Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Ser Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser
65 70 75 80
Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly
100 105 110
Glu Phe Val Arg Gly Tyr Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys
115 120 125
Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile
130 135 140
Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr
145 150 155 160
Gly Arg Glu Asn Arg Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu
165 170 175
Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly
180 185 190
Lys Phe Leu Ala Tyr Val Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile
210 215 220
Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile
225 230 235 240
Val Asp Thr Thr Tyr Pro His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val
245 250 255
Pro Glu Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp
260 265 270
Val Ser Ser Glu Arg Val Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn
275 280 285
Val Ser Val Leu Ser Ile Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp
290 295 300
Glu Cys Pro Lys Asn Gln Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp
305 310 315 320
Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr
325 330 335
Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His
340 345 350
Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys
355 360 365
Trp Glu Ala Ile Tyr Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr
370 375 380
Ser Ser Asn Glu Phe Glu Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg
385 390 395 400
Ile Ser Ile Gly Asn Ser Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His
405 410 415
Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys
420 425 430
Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser
435 440 445
Thr Leu His Asp Gly Arg Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu
450 455 460
Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val
465 470 475 480
Glu Ile Lys Lys Leu Lys Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met
485 490 495
Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile
500 505 510
Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala
515 520 525
Val Asn Trp Ile Thr Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala
530 535 540
Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His
545 550 555 560
Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr
565 570 575
Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile
580 585 590
Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met Gly
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645 650 655
Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His
660 665 670
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675 680 685
Lys Ala Leu Val Asn Ala Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser
690 695 700
Asp Gln Asn His Gly Ile Leu Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu Tyr
705 710 715 720
Thr His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly
725 730 735
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
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<210> 26
<211> 2247
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠FAP外域 + poly-lys标签 + his标签
<400> 26
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tatcttcatc aatctgagga tgataacata gtattttata atattgaaac aagagaatca 180
tatatcattt tgagtaatag caccatgaaa agtgtgaatg ctacagatta tggtttgtca 240
cctgatcggc aatttgtgta tctagaaagt gattattcaa agctctggcg atattcatac 300
acagcgacat actacatcta cgaccttcag aatggggaat ttgtaagagg atacgagctc 360
cctcgtccaa ttcagtatct atgctggtcg cctgttggga gtaaattagc atatgtatat 420
caaaacaata tttatttgaa acaaagacca ggagatccac cttttcaaat aacttatact 480
ggaagagaaa atagaatatt taatggaata ccagactggg tttatgaaga ggaaatgctt 540
gccacaaaat atgctctttg gtggtctcca gatggaaaat ttttggcata tgtagaattt 600
aatgattcag atataccaat tattgcctat tcttattatg gtgatggaca gtatcctaga 660
actataaata ttccatatcc aaaggctggg gctaagaatc cggttgttcg tgtttttatt 720
gttgacacca cctaccctca ccacgtgggc ccaatggaag tgccagttcc agaaatgata 780
gcctcaagtg actattattt cagctggctc acatgggtgt ccagtgaacg agtatgcttg 840
cagtggctaa aaagagtgca gaatgtctca gtcctgtcta tatgtgattt cagggaagac 900
tggcatgcat gggaatgtcc aaagaaccag gagcatgtag aagaaagcag aacaggatgg 960
gctggtggat tctttgtttc gacaccagct tttagccagg atgccacttc ttactacaaa 1020
atatttagcg acaaggatgg ttacaaacat attcactaca tcaaagacac tgtggaaaat 1080
gctattcaaa ttacaagtgg caagtgggag gccatatata tattccgcgt aacacaggat 1140
tcactgtttt attctagcaa tgaatttgaa ggttaccctg gaagaagaaa catctacaga 1200
attagcattg gaaactctcc tccgagcaag aagtgtgtta cttgccatct aaggaaagaa 1260
aggtgccaat attacacagc aagtttcagc tacaaagcca agtactatgc actcgtctgc 1320
tatggccctg gcctccccat ttccaccctc catgatggcc gcacagacca agaaatacaa 1380
gtattagaag aaaacaaaga actggaaaat tctctgagaa atatccagct gcctaaagtg 1440
gagattaaga agctcaaaga cgggggactg actttctggt acaagatgat tctgcctcct 1500
cagtttgaca gatcaaagaa gtaccctttg ctaattcaag tgtatggtgg tccttgtagc 1560
cagagtgtta agtctgtgtt tgctgttaat tggataactt atctcgcaag taaggagggg 1620
atagtcattg ccctggtaga tggtcggggc actgctttcc aaggtgacaa attcctgcat 1680
gccgtgtatc gaaaactggg tgtatatgaa gttgaggacc agctcacagc tgtcagaaaa 1740
ttcatagaaa tgggtttcat tgatgaagaa agaatagcca tatggggctg gtcctacgga 1800
ggttatgttt catccctggc ccttgcatct ggaactggtc ttttcaaatg tggcatagca 1860
gtggctccag tctccagctg ggaatattac gcatctatct actcagagag attcatgggc 1920
ctcccaacaa aggacgacaa tctcgaacac tataaaaatt caactgtgat ggcaagagca 1980
gaatatttca gaaatgtaga ctatcttctc atccacggaa cagcagatga taatgtgcac 2040
tttcagaact cagcacagat tgctaaagct ttggttaatg cacaagtgga tttccaggcg 2100
atgtggtact ctgaccagaa ccatggtata ttatctgggc gctcccagaa tcatttatat 2160
acccacatga cgcacttcct caagcaatgc ttttctttat cagacggcaa aaagaaaaag 2220
aaaaagggcc accaccatca ccatcac 2247
<210> 27
<211> 748
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴FAP外域 + poly-lys标签 + his标签
<400> 27
Arg Pro Pro Arg Val His Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu
1 5 10 15
Thr Leu Lys Asp Ile Leu Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe
20 25 30
Pro Asn Trp Ile Ser Gly Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn
35 40 45
Asn Ile Val Leu Tyr Asn Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu
50 55 60
Ser Asn Arg Thr Met Lys Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser
65 70 75 80
Pro Asp Arg Gln Phe Val Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp
85 90 95
Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly
100 105 110
Glu Phe Val Arg Gly Asn Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys
115 120 125
Trp Ser Pro Val Gly Ser Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile
130 135 140
Tyr Leu Lys Gln Arg Pro Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn
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Gly Arg Glu Asn Lys Ile Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu
165 170 175
Glu Glu Met Leu Ala Thr Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly
180 185 190
Lys Phe Leu Ala Tyr Ala Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile
195 200 205
Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile
210 215 220
Pro Tyr Pro Lys Ala Gly Ala Lys Asn Pro Phe Val Arg Ile Phe Ile
225 230 235 240
Ile Asp Thr Thr Tyr Pro Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val
245 250 255
Pro Ala Met Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Asp Cys Pro Lys Thr Gln Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp
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Ala Gly Gly Phe Phe Val Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile
325 330 335
Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His
340 345 350
Tyr Ile Lys Asp Thr Val Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys
355 360 365
Trp Glu Ala Ile Asn Ile Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr
370 375 380
Ser Ser Asn Glu Phe Glu Asp Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg
385 390 395 400
Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His
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Leu Arg Lys Glu Arg Cys Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr
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Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser
435 440 445
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Asn Lys Glu Leu Glu Asn Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu
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485 490 495
Ile Leu Pro Pro Gln Phe Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile
500 505 510
Gln Val Tyr Gly Gly Pro Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala
515 520 525
Val Asn Trp Ile Ser Tyr Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala
530 535 540
Leu Val Asp Gly Arg Gly Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr
545 550 555 560
Ala Val Tyr Arg Lys Leu Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr
565 570 575
Ala Val Arg Lys Phe Ile Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile
580 585 590
Ala Ile Trp Gly Trp Ser Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu
595 600 605
Ala Ser Gly Thr Gly Leu Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val
610 615 620
Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly
625 630 635 640
Leu Pro Thr Lys Asp Asp Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val
645 650 655
Met Ala Arg Ala Glu Tyr Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His
660 665 670
Gly Thr Ala Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala
675 680 685
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690 695 700
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705 710 715 720
His Met Thr His Phe Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp Gly Lys
725 730 735
Lys Lys Lys Lys Lys Gly His His His His His His
740 745
<210> 28
<211> 2244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴FAP外域 + poly-lys标签 + his标签
<400> 28
Cys Gly Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Ala Gly Ala Gly Thr Thr Cys
1 5 10 15
Ala Thr Ala Ala Cys Thr Cys Thr Gly Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala
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Thr Ala Cys Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Thr Cys
35 40 45
Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Thr Ala Thr Thr Thr
50 55 60
Thr Ala Ala Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Cys
65 70 75 80
Thr Thr Ala Thr Ala Ala Ala Ala Cys Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr
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Cys Cys Ala Ala Ala Cys Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Cys Ala Gly
100 105 110
Gly Ala Cys Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Thr Cys Thr Thr Cys Ala
115 120 125
Thr Cys Ala Ala Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Ala Ala Cys
130 135 140
Ala Ala Thr Ala Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Thr Thr Ala Thr Ala
145 150 155 160
Ala Thr Ala Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala
165 170 175
Ala Thr Cys Ala Thr Ala Thr Ala Cys Cys Ala Thr Thr Thr Thr Gly
180 185 190
Ala Gly Thr Ala Ala Cys Ala Gly Ala Ala Cys Cys Ala Thr Gly Ala
195 200 205
Ala Ala Ala Gly Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Thr Thr Cys
210 215 220
Ala Ala Ala Thr Thr Ala Thr Gly Gly Cys Thr Thr Ala Thr Cys Ala
225 230 235 240
Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gly
245 250 255
Thr Ala Thr Ala Thr Cys Thr Ala Gly Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala
260 265 270
Thr Thr Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Gly Cys Thr Thr Thr Gly Gly
275 280 285
Ala Gly Ala Thr Ala Cys Thr Cys Thr Thr Ala Cys Ala Cys Ala Gly
290 295 300
Cys Ala Ala Cys Ala Thr Ala Thr Thr Ala Cys Ala Thr Cys Thr Ala
305 310 315 320
Thr Gly Ala Cys Cys Thr Thr Ala Gly Cys Ala Ala Thr Gly Gly Ala
325 330 335
Gly Ala Ala Thr Thr Thr Gly Thr Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala
340 345 350
Ala Thr Gly Ala Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Gly Thr Cys Cys
355 360 365
Ala Ala Thr Thr Cys Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Gly Cys
370 375 380
Thr Gly Gly Thr Cys Gly Cys Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly Gly Ala
385 390 395 400
Gly Thr Ala Ala Ala Thr Thr Ala Gly Cys Ala Thr Ala Thr Gly Thr
405 410 415
Cys Thr Ala Thr Cys Ala Ala Ala Ala Cys Ala Ala Thr Ala Thr Cys
420 425 430
Thr Ala Thr Thr Thr Gly Ala Ala Ala Cys Ala Ala Ala Gly Ala Cys
435 440 445
Cys Ala Gly Gly Ala Gly Ala Thr Cys Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr
450 455 460
Thr Cys Ala Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Thr Thr Thr Ala Ala Thr
465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr Thr Gly Cys Thr Ala
530 535 540
Cys Ala Ala Ala Ala Thr Ala Thr Gly Cys Thr Cys Thr Cys Thr Gly
545 550 555 560
Gly Thr Gly Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ala
565 570 575
Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Gly Gly Cys Ala Thr Ala Thr Gly
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2240
<210> 29
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<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 29
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<210> 30
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<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 30
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1415 1420 1425
Leu Ile Arg Tyr Val His Asp Gly Ser Glu Thr Leu Thr Asp Ser
1430 1435 1440
Phe Val Leu Met Ala Asn Ala Ser Glu Met Asp Arg Gln Ser His
1445 1450 1455
Pro Val Ala Phe Thr Val Thr Val Leu Pro Val Asn Asp Gln Pro
1460 1465 1470
Pro Ile Leu Thr Thr Asn Thr Gly Leu Gln Met Trp Glu Gly Ala
1475 1480 1485
Thr Ala Pro Ile Pro Ala Glu Ala Leu Arg Ser Thr Asp Gly Asp
1490 1495 1500
Ser Gly Ser Glu Asp Leu Val Tyr Thr Ile Glu Gln Pro Ser Asn
1505 1510 1515
Gly Arg Val Val Leu Arg Gly Ala Pro Gly Thr Glu Val Arg Ser
1520 1525 1530
Phe Thr Gln Ala Gln Leu Asp Gly Gly Leu Val Leu Phe Ser His
1535 1540 1545
Arg Gly Thr Leu Asp Gly Gly Phe Arg Phe Arg Leu Ser Asp Gly
1550 1555 1560
Glu His Thr Ser Pro Gly His Phe Phe Arg Val Thr Ala Gln Lys
1565 1570 1575
Gln Val Leu Leu Ser Leu Lys Gly Ser Gln Thr Leu Thr Val Cys
1580 1585 1590
Pro Gly Ser Val Gln Pro Leu Ser Ser Gln Thr Leu Arg Ala Ser
1595 1600 1605
Ser Ser Ala Gly Thr Asp Pro Gln Leu Leu Leu Tyr Arg Val Val
1610 1615 1620
Arg Gly Pro Gln Leu Gly Arg Leu Phe His Ala Gln Gln Asp Ser
1625 1630 1635
Thr Gly Glu Ala Leu Val Asn Phe Thr Gln Ala Glu Val Tyr Ala
1640 1645 1650
Gly Asn Ile Leu Tyr Glu His Glu Met Pro Pro Glu Pro Phe Trp
1655 1660 1665
Glu Ala His Asp Thr Leu Glu Leu Gln Leu Ser Ser Pro Pro Ala
1670 1675 1680
Arg Asp Val Ala Ala Thr Leu Ala Val Ala Val Ser Phe Glu Ala
1685 1690 1695
Ala Cys Pro Gln Arg Pro Ser His Leu Trp Lys Asn Lys Gly Leu
1700 1705 1710
Trp Val Pro Glu Gly Gln Arg Ala Arg Ile Thr Val Ala Ala Leu
1715 1720 1725
Asp Ala Ser Asn Leu Leu Ala Ser Val Pro Ser Pro Gln Arg Ser
1730 1735 1740
Glu His Asp Val Leu Phe Gln Val Thr Gln Phe Pro Ser Arg Gly
1745 1750 1755
Gln Leu Leu Val Ser Glu Glu Pro Leu His Ala Gly Gln Pro His
1760 1765 1770
Phe Leu Gln Ser Gln Leu Ala Ala Gly Gln Leu Val Tyr Ala His
1775 1780 1785
Gly Gly Gly Gly Thr Gln Gln Asp Gly Phe His Phe Arg Ala His
1790 1795 1800
Leu Gln Gly Pro Ala Gly Ala Ser Val Ala Gly Pro Gln Thr Ser
1805 1810 1815
Glu Ala Phe Ala Ile Thr Val Arg Asp Val Asn Glu Arg Pro Pro
1820 1825 1830
Gln Pro Gln Ala Ser Val Pro Leu Arg Leu Thr Arg Gly Ser Arg
1835 1840 1845
Ala Pro Ile Ser Arg Ala Gln Leu Ser Val Val Asp Pro Asp Ser
1850 1855 1860
Ala Pro Gly Glu Ile Glu Tyr Glu Val Gln Arg Ala Pro His Asn
1865 1870 1875
Gly Phe Leu Ser Leu Val Gly Gly Gly Leu Gly Pro Val Thr Arg
1880 1885 1890
Phe Thr Gln Ala Asp Val Asp Ser Gly Arg Leu Ala Phe Val Ala
1895 1900 1905
Asn Gly Ser Ser Val Ala Gly Ile Phe Gln Leu Ser Met Ser Asp
1910 1915 1920
Gly Ala Ser Pro Pro Leu Pro Met Ser Leu Ala Val Asp Ile Leu
1925 1930 1935
Pro Ser Ala Ile Glu Val Gln Leu Arg Ala Pro Leu Glu Val Pro
1940 1945 1950
Gln Ala Leu Gly Arg Ser Ser Leu Ser Gln Gln Gln Leu Arg Val
1955 1960 1965
Val Ser Asp Arg Glu Glu Pro Glu Ala Ala Tyr Arg Leu Ile Gln
1970 1975 1980
Gly Pro Gln Tyr Gly His Leu Leu Val Gly Gly Arg Pro Thr Ser
1985 1990 1995
Ala Phe Ser Gln Phe Gln Ile Asp Gln Gly Glu Val Val Phe Ala
2000 2005 2010
Phe Thr Asn Phe Ser Ser Ser His Asp His Phe Arg Val Leu Ala
2015 2020 2025
Leu Ala Arg Gly Val Asn Ala Ser Ala Val Val Asn Val Thr Val
2030 2035 2040
Arg Ala Leu Leu His Val Trp Ala Gly Gly Pro Trp Pro Gln Gly
2045 2050 2055
Ala Thr Leu Arg Leu Asp Pro Thr Val Leu Asp Ala Gly Glu Leu
2060 2065 2070
Ala Asn Arg Thr Gly Ser Val Pro Arg Phe Arg Leu Leu Glu Gly
2075 2080 2085
Pro Arg His Gly Arg Val Val Arg Val Pro Arg Ala Arg Thr Glu
2090 2095 2100
Pro Gly Gly Ser Gln Leu Val Glu Gln Phe Thr Gln Gln Asp Leu
2105 2110 2115
Glu Asp Gly Arg Leu Gly Leu Glu Val Gly Arg Pro Glu Gly Arg
2120 2125 2130
Ala Pro Gly Pro Ala Gly Asp Ser Leu Thr Leu Glu Leu Trp Ala
2135 2140 2145
Gln Gly Val Pro Pro Ala Val Ala Ser Leu Asp Phe Ala Thr Glu
2150 2155 2160
Pro Tyr Asn Ala Ala Arg Pro Tyr Ser Val Ala Leu Leu Ser Val
2165 2170 2175
Pro Glu Ala Ala Arg Thr Glu Ala Gly Lys Pro Glu Ser Ser Thr
2180 2185 2190
Pro Thr Gly Glu Pro Gly Pro Met Ala Ser Ser Pro Glu Pro Ala
2195 2200 2205
Val Ala Lys Gly Gly Phe Leu Ser Phe Leu Glu Ala Asn Met Phe
2210 2215 2220
Ser Val Ile Ile Pro Met Cys Leu Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu
2225 2230 2235
Ile Leu Pro Leu Leu Phe Tyr Leu Arg Lys Arg Asn Lys Thr Gly
2240 2245 2250
Lys His Asp Val Gln Val Leu Thr Ala Lys Pro Arg Asn Gly Leu
2255 2260 2265
Ala Gly Asp Thr Glu Thr Phe Arg Lys Val Glu Pro Gly Gln Ala
2270 2275 2280
