BR112020013425A2 - agonista de 4-1bb (cd137), produto farmacêutico, composição farmacêutica, uso de uma combinação de um agonista de 4-1bb e um agente de direcionamento de her-2 e método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a terapias combinadas que empregam agonistas de 4-1BB (CD137), em particular trímero de 4-1BBL contendo moléculas de ligação ao antígeno, em combinação com agentes de direcionamento HER-2, o uso dessas terapias combinadas para o tratamento de câncer e métodos de usar as terapias combinadas.

Description

“AGONISTA DE 4-1BB (CD137), PRODUTO FARMACÊUTICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UMA COMBINAÇÃO DE UM AGONISTA DE 4-1BB E UM AGENTE DE DIRECIONAMENTO DE HER-2 E

MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DO CÂNCER EM UM INDIVÍDUO” CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a terapias combinadas que empregam agonistas de 4-1BB (CD137), em particular o trímero de 4-1BBL contendo moléculas de ligação aos antígenos e um agente de direcionamento de HER-2 e o uso dessas terapias combinadas para o tratamento de câncer e métodos de uso das terapias combinadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O câncer é uma das principais causas de morte no mundo. Apesar dos avanços nas opções de tratamento, o prognóstico dos pacientes com câncer avançado permanece ruim. Consequentemente, existe uma necessidade médica persistente e urgente de terapias ideais para aumentar a sobrevida de pacientes com câncer sem causar toxicidade inaceitável. Resultados recentes de ensaios clínicos mostraram que as terapias imunológicas podem prolongar a sobrevida global de pacientes com câncer e levar a respostas duradouras. Apesar desses resultados promissores, as terapias imunológicas atuais são eficazes apenas em uma proporção de pacientes e são necessárias estratégias de combinação para melhorar o benefício terapêutico.

[003] O receptor-2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER-2; ErbB2) é um receptor tirosina-quinase e um membro da família de receptores transmembranares do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). O HER-2 é superexpresso em vários tipos de tumores e está implicado no início e progressão da doença. Está associado a um mal prognóstico. Por exemplo, a superexpressão de HER-2 é observada em aproximadamente 30% dos cânceres de mama humanos e está implicada no crescimento agressivo e nos desfechos clínicos ruins associados a esses tumores (Slamon et al (1987) Science 235: 177-182).

[004] O anticorpo “monoclonal humanizado anticHER-2 trastuzumabe (CAS 180288-69-1, HERCEPTINº, huMAb4D5-8, rhnumabe HER- 2, Genentech) tem como alvo o domínio extracelular de HER-2 (US 5677171; US 5821337; US 6054297; US 6165464; US 6339142; US 6407213; US 6639055; US 6719971; US 6800738; US 7074404; Coussens et al (1985) Science 230:1 132-9; Slamon et al (1989) Science 244:707-12; Slamon et al (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792). Demonstrou-se que o trastuzumabe inibe a proliferação de células tumorais humanas que superexpressam o HER- 2eé um mediador da citotoxicidade celular dependente de anticorpos, ADCC (Hudziak et al (1989) Mol Cell Biol 9:1 165-72; Lewis et al (1993) Cancer Immunol Immunother; 37:255-63; Baselga et al (1998) Cancer Res. 58:2825- 2831; Hotaling et al (1996) [Resumo]. Proc. Annual Meeting Am Assoc Cancer Res; 37:471; Pegram MD, et al (1997) [Resumo]. Proc Am Assoc Cancer Res; 38:602; Sliwkowski et al (1999) Seminars in Oncology 26(4), Suppl 12:60- 70; Yarden Y. and Sliwkowski, M. (2001) Nature Reviews: Molecular Cell Biology, Macmillan Magazines, Ltd., Vol. 2:127-137).

[005] O HERCEPTINº (trastuizumabe, Genentech Inc.) foi aprovado em 1998 para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático com superexpressão de HER-2 (Baselga et al, (1996) J. Clin. Oncol. 14:737-744). Em 2006, o FDA aprovou o HERCEPTINº como parte de um regime de tratamento contendo doxorrubicina, ciclofosfamida e paclitaxel para o tratamento adjuvante de pacientes com câncer de mama positivo para nó e positivo para HER-2.

[006] O trastuzumabe-MCC-DM1 (T-DM1, trastuzumabe emtansina, ado-trastuzumabe emtansina, KADCYLAS), um novo conjugado anticorpo-medicamento (ADC) para o tratamento de câncer de mama positivo para HER-2, é composto pelo agente citotóxico DM1 (um agente anti- microtúbulo maitansinóide contendo tiol) conjugado com trastuzumabe nas cadeias laterais de lisina por meio de um ligante MCC, com uma carga média de medicamento (proporção medicamento/ anticorpo) de cerca de 3,5. Após ligação ao HER-2 expresso nas células tumorais, o T-DM1 sofre internalização mediada pelo receptor, resultando na liberação intracelular de catabolitos citotóxicos contendo DM1 e subsequente morte celular. O FDA aprovou o ado- trastuzumabe emtansina, comercializado sob o nome comercial KADCYLAS?º, em 2013 para o tratamento de pacientes com câncer de mama metastático positivo para HER-2, que receberam tratamento anteriormente com trastuzumabe e taxano.

[007] O pertuzumabe (também conhecido como anticorpo monoclonal humanizado recombinante 2C4, rhumabe 2C4, PERJETA?, Genentech, Inc, sul de São Francisco) é outro tratamento de anticorpos direcionado ao HER-2. O pertuzumabe é um inibidor da dimerização de HER (IDH) e funciona para inibir a capacidade do HER-2 de formar heterodímeros ativos ou homodímeros com outros receptores de HER (como EGFR/ HER1, HER-2, HER3 e HER4). Ver, por exemplo, Harari e Yarden Oncogene 19:6102- 14 (2000); Yarden e Sliwkowski. Nat Rev Mol Cell Biol 2:127-37 (2001); Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003); Cho et al. Nature 421:756-60 (2003); and Malik et al. Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003); US 7560111. PERJETAS, foi aprovado pela primeira vez em 2012 em combinação com trastuzumabe e docetaxel para o tratamento de pacientes com câncer de mama Positivo para HER-2 ou avançado (metastático) em estágio avançado. Enquanto isso, a terapia combinada usando trastuzumabe e pertuzumabe também é aprovada para o tratamento neoadjuvante (antes da cirurgia) do câncer de mama em fase inicial positivo, localmente avançado, inflamatório ou inflamatório para HER-2 e para o tratamento adjuvante (após a cirurgia) do câncer de mama precoce Positivo para HER-2 (EBC) com alto risco de recorrência. Acredita-se que os mecanismos de ação de Perjeta e Herceptin se complementem, pois ambos se ligam ao receptor de HER-2, mas em locais diferentes. Pensa-se que a combinação de Perjeta e Herceptin forneça um bloqueio duplo mais abrangente das vias de sinalização de HER, impedindo assim o crescimento e a sobrevivência das células tumorais.

[008] Anticorpos bivalentes e específicos para HER-2 que são direcionados contra os domínios Il, Ill e IV de ErbB2 humano são divulgados no documento WO 2012/143523. Anticorpos biespecíficos HER-2 compreendendo variantes otimizadas dos anticorpos rhumabe 2C4 e hu4D5, chamados Herceptarg, foram descritos no documento WO 2015/091738.

[009] Embora a eficácia terapêutica do trastuzumabe no carcinoma da mama seja bem demonstrada, há muitos pacientes que não se beneficiam do trastuzumabe devido à resistência. Dada a falta de uma terapia anti-HER-2 eficaz em cânceres específicos que expressam baixos níveis de HER-2, a resistência às terapias atuais e a prevalência de cânceres relacionados ao HER-2, novas terapias são necessárias para tratar esses cânceres.

[010] 4-1BB (CD137), um membro da superfamília do receptor de TNF, foi identificado pela primeira vez como uma molécula induzível expressa por w ativada por células T (Kwon e Weissman, 1989, Proc Natl Acad Sci USA 86, 1963-1967). Estudos subsequentes demonstraram que muitas outras células imunológicas também expressam 4-1BB, incluindo células NK, células B, células NKT, monócitos, neutrófilos, mastócitos, células dendríticas (DCs) e células de origem não hematopoiética, como células endoteliais e musculares lisas (Vinay e Kwon, 2011, Cell Mol Immunol 8, 281-284). A expressão de 4-

1BB em diferentes tipos de células é principalmente induzível e conduzida por vários sinais estimuladores, como o desencadeamento de receptores de células T (TOR) ou receptores de células B, bem como a sinalização induzida por moléculas co-estimuladoras ou receptores de citocinas pró-inflamatórias (Diehl et al., 2002, J Immunol 168, 3755-3762; Zhang et al., 2010, Clin Cancer Res 13, 2758-2767).

[011] O ligando de 4-1BB (4-1BBL ou CD137L) foi identificado em 1993 (Goodwin et al, 1993, Eur J Immunol 23, 2631-2641). Foi demonstrado que a expressão de 4-1BBL era restrita a células apresentadoras de antígeno profissionais (APC), como células B, DCs e macrófagos. A expressão induzível de 4-1BBL é característica para células T, incluindo subconjuntos de células T af e vB, e células endoteliais (Shao e Schwarz, 2011, J Leukoc Biol 89, 21-29).

[012] A co-estimulação através do receptor de 4-1BB (por exemplo, pela ligação de 4-1BBL) ativa várias cascatas de sinalização dentro da célula T (subconjuntos CD4* e CD8*), aumentando poderosamente a ativação das células T (Bartkowiak e Curran, 2015). Em combinação com o desencadeamento de TCR, os anticorpos agonísticos específicos de 4-1BB aumentam a proliferação de células T, estimulam a secreção de linfocinas e diminuem a sensibilidade dos linfócitos T à morte de células induzidas por ativação (Snell et al., 2011, Immunol Rev 244, 197- 217) Esse mecanismo foi ainda mais avançado como a primeira prova de conceito em imunoterapia contra o câncer. Em um modelo pré-clínico, a administração de um anticorpo agonístico contra 4-1BB em camundongos portadores de tumores levou a um efeito antitumoral potente (Melero et al., 1997, Nat Med 3, 682-685). Posteriormente, evidências acumuladas indicaram que o 4-1BB de forma geral exibe sua potência como agente antitumoral somente quando administrado em combinação com outros compostos imunomoduladores, reagentes quimioterapêuticos, vacinação específica por tumor ou radioterapia (Bartkowiak e Curran, 2015, Front Oncol 5, 117).

[013] A sinalização da superfamília TNFR precisa de reticulação dos ligantes trimerizados para se envolver com os receptores, o mesmo acontece com os anticorpos agonísticos de 4-1BB que requerem ligação a Fc do tipo selvagem (Li e Ravetch, 2011, Science 333, 1030-1034). No entanto, a administração sistêmica de anticorpos agonísticos específicos de 4-1BB com o domínio Fc funcionalmente ativo resultou no influxo de células T CD8* associadas à toxicidade hepática (Dubrot et al., 2010, Cancer Immunol Immunother 59, 1223-1233) diminuído ou melhorado significativamente na ausência de receptores Fc funcionais em camundongos. Na clínica, um Ab agonista de 4-1BB competente em FC (BMS-663513) (NCTOO612664) causou uma hepatite de grau 4 levando ao término do julgamento (Simeone e Ascierto, 2012, J Immunotoxicol 9, 241-247). Portanto, é necessário agonistas de 4-1BB eficazes e mais seguros.

[014] Proteínas de fusão compostas por um domínio extracelular de um ligante de 4-1BB e um fragmento de anticorpo de cadeia única (Hornig et al., 2012, J Immunother 35, 418-429; Múller et al., 2008, J Inmunother 37, 714-722) ou um único ligando de 4-1BB fundido ao terminal C de uma cadeia pesada (Zhang et al., 2007, Clin Cancer Res 13, 2758-2767) foi produzido. O documento WO 2010/010051 divulga a geração de proteínas de fusão que consistem em três ectodomínios do ligando de TNF ligados um ao outro e fundidos a uma parte do anticorpo. Na presente invenção, moléculas de ligação ao antígeno compostas por um ligante de 4-1BB trimérico e, portanto, biologicamente ativo e um domínio de ligação ao antígeno específico para o antígeno associado ao tumor e um domínio Fc inativo, são mostrados particularmente estáveis e robustos. Para a co-estimulação específica do tumor via 4-1BB (CD137), uma molécula que compreende um domínio de ligação ao antígeno direcionado à FAP no estroma do tumor e um trímero de ligantes de 4-1BB são particularmente úteis, a seguir denominada FAP-4-1BBL. O domínio de ligação ao antígeno FAP substitui a reticulação inespecífica mediada por FecyR, responsável pela toxicidade mediada por Fc, em particular no fígado, por uma reticulação específica direcionada a FAP, reduzindo assim o risco de toxicidade.

[015] Descrevemos aqui uma nova terapia de combinação para tumores que expressam HER-2.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[016] A presente invenção refere-se a agonistas de 4-1BB (CD137), em particular o trímero de 4-1BBL contendo moléculas de ligação ao antígeno e seu uso em combinação com a terapia de direcionamento ao HER- 2, em particular ao seu uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer. Verificou-se que a terapia de combinação aqui descrita é mais eficaz na inibição do crescimento tumoral e na eliminação de células tumorais do que o tratamento com agonistas de 4-1BB ou terapias de direcionamento conhecidas de HER-2 isoladamente.

[017] Em alguns aspectos, a invenção fornece um agonista de 4- 1BB (CD137) para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2 e em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor.

[018] Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER- 2 compreende um anticorpo de HER-2, um anticorpo biespecífico de HER-2 e/ ou um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende trastuzumabe,

pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende uma combinação de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2 selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e margetuximabe. Em um aspecto, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe ou pertuzumabe. Mais particularmente, o agente de direcionamento de HER-2 é o trastuzumabe. Em alguns aspectos, o direcionamento HER-2 é um anticorpo de HER-2 com glicoengenharia, por exemplo, TrasGex. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um anticorpo biespecífico de HER-2, por exemplo, Herceptarg. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2, em particular o trastuzumabe emtansina (ado-trastuzumabe emtansina).

[019] Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos. Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é uma molécula que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, em particular a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[020] Em aspectos adicionais, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor. Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor. Em um aspecto, o antígeno associado ao tumor é selecionado a partir do grupo que consiste em proteína de ativação de fibroblastos (FAP) e CEA.

[021] Em aspectos adicionais, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, de forma específica um domínio Fc de I9G1 ou um domínio Fc de I9G4. Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora. Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc com modificações que reduzem a ligação ao receptor de Fcy e/ ou a função efetora. A reticulação por um antígeno associado ao tumor torna possível evitar a reticulação mediada por FcyR inespecífica e, portanto, doses mais altas e mais eficazes dos agonistas de 4-1BB podem ser administradas em comparação com os anticorpos comuns de 4-1BB.

[022] Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a uma proteína de ativação de fibroblastos (FAP). Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[023] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 24.

[024] Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um com o outro através de meio de um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo. Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a uma FAP compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[025] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.

[026] Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-FAP/ anti-4-1BB.

[027] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA. Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[028] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[029] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[030] Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[031] Em um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CEA/ anti-4-1BB.

[032] Em outros aspectos, o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER-2 são administrados juntos em uma única composição ou administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes. Em outros aspectos, o agonista de 4-1BB atua sinergicamente com o agente de direcionamento de HER-2. Em outros aspectos, o agonista de 4-1BB é administrado simultaneamente com, antes ou subsequentemente ao agente de direcionamento de HER-2.

[033] Em outros aspectos, é fornecida uma combinação que compreende um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2. Em um aspecto, a combinação é para uso como um medicamento, em que o agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 são de administração simultânea. Em outros aspectos, a combinação é para uso como um medicamento, em que o agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 são de administração sequencial.

[034] Em outro aspecto, é fornecido um produto farmacêutico que compreende (A) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4-1BB e um veículo farmaceuticamente aceitável; e (B) uma segunda composição compreendendo como ingrediente ativo um agente de direcionamento de HER-2 e um veículo farmaceuticamente aceitável, para uso no tratamento combinado, sequencial ou simultâneo de uma doença, em particular câncer.

[035] Em um aspecto adicional, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende trastuzumabe, pertuzumabe &e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é uma combinação de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em aspectos adicionais, é fornecida a composição farmacêutica para uso no tratamento ou no retardo da progressão do câncer, em particular no tratamento de tumores sólidos avançados e/ ou metastáticos.

[036] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao uso de uma combinação de um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 na fabricação de um medicamento para o tratamento ou o retardo da progressão de uma doença proliferativa, em particular câncer. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é uma combinação de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

[037] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB e uma quantidade eficaz de um agente de direcionamento de HER-2. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é uma combinação de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

[038] Em alguns aspectos, a invenção se refere a um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB e uma quantidade eficaz de um agente de direcionamento de HER-2, em que o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos. Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é qualquer agonista de 4-1BB aqui fornecido. Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER-2 são administrados juntos em uma única composição ou administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes. Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER-2 são administrados por via intravenosa ou subcutânea. Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB é administrado simultaneamente com, antes ou subsequentemente ao agente de direcionamento de HER-2.

[039] Em outros aspectos, a invenção se refere a um agonista de 4-1BB em combinação com um agente de direcionamento de HER-2 ou composição farmacêutica para uso no tratamento ou no retardo da progressão do câncer, um uso de uma combinação de um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 na fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão de uma doença proliferativa, em particular câncer, ou um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo, em que o câncer é um câncer positivo para HER-2. Em alguns aspectos, o câncer é câncer de mama, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão, câncer uterino, carcinoma do ducto salivar, câncer de bexiga, câncer de endométrio, câncer de pâncreas, câncer de cólon, câncer de próstata e/ ou câncer de cabeça e pescoço.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[040] A Figura 1 mostra moléculas particulares de ligação ao antígeno FAP-4-1BBL. Essas moléculas são descritas em mais detalhes no Exemplo 1. O ponto preto grosso representa a modificação do knob-into-hole. À Figura 1A mostra uma molécula monovalente de ligação ao antígeno contendo FAP 4-1BBL com modificações no domínio CH1 e CL adjacente ao dímero 4- 1BBL e monômero 4-1BBL. Como compreendia o aglutinante de FAP 4B9, foi denominado mono FAP(4B9)-4-1BBL neste documento. A Figura 1B mostra a construção bivalente com o ligante FAP(4B9), denominado bi FAP(4B9)-4- 1BBL. As Figuras 1C e 1D mostram moléculas de controle não direcionadas (o aglutinante de FAP foi substituído por um Fab DP47 não ligado).

[041] As Figuras 2A e 2B mostram a ligação simultânea do substituto híbrido FAP-mu4-1BBL (Analito 1) a 4-16BB murino imobilizado e FAP humano ou FAP murino (Analito 2), respectivamente. Na Figura 2C é mostrada a ligação simultânea do anticorpo muFAP-4-1BB biespecífico murino (Analito 1) a 4-1BB murino imobilizado e FAP murino (Analito 2).

[042] A Figura 3 mostra o perfil farmacocinético do muFAP-4- 1BB após injeção única em camundongos C57BL/ 6, como descrito no Exemplo 4. Foi observado um comportamento estável da PK, o que sugere que o composto pode ser administrado em um esquema uma vez por semana.

[043] As Figuras 4A e 4B mostram o esquema de tratamento e os grupos de tratamento de camundongos huCD16TgScid, conforme descrito no Exemplo 5.

[044] A Figura 5A mostra a cinética de crescimento do tumor (Média +/- SEM), como observado em camundongos tratados apenas com trastuzumabe, híbrido FAP-mu4-1BBL sozinho ou com a combinação de ambos. As cinéticas individuais de crescimento tumoral de cada animal para todos os grupos de tratamento são mostradas nas Figuras 5B (grupo controle),

5C (tratamento apenas com trastuzumabe), 5D (tratamento apenas com FAP- mu4-1BBL) e 5E (tratamento com a combinação). O número de camundongos livres de tumor no término do estudo é indicado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO DEFINIÇÕES

[045] Salvo indicação em contrário, os termos peritos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que os de forma geral utilizados na técnica à qual a presente invenção pertence. Para fins de interpretação desta especificação, as seguintes definições serão aplicadas e, sempre que apropriado, os termos usados no singular também incluirão o plural e vice-versa.

[046] Como aqui utilizado, o termo “molécula de ligação ao antígeno” refere-se no seu sentido mais lato a uma molécula que se liga de forma específica a um determinante antigênico. Exemplos de moléculas de ligação ao antígeno são anticorpos, fragmentos de anticorpo e proteínas de ligação ao antígeno de estrutura.

[047] O termo “anticorpo” aqui utilizado no sentido mais amplo e engloba vias estruturas de anticorpo, incluindo, mas não limitado a anticorpos monoclonais, — anticorpos — policlonais, anticorpos — monoespecíficos e multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos desde que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.

[048] O termo “anticorpo monoclonal” como aqui utilizado refere- se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto para possíveis anticorpos variantes, por exemplo mutações que ocorrem naturalmente ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monocional, estando estas variantes de forma geral presentes em quantidades menores.

Em contraste com as preparações de anticorpos policlonais, que incluem de forma comum diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monocional direcionado contra um único determinante em um antígeno.

[049] O termo anticorpo “monoespecífico”, como aqui utilizado, denota um anticorpo que possui um ou mais sítios de ligação, cada um dos quais se liga ao mesmo epítopo do mesmo antígeno. O termo “biespecífico” significa que a molécula de ligação ao antígeno é, capaz de se ligar de forma específica a pelo menos dois determinantes antigênicos distintos. De forma comum, uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno compreende dois locais de ligação ao antígeno, cada um dos quais específico para um determinante antigênico diferente. Em certas formas de realização, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno é, capaz de se ligar simultaneamente a dois determinantes antigênicos, em particular dois determinantes antigênicos expressos em duas células distintas.

[050] O termo “valente” como utilizado no presente pedido denota a presença de um número específico de locais de ligação em uma molécula de ligação ao antígeno. Como tal, os termos “bivalente”, “tetravalente” e “hexavalente” denotam a presença de dois sítios de ligação, quatro sítios de ligação e seis sítios de ligação, respectivamente, em uma molécula de ligação ao antígeno.

[051] Os termos “anticorpo de comprimento total”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são aqui utilizados indistintamente para referir um anticorpo possuindo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativa. “Anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variadas. Por exemplo, anticorpos de classe IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são ligadas por dissulfureto, do terminal N ao terminal C, cada cadeia pesada possui uma região variável (VH), também chamada de domínio variável ou um domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), também chamados de região constante de cadeia. Similarmente, do terminal N ao C, cada cadeia leve possui uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio constante de cadeia leve (CL), também chamado de região constante de cadeia leve. A cadeia pesada de um anticorpo pode ser atribuída a um de cinco tipos, denominados a (IgA), 5 (I9D), € (IgE), y (IG) ou up (IgM), alguns dos quais podem ser divididos em subtipos, por exemplo, y1 (I9G1), y2 (IgG2), v3 (I9G3), v4 (I9G4), a1 (I9gA1) e a2 (IgA2). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um de dois tipos, chamados kappa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos do seu domínio constante.

[052] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem mas não estão limitados a Fv, Fab, Fab, Fab'-SH, F (ab')2; diacorpos, triacorpos, tetracorpos, fragmentos de “Fab cruzado”; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia simples (por exemplo, scFv); e anticorpos de domínio único. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, ver Hudson et a/., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, ver, por exemplo, Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Anticorpos, vol. 113, Rosenburg e Moore eds,, Springer-Verlag, Nova lorque, pp. 269-315 (1994); ver também WO 93/16185; e Patentes U.S. Nos 5,571,894 e 5,587,458. Para discussão de fragmentos de Fab e F(ab')2 que compreende resíduos de epítopo de ligação ao receptor de salvamento e possuindo semi-vida in vivo aumentada, ver Patente U.S. Nº

5.869.046. Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos, ver, por exemplo, EP

404.097; WO 1993/01161; Hudson et al. f Nat Med 9, 129-134 (2003); e Hollinger e outros, Proc Natl Acad Sci US A 90, 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et a/., Nat Med 9, 129-134 (2003). Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreende todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou a totalidade ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas formas de realização, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por exemplo, Patente U.S. Nº 6,248,516 B1). Os fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por vias técnicas, incluindo, mas não se limitando a digestão proteolítica de um anticorpo intacto, assim como a produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, por exemplo, coli ou fago), como descrito neste documento.

[053] A digestão com papaína de anticorpos intactos produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antígeno, chamados fragmentos “Fab” contendo cada um dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve e também o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Como aqui utilizado, Assim, o termo “fragmento de Fab” refere- se a um fragmento de anticorpo que compreende um fragmento de cadeia leve que compreende um domínio VL e um domínio constante de uma cadeia leve (CL) e um domínio VH e um primeiro domínio constante (CH1) de uma cadeia pesada. Os fragmentos de Fab' diferem dos fragmentos de Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxila do domínio CH1 da cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH são fragmentos de Fab' em que o (s) resíduo (s) de cisteína dos domínios constantes contêm um grupo tiol livre. O tratamento com pepsina origina um fragmento F(ab')2 que possui dois locais de combinação com o antígeno (dois fragmentos de Fab) e uma parte da região Fc.

[054] O termo “fragmento de Fab cruzado” ou “fragmento x Fab” ou “fragmento de Fab cruzado” refere-se a um fragmento de Fab, em que as regiões variáveis ou as regiões constantes da cadeia pesada e leve são trocadas. Duas composições de cadeia diferentes de uma molécula de Fab cruzada são possíveis e compreendidas nos anticorpos biespecíficos da invenção: Por um lado, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de Fab são trocadas, isto é, a molécula de Fab de cruzamento compreende uma cadeia peptídica composta de a região variável de cadeia leve (VL) e a região constante da cadeia pesada (CH1) e uma cadeia peptídica composta pela região variável de cadeia pesada (VH) e pela região constante da cadeia leve (CL). Esta molécula de cruzamento de Fab é também referida como CrossFab (VLVH). Por outro lado, quando as regiões constantes da cadeia pesada e leve de Fab são trocadas, a molécula de Fab de cruzamento compreende uma cadeia peptídica composta pela região variável de cadeia pesada (VH) e a região constante da cadeia leve (CL) e um peptídeo composto pela região variável de cadeia leve (VL) e pela região constante da cadeia pesada (CH1). Esta molécula de cruzamento de Fab é também referida como CrossFab (CLCH1).

[055] Um “fragmento de Fab de cadeia simples” ou “scFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável de cadeia pesada do anticorpo (VH), um domínio constante do anticorpo 1 (CH1), um domínio variável de cadeia leve do anticorpo (VL), uma domínio constante da cadeia leve do anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção do terminal N para o terminal C: a) ligante VH-CH1-VL-CL, b) ligante VL-CL -VH-CH1, c)

Ligante VH-CL-VL-CH1 ou d) Ligante VL-CH1-VH-CL; e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, de forma preferida entre 32 e 50 aminoácidos. Os referidos fragmentos de Fab de cadeia simples são estabilizados através da ligação dissulfureto natural entre o domínio CLe o domínio CH1, de forma adicional, estas moléculas Fab de cadeia simples podem ser ainda estabilizadas por geração de ligações dissulfureto intercadeia através da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, posição 44 na cadeia pesada variável e posição 100 na cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).

[056] Um “fragmento de Fab de cadeia simples cruzada” ou “x- scFab” é um polipeptídeo que consiste em um domínio variável de cadeia pesada (VH) de anticorpo, um domínio constante de anticorpo 1 (CH1), um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL), um domínio constante de cadeia leve de anticorpo (CL) e um ligante, em que os referidos domínios de anticorpo e o referido ligante têm uma das seguintes ordens na direção terminal N para terminal C: a) VH-CL-ligante-VL-CH1 e b) VL-CH1-ligante-VH-CL; em que VH e VL formam em conjunto um sítio de ligação ao antígeno, que se liga de forma específica a um antígeno e em que o referido ligante é um polipeptídeo de pelo menos 30 aminoácidos, de forma adicional, estas moléculas x-scFab podem ser ainda estabilizadas por geração de ligações dissulfureto intercadeia através da inserção de resíduos de cisteína (por exemplo, posição 44 na cadeia pesada variável e posição 100 na cadeia leve variável de acordo com a numeração de Kabat).

[057] Um “fragmento variável de cadeia única (scFv) é uma proteína de fusão das regiões variáveis das cadeias pesada (VH) e leve (VL) de um anticorpo, ligada a um peptídeo ligante curto de dez a cerca de 25 aminoácidos. O ligante é de forma geral rico em glicina para flexibilidade, assim como serina ou treonina para solubilidade e pode ligar o terminal N da VH com o terminal C da VL, ou vice-versa. Esta proteína retém a especificidade do anticorpo original, apesar da remoção das regiões constantes e da introdução do ligante. Os anticorpos scFv são, por exemplo, descritos em Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96), de forma adicional, os fragmentos de anticorpo — compreendem polipeptídecos de cadeia simples com as características de um domínio VH, nomeadamente sendo capazes de se reunirem com um domínio VL, ou de um domínio VL, nomeadamente serem capazes de se unir com um domínio VH a um local funcional de ligação ao antígeno e desse modo proporcionando a propriedade de ligação ao antígeno de anticorpos de comprimento total.