Ile Pro Leu Thr Ala Val Pro Gly Gln Gly Pro Pro Pro Gly Gly
2285 2290 2295
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2300 2305 2310
Ala Leu Lys Asn Gly Gln Tyr Trp Val
2315 2320
<210> 31
<211> 1210
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 31
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
35 40 45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65 70 75 80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
85 90 95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145 150 155 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
165 170 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
180 185 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
195 200 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
210 215 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225 230 235 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
245 250 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
260 265 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
275 280 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
290 295 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305 310 315 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
325 330 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
340 345 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
355 360 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
370 375 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
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Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
405 410 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
420 425 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
435 440 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
450 455 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
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Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
530 535 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545 550 555 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
565 570 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
580 585 590
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595 600 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
610 615 620
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625 630 635 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
645 650 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
660 665 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
675 680 685
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690 695 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
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Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
725 730 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
740 745 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
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Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
835 840 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
850 855 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
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Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
885 890 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
900 905 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu
915 920 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
930 935 940
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945 950 955 960
Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln
965 970 975
Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
980 985 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp
995 1000 1005
Asp Val Val Asp Ala Asp Glu Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly Phe
1010 1015 1020
Phe Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu
1025 1030 1035
Ser Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Val Ala Cys Ile Asp Arg Asn
1040 1045 1050
Gly Leu Gln Ser Cys Pro Ile Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg
1055 1060 1065
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1070 1075 1080
Asp Thr Phe Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val Pro
1085 1090 1095
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1100 1105 1110
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1130 1135 1140
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Gln Asp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro Asn Gly Ile Phe Lys
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Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg Val Ala Pro Gln
1190 1195 1200
Ser Ser Glu Phe Ile Gly Ala
1205 1210
<210> 32
<211> 556
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 32
Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met
1 5 10 15
Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp
20 25 30
Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln
35 40 45
Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile
65 70 75 80
Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu
85 90 95
Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr
100 105 110
Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp
115 120 125
Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro
130 135 140
Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala
145 150 155 160
Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro
165 170 175
Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro
180 185 190
Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser
195 200 205
Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser
210 215 220
Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp
225 230 235 240
Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala
245 250 255
Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu
260 265 270
Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly
275 280 285
Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
290 295 300
Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val
325 330 335
Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu
340 345 350
Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala
355 360 365
Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp
370 375 380
Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly
385 390 395 400
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu
405 410 415
Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu
420 425 430
Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly
435 440 445
Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu
450 455 460
Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser
465 470 475 480
Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly
485 490 495
Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln
500 505 510
Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala
515 520 525
Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp
530 535 540
Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg
545 550 555
<210> 33
<211> 297
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 33
Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro
1 5 10 15
Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg
20 25 30
Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu
35 40 45
Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile
50 55 60
Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile
65 70 75 80
Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile
85 90 95
Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu
100 105 110
Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile
115 120 125
Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser
130 135 140
His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn
165 170 175
Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly
180 185 190
Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile
195 200 205
Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys
210 215 220
Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile
225 230 235 240
Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro
245 250 255
Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu
260 265 270
Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser
275 280 285
Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro
290 295
<210> 34
<211> 364
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 34
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Met Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln
20 25 30
Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro
35 40 45
Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly
50 55 60
Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln
65 70 75 80
Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro
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Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp
100 105 110
Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser
115 120 125
Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg
130 135 140
Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn
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Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu
210 215 220
Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr
225 230 235 240
Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly
245 250 255
Val Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala
260 265 270
Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys
275 280 285
Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly
290 295 300
Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr
305 310 315 320
Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu
325 330 335
Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys
340 345 350
Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln
355 360
<210> 35
<211> 205
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 35
Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Cys Gly Thr Thr
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala
20 25 30
Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala
35 40 45
Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala
50 55 60
Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg
65 70 75 80
Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn
85 90 95
Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln
100 105 110
Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro
115 120 125
Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe
130 135 140
His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln
145 150 155 160
Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr
165 170 175
Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val
180 185 190
Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu
195 200 205
<210> 36
<211> 233
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 36
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
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130 135 140
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195 200 205
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210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 37
<211> 244
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 37
Met Gly Ala Leu Gly Leu Glu Gly Arg Gly Gly Arg Leu Gln Gly Arg
1 5 10 15
Gly Ser Leu Leu Leu Ala Val Ala Gly Ala Thr Ser Leu Val Thr Leu
20 25 30
Leu Leu Ala Val Pro Ile Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Leu Val Pro
35 40 45
Gln Asp Gln Gly Gly Leu Val Thr Glu Thr Ala Asp Pro Gly Ala Gln
50 55 60
Ala Gln Gln Gly Leu Gly Phe Gln Lys Leu Pro Glu Glu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Thr Asp Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Ala Pro
85 90 95
Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu Gln Ala Phe
100 105 110
Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp Ala Glu Gly Leu Ala Leu Pro
115 120 125
Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Leu Val Gly Tyr Arg Gly Arg
130 135 140
Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln Gly Arg Ser Val Thr Leu Arg
145 150 155 160
Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Glu
165 170 175
Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu Asp Pro Ala
180 185 190
Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val Gly Phe Gly
195 200 205
Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val Asn Ile Ser
210 215 220
His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe Gly Ala
225 230 235 240
Val Met Val Gly
<210> 38
<211> 183
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 38
Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg
1 5 10 15
Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln
20 25 30
Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser
35 40 45
Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val
50 55 60
Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln
65 70 75 80
Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn
85 90 95
Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu
100 105 110
Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln
115 120 125
Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr
130 135 140
Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu
145 150 155 160
Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn
165 170 175
Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu
180
<210> 39
<211> 261
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 39
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 40
<211> 281
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 40
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
50 55 60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
65 70 75 80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
100 105 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
115 120 125
Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg
130 135 140
Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu
145 150 155 160
Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr
165 170 175
Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr
180 185 190
Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
195 200 205
His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met
210 215 220
Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala
225 230 235 240
Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
245 250 255
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
260 265 270
Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
275 280
<210> 41
<211> 193
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 41
Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly
1 5 10 15
Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile
20 25 30
Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu
35 40 45
Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His
50 55 60
Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala
65 70 75 80
Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu
85 90 95
Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu
100 105 110
Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu
115 120 125
Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro
145 150 155 160
Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu
165 170 175
Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg
180 185 190
Pro
<210> 42
<211> 234
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 42
Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ala Met His Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Ser His Leu Gly
20 25 30
Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu
35 40 45
Cys Leu Val Phe Thr Val Ala Thr Ile Met Val Leu Val Val Gln Arg
50 55 60
Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys Gly Gly
65 70 75 80
Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys
85 90 95
Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys
100 105 110
Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr Gln Asp
115 120 125
Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile Cys Gln
130 135 140
Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu Lys Leu
145 150 155 160
Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val Thr Val
165 170 175
Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln
180 185 190
Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val Asn Val
195 200 205
Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val
210 215 220
Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp
225 230
<210> 43
<211> 254
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 43
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 44
<211> 281
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 44
Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys
1 5 10 15
Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala
20 25 30
Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys
35 40 45
Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr
50 55 60
Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val
65 70 75 80
Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser
85 90 95
Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro
100 105 110
Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly
115 120 125
Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu
130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly
145 150 155 160
His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile
165 170 175
His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
180 185 190
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln
195 200 205
Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys
210 215 220
Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr
225 230 235 240
Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile
245 250 255
Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
260 265 270
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