[058] “Proteínas de ligação de antígeno de suporte” são conhecidas no estado da técnica, por exemplo, fibronectina e proteínas de repetição de anquirina (DARPins) têm sido utilizadas como estruturas alternativas para domínios de ligação ao antígeno, ver, por exemplo, Gebauer e Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation anticorpo therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13: 245-255 (2009) e Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008). Em um aspecto da invenção, uma proteína de ligação ao antígeno de estrutura selecionada a partir do grupo que consiste em CTLA-4 (Evocorpo), Lipocalinas (Anticalina), uma molécula derivada de Proteína A, tal como o domínio Z de Proteína A (Aficorpo), um Domínio A (Avimer/ Maxicorpo), uma transferrina sérica (trans-corpo); uma proteína repetida de anquirina (DARPin), um domínio variável de cadeia leve ou cadeia pesada de anticorpo (anticorpo de domínio nico, sdAb), um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (nanocorpo, aVH), fragmentos VNAR, uma fibronectina (AdNectin) um domínio de lectina do tipo C (tetranectina); um domínio variável de uma nova beta-lactamase do receptor de antígeno (fragmentos VNAR), uma faixa-cristalina humana ou ubiquitina (moléculas de Affilin); um domínio do tipo Kkunitz de inibidores de proteases humanas, microrganismos, tais como as proteínas da família knottin, aptâmeros de peptídeos e fibronectina (adnectina).

[059] As lipocalinas são uma família de proteínas extracelulares que transportam pequenas moléculas hidrofóbicas, como esteróides, bilinas, retinóides e lipídios. Eles têm uma estrutura secundária de folha-beta rígida com um número de loops na extremidade aberta da estrutura cônica que pode ser projetada para se ligar a diferentes antígenos-alvo. As anticalinas têm entre 160 e 180 aminoácidos de tamanho e são derivadas de lipocalinas. Para mais detalhes ver Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000), US 7250297 B1 e US

20070224633.

[060] As Proteínas de Repetição de Ankyrin Desenhadas (DARPins) são derivadas da Ankyrin, que é uma família de proteínas que medeiam a ligação de proteínas de membrana integrais ao citoestrutura. Uma única repetição de anquirina é um motivo de 33 resíduos que consiste em duas hélices alfa e uma volta beta. Eles podem ser manipulados para se ligarem a diferentes antígenos-alvo por randomização de resíduos na primeira hélice-alfa e uma volta-beta de cada repetição. Sua interface de ligação pode ser aumentada aumentando o número de módulos (um método de maturação por afinidade). Para mais detalhes, ver J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100 (4), 1700-1705 (2003) e J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007) e US 20040132028 A1.

[061] Um anticorpo de domínio único é um fragmento de anticorpo que consiste em um único domínio de anticorpo variável monomérico. Os primeiros domínios únicos foram derivados do domínio variável de cadeia pesada do anticorpo de camelídeos (nanocorpos ou fragmentos VHH). Além disso, o termo anticorpo de domínio único inclui um domínio variável de cadeia pesada humana (aVH) autónomo ou fragmentos VNAR derivados de tubarões.

[062] Uma “molécula de ligação ao antígeno, que se liga ao mesmo epítopo” como uma molécula de referência refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno que bloqueia a ligação da molécula de referência ao seu antígeno em um teste de competição em 50% ou mais e inversamente, a molécula de referência bloqueia a ligação da molécula de ligação ao antígeno ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais.

[063] O termo “domínio de ligação ao antígeno” refere-se parte de uma molécula de ligação ao antígeno que compreende a área que se liga de forma específica e complementar a parte ou a totalidade de um antígeno. Quando um antígeno é grande, uma molécula de ligação ao antígeno pode ligar-se apenas a uma parte particular do antígeno, parte a qual é denominada epítopo. Um domínio de ligação ao antígeno pode ser proporcionado, por exemplo, por um ou mais domínios variáveis (também denominados regiões variáveis). De preferência, um domínio de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve do anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada do anticorpo (VH).

[064] Como aqui utilizado, o termo “determinante antigênico” é sinônimo de “antígeno” e “epítopo” e refere-se a um sítio (por exemplo, um trecho contíguo de aminoácidos ou uma configuração conformacional composta de diferentes regiõês de aminoácidos não contíguos) em uma macromolécula polipeptídica à qual se liga uma fração de ligação ao antígeno, formando um complexo antígeno de ligação ao antígeno. Determinantes antigênicos úteis podem ser encontrados, por exemplo, na superfície de células tumorais, na superfície de células infectadas por vírus, nas superfícies de outras células doentes, na superfície de células imunológicas, livres em soro sanguíneo e/ ou em a matriz extracelular (ECM). As proteínas úteis como antígenos aqui podem ser qualquer forma nativa das proteínas de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, seres humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. Em uma forma de realização particular, o antígeno é uma proteína humana. Quando é feita aqui referência a uma proteína específica, o termo engloba a proteína não processada “completa”, assim como qualquer forma da proteína que resulta do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural da proteína, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas.

[065] Por “ligação específica” entende-se que a ligação seletiva para o antígeno e pode ser discriminada de interações indesejadas ou não específicas. A capacidade de uma molécula de ligação ao antígeno se ligar a um antígeno específico pode ser medida quer através de um ensaio imuno absorvente ligado a enzima (ELISA) quer outras técnicas familiares para um técnico no assunto, por exemplo, técnica de ressonância plasmídica de superfície (SPR) (analisado em um instrumento BlAcore) (Liljeblad et al/., Glyco J 17, 323-329 (2000)) e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). Em uma forma de realização, a extensão da ligação de uma molécula de ligação ao antígeno a uma proteína não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação da molécula de ligação ao antígeno ao antígeno medida, por exemplo, por SPR. Em certas formas de realização, uma molécula que se liga ao antígeno tem uma constante de dissociação (Kd) de 1 mM, 100 NM, 10 NM, 1 NM, 0,1 NM, 0,01 nM, ou 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 Ma 10-13 M).

[066] “Afinidade” ou “afinidade de ligação” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). Salvo indicação em contrário, como aqui utilizado, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1: 1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X por seu parceiro Y de forma geral pode ser representada pela constante de dissociação (Kd), que é a razão de constantes de dissociação e de taxa de associação (kdesligado e Kligado, respectivamente). Assim, afinidades equivalentes podem compreender constantes de velocidade diferentes, desde que a razão das constantes de velocidade permaneça a mesma. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos no estado da técnica, incluindo aqueles descritos neste documento. Um método particular para medir a afinidade é a Ressonância de Plasmon Surface (SPR).

[067] O termo “antígeno associado ao tumor” significa qualquer antígeno que é altamente expresso por células tumorais ou no estroma do tumor. Antígenos associados a tumores particulares são CEA ou FAP.

[068] O termo “proteína de ativação de fibroblastos (FAP)”, também conhecido como Prolil endopeptidase FAP ou Seprase (EC 3.4.21), refere-se a qualquer FAP nativa de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) não humanos primatas (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. O termo engloba o FAP “completo”, não processado, bem como qualquer forma de FAP que resulte do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de FAP, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas. Em uma forma de realização, a molécula de ligação ao antígeno da invenção é, capaz de se ligar de forma específica ao FAP, humana, de camundongo e/ ou cynomolgus. À sequência de aminoácidos da PAF humana é mostrada no UniProt (www.uniprot.org). Q12884 (versão 149, SEQ ID NO: 56), ou NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeg NP 004451.2. O domínio extracelular (ECD) da FAP humana estende-se desde a posição de aminoácido 26 até 760. À sequência de aminoácidos de um ECD de FAP humano marcado com His mostrada na SEQ ID NO: 81. A sequência de aminoácidos de FAP de camundongo apresentada na adesão UniProt. Nº. P97321 (versão 126, SEQ ID NO: 58), ou NCBI RefSeq NP 032012.1. O domínio extracelular (ECD) de FAP de camundongo estende-se desde a posição de aminoácido 26 até 761. A SEQ ID NO: 83 mostra a sequência de aminoácido de um ECD de camundongo FAP marcado com His. A SEQ ID NO: 84 mostra a sequência de aminoácido de um ECD FAP cynomolgus marcado com His. De preferência, uma molécula de ligação anti-FAP da invenção liga-se ao domínio extracelular da FAP. Moléculas de ligação anti-FAP de exemplos são descritas no Pedido de Patente Internacional No. WO 2012/020006 A2.

[069] O termo “antígeno carcinoembriônico (CEA), também conhecido como molécula de adesão celular relacionada ao antígeno carcinoembriônico 5 (CEACAMS), refere-se a qualquer CEA nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicado de outra forma. A sequência de aminoácidos do CEA humano é mostrada no número de acesso UniProt PO6731 (versão 151, SEQ ID NO: 61). O CEA foi identificado há muito tempo como um antígeno associado a um tumor (Gold e Freedman, J Exp Med., 121: 439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20: 2197-2207, 2002). Originalmente classificado como uma proteína expressa apenas no tecido fetal, o CEA foi agora identificado em vários tecidos normais de adultos. Esses tecidos têm origem principalmente epitelial, incluindo células dos tratos gastrointestinal, respiratório e urogencial e células do cólon, colo do útero, glândulas sudoríparas e próstata (Nap et al., Tumour Biol., 9 (2-3): 145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52 (8): 2329-23339, 1992). Tumores de origem epitelial, bem como suas metástases, contêm CEA como antígeno associado a um tumor. Embora a presença do CEA em si não indique transformação em uma célula cancerosa, a distribuição do CEA é indicativa. No tecido normal, o

CEA é geralmente expresso na superfície apical da célula (Hammarstrôm S,., Semin Cancer Biol. 9 (2): 67-81 (1999)), tornando-o inacessível a anticorpos na corrente sanguínea. Ao contrário do tecido normal, o CEA tende a ser expresso em toda a superfície das células de câncer (Hammarstrôm S., Semin Cancer Biol. 9 (2): 67-81 (1999)). Essa mudança no padrão de expressão torna o CEA acessível à ligação de anticorpos em células de câncer. Além disso, a expressão de CEA aumenta nas células de câncer. Além disso, o aumento da expressão de CEA promove adesões intercelulares aumentadas, que podem levar a metástases (Marshall J., Semin Oncol., 30 (a Suppl. 8): 30-6, 2003). À prevalência da expressão de CEA em várias entidades tumorais é geralmente muito alta. Em concordância com os dados publicados, análises próprias realizadas em amostras de tecido confirmaram sua alta prevalência, com aproximadamente 95% em carcinoma colorretal (CRC), 90% em câncer de pâncreas, 80% em câncer gástrico, 60% em câncer de pulmão de células não pequenas. (NSCLC, onde é co-expresso com HER3) e 40% no câncer de mama; baixa expressão foi encontrada no câncer de pulmão de célula pequena e no glioblastoma.

[070] O CEA é facilmente clivado da superfície da célula e derramado na corrente sanguínea a partir de tumores, diretamente ou via linfáticos. Devido a essa propriedade, o nível de CEA sérico tem sido utilizado como marcador clínico para diagnóstico de câncer e triagem de recorrência de câncer, particularmente câncer colorretal (Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7: 183-188, 1992; Chau |., et al., J. Clin Oncol., 22: 1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12 (23): 6985-6988, 2006).

[071] Um “antígeno de célula T”, como aqui utilizado, refere-se a um determinante antigênico apresentado na superfície de um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico.

[072] Um “agente terapêutico ativador de células T”, conforme usado neste documento, refere-se a um agente terapêutico capaz de induzir a ativação de células T em um indivíduo, particularmente um agente terapêutico projetado para induzir a ativação de células T em um sujeito.

[073] Um “antígeno ativador de células T”, conforme usado aqui, referesse a um determinante antigênico expresso por um linfócito T, particularmente um linfócito T citotóxico, que é capaz de induzir ou melhorar a ativação de célula T após a interação com uma molécula de ligação ao antígeno. Especificamente, a interação de uma molécula de ligação ao antígeno com um antígeno ativador de célula T pode induzir a ativação da célula T acionando a cascata de sinalização do complexo receptor de célula T. Um antígeno ativador de célula T exemplificativo é o CD3.

[074] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de anticorpo que está envolvida na ligação da molécula de ligação ao antígeno ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo de forma geral possuem estruturas semelhantes, com cada domínio que compreende quatro regiões estruturais (FR) conservadas e três regiões hipervariáveis (HVR). Ver, por exemplo, Kindt et a/., Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno.

[075] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, como usado aqui, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ ou formam alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”). De forma geral, os anticorpos nativos de quatro cadeias compreendem seis HVRs; três no VH (H1, H2, H3) e três no VL (L1, L2, L3). HVRs de forma geral compreendem resíduos de aminoácidos das alças hipervariáveis e/ ou das “regiões determinantes de complementaridade”

(CDRs), sendo esta última a mais alta variabilidade de sequência e/ ou envolvida no reconhecimento de antígeno.

Loops hipervariáveis de exemplos ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3). (Chothia e Lesk, J.

Mol.

Biol. 196: 901-917 (1987)). CDRs de exemplos (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89- 97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2 e 95-102 de H3. (Kabat et al, Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico, 5º Ed.

Serviço de Saúde Pública, National Institutes of Healthy Bethesda, MD (1991) Regiões hipervariáveis (HVRs) também são referidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e estes termos são aqui utilizados indistintamente em referência a porções da região variável que formam as regiões de ligação ao antígeno.

Esta região particular foi descrita por Kabat et a/., U.S.

Dept. de Saúde e Serviços Humanos, “Sequências de Proteínas de Interesse Imunológico” (1983) e por Chothia et a/l., J.

Mol.

Biol. 196: 901-917 (1987), em que as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados um contra o outro.

No entanto, a aplicação de qualquer definição para referir uma CDR de um anticorpo ou suas variantes pretende estar dentro do âmbito do termo como definido e utilizado neste documento.

Os resíduos de aminoácidos apropriados que abrangem as CDRs como definido por cada uma das referências citadas acima são expostos a seguir na Tabela A como uma comparação.

Os números exatos de resíduos que abrangem uma CDR específica irão variar dependendo da sequência e tamanho da CDR.

Os peritos no assunto podem determinar rotineiramente quais os resíduos que compreendem uma CDR particular dada a sequência de aminoácidos da região variável do anticorpo.

TABELA A - DEFINIÇÕES DO CDR1

Va CDR2 50 a 65 V.CDR2 50 a 56 *1 A numeração de todas as definições de CDR na Tabela A está de acordo com as convenções de numeração estabelecidas por Kabat et al. (ver abaixo).

*2 “ADM” com letra minúscula “b”, como usado na Tabela A, refere-se às CDRs como definido pelo software de modelagem de anticorpos “AbM” da Oxford Molecular.

[076] Kabat et al. também definiu um sistema de numeração para sequências de regiões variáveis que é aplicável a qualquer anticorpo. Um vulgar técnico no assunto pode atribuir inequivocamente este sistema de “numeração Kabat" a qualquer sequência de região variável, sem depender de quaisquer dados experimentais além da própria sequência. Como aqui utilizado, a “numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecido por Kabat et al., Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, “Sequência of Proteins of Immunological Interest" (1983). Salvo indicação em contrário, as referências à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicos em uma região variável de anticorpo estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[077] Com a exceção de CDR1 em VH, as CDRs de forma geral compreendem os resíduos de aminoácidos que formam as alças hipervariáveis. As CDRs também compreendem “resíduos determinantes de especificidade” ou “SDRs”, que são resíduos que entram em contato com o antígeno. Os SDRs estão contidos em regiões dos CDRs chamados CDRs abreviados ou CDRs. Exemplos de a-CDRs (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 e a-CDR-H3) ocorrem nos resíduos de aminoácidos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2 e 95-102 de H3. (Ver Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)). Salvo indicação em contrário,

resíduos HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são aqui numerados de acordo com Kabat et al. supra.

[078] Como usado aqui, o termo “uma afinidade amadurecida” no contexto de moléculas de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpos) refere- se a uma molécula de ligação ao antígeno que é derivada de uma molécula de ligação ao antígeno de referência, por exemplo, por mutação, se liga ao mesmo antígeno, preferencialmente liga-se ao mesmo epítopo, como o anticorpo de referência; e tem uma afinidade maior pelo antígeno do que a molécula de ligação ao antígeno de referência. A maturação por afinidade geralmente envolve a modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos em uma ou mais CDRs da molécula de ligação ao antígeno. Tipicamente, a molécula de ligação ao antígeno amadurecida por afinidade se liga ao mesmo epítopo que a molécula de ligação ao antígeno de referência inicial.

[079] “Estrutura” ou “FR” refere-se a resíduos do domínio variável que não sejam resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável de forma geral consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências HVR e FR de forma geral aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)- FRA4.

[080] Uma “estrutura humana aceptora” para os objetivos aqui mencionados é uma estrutura compreendendo a sequência de aminoácidos de uma estrutura de domínio variável de cadeia leve (VL) ou uma estrutura de domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humano, conforme definido abaixo. Uma estrutura humana aceptora “derivada de” uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura de consenso humano pode compreender a mesma sequência de aminoácidos da mesma, ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em algumas formas de realização, o número de alterações de aminoácidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em algumas formas de realização, a estrutura humana aceptora de VL é idêntica em sequência à sequência de estrutura de imunoglobulina humana de VL ou sequência de estrutura de consenso humano.

[081] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particular, enquanto o restante da cadeia pesada e/ ou leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[082] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuído por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, I9G1, IgG2, 19G3, I1gG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados a, ô, e, y e p respectivamente.

[083] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácido de HVRs não humanos e resíduos de aminoácidos de FRs humanos. Em certas formas de realização, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos pelo menos um e de forma comum dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àqueles de um anticorpo não humano e todos ou substancialmente todos os FRs correspondem aos de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente pode compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere- se a um anticorpo que sofreu humanização. Outras formas de “anticorpos humanizados” abrangidos pela presente invenção são aquelas em que a região constante foi, de forma adicional, modificada ou alterada da do anticorpo original para gerar as propriedades de acordo com a invenção, especialmente em relação à ligação de C1qg e/ ou Fc ligação de receptor (FCR).

[084] Um anticorpo “humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por uma célula humana ou humana ou derivado de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências codificadoras de anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui de forma específica um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação ao antígeno não humanos.

[085] O termo “domínio Fc” ou “região FC” aqui utilizado para definir uma região terminal C de uma cadeia pesada de anticorpo que contêm pelo menos uma parte da região constante. O termo inclui regiõôeêes Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Uma região IgG Fc compreende um domínio IgG CH2 e um IgG CH3. O “domínio CH2" de uma região Fc de IgG humana normalmente estende-se desde um resíduo de aminoácido na posição 231 atum resíduo de aminoácido na posição 340. Em uma forma de realização, uma cadeia de hidrato de carbono ligada ao domínio CH2. O domínio CH2 aqui pode ser um domínio CH2 de sequência nativa ou domínio CH2 variante. O “domínio CH3" compreende o trecho de resíduos terminal C para um domínio CH2 em uma região FC (ou seja, de um resíduo de aminoácido em cerca da posição 341 para um resíduo de aminoácido em cerca da posição 447 de uma IgG). A região CH3 aqui pode ser um domínio CH3 de sequência nativa ou um domínio CH3 variante (por exemplo, um domínio CH3 com uma protuberância introduzida (“maçaneta”) em uma cadeia da mesma e uma “cavidade” introduzida correspondente (“hole”) na outra cadeia do mesmo; ver Patente US Nº 5,821,333, expressamente incorporada aqui por referência). Tais domínios

CH3 variantes podem ser utilizados para promover a heterodimerização de duas cadeias pesadas de anticorpos não idênticas como descrito neste documento. Em uma forma de realização, uma região Fc da cadeia pesada de IgG humana estende-se desde Cys226, ou desde Pro230, ao terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina terminal C (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que aqui especificado de outro modo, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração UE, também designado por índice EU, como descrito em Kabat et a/.,, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Serviço de Saúde Pública, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[086] A tecnologia “maçaneta em hole - knob-into-hole" é descrita, por exemplo, na US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al.f Prot Eng 9, 617-621 (1996) e Carter, J Imnmunol Meth 248, 7-15 (2001). De forma geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“maçaneta”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade correspondente (“hole”) na interface de um segundo polipeptídeo, de tal forma que a protuberância possa ser posicionada na cavidade de modo a promovem a formação de heterodímeros e impedem a formação de homodímeros. As protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por pequenas (por exemplo, alanina ou treonina). A protuberância e cavidade podem ser feitas alterando o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese específica do local, ou por síntese peptídica. Em uma forma de realização específica, uma modificação de maçaneta compreende a substituição de aminoácidos T366W em uma das duas subunidades do domínio Fc e a modificação do hole compreende as substituições de aminoácidos T366S, L368A e Y407V na outra das duas subunidades do domínio Fc. Em uma forma de realização específica adicional, a subunidade do domínio Fc que compreende a modificação da maçaneta compreende, de forma adicional, a substituição de aminoácidos S354C e a subunidade do domínio Fc que compreende a modificação do hole compreende, de forma adicional, a substituição de aminoácidos Y349C. À introdução destes dois resíduos de cisteina resulta na formação de uma ponte dissulfureto entre as duas subunidades da região Fc, estabilizando assim o dímero (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

[087] Uma “região equivalente região Fc de uma imunoglobulina” pretende incluir variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc de uma imunoglobulina, bem como variantes com alterações que produzem substituições, adições ou eliminações, mas que não diminuem substancialmente a capacidade de a imunoglobulina para mediar as funções efetoras (tal como citotoxicidade celular dependente de anticorpo). Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser eliminados do terminal N ou terminal C da região Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial da função biológica. Tais variantes podem ser selecionadas a partir de acordo com regras gerais conhecidas na técnica, de modo a terem um efeito mínimo na atividade (ver, por exemplo, Bowie, J. U. et al., Science 247: 1306-10 (1990)).

[088] O termo “funções efetoras” refere-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação a Ciq e citotoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação ao receptor Fc, citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP), secreção de citocina,

captação de antígeno mediada por complexo imune por células que apresentam o antígeno, regulação para baixo de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B) e ativação de células B.

[089] As funções efetoras dependentes da ligação ao receptor de Fc podem ser mediadas pela interação da região Fc de um anticorpo com receptores FC (FcR), que são receptores de superfície celular especializados em células hematopoiéticas. Os receptores Fc pertencem à superfamília de imunoglobulinas e demonstraram mediar tanto a remoção de patógenos revestidos de anticorpos pela fagocitose de complexos imunes, quanto a lise de eritrócitos e vários outros alvos celulares (por exemplo, células tumorais) revestidos com o anticorpo correspondente, via citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) (ver, por exemplo, Van de Winkel, JG e Anderson, CL, J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). Os FcRs são definidos pela sua especificidade para os isotipos das imunoglobulinas: os receptores Fc para anticorpos IgG são referidos como FcyR. A ligação ao receptor de Fc descrita, por exemplo, em Ravetch, J.V. e Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Inmunomethods 4 (1994)25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; e Gessner, J.E. et al. Ann. Hematol 76 (1998)231-248.

[090] Um “receptor Fc ativador” é um receptor Fc que, após o envolvimento de uma região Fc de um anticorpo, desencadeia eventos de sinalização que estimulam a célula portadora de receptor para realizar funções efetoras. Receptores Fc ativadores incluem FcecyRllla (CD16a), FcyRI (CD64), FeyRlla (CD32) e FcaRI (CD89). Um receptor Fc ativante particular é o FeyRllla humano (ver n.º de acesso UniProt PO8637, versão 141).

[091] Um “ectodomínio” é o domínio de uma proteína de membrana que se estende para o espaço extracelular (isto é, o espaço fora da célula alvo). Ectodomínios são de forma geral as partes de proteínas que iniciam o contato com as superfícies, o que leva à transdução de sinal. O ectodomínio de 4-1BBL, como aqui definido, refere-se, portanto, à parte de 4- 1BBL que se estende ao espaço extracelular (o domínio extracelular), mas também inclui partes ou fragmentos mais curtos que são responsáveis pela trimerização e pela ligação ao receptor correspondente 4-1BB. O termo “ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo” refere-se, assim, ao domínio extracelular de 4-1BBL que forma o domínio extracelular ou a parte do mesmo que ainda são capazes de se ligar ao receptor (domínio de ligação ao receptor).

[092] “4-1BBL" ou “ligante de 4-1BB” ou “CD137L” é um membro da família do ligante TNF co-estimulatório, capaz de estimular a proliferação e produção de citocinas de células T. Os ligantes da família de TNF co- estimulatórios podem co-estimular sinais de TOR após a interação com seus correspondentes receptores de TNF e a interação com seus receptores leva ao recrutamento de fatores associados ao TNFR (TRAF), que iniciam cascatas de sinalização que resultam na ativação das células T. 4-1BBL é uma proteína transmembranar do tipo Il. 4-1BBL de comprimento completo ou total, com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, foi descrito para formar trímeros na superfície das células. A formação de trímeros é possibilitada por motivos específicos do ectodomínio de 4-1BBL. Os referidos motivos são aqui designados como “região de trimerização”. Os aminoácidos 50 a 254 da sequência 4-1BBL humana (SEQ ID NO: 63) formam o domínio extracelular de 4-1BBL, mas mesmo os fragmentos do mesmo são capazes de formar os trímeros. Em formas de realização específicas da invenção, o termo “ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo” refere-se a um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NO: 4 (aminoácidos 52 a 254 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 71 a 254 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 3 (aminoácidos 80 a

254 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 2 (aminoácidos 85 a 254 do 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 5 (aminoácidos 71 a 248 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 6 (aminoácidos 85 a 248 de 4-1BBL humano), SEQ ID NO: 7 (aminoácidos 80 a 248 de 4-1BBL humano) e SEQ ID NO: 8 (aminoácidos 52 a 248 de 4- 1BBL humano), mas também outros fragmentos do ectodomínio capaz de trimerização são aqui incluídos.

[093] O termo “4-1BB” ou “CD137”, como aqui utilizado, refere-se a qualquer 4-1BB nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. O termo abrange o 4-1BB “completo”, não processado, bem como qualquer forma de 4-1BB resultante do processamento na célula. O termo também abrange variantes de ocorrência natural de 4-1BB, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas. À sequência de aminoácidos de um 4-1BB humano exemplificativo mostrada na SEQ ID NO: 88 (acesso Uniprot nº Q07011), a sequência de aminoácidos de um 4-1BB murino de exemplo é mostrada na SEQ ID NO: 89 (acesso Uniprot nº P20334) e a sequência de aminoácidos de um 4-1BB cynomolgus de exemplo (de Macaca mulatta) é mostrada na SEQ ID NO: 66 (acesso Uniprot nº F6W5G6).

[094] Os termos “anticorpo anti-4-1BB", “anti-4-1BB”, “anticorpo 4-1BB e” um anticorpo que se liga de forma específica ao 4-1BB “referem-se a um anticorpo que é, capaz de se ligar ao 4-1BB com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como diagnóstico e/ ou agente terapêutico na segmentação de 4-1BB. Em uma forma de realização, a extensão da ligação de um anticorpo anti-4-1BB a uma proteína não 4-1BB não relacionada é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao 4-1BB conforme medido, por exemplo, por um rádio imuno ensaio (RIA) ou citometria de fluxo (FACS). Em certas formas de realização, um anticorpo que se liga a 4-1BB tem uma constante de dissociação (KD) de 1 mM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 0,1 nM, 0,01 NM, ou 0,001 nM (por exemplo, 10º M ou menos, por exemplo, de 10º M a 10 13 M, por exemplo, de 108 M a 10º M).

[095] O termo “HER-2", também conhecido como “ErbB2”, “receptor ErbB2” ou “c-Erb-B2”, refere-se a qualquer HER-2 maduro nativo que resulta do processamento de uma proteína precursora do HER-2 em uma célula. O termo inclui HER-2 de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos e macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo também inclui variantes naturais de HER-2, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de uma proteína HER-2 humana de exemplo é mostrada na SEQ ID NO: 95.

[096] O termo “ligante peptídico” refere-se a um peptídeo que compreende um ou mais aminoácidos, de forma comum cerca de 2 a 20 aminoácidos. Os ligantes peptídicos são conhecidos na técnica ou são descritos neste documento. Peptídeos de ligação adequados, não imunogênicos são, por exemplo, ligantes peptídicos (G4S)n, (SG4) não ou G4 (SG4)n, em que “nº de forma geral é um número entre 1 e 10, de forma comum entre 2 e 4, em particular 2, isto é, os peptídeos selecionados a partir do grupo que consiste em GGGGS (SEQ ID NO: 67) GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 68), SGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 69) e GGGESGSGGESCGGGG (SEQ ID NO: 70), mas também incluem as sequências GSPGSSSSGS (SEQ ID NO: 71), (G4S); (SEQ ID NO: 72), (G4S)a (SEQ ID NO: 73), GSGSGSGS (SEQ ID NO: 74), GSGSGNGS (SEQ ID NO: 75), GGSGSGSG (SEQ ID NO: 76), GGSGSG (SEQ ID NO: 77), GGSG (SEQ ID NO: 78), GGSGNGSG (SEQ ID NO: 79), GGNGSGSG (SEQ ID NO: 80) e GGNGSG (SEQ ID NO: 81). Os ligantes peptídicos de interesse particular são (G4S) (SEQ ID NO: 67), (G1aS)2 e GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 68).

[097] O termo “aminoácido” como utilizado neste pedido indica o grupo de a-aminoácidos de carboxila que compreende alanina (código de três letras: ala, um código de letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gln, Q), ácido glutâmico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, 1), leucina (leu, L), lisina (Iys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptofano (trp, W), tirosina (tyr, Y) e valina (val, V).

[098] Por “fundido” ou “conectado” entende-se que os componentes (por exemplo, um polipeptídeo e um ectodomínio de 4-1BBL) são ligados por ligações peptídicas, diretamente ou através de um ou mais ligantes peptídicos.

[099] “Porcentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência de polipeptídeo (proteína) de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência polipeptídica de referência, após o alinhamento sequências e introduzindo lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade da sequência. O alinhamento para fins de determinação da identidade da sequência percentual de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras dentro da habilidade na técnica, por exemplo, utilizando software de computador disponível publicamente, tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN, SAW! ou Megalign (DNASTAR). Os peritos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de toda a extensão das sequências comparadas. Para os fins descritos neste documento, no entanto, são gerados % de valores de identidade de sequência de aminoácidos utilizando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-?2 foi criado pela Genentech, Inc. e o código-fonte foi depositado com a documentação do usuário no Escritório de Direitos Autorais dos EUA, Washington D.C., 20559, em que está registrado no Registro de Direitos Autorais dos EUA Nº TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente na Genentech, Inc., no sul de São Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte.

O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo o digital UNIX V4.0D.

Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Em situações em que o ALIGN-2 é utilizado para comparações de sequências de aminoácidos, a% de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A, com, ou contra uma dada sequência de aminoácidos B (que pode de forma alternativa ser expressa como um dado aminoácido A sequência A que tem ou compreende uma certa identidade de sequência de aminoácidos% com, com ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue: 100 vezes a fração X/ Y em que X é o número de resíduos de aminoácidos marcados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento desse programa de A e B e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B.

Será apreciado que o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a% de identidade de sequência de aminoácidos de A a B não será igual à% de identidade de sequência de aminoácidos de B a A.

A menos que especificado de outra forma, todas as% Os valores de identidade de sequência de aminoácidos usados aqui são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente anterior usando o programa de computador ALIGN-2.

[0100] Em certas formas de realização, contemplam-se variantes da sequência de aminoácidos das moléculas de ligação ao antígeno aqui proporcionadas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e / ou outras propriedades biológicas das moléculas de ligação ao antígeno. Podem ser preparadas variantes da sequência de aminoácidos das moléculas de ligação de antígeno e trado, introduzindo modificações apropriadas na sequência nucleotídica que codifica as moléculas, ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ ou inserções e/ ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno. Os locais de interesse para a mutagênese substitucional incluem os HVRs e o Framework (FRs). As substituições conservativas são fornecidas na Tabela B sob o título “Substituições Preferidas” e ainda descritas abaixo em referência às classes de cadeia lateral de aminoácidos (I) a (6). As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas na molécula de interesse e os produtos rastreados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno retida/ melhorada, imunogenicidade diminua ou ADCC ou CDC melhorado.

TABELAB Gln (Q) Asn; Glu Asn

[se | eee |

[0101] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lle; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acético: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[0102] Substituições não conservadoras implicarão a troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[0103] O termo “variantes da sequência de aminoácidos” inclui variantes substanciais em que existem substituições de aminoácidos em um ou mais resíduos da região hipervariável de uma molécula de ligação ao antígeno parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). De forma geral, a (s) variante (s) resultante (s) selecionada (s) para estudos posteriores terão modificações (por exemplo, melhoramentos) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação à molécula de ligação ao antígeno parental e/ ou terão substancialmente reteve certas propriedades biológicas da molécula de ligação ao antígeno parental.

Uma variante substitucional de exemplo é um anticorpo amadurecido por afinidade, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, utilizando técnicas de maturação de afinidade com base em exibição de fagos, tais como as aqui descritas.

Em resumo, um ou mais resíduos CDR são mutados e as moléculas de ligação ao antígeno variantes exibidas no fago e pesquisadas quanto a uma atividade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação). Em certas formas de realização, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais CDRs, desde que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade da molécula de ligação ao antígeno se ligar ao antígeno.

Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas como aqui fornecidas) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em CDRs.

Um modo útil para a identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese designado “mutagênese de varrimento de alanina” como descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada.

Outras substituições podem ser introduzidas nos locais de aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições iniciais.

De forma alternativa, ou, de forma adicional, uma estrutura cristaliha de um complexo molécula de ligação antígeno-antígeno para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição. Variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[0104] As inserções de sequências de aminoácidos incluem fusões de terminal amino e/ ou carboxila que variam em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções intra-sequência de um ou vários resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem moléculas de ligação ao antígeno com um resíduo metionila terminal N. Outras variantes de inserção da molécula incluem a fusão ao terminal N ou C a um polipeptídeo que aumenta a semivida no soro das moléculas de ligação ao antígeno.

[0105] Em certas formas de realização, as moléculas de ligação ao antígeno aqui proporcionadas são alteradas para aumentar ou diminuir a extensão na qual o anticorpo glicosilado. As variantes de glicosilação das moléculas podem ser convenientemente obtidas alterando a sequência de aminoácidos de tal forma que um ou mais locais de glicosilação sejam criados ou removidos. Quando a molécula de ligação ao antígeno compreende uma região Fc, o hidrato de carbono a ela ligado pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos compreendem de forma comum um oligossacarídeo ramiíficado, bianternário, que é de forma geral ligado por uma ligação não a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Veja, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15: 26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários hidratos de carbono, por exemplo, manose, N-acetilglucosamina (GICNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GICNAc no “caule” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em algumas formas de realização, podem ser feitas modificações do oligossacarídeo nas moléculas de ligação ao antígeno, de modo a criar variantes com certas propriedades melhoradas. Em um aspecto, variantes de moléculas de ligação ao antígeno são proporcionadas com uma estrutura de hidrato de carbono que não tem fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Tais variantes de fucosilação podem ter função ADCC melhorada, ver por exemplo, Publicação de Patente US Nos. 2003/0157108 (Presta, L.) ou US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Variantes adicionais das moléculas de ligação ao antígeno da invenção incluem os com oligossacarídeos bisseccionados, por exemplo, em que um oligossacarídeo biantenário ligado região Fc bissectado por GIcNAc. Tais variantes podem ter fucosilação reduzida e/ ou função ADCC melhorada. Ver, por exemplo, WO 2003/011878 (Jean-Mairet et a/.); Patente US Nº 6.602.684 (Umana et al/.); e US 2005/0123546 (Umana et al.). Também são fornecidas variantes com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Tais variantes de anticorpo podem ter função de CDC melhorada e são descritas, por exemplo, no documento WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).

[0106] Em certas formas de realização, pode ser desejável criar variantes manipuladas com cisteína das moléculas de ligação ao antígeno da invenção, por exemplo, “tioMAbs”, em que um ou mais resíduos da molécula são substituídos com resíduos de cisteina. Em formas de realização particulares, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis da molécula. Substituindo esses resíduos com cisteina, grupos tiol reativos são assim posicionados em locais acessível do anticorpo e podem ser utilizados para conjugar o anticorpo a outras porções, tais como porções de medicamentos ou porções de ligante-medicamento, para criar um imunoconjugado. Em certas formas de realização, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração UE) da cadeia pesada; e S400

(numeração UE) da região Fc da cadeia pesada. As moléculas de ligação ao antígeno modificadas por cisteina podem ser geradas como descrito, por exemplo, na Patente U.S. Nº 7.521.541.

[0107] Em certos aspectos, as moléculas de ligação ao antígeno aqui fornecidas podem ser modificadas adicionalmente para conter porções não proteicas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. As porções adequadas para derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitativos de polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/ propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1,3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/ anidrido maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/ óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas dos mesmos. O propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros conectados ao anticorpo pode variar e, se mais de um polímero estiver conectado, eles podem ser a mesma molécula ou diferentes. Em geral, o número e/ ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base em considerações que incluem, mas não estão limitadas, às propriedades ou funções particulares do anticorpo a ser aprimorado, independentemente do derivado de anticorpo biespecífico ser usado em uma terapia sob condições definidas, etc. Em outro aspecto, são fornecidos conjugados de um anticorpo e uma porção não proteica que podem ser seletivamente aquecidos pela exposição à radiação. Em uma forma de realização, a fração não proteica é um nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). A radiação pode ter qualquer comprimento de onda e inclui, mas não está limitada a, comprimentos de onda que não prejudicam as células comuns, mas que aquecem a porção não proteica a uma temperatura na qual as células próximas à porção de anticorpo não proteica são mortas. Em outro aspecto, imunoconjugados das moléculas de ligação ao antígeno contendo 4-1BBL aqui fornecidas podem ser obtidos. Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado com uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo, sem limitação, um agente citotóxico.

[0108] O termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada ou construção, por exemplo, RNA mensageiro (mMRNA), RNA derivado de vírus ou DNA plasmídico (pPDNA). Um polinucleotídeo pode compreender uma ligação fosfodiéter convencional ou uma ligação não convencional (por exemplo, uma ligação amida, tal como encontrada em ácidos nucleicos peptídicos (PNA). O termo “molécula de ácido nucleico” refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo.

[0109] Por molécula de ácido nucleico “isolado” ou polinucleotídeo entende-se uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA, que foi removida do seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante que codifica um polipeptídeo contido em um vetor é considerado isolado para os fins da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes mantidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos purificados (parcialmente ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo isolado inclui uma molécula polinucleotídica contida em células que normalmente contém a molécula polinucleotídica, mas a molécula polinucleotídica está presente extracromossomáticamente ou em uma localização cromossômica que diferente da sua localização cromossômica natural. As moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vivo ou in vitro da presente invenção, assim como formas de cadeia positiva e negativa e formas de cadeia dupla. Polinucleotídeos isolados ou ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, incluem ainda tais moléculas produzidas sinteticamente. Além disso, um polinucleotídeo ou um ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, tal como um promotor, local de ligação ao ribossoma ou um terminador de transcrição.

[0110] Por um ácido nucleico ou polinucleotídeo possuindo uma sequência nucleotídica de pelo menos, por exemplo, 95% “idêntico” a uma sequência nucleotídica de referência da presente invenção, pretende-se que a sequência nucleotídica do polinucleotídeo seja idêntica sequência de referência exceto que A sequência polinucleotídica pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleotídeos da sequência nucleotídica de referência. Em outras palavras, para obter um polinucleotídeo com uma sequência nucleotídica pelo menos 95% idêntica a uma sequência nucleotídica de referência, até 5% dos nucleotídeos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos por outro nucleotídeo ou um número de nucleotídeos até 5% do total de nucleotídeos na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições terminais 5' ou 3' da sequência nucleotídica de referência ou em qualquer local entre essas posições terminais, intercaladas individualmente entre resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contínuos na sequência de referência. Como uma questão prática, se qualquer sequência polinucleotídica particular é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência nucleotídica da presente invenção pode ser determinada convencionalmente usando programas de computador conhecidos, tais como os discutidos acima para polipeptídeos (por exemplo, ALIGN-2).

[0111]O termo “cassete de expressão” refere-se a um polinucleotídeo gerado de forma recombinante ou sintética, com uma sie de elementos de ácido nucleico especificados que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossoma, DNA mitocondrial, DNA plasmático, vírus ou fragmento de ácido nucleico. De forma comum, a porção do cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão inclui, entre outras sequências, uma sequência de ácido nucleico a transcrever e um promotor. Em certas formas de realização, o cassete de expressão da invenção compreende sequências polinucleotídicas que codificam moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção ou seus fragmentos.

[0112] O termo “vetor” ou “vetor de expressão” é sinônimo de “construção de expressão” e refere-se a uma molécula de DNA que é utilizada para introduzir e dirigir a expressão de um gene específico ao qual está operacionalmente associado em uma célula alvo. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico auto replicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. O vetor de expressão da presente invenção compreende um cassete de expressão. Os vetores de expressão permitem a transcrição de grandes quantidades de MRNA estável. Uma vez que o vetor de expressão esteja dentro da célula alvo, a molécula ou proteína de ácido ribonucleico que é codificada pelo gene é produzida pela maquinaria de transcrição e/ ou tradução celular. Em uma forma de realização, o vetor de expressão da invenção compreende um cassete de expressão que compreende sequências polinucleotídicas que codificam moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção ou seus fragmentos.

[0113] Os termos “célula hospedeira”, “linha celular hospedeira" e

“cultura de células hospedeiras” são utilizados de forma alternada e referem-se a células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a descendência de tais células. As células hospedeiras incluem “transformantes” e “células Transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada a partir da mesma sem ter em conta o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucléico a uma célula-mãe, mas pode conter mutações. A descendência mutante que tem a mesma função ou atividade biológica como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada é aqui incluída. Uma célula hospedeira é qualquer tipo de sistema celular que pode ser utilizado para gerar as moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da presente invenção. As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas em mamíferos, tais como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/ O, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, levedura células, células de inseto e células vegetais, para mencionar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou tecido vegetal ou animal cultivado.

[0114]Uma “quantidade eficaz” de um agente refere-se à quantidade que é necessária para resultar em uma alteração fisiológica na célula ou tecido ao qual é administrada.

[0115] As terapias de combinação de acordo com a invenção têm um efeito sinérgico. Um “efeito sinérgico” de dois compostos é aquele em que o efeito da combinação dos dois agentes é maior que a soma de seus efeitos individuais e é estatisticamente diferente dos controles e dos medicamentos isolados. Em outra forma de realização, as terapias de combinação divulgadas neste documento têm um efeito aditivo. Um “efeito aditivo” de dois compostos é aquele em que o efeito da combinação dos dois agentes é a soma de seus efeitos individuais e é estatisticamente diferente dos controles e/ ou dos medicamentos isolados.

[0116] Uma “quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente, por exemplo, uma composição farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado — terapêutico — ou profilático desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente, por exemplo, elimina, diminui, retarda, minimiza ou previne efeitos adversos de uma doença.

[0117]Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Particularmente, o indivíduo ou sujeito é um humano.

[0118]O termo “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em tal forma que permita que a atividade biológica de um ingrediente ativo contida seja eficaz e que não contenha componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada.

[0119] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma composição farmacêutica, que não um ingrediente ativo, que não ótimo para um sujeito. Um excipiente farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, um estabilizador ou um conservante.

[0120] O termo “bula informativa” é usado para se referir a instruções habitualmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contraindicações e/ ou avisos referentes ao uso de tais produtos terapêuticos.

[0121] Conforme usado neste documento, “tratamento” (e suas variações gramaticais, tais como “tratar” ou “tratar”) refere-se à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural do indivíduo a ser tratado e pode ser realizada para profilaxia ou durante o tratamento de patologia clínica. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, mas não se limitam a prevenir a ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação da doença, estado de doença e remissão ou melhor prognóstico. Em algumas formas de realização, as moléculas da invenção são utilizadas para retardar o desenvolvimento de uma doença ou retardar a progressão de uma doença.

[0122]Os termos “câncer” e “cancerígeno” se referem ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado, isto é, doenças proliferativas, como tumores sólidos ou melanoma. Um “tumor” compreende uma ou mais células cancerígenas. O termo “tumor sólido”, conforme usado neste documento, refere-se a uma massa anormal de tecido que de forma geral não contém cistos ou áreas líquidas. Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. Exemplos de câncer incluem, entre outros, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou neoplasias linfóides. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem câncer de mama, câncer de células escamosas (por exemplo, câncer epitelial de células escamosas), câncer de pulmão, incluindo câncer de pequenas células, câncer de células não pequenas (“NSCLC”), adenocarcinoma de pulmão e carcinoma escamoso de pulmão, câncer de peritônio, câncer hepatocelular, câncer de estômago ou gástrico, incluindo câncer gastrointestinal, câncer de pâncreas, glioblastoma, câncer de colo do útero, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga,

hepatoma, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer renal ou de fígado, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer de tireóide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, bem como câncer de cabeça e pescoço. Em uma forma de realização preferida, o câncer é câncer de mama. Em outra forma de realização preferida, o câncer é câncer gástrico.

[0123] A referência a um tumor ou câncer como um “Estágio O”, “Estágio 1”, “Estágio II”, “Estágio Ill” ou “Estágio IV" e vários sub estágios dessa classificação indica a classificação do tumor ou câncer usando os métodos Agrupamento de Estágio Geral ou Estadiamento de Numeral Romano conhecidos no estado da técnica. Embora o estágio real do câncer dependa do tipo de câncer, em geral, um câncer no estágio O é uma lesão in situ, um câncer no estágio | é um pequeno tumor localizado, um câncer no estágio Il e Il é um tumor local avançado que exibe envolvimento dos gânglios linfáticos locais e um câncer em estágio IV representa câncer metastático. Os estágios específicos para cada tipo de tumor são conhecidos pelo clínico especializado.

[0124] O termo “câncer de mama metastático” significa o estado do câncer de mama em que as células cancerígenas são transmitidas do local original para um ou mais locais no corpo, pelos vasos sanguíneos ou linfáticos, para formar um ou mais tumores secundários em um ou mais órgãos além do peito.

[0125] Um câncer “avançado” é aquele que se espalhou para fora do local ou órgão de origem, por invasão local ou metástase. Consequentemente, o termo câncer “avançado” inclui doenças localmente avançadas e metastáticas. Um câncer “refratário” é aquele que progride, embora um agente antitumoral, como uma quimioterapia, esteja sendo administrado ao paciente com câncer. Um exemplo de câncer refratário é aquele que é refratário à platina. Um câncer “recorrente” é aquele que se recuperou, no local inicial ou em local distante, após uma resposta à terapia inicial, como a cirurgia. Um câncer “localmente recorrente” é o câncer que retorna após o tratamento no mesmo local que um câncer tratado anteriormente. Um câncer “operável” ou “ressecável” é um câncer confinado ao órgão primário e adequado para cirurgia (resseção) Um câncer “não ressecável” ou “irressecável” não pode ser removido (ressecado) pela cirurgia.

[0126] Um câncer ou amostra biológica que “exibe expressão, amplificação ou ativação de HER” é aquela que, em um teste de diagnóstico, expressa (incluindo superexpressa) um receptor de HER, amplifica o gene HER e/ ou demonstra a ativação ou fosforilação de um receptor de HER.

[0127] Os termos “Positivo para HER-2" e “HER-2 expressando” são aqui utilizados indiferentemente. Um câncer “Positivo para HER-2" compreende células cancerígenas que possuem níveis mais altos do que o normal de HER-2. Exemplos de câncer Positivo para HER-2 incluem câncer de mama Positivo para HER-2 e câncer gástrico positivo para HER-2. Opcionalmente, o HER-2-positivo é um câncer superexpressor de HER-2 e, em certas formas de realização, o câncer positivo para HER-2 tem uma pontuação imuno-histoquímica (HC) de 2+ ou 3+ e/ ou uma razão de amplificação de hibridização in situ (ISH) = 2,0.

[0128] A hibridização in situ (ISH) determina o número de cópias HER-2 usando uma sonda de DNA acoplada a um sistema de detecção fluorescente, cromogênico ou de prata (ou seja, FISH, CISH ou SISH) ou uma combinação de sistemas CISH e SISH (campo claro ISH duplo (BDISH) ou ISH dual-hapteno, de duas cores (DDISH)). O ISH pode ser conduzido usando uma sonda única para enumerar cópias de HER-2 apenas por núcleo ou como uma técnica de sonda dupla, em que a hibridização de uma sonda cromossômica 17 centrômero (sonda de enumeração cromossômica 17, CEP17) permite a determinação da razão HER-2: CEP17. A abordagem de duas sondas pode ser realizada como uma técnica de duas cores, com co-hibridização das duas sondas na mesma lâmina ou como um ensaio monocromático em que cada sonda é usada em lâminas sequenciais. Às vezes, a proporção HER-2: CEP17 é considerada um melhor reflexo do status de amplificação HER-2 do que o número médio de cópias HER-2, pois este também depende de outros parâmetros, como índice mitótico do tumor, espessura da seção, efeitos de truncamento nuclear e alterações anormais no número de cópias do cromossomo (aneusomia). A frase “razão de amplificação 2 2,0 de hibridização situ (ISH)” refere-se à razão HER-2: CEP17 > 2,0. Para mais detalhes, consulte, por exemplo, Sauter G, et al. Diretrizes para o teste do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano: considerações biológicas e metodológicas. J Clin Oncol 2009; 27: 1323-1333 e o artigo de revisão de Hanna et al. Modern Pathology (2014)27, 4-18.

[0129] Aqui, um “paciente” ou “sujeito” é um paciente humano. O paciente pode ser um “paciente com câncer”, isto é, aquele que está sofrendo ou corre o risco de sofrer de um ou mais sintomas de câncer, em particular câncer gástrico ou de mama.

[0130] Uma “população de pacientes” refere-se a um grupo de pacientes com câncer. Essas populações podem ser usadas para demonstrar eficácia e/ ou segurança estatisticamente significantes de um medicamento, como o Pertuzumabe. Um paciente “recidivado” é aquele que apresenta sinais ou sintomas de câncer após remissão. Opcionalmente, o paciente recidivou após terapia adjuvante ou neoadjuvante.

[0131] “Terapia neoadjuvante”" ou “terapia pré-operatória” refere-se à terapia administrada antes da cirurgia. O objetivo da terapia neoadjuvante é proporcionar tratamento sistêmico imediato, potencialmente erradicando micro metástases que, de outra forma, proliferariam se a sequência padrão de cirurgia seguida de terapia sistêmica fosse seguida. A terapia neoadjuvante também pode ajudar a reduzir o tamanho do tumor, permitindo assim a resseção completa de tumores inicialmente irressecáveis ou preservando partes do órgão e suas funções. Além disso, a terapia neoadjuvante permite uma avaliação in vivo da eficácia do medicamento, o que pode orientar a escolha dos tratamentos subsequentes.

[0132] “Terapia adjuvante” neste documento refere-se à terapia administrada após cirurgia definitiva, onde nenhuma evidência de doença residual pode ser detectada, de modo a reduzir o risco de recorrência da doença. O objetivo da terapia adjuvante é prevenir a recorrência do câncer e, portanto, reduzir a chance de morte relacionada ao câncer. A terapia adjuvante neste documento exclui de forma específica a terapia neoadjuvante.

[0133] “Quimioterapia” refere-se ao uso de um agente quimioterapêutico útil no tratamento de câncer.

[0134] Um “agente quimioterapêutico” é um composto químico útil no tratamento do câncer, independentemente do mecanismo de ação. As classes de agentes quimioterapêuticos incluem, mas não estão limitados a: agentes alquilantes, antimetabólitos, alcaloides de plantas com veneno por fuso, antibióticos citotóxicos/ antitumorais, inibidores de topoisomerase, anticorpos, fotosensibilizadores e inibidores de cinase.

[0135] “CD20” refere-se ao antígeno de linfócitos B CD20, também conhecido como antígeno de superfície de linfócitos B1 ou antígeno de superfície de leucócitos Leu-16 e inclui qualquer CD20 nativo de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos), primatas não humanos (por exemplo, macacos cynomolgus) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), salvo indicação em contrário. A sequência de aminoácidos do CD20 humano é mostrada no acesso Uniprot nº P11836 (versão 149, SEQ ID NO: 85). CD20 é uma proteína transmembranar hidrofóbica com um peso molecular de aproximadamente 35 kD expresso em linfócitos B pré-B e maduros. O gene humano correspondente é de 4 domínios abrangendo a membrana, subfamília A, membro 1, também conhecido como MS4A1. Este gene codifica um membro da família de genes 4A que mede a membrana. Os membros desta família de proteínas nascentes são caracterizados por características estruturais comuns e limites semelhantes de emenda do íntron/ éxon e exibem padrões de expressão únicos entre células hematopoiéticas e tecidos não linfoides. Este gene codifica a molécula de superfície dos linfócitos B, que desempenha um papel no desenvolvimento e diferenciação de células B em células plasmáticas. Este membro da família está localizado no 11912, entre um cluster de membros da família. O processamento alternativo deste gene resulta em duas variantes de transcrição que codificam a mesma proteína. O termo “CD20” abrange CD20 não processado “de comprimento total”, bem como qualquer forma de CD20 resultante do processamento na célula. O termo também abrange variantes de CD20 que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de emenda ou variantes alélicas.

[0136] Os termos “anticorpo anti-CD20" e “um anticorpo que se liga a CD20” se referem a um anticorpo que é capaz de se ligar a CD20 com afinidade suficiente, de forma que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ ou terapêutico para direcionar CD20. Em uma forma de realização, a extensão da ligação de um anticorpo anti-CD20 a uma proteína não relacionada a CD20 não é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo a CD20, conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas formas de realização, um anticorpo que se liga ao CD20 tem uma constante de dissociação (Kd) de € 1 uM, € 100 nM, £ 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou € 0,001 nM (por exemplo, 10“ M ou menos, por exemplo, de 108 M a 10º? M, por exemplo, de 10º M a 10º M). Em certas formas de realização, um anticorpo anti-CD20 se liga a um epítopo de CD20 que é conservado entre CD20 de diferentes espécies.

[0137] Por “anticorpo anti-CD20 do tipo II” entende-se um anticorpo anti-CD20 com propriedades de ligação e atividades biológicas dos anticorpos anti-CD20 do tipo Il, conforme descrito em Cragg et al., Blood 103 (2004) 2738-2743; Cragg et al., Blood 101 (2003) 1045-1052, Klein et al., MAbs (2013), 22-33. Um anticorpo anti-CD20 do tipo Il se liga ao epítopo da classe 1l no CD20, não localiza CD20 em balsas lipídicas, mostra atividade do ADCC, mas um CDC baixo, se for um anticorpo isotipo IgG1, tem menos capacidade de ligação às células B em comparação com a ligação de anticorpos para o epítopo de Classe | de CD20, mostra agregação homotípica e forte indução de morte. Exemplos de anticorpos anti-CD20 do tipo Il incluem, por exemplo, obinutuzumabe (GA101), tositumumabe (B1), anticorpo IgG1 humanizado B- Ly1 (um anticorpo quimérico I9G1 humanizado como divulgado em WO 2005/044859), 11B8 IgG1 (como divulgado em WO 2004/035607) e AT80 IgG1. Em um aspecto particular, o anticorpo anti-CD20 do tipo Il é o obinutuzumabe (DCI recomendado, WHO Drug Information, Vol. 26, No. 4, 2012, página 453). Como aqui utilizado, obinutuzumabe é sinônimo de GA101. O nome comercial é GAZYVA? ou GAZYVARO?. Isso substitui todas as versões anteriores (por exemplo, Vol. 25, Nº 1, 2011, páginas 75 e 76) e é conhecido anteriormente como afutuzumabe (DCI recomendado, WHO Drug Information, Vol. 23, Nº 2, 2009, página 176; Vol. 22, No. 2, 2008, página 124). Em um aspecto, o anticorpo anti-CD20 do tipo Il é o tositumomabe.

AGONISTAS DE 4-1BB DE EXEMPLOS PARA USO NA INVENÇÃO

[0138] A presente invenção refere-se a agonistas de 4-1BB e seu uso em combinação com a terapia de direcionamento de HER-2, em particular seu uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer. Em algumas formas de realização, os agonistas de 4-1BB e seu uso em combinação com a terapia de direcionamento de HER-2 estão em um método para tratar ou retardar a progressão de tumores sólidos.

[0139] Em particular, os agonistas de 4-1BB, como utilizados, em combinação com a terapia de direcionamento de HER-2, são moléculas compreendendo 4-1BBL. Em particular, o agonista de 4-1BB utilizado na invenção compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

[0140] Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, em particular a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[0141] O agonista de 4-1BB é especialmente útil se compreender um domínio de ligação ao antígeno que é específico para um antígeno associado ao tumor, em particular para um alvo nas células cancerígenas ou no estroma. Assim, em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a uma proteína de ativação de fibroblastos (FAP) ou CEA.

[0142] Em um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[0143] EM um aspecto particular, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[0144] Em um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24. Mais particularmente, o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[0145] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável. Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, de forma específica um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4. Particularmente, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora. Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG1 compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[0146] Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[0147] EM um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica ao FAP, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada por: (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CLeo segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados um ao outro e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou (ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao terminal C do domínio CH3 por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao terminal C do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou (iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou um domínio VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao VH ou VL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[0148] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica ao FAP que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0149] Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e b) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.

[0150] Particularmente, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.

[0151] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos.

[0152] Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o polipeptídeo que compreende os três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos é fundido ao aminoácido N- ou C-terminal de uma das duas subunidades do domínio Fc, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0153] Anticorpos biespecíficos específicos são descritos na publicação PCT Nº WO 2016/075278 A1 ou na publicação PCT Nº WO 2016/156291 A1.

[0154] Em um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-FAP/ anti-4-1BB.