275 280
<210> 45
<211> 317
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 45
Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu
1 5 10 15
Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met
35 40 45
Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val
50 55 60
Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser
65 70 75 80
Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn
85 90 95
Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile
100 105 110
Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln
115 120 125
Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys
130 135 140
Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu
145 150 155 160
Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro
165 170 175
Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly
180 185 190
Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val
195 200 205
Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His
210 215 220
His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val
225 230 235 240
Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met
245 250 255
Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe
260 265 270
Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu
275 280 285
Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp
290 295 300
Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp
305 310 315
<210> 46
<211> 249
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 46
Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro
1 5 10 15
Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ala Leu
20 25 30
Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly Ser Arg Ala
35 40 45
Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val Ala Glu Glu
50 55 60
Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp
65 70 75 80
Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu
100 105 110
Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly
115 120 125
Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu
130 135 140
Arg Tyr Asn Arg Gln Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg Ala Gly Leu
145 150 155 160
Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr
165 170 175
Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu
180 185 190
Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gln Leu Arg
195 200 205
Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His
245
<210> 47
<211> 250
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 47
Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly
1 5 10 15
Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu
35 40 45
Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg
50 55 60
Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp
65 70 75 80
Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn
85 90 95
Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys
100 105 110
Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys
115 120 125
Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg
130 135 140
Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala
145 150 155 160
Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe
165 170 175
Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr
180 185 190
Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr
195 200 205
Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile
210 215 220
Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro
225 230 235 240
His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu
245 250
<210> 48
<211> 285
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 48
Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu
1 5 10 15
Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
20 25 30
Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
50 55 60
Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg
65 70 75 80
Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
85 90 95
Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu
100 105 110
Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn
115 120 125
Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln
130 135 140
Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser
165 170 175
Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr
180 185 190
Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met
195 200 205
Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu
210 215 220
Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu
225 230 235 240
Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly
245 250 255
Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu
260 265 270
Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu
275 280 285
<210> 49
<211> 240
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 49
Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln
1 5 10 15
Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser
20 25 30
Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly
35 40 45
Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg
50 55 60
Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp
65 70 75 80
Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala
85 90 95
His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu
100 105 110
Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr
115 120 125
His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr
130 135 140
Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser
145 150 155 160
Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu
165 170 175
Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser
180 185 190
Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His
195 200 205
Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu
210 215 220
Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val
225 230 235 240
<210> 50
<211> 251
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 50
Met Ala Glu Asp Leu Gly Leu Ser Phe Gly Glu Thr Ala Ser Val Glu
1 5 10 15
Met Leu Pro Glu His Gly Ser Cys Arg Pro Lys Ala Arg Ser Ser Ser
20 25 30
Ala Arg Trp Ala Leu Thr Cys Cys Leu Val Leu Leu Pro Phe Leu Ala
35 40 45
Gly Leu Thr Thr Tyr Leu Leu Val Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu
50 55 60
Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser
65 70 75 80
His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg
85 90 95
Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn
100 105 110
Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr
115 120 125
Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser
130 135 140
Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser
145 150 155 160
Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser
165 170 175
Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr
180 185 190
Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp
195 200 205
Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp
210 215 220
Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys
225 230 235 240
Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu
245 250
<210> 51
<211> 199
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 51
Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr
1 5 10 15
Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro
20 25 30
Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu
35 40 45
Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser
50 55 60
Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys
65 70 75 80
Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser
85 90 95
Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu
100 105 110
Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn
115 120 125
Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp
130 135 140
Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly
145 150 155 160
Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser
165 170 175
Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu
180 185 190
Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser
195
<210> 52
<211> 391
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 52
Met Gly Tyr Pro Glu Val Glu Arg Arg Glu Leu Leu Pro Ala Ala Ala
1 5 10 15
Pro Arg Glu Arg Gly Ser Gln Gly Cys Gly Cys Gly Gly Ala Pro Ala
20 25 30
Arg Ala Gly Glu Gly Asn Ser Cys Leu Leu Phe Leu Gly Phe Phe Gly
35 40 45
Leu Ser Leu Ala Leu His Leu Leu Thr Leu Cys Cys Tyr Leu Glu Leu
50 55 60
Arg Ser Glu Leu Arg Arg Glu Arg Gly Ala Glu Ser Arg Leu Gly Gly
65 70 75 80
Ser Gly Thr Pro Gly Thr Ser Gly Thr Leu Ser Ser Leu Gly Gly Leu
85 90 95
Asp Pro Asp Ser Pro Ile Thr Ser His Leu Gly Gln Pro Ser Pro Lys
100 105 110
Gln Gln Pro Leu Glu Pro Gly Glu Ala Ala Leu His Ser Asp Ser Gln
115 120 125
Asp Gly His Gln Met Ala Leu Leu Asn Phe Phe Phe Pro Asp Glu Lys
130 135 140
Pro Tyr Ser Glu Glu Glu Ser Arg Arg Val Arg Arg Asn Lys Arg Ser
145 150 155 160
Lys Ser Asn Glu Gly Ala Asp Gly Pro Val Lys Asn Lys Lys Lys Gly
165 170 175
Lys Lys Ala Gly Pro Pro Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
180 185 190
Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ile Pro Gly Ile Pro Gly Ile
195 200 205
Pro Gly Thr Thr Val Met Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly
210 215 220
Pro Gln Gly Pro Pro Gly Leu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ala Asp Lys
225 230 235 240
Ala Gly Thr Arg Glu Asn Gln Pro Ala Val Val His Leu Gln Gly Gln
245 250 255
Gly Ser Ala Ile Gln Val Lys Asn Asp Leu Ser Gly Gly Val Leu Asn
260 265 270
Asp Trp Ser Arg Ile Thr Met Asn Pro Lys Val Phe Lys Leu His Pro
275 280 285
Arg Ser Gly Glu Leu Glu Val Leu Val Asp Gly Thr Tyr Phe Ile Tyr
290 295 300
Ser Gln Val Glu Val Tyr Tyr Ile Asn Phe Thr Asp Phe Ala Ser Tyr
305 310 315 320
Glu Val Val Val Asp Glu Lys Pro Phe Leu Gln Cys Thr Arg Ser Ile
325 330 335
Glu Thr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Thr Cys Tyr Thr Ala Gly Val Cys
340 345 350
Leu Leu Lys Ala Arg Gln Lys Ile Ala Val Lys Met Val His Ala Asp
355 360 365
Ile Ser Ile Asn Met Ser Lys His Thr Thr Phe Phe Gly Ala Ile Arg
370 375 380
Leu Gly Glu Ala Pro Ala Ser
385 390
<210> 53
<211> 205
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 53
Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala
35 40 45
Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro
50 55 60
Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp
65 70 75 80
Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe
85 90 95
Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val
100 105 110
Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg
130 135 140
Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly
145 150 155 160
Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala
165 170 175
Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr
180 185 190
Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
195 200 205
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 54
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 55
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 56
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 56
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 57
Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 58
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 58
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 59
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 59
Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser
1 5
<210> 60
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 60
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 61
Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 62
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 62
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 63
Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 64
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 64
Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly
1 5
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头
<400> 65
Gly Gly Asn Gly Ser Gly
1 5
<210> 66
<211> 2427
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 三聚体hu 4-1BBL (71-254) Fc节链
<400> 66
agagagggcc ctgagctgag ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 60
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg atggccccct gtcctggtac 120
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 180
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 240
agagtggtgg ccggcgaagg atctggctct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcctctg 300
agaagcgctg ctggcgctgc agctctggca ctgacagtgg atctgcctcc tgccagctcc 360
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 420
aggctgggag tgcatctgca cacagaggcc agggctagac acgcctggca gctgacacag 480
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 540
ccaagaagcg aaggcggagg cggatctggc ggcggaggat ctagagaggg acccgaactg 600
tcccctgacg atccagccgg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 660
gctcagaatg tgctgctgat tgacggacct ctgagctggt actccgaccc agggctggca 720
ggggtgtccc tgactggggg actgtcctac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 780
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggag 840
ggctcaggat ctgtgtccct ggctctgcat ctgcagccac tgcgctctgc tgctggcgca 900
gctgcactgg ctctgactgt ggacctgcca ccagcctcta gcgaggccag aaacagcgcc 960
ttcgggttcc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 1020
catactgaag ccagagcccg gcatgcttgg cagctgactc agggggcaac tgtgctggga 1080
ctgtttcgcg tgacacctga gatccctgcc ggactgccaa gccctagatc agaagggggc 1140
ggaggaagcg gagggggagg aagtagagaa ggaccagagc tgtctccaga tgaccccgca 1200
ggactgctgg acctgagaca gggcatgttc gcacagctgg tggcccagaa tgtgctgctg 1260
atcgacgggc cactgtcttg gtattccgat cccggcctgg ccggcgtgtc cctgaccggc 1320
ggactgagtt acaaagagga tacaaaagaa ctggtggtgg caaaggcagg ggtgtactat 1380
gtgttctttc agctggaact gagaagggtg gtggccggcg agggaagcgg atcagtgtca 1440
ctggcactgc atctgcagcc cctgagatcc gctgcagggg ccgctgctct ggccctgacc 1500
gtggacctgc cccctgcttc ttccgaggct agaaactctg catttgggtt tcaaggacgc 1560
ctgctgcatc tgtcagccgg gcagagactg ggagtgcatc tgcataccga ggctcgcgcc 1620
agacatgcat ggcagctgac ccagggcgcc accgtgctgg gactgtttag agtgactcca 1680
gaaatccccg ctggcctgcc cagcccaaga tccgagggat ctcctggcag cagctctagc 1740
ggatccgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagctgc agggggaccg 1800
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 1860
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 1920
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 1980
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 2040
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ggcgccccca tcgagaaaac catctccaaa 2100
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg 2160
accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 2220
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 2280
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 2340
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 2400
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 2427
<210> 67
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP(28H1) Fc穴链
<400> 67
gaagtgcagc tgctggaatc cggcggaggc ctggtgcagc ctggcggatc tctgagactg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc tcccacgcca tgtcctgggt ccgacaggct 120
cctggcaaag gcctggaatg ggtgtccgcc atctgggcct ccggcgagca gtactacgcc 180
gactctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccaa gggctggctg 300
ggcaacttcg actactgggg acagggcacc ctggtcaccg tgtccagcgc标签caccaag 360
ggcccctccg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca ccagcggcgg cacagccgct 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgtcctg gaacagcgga 480
gccctgacct ccggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagttctgg cctgtatagc 540
ctgagcagcg tggtcaccgt gccttctagc agcctgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gagctgcgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtgcaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1080
caggtcagcc tctcgtgcgc agtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctcgtgag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggtaaa 1338
<210> 68
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP(28H1)轻链
<400> 68
gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60
ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgtcc cggtcctacc tcgcctggta tcagcagaag 120
cccggccagg cccctcggct gctgatcatc ggcgcctcta ccagagccac cggcatccct 180
gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggccagg tcatccctcc cacctttggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 69
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DP47 Fc穴链
<400> 69
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgtg caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1080
gtcagcctct cgtgcgcagt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1140
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1200
tccttcttcc tcgtgagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320
ctgtctccgg gtaaa 1335
<210> 70
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DP47轻链
<400> 70
gaaatcgtgt taacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcttgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact标签cctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggagcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg atccgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgct gacgttcggc 300
caggggacca aagtggaaat caaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 71
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DP47 Fc穴链
<400> 71
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 72
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗DP47轻链
<400> 72
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 73
<211> 163
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 73
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln
<210> 74
<211> 163
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 74
Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln
<210> 75
<211> 164
<212> PRT
<213> 小鼠（mus musculus）
<400> 75
Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys
1 5 10 15
Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile
20 25 30
Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe
35 40 45
Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr His Asn Ala Glu Cys Glu Cys
50 55 60
Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys
65 70 75 80
Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys
85 90 95
Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr
115 120 125
Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro Pro Val Val Ser Phe Ser Pro
130 135 140
Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu Gly Gly Pro Gly Gly His Ser
145 150 155 160
Leu Gln Val Leu
<210> 76
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc穴链
<400> 76
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 77
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BB Fc节链
<400> 77
ctgcaggacc cctgcagcaa ctgccctgcc ggcaccttct gcgacaacaa ccggaaccag 60
atctgcagcc cctgcccccc caacagcttc agctctgccg gcggacagcg gacctgcgac 120
atctgcagac agtgcaaggg cgtgttcaga acccggaaag agtgcagcag caccagcaac 180
gccgagtgcg actgcacccc cggcttccat tgtctgggag ccggctgcag catgtgcgag 240
caggactgca agcagggcca ggaactgacc aagaagggct gcaaggactg ctgcttcggc 300
accttcaacg accagaagcg gggcatctgc cggccctgga ccaactgtag cctggacggc 360
aagagcgtgc tggtcaacgg caccaaagaa cgggacgtcg tgtgcggccc cagccctgct 420
gatctgtctc ctggggccag cagcgtgacc cctcctgccc ctgccagaga gcctggccac 480
tctcctcagg tcgacgaaca gttatatttt cagggcggct cacccaaatc tgcagacaaa 540
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 600
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 660
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 720
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 780
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 840
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 900
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatgccggg atgagctgac caagaaccag 960
gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1020
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1080
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1140
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1200
ctgtctccgg gtaaatccgg aggcctgaac gacatcttcg aggcccagaa gattgaatgg 1260
cacgag 1266
<210> 78
<211> 1266
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴4-1BB Fc节链
<400> 78
ttgcaggatc tgtgtagtaa ctgcccagct ggtacattct gtgataataa caggagtcag 60
atttgcagtc cctgtcctcc aaatagtttc tccagcgcag gtggacaaag gacctgtgac 120
atatgcaggc agtgtaaagg tgttttcaag accaggaagg agtgttcctc caccagcaat 180
gcagagtgtg actgcatttc agggtatcac tgcctggggg cagagtgcag catgtgtgaa 240
caggattgta aacaaggtca agaattgaca aaaaaaggtt gtaaagactg ttgctttggg 300
acatttaatg accagaaacg tggcatctgt cgcccctgga caaactgttc tttggatgga 360
aagtctgtgc ttgtgaatgg gacgaaggag agggacgtgg tctgcggacc atctccagcc 420
gacctctctc caggagcatc ctctgcgacc ccgcctgccc ctgcgagaga gccaggacac 480
tctccgcagg tcgacgaaca gttatatttt cagggcggct cacccaaatc tgcagacaaa 540
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 600
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 660
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 720
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 780
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 840
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 900
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatgccggg atgagctgac caagaaccag 960
gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1020
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1080
tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1140
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1200
ctgtctccgg gtaaatccgg aggcctgaac gacatcttcg aggcccagaa gattgaatgg 1260
cacgag 1266
<210> 79
<211> 1269
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠4-1BB Fc节链
<400> 79
gtgcagaaca gctgcgacaa ctgccagccc ggcaccttct gccggaagta caaccccgtg 60
tgcaagagct gcccccccag caccttcagc agcatcggcg gccagcccaa ctgcaacatc 120
tgcagagtgt gcgccggcta cttccggttc aagaagttct gcagcagcac ccacaacgcc 180
gagtgcgagt gcatcgaggg cttccactgc ctgggccccc agtgcaccag atgcgagaag 240
gactgcagac ccggccagga actgaccaag cagggctgta agacctgcag cctgggcacc 300
ttcaacgacc agaacgggac cggcgtgtgc cggccttgga ccaattgcag cctggacggg 360
agaagcgtgc tgaaaaccgg caccaccgag aaggacgtcg tgtgcggccc tcccgtggtg 420
tccttcagcc ctagcaccac catcagcgtg acccctgaag gcggccctgg cggacactct 480
ctgcaggtcc tggtcgacga acagttatat tttcagggcg gctcacccaa atctgcagac 540
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 600
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 660
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 720
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 780
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 840
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 900
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatgcc gggatgagct gaccaagaac 960
caggtcagcc tgtggtgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1020
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1080
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1140
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1200
tccctgtctc cgggtaaatc cggaggcctg aacgacatct tcgaggccca gaagattgaa 1260
tggcacgag 1269
<210> 80
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc穴链
<400> 80
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 81
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BB Fc节链
<400> 81
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys
165 170 175
Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
180 185 190
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
195 200 205
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
210 215 220
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
225 230 235 240
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
245 250 255
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
260 265 270
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
275 280 285
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
290 295 300
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
305 310 315 320
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
325 330 335
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
340 345 350
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
355 360 365
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370 375 380
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
405 410 415
Lys Ile Glu Trp His Glu
420
<210> 82
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴4-1BB Fc节链
<400> 82
Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys
165 170 175
Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
180 185 190
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
195 200 205
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
210 215 220
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
225 230 235 240
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
245 250 255
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
260 265 270
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
275 280 285
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
290 295 300
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
305 310 315 320
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
325 330 335
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
340 345 350
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
355 360 365
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
370 375 380
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
405 410 415
Lys Ile Glu Trp His Glu
420
<210> 83
<211> 423
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠4-1BB Fc节链
<400> 83
Val Gln Asn Ser Cys Asp Asn Cys Gln Pro Gly Thr Phe Cys Arg Lys
1 5 10 15
Tyr Asn Pro Val Cys Lys Ser Cys Pro Pro Ser Thr Phe Ser Ser Ile
20 25 30
Gly Gly Gln Pro Asn Cys Asn Ile Cys Arg Val Cys Ala Gly Tyr Phe
35 40 45
Arg Phe Lys Lys Phe Cys Ser Ser Thr His Asn Ala Glu Cys Glu Cys
50 55 60
Ile Glu Gly Phe His Cys Leu Gly Pro Gln Cys Thr Arg Cys Glu Lys
65 70 75 80
Asp Cys Arg Pro Gly Gln Glu Leu Thr Lys Gln Gly Cys Lys Thr Cys
85 90 95
Ser Leu Gly Thr Phe Asn Asp Gln Asn Gly Thr Gly Val Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Arg Ser Val Leu Lys Thr Gly Thr
115 120 125
Thr Glu Lys Asp Val Val Cys Gly Pro Pro Val Val Ser Phe Ser Pro
130 135 140
Ser Thr Thr Ile Ser Val Thr Pro Glu Gly Gly Pro Gly Gly His Ser
145 150 155 160
Leu Gln Val Leu Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro
165 170 175
Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
180 185 190
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
195 200 205
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
210 215 220
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
225 230 235 240
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
245 250 255
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
260 265 270
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
275 280 285
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
290 295 300
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
305 310 315 320
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
325 330 335
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
340 345 350
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
355 360 365
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
370 375 380
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
385 390 395 400
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala
405 410 415
Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
420
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Avi标签
<400> 84
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
1 5 10 15
<210> 85
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人4-1BB his标签ged
<400> 85
ctgcaggacc cctgcagcaa ctgccctgcc ggcaccttct gcgacaacaa ccggaaccag 60
atctgcagcc cctgcccccc caacagcttc agctctgccg gcggacagcg gacctgcgac 120
atctgcagac agtgcaaggg cgtgttcaga acccggaaag agtgcagcag caccagcaac 180
gccgagtgcg actgcacccc cggcttccat tgtctgggag ccggctgcag catgtgcgag 240
caggactgca agcagggcca ggaactgacc aagaagggct gcaaggactg ctgcttcggc 300
accttcaacg accagaagcg gggcatctgc cggccctgga ccaactgtag cctggacggc 360
aagagcgtgc tggtcaacgg caccaaagaa cgggacgtcg tgtgcggccc cagccctgct 420
gatctgtctc ctggggccag cagcgtgacc cctcctgccc ctgccagaga gcctggccac 480
tctcctcagg tcgacgaaca gttatatttt cagggcggct caggcctgaa cgacatcttc 540
gaggcccaga agatcgagtg gcacgaggct cgagctcacc accatcacca tcac 594
<210> 86
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带His标签的人4-1BB
<400> 86
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser
20 25 30
Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val
35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Gly Leu
165 170 175
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Ala Arg Ala
180 185 190
His His His His His His
195
<210> 87
<211> 1968
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 三聚体hu OX40L(51-183) Fc节链
<400> 87
caggtgtccc acagataccc cagaatccag agcatcaagg tgcagttcac cgagtacaag 60
aaagagaagg gcttcatcct gaccagccag aaagaggacg agatcatgaa ggtgcaggac 120
aacagcgtga tcatcaactg cgacggcttc tacctgatca gcctgaaggg ctacttcagc 180
caggaagtgg acatcagcct gcactaccag aaggacgagg aacccctgtt ccagctgaag 240
aaagtgcgga gcgtgaacag cctgatggtg gccagcctga cctacaagga caaggtgtac 300
ctgaacgtga ccaccgacaa caccagcctg gacgacttcc acgtgaacgg cggcgagctg 360
atcctgattc accagaaccc cggcgagttc tgcgtgctgg gaggcggagg atctggcgga 420
ggcggatctc aggtgtcaca ccgctacccc cggattcagt ccattaaggt gcagtttaca 480
gagtataaga aagaaaaagg ctttattctg acttcccaga aagaagatga gattatgaag 540
gtgcaggata attctgtgat catcaattgt gatgggtttt atctgatctc cctgaaagga 600
tactttagtc aggaagtgga tatttctctg cactatcaga aagatgaaga acctctgttc 660
cagctgaaaa aagtgcgctc cgtgaattct ctgatggtgg cttccctgac atacaaagac 720
aaagtgtatc tgaatgtgac aacagataat acctccctgg atgatttcca tgtgaatggg 780
ggggaactga ttctgatcca tcagaaccct ggggaatttt gtgtgctggg cggaggggga 840
agtggcggcg gaggcagtca ggtgtcccat cggtatccta gaatccagtc tatcaaagtg 900
cagtttactg agtacaaaaa agagaaagga ttcattctga cctctcagaa agaggacgaa 960
attatgaagg tgcaggataa cagtgtgatt attaactgtg atgggttcta cctgatttct 1020
ctgaagggat atttcagtca ggaagtggac atctcactgc attaccagaa ggatgaagaa 1080
ccactgttcc agctgaagaa agtgcgctct gtgaatagcc tgatggtggc ctctctgact 1140
tataaggata aggtgtacct gaatgtgaca actgacaata cttctctgga cgactttcat 1200
gtgaacgggg gagagctgat tctgatccac cagaatccag gcgagttttg tgtgctggga 1260
agccccggca gcagcagctc tggatccgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 1320
cctgaagctg cagggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 1380
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 1440
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1500
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1560
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cggcgccccc 1620
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1680
cccccatgcc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgtggtgcct ggtcaaaggc 1740
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1800
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1860
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1920
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1968
<210> 88
<211> 186
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 88
Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His
1 5 10 15
Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln
20 25 30
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val
35 40 45
Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp
85 90 95
Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala
100 105 110
Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln
115 120 125
Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro
130 135 140
Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr
145 150 155 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr
165 170 175
Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala
180 185
<210> 89
<211> 186
<212> PRT
<213> 食蟹猴
<400> 89
Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln
1 5 10 15
Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln
20 25 30
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val
35 40 45
Ser Ala Lys Pro Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp
85 90 95
Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala
100 105 110
Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln
115 120 125
Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro
130 135 140
Pro Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr
145 150 155 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr
165 170 175
Arg Pro Val Glu Val Pro Arg Gly Pro Ala
180 185
<210> 90
<211> 192
<212> PRT
<213> 小鼠（mus musculus）
<400> 90
Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr Pro Ser Gly
1 5 10 15
His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met Val Ser Arg
20 25 30
Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu Thr Gly Phe
35 40 45
Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys Thr Gln Cys
50 55 60
Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr Pro Thr Gln
65 70 75 80
Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg Gln Asp Ser
85 90 95
Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro Gly His Phe
100 105 110
Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu
115 120 125
Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu Asp Ala Val
130 135 140
Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu Thr Gln Arg
145 150 155 160
Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val Trp Pro Arg
165 170 175
Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro Glu Gly Pro
180 185 190
<210> 91
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人OX40 Fc节链
<400> 91
ctgcactgcg tgggcgacac ctaccccagc aacgaccggt gctgccacga gtgcagaccc 60
ggcaacggca tggtgtcccg gtgcagccgg tcccagaaca ccgtgtgcag accttgcggc 120
cctggcttct acaacgacgt ggtgtccagc aagccctgca agccttgtac ctggtgcaac 180
ctgcggagcg gcagcgagcg gaagcagctg tgtaccgcca cccaggatac cgtgtgccgg 240
tgtagagccg gcacccagcc cctggacagc tacaaacccg gcgtggactg cgccccttgc 300
cctcctggcc acttcagccc tggcgacaac caggcctgca agccttggac caactgcacc 360
ctggccggca agcacaccct gcagcccgcc agcaatagca gcgacgccat ctgcgaggac 420
cgggatcctc ctgccaccca gcctcaggaa acccagggcc ctcccgccag acccatcacc 480
gtgcagccta cagaggcctg gcccagaacc agccaggggc ctagcaccag acccgtggaa 540
gtgcctggcg gcagagccgt cgacgaacag ttatattttc agggcggctc acccaaatct 600
gcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 660
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 720
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 780
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 840
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 900
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 960
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catgccggga tgagctgacc 1020
aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1080
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1140
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1200
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1260
agcctctccc tgtctccggg taaatccgga ggcctgaacg acatcttcga ggcccagaag 1320
attgaatggc acgag 1335
<210> 92
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴OX40 Fc节链
<400> 92
ctccactgtg tcggggacac ctaccccagc aacgaccggt gctgtcagga gtgcaggcca 60
ggcaacggga tggtgagccg ctgcaaccgc tcccagaaca cggtgtgccg tccgtgcggg 120
cccggcttct acaacgacgt ggtcagcgcc aagccctgca aggcctgcac atggtgcaac 180
ctcagaagtg ggagtgagcg gaaacagccg tgcacggcca cacaggacac agtctgccgc 240
tgccgggcgg gcacccagcc cctggacagc tacaagcctg gagttgactg tgccccctgc 300
cctccagggc acttctcccc gggcgacaac caggcctgca agccctggac caactgcacc 360