[0155] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende (i). CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[0156]EmM um aspecto adicional, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[0157] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável. Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, de forma específica um domínio Fc de I9gG1 ou um domínio Fc de IgG4. Particularmente, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora. Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG1 compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[0158] Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[0159] Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada por: (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CLeo segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados um ao outro e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou (ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao terminal C do domínio CH3 por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao terminal C do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou (iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou um domínio VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao VH ou VL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[0160] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,

SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0161] Em um aspecto particular, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

[0162] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, e (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos.

[0163] Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o polipeptídeo que compreende os três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos é fundido ao aminoácido N- ou C-terminal de uma das duas subunidades do domínio Fc,

opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0164] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB compreende um anticorpo biespecífico anti-CEA/ anti-4-1BB.

AGENTES DIRECIONADOS AO HER-2

[0165] Em alguns aspectos da presente invenção, um agonista de 4-1BB, descrito neste documento, é usado em combinação com a terapia de direcionamento de HER-2.

[0166] Em alguns aspectos da presente invenção, o agonista de 4- 1BB é usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2. Em algumas formas de realização, o agente interage com HER-2. Em algumas formas de realização, o agente é um antagonista de HER-2. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2, um anticorpo biespecífico de HER-2 e/ ou um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2. Em algumas formas de realização, o agente é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, em particular um anticorpo anti-HER-2. Em algumas formas de realização, o agente é um anticorpo biespecífico de HER-2. Em algumas formas de realização, o agente é um conjugado anticorpo-medicamento.

[0167] Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER- 2 compreende trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende uma combinação de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2 selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe,

pertuzumabe e margetuximabe. Em um aspecto, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe ou pertuzumabe. Mais particularmente, o agente de direcionamento de HER-2 é o trastuzumabe. Em alguns aspectos, o direcionamento HER-2 é um anticorpo de HER-2 com glicoengenharia, por exemplo, TrasGex. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um anticorpo biespecífico de HER-2, por exemplo, Herceptarg. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2, em particular o trastuzumabe emtansina (ado-trastuzumabe emtansina).

[0168] Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER- 2 compreende um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 96 e um domínio variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 97. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) da SEQ ID NO: 98 e um domínio variável de cadeia leve (VL) da SEQ ID NO: 99.

[0169] Em algumas formas de realização e para qualquer uso, descrito neste documento, o agente compreende trastuzumabe (CAS 180288- 69-1, HERCEPTINºS, huMAb4D5-8, rhumabe HER-2, Genentech), pertuzumabe (rhumabe 2C4, PERJETAºS, Genentech, Inc, Sul de San Francisco) ou trastuzumabe emtansina (Trastuzumabe-MCC-DM1, T-DM1, ado-trastuzumabe emtansina, KADCYLAº). Em algumas formas de realização, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em algumas formas de realização, o agente de direcionamento de HER-2 é selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina. Em algumas formas de realização, o agente de direcionamento de HER-2 compreende ou consiste em uma combinação de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em algumas formas de realização, o agente de direcionamento de HER-2 compreende ou consiste em uma combinação de trastuzumabe e pertuzumabe. Mais particularmente, o agente é o trastuzumabe.

[0170] O trastuzumabe é um anticorpo monoclonal recombinante derivado do DNA IgG1 kappa que é uma versão humanizada de um anticorpo murino anti-HER-2 (4D5) que se liga de forma seletiva com alta afinidade em um ensaio com base em células (Kd = 5 nM) ao domínio extracelular de HER-2. O trastuzumabe é um anticorpo que possui resíduos de ligação aos antígenos do anticorpo murino 4D5 (ATCC CRL 10463, depositado na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 sob o Tratado de Budapeste em 24 de maio de 1990). Anticorpos 4D5 humanizados exemplificativos — incluem — huMAb4D5-1, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 e huMAb4D5-8 (HERCEPTIN2) como USER 58PT5.

[0171] O pertuzumabe é um anticorpo monoclonal humanizado recombinante, gerado com base na estrutura humana de IgG1 (K), ver, por exemplo, US 7560111. O pertuzumabe difere do trastuzumabe nas regiões de ligação do epítopo da cadeia leve (12 diferenças de aminoácidos) e da cadeia pesada (30 diferenças de aminoácidos). Como resultado dessas diferenças, o pertuzumabe se liga a um epítopo completamente diferente no receptor de HER-2. A ligação do pertuzumabe ao receptor de HER-2 nas células epiteliais humanas impede que ele forme complexos com outros membros da família de receptores de HER (Agus et al., Cancer Cell 2: 127-137 (2002)). Ao bloquear a formação de complexos, o pertuzumabe evita os efeitos estimuladores do crescimento de ligantes para os complexos (por exemplo, EGF e heregulina).

[0172] O trastuzumabe emtansina é um conjugado anticorpo- medicamento em que o trastuzumabe é ligado através da porção ligante MCC à porção dru maitansinóide DM1 (US 5208020; US 6441163). A proporção de medicamento para anticorpo ou carga de medicamento varia em valores inteiros de 1 a cerca de 8. O trastuzumabe-MCC-DM1 inclui todas as misturas de conjugados anticorpo-medicamento carregados e ligados de várias formas, em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 porções de medicamento estão covalentemente ligadas ao anticorpo trastuzumabe (US 7097840; US 2005/0276812; US 2005/0166993). A carga média de medicamentos é de cerca de 3,5.

[0173] Trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina podem ser usados em qualquer combinação. Em algumas formas de realização, o agente de direcionamento de HER-2 compreende trastuzumabe e pertuzumabe.

[0174] Os termos “terapia de direcionamento de HER-2", “agente de direcionamento de HER-2" e “agente que interage com HER-2"”, conforme aqui utilizado, refere-se a um agente ou agentes que têm como alvo a tirosina quinase do receptor de HER-2 (ErbB2). Em particular, o termo refere-se a um agente ou agentes que se ligam de forma seletiva ao HER-2. O (s) agente (s) pode (m) ser um anticorpo, em particular um anticorpo monoclonal. Em alguns casos, o (s) agente (s) se liga (m) de forma seletiva ao HER-2 com alta afinidade, por exemplo, na faixa de nM ou pM. Em alguns casos, o (s) agente (s) se liga (m) ao domínio extracelular do receptor de HER-2. Um agente pode causar regulação negativa da expressão do receptor de HER-2, inibição da proliferação de células tumorais humanas que superexpressam a proteína HER-2, aprimoramento do recrutamento imunológico e ADCC contra células tumorais que superexpressam a proteína HER-2 e/ ou regulação negativa de fatores de angiogênese. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um anticorpo de HER-2 com glicoengenharia, por exemplo, TrasGex. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um anticorpo biespecífico de HER-2, por exemplo, Herceptarg. O termo “anticorpo anti-HER- 2" ou “anticorpo que se liga ao HER-2 humano” ou “anticorpo que se liga de forma específica ao HER-2 humano” ou “anti-HER-2 antagonista” refere-se a um anticorpo que se liga de forma específica ao HER-2 humano. O anticorpo pode se ligar ao antígeno HER-2 humano com uma afinidade de ligação do valor Kd < 10 nM, < 5 nM, < 2 nM, < 1 nM, < 0,5 NM ou menos. A afinidade de ligação pode ser determinada com um ensaio de ligação padrão, como a técnica de ressonância plasmônica de superfície (BlAcoreº, GE-Healthcare Uppsala, Suécia).

PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS PARA USO NA INVENÇÃO

[0175] Em certos aspectos, os agentes terapêuticos utilizados na combinação “compreendem anticorpos multiespecíficos, por exemplo, anticorpos — biespecíficos. — Anticorpos — multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois locais diferentes. Em certos aspectos, as especificidades de ligação são para diferentes antígenos. Em certos aspectos, as especificidades de ligação referem-se a diferentes epítopos no mesmo antígeno. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos completos ou fragmentos de anticorpos.

[0176] As técnicas para produzir anticorpos multiespecíficos incluem, mas não estão limitadas a, co-expressão recombinante de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina tendo especificidades diferentes (ver Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 e Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)) e engenharia “knob-in-hole” (ver, por exemplo, Patente US No. 5,731,168). Os anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por efeitos de direção eletrostática de engenharia para produzir moléculas Fc-heterodiméricas de anticorpos (WO 2009/089004 A1); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (ver, por exemplo, Patente US No. 4,676,980 e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); utilizando zippers de leucina para produzir anticorpos biespecíficos

(ver, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)); utilizando a tecnologia “diacorpo” para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos (ver, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)); e utilizando dímeros de Fv (sFv) de cadeia simples (ver, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)); e preparação de anticorpos triespecíficos como descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immun ol. 147: 60 (1991).

[0177] Os anticorpos modificados por engenharia genética com três ou mais locais de ligação ao antígeno funcionais, incluindo “Anticorpos polvo”, também estão incluídos neste documento (consulte, por exemplo, US 2006/0025576A1).

[0178] Os anticorpos ou fragmentos aqui incluídos também incluem um “FAb de ação dupla” ou “DAF” compreendendo um local de ligação ao antígeno que se liga a dois antígenos diferentes (consulte, US 2008/0069820, por exemplo). Os anticorpos “Crossmab” também estão incluídos neste documento (consulte, por exemplo, WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253 ou WO 2009/080254).

[0179] Outra técnica para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos é o “engajador de células T biespecífico” ou a abordagem BITEG (ver, por exemplo, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261 e WO 2008/119567). Esta abordagem utiliza dois domínios variáveis de anticorpo dispostos em um único polipeptídeo. Por exemplo, uma única cadeia polipeptídica inclui dois fragmentos Fv (scFv) de cadeia única, cada um tendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável cadeia leve (VL) separados por um ligante polipeptídico de um comprimento suficiente para permitir a associação intramolecular entre os dois domínios. Este polipeptídeo único inclui ainda uma sequência espaçadora de polipeptídeo entre os dois fragmentos scFv. Cada scFv reconhece um epítopo diferente e esses epítopos podem ser específicos para diferentes tipos de células, de modo que células de dois tipos diferentes de células são trazidas para perto ou ligadas quando cada scFv está engatado com seu epítopo cognato. Uma forma de realização específica dessa abordagem inclui um scFv que reconhece um antígeno da superfície celular expresso por uma célula do sistema imune, por exemplo, um polipeptídeo CD3 em uma célula T, ligado a outro scFv que reconhece um antígeno da superfície celular expresso por uma célula alvo, como uma célula maligna ou tumoral.

[0180] Como se trata de um único polipeptídeo, o agente de células T biespecífico pode ser expresso usando qualquer sistema de expressão de células procarióticas ou eucarióticas conhecidas na técnica, por exemplo, uma linha celular CHO. No entanto, técnicas de purificação específicas (ver, por exemplo, EP 1 691 833) podem ser necessárias para separar os engajadores de células T biespecíficas monoméricas de outras espécies multiméricas, que podem ter atividades biológicas diferentes da atividade pretendida do monômero. Em um esquema de purificação exemplificativo, uma solução contendo polipeptídeos segregados é primeiro submetida a uma cromatografia de afinidade de metal e os polipeptídeos são eluídos com um gradiente de concentrações de imidazo. Este eluato é ainda purificado utilizando cromatografia de troca aniônica e os polipeptídeos são eluídos utilizando um gradiente de concentrações de cloreto de sódio. Finalmente, este eluato é submetido a cromatografia de exclusão por tamanho para separar monômeros de espécies multiméricas. Em um aspecto, os anticorpos biespecíficos biespecíficos utilizados na invenção são compostos por uma única cadeia polipeptídica compreendendo dois fragmentos FV de cadeia única (scFV) fundidos um ao outro por um ligante peptídico.

MODIFICAÇÕES NO DOMÍNIO FC QUE REDUZEM A LIGAÇÃO AO RECEPTOR FC E/ OU A FUNÇÃO EFETORA

[0181] O domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno da invenção consiste em um par de cadeias polipeptídicas compreendendo domínios de cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina. Por exemplo, o domínio Fc de uma molécula de imunoglobulina G (IgG) é um dímero, cada subunidade da qual compreende os domínios constantes de cadeia pesada CH2 e CH3 de IgG. As duas subunidades do domínio Fc são capazes de associação estável um com o outro.

[0182] O domínio Fc confere propriedades farmacocinéticas favoráveis às moléculas de ligação ao antígeno da invenção, incluindo uma meia-vida sérica longa que contribui para uma boa acumulação no tecido alvo e uma razão de distribuição tecido-sangue favorável. Ao mesmo tempo, pode, no entanto, levar a um direcionamento indesejável dos anticorpos biespecíficos da invenção para células que expressam receptores Fc em vez de para as células portadoras de antígeno preferidas. Por conseguinte, em aspectos particulares, o domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno da invenção exibe afinidade de ligação reduzida a um receptor Fc e/ ou função efetor reduzida, em comparação com um domínio Fc1 de IgG nativo. Em um aspecto, o Fc não se liga substancialmente a um receptor Fc e/ ou não induz a função efetora. Em um aspecto particular, o receptor Fc é um receptor Fcy. Em um aspecto, o receptor Fc é um receptor Fc humano. Em um aspecto específico, o receptor Fc é um receptor Fcy humano ativador, mais especificamente FeyRllla humano, FeyRI ou FeyRlla, mais especificamente FeyRlilla humano. Em um aspecto, o domínio Fc não induz a função efetora. A função efetora reduzida pode incluir, mas não se limita a, um ou mais dos seguintes: citotoxicidade dependente de complemento reduzida (CDC), citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos reduzida (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpos reduzida (ADCP), secreção de citocinas reduzida, captação de antígenos mediada por complexo imune por células apresentadoras de antígenos reduzida, ligação reduzida a células NK, ligação reduzida a macrófagos, ligação reduzida a monócitos, ligação reduzida a células polimorfonucleares, sinalização direta indutora de apoptose reduzida, maturação de célula dendrítica reduzida ou primeira exposição (priming) reduzida de células T.

[0183] EM certos aspectos, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo aqui fornecido, gerando assim uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.

[0184] EM um aspecto particular, a invenção fornece um anticorpo, em que o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc, em particular ao receptor Fcy.

[0185] Em um aspecto, o domínio Fc do anticorpo da invenção compreende uma ou mais mutações de aminoácidos que reduzem a afinidade de ligação do domínio Fc a um receptor Fc e/ ou função efetora. Tipicamente, a mesma uma ou mais mutação de aminoácidos está presente em cada uma das duas subunidades do domínio Fc. Em particular, o domínio Fc compreende uma substituição de aminoácidos na posição de E233, L234, L235, N297, P331 e P329 (numeração UE). Em particular, o domínio Fc compreende substituições de aminoácidos nas posições 234 e 235 (numeração UE) e/ ou 329 (numeração UE) das cadeias pesadas de IgG. Mais particularmente, é fornecido um anticorpo de acordo com a invenção, que compreende um domínio Fc com as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G (“P329G LALA”, numeração UE) nas cadeias pesadas de IgG. As substituições de aminoácido L234A e L235A referem-se à chamada mutação LALA. À combinação “P329G LALA" de substituições de aminoácidos abole quase completamente a ligação ao receptor Fcy de um domínio Fc1 de IgG humano e é descrita na Publ. do Pedido de Patente Internacional WO 2012/130831 AJ1, que também descreve métodos para preparar tais domínios Fc mutantes e métodos para determinar suas propriedades, tais como ligação ao receptor Fc ou funções efetoras.

[0186] Os domínios Fc com ligação ao receptor Fc e/ ou função efetora reduzida também incluem aqueles com substituição de um ou mais resíduos do domínio Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (Patente US No. 6,737,056). Esses mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o chamado mutante Fc “DANA” com substituição dos resíduos 265 e 297 na alanina (Patente US No. 7,332,581).

[0187] Em outro aspecto, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4. Os anticorpos IgG4 exibem afinidade de ligação reduzida aos receptores Fc e funções efetoras reduzidas em comparação com os anticorpos IgG1. Em um aspecto mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4 que compreende uma substituição de aminoácido na posição S228 (numeração de Kabat), particularmente a substituição de aminoácido S228P. Em um aspecto mais específico, o domínio Fc é um domínio Fc de IgG4 compreendendo as substituições de aminoácidos L235E e S228P e P329G (numeração UE). Tais mutantes do domínio Fc de IgG4 e suas propriedades de ligação ao receptor Fey também são descritos no documento WO 2012/130831.

[0188] Os domínios Fc mutantes podem ser preparados por deleção, substituição, inserção ou modificação de aminoácidos usando métodos genéticos ou químicos bem conhecidos na técnica. Os métodos genéticos podem incluir mutagênese específica de local da sequência de DNA codificante, PCR, síntese de genes e similares. As alterações nucleotídicas corretas podem ser verificadas, por exemplo, por sequenciamento.

[0189] A ligação aos receptores Fc pode ser facilmente determinada, por exemplo, por ELISA ou por Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR) usando instrumentação padrão, como um instrumento BlAcore (GE Healthcare) e receptores Fc, como os que podem ser obtidos por expressão recombinante. Alternativamente, a afinidade de ligação de domínios Fc ou anticorpos de ativação celular que compreendem um domínio Fc a receptores Fc pode ser avaliada usando linhagens celulares conhecidas por expressar receptores Fc específicos, como células NK humanas que expressam o receptor Fcylila.

[0190] A função efetora de um domínio Fc ou anticorpos da invenção compreendendo um domínio Fc, pode ser medida por métodos conhecidos na técnica. Um ensaio adequado para medir ADCC é, descrito neste documento. Outros exemplos de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente US No. 5,500,362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) e Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); Patente US No. 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). Como alternativa, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (ver, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTITY para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); e ensaio de citotoxicidade não radioativa CytoTox 968 (Promega, Madison, WI)). As células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como o divulgado em Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

[0191] Em alguns aspectos, a ligação do domínio Fc a um componente do complemento, especificamente a Cia, é reduzida. Por conseguinte, em algumas formas de realização em que o domínio Fc é projetado por engenharia genética para ter uma função efetora reduzida, a referida função efetora reduzida inclui CDC reduzido. Os ensaios de ligação a C1qg podem ser realizados para determinar se os anticorpos biespecíficos da invenção são capazes de se ligar a C1q e, portanto, possuem atividade CDC. Ver, por exemplo, ELISA de ligação a Ciq e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio CDC pode ser realizado (ver, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); e Cragg e Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

MODIFICAÇÕES NO DOMÍNIO FC PROMOVENDO HETERODIMERIZAÇÃO

[0192] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficos da invenção compreendem diferentes locais de ligação ao antígeno, fundidos com uma ou outra das duas subunidades do domínio Fc, assim as duas subunidades do domínio Fc podem estar compreendidas em duas cadeias polipeptídicas não idênticas. A co-expressão recombinante desses polipeptídeos e a subsequente dimerização levam a várias combinações possíveis dos dois polipeptídeos. Para melhorar o rendimento e a pureza dos anticorpos biespecíficos da invenção na produção recombinante, será vantajoso introduzir no domínio Fc das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficos da invenção uma modificação que promove a associação dos polipeptídeos desejados.

[0193] Por conseguinte, em aspectos particulares, a invenção refere-se à molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender dois ectodomínios de 4-1BBL ou dois fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de meio de um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende apenas um ectodomínio do referido 4-1BBL ou um fragmento do mesmo e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável, em que o domínio Fc compreende uma modificação que promove a associação da primeira e segunda subunidade do domínio Fc. O local da interação proteína- proteína mais extensa entre as duas subunidades de um domínio Fc de IgG humano está no domínio CH3 do domínio Fc. Assim, em um aspecto, a referida modificação está no domínio CH3 do domínio Fc.

[0194] EM um aspecto específico, a modificação é uma modificação chamada “knob-into-holer, que compreende uma modificação “knob” em uma das duas subunidades do domínio Fc e uma modificação “hole” na outra das duas subunidades do domínio Fc. Assim, a invenção se refere a uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender dois ectodomínios de 4-1BBL ou dois fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de meio de um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende apenas um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capaz de associação estável, em que a primeira subunidade do domínio Fc compreende maçanetas e a segunda subunidade do domínio Fc compreende holes de acordo com o método dos maçanetas em holes. Em um aspecto particular, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração EU) e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).

[0195] A tecnologia de maçaneta no hole é descrita, por exemplo, na US 5,731,168; US 7,695,936; Ridgway et al.f Prot Eng 9, 617-621 (1996) e Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). De forma geral, o método envolve a introdução de uma protuberância (“maçaneta”) na interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade correspondente (“hole”) na interface de um segundo polipeptídeo, de tal forma que a protuberância possa ser posicionada na cavidade de modo a promovem a formação de heterodímeros e impedem a formação de homodímeros. As protuberâncias são construídas substituindo pequenas cadeias laterais de aminoácidos da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). Cavidades compensatórias de tamanho idêntico ou semelhante às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por pequenas (por exemplo, alanina ou treonina).

[0196] Por conseguinte, em um aspecto, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc das moléculas biespecíficas de ligação ao antígeno da invenção, um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com um volume de cadeia lateral maior, gerando assim uma protuberância dentro o domínio CH3 da primeira subunidade que é posicionável em uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc um resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com um lado menor volume da cadeia, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da segunda subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da primeira subunidade é posicionável. A protuberância e cavidade podem ser feitas alterando o ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, por exemplo, por mutagênese específica do local, ou por síntese peptídica. Em um aspecto específico, no domínio CH3 da primeira subunidade do domínio Fc, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de triptofano (T366W) e no domínio CH3 da segunda subunidade do domínio Fc, o resíduo de tirosina em a posição 407 é substituída por um resíduo de valina (Y407V). Em um aspecto, na segunda subunidade do domínio Fc, de forma adicional, o resíduo de treonina na posição 366 é substituído por um resíduo de serina (T366S) e o resíduo de leucina na posição 368 é substituído por um resíduo de alanina (L368A).

[0197] Ainda em um outro aspecto, na primeira subunidade do domínio Fc, de forma adicional, o resíduo de serina na posição 354 é substituído por um resíduo de cisteína (S354C) e na segunda subunidade do domínio Fc, de forma adicional, o resíduo de tirosina na posição 349 é substituído por um resíduo de cisteina (Y349C). A introdução destes dois resíduos de cisteina resulta na formação de uma ponte dissulfureto entre as duas subunidades do domínio Fc, estabilizando, de forma adicional, o dímero (Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15). Em um aspecto particular, a primeira subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos S354C e T366W (numeração EU) e a segunda subunidade do domínio Fc compreende as substituições de aminoácidos Y349C, T366S e Y407V (numeração de acordo com o índice de Kabat EU).

[0198] Em um aspecto alternativo, uma associação promotora de modificações da primeira e segunda subunidade do domínio Fc compreende uma modificação mediando efeitos de direção eletrostática, por exemplo, como descrito na publicação PCT WO 2009/089004. De forma geral, este método envolve a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na interface das duas subunidades do domínio Fc por resíduos de aminoácidos carregados, de forma que a formação de homodímeros se torne eletrostaticamente desfavorável, mas a heterodimerização é eletrostaticamente favorável.

[0199] O terminal C da cadeia pesada do anticorpo biespeciífico, tal como aqui relatado, pode ser uma terminação terminal C completa com os resíduos de aminoácidos PGK. O terminal C da cadeia pesada pode ser um terminal C encurtado no qual um ou dois dos resíduos de aminoácido do terminal C foram removidos. Em um aspecto preferido, o terminal C da cadeia pesada uma terminação C encurtada que termina em PG. Em um aspecto de todos os aspectos como aqui relatado, um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 terminal C, tal como aqui especificado, compreende o dipeptídeo glicina-lisina terminal C (G446 e K447, numerando de acordo com o índice de Kabat EU). Em uma forma de realização de todos os aspectos descritos neste documento, um anticorpo biespecífico que compreende uma cadeia pesada incluindo um domínio CH3 terminal C, tal como aqui especificado, compreende um resíduo de glicina terminal C (G446, numeração de acordo com o índice de Kabat EU).

MODIFICAÇÕES NOS DOMÍNIOS FAB

[0200] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno contendo 4-1BBL, compreendendo (a) um fragmento de Fab capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um com o outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender dois ectodomínios de 4-1BBL ou dois fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de meio de um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende apenas um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo e (c) Domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que em um dos fragmentos de Fab os sítios variáveis VH e VL ou os domínios constantes CH1 e CL são trocados. Os anticorpos biespecíficos são preparados de acordo com a tecnologia Crossmab.

[0201] Anticorpos multiespecíficos com uma substituição/ troca de domínios em um braço de ligação (CrossMabVH-VL ou CrossMabCH-CL) são descritos em detalhe no documento WO 2009/080252 e Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191. Eles claramente reduzem os subprodutos causados pelo desencontro de uma cadeia leve contra um primeiro antígeno com a cadeia pesada incorreta contra o segundo antígeno (comparado a abordagens sem essa troca de domínio).

[0202] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende (a) um primeiro fragmento de Fab capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender dois ectodomínios de 4-1BBL ou dois fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de meio de um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende apenas um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo e em que cada um deles está ligado a um domínio CH1 ou CL e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que os domínios constantes CL e CH1 adjacentes a 4-1BBL são substituídos um pelo outro para que o domínio CH1 faça parte da cadeia leve e o domínio CL faça parte da cadeia pesada.

[0203] Em outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, que compreende (a) duas cadeias leves e duas cadeias pesadas de um anticorpo que compreende dois fragmentos de Fab, capazes de se ligarem de forma específica ao 4-1BB e ao domínio Fc e

(b) dois Fab adicionais fragmentos capazes de ligação específica a um antígeno de célula alvo, em que os referidos fragmentos de Fab adicionais estão ligados, cada um, através de um ligante peptídico ao terminal C das cadeias pesadas de (a). Em um aspecto particular, os fragmentos de Fab adicionais são fragmentos de Fab, em que os domínios variáveis VL e VH são substituídos um pelo outro de forma que o domínio VH seja parte da cadeia leve e o domínio VL seja parte da cadeia pesada.

[0204] Em outro aspecto e para melhorar ainda mais o emparelhamento correto, a molécula biespecífica de ligação ao antígeno que compreende (a) um primeiro fragmento de Fab, capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender dois ectodomínios de 4-1BBL ou dois fragmentos dos mesmos que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende apenas um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo e em que cada um deles está ligado a um domínio CH1 ou CL e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, pode conter diferentes substituições de aminoácidos carregados (os chamados “resíduos carregados”). Estas modificações são introduzidas nos domínios CH1 e CL cruzados ou não cruzados. Em um aspecto particular, a invenção refere-se a uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno, em que em um dos domínios CL o aminoácido na posição 123 (numeração UE) foi substituído por arginina (R) e o aminoácido na posição 124 (numeração UE) foi substituída por lisina (K) e em que em um dos domínios CH1 os aminoácidos na posição 147 (numeração UE) e na posição 213 (numeração UE) foram substituídos por ácido glutâmico (E).

[0205] Mais particularmente, a invenção refere-se a uma molécula de ligação biespecífica compreendendo Fab, em que no domínio CL adjacente a 4-1BBL o aminoácido na posição 123 (numeração UE) foi substituído por arginina (R) e o aminoácido na posição 124 (Numeração UE) foi substituído por lisina (K) e, no domínio CH1 adjacente a 4-1BBL, os aminoácidos na posição 147 (numeração UE) e na posição 213 (numeração UE) foram substituídos pelo ácido glutâmico (E)

POLINUCLEOTÍDEOS

[0206] A invenção fornece ainda polinucleotídeos isolados que codificam um anticorpo como descrito neste documento, ou um fragmento do mesmo.

[0207] Os polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos da invenção podem ser expressos como um único polinucleotídeo que codifica toda a molécula de ligação ao antígeno ou como polinucleotídeos múltiplos (por exemplo, dois ou mais) que são co-expressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são co-expressos podem associar-se através, por exemplo, de ligações dissulfeto ou outros meios para formar uma molécula funcional de ligação ao antígeno. Por exemplo, a porção de cadeia leve de uma imunoglobulina pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da porção de cadeia pesada da imunoglobulina. Quando co-expressos, os polipeptídeos de cadeia pesada se associarão aos polipeptídeos de cadeia leve para formar a imunoglobulina.

[0208] Em alguns aspectos, o polinucleotídeo isolado codifica todo o anticorpo de acordo com a invenção, como descrito neste documento. Em outras formas de realização, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo compreendido no anticorpo de acordo com a invenção, como descrito neste documento.

[0209] Em certas formas de realização, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é DNA. Em outras formas de realização, um polinucleotídeo da presente invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mMRNA). O RNA da presente invenção pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla.