ttggccggga agcacaccct gcagccagcc agcaatagct cggacgccat ctgtgaggac 420
agggaccccc cacccacaca gccccaggag acccagggcc ccccggccag gcccaccact 480
gtccagccca ctgaagcctg gcccagaacc tcacagagac cctccacccg gcccgtggag 540
gtccccaggg gccctgcggt cgacgaacag ttatattttc agggcggctc acccaaatct 600
gcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 660
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 720
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 780
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 840
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 900
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 960
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catgccggga tgagctgacc 1020
aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1080
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1140
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1200
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1260
agcctctccc tgtctccggg taaatccgga ggcctgaacg acatcttcga ggcccagaag 1320
attgaatggc acgag 1335
<210> 93
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠OX40 Fc节链
<400> 93
gtgaccgcca gacggctgaa ctgcgtgaag cacacctacc ccagcggcca caagtgctgc 60
agagagtgcc agcccggcca cggcatggtg tccagatgcg accacacacg ggacaccctg 120
tgccaccctt gcgagacagg cttctacaac gaggccgtga actacgatac ctgcaagcag 180
tgcacccagt gcaaccacag aagcggcagc gagctgaagc agaactgcac ccccacccag 240
gataccgtgt gcagatgcag acccggcacc cagcccagac aggacagcgg ctacaagctg 300
ggcgtggact gcgtgccctg ccctcctggc cacttcagcc ccggcaacaa ccaggcctgc 360
aagccctgga ccaactgcac cctgagcggc aagcagacca gacaccccgc cagcgacagc 420
ctggatgccg tgtgcgagga cagaagcctg ctggccaccc tgctgtggga gacacagcgg 480
cccaccttca gacccaccac cgtgcagagc accaccgtgt ggcccagaac cagcgagctg 540
cccagtcctc ctaccctcgt gacacctgag ggccccgtcg acgaacagtt atattttcag 600
ggcggctcac ccaaatctgc agacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 660
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 720
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 780
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 840
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 900
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 960
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1020
tgccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat 1080
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1140
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1200
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1260
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatccggagg cctgaacgac 1320
atcttcgagg cccagaagat tgaatggcac gag 1353
<210> 94
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人OX40 Fc节链
<400> 94
Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His
1 5 10 15
Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln
20 25 30
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val
35 40 45
Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp
85 90 95
Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala
100 105 110
Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln
115 120 125
Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro
130 135 140
Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr
145 150 155 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr
165 170 175
Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Asp Glu Gln Leu Tyr
180 185 190
Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
195 200 205
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
210 215 220
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
225 230 235 240
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
245 250 255
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
260 265 270
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
275 280 285
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
290 295 300
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
305 310 315 320
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
325 330 335
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
340 345 350
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
355 360 365
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
370 375 380
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
385 390 395 400
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
405 410 415
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu
420 425 430
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
435 440 445
<210> 95
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴OX40 Fc节链
<400> 95
Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys Gln
1 5 10 15
Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Asn Arg Ser Gln
20 25 30
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val
35 40 45
Ser Ala Lys Pro Cys Lys Ala Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Pro Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp
85 90 95
Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala
100 105 110
Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln
115 120 125
Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro
130 135 140
Pro Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Thr Thr
145 150 155 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Arg Pro Ser Thr
165 170 175
Arg Pro Val Glu Val Pro Arg Gly Pro Ala Val Asp Glu Gln Leu Tyr
180 185 190
Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
195 200 205
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
210 215 220
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
225 230 235 240
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
245 250 255
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
260 265 270
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
275 280 285
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
290 295 300
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
305 310 315 320
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
325 330 335
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
340 345 350
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
355 360 365
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
370 375 380
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
385 390 395 400
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
405 410 415
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu
420 425 430
Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
435 440 445
<210> 96
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠OX40 Fc节链
<400> 96
Val Thr Ala Arg Arg Leu Asn Cys Val Lys His Thr Tyr Pro Ser Gly
1 5 10 15
His Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met Val Ser Arg
20 25 30
Cys Asp His Thr Arg Asp Thr Leu Cys His Pro Cys Glu Thr Gly Phe
35 40 45
Tyr Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys Thr Gln Cys
50 55 60
Asn His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr Pro Thr Gln
65 70 75 80
Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg Gln Asp Ser
85 90 95
Gly Tyr Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro Gly His Phe
100 105 110
Ser Pro Gly Asn Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu
115 120 125
Ser Gly Lys Gln Thr Arg His Pro Ala Ser Asp Ser Leu Asp Ala Val
130 135 140
Cys Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu Thr Gln Arg
145 150 155 160
Pro Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Gln Ser Thr Thr Val Trp Pro Arg
165 170 175
Thr Ser Glu Leu Pro Ser Pro Pro Thr Leu Val Thr Pro Glu Gly Pro
180 185 190
Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe Gln Gly Gly Ser Pro Lys Ser Ala Asp
195 200 205
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
210 215 220
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
225 230 235 240
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
245 250 255
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
260 265 270
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
275 280 285
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
290 295 300
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
305 310 315 320
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
325 330 335
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
340 345 350
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
355 360 365
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
370 375 380
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
385 390 395 400
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
405 410 415
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
420 425 430
Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu
435 440 445
Trp His Glu
450
<210> 97
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 带His标签的人OX40
<400> 97
ctgcactgcg tgggcgacac ctaccccagc aacgaccggt gctgccacga gtgcagaccc 60
ggcaacggca tggtgtcccg gtgcagccgg tcccagaaca ccgtgtgcag accttgcggc 120
cctggcttct acaacgacgt ggtgtccagc aagccctgca agccttgtac ctggtgcaac 180
ctgcggagcg gcagcgagcg gaagcagctg tgtaccgcca cccaggatac cgtgtgccgg 240
tgtagagccg gcacccagcc cctggacagc tacaaacccg gcgtggactg cgccccttgc 300
cctcctggcc acttcagccc tggcgacaac caggcctgca agccttggac caactgcacc 360
ctggccggca agcacaccct gcagcccgcc agcaatagca gcgacgccat ctgcgaggac 420
cgggatcctc ctgccaccca gcctcaggaa acccagggcc ctcccgccag acccatcacc 480
gtgcagccta cagaggcctg gcccagaacc agccaggggc ctagcaccag acccgtggaa 540
gtgcctggcg gcagagccgt cgacgaacag ttatattttc agggcggctc aggcctgaac 600
gacatcttcg aggcccagaa gatcgagtgg cacgaggctc gagctcacca ccatcaccat 660
cac 663
<210> 98
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带His标签的人OX40
<400> 98
Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His
1 5 10 15
Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln
20 25 30
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val
35 40 45
Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp
85 90 95
Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala
100 105 110
Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln
115 120 125
Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro
130 135 140
Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr
145 150 155 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr
165 170 175
Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Asp Glu Gln Leu Tyr
180 185 190
Phe Gln Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile
195 200 205
Glu Trp His Glu Ala Arg Ala His His His His His His
210 215 220
<210> 99
<211> 178
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 99
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu
<210> 100
<211> 164
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 100
Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val
1 5 10 15
Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala
20 25 30
Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu
35 40 45
Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu
50 55 60
Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala
65 70 75 80
Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala
85 90 95
Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala
100 105 110
Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu
115 120 125
Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu
130 135 140
Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile
145 150 155 160
Pro Ala Gly Leu
<210> 101
<211> 169
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 101
Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu
1 5 10 15
Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser
20 25 30
Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val
50 55 60
Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly
65 70 75 80
Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly
85 90 95
Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu
100 105 110
Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser
115 120 125
Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg
130 135 140
His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg
145 150 155 160
Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
165
<210> 102
<211> 197
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 102
Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser
1 5 10 15
Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly
20 25 30
Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn
35 40 45
Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu
50 55 60
Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys
65 70 75 80
Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu
85 90 95
Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu
100 105 110
Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu
115 120 125
Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser
130 135 140
Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg
145 150 155 160
Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln
165 170 175
Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu
180 185 190
Ile Pro Ala Gly Leu
195
<210> 103
<211> 555
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 通过(G4S)2接头连接的三聚体hu 4-1BBL (71-248)
<400> 103
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
1 5 10 15
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
20 25 30
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
35 40 45
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
50 55 60
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
85 90 95
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
100 105 110
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
115 120 125
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
130 135 140
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
145 150 155 160
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
165 170 175
Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly
180 185 190
Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln
195 200 205
Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly
210 215 220
Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr
225 230 235 240
Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys
245 250 255
Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val
260 265 270
Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro
275 280 285
Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu
290 295 300
Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly
305 310 315 320
Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His
325 330 335
Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr
340 345 350
Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly
355 360 365
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser
370 375 380
Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala
385 390 395 400
Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp
405 410 415
Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser
420 425 430
Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr
435 440 445
Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly
450 455 460
Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala
465 470 475 480
Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser
485 490 495
Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His
500 505 510
Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg
515 520 525
Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu
530 535 540
Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
545 550 555
<210> 104
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H1
<400> 104
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 105
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H2
<400> 105
Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-H3
<400> 106
Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr
1 5
<210> 107
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L1
<400> 107
Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L2
<400> 108
Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) CDR-L3
<400> 109
Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr
1 5
<210> 110
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VH
<400> 110
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 111
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FAP(4B9) VL
<400> 111
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 112
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(sm9b) CDR-H1
<400> 112
Asp Ser Tyr Met His
1 5
<210> 113
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(sm9b) CDR-H2
<400> 113
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 114
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(sm9b) CDR-H3
<400> 114
Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 115
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(sm9b) CDR-L1
<400> 115
Ser Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met His
1 5 10
<210> 116
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(sm9b) CDR-L2
<400> 116
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(sm9b) CDR-L3
<400> 117
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 118
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(sm9b) VH
<400> 118
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 119
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CEA(sm9b) VL
<400> 119
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 120
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-H1
<400> 120
Asp Tyr Ile Met His
1 5
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-H2
<400> 121
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 122
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-H3
<400> 122
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 123
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-L1
<400> 123
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 124
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-L2
<400> 124
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