MÉTODOS RECOMBINANTES

[0210] Os anticorpos biespecíficos utilizados na invenção podem ser obtidos, por exemplo, por síntese de peptídeos no estado sólido (por exemplo, síntese em fase sólida de Merrifield) ou produção recombinante. Para produção recombinante, um ou mais polinucleotídeos que codificam o anticorpo ou seus fragmentos de polipeptídicos, por exemplo, como descritos acima, são isolados e inseridos em um ou mais vetores para posterior clonagem e/ ou expressão em uma célula hospedeira. Esse polinucleotídeo pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais. Em um aspecto da invenção, é fornecido um vetor, preferencialmente um vetor de expressão, compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos da invenção. Os métodos que são bem conhecidos dos técnicos no assunto podem ser utilizados para construir vetores de expressão que contenham a sequência de codificação do anticorpo (fragmento) juntamente com os sinais de controle de transcrição/ tradução apropriados. Estes métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação in vivo/ recombinação genética. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1989); e Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates e Wiley Interscience, NY (1989). O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus ou pode ser um fragmento de ácido nucleico. O vector de expressão inclui uma cassete de expressão na qual o polinucleotídeo que codifica o anticorpo ou fragmentos de polipeptídeo dos mesmos (isto é, a região de codificação) é clonado em associação operativa com um promotor e/ ou outros elementos de controle de transcrição ou tradução. Como aqui utilizado, uma “região de codificação” é uma porção de ácido nucleico que consiste em códons traduzidos em aminoácidos.

Embora um “códon de parada” (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, ele pode ser considerado parte de uma região de codificação, se presente, mas qualquer sequência de flanqueamento, por exemplo, promotores, locais de ligação ao ribossomo, terminadores transcricionais, íntrons, regiões 5' e 3' não traduzidas e similares, não fazem parte de uma região de codificação.

Duas ou mais regiões codificadoras podem estar presentes em uma única construção polinucleotídica, por exemplo, em um único vetor, ou em construções polinucleotídicas separadas, por exemplo, em vetores separados (diferentes). Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região de codificação ou pode compreender duas ou mais regiões de codificação, por exemplo, um vetor da presente invenção pode codificar um ou mais polipeptídeos, que são pós ou co-traducionalmente separados nas proteínas finais por clivagem proteolíticaa Além disso, um vector, polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção pode codificar regiões codificantes heterólogas, quer fundidos ou não fundidos a um polinucleotídeo codificando o anticorpo da invenção ou fragmentos de polipeptídeo dos mesmos, ou variantes ou derivados dos mesmos.

As regiões codificadoras heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos especializados, tais como um peptídeo sinal secretório ou um domínio funcional heterólogo.

Uma associação operável ocorre quando uma região de codificação de um produto de gene, por exemplo, um polipeptídeo, é associada a uma ou mais sequências reguladoras de forma a colocar a expressão do produto gênico sob a influência ou controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (tal como uma região de codificação de polipeptídeo e um promotor associado a ele) são “operativamente associados” se a indução da função do promotor resultar na transcrição do MRNA que codifica o produto gênico desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interferir na capacidade de expressão das sequências reguladoras para direcionar a expressão do produto gênico ou interferir na capacidade do modelo de DNA a ser transcrito. Assim, uma região promotora estaria operacionalmente associada a um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo se o promotor fosse capaz de efetuar a transcrição desse ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor específico de célula que direciona a transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, intensificadores, operadores, repressores e sinais de terminação de transcrição, podem ser operativamente associados ao polinucleotídeo para direcionar a transcrição específica da célula.

[0211] Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são aqui divulgados. Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conhecida dos técnicos no assunto. Isso inclui, sem limitação, regiões de controle de transcrição, que funcionam em células de vertebrados, como, mas não se limitando a, segmentos promotores e estimuladores de citomegalovírus (por exemplo, o promotor imediato precoce, em conjunto com o intron-A), vírus símio 40 (por exemplo, o promotor inicial) e retrovírus (como, por exemplo, vírus do sarcoma de Rous). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de genes de vertebrados, tais como actina, proteína de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e à- globina de coelho, bem como outras sequências capazes de controlar a expressão gênica em células eucarióticas. Regiões de controle de transcrição apropriadas adicionais incluem promotores e intensificadores específicos para tecidos, bem como promotores induzíveis (por exemplo, promotores de tetraciclinas induzíveis). Da mesma forma, uma variedade de elementos de controle de tradução são conhecidos dos técnicos no assunto. Isso inclui, mas não se limita a, locais de ligação ao ribossomo, códons de iniciação e terminação da tradução e elementos derivados de sistemas virais (particularmente um local interno de entrada do ribossomo, ou IRES, também conhecido como sequência CITE). A cassete de expressão também pode incluir outras características, como uma origem de replicação e/ ou elementos de integração cromossômica, como repetições terminais longas retrovirais (LTRs) ou repetições terminais invertidas (ITRsS) virais adeno-associadas (AAV).

[0212] As regiões codificadoras de polinucleotídeo e ácido nucleico da presente invenção podem ser associadas a regiões codificadoras adicionais que codificam peptídeos secretores ou sinal, que direcionam a secreção de um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Por exemplo, se a secreção dos fragmentos de anticorpos e polipeptídeos dos mesmos for desejada, o DNA que codifica uma sequência sinal pode ser colocado a montante do ácido nucleico de um anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos dos mesmos. De acordo com a hipótese do sinal, as proteínas secretadas pelas células de mamíferos têm um peptídeo sinal ou uma sequência líder secretora que é clivada da proteína madura uma vez iniciada a exportação da cadeia proteica crescente através do retículo endoplasmático rugoso. Os técnicos no assunto sabem que os polipeptídeos secretados pelas células dos vertebrados geralmente têm um peptídeo sinal fundido ao N terminal do polipeptídeo, que é clivado do polipeptídeo traduzido para produzir uma forma secretada ou “madura” do polipeptídeo. Em certas formas de realização, o peptídeo sinal nativo, por exemplo, um peptídeo sinal de cadeia pesada ou de cadeia leve de imunoglobulina é usado ou um derivado funcional dessa sequência que retém a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo que está operacionalmente associado a ele. Alternativamente, pode ser utilizado um peptídeo sinal heterólogo de mamífero ou um derivado funcional do mesmo. Por exemplo, a sequência líder do tipo selvagem pode ser substituída pela sequência líder do ativador de plasminogênio de tecido humano (TPA) ou da B-glucuronidase de camundongo.

[0213] O DNA que codifica uma sequência curta de proteína que pode ser usada para facilitar a purificação posterior (por exemplo, um marcador de histidina) ou auxiliar na marcação da proteína de fusão pode ser incluído dentro ou nas extremidades do polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos do mesmo.

[0214] Em um aspecto adicional da invenção, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais polinucleotídeos da invenção. Em certas formas de realização, é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores da invenção. Os polinucleotídeos e vetores podem incorporar qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, aqui descritas em relação aos polinucleotídeos e vetores, respectivamente. Em um aspecto, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada ou transfectada) um vetor compreendendo um polinucleotídeo que codifica (parte de) um anticorpo da invenção. Como aqui utilizado, o termo “célula hospedeira” refere-se a qualquer tipo de sistema celular que pode ser manipulado por engenharia genética para gerar as proteínas de fusão da invenção ou fragmentos dos mesmos. As células hospedeiras adequadas para replicar e para apoiar a expressão de moléculas de ligação ao antígeno são bem conhecidas na técnica. Tais células podem ser transfectadas ou transduzidas conforme apropriado com o vetor de expressão particular e grandes quantidades de células contendo vetores podem ser cultivadas para a semeadura de fermentadores em larga escala para obter quantidades suficientes da molécula de ligação ao antígeno para aplicações clínicas. As células hospedeiras adequadas incluem procariotas, microorganismos, tais como E. coli ou várias células eucarióticas, como células de ovário de hamster chinês (CHO), células de inseto ou similares. Por exemplo, os polipeptídeos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação não é necessária. Após a expressão, o polipeptídeo pode ser isolado da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser ainda mais purificado. Além dos procariontes, micróbios eucarióticos, como fungos filamentosos ou leveduras, são hospedeiros de clonagem ou de expressão adequados para vetores codificadores de polipeptídeos, incluindo cepas de fungos e leveduras cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um polipeptídeo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano. Ver Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004) e Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006).

[0215] As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos — (glicosilados) também são derivadas de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados) Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e insetos. Foram identificadas numerosas cepas baculovirais que podem ser usadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda. As culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiras. Ver, por exemplo, as patentes US Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,1259/8 e 6, 417429 (descrevendo a tecnologia PLANTIBODIESTM para produzir anticorpos em plantas transgênicas). As células vertebradas também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens celulares de mamífero que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293T como descrito, por exemplo, em Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células renais de hamster bebê (BHK), células sertoli de camundongo (células TM4 como descritas, por exemplo, em Mather, Biol Reprod 23, 243-

251 (1980)), células renais de macaco (CV1), células renais de macaco verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical. humano (HELA), células renais caninas (MDCK), células hepáticas de camundongos búfalo (BRL 3A), células pulmonares humanas (W1 38), células hepáticas humanas (Hep G2), células tumorais mamárias de camundongos (MMT 060562), células TRI (como descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC5 e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis incluem células ovárias de hamster chinês (CHO), incluindo células dhfr-CHO (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)) e linhagens celulares de mieloma como YO, NSO0, P3X63 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens celulares de mamíferos adequadas para produção de proteínas, ver, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). As células hospedeiras incluem células cultivadas, por exemplo, células cultivadas em mamíferos, células de leveduras, células de insetos, células bacterianas e células vegetais, para citar apenas algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou planta ou tecido animal cultivado. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica, preferencialmente uma célula de mamífero, como uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO), uma célula de rim embrionário humano (HEK) ou uma célula linfóide (por exemplo, célula YO, NSO, Sp20). As tecnologias padrão são conhecidas na técnica para expressar genes estranhos nesses sistemas. As células que expressam um polipeptídeo que compreende a cadeia pesada ou a cadeia leve de uma imunoglobulina podem ser manipuladas por engenharia genética de modo a expressar também a outra das cadeias de imunoglobulina, de modo que o produto expresso seja uma imunoglobulina que possui uma cadeia pesada e uma cadeia leve.

[0216] Em um aspecto, um método de produção de um anticorpo da invenção ou fragmentos de polipeptídeo do mesmo é fornecido, em que o método compreende a cultura de uma célula hospedeira compreendendo polinucleotídeos que codificam o anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos do mesmo, como aqui fornecido, sob condições adequadas para expressão do anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos do mesmo e recuperação do anticorpo da invenção ou fragmentos polipeptídicos do mesmo da célula hospedeira (ou meio de cultura de células hospedeiras).

[0217] Em certas formas de realização, as porções capazes de ligação específica a um antígeno da célula alvo (por exemplo, fragmentos Fab) que fazem parte da molécula de ligação ao antígeno compreendem pelo menos uma região variável de imunoglobulina capaz de se ligar a um antígeno. Regiões variáveis podem formar parte e derivar de anticorpos naturais ou não naturais e fragmentos dos mesmos. Os métodos para produzir anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais são bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Harlow e Lane, “Antibodies, a laboratory manual”, Cold Spring Harbor Laboratry, 1988). Os anticorpos de ocorrência não natural podem ser construídos usando síntese de peptídeos em fase sólida, podem ser produzidos de forma recombinante (por exemplo, como descrito na patente US No. 4,186,567) ou podem ser obtidos, por exemplo, por triagem de bibliotecas combinatórias compreendendo cadeias pesadas variáveis e cadeias leves variáveis (ver, por exemplo, Patente US No. 5,969,108 de McCafferty).

[0218] Qualquer espécie animal de imunoglobulina pode ser utilizada na invenção. As imunoglobulinas não limitativas úteis na presente invenção podem ser de origem murina, primata ou humana. Se a proteína de fusão se destina ao uso humano, pode ser utilizada uma forma quimérica de imunoglobulina em que as regiões constantes da imunoglobulina são de um humano. Uma forma humanizada ou totalmente humana da imunoglobulina também pode ser preparada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente US No. 5,565,332 de Winter). A humanização pode ser alcançada por vários métodos, incluindo, mas não se limitando a (a) enxertar as CDRs não humanas (por exemplo, anticorpo doador) na estrutura humana (por exemplo, anticorpo receptor) e regiões constantes com ou sem retenção de resíduos críticos da estrutura (por exemplo aqueles que são importantes para reter boas afinidades de ligação ao antígeno ou funções de anticorpo), (b) enxertar apenas as regiões determinantes da especificidade não humanas (SDRs ou a-CDRs; os resíduos críticos para a interação anticorpo-antígeno) na estrutura humana e regiões constantes ou (c) transplantar todos os domínios variáveis não humanos, mas “encobri-los” com uma seção semelhante à humana por substituição de resíduos de superfície.

Anticorpos humanizados e métodos para produzí-los são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008) e são descritos mais detalhadamente, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989); Patentes US Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 e 7,087,409; Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984); Morrison e Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988); Verhoeyen et al.

Science 239, 1534-1536 (1988); Padlan, Molec Immun 31 (3), 169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005) (descrevendo enxerto de SDR (a- CDR)); Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (descrevendo “resurfacing”); Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005) (descrevendo “embaralhamento de FR”); e Osbourn et al., Methods 36, 61-68 (2005) e Klimka et al., Br J.

Cancer 83, 252-260 (2000) (descrevendo a abordagem de “seleção guiada” para embaralhamento de FR). Imunoglobulinas particulares de acordo com a invenção são imunoglobulinas humanas.

Os anticorpos humanos e as regiões variáveis humanas podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na arte.

Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk e van de

Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) e Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). As regiões variáveis humanas podem formar parte e ser derivadas de anticorpos monoclonais humanos produzidos pelo método do hibridoma (ver, por exemplo, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova lorque, 1987)). Anticorpos humanos e regiões variáveis humanas também podem ser preparados pela administração de um imunogênio a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta a desafio antigênico (ver, por exemplo, Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005). Os anticorpos humanos e as regiões variáveis humanas também podem ser gerados pelo isolamento de sequências de regiões variáveis do clone Fv selecionadas de bibliotecas de exibição de fagos derivadas de humanos (ver, por exemplo, Hoogenboom et al. Em Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001); e McCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)). Normalmente os fagos exibem fragmentos de anticorpo, como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab.

[0219] Em certos aspectos, os anticorpos são modificados para ter afinidade de ligação aprimorada de acordo com, por exemplo, os métodos divulgados na publicação PCT WO 2012/020006 (ver Exemplos relacionados à maturação por afinidade) ou Publicação de Pedido de Patente US 2004/0132066. A capacidade das moléculas de ligação ao antígeno da invenção de se ligarem a um determinante antigênico específico pode ser medida por meio de um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) ou outras técnicas familiares de um técnico no assunto, por exemplo, técnica de ressonância de plasmon de superfície (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)) e ensaios de ligação tradicionais (Heeley, Endocr Res 28, 217-229

(2002)). Os ensaios de competição podem ser utilizados para identificar uma molécula de ligação ao antígeno que compete com um anticorpo de referência pela ligação a um antígeno específico. Em certas formas de realização, tal uma molécula de ligação a antígeno competidora se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado pela molécula de ligação ao antígeno de referência. Métodos exemplificativos detalhados para mapear um epítopo ao qual uma molécula de ligação ao antígeno se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Em um ensaio de competição exemplificativo, o antígeno imobilizado é incorporado em uma solução compreendendo uma primeira molécula de ligação ao antígeno marcada que se liga ao antígeno e uma segunda molécula de ligação ao antígeno não marcada que está sendo testada quanto à sua capacidade de competir com a primeira molécula de ligação ao antígeno pela ligação ao antígeno. A segunda molécula de ligação ao antígeno pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como controle, o antígeno imobilizado é incubado em uma solução compreendendo a primeira molécula de ligação ao antígeno marcada, mas não a segunda molécula de ligação ao antígeno não marcada. Após a incubação sob condições permissivas para a ligação do primeiro anticorpo ao antígeno, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associada ao antígeno imobilizado é medida. Se a quantidade de marcador associado ao antígeno imobilizado for substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, isso indica que a segunda molécula de ligação ao antígeno está competindo com a primeira molécula de ligação ao antígeno pela ligação ao antígeno. Ver Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

[0220] Os anticorpos da invenção preparados como descritos neste documento podem ser purificados por técnicas conhecidas na arte, tais como cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia de troca iônica, eletroforese em gel, cromatografia por afinidade, cromatografia de exclusão por tamanho e similares. As condições reais usadas para purificar uma proteína específica dependerão, em parte, de fatores como carga líquida, hidrofobicidade, hidrofiliidade etc. e serão evidentes para os técnicos no assunto. Para purificação por cromatografia de afinidade, pode ser utilizado um anticorpo, ligando, receptor ou antígeno ao qual a molécula de ligação ao antígeno se liga. Por exemplo, para purificação por cromatografia por afinidade de proteínas de fusão da invenção, pode ser utilizada uma matriz com proteína A ou proteína G. A cromatografia por afinidade sequencial de proteína A ou Ge a cromatografia por exclusão de tamanho podem ser usadas para isolar uma molécula de ligação ao antígeno essencialmente como descrito nos Exemplos. A pureza da molécula de ligação ao antígeno ou fragmentos dos mesmos pode ser determinada por qualquer de uma variedade de métodos analíticos bem conhecidos, incluindo eletroforese em gel, cromatografia líquida de alta pressão e similares. Por exemplo, as moléculas de ligação ao antígeno contendo 4- 1BBL expressas como descritos nos Exemplos, mostraram-se intactos e adequadamente montados, como demonstrado por SDS-PAGE redutor e não redutor.

ENSAIOS

[0221] As moléculas de ligação ao antígeno aqui fornecidas podem ser identificadas, rastreadas ou caracterizadas por suas propriedades físicas/ químicas e/ ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.

1. ENSAIOS DE AFINIDADE

[0222] A afinidade das moléculas de ligação ao antígeno biespecífico aqui fornecidas para o receptor correspondente pode ser determinada de acordo com os métodos estabelecidos nos Exemplos por ressonância de plasmon de superfície (SPR), utilizando instrumentação padrão, como um instrumento BlAcore (GE Healthcare) e receptores ou proteínas alvo tais como as que podem ser obtidas por expressão recombinante. A afinidade da molécula de ligação ao antígeno biespecífico em relação aos antígenos de células alvo pode também ser determinada por ressonância de plasmon de superfície (SPR), utilizando instrumentação convencional, tal como um instrumento BlAcore (GE Healthcare) e receptores ou proteinas alvo, como pode ser obtido por expressão recombinante. Para as moléculas de ligação ao antígeno FAP-4-1BBL, os métodos foram descritos em mais detalhes na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2016/075278 A1. De acordo com um aspecto, KD é medido por ressonância de plasmon de superfície utilizando uma máquina BIACOREG T100 (GE Healthcare), a 25 ºC.

2. ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS

[0223] Em um aspecto, as moléculas de ligação ao antígeno FAP- 4-1BBL como aqui relatadas são testadas quanto à sua atividade de ligação ao antígeno, como descrito em mais detalhes na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. O 2016/075278 A1.

3. ENSAIOS DE ATIVIDADE

[0224] Em um aspecto, são fornecidos ensaios para identificar a atividade biológica das moléculas de ligação ao antígeno FAP-4-1BBL.

[0225] Em certas formas de realização, um anticorpo como aqui relatado é testado para essa atividade biológica, em ensaios de co-cultura in vitro com células efetoras imunológicas humanas.

CoMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, FORMULAÇÕES E ROTAS DE ADMINISTRAÇÃO

[0226] Em um aspecto adicional, a invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo os agonistas de 4-1BB aqui fornecidos e uma terapia ou agente de direcionamento de HER-2 aqui fornecido, por exemplo,

para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos abaixo. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2, um anticorpo biespecífico de HER-2 e/ ou um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende uma combinação de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2 selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e margetuximabe. Em um aspecto, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe ou pertuzumabe. Mais particularmente, o agente de direcionamento de HER-2 é o trastuzumabe. Em alguns aspectos, o direcionamento HER-2 é um anticorpo de HER-2 com glicoengenharia, por exemplo, TrasGex. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um anticorpo biespecífico de HER-2, por exemplo, Herceptarg. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2, em particular o trastuzumabe emtansina (ado-trastuzumabe emtansina).

[0227] EM alguns aspectos, uma composição farmacêutica compreende um agonista de 4-1BB aqui fornecido e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em outras formas de realização, uma composição farmacêutica compreende um agonista de 4-1BB aqui fornecido e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo. Em algumas formas de realização, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um agente de direcionamento de HER-2 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0228] As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpos ou agentes dissolvidas ou dispersas em um excipiente, veículo, adjuvante ou diluente farmaceuticamente aceitável. As frases “farmacêutica ou farmacologicamente aceitável" referem-se a entidades moleculares e composições que são de forma geral não tóxicas para os receptores nas dosagens e concentrações utilizadas, isto é, não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação inconveniente quando administrada a um animal, tal como por exemplo, um humano, conforme apropriado. A preparação de uma composição farmacêutica que contenha pelo menos um anticorpo de acordo com a invenção e, opcionalmente, um ingrediente ativo adicional será conhecida pelos peritos no assunto luz da presente invenção, como exemplificado por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Ed. Mack Printing Company, 1990, aqui incorporada por referência. Em particular, as composições são formulações liofiizadas ou soluções aquosas. Como aqui utilizado, “excipiente farmaceuticamente aceitável” inclui qualquer e todos os solventes, tampões, meios de dispersão, revestimentos, tensoativos, antioxidantes, conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotônicos, sais, estabilizadores e combinações destes, tal como ser conhecido por um técnico no assunto.

[0229] As composições parenterais incluem aquelas concebidas para administração por injeção, por exemplo, injeção subcutânea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intra-arterial intramuscular, —intratecal! ou intraperitoneal. Para injeção, as moléculas de ligação ao antígeno da invenção podem ser formuladas em soluções aquosas, de forma preferencial em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como solução de Hanks, solução de

Ringer ou tampão salino fisiológico.

A solução pode conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ ou dispersão.

De forma alternativa, as proteínas de fusão podem estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água isenta de pirogênios estéreis, antes da utilização.

As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando as proteínas de fusão da invenção na quantidade requerida no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados abaixo, conforme necessário.

A esterilidade pode ser prontamente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

De forma geral, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e/ ou os outros ingredientes.

No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, suspensões ou emulsões, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem sob vácuo ou secagem por congelação que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma forma previamente esterilizada em meio líquido filtrado do mesmo.

O meio líquido deve ser adequadamente tamponado se necessário e o diluente líquido deve ser primeiro isotônico antes da injeção com solução salina ou glucose suficientes.

A composição deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e preservada contra a ação contaminante de microrganismos, como bactérias e fungos.

Será apreciado que a contaminação com endotoxina deve ser mantida minimamente a um nível seguro, por exemplo, inferior a 0,5 ng/ mg de proteína.

Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, mas não estão limitados a: tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico;

alquilparabenos, tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metílicos (por exemplo, complexos de proteína-Zn); e/ ou tensoativos não iônicos, tais como polietilenoglicol (PEG). As suspensões aquosas para injeção podem conter compostos que aumentam a viscosidade da suspensão, tais como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol dextrano ou semelhantes. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizantes ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas, de forma adicional, as suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosas apropriadas. Os solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos tais como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos graxos sintéticos, tais como grampos de etilo ou triglicerídeos, ou lipossomas.

[0230] Os ingredientes ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e poli (metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de distribuição coloidal de medicamentos (por exemplo, lipossomas, albumina microesferas, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences (18a Ed. Mack Printing Company, 1990). Preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o polipeptídeo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Em formas de realização particulares, a absorção prolongada de uma composição injetável pode ser alcançada pela utilização nas composições de agentes que retardam a absorção, tais como, por exemplo, monoestearato de alumínio, gelatina ou combinações dos mesmos.

[0231] Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis aqui incluídos incluem agentes de dispersão de medicamentos intersticial, tais como glicoproteínas de hialuronidase neutras ativas solúveis (SHASEGP), por exemplo, glicoproteínas de hialuronidase solúveis em PH-20 humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEXS, Baxter International, Inc.). Certos exemplos de SHASEGPs e modos de utilização, incluindo rHuPH20, são descritos nas Publicações de Patente US Nos. 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais, tais como condroitinases.

[0232] Exemplos de formulações de anticorpos liofilizados são descritos na patente US Nº 6.267.958. Formulações aquosas de anticorpo incluem as descritas na Patente US Nº 6.171.586 e no WO 2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão de histidina-acetato.

[0233] Além das composições descritas anteriormente, as moléculas de ligação ao antígeno podem também ser formuladas como uma preparação de depósito. Tais formulações de atuação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, as proteínas de fusão podem ser formuladas com materiais de polímero ou hidrofílicos adequados (por exemplo como emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados pouco soleis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

[0234] Composições farmacêuticas que compreende as moléculas de ligação ao antígeno da invenção podem ser fabricadas por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, emulsificação, encapsulação, aprisionamento ou liofiização. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de maneira convencional utilizando um ou mais transportadores, diluentes, excipientes ou auxiliares fisiologicamente aceitáveis que facilitam o processamento das proteínas em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida.

[0235] Os anticorpos da invenção podem ser formulados em uma composição em uma forma livre de ácido ou base, neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis são sais que retêm substancialmente a atividade biológica do ácido ou base livre. Estes incluem os sais de adição de ácido, por exemplo, aqueles formados com os grupos amino livres de uma composição proteica, ou que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como ácido acético, oxálico, tartárico ou ácido mandélico. Sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico; ou bases orgânicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina ou procaína. Os sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveis em solventes aquosos e outros solventes próticos do que as correspondentes formas de base livre.

[0236] A composição aqui também pode conter mais do que um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação particular a ser tratada, de preferência aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente uns aos outros. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o fim pretendido.

[0237] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo são de forma geral estéreis. A esterilidade pode ser prontamente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

ADMINISTRAÇÃO DO AGONISTA DE 4-1BB E DA TERAPIA DE DIRECIONAMENTO HER-2

[0238] Tanto o agonista de 4-1BB quanto a terapia/ agente de direcionamento de HER-2 (ambos denominados substância aqui) podem ser administrados por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para o tratamento local, administração intralesional. Os métodos da presente invenção são particularmente úteis, no entanto, em relação a agentes terapêuticos administrados por infusão parentérica, particularmente intravenosa. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2, um anticorpo biespecífico de HER-2 e/ ou um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende uma combinação de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2 selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e margetuximabe. Em um aspecto, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe ou pertuzumabe. Mais particularmente, o agente de direcionamento de HER-2 é o trastuzumabe. Em alguns aspectos, o direcionamento HER-2 é um anticorpo de HER-2 com glicoengenharia, por exemplo, TrasGex. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um anticorpo biespecífico de HER-2, por exemplo, Herceptarg. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2, em particular o trastuzumabe emtansina (ado-trastuzumabe emtansina).

[0239] As infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser feita por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem, incluindo, mas não limitados, a administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários períodos de tempo, administração de bolus e infusão de pulso, são contemplados aqui. Em uma forma de realização, o agente terapêutico é administrado parentericamente, particularmente por via intravenosa. Em uma forma de realização particular, o agente terapêutico é administrado por infusão intravenosa.

[0240] Em alguns aspectos, o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER-2 são administrados juntos em uma única composição. Em algumas formas de realização, o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER-2 são administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

[0241] Tanto o agonista de 4-1BB como a terapia/ agente de direcionamento de HER-2 seriam formulados, dosados e administrados de maneira consistente com as boas práticas médicas. Os fatores a serem considerados neste contexto incluem o distúrbio específico que está sendo tratado, o mamífero específico que está sendo tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa do distúrbio, o local de administração do agente, o método de administração, o cronograma da administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. O agonista de 4-1BB e a terapia/ agente de direcionamento de HER-2 não precisa ser, mas são opcionalmente formulados com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar a doença em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de agente terapêutico presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração descritas aqui, ou cerca de 1 a 99% das dosagens aqui descritas, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/ clinicamente determinada como apropriada.

[0242] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada do agonista de 4-1BB e da terapia/ agente de direcionamento de HER-2 (quando usado em sua combinação ou com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo do agente 4-1BB, da gravidade e curso da doença, se ambos os agentes são administrados para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e resposta ao agente terapêutico e a critério do médico assistente. Cada substância é adequadamente administrada ao paciente ao mesmo tempo ou durante uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e gravidade da doença, cerca de 1 ug/ kg a 15 mg/ kg (por exemplo, 0,1 mg/ kg a mg/ kg) da substância pode ser uma dose candidata inicial para administração ao sujeito, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 ug/ kg a 100 mg/ kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento geralmente é mantido até que ocorra a supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exembplificativa de cada substância estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/ kg a cerca de 10 mg/ kg. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/ kg, 1,0 mg/ kg, 2,0 mg/ kg, 3,0 mg/ kg, 4,0 mg/ kg, 5,0 mg/ kg, 6,0 mg/ kg, 7,0 mg/ kg, 8,0 mg/ kg, 9,0 mg/ kg ou 10 mg/ kg (ou qualquer combinação desta) podem ser administradas ao sujeito. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, toda semana, a cada duas semanas ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o indivíduo receba de cerca de duas a cerca de vinte, ou por exemplo, cerca de seis doses do agente terapêutico). Pode ser administrada uma dose inicial de carga mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas, ou uma dose inicial mais baixa, seguida por uma ou mais doses mais altas. Um regime de dosagem exemplificativo compreende a administração de uma dose inicial de cerca de 10 mg, seguida por uma dose após duas semanas de cerca de 20 mg do agente terapêutico. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

[0243] Em um aspecto, a administração do agonista de 4-1BB e da terapia/ agente de direcionamento de HER-2 é uma administração única. Em algumas formas de realização, o agonista de 4-1BB e a terapia/ agente de direcionamento de HER-2 são administrados simultaneamente. O termo “simultaneamente” significa ao mesmo tempo ou dentro de um curto período de tempo, de forma geral menos de 1 hora. Em certos aspectos, a administração do agente terapêutico é duas ou mais administrações. Um medicamento que é administrado “simultaneamente” com um ou mais outros medicamentos é administrado durante o mesmo ciclo de tratamento, no mesmo dia de tratamento que um ou mais outros medicamentos e, opcionalmente, ao mesmo tempo que um ou mais outros medicamentos. Por exemplo, para terapias administtadas a cada 3 semanas, os medicamentos administrados simultaneamente são administrados no dia 1 de um ciclo de 3 semanas. Em um aspecto específico, as substâncias são administradas toda semana, a cada duas semanas ou a cada três semanas, principalmente a cada duas semanas. Em um aspecto, a substância é administada em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em um aspecto, a substância é administrada em uma dose de cerca de 50 ug/ kg, cerca de 100 ug/ kg, cerca de 200 ug/ kg, cerca de 300 ug/ kg, cerca de 400 ug/ kg, cerca de 500 ug/ kg, cerca de 600 ug/ kg, cerca de 700 ug/ kg, cerca de 800 ug/ kg, cerca de 900 ug/ kg ou cerca de 1000 ug/ kg. Em uma forma de realização, o agonista de 4-1BB é administrado em uma dose que é mais alta que a dose do agonista de 4-1BB em um regime de tratamento correspondente sem a administração da terapia/ agente de direcionamento de HER-2. Em uma forma de realização, a terapia/ agente de direcionamento de HER-2 é administrada a uma dose que é mais alta que a dose da terapia/ agente de direcionamento de HER-2 em um regime de tratamento correspondente sem a administração do agonista de 4-1BB. Em um aspecto, a administração do agonista de 4-1BB compreende uma administração inicial de uma primeira dose do agonista de 4-1BB e uma ou mais administrações subsequentes de uma segunda dose do agonista de 4- 1BB, em que a segunda dose é mais alta que a primeira dose. Em um aspecto, a administração do agonista de 4-1BB compreende uma administração inicial de uma primeira dose do agonista de 4-1BB e uma ou mais administrações subsequentes de uma segunda dose do agonista de 4-1BB em que a primeira dose não é inferior a segunda dose.

[0244] Quando os dois agentes terapêuticos são co-administrados sequencialmente, os agentes são administrados em duas administrações separadas, separadas por um “período de tempo específico”. O período específico é de 1 hora a 15 dias. Por exemplo, um dos agentes pode ser administrado dentro de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou 1 a 24 horas após a administração do outro agente e, em uma forma de realização, o período de tempo específico é 1 a 3 dias ou 2 a 8 horas.

[0245] Em um aspecto, o agonista de 4-1BB é administrado antes da administração da terapia/ agente de direcionamento de HER-2. Em outro aspecto, a terapia/ agente de direcionamento de HER-2 é administrada antes da administração do agonista de 4-1BB.

[0246] Em alguns aspectos, a quantidade inicial farmaceuticamente eficaz de trastuzumabe emtansina administrada por dose estará na faixa de cerca de 0,3 a 15 mg/ kg/ dia do peso corporal do paciente. Um fomento comercial de T-DM1 (KADCYLAS, ado-trastuzumabe emtansina) é um pó liofilizado livre de conservante estéril, branco a esbranquiçado, em frascos de uso único. Cada frasco para injetáveis contém 100 mg ou 160 mg de ado-trastuzumabe emtansina. Após a reconstituição, cada frasco para injetáveis de uso único contém ado-trastuzumabe emtansina (20 mg/ mL), polissorbato 20 [0,02% (p/ v)], succinato de sódio (10 mM) e sacarose [6% > (p/ v)] com um pH de 5,0 e densidade de 1,026 g/ mL. A solução resultante contendo 20 mg/ mL de adotrastuzumabe emtansina é administrada por infusão intravenosa após diluição.

[0247] Uma formulação comercial de pertuzumabe (PERJETAº) contém pertuzumabe 420 mg/ 14 mL (30 mg/ mL) na forma de uma solução sem conservantes para infusão intravenosa e pode ser administrada em uma dose fixa de aproximadamente 420 mg (equivalente a doses de 6 mg/ kg para um indivíduo de 70 kg), aproximadamente 525 mg, aproximadamente 840 mg e/ ou aproximadamente 1050 mg. O tratamento pode começar com uma dose de carga mais alta (por exemplo, 840 mg, equivalente a 12 mg/ kg de peso corporal). Uma formulação adequada de pertuzumabe para uso terapêutico compreende 30 mg/ mL de pertuzumabe em acetato de histidina 20 mM, sacarose 120 mM, polissorbato 20 a 0,02%, a pH 6,0. Uma formulação alternativa de pertuzumabe compreende 25 mg/ mL de pertuzumabe, tampão histidina-HCl 10 mM, sacarose 240 mM, polissorbato 20 a 0,02%, pH 6,0.

[0248] Em outro aspecto, o agonista de 4-1BB é para uso com a terapia/ agente de direcionamento de HER-2, em que um pré-tratamento com um anticorpo anti-CD20 do tipo Il, de forma preferencial obinutuzumabe, é realizado antes do tratamento combinado, em que o período de tempo entre o pré-tratamento e o tratamento combinado é suficiente para a redução de células B no indivíduo em resposta ao anticorpo anti-CD20 do tipo Il, de forma preferencial obinutuzumabe.

[0249] A ativação das células T pode levar à síndrome grave de liberação de citocinas (SRC). Em um estudo de fase 1 conduzido por TeGenero (Suntharalingam et al., N Engl J Med (2006) 355,1018-1028), todos os 6 voluntários saudáveis apresentaram uma síndrome fatal de liberação de citocinas (SRC) quase fatal e rapidamente fatal após a infusão inadequada de um anticorpo monoclional super-agonista de anti-CD28 estimulador de células T. A liberação de citocinas associada à administração de um agente terapêutico ativador de células T, como os agonistas de 4-1BB descritos neste documento, a um indivíduo pode ser significativamente reduzida por pré- tratamento do referido sujeito com um anticorpo anti-CD20 do tipo Il, como obinutuzumabe. O uso do pré-tratamento com GAZYVA?º (Gpt) deve auxiliar no rápido esgotamento das células B, tanto no sangue periférico quanto nos órgãos linfóides secundários, de forma que o risco de eventos adversos (EAs) altamente relevantes da forte ativação sistêmica das células T por agentes terapêuticos ativadores de células T (por exemplo, SRC) é reduzido, enquanto suporta níveis de exposição de agentes terapêuticos ativadores de células T que são altos o suficiente desde o início da dosagem para mediar a eliminação de células tumorais. Até a presente data, o perfil de segurança do obinutuzumabe (incluindo liberação de citocinas) foi avaliado e gerenciado em centenas de pacientes em ensaios clínicos em andamento com obinutuzumabe. Finalmente, além de apoiar o perfil de segurança dos anticorpos ativadores de células T, o Gpt também deve ajudar a impedir a formação de anticorpos anti-drogas (ADAs) para essas moléculas únicas.

[0250] Na presente invenção, a combinação do agonista de 4-1BB e a terapia/ agente de direcionamento de HER-2 pode ser utilizada em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, pelo menos um agente terapêutico adicional pode ser co-administrado. Em certos aspectos, um agente terapêutico adicional é um agente imunoterapêutico. Em algumas formas de realização, o agente terapêutico adicional é um agente quimioterapêutico. Os agentes quimioterapêuticos adequados incluem um ou mais medicamentos de antraciclinas, como doxorrubicina e epirrubicina (farmorubicinaº); medicamentos de taxanos, como paclitaxel (Taxolº) e docetaxel (Taxotereº); fluorouracil (5FU); ciclofosfamida; metotrexato; cisplatina; e capecitabina. Outros agentes terapêuticos adicionais incluem os inibidores de cinase, como lapatinibe (Tykerb) e neratinibe (Nerlynx).

[0251] Tais terapias de combinação mencionadas acima abrangem a administração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma ou em formulações separadas) e administração separada; nesse caso, a administração do agente terapêutico pode ocorrer antes, simultaneamente e/ ou após, a administração de um agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em uma forma de realização, a administração do agente terapêutico e a administração de um agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um mês, ou dentro de uma, duas ou três semanas, ou dentro de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, um do outro.

MÉTODOS E COMPOSIÇÕES TERAPÊUTICAS

[0252] Em um aspecto, é fornecido um método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB, descrito neste documento, e uma quantidade eficaz de um agente de direcionamento de HER- 2, descrito neste documento. Em vários aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2, um anticorpo biespecífico de HER-2 e/ ou um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina, Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende uma combinação de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2 selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e margetuximabe. Em um aspecto, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe ou pertuzumabe. Mais particularmente, o agente de direcionamento de HER-2 é o trastuzumabe. Em alguns aspectos, o direcionamento HER-2 é um anticorpo de HER-2 com glicoengenharia, por exemplo, TrasGex. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um anticorpo biespecífico de HER-2, por exemplo, Herceptarg. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2, em particular o trastuzumabe emtansina (ado-trastuzumabe emtansina).

[0253] Em um desses aspectos, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Agentes adicionais adequados incluem um ou mais medicamentos de antraciclinas, tais como doxorrubicina e epirrubicina (farmorubicinaº); medicamentos de taxanos, como paclitaxel (Taxolº) e docetaxel (Taxotereº); fluorouracil (5FU); ciclofosfamida; metotrexato; cisplatina; e capecitabina. Outros agentes terapêuticos adicionais adequados incluem os inibidores de cinase, como lapatinibe (Tykerb) e neratinibe (Nerlynx). Em outras formas de realização, é aqui fornecido um método para a retração do tumor, compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2, como descrito neste documento. Um “indivíduo” ou um “sujeito” de acordo com qualquer um dos aspectos acima é de preferência um humano.

[0254] Em um aspecto, a invenção fornece um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2. Em outro aspecto, a invenção fornece um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer. Em algumas formas de realização, o agonista de 4-1BB e/ ou o agente de direcionamento de HER-2 são combinados com um agente terapêutico adicional.

[0255] Em aspectos adicionais, é fornecida uma composição para uso em imunoterapia contra o câncer que compreende um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2. Em certas formas de realização, é fornecida uma composição que compreende um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 para uso em um método de imunoterapia para câncer.

[0256] Em um aspecto adicional, é aqui proporcionado o uso de uma composição que compreende um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 na fabricação ou preparação de um medicamento. Em algumas formas de realização, o medicamento é para tratamento de câncer. Em algumas formas de realização, o medicamento é para tratamento de tumores sólidos. Em algumas formas de realização, o medicamento é para uso em um método de retração de tumor compreendendo a administração a um indivíduo com um tumor sólido de uma quantidade eficaz do medicamento. Em uma dessas formas de realização, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Em algumas formas de realização, o medicamento é para o tratamento de tumores sólidos.

[0257] Em aspectos particulares, o indivíduo tem câncer Positivo para HER-2. Em algumas formas de realização, o câncer pode compreender células superexpressando HER-2. Em algumas formas de realização, o câncer compreende um tumor sólido. Em algumas formas de realização, o tumor sólido é um tumor sólido avançado e/ ou metastático. Em alguns aspectos, o câncer Positivo para HER-2 é câncer de mama, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão, por exemplo. adenocarcinoma do pulmão ou câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer uterino, por exemplo, carcinoma endometrial seroso uterino, carcinoma do ducto salivar, câncer de bexiga, câncer endometrial, câncer de pâncreas, câncer de cólon, câncer de próstata e/ ou câncer de cabeça e pescoço. Em alguns aspectos, o câncer de mama é um carcinoma de mama ou um adenocarcinoma de mama. Em alguns aspectos, o carcinoma da mama é um carcinoma ductal invasivo. Em alguns aspectos, o câncer de pulmão é um adenocarcinoma de pulmão. Em algumas formas de realização, o câncer de cólon é um adenocarcinoma colorretal. Um “indivíduo” de acordo com qualquer uma das formas de realização acima pode ser um humano.

[0258] Em alguns aspectos, o câncer é o câncer de mama positivo para HER-2, em particular o câncer de mama metastático (câncer de mama em estágio IV). Em alguns aspectos, o câncer é um câncer de mama positivo para

HER-2 nos estágios || ou Ill. Em alguns aspectos, o câncer é um câncer de mama precoce positivo para HER-2. Em alguns aspectos, o câncer é um câncer gástrico positivo para HER-2.

[0259] O tratamento pode ter como objetivo a prevenção do desenvolvimento ou progressão de um câncer. Como tal, os sujeitos podem ser tratados profilaticamente contra o desenvolvimento de um estado de doença usando os agonistas de 4-1BB e os agentes alvos de HER-2 descritos neste documento. Isso pode ocorrer antes do início dos sintomas do estado da doença e/ ou pode ser administrado a indivíduos considerados com maior risco de desenvolvimento ou progressão do câncer.

[0260] Em algumas formas de realização, o agonista de 4-1BB atua sinergicamente com o agente de direcionamento de HER-2.

[0261] As terapias de combinação mencionadas acima abrangem administração combinada (onde dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma ou em formulações separadas) e administração separada; nesse caso, a administração do anticorpo conforme relatado neste documento pode ocorrer antes, simultaneamente e/ ou após, a administração do agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em uma forma de realização, a administração de um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 e, opcionalmente, a administração de um agente terapêutico adicional ocorre dentro de cerca de um mês ou dentro de uma, duas ou três semanas, ou dentro de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias um do outro.

[0262] Tanto o agonista de 4-1BB como o agente de direcionamento de HER-2, conforme, descrito neste documento, (e qualquer agente terapêutico adicional), podem ser administrados por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser feita por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários cronogramas de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários períodos de tempo, administração de bolus e infusão de pulsos são contempladas aqui.

[0263] Tanto o agonista de 4-1BB como o agente de direcionamento de HER-2, conforme, descrito neste documento, seriam formulados, dosados e administrados de um modo consistente com a boa prática médica. Os fatores a serem considerados neste contexto incluem o distúrbio específico que está sendo tratado, o mamífero específico que está sendo tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa do distúrbio, o local de administração do agente, o método de administração, o cronograma da administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. Os anticorpos não precisam de ser, mas são opcionalmente formulados com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar a desordem em questão. À quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpos presente na formulação, do tipo de desordem ou tratamento e outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração como descritas aqui, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas aqui, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/ clinicamente determinada como apropriada.

ARTIGOS DE FABRICAÇÃO (KITS)

[0264] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um kit contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O kit compreende pelo menos um recipiente e uma etiqueta ou bula sobre ou associada ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, sacos de solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico.

O recipiente contém uma composição que é por si só ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos dois agentes ativos no kit são um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 da invenção.

Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2, um anticorpo biespecífico de HER-2 e/ ou um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2. Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e trastuzumabe emtansina.

Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende uma combinação de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2 selecionado a partir do grupo que consiste em trastuzumabe, pertuzumabe e margetuximabe.

Em um aspecto, o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe ou pertuzumabe.

Mais particularmente, o agente de direcionamento de HER-2 é o trastuzumabe.

Em alguns aspectos, o direcionamento HER-2 é um anticorpo de HER-2 com glicoengenharia, por exemplo, TrasGex.

Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um anticorpo biespecífico de HER-2, por exemplo, Herceptarg.

Em alguns aspectos, o agente de direcionamento de HER-2 é um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2, em particular o trastuzumabe emtansina (ado-trastuzumabe emtansina).

[0265] Em um aspecto particular, é fornecido um kit para tratar ou retardar a progressão do câncer em um sujeito, compreendendo uma embalagem que compreende (A) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4-1BB e um veículo farmaceuticamente aceitável; (B) uma segunda composição compreendendo como ingrediente ativo um agente de direcionamento de HER-2 e um veículo farmaceuticamente aceitável e (C) instruções para usar as composições em uma terapia de combinação.

[0266] O rótulo ou bula indica como a composição é usada para tratar a condição de escolha e fornece as instruções para o uso das composições em uma terapia de combinação. Além disso, o kit pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um agonista de 4-1BB da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição nele contida, em que a composição compreende um agente de direcionamento de HER-2 da invenção. Além disso, o kit pode compreender um ou mais recipientes adicionais compreendendo outros ingredientes ativos que podem ser utilizados em combinação. O artigo de fabricação nesta forma de realização da invenção pode ainda compreender um folheto informativo (bula) indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica.

[0267] Alternativamente, ou adicionalmente, o Kkit pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

TABELA C (SEQUÊNCIAS):

Fome mes | 1 (hu) 4-1BBL humano (71- | REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQ 254) NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYK

EDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFOGRLLHLSAGORLGV HLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPE

IPAGLPSPRSE 2 hu 4-1BBL (85-254) LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDP

GLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYY VFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLR SAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQ GRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWOAQL

TQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 3 hu 4-1BBL (80-254) DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLS

WYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAK AGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALH LQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS AFGFQGRLLHLSAGQORLGVHLHTEARARH AWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRS

E hu 4-1BBL (52-254) PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPD

DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLS WYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAK AGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALH

Fome mes |

LQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARH AWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRS

E (hu) 4-1BBL humano (71- | REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQ 248) NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYK

EDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGV HLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPE

IPAGL hu 4-1BBL (85-248) LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDP

GLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYY VFFOLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLR SAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQ GRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWOL

TQGATVLGLFRVTPEIPAGL 7 hu 4-1BBL (80-248) DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLS

WYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAK AGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALH LQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARH

AWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL | 6 | huateaisazas) | PWAvSCARASPESAASPRLREGPELSPD |

Toe | = |

DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLS WYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAK AGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALH LQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARH

AWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL | 9 | FaPGSEDECDRA [smams 21 FAP(28H1) VH EVALLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTF

SSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGE QYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL

RAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVT vSS

Fome mes |

RSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC

QQAGQAVIPPTFGAGTKVEIK 23 FAP(4B9) VH EVOALLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTF

SSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGAST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTV

SS 24 FAP(4B9) VL EIVLTAQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVT

SSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC

QQAGIMLPPTFGQAGTKVEIK hu 4-1BBL dimérico (71- | REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQ 254) conectado pelo NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYK ligante (G4S)? EDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE

GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFOGRLLHLSAGORLGV HLHTEARARHAWOQLTQGATVLGLFRVTPE IPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELS PDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGP LSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVV AKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLA LHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARA

Ee em a EE

RSE 26 hu 4-1BBL dimérico (85- | LOLRQOGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDP 254) conectado pelo GLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYY ligante (G4S)? VFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLR

SAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQ GRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWOQL TQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSEGGG GSGGGGSLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDG PLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELV VAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSL ALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARA RHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSP

RSE 27 hu 4-1BBL dimérico (80- | DPAGLLDLRQOGMFAQLVAQNVLLIDGPLS 254) conectado pelo WYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAK ligante (G4S)? AGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALH

LQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARH AWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRS EGGGGSGGGGSDPAGLLDLRQGMFAQL VAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGL SYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVV AGEGSGSVSLALHLQOPLRSAAGAAALALT

Fome mes |

VDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGOR LGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRV

TPEIPAGLPSPRSE 28 hu 4-1BBL dimérico (52- | PWVAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPD 254) conectado pelo DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLS ligante (G4S)? WYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAK

AGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALH LQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS AFGFQGRLLHLSAGQORLGVHLHTEARARH AWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRS EGGGGSCGSGEGSPWAVSGARASPGSAAS PRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLV AQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLS YKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVA GEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTV DLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQORL GVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRV

TPEIPAGLPSPRSE 29 hu 4-1BBL dimérico (71- | REGPELSPDDPAGLLDLROQGMFAQLVAQ 248) conectado pelo NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYK ligante (G4S)2 EDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE

GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGORLGV HLHTEARARHAWOQLTQGATVLGLFRVTPE IPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAG

Fome mes |

LLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSD PGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVY YVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPL RSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGF QGRLLHLSAGOQRLGVHLHTEARARHAWOQ

LTAGATVLGLFRVTPEIPAGL hu 4-1BBL dimérico (85- | LOLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDP 248) conectado pelo GLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYY ligante (G4S)? VFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLR

SAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQ GRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWOQL TQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGGG GSLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYS DPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGV YYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQP LRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFG FOGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAW

QLTAGATVLGLFRVTPEIPAGL 31 hu 4-1BBL dimérico (80- | DPAGLLDLROGMFAQLVAQNVLLIDGPLS 248) conectado pelo WYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAK ligante (G4S)? AGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALH

LQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARH AWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGS GGGGSDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLI

Fome mes |

DGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTK ELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASS EARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTE

ARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 32 hu 4-1BBL dimérico (52- | PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPD 248) conectado pelo DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLS ligante (G4S)? WYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAK

AGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALH LQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNS AFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARH AWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGS GGGGSPWAVSGARASPGSAASPRLREG PELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLL IDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTK ELVVAKAGVYYVFFOLELRRVVAGEGSGS VSLALHLOQPLRSAAGAAALALTVDLPPASS EARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTE ARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL

Fome mes | 39 CEA VH (CEACAMS5) QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNI

KDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANG NSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSL RSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQG

TLVTVSS 40 CEA VL (CEACAM5) EIVLTAQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVD

IFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRA TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV

YYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK 411 Hu 4-1BBL dimérico (71- | REGPELSPDDPAGLLDLROQGMFAQLVAQ 248) — cadeia knob CL* | NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYK Fc (Construção 2.4 e 5.4) | EDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE

GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGOQRLGV HLHTEARARHAWOQLTQGATVLGLFRVTPE IPAGLGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAG LLDLRQOGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSD PGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVY YVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPL RSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGF QGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQ LTAGATVLGLFRVTPEIPAGLGGGGSGCGGG GSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCL

Fome mes |

LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESV TEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGK 42 hu 4-1BBL monomérico | REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQ (71-248) — CH1* NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYK (Construção 2.4 e 5.4) | EDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE

GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGV HLHTEARARHAWOQLTQGATVLGLFRVTPE IPAGLGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNS GALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVP

SSSLGTQTYICNVWYNHKPSNTKVDEKVEPK Sc 43 cadeia hole anti-FAP EVQLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTF (4B9) Fc SSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGAST (Construção 2.4) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR

Fome mes |

AEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTOKSLSLSPGK cadeia leve anti-FAP EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVT (489) SSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGI (Construção 2.4) PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC

QQGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP

VTKSFNRGEC 45 Hu 4-1BBL dimérico (71- | REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQ 254) — Cadeia knob CL* | NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYK Fe EDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE (Construção 1.2) GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL

Fome mes |

PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGV HLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPE IPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSREGPELS PDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGP LSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVV AKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLA LHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARA RHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSP RSEGGGGSGGGGSRTVAAPSVFIFPPSD RKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTK NQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSP

GK hu 4-1BBL monomérico | REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQ (7171-254) -CH1* NVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYK (Construção 1.2) EDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGE

Fome mes |

GSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDL PPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGV HLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPE IPAGLPSPRSEGGGGSGGGGSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV

DEKVEPKSC 47 cadeia hole anti-FAP EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF (28H1) Fc SSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGE

QYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQ VCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTOQKSLSLSPGK | 46 | codeialeveantrar | EM TOSPGTLSLSPEERATLSCRASASvs | dE o (28H1) RSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIP

DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQAGAVIPPTFGQAGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP

VTKSFNRGEC 49 cadeia hole DP47 Fc EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF

SSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGS TYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAKGSGFDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN

HYTOKSLSLSPGK (4B9) Fc fundido a hu 4- | SSTYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGAST

Fome mes | 1BBL dimérico (71-254) | YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR

AEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTOKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPEL SPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDG PLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELV VAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSL ALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQOGRLLHLSAGOARLGVHLHTEARA RHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSP RSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLL DLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPG LAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRS AAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQG

E E Ca EEE

QGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 51 cadeia knob anti-FAP EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF (4B9) Fc fundido a hu 4- | SSTYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGAST 1BBL monomérico (71- | YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR 254) AEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTV

SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQASSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKE YKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTOKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGP ELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLI DGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTK ELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASS EARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTE ARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL PSPRSE

Fome mes | 52 cadeia hole anti-FAP EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF (28H1) Fc fundido a hu 4- | SSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGE 1BBL dimérico (71-254) | QYIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL

RAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQ VCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTOKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGP ELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLI DGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTK ELVVAKAGVYYVFFOLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASS EARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTE ARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL PSPRSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDP AGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWY SDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAG

Fome mes |

VYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLO PLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAF GFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHA

WQLTQAGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 53 cadeia knob anti-FAP EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTF (28H1) Fc fundido a hu 4- | SSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGE 1BBL monomérico (71- | QIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL 254) RAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVT

VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNV NHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSD IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQOKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGP ELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLI DGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTK ELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGS VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASS EARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTE

E E Ca EEE

PSPRSE 54 cadeia hole DP47 Fc EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF fundido a hu 4-1BBL SSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGAST dimérico (71-254) YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR

AEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQASSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHOQDWLNGKE YKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV CTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL VSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTOKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGPEL SPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDG PLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELV VAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSL ALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARA RHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSP RSEGGGGSGGGGSREGPELSPDDPAGLL

Fome mes |

DLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPG LAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYV FFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRS AAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQG RLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWOLT

QGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 55 cadeia knob DP47 Fc EVQLLESGGGLVQAPGGSLRLSCAASGFTF fundido a hu 4-1BBL SSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGAST monomérico (71-254) | YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLR

AEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN HKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKE YKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQOKSLSLSPGGGGGSGGGGSREGP ELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLI DGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTK ELVVAKAGVYYVFFOQLELRRVVAGEGSGS

Fome mes |

VSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASS EARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTE ARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL

PSPRSE 57 ectodomínio hu FAP + | RESRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKT poly-lys-tagt+hiss-tag FFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGOS

YTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLE SDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGN ELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQ RPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEE MLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVI AYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRI FIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFS WLTWVTDERVCLOQWLKRVQNVSVLSICD FREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGF FVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIK DTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSS

NEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCH LRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGI|

PISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQ LPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKK YPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLAS KEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKL GVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWG

Fome mes |

WSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVS SWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKN STVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQ NSAQIAKALVNAQVDFOAMWYSDQNHGL SGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKK

KKGHHHHHH 59 ectodomínio de FAP RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKT Murino + poly-lys- YFPNWISEQEYLHQSEDDNIVFYNIETRES tag+hiss-tag YIILSNSTMKSVNATDYGLSPDRQFVYLES

DYSKLWRYSYTATYYIYDLQONGEFVRGYE LPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQ RPGDPPFQITYTGRENRIFNGIPDWVYEEE MLATKYALWWSPDGKFLAYVEFNDSDIPII AYSYYGDGQYPRTINIPYPKAGAKNPVVR VFIVDTTYPHHVGPMEVPVPEMIASSDYYF SWLTWVSSERVCLOWLKRVQNVSVLSIC DFREDWHAWECPKNQEHVEESRTGWAG GFFVSTPAFSQDATSYYKIFSDKDGYKHIH YIKDTVENAIQITSGKWEAIYIFRVTQDSLF YSSNEFEGYPGRRNIYRISIGNSPPSKKCV TCHLRKERCQYYTASFSYKAKYYALVCYG PGLPISTLHDGRTDQEIQVLEENKELENSL RNIQLPKVEIKKLKDGGLTFWYKMILPPQF DRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVKSVFAVNW

Ee em

ITYLASKEGIVIALVDGRGTAFQGDKFLHAV YRKLGVYEVEDQLTAVRKFIEMGFIDEERI AIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAV APVSSWEYYASIYSERFMGLPTKDDNLEH YKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNV HFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQN HGILSGRSQNHLYTHMTHFLKQCFSLSDG

KKKKKKGHHHHHH Ectodomínio de FAP RPPRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKT cynomolgus + poly-lys- | FFPNWISGQEYLHOSADNNIVLYNIETGOS tag+hiss-tag YTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLE

SDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGN ELPRPIQYLOCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQ RPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEE MLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVI AYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPFVRI FIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFS WLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICD FREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGF FVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIK DTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSS NEFEDYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCH LRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGI PISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQ

LPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKK do

YPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLAS KEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKL GVYEVEDOQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWG WSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVS SWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKN STVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQ NSAQIAKALVNAQVDFQOAMWYSDQNHGL SGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKK

KKGHHHHHH 1BBL 63 4-1BBL (50-254) ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELS

PDDPAGLLDLROQGMFAQLVAQNVLLIDGP LSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVV AKAGVYYVFFOQLELRRVVAGEGSGSVSLA LHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEAR NSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARA RHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSP

RSE 16 | ateshumano — [unProtacessoNo aozort = [66 | arteBamomeligus — | uniprotacesso No. Fewses —

Toe | = | [68 | esr lesceseeces === | [8 | sen — Íseeeeseeea === | | so | hgantepeptico — fesnesese ===> | 82 cadeia hole anti- QVALVASGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNI CEACAMS Fc KDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANG (Construção 5.4) NSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSL

RSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQG TLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVH TFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQOTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH

Fome mes |

NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFY PSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE

ALHNHYTQKSLSLSPGK 83 cadeia leve anti- EIVLTAQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVD CEACAM5 IFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRA (Construção 5.4) TGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAV

YYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVAQWKVDNALOSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHOGL

SSPVTKSFNRGEC cadeia leve DP47 EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVS

SSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQYGSSPLTFGQAGTKVEIKRTVAAPSVFIF PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP

VTKSFNRGEC [ss | eo junmProtacessono Pitas = | | 86 | cadeiaimondimua verte

Ee em | Beer cH1 Fc | 89 ) cadeialevevcuiaso) Jvertaeina =>) Cadeia pesada VÓMHCH1 | ver Tabela 5 (MU137-1) - Fo-DD-VL (28H1) 91 Cadeia pesada VÓHCH1 | ver Tabela 5 (20H4.9) - Fo-KK-VH (28H1) (MU137-1) 93 Cadeia pesada VÓMHCH1 | ver Tabela 6 (MU137-1) - Fo-DD-VH (28H1) 94 Cadeia pesada VÓHCH1 | ver Tabela 6 (MU137-1) - Fo-KK-VL (28H1) | 95 | mERAnmano — [unProrace No POST | domínio variável de EVQLVESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFNI cadeia pesada VH, KDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYT trastuzumabe RYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLR

Ee em a EE

LVTVSS 97 domínio variável de DIQMTQAOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDV cadeia leve VL, NTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGV trastuzumabe PSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC

QQHYTTPPTFGQGTKVEIK domínio variável de EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTF cadeia pesada VH, TDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSG pertuzumabe GSIYNQORFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNS

LRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGT

LVTVSS domínio variável de DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDV cadeia leve VL, SIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGV pertuzumabe PSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYC

QQYYIYPYTFGQAGTKVEIK

[0268] Informações gerais sobre as sequências nucleotídicas das cadeias leves e pesadas de imunoglobulinas humanas são fornecidas em: Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º ed., Serviço de Saúde Pública, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Os aminoácidos das cadeias de anticorpos são numerados e referidos de acordo com os sistemas de numeração de acordo com Kabat (Kabat, EA, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5º ed., Serviço de Saúde Pública, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) como definido acima.