<210> 125
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) CDR-L3
<400> 125
Leu Gln Leu Thr His Val Pro Tyr Thr
1 5
<210> 126
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) VH
<400> 126
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 127
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-018) VL
<400> 127
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 128
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H1
<400> 128
Asp Tyr Ile Met His
1 5
<210> 129
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H2
<400> 129
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 130
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H3
<400> 130
Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-L1
<400> 131
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 132
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-L2
<400> 132
Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser
1 5
<210> 133
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-L3
<400> 133
Leu Gln Leu Leu Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5
<210> 134
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) VH
<400> 134
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 135
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8-2B11) VL
<400> 135
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 136
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽接头G4S
<400> 136
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 137
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP(4B9) Fc穴链的核苷酸序列
<400> 137
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggcccct ccgtgttccc cctggccccc agcagcaaga gcaccagcgg cggcacagcc 420
gctctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaacagc 480
ggagccctga cctccggcgt gcacaccttc cccgccgtgc tgcagagttc tggcctgtat 540
agcctgagca gcgtggtcac cgtgccttct agcagcctgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggagcc caagagctgc 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 1080
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320
ctctccctgt ctccgggtaa a 1341
<210> 138
<211> 3084
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与三聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗FAP(4B9) Fc节链的核苷酸序列
<400> 138
gaggtgcagc tgctcgaaag cggcggagga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60
tcttgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tgagctgggt ccgccaggcc 120
cctggcaagg gactggaatg ggtgtccgcc atcatcggct ctggcgccag cacctactac 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc caagggatgg 300
ttcggcggct tcaactactg gggacagggc accctggtca cagtgtccag cgctagcacc 360
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 720
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 840
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 900
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccct gcagagatga gctgaccaag 1080
aaccaggtgt ccctgtggtg cctcgtgaag ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1140
tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200
gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agagccggtg gcagcagggc 1260
aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320
ctgagcctga gccctggcgg aggcggagga tctggcgggg gaggatctag agagggccct 1380
gagctgtccc ccgatgatcc tgctggactg ctggacctgc ggcagggcat gtttgctcag 1440
ctggtggccc agaacgtgct gctgatcgac ggccctctga gctggtacag cgatcctgga 1500
ctggctggcg tgtcactgac aggcggcctg agctacaaag aggacaccaa agaactggtg 1560
gtggccaagg ccggcgtgta ctacgtgttc tttcagctgg aactgcggag agtggtggcc 1620
ggcgagggat ctggatctgt gtctctggcc ctgcatctgc agcccctgag atcagctgct 1680
ggcgctgctg ctctggctct gacagtggat ctgcctcctg ccagcagcga ggcccggaat 1740
agcgcatttg ggtttcaagg caggctgctg cacctgtctg ccggccagag gctgggagtg 1800
catctgcaca cagaagccag agccaggcac gcttggcagc tgacacaggg cgctacagtg 1860
ctgggcctgt tcagagtgac ccccgagatt ccagccggcc tgccttctcc aagaagcgaa 1920
ggcggcggag gctccggagg aggcggctct agagaaggac ctgaactgag cccagacgac 1980
cccgcagggc tgctggatct gagacaggga atgttcgccc agctggtggc tcagaatgtg 2040
ctgctgattg atggacccct gtcctggtac tccgacccag ggctggcagg ggtgtccctg 2100
actggcggac tgtcttacaa agaagataca aaagaactgg tggtggctaa agctggggtg 2160
tactatgtgt tttttcagct ggaactgagg cgggtggtgg ctggggaagg cagtggctct 2220
gtgtccctgg cactgcatct gcagcctctg cgcagtgctg caggcgcagc cgcactggca 2280
ctgactgtgg acctgccccc agcttccagc gaggctagaa acagcgcctt cgggtttcaa 2340
ggacgcctgc tgcatctgag cgccggacag cgcctgggag tgcatctgca tactgaggct 2400
agggccagac atgcctggca gctgacccag ggggcaactg tgctgggact gtttcgcgtg 2460
acacctgaga tccccgctgg cctgccaagc cctagatcag aaggcggagg gggatcaggg 2520
ggaggcggat ccagagaggg ccctgagctg agccccgatg atcctgctgg actgctggac 2580
ctgcggcagg gcatgtttgc tcagctggtg gcccagaacg tgctgctgat cgatggcccc 2640
ctgtcctggt acagcgatcc tggactggct ggcgtgtcac tgacaggcgg cctgagctac 2700
aaagaggaca ccaaagaact ggtggtggcc aaggccggcg tgtactacgt gttctttcag 2760
ctggaactgc ggagagtggt ggccggcgaa ggatctggct ctgtgtctct ggccctgcat 2820
ctgcagcctc tgagaagcgc tgctggcgct gcagctctgg cactgacagt ggatctgcct 2880
cctgccagct ccgaggcccg gaatagcgca tttgggtttc aaggcaggct gctgcacctg 2940
tctgccggcc agaggctggg agtgcatctg cacacagagg ccagggctag acacgcctgg 3000
cagctgacac agggcgctac agtgctgggc ctgttcagag tgacccccga gattccagcc 3060
ggcctgcctt ctccaagaag cgaa 3084
<210> 139
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP(4B9)轻链的核苷酸序列
<400> 139
gagatcgtgc tgacccagtc ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60
ctgtcctgca gagcctccca gtccgtgacc tcctcctacc tcgcctggta tcagcagaag 120
cccggccagg cccctcggct gctgatcaac gtgggcagtc ggagagccac cggcatccct 180
gaccggttct ccggctctgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatctc ccggctggaa 240
cccgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagggcatca tgctgccccc cacctttggc 300
cagggcacca aggtggaaat caagcgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 140
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP(4B9) Fc穴链
<400> 140
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 141
<211> 1028
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与三聚体4 hu 4-1BBL (71-254)融合的抗FAP(4B9) Fc节链
<400> 141
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
450 455 460
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
465 470 475 480
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
485 490 495
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
500 505 510
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
515 520 525
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
530 535 540
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
545 550 555 560
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
565 570 575
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
580 585 590
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
595 600 605
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
610 615 620
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
625 630 635 640
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu
645 650 655
Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe
660 665 670
Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser
675 680 685
Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu
690 695 700
Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val
705 710 715 720
Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu
725 730 735
Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
740 745 750
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala
755 760 765
Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu
770 775 780
His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala
785 790 795 800
Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly
805 810 815
Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg
820 825 830
Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
835 840 845
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
850 855 860
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
865 870 875 880
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
885 890 895
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
900 905 910
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
915 920 925
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
930 935 940
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
945 950 955 960
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
965 970 975
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
980 985 990
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
995 1000 1005
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro
1010 1015 1020
Ser Pro Arg Ser Glu
1025
<210> 142
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP(4B9)轻链
<400> 142
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 143
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEA(sm9b) Fc穴链的核苷酸序列
<400> 143
caagtgaagc tggagcagag cggcgccgaa gtcgtgaaac ccggggcttc cgtcaagctc 60
tcttgcaagg catcaggatt caacatcaaa gacagctaca tgcactggct gaggcagggc 120
cctggtcagt gccttgagtg gattggctgg atcgatccag agaatggcga caccgaatat 180
gcccccaagt ttcaaggaaa ggctacattc accactgata catccgcaaa caccgcctac 240
ctgggtctct caagtctgcg ccctgaggac actgctgtgt attactgtaa tgagggcacc 300
ccaacagggc cctactattt tgactactgg ggacagggca ccttggttac agtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtgcaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctctcgtgc gcagtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctcgtg agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 144
<211> 3093
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与三聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗CEA(sm9b) Fc节链的的核苷酸序列
<400> 144
caagtgaagc tggagcagag cggcgccgaa gtcgtgaaac ccggggcttc cgtcaagctc 60
tcttgcaagg catcaggatt caacatcaaa gacagctaca tgcactggct gaggcagggc 120
cctggtcagt gccttgagtg gattggctgg atcgatccag agaatggcga caccgaatat 180
gcccccaagt ttcaaggaaa ggctacattc accactgata catccgcaaa caccgcctac 240
ctgggtctct caagtctgcg ccctgaggac actgctgtgt attactgtaa tgagggcacc 300
ccaacagggc cctactattt tgactactgg ggacagggca ccttggttac agtgagctcc 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc tgcaggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcggcgccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccctg cagagatgag 1080
ctgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgc ctcgtgaagg gcttctaccc ctccgatatc 1140
gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200
ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gagccggtgg 1260
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320
cagaagtccc tgagcctgag ccctggcgga ggcggaggat ctggcggggg aggatctaga 1380
gagggccctg agctgtcccc cgatgatcct gctggactgc tggacctgcg gcagggcatg 1440
tttgctcagc tggtggccca gaacgtgctg ctgatcgacg gccctctgag ctggtacagc 1500
gatcctggac tggctggcgt gtcactgaca ggcggcctga gctacaaaga ggacaccaaa 1560
gaactggtgg tggccaaggc cggcgtgtac tacgtgttct ttcagctgga actgcggaga 1620
gtggtggccg gcgagggatc tggatctgtg tctctggccc tgcatctgca gcccctgaga 1680
tcagctgctg gcgctgctgc tctggctctg acagtggatc tgcctcctgc cagcagcgag 1740
gcccggaata gcgcatttgg gtttcaaggc aggctgctgc acctgtctgc cggccagagg 1800
ctgggagtgc atctgcacac agaagccaga gccaggcacg cttggcagct gacacagggc 1860
gctacagtgc tgggcctgtt cagagtgacc cccgagattc cagccggcct gccttctcca 1920
agaagcgaag gcggcggagg ctccggagga ggcggctcta gagaaggacc tgaactgagc 1980
ccagacgacc ccgcagggct gctggatctg agacagggaa tgttcgccca gctggtggct 2040
cagaatgtgc tgctgattga tggacccctg tcctggtact ccgacccagg gctggcaggg 2100
gtgtccctga ctggcggact gtcttacaaa gaagatacaa aagaactggt ggtggctaaa 2160
gctggggtgt actatgtgtt ttttcagctg gaactgaggc gggtggtggc tggggaaggc 2220
agtggctctg tgtccctggc actgcatctg cagcctctgc gcagtgctgc aggcgcagcc 2280
gcactggcac tgactgtgga cctgccccca gcttccagcg aggctagaaa cagcgccttc 2340
gggtttcaag gacgcctgct gcatctgagc gccggacagc gcctgggagt gcatctgcat 2400
actgaggcta gggccagaca tgcctggcag ctgacccagg gggcaactgt gctgggactg 2460
tttcgcgtga cacctgagat ccccgctggc ctgccaagcc ctagatcaga aggcggaggg 2520
ggatcagggg gaggcggatc cagagagggc cctgagctga gccccgatga tcctgctgga 2580
ctgctggacc tgcggcaggg catgtttgct cagctggtgg cccagaacgt gctgctgatc 2640
gatggccccc tgtcctggta cagcgatcct ggactggctg gcgtgtcact gacaggcggc 2700
ctgagctaca aagaggacac caaagaactg gtggtggcca aggccggcgt gtactacgtg 2760
ttctttcagc tggaactgcg gagagtggtg gccggcgaag gatctggctc tgtgtctctg 2820
gccctgcatc tgcagcctct gagaagcgct gctggcgctg cagctctggc actgacagtg 2880
gatctgcctc ctgccagctc cgaggcccgg aatagcgcat ttgggtttca aggcaggctg 2940
ctgcacctgt ctgccggcca gaggctggga gtgcatctgc acacagaggc cagggctaga 3000
cacgcctggc agctgacaca gggcgctaca gtgctgggcc tgttcagagt gacccccgag 3060
attccagccg gcctgccttc tccaagaagc gaa 3093
<210> 145
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEA(sm9b)轻链的核苷酸序列
<400> 145
gagaacgtgc tgacccagag cccctcctct atgtcagtca gcgtgggcga cagggtcaca 60
atcgcctgct ccgcttctag标签cgtgcct tacatgcact ggctccagca gaagccaggg 120
aaatccccca agctgcttat ttattctacc tcaaatctgg caagcggagt tcctagcaga 180
ttctctggca gtggtagcgg gactgattac tccctcacaa tctcaagtgt gcagccagaa 240
gacgccgcta cctattactg tcaacagcgc agctcctacc ccctgacttt tggctgtggc 300
accaagttgg agattaaacg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360
gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420
agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480
agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540
agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600
agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgt 639
<210> 146
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEA(sm9b) Fc穴链
<400> 146
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 147
<211> 1031
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与三聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗CEA(sm9b) Fc节链
<400> 147
Gln Val Lys Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gly Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu
450 455 460
Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met
465 470 475 480
Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu
485 490 495
Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly
500 505 510
Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly
515 520 525
Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly
530 535 540
Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg
545 550 555 560
Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro
565 570 575
Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu
580 585 590
Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu
595 600 605
Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu
610 615 620
Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro
625 630 635 640
Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly
645 650 655
Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln
660 665 670
Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly
675 680 685
Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr
690 695 700
Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys
705 710 715 720
Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val
725 730 735
Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro
740 745 750
Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu
755 760 765
Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly
770 775 780
Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His
785 790 795 800
Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr
805 810 815
Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro
820 825 830
Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg
835 840 845
Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu
850 855 860
Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile
865 870 875 880
Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser
885 890 895
Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val
900 905 910
Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg
915 920 925
Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu
930 935 940
Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val
945 950 955 960
Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe
965 970 975
Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His
980 985 990
Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly
995 1000 1005
Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala
1010 1015 1020
Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
1025 1030
<210> 148
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEA(sm9b)轻链
<400> 148
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met
20 25 30
His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 149
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗 CD19(8B8-018) Fc穴链的核苷酸序列
<400> 149
caggtccagc tggtgcagtc cggcgccgag gtcaagaaac ccggggcttc tgtgaaggtt 60
tcatgcaagg caagcggata caccttcacc gactatatca tgcattgggt caggcaggcc 120
cctggccaag gtctcgaatg gatgggctac attaacccat ataatgatgg ctccaaatac 180
accgagaagt ttcagggaag agtcactatg acatctgaca ccagtatcag cactgcttac 240
atggagctgt cccgccttcg gtctgatgac accgcagtgt attactgtgc caggggcaca 300
tattactacg gctcagctct gttcgactat tgggggcagg gaaccacagt aaccgtgagc 360
tccgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 150
<211> 3096
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与三聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗CD19(8B8-018) Fc节链的核苷酸序列
<400> 150
caggtccagc tggtgcagtc cggcgccgag gtcaagaaac ccggggcttc tgtgaaggtt 60
tcatgcaagg caagcggata caccttcacc gactatatca tgcattgggt caggcaggcc 120
cctggccaag gtctcgaatg gatgggctac attaacccat ataatgatgg ctccaaatac 180
accgagaagt ttcagggaag agtcactatg acatctgaca ccagtatcag cactgcttac 240
atggagctgt cccgccttcg gtctgatgac accgcagtgt attactgtgc caggggcaca 300
tattactacg gctcagctct gttcgactat tgggggcagg gaaccacagt aaccgtgagc 360
tccgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgcctcgtga agggcttcta cccctccgat 1140
atcgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccctggc ggaggcggag gatctggcgg gggaggatct 1380
agagagggcc ctgagctgtc ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 1440
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg acggccctct gagctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaggg atctggatct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcccctg 1680
agatcagctg ctggcgctgc tgctctggct ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaagcc agagccaggc acgcttggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 1920
ccaagaagcg aaggcggcgg aggctccgga ggaggcggct ctagagaagg acctgaactg 1980
agcccagacg accccgcagg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 2040
gctcagaatg tgctgctgat tgatggaccc ctgtcctggt actccgaccc agggctggca 2100
ggggtgtccc tgactggcgg actgtcttac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 2160
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggaa 2220
ggcagtggct ctgtgtccct ggcactgcat ctgcagcctc tgcgcagtgc tgcaggcgca 2280
gccgcactgg cactgactgt ggacctgccc ccagcttcca gcgaggctag aaacagcgcc 2340
ttcgggtttc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 2400
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ctgtttcgcg tgacacctga gatccccgct ggcctgccaa gccctagatc agaaggcgga 2520
gggggatcag ggggaggcgg atccagagag ggccctgagc tgagccccga tgatcctgct 2580
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gtgttctttc agctggaact gcggagagtg gtggccggcg aaggatctgg ctctgtgtct 2820
ctggccctgc atctgcagcc tctgagaagc gctgctggcg ctgcagctct ggcactgaca 2880
gtggatctgc ctcctgccag ctccgaggcc cggaatagcg catttgggtt tcaaggcagg 2940
ctgctgcacc tgtctgccgg ccagaggctg ggagtgcatc tgcacacaga ggccagggct 3000
agacacgcct ggcagctgac acagggcgct acagtgctgg gcctgttcag agtgaccccc 3060
gagattccag ccggcctgcc ttctccaaga agcgaa 3096
<210> 151
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018)轻链的核苷酸序列
<400> 151
gacatcgtca tgacccagac acccctgtcc ctctctgtga cccctggcca gccagcctca 60
attagctgca agtcctctca aagtctggag aaccccaatg ggaacactta ccttaattgg 120
tatctgcaga aacccggaca atcccctcaa ctcctgatct acagggtctc taagagattc 180
tcaggcgtgc cagatcgctt标签cggttcc gggtctggca cagacttcac cttgaagatt 240
agtcgggttg aagctgagga tgtgggagtc tattactgtc tgcagctcac tcatgtgccc 300
tacacctttg gtcagggcac aaaactggag atcaagcgga ccgtggccgc tccctccgtg 360
ttcatcttcc caccctccga cgagcagctg aagtccggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 420
ctgaacaact tctacccccg cgaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctgcag 480
tccggcaact cccaggaatc cgtgaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg 540
tcctccaccc tgaccctgtc caaggccgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgaa 600
gtgacccacc agggcctgtc cagccccgtg accaagtcct tcaaccgggg cgagtgc 657
<210> 152
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018) Fc穴链
<400> 152
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 153
<211> 1032
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与三聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗CD19(8B8-018) Fc节链
<400> 153
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
625 630 635 640
Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu
645 650 655
Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg
660 665 670
Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
675 680 685
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
690 695 700
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
705 710 715 720
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
725 730 735
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
740 745 750
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
755 760 765
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
770 775 780
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
785 790 795 800
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
805 810 815
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
820 825 830
Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
835 840 845
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
850 855 860
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
865 870 875 880
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
885 890 895
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
900 905 910
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
915 920 925
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
930 935 940
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
945 950 955 960
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
965 970 975
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
980 985 990
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
995 1000 1005
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro
1010 1015 1020
Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
1025 1030
<210> 154
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-018)轻链
<400> 154
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 155
<211> 1353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-2B11) Fc穴链的核苷酸序列
<400> 155
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catctggtta caccttcact gactatatca tgcactgggt tcgtcaggcc 120
ccgggccagg gtctggagtg gatgggctac attaacccat acaacgacgg ttccaaatat 180
accgagaaat tccagggccg cgtcacgatg accagcgaca cttctatctc caccgcgtac 240
atggaactgt ctagactgcg ttctgacgac accgctgttt actattgtgc acgcggtacc 300
tactactacg gtccacagct gtttgattac tggggccaag gtaccacggt gaccgtaagc 360
tctgctagca ccaagggccc ctccgtgttc cccctggccc ccagcagcaa gagcaccagc 420
ggcggcacag ccgctctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgagcc cgtgaccgtg 480
tcctggaaca gcggagccct gacctccggc gtgcacacct tccccgccgt gctgcagagt 540
tctggcctgt atagcctgag cagcgtggtc accgtgcctt ctagcagcct gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggtggag 660
cccaagagct gcgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtgca ccctgccccc atcccgggat 1080
gagctgacca agaaccaggt cagcctctcg tgcgcagtca aaggcttcta tcccagcgac 1140
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gtgagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320
acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353
<210> 156
<211> 3096
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与三聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗CD19(8B8-2B11) Fc节链的核苷酸序列
<400> 156
caggtgcaat tggttcaatc tggtgctgaa gtaaaaaaac cgggcgcttc cgttaaagtg 60
agctgcaaag catctggtta caccttcact gactatatca tgcactgggt tcgtcaggcc 120
ccgggccagg gtctggagtg gatgggctac attaacccat acaacgacgg ttccaaatat 180
accgagaaat tccagggccg cgtcacgatg accagcgaca cttctatctc caccgcgtac 240
atggaactgt ctagactgcg ttctgacgac accgctgttt actattgtgc acgcggtacc 300
tactactacg gtccacagct gtttgattac tggggccaag gtaccacggt gaccgtaagc 360
tctgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agctgcaggg 720
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cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcggcg cccccatcga gaaaaccatc 1020
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc ctgcagagat 1080
gagctgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgcctcgtga agggcttcta cccctccgat 1140
atcgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200
gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1260
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320
acccagaagt ccctgagcct gagccctggc ggaggcggag gatctggcgg gggaggatct 1380
agagagggcc ctgagctgtc ccccgatgat cctgctggac tgctggacct gcggcagggc 1440
atgtttgctc agctggtggc ccagaacgtg ctgctgatcg acggccctct gagctggtac 1500
agcgatcctg gactggctgg cgtgtcactg acaggcggcc tgagctacaa agaggacacc 1560
aaagaactgg tggtggccaa ggccggcgtg tactacgtgt tctttcagct ggaactgcgg 1620
agagtggtgg ccggcgaggg atctggatct gtgtctctgg ccctgcatct gcagcccctg 1680
agatcagctg ctggcgctgc tgctctggct ctgacagtgg atctgcctcc tgccagcagc 1740
gaggcccgga atagcgcatt tgggtttcaa ggcaggctgc tgcacctgtc tgccggccag 1800
aggctgggag tgcatctgca cacagaagcc agagccaggc acgcttggca gctgacacag 1860
ggcgctacag tgctgggcct gttcagagtg acccccgaga ttccagccgg cctgccttct 1920
ccaagaagcg aaggcggcgg aggctccgga ggaggcggct ctagagaagg acctgaactg 1980
agcccagacg accccgcagg gctgctggat ctgagacagg gaatgttcgc ccagctggtg 2040
gctcagaatg tgctgctgat tgatggaccc ctgtcctggt actccgaccc agggctggca 2100
ggggtgtccc tgactggcgg actgtcttac aaagaagata caaaagaact ggtggtggct 2160
aaagctgggg tgtactatgt gttttttcag ctggaactga ggcgggtggt ggctggggaa 2220
ggcagtggct ctgtgtccct ggcactgcat ctgcagcctc tgcgcagtgc tgcaggcgca 2280
gccgcactgg cactgactgt ggacctgccc ccagcttcca gcgaggctag aaacagcgcc 2340
ttcgggtttc aaggacgcct gctgcatctg agcgccggac agcgcctggg agtgcatctg 2400
catactgagg ctagggccag acatgcctgg cagctgaccc agggggcaac tgtgctggga 2460
ctgtttcgcg tgacacctga gatccccgct ggcctgccaa gccctagatc agaaggcgga 2520
gggggatcag ggggaggcgg atccagagag ggccctgagc tgagccccga tgatcctgct 2580
ggactgctgg acctgcggca gggcatgttt gctcagctgg tggcccagaa cgtgctgctg 2640
atcgatggcc ccctgtcctg gtacagcgat cctggactgg ctggcgtgtc actgacaggc 2700
ggcctgagct acaaagagga caccaaagaa ctggtggtgg ccaaggccgg cgtgtactac 2760
gtgttctttc agctggaact gcggagagtg gtggccggcg aaggatctgg ctctgtgtct 2820
ctggccctgc atctgcagcc tctgagaagc gctgctggcg ctgcagctct ggcactgaca 2880
gtggatctgc ctcctgccag ctccgaggcc cggaatagcg catttgggtt tcaaggcagg 2940
ctgctgcacc tgtctgccgg ccagaggctg ggagtgcatc tgcacacaga ggccagggct 3000
agacacgcct ggcagctgac acagggcgct acagtgctgg gcctgttcag agtgaccccc 3060
gagattccag ccggcctgcc ttctccaaga agcgaa 3096
<210> 157
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-2B11)轻链的核苷酸序列
<400> 157
gatattgtca tgactcaaac tccactgtct ctgtccgtga ccccgggtca gccagcgagc 60
atttcttgca aatccagcca atctctggaa acctccaccg gcaccacgta cctgaactgg 120
tatctccaga aaccgggtca gagcccgcag ctgctgatct accgtgtatc taagcgcttc 180
tccggcgttc ctgatcgttt cagcggttct ggatccggca ccgactttac tctgaaaatc 240
agccgtgtgg aagctgaaga cgttggcgtc tactattgtc tgcagctgct ggaagatcca 300
tacaccttcg gtcaaggaac gaaactggaa attaaacgta cggtggctgc accatctgtc 360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgt 657
<210> 158
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-2B11) Fc穴链
<400> 158
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 159
<211> 1032
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与三聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的抗CD19(8B8-2B11) Fc节链
<400> 159
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro
450 455 460
Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly
465 470 475 480
Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro
485 490 495
Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly
500 505 510
Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala
515 520 525
Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala
530 535 540
Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu
545 550 555 560
Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro
565 570 575
Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg
580 585 590
Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr
595 600 605
Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val
610 615 620
Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser
625 630 635 640
Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu
645 650 655
Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg
660 665 670
Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp
675 680 685
Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu
690 695 700
Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala
705 710 715 720
Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val
725 730 735
Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln
740 745 750
Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp
755 760 765
Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln
770 775 780
Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu
785 790 795 800
His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala
805 810 815
Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu
820 825 830
Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
835 840 845
Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp
850 855 860
Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu
865 870 875 880
Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val
885 890 895
Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val
900 905 910
Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg
915 920 925
Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His
930 935 940
Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr
945 950 955 960
Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly
965 970 975
Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val
980 985 990
His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln
995 1000 1005
Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro
1010 1015 1020
Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
1025 1030
<210> 160
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19(8B8-2B11)轻链
<400> 160
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser
20 25 30
Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu
85 90 95
Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 161
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-L1 抗CD19(8B8)
<400> 161
Asn Ser Asn Gly Asn Thr
1 5
<210> 162
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HVR-H2 抗CD19(8B8)
<400> 162
Lys Phe Asn Gly
1
<210> 163
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有HYRF突变的Fc穴链的核苷酸序列
<400> 163
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaag ctgcaggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggcgcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 164
<211> 1602
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD19抗原Fc节链avi标签的核苷酸序列
<400> 164
cccgaggaac ccctggtcgt gaaggtggaa gagggcgaca atgccgtgct gcagtgcctg 60
aagggcacct ccgatggccc tacccagcag ctgacctggt ccagagagag ccccctgaag 120
cccttcctga agctgtctct gggcctgcct ggcctgggca tccatatgag gcctctggcc 180
atctggctgt tcatcttcaa cgtgtcccag cagatgggcg gcttctacct gtgtcagcct 240
ggccccccat ctgagaaggc ttggcagcct ggctggaccg tgaacgtgga aggatccggc 300
gagctgttcc ggtggaacgt gtccgatctg ggcggcctgg gatgcggcct gaagaacaga 360
tctagcgagg gccccagcag ccccagcggc aaactgatga gccccaagct gtacgtgtgg 420
gccaaggaca gacccgagat ctgggagggc gagcctcctt gcctgccccc标签agacagc 480
ctgaaccaga gcctgagcca ggacctgaca atggcccctg gcagcacact gtggctgagc 540
tgtggcgtgc cacccgactc tgtgtctaga ggccctctga gctggaccca cgtgcaccct 600
aagggcccta agagcctgct gagcctggaa ctgaaggacg acaggcccgc cagagatatg 660
tgggtcatgg aaaccggcct gctgctgcct agagccacag cccaggatgc cggcaagtac 720
tactgccaca gaggcaacct gaccatgagc ttccacctgg aaatcaccgc cagacccgtg 780
ctgtggcact ggctgctgag aacaggcggc tggaaggtcg acgctagcgg tggtagtccg 840
acacctccga cacccggggg tggttctgca gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 900
gcacctgaag ccgcaggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 960
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 1020
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1080
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1140
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcggagcc 1200
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1260
ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgtggtg cctggtcaaa 1320
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1380
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1440
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1500
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa atccggaggc 1560
ctgaacgaca tcttcgaggc ccagaagatt gaatggcacg ag 1602
<210> 165
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带有HYRF突变的Fc穴链
<400> 165
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 166
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD19抗原Fc节链avi标签
<400> 166
Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val
1 5 10 15
Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr
20 25 30
Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe
50 55 60
Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro
65 70 75 80
Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val
85 90 95
Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro
115 120 125
Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg
130 135 140
Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro Arg Asp Ser
145 150 155 160
Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr
165 170 175
Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro
180 185 190
Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser
195 200 205
Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu
210 215 220
Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr
245 250 255
Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys
260 265 270
Val Asp Ala Ser Gly Gly Ser Pro Thr Pro Pro Thr Pro Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
305 310 315 320
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
325 330 335
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
340 345 350
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
355 360 365
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
370 375 380
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala
385 390 395 400
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
405 410 415
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
420 425 430
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
435 440 445
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
450 455 460
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
465 470 475 480
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
485 490 495
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
500 505 510
Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln
515 520 525
Lys Ile Glu Trp His Glu
530
<210> 167
<211> 1605
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴CD19抗原Fc节链avi标签的核苷酸序列
<400> 167
ccccaggaac ccctggtcgt gaaggtggaa gagggcgaca atgccgtgct ccagtgcctg 60