ASPECTOS DA INVENÇÃO

[0269] A seguir, alguns dos aspectos da invenção são listados.

[0270] 1. Um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2.

[0271] 2. Um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2 e em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor.

[0272]3. O agonista de 4-1BB para uso em um método do aspecto 1, em que o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER- 2 são administrados juntos em uma única composição ou administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

[0273] 4. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos 1 ou 2, em que o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

[0274]5. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, em particular a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[0275] 6. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor.

[0276] 7. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a Proteína de ativação de fibroblastos (FAP).

[0277] 8. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v)

CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[0278] 9. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[0279] 10. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, de forma específica um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4.

[0280] 11. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora.

[0281] 12. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[0282] 13. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a um CD19, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada por: (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CLe o segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados um ao outro e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou (ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao terminal C do domínio CH3 por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao terminal C do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou (iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou um domínio VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao VH ou VL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[0283] 14. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica ao FAP que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ

ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0284] 15. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e b) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.

[0285] 16. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, e (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos.

[0286] 17. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o polipeptídeo que compreende os três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos é fundido ao aminoácido N- ou C-terminal de uma das duas subunidades do domínio Fc, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0287] 18. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-FAP/ anti-4-1BB.

[0288] 19. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA.

[0289] 20. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (ili) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[0290] 21. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[0291] 22. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, de forma específica um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4.

[0292] 23. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora.

[0293] 24. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[0294] 25. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada por: (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CLeo segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados um ao outro e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou (ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao terminal C do domínio CH3 por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao terminal C do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou (iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou um domínio VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao VH ou VL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[0295] 26. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0296] 27. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

[0297] 28. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, e (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos.

[0298] 29. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos, e

(c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o polipeptídeo que compreende os três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos é fundido ao aminoácido N- ou C-terminal de uma das duas subunidades do domínio Fc, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0299] 30. O agonista de 4-1BB para uso em um método dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CEA/ anti-4-1BB.

[0300] 31. O agonista de 4-1BB para uso em um método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2 e em que a combinação é administrada em intervalos de cerca de uma semana a três semanas.

[0301] 32. Produto farmacêutico que compreende (A) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4- 1BB e um veículo farmaceuticamente aceitáveli e (B) uma segunda composição — compreendendo como ingrediente ativo um agente de direcionamento de HER-2 e um veículo farmaceuticamente aceitável, para uso no tratamento combinado, sequencial ou simultâneo de uma doença, em particular câncer.

[0302] 33. Uma composição farmacêutica que compreende um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2.

[0303] 34. A composição farmacêutica do aspecto 32 para uso no tratamento de tumores sólidos.

[0304] 35. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

[0305] 36. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos, selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, em particular a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[0306] 37. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor.

[0307] 38. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o antígeno associado ao tumor é FAP.

[0308] 39. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi)

CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[0309] 40. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[0310]41. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.

[0311]42. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, de forma específica um domínio Fc de IgG1 ou um domínio Fc de IgG4.

[0312]43. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora.

[0313] 44. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG1 compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[0314]45. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[0315] 46. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica ao FAP, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada por (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CLeo segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados um ao outro e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou (ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao terminal C do domínio CH3 por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao terminal C do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou (iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou um domínio VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao VH ou VL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[0316] 47. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica ao FAP que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0317]48. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e b) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.

[0318] 49. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, e (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos.

[0319] 50. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o polipeptídeo que compreende os três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos é fundido ao aminoácido N- ou C-terminal de uma das duas subunidades do domínio Fc,

opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0320] 51. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-FAP/ anti-4-1BB.

[0321] 52. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o antígeno associado ao tumor é CEA.

[0322] 53. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (ili) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[0323] 54. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[0324] 55. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.

[0325] 56. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc IgG, de forma específica um domínio Fc IgG1 ou um domínio Fc IgG4.

[0326] 57. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora.

[0327] 58. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG1 compreendendo as substituições de aminoácidos L234A, L235A e P329G.

[0328] 59. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[0329] 60. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada por (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CLe o segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados um ao outro e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou (ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao terminal C do domínio CH3 por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao terminal C do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou (iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou um domínio VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao VH ou VL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[0330] 61. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0331]62. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

[0332] 63. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, e (b) um polipeptídeo que compreende ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos.

[0333] 64. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos, e (c) um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável, em que o polipeptídeo que compreende os três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos é fundido ao aminoácido N- ou C-terminal de uma das duas subunidades do domínio Fc, opcionalmente através de um ligante peptídico.

[0334]65. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CEA/ anti-4-1BB.

[0335] 66. O agonista de 4-1BB para uso ou a composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agente de direcionamento de HER-2 é um ou mais de trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

[0336] 67. O agonista de 4-1BB para uso ou a composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agente de direcionamento de HER-2 é trastuzumabe.

[0337] 68. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2 e em que a combinação é administrada em intervalos de cerca de uma semana a três semanas.

[0338] 69. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores para uso no tratamento ou no retardo da progressão de uma doença proliferativa, em particular câncer.

[0339] 70. A composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores para uso no tratamento de câncer de mama, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão, câncer uterino, carcinoma do ducto salivar, câncer de bexiga, câncer de endométrio, câncer de pâncreas, câncer de cólon, câncer de próstata e/ ou câncer de cabeça e pescoço.

[0340] 71. Um kit para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo, compreendendo uma embalagem compreendendo (a) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4- 1BB e um veículo farmaceuticamente aceitável; (B) uma segunda composição compreendendo como ingrediente ativo um agente de direcionamento de HER- 2 e um veículo farmaceuticamente aceitável e (C) instruções para o uso das composições em uma terapia de combinação.

[0341] 72. Uso de uma combinação de um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 na fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão de uma doença proliferativa, em particular câncer.

[0342] 73. Uso de uma combinação de um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2 na fabricação de um medicamento, em que o medicamento é para o tratamento de tumores sólidos.

[0343] 74. Método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB e uma quantidade eficaz de um agente de direcionamento de HER-2.

[0344] 75. Método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB e uma quantidade eficaz de um agente de direcionamento de HER-2, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno.

[0345] 76. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc.

[0346] 77. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc com modificações que reduzem a ligação ao receptor de Fcy e/ ou a função efetora.

[0347] 78. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

[0348] 79. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor.

[0349] 80. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, em particular a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[0350] 81. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos uma fração capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ

ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[0351] 82. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, em que o domínio de ligação ao antígenocapaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[0352] 83. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.

[0353] 84. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, de forma específica um domínio Fc de I9G1 ou um domínio Fc de IgG4.

[0354] 85. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora.

[0355] 86. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[0356] 87. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica ao FAP, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada por (i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CLeo segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados um ao outro e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou (ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao terminal C do domínio CH3 por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao terminal C do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou (iii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou um domínio VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao VH ou VL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[0357] 88. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica ao FAP que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e

(b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0358] 89. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno selecionada a partir do grupo que consiste em: a) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44; e b) uma molécula que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48.

[0359] 90. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende:

(a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, e (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos.

[0360] 91. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-FAP/ anti-4-1BB.

[0361] 92. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos uma fração capaz de se ligar de forma específica a CEA, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA compreende: - uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[0362] 93. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[0363] 94. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende ainda um domínio Fc composto por uma primeira e uma segunda subunidade capazes de associação estável.

[0364] 95. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, de forma específica um domínio Fc de I9G1 ou um domínio Fc de IgG4.

[0365] 96. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora.

[0366] 97. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[0367] 98. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende:

(a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA, e

(b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto,

em que a molécula de ligação ao antígeno é caracterizada por

(i) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH1 ou CLeo segundo polipeptídeo contém um domínio CL ou CH1, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos que estão conectados um ao outro e ao domínio CH1 ou CL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4- 1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao domínio CL ou CH1 do referido polipeptídeo, ou

(ii) o primeiro polipeptídeo contém um domínio CH3 e o segundo polipeptídeo contém um domínio CH3, respectivamente e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao terminal C do domínio CH3 por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao terminal C do domínio CH3 do referido polipeptídeo, ou

(ili) o primeiro polipeptídeo contém um domínio VH-CL ou VL-CH1 e o segundo polipeptídeo contém um domínio VL-CH1 ou um domínio VH-CL, respectivamente, em que o segundo polipeptídeo está ligado ao primeiro polipeptídeo por uma ligação dissulfeto entre o domínio CH1 e CL e em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que estão conectados um ao outro e ao VH ou VL por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-

1BBL ou um fragmento do mesmo conectado através de um ligante peptídico ao VL ou VH do referido polipeptídeo.

[0368] 99. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0369] 100. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

[0370] 101. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, e (b) um polipeptídeo que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos que são conectados um com o outro através de ligantes peptídicos.

[0371] 102. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CEA/ anti-4-1BB.

[0372] 103. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2 e em que a combinação é administrada em intervalos de cerca de uma semana a três semanas.

[0373] 104. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER-2 são administrados juntos em uma única composição ou administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

[0374] 105. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER-2 são administrados por via intravenosa ou subcutânea.

[0375] 106. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é administrado simultaneamente com, antes ou subsequentemente ao agente de direcionamento de HER-2.

[0376] 107. O método de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER-2 são administrados simultaneamente.

[0377] 108. Um agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2 e em que o agonista de 4-1BB atua sinergicamente com o agente de direcionamento de HER-2.

[0378] 109. O agonista de 4-1BB para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, em que o agonista de 4-1BB é usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2 e em que um pré-tratamento com um anticorpo anti-CD20 do Tipo Il é realizado antes do tratamento combinado, em que o período de tempo entre o pré-tratamento e o tratamento combinado é suficiente para a redução de células B no indivíduo em resposta ao anticorpo anti-CD20 do Tipo |l.

[0379] 110. O agonista de 4-1BB para uso em um método do aspecto 109, em que o anticorpo anti-CD20 do Tipo Il é obinutuzumabe.

[0380] 111. Método para tratar ou retardar a progressão do câncer em um indivíduo, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma combinação de uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB e uma quantidade eficaz de um agente de direcionamento de HER-2, em que um pré- tratamento com um anticorpo anti-CD20 do Tipo Il é realizado antes do tratamento com a combinação, em que o período de tempo entre o pré- tratamento e o tratamento combinado é suficiente para a redução de células B no indivíduo em resposta ao anticorpo anti-CD20 do tipo Il.

[0381] 112. O método do aspecto 111, em que o anticorpo anti- CD?20 do tipo |! é obinutuzumabe.

[0382] 113. Uma combinação que compreende um agonista de 4- 1BB (CD137) e um agente de direcionamento de HER-2, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor.

[0383] 114. A combinação do aspecto 113, em que o agente de direcionamento de HER-2 compreende um anticorpo de HER-2, um anticorpo biespecífico de HER-2 e/ ou um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2.

[0384] 115. A combinação dos aspectos 113 ou 114, em que o agente de direcionamento de HER-2 compreende trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

[0385] 116. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos.

[0386] 117. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, em particular a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

[0387] 118. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor, selecionados a partir do grupo que consiste em proteína de ativação de fibroblastos (FAP) e CEA.

[0388] 119. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc IgG, de forma específica um domínio Fc I9G1 ou um domínio Fc IgG4.

[0389] 120. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora.

[0390] 121. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a uma proteína de ativação de fibroblasto (FAP).

[0391] 122. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v)

CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[0392] 123. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a uma FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

[0393] 124. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[0394] 125. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende:

(a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica ao FAP que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0395] 126. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.

[0396] 127. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-FAP/

anti-4-1BB.

[0397] 128. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA.

[0398] 129. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA que compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

[0399] 130. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor é um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

[0400] 131. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende:

(a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

[0401] 132. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0402] 133. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB é um anticorpo biespecífico anti-CEA/

anti-4-1BB.

[0403] 134. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores para uso como medicamento.

[0404] 135. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER- 2 são administrados juntos em uma única composição ou administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

[0405] 136. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores, em que o agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER- 2 são de administração simultânea ou para administração sequencial.

[0406] 137. A combinação de qualquer um dos aspectos anteriores para uso no tratamento de câncer positivo para HER-2.

EXEMPLOS

[0407] A seguir estão exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras formas de realização podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.

TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE

[0408] Métodos padrão foram usados para manipular o DNA, como descrito em Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova lorque, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante. Informações gerais sobre as sequências nucleotídicas de cadeias leves e pesadas de imunoglobulina humana são fornecidas em: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Ed., Publicação NIH No 91-3242.

SEQUENCIAMENTO DE DNA

[0409] As = sequências de DNA foram determinadas por sequenciamento de fita dupla.

SÍNTESE DE GENES

[0410] Os segmentos genéticos desejados foram gerados por PCR usando modelos apropriados ou foram sintetizados por Geneart AG (Regensburg, Alemanha) a partir de oligonucleotídeos sintéticos e produtos de PCR por síntese genética automatizada. Nos casos em que não estava disponível uma sequência exata do gene, os iniciadores oligonucleotídicos foram projetados com base nas sequências dos homólogos mais próximos e os genes foram isolados por RT-PCR do RNA originário do tecido apropriado. Os segmentos de genes flanqueados por locais de clivagem de endonucleases de restrição singulares foram clonados em vetores de clonagem/ sequenciamento padrão. O DNA do plasmídeo foi purificado a partir de bactérias transformadas e a concentração determinada por espectroscopia UV. A sequência de DNA dos fragmentos de genes subclonados foi confirmada por sequenciamento de DNA. Os segmentos gênicos foram projetados com locais de restrição adequados para permitir subclonagem nos respectivos vetores de expressão. Todas as construções foram desenhadas com uma sequência de DNA na extremidade 5' que codifica para um peptídeo líder que tem como alvo proteínas para secreção em células eucarióticas.

TÉCNICAS DE CULTURA CELULAR

[0411] Técnicas de cultura celular padrão foram usadas como descrito em Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, JB, Lippincott-Schwartz, J. e Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons., Inc.

PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS

[0412] As proteínas foram purificadas a partir de sobrenadantes filtrados da cultura de células, referindo-se a protocolos padrão. Em resumo, os anticorpos foram aplicados a uma coluna de Proteína A Sepharose (GE Healthcare) e lavados com PBS. A eluição dos anticorpos foi alcançada a pH

2,8 seguida por neutralização imediata da amostra. A proteína agregada foi separada dos anticorpos monoméricos por cromatografia de exclusão por tamanho (Superdex 200, GE Healthcare) em PBS ou em Histidina a 20 mM, NaCl a 150 mM, pH 6,0. As frações de anticorpos monoméricos foram reunidas, concentradas (se necessário) usando, por exemplo, um concentrador centrífugo MILLIPORE Amicon Ultra (380 MWCO), congeladas e armazenadas a -20 “C ou -80 “C. Parte das amostras foi fornecida para posterior análise de proteínas e caracterização analítica por exemplo, por SDS-PAGE, cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) ou espectrometria de massa. SDS-PAGE

[0413] O sistema de gel NUPAGEO Pre-Cast (Invitrogen) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Em particular, 10% ou 4-12% de géis pré-moldados NUPAGE? NovexO Bis-TRIS (pH 6,4) e um tampão de corrida NUPAGEG MES (géis reduzidos, com aditivo tampão de corrida de antioxidante NUPAGEGO) ou MOPS (géis não reduzidos) foi usado.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO ANALÍTICO

[0414] A cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para a determinação da agregação e do estado oligomérico dos anticorpos foi realizada por cromatografia por HPLC. Resumidamente, os anticorpos purificados de proteína A foram aplicados a uma coluna Tosoh TSKgel G3000SW em NaCl a 300 mM, KH2PO4/ K2HPO4 a 50 mM, pH 7,5 em um sistema Agilent HPLC 1100 ou em uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare) em 2 x PBS em um sistema Dionex HPLC. A proteína eluída foi quantificada por absorção de UV e integração de áreas de pico. O Padrão de Filtragem em Gel BioRad 151-1901 serviu como padrão.

ESPECTROMETRIA DE MASSA

[0415] Esta seção descreve a caracterização dos anticorpos multiespecíficos com troca VH/ VL (CrossMabs VH/ VL), com ênfase em sua montagem correta. As estruturas primárias esperadas foram analisadas por espectrometria de massa com ionização por eletropulverização (ESI-MS) dos CrossMabs intactos desglicosilados e CrossMabs digeridos desglicosilados/ plasmina ou alternativamente CrossMabs digeridos desglicosilados/ com LysC limitada.

[0416] Os CrossMabs VH/ VL foram desglicosilados com N- Glicosidase F em um tampão fosfato ou Tris a 37 “ºC por até 17 h em uma concentração de proteína de 1 mg/ ml. As digestões com plasmina ou LysC limitada (Roche) foram realizadas com 100 ug de CrossMabs VH/ VL desglicosilados em um tampão Tris a pH 8 à temperatura ambiente por 120 horas e a 37 “C por 40 min, respectivamente. Antes da espectrometria de massa, as amostras foram dessalinizadas por HPLC em uma coluna Sephadex G25 (GE Healthcare). A massa total foi determinada via ESI-MS em um sistema maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik) equipado com uma fonte Triversa NanoMate (Advion).

DETERMINAÇÃO DA LIGAÇÃO E AFINIDADE DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS AOS RESPECTIVOS ANTÍGENOS USANDO RESSONÂNCIA DE PLASMON DE SUPERFÍCIE (SPR) (BIACORE)

[0417] A ligação dos anticorpos gerados aos respectivos antígenos é investigada por ressonância de plasmon de superfície usando um instrumento BIACORE (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Suécia). Resumidamente, para medições de afinidade de IgG de cabra anti-humana, os anticorpos JIR 109-005-098 são imobilizados em um chip CM5 via acoplamento de amina para apresentação dos anticorpos contra o respectivo antígeno. À ligação é medida em tampão HBS (HBS-P (10 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, 0,005% de Tween 20, ph 7,4), 25 ºC (ou alternativamente a 37 ºC). O antígeno (R&D Systems ou purificado no local) foi adicionado em várias concentrações na solução. A associação foi medida por uma injeção de antígeno de 80 segundos a 3 minutos; a dissociação foi medida lavando a superfície do chip com tampão HBS por 3 a 10 minutos e um valor de KD foi estimado usando um modelo de ligação de Langmuir 1: 1. Os dados de controle negativos (por exemplo, curvas de tampão) são subtraídos das curvas de amostra para correção do desvio da linha de base intrínseca do sistema e para redução do sinal de ruído. O respectivo software de avaliação Biacore é usado para análise de diagramas de sensores e para cálculo de dados de afinidade. EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DE FAP-4-1BBL

[0418] As moléculas de ligação ao antígeno de fusão Fc contendo o trímero-ligante de 4-1BB direcionado a FAP foram preparadas como descrito no Pedido de Patente Internacional Publ. No. WO 2016/075278 A1.

[0419] Em particular, as seguintes moléculas foram feitas: a) Moléculas de ligação ao antígeno de fusão Fc contendo o trímero-ligante de 4-1BB direcionado a FAP e não alvo.

[0420] Um polipeptídeo que codifica um ligante de 4-1BB dimérico fundido ao domínio CL humano foi subclonado na estrutura com os domínios CH2 e CH3 da cadeia pesada de IgG1 humana no knob (Merchant, Zhu et al. 1998, Nature Biotechnol. 16, 677-681). Um polipeptídeo contendo um ectodomínio do ligante de 4-1BB foi fundido com o domínio I9G1-CH1 humano. Na Construção 2.4, para melhorar o emparelhamento correto das cadeias, as seguintes mutações foram adicionalmente introduzidas no CH-CL cruzado (variante carregada). No ligando de 4-1BB dimérico fundido ao CL humano, E123R e Q124K, no ligando de 4-1BB monomérico fundido ao CH1, KI47E e K213E humano.

[0421] A região variável das sequências de DNA das cadeias pesada e leve que codificam um aglutinante específico para FAP, clone 28H1 ou clone 4B9, foram subclonadas na estrutura com a cadeia pesada constante do hole ou a cadeia leve constante da IIG1 humana. As mutações Pro329GlIy, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas de knobs-and-holes para revogar a ligação a receptores gama Fc de acordo com o método descrito em WO 2012/130831. Combinação da cadeia de nó dimérica ligante-Fc contendo as mutações S354C/ T366W, a fusão monomérica de CH1, a cadeia de holes anti-FAP-Fc direcionada que contém as mutações Y349C/ T366S/ L368A/ Y407V e a cadeia leve anti-FAP permitem a geração de um heterodímero, que inclui um ligando 4-1BB trimérico montado e um Fab de ligação a FAP (Figura 1A). Uma versão não segmentada foi preparada de acordo com a substituição do ligante FAP pela linha germinativa DP47 (Figura 1C). TABELA 1: CONSTRUÇÕES MONOVALENTES o [eee o compete — (Variante carregada) (Construção 2.4) NO: 43 e SEQ ID NO: 44 segmentado B) NO: 49 e SEQ ID NO: 84 A) MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DE TRÍMERO DE LIGANTE DE 4-1BB

DIRECIONADO A FAP E NÃO DIRECIONADO BIVALENTES QUE CONTÊM FUSÃO FC

[0422] As sequências de DNA que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um ligante específico da cadeia pesada e leve específico para FAP, clone 28H1 ou clone 4B9, foram subclonadas na estrutura com a cadeia pesada constante do hole, o knob ou a cadeia leve constante de IgG1 humana. As mutações Pro329Gly, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas de knob e hole para anular novamente a ligação aos receptores gama Fc de acordo com o método descrito em WO 2012/130831. Além disso, um polipeptídeo que compreende dois ectodomínios do ligante de 4-1BB foi fundido com o terminal C da cadeia de holes de Fc de IgG1 humana e um polipeptídeo que compreende um ectodomínio do ligante de 4-1BB foi fundido com o terminal C da cadeia do knob Fc de I9gG1 humano. A combinação da cadeia pesada do ligante dimérico do hole anticFAP hulgG1 contendo as mutações Y349C/ T366S/ L368A/ Y407V, a cadeia pesada do ligando monomérico do knob anti-FAP hulgG1 contendo as mutações S354C/ T366W e as cadeias leves anti-FAP permitiram a geração de um heterodímero, que incluía um ligante de 4-1BB trimérico montado e dois Fabs de ligação a FAP (Figura 1B). Uma versão não segmentada foi preparada de acordo com a substituição do ligante FAP pela linha germinativa DP47 (Figura 1D). TABELA 2: CONSTRUÇÕES BIVALENTES o Senso | compeinae — biFAP(4B9) 4-1BBL — Exemplo Za onstrução biFAP(28H1)4-1BBL — | Exemplo 1 goenstrução

[0423] A produção e caracterização das moléculas de ligação ao antígeno do trímero de ligante de 4-1BB direcionado e não direcionado ao FAP contendo fusão Fc é descrita em detalhes no documento WO 2016/075278, Exemplos 1 a 6, respectivamente. EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO 4-1BBL DE CAMUNDONGO DIRECIONADA À FAP (SUBSTITUTO HÍBRIDO)

[0424]Uma “molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um ligante de 4-1BB agonístico de camundongo com ligação monovalente a FAP, também denominada substituto híbrido ou FAP-mu4-

1BBL, foi preparada como descrito no pedido de patent internacional Publ. No. WO 2016/075278 A1. O camundongo alvo 4-1BBL foi preparado como descrito para o ligando humano substituindo o ligando humano pelo ectodomínio de camundongo.

[0425] A sequência de DNA que codifica parte do ectodomínio (aminoácido 104-309, incluindo a mutação C1608S) do ligante de 4-1BB do camundongo foi sintetizada de acordo com a sequência Q3U12Z9-1 do banco de dados Uniprot. O ligante de FAP utilizado para atingir o ligando de 4-1BB foi o clone 4B9. As sequências de aminoácidos para o substituto híbrido FAP- mu4-1BBL podem ser encontradas na Tabela 3.

TABELA 3: SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DO SUBSTITUTO HÍBRIDO MADURO FAP- MU4-1BBL Descrição Sequência ID NO: cadeia — knob | RTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGC di-mu4-1BBL- | PNTTOQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQD CL Fc GAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLEL

KLSPTFTNTGHKVAQGWVSLVLQOAKPQVDDFDNL ALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSV GLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKP DNPWEGGGGSGGGGSRTEPRPALTITTSPNLGT RENNADQVTPVSHIGCPNTTAQQAQGSPVFAKLLAK NQASLSNTTLNWHSQDGAGSSYLSQGLRYEED KKELVVDSPGLYYVFLELKLSPTFTNTGHKVOG WVSLVLQOAKPQVDDFDNLALTVELFPCSMENKL VDRSWSQLLLLKAGHRLSVGLRAYLHGAQDAYR DWELSYPNTTSFGLFLVKPDNPWEGGGGSGGG GSRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNF

Descrição Sequência ID NO:

YPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLH QDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS

LSPGK 87 Cadeia mono- | KRTEPRPALTITTSPNLGTRENNADQVTPVSHIGC mu4-1BBL- PNTTQQGSPVFAKLLAKNQASLSNTTLNWHSQD cH1 GAGSSYLSQGLRYEEDKKELVVDSPGLYYVFLEL

KLSPTFTNTGHKVAOGWVSLVLOAKPQVDDFDNL ALTVELFPCSMENKLVDRSWSQLLLLKAGHRLSV GLRAYLHGAQDAYRDWELSYPNTTSFGLFLVKP DNPWEGGGGSGGGGSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN

VNHKPSNTKVDEKVEPKSC 88 cadeia hole | EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYA VHCH1 (4B9)) MSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKG Fc RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKG

WFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTY

Descrição Sequência ID NO:

ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYN STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGA PIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVS LSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV LDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH

EALHNHYTQKSLSLSPGK Cadeia — leve | ENVYLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYL VLCL (4B9) AWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSG

SGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALOSGNSQESVTEQD SKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC

[0426] O substituto híbrido FAP-mu4-1BBL foi produzido co- transfectando células CHO-K1 que crescem em suspensão com os vetores de expressão de mamíferos usando eviFect (Evitria AG). As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes na proporção 1: 1: 1: 1 (“cadeia pesada do vetor Fc-hole": “cadeia leve do vetor FAP”: “cadeia pesada do vetor 4-1BBL Fc-knob”: “cadeia leve do vetor mu4-1BBL”).

[0427] Para a transfecção, as células CHO-K1 são cultivadas em suspensão isentas de soro no meio de cultura eviMake (Evitria AG). Após 7 dias a 37 ºC em uma incubadora com uma atmosfera de 5% de CO>z, o sobrenadante do cultivo é coletado para purificação por centrifugação e a solução é filtrada estéril (filtro de 0,22 mm) e mantida a 4 ºC.

[0428] As proteínas segregadas foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células por cromatografia de afinidade usando proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho. Para cromatografia de afinidade, o sobrenadante foi carregado em uma coluna Protein A MabSeletSure (GE Healthcare) equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida por lavagem com 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de tampão contendo citrato de sódio (pH 7,5). A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de pH linear de cloreto de sódio de 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de NaCl, 100 mM de glicina, 0,01% de Tween20, pH 3,0. A coluna foi então lavada com mM de citrato de sódio, 100 mM de NaCl, 100 mM de glicina, 0,01% de Tween20, pH 3,0. O pH das frações coletadas foi ajustado adicionando 1/40 (v/ v) de 2M Tris, pH 8,0. A proteína foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HiLoad Superdex (GE Healthcare) equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, 0,01% de Tween20, pH 6,0.

[0429] A concentração de proteína de construções biespecíficas purificadas foi determinada medindo a DO a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. A pureza e o peso molecular das construções biespecíficas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor (Invitrogen, EUA), utilizando um LabChipGXllI (Caliper). O conteúdo agregado de construções biespecíficas foi analisado usando uma coluna analítica de exclusão de tamanho TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada em 25 mM de K2HPOA4, 125 mM de NaCl, 200 mM de monohidrocloreto de L-arginina, NaN3 a 0,02% (p/ v) de NaN3, pH 6,7 tampão de corrida a 25 ºC.

TABELA 4: ANÁLISE BIOQUÍMICA DO SUBSTITUTO HÍBRIDO FAP-MU4-1BBL

2.1 CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DO SUBSTITUTO HÍBRIDO FAP-MU4-1BBL POR

RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE

[0430] A capacidade de ligação simultânea de 4-1BB Fc murino (kih) e FAP humano ou murino foi avaliada por ressonância plasmônica de superfície (SPR) da maneira descrita em WO 2016/075278 A1. Todas as experiências de SPR foram realizadas em um Biacore T200 a 25 ºC com HBS- EP como tampão de corrida (0,01 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% de tensoativo P20, Biacore, Freiburg/ Alemanha). O 4-1BB Fc murino biotinilado (kih) foi diretamente acoplado a uma célula de fluxo de um chip sensor de estreptavidina (SA). Foram utilizados níveis de imobilização de até 600 unidades de ressonância (RU).

[0431] A construção de mu4-1BBL direcionada à FAP foi passada em uma faixa de concentração de 200 nM com um fluxo de 30 ul/ minuto através das células de fluxo ao longo de 90 segundos e a dissociação foi ajustada para zero segundos. FAP humano ou murino foi injetado como segundo analito com um fluxo de 30 ul/ minuto através das células de fluxo durante 90 segundos a uma concentração de 500 nM. A dissociação foi monitorada por 120 segundos. As diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida em uma célula de fluxo de referência, onde nenhuma proteína foi imobilizada.

[0432] Como pode ser visto nos gráficos das Figuras 2A e 2B, o substituto híbrido FAP-mu4-1BBL pode ligar simultaneamente 4-1BB murino e FAP murino/ humano.

EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AOS ANTÍGENOS BIESPECÍFICOS COM LIGAÇÃO BIVALENTE AO CAMUNDONGO 4-1BB E

LIGAÇÃO MONOVALENTE AO FAP

[0433] Anticorpos — 4-1BB — agonísticos biespecíficos — de camundongo com ligação bivalente a 4-1BB e ligação monovalente a FAP, também denominados 2 + 1, foram preparados em analogia à Figura 1. Neste exemplo, a primeira cadeia pesada HC1 da construção era composta por os seguintes componentes: VHCH1 de um anti-4-1BB (clone MU137-1) seguido de Fc contendo as mutações Lys392Asp e Lys409Asp (denominadas Fc-DD), nas quais o terminal C é um VL ou VH do aglutinante anti-FAP (clone 28H1) foi fundido. A segunda cadeia pesada HC2 era composta por VÓHCH1 de anti-4- 1BB (clone MU137-1) seguido por Fc contendo a mutação Glu356Lys e Asp399Lys (denominada Fc-KK), na qual o terminal C é um VH, ou VL, de ligante anti-FAP (clone 28H1) foi fundido. As mutações DDKK para melhorar a formação do heterodímero Fc do anticorpo são, entre outras, descritas por Gunasekaran et al., J. Biol. Chem. 2010,19637-19646. A combinação do DD anti-FAP-Fc alvo com a cadeia anti-4-1BB-Fc KK permite a geração de um heterodímero, que inclui uma fração de ligação a FAP e dois Fabs de ligação a 4-1BB de camundongos murinos. As mutações de DAPG foram introduzidas nas regiões constantes das cadeias pesadas para revogar a ligação aos receptores gama Fc de camundongo, de acordo com o método descrito, por exemplo, em Baudino et al. J. Immunol. (2008), 181, 6664-6669, ou no documento WO 2016/030350 A1. Resumidamente, as mutações Asp265Ala e Pro329Gly foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas Fc-DD e Fc-KK para revogar a ligação aos receptores gama FC (numeração de acordo com o índice Kabat EU; isto é, D265A, P329G).

[0434] As sequências de aminoácidos para a construção 2 + 1 anti4-1BB (MU137-1), anti-FAP (28H1) com um VH a-FAP (28H1) fundido a Fc-KK e VL fundido à cadeia Fc-DD podem ser encontradas respectivamente na Tabela 5. As sequências de aminoácidos para a construção 2 + 1 anti-4- 1BB (MU137-1), anti-FAP (28H1) com um VL a-FAP (28H1) fundido a Fc-KK e VH fundido a cadeia Fc-DD pode ser encontrada, respectivamente, na Tabela

6. TABELA 5: SEQUÊNCIAS DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO IGG1 DAPG IGG1 DE CAMUNDONGO ANTI-4-1BB (MU137-1)/ ANTI-FAP (28H1) (CONSTRUÇÕES com VL FAP FUNDIDO À CADEIA FC-DD E VH FUNDIDO À CADEIA FC-KK, TAMBÉM DENOMINADO ABAIXO DE FC-DD-VL) Ee em 90 Cadeia pesada | DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYF VHCH1 (MU137-1)| DMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSV - Fc-DD-VL (28H1) | KGRFTVSRENAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYC

ARRSYGGYSELDYWGQGVMVTVSSAKTTPPS VYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTV TWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVP SSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTC VVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPRE EQINSTFRSVSELPIMHODWLNGKEFKCRVNS AAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMA KDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENY DNTQPIMDTDGSYFVYSDLNVOKSNWEAGNTF TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGG GSGGGGSGGGGSEIVLTASPGTLSLSPGERAT LSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGAS TRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV

YYCQAQAGQAVIPPTFGQAGTKVEIK VHCH1 (20H4.9) - | DMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSV

Ee em Fc-KK-VH (28H1) | KG RFTVSRENAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYC

ARRSYGGYSELDYWGQGVMVTVSSAKTTPPS VYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTV TWNSGSLSSGVHTFPAVLOQSDLYTLSSSVTVP SSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTC VVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPRE EQINSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNS AAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMA KDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENY KNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTF TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGG GSGGGEGSCGEGGESEVALLESGGGLVQAPGGSL RLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS AIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGOQOGTLV

TVSS 92 Cadeia leve VLCL | DIQMTAQSPASLSASLEEIVTITCEOASQDIGNWLA - (MU137-1) WYHQKPGKSPQLLIYGTSSLADGVPSRFSGSS

SGSQYSLKISRLQVEDIGIYYCLOAYGAPWTFG GGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASV VCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWT DQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEA

THKTSTSPIVKSFNRNEC TABELA 6: SEQUÊNCIAS DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO IGG1 DAPG

IGG1 DE CAMUNDONGO ANTI-4-1BB (MU137-1)/ ANTI-FAP BIVALENTE (consTRUÇÕES COM VH FAP FUNDIDO À CADEIA FC DD E VL FUNDIDO À CADEIA FC KK, DENOMINADO FC-DD-VH) Ee em 93 Cadeia pesada | DVQOLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYF VHCH1 (MU137-1)| DMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSV - Fce-DD-VH | KGRFTVSRENAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYC (28H1) ARRSYGGYSELDYWGQGVMVTVSSAKTTPPS

VYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTV TWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVP SSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTC VVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPRE EQINSTFRSVSELPIMHQODWLNGKEFKCRVNS AAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMA KDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENY DNTQPIMDTDGSYFVYSDLNVQKSNWEAGNTF TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGGG GSCGESGESGEGESEVALLESGGGLVAQPGGSL RLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVS AIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ MNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLV

TVSS Cadeia pesada | DVQLVESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFIFSYF VHCH1 (MU137-1)| DMAWVRQAPTKGLEWVASISPSGDIPYYRDSV - Fo-KK-VL (28H1) | KGRFTVSRENAKSSLYLQMDSLRSEDTATYYC

ARRSYGGYSELDYWGQGVMVTVSSAKTTPPS VYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTV TWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVP SSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCG CKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTC VVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPRE EQINSTFRSVSELPIMHQODWLNGKEFKCRVNS AAFGAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKKQMA KDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENY KNTQPIMKTDGSYFVYSKLNVQOKSNWEAGNTF TCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGGGGGSGCGGG GSGGGGSCGGGGSEIVLTASPGTLSLSPGERAT LSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGAS TRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAV

YYCQAQQAGQAVIPPTFGQAGTKVEIK - (MU137-1)

[0435]O DAPG anti-4-1BB anti-FAP mulgG1 biespecífico foi produzido co-transfectando células CHO-K1 que crescem em suspensão com os vetores de expressão de mamíferos usando eviFect (Evitria AG). As células foram transfectadas com os vetores de expressão correspondentes na proporção de 1: 1: 1 (“cadeia pesada do vetor Fc-DD": “cadeia leve do vetor”: “cadeia pesada do vetor Fc-KK").

[0436] Para transfecção, as células CHO-K1 são cultivadas em suspensão isentas de soro no meio de cultura eviMake (Evitria AG). Após 7 dias a 37 ºC em uma incubadora com uma atmosfera de 5% de CO>z, o sobrenadante do cultivo é coletado para purificação por centrifugação e a solução é filtrada estéril (filtro de 0,22 mm) e mantida a 4 ºC.

[0437] As proteínas segregadas foram purificadas a partir de sobrenadantes da cultura de células por cromatografia de afinidade usando proteína A, seguida por cromatografia de exclusão por tamanho. Para cromatografia de afinidade, o sobrenadante foi carregado em uma coluna Protein A MabSeletSure (CV = 5 mL, GE Healthcare) equilibrada com 40 mL de mM de fosfato de sódio, 20 mM de citrato de sódio, pH 7,5. A proteína não ligada foi removida por lavagem com pelo menos 10 volumes de coluna de 20 mM de fosfato de sódio, 20 mM de tampão contendo citrato de sódio (pH 7,5). A proteína ligada foi eluída utilizando um gradiente de pH linear de cloreto de sódio (de 20 a 100 mM) criado em 15 volumes de coluna de 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de NaCl, 100 MM de glicina, pH 3,0. A coluna foi então lavada com 10 volumes de coluna de 20 mM de citrato de sódio, 100 mM de NaCl, 100 mM de glicina, pH 3,0. O pH das frações coletadas foi ajustado adicionando 1/40 (v/ v) de 2M Tris, pH 8,0. A proteína foi concentrada e filtrada antes do carregamento em uma coluna HiLoad Superdex 16/600 S200 (GE Healthcare) equilibrada com 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, pH 6,0.

[0438] A concentração de proteína de construções biespecíficas purificadas foi determinada medindo a DO a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos. A pureza e o peso molecular das construções biespecíficas foram analisados por CE-SDS na presença e ausência de um agente redutor (Invitrogen, EUA), utilizando um LabChipGXllI (Caliper). O conteúdo agregado de construções biespecíficas foi analisado usando uma coluna analítica de exclusão de tamanho TSKgel G3000 SW XL (Tosoh) equilibrada em 25 mM de K2HPOA4, 125 mM de NaCl, 200 mM de monohidrocloreto de L-arginina, NaN3 a 0,02% (p/ v) de NaN3, pH 6,7 tampão de corrida a 25 ºC.

TABELA 7 - ANÁLISE BIOQUÍMICA DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AOS ANTÍGENOS BIESPECÍFICOS COM LIGAÇÃO BIVALENTE A 4-1BB E LIGAÇÃO MONOVALENTE A FAP

(2+1) ANTI-4-1BB (MU137-1), ANTI-FAP (28H1) IGG1 DAPG a E e E Memo Pecas [%] [mg] red) 4-1BB (MU137-1)/ FAP(28H1) DAPG IgG1 2 EEE. | 6 | MUFAP-4-1BB

3.1 CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DO SUBSTITUTO MUFAP-4-1BB DE CAMUNDONGO

POR RESSONÂNCIA PLASMÔNICA DE SUPERFÍCIE

[0439] A capacidade de ligação simultânea de 4-1BB Fc murino (kKkih) e FAP murino foi avaliada por ressonância plasmônica de superfície (SPR) da maneira descrita em WO 2016/075278 A1. Todas as experiências de SPR foram realizadas em um Biacore T200 a 25 ºC com HBS-EP como tampão de corrida (0,01 M de HEPES, pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, tensoativo P20 a 0,005%, Biacore, Freiburg/ Alemanha). O 4-1BB Fc murino biotinilado (kih) foi diretamente acoplado a uma célula de fluxo de um chip sensor de estreptavidina (SA). Foram utilizados níveis de imobilização de até 600 unidades de ressonância (RU).

[0440] As construções de 4-1BB direcionadas à FAP foram passadas em uma faixa de concentração de 200 nM com um fluxo de 30 uL/ minuto através das células de fluxo ao longo de 90 segundos e a dissociação foi ajustada para zero segundos. O FAP murino foi injetado como segundo analito com um fluxo de 30 ul/ minuto através das células de fluxo ao longo de 90 segundos a uma concentração de 500 nM. A dissociação foi monitorada por 120 segundos. As diferenças no índice de refração em massa foram corrigidas subtraindo a resposta obtida em uma célula de fluxo de referência, onde nenhuma proteína foi imobilizada. Como pode ser visto no gráfico da Figura 2C, o substituto muFAP-4-1BB do camundongo pode se ligar simultaneamente ao 4-1BB murino e ao FAP murino.

EXEMPLO 4 PERFIL FARMACOCINÉTICO DO MUFAP-4-1BB APÓS INJEÇÃO ÚNICA EM

CAMUNDONGOS C57BL/ 6

[0441] Uma dose única de 2,5 mg/ kg de muFAP+4-1BB (preparada de acordo com o Exemplo 3) foi injetada em camundongos C57BL/

6. Todos os camundongos foram injetados via i.v. com 200 ul da solução apropriada. Para obter a quantidade adequada de compostos por 200 ul, a solução estoque (muFAP-4-1BB; 1,81 mg/ mL em 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, pH 6,0) foi diluída com tampão de histidina. Três camundongos por ponto de tempo foram sangrados às 10 min, 1 hora, 6 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 6 dias e 9 dias. O composto injetado foi analisado em amostras de soro por ELISA. 4-1BB murino biotinilado, amostra de soro de teste, anticorpo de detecção anti-mslgG marcado com HRP foram adicionados passo a passo a uma placa de microtitulação revestida com estreptavidina de 96 poços e incubados após cada passo por 1 hora à temperatura ambiente. À placa foi lavada três vezes após cada passo para remover substâncias não ligadas. Finalmente, o complexo ligado à peroxidase foi visualizado adicionando solução de substrato ABTS para formar um produto de reação colorido. A intensidade do produto da reação foi determinada fotometricamente a 405 nm (com comprimento de onda de referência a 490 nm) e foi proporcional à concentração do analito na amostra de soro. O resultado é mostrado na Figura 3. O muFAP-4-1BB mostrou um comportamento PK estável, sugerindo uma programação semanal para estudos de eficácia.

EXEMPLO 5 EFICÁCIA ANTITUMORAL IN VIVO DA CONSTRUÇÃO HÍBRIDA DE FAP-MU4-1BBL EM

COMBINAÇÃO COM TRASTUZUMABE

[0442] A primeira prova de conceito para a combinação de híbridos FAP-mu4-1BBL (anti-FAP, 4-1BBL de camundongo, coluna vertebral IgG humana) e Trastuzumabe foi realizada em camundongos huCD16TgScid portadores de tumor (portador de N87).

[0443] As células N87 (carcinoma gástrico humano HER-2*) foram originalmente obtidas da ATCC e após a expansão depositada no banco celular interno da Roche Glycart. As células foram cultivadas em RPMI contendo 10% de FCS e 1% de Glutamax. As células foram cultivadas a 37 ºC em uma atmosfera saturada de água a 5% de CO. Foram injetadas 5 x 10º células por animal por via subcutânea no flanco direito dos animais em meio de cultura de células RPMI (Gibco) e matrigel GFR (1: 1, volume total de 100 ul) a uma viabilidade de > 95,0%.

[0444] Camundongos SCID transgênicos humanos FcegRllla (CD16) (que expressam macrófagos murinos positivos para FcyRIVa e células NK murinas transgênicas humanas positivas para FeyRllla como efetores) com idades de 8 a 10 semanas no início do experimento (criados em Charles River, França) foram mantidos sob condição livre de patógenos específicos com ciclos diários de 12 h de luz/ 12 h de escuridão, de acordo com as diretrizes adotadas (GV-Solas; Felasa; TierschG). O protocolo do estudo experimental foi revisado e aprovado pelo governo local. Após a chegada, os animais foram mantidos por uma semana para se acostumar com o novo ambiente e para observação. O monitoramento contínuo da saúde era realizado regularmente.

[0445] De acordo com o protocolo (Figura 4A), camundongos huCD16TgScid fêmeas foram injetados subcutaneamente com células tumorais como descrito acima e tratados uma vez por semana com os compostos ou PBS (Veículo) quando o tamanho do tumor atingiu aproximadamente 220 mm? (dia 28). Todos os ratos foram injetados por via intravenosa com 200 ul da solução apropriada uma vez por semana. Para obter a quantidade adequada de compostos por 200 ul, as soluções estoque (Tabela 1) foram diluídas com tampão histidina quando necessário. Para terapia combinada (Grupo D, Figura 4B) com construções de Trastuzumabe e FAP-4-1BBL, as terapias foram injetadas concomitantemente. O crescimento do tumor foi medido duas vezes por semana usando um paquímetro (Figura 5A e 5B) e o volume do tumor foi calculado da seguinte forma: Tv: (W2?/ 2) x L (W: Largura, L: Comprimento)

[0446] O estudo foi encerrado e todos os camundongos foram sacrificados após oito injeções dos compostos (dia 86 após a injeção das células tumorais). As Figuras 5A e 5B mostram a cinética de crescimento tumoral (Média +/- SEM) em todos os grupos de tratamento, bem como a cinética individual de crescimento tumoral de cada animal para todos os grupos. A monoterapia com o híbrido FAP-mu4-1BBL não revelou nenhuma inibição do crescimento tumoral. O trastuzumabe, administrado em monoterapia, induziu estase tumoral (TGI: 95 e TCR: 0,35) com um camundongo livre de tumor no término do estudo. No entanto, a combinação de Trastuzumabe e híbrido FAP-mu4-1BBL induziu forte regressão tumoral (TGI: 132 e TCR: 0,09), resultando em 60% de ratos livres de tumor no dia 86.

[0447] A análise estatística foi realizada no software JMP: TGI = 100 — Av(Trratamentolpiax! — TrratamentolLinha de base] ) + 100 Av(Tyeicutotviax — Tyeícutoltinha de base]) TCR = AV(T tratamentolPia*x1) Av(T veicutolviax])

[0448] Os cálculos com base no dia 59 do estudo são mostrados na Tabela 9 abaixo. TABELA 8: COMPOSIÇÕES USADAS NAS EXPERIÊNCIAS IN VIVO Concentração (mg/mL) mM de Histidina, 5,33 FAP-mu4-1BBL 140 mM de NaCl, (= solução de estoque) pH 6,0 20 mM de Histidina, 25 Trastuzumabe 140 mM de NaCl, (= solução de estoque) pH6,0 á au TABELA 9: INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO TUMORAL (TGI) E TCR NO DIA 59 [o eo [| ta | tr ||

FAP-Mu4-1B8L

[0449] TGI: Inibição do Crescimento Tumoral => TGI > 100 significa regressão tumoral; TGI| = 100 significa estase tumoral.

[0450] TOR: Relação Tratamento/ Controle => TCR = 1 significa nenhum efeito, TOR = O significa regressão completa do tumor.

EXEMPLO 6 PREPARAÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO CEA4-1BBL

[0451] As moléculas de ligação ao antígeno do trímero ligando de 4-1BB direcionadas a CEA contendo fusão Fc foram preparadas como descrito no Pedido de Patente Internacional Publ. No. WO 2016/075278 A1.

[0452] Em particular, foram feitas moléculas de ligação ao antígeno do trímero ligando de 4-1BB direcionado a CEA e não direcionado a CEA contendo fusão Fc.

[0453] Um polipeptídeo que codifica um ligante de 4-1BB dimérico fundido ao domínio CL humano foi subclonado no quadro com os domínios CH2 e CH3 da cadeia pesada de IgG1 humana no knob (Merchant, Zhu et al. 1998, Nature Biotechnol. 16, 677-681). Um polipeptídeo contendo um ectodomínio do ligante de 4-1BB foi fundido com o domínio IgG1-CH1 humano. Para melhorar o emparelhamento correto das cadeias, as seguintes mutações foram introduzidas adicionalmente no CH-CL cruzado (variante carregada): No ligante de 4-1BB dimérico fundido ao CL humano, E123R e Q124K, no ligando de 4-1BB monomérico fundido para CH1 humano, K147E e K213E.

[0454] A região variável das sequências de DNA das cadeias pesada e leve que codificam um aglutinante específico para CEA, clone T84.66-LCHA (CEACAMS), foi subclonada em quadro com a cadeia pesada constante do hole ou a cadeia leve constante da IIG1 humana. As mutações

Pro329GIy, Leu234Ala e Leu235Ala foram introduzidas na região constante das cadeias pesadas de knob e hole para anular novamente a ligação aos receptores gama Fc de acordo com o método descrito em WO 2012/130831. À combinação da cadeia do knob do ligante dimérico-Fc contendo as mutações S354C/ T366W, a fusão monomérica CH1, a cadeia de holes anti-CEA-Fc direcionada que contém as mutações Y349C/ T366S/ L368A/ Y407V e a cadeia leve anti-CEA permite a geração de um heterodímero, que inclui um ligante de 4-1BB trimérico montado e um Fab de ligação a CEA (em analogia à Figura 1A, anti-FAP substituído por anti-CEA). TABELA 10: CONSTRUÇÃO MONOVALENTE LCHA)-4-1BBL (Variante | Exemplo 11.2.4 (Construção 5.4) | 42, SEQ ID NO: 82 e SEQ ID carregada) NO: 83

[0455] A produção e caracterização das moléculas de ligação ao antígeno do trímero de ligante de 4-1BB direcionado e não direcionado a CEA contendo fusão Fc é descrita em detalhes no documento WO 2016/075278, Exemplos 11 a 13, respectivamente.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método para tratar ou retardar a progressão do câncer, caracterizado pelo agonista de 4-1BB (CD137) ser usado em combinação com um agente de direcionamento de HER-2 e em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor.

   2. AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo agente de direcionamento de HER-2 compreender um anticorpo de HER-2, um anticorpo biespecífico de HER-2 e/ ou um conjugado de medicamento de anticorpo de HER-2.

   3. AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo agente de direcionamento de HER-2 compreender trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

   4. AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo agonista de 4-1BB compreender três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

   5. AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula que compreende três ectodomínios de 4- 1BBL ou fragmentos dos mesmos e em que os ectodomínios de 4-1BBL compreendem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, em particular a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 5.

   6. AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método,

   de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor selecionado a partir do grupo que consiste em proteína de ativação de fibroblastos (FAP) e CEA.

   7. AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc de IgG, de forma específica um domínio Fc de I9G1 ou um domínio Fc de IgG4.

   8. AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende um domínio Fc que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor de Fc e/ ou função efetora.

   9. AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a uma proteína de ativação de fibroblastos (FAP).

   10. —AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, compreendendo: (a) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, ou (b) uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

   11. — AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou em que o domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:

   24.

   12. —AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica ao FAP, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

   13. — AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica ao FAP que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 ou uma região variável de cadeia pesada (VHFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e uma região variável de cadeia leve (VLFAP) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

   14. —AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende uma primeira cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41, uma primeira cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42, uma segunda cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 43 e uma segunda cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44.

   15. —AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou 7 a 11, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser um anticorpo biespecífico anti-FAP/ anti-4-1BB.

   16. AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos e pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA.

   17. —"AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 17, caracterizado pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA que compreende (a) uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) que compreende (i) CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33, (ii) CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34 e (iii) CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) que compreende (iv) CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 36, (v) CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e (vi) CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38.

   18. —AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 16 ou 17, caracterizado pelo domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor ser um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA que compreende uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40.

   19. — AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 16 a 18, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a CEA, (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que o primeiro polipeptídeo compreende dois ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos do mesmo que são conectados um ao outro por um ligante peptídico e em que o segundo polipeptídeo compreende um ectodomínio de 4-1BBL ou um fragmento do mesmo.

   20. —“AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 16 a 19, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser uma molécula de ligação ao antígeno que compreende: (a) pelo menos um domínio de Fab capaz de se ligar de forma específica a CEA compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39 e uma região variável de cadeia leve (VLCEA) compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40, e (b) um primeiro e um segundo polipeptídeo que estão ligados um ao outro por uma ligação dissulfeto, em que a molécula de ligação ao antígeno é definida pelo primeiro polipeptídeo compreender a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 32 e em que o segundo polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

   21. —“AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou 17 ou 18, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser um anticorpo biespecífico anti-CEA/ anti-4-1BB.

   22. —AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo agonista de 4-1BB e o agente de direcionamento de HER-2 serem administrados juntos em uma única composição ou administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

   23. —AGONISTA DE 4-1BB (CD137), para uso em um método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo agonista de 4-1BB atuar sinergicamente com o agente de direcionamento de

   HER-2.

   24. PRODUTO FARMACÊUTICO, caracterizado por compreender (A) uma primeira composição compreendendo como ingrediente ativo um agonista de 4-1BB (CD137) e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor; e (B) uma segunda composição compreendendo como ingrediente ativo um agente de direcionamento de HER-2 e um veículo farmaceuticamente aceitável, para uso no tratamento combinado, sequencial ou simultâneo de uma doença, em particular câncer.

   25. “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor.

   26. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo agente de direcionamento de HER-2 compreender trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

   27. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 26, caracterizado por ser para uso no tratamento ou no retardo da progressão do câncer, em particular para o tratamento de tumores sólidos avançados e/ ou metastáticos.

   28. USO DE UMA COMBINAÇÃO DE UM AGONISTA DE 4- 1BB E UM AGENTE DE DIRECIONAMENTO DE HER-2, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão de uma doença proliferativa, em particular câncer, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor.

   29. USO DE UMA COMBINAÇÃO DE UM AGONISTA DE 4- 1BB E UM AGENTE DE DIRECIONAMENTO DE HER-2, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo agente de direcionamento de HER-2 compreender trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

   30. MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DO CÂNCER EM UM INDIVÍDUO, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agonista de 4-1BB e uma quantidade eficaz de um agente de direcionamento de HER-2, em que o agonista de 4-1BB é uma molécula de ligação ao antígeno que compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno capaz de se ligar de forma específica a um antígeno associado ao tumor.

   31. MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DO CÂNCER EM UM INDIVÍDUO, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo agente de direcionamento de HER-2 ser trastuzumabe, pertuzumabe e/ ou trastuzumabe emtansina.

   32. MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DO CÂNCER EM UM INDIVÍDUO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 31, caracterizado pelo agonista de 4-1BB compreender três ectodomínios de 4-1BBL ou fragmentos dos mesmos.

   33. MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DO CÂNCER EM UM INDIVÍDUO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, caracterizado pelo agonista de 4-1IBB e o agente de direcionamento de HER-2 serem administrados juntos em uma única composição ou administrados separadamente em duas ou mais composições diferentes.

   34. MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A

   PROGRESSÃO DO CÂNCER EM UM INDIVÍDUO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizado pelo agonista de 4-1IBB e o agente de direcionamento de HER-2 serem administrados por via intravenosa ou subcutânea.

   35. MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DO CÂNCER EM UM INDIVÍDUO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizado pelo agonista de 4-1BB ser administrado simultaneamente com, antes ou subsequentemente ao agente de direcionamento de HER-2.

   36. AGONISTA DE 41BB (CD137) ou composição farmacêutica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou 25 a 27, uso de uma combinação de um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 29, ou o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizado pelo câncer ser um câncer positivo para HER-2.

   37. AGONISTA DE 4-1BB (CD137) ou composição farmacêutica para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23 ou 25 a 27, uso de uma combinação de um agonista de 4-1BB e um agente de direcionamento de HER-2, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 29, ou o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizado pelo câncer ser câncer de mama, câncer de ovário, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer de pulmão, câncer uterino, carcinoma do ducto salivar, câncer de bexiga, câncer de endométrio, câncer de pâncreas, câncer de cólon, câncer de próstata e/ ou câncer de cabeça e pescoço.