gaaggcacct ccgatggccc tacacagcag ctcgtgtggt gcagagacag ccccttcgag 120
cccttcctga acctgtctct gggcctgcct ggcatgggca tcagaatggg ccctctgggc 180
atctggctgc tgatcttcaa cgtgtccaac cagaccggcg gcttctacct gtgtcagcct 240
ggcctgccaa gcgagaaggc ttggcagcct ggatggaccg tgtccgtgga aggatctggc 300
gagctgttcc ggtggaacgt gtccgatctg ggcggcctgg gatgcggcct gaagaacaga 360
agcagcgagg gccctagcag ccccagcggc aagctgaata gcagccagct gtacgtgtgg 420
gccaaggaca gacccgagat gtgggagggc gagcctgtgt gtggcccccc标签agatagc 480
ctgaaccaga gcctgagcca ggacctgaca atggcccctg gcagcacact gtggctgagc 540
tgtggcgtgc cacccgactc tgtgtccaga ggccctctga gctggacaca cgtgcggcca 600
aagggcccta agagcagcct gctgagcctg gaactgaagg acgaccggcc cgaccgggat 660
atgtgggtgg tggatacagg cctgctgctg accagagcca cagcccagga tgccggcaag 720
tactactgcc acagaggcaa ctggaccaag agcttttacc tggaaatcac cgccagaccc 780
gccctgtggc actggctgct gagaatcgga ggctggaagg tcgacgctag cggtggtagt 840
ccgacacctc cgacacccgg gggtggttct gcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 900
ccagcacctg aagccgcagg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 960
accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1020
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1080
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1140
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctcgga 1200
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1260
accctgcccc catgccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc 1320
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1380
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1440
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1500
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatccgga 1560
ggcctgaacg acatcttcga ggcccagaag attgaatggc acgag 1605
<210> 168
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 食蟹猴CD19抗原Fc节链avi标签
<400> 168
Pro Gln Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val
1 5 10 15
Leu Gln Cys Leu Glu Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Val
20 25 30
Trp Cys Arg Asp Ser Pro Phe Glu Pro Phe Leu Asn Leu Ser Leu Gly
35 40 45
Leu Pro Gly Met Gly Ile Arg Met Gly Pro Leu Gly Ile Trp Leu Leu
50 55 60
Ile Phe Asn Val Ser Asn Gln Thr Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro
65 70 75 80
Gly Leu Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Ser Val
85 90 95
Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly
100 105 110
Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro
115 120 125
Ser Gly Lys Leu Asn Ser Ser Gln Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg
130 135 140
Pro Glu Met Trp Glu Gly Glu Pro Val Cys Gly Pro Pro Arg Asp Ser
145 150 155 160
Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr
165 170 175
Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro
180 185 190
Leu Ser Trp Thr His Val Arg Pro Lys Gly Pro Lys Ser Ser Leu Leu
195 200 205
Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Asp Arg Asp Met Trp Val Val
210 215 220
Asp Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Trp Thr Lys Ser Phe Tyr Leu Glu Ile
245 250 255
Thr Ala Arg Pro Ala Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Ile Gly Gly Trp
260 265 270
Lys Val Asp Ala Ser Gly Gly Ser Pro Thr Pro Pro Thr Pro Gly Gly
275 280 285
Gly Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
290 295 300
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
305 310 315 320
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
325 330 335
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
340 345 350
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
355 360 365
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
370 375 380
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly
385 390 395 400
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
405 410 415
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
420 425 430
Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
435 440 445
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
450 455 460
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
465 470 475 480
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
485 490 495
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
500 505 510
Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala
515 520 525
Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
530 535
<210> 169
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8) VH亲本克隆的核苷酸序列
<400> 169
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
gcctgcaagg cttctggata cacattcact gactatatta tgcactgggt gaagcagaag 120
actgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg ttctaagtac 180
actgagaagt tcaacggcaa ggccacactg acttcagaca aatcttccat cacagcctac 240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagggacc 300
tattattatg gtagcgccct ctttgactac tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360
tcg 363
<210> 170
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 (8B8) VL亲本克隆的核苷酸序列
<400> 170
gatgctgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca ggtctagtca gagccttgaa aacagtaatg gaaacaccta tttgaactgg 120
tacctccaga aaccaggcca gtctccacaa ctcctgatct acagggtttc caaacgattt 180
tctggggtcc标签acaggtt cagtggtagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tatttctgcc tacaacttac acatgtcccg 300
tacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 336
<210> 171
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 43-45: 40% Y, 6% A/S/T/G/P/D/N/E/Q/V, 49-51: 40% N, 6%
A/S/T/Y/G/P/D/E/Q/V, 55-57: 25% S/T/Q/E, 61-63: 25% S/T/Q/E
<220>
<221> 混杂特征
<222> (43)..(45)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (49)..(51)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (55)..(57)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (61)..(63)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 171
cagctgcggg ctctgacccg gtttctggag ataccagttc agnnncgtnn ngccnnngga 60
nnnttccaga gattggctgg atttgcaaga aatg 94
<210> 172
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 40-42: 30% R, 20% E, 5% A/S/T/Y/G/P/D/N/Q/V. 49-51: 30% K, 20% S,
5% A/N/T/Y/G/P/D/E/Q/V, 55-57: 40% F, 5% A/S/T/Y/G/P/D/E/Q/V/I/L,
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(42)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (49)..(51)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (55)..(57)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (58)..(60)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (67)..(69)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 172
ctccagaaac cgggtcagag cccgcagctg ctgatctacn nngtatctnn ncgcnnnnnn 60
ggcgttnnng atcgtttcag cggttctgga tccggcacc 99
<210> 173
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 40-42: 52% H, 4% G/A/S/P/T/N/Y/D/E/Q/V/I, 46-48: 30% I, 15% Y, 5%
G/A/S/T/P/N/H/D/E/Q/V, 49-51: 52% Y, 4% G/A/S/P/T/N/H/D/E/Q/V/I,
52-54: 30% D, 15% G, 5% A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I, 55-57: 52% T, 4%
G/A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I, 61-63: 52% T, 4% G/A/S/P/Y/N/H/D/E/
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(42)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (46)..(48)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (49)..(51)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (52)..(54)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (55)..(57)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (61)..(63)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 173
catccactcc agaccctggc ccggggcctg acgaacccan nncatnnnnn nnnnnnngaa 60
nnngtaacca gatgctttgc agctcacttt aacggaagc 99
<210> 174
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34-36: 45% Y, 5% 其它, 40-42: 52% N, 4% 其它, 46-48: 40% Y,5%
其它, 49-51: 30% N, 15% S, 5% 其它, 52-54: 30% D, 15% G,5%
其它, 55-57: 52% G, 4% 其它, 61-63: 30% K, 15% N, 4% 其它,
70-72: 30% E, 15% Q, 5% 其它
<220>
<221> 混杂特征
<222> (34)..(36)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(42)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (46)..(48)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (49)..(51)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (52)..(54)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (55)..(57)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (61)..(63)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (70)..(72)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 174
caggccccgg gccagggtct ggagtggatg ggcnnnattn nnccannnnn nnnnnnntcc 60
nnntataccn nnaaattcca gggccgcgtc acgatgacc 99
<210> 175
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 H3 reverse constant
<400> 175
cgtcaccggt tcggggaagt agtccttgac cag 33
<210> 176
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LMB3
<400> 176
caggaaacag ctatgaccat gattac 26
<210> 177
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 L1 forward constant
<400> 177
tggtatctcc agaaaccggg tcagagcccg cag 33
<210> 178
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 34-36: 52% Y, 4% 其它, 37-39: 52% P, 4% 其它, 40-42: 42%
V,10% L, 4% 其它, 43-45: 52% H, 4% 其它, 46-48: 42% T, 10% I,
4% 其它, 49-51: 45% L, 11% G, 4% 其它
<220>
<221> 混杂特征
<222> (34)..(36)
<223> n 是 a,c,g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (37)..(39)
<223> n 是 a,c,g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (40)..(42)
<223> n 是 a,c,g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (43)..(45)
<223> n 是 a,c,g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (46)..(48)
<223> n 是 a,c,g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (49)..(51)
<223> n 是 a,c,g 或 t
<400> 178
tttaatttcc agtttagttc cttgaccgaa ggtnnnnnnn nnnnnnnnnn nctgcagaca 60
atagtagacg ccaacgtctt cagc 84
<210> 179
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD19 L3正向恒定
<400> 179
accttcggtc aaggaactaa actggaaatt aaacg 35
<210> 180
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 位置59-61: 50% L, 3.8% 其它, 62-64: 50% A, 4.2% 其它,
65-67:50% S, 4.2% 其它, 68-70: 50% G, 4.2% 其它, 71-73: 50%
Y, 4.2%其它, 74-76: 50% Y, 4.2% 其它, 77-79: 50% Y, 4.2%
其它, 80-82: 50% T, 4.2% 其它, 83-85: 50% G, 4.2% 其它.
<220>
<221> 混杂特征
<222> (54)..(58)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (59)..(61)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (62)..(64)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (65)..(67)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (68)..(70)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (71)..(73)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (74)..(76)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (77)..(79)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<220>
<221> 混杂特征
<222> (80)..(82)
<223> n 是 a, c, g 或 t
<400> 180
ttggtgctag cagagcttac ggtcaccgtg gtaccttggc cccagtaatc aaannnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gcgtgcacaa标签taaacag cggtgtc 107
<210> 181
<211> 3078
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 与三聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的DP47 Fc节的核苷酸序列
<400> 181
gaggtgcaat tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agttatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaaggcagc 300
ggatttgact actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cgagtgctag caccaagggc 360
ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 600
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 660
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagctgcag ggggaccgtc agtcttcctc 720
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 780
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 840
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 900
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 960
gtctccaaca aagccctcgg cgcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1020
ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccctgcagag atgagctgac caagaaccag 1080
gtgtccctgt ggtgcctcgt gaagggcttc tacccctccg atatcgccgt ggaatgggag 1140
agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ctgtgctgga cagcgacggc 1200
tcattcttcc tgtactccaa gctgaccgtg gacaagagcc ggtggcagca gggcaacgtg 1260
ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgagc 1320
ctgagccctg gcggaggcgg aggatctggc gggggaggat ctagagaggg ccctgagctg 1380
tcccccgatg atcctgctgg actgctggac ctgcggcagg gcatgtttgc tcagctggtg 1440
gcccagaacg tgctgctgat cgacggccct ctgagctggt acagcgatcc tggactggct 1500
ggcgtgtcac tgacaggcgg cctgagctac aaagaggaca ccaaagaact ggtggtggcc 1560
aaggccggcg tgtactacgt gttctttcag ctggaactgc ggagagtggt ggccggcgag 1620
ggatctggat ctgtgtctct ggccctgcat ctgcagcccc tgagatcagc tgctggcgct 1680
gctgctctgg ctctgacagt ggatctgcct cctgccagca gcgaggcccg gaatagcgca 1740
tttgggtttc aaggcaggct gctgcacctg tctgccggcc agaggctggg agtgcatctg 1800
cacacagaag ccagagccag gcacgcttgg cagctgacac agggcgctac agtgctgggc 1860
ctgttcagag tgacccccga gattccagcc ggcctgcctt ctccaagaag cgaaggcggc 1920
ggaggctccg gaggaggcgg ctctagagaa ggacctgaac tgagcccaga cgaccccgca 1980
gggctgctgg atctgagaca gggaatgttc gcccagctgg tggctcagaa tgtgctgctg 2040
attgatggac ccctgtcctg gtactccgac ccagggctgg caggggtgtc cctgactggc 2100
ggactgtctt acaaagaaga tacaaaagaa ctggtggtgg ctaaagctgg ggtgtactat 2160
gtgttttttc agctggaact gaggcgggtg gtggctgggg aaggcagtgg ctctgtgtcc 2220
ctggcactgc atctgcagcc tctgcgcagt gctgcaggcg cagccgcact ggcactgact 2280
gtggacctgc ccccagcttc cagcgaggct agaaacagcg ccttcgggtt tcaaggacgc 2340
ctgctgcatc tgagcgccgg acagcgcctg ggagtgcatc tgcatactga ggctagggcc 2400
agacatgcct ggcagctgac ccagggggca actgtgctgg gactgtttcg cgtgacacct 2460
gagatccccg ctggcctgcc aagccctaga tcagaaggcg gagggggatc agggggaggc 2520
ggatccagag agggccctga gctgagcccc gatgatcctg ctggactgct ggacctgcgg 2580
cagggcatgt ttgctcagct ggtggcccag aacgtgctgc tgatcgatgg ccccctgtcc 2640
tggtacagcg atcctggact ggctggcgtg tcactgacag gcggcctgag ctacaaagag 2700
gacaccaaag aactggtggt ggccaaggcc ggcgtgtact acgtgttctt tcagctggaa 2760
ctgcggagag tggtggccgg cgaaggatct ggctctgtgt ctctggccct gcatctgcag 2820
cctctgagaa gcgctgctgg cgctgcagct ctggcactga cagtggatct gcctcctgcc 2880
agctccgagg cccggaatag cgcatttggg tttcaaggca ggctgctgca cctgtctgcc 2940
ggccagaggc tgggagtgca tctgcacaca gaggccaggg ctagacacgc ctggcagctg 3000
acacagggcg ctacagtgct gggcctgttc agagtgaccc ccgagattcc agccggcctg 3060
ccttctccaa gaagcgaa 3078
<210> 182
<211> 1026
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 与三聚体hu 4-1BBL (71-254)融合的DP47 Fc节
<400> 182
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly
435 440 445
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
450 455 460
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
465 470 475 480
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
485 490 495
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
500 505 510
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
515 520 525
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
530 535 540
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
545 550 555 560
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
565 570 575
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
580 585 590
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
595 600 605
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
610 615 620
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly
625 630 635 640
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro
645 650 655
Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln
660 665 670
Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr
675 680 685
Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr
690 695 700
Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr
705 710 715 720
Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser
725 730 735
Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala
740 745 750
Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser
755 760 765
Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu
770 775 780
Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala
785 790 795 800
Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe
805 810 815
Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
820 825 830
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu
835 840 845
Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe
850 855 860
Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser
865 870 875 880
Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu
885 890 895
Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val
900 905 910
Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu
915 920 925
Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser
930 935 940
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala
945 950 955 960
Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu
965 970 975
His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala
980 985 990
Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly
995 1000 1005
Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro
1010 1015 1020
Arg Ser Glu
1025
<210> 183
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV衍生肽
<400> 183
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5

Claims (9)

1.一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其包含：
(a)至少一个能够特异性结合靶细胞抗原的模块，
(b)包含三个彼此连接的TNF配体家族成员的胞外域或其片段的多肽，任选通过肽接头，和
(c)由能够稳定联合的第一和第二亚基构成的Fc域。
2.权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子，其中该靶细胞抗原选自由成纤维细胞激活蛋白(FAP)，黑素瘤关联硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)，表皮生长因子受体(EGFR)，癌胚抗原(CEA)，CD19，CD20和CD33组成的组。
3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。
4.一种载体，特别是表达载体，其包含权利要求3的分离的多核苷酸。
5.一种宿主细胞，其包含权利要求3的分离的多核苷酸或权利要求4的载体。
6.一种生成权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法，其包括以下步骤：
(i)在适合于表达该抗原结合分子的条件下培养权利要求5的宿主细胞，并
(ii)回收该抗原结合分子。
7.一种药物组合物，其包含权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学上可接受的赋形剂。
8.权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子制造用于治疗癌症的药物的用途。
9.一种在个体中治疗疾病的方法，其包括对所述个体施用治疗有效量的药学上可接受形式的包含权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的组合物。
